CN108103041A

CN108103041A - 一种热稳定微生物转谷氨酰胺酶及其编码基因

Info

Publication number: CN108103041A
Application number: CN201810104654.7A
Authority: CN
Inventors: 步国建; 张充; 张晓健; 程伟
Original assignee: Taixing East Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Taixing East Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2018-06-01

Abstract

本发明公开了一种热稳定微生物转谷氨酰胺酶及其编码基因。热稳定微生物转谷氨酰胺酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述的热稳定微生物转谷氨酰胺酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该重组转谷氨酰胺酶在60℃条件下，半衰期达10min以上。本发明丰富了微生物源转谷酰胺酶基因的资源，为扩大微生物转谷酰胺酶在食品加工中的应用范围奠定了基础。

Description

一种热稳定微生物转谷氨酰胺酶及其编码基因

技术领域

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种热稳定性微生物转谷酰胺酶及其编码基因。

背景技术

微生物转谷氨酰胺酶(Microbial Transglutaminase，EC 2.3.2.13简称MTG)是一种硫醇酶，通过催化蛋白质分子内或分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间连接、以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，提高蛋白质功能性质、改善结构，并通过引入赖氨酸提高蛋白质营养价值。

MTG能改变食品蛋白质的功能性质主要由于:(1)它可改变酪蛋白、肌球蛋白和乳球蛋白等蛋白质的物理特性；(2)利用谷氨酰胺转胺酶催化作用可将各种必需氨基酸以共价健形式与各食品蛋白质结合，以弥补加工过程中所流失或破坏之必需氨基酸而提高食品蛋白质的营养价值；(3)不同蛋白质也可通过谷氨酰胺转胺酶作用结合成一大分子，其物理特性与同种蛋白质分子结合体类似，可作为开发新蛋白食品的方法，如:各种人造肉、仿蟹肉等的开发；(4)在低蛋白质浓度下，谷氨酰胺转胺酶作用所产生的聚合体可溶于水，但在高浓度下，谷氨酰胺转胺酶作用有助于胶体的形成。利用此特性，可用于各种食品蛋白薄膜的制造，所制得的薄膜具有高拉力强度、且不溶于水及其它溶剂。

由于能催化蛋白质分子发生交联，从而改变食品蛋白质体系的功能特性，进而提高食品的制作品质，所以转谷氨酰胺酶在食品加工中有很多独特的应用。由于具有非常特殊的性质，转谷氨酰胺酶在世界范围内的食品加工中做为食品加工基料的需求与日俱增，这种酶已经被专家确认为“公认安全的食品添加剂”，其应用范围将会持续增加，应用前景十分广阔。

MTG的在常温条件(20-25℃)范围内具有较好的稳定性，而在高温条件下，如55-60℃范围内保存，则会迅速失活，如目前大多数商品化的MTG在60℃的4-5min,酶活性全部丧失。因此，在一些需要高温条件食品加工环节，MTG目前还未得到很好的应用。另一方面，目前日本味之素公司是世界范围内最大的MTG生产、销售公司。由于我国缺乏具有自主知识产权的产酶菌种，因此，国内市场一直被国外产品垄断。我国地大物博，基因资源丰富，筛选、构建具有自主知识产权的、热稳定MTG产酶菌种迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的热稳定微生物转谷氨酰胺酶。

本发明的另一目的是提供一种新的编码热稳定微生物转谷氨酰胺酶的基因。

本发明的又一目的是提供该热稳定微生物转谷氨酰胺酶的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种热稳定微生物转谷氨酰胺酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的热稳定微生物转谷氨酰胺酶的基因。

所述的基因优选核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的基因的重组表达载体。

本发明所述的热稳定微生物转谷氨酰胺酶在食品加工中的应用；优选在制备食品蛋白薄膜中的应用。

有益效果:

发明人在分析NCBI数据库中数种土壤来源的MTG蛋白质序列基础上，设计简并引物，提取土壤样品中微生物的总基因组DNA，并以其为模板，利用简并PCR进行扩增，拼接所有扩增产物获得全长1266bp的完整读码框序列，编码421个氨基酸。编码产物分子量为46.963kD。将该基因两端分别加上BamHI限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pET-23a连接，并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，实现了异源高效表达。本发明热稳定微生物转谷氨酰胺酶具有优良的热稳定性质。最适反应温度：50℃；60℃条件下保温处理10min，酶活仍保留60％以上。本发明扩大MTG基因资源，从而为开发热稳定的MTG，并将其运用到食品加工中的研究提供科学依据。

附图说明

图1 MTG表达载体构建过程

具体实施方式

实施例1：MTG基因的克隆与测序分析

从NCBI网站中搜索几种链霉菌转谷酰胺酶序列，进行生物信息学分析，用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)程序选择其中的两处高度保守的氨基酸序列设计了简并引物。

利用MP bio公司的土壤基因组DNA提取试剂盒(Spin Kit for Soil)土壤基因组提取试剂盒，提取50份不同来源的土壤样品总基因组。

在50μl体系中，分别加入上游引物:5′-gcaccggattccgacgacag-3′,和下游引物:5′-tcgccgcaggccgactctag-3′,终浓度各为0.8μM，dNTPs终浓度为0.2mM,土壤基因组总DNA10ng，2U Pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃5min；35×(94℃30s，55℃60s，72℃60s)；72℃10min。将PCR产物送上海生工生物工程公司测序。

分析测序结果，得到一个全长为1266bp完整读码框序列的基因，核苷酸序列如SEQID NO.1所示，编码一个由421个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因提交至NCBI利用blastx比对，与吸水链霉菌推测的转谷氨酰胺酶基因(GenBank:AY502065.1)同源性最高，为79％，证明是一个新的MTG基因。

实施例2：新型MTG基因合成及原核表达载体的构建

根据获得的测序获得的MTG基因序列，在5′与3′端分别加上BamHI识别序列(GGATCC)后，委托上海生工生物工程公司合成该基因。合成的基因与载体pET-23a，分别用适量的相同限制性内切酶BamHI消化后，用T4DNA连接酶连接。重组载体转化大肠杆菌DH5α。从转化平板上随机挑取单菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工生物工程公司测序。

实施例3：新型MTG酶基因在大肠杆菌中的表达

将含有MTG表达质粒pET-23a-MTG转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm30℃培养过夜，按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃、180rpm振荡培养2-3小时至OD600约为0.6时，加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导。1.5小时后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，即为重组MTG粗酶液

实施例4：MTG酶活测定方法

取0.2m L粗酶液，加入50μL 0.1％的胰蛋白酶，混匀后37℃水浴5min，即得到成熟的MTG。酶活测定采用Crossowicz比色法，以CBZ-Gln-Gly与盐酸羟胺为底物，将150μL的底物(0.01mol/L)与50μL激活后的成熟酶混匀后37℃反应5min，然后迅速加入200μL的反应终止剂氯化铁(5％)-三氯乙酸(4％)，同时以L-谷氨酸-γ-单羟肟酸制作标准曲线，用酶标仪测量反应液在525nm下的吸光值。酶活力单位定义为：37℃时1min催化N-α-CBZ-Gln-Gly生成1μmol L-谷氨酸-γ-单羟肟酸所需要的酶量。

重组MTG在30℃，40℃，50℃，60℃，70℃的温度反应条件下的酶活测定结果如表1所示。

表1不同反应温度对重组MTG酶活性的影响

温度	30℃	40℃	50℃	60℃	70℃
						酶活(U/ml)	1.3	3.2	5.1	4.4	4.1

将重组MTG(酶蛋白浓度为0.1mg/ml)在30℃，40℃，50℃，60℃的温度条件下分别保温5min，10min，15min。之后在反应温度为50℃的条件下，测定剩余酶活。以保温前的酶活为对照(100％)，剩余相对酶活如表2所示。

表2不同温度保温处理后重组MTG剩余相对酶活

以上结果表明，该重组MTG最适反应温度：50℃；热稳定性：60℃条件下保温处理10min，酶活仍保留60％以上。

实施例5：热稳定性重组MTG制备乳清蛋白包装膜的流程

称取乳清蛋白粉溶于超纯水中配制成质量百分含量10％，甘油与乳清蛋白比例进一步优选1:4于搅拌过程中缓慢加入获得成膜液，磁力搅拌使其充分溶解后用NaOH或HCl溶液调节pH至5，加入热稳定性重组MTG制备，酶量优选1U/g成膜液。成膜液至于50℃恒温水浴处理10min，之后升温至85℃继续恒温水浴30min，待成膜液冷却后，超声波脱气处理，倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，室温20℃反应2h，55℃干燥36h揭膜。

实施例6：乳清蛋白膜性能的测定

膜感官指标的测定：感官评定膜的颜色，表面光滑度以及膜的黏性，是否易揭膜。

膜厚度(mm)的测定：在被测膜上随机(除膜的最边缘)取五个点，用电子数显卡尺测量其厚度，取其平均值并记录。

膜折痕(FM)的测定：将膜对折，依据折痕程度来判断膜的折痕，用0-4作为指标，0表示无折痕，1表示折痕轻微，2表示膜折痕明显，3表示膜对折后部分断裂，4表示膜对折的部分全部断裂。

透光率的测定：将试样裁成一定规格(0.8mm*4.5cm)的长方形，贴入比色皿的内光滑面，在500nm的波长下测定其透射比即透光率，以空比色皿作为对照。每个试样做2个平行。

膜水溶性测定：将膜样(2cm×2cm)在105℃条件下干燥至恒重,称重后根据干、湿重之差计算水分含量.将测定完水分含量的膜放入盛有30mL水的烧杯中,在室温下溶解24h,再将膜在105℃条件下干燥至恒重,称重,根据两次干重之差计算水溶性.

水蒸气透过率测定:取直径3cm、深4cm的圆形敞口塑料杯,加入3g干燥的CaC1₂,将裁切成直径7cm的膜样品,盖住杯口,膜与杯之间的接口用石蜡封住。而后将各杯置于底部加入1000mL的蒸馏水的干燥器中(25℃,相对湿度100％)。每12h称量1次,持续1周。通过杯重的增加量确定水蒸气的透过量。按ASTM方法(E96-93,1993)计算水蒸气转移速率(WVTR)和水蒸气透过率(WVP)。

机械性能测定：将薄膜裁剪成4cm*2cm规格的长条，并固定于物性仪上测定。设置物性仪两夹具的初始距离为20mm，速度为1mm/sec。测定结束后，记录膜拉断瞬间的力(g)和膜断裂时两夹具的距离L。每个试样取三个平行样品测定。

拉伸强度TS(g)：用膜拉断时瞬间的力表示拉伸强度。

断裂伸长率E(％)按下式计算：

E＝(L1－L0)/L0

式中：E—膜的断裂伸长率(％)；

L1—膜断裂时两夹夹具的距离(mm)；

L0—两夹具初始时的距离(mm)。

按照上述方法，对重组MTG处理和未加重组MTG处理制备的乳清蛋白膜性能指标对比如表3：

表3不同处理制备的乳清蛋白膜性能

序列表

<110> 泰兴市东圣生物科技有限公司

<120> 一种热稳定微生物转谷氨酰胺酶及其编码基因

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccgtccg caggcgcggc caccggcagt ggcagtggca gcggcaccgg ggaagagaag 60

ggacaaactc gccactggca gcgacgacct atggtgacga gcgcagctag cggtgacgag 120

gaaagggagg ggtcctacgc cgaaacgcac ggtctgacgg cggaggacgt caacatcaac 180

gcactgaaca aaagggccct gactgcgggt caacctggca attctctgga attgccgccg 240

agcgtcagtg cgctcttccg ggcccccgac gctgccgacg agagggtgac ccctcctgcc 300

gagccgctca accggatgcc tgacgcgtac cgggcctacg gaggcagggc cgagacggtc 360

gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc accgcgacgg caggaagcag 420

cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc 480

aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc 540

aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc 600

cgcgtcgcga aggagcgctt cgacgaggag aagggcttcc agcgggcgcc tgaggtggcg 660

tccttcatca acaggaccct ggagaacgcc cacgcagaga gcgctaacct cgacaacctc 720

aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg aggacgcccg ttccccgttc 780

tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg 840

tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga gcggccagga ccggacgagt 900

tcggccgaca agaggcagta ctgcgacccg gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc 960

ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc ccaccagccc cggtgaggga 1020

ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc gcccagacgg aagcgcacgc cgacaagacc 1080

gtctggaccc acggatatca ctatcacgcg cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc 1140

tacgagagca agttccgcaa ctggtccgag ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat 1200

gtgatcacct tcatccccaa gagctggaac accgcccccg ccgaggtaaa gcagggctgg 1260

ccgtaa 1266

<210> 2

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Pro Ser Ala Gly Ala Ala Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

1 5 10 15

Gly Glu Glu Lys Gly Gln Thr Arg His Trp Gln Arg Arg Pro Met Val

20 25 30

Thr Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Glu

35 40 45

Thr His Gly Leu Thr Ala Glu Asp Val Asn Ile Asn Ala Leu Asn Lys

50 55 60

Arg Ala Leu Thr Ala Gly Gln Pro Gly Asn Ser Leu Glu Leu Pro Pro

65 70 75 80

Ser Val Ser Ala Leu Phe Arg Ala Pro Asp Ala Ala Asp Glu Arg Val

85 90 95

Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asn Arg Met Pro Asp Ala Tyr Arg Ala

100 105 110

Tyr Gly Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp

115 120 125

Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu

130 135 140

Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val

145 150 155 160

Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp

165 170 175

Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly

180 185 190

Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Arg Phe Asp

195 200 205

Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Pro Glu Val Ala Ser Phe Ile Asn

210 215 220

Arg Thr Leu Glu Asn Ala His Ala Glu Ser Ala Asn Leu Asp Asn Leu

225 230 235 240

Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala

245 250 255

Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu

260 265 270

Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr

275 280 285

Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Thr Ser Ser Ala Asp Lys

290 295 300

Arg Gln Tyr Cys Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly

305 310 315 320

Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser

325 330 335

Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln

340 345 350

Thr Glu Ala His Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Tyr His Tyr

355 360 365

His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys

370 375 380

Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr

385 390 395 400

Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Glu Val

405 410 415

Lys Gln Gly Trp Pro

420

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaccggatt ccgacgacag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgccgcagg ccgactctag 20

Claims

1.一种热稳定微生物转谷酰胺酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的热稳定微生物转谷酰胺酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3所述的基因的重组表达载体。

5.权利要求1所述的热稳定微生物转谷酰胺酶在食品加工中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于权利要求1所述的热稳定微生物转谷酰胺酶在制备食品蛋白薄膜中的应用。