JP7098608B2 - Ａｔｐを利用した物質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＡＴＰを利用した新規の物質の製造方法に関する。

グルタチオンは、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸からなるペプチドであり、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物など多くの生体内に存在する。グルタチオンはまた、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸代謝などの機能を有し、生体にとって重要な化合物である。

グルタチオンは、生体内において、Ｌ－システイン残基のチオール基が還元されたＳＨの形態である還元型のグルタチオン（以下、「ＧＳＨ」と称することもある。）、またはＬ－システイン残基のチオール基が酸化され、グルタチオン２分子間でジスルフィド結合を形成した形態である酸化型のグルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」と称することもある。）のいずれかの形態で存在する。

グルタチオンの製造方法としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－システイン、グリシン及び界面活性剤や有機溶媒の存在下、γ－グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を組換え生産させたエシェリヒア・コリやサッカロマイセス・セレビシエの菌体を酵素源として用いる酵素法等が知られている（特許文献１および２）。また、最近において、出願人は、Ｌ－グルタミン酸とＬ－シスチンとから酸化型γ－グルタミルシステインを製造し、続いて、酸化型γ－グルタミルシステインとグリシンとから酸化型グルタチオンを製造する工程を含む、酸化型グルタチオンの製造方法を公開している（特許文献３）。

グルタチオン合成に関わる酵素として、Ｌ－グルタミン酸とＬ－システインとを結合して、γ－グルタミルシステインを生成するγ－グルタミルシステイン合成酵素（以下、「ＧＳＨＩ」と称することもある。）と、γ－グルタミルシステインとグリシンとを結合して、還元型グルタチオンを生成するグルタチオン合成酵素（以下、「ＧＳＨＩＩ」と称することもある。）とが知られている。また、ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩは、それぞれ、Ｌ－シスチン、酸化型γ－グルタミルシステインも基質として利用できることが知られており、この場合、各酵素反応の生成物として、それぞれ、酸化型γ－グルタミルシステイン、酸化型グルタチオンが合成される（特許文献３）。さらに、ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩの両方の機能を併せ持つ二機能性グルタチオン合成酵素（以下、「ＧＳＨＦ」と称することもある。）も知られている（特許文献３）。

特開昭６０－２７３９６号公報 特開昭６０－２７３９７号公報 国際公開第２０１６／００２８８４号公報

ところで、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩ、ＧＳＨＦ等は、その活性のためのエネルギー源としてアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」と称することもある。）を消費する。そのために、グルタチオン製造の反応を維持するためには、ＡＴＰを外部から与えるか、またはＡＴＰの消費産物であるアデノシンニリン酸（以下、「ＡＤＰ」と称することもある。）をＡＴＰへ再変換する必要がある。

ここで、ＡＴＰを外部から与える場合には、高額な費用が発生するため、ＡＤＰをＡＴＰへ再変換するＡＴＰ再生系の利用が検討されている。

ＡＴＰ再生系においてＡＤＰをＡＴＰへ変換する酵素としては、２型ポリリン酸キナーゼが知られており、当該酵素は、メタリン酸等を基質として、ＡＤＰをＡＴＰへ変換する機能を有する。

しかしながら、ＡＴＰ再生系を物質の製造の一工程として包含する製造方法、例えば、酸化型グルタチオンの製造方法では、原料から最終産物（例えば、酸化型グルタチオン）への高い変換率を得るために、ＡＴＰ再生系のさらなる改良が求められていた。

上記の事情に鑑み、本発明の目的は、ＡＴＰを利用した新規の物質の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、高重合度のポリリン酸を含む混合物を２型ポリリン酸キナーゼの基質として用いることにより、酸化型グルタチオンへの高い変換率が得られることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の一態様は、ＡＴＰを利用して物質を製造する方法であって、当該製造方法においてＡＴＰから生成されたＡＤＰに、２型ポリリン酸キナーゼとポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と、当該製造方法とが共役しており、当該製造方法で利用されるＡＴＰは、当該製造方法と共役している当該ＡＴＰ再生反応によって再生されたＡＴＰを含み、当該２型ポリリン酸キナーゼの基質として、重合度１５以上のポリリン酸を４８％以上含むポリリン酸混合物とを用いることを特徴とする物質の製造方法に関する。

本発明の一態様によれば、安価で、かつ、高い変換率で、ＡＴＰを利用した物質の製造を行うことができる。

ポリリン酸混合物の重合度の分析結果を示した図である。 ポリリン酸混合物について、調製後の放置期間の相違による重合度の変動を比較した図である。 酸化型グルタチオンの製造過程における、ポリリン酸混合物の消費の変動を示した図である。

本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更してもよい。同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。

また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。

〔物質の製造方法〕
本発明の一実施形態において、ＡＴＰを利用して物質を製造する方法であって、当該製造方法においてＡＴＰから生成されたＡＤＰに、２型ポリリン酸キナーゼとポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と、当該製造方法とが共役しており、当該製造方法で利用されるＡＴＰは、当該製造方法と共役している当該ＡＴＰ再生反応によって再生されたＡＴＰを含み、当該２型ポリリン酸キナーゼの基質として、重合度１５以上のポリリン酸を４８％以上含むポリリン酸混合物とを用いることを特徴とする物質の製造方法を提供する。

本発明の一実施形態は、ＡＴＰを利用して物質を製造する方法において、２型ポリリン酸キナーゼの基質として、特定の重合度、とりわけ、高重合度のポリリン酸を一定量以上含むポリリン酸の混合物を用いてＡＴＰを再生することにより、高い変換率で、当該ＡＴＰを用いた物質の製造を行うことができることを初めて見出したことに基づく。したがって、本発明の一実施形態では、ＡＴＰ再生反応において高重合度のポリリン酸を一定量以上含むポリリン酸混合物を用いることにより、安価で、かつ、高い変換率で、物質を製造することができる。

以下、本発明の各構成について、詳細に説明する。

＜１．ポリリン酸混合物＞
本発明の一実施形態において、２型ポリリン酸キナーゼと、当該２型ポリリン酸キナーゼの基質として、重合度１５以上のポリリン酸を４８％以上含むポリリン酸混合物とを用いることが好ましい。本発明の一実施形態において、上記のような高重合度のポリリン酸を一定量以上含むポリリン酸混合物を用いることにより、安価で、かつ、高い変換率で、物質を製造することができる。

本明細書において「ポリリン酸」は、リン酸が重合したリン酸のポリマーを意味し、例えば、下記の式１で表される化合物である。

本明細書において「メタリン酸」は、リン酸の鎖状ポリマー構造および環状構造を有する化合物を意味する。「メタリン酸」は、例えば、上記式１で表される化合物（「リン酸の鎖状ポリマー構造」に相当）に加えて、下記の式２で表される化合物（「環状構造」に相当）を有する化合物である。

本明細書において「ポリリン酸混合物」は、上記「ポリリン酸」および「メタリン酸」のいずれか一方、またはその両方が含まれる集合体を意味する。「ポリリン酸混合物」に含まれる「ポリリン酸」および／または「メタリン酸」の比率は、本願発明の効果を奏する限り、特に限定されない。

なお、「ポリリン酸」および「メタリン酸」は混在し得るため、厳密に区別することは難しい。よって、本明細書において「ポリリン酸」および「メタリン酸」は、厳密に区別することなく、「ポリリン酸」と記載したときには「メタリン酸」を含むものとし、「メタリン酸」と記載したときには「ポリリン酸」を含むものとする。

本発明の一実施形態において、ポリリン酸混合物は、重合度１５以上のポリリン酸を４８％以上含み、好ましくは、重合度１５以上のポリリン酸を５０％以上含む。

また、本発明の別の実施形態において、ポリリン酸混合物は、重合度２０以上のポリリン酸を３１％以上含み、好ましくは、重合度２０以上のポリリン酸を３２％以上含む。

さらに、本発明の別の実施形態において、ポリリン酸混合物は、重合度３６以上のポリリン酸を４％以上含み、好ましくは、重合度３６以上のポリリン酸を５％以上含む。

また、本発明の別の実施形態において、ポリリン酸混合物は、重合度４３以上のポリリン酸を２％以上含み、さらに、本発明の別の実施形態において、ポリリン酸混合物は、重合度５０以上のポリリン酸を２％以上含む。

本発明におけるポリリン酸の重合度は、後述の実施例に記載された方法にて測定される。また、上記のような高重合度のポリリン酸を一定量以上含むポリリン酸の混合物は、後述する実施例において、例示している（実施例１、４等参照）。

＜２．２型ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ２）＞
本発明の一実施形態において、２型ポリリン酸キナーゼが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＮＤＫ」とも称する。）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ６３１２株由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「Ｓｙ ＰＰＫ２」とも称する。）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＣＥ ＰＰＫ２」とも称する。）、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＫＲ ＰＰＫ２」とも称する。）、Ｐａｎｎｏｎｉｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｃｕｓ由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＩ ＰＰＫ２」とも称する。）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ Ｋ１株由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＤＲ ＰＰＫ２」とも称する。）、Ｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ ｉｎｄｉｃａ由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＧＩ ＰＰＫ２」とも称する。）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＡＡ ＰＰＫ２」とも称する。）、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ２５２５９株由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＴＤ ＰＰＫ２」とも称する。）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＦ ＰＰＫ２」とも称する。）からなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする、物質の製造方法を提供する。

ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ」と称することもある。）は、可逆反応を行う２種類の酵素（１型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ１」と称することもある。）および２型ポリリン酸キナーゼ（以下、「ＰＰＫ２」と称することもある。））に分類される。ＰＰＫ１は、ＡＴＰをＡＤＰとポリリン酸（以下、「ＰｏｌｙＰ」と称することもある。）に分解する反応が優位であり、ＰＰＫ２は、ＡＤＰとＰｏｌｙＰとを結合してＡＴＰを生成する反応が優位であることが知られている。

ＰＰＫ２は、さらに、触媒反応の観点から、３つのクラスに分類される。クラスＩのＰＰＫ２は、ＡＤＰとＰｏｌｙＰとを結合してＡＴＰを生成する反応を触媒するものであり、ＰＮＤＫ等が例示される。また、クラスＩＩのＰＰＫ２は、アデノシン一リン酸（以下、「ＡＭＰ」と称することもある。）とＰｏｌｙＰとを結合してＡＴＰを生成する反応を触媒するものであり、ポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）等が例示される。さらに、クラスＩＩＩのＰＰＫ２は、上記クラスＩおよびクラスＩＩの２つの反応を触媒する二機能性を有する酵素であり、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ由来ＰＰＫ２等が例示される。

本願発明者らは、新規のＰＰＫ２を探索する目的で鋭意検討を行った結果、ＡＤＰとＰｏｌｙＰとを結合してＡＴＰに変換する活性を有する、クラスＩまたはクラスＩＩＩに分類される８種類の新規ＰＰＫ２の同定に成功した。したがって、従来から知られているＰＰＫ２およびＤＲ ＰＰＫ２に加えて、これらの８種類のＰＰＫ２を適宜選択して、ＡＴＰ再生反応を触媒することができる。

なお、本発明の一実施形態において、２型ポリリン酸キナーゼとして、従来から知られているＰＰＫ２を選択し得ることは言うまでもない。

上記のＰＰＫ２（すなわち、ＰＮＤＫ、ＤＲ ＰＰＫ２および８種類の新規ＰＰＫ２）について、以下で詳細に説明する。

ＰＮＤＫは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長３５７アミノ酸残基から構成される（配列番号１）。

Ｓｙ ＰＰＫ２は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ６３１２株由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長２９６アミノ酸残基から構成される（配列番号２）。

ＣＥ ＰＰＫ２は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長３５１アミノ酸残基から構成される（配列番号３）。

ＫＲ ＰＰＫ２は、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長２９６アミノ酸残基から構成される（配列番号４）。

ＰＩ ＰＰＫ２は、Ｐａｎｎｏｎｉｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｃｕｓ由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長３６７アミノ酸残基から構成される（配列番号５）。

ＤＲ ＰＰＫ２は、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ Ｋ１株由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長２６６アミノ酸残基から構成される（配列番号６）。

ＧＩ ＰＰＫ２は、Ｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ ｉｎｄｉｃａ由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長３５０アミノ酸残基から構成される（配列番号７）。

ＡＡ ＰＰＫ２は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長３１４アミノ酸残基から構成される（配列番号８）。

ＴＤ ＰＰＫ２は、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ２５２５９株由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長２６９アミノ酸残基から構成される（配列番号９）。

ＰＦ ＰＰＫ２は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の２型ポリリン酸キナーゼであり、全長３６２アミノ酸残基から構成される（配列番号１０）。

上記１０種類のＰＰＫ２について、大腸菌での発現のためにコドン最適化した塩基配列は、以下の通りである：ＰＮＤＫ（配列番号１１）、Ｓｙ ＰＰＫ２（配列番号１２）、ＣＥ ＰＰＫ２（配列番号１３）、ＫＲ ＰＰＫ２（配列番号１４）、ＰＩ ＰＰＫ２（配列番号１５）、ＤＲ ＰＰＫ２（配列番号１６）、ＧＩ ＰＰＫ２（配列番号１７）、ＡＡ ＰＰＫ２（配列番号１８）、ＴＤ ＰＰＫ２（配列番号１９）、およびＰＦ ＰＰＫ２（配列番号２０）。

ＰＮＤＫは、３７℃の至適温度を有するため（Motomura et al., Applied and Environmental Microbiology, volume 80, number 8, 2602-2608, 2014）、ＰＮＤＫを用いると、比較的低い温度（すなわち、穏やかな条件下）で反応を行うことができる。したがって、この観点から、本発明の一実施形態におけるＰＰＫ２として、ＰＮＤＫが好ましい。

また、上述のとおり、ＰＮＤＫは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来するＰＰＫ２である。したがって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に分類される微生物種由来のＰＰＫ２であれば、上述したＰＮＤＫと同様の利点を有し得る。したがって、本発明の一実施形態におけるＰＰＫ２として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に分類される微生物種由来のＰＰＫ２が好ましい。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に分類される微生物種として、上述したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの他に、例えば、以下の種が挙げられる：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｋ－９、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａｎ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌａｎｔａｒｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｕｂｒｉｓｕｂａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｌｅｒｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔａｅｎｉｏｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎａｕｔｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｉｎｅｒｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒａｄｉｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｏｄｏｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｏｕｄｏｒｏｆｆｉｉ、Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂａｌｅａｒｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ｓｕｂｓｐ． ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｍｏｒｉｃｏｌｏｒａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｓｓａｒｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｉｎｄｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｉａｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｉｎｊｕｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｉｇｕｌａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｆｕｌｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｖｏｎａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒｉａｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｃｙａｎｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｙｏｔｏｍｉｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｃｈｉｎｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ。

本発明の一実施形態において、ＰＰＫ２は、ＰＰＫ２活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いても良いし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いても良いし、前記細胞から分離され精製されたタンパク質の形態で用いても良い。ここでＰＰＫ２活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であっても良い。ＰＰＫ２活性を有する細胞の凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物であっても良く、さらにポリペプチド自体あるいは菌体のまま固定化されていても良い。
好ましくは、ＰＰＫ２活性を有する生細胞を用いない。より好ましくはＰＰＫ２活性を有する生細胞および損傷していない死滅細胞を用いない。

本発明の一実施形態において、上記１０種類のＰＰＫ２は、（ａ）配列番号１～１０に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、ＰＰＫ２活性を有するタンパク質であってもよい。

上記（ａ）のタンパク質は、配列番号１～１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、ＰＰＫ２活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。ここで欠失、置換または付加されてもよいアミノ酸の数は、上記機能を失わせない限り、限定されてないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって欠失、置換または付加できる程度の数をいい、好ましくは５アミノ酸以内であり、より好ましくは３アミノ酸以内（例えば、３、２または１アミノ酸）である。また、明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。

置換されるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されていることが好ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。さらに、変異後のアミノ酸残基は、共通した性質をできるだけ多く有するアミノ酸残基に変異していることがより好ましい。

本明細書において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、目的とするタンパク質と同等（同一および／または類似）の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれ得る。変異を導入したタンパク質が所望の機能を有するかどうかは、そのタンパク質をコードする遺伝子を導入発現させた形質転換体を取得し、この形質転換体が、ＡＤＰおよびＰｏｌｙＰからＡＴＰを生成し得るかどうかを調べることにより判断できる。

本発明の一実施形態において、上記１０種類のＰＰＫ２は、（ｂ）配列番号１～１０に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、ＰＰＫ２活性を有するタンパク質であってもよい。

上記（ｂ）のタンパク質も、配列番号１～１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、ＰＰＫ２活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。

アミノ酸配列の相同性とは、アミノ酸配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol.、215: 403-410、1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:2264-2268、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90: 5873-5877、1993）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402、1997）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。

本明細書において「相同性」とは、性質が類似のアミノ酸残基数の割合（ｈｏｍｏｌｏｇｙ、ｐｏｓｉｔｉｖｅ等）を意図しているが、より好ましくは、同一のアミノ酸残基数の割合、すなわち同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）である。なお、アミノ酸の性質については上述したとおりである。

本発明の一実施形態において、上記１０種類のＰＰＫ２は、（ｃ）配列番号１１～２０に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質であってもよい。

上記（ｃ）のタンパク質について、配列番号１１～２０は、それぞれ配列番号１～１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を示す。

また、本発明の一実施形態において、上記１０種類のＰＰＫ２は、（ｃ）配列番号１１～２０に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質において、その塩基配列が宿主細胞内での発現向上等の目的のために、適宜改変されたものであってもよい。ＰＰＫ２の宿主細胞内での発現を向上させる目的で、Ｎ末端側が切断されたものであってもよいし、あるいはそれ以外の任意の箇所で切断されたものであってもよい。また、同様の目的で、コドンを最適化したものであってもよい。

塩基配列の改変の一例としては、後述の実施例３に示されるように、野生型ＰＮＤＫのＮ末端側８１アミノ酸を切断し、８２番目のアラニンを開始コドンであるメチオニンに置換する改変等が挙げられる。また、後述の実施例２に示されるように、天然のＰＦ ＰＰＫ２からアミノ酸のＮ末端側１～８５を除去し、Ｐ８６Ｍ変異を導入する改変や、Ｎ末端側１～８６を除去し、Ｇ８７Ｍ変異を導入する改変等が挙げられる。

上記遺伝子・タンパク質を得る方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法を用いてもよい。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Clontech）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Stratagene）等）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。

また、上記遺伝子は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもよい。付加される塩基配列としては、特に限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）、プロモーター配列、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。

＜３．ＰＰＫ２遺伝子＞
本発明の一実施形態において、上記タンパク質をコードするＰＰＫ２遺伝子を提供する。

ＰＰＫ２遺伝子は、天然の配列からなるヌクレオチドであっても、人工的に改変された配列からなるヌクレオチドであってもよいが、発現させる宿主（例えば、大腸菌）においてコドン最適化された配列からなるヌクレオチドであることが好ましい。

＜４．ベクター＞
本発明の一実施形態において、＜３．ＰＰＫ２遺伝子＞の項に記載の遺伝子を含むベクターを提供する。本ベクターとしては、形質転換体作製のために宿主細胞内で、上記遺伝子を発現させるための発現ベクターのほか、組換えタンパク質の生産に用いるものも含まれる。

上記ベクターの母体となる基材ベクターとしては、一般的に使用される種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージまたはコスミド等を用いることができ、導入される細胞または導入方法に応じて適宜選択できる。つまり、ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。宿主細胞の種類に応じて、確実に上記遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記遺伝子とを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメントおよびウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルス））ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）を利用可能である。

細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０およびｐＱＥ９（Qiagenから入手可能）；ｐＴｉｐＱＣ１（Qiagenまたは北海道システムサイエンスから入手可能）、ｐＴｉｐＲＴ２（北海道システムサイエンスから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８ＡおよびｐＮＨ４６Ａ（Stratageneから入手可能）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（Addgeneから入手可能）；ｐＲＳＦ（MERCKから入手可能）；ならびにｐＡＣ（（株）ニッポンジーンから入手可能）が含まれる。特に、大腸菌の場合には、例えば、ｐＵＣＮ１８（ｐＵＣ１８（株）タカラバイオから入手可能）を改変して作製可能）、ｐＳＴＶ２８（（株）タカラバイオから入手可能）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号公報）などが挙げられる。

また、上記遺伝子のインサートは、適切なプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。他の適切なプロモーターとしては、当業者に知られたものを利用可能であり、特に限定されないが、例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇａｐプロモーター、ＯｍｐＡプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。

上記ベクターは、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。ベクター構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。

ベクターが導入される宿主としては、特に限定されないが、各種細胞を好適に用いることができる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞等が挙げられ、特に大腸菌が好ましい。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で公知ものを利用可能である。

上記ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入または感染等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このような方法は、DavisらによるBasic Methods In Molecular Biology (1986)のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。

＜５．形質転換体＞
本発明の一実施形態において、＜３．遺伝子＞の項に記載の遺伝子または＜４．ベクター＞の項に記載の組換えベクターを含む形質転換体を提供する。ここで、「遺伝子またはベクターを含む」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されていることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。

本形質転換体の作製方法（生産方法）としては、上述したベクターを形質転換する方法が挙げられる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種生物を挙げることができる。

本発明の一実施形態において使用される宿主細胞としては、導入した遺伝子またはベクターに含まれる遺伝子にコードされるタンパク質が発現可能な細胞であれば、特段限定されない。宿主細胞として利用可能な微生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等の放線菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母、ノイロスプラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等のカビが挙げられる。また、微生物以外でも、植物細胞、動物細胞等が宿主細胞として利用し得る。これらの中でも、導入および発現効率の観点から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。

〔ＡＴＰを利用した物質の製造〕
本発明の一実施形態において、ＡＴＰを利用した物質の製造は、ＡＴＰ由来のエネルギーを消費して物質を製造する方法であれば特段限定されない。ＡＴＰを利用した物質の製造としては、例えば、酸化型グルタチオンの製造、還元型グルタチオンの製造、Ｓ－アデノシルメチオニンの製造、糖リン酸の製造、アセチルＣｏＡの製造、プロパノイルＣｏＡの製造、オキシルシフェリンの製造、グアノシン３’－二リン酸５’－三リン酸の製造、５－ホスホリボシル１－ピロリン酸の製造、アシル－ＣｏＡの製造、ビオチン－ＣｏＡの製造、アミノアシル－ｔＲＮＡの製造、環状ＲＮＡの製造、Ｌ－アスパラギンの製造、Ｌ－アスパラギン酸の製造、糖ヌクレオチドの製造、３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸の製造等が挙げられる。当業者であれば、ＡＴＰを利用して物質を生成する酵素反応に関して、例えば、ＫＥＧＧ（http://www.genome.jp/kegg/）を検索することによって、上述した以外の反応も容易に理解することができる。

以下、ＡＴＰを利用した物質の製造の代表例として、＜１．酸化型グルタチオンの製造方法＞および＜２．還元型グルタチオンの製造方法＞について説明する。

＜１．酸化型グルタチオンの製造方法＞
本発明の一実施形態において、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする、物質の製造方法を提供する。：
（１）Ｌ－グルタミン酸とＬ－シスチンとを反応させて、酸化型γ－グルタミルシステインを製造する工程、および
（２）上記（１）で得られた酸化型γ－グルタミルシステインとグリシンとを反応させて、酸化型グルタチオンを製造する工程。

本発明の一実施形態における酸化型グルタチオンの製造方法は、国際公開第２０１６／００２８８４号公報に記載された方法であることが好ましい。

本発明の一実施形態において、上記工程（１）は、例えば、以下の式により表される。

上記工程（１）では、ＧＳＨＩとＡＴＰとの存在下で、Ｌ－シスチンとＬ－グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ－グルタミルシステインを生成することを特徴とする。

上記工程（１）で用いられるＧＳＨＩは、上記の活性を有する限り特に限定されない。ＧＳＨＩの起源は、特に限定されず、微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨＩが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌、好熱菌・耐熱菌、好冷菌・耐冷菌、好酸菌・耐酸菌、好塩基菌・耐塩基菌、メチロトローフ、ハロゲン耐性菌、硫黄細菌、放射能耐性菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨＩが好ましい。

また、本発明の一実施形態において、上記工程（２）は、例えば、以下の式により表される。

一方、上記工程（２）では、ＧＳＨＩＩとＡＴＰとの存在下で、酸化型γ－グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより酸化型グルタチオンを生成することを特徴とする。

上記工程（２）で用いられるＧＳＨＩＩは、上記の活性を有する限り特に限定されない。ＧＳＨＩＩの起源は、特に限定されず、微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨＩＩが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌、好熱菌・耐熱菌、好冷菌・耐冷菌、好酸菌・耐酸菌、好塩基菌・耐塩基菌、メチロトローフ、ハロゲン耐性菌、硫黄細菌、放射能耐性菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨＩＩが好ましい。

本発明の一実施形態において、上記ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩのどちらか一方、または両方の代わりに、ＧＳＨＦを用いてもよい。ＧＳＨＦは、ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩの二つの酵素が有する機能を併せ持った二機能性のグルタチオン合成酵素であり、ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩの代替として利用できる限り、特段限定されない。ＧＳＨＦの起源は、特に限定されず、微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨＦが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌、好熱菌・耐熱菌、好冷菌・耐冷菌、好酸菌・耐酸菌、好塩基菌・耐塩基菌、メチロトローフ、ハロゲン耐性菌、硫黄細菌、放射能耐性菌、乳酸菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨＦが好ましい。さらに、例えば、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）等のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；ラクトバシルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）等のラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌；デスルフォタレア・サイクロフィラ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）等のデスルフォタレア（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）属細菌；クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・イタリカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ）等のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）等のパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属細菌；マンハイミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｅｃｅｎｓ）等のマンハイミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌；及び、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）等のヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌；アクチノバチルス・スクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・リュウロニュウモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）等のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌からなる群から選択される少なくとも１種に由来するＧＳＨＦが好ましい。

本発明の一実施形態において、上記１０種類のＰＰＫ２は、γ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）および二機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＦ）からなる群より選択される少なくとも一つと共役して機能することを特徴とする。

上記１０種類のＰＰＫ２と、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩおよびＧＳＨＦからなる群より選択される少なくとも一つとの組み合わせは、高変換率で酸化型グルタチオンが製造できる限り特に限定されず、任意の組み合わせを用いることができる。また、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩおよびＧＳＨＦのそれぞれと組み合わせるＰＰＫ２は、異なった種類のものであってもよく、同じ種類のものであってもよい。

本発明の一実施形態において、ＰＰＫ２、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩおよびＧＳＨＦは、それぞれの酵素活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、上記それぞれの酵素が細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の粉砕物の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。好ましくは、ＰＰＫ２活性を有する生細胞を用いない。より好ましくはＰＰＫ２活性を有する生細胞および損傷していない死滅細胞を用いない。

本発明の一実施形態において、ポリリン酸混合物は、酸化型グルタチオンへの変換率の観点から、工程（１）および（２）の両方の工程において用いられる（すなわち、添加される）ことが好ましいが、工程（１）および（２）のいずれか一方の工程のみで用いられてもよい。

＜２．還元型グルタチオンの製造方法＞
本発明の一実施形態において、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする、物質の製造方法を提供する。：
（１）Ｌ－グルタミン酸とＬ－システインとを反応させて、γ－グルタミルシステインを製造する工程、および
（２）上記（１）で得られたγ－グルタミルシステインとグリシンとを反応させて、還元型グルタチオンを製造する工程。

本発明の一実施形態における還元型グルタチオンの製造方法は、ＷＯ２０１６／０１７６３１に記載された方法であることが好ましい。ＷＯ２０１６／０１７６３１には、還元型グルタチオンの酸化を防ぐために窒素雰囲気下で反応することが記載されているが、還元型グルタチオンの製造は、窒素雰囲気下の反応に限定されない。

本発明の一実施形態において、上記工程（１）は、例えば、以下の式により表される。

上記工程（１）では、ＧＳＨＩとＡＴＰとの存在下で、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを反応させることによりγ－グルタミルシステインを生成することを特徴とする。

上記工程（１）で用いられるＧＳＨＩは、上記の活性を有する限り特に限定されない。ＧＳＨＩの起源は、特に限定されず、微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨＩが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨＩが好ましい。

また、本発明の一実施形態において、上記工程（２）は、例えば、以下の式により表される。

一方、上記工程（２）では、ＧＳＨＩＩとＡＴＰとの存在下で、γ－グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより還元型グルタチオンを生成することを特徴とする。

上記工程（２）で用いられるＧＳＨＩＩは、上記の活性を有する限り特に限定されない。ＧＳＨＩＩの起源は、特に限定されず、微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨＩＩが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨＩＩが好ましい。

本発明の一実施形態において、上記ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩのどちらか一方、または両方の代わりに、ＧＳＨＦを用いてもよい。ＧＳＨＦの機能、由来等については、＜１．酸化型グルタチオンの製造方法＞で記載したものと同様である。

本発明の一実施形態において、上記１０種類のＰＰＫ２は、γ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）および二機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨＦ）からなる群より選択される少なくとも一つと共役して機能することを特徴とする。

上記１０種類のＰＰＫ２と、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩおよびＧＳＨＦからなる群より選択される少なくとも一つとの組み合わせは、高変換率で還元型グルタチオンが製造できる限り特に限定されず、任意の組み合わせを用いることができる。また、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩおよびＧＳＨＦのそれぞれと組み合わせるＰＰＫ２は、異なった種類のものであってもよく、同じ種類のものであってもよい。

本発明の一実施形態において、ＰＰＫ２、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩおよびＧＳＨＦは、それぞれの酵素活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、上記それぞれの酵素が細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の粉砕物の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。好ましくは、ＰＰＫ２活性を有する生細胞を用いない。より好ましくはＰＰＫ２活性を有する生細胞および損傷していない死滅細胞を用いない。

本発明の一実施形態において、ポリリン酸混合物は、還元型グルタチオンへの変換率の観点から、工程（１）および（２）の両方の工程において用いられる（すなわち、添加される）ことが好ましいが、工程（１）および（２）のいずれか一方の工程のみで用いられてもよい。

すなわち、本発明の一態様は、以下の発明を包含する。

〔１〕ＡＴＰを利用して物質を製造する方法であって、当該製造方法においてＡＴＰから生成されたＡＤＰに、２型ポリリン酸キナーゼとポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と、当該製造方法とが共役しており、当該製造方法で利用されるＡＴＰは、当該製造方法と共役している当該ＡＴＰ再生反応によって再生されたＡＴＰを含み、当該２型ポリリン酸キナーゼの基質として、重合度１５以上のポリリン酸を４８％以上含むポリリン酸混合物とを用いることを特徴とする物質の製造方法。

〔２〕上記ポリリン酸混合物が、重合度１５以上のポリリン酸を５０％以上含むことを特徴とする、〔１〕に記載の物質の製造方法。

〔３〕上記２型ポリリン酸キナーゼが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来２型ポリリン酸キナーゼ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ６３１２株由来２型ポリリン酸キナーゼ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来２型ポリリン酸キナーゼ、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来２型ポリリン酸キナーゼ、Ｐａｎｎｏｎｉｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｃｕｓ由来２型ポリリン酸キナーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ Ｋ１株由来２型ポリリン酸キナーゼ、Ｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ ｉｎｄｉｃａ由来２型ポリリン酸キナーゼ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１由来２型ポリリン酸キナーゼ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ２５２５９株由来２型ポリリン酸キナーゼ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来２型ポリリン酸キナーゼからなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の物質の製造方法。

〔４〕上記２型ポリリン酸キナーゼが、γ－グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素および二機能性グルタチオン合成酵素からなる群より選択される少なくとも一つと共役して機能することを特徴とする、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の物質の製造方法。

〔５〕上記物質の製造方法が、酸化型グルタチオンの製造方法または還元型グルタチオンの製造方法であることを特徴とする、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の物質の製造方法。

〔６〕上記物質の製造方法が、酸化型グルタチオンの製造方法であり、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする、〔５〕に記載の物質の製造方法：
（１）Ｌ－グルタミン酸とＬ－シスチンとを反応させて、酸化型γ－グルタミルシステインを製造する工程、および
（２）上記（１）で得られた酸化型γ－グルタミルシステインとグリシンとを反応させて、酸化型グルタチオンを製造する工程。

その他、上記の各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できることを付言する。また、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。

〔参考例１〕ポリリン酸キナーゼ用発現ベクターの構築
国際公開第２００６／０８０３１３号公報に記載の情報に基づき、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ポリリン酸キナーゼ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０２３１０９５２９）（アミノ酸配列：配列番号１、塩基配列：配列番号１１）のＮ末端側８１アミノ酸を切断し、８２番目のアラニンを開始コドンであるメチオニンに置換したポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌宿主に対応するようコドン最適化した遺伝子配列の５’端にＮｄｅＩサイト、３’端にＥｃｏＲＩサイトを付加した配列をユーロフィンジェノミクス社にて化学合成した。この遺伝子をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＰＰＫを構築した。

〔参考例２〕ポリリン酸キナーゼを発現する組換え生物の作製
参考例１で構築した組換えベクターｐＰＰＫを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＰＰＫ）を得た。また、ｐＵＣＮ１８を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。

〔参考例３〕組換え生物におけるポリリン酸キナーゼ遺伝子の発現
参考例２で得た２種類の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＰＰＫ）を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、５ｍｌの２×ＹＴ培地（１．６％ トリプトン、１．０％ イーストエキス、０．５％ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。上記の培養で得られたそれぞれの培養液について、遠心分離により菌体を集め、１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。

これらの無細胞抽出液を用いて、ポリリン酸キナーゼ活性を測定した。ポリリン酸キナーゼ活性は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に、５ｍＭ メタリン酸ナトリウム（和光純薬社製）、１０ｍＭ ＡＤＰ二ナトリウム塩（オリエンタル酵母社製）、７０ｍＭ 硫酸マグネシウム（和光純薬社製）、および無細胞抽出液を添加して、３０℃で５分間反応を行い、生成したＡＴＰをＨＰＬＣ分析により定量した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＡＴＰを生成する酵素活性を１Ｕと定義した。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）については、ＡＴＰ生成活性は、５Ｕ／ｍＬ以下であった。

〔参考例４〕ポリリン酸キナーゼの調製
参考例２で取得したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＰＰＫ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、５０ｍｌの２×ＹＴ培地（１．６％ トリプトン、１．０％ イーストエキス、０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。参考例３に記載の方法で酵素活性を測定すると、酵素活性は、１２０Ｕ／ｍＬであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕したものを酵素液とした。

〔製造例１〕酸化型グルタチオンの製造
（Ａ）Ｌ－グルタミン酸とＬ－シスチンとから酸化型γ－グルタミルシステインを製造する工程、および（Ｂ）酸化型γ－グルタミルシステインとグリシンとから酸化型グルタチオンを製造する工程の２段階の工程により、酸化型グルタチオンの製造を行った（国際公開第２０１６／００２８８４号公報の＜実施例１＞に記載された方法を一部改変した方法により、酸化型γ－グルタミルシステインの製造を行った。）。

＜工程（Ａ）＞
０．３６２９ｇのＬ－グルタミン酸Ｎａ１水和物（２．１５ｍｍｏｌ）、０．３１１３ｇのＬ－シスチン２塩酸塩（０．９９ｍｍｏｌ）、０．７０７９ｇの硫酸マグネシウム７水和物、０．０５８３ｇのＡＴＰ（０．１１ｍｍｏｌ）、０．８ｇのメタリン酸Ｎａ、１２ｇの蒸留水を混合し、０．８ｇの１５重量％ 水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．５に調整した。その溶液に、２ｇの大腸菌Ｋ１２株由来γ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）酵素液、および反応液中の総ＰＰＫ２活性が２０Ｕ／ｍＬとなるようにポリリン酸キナーゼ酵素液を添加し、反応を開始した。反応温度は３０℃で、６～８時間の反応を行なった。

なお、上記ＧＳＨＩ酵素液の調製は、それぞれ、国際公開第２０１６／００２８８４号公報の実験１および実験４に基づいて行った。

また、上記ポリリン酸キナーゼ酵素液は、参考例１～４と同様の方法により調製した。

＜工程（Ｂ）＞
続いて、上記反応液に、０．１９ｇのグリシン（２．５３ｍｍｏｌ）、２ｇのグルタチオン合成酵素液、既定量のポリリン酸キナーゼ酵素液、０．２１ｇの硫酸マグネシウム７水和物、０．０４ｇのＡＴＰ、０．９２ｇのメタリン酸Ｎａ水溶液（３６．２ｗｔ％）を添加し、反応を開始した。この際、１．１ｇの１５重量％ 水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．５に調整した。反応温度は３０℃で、８時間の反応を行なった。その後、反応を停止させ、反応液を分析した。

なお、上記ＧＳＨＩＩは、特願２０１６－２１４０７３に記載の改変型グルタチオン合成酵素（Ｖ２６０Ａ）を用いた。

また、上記ポリリン酸キナーゼ酵素液は、参考例１～４と同様の方法により調製した。

〔実施例１〕ポリリン酸混合物を用いた酸化型グルタチオンの製造
ＡＴＰ再生系において２型ポリリン酸キナーゼの基質となるポリリン酸混合物を複数調製して、酸化型グルタチオンの製造を行った。ポリリン酸混合物の調製は、当該技術分野における通常の方法に基づいてポリリン酸の合成を行い、それを混合することによって行った。また、酸化型グルタチオンの製造は、製造例１の方法に基づいて行った。

その結果、特定のポリリン酸混合物を用いた場合に、酸化型グルタチオンの変換率が高まることが見出された。

そこで、酸化型グルタチオンへの変換効率が高かったポリリン酸混合物について、ポリリン酸の重合度の分析を行った。分析条件は、以下に示す。

＜分析条件＞
・イオンクロマトグラフ
・機種：サーモフィッシャーサイエンティフィック製ＩＣＳ－２１００
・カラム：ＩｏｎＰａｃ ＡＧ１１，ＡＳ１１（４ｍｍ×２５０ｍｍ）
・溶離液：ＫＯＨグラジエント
・溶離液流量：１．０ｍＬ／分
・試料注入量：２５μＬ
・カラム温度：３５℃
・検出器：電気伝導度検出器
各重合度の含量の算出は、全ピークの面積の和を１００％とし、各ピークの面積の割合を算出することにより行った。

その結果、ポリリン酸混合物内の高重合度のポリリン酸の分布は、以下の通りであった（図１参照）。
・重合度１５以上のポリリン酸が４８％以上。
・重合度２０以上のポリリン酸が３１％以上。
・重合度３６以上のポリリン酸が４％以上。
・重合度４３以上のポリリン酸が２％以上。
・重合度５０以上のポリリン酸が２％以上。

したがって、このような高重合度のポリリン酸を一定量以上含むポリリン酸の混合物をＰＰＫ２によるＡＴＰ再生系の基質として使用した場合に、高い変換率で、酸化型グルタチオンを製造できることが明らかとなった。

〔実施例２〕新規ポリリン酸キナーゼの酵素活性
データベース検索の結果、ポリリン酸キナーゼ活性を有すると推定される以下の８種類のポリリン酸キナーゼおよび既知のＤＲ ＰＰＫ２について、参考例１～４と同様の方法によりポリリン酸キナーゼ酵素液を調製し、参考例３と同様の方法により酵素活性を測定した。
・Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ６３１２由来ＰＰＫ２（Ｓｙ ＰＰＫ２）：配列番号２
・Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来ＰＰＫ２（ＣＥ ＰＰＫ２）：配列番号３
・Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来ＰＰＫ２（ＫＲ ＰＰＫ２）：配列番号４
・Ｐａｎｎｏｎｉｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｃｕｓ由来ＰＰＫ２（ＰＩ ＰＰＫ２）：配列番号５
・Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ Ｋ１株由来ＰＰＫ２（ＤＲ ＰＰＫ２）：配列番号６
・Ｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ ｉｎｄｉｃａ由来ＰＰＫ２（ＧＩ ＰＰＫ２）：配列番号７
・Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１由来ＰＰＫ２（ＡＡ ＰＰＫ２）：配列番号８
・Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ２５２５９株由来ＰＰＫ２（ＴＤ ＰＰＫ２）：配列番号９
・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来ＰＰＫ２（ＰＦ ＰＰＫ２）（天然のＰＦ ＰＰＫ２（配列番号１０）からアミノ酸のＮ末端側１～８５を除去し、Ｐ８６Ｍ変異を導入したもの、および、Ｎ末端側１～８６を除去し、Ｇ８７Ｍ変異を導入したものを使用。）
その結果、上記８種類の新規ポリリン酸キナーゼのすべてが、酵素活性を有することが明らかとなった。また、既知のＤＲ ＰＰＫ２についても酵素活性を有することが確認された。

ＰＩ ＰＰＫ２の酵素活性は、１３８Ｕ／ｍＬであり、ＰＮＤＫ（１２０Ｕ／ｍＬ（参考例４参照））と比較して、高いことが明らかとなった。

なお、上記と同様の実験を、調製後１３日間室温で放置したポリリン酸混合物溶液を用いて行った場合、調製後すぐのポリリン酸混合物溶液を用いて行った場合（これを１００％とすると）と比較して、７３％のＰＩ ＰＰＫ２酵素活性を示した。

〔実施例３〕種々のポリリン酸混合物を用いた酸化型グルタチオンの製造
製造例１の方法に基づいて、酸化型グルタチオンの製造を行った。

ポリリン酸キナーゼは、以下の３種類のポリリン酸キナーゼを使用した（工程（Ａ）および工程（Ｂ）間で同種類の酵素を使用）。
・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ＰＰＫ２（ＰＮＤＫ）（野生型ＰＮＤＫ（配列番号１）のＮ末端側８１アミノ酸を切断し、８２番目のアラニンを開始コドンであるメチオニンに置換したタンパク質を使用）
・Ｐａｎｎｏｎｉｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｃｕｓ由来ＰＰＫ２（ＰＩ ＰＰＫ２）
・Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ６３１２株由来ＰＰＫ２（Ｓｙ ＰＰＫ２）
また、ＰＮＤＫ、ＰＩ ＰＰＫ２およびＳｙ ＰＰＫ２の各々について、以下の表１に示す条件で、実験を行った。反応液中の酵素活性は、培養液あたりの酵素活性に基づいて、培養液（菌体）を一定量添加することにより調整した。

工程（Ｂ）におけるポリリン酸キナーゼ酵素液の添加量は、反応液中のＰＰＫ２活性が表２に記載したものとなる量とした。

上記に基づいて、酸化型グルタチオンの製造を行った結果を、以下の表３に示す。

上記結果より、いずれのポリリン酸キナーゼを用いた場合も、保存期間が長いメタリン酸水溶液を用いると、酸化型グルタチオンへの変換率が低減することが分かった（ＰＮＤＫ：実験Ａと実験Ｂとの比較、ＰＩ ＰＰＫ２：実験Ｃ～Ｆと実験Ｇ～Ｈとの比較、Ｓｙ ＰＰＫ２：実験Ｉと実験Ｊとの比較）。

すなわち、保存期間が短いメタリン酸水溶液を用いた場合に比べて、保存期間が長いメタリン酸水溶液を用いた場合は、反応液中のＰＰＫ２酵素活性が高かったにもかかわらず、酸化型グルタチオンへの変換率は低い結果となった（ＰＮＤＫ：実験Ａと実験Ｂとの比較、ＰＩ ＰＰＫ２：実験Ｆと実験Ｇとの比較、Ｓｙ ＰＰＫ２：実験Ｉと実験Ｊとの比較）。これは、実験Ｂ、Ｇ、Ｊにおいて、反応系中のＰＰＫ２活性は十分であったが、ポリリン酸キナーゼの基質となるメタリン酸が、保存期間中に分解され不足したためであると推察される。

〔実施例４〕ポリリン酸混合物の組成（重合度）の変動（１）
実施例３の結果を受けて、保存期間によりポリリン酸混合物の組成が変化していることを調べるために、以下の実験を行った。

具体的には、メタリン酸Ｎａに水を添加して、５０ｗ／ｖ％のメタリン酸Ｎａをサンプル１として調製した。サンプル１を調製してから１３日後に、別途、５０ｗ／ｖ％のメタリン酸Ｎａを調製した（サンプル２）。サンプル２を調製した日に、サンプル１およびサンプル２に含まれるメタリン酸の重合度について分析を行った。分析条件は以下の通りである。

＜分析条件＞
・イオンクロマトグラフ
・機種：サーモフィッシャーサイエンティフィック製ＩＣＳ－２１００
・カラム：ＩｏｎＰａｃ ＡＧ１１，ＡＳ１１（４ｍｍ×２５０ｍｍ）
・溶離液：ＫＯＨグラジエント
・溶離液流量：１．０ｍＬ／分
・試料注入量：２５μＬ
・カラム温度：３５℃
・検出器：電気伝導度検出器
結果を図２に示す。図２から明らかなように、調製後に１３日間放置したサンプル１は、調製後すぐに分析を行ったサンプル２に比べて、高重合度のメタリン酸が減少していた。この結果から、メタリン酸の水溶液を常温で放置しておくと、高重合度のものから分解されることが明らかとなった。

また、本結果および実施例３の結果を併せると、ポリリン酸キナーゼによって効率的にＡＤＰからＡＴＰへの変換反応を行うためには、ポリリン酸キナーゼの酵素活性が十分であることだけでなく、その基質となるメタリン酸が適切な状態である（すなわち、高重合度のメタリン酸が存在する）ことが必要であることが示唆される。

〔実施例５〕ポリリン酸混合物の組成（重合度）の変動（２）
酸化型グルタチオンの製造過程において、ポリリン酸混合物の組成（重合度）が変動していることを調べるために、以下の実験を行った。

具体的には、実施例３の実験Ｇと同様の実験を行い、工程（ａ）および工程（ｂ）のそれぞれの工程の完了直後の反応液を回収し、含まれるポリリン酸の組成（重合度）を調べた。組成（重合度）の分析は、実施例４に記載の方法に基づいて行った。

また、ＰＰＫ２による消費前の（使用前の）ポリリン酸混合物として、実施例４のサンプル２（調製後すぐのポリリン酸混合物）を使用した。

結果を図３に示す。図３において、（ａ）は調製後すぐのポリリン酸混合物組成（重合度）を、（ｂ）は工程（Ａ）の完了後のポリリン酸混合物の組成（重合度）を、（ｃ）は工程（Ｂ）の完了後のポリリン酸混合物の組成（重合度）を示す。

この結果より、ＰＰＫ２によるＡＴＰ再生反応には、高重合度のポリリン酸が優先的に使用されることが明らかとなった。

本発明は、安価で、かつ、高い変換率で、ＡＴＰを利用した物質の製造を行うことができるため、酸化型グルタチオンの製造や還元型グルタチオンの製造等の分野において利用することができる。

Claims (4)

1. ＡＴＰを利用して物質を製造する方法であって、当該製造方法においてＡＴＰから生成されたＡＤＰに、２型ポリリン酸キナーゼとポリリン酸とを反応させてＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と、当該製造方法とが共役しており、当該製造方法で利用されるＡＴＰは、当該製造方法と共役している当該ＡＴＰ再生反応によって再生されたＡＴＰを含み、当該２型ポリリン酸キナーゼの基質として、重合度１５以上のポリリン酸を５０％以上含むポリリン酸混合物を用い、上記２型ポリリン酸キナーゼが、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＰａｎｎｏｎｉｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｃｕｓ由来２型ポリリン酸キナーゼと配列同一性が９０％以上であり、かつ、２型ポリリン酸キナーゼ活性を有する２型ポリリン酸キナーゼであることを特徴とする物質の製造方法。
2. 上記２型ポリリン酸キナーゼが、γ－グルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン合成酵素および二機能性グルタチオン合成酵素からなる群より選択される少なくとも一つと共役して機能することを特徴とする、請求項１に記載の物質の製造方法。
3. 上記物質の製造方法が、酸化型グルタチオンの製造方法または還元型グルタチオンの製造方法であることを特徴とする、請求項１または２に記載の物質の製造方法。
4. 上記物質の製造方法が、酸化型グルタチオンの製造方法であり、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする、請求項３に記載の物質の製造方法：
   （１）Ｌ－グルタミン酸とＬ－シスチンとを反応させて、酸化型γ－グルタミルシステインを製造する工程、および
   （２）上記（１）で得られた酸化型γ－グルタミルシステインとグリシンとを反応させて、酸化型グルタチオンを製造する工程。

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