DE69116593T2

DE69116593T2 - Cephalosporin Acetylhydrolasegen und dadurch kodiertes Protein

Info

Publication number: DE69116593T2
Application number: DE69116593T
Authority: DE
Inventors: Kenji Mitsushima; Takayasu Sonoyama; Akio Takimoto; Shigeo Yagi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-04-27
Filing date: 1991-04-26
Publication date: 1996-07-04
Anticipated expiration: 2011-04-27
Also published as: CN1047202C; DK0454478T3; CA2040707C; ES2085422T3; CA2040707A1; IL97915A0; JPH04228079A; CN1155712C; EP0454478B1; AU638124B2; US5281525A; GR3018790T3; JP2651288B2; NZ237878A; KR910018549A; KR960014703B1; CN1227872A; IL97915A; AU7535491A; DE69116593D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen, ein rekombinantes DNA-Molekül, das durch Einführen dieses Gens in einen in einem Escherichia coli-Wirtsvektorsystem verwendeten Vektor hergestellt wurde, mit diesem rekombinanten DNA-Molekül transformierte E. coli-Zellen, ein Protein mit einer von diesem Gen codierten Aminosäuresequenz, ein Enzym, das ein Multimer, vorzugsweise ein Tetramer oder Octamer dieses Proteins umfaßt, und ein Verfahren zur Herstellung dieses Proteins oder Enzyms.
Bisher wurden Cephalosporine, wie z.B. Cephalosporin C und 7- Aminocephalosporansäure (nachstehend als 7-ACA bezeichnet), durch Eliminierung der an die 3-Position der Hydroxymethyl-Gruppe gebundenen Acetyl-Gruppe (nachstehend als Deacetylierung bezeichnet) erzeugt, wobei deacetylierte Verbindungen, wie Deacetylcephalosporin C und Deacetyl-7-ACA, entstehen, die sich als Ausgangsmaterial zur Synthese verschiedener Cephalosporin-Antibiotika, einschließlich der bereits auf dem Markt erhältlichen Antibiotika, eignen.
Zur Deacetylierung von Cephalosporinen gibt es chemische und enzymatische Verfahren. Man geht davon aus, daß letztere Verfahren vorteilhaft sind, teils weil sie bei annähernd neutralem pH-Wert sowie milden Temperaturen durchgeführt werden können und teils weil sie weniger Nebenreaktionen haben. Mehrere enzymatische Verfahren sind bereits offenbart worden (beispielsweise in den Japanischen Patenten 108,790/1984, 132,294/1974 und 67,489/1986 und dem US-Patent 3,304,236).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, daß ein aus dem Boden isolierter Bacillus subtilis-Stamm Cephalosporin-Acetylhydrolase produziert. Durch Deacetylierung von Cephalosporinen produziert er wirksam Deactylcephalosporine. Diese Beobachtung hat die Erfinder auf den Gedanken gebracht, daß die Konstruktion eines Mikroorganismus, der vorzugsweise Cephalosporin-Acetylhydrolase produzieren kann, mit Hilfe von DNA- Rekombinationstechniken sehr vorteilhaft für die industrielle Herstellung von Deacetylcephalosporinen wäre. Ein derartiger Mikroorganismus, der sich durch die ausschließliche Produktion von Cephalosporin-Acetylhydrolase auszeichnet, ist bis jetzt nicht bekannt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine umfangreiche Untersuchung durchgeführt und es gelang ihnen, ein DNA-Fragment, das ein Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen aus einem neu aus dem Boden isolierten Bacillus subtilis-Stamm enthielt, zu isolieren, aufzureinigen und in E. coli zu clonieren. Sie stellten auch fest, daß E. coli, das mit einem Plasmid-DNA-Vektor transformiert war, in das dieses DNA-Fragment inseriert worden war, eine beträchtliche Menge Cephalosporin-Acetylhydrolase produzierte. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der vorstehenden Ergebnisse vollendet.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Cephalosporin-Acetylhydrolase- Gen, eine dieses Gen enthaltende rekombinante DNA, mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierte E. coli-Zellen, ein Protein mit einer von diesem Gen codierten Aminosäuresequenz, ein Enzym, das ein Multimer des Proteins umfaßt, und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins oder Enzyms bereit.
Der neu isolierte Bacillus subtilis-Stamm SHS0133, aus dem das Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen erfindungsgemäß gewonnen wurde, wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages unter der Eingangsnummer FERM BP-2755 hinterlegt (Datum: 15. Februar 1990).
Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen bereit:
(1) eine Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Protein oder Enzym umfaßt, zur Verwendung bei der Deacetylierung eines Cephalosporins sowie
(2) ein Verfahren zur Deacetylierung eines Cephalosporins, das die Behandlung dieses Cephalosporins mit einem erfindungsgemäßen Protein oder Enzym umfaßt.
Die Verwendung eines mit Hilfe des Verfahrens von (2) produzierten, deacetylierten Cephalosporins zur Herstellung eines Antibiotikums ist ebenfalls beschrieben.
Figur 1 stellt die Aminosäuresequenz der Cephalosporin-Acetylhydrolase dar.
Figur 2 stellt die Basensequenz des Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gens (untere Reihe) und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (obere Reihe) dar.
Figur 3 zeigt die teilweise bestimmte Aminosäuresequenz (34 Aminosäure- Reste) der Cephalosporin-Acetylhydrolase.
Figur 4 zeigt vier synthetische Oligonucleotid-Sonden, die alle genetisch möglichen DNA-Basensequenzen umfassen, die aus der in Figur 3 unterstrichenen Aminosäuresequenz abgeleitet wurden.
Figur 5 zeigt die Restriktionsenzymkarte des rekombinanten Plasmids pCAH01 und die Stelle, an der die DNA-Sonden hybridisieren.
Figur 6 stellt die Restriktionsenzymkarte des rekombinanten Plasmids pCAH03 dar.
Figur 7 stellt die DNA-Sequenz des clonierten Cephalosporin- Acetylhydrolase-Gens und flankierender Bereiche dar.
Figur 8 stellt die Konstruktion des verkleinerten Plasmids pCAH10 dar, das dem Plasmid pCAH03 entspricht, bei dem jedoch ein stromabwärts vom Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen gelegener Bereich deletiert ist.
Figur 9 stellt die Konstruktion des in E. coli verwendeten Expressionsplasmids pCAH21 dar.
Figur 10 stellt die Konstruktion der in E. coli verwendeten Expressionsplasmide pCAH211 und pCAH212 dar.

Charakterisierung des B. subtilis-Stamms SHS0133

1. G+C-Molprozent (%) der chromosomalen DNA: 43,4
2. Morphologische Merkmale
Der Stamm ist ein grampositives, kleines stäbchenförmiges Bakterium mit einer Größe von 0,7 - 0,8 x 1,8 - 2,6 µm, das peritrich begeißelt ist. Unter aeroben Bedingungen wächst der Stamm gut und unter anaeroben Bedingungen in einem Glucose enthaltenden natürlichen Medium schwach. Sporen mit einer Größe von 0,8 x 1,3 - 1,7 µm werden im zentralen Teil der Zelle gebildet.
3. Züchtungsmerkmale
(1) Fleischextrakt-Agarplatten-Kultur (7 Tage bei 30ºC)
Koloniebildung: 24 Stunden nach Beimpfung
Form: ungleichmäßig
Oberfläche: lamellenförmig
Rand: gewellt
Höhen-Ausdehnung: konvex
Farbe: cremefarben
Glanz: glanzlos
Optische Eigenschaften: undurchsichtig
(2) Fleischextrakt-Schrägagar-Kultur (7 Tage bei 30ºC)
Wachstum: gut
Form: filamentös
Oberfläche: lamellenförmig
Farbe: cremefarben
Glanz: glanzlos
Optische Eigenschaften: undurchsichtig
Konsistenz: butterartig
(3) Kultur in Fleischextrakt-Nährlösung (7 Tage bei 30ºC)
Wachstum auf der Oberfläche: ein dicker Film wird gebildet
Trübung: geringfügig
Geruch: leicht aromatisch
Bodensatz: sichtbar
Menge des Bodensatzes: wenig
(4) Fleischextrakt-Gelatine-Stichkultur (30 Tage bei 24ºC)
Wachstum: gleichmäßiges Wachstum entlang der Einstichlinie
Einstichlinie: filamentös
Art der Verflüssigung: am 7. Tag bei 24ºC verflüssigt, unter Bildung einer 0,5 mm dicken verflüssigten Schicht (flächenförmig)
(5) Lackmus-Milch-Kultur
Lackmus wird reduziert. Casein wird ohne Koagulation schnell gespalten.
4. Biochemische Eigenschaften
(1) Nitratreduktion: positiv
(2) Denitrifizierung: positiv
(3) MR-Test: negativ
(4) VP-Test: positiv
(5) Indol-Bildung: negativ
(6) H&sub2;S-Bildung: Bleiacetatpapier: negativ
TSI: negativ
Krigler: negativ
(7) Stärkehydrolyse: positiv
(8) Citratverwertung: Koser: positiv
Christensen: positiv
(9) Verwertung anorganischer Stickstoff-Quellen:
Nitrat: positiv
Ammonium: positiv
(10) Pigmentbildung: es wurde ein braunes Pigment gebildet
(11) Urease-Test: positiv
(12) Oxidase-Test: positiv
(13) Catalase-Test: positiv
(14) pH-Wert: Wachstumsbereich: 1,5 - 8,8
Optimum: 6,0 - 8,8
(15) Temperatur: Wachstumsbereich: 16,5ºC - 50,5ºC
Optimum: 26,0ºC - 36,0ºC
(16) OF-Test:
D-Glucose: fermentative Säureproduktion ohne Gasbildung
Lactose: fermentative Säureproduktion ohne Gasbildung
(17) Bildung von Säuren und Gas aus verschiedenen Zuckern
i) Säureproduktion ohne Gasbildung aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Mannit, Glycerin und Stärke;
ii) weder Säureproduktion noch Gasbildung aus D-Galactose, Lactose, D-Sorbit und Inosit.
(18) Nährstoff-Bedarf: keine
(19) Pectin-Abbau: positiv
(20) Hippursäure-Abbau: negativ
(21) Bildung von Levan (aus Saccharose, Raffinose): positiv
(22) Argininhydrolase: negativ
(23) Lecithinase: negativ
(24) Wachstum unter anaeroben Bedingungen: in D-Glucose enthaltendem natürlichem Medium geringes Wachstum.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen Ergebnisse wurde der Stamm auf der Basis von Bergey's "Manual of Systematic Bacteriology", Bd. II (1986) als Bacillus subtilis-Stamm bestimmt und als Bacillus subtilis SHS0133 bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin-Acetylhydrolase unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das hergestellt wurde, indem eine isolierte DNA-Basensequenz, die die in Figur 1 dargestellte Aminosäuresequenz codiert und vorzugsweise die in Figur 2 dargestellte DNA-Basensequenz ist, in einen im E. coli-Wirtsvektorsystem verwendeten Vektor eingeführt wurde. Das Verfahren kann durch Anwendung der folgenden sieben Schritte realisiert werden, die den Verlauf der Entwicklung der vorliegenden Erfindung darstellen, obwohl aufgrund der Offenbarung der die Cephalosporin-Acetylhydrolase codierenden DNA- Basensequenz in der vorliegenden Erfindung das Verfahren auf einfachere Weise durchgeführt werden kann.
(1) Bacillus subtilis (FERM BP-2755) wird in einem geeigneten Medium gezüchtet, wobei Cephalosporin-Acetylhydrolase produziert wird. Die produzierte Cephalosporin-Acetylhydrolase wird vom Medium abgetrennt und aufgereinigt. Das gereinigte Enzym wird mit einer zur Fragmentierung eines Proteins verwendeten geeigneten Protease gespalten, die erhaltenen Peptidfragmente werden abgetrennt und dann wird die Aminosäuresequenz eines der Peptidfragmente ausgehend vom Amino-Terminus bestimmt.
(2) Mögliche DNA-Basensequenzen, die einem Teil der bestimmten Aminosäuresequenz entsprechen, werden abgeleitet, ein Pool von Oligonucleotiden mit den abgeleiteten Basensequenzen wird chemisch synthetisiert und die 5'-Enden der Oligonucleotide werden mit ³²P markiert. Die markierten Oligonucleotide werden als Sonden zur Genclonierung verwendet.
(3) Aus B. subtilis (FERM BP-2755) wird chromosomale DNA extrahiert, aufgereinigt, mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und einer Elektrophorese auf einem Agarose-Gel unterworfen. Die getrennten DNA- Fragmente werden vom Gel auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen. Zur Selektion von DNA-Fragmenten mit Homologie zu den Sonden wird eine Southern-Hybridisierung unter Verwendung der Nitrocellulose-Membran und der im vorstehenden Schritt (2) hergestellten ³²P-markierten Sonden durchgeführt. Aus den DNA-Fragmenten wird ein Fragment ausgewählt, dessen Größe die Größe des erwünschten Gens, die aufgrund des Molekulargewichts des Cephalosporin-Acetylhydrolase-Proteins zu erwarten ist, etwas übersteigt. Der das DNA-Fragment enthaltende relevante Bereich auf dem Agarose-Gel wird ausgeschnitten und die DNA wird extrahiert.
(4) Das im vorstehenden Schritt (3) erhaltene DNA-Fragment wird in einen E. coli-Clonierungsvektor inseriert und das erhaltene rekombinante Plasmid wird mittels Transformation in E. coli-Zellen eingeführt. Zur Koloniebildung werden die Transformanten auf Agarmedium ausplattiert und dann wird unter Verwendung der ³²P-markierten Sonden eine Kolonie-Hybridisierung durchgeführt. E. coli-Kolonien mit Homologie zu den Sonden werden ausgewählt und isoliert.
(5) Aus den ausgewählten E. coli-Zellen wird DNA des rekombinanten Plasmids extrahiert und es wird eine Restriktionsenzymkarte konstruiert. Anschließend werden die für das Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen irrelevanten Bereiche beseitigt. Die Basensequenz des aus B. subtilis stammenden, Cephalosporin-Acetylhydrolase codierenden DNA-Fragments wird bestimmt. Die aus der bestimmten DNA-Basensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz wird dann mit der partiellen Aminosäuresequenz, dem Molekulargewicht, der terminalen Aminosäuresequenz und der Aminosäurezusammensetzung der Cephalosporin-Acetylhydrolase verglichen. Anschließend wird das Strukturgen der Cephalosporin-Acetylhydrolase bestimmt.
(6) Zur Konstruktion eines rekombinanten Expressionsplasmids wird das das Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen enthaltende DNA-Fragment in geeigneter Weise modifiziert und dann in einen Genexpressionsvektor für E. coli eingeführt, so daß sich das Strukturgen an einen aus E. coli stammenden Promotor anschließt.
(7) Das vorstehend erhaltene rekombinante Expressionsplasmid wird mittels Transformation in einen E.coli-Wirt eingeführt, wobei ein neuer, Cephalosporin-Acetylhydrolase produzierender E. coli-Stamm hergestellt wird.
Die in den vorstehend beschriebenen Schritten angewendeten Verfahren sind dem Fachmann bekannt und können nach experimentellen Verfahrensweisen, die in Standard-Lehrbüchern offenbart sind, wie z.B. in T. Maniatis et al., "Molecular Cloning" (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, ohne weiteres durchgeführt werden. Alle verwendeten Materialien, wie Enzyme und Reagenzien, sind im Handel erhältlich und können nach den Anweisungen der Hersteller verwendet werden.
Als E. coli-Wirt kann ein Stamm des E. coli-Abkömmlings K-12 verwendet werden, wie z.B. HB101, DH1, C600, JM103, JM105 oder JM109. Beispiele für E. coli- Vektoren, die zur Clonierung verwendet werden, sind sowohl Plasmidvektoren, wie pUC13, pBR322 und pAT153, als auch Phagenvektoren, wie λgt10. Die vorstehend erwähnten Wirte und Vektoren sind im Handel verfügbar und ohne weiteres erhältlich.
Das im vorstehend beschriebenen Schritt (1) verwendete Verfahren zur Aminosäuresequenzierung eines Proteins ist bekannt (beispielsweise kann eine im Handel erhältliche automatische Aminosäure-Sequenzierungsvorrichtung verwendet werden). Im vorstehenden Schritt (2) kann die Synthese von Oligonucleotiden unter Verwendung einer im Handel erhältlichen DNA-Synthesevorrichtung nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden. Die Bestimmung der DNA-Basensequenz im vorstehenden Schritt (5) kann nach dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74 (1977), 5463-5467, durchgeführt werden, wobei ein bekanntes M13-Vektorsystem eingesetzt wird.
Die Konstruktion eines Plasmids im vorstehenden Schritt (6) zur effizienten Expression des gewünschten Gens in E. coli kann durchgeführt werden, indem ein das gewünschte Strukturgen der Cephalosporin- Acetylhydrolase enthaltendes DNA-Fragment in einen Expressionsvektor (pKK223-3, pBS, pDR540, pPL-lambda, usw.), der einen in einem Wirt funktionierenden geeigneten Promotor (Lac, Tac, Trc, Trp, PL, usw.) und eine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz enthält, oder in einen ATG-Vektor (pKK233-2, usw.) inseriert wird, der zusätzlich das Translations-Startcodon ATG enthält. Durch Einführung des Expressionsplasmids in einen geeigneten Wirt (beispielsweise in einen Stamm wie E. coli JM103, JM109, H8101 und C600) wird ein Mikroorganismus erhalten, der Cephalosporin-Acetylhydrolase wirksam exprimiert.
Die exprimierte Cephalosporin-Acetylhydrolase kann nach einem üblichen Reinigungsverfahren, beispielsweise durch Kombination von Zentrifugation, Säulen-Chromatographie und dergleichen, aufgereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert, ist jedoch nicht darauf beschränkt.

Beispiel 1

1. Trennung und Reinigung der Cephalosporin-Acetylhydrolase und Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz

(1) Trennung und Aufreinigung der Cephalosporin-Acetylhydrolase

Ein aus 2,5% Glucose, 0,75% Maisquellwasser, 1% Aminosäuregemisch, 0,3% KH&sub2;PO&sub4; und 0,8 ppm MnSO&sub4; x 4 H&sub2;O bestehendes Medium (20 l) mit einem pH- Wert von 7,0 wurde in einen Glasfermentor mit einem Volumen von 30 l gegeben. Nach Sterilisation wurde B. subtilis (FERM BP-2755), das in einem aus 0,5% Glucose, 0,75% Maisquellwasser, 0,5% Aminosäuregemisch und 0,02% KH&sub2;PO&sub4; bestehenden Medium mit einem pH-Wert von 7,0 vorinkubiert worden war, bis zu einer Inokulum-Endkonzentration von 6% in das Medium gegossen. Nach 48-stündiger Züchtung bei 28ºC wurde der Kulturflüssigkeit aktivierte Holzkohle bis zu einer Konzentration von 1% zugegeben und danach wurde 2 Stunden gerührt. Durch anschließende Filtration wurde eine Rohenzym- Lösung als Filtrat erhalten. Der Rohenzym-Lösung wurde DEAE-Sephadex-A-50 (Pharmacia) bis zu einer Konzentration von 0,7% zugegeben, der pH-Wert des Gemisches wurde unter Verwendung von 2 N NaOH auf 8,0 eingestellt und danach wurde eine Stunde gerührt. Nach Filtration wurde DEAE-Sephadex-A-50 mit darauf adsorbierter Cephalosporin-Acetylhydrolase-Aktivität mit 0,1 M NaCl enthaltendem 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0, 4 l) gewaschen und die Aktivität wurde mit demselben Puffer, der jedoch 0,4 M NaCl enthielt, eluiert. Nach Konzentrieren und Entsalzen mit Hilfe einer Ultrafiltrationsapparatur (Tosoh) wurde die Aktivität an eine mit DEAE-Sepharose-CL-6B (Pharmacia) gefüllte Säule adsorbiert, die vorher mit demselben Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit demselben Puffer und anschließend mit demselben, jedoch 0,15 M NaCl enthaltenden Puffer gewaschen. Die Aktivität wurde mit demselben, jedoch 0,2 M NaCl enthaltenden Puffer eluiert. Nach Konzentrieren und Entsalzen mittels Ultrafiltration wurde eine Reinigung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (nachstehend als HPLC bezeichnet) durchgeführt. Als Säule wurde DEAE-Toyopearlpak 650M (Tosoh) verwendet. Die Aktivität wurde mit Hilfe eines Konzentrationsgradienten eluiert, wobei die Salzkonzentration schrittweise erhöht wurde. Bei der Elution wurde mit demselben, 0, 15 M NaCl enthaltendem Puffer begonnen und dann wurde die NaCl-Konzentration schrittweise auf 0,5 M angehoben. Fraktionen, die die eluierte Aktivität enthielten, wurden gesammelt, mittels Ultrafiltration konzentriert und danach mittels HPLC unter Verwendung einer Molekularsieb-Säule gereinigt. Als Säule wurde TSK-G3000 (Tosoh) und als mobile Phase 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0) verwendet. Die eluierten aktiven Fraktionen wurden gesammelt, mittels Ultrafiltration konzentriert und dann unter Verwendung einer Umkehrphasen-Säule mittels HPLC gereinigt. Als Säule wurde Microbondapak C&sub1;&sub8; (Waters) verwendet und die Elution wurde mittels eines Konzentrationsgradienten durchgeführt, wobei die Konzentration von Acetonitril schrittweise angehoben wurde. Dabei wurde mit einem 0,1% Trifluoressigsäure enthaltenden wäßrigen System begonnen und die Acetonitril-Konzentration auf eine Endkonzentration von 98% erhöht. Die Fraktionen, die die eluierte Cephalosporin-Acetylhydrolase enthielten, wurden unter vermindertem Druck bei 50ºC konzentriert und der Rückstand wurde in 6 M Guanidinhydrochlorid enthaltendem 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gelöst. Der Lösung wurden EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) bis zu einer Konzentration von 2 mM und eine im Vergleich zur Cephalosporin- Acetylhydrolase 200fache Molmenge 2-Mercaptoethanol zugegeben. Dann wurde 4 Stunden bei 37ºC unter Stickstoff-Atmosphäre eine Reduktion durchgeführt. Anschließend wurde der Lösung eine im Vergleich zur Cephalosporin-Acetylhydrolase 190fache Molmenge Natriumjodacetat zugegeben und das Gemisch wurde zur Durchführung einer reduzierenden Carboxymethylierung 10 Minuten bei 37ºC im Dunkeln umgesetzt. Danach wurde erneut nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren eine Reinigung mittels HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen-Säule durchgeführt. Die erhaltenen Cephalosporin-Acetylhydrolase enthaltenden Fraktionen wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach dem Verfahren von Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685, untersucht. Dabei wurde nur eine einzige Bande bei einer Position nachgewiesen, die einem Molekulargewicht von 35 kD entsprach, was eine Reinigung zur Homogenität nahelegte. Die gereinigte, in 7 M Harnstoff enthaltendem 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gelöste Cephalosporin-Acetylhydrolase wurde durch eine 10fache Verdünnung mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) reaktiviert. Die Aktivität wurde unter Anwendung der vorstehend erwähnten HPLC mittels Molekularsieb- Säulenchromatographie bei einer Position eluiert, die einem Molekulargewicht von 280 kD entsprach, was darauf hindeutete, daß die Cephalosporin- Acetylhydrolase in natürlicher Form als Octamer vorliegt, das aus homogenen Untereinheiten besteht.
Andererseits betrug das unter Verwendung des Verfahrens von Hedrick et al., Arch. Biochem. Biophys. 126 (1968), 155-164, bestimmte Molekulargewicht etwa 150 kD und an der entsprechenden Position wurde ebenfalls Aktivität nachgewiesen, was darauf hindeutete, daß auch das Tetramer aktiv ist.
Durch Analyse der terminalen Aminosäuren der gereinigten Cephalosporin-Acetylhydrolase mittels Edman-Abbau und Hydrazin-Hydrolyse wurde festgestellt, daß der Amino-Terminus aus Methionin und der Carboxyl- Terminus aus Glycin besteht.
(2) Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz der Cephalosporin- Acetylhydrolase
Gereinigte Cephalosporin-Acetylhydrolase (1 mg) wurde in 2 M Harnstoff enthaltendem 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,8,1,0 ml) gelöst. Der Lösung wurde Lysylendopeptidase (0,01 mg) zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden bei 37ºC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels HPLC getrennt. Als Säule wurde Microbondapak C 18 (Waters) verwendet und die Elution wurde mittels eines Konzentrationgradienten durchgeführt, wobei die Konzentration von Acetonitril schrittweise erhöht wurde. Dabei wurde mit einem 0,1% Trifluoressigsäure enthaltenden wäßrigen System begonnen und die Acetonitril-Konzentration wurde auf eine Endkonzentration von 98% erhöht. Der Nachweis erfolgte bei 214 nm. Von den getrennten Peaks wurden charakteristische Fraktionen mit langer Durchlaufzeit gesammelt und unter Verwendung der gleichen Umkehrphasen-Säule erneut gereinigt. Unter Verwendung einer automatischen Gasphasen-Sequenziervorrichtung (Applied Biosystems) wurde die Aminosäuresequenz des Peptids bestimmt, wobei die in Figur 3 gezeigte Aminosäuresequenz vom Amino-Terminus bis zur 34. Aminosäure des Peptidfragments erhalten wurde.

2. Synthese von DNA-Sonden und Markierung der 5'-Enden

Die Sequenz, die in der im vorstehenden Schritt 1 erhaltenen Aminosäuresequenz von Figur 3 unterstrichen ist, wurde ausgewählt und ein Pool von Oligonucleotiden synthetisiert, der allen genetisch möglichen DNA- Basensequenzen entsprach, die aus der Aminosäuresequenz abgeleitet worden waren. Wie in Figur 4 gezeigt, wurden vier als DNA-Sonden CAH-RM1, CAH-RM2, CAH-RM3 und CAH-RM4 bezeichnete Gruppen von Oligonucleotiden synthetisiert. Die Synthese der Oligonucleotide wurde unter Verwendung der automatischen DNA-Synthesevorrichtung ZEON-GENET A-II (Nihon Zeon) durchgeführt.
Die 5'-Enden der erhaltenen DNA-Sonden wurden unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase und [γ-³²P]ATP nach dem Verfahren von Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6 (1979), 3543-3557, markiert.

3. Extraktion sowie Aufreinigung chromosomaler DNA aus B. subtilis und Southern-Hybridisierung

Zellen von B. subtilis (FERM BP-2755) wurden mit Lysozym und anschließend Natrium-N-lauroylsarcosinat behandelt. Aus dem erhaltenen Lysat wurde chromosomale DNA nach dem Verfahren von Harris-Warrick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (1975), 2207-2211 mittels Gleichgewichts- Ultrazentrifugation unter Verwendung eines CsCl-Ethidiumbromid- Dichtegradienten extrahiert und aufgereinigt. Die DNA (1 µg) wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen (jeweils etwa 10 Einheiten) unter geeigneten Bedingungen gespalten. Die Reaktanten wurden einer Elektrophorese auf einem 0,8%-igen Agarose-Gel unterworfen. Nach Untersuchung der Restriktionsenzym-Spaltmuster wurde das Gel nach dem Verfahren von Southern et al., J. Mol. Biol. 98 (1975), 503-517, einer Southern- Hybridisierung unterworfen. Zur DNA-Denaturierung wurde das Gel 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einer 0,5 N NaOH enthaltenden 1,5 M NaCl-Lösung behandelt und dann 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 1,5 M NaCl enthaltendem 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) neutralisiert. Zur Übertragung der DNA vom Gel auf eine Membran wurde dann eine Nitrocellulose-Membran auf das Gel gelegt. Unter Verwendung der Nitrocellulose-Membran mit der übertragenen DNA wurde eine Hybridisierung mit markierten Sonden durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 38ºC unter Verwendung von 4fach konzentriertem SSC-Puffer (1 x SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 10fach konzentrierter Denhardt-Lösung (1 x Denhardt-Lösung: 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin) und etwa 1 x 10&sup6; cpm/ml markierten Sonden durchgeführt. Die Membran wurde mehrmals mit 4fach konzentriertem SSC-Puffer bei Raumtemperatur gewaschen und dann einer Autoradiographie unterworfen. Außerdem wurde die Waschtemperatur der Membran schrittweise erhöht und die Membran wiederholt, d.h. bei jeder Waschtemperatur, einer Autoradiographie unterworfen. Es stellte sich heraus, daß mehrere DNA-Banden selbst bei hohen Waschtemperaturen, wie 48ºC und 53ºC, positive Signale zeigten und daß die hybridisierenden Banden je nach verwendetem Restriktionsenzym unterschiedlich groß waren. Von den DNA- Fragmenten, die positive Signale zeigten, wurden das 2,5 kb - 3 kb große DraI- und das 4 kb - 4,5 kb große HindIII-Spaltfragment vorzugsweise zur Genclonierung verwendet, da sie größer als das gewünschte Gen waren.

4. Clonierung des Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gens

(1) Konstruktion einer Genbank

Chromosomaler DNA (12 µg) aus B. subtilis (FERM BP-2755), die im vorstehenden Schritt 3 extrahiert und aufgereinigt worden war, wurde das Restriktionsenzym DraI (etwa 120 Einheiten) zugegeben und dann wurde 90 Minuten bei 37ºC inkubiert. Der Reaktant wurde danach mit Phenol in gleicher Menge extrahiert. Der erhaltenen wäßrigen Phase wurde Ethanol zur DNA- Präzipitation zugegeben. Die erhaltene DNA wurde in TE-Puffer [10 mM Tris- HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0] (60 µl) gelöst, die erhaltene Lösung einer Elektrophorese auf einem 0,8%-igen Agarose-Gel unterworfen und der Bereich des Gels, der einer Größe von 2 kb - 4 kb entsprach, ausgeschnitten. Die DNA- Fragmente wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Bio 101, GENECLEAN) eluiert und aus dem Gel gewonnen und dann in TE-Puffer gelöst (30 µl).
Zur Konstruktion einer Genbank wurde andererseits pUC13 als Vektor verwendet. pUC13 (10 µg) wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI (etwa 100 Einheiten) gemischt, 140 Minuten bei 37ºC inkubiert und dann 10 Minuten bei 65ºC behandelt. Dem Gemisch wurde alkalische Phosphatase (BAP) (etwa 20 Einheiten) zugegeben und dann wurde die Reaktion 80 Minuten bei 65ºC weitergeführt. Gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren wurden eine Phenolextraktion und anschließend eine DNA-Ethanolpräzipitation durchgeführt. Zum Schluß wurde die DNA in TE-Puffer (50 µl) gelöst.
Die Lösung, die die DraI-Spaltfragmente der chromosomalen DNA von B. subtilis (FERM BP-2755) enthielt (7,5 µl), und die Lösung, die die mit SmaI- BAP behandelten Fragmente des Vektors pUC13 enthielt (2,5 µl), wurden vereinigt. Zur Ugierung der Fragmente und damit Bildung einer rekombinanten DNA wurde das Gemisch mit T4-DNA-Ligase 20 Stunden bei 6ºC inkubiert. Die erhaltene rekombinante DNA wurde zur Transformation des E. coli-Stamms HB101 nach dem Verfahren von Hanahan et al., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580, verwendet. Die Koloniebildung der Transformanten erfolgte auf Nitrocellulose- Membranen, die auf 40 µg/ml Ampicillin und L-Nährlösung [1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, (pH7,3)] enthaltendes Agarmedium gelegt worden waren. Die Kolonien stellten die Genbank von B. subtilis (FERM BP-2755) dar.

(2) Selektion von Cephalosporin-Acetylhydrolase-positiven Clonen mittels Kolonie-Hybridisierung

Die im vorstehenden Schritt (1) auf der Nitrocellulose-Membran gebildeten Kolonien wurden auf eine andere Nitrocellulose-Membran überstempelt. Die duplizierte Membran wurde auf 40 µg/ml Ampicillin enthaltendes L- Nährlösungs-Agarmedium gelegt und 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Danach wurde die Membran auf 250 µg/ml Chloramphenicol enthaltendes L- Nährlösungs-Agarmedium übertragen und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Kolonie-Hybridisierung wurde im wesentlichen nach dem Verfahren von Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (1975), 3961-3965, durchgeführt. Zur Lyse der Zellen und DNA-Denaturierung wurde die Membran daher mit 0,5 N NaOH (10-15 Minuten) behandelt. Anschließend wurde die Membran 5-10 Minuten mit 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) neutralisiert und 10-15 Minuten mit 1,5 M NaCl enthaltendem 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) weiterbehandelt. Nachdem die Membran zur Immobilisierung der DNA an der Membran 2 Stunden bei 80ºC unter vermindertem Druck behandelt worden war, wurde die immobilisierte DNA mit der markierten Sonde CAH-RM2 hybridisiert. Die Reaktion wurde 16 Stunden bei 38ºC in einer Lösung durchgeführt, die 4fach konzentrierten SSC-Puffer, 10fach konzentrierte Denhardt-Lösung und etwa 2 x 10&sup6; cpm/ml markierte Sonde enthielt. Anschließend wurde die Membran 3- 4mal mit 4fach konzentriertem SSC-Puffer bei Raumtemperatur sowie 2 Minuten bei 38ºC gewaschen und dann einer Autoradiographie unterworfen (Behandlungsbedingungen: -80ºC, 3 Stunden). Zur Untersuchung der Beziehung zwischen Waschtemperatur und Signalintensität auf dem Film wurde die Waschtemperatur schrittweise weiter erhöht und bei jeder Temperatur wurde eine Autoradiographie durchgeführt. Die Waschungen erfolgten jeweils 2 Minuten bei 43ºC, 48ºC und 53ºC.
Es stellte sich heraus, daß von etwa 30 000 Kolonien 3 selbst bei der hohen Waschtemperatur positive Signale zeigten. Diese Kolonien wurden über Nacht bei 37ºC in Flüssigkultur in 40 µg/ml Ampicillin enthaltender L-Nährlösung (5 ml) gezüchtet und daraus wurden rekombinante Plasmide isoliert [Verfahren von Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523]. Die Plasmide wurden mit Restriktionsenzymen, wie EcoRI, HindIII und PvuII, für die die Vektor-DNA (pUC13) Spaltstellen aufweist, gespalten und fragmentiert. Danach wurden eine Elektrophorese auf einem Agarose-Gel und anschließend eine Southern- Hybridisierung mit einer markierten Sonde durchgeführt. Es stellte sich heraus, daß zwei der drei rekombinanten Plasmide ein Restriktionsenzym- Spaltfragment enthielten, das mit der DNA-Sonde deutlich hybridisierte. Die Größe der hybridisierenden Fragmente war bei den zwei positiven Plasmiden unterschiedlich und deshalb schienen sich die in die Vektor-DNA inserierten DNA-Fragmente zu unterscheiden. Aufgrund des Unterschieds zwischen den betreffenden rekombinanten Plasmiden wurden diese als pCAH01 bzw. pCAH02 bezeichnet.

5. Identiflzierung positiver Clone und Bestimmung der Basensequenz

(1) Identifizierung positiver Clone

Während der Versuche zur Erstellung von Pestriktionskarten für die rekombinanten Plasmide pCAH01 und pCAH02 durch deren Spaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen wurde festgestellt, daß Plasmid pCAH01 zwei verschiedene DraI-Spaltfragmente und Plasmid pCAH02 mindestens drei verschiedene DraI-Spaltfragmente aufwies, die in die Smal-Spaltstelle der Vektor-DNA inseriert waren, und daß die DNA-Sonde nur mit einem dieser DraI- Fragmente hybridisierte. Folglich wurde in den nachfolgenden Verfahren das rekombinante Plasmid pCAH01 verwendet. In Figur 5 sind die Restriktlonskarte von Plasmid pCAH01 und die Stelle dargestellt, an der die DNA-Sonde hybridisiert.
Da Plasmid pCAH01 zwei aus der chromosomalen DNA von B. subtilis (FERM BP-2755) stammende exogene DraI-Fragmente enthielt (1,8 kb und 2,5 kb) und nur das 2,5 kb große Fragment mit der DNA-Sonde hybridisierte, wurde das 1,8 kb große DraI-Fragment aus dem Plasmid deletiert. Ein DraI-PstI-Fragment (2,6 kb), das das 2,5 kb große Fragment enthielt, wurde aus dem Plasmid pCAH01 ausgeschnitten und in die SmaI-PstI-Spaltstelle von Vektor-Plasmid pUC13 inseriert, wobei das verkleinerte rekombinante Plasmid pCAH03 (5,3 kb) erhalten wurde. Die Pestriktionskarte des rekombinanten Plasmids pCAH03 ist in Figur 6 gezeigt.

(2) Bestimmung der Basensequenz

Aus dem rekombinanten Plasmid pCAH03 wurde ein 0,24 kb großes EcoRI- HindIII-Fragment, mit dem die DNA-Sonde hybridisiert hatte, ausgeschnitten und seine DNA-Basensequenz nach dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (1977), 5463-5467, bestimmt. Dabei wurde eine Basensequenz, die der im vorstehenden Schritt 1 erhaltenen partiellen Aminosäuresequenz der Cephalosporin-Acetylhydrolase entsprach, im EcoRI-HindIII-Fragment gefunden, was zeigte, daß das Fragment einen Teil des Cephalosporin- Acetylhydrolase-Gens enthielt. Auf der Basis der Restriktionskarte von Plasmid pCAH03 wurden anschließend die Basensequenzen sowohl zwischen den DraI- und HindIII-Spaltstellen (0,38 kb) als auch zwischen den EcoRI- und EcoRI-Spaltstellen (1,45 kb) bestimmt, wobei die in Figur 7 gezeigte, etwa 2 kb große Basensequenz zwischen den DraI- und EcoRI-Spaltstellen erhalten wurde. Dadurch wurde bewiesen, daß eine Basensequenz vorlag, die ein aus 318 Aminosäureresten bestehendes Protein codierte, das ein vom Translations- Startsignal ATG codiertes Methionin enthielt. Das durch die vorstehende Basensequenz codierte mutmaßliche Protein stimmte außerdem hinsichtlich Molekulargewicht, amino- und carboxylterminalen Aminosäuren sowie Aminosäure-zusammensetzung der Lysylendopeptidase-Spaltfragmente gut mit der Cephalosporin-Acetylhydrolase überein. Man konnte deshalb davon ausgehen, daß dieses Protein Cephalosporin-Acetylhydrolase sein mußte. Dadurch wurde bewiesen, daß das Cephalosporin-Acetylhydrolase-Strukturgen in dem aus B. subtilis (FERM BP-2755) stammenden DNA-Fragment des Plasmids pCAH03 vollständig enthalten war.

6. Konstruktion eines Expressionsplasmids

Das clonierte, aus B. subtilis (FERM BP-2755) stammende DNA-Fragment von Plasmid pCAH03 enthält einen Bereich, der nicht zum Cephalosporin- Acetylhydrolase-Gen gehört. Der für die phänotypische Expression des Gens irrelevante Bereich wurde deshalb nach dem in Figur 8 dargestellten Verfahren deletiert.
Zur Erzielung einer hohen Expression eines heterologen Gens in E. coli ist im allgemeinen die Konstruktion eines Expressionsplasmids vorteilhaft, bei dem sich ein gewünschtes Strukturgen unmittelbar an eine Sequenz anschließt, die aus einem Promotor mit hoher Expressionseffizienz, einer SD- Sequenz und dem Translations-Startcodon ATG besteht. Zur Herstellung einer großen Menge Cephalosporin-Acetylhydrolase in E. coli wurde daher nach dem in Figur 9 dargestellten Verfahren ein Iixpressionsplasmid unter Verwendung eines Vektors konstruiert, der einen Promotor, eine SD-Sequenz und ein ATG- Codon enthielt. Im Konstruktionsverfahren kann das Strukturgen der Cephalosporin-Acetylhydrolase wie folgt hergestellt werden. Ein das gewünschte Gen vollständig enthaltender Bereich wurde in einen Vektor der M13mp-Serie cloniert, wobei eine einzelsträngige DNA erhalten wurde. Nach dem sogenannten Primerverlängerungs-Verfahren wurde ein Oligonucleotid als Primer verwendet, das mehrere Aminosäuren ohne den Methioninrest der aminoterminalen Sequenz der Cephalosporin-Acetylhydrolase codierte, wobei ein DNA-Fragment gewonnen wurde, bei dem nur der Strukturgen-Anteil der Cephalosporin-Acetylhydrolase in doppelsträngiger Form vorlag.
Figur 10 zeigt das Verfahren zur Konstruktion eines modifizierten Expressionsplasmids, das im Vergleich zu dem Expressionsplasmid, das mittels des Verfahrens von Figur 9 hergestellt wurde, eine erhöhte Kopienzahl aufweist und anstelle des Ampicillin-Resistenzmarkers (Apr) den Tetracyclin- Resistenzmarker (Tcr) enthält.
Nachfolgend wird jeder Schritt genauer beschrieben.

(1) Konstruktion eines verkleinerten Plasmids

Zur Verkürzung des stromabwärts vom Cephalosporin-Acetylhydrolase- Strukturgen (in Figur 8 als CAH abgekürzt) gelegenen Bereichs wurde das Plasmid pCAH03 mit EcoRV und BamHI gespalten. Das erhaltene, etwa 4,1 kb große DNA-Fragment wurde gereinigt und dann wurden die durch die BamHI- Spaltung erzeugten überhängenden 5'-Enden unter Verwendung des Klenow- Fragments der DNA-Polymerase aufgefüllt (Figur 8). Nach einer weiteren Reinigung wurde eine Ligierung unter Verwendung der T4-DNA-Ligase durchgeführt, wobei das verkleinerte Plasmid pCAH10 konstruiert wurde, das das Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen enthielt.

(2) Herstellung einzelsträngiger DNA zur Konstruktion eines Expressionsplasmids

Das im vorstehenden Schritt (1) hergestellte, verkleinerte Plasmid pCAH 10 wurde mit SacI und SalI gespalten und das erhaltene, etwa 1,5 kb große SacI- SalI-Fragment wurde gereinigt und gewonnen. Andererseits wurde doppelsträngige DNA des Phagen M13mp11 mit SacI und SalI gespalten. Letzterer DNA wurde das genannte SacI-SalI-Fragment zugesetzt und sie wurde zur Konstruktion einer das vollständige Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen enthaltenden doppelsträngigen Phagen-M13-CAH-DNA mit T4-DNA-Ligase ligiert. Daraus wurde anschließend nach dem Verfahren von Messing, Methods in Enzymology 101(1983), 20-78, einzelsträngige DNA hergestellt.

(3) Primerverlängerung

Ein das Strukturgen der Cephalosporin-Acetylhydrolase enthaltender Bereich wurde im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 4057-4074, hergestellt, indem ein kein Protein codierender Bereich beseitigt wurde, der aus B. subtilis (FERM BP-2755) stammte und sich stromaufwärts der Translations-Startstelle (ATG) der Cephalosporin- Acetylhydrolase befand. Als Primer, der bei der Primerverlängerung verwendet werden sollte, wurde ein als CAH-P1 bezeichnetes Oligonucleotid mit einer Basensequenz synthetisiert, die der 2. Aminosäure Glutamin bis zur 7. Aminosäure Prolin vom Amino-Terminus der Cephalosporin-Acetylhydrolase entsprach. Der Primer CAH-P1 (3 pmol) wurde der im vorstehenden Schritt (2) hergestellten einzelsträngigen Phagen-M13-CAH-DNA (7,5 µg) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 60ºC erhitzt und dann bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wurden dem Gemisch sowohl dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 0,25 mM) als auch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (2 Einheiten) zugegeben. Die Primerverlängerung wurde 2 Stunden bei 37ºC in einem Reaktionsgemisch (20 µl) durchgeführt, das 7 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM EDTA und 20 mM NaCl enthielt. Nach der Reaktion wurden eine Phenolextraktion und eine Ethanolpräzipitation durchgeführt. Die DNA wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser gelöst und S1-Nuclease (4 Einheiten) wurde zugegeben. Zur Spaltung der verbliebenen einzelsträngigen DNA erfolgte eine 30-minütige Inkubation bei 37ºC in einem Reaktionsgemisch (40 µl) aus 30 mM Natriumacetat (pH 4,6), 100 mM NaCl und 1 mM ZnSO&sub4;. Die Lösung, die das erhaltene doppelsträngige DNA-Fragment enthielt, wurde einer Phenolextraktion und anschließend einer Ethanolpräzipitation unterworfen. Zum Auffüllen der Enden wurde die DNA nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase umgesetzt.

(4) Konstruktion eines Expressionsplasmids

Der im vorliegenden Beispiel zur Konstruktion eines Expressionsplasmids verwendete Vektor pKK233-2 (Ampicillin-Resistenz) ist im Handel von Pharmacia erhältlich. Der Vektor gehört zu den ATG-Vektoren, enthält den Trc- Promotor und kann unmittelbar nach dem Startcodon ATG gespalten werden, indem mit dem Restriktionsenzym NcoI gespalten wird und die überhängenden 5'-Enden aufgefüllt werden. Wie in Figur 9 gezeigt, wurde das im vorstehenden Schritt (3) erhaltene DNA-Fragment, das das Cephalosporin-Acetylhydrolase- Strukturgen enthielt, mit PstI gespalten. Das dadurch erhaltene 1,27 kb große DNA-Fragment wurde abgetrennt und aufgereinigt. Andererseits wurde das den Trc-Promotor enthaltende Plasmid pKK233-2 mit NcoI gespalten und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt. Das erhaltene Fragment wurde dann mit PstI gespalten, wobei ein etwa 4,6 kb großes DNA-Fragment erhalten wurde. Anschließend wurden die beiden Fragmente gemischt und mit T4-DNA-Ligase miteinander ligiert. Das erhaltene Gemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stammes JM103 verwendet. Es wurden Kolonien selektiert, die sich auf 40 µg/ml Ampicillin enthaltendem L-Nährlösungs- Agarmedium gebildet hatten. Die Kolonien wurden über Nacht mittels Flüssigkultur in L-Nährlösung gezüchtet und die Zellen wurden gewonnen. Aus den Zellen wurde Plasmid-DNA extrahiert und die Basensequenz in der Nähe der Verbindungsstelle zwischen ATG-Vektor und dem Fragment, das das Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen enthielt, wurde bestimmt. Dabei wurde das als pCAH21 bezeichnete Expressionsplasmid gewonnen, bei dem das Strukturgen der Cephalosporin-Acetylhydrolase außer dem aminoterminalen Methionin- Rest unmittelbar nach dem ATG-Codon inseriert war. Der E. coli-Stamm, der das Expressionsplasmid enthielt, wurde als E. coli JM103/pCAH21 bezeichnet.
Das Replikationssystem des Fxpressionsplasmids pCAH21 stammt von pBR322. Dementsprechend wurde zur Erhöhung der Plasmid-Kopienzahl und damit zur Erhöhung des Expressionsniveaus in E. coli der Replikationsbereich (ori) des Plasmids gegen den von pAT153 ausgetauscht. Gleichzeitig wurde der Ampicillin-Resistenz (Apr)-Resistenzmarker des Plasmids gegen Tetracyclin- Resistenz (Tcr) ausgetauscht. Ein Verfahren zur Modifikation des Plasmids ist in Figur 10 dargestellt. Das Plasmid pCAH21 wurde zunächst mit BamHI gespalten und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt. Dann wurde das erhaltene Plasmid mit ScaI gespalten, wobei ein etwa 2,4 kb großes DNA- Fragment erhalten wurde, das den Trc-Promotor, das Cephalosporin- Acetylhydrolase-Gen und den T&sub1;T&sub2;-Terminator der ribosomalen 55-RNA (5SrrnBT&sub1;T&sub2;) enthielt. Als Vektor-Plasmid wurde das im Handel erhältliche Plasmid pAT153 verwendet. Das Plasmid pAT153 wurde mit EcoRI gespalten, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt und dann mit DraI gespalten. Zur Verhinderung der Selbstligierung des Vektors wurde weiterhin eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase durchgeführt. Dabei wurde ein etwa 2,5 kb großes Fragment hergestellt, das den Replikationsbereich und das Tetracyclin-Resistenzgen von pAT153 enthielt. Danach wurden die beiden vorstehend beschriebenen DNA-Fragmente gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Das erhaltene Gemisch wurde zur Transformation des E. coli-Stammes JM103 verwendet. Anschließend wurden Kolonien selektiert, die sich auf 20 µg/ml Tetracyclin enthaltendem L-Nährlösungs-Agarmedium gebildet hatten. Nach Züchtung der Kolonien über Nacht in L-Nährlösung wurden Zellen gewonnen, aus den Zellen wurde Plasmid-DNA extrahiert und mittels Restriktionsenzym-Spaltung analysiert. Dabei wurden zwei rekombinante Plasmide mit unterschiedlicher Orientierung der ligierten Fragmente gewonnen. Ein Plasmid, bei dem das Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen die gleiche Orientierung aufwies wie das Tetracyclin-Resistenzgen, wurde als pCAH211 bezeichnet. Das andere Plasmid, bei dem beide Gene in umgekehrter Orientierung inseriert waren, wurde als pCAH212 bezeichnet. Die E. coli- Stämme, die diese rekombinanten Expressionsplasmide enthielten, wurden als E. coli JM103/pCAH211 bzw. E. coli JM103/pCAH212 bezeichnet.

7. Expression des Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gens in E. coli

(1) Expression des Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gens

E. coli JM103/pCAH211 oder E. coli JM103/pCAH212 wurde in 20 µg/ml Tetracyclin enthaltende, doppelt konzentrierte L-Nährlösung (50 ml, in einer Flasche mit einem Volumen von 0,5 ml) überimpft und 24 Stunden bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet. Ein Aliquot (0,5 ml) der Kulturflüssigkeit wurde zur Zellgewinnung zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 0,5 ml) suspendiert und mit einem Ultraschallgerät aufgeschlossen. Der durch Zentrifugation der Lösung gewonnene Überstand wurde als Probenlösung, die das gewünschte Enzym enthielt, verwendet. Als Vergleichs- Enzymlösung wurde andererseits ein Überstand verwendet, der durch Zentrifugation der im vorstehenden Schritt 1 gewonnenen Kulturflüssigkeit von B. subtilis (FERM BP-2755) erhalten worden war. Cephalosporin- Acetylhydrolase wirkt nicht nur bei Cephalosporin C und 7-ACA, sondern auch bei p-Nitrophenylacetat (nachstehend als pNPA abgekürzt), wobei der Farbstoff p-Nitrophenol (nachstehend als pNP abgekürzt) gebildet wird. pNP läßt sich spektrophotometrisch nachweisen und deshalb wurde das Verfahren unter Verwendung von pNPA als Substrat gewählt, um die Cephalosporin- Acetylhydrolase-Aktivität einfach zu bestimmen. Die Reaktion wurde bei 30ºC in einem Gemisch (3 ml) durchgeführt, das 0,02% PNPA, 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) und die vorstehend erwähnte Enzymlösung enthielt. Die Enzymaktivität wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers durch Messung der Extinktion bei 400 nm bestimmt. Als eine Einheit (E) wurde die Enzymmenge definiert, die bei einem pH-Wert von 6,8 und einer Temperatur von 30ºC 1 µmol pNP pro Minute produziert. Es wurde festgestellt, daß die Enzymaktivitäten in den Kulturflüssigkeiten von E. coli JM103/pCAH211 und E. coli JM103/pCAH212 9,9 E/ml bzw. 12,4 E/ml betrugen. Andererseits betrug die Enzymaktivität von B. subtilis (FERM BP-2755) 0,36 E/ml.
Außerdem wurde ein Plasmid konstruiert, bei dem der Trc-Promotor und die SIYATG-Sequenz des Expressionsplasmids pCAH211 durch den Trp-Promotor und die SD-ATG-Sequenz des aus E. coli stammenden Tryptophan-Operons ersetzt wurden. Nach Einführung des Plasmids in E. coli JM109 mittels Transformation wurde die erhaltene Transformante in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben gezüchtet, wobei in der Kulturflüssigkeit eine Enzymaktivität von 75,5 E/ml erhalten wurde.
Die produzierte Cephalosporin-Acetylhydrolase-Menge kann durch Züchtung eines diese Expressionsplasmide enthaltenden E. coli-Stammes in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen in einer großen Züchtungsapparatur, wie einem Glasfermentor, erhöht werden.

(2) Deacetylierung von Cephalosporin C und 7-ACA

Unter Verwendung von Cephalosporin C oder 7-ACA als Substrat wurde eine Deacetylierung mittels einer aus E. coli JM103/pCAH212 gewonnenen Enzymlösung durchgeführt. Nach Zugabe der Enzymlösung (0,2 ml) zu 10 mM Substrat enthaltendem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0,1,0 ml) wurde die Reaktion 40 Minuten bei 37ºC durchgeführt und durch Zugabe von 0,2 M Acetatpuffer (pH 4,0, 1,2 ml) beendet. Die erhaltene Lösung wurde einer HPLC unterworfen und die Menge an Deacetylcephalosporin C oder Deacetyl-7-ACA bestimmt. Als Säule wurde Cosmosil 5C&sub8; (Nacalai tesque) verwendet. Die Elution erfolgte durch einen Konzentrationsgradienten, wobei die Konzentration von Methanol schrittweise erhöht wurde. Unter Verwendung einer 20 mM NaH&sub2;PO&sub4; und 5 mM Tetra-n-butylammoniumhydroxid (TBAH) enthaltenden Lösung wurde die Methanol-Konzentration auf 20% erhöht. Der Nachweis der deacetylierten Produkte erfolgte durch Extinktionsmessung bei 254 nm. Die Aktivität der Cephalosporin-Acetylhydrolase wurde wie folgt definiert. Als eine Einheit (E) wurde die Enzymmenge definiert, die bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 37ºC 1 µmol Produkt pro Minute produziert. Es stellte sich heraus, daß die Aktivität der von E. coli JM103/pCAH212 gewonnenen Enzymlösung sowohl bei Cephalosporin C als auch bei 7-ACA 7,4 E/ml Kulturflüssigkeit betrug.

(3) Struktur der rekombinanten Cephalosporin-Acetylhydrolase

Eine Molekulargewichts-Bestimmung der aktiven Form und einer in E. coli produzierten Untereinheit der Cephalosporin-Acetylhydrolase erbrachte das gleiche Ergebnis wie vorstehend in Schritt 1, was darauf hindeutete, daß auch die rekombinante Cephalosporin-Acetylhydrolase ähnlich wie die natürliche Form als Octamer vorliegt.
Die rekombinante Cephalosporin-Acetylhydrolase wurde außerdem mittels HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen-Säule aufgereinigt. Eine Analyse der Protein-Enden mittels Edman-Abbau und Hydrazin-Hydrolyse zeigte, daß die Amino- und Carboxyl-Enden des Enzyms aus Methionin bzw. aus Glycin bestanden und identisch mit den in der natürlichen Form gefundenen Aminosäuren waren. Außerdem zeigte eine Bestimmung der aminoterminalen Sequenz unter Verwendung einer automatischen Aminosäure- Sequenziervorrichtung, daß die Aminosäuresequenz bis zur 25. Aminosäure vollkommen identisch mit der vom Strukturgen abgeleiteten Sequenz (Figur 2) war.

Auswirkung der vodiegenden Erfindung

Wie im vorstehenden Beispiel genauer beschrieben, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigt, daß durch Clonierung eines Gens, das die von B. subtilis produzierte Cephalosporin-Acetylhydrolase codiert, und Konstruktion eines das Gen enthaltenden rekombinanten Plasmids unter Verwendung eines in E. coli exprimierbaren Vektors eine effiziente Produktion der Cephalosporin-Acetylhydrolase in großem Maßstab möglich ist. Das ist eine Voraussetzung für eine umfangreiche Anwendung dieses Enzyms. Das DNA- Fragment, das das clonierte Cephalosporin-Acetylhydrolase-Gen enthält, stellt außerdem ein äußerst wirksames Mittel zur vorteilhaften Nutzung der Funktionen der Cephalosporin-Acetylhydrolase dar.

Claims

1. DNA-Basensequenz, die die folgende Aminosäuresequenz codiert:

2. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Basensequenz nach Anspruch 1.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, das ein in einem E. coli-Wirtsvektorsystem verwendeter Vektor ist.

4. E. coli-Zelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 transformiert ist.

5. Protein mit der folgenden Aminosäuresequenz

6. Protein mit der folgenden Aminosäuresequenz, das außerdem Methionin am Aminoende enthält:

7. Enzym, das aus einem Multimer eines Proteins nach Anspruch 5 oder 6 zusammengesetzt ist.

8. Enzym nach Anspruch 7, das ein Tetramer oder Octamer des Proteins ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 5 oder 6 oder eines Enzyms nach Anspruch 7 oder 8, umfassend die Züchtung der E. coli-Zelle nach Anspruch 4 in einem Medium und Gewinnung des Proteins oder Enzyms aus der Kulturflüssigkeit.

10. Mittel, umfassend ein Protein nach Anspruch 5 oder 6 oder ein Enzym nach Anspruch 7 oder 8 zur Verwendung in der Deacetylierung von Cephalosporinen.

11. Verfahren zur Deacetylierung eines Cephalosporins, umfassend die Behandlung des Cephalosporins mit einem Protein nach Anspruch 5 oder 6 oder einem Enzym nach Anspruch 7 oder 8.