DE69329164T2

DE69329164T2 - Protein mit Alpha-Glukosidase-Aktivität, DNS mit dessen genetischer Information und Herstellung von Alpha-Glukosidase

Info

Publication number: DE69329164T2
Application number: DE69329164T
Authority: DE
Inventors: Shigenori Emi; Yoshiaki Nishiya; Atsushi Sogabe; Yukihiro Sogabe; Yuzuru Suzuki; Yukio Takii; Kazumi Yamamoto
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1992-03-27
Filing date: 1993-03-26
Publication date: 2001-04-05
Anticipated expiration: 2013-03-27
Also published as: EP0567785A3; EP0567785B1; DE69329164D1; US5795766A; US5550046A; EP0567785A2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine α-Glucosidase, die für die Herstellung von Stärken sowie für die Bestimmung von in Körperflüssigkeiten vorhandener α-Amylase, die klinisch als Index für die Diagnose von Bauchspeicheldrüsenkrankheiten und
Speicheldrüsenkrankheiten verwendet wird, verwendbar ist; eine DNA mit der genetischen Information des Proteins, das eine α-Glucosidase- Aktivität hat; einen rekombinanten Vektor, der die DNA enthält; eine Transformante, die mit dem Vektor transformiert ist; und die Herstellung von α-Glucosidase unter Verwendung der Transformante.

Hintergrund der Erfindung

Die Organismen, die α-Glucosidase (α-D-Glucosid-Glucohydrolase, EC 3.2.1.20) erzeugen, findet man verbreitet in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen, und die dadurch erzeugten α-Glucosidasen zeigen je nach ihrer Herkunft verschiedene charakteristische Eigenschaften. Zum Beispiel ist die von Hefe stammende α-Glucosidase ein Enzym, das durch den Zucker, der mit nichtreduzierender terminaler Glucose verknüpft ist, oder das Aglycon von Maltooligoglucosid-Derivaten als Substrate kaum beeinflusst wird, und wird hauptsächlich für die Bestimmung von α- Amylase verwendet. Von der α-Glucosidase in menschlichem Urin oder Schweineblut ist bekannt, dass sie kaum Aktivität zeigt, es sei denn, die Substrate weisen eine Glucose auf, die mit einer nichtreduzierenden terminalen Glucose verknüpft ist und die Verknüpfung eine α-1,4- Verknüpfung ist.
Hinsichtlich der DNA-Sequenz und der Aminosäuresequenz des a-Glucosidase-Gens sind diejenigen von menschlicher lysosomaler α-Glucosidase [Biochem. J. 272: 493-497 (1990)], Fliegen-α-Gfucosidase [J. Mol. Biol. 166: 101-118 (1983)], Moskito-α-Glucosidase [Gene 75: 73-83 (1989)], Hefe-α-Glucosidase [Gene 41: 75-84 (1986)] usw. bekannt. Sie sind alle von Eukaryonten abgeleitet, und ein aus einem Prokaryonten stammendes Gen, das für die industrielle Produktion geeignet wäre, wurde noch nicht gefunden.
Die von der Gattung Bacillus abgeleitete α-Glucosidase ist von der von Hefe oder Tieren abgeleiteten, die bis jetzt bekannt ist, verschieden und hat eine überlegene Wärmeresistenz und breite Substratspezifität, die eine wesentliche Reaktion an Maltotetraose, Maltopentaose usw. erlaubt [Biochimica et Biophysica Acta: 787: 281-289 (1984)].
Unter den Stämmen, die zur Gattung Bach/us gehören, gibt es jedoch solche, die in der Lage sind, gleichzeitig mit α-Glucosidase auch α-Amylase zu erzeugen. Die aus diesen Stämmen erhaltenen α-Glucosidasen enthalten auch nach der Reinigung noch α-Amylase und verursachen gelegentlich Fehler bei der Bestimmung von Amylase in Körperflüssigkeiten.

Kurzbeschreibunci der Erfindung

Dementsprechend ist es ein Ziel der Erfindung, die Molekülstruktur von α- Glucosidase durch Identifizieren der N-terminalen Aminosäuresequenz von α-Glucosidase, die von der Gattung Bacillus abgeleitet ist, aufzuklären und eine Methode bereitzustellen, um die α-Glucosidase in reiner Form ohne Kontamination mit α-Amylase kostengünstig und in großen Mengen gentechnisch herzustellen.
Um das oben genannte Ziel zu erreichen, wählten die Erfinder Bacillus stearothermophilus ATCC 12016 als α-Glucosidase-erzeugende Zelle und erhielten durch die Reinigung seiner Kultur erfolgreich ein α-Glucosidase- Präparat mit einer Reinheit, die derjenigen überlegen ist, über die in Biochimica et Biophysica Acta: 787: 281-289 (1984), berichtet wird, wo eine α-Glucosidase durch Reinigen der Kultur eines bekannten Stammes erhalten wurde, und die Erfinder identifizierten seine N-terminale Aminosäuresequenz.
Weiterhin ist es den Erfindern gelungen, ein α-Glucosidase-Gen aus chromosomaler DNA zu isolieren, die aus Bacillus stearothermophilus ATCC 12016 extrahiert wurde, und sie identifizierten die gesamte Struktur seiner DNA. Außerdem ist es ihnen gelungen, diese α-Glucosidase gentechnisch in hohen Ausbeuten aus einer Transformante herzustellen, die im wesentlichen keine α-Amylase erzeugt, und sie ermöglichten die kostengünstige Herstellung von hochreiner α-Glucosidase in großen Mengen.

Kurzbeschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist eine Restriktionsenzymkarte eines DNA-Einschubs in pSAGH2-9.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
(1) ein gereinigtes Protein mit α-Glucosidase-Aktivität, wobei das Protein gekennzeichnet ist
(a) durch eine Aminosäuresequenz, wie sie als Sequenz Nr. 3 im "Sequence Listing" abgebildet ist;
(b) durch ein Molekulargewicht von 65 000 (SDS-PAGE);
(c) durch ein Temperaturoptimum von 60ºC; und
(d) dadurch, dass es im wesentlichen frei von einer Kontamination durch α-Amylase ist;
(2) eine DNA, die das Protein gemäß dem obigen Punkt (1) codiert;
(3) einen rekombinanten Vektor, der die DNA gemäß dem obigen Punkt (2) enthält;
(4) eine Transformante, die mit dem Vektor gemäß dem obigen Punkt (3) transformiert ist;
(5) ein Verfahren zur Herstellung von α-Glucosidase, wie sie oben in (1) definiert ist, wobei das Verfahren das Kultivieren der Transformante gemäß dem obigen Punkt (4) in einem Medium, so dass sie α-Glucosidase erzeugt, und das Ernten der α-Glucosidase umfasst.
Das oben in (1) definierte Protein hat eine N-terminale Aminosäuresequenz, die im "Sequence Listing" als Sequenz Nr. 1 abgebildet ist und die sich von der von bekannten α-Glucosidasen (z. B. der von humanen Lysosomen, Fliegen, Moskito oder Hefe abgeleiteten) unterscheidet.
Das oben in (1) definierte Protein ist vorzugsweise ein Enzym, das von Bacillus stearothermophilus ATCC 12016 erzeugt wird und sich hinsichtlich der Reinheit von bekannten α-Glucosidasen unterscheidet.
Bei dem Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört, handelt es sich zum Beispiel um Bacillus stearothermophilus ATCC 12016.
Die Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören, können in einem Medium kultiviert werden, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Ionen enthält und dem man nach Bedarf weiterhin Nitrat oder Phosphat zusetzen kann. Als Kohlenstoffquelle sind Stärke, hydrolysierte Stärke und Melasse geeignet. Als Stickstoffquelle sind Polypepton, Trypton, Fleischextrakt und Hefeextrakt geeignet. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, wird die Kultur unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei man pH-Wert und Temperatur des Mediums in geeigneter Weise einstellt. Die Kultur sollte fortgesetzt werden, bis die α-Glucosidase-Aktivität der Kultur ihr Maximum erreicht.
Das Ernten der α-Glucosidase aus einer Kultur umfasst die folgenden Schritte. Die Kulturlösung wird zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen, und dann wird durch Lyse ein α-Glucosidase-haltiges Lysat hergestellt. Die Lyse wird zweckmäßigerweise durch Behandlung mit einem zellwandlysierenden Enzym, wie Lysozym oder β-Glucanase, oder durch physikalische Lyse durch Ultraschallbehandlung oder Behandlung mit einer French Press durchgeführt.
Das so erhaltene Lysat wird zum Beispiel einer Fraktionierung durch Fällung mit Ammoniumsulfat unterzogen, und nach dem Entsalzen wird die Probe einer Fraktionierung unter Verwendung einer DEAE-Sepharose- CL-6B-Säule (Pharmacia LKB) unterzogen. Auch andere Säulen können verwendet werden, sofern damit eine Trennung durch Ionenaustausch durchgeführt werden kann. Ansonsten kann dieser Schritt auch ausgelassen werden. Die fraktionierte Probe wird einer HPLC (high performance liquid chromatography, Pharmacia LKB) unter Verwendung von Q-Sepharose HiLoad 16/10 (Pharmacia LKB) und dann zur weiteren Reinigung TSKgel Phenyl-5PW (Toso) unterzogen. Das gereinigte Produkt wanderte bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) als einzelne Bande. Man beachte, dass die Kombination von Säulenchromatographien nicht auf die oben beispielhaft genannte beschränkt ist, sondern einschließlich der Art der zu verwendenden Säule gegebenenfalls abgeändert werden kann.
In der vorliegenden Erfindung wurde das gereinigte Standard- -Glucosidase-Produkt dann auf einen Aminosäuresequencer aufgebracht, und die folgende N-terminale Aminosäuresequenz (Sequenz Nr. 1) wurde bestimmt:
Met Lys Lys Thr Trp Trp Lys Glu Gly Val Ala Tyr Gln Ile Tyr
Das oben in (1) definierte Protein der vorliegenden Erfindung hat die Aminosäuresequenz, die im "Sequence Listing" als Sequenz Nr. 3 abgebildet ist.
Die oben in (2) definierte DNA der vorliegenden Erfindung (im folgenden auch als -Glucosidase-Gen bezeichnet) kann aus Bacillus stearothermophilus extrahiert oder aber synthetisiert werden. Die DNA- Sequenz ist zum Beispiel eine DNA-Sequenz, die die im "Sequence Listing" als Sequenz Nr. 3 abgebildete Aminosäuresequenz codiert, oder eine DNA mit der im "Sequence Listing" als Sequenz Nr. 2 abgebildeten Nucleotidsequenz.
Der rekombinante Vektor für die DNA der vorliegenden Erfindung wird zum Beispiel hergestellt, indem man die DNA von Bacillus stearothermophilus abtrennt und reinigt, DNA mit Hilfe von Ultraschallwellen oder einem Restriktionsenzym herausspaltet und diese DNA mit einem linearen Expressionsvektor durch Cyclisierung mit DNA-Ligase an den glatten oder klebrigen Enden der beiden DNAs ligasiert. Der so erhaltene rekombinante Vektor wird in einen replikationsfähigen Wirt transfiziert, aus dem ein Mikroorganismus, der den rekombinanten Vektor trägt, durch Screening unter Verwendung eines Markers des Vektors und der -Glucosidase- Aktivität als Indikator erhalten wird. Der erhaltene Mikroorganismus wird kultiviert, und aus den kultivierten Zellen wird ein rekombinanter DNA- Vektor isoliert und gereinigt. Dann kann aus dem rekombinanten Vektor ein -Glucosidase-Gen geerntet werden.
Es folgt eine ausführliche Erklärung des DNA-Erntens. Die aus einem Gen- Donormikroorganismus abgeleitete DNA wird wie folgt geerntet. Ein Bakterium, wie es oben erwähnt ist und bei dem es sich um den Donororganismus handelt, wird zum Beispiel 1-3 Tage lang unter Belüftung und Rühren in einem flüssigen Medium kultiviert, und danach wird die erhaltene Kultur zentrifugiert, und Zellen werden gewonnen. Durch Lyse kann ein Lysat hergestellt werden, das -Glucosidase-Gen enthält. Die Lyse kann zum Beispiel durch Behandlung mit einem zellwandlysierenden Enzym, wie Lysozym oder β-Glucanase, erfolgen, wobei man nötigenfalls gleichzeitig ein anderes Enzym, wie Protease, oder ein Tensid, wie Natriumlaurylsulfat, verwendet. Eine physikalische Lyse durch Gefrieren- Tauen oder Behandlung mit der French Press kann weiterhin mit der beschriebenen Lyse kombiniert werden.
Aus dem so erhaltenen Lysat wird DNA mit herkömmlichen Methoden, wie Proteinentfernung durch Phenolextraktion, Protease-Behandlung, Ribonuclease-Behandlung, Alkoholfällung und Zentrifugation, die auch in geeigneter Weise miteinander kombiniert werden können, isoliert und gereinigt.
Die DNA, die aus dem Mikroorganismus isoliert und dann gereinigt wurde, wird gespalten, zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung oder Behandlung mit einem Restriktionsenzym, wobei die Behandlung mit einem Restriktionsenzym unter Verwendung eines Restriktionsenzyms, das auf eine spezifische Nucleotidsequenz einwirkt, wie Restriktionsenzyme des Typs II (z. B. EcoRI, Hindill, BamHI) bevorzugt wird, so dass die Ligasierung eines erhaltenen DNA-Fragments mit einem Vektor erleichtert wird.
Als Vektor ist ein solcher geeignet, der zur Verwendung bei der Genrekombination aus einem Phagen oder einem Plasmid konstruiert wurde und zur autonomen Vermehrung in einem Wirt befähigt ist.
Als Phage können zum Beispiel gt 10 oder gt 11 verwendet werden, wenn Escherichia coli als Wirt verwendet wird.
Als Plasmid können zum Beispiel pBR322 oder pUC19 verwendet werden, wenn Escherichia coli als Wirt verwendet wird, und pBU110 oder pC194 können verwendet werden, wenn Bacillus subtilis als Wirt verwendet wird. Außerdem kann auch ein Schaukelvektor verwendet werden, der zur autonomen Vermehrung in zwei oder mehr Wirten einschließlich sowohl Gram-negativer Wirte, wie Escherichia coli, als auch Gram-positiver Wirte, wie Bacillus subtilis, befähigt ist. Ein solcher Vektor wird vorzugsweise mit demselben Restriktionsenzym gespalten, das auch für die Spaltung der DNA des oben erwähnten, als -Glucosidase-Gen-Donor dienenden Mikroorganismus verwendet wurde, so dass man ein Vektorfragment erhält. Bei dem Verfahren zum Ligasieren des DNA-Fragments des Mikroorganismus mit einem Vektorfragment kann es sich um jedes Verfahren handeln, bei dem eine bekannte DNA-Ligase verwendet wird. Ein Beispiel dafür ist ein Verfahren, das die Assoziation der klebrigen Enden eines DNA-Fragments eines Mikroorganismus und eines Vektorfragments und den Aufbau eines rekombinanten Vektors aus dem DNA-Fragment des Mikroorganismus und dem Vektorfragment unter Verwendung einer geeigneten DNA-Ligase umfasst. Falls notwendig, kann ein rekombinanter Vektor durch Transfektion in einen Wirt nach der Assoziation hergestellt werden, so dass eine DNA-Ligase in dem Wirt verwendet werden kann.
Als Wirt kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, solange ein rekombinanter Vektor darin stabil und zur autonomen Vermehrung befähigt ist und die Expression des Charakters der Fremd-DNA erlaubt, und verwendbar sind zum Beispiel Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 oder Escherichia coli JM109:
Der rekombinante Vektor wird zum Beispiel, wenn der Wirt ein Mikroorganismus ist, der zur Gattung Escherichia gehört, durch Transfektion in Gegenwart von Calcium-Ionen, und wenn der Wirt ein Mikroorganismus ist, der zur Gattung Bacillus gehört, durch das Verfahren der kompetenten Zellen oder das Protoplastenverfahren, zusätzlich mit oder ohne Mikroinjektion, in einen Wirt transfiziert. Es hat sich gezeigt, dass der so erhaltene Mikroorganismus (die Transformante) bei Kultivierung in einem Nährmedium -Glucosidase stabil und in großer Menge erzeugen kann. Der Wirtsmikroorganismus, in den der gewünschte rekombinante Vektor transfiziert werden kann, wird aus den Mikroorganismen ausgewählt, die zur gleichzeitigen Expression von Glucosidase und dem Wirkstofftoleranzmarker des Vektors, der die gewünschte DNA trägt, befähigt sind, und es kann zum Beispiel ein Mikroorganismus gewählt (bzw. selektiert) werden, der in einem Selektionsmedium, das im Hinblick auf den Wirkstofftoleranzmarker hergestellt wurde, wachsen und -Glucosidase erzeugen kann.
Vorzugsweise wird 5-Brom-4-chlor-3-indoiyf- -D-glucopyranosid als Substrat für -Glucosidase zu einem Selektionsmedium gegeben, und ein rekombinanter Vektor, der ein -Glucosidase-Gen enthält, wird beim Screening herausgesucht, wobei man blaue Kolonien als Indikator verwendet.
Die Nucleotidsequenz des durch die oben genannten Schritte erhaltenen - GLucosidase-Gens wurde nach dem Didesoxy-Verfahren analysiert, das in Science 214, 1205-1210 (1981), beschrieben ist, und die Aminosäuresequenz von -Glucosidase wurde aus der Nucleotidsequenz abgeleitet. Die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz der -Glucosidase stimmte perfekt mit dem Ergebnis der Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz der oben genannten, von Bacillus stearothermophilus abgeleiteten -Glucosidase überein. Auf diese Weise kann der einmal selektierte rekombinante Vektor, der das - Glucosidase-Gen enthält, leicht aus dem transformierten Mikroorganismus herausgespalten und in einen anderen Wirt transfiziert werden. Auch kann die DNA, bei der es sich um ein -Glucosidase-Gen handelt, leicht unter Verwendung eines Restriktionsenzyms aus dem rekombinanten Vektor, der das -Glucosidase-Gen enthält, herausgespalten und mit einem Vektorfragment, das in ähnlicher Weise durch Spaltung erhalten wurde, ligasiert und in einen Wirt transfiziert werden.
Die Kultur eines Wirtsmikroorganismus kann unter den Bedingungen durchgeführt werden, die man unter Berücksichtigung der ernährungsphysiologischen Merkmale des Wirtes auswählt. Im allgemeinen wird eine Flüssigkultur gewählt, doch ist eine Kultur mit Belüftung und Rühren unter industriellen Gesichtspunkten vorteilhaft. Die Nahrungsquellen können solche sein, die gewöhnlich für die Kultur von Mikroorganismen eingesetzt werden. Bei der Kohlenstoffquelle kann es sich um jede verwertbare Kohlenstoffverbindung handeln, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose, Melasse und Brenztraubensäure. Bei der Stickstoffquelle kann es sich um jede verwertbare Stickstoffverbindung handeln, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, hydrolysiertes Casein und Alkaliextrakt von Sojabohnen. Außerdem können bei Bedarf auch Salze, wie Phosphat, Carbonat, Sulfat, Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan und Zink, spezielle Aminosäuren und spezielle Vitamine verwendet werden.
Die Kulturtemperatur kann zweckmäßigerweise innerhalb des Bereichs variiert werden, in dem Zellen wachsen und -Glucosidase erzeugen können. Im Falle von Escherichia coli beträgt die bevorzugte Temperatur 20ºC bis 42ºC. Die Kultur wird je nach den Kulturbedingungen unterschiedlich lange durchgeführt, kann jedoch zu einem geeigneten Zeitpunkt beendet werden, wenn die -Glucosidase in den höchsten Ausbeuten erzeugt wurde, normalerweise nach 12 bis 48 Stunden. Der pH- Wert des Mediums kann zweckmäßigerweise innerhalb des Bereichs variiert werden, in dem Zellen wachsen und -Glucosidase erzeugen können, wobei ein pH-Wert von 6,0-8,0 bevorzugt ist.
Das Kulturmedium, das die -Glucosidase-erzeugenden Zellen enthält, kann aus einer Kultur gewonnen und so, wie es ist, verwendet werden, doch wenn -Glucosidase in dem Kulturmedium enthalten ist, werden die - Glucosidase-haltige Lösung und die Zellen normalerweise durch herkömmliche Verfahren, wie Filtration und Zentrifugation, voneinander getrennt und dann verwendet. Wenn -Glucosidase in den Zellen enthalten ist, werden die Zellen zum Beispiel durch Filtration oder Zentrifugation der erhaltenen Kultur geerntet und dann mit einem mechanischen Verfahren oder einem enzymatischen Verfahren unter Verwendung von Lysozym zerstört, und danach wird -Glucosidase in Lösung gebracht, indem man, falls notwendig, ein Chelatisierungsmittel, wie EDTA, und/oder ein Tensid hinzufügt, wodurch man -Glucosidase in wässriger Lösung erhält.
Die so erhaltene Lösung, die -Glucosidase enthält, wird zum Beispiel einer Konzentration unter reduziertem Druck, einer Membrankonzentration, einer Aussalzung mit Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat oder einer fraktionierenden Fällung mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Aceton, unterzogen, um eine Fällung zu ermöglichen. Außerdem sind auch eine Hitzebehandlung und eine isoelektrische Behandlung effektive Methoden zur Reinigung. Gereinigte - Glucosidase kann durch Gelfiltration unter Verwendung eines Adsorbens oder eines Gelfiltrationsmittels, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie erhalten werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Nucleotidsequenz eines - Glucosidase-Gens sowie die Aminosäuresequenz von -Glucosidase aufgeklärt, und -Glucosidase ohne Kontaminierung durch Amylase kann leicht in großen Mengen gentechnisch hergestellt werden.
Die durch die vorliegende Erfindung erhaltene -Glucosidase hat eine höhere spezifische Aktivität und eine höhere Reinheit als die bisher bekannten. Außerdem erlaubt die durch die vorliegende Erfindung erhaltene -Glucosidase eine genaue Bestimmung von -Amylase in Körperflüssigkeiten, was der fehlenden Kontamination durch -Amylase zuzuschreiben ist.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlicher anhand von Beispielen erläutert.
In den Beispielen wurde die -Glucosidase-Aktivität wie folgt bestimmt.
Ein Enzym wurde 20 Minuten lang bei 60ºC in 33,3 mM Phosphatpuffer (pH 6,8), der 2 mM p-Nitrophenyl- -D-glucopyranosid enthielt, umgesetzt, und die Extinktion bei 400 nm wurde bestimmt. Die Menge an Enzym, die notwendig war, um unter diesen Bedingungen 1 umol p-Nitrophenol pro Minute zu erzeugen, wurde als Einheit der Enzymaktivität genommen.

Beispiel 1

Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz von -Glucosidase

Die -Glucosidase-erzeugende Zelle, Bacillus stearothermophilus ATCC 12016, wurde in einem 10-l-Flaschenfermenter kultiviert. Das Medium (pH 7,0) wurde mit 2% löslicher Stärke, 0,05% Fleischextrakt, 0,2% Hefeextrakt, 0,3% K&sub2;HPO&sub4; und 0,1% KH&sub2;PO&sub4; versetzt und 10 Stunden lang bei 60ºC unter Belüftung und Rühren kultiviert.
Das erhaltene Kulturmedium (5,2 l) wurde zentrifugiert, und 80 g Zellen wurden abgetrennt. Die Zellen wurden in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert und in Dyno Mill lysiert, was 21 Zelllysat ergab. Die α- Glucosidase-Aktivität betrug zu diesem Zeitpunkt 5,8 E/ml. Nach Sulfatfraktionierung wurde das Lysat auf Sephadex G-25 (Pharmacia LKB) entsalzt. Die spezifische Aktivität betrug zu diesem Zeitpunkt 4,0 E/mg.
Die entsalzte Lösung wurde auf eine DEAE-Sepharose -CL-6B-Säule aufgetragen, die mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, äquilibriert worden war, und die adsorbierte Fraktion wurde mit einem Gradienten von 0-0,3 M NaCl eluiert. Danach wurde die erhaltene Fraktion wiederum auf Sephadex G-25 entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde einer HPLC auf einer Q-Sepharose -HiLoad-16/10-Säule für die Ionenaustauschchromatographie und dann einer hydrophoben Chromatographie unter Verwendung einer TSKgeI-Phenyl-5PW-Säule unterzogen, was ein gereinigtes α-Glucosidase-Präparat ergab. Die spezifische Aktivität des α-Glucosidase-Präparats betrug 150 E/mg, und die Aktivitätsausbeute betrug 13%. Das a-Glucosidase-Präparat wurde einer SDS-PAGE unterzogen. Dieses Präparat wanderte als einzelne Bande und hatte ein Molekulargewicht von 65 000.
Die bis dahin durchgeführten Reinigungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: α-Glucosidase-Reinigung
Das gereinigte -Glucosidase-Präparat wurde mit einem Aminosäuresequencer analysiert, und die im "Sequence Listing" als Sequenz Nr. 1 gezeigte N-terminale Aminosäuresequenz wurde bestimmt.

Beispiel 2

Abtrennung von chromosomaler DNA

Die chromosomale DNA von Bacillus stearothermophilus ATCC 12016 wurde nach dem folgenden Verfahren isoliert. Diese Zelllinie wurde über Nacht bei 60ºC einer Schüttelkultur in einem gewöhnlichen Bouillonmedium (150 ml) unterzogen und zentrifugiert (8000 U/min. 10 Minuten), um Zellen zu gewinnen. Die Zellen wurden in 5 ml einer Lösung suspendiert, die 10% Saccharose, 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 50 mM EDTA enthielt, und danach wurde 1 ml einer Lysozymlösung (10 mg/ml) hinzugefügt, und das Gemisch wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, und dann wurde 10% SDS (Natriumdodecylsulfat, 1 ml) hinzugefügt. Zu der Suspension wurde eine äquivalente Menge einer Chloroform-Phenol-Lösung (1 : 1) gegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Dann wurde das Gemisch 3 Minuten lang mit 10 000 U/min zentrifugiert, so dass es in eine Wasserschicht und eine Lösungsmittelschicht getrennt wurde, und die Wasserschicht wurde abgetrennt. Eine zweifache Menge Ethanol wurde vorsichtig über die Wasserschicht geschichtet, und DNA wurde isoliert, indem man das Gemisch langsam mit einem Glasstab rührte, so dass sich die DNA um den Glasstab wickeln konnte; dann wurde sie in einer Lösung von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA (im folgenden als TE abgekürzt) gelöst. Nach der Behandlung der Lösung mit einer äquivalenten Menge Chloroform-Phenol wurde die Wasserschicht durch Zentrifugation abgetrennt. Eine zweifache Menge Ethanol wurde hinzugefügt, und die DNA wurde wiederum in derselben Weise wie oben isoliert und in 2 ml TE gelöst.
Die kompetente Zelle von Escherichia coli JM109 wurde nach dem Verfahren von Hanahan hergestellt und als Wirt für den Aufbau einer Bibliothek verwendet.

Beispiel 3

Herstellung eines DNA-Fragments, das ein Gen enthält, in dem a-Glucosidase codiert ist, und eines rekombinanten Vektors, der das DNA-Fragment enthält.
Die in Beispiel 2 erhaltene DNA (1 ug) wurde 1 Stunde lang bei 37ºC mit 10 Einheiten eines Restriktionsenzyms Aval (hergestellt von Toyo Boseki K. K.) umgesetzt, bis sie vollständig zersetzt war. In ähnlicher Weise wurde die DNA 12 Stunden lang bei 16ºC in Gegenwart von 1 Einheit T4- DNA-Ligase (hergestellt von Toyo Boseki K. K.) mit 0,5 ug pUC19, das mit Aval gespalten worden war, umgesetzt, um die DNA zu ligasieren. Mit der auf diese Weise ligasierten DNA Wurde die kompetente Zelle von Escherichia coli JM109 transformiert. Eine Kolonie von 1 · 106 transformierten Zellen pro ug der verwendeten DNA wurde erhalten. Die erhaltenen Kolonien wurden 18 Stunden lang bei 37ºC in einem LB- Medium (1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid) kultiviert, dem 50 ug/ml Ampicillin und 0,01% 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-α -glucopyranosid zugesetzt war, und die rekombinante DNA, die das α- Glucosidase-Gen enthielt, wurde durch Screening herausgesucht, wobei man blaue Kolonien als Indikator verwendete.
Als Ergebnis wurde von 3000 Kolonien eine Kolonie erhalten, die eine blaue Farbe zeigte. Das Plasmid darin enthielt ein 5,4-kbp-DNA-Fragment als Einschub, und dieses Plasmid wurde pSAGHI genannt. Dann wurde der DNA-Fragment-Einschub durch verschiedene Restriktionsenzyme aus dem pSAGHI abgespalten und in pUC19 subkloniert, was pSAGH2-9 ergab, das ein 2,2-kbp-DNA-Fragment als Einschub enthielt und mit dem Escherichia coli JM109 transformiert wurde. Die Restriktionsenzymkarte des DNA- Einschubs von pSAGH2-9 ist in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 4

Bestimmung der Nucleotidsequenz

Der 2,2-kbp-DNA-Fragment-Einschub von pSAGH2-9 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen abgespalten, und Subklone wurden hergestellt. Aus den verschiedenen Subklonen wurde nach herkömmlichen Verfahren eine einzelsträngige DNA präpariert, und die einzelsträngige DNA wurde mit dem SEQUENASE -VERSION-2.0-7-deaza-dGTP-Kit (hergestellt von Toyo Boseki K. K.) analysiert, um ihre Nucleotidsequenz zu bestimmen. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz sind im "Sequence Listing" als Sequenz Nr. 2 gezeigt.

Beispiel 5

Herstellung von -Glucosidase

Das oben genannte LB-Medium (6 l) wurde in einen 10&supmin;¹-Flaschenfermenter gegeben, 15 Minuten lang bei 121ºC autoklaviert, abkühlen gelassen und mit 6 ml 50 mg/ml Ampicillin (hergestellt von Nacalai Tesque) und 200 mM IPTG, das getrennt durch Filtration sterilisiert wurde, versetzt. In dieses Medium wurden 60 ml eines Kulturmediums von Escherichia coli JM109 (pSAGH2-9) eingeimpft, das zuvor 18 Stunden lang bei 37ºC in einem Medium mit derselben Zusammensetzung wie oben einer Schüttelkultur unterzogen worden war, und das Medium wurde 18 Stunden lang bei 37ºC unter Belüftung und Rühren kultiviert. Die α-Glucosidase-Aktivität bei Beendigung der Kultur betrug 12,5 E/ml. Das Kulturmedium (6 l) wurde zentrifugiert, um Zellen zu gewinnen, und die Zellen wurden in 200 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Die Zellen wurden nach einem herkömmlichen Verfahren mit Hilfe einer Dyno Mill lysiert und 20 Minuten lang bei 15 000 U/min zentrifugiert, was eine Rohenzymlösung von α-Glucosidase ergab. Diese Rohlösung wurde mit Protamin behandelt, um Nucleinsäure zu entfernen, und einer Fraktionierung unter Verwendung von Ammoniumsulfat unterzogen. Der Niederschlag wurde in 50 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und 16 Stunden lang auf 55ºC erhitzt. Die resultierende Lösung wurde auf Sephadex G-25 entsalzt und einer Chromatographie auf DEAE-Sepharose CL-6B unterzogen, was eine Fraktion mit -Glucosidase-Aktivität ergab.
Die -Glucosidase-Fraktion nach der Chromatographie auf DEAE-Sepharose zeigte bei der SDS-PAGE eine einzelne Bande, eine spezifische Aktivität von 187 E/mg und eine Aktivitätsausbeute von 70,5%.
Die Enzymeigenschaften der aus einer Transformanten erhaltenen -Glucosidase waren wie folgt: Molekulargewicht 65 000, isoelektrischer Punkt 5,2, pH-Optimum 6-7, Wärmeresistenz nicht mehr als 60ºC (pH 7,0, 15 Minuten Behandlung) und Temperaturoptimum 60ºC. Die bis dahin durchgeführten Reinigungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: α-Glucosidase-Reinigung
Im Vergleich zu den Ergebnissen von Tabelle 1 wurde in demselben Kulturmaßstab, aber mit einem leichteren Reinigungsverfahren, eine etwa 38mal größere Menge an -Glucosidase in höherer Reinheit erhalten.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
(B) STRASSE: 2-8, Dojimahama 2-chome
(C) ORT: Kita-ku,-Osaka-shi, Osaka
(E) LAND: Japan
(F) POSTLEITZAHL: 530
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: PROTEIN MIT alpha-GLUKOSIDASE AKTIVITAET, DNS MIT DESSEN GENETISCHER INFORMATION UND HERSTELLUNG VON alpha-GLUKOSIDASE
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(v) DATEN DER JETZIGEn ANMELDUNG:
ANMELDENUMMER: EP 93105023.1
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM; Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Bacillus stearothermophilus
(B) STAMM: ATCC12016
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2074 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Bacillus stearothermophilus
(B) STAMM: ATCC12016
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: genomic
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:199..1863
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 555 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

Claims

1. Gereinigtes Protein mit α-Glucosidase-Aktivität, wobei das Protein gekennzeichnet ist

(1) durch eine Aminosäuresequenz, wie sie als Sequenz Nr. 3 im "Sequence Listing" abgebildet ist;

(2) durch ein Molekulargewicht von 65000 (SDS-PAGE);

(3) durch ein Temperaturoptimum von 60ºC; und

(4) dadurch, dass es im wesentlichen frei von einer Kontamination durch α-Amylase ist.

2. Protein gemäß Anspruch 1, das von einem Mikroorganismus erhältlich ist, der zur Gattung Bacillus gehört.

3. Protein gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört, um Bacillus stearothermophilus ATCC 12016 handelt.

4. DNA, die das Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert.

5. Rekombinanter Vektor, der die DNA gemäß Anspruch 4 enthält.

6. Transformante, die mit dem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 5 transformiert ist.

7. Verfahren zur Herstellung von α-Glucosidase, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, wobei das Verfahren das Kultivieren der Transformante von Anspruch 6 in einem Medium, so dass sie α-Glucosidase erzeugt, und das Erntender α-Glucosidase umfasst.