DE69636649T2

DE69636649T2 - Für einen Endoglycoceramidase-Aktivator kodierendes Gen

Info

Publication number: DE69636649T2
Application number: DE69636649T
Authority: DE
Inventors: Yoko Kusatsu-shi Kurome; Hiroyuki Kusatsu-shi Izu; Yoshiya Onojyo-shi Izumi; Mutsumi Otsu-shi Sano; Ikunoshin Uji-shi KATO; Makoto Fukuoka-shi ITO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2016-06-29
Also published as: CN1153831C; DE69636649D1; US5824503A; EP0759470A2; KR970001541A; EP0759470B1; EP0759470A3; KR100541202B1; CN1145952A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA, die ein Polypeptid codiert, welches Endoglycoceramidase aktiviert, ein Enzym, welches für strukturelle, funktionelle und andere Untersuchungen von Glycolipiden bei der Bearbeitung von Zuckerketten nützlich ist oder welches eine Aktivität eines Endoglycoceramidase-Aktivators besitzt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein industrielles Produktionsverfahren für ein Polypeptid, welches eine Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, wobei ein rekombinanter Einbau eines rekombinanten Plasmids verwendet wird, welches die DNA darin eingefügt aufweist.
Endoglycoceramidase (EC 3.2.1.123), ein Enzym, welches zuerst aus den Actinomyceten des Rhodococcus-Stamms isoliert worden ist [The Journal of Biological Chemistry 261: 14278–14282 (1986)], hydrolysiert die Glycosidbindung zwischen der Zuckerkette und dem Ceramid in Glycosphingolipid, um die Zuckerkette und das Ceramid in ihrer vollständigen Form freizusetzen. Die Rhodococcus-Stämme sind auch dafür bekannt, dass sie drei verschiedene Arten von Endoglycoceramidase (I, II und III) mit verschiedenen Substratspezifitäten produzieren [The Journal of Biological Chemistry 264 (16): 9510–9519 (1989)]. Zu anderen bekannten Arten von Endoglycoceramidase gehört die von Blutegeln abgeleitete Endoglycoceramidase (Ceramid-Glycanase) [Biochemical and Biophysical Research Communications 141: 346–352 (1986)]. Obwohl diese Enzyme in der Lage sind, Glycolipide in Gegenwart verschiedener grenzflächenaktiver Mittel effizient abzubauen, ist der Abbau von Glycolipiden durch diese in Abwesenheit von grenzflächenaktiven Mitteln sehr langsam.
Auf der anderen Seite stellt der Endoglycoceramidase produzierende Rhodococcus-Stamm zwei Protein-Aktivatoren (Aktivator I, Aktivator II) her, welche die Endoglycoceramidase mit molekularer Spezifität aktivieren, was es der Endoglycoceramidase ermöglicht, Glycolipide sogar in der Abwesenheit von grenzflächen aktiven Mitteln gleichzeitig mit der Endoglycoceramidase-Produktion zu hydrolysieren. Der Aktivator I aktiviert Endoglycoceramidase I, während der Aktivator II die Endoglycoceramidase II aktiviert. Es ist jedoch eine wohlbekannte Tatsache, dass der Aktivator II die Endoglycoceramidase II stärker aktiviert als Endoglycoceramidase I, obwohl er Endoglycoceramidase I ebenfalls aktiviert, und dass der Aktivator II auch in der Lage ist, von Blutegeln abgeleitete Endoglycoceramidase (Ceramid-Glycanase) zu aktivieren [The Journal of Biological Chemistry 266 (12): 7919–7926 (1991)].
Es ist auch gezeigt worden, dass der Aktivator II, welcher ein Molekulargewicht von 69,2 kDa hat, durch einen vollständigen Verdau mit Trypsin auf 27,9 kDa verdaut wird, wobei er seine Aktivität in einem intakten Zustand beibehält [The Journal of Biochemistry 110: 328–332 (1991)]. In Gegenwart von Aktivator II verschiebt sich der optimale pH-Wert für Endoglycoceramidase II zur neutralen Seite hin, was es der Endoglycoceramidase II ermöglicht, Glycolipide sogar bei einem pH-Wert von 7,5 zu hydrolysieren. Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass die Verwendung von Aktivator II es der Endoglycoceramidase II erlauben könnte, ihre Aktivität auf lebensfähige Zellen unter physiologischen Bedingungen (bei fast neutralem pH-Wert, in Abwesenheit von grenzflächenaktiven Mitteln) zu entfalten, unter denen die Aktivität des Enzyms ansonsten eingeschränkt ist. Mit anderen Worten, es ist erwiesen worden, dass die Verwendung von Aktivator II die Analyse der intrazellulären Funktion von Glycolipiden mit Hilfe der Endoglycoceramidase II ermöglicht.
Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Aktivität von Endoglycoceramidase II auf lebensfähige Zellen große Mengen von Endoglycoceramidase II und Endoglycoceramidase-Aktivator II in hoher Reinheit erfordert. Eine Produktion von Endoglycoceramidase-Aktivator II mit Hilfe des Produzenten Rhodococcus erfordert lange Züchtungszeiten und viele Aufreinigungsschritte; es ist sehr schwierig, große Mengen von Aktivator II in hoher Reinheit zu gewinnen. Es besteht daher Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms zu niedrigeren Kosten und in höherer Reinheit.
Es ist auch schwierig, den Endoglycoceramidase-Aktivator II mit gentechnologischen Mitteln herzustellen, weil die Aminosäuresequenz und die Genstruktur des Endoglycoceramidase-Aktivators II bislang noch unbekannt sind. Infolgedessen ist es das dieser Erfindung zugrunde liegende technische Problem, eine DNA bereitzustellen, welche ein Polypeptid codiert, das Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Endoglycoceramidase-Aktivators mit gentechnologischen Mitteln.
Dieses technische Problem wird durch die in den Ansprüchen widergegebenen Ausführungsformen gelöst. Der vorliegenden Erfindung liegt nämlich die Isolierung einer DNA zugrunde, welche ein Polypeptid codiert, das Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform eine DNA, welche eine Sequenz aufweist, die ein Polypeptid codiert, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, oder funktionell gleichwertige Varianten davon, die dieselbe Aktivität aufweisen. Daher umfasst die DNA eine DNA-Sequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) DNA-Sequenzen, welche die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 umfassen, oder ein Fragment davon;
(b) DNA-Sequenzen, welche ein Polypeptid codieren, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 umfasst, oder ein Fragment davon;
(c) DNA-Sequenzen, welche ein Polypeptid codieren, welches die Aminosäuresequenz umfasst, die das Ergebnis einer Deletion, einer Addition, einer Insertion oder einer Substitution von einer oder von mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist oder ein Fragment davon; und
(d) DNA-Sequenzen, welche in der Lage sind, an eine DNA-Sequenz aus (a), (b) oder (c) in einer Lösung, welche 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardt-Lösung und 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthält, bei 65°C zu hybridisieren, wobei alle der DNA-Sequenzen aus (a)–(d) oder die Fragmente davon ein Polypeptid codieren, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt.

In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck „Hybridisierung" auf übliche Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine rekombinante DNA, welche die DNA der vorliegenden Erfindung umfasst, einen Vektor, welcher die rekombinante DNA umfasst, vorzugsweise einen Vektor, in dem die DNA funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, sowie eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, welche eine erfindungsgemäße DNA oder einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, oder von funktionell gleichwertigen Varianten davon, umfassend die Schritte:

(a) Züchten der Wirtszelle der vorliegenden Erfindung und
(b) Gewinnen des Polypeptids, das Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, aus der in Schritt (a) erhaltenen Kultur.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Oligonucleotid-Sonde oder einen -Primer, welcher unter den hierin aufgeführten Bedingungen spezifisch mit der DNA der vorliegenden Erfindung hybridisiert.
Die Aminosäuresequenz, welche an der Aktivität des Endoglycoceramidase-Aktivators beteiligt ist, sowie dessen Nucleotidsequenz sind zum ersten Mal durch die vorliegende Erfindung ermittelt worden, wodurch das Gen für den Endoglycoceramidase-Aktivator und ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität mit gentechnologischen Mitteln bereitgestellt werden.
Durch die Verwendung der DNA-Sequenz, welche den Endoglycoceramidase-Aktivator der vorliegenden Erfindung codiert, wird es ermöglicht, mit einer Sonde eine DNA zu finden, welche eine andere Sequenz als die der vorliegenden Erfindung aufweist, aber womöglich ein Polypeptid codiert, welches eine funktionell gleichwertige Aktivität wie die der vorliegenden Erfindung besitzt. Zudem ist die Aminosäuresequenz, welche der DNA-Sequenz entspricht, die den Endoglycoceramidase-Aktivator der vorliegenden Erfindung codiert, nützlich für die Herstellung des Antikörpers gegen den Endoglycoceramidase-Aktivator der vorliegenden Erfindung.
1 zeigt eine schematische Darstellung des Strukturgens, welches den Endoglycoceramidase-Aktivator II codiert, sowie die Sequenzen der Sonden ACTHI und ACTNH.
2 stellt ein Konstruktionsdiagramm des Plasmids pTAC2 dar.
3 stellt ein Konstruktionsdiagramm des Plasmids pEAC001 dar.
4 stellt ein Konstruktionsdiagramm des Plasmids pEAC101 dar.
5 stellt ein Konstruktionsdiagramm des Plasmids pEAC002 dar.
6 stellt ein Konstruktionsdiagramm des Plasmids pEAC201 dar.
Wie hierin aufgeführt, bezieht sich Endoglycoceramidase-Aktivator auf ein Protein, welches Endoglycoceramidase in Abwesenheit eines grenzflächenaktiven Mittels aktiviert.
Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität, wie hierin dargestellt, kann wie folgt bestimmt werden:
Die Aktivität kann mit dem in The Journal of Biological Chemistry 266 (12): 7919–7926 (1991) beschriebenen Verfahren bestimmt werden, wobei ein Extrakt von rekombinanten Escherichia coli – Zellen verwendet wird. Speziell werden 40 nMol Asialo-GM1, 5 μg Rinderserumalbumin, 0,3 Tausendstel Einheiten gereinigte Endoglycoceramidase und eine zweckdienliche Menge eines Roh-Extrakts (Endoglycoceramidase-Aktivator-Protein) in 40 μl eines 20 mMol Natriumacetatpuffers (pH 5,5) gemischt, der zuvor mit 0,85% NaCl isotonisch gemacht worden ist, um ein Standard-Testgemisch zu ergeben. Die Enzymaktivität wird dann mit dem in The Journal of Biological Chemistry 264: 9510–9519 (1989) beschriebenen Verfahren bestimmt. Nach einer Inkubation für 60 Minuten bei 37°C wird die Reaktion durch die Zugabe von 250 μl einer Carbonat-Cyanid-Lösung (pH 11) gestoppt; die reduzierende Aktivität wird mit der Methode von Park und Johnson [The Journal of Biological Chemistry 181: 149–151 (1949)] gemessen. Für das Kontrollexperiment werden das Substrat und der Rohextrakt (das Endoglycoceramidase-Aktivator-Protein) oder das Substrat und Endoglycoceramidase getrennt inkubiert. Die Summe der beiden Kontrollwerte wird von dem vorstehenden tatsächlichen Testwert subtrahiert. Eine Einheit des Endoglycoceramidase-Aktivator-Proteins ist als die Menge von Endoglycoceramidase-Aktivator-Protein definiert, welche die Hydrolyse von Asialo-GM1 unter den vorstehend beschriebenen experimentellen Standardbedingungen um 1 μMol pro Minute erhöht.
Der Begriff „ein Polypeptid, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, schließt nicht nur jene ein, die eine Aminosäuresequenz des nativen Endoglycoceramidase-Aktivators aufweisen, sondern auch dessen Varianten auf Grund von Modifikationen der Aminosäuresequenz z.B. durch Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von Aminosäure(n) solange diese in der Lage sind, Endoglycoceramidase zu aktivieren. „Nativer Endoglycoceramidase-Aktivator", wie hierin verwendet, umfasst, ist aber nicht beschränkt auf jene, die von Rhodococcus-Stämmen produziert werden. Ebenfalls eingeschlossen sind jene, die von anderen Mikroorganismen abgeleitet sind, wie z.B. von anderen Actinomyceten, Bakterien, Hefen, Pilzen, Ascomyceten und Basidiomyceten, und jene, die von Pflanzen, Tieren, Insekten und anderen Lebewesen abgeleitet sind.
Der Begriff „funktionell gleichwertige Variante", wie hierin verwendet, ist wie folgt definiert:
Bei einem natürlich vorkommenden Protein können eine Aminosäuredeletion, -insertion, -addition oder -substitution und andere Variationen in seiner Aminosäuresequenz auf Grund von Modifikationen etc. des Proteins selbst in vivo oder während der Aufreinigung vorkommen, ebenso wie jene, welche auf Grund von Polymorphismus und Variation des Gens entstehen, welches dieses codiert. Es ist eine wohlbekannte Tatsache, dass es einige solche Polypeptide gibt, welche den Proteinen ohne Variationen im Hinblick auf die physiologische und biologische Aktivität im Wesentlichen gleichwertig sind. Ein Polypeptid, welches sich strukturell von dem entsprechenden Protein unterscheidet, aber keinen wesentlichen funktionellen Unterschied zu dem Protein aufweist, wird als funktionell gleichwertige Variante bezeichnet.
Dasselbe gilt für Polypeptide, welche durch künstliches Einfügen solcher Variationen in die Aminosäuresequenz eines Proteins hergestellt werden. Obwohl auf diese Weise unterschiedlichere Varianten erhalten werden können, sieht man die daraus entstehenden Varianten als funktionell gleichwertige Varianten an, so lange deren physiologische Aktivität im Wesentlichen gleichwertig zu der des ursprünglichen Proteins ohne Variationen ist.
Zum Beispiel wird der Methioninrest am N-Terminus eines in Escherichia coli exprimierten Proteins Berichten zufolge häufig durch die Aktivität einer Methioninaminopeptidase entfernt, aber einige derart exprimierte Proteine haben den Methioninrest und andere nicht. Das Vorliegen oder das Fehlen des Methioninrests beeinflusst die Aktivität des Proteins jedoch in den meisten Fällen nicht. Es ist auch bekannt, dass ein Polypeptid, welches aus einem Austausch eines bestimmten Cysteinrestes in der Aminosäuresequenz von menschlichem Interleukin-2 (IL-2) durch ein Serin hervorgeht, die IL-2-Aktivität beibehält [Science 224: 1431 (1984)].
Wenn man ein Protein mit Hilfe von gentechnologischen Verfahren herstellt, wird das gewünschte Protein darüber hinaus häufig als Fusionsprotein exprimiert. Zum Beispiel wird eine von einem anderen Protein abgeleitete N-terminale Peptidkette zu dem N-Terminus des gewünschten Proteins hinzugefügt, um die Expression des gewünschten Proteins zu verstärken, oder die Aufreinigung des gewünschten Proteins wird erleichtert, indem man eine geeignete Peptidkette an den N- oder den C-Terminus des gewünschten Proteins hinzufügt, das Protein exprimiert und einen Träger verwendet, welcher Affinität für die hinzugefügte Peptidkette zeigt.
Auch im Hinblick auf das Codon (die Kombination des Basentripletts), welches auf dem Gen eine bestimmte Aminosäure festlegt, ist es bekannt, dass es 1 bis 6 Arten für jede Aminosäure gibt. Daher kann es eine große Zahl von Genen geben, die eine Aminosäuresequenz codieren, obgleich dies von der Aminosäuresequenz abhängt. In der Natur ist das Gen nicht stabil, sondern ist häufig Nucleinsäure-Änderungen ausgesetzt. Eine Änderung in dem Gen muß die davon codierte Aminosäuresequenz manchmal nicht beeinflussen (stille Variation); in diesem Fall kann man sagen, dass ein unterschiedliches Gen hergestellt worden ist, welches die gleiche Aminosäuresequenz codiert. Die Möglichkeit ist daher nicht von der Hand zu weisen, dass sogar dann, wenn ein Gen isoliert wird, welches eine bestimmte Amino säuresequenz codiert, im Laufe der Generationen des Organismus, der es enthält, eine Vielzahl von Genen hergestellt wird, die dieselbe Aminosäuresequenz codieren.
Darüber hinaus ist es mit Hilfe verschiedener gentechnologischer Methoden nicht schwierig, künstlich eine Vielzahl von Genen herzustellen, welche dieselbe Aminosäuresequenz codieren.
Zum Beispiel ist die Menge eines exprimierten Proteins manchmal nicht ausreichend, wenn ein Codon, das in dem natürlichen Gen verwendet wird, welches das gewünschte Protein codiert, in dem verwendeten Wirt, der zur Herstellung des Proteins mit gentechnologischen Methoden eingesetzt wird, nicht in genügender Menge zur Verfügung steht. In diesem Fall wird die Expression des gewünschten Proteins dadurch verstärkt, dass das Codon künstlich in ein anderes umgewandelt wird, welches in dem Wirt in hoher Menge vorhanden ist, ohne dadurch die codierte Aminosäuresequenz zu verändern. Es ist selbstverständlich möglich, künstlich eine Vielzahl von Genen herzustellen, die eine bestimmte Aminosäuresequenz codieren. Solche künstlich hergestellten unterschiedlichen Polynucleotide sind daher im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange eine hierin offenbarte Aminosäuresequenz codiert wird.
Außerdem besitzt ein Polypeptid, welches das Ergebnis von mindestens einer Veränderung, wie z.B. einer Deletion, einer Addition, einer Insertion oder einer Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins ist, gewöhnlich eine Aktivität, die funktionell der des gewünschten Proteins gleichwertig ist. Gene, die solche Polypeptide codieren, sind ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, gleich ob sie aus natürlichen Quellen isoliert oder künstlich hergestellt werden.
Im Allgemeinen sind funktionell gleichwertige Varianten häufig homolog zueinander in Bezug auf die Gene, welche diese codieren. Nucleinsäuremoleküle, welche in der Lage sind, an ein Gen der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren und die ein Polypeptid codieren, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, sind daher ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung wird hierin nachfolgend in Bezug auf die Isolierung und die Sequenzierung der DNA der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf den Endoglycoceramidase-Aktivator II ausführlich beschrieben.
Zunächst wird eine Information gewonnen, welche eine partielle Aminosäure sequenz des aufgereinigten Endoglycoceramidase-Aktivators II betrifft. Speziell wird der Endoglycoceramidase-Aktivator II, welcher nach der in The Journal of Biochemistry 110; 328–332 (1991) beschriebenen Methode aufgereinigt worden ist, beispielsweise direkt einem Edman-Abbau unterzogen [The Journal of Biological Chemistry 256: 7990–7997 (1981)], um eine Aminosäurensequenzierung nach einer herkömmlichen Methode durchzuführen. Alternativ kann dieser Aktivator durch die Aktivität einer Proteinhydrolase mit hoher Spezifität partiell hydrolysiert werden, das entstehende Peptidfragment kann aufgetrennt, gereinigt und einer Aminosäurensequenzierung unterzogen werden, um dessen interne partielle Aminosäuresequenz zu ermitteln.
Auf der Grundlage der so erhaltenen partiellen Aminosäuresequenzinformation wird das Gen des Endoglycoceramidase-Aktivators II cloniert. Für diesen Zweck kann eine üblicherweise verwendete PCR- oder Hybridisierungsmethode verwendet werden.
Als nächstes werden auf der Grundlage der partiellen Aminosäuresequenzinformation synthetische Oligonucleotide zur Verwendung als Southern-Hybridisierungssonden konstruiert. Getrennt davon wird die genomische DNA von Rhodococcus sp. M-777 vollständig mit den zweckdienlichen Restriktionsenzymen verdaut, wozu MluI, SalI, PstI und BamHI gehören, und zur Auftrennung einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, T. Maniatis et al., Kapitel 6, 3–20, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)], und die aufgetrennten Fragmente werden nach einem herkömmlichen Verfahren auf eine Nylonmembran transferiert [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, T. Maniatis et al., Kapitel 9, 34, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)].
Die Hybridisierung kann unter üblicherweise verwendeten Bedingungen durchgeführt werden. Zum Beispiel wird die Nylonmembran bei 65°C in einer Vorhybridisierungslösung blockiert, welche 6 × SSC (1 × SSC wird hergestellt, indem 8,77 g NaCl und 4,41 g Natriumcitrat in 1 l Wasser aufgelöst werden), 0,5% SDS, 5 × Denhardt-Lösung und 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthält, und jedes ³²P-markierte synthetische Oligonucleotid wird hinzugefügt, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 65°C. Nachdem die Nylonmembran für 30 Minuten bei 55°C in 2 × SSC gewaschen worden ist, welches 0,1 % SDS enthält, wird ein Autoradiogramm angefertigt, um ein DNA-Fragment nachzuweisen, welches an die synthetische Oligonucleotidsonde hybridisiert. Nachdem das DNA-Fragment, welches der nachgewiesenen Bande entspricht, aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt worden ist, wird das DNA-Fragment mit einer üblicherweise verwendeten Methode in einen Plasmidvektor eingesetzt. Nützliche Plasmidvektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die im Handel erhältlichen pUC18, pUC19, pUC119 und pTV118N (alle Produkte von Takara Shuzo).
Danach wird das so erhaltene rekombinante Plasmid in einen Wirt eingebracht, um den Wirt zu transformieren. Zu den verwendbaren Wirtszellen gehören prokaryontische Zellen von Bakterien (z.B. Escherichia coli) und Actinomyces und eukaryontische Zellen von Hefe, Pilzen, Tieren, Pflanzen etc.
Wenn es sich bei dem Wirt um Escherichia coli handelt, kann er von einem Wildstamm oder von einem Laborstamm sein, solange er in der Lage ist, transformiert zu werden und ein Gen zu exprimieren. Diese Einführung eines Plasmids kann mit Hilfe einer üblicherweise verwendeten Methode erreicht werden, wie z.B. der in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, T. Maniatis et al., Kapitel 1, 74–84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) beschriebenen Methode.
Als nächstes wird eine Transformante selektiert, welche das gewünschte DNA-Fragment beherbergt. Zu diesem Zweck werden die Eigenschaften des Plasmidvektors ausgenutzt. Im Fall von pUC19 werden zum Beispiel Kolonien, welche ein darin eingesetztes fremdes Gen besitzen, selektiert, indem Ampicillin-resistente Kolonien auf einer Ampicillin enthaltenden Platte ausgewählt werden oder indem weiße Ampicillin-resistente Kolonien auf einer Platte ausgewählt werden, welche Ampicillin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactosid (X-Gal) und Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) enthalten.
Als nächstes wird eine Kolonie, welche einen Vektor hat, der das gewünschte DNA-Fragment enthält, aus der vorstehenden Population herausselektiert. Diese Selektion wird bewerkstelligt, indem eine Koloniehybridisierung [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, T. Maniatis et al., Kapitel 1, 90–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] oder eine Plaque-Hybridisierung [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, T. Maniatis et al., Kapitel 2, 108–117, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] eingesetzt wird, welche geeigneterweise je nach den Vektortypen gewählt wird. Es lassen sich auch PCR-Methoden [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, T. Maniatis et al., Kapitel 14, 15–19, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] anwenden.
Sobald der Vektor, welcher das erhaltene DNA-Fragment enthält, selektiert worden ist, wird die Basensequenz des erhaltenen DNA-Fragments, welches in diesen Vektor eingesetzt ist, mit Hilfe eines üblichen Verfahrens wie z.B. der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, T. Maniatis et al., Kapitel 13, 3–10, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) ermittelt. Die so ermittelte Basensequenz wird mit der N-terminalen Sequenz, der partiellen Aminosäuresequenz, dem Molekulargewicht etc. des Endoglycoceramidase-Aktivators II verglichen, um die Genstruktur und die gesamte Aminosäuresequenz des Endoglycoceramidase-Aktivators II in Erfahrung zu bringen. Sofern das erhaltene DNA-Fragment nicht das Volllängen-Gen des Endoglycoceramidase-Aktivators II enthält, kann das Volllängen-Gen des Endoglycoceramidase-Aktivators II erhalten werden, indem man die genomische DNA von Rhodococcus sp. M-777 mit anderen Restriktionsenzymen verdaut, den fehlenden Teil aus den Verdaus durch Hybridisierung etc. gewinnt, wobei ein Teil des vorstehend erhaltenen DNA-Fragments als eine Sonde eingesetzt wird, und man dann den fehlenden Teil verknüpft.
Das gesamte, so erhaltene Gen des Endoglycoceramidase-Aktivators II oder ein Teil davon, welches(r), wie vorstehend beschrieben, erhalten worden ist, wird in einen geeigneten Plasmidvektor eingesetzt, welcher dann in eine Wirtszelle transformiert wird. Die so erhaltene Transformante wird unter üblicherweise verwendeten Bedingungen gezüchtet, um ein Polypeptid zu erzeugen, welches Endoglycoceramidase-Aktivator II-Aktivität besitzt.
Wenn zum Beispiel Escherichia coli und pET23b [von Novagen hergestellt] als eine Wirtszelle bzw. ein Plasmidvektor eingesetzt werden, wird die Transformante bei 37°C über Nacht in einem L-Medium (0,1 % Trypton, 0,05% Hefeextrakt, 0,1 % NaCl, pH 7,2), welches 100 μg/ml Ampicillin enthält, bis zu einer Extinktion bei 600 nm von etwa 0,5 gezüchtet, IPTG wird hinzugegeben, gefolgt von einem weiteren Schütteln der Kultur bei 37°C über Nacht. Nach Beendigung der Züchtung werden die Zellen zurückgewonnen, durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen etc. und abzentrifugiert. Der so erhaltene Überstand, wird wie nachstehend beschrieben, einer normalen Proteinaufreinigungsprozedur unterzogen, um einen Endoglyco ceramidase-Aktivator II von hoher Reinheit zu ergeben. Es kann der Fall eintreten, dass das exprimierte Polypeptid in Form von Einschlusskörpern produziert wird.
Die Expression des Genprodukts kann zum Beispiel durch eine Bestimmung der Aktivität des Endoglycoceramidase-Aktivators II bestätigt werden. Wenn es sich bei der Rekombinante zum Beispiel um Escherichia coli handelt, kann die Aktivität mit dem in The Journal of Biological Chemistry 266 (12): 7919–7929 (1991) beschriebenen Verfahren bestimmt werden, wobei der Extrakt von dem rekombinanten Escherichia coli als Enzymlösung verwendet wird. Genau gesagt, da die Endoglycoceramidase II zur Expression ihrer Aktivität ein grenzflächenaktives Mittel wie z.B. Triton X-100 benötigt, kann die Aktivität des Endoglycoceramidase-Aktivators II dadurch getestet werden, dass man die Zunahme der Aktivität der Endoglycoceramidase II in Abwesenheit von grenzflächenaktiven Mitteln misst, welche durch eine Zugabe eines Rohextrakts verursacht wird.
Geanu gesagt werden 40 nMol Asialo-GM1 (von IATRON hergestellt), 5 μg Rinderserumalbumin, 0,3 Tausendstel Einheiten gereinigter Endoglycoceramidase II und eine zweckdienliche Menge des Rohextrakts (das Endoglycoceramidase-Aktivator II - Protein) in 40 μl eines 20 mMol Natriumacetatpuffers (pH 5,5) gemischt, welcher zuvor mit 0,85% NaCl isotonisch gemacht worden ist, um ein Standard-Testgemisch zu ergeben. Die Enzymaktivität wird dann mit Hilfe der Methode bestimmt, welche in The Journal of Biological Chemistry 264: 9510–9519 (1989) beschrieben worden ist. Nach Inkubation für 60 Minuten bei 37°C wird die Reaktion durch die Zugabe von 250 μl einer Carbonat-Cyanid-Lösung (pH 11) gestoppt; die reduzierende Aktivität wird mit der Methode von Park und Johnson [The Journal of Biological Chemistry 181: 149–151 (1949)] gemessen. Für das Kontrollexperiment werden das Substrat und der Rohextrakt (das Endoglycoceramidase-Aktivator II-Protein) oder das Substrat und Endoglycoceramidase getrennt inkubiert. Die Summe der beiden Kontrollwerte wird von dem vorstehenden tatsächlichen Testwert subtrahiert. Eine Einheit des Endoglycoceramidase-Aktivator II-Proteins ist als die Menge Proteins definiert, welche die Hydrolyse von Asialo-GM1 unter den vorstehend beschriebenen experimentellen Standardbedingungen um 1 μMol pro Minute erhöht.
Die Expression kann auch immunologisch bestätigt werden, wobei man ein Antiserum verwendet, welches dadurch erhalten worden ist, dass man eine Ratte mit gereinigtem Endoglycoceramidase-Aktivator II immunisiert.
Wenn die gewünschte Expression von Endoglycoceramidase-Aktivator II beobachtet wird, sind die optimalen Bedingungen für die Expression von Endoglycoceramidase-Aktivator II ausgewählt worden.
Der Endoglycoceramidase-Aktivator II kann von der Kultur der Transformante mit Hilfe eines üblichen Verfahrens aufgereinigt werden. Das heißt, die Zellen der Transformante werden durch Zentrifugation aufgefangen, durch Behandlung mit Ultraschall oder dergleichen aufgeschlossen und dann einer Zentrifugation etc. unterzogen, um einen zellfreien Extrakt zu gewinnen, welcher durch übliche Proteinaufreinigungsmethoden wie z.B. Aussalzen. und verschiedene Chromatographieverfahren aufgereinigt werden kann, wozu Ionenaustausch-, Gelfiltrations-, hydrophobe und Aftinitätschromatographie-Verfahren gehören. Je nach dem verwendeten Wirt-Vektor-System wird das Expressionsprodukt von der Transformante extrazellulär sekretiert; in diesem Fall kann das Produkt aus dem Kulturüberstand auf die gleiche Weise, wie vorstehend beschrieben, aufgereinigt werden. Wenn es sich bei dem Wirt um Escherichia coli handelt, wird das Expressionsprodukt manchmal als ein unlöslicher Einschlusskörper gebildet. In diesem Fall werden die Zellen nach der Züchtung durch Zentrifugation aufgefangen, durch Behandlung mit Ultraschall oder dergleichen aufgeschlossen, dann einer Zentrifugation etc. unterzogen, um die unlösliche Fraktion abzutrennen, welche den Einschlusskörper enthält. Nachdem sie gewaschen worden sind, werden die Einschlusskörper mit einem üblicherweise verwendeten Proteinlösungsvermittler solubilisiert, wie z.B. dem Detergens Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, gefolgt von einer Aufreinigung mit verschiedenen Chromatographieverfahren, wie z.B. Ionenaustausch-, Gelfiltrations-, hydrophobe Interaktions- und gegebenenfalls Affinitätschromatographieverfahren, je nach Bedarf, wonach eine Rückfaltungsbehandlung mittels Dialyse oder Verdünnung durchgeführt wird, um eine Zubereitung von Endoglycoceramidase-Aktivator II zu ergeben, welcher seine Aktivität beibehält. Diese Zubereitung kann durch verschiedene Chromatographieverfahren aufgereinigt werden, um eine Endoglycoceramidase-Aktivator II-Zubereitung von hoher Reinheit zu ergeben.
Indem man das Endoglycoceramidase-Aktivator-Gen der vorliegenden Erfindung verwendet, kann man ein Gen, welches das gewünschte Polypeptid codiert, das Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, oder eine funktionell gleichwertige Variante davon mit Hilfe einer Hybridisierung aus DNAs oder cDNAs von anderen Genquellen erhalten als jenen, die vorstehend aufgeführt sind. Um das gewünschte Gen, welches ein Polypeptid codiert, das Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, oder eine funktionell gleichwertige Variante davon durch Hybridisierung zu erhalten, kann zum Beispiel die folgende Methode verwendet werden.
Zuerst wird chromosomale DNA, welche man aus der gewünschten Genquelle erhält, oder eine cDNA, welche mit Hilfe von reverser Transkriptase aus mRNA hergestellt wird, auf eine herkömmliche Methode mit einem Plasmid oder einem Phagenvektor verknüpft und in einen Wirt eingebracht, um eine Bank zu ergeben. Die Bank wird dann auf einer Platte in Kultur gehalten; die so erhaltenen Kolonien oder Plaques werden auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran transferiert und einer denaturierenden Behandlung unterzogen, um die DNA an der Membran zu immobilisieren. Diese Membran wird in einer Lösung inkubiert, welche eine mit ³²P oder dergleichen markierte Sonde enthält (die verwendete Sonde kann jedes Gen sein, welches die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäuresequenz codiert oder einen Teil davon; zum Beispiel können die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 gezeigten Gene oder ein Teil davon verwendet werden), um einen Hybrid zwischen der DNA auf der Membran und der Sonde auszubilden. Die Membran mit der darauf immobilisierten DNA wird beispielsweise in einer Lösung, welche 6 × SSC, 1 % Natriumlaurylsulfat, 100 μg/ml Lachssperma-DNA und 5 × Denhardt-Lösung (welche Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll jeweils in einer Konzentration von 0,1 % enthält) für 20 Stunden bei 65°C einer Hybridisierung mit der Sonde unterzogen. Nach der Hybridisierung wird der unspezifisch adsorbierte Teil weggewaschen, gefolgt von Autoradiographie etc., um Clone zu identifizieren, welche ein Hybridmolekül mit der Sonde gebildet haben. Diese Prozedur wird wiederholt, bis nur ein einziger Clon das Hybridmolekül bildet. Der so erhaltene Clon weist ein Gen auf, welches das gewünschte darin eingefügte Protein codiert.
Die Nucleotidsequenz des erhaltenen Gens wird dann beispielsweise durch die folgende Methode bestimmt, um zu bestätigen, ob das erhaltene Gen identisch mit dem gewünschten Gen, welches ein Polypeptid codiert, das Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, oder einer funktionell gleichwertigen Variante davon ist.
Wenn es sich bei der Rekombinante um Escherichia coli handelt, kann man eine Nucleotidsequenzierung für einen mittels Hybridisierung erhaltenen Clon dadurch erreichen, dass man Escherichia coli in einem Teströhrchen oder dergleichen züchtet, das Plasmid mit Hilfe einer herkömmlichen Methode extrahiert, das extrahierte Plasmid mit Restriktionsenzymen verdaut, die Insertion davon abtrennt und sie in den M13-Phagenvektor oder dergleichen subcloniert und die Nucleotidsequenz mit der Didesoxy-Methode bestimmt. Wenn es sich bei der Rekombinante um einen Phagen handelt, kann im Wesentlichen dieselbe Methode verwendet werden, die vorstehend verwendet worden ist, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Grundlegende experimentelle Techniken für die Züchtung bis zur Nucleotidsequenzierung sind zum Beispiel in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben.
Um zu bestätigen, ob das erhaltene Gen identisch mit dem gewünschten Gen, welches ein Polypeptid codiert, das Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, oder einer funktionell gleichwertigen Variante davon ist, wird die ermittelte Nucleotidsequenz mit der Nucleotidsequenz des Endoglycoceramidase-Aktivator-Gens der vorliegenden Erfindung und der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigten Aminosäuresequenz in dem Sequenzprotokoll verglichen.
Falls das erhaltene Gen nicht die gesamte Region, welche ein Polypeptid codiert, das Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, oder eine funktionell gleichwertige Variante davon enthält, kann die Nucleotidsequenz der gesamten Region, welche ein Polypeptid codiert, das Endoglycoceramidase-Aktivator – Aktivität besitzt, oder eine funktionell gleichwertige Variante davon, welche an das Endoglycoceramidase-Aktivator-Gen der vorliegenden Erfindung hybridisiert, dadurch bestimmt werden, indem ein synthetischer DNA-Primer aus dem erhaltenen Gen hergestellt wird und die fehlende Region mittels PCR amplifiziert wird oder indem die DNA-Bank oder cDNA-Bank mit dem erhaltenen Genfragment als Sonde durchmustert wird.
Ein Polypeptid, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, oder eine funktionell gleichwertige Variante davon kann mit Hilfe von gentechnologischen Verfahren wie folgt erhalten werden: zuerst wird das erhaltene Endoglycoceramidase-Aktivator-Gen oder ein anderes Gen, welches ein Polypeptid codiert, das eine funktionell gleichwertige Aktivität besitzt, mit einem Expressionsvektor verknüpft, welcher in der Lage ist, das Gen in einer geeigneten Wirtszelle wie z.B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces, Hefe, einem Pilz, einer Tierzelle, einer Insektenzelle oder einer Pflanzenzelle auf eine herkömmliche Methode zu exprimieren, gefolgt von einer Einführung in die Wirtszelle, um eine Rekombinante zu ergeben. Indem man diese Rekombinante züchtet, kann man ein Polypeptid herstellen, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt. Durch die Verwendung einer Zelle, welche nicht zur Biosynthese von Zuckerketten befähigt ist, als Wirt z.B. ein prokaryontischer Organismus wie z.B. Escherichia coli und Bacillus subtilis, Actinomyces oder durch die Verwendung einer Variante einer Hefe-, Pilz-, Tier-, Insekten- oder Pflanzenzelle, welche ihre Fähigkeit zur Biosynthese von Zuckerketten verloren hat, kann man ein Endoglycoceramidase-Aktivator-Polypeptid exprimieren, welches keine Zuckerketten aufweist.
In einigen Expressionssystemen schließt das erhaltene Endoglycoceramidase-Aktivator-Gen oder ein Gen, welches eine funktionell gleichwertige Variante des Endoglycoceramidase-Aktivators codiert, eine Region ein, welche ein Signalpeptid für zelluläre Sekretion codiert, was zu zellulärer Sekretion und Anreicherung des gewünschten Polypeptids in der Kulturbrühe führt. In diesem Fall kann das gewünschte Polypeptid aus der Kulturbrühe gewonnen werden. Wenn das gewünschte Polypeptid in der Rekombinante angereichert ist, kann es aus den gezüchteten Zellen über Zellaufschluss gewonnen werden. Außerdem kann das in der Rekominanten exprimierte Polypeptid, wenn es in Form einer unlöslichen Substanz (Einschlusskörper) angereichert ist, gewonnen werden, dann unter milden Bedingungen z.B. mit Harnstoff solubilisiert werden, gefolgt von einer Entfernung des Denaturierungsmittels, um die ursprüngliche Aktivität wiederherzustellen. Die Expression kann dadurch bestätigt werden, indem man die Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Ein Polypeptid, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, kann durch gewöhnliche Chromatographie-Techniken aus einer Rekombinante aufgereinigt werden. Wenn das gewünschte Polypeptid von der Rekombinante extrazellulär sekretiert wird, wird der Kulturüberstand zum Beispiel einem chromatographischen Verfahren wie z.B. einer hydrophoben, einer Ionenaustausch- oder einer Gelfiltrationschromatographie unterzogen, um das gewünschte exprimierte Polypeptid zu gewinnen. Wenn das gewünschte Polypeptid in der Rekombinante angereichert ist, werden die gezüchteten Zellen aufgeschlossen und der Überstand wird, falls das gewünschte Polypeptid in solubilisierter Form vorliegt, einem chromatographischen Verfahren wie z.B. einer hydrophoben, einer Ionenaustausch- oder einer Gelfiltrationschromatographie unterzogen, um das gewünschte exprimierte Polypeptid zu gewinnen. Wenn das exprimierte Polypeptid als eine unlösliche Substanz angereichert ist, werden die Zellen aufgeschlossen, wonach das Präzipitat gewonnen und mit einem Denaturierungsmittel wie z.B. Harnstoff solubilisiert wird. Das Denaturierungsmittel wird dann entfernt, gefolgt von einer Rückfaltung und anschließenden chromatographischen Behandlung, wie vorstehend beschrieben, um ein Polypeptid mit der gewünschten Aktivität zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt die Primärstruktur des Endoglycoceramidase-Aktivators und dessen Genstruktur bereit. Die Aufklärung der Genstruktur, welche in der vorliegenden Erfindung erreicht worden ist, erlaubt die gentechnologische Herstellung eines Polypeptids, welches Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt. Mit dem vorliegenden Verfahren kann eine Polypeptid-Zubereitung von hoher Reinheit, welche Endoglycoceramidase-Aktivator-Aktivität besitzt, mit gentechnologischen Methoden kostengünstig hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, sind aber nicht dazu gedacht, die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
Beispiel 1: Clonierung des Strukturgens des Endoglycoceramidase-Aktivators II (1) Extraktion und Aufreinigung genomischer DNA
Rhodococcus sp. M-777, ein Produzent von Endoglycoceramidase-Aktivator II, wurde in 30 ml eines Mediums (pH 7,0) inokuliert, umfassend 1,5% mykologisches Peptone (hergestellt von OXOID), 0,2% NaCl und 0,1 % Hefeextrakt, und für 3 Tage bei 28°C einer Schüttelkultur unterzogen. Die Kulturbrühe wurde in 900 ml des gleichen Mediums überführt und für 3 Tage bei 28°C einer Schüttelkultur unterzogen. Nach Abschluss der Züchtung wurde die Kulturbrühe zentrifugiert; die Zellen wurden aufgefangen und in 4,5 ml eines Puffers (50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert, dann eingefroren und aufgetaut. Zu dieser Zellsuspension wurden 2,5 ml eines Puffers (50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0) hinzugefügt, welcher 4 mg/ml Lysozym enthielt, gefolgt von einer Inkubation für 16 Stunden bei 30°C. Zu diesem Gemisch wurden 10 ml eines Extraktionspuffers (50 mM Tris-HCl, 1 % SDS, 0,4 mg/ml Proteinase K, pH 7,5) hinzugefügt, gefolgt von einer Inkubation für 16 Stunden bei 50° C, wonach 10 ml eines anderen Extraktionspuffers (50 mM Tris-HCl, 0,5% SDS, 0,2 mg/ml Proteinase K, pH 7,5) hinzugefügt wurden, gefolgt von einer Inkubation für 8 Stunden. Nachdem man das Inkubationsgemisch auf Raumtemperatur hatte abkühlen lassen, wurde ein gleich großes Volumen einer Phenol/Chloroform-Lösung hinzugefügt, welche zuvor mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) gesättigt worden war, gefolgt von leichtem kreisförmigen Schütteln für 16 Stunden und anschließender Zentrifugation bei 3500 UpM für 30 Minuten, wonach der Überstand gewonnen wurde. Diese Lösung wurde bei 4°C gegen einen Puffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8,0) dialysiert, um eine Lösung genomischer DNA zu ergeben.
(2) Partielle Aminosäuresequenzierung des Endoglycoceramidase-Aktivators II
Das 27,9 kDa große Trypsinspaltungsprodukt von Endoglycoceramidase-Aktivator II wurde zunächst mit dem in The Journal of Biochemistry 110: 328–332 (1991) beschriebenen Verfahren aufgereinigt. Die N-terminate Sequenz des aufgereinigten 27,9 kDa Trypsinspaltungsprodukts von Endoglycoceramidase-Aktivator II wurde dann mit Hilfe des Edman-Abbau-Verfahrens bestimmt. Als ein Ergebnis wurde die N-terminale Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5) bestimmt und als ACTN bezeichnet.
Die interne Aminosäuresequenz wurde dann wie folgt ermittelt:
In ein Teströhrchen, welches 4 μl Pyridin, 1 μl 4-Vinylpyridin, 1 μl Tributylphosphin und 5 μl destilliertes Wasser enthielt, wurde ein kleineres Probenröhrchen eingesetzt, welches die aufgereinigte Probe enthielt; das äußere Röhrchen wurde unter Vakuum verschlossen, gefolgt von Erhitzen für 5 Minuten bei 100° C, um die Cysteinreste in der Probe in einer Gasphase mit Pyridylethylatgruppen zu versehen.
Eine derart mit Pyridylethylatgruppen versehene 1 nMol-Probe wurde in 50 μl eines 20 mM Tris-Puffers (pH 9,0) aufgelöst, der 4 M Harnstoff enthielt; es wurden 8 pMol Lysylendopeptidase (hergestellt von Pierce) hinzugefügt, gefolgt von einer Verdauung für 16 Stunden bei 37°C. Es wurde dann mit Hilfe eines SMART-Systems eine Umkehrphasen-Chromatographie durch eine μRPC C2/C18 SC2.1/10-Säule (hergestellt von Pharmacia) auf einem Dichtegradienten von destilliertem Wasser, welches 0,065% Trifluoressigsäure (TFA) enthielt, zu Acetonitril, das 0,05% TFA enthielt, durchgeführt, um das Peptidfragment aufzureinigen. Das so aufgereinigte Peptidfragment wurde mit dem Edman-Abbau untersucht, wobei ein Modell 477-Gasphasen-Peptidsequenziergerät (hergestellt von Applied Biosystems) verwendet wurde. Als ein Ergebnis wurde die interne partielle Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) bestimmt und als ACTI bezeichnet.
(3) Clonierung eines DNA-Fragments, welches das Gen für den Endoglycoceramidase-Aktivator II enthält
Die in Beispiel 1 (1) hergestellte genomische DNA, 25 μg, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI, PstI und SalI (alle von Takara Shuzo hergestellt), jeweils 100 E für 6 Stunden bei 37°C verdaut; nachdem weitere 100 E von jedem Enzym hinzugefügt wurden, wurde die Reaktion für 16 Stunden fortgesetzt. Dieses Reaktionsgemisch wurde in einer Menge, welche 5 μg DNA entsprach, einer Elektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel unterzogen, wonach die DNA mit Hilfe der Southern-Blot-Methode (Idenshi Kenkyuhou II, S. 218–221, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin) auf eine Nylonmembran (Hybond-N+, hergestellt von Amersham)transferiert wurde. Dieser Filter wurde im Duplikat erstellt.
Bei den verwendeten Hybridisierungssonden handelte es sich um die Oligonucleotide ACTNH (SEQ ID NO: 7) und ACTIH (SEQ ID NO: 8), welche auf der Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz ACTN (SEQ ID NO: 5) und der internen partiellen Aminosäuresequenz ACTI (SEQ ID NO: 6), welche in Beispiel 1 (2) bestimmt worden waren, konstruiert und synthetisiert wurden. Diese Oligonucleotid-Sequenzen wurden auf der Grundlage von Codons mit hoher Verfügbarkeit in dem Wirt konstruiert, wie sie aus bekannten Basissequenzen bestimmt worden waren, welche verschiedene Proteine der Gattung Rhodococcus codieren.
Diese synthetischen Oligonucleotide, jeweils 10 pMol, wurden mit ³²P markiert, wobei der MEGARABEL^TM (hergestellt von Takara Shuzo) verwendet wurde.
Jeder der vorstehend vorbereiteten Filterpaare wurde für 3 Stunden bei 65°C in einer Lösung, welche 6 × SSC (1 × SSC ist eine wässrige Lösung aus 8,77 g NaCl und 4,41 g Natriumcitrat in 1 l Wasser), 0,5% SDS, 100 μg/ml Heringsperma-DNA und 5 × Denhardt-Lösung (welche Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll jeweils in einer Konzentration von 0,1 % enthielt) enthielt, einer Prähybridisierung unterzogen, wonach jede der markierten Sonden in einer Konzentration von 0,5 pMol/ml zugegeben wurde, gefolgt von einer Hybridisierung über Nacht bei 55°C. Jeder Filter wurde dann für 10 Minuten bei Raumtemperatur in 6 × SSC, in 2 × SSC und 0,1 % SDS für 10 Minuten bei Raumtemperatur und in 0,2 × SSC und 0,1 % SDS für 30 Minuten bei 55°C gewaschen, wonach überschüssige Lösung entfernt wurde; jeder Filter wurde für 3 Stunden auf einer Abbildungsplatte (hergestellt von Fuji Photo Film) exponiert, und das Bild wurde mit Hilfe eines BAS2000 Abbildungsanalysegerät (hergestellt von Fuji Photo Film) nachgewiesen.
Als ein Ergebnis waren an Positionen, welche etwa 10 kbp für den BamHI-Verdau, etwa 2,3 kbp für den PstI-Verdau und etwa 450 bp für den SalI-Verdau entsprachen, Banden zu sehen, welche an das Oligonucleotid ACTNH hybridisierten. Auch waren an Positionen, welche etwa 10 kbp für den BamHI-Verdau, etwa 2,3 kbp für den PstI-Verdau und etwa 1 kbp für den SalI-Verdau entsprachen, Banden zu sehen, welche an das Oligonucleotid ACTIH hybridisierten. Für die anschließenden Experimente wurde der PstI-Verdau verwendet, weil er einfach zu handhaben ist.
Die mit dem Restriktionsenzym PstI verdaute genomische DNA, 20 μg, wurde einer Elektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel unterzogen; ein Teil, welcher der Bande entsprach, die in der vorstehend beschriebenen Hybridisierung zu sehen war, wurde ausgeschnitten und einer Extraktion und Aufreinigung mit dem EASYTRAP^TM (hergestellt von Takara Shuzo) unterzogen; das so erhaltene DNA-Fragment wurde in die PstI-Stelle von pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo) eingesetzt.
Der Escherichia coli-Stamm JM109 wurde mit diesem Plasmid transformiert, wonach er auf 5 runden Petrischalen mit einem Durchmesser von 8,5 cm gezüchtet wurde, bis 200 bis 1000 Kolonien pro Platte entstanden waren. Von diesen Platten wurden 300 Kolonien ausgewählt und auf eine Nylonmembran (Hybond-N+, hergestellt von Amersham) transferiert, welche auf eine Platte mit Medium platziert war. Nach einer Inkubation für 3 Stunden bei 37°C wurde diese Nylonmembran für 5 Minuten auf einem Filterpapier gehalten, welches in eine Lösung eingetaucht war, die 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl umfasste (Denaturierung), und für 5 Minuten auf einem Filterpapier gehalten, welches in eine Lösung eingetaucht war, die 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und 3 M NaCl umfasste (Neutralisierung), gefolgt von Abspülen mit 2 × SSC. Indem diese Nylonmembran und das Oligonucleotid ACTNH (SEQ ID NO: 7) als Sonde verwendet wurden, wurde eine Hybridisierung unter denselben Bedingungen wie vorstehend beschrieben, ausgeführt; drei positive Kolonien wurden erhalten.
Diese Escherichia coli JM109-Transformanten wurden als P23, P54 bzw. P62 bezeichnet. Diese Transformanten wurden dem Verfahren der alkalischen Lyse unterzogen, um deren Plasmid-DNAs zu präparieren, welche die erhaltenen Clone trugen, welche als pACTP23, pACTP54 bzw. pACTP62 bezeichnet wurden. Diese wurden durch Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen und Gelelektrophorese untersucht. Als ein Ergebnis fand man, dass diese Plasmide dieselbe Insertion gemeinsam haben. Mit Blick auf diesen Befund wurde für die folgenden Experimente pACTP54 eingesetzt.
Eine Verdauung von pACTP54 mit dem Restriktionsenzym SalI ergab ein etwa 1 kbp großes Fragment, ein etwa 450 bp großes Fragment, ein etwa 300 bp großes Fragment und ein etwa 150 bp großes Fragment, welche als S1, S2, S3 bzw. S4 bezeichnet wurden. Diese Fragmente wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, dann extrahiert und aus dem Gel aufgereinigt und in die SalI-Stelle von pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo) subcloniert; die so erhaltenen Plasmide wurden als pACTS1, pACTS2, pACTS3 bzw. pACTS4 bezeichnet. Diese Plasmide wurden weiter mit zweckdienlichen Restriktionsenzymen (SmaI, BalI, NaeI etc.) verdaut und einer Selbstligierung mit Hilfe eines DNA-Ligierungs-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) unterzogen, um verschiedene Deletionsvarianten zu gewinnen. Die Basensequenzen von diesen Deletionsvarianten und von pACTP54 wurden von deren Ende mit Hilfe der Didesoxy-Methode ermittelt.
Als ein Ergebnis wurde gezeigt, dass eine Sequenz, welche die N-terminate Aminosäuresequenz ACTN codiert, eine Sequenz, welche mit ACTNH (dem als Sonde verwendeten Oligonucleotid) hybridisiert, auf pACTS2 vorhanden ist, dass eine Sequenz, welche die interne Aminosäuresequenz ACTI codiert, eine Sequenz, welche mit ACTIH (dem als Sonde verwendeten Oligonucleotid) hybridisiert, auf pACTS1 vorhanden ist, und dass die vier SalI-Fragmente auf pACTP54 in der Reihenfolge S3, S2, S1 und S4 angeordnet sind (1).
Eine Translation dieser Nucleotidsequenzen in Aminosäuresequenzen zeigte das Vorhandensein einer Signal-ähnlichen Sequenz stromaufwärts von der Aminosäuresequenz von Endoglycoceramidase-Aktivator II, was die Ableitung des Start codons ermöglichte. Es wurde kein Stopcodon stromabwärts von diesem Leserahmen gefunden; man fand heraus, dass diese Sequenzen die 417 Aminosäurereste (SEQ ID NO: 9) vom N-Terminus des aufgereinigten, 27,9 kDa großen Trypsinverdauungsprodukts von Endoglycoceramidase-Aktivator II codieren. Diese 417 Reste umfassende Aminosäuresequenz entspricht einem Molekulargewicht von 42 kDa. Die Basensequenz, welche diese 417 Reste umfassende Aminosäuresequenz codiert, ist in SEQ ID NO: 10 im Sequenzprotokoll dargestellt. Es ist damit bewiesen worden, dass pACTP54 die Sequenz enthält, welche einen N-terminalen Teil von Endoglycoceramidase-Aktivator II codiert, welcher den 27,9 kDa großen Teil von Endoglycoceramidase-Aktivator II einschließt, der minimalen Grundeinheit für dessen Aktivität.
(4) Clonierung eines DNA-Fragments, welches das Gen enthält, das die C-terminale Region des Endoglycoceramidase-Aktivators II codiert
Um das Volllängen-Gen von Endoglycoceramidase-Aktivator II abzudecken, wurde mit Hilfe des Southern-Hybridisierungsverfahrens auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (3) eine Durchmusterung auf ein DNA-Fragment durchgeführt, das die Region in der Nähe des C-Terminus codiert, der Region, die pACTP54 fehlt. Bei der verwendeten Sonde handelte es sich um das etwa 0,4 kbp große Fragment, das durch eine SmaI/PstI-Verdauung von pACTP54 erhalten wird, welches die DNA-Sequenz enthält, welche von den in Beispiel 1 (3) erhaltenen Sequenzen am nähesten zum C-Terminus liegt. Speziell wurde pACTP54 mit den Restriktionsenzymen SmaI und PstI (beide von Takara Shuzo hergestellt) verdaut und einer 1 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen; das so erhaltene etwa 0,4 kbp große DNA-Fragment wurde ausgeschnitten.
Dieses DNA-Fragment wurde einer Extraktion und einer Aufreinigung unterzogen, wobei die SpinBind^TM-Serie II (hergestellt von Takara Shuzo) eingesetzt wurde; das so erhaltene aufgereinigte DNA-Fragment wurde mit ³²P markiert, wobei ein BcaBEST^TM-Markierungskit (hergestellt von Takara Shuzo) verwendet wurde. Die in Beispiel 1 (1) hergestellte genomische DNA, 50 μg, wurde mit den Restriktionsenzymen MluI, SacII, ApaI und Eco52I (alle von Takara Shuzo hergestellt), jeweils 180 U, für 6 Stunden bei 37°C verdaut. Aus diesem Reaktionsgemisch wurden in einer Menge, welche 10 μg DNA entspricht, Filter auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (3) hergestellt. Jeder der Filter wurde für 3 Stunden bei 68°C in einer Lösung, welche 6 × SSC (1 × SSC ist eine wässrige Lösung aus 8,77 g NaCl und 4,41 g Natriumcitrat in 1 l Wasser), 0,5% SDS, 100 μg/ml Heringsperma-DNA und 5 × Denhardt-Lösung (welche Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll jeweils in einer Konzentration von 0,1 % enthielt) enthielt, einer Prähybridisierung unterzogen, wonach die markierte Sonde in einer Konzentration von jeweils 0,1 pmol/ml zugegeben wurde, gefolgt von einer Hybridisierung über Nacht bei 68° C.
Jeder Filter wurde dann für 10 Minuten bei Raumtemperatur in 6 × SSC, in 2 × SSC und 0,1 % SDS für 10 Minuten bei Raumtemperatur und in 0,2 × SSC und 0,1 % SDS für 30 Minuten bei 70°C gewaschen, wonach überschüssige Lösung entfernt wurde; jeder Filter wurde für 10 Minuten auf einer Abbildungsplatte (hergestellt von Fuji Photo Film) exponiert, und das Bild wurde mit Hilfe eines BAS2000 Abbildungsanalysegeräts (hergestellt von Fuji Photo Film) nachgewiesen.
Als ein Ergebnis waren an Positionen, welche etwa 4 kbp für den MluI-Verdau, etwa 1,3 kbp für den SacII-Verdau, etwa 1 kbp für den ApaI-Verdau und etwa 0,6 kbp für den Eco52I-Verdau entsprachen, Banden zu sehen, welche an die Sonde hybridisierten. Nach seiner Größe zu urteilen, nahm man an, dass der Eco52I-Verdau die Region in der Nähe des C-Terminus, welche pACTP54 fehlt, nicht vollständig abdeckt. Unter Berücksichtigung dieses Befunds wurden in den folgenden Experimenten die Verdauungen mit den Restriktionsenzymen MluI, SacII und ApaI eingesetzt.
Die mit den Restriktionsenzymen MluI, SacII und ApaI verdaute genomische DNA, 20 μg, wurde einer Elektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel unterzogen; die Teile, welche den Banden entsprachen, die in der vorstehend beschriebenen Hybridisierung nachgewiesen wurden, wurden ausgeschnitten und einer Extraktion und Aufreinigung mit dem EASYTRAP^TM (hergestellt von Takara Shuzo) unterzogen; das so erhaltene MluI-Fragment wurde in die MluI-Stelle von pUC19M inseriert [einem Plasmid, das durch Einsetzen und Ligieren eines phosphorylierten MluI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo) in ein Verdauungsprodukt von pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo) mit dem Restriktionsenzym HincII (hergestellt von Takara Shuzo) hergestellt wurde, um eine MluI-Stelle auf pUC19 zu übertragen]; das SacII-Fragment wurde in die SacII-Stelle von pBluescript II SK(–) (hergestellt von Stratagene) eingesetzt und das ApaI-Fragment wurde in die ApaI-Stelle von pBluescript II SK(–) eingesetzt.
Der Escherichia coli-Stamm HB101 wurde mit diesen Plasmiden transformiert, wonach er auf 10 runden Petrischalen mit einem Durchmesser von 8,5 cm gezüchtet wurde, welche ein L-Agar-Medium enthielten, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bis 200 bis 500 Kolonien pro Platte entstanden waren. Von diesen Platten wurden 1000 Kolonien ausgewählt und auf eine Nylonmembran (Hybond-N+, hergestellt von Amersham) transferiert, welche auf eine Platte mit dem gleichen Medium platziert war. Nach einer Inkubation für 10 Stunden bei 37°C wurde diese Nylonmembran für 5 Minuten auf einem Filterpapier gehalten, welches in eine Lösung eingetaucht war, die 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl umfasste (Denaturierung) und für 5 Minuten auf einem Filterpapier, welches in eine Lösung eingetaucht war, die 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und 3 M NaCl umfasste (Neutralisierung), gefolgt von Abspülen mit 2 × SSC. Indem diese Nylonmembran und das etwa 0,4 kbp große DNA-Fragment verwendet wurden, welches durch einen SmaI/PstI-Verdau von pACTP54 auf die gleiche Weise wie vorstehend erhalten worden war, wurde eine Hybridisierung unter denselben Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt. Zwei positive Signale wurden von Kolonien erhalten welche das ApaI-Fragment enthielten, obgleich keine positiven Signale von Kolonien erhalten wurden, welche das MluI- oder das SacII-Fragment enthielten.
Plasmid-DNAs wurden mit dem Verfahren der alkalischen Lyse aus den zwei positiven Kolonien hergestellt und als pBAp42 bzw. pBAp69 bezeichnet. Diese Plasmid-DNAs wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen (ApaI, PstI, SalI, Eco52I, BamHI, KpnI, SacI, Eco109I, NaeI, XhoI, SacII, MluI, EcoRI und HindII) verdaut und mittels Gelelektrophorese untersucht. Als ein Ergebnis fand man, dass pBAp42 und pBAp69 dieselbe Insertion gemeinsam haben. Mit Blick auf diesen Befund wurde für die folgenden Experimente pBAp42 eingesetzt.
pBAp42 wurde dann mit mehreren Restriktionsenzymen (PstI, SalI, HincII, AccI und SmaI) verdaut und subcloniert.
Die Nucleotidsequenzen von diesen Subclonen und von pBAp42 wurden von ihrem Ende mit Hilfe der Didesoxy-Methode bestimmt, gefolgt von einer Aminosäuresequenzierung, wobei synthetische DNA-Primer eingesetzt wurden, die auf der Grundlage der ermittelten Nucleotidsequenzen synthetisiert wurden. Als ein Ergebnis wurde die gleiche Sequenz wie jene des etwa 0,4 kbp großen Fragments gefunden, welches durch einen SmaI/PstI-Verdau von pACTP54 erhalten worden war. Außerdem wurde ein 1740 bp großer offener Leserahmen (ORF) über die Region zwischen dem PstI-Fragment in der pACTP54-Insertion und dem ApaI-Fragment in der pBAp42-Insertion gefunden, dessen Sequenz in Beispiel 1 (3) bestimmt wurde. Man stellte fest, dass dieser ORF am Startcodon ATG beginnt und an dem Stopcodon TGA endet; in der translatierten Aminosäuresequenz wurden Aminosäuresequenzen gefunden, die den Aminosäuresequenzen ACTN und ACTI entsprechen, die in Beispiel 1 (2) erhalten worden waren.
Auf der Grundlage der vorstehenden Ergebnisse wurde die gesamte Nucleotidsequenz und Primärstruktur des Endoglycoceramidase-Aktivator II-Gens bestimmt. Diese Ergebnisse sind in 1 dargestellt, in der die Restriktionsenzym-Karten für die pACTP54- und pBAp42-Insertionen und die Positionen dieser Insertionen und des Endoglycoceramidase-Aktivator II-Gens gezeigt sind.
Die Nucleotidsequenz des ORF von Endoglycoceramidase-Aktivator II ist in SEQ ID NO: 2 im Sequenzprotokoll dargestellt. Die gesamte Aminosäuresequenz des Endoglycoceramidase-Aktivators II ist in SEQ ID NO: 1 im Sequenzprotokoll dargestellt.
Beispiel 2: Konstruktion eines Plasmids zur Expression von Endoglycoceramidase-Aktivator II
Es wurde ein Plasmid zur Expression von Endoglycoceramidase-Aktivator II in Escherichia coli konstruiert, indem man das Strukturgen des Endoglycoceramidase-Aktivators II aus pACTP54 und pBAp42 wie in Beispiel 1 erhalten, in denen die Abschnitte des Strukturgens getrennt voneinander vorliegen, isolierte, das Gen an ein für seine Expression in Escherichia coli zweckdienliches Plasmid ligierte und es in eine Escherichia coli-Zelle einbrachte.
(1) Konstruktion eines Plasmids zur Expression des aktiven Polypeptids aus der N-terminalen Region von Endoglycoceramidase-Aktivator II
pACTP54 wie in Beispiel 1 erhalten, wurde mit dem Restriktionsenzym SacII verdaut und eine Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, wonach ein etwa 670 bp großes Fragment extrahiert und aufgereinigt wurde, wobei EASYTRAP^TM (hergestellt von Takara Shuzo) verwendet wurde. Nach dem Überführen der Enden in glatte Enden mit Hilfe eines DNA-Kits zur Herstellung glatter Enden (hergestellt von Takara Shuzo wurde das Fragment weiter mit dem Restriktionsenzym MluI verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, wonach ein etwa 450 bp großes Fragment extrahiert und aufgereinigt wurde, um ein SalIMluI-Fragment zu ergeben.
Als nächstes wurde pACTP54 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und MluI verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, gefolgt von einer Extraktion und Aufreinigung, um ein etwa 820 bp großes MluI-EcoRI – Fragment zu ergeben.
Diese zwei Fragmente wurden in die HincII-EcoRI-Stelle von pTV119N (hergestellt von Takara Shuzo) eingesetzt, wobei ein DNA-Ligierungs-Kit (hergestellt von Takara Shuzo) verwendet wurde. Das so erhaltene Plasmid, welches als pTAC1 bezeichnet wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut, gefolgt von einer Überführung in glatte Enden, wonach ein Stop-Linker (SEQ ID NO: 11) eingesetzt wurde. Das so erhaltene Plasmid wurde als pTAC2 bezeichnet.
Da dieses pTAC2 stromaufwärts von dem Gen, welches den Endoglycoceramidase-Aktivator II codiert, eine Sequenz enthält, welche 13 Aminosäurereste codiert, einschließlich eines lacZα-abgeleiteten Peptids, ist zu erwarten, dass eine Expression von Endoglycoceramidase-Aktivator II als Fusionskomplex mit lacZα durch die Verwendung der SD-Sequenz und des Startcodons von lacZ induziert wird. Dieses pTAC2 wurde in den Escherichia coli-Stamm JM109 eingebracht; nachdem Plasmid-DNA mit dem Verfahren der alkalischen Lyse aus der so erhaltenen Rekombinante präpariert worden war, wurde die Basensequenz der Insertion identifiziert. Der mit pTAC2 transformierte Escherichia coli-Stamm JM109 wurde als Escherichia coli JM109/pTAC2 bezeichnet.
pTAC1 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI verdaut, gefolgt von einer Überführung der Enden in glatte Enden und einer Agarosegel-Elektrophorese, wonach ein etwa 1,3 kbp großes DNA-Fragment extrahiert und aufgereinigt wurde. Das aufgereinigte Fragment wurde zwischen der HincII-Stelle und der in glatte Enden überführten NotI-Stelle von pET23b (hergestellt von Novagen) eingesetzt. Dieses Plasmid wurde als pEAC001 bezeichnet (3).
Da dieses pEAC001 stromaufwärts von dem Gen, das den Endoglycoceramidase-Aktivator II codiert, die T7·Tag^TM-Sequenz (welche die Aminosäuresequenz der ersten 11 Reste des Gen 10-Proteins des Bakteriophagen T7 codiert, hergestellt von Novagen) sowie eine Sequenz enthält, welche 14 Aminosäurereste codiert, die von der Clonierungsstelle abgeleitet sind, mit der His·Tag^TM-Sequenz (einer Sequenz, welche 6 Histidinreste codiert, hergestellt von Novagen) stromabwärts von dem Endoglycoceramidase-Aktivator II-Gen, ist zu erwarten, dass die Expression von Endoglycoceramidase-Aktivator II als Fusionskomplex der N-terminalen 417 Reste des reifen Endoglycoceramidase-Aktivators II mit dem His·Tag^TM und dem T7·Tag^TM induziert wird. Dieses Plasmid wurde in den Escherichia coli-Stamm JM109 eingebracht; aus der so erhaltenen Rekombinante wurde Plasmid-DNA mit dem Verfahren der alkalischen Lyse präpariert, wonach die Nucleotidsequenz der Insertion identifiziert wurde. Ein Plasmid, das nachgewiesenermaßen korrekt konstruiert worden war, wurde zur Expression in Escherichia coli BL21(DE3) eingebracht. Der mit pEAC001 transformierte Escherichia coli-Stamm BL21(DE3) wurde als Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC001 bezeichnet.
pEAC001 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SphI verdaut, gefolgt von einer Überführung der Enden in glatte Enden und einer Selbstligierung. Das so erhaltene Plasmid wurde als pEAC101 bezeichnet (4).
Es ist zu erwarten, dass dieses Plasmid Endoglycoceramidase-Aktivator II auf induktive Weise als einen Fusionskomplex exprimiert, welcher einen fusionierten Proteinteil aufweist, der um die 9 Aminosäurereste, die von der von der Clonierungsstelle abgeleiteten Sequenz codiert werden, kürzer ist als der von pEAC001. Dieses Plasmid wurde in den Escherichia coli-Stamm JM 109 eingebracht; aus der so erhaltenen Rekombinante wurde Plasmid-DNA mit Hilfe des Verfahrens der alkalischen Lyse präpariert, wonach die Basensequenz der Insertion identifiziert wurde. Ein Plasmid, das nachgewiesenermaßen korrekt konstruiert worden war, wurde für die Expression in Escherichia coli BL21(DE3) eingebracht. Der mit pEAC101 transformierte Escherichia coli – Stamm BL21(DE3) wurde als Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC101 bezeichnet [unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5531 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt; dieser Stamm wurde zunächst unter dem Namen Escherichia coli BL2(DE3)/pEAC101 (Registrierungsurkunde) hinterlegt, aber die irrtümliche Bezeichnung wurde wie vorstehend bei Ausgabe des Microbial Deposit Certificate vom 15. Juni 1995 hin korrigiert].
pEAC001 wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut, gefolgt von einer Überführung in glatte Enden, Verdauung mit SmaI und Selbstligierung, um ein Plasmid zu ergeben, welchem die Sequenz fehlt, die 143 Reste codiert, und das die Sequenz zurückbehält, welche die 274 N-terminalen Reste des reifen Endoglycoceramidase-Aktivators II von pEAC001 codiert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pEAC002 bezeichnet (5). Dieses Plasmid wurde in den Escherichia coli-Stamm JM109 eingebracht; aus der so erhaltenen Rekombinante wurde Plasmid-DNA mit Hilfe des Verfahrens der alkalischen Lyse präpariert, wonach die Nucleotidsequenz der Insertion identifiziert wurde. Ein Plasmid, das nachgewiesenermaßen korrekt konstruiert worden war, wurde für die Expression in Escherichia coli BL21(DE3) eingebracht. Der mit pEAC002 transformierte Escherichia coli-Stamm BL21(DE3) wurde als Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC002 bezeichnet.
(2) Konstruktion eines Plasmids zur Expression des Endoglycoceramidase-Aktivator II-Polypeptids ohne Signalsequenz
pBAp42 wurde mit dem Restriktionsenzym ApaI verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, gefolgt von einer Extraktion und Aufreinigung aus dem Gel, um ein etwa 1000 bp großes BAp42-ApaI-Fragment zu ergeben. Getrennt davon wurde pEAC101, wie in Beispiel 2 erhalten mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut, gefolgt von Überführung der Enden in glatte Enden mit Hilfe eines Kits zur Herstellung von glatten DNA-Enden (hergestellt von Takara Shuzo); an dieses Fragment wurde ein phosphorylierter ApaI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) angesetzt und es erfolgte eine Ligierung, um pEAC101 mit einer ApaI-Stelle zu versehen. Dieses Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym ApaI verdaut und mit aus Escherichia coli abgeleiteter alkalischer Phosphatase dephosphoryliert, gefolgt von einer Ligierung des BAp42-ApaI-Fragments, um pEAC201 zu ergeben (6).
Dieses Plasmid wurde in den Escherichia coli-Stamm JM109 eingebracht; aus der so erhaltenen Rekombinante wurde Plasmid-DNA mit Hilfe des Verfahrens der alkalischen Lyse präpariert, wonach die Nucleotidsequenz der Insertion identifiziert wurde. Ein Plasmid, das nachgewiesenermaßen korrekt konstruiert worden war, wurde für die Expression in Escherichia coli BL21(DE3) eingebracht. Der mit pEAC201 transformierte Escherichia coli-Stamm BL21(DE3) wurde als Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC201 bezeichnet.
Beispiel 3: Expression von rekombinantem Endoglycoceramidase-Aktivator II in Escherichia coli
(1) Expression eines Polypeptids, das Endoglycoceramidase-Aktivator II-Aktivität besitzt, in Escherichia coli
Escherichia coli JM109/pTAC2, Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC001, Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC101, Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC002 und Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC201, wie in Beispiel 2 erhalten, wurden jeweils in 5 ml L-Medium inokuliert, das 100 μl/ml Ampicillin enthielt, und über Nacht einer Schüttelkultur bei 37°C unterzogen; 0,2% der Kulturbrühe wurde weiter in 5 ml des gleichen Mediums inokuliert. Nach Erreichen einer Trübung (Extinktion bei 660 nm) von etwa 0,5 im Laufe der Züchtung wurde IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, gefolgt von Schütteln der Kultur für 16 Stunden. Nach Abschluss der Züchtung wurde die Kulturbrühe abzentrifugiert; die Zellen wurden aufgefangen, in 0,5 ml eines 20 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,9) suspendiert, durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen und zentrifugiert, um zwei Fraktionen zu ergeben: einen Escherichia coli-Zellextrakt als dem Überstand und ein Präzipitat. Der Extrakt und das Präzipitat wurden einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen und mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt.
Als ein Ergebnis wurde im Fall von Escherichia coli JM109/pTAC2 Endoglycoceramidase-Aktivator II nicht nachgewiesen. Auf der anderen Seite wurde im Fall von Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC001, im Fall von Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC101 und im Fall von Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC201 in dem Extrakt und in dem Präzipitat, und im Fall von Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC002 in dem Präzipitat eine Bande entdeckt, welche dem Endoglycoceramidase-Aktivator II zugeschrieben werden konnte; dadurch wurde die Expression des Endoglycoceramidase-Aktivators II bestätigt.
Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC001 produzierte die höchste Konzentration von Endoglycoceramidase-Aktivator II in der löslichen Fraktion. Das Expressionsprodukt von Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC201 lieferte ebenfalls eine Bande an fast derselben Position wie derjenigen für den nativen von Rhodococcus sp. M-777 produzierten Endoglycoceramidase-Aktivator II.
Als nächstes wurden die Zellextrakte von Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC001, Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC101 und Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC201 mit der in The Journal of Biochemistry 110: 328–332 (1991) beschriebenen Methode mit Trypsin verdaut. Jeder Verdau wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen, dann mit einem Elektroblot-Verfahren auf eine PVDF-Membran transferiert. Diese Membran wurde einer spezifischen immunologischen Färbung unterzogen, wobei ein Antiserum verwendet wurde, welches durch Immunisieren einer Ratte mit dem 27,9 kDa großen Trypsinverdauungsprodukt von gereinigtem Endoglycoceramidase-Aktivator II aus Rhodococcus sp. M-777 erhalten worden war. Als ein Ergebnis wurde eine etwa 28 kDa große Bande entdeckt, welche dem Trypsinverdauungsprodukt von Endoglycoceramidase-Aktivator zugeschrieben werden konnte.
Diese Tatsache weist darauf hin, dass der von Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC001, Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC101 und Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC201 in ihrer löslichen Fraktion produzierte Endoglycoceramidase-Aktivator II als Gemisch der nativen Struktur und fehlgefalteter sterischer Strukturen vorkommt.
(2) Aufreinigung des löslichen Expressionsprodukts
Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC101 wurde in 5 ml L-Medium inokuliert, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, und für 16 Stunden einer Schüttelkultur bei 37°C unterzogen; 0,6 ml der Kulturbrühe wurden weiter in 300 ml des gleichen Mediums inokuliert, gefolgt von Schütteln der Kultur bei 37°C. Nach Erreichen einer Trübung (Extinktion bei 660 nm) von etwa 0,5 in der Kulturbrühe wurde IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, gefolgt von Schütteln der Kultur über Nacht bei 37°C.
Nach Abschluss der Züchtung wurden die Zellen mittels Zentrifugation aufgefangen, in 10 ml eines 20 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,9) suspendiert, durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen und zentrifugiert, um den Überstand von dem Präzipitat zu trennen. Zu dem Überstand wurden 10 ml eines 40 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,9) hinzugefügt, welcher 10 mM Imidazol und 1 M NaCl enthielt, um eine Probenlösung zu ergeben.
Diese Probenlösung wurde einer Affinitäts-Chromatographie unterzogen, um ein Expressionsprodukt aus der löslichen Fraktion aufzureinigen. Genau gesagt wurde eine Säule von His·Bind-Metall-chelierendem Harz (hergestellt von Novagen), an welche zuvor Ni²⁺ immobilisiert worden war, mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,9) äquilibriert, der 5 mM Imidazol und 0,5 M NaCl enthielt. Nachdem die Probenlösung zu dieser Säule hinzugefügt worden war, wurde die Säule mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,9) gewaschen, der 60 mM Imidazol und 0,5 M NaCl enthielt, gefolgt von Elusion mit einem 20mM Tris-Hcl-Puffer (pH 7,9), der 1 M Imidazol und 0,5 M NaCl enthielt, um 10 ml eines gereinigten löslichen Expressionsprodukts zu ergeben.
(3) Rückfaltung und Produktion von rekombinantem 27,9 kDa großem Endoglycoceramidase-Aktivator II
Zehn Milliliter des gereinigten löslichen Expressionsprodukts aus Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC101, welches in Beispiel 3 (2) erhalten worden war, wurde tropfenweise unter Rühren zu 990 ml eines 20 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,9) zugegeben; die so erhaltene Verdünnung wurde bei 5°C für 4 Tage gerührt, um eine Rückfaltung zu erreichen.
Diese Lösung wurde zu einer Säule mit His·Bind-Metall-chelierendem Harz zugegeben, gefolgt von Waschen und Elution auf die gleiche Weise wie vorstehend, um eine Aufkonzentrierung zu erreichen. Der Puffer für dieses Eluat wurde durch einen 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) ersetzt, der 2 mM CaCl₂ enthielt, wobei eine Hi-Trap-Entsalzungssäule (hergestellt von Pharmacia) verwendet wurde. Nach einem Verdau mit 2 mg Trypsin für 4 Stunden bei 37°C wurden weitere 2 mg Trypsin hinzugefügt, gefolgt von einem weitere Verdau für 16 Stunden bei 37°C, um eine Umwandlung in den 27,9 kDa großen Endoglycoceramidase-Aktivator II zu erreichen. Der Verdau wurde dann durch eine Anionenaustauschharz-Q-Patrone (hergestellt von Bio-Rad) geschickt, welche zuvor mit einem 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,9) äquilibriert worden war, und weiter durch eine Prototrap^TM-Affinitätssäule (hergestellt von Takara Shuzo) geschickt, um das Trypsin zu entfernen, gefolgt von einer Ultrafiltration, um 45 μl eines Konzentrats zu erhalten.
Eine Untersuchung durch eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese brachte eine einzelne Bande zu Tage, welche einem Molekulargewicht von etwa 28.000 entsprach. Eine quantitative Messung mit dem BCA^TM Protein-Test-Reagenz (hergestellt von Pierce) zeigte einen Proteingehalt von 11 μg/μl, wobei Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde.
Die Endoglycoceramidase II aktivierende Aktivität wurde mit Hilfe der in The Journal of Biochemistry 110: 328–332 (1991) beschriebenen Methode bestimmt; die Endoglycoceramidase II aktivierende Aktivität wurde bestätigt. Mit anderen Worten, es wurde der Beweis erbracht, dass etwa 1,7 mg des rekombinanten 27,9 kDa Endoglycoceramidase-Aktivators II von 1 Liter der Kulturbrühe von Escherichia coli BL21(DE3)/pEAC101 gewonnen werden, welcher das Gen der vorliegenden Erfindung einschließt. Die Aminosäuresequenz dieses 27,9 kDa großen Endoglycoceramidase-Aktivators II ist in der SEQ ID NO: 3 im Sequenzprotokoll dargelegt und seine Basensequenz ist in der SEQ ID NO: 4 im Sequenzprotokoll dargelegt.
Es ist vorgesehen, dass andere Modifikationen der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, welche den Fachleuten offensichtlich sind, innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche liegen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA mit einer Sequenz, die ein Polypeptid codiert, das eine Aktivität eines Endoglycoceramidase-Aktivators besitzt, umfassend eine DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA-Sequenzen, umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder ein Fragment davon, das ein Polypeptid codiert, das eine Aktivität eines Endoglycoceramidase-Aktivators besitzt; (b) DNA-Sequenzen, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR:3 umfasst, oder ein Fragment davon, das eine Aktivität eines Endoglycoceramidase-Aktivators besitzt; (c) DNA-Sequenzen, die ein Polypeptid codieren, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 3 resultiert, oder ein Fragment davon, wobei die DNA-Sequenzen oder ein Fragment davon ein Polypeptid codieren, das eine Aktivität eines Endoglycoceramidase-Aktivators besitzt; und (d) DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, an eine DNA-Sequenz von (a), (b) oder (c) bei 65°C in einer Lösung, die 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardt's und 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthält, zu hybridisieren, und ein Polypeptid codieren, das eine Aktivität eines Endoglycoceramidase-Aktivators besitzt.
DNA nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid von einem Stamm der Gattung Rhodococcus stammt.
DNA nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid von Rhodococcus sp. M-777 stammt.
Rekombinante DNA, die eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Vektor, der die rekombinante DNA nach Anspruch 4 umfasst.
Vektor nach Anspruch 5, wobei die rekombinante DNA funktionell mit einem Promoter verknüpft ist.
Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 7, die E. coli, vorzugsweise E. coli BL21(DE3)/pEAC101 (FERM BP-5531) ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das eine Aktivität eines Endoglycoceramidase-Aktivators besitzt, umfassend die Schritte: (a) Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8; und (b) Gewinnen des Polypeptids aus der Kultur.
Verwendung einer Oligonucleotidsonde oder eines Oligonucleotidprimers, die/der bei 65°C mit einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einer Lösung, die 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardt's und 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthält, hybridisiert, zum Nachweis einer DNA, die ein Polypeptid codiert, das eine Aktivität eines Endoglycoceramidase-Aktivators besitzt.