CN113046402B - 一种基于构建双功能酶合成paps的方法 - Google Patents
一种基于构建双功能酶合成paps的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113046402B CN113046402B CN202011069389.7A CN202011069389A CN113046402B CN 113046402 B CN113046402 B CN 113046402B CN 202011069389 A CN202011069389 A CN 202011069389A CN 113046402 B CN113046402 B CN 113046402B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- paps
- atp
- enzyme
- atp sulfurylase
- aps kinase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- GACDQMDRPRGCTN-KQYNXXCUSA-N 3'-phospho-5'-adenylyl sulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O GACDQMDRPRGCTN-KQYNXXCUSA-N 0.000 title claims abstract description 59
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 9
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 102100040149 Adenylyl-sulfate kinase Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 101001040270 Homo sapiens Hydroxyacylglutathione hydrolase, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100040544 Hydroxyacylglutathione hydrolase, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 24
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims 2
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 101000610216 Urechis caupo Adenylyl-sulfate kinase Proteins 0.000 abstract 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 abstract 1
- 101150105093 PaPS gene Proteins 0.000 description 51
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 17
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 7
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- IRLPACMLTUPBCL-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylyl sulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- MCAVASRGVBVPMX-FXQIFTODSA-N Gln-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MCAVASRGVBVPMX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- IRDASPPCLZIERZ-XHNCKOQMSA-N Glu-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IRDASPPCLZIERZ-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 2
- FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054404 Adenylyl-sulfate kinase Proteins 0.000 description 1
- JPGBXANAQYHTLA-DRZSPHRISA-N Ala-Gln-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JPGBXANAQYHTLA-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- PVBBEKPHARMPHX-DCAQKATOSA-N Glu-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O PVBBEKPHARMPHX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DBJYVKDPGIFXFO-BQBZGAKWSA-N Gly-Met-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DBJYVKDPGIFXFO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N Gly-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(O)=O ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N Lys-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HWMZUBUEOYAQSC-DCAQKATOSA-N Lys-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HWMZUBUEOYAQSC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VEGLGAOVLFODGC-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VEGLGAOVLFODGC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000826396 Rattus norvegicus Sulfotransferase 1A1 Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052920 inorganic sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N pentaglycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- -1 salt ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01025—Adenylyl-sulfate kinase (2.7.1.25)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07004—Sulfate adenylyltransferase (2.7.7.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，属于生物技术领域。本发明首先对不同来源的ATP硫酸化酶和APS激酶进行优选，利用蛋白质融合技术，将优选所得的ATP硫酸化酶和APS激酶之间融合一段不同的蛋白接头(linker)，构建了双功能PAPS合酶。进一步对linker进行理性设计和改造，大大提高了转化效率，并简化了酶催化剂的获取，减少酶催化剂在制备过程中的损失。使得ATP转化率提高了25％，催化时间缩短59％。此外通过突变ATP硫酸化酶P环HRAH序列为HNGH和HAGH，进一步提高其酶活，使得PAPS的转化率可达48％。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，属于生物技术领域。
背景技术
3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate，PAPS)是已知唯一有活性的硫酸基团供体，是生物“活化”的硫酸盐形式，是细胞对无机硫酸盐的吸收和代谢至关重要的物质。此外，已证实多种疾病的产生与发展会引起组织中PAPS含量的改变，如癌症、HIV等。
PAPS是硫酸软骨素、肝素和硫酸皮肤素等最直接的硫酸根供体。目前PAPS的主要来源为提取法和酶法合成。由于PAPS在大多数生物体内直接含量少，使得提取PAPS工艺繁琐，且副产物较多难以纯化，直接导致PAPS的生产成本高昂。
酶法合成PAPS以腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)和硫酸根为底物，经ATP硫酸化酶和APS激酶催化合成PAPS。在反应的第一步由ATP硫酸化酶生成腺苷磷酰硫酸(Adenosine phosphosulfate，APS)和副产物焦磷酸，第二步反应APS经由APS激酶催化合成目的产物PAPS和副产腺苷二磷酸(Adenosine diphosphate，ADP)。由于必然产生的副产物ADP，酶法合成PAPS的底物ATP理论转化率为50％。在高等生物，如哺乳动物、海底蠕虫等生物中，PAPS合成酶为双功能酶，使得硫代谢更加多功能高效率。
由于目前PAPS的纯化处起步阶段，所得PAPS纯度有限，直接导致纯度较高的PAPS价格昂贵且限制了其应用。
发明内容
[技术问题]
目前体外酶法合成PAPS主要为双酶一锅法，存在效率与转化率低，成本高等缺点，不利于规模化生产。
[技术方案]
本发明提供一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，是模仿高等生物生产PAPS的方式，也体现了高等生物体的一种进化趋势，利用不同的接头序列将ATP硫酸化酶和APS激酶融合成一个双功能蛋白，实现人工PAPS合成双功能酶的构建。这种将不稳定的中间体导入双功能酶反应中的机制，极大的提高了底物ATP的转化率和转化效率。且在实际生产中也简化了多酶制备的步骤，降低生产成本。并通过突变ATP硫酸化酶保守区域P环HRAH序列为HNGH和HKGH，进一步提高其催化活力。
本发明提供了一种合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，利用PAPS合成双功能酶，以ATP为底物，合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。
在本发明的一种实施方式中，所述PAPS合成双功能酶是将ATP硫酸化酶和APS激酶通过融合接头序列连接，得到ATP硫酸化酶和APS激酶的融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列如SEQ ID NO:1～5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列可以重复多次，重复次数不超过6次。
在本发明的一种实施方式中，所述ATP硫酸化酶来源于乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母或产黄青霉菌。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于乳酸克鲁维酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为2894185；
所述来源于酿酒酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为853466；
所述来源于产黄青霉菌的ATP硫酸化酶的GenBank号为CAP86100.1。
在本发明的一种实施方式中，所述APS激酶来源于黄青霉菌、大肠杆菌、酿酒酵母或结核分枝杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于产黄青霉菌的APS激酶Gen Bank号为U39393.1；
所述来源于大肠杆菌的APS激酶Gen Bank号为M74586.1；
所述来源于酿酒酵母的APS激酶Gene ID为853869；
所述来源于结核分枝杆菌的APS激酶Gen Bank号为QGK78545.1。
在本发明的一种实施方式中，将所述ATP硫酸化酶第215位～218位的P环上氨基酸序列HRAH突变为HNGH或HAGH。
在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入硫酸盐作为硫酸根供体，在反应中可适当添加。
在本发明的一种实施方式中，硫酸根供体可以是硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾。
在本发明的一种实施方式中，硫酸根供体可优选为硫酸镁。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中缓冲溶液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、1～5mM硫酸镁和2～200mM硫酸钠，0.5～1.0mg/mL PAPS合成双功能酶。
在本发明的一种实施方式中，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为24～72h。
本发明还提供一种提高3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成量的方法，利用PAPS合成双功能酶，以ATP为底物转化合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。
在本发明的一种实施方式中，所述PAPS合成双功能酶是将ATP硫酸化酶和APS激酶通过融合接头序列连接，得到ATP硫酸化酶和APS激酶的融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列如SEQ ID NO:1～5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列可以重复多次，重复次数不超过6次。
在本发明的一种实施方式中，所述ATP硫酸化酶来源于乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母或产黄青霉菌。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于乳酸克鲁维酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为2894185；
所述来源于酿酒酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为853466；
所述来源于产黄青霉菌的ATP硫酸化酶的GenBank号为CAP86100.1。
在本发明的一种实施方式中，所述APS激酶来源于黄青霉菌、大肠杆菌、酿酒酵母或结核分枝杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于产黄青霉菌的APS激酶Gen Bank号为U39393.1；
所述来源于大肠杆菌的APS激酶Gen Bank号为M74586.1；
所述来源于酿酒酵母的APS激酶Gene ID为853869；
所述来源于结核分枝杆菌的APS激酶Gen Bank号为QGK78545.1。
在本发明的一种实施方式中，将所述ATP硫酸化酶第215位～218位的P环上氨基酸序列HRAH突变为HNGH或HAGH。
在本发明的一种实施方式中，催化合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的催化体系中缓冲液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、1～5mM硫酸镁，0.5～1.0mg/mL人工PAPS合成双功能酶。
在本发明的一种实施方式中，在催化体系中还可添加2～200mM硫酸钠。
在本发明的一种实施方式中，催化体系添加保护剂甘油、BSA、DTT中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，甘油的添加量为终浓度40～200mg/mL；BSA的添加量为终浓度20～100mg/mL；DTT的添加量为10～50mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为24～72h。
本发明还保护所述合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，或提高3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成量的方法在合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸中的应用。
本发明还保护所述合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，或提高3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成量的方法在利用3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸生产的相关产品中的应用。
[有益效果]
1、本发明通过筛选不同来源的ATP硫酸化酶和APS激酶，获得了优良的ATP硫酸化酶和APS激酶基因，比酶活较其他来源的酶更高，生产得到的PAPS产量也更高。
2、本发明通过借鉴和模仿高等生物的双功能酶模式，利用接头序列人工构建出PAPS合成双功能酶，拉近双酶之间的距离，缩短了中间底物的传递传质过程，提高催化活力，并简化了催化剂的获得，可以降低在反应过程中因为需要添加多种酶，在每次操作时存在的误差从而导致的产量的不稳定，且反应时间显著缩短，反应效率显著提升。
3、本发明通过向反应体系中添加的稳定剂和优化催化体系可以使酶长时间保持较高的活性；与其他体外酶法催化合成PAPS相比，显著的提高了合成效率，降低了成本。
4、本发明通过对ATP硫酸化酶的P环保守区突变，进一步提高了合成效率，使得底物催化转化率达到48％(理论值50％)，可以有效地进行PAPS规模化合成。
附图说明
图1是PAPS合成示意图。
图2是PAPS合成双功能酶构建示意图。
图3是不同来源ATP硫酸化酶和APS激酶纯化胶图；泳道1～5分别是酿酒酵母来源ATP硫酸化酶，克拉维酵母来源ATP硫酸化酶，大肠杆菌来源APS激酶，酿酒酵母来源APS激酶，产黄青霉来源APS激酶。
图4是部分接头序列的双功能酶催化活力比较图。
图5是双功能酶与双酶一锅法合成PAPS转化率比较图。
图6是改造不同P环后双功能酶催化活力比较图。
图7是添加不同稳定剂48h后双功能酶相对活力图。
具体实施方式
1.Escherichia coli BL21(DE3)、pET28a(+)为实验室保藏。
2.质粒构建试剂及测序验证均在上海生物生工公司购买和完成。
3.各种分析纯试剂购自国药集团。
4.培养基：
LB培养基：10g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉。
TB培养基，2.31g/L KH2PO4，12.54g/L K2HPO4，12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母粉，4mL/L甘油。
PAPS双功能酶酶活定义为：37℃条件下，每小时合成1μM PAPS所需要的酶量。
PAPS双功能酶的酶活检测方法：反应体系中加入5mM ATP，5mM MgSO4，2mg ASTIV，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)将反应体系定容至1.5mL，置于37℃恒温孵育24h后，利用高效液相检测PAPS产量。
PAPS检测方法：采用Agilent 1600HPLC系统，Polyamine II柱(4.6×250mm,12nm)，流动相：50mM KH2PO4和0.1％三乙胺溶液，流速：0.6mL·min-1，进样量：5μL，检测时间35min，检测器：UV 254nm。
ATP转化率：产品PAPS的摩尔数与底物ATP的摩尔比值。
实施例1：ATP硫酸化酶和APS激酶的表达和纯化
选取来源于酿酒酵母的ATP硫酸化酶(Gene ID为853466)、来源于产黄青霉菌的ATP硫酸化酶(GenBank号为CAP86100.1)、来源于乳酸克鲁维酵母的ATP硫酸化酶(Gene ID为2894185)，依据大肠杆菌密码子偏好性规律进行密码子优化，将优化后的核苷酸序列连接至质粒pET28a(+)的Nde I和Hind III限制性酶切位点之间，得到重组质粒。
选取来源于产黄青霉菌的APS激酶(Gen Bank号为U39393.1)、来源于大肠杆菌的APS激酶(Gen Bank号为M74586.1)、来源于酿酒酵母的APS激酶(Gene ID为853869)、结核分枝杆菌的APS激酶(Gen Bank号为QGK78545.1)，依据大肠杆菌密码子偏好性规律进行密码子优化，将优化后的核苷酸序列连接至质粒pET28a(+)的Nde I和Hind III限制性酶切位点之间，得到重组质粒。
将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)，验证后在含有卡那霉素(50μg/L)的平板上划线培养，挑取单菌落接种于LB种子培养基中，培养至种子液后，将种子液按1mL/50mL体积分数转接到50mL TB发酵培养基中，继续培养1～2h后加入0.5mM的IPTG并在30℃进行诱导培养6-10h。结束后收集菌体，超声破碎后用于纯化和分析。
将收集的菌体超声破碎后高速离心去除细胞碎片，上清利用0.22μm水系膜过滤，利用Ni-NTA亲和层析对目的蛋白进行纯化。A液平衡柱子后上样粗酶液，再利用A液平衡层析柱，之后利用不同浓度的B液冲洗层析柱并收集冲洗液，利用SDS-PAGE验证纯化的组分，并将最纯的组分用PD-10脱盐柱进行脱盐，脱盐时使用低盐缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1MNaCl；pH 6.0)，收集得到纯化脱盐的蛋白，如图3所示。
A液：20mM Tris-HCl buffer pH 7.5，500mM NaCl；
B液：20mM Tris-HCl buffer pH 7.5，500mM NaCl，500mM咪唑。
实施例2：不同来源的ATP硫酸化酶和APS激酶的比较
将酿酒酵母菌、乳酸克鲁维酵母菌、产黄青霉菌来源的ATP硫酸化酶基因构建至载体上获得目的蛋白后，向催化体系中加入等摩尔蛋白0.1mM，催化体系为50-100mM Tris-HCl buffer pH 7.0～8.5，再加入5mM ATP，4mM MgSO4，35～40℃催化60h，利用高效液相色谱检测APS的生成，比较后酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶的比酶活更高，更具优势。
在获得大肠杆菌、酿酒酵母菌、产黄青霉菌、结核分支杆菌来源的APS激酶蛋白后，级联酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶一同催化比较。向催化体系中加入终浓度为0.1～5mM不同来源的APS激酶和酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶，再加入终浓度为5～10mM的ATP和10～20mM的MgSO4，35～40℃催化55～60h，利用高效液相色谱检测PAPS的生成，比较后大肠杆菌来源的APS激酶比酶活更高，更具优势。
表1不同来源的PAPS合成途径酶的比酶活比较
| 名称 | 比酶活(U/mg) |
| 酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶 | 652±15 |
| 乳酸克鲁维酵母来源的ATP硫酸化酶 | 408±12 |
| 大肠杆菌来源的APS激酶 | 518±22 |
| 产黄青霉菌来源的APS激酶 | 396±25 |
| 酿酒酵母来源的APS激酶 | 308±18 |
实施例3：不同接头序列的双功能酶的酶活测定比较
双功能酶的构建：按照基因操作手段将酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶和大肠杆菌来源的APS激酶融合为一个片段(两种酶的前后顺序不影响其表达)，分别在接头部分添加不同融合接头序列(linker)，融合为一个片段，使两种酶均保持一定的空间位置，催化更加有序，具体为，将前面一个基因的终止密码子去除，与linker直接连接，再与另一个基因的起始密码子连接；linker的序列可以为SEQ ID NO.1～5(分别是GGGGGS、EAAAAK、GMALP、GA2PA3PAKQEA3PAPA2KAEAPA3PA2KA、KESGSVSSEQLAQFRSLD)，此处比较重复次数n＝1。
表达条件：挑取单菌落于LB培养基中过夜培养，将种子按照1mL/50mL接种于TB培养基中，继续培养至OD600为0.6-0.8时进行诱导表达，诱导条件：0.1-0.2mM的IPTG诱导表达(25℃，220rpm)，表达时间为10-15h。重组菌株的培养均需加入50mg/L硫酸卡那霉素以保证质粒的稳定性。
表达后的结果如图4所示，在序列如SEQ ID NO.1～5所示的linker中，SEQ IDNO.1的效果更好，对SEQ ID NO.1所示的重复序列进行优化，结果如表2所示，序列重复次数在1～6之间时，随着重复次数的增加，所得到的双功能酶的比酶活也逐渐提高，因而将重复次数为6的序列简称为PAPS合成双功能酶。
表2双功能酶接头重复次数优化
| 名称 | 比酶活(U/mg) |
| (GGGGS)*1 | 562±18 |
| (GGGGS)*2 | 593±23 |
| (GGGGS)*3 | 613±18 |
| (GGGGS)*4 | 608±25 |
| (GGGGS)*5 | 625±15 |
| (GGGGS)*6 | 660±17 |
实施例4：双酶一锅法和双功能酶法合成PAPS的比较
将纯化所得PAPS合成双功能酶和ATP硫酸化酶及APS激酶经SDS-PAGE验证正确，透析去除盐离子后，向催化体系(含有50-100mM Tris-HCl buffer、pH 7.0～8.5)中加入0.1～5mM大肠杆菌来源的APS激酶和0.1～5mM酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶，向另外的催化体系中加入相同摩尔数的PAPS合成双功能酶，之后加入5～10mM ATP，10～20mM MgSO4，在35～40℃下进行催化反应，反应结束后利用高效液相色谱检测PAPS的生成。
双酶一锅法反应到达终点的时间为68±4h，底物ATP转化率仅为31％，生产强度为22.79±1.26mg/(h·mg蛋白)；双功能酶催化到终点的时间为28±3h，ATP转化率为45％，生产强度为80.35±7.77mg/(h·mg蛋白)。
实施例5：P环优化的双功能酶的酶活测定比较
对PAPS合成双功能酶的ATP硫酸化酶区域P环进行更换和突变，是将ATP硫酸化酶的第215-218位的HARH分别替换为HNGH和HAGH，在获得纯化后的重组蛋白，对其酶催化活力比较分析。向催化体系中添加相同浓度的重组蛋白0.5mg/L，之后加入5mM ATP，4mM MgSO4，比较24h后的PAPS产量。结果如图6所示，HRAH、HNGH、HAGH的比酶活分别为660、680、690U/mg，说明将ATP硫酸化酶的第215-218位的HARH分别替换为HNGH和HAGH之后，同样能够取得较高的酶活，甚至略有提升。
按照实施例4的实施方式，将P环优化后的双功能酶应用于PAPS的制备中，P环优化为HNGH、HAGH之后的双功能酶，其制备得到的PAPS的转化率分别为45％和48％。
实施例6：保护剂的添加对PAPS双功能酶稳定性的影响
向双功能酶蛋白中加入不同的保护剂甘油(40mg/mL)、BSA(20mg/mL)、DTT(10mg/mL)中的1种或2种，在37℃下孵育48h，之后测定双功能酶的活力，用来表征其稳定性。结果如图7所示，添加入甘油、BSA、DTT之后，均对酶的稳定性有不同程度的提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法
<130> BAA200988A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Glu Ala Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Met Ala Leu Pro
1 5
<210> 4
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Ala Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Lys Gln Glu Ala
1 5 10 15
Pro Ala Lys Gln Glu Ala Pro Ala Lys Gln Glu Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Ala Lys Ala Glu Ala Pro Ala Lys Ala Glu Ala Pro Ala
35 40 45
Lys Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Lys Ala
50 55 60
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
Claims (6)
1.一种合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，其特征在于，以ATP为底物，利用PAPS合成双功能酶合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸；所述PAPS合成双功能酶是由ATP硫酸化酶和APS激酶通过融合接头序列连接而成的ATP硫酸化酶和APS激酶的融合蛋白；所述融合接头序列如SEQ ID NO.1～5任一所示；所述ATP硫酸化酶来源于酿酒酵母；所述APS激酶来源于大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合接头序列重复多次，重复次数小于6次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述ATP硫酸化酶第215位～218位的P环上氨基酸序列HRAH突变为HNGH或HAGH。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，催化合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的催化体系中缓冲液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、1～5mM硫酸镁，0.5～1.0mg/mL PAPS合成双功能酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，催化体系添加保护剂甘油、BSA、DTT中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为24～72h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011069389.7A CN113046402B (zh) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | 一种基于构建双功能酶合成paps的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011069389.7A CN113046402B (zh) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | 一种基于构建双功能酶合成paps的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113046402A CN113046402A (zh) | 2021-06-29 |
| CN113046402B true CN113046402B (zh) | 2023-04-28 |
Family
ID=76507748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011069389.7A Active CN113046402B (zh) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | 一种基于构建双功能酶合成paps的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113046402B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115786320A (zh) * | 2022-12-21 | 2023-03-14 | 江南大学 | 一种基于自组装策略构建固定化酶合成磺酸基供体paps的方法 |
| CN117965490A (zh) * | 2024-01-19 | 2024-05-03 | 杭州裕元生物科技有限公司 | 一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103451165A (zh) * | 2013-08-06 | 2013-12-18 | 浙江师范大学 | 3’，5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶及其构建方法和应用 |
| TW202204632A (zh) * | 2020-04-03 | 2022-02-01 | 美商瑞瑟勒綜合技術協會 | 硫酸化多醣之製造方法及３＇－磷酸腺苷－５＇－磷醯硫酸（ｐａｐｓ）之製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5919673A (en) * | 1995-03-22 | 1999-07-06 | The Scripps Research Institute | One-pot enzymatic sulfation process using 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate and recycled phosphorylated adenosine intermediates |
| WO2004013152A2 (en) * | 2002-08-06 | 2004-02-12 | Duke University | Novel targets for lithium therapy |
| KR101234513B1 (ko) * | 2005-01-25 | 2013-02-19 | 야마사 쇼유 가부시키가이샤 | 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트의 효소 합성법 |
| WO2018203482A1 (ja) * | 2017-05-01 | 2018-11-08 | 株式会社カネカ | Ａｔｐを利用した物質の製造方法 |
-
2020
- 2020-09-30 CN CN202011069389.7A patent/CN113046402B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103451165A (zh) * | 2013-08-06 | 2013-12-18 | 浙江师范大学 | 3’，5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶及其构建方法和应用 |
| TW202204632A (zh) * | 2020-04-03 | 2022-02-01 | 美商瑞瑟勒綜合技術協會 | 硫酸化多醣之製造方法及３＇－磷酸腺苷－５＇－磷醯硫酸（ｐａｐｓ）之製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113046402A (zh) | 2021-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113046403B (zh) | 一种基于构建atp再生系统高效催化合成paps的方法 | |
| CN107201352B (zh) | 一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体及其制备方法和应用 | |
| CN113046402B (zh) | 一种基于构建双功能酶合成paps的方法 | |
| CN112980906B (zh) | 一种用于制备β-烟酰胺单核苷酸的酶组合物及其应用 | |
| CN111534493B (zh) | 一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用 | |
| CN113265382B (zh) | 多聚磷酸激酶突变体 | |
| KR102069301B1 (ko) | 과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방법 | |
| CN110157653A (zh) | 一种高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌及其在合成环磷酸腺苷上的应用 | |
| CN110551781A (zh) | 一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法 | |
| CN112437811B (zh) | 一种重组nad合成酶及其基因和应用 | |
| CN114591940A (zh) | 一种催化葡萄糖合成d-阿洛酮糖的融合蛋白及其构建方法 | |
| CN111269870A (zh) | 一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用 | |
| Richter et al. | [34] Biosynthesis of riboflavin: 3, 4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase | |
| KR100914525B1 (ko) | 신규 ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를 이용한 ｃｍｐ―ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법 | |
| CN109370998A (zh) | 一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体I215F | |
| ES2229807T3 (es) | Cepas bacterianas recombinantes para la produccion de nucleosidos naturales y analogos modificados de los mismos. | |
| WO2024222534A1 (zh) | 一种基于aps和paps为活性磺酸供体的再生系统构建与应用方法 | |
| WO2024082546A1 (zh) | 阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物 | |
| CN109295026B (zh) | 一种n-脱氧核糖转移酶ii定向进化改造和生物催化应用 | |
| CN110607335B (zh) | 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物生物合成方法 | |
| CN112831532B (zh) | 一种酶促合成d-亮氨酸的方法 | |
| CN116536382A (zh) | 一种基于aps为活性磺酸供体的合成和再生系统的构建方法 | |
| CN112437813B (zh) | 酶法工业化生产nad的方法 | |
| CN111621533B (zh) | 一种人工酶法高效生产硫酸软骨素a的方法 | |
| CN106834176A (zh) | 一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20210629 Assignee: NANJING HANXIN PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2023980051872 Denomination of invention: A method for synthesizing PAPS based on constructing bifunctional enzymes Granted publication date: 20230428 License type: Common License Record date: 20231213 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20210629 Assignee: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2024980001409 Denomination of invention: A method for synthesizing PAPS based on constructing bifunctional enzymes Granted publication date: 20230428 License type: Common License Record date: 20240125 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |