KR100270508B1

KR100270508B1 - 신규세파로스포린디아세틸라아제유전자및이를이용한단백질제조방법

Info

Publication number: KR100270508B1
Application number: KR1019980014790A
Authority: KR
Inventors: 김용덕; 정일선; 이상훈; 최덕호; 한금수; 임번삼
Original assignee: 고두모; 대상주식회사
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2001-02-01
Anticipated expiration: 2018-04-24
Also published as: WO1999055881A1; KR19990081077A

Abstract

토양에서 신규 세팔로스포린 디아세틸레이즈를 분비하는 신균주를 순수 분리 하여, 그 신균주를 동정한 결과 바실루스 종(Bacillus sp.)으로 확인하고 이 균주를 바실루스 DS1152로 명명하였다.

신균주 바실루스 DS1152(KFCC11026)로 부터 디아세틸 세팔로스포린 C, 디아세틸 7-ACA 및 디아세틸 2-메톡시미노-2-푸릴-아세틱 세팔로스포린산 생산에 관여하는, 신규 세팔로스포린 디아세틸레이즈 유전자를 분리하여, 유전자 서열 및 아미노산 배열을 분석하여 신규 효소임을 밝혔다.

이 신규 유전자에 의해 코딩된 신규효소를 분리, 정제하여 생화학적 성질을 조사하였고 분리된 신규 효소의 유전자를 유전자 재조합 기술로 조작하여, 대장균(KFCC11029)에서 대량으로 증폭, 발현을 하였다. 이 때 발현된 효소는 분자량이 24KD이였으며, 구조 형태는 이중체로 구성되어 있으며 분자량 48KD이였다.

이 신규 재조합효소는 다양한 세파로스포린계 중간체에 우수한 기질 반응성을 보유하고 있음을 균체 및 효소를 고정화하여 확인하였다. 이러한 신규 기술을 이용하여 세파로스포린계 반합성 중간체 제조에 응용함으로써, 기존의 합성법 보다 산업적으로 매우 유리한 신규 기술을 확립하였다.

Description

신규 세파로스포린 디아세틸라아제 유전자 및 이를 이용한 단백질 제조방법

본 발명은 세팔로스포린계 항생제 제조에 필수적 전구체인, 세팔로스포린C 와 7-ACA(7-aminocephalosporanic acid)의 탈아세틸화 반응을 촉진하는 효소와 이의 유전자에 관한 것이다.

세팔로스포린C 와 7-ACA 같은 세파로스포린계 화합물은 3위치에 결합된 아세틸기가 제거됨으로서, 고부가가치 세파로스포린계 항생제 제조에 반합성 중간체로 이용된다. 세팔로스포린의 탈아세틸화 반응을 위한 방법으로는 화학적 방법과 효소적 방법이 있다. 이중 효소적 방법은 반응pH, 반응온도, 반응부산물 등에 의한 수율향상의 잇점들이 보고되고 있다.(USP3,304,236)

이러한 효소(Cephalosporin C Deacetylase)는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis; 고초균) 기원의 미생물에서 일본 시오노기(Shionogi)사에 의해 생화학적 특성이 구분되는 2종의 효소가 보고되었으며, 그 중 한 종의 효소는 대장균에 유전자를 도입하여 대량생산하는 방법으로 최근에 보고되었다.(EP0454478A1, Applied and Environmental Microbiology.1995.p2224)

본 발명자들은 대한민국 경기도 이천 근교의 토양에서 강력한 세팔로스포린C 디아세틸레이즈 활성을 가지는 바실루스 종(Bacillus sp. DS1152)을 분리하였으며, 이 균주로부터 활성효소를 코딩하는 신규유전자를 분리하였다. 분리된 유전자를 유전자 재조합법에 의해 대장균하에서 여러가지 벡터시스템으로 대량증폭 하였다. 그 증폭된 효소단백질의 생화학적 특성을 분석한 결과는 다음의 표 1과 같다. 이 결과에 의하면 기보고된(Shionogi사) 것과 효소의 생화학적 특성이 상이하게 구분되며, 특히 세파로스포린 씨에 대한 기질친화력과 반응성이 우수하였다.

표1. 효소단백질의 생화학적 특성

균 주	EP0,454,478,A1의 균주	본발명의 균주KFCC11026
분 자 량구 조최적 온도최적 pH등 전 점Km(7-ACA)Km(CPC)Km(MIFACA)	280KDaoctameric(팔중체)55C8.0-8.55.37.3mM24.3mM-	48KDadimeric(이중체)40C8.0-9.04.318.8mM14.6mM17.2mM

본 발명에서 생산된 효소를 세팔로스포린계 항생제 제조 공정에 이용함으로써, 기존의 화학합성공정의 다단계 반응공정을 축소할 수 있고, 효소반응에 의하여 세팔로스포린계 항생제의 생산성을 향상시키는 새로운 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1 은 본 발명에 사용된 발현벡타에 유전자를 도입하는 플라스미드 재구성 과정이다.

본 연구의 바실루스 (Bacillus sp. DS1152(KFCC11026))는 토양으로부터 순수분리된 종균으로서 LB(Luria-Bertani) 평판배지에서 30℃에서 24시간 배양으로 균의 성장을 확인 할수 있으며 배양균의 특성은 다음과 같다.

표 2. 바실루스(Bacillus sp. DS1152(KFCC11026)) 균주특성

구 분	균주의 특성
형태	간균형태(Rod-shaped)
내성포자 생성 유무	내성포자를 생성
운동성	운동성 보유
그람염색반응	그람 양성반응
호기성 유무	호기성

실시예 1 : 효소의 특성 분석

(1) 효소의 분리 정제

LB 배양액을 첨가한 500ml 삼각 플라스크를 121℃에서 20분간 살균한 다음 바실루스 DS1152를 접종하여 30℃에서 9시간 전배양을 실시하여 이를 생산배지의 종균으로 사용하였다. 본 배양은 4.5L의 LB 배지가 첨가된 7.0L발효조를 121℃에서 20분간 살균한 다음 위의 배양된 전 배양액을 1%되게 첨가하여 30℃에서 48시간 배양한 후 이의 배양액으로부터 디아세틸레이즈를 아래와 같은 방법을 통하여 정제하였다. 위의 배양액으로 부터 원심분리(5000 rpm x 30분)하여 균체를 회수하였다. 50mM Tris/HCl(pH8.0)의 pH완충 용액을 이용하여 회수된 균체를 현탁시킨 다음, 초음파 균체 파쇄기를 이용하여 균체를 파쇄하였다. 이렇게 파쇄된 균체는 원심분리(12,000 rpm x 30분)를 통하여 물에 녹지않는 부분을 다시 제거하였으며, 원심분리 후 위의 상등액은 40 - 80% (NH₄)₂SO₄포화용액을 이용한 단백질 분별 침전법을 이용하여 1차로 정제되었다. 이때 용액 중에는 많은 양의 염이 존재하므로 이를 제거하고 또한 단백질을 농축하기 위해서 한외여과를 실시하였으며 투과성막의 기공크기는 30KDa 이었다. 이렇게 농축된 단백질 용액은 50mM Tris/HCl(pH8.0)에서 안정화된 DEAE-세파로즈(pharmacia 제품)에 유속 2.0ml/min의 속도로 첨가되었으며 첨가량은 겔의 ml당 40mg의 단백질을 첨가하였다. 완전히 첨가된 후에 안정화에 이용되었던 완충용액으로 다시 칼럼을 씻어주고 단백질의 용리는 0 - 300 mM NaCl을 연속 농도구배 방법으로 흘려서 용리하였다. 이때 디아세틸레이즈의 대부분이 150 - 200mM의 NaCl농도 구간에서 용리되었으며 이들은 한 곳으로 모아져 다시 기공의 크기가 30KDa인 투과성 막을 이용한 한외여과 방법에 의해 농축되어 세파크릴-S300(Sephacryl-S300; pharmacia 제품)을 이용한 겔 크로마토그래피에 적용되어 최종적으로 분리 정제되었다. 이때 기질을 7-ACA로 하여 비활성도를 측정한 결과 단백질 mg당 31unit이었다.

(2) 효소의 분자량 측정

효소의 전체적인 분자량 측정은 1.6 x 100cm(겔 부피:300ml)의 칼럼에 세파크릴-S300이 충진된 겔 크로마토그래피를 이용였다. 컬럼은 2.5ml/min의 유속하에 완충용액으로 200, 150, 66, 29, 19.3KDa (sigma 제품)의 표준단백질을 용리하였다. 동일한 방법으로 측정효소의 시료가 용리되는 완충용액의 부피를 표준시료와 비교하며 표준곡선 하에서 분자량을 계산하였다. 이때 계산된 효소의 분자량은 48KDa이었으며, 결과는 도 4와 같다. 또한 보조적으로 12%의 폴리 아크릴과 라밀리스(Lammilis)방법을 이용한 SDS-PAGE를 이용하여 단량체(monomer)의 분자량을 결정하였으며, 측정된 단량체(monomer)의 분자량은 24KDa에었다. 이로부터 활성효소는 분자량 24KDa의 단량체(monomer)가 이중체(dimer)로 구성된 효소임을 확인하였다.

(3) 효소의 아미노 말단부위의 아미노산서열 분석

부분정제된 효소는(정제도:95%)는 증류수로 한외여과하여 염을 제거한 후 동결 건조하였으며, 이 시료를 단백질 염기서열 분석시스템(Precise Protein sequencing system: Applied Biosystems 제품)하에서 제시된 표준분석 메뉴얼에 따라 아미노 말단의 10base 아미노산 배열을 결정 하였다. 결정된 세팔로스포린 디아세틸레이즈 아미노 말단의 염기서열은 메치오닌이 아닌 Ala-Asn-His-Ile- Tyr-Leu-Ala-Gly-Asp-Ser의 순서임을 확인 하였다.

(4) 효소의 활성 측정

시오노기등에 의해 실시된 예와 같이 0.1M 나트륨 인산 완충용액(pH7.0)을 사용하였으며, 효소의 활성도는 37℃에서 분당 1M의 7-ACA를 탈아세틸화시키는 양을 1unit로 정의 하였다. 실험에 사용된 효소는 앞서 실시된 정제 방법에 의해 준비된 효소를 진공건조 한 후 필요시 완충용액에 일정양을 녹여 사용하였다. 또한 7-ACA의 탈아세틸화 반응 산물인 디아세틸-7-아미노세팔로스포린산(deacetyl-7-aminocephalosporanic acid; 이하 DACA)의 정량 분석은 HPLC에 의해 해석되었으며 이용된 HPLC조건은 아래와 같다.

표 3. HPLC 분석 조건

조 건	상 태
이 동 상고 정 상컬럼 용적유 속파 장(nm)온 도(℃)	50mM (NH₄)₂HPO₄/ 20% CH₃CN pH3.2Alltech NH₂46 X 250 mm0.5 ml/ min254 nm45

(5) 효소의 최적 반응 pH 측정

효소의 최적 pH를 측정하기 위해 pH3.0 - 11.0사이의 구간이 조사 되었으며 pH3.0 - 5.0의 산성 구간에서는 0.1M의 구연산 완충용액을 사용하였으며 pH6.0 - 11.0사의 구간에서는 0.05M의 나트륨 인산과 0.05M의 구연산을 첨가한 뒤 NaOH로 pH를 조정한 광범위 완충용액을 사용하였다. 또한 기질은 7-ACA를 사용하였으며 생성된 DACA와 소비된 기질은 앞서 제시된 HPLC조건을 통하여 분석되었다. 효소의 pH에 따른 반응성은 8.0 - 9.0에서 가장 높은 활성도를 보였다.

(6) 효소의 최적 반응 온도 측정

효소의 최적 온도 분석을 위해 0.1M의 나트륨 인산 완충용액(pH7.0)이 사용되었으며 시험에 이용되는 온도 범위는 20 - 45℃의 구간에서 5℃의 간격으로 실시되었다. 또한 실험에 이용된 기질은 앞서 실시된 방법에 의해 기질은 7-ACA를 사용하였으며 분석은 앞서 제시된 HPLC조건을 통해 실시되었다. 효소 활성은 30℃에서부터 반응성이 증가되었으며, 40℃에서 가장 높은 활성도를 보였다.

(7) 효소의 등전점 측정

효소의 등전점에 관한 분석은 농도구배등전점 측정법 (iso-electrofocusing)을 통하여 실시되었으며 pH의 구간은 pH3.0 - 9.0의 구간이었다. 이때 표준 물질로서는 등전점이 pH4.7 - 4.9인 bovine serum albumin이 사용되었으며 실제 pH는 효소가 걸려있는 겔상의 위치를 잘라내어 겔속에 녹아있는 전해물질을 증류수에 녹여내어 pH를 측정하였다. 이때 측정된 효소의 pI값은 4.3을 보였다.

(8) 효소의 기질 반응성

효소의 기질반응성은 미카엘리스(Michaelis) 상수로서 효소의 반응속도를 정의하였다. 효소의 반응을 위한 조건은 0.1M의 나트륨인산완충용액(pH7.0)에, 7-ACA, 세팔로스포린 C (이하 CPC), 2-메톡시미노-2-푸릴아세틱세팔로스포린산; 2-Methoxyimino-2-furylacetic cephalosporanic acid; 이하 MIFACA)의 기질을 농도를 달리하여 첨가한 후 37℃에서 10분간 반응시켜 HPLC로 분석하였다. 분석된 효소의 기질반응성은 Lineweaver-Burke식에 의해 계산하였다. 계산된 기질에 대한 반응성은 다음의 표와 같으며, 특히 세파로스포린계 중간체에 고른 반응성을 보였다.

표 4. 효소의 기질반응성

기질의 종류	Km(mM)	Vmax(mole/min)
7-ACA	18.8	0.59
CPC	14.6	0.36
MIFACA	17.2	0.51

실시예 2 : 유전자 분리 및 염기서열분석

(1) DNA 단리 및 유전자 라이브러리 제조

바실루스 DS1152를 LB 배양액, 30℃에서 24시간 배양후, 5000rpm x 10min 원심분리한후 4g의 균체를 회수하였으며, 이를 20mM 트리스 완충액(pH8.0) 20mL하에서 현탁하였다.

이를 20% PEG #8000 용액 10ml, 리소짐용액 1mL(100mg/ml)처리한후 37℃에서 4시간 반응하였다. 이것을 3500rpm x 20min 원심분리하여 상층액을 제거한후 100mM 트리스완충용액, 10mM EDTA 용액(pH8.0) 20mL하에서 혼합한후 25% SDS 1ml를 넣고 37℃에서 1시간 섞어 혼탁한후 프로테네이즈 K 용액(20mg/ml) 200μL를 첨가하여 4시간 반응하였다

위의 반응액을 15ml 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25:24:1)하에서 12시간 교반한 후 12000rpm x 30min 원심분리하여 상층액을 취하였다. 취한 용액은 1.5ml 아세트산 완충용액(pH5.2), 냉각 에탄올 35ml을 처리하여 -70℃에서 15분간 정치 시켰다. 이를12000rpm x 10min 원심분리하여 상층액을 제거한후, 진공건조하여 10mM 트리스 완충용액, 1mM EDTA 용액(pH8.0) 500μL하에서 녹였다.

단리된 DNA는 제한효소 Sau3AI으로 부분 절단한 후, 25000rpmX24hr 수크로스 밀도 기울기 초원심분리법으로 절편의 크기에 따라 분획하였다. 분획된 절편은 70% 에타놀하에서 침전 진공 건조하여 2-6Kb의 DNA절편을 획득하였다.

획득된 DNA 절편은 제한효소 BamHI으로 절단된 pUC18 벡터에 라이게이션(ligation) 하였으며, 이를 E.Coli JM109 균주에 형질전환하여 항생제(Ampicillin 50ug/ml)가 함유된 평판배지하에서 성장성이 있는 균을 선별하였다.

(2) 아세틸에스테레라제 양성 균주의 선별

클로닝된 유전자로부터 아세틸에스테라제 활성을 지닌 균주선별을 위하여 에틸렌 글리세롤 모노에틸 에스테르에 용해된 알파-나프텔아세테이트 20mg을 파스트 블루 RR 염(Fast blue RR salt) 12mg이 용해된 트리스-말레이트산 완충용액(pH7.6)을 첨가하여 평판배지에 도말 한 후 균체를 레플리카 방법에 의해 알파-나프텔아세테이트에 대해 분해성이 있는 적갈색의 균을 분리하였다.

(3) 양성 클론의 유전자 염기서열 분석

재조합된 플라스미드는 플라스미드 단리 키트(Flex-prep kit: Pharmacia 제품)하에서 분리하여 플라스미드 제한효소 지도를 조사한 결과 2.7Kb의 DNA 절편으서 약1.6Kb(pSPF1.6)위치에 제한효소 Sph I 절단 부위를 가지고 있었으며, 이 부위내에서 동일한 효소활성도를 보이고 있었다. 1.6Kb의 DNA 절편은 제한효 소 Sau3AI으로 부분절단하여 그 절편들을 크로닝벡터인 pUC18 플라스미드에 0.4Kb, 0.8Kb, 1.0Kb, 1.3Kb에 해당되는 DNA 단편을 가지는 서브클론들로 재크로닝하였다. 이러한 서브클론들은 유전자 염기서열 분석 장치(Cy5TM AutoReadTM sequencing kit: Pharmacia제품)하에서 제시된 표준반응 조건에 의해 진행하였으며, 이를 준비된 유전자 자동 염기서열 분석 장치(ALF express automatic sequencer: Pharmacia제품)를 이용하여 정방향과 역방향의 상보적 염기서열을 동시에 약 500bp를 읽는 방법으로 크로닝된 유전자 염기서열을 확인 하였다. 확인된 염기서열은 중복된 부분을 연결하여 전체적인 1562bp 유전자 염기서열을 확인하였으며, 그 결과는 서열목록1과 같다.

(4) 유전자 검색

결정된 유전자 염기서열은 효소정제과정에서 확인된 분자량(dimer 48KDa:24KDa subunit), 10개의 아미노말단 아미노산 서열(Ala-Asn-His-Ile- Tyr-Leu-Ala-Gly-Asp-Ser) 및 아미노산 전사 시작 부위(open reading frame) 분석을 통해 활성효소의 구조유전자부분(581~1235 부분)을 결정하였다. 이러한 유전자부위는 유전자 은행(NIH BLASTN search)에서 상동성 검색을 한결과 기능이 알려지지 않은 바실루스 서브틸리스 유전자(Bacillus subtilis complete genome)의 172923에서 173602부분과 93% 상동성을 보이고 있었으며, 신규의 기능을 가진 유전자임을 확인하였다.

이 부위의 구조유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 본 발명의 재조합된 유전자 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 분석 결과, 총217개의 아미노산중 4개(부위:127, 128, 176, 217) 부위에서만 차이를 보이고 있다. 이러한 결과는 동일기능의 효소가 균 종류에 따라 부분적 아미노산서열의 차이성을 보이고 있었으며, 그 기능은 동일할 것으로 판단된다. 바실루스 서브틸리스 유전자 부위의 추정 아미노산서열과 본 발명의 재조합유전자의 아미노산서열과의 상동성 비교 결과는 서열목록2와 같다.

실시예 3 : 유전자 발현

(1)유전자의 PCR증폭

상기의 실시예2)에서 추정된 구조유전자 부위를 기준으로, 5부위에 제한효소 Nco I 절단부위를 포함한 21bp, 3부위에 제한효소 Hind III 절단부위를 포함하는 22bp의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였으며, 이를 세팔로스포린디아세틸레이즈 유전자 증폭을 위한 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 위한 프라이머로 이용하였다. 디자인된 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

1. 5-TGA GCC ATG GCG AAT CAC ATT-3

Nco I

2. 5-TCA CAA GCT TCA CCC TTC TTT G-3

Hind III

pSPF1.6 프라스미드를 모체로하여 실시예4)에서 디자인된 프라이머와 태그 DNA 폴리머라아제(Taq DNA polymerase)를 혼합하여 55℃ 60sec, 72℃ 90sec, 95℃ 60sec의 사이클을 30회 반복수행하여 654bp에 해당되는 세팔로스포린디아세틸레이즈의 구조유전자를 대량 증폭하였다.

(2) 발현벡터의 구성 및 재조합 대장균 제조

증폭된 유전자는 제한효소 Nco I, Hind III로 절단하였으며, 동일한 방법(pKK223-3: Sma I, Hind III)으로 절단된 발현 벡터인 pKK223-3(Pharmacia제품:암피실린 내성), pTrc99A(Pharmacia 제품: 암피실린 내성), pET24d(+)(Novagen제품: 가나마이신 내성)에 라이게이션하여 E.Coli JM109 균주에 형질전환 하여 각각 pDSTA654, pDST654, pDSET654를 구성하였으며, pDSET654는 다시 발현용 숙주인 BL21(pLys S)에 재도입하여 도 1과 같이 숙주-벡터 시스템을 재구성 하여 재조합 대장균 KFCC11029를 제조하였다.

(3) 유전자 발현

재조합된 각 균체를 100ml LB배지하에서 37℃에서 12시간 배양하여 벡터의 특성에 따라 0.5mM IPTG나 배양온도를 전환시킴으로서 발현을 유도하였다. 이를 5000rpmx10 원심분리한후의 균체를 회수하였으며, 이를 10mM 트리스완충액(Tris HCl buffer(pH7.0)), 1mM EDTA 용액 10mL하에서 현탁하였다. 이를 초음파 파쇄기로 10sec x 4회 처리한 후 13000rpm x 10분 원심분리하여 상층액을 유전자 발현도 조사를 위한 재료로 하였다.

이를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법에 의해 E.Coli JM109(pUC18)균을 비교군으로 하여 24KDa에 해당되는 단백질의 발현 정도를 확인하였으며, 증폭된 양은 플라스미드의 특성에 따라 다소의 차이를 보이고 있으나 모두 대량으로 발현됨을 확인하였다.

효소반응을 위한 기질로서는 7-ACA를 10mM 트리스 완충용액(pH8.0)하에서 5mg/ml농도로 녹인 후 50mM 트리스 완충용액(pH7.0)에 최종농도 1mg/ml 7-ACA를 첨가하여 30℃하에서 30분 반응하여 디아세틸7-ACA의 생성량을 HPLC하에서 정량하였다. 균체파쇄액으로부터 단백질의 양은 브래드포드(Bradford) 정량법에 의해 표준 단백질양과 비교 결정하였으며, 재조합된 유전자의 발현 효소 생산 역가는 표와 같다.

표 5. 재조합 유전자의 발현효소 생산역가

숙주	플라스미드	발현 유도	비활성도(mole deacetyl-7ACA/mg protein/min)
E.Coli JM109BL21(DE3)Bacillus sp.DS1152	pUC18PDST654pDSTA654pDSET654	(-)0.5mM IPTG0.5mM IPTG0.5mM IPTG	0.054.723.203.860.46

실시예 4 : 균체배양 및 고정화

(1) 균체의 배양

균체배양에 이용된 배지는 글루코즈 0.2%, 효소추출물 3%, NaCl 0.25%, pH7.2를 접종배지로 하여 37℃에서 12hr 배양한 후 동일배지하에서 5L 발효조에 교반속도 400rpm, 에어주입량 1V/V/M의 조건으로 배양하였으며, 당이 고갈되는 시점에서 최종농도가 효소추출물 5.6%, NaCl 0.4%, 글루코즈 3.4%가 되게 추가배지를 주입하며 균체를 배양하였다. 유전자 발현은 균체의 성장 곡선상에서 성숙기 단계에 도달할 시점에 500uM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였으며, 이후 4시간의 배양을 지속한 후 균체는 원심분리기에서 4000rpm x 20min 원심분리하여 균체를 수집하였다.

(2) 균체고정화

수집된 균은 10mM 트리스 완충용액(pH9.0), 1mM EDTA하의 완충용액에서 재현탁하여 40℃에서 1시간 교반한 후 원심분리하여 재수집하였다. 수집된 8g(wet weight)의 균체는 40℃, 0.9% NaCl, 0.2% 트라톤 엑스-100(Triton X-100) 8ml하에서 재현탁하였다. 동시에 2.07g 카르지난(κ-carrageenan)을 0.9% NaCl 45ml, 80℃에서 녹인 후 45℃까지 식혀 두 용액을 혼합하여 10℃에서 30분동안 다시 냉각하였다. 이때 겔의 강도를 증가하기 위하여 0.3M KCl하에 적셔서 고정화된 균을 획득하였다.

(3) 효소고정화

수집된 균체는 10mM 트리스 완충용액(pH7.0), 1mM EDTA 용액에서 20% 농도로 현탁하였다. 이를 유압식 균체 파쇄기에서 균체를 파쇄한 후 20mM MgCl2를 첨가하고 1U/ml 농도로 데옥시리보뉴클라아제(Deoxyribonuclease I) 효소를 처리하여 상온에서 1시간 교반하며 핵산을 가수분해하였다. 이러한 용액은 미세여과하여, 세포찌거기 및 비활성 펩타이드를 제거하여 효소고정화를 위한 시료로 이용하였다.

효소 고정화 과정은 유포지트 씨(Eupergit-C:독일 Rhm 제품)의 표준방법에 따라 100ml(역가 880U/ml, 총 88,000units)을 1.0M (K2HPO4+KH2PO4 )(pH7.5) 완충용액하에 20g 유포지트 씨 담체와 혼합하여 상온에서 3일간 정치하였다.

이러한 반응혼합물은 0.1M (K2HPO4+KH2PO4 )(pH7.5) 완충용액을 이용하여 필터링하며 세척하여 냉장보관하였다.

실시예 5 : 고정화에 의한 탈아세틸화 반응

발명의 효소반응에 의해 전환된 산물의 구조는 다음과 같다.

반응기질(7-ACA) 20g을 정량하여 1L의 100mM 카보네이트 나트륨 완충용액(pH7.5) 하에 녹인 후 반응기의 고정화효소와 교반하였다.

이때 반응이 진행됨에 따라 발생되는 탈아세틸화된 초산에 의해, pH가 강하되는 것을 방지하기 위하여 1N KOH을 첨가하였으며, 반응pH를 7.9 - 8.2수준으로 조절하며 반응을 진행하였다. 반응온도는 30℃를 유지하였으며, KOH의 첨가가 종결되는 시점에서 반응을 종결하였다.

반응기질(2% 농도)이 탈아세틸화 되는데 약40분의 반응시간이 소요되었다. 진행된 반응산물은 HPLC분석에 의해 반응물을 확인한 결과 반응수율은 92% 수준이었다.

동일한 방법으로 고정화된 균체를 함유한 반응은 반응은 균체막을 통과하는 기질의 투과성에 의해 반응성이 제한되었으며, 진행된 반응물의 분석에 의한 반응수율은 고정화 효소에 비해 낮은 44% 수준을 보였다.

[서열목록]

서열번호(SEQ ID NO.) : 1

서열의 길이 : 1562

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

토폴로지 : 직쇄상

서열의 종류 : Gemonic DNA

기원

생물명 : 바실러스종

주명 : DS1152 (KFCC11026)

서열:

ATCGAGCTCG GTACCGGGGA TCATGACTGG GACGGAACGG TCGGCAGGCC 50

GAAGATTGAA AAGTGGGATG CTGAAAACCG CTGTCTGAAG ACGATTTTTC 100

AGCCGGACGG CGTGCTGTCC AACAACGGCA CAAAAGGAAA TCCTGTTCTT 150

CAGGCCAACC TGTTCGGAGA CTGGCGGGAA GAAGTGATAT GGAGAACGGA 200

AGACAGCAGC GCACTCCGCA TCTATACAAC GACACATCTC ACCCGCCATC 250

GCTTTTACAC GCTTATGCAC GATCCGGTTT ACAGGCTCGG CATCGCCTGG 300

CAGAATACCG CCTACAACCA GCCGCCGCAC ACGGGCTTTT ATCTCGGAAC 350

GGGAATGAAA AAACCACCGA AGCCCGCCCT GTACATAGCG GGCAGCAAAG 400

CGGAGGCGCC GCTATAGGAG GAACTAAGGG ATAAGAAGCA AAGGCTGAAC 450

AGTACGACAA GATGACTTAT CAAAGCCAGG ACGACTAATG TTCAGGCGCT 500

GAAATCACCG GTTTTTTCAA GGGAAGAGCT GTCCATGATT GATGCCATAT 550

GAAACGAAAA AAACGAGGGG GAATGAGAA ATG GCG AAT CAC ATT TAT 597

1 Met Ala Asn His Ile Tyr 6

CTT GCT GGC GAT TCA ACT GTT CAA ACG TAT GGA GAC AGC ACA 639

Leu Ala Gly Asp Ser Thr Val Gln Thr Tyr Gly Asp Ser Thr 20

AAT CAA GGG GGG TGG GGG CAG TTT CTC GGC TCG CAT CTG CCG 681

Asn Gln Gly Gly Trp Gly Gln Phe Leu Gly Ser His Leu Pro 34

GAG CAT ATT CAA GTG ATT AAC AGA GCA ATC GGG GGA AGA AGC 723

Glu His Ile Gln Val Ile Asn Arg Ala Ile Gly Gly Arg Ser 48

TCG AAA ACA TTT GTG GAA GAG GGC AGG CTT CAG GCG ATT CTT 765

Ser Lys Thr Phe Val Glu Glu Gly Arg Leu Gln Ala Ile Leu 62

GAT GTG ATT GAG CCG GAT GAC TGG CTG TTT GTG CAG ATG GGC 807

Asp Val Ile Glu Pro Asp Asp Trp Leu Phe Val Gln Met Gly 76

CAT AAT GAC GCG TCG AAA AAT AAG CCG GAG CGC TAC ACC GAG 849

His Asn Asp Ala Ser Lys Asn Lys Pro Glu Arg Tyr Thr Glu 90

CCC TAT ACC ACC TAT AAA CAA TAT TTA AAG CAG TAT ATC GCA 891

Pro Tyr Thr Thr Tyr Lys Gln Tyr Leu Lys Gln Tyr Ile Ala 104

GGC GCG CGG GAA AAA GGC GCC CAT CCG CTT CTC ATT ACC CCT 933

Gly Ala Arg Glu Lys Gly Ala His Pro Leu Leu Ile Thr Pro 118

GTA GCA CGC TTT CAT TAT GAA AAT GAC ATG TTT TTG AAC GAC 975

Val Ala Arg Phe His Tyr Glu Asn Asp Met Phe Leu Asn Asp 132

TTT CCT GAC TAT TGC ATT GCC ATG AAG CAG ACG GCT GCT GAG 1017

Phe Pro Asp Tyr Cys Ile Ala Met Lys Gln Thr Ala Ala Glu 146

GAG AAT GTC CAG CTC ATT GAT CTG ATG GAG AAA AGT CTT GCT 1059

Glu Asn Val Gln Leu Ile Asp Leu Met Glu Lys Ser Leu Ala 160

TTC TTT ACC GAG AAG GGC GAG GAA AAA GTG TAC ACC TAT TTT 1101

Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Glu Lys Val Tyr Thr Tyr Phe 174

ATG GTG TCA GAA GGA ATT AAC GAT TAC ACG CAC TTT ACA AAA 1143

Met Val Ser Glu Gly Ile Asn Asp Tyr Thr His Phe Thr Lys 188

AAA GGC GCA AAT GAA ATG GCG AAA CTT GTG GCA AAA GGC ATA 1185

Lys Gly Ala Asn Glu Met Ala Lys Leu Val Ala lys Gly Ile 202

AAG GAA CTC GGC CTG CCA TTG ACA GAA TCG ATC ATC AAA GAA 1227

Lys Glu Leu Gly Leu Pro Leu Thr Glu Ser Ile Ile Lys Glu 216

GGG TGA AAA ATG TGA GGA GAAAACTG TATCACGGCG CTTGTTATTA 1273

Gly *** 217

TCCCGAATTA TGGGATGAAG AGACGATTCA GCAGGACATT GACATCATGC 1323

GTGAAGTTGG CGTGAATGTT GTGCGGATCG GTGAATTTGC CTGGTCTGTC 1373

ATGGAACCGG AAGAAGGAAA AATTGACGTC AGTTTTTTCA AAGAGATCAT 1423

CACCCGTCTG TATGATAACG GCATCGAAAC GATCATGTGC ACGCCGACGC 1473

CTACACCGCC GATTTGGCTG TCGCACGGCC GGCCGGAGCG TATGCATGTA 1523

AACGAAAAAA GAGAGGTCAT GGGGCATGGC TCCCGTCAG 1562

[서열목록]

서열번호(SEQ ID NO.) : 2

서열의 길이 : 217

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

서열의 종류 : 단백질

기원

생물명 : 바실러스종

주명 : DS1152 (KFCC11026)

서열:

A Met Ala Asn His Ile Ty Leu Ala Gly Asp Ser Thr Val Gln Thr Tyr 16

B Met Ala Asn His Ile Ty Leu Ala Gly Asp Ser Thr Val Gln Thr Tyr 16

A Gly Asp Ser Thr Asn Gln Gly Gly Trp Gly Gln Phe Leu Gly Ser His 32

B Gly Asp Ser Thr Asn Gln Gly Gly Trp Gly Gln Phe Leu Gly Ser His 32

A Leu Pro Glu His Ile Gln Val Ile Asn Arg Ala Ile Gly Gly Arg Ser 48

B Leu Pro Glu His Ile Gln Val Ile Asn Arg Ala Ile Gly Gly Arg Ser 48

A Ser Lys Thr Phe Val Glu Glu Gly Arg Leu Gln Ala Ile Leu Asp Val 64

B Ser Lys Thr Phe Val Glu Glu Gly Arg Leu Gln Ala Ile Leu Asp Val 64

A Ile Glu Pro Asp Asp Trp Leu Phe Val Gln Met Gly His Asn Asp Ala 80

B Ile Glu Pro Asp Asp Trp Leu Phe Val Gln Met Gly His Asn Asp Ala 80

A Ser Lys Asn Lys Pro Glu Arg Tyr Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Tyr Lys 96

B Ser Lys Asn Lys Pro Glu Arg Tyr Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Tyr Lys 96

A Gln Tyr Leu Lys Gln Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Glu Lys Gly Ala His 112

B Gln Tyr Leu Lys Gln Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Glu Lys Gly Ala His 112

A Pro Leu Leu Ile Thr Pro Val Ala Arg Phe His Tyr Glu Asn Asp Met 128

B Pro Leu Leu Ile Thr Pro Val Ala Arg Phe His Tyr Glu Asn Gly Val 128

A Phe Leu Asn Asp Phe Pro Asp Tyr Cys Ile Ala Met Lys Gln Thr Ala 144

B Phe Leu Asn Asp Phe Pro Asp Tyr Cys Ile Ala Met Lys Gln Thr Ala 144

A Ala Glu Glu Asn Val Gln Leu Ile Asp Leu Met Glu Lys Ser Leu Ala 160

B Ala Glu Glu Asn Val Gln Leu Ile Asp Leu Met Glu Lys Ser Leu Ala 160

A Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Glu Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Met Val 176

B Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Glu Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Met Ile 176

A Ser Glu Gly Ile Asn Asp Tyr Thr His Phe Thr Lys Lys Gly Ala Asn 192

B Ser Glu Gly Ile Asn Asp Tyr Thr His Phe Thr Lys Lys Gly Ala Asn 192

A Glu Met Ala Lys Leu Val Ala lys Gly Ile Lys Glu Leu Gly Leu Pro 208

B Glu Met Ala Lys Leu Val Ala lys Gly Ile Lys Glu Leu Gly Leu Pro 208

A Leu Thr Glu Ser Ile Ile Lys Glu Gly *** 217

B Leu Thr Glu Ser Ile Ile Lys Glu Arg *** 217

상기의 표에서 상위 아미노산 서열(A)은 본 발명의 아미노산 서열이며, 하위의아미노산 서열(B)은 유전자 은행에서 검색된 바실루스 서브틸리스 게놈부위의 유전자에서 추정된 아미노산 서열이다.

본 발명은 미생물로부터 신규의 효소를 유전자 재조합법에 의해 대량생산하였다. 생산된 효소는 세파로스포린계열의 항생제 제조에 필수적인 전구체인, 디아세틸 세팔로스포린C 및 디아세틸7-ACA를 효소적 방법에 의해 제조한다.

본 발명의 효소를 세팔로스포린C와 7-ACA의 탈아세틸화반응에 이용함으로서, 기존의 다단계 화학합성공정중 일부공정의 제거 및 단축이 가능하며, 반응부산물 생성 및 중간체의 분해를 방지 함으로서 산업적 생산수율의 향상에 기여할 수 있다.

Claims

서열번호 1의 DNA염기서열로 표시되는 세팔로스포린 디아세틸라아제 구조유전자
제 1항의 세팔로스포린 디아세틸라아제 구조유전자를 포함하는 재조합 벡터
제 2항의 재조합벡터를 포함하는 형질전환체 대장균 KFCC11029
제 3항의 형질전환체 대장균 KFCC11029가 생산하는 서열 2(A) 기재의 단백질
서열번호 1의 DNA 단편 및 세팔로스포린 디아세틸라아제 활성을 보유한 바실루스 DS1152(KFCC11026)
제 4항에 있어서, 아미노 말단에 메티오닌을 함유한 아미노산 염기서열과 아미노산이 부분치환된 변이 단백질임을 특징으로 하는 형질전환체 대장균 KFCC11029가 생산하는 서열 2(A) 기재의 단백질
제 4항에 있어서, 이중체 또는 다중체로 구성된 효소임을 특징으로 하는 형질전환체 대장균 KFCC11029가 생산하는 서열 2(A) 기재의 단백질
제 4항에 있어서, 세팔로스포린 디아세틸레이션 반응에 사용하는 단백질 구성물임을 특징으로 하는 형질전환체 대장균 KFCC11029가 생산하는 서열 2(A) 기재의 단백질
제 4항에 있어서, 세팔로스포린 디아세틸레이션 반응에 사용하는 효소임을 특징으로 하는 형질전환체 대장균 KFCC11029가 생산하는 서열 2(A) 기재의 단백질
제 8항에 있어서, 담체에 고정화하여 세팔로스포린 디아세틸레이션 반응에 사용하는 효소임을 특징으로 하는 형질전환체 대장균 KFCC11029가 생산하는 서열 2(A) 기재의 단백질
대장균 KFCC11029를 글루코즈 0.2%, 효소추출물 3%, NaCl 0.25%, pH7.2를 종배지로 하여 37℃에서 12시간 배양한 후 동일배지하에서 5L 발효조에 교반속도 400rpm, 공기주입량 1V/V/M의 조건으로 배양하고, 당이 고갈되는 시점에서 최종농도가 효소추출물 5.6%, NaCl 0.4%, 글루코즈 3.4%가 되게 추가배지를 주입하며 배양한 후, 균체의 성장 곡선상에서 성숙기 단계에 도달할 시점에 500uM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하여 세팔로스포린 디아세틸라아제 제조방법.