DE69030615T2

DE69030615T2 - Neue Polypeptide, DNA-Sequenzen, die deren Expression erlauben, Verfahren zur Vorbereitung und Verwendung

Info

Publication number: DE69030615T2
Application number: DE69030615T
Authority: DE
Inventors: Edith Cerbelaud; Jean-Francois Mayaux; Dominique Petre; Patrice Yeh
Original assignee: Rhone Poulenc Sante SA
Current assignee: Rhone Poulenc Sante SA
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 1997-11-06
Anticipated expiration: 2010-11-16
Also published as: EP0433117B1; CN1052508A; JP3150335B2; AU6661490A; HU907151D0; FI102971B; HUT56138A; KR0164850B1; AU631696B2; CA2030073C; IE904115A1; JPH04218379A; PT95909A; DE69030615D1; GR3024316T3; NZ236087A; FI905660A0; PT95909B; CA2030073A1; KR910012245A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, die eine enantioselektive Amidaseaktivität besitzen. Sie betrifft auch das zur Expression dieser Polypeptide benötigte genetische Material, sowie ein mikrobiologisches Verfahren zu deren Herstellung. Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Polypeptide und der transformierten Mikroorganismen zur enantioselektiven Synthese von Säuren aus racemischen Amiden und insbesondere Propionsäuren, insbesondere (S)-2-Arylpropionsäuren und (R)- 2-Aryloxypropionsäuren.
Infolge der Anwesenheit eines asymmetrischen Kohlenstoffatoms besitzen zahlreiche Moleküle zwei verschiedene stereoisomere Formen, R und S, wobei eine das Spiegelbild der anderen ist. Dies trifft für die 2-Arylpropionsäuren zu. Die meiste Zeit liegen diese Moleküle als ein racemisches Gemisch vor, wobei die zwei Isomeren in mehr oder weniger gleichen Anteilen vorhanden sind. In bestimmten Fällen wird nur ein spezifisches Isomeres benötigt, und es ist daher praktisch, ein Mittel zur Trennung der zwei Isomeren oder zur Durchführung einer stereospezifischen Synthese des gewünschten Isomeren zu besitzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Polypeptide die Amide enantioselektiv hydrolysieren können: insbesondere racemische 2-Arylpropionamide in (S)-2-Arylpropionsäuren und racemische 2-Aryloxypropionamide in (R)-2- Aryloxypropionsäuren.
Unter den Mikroorganismen, bei denen diese enzymatische Aktivität nachgewiesen wurde, ragen Stämme der Gattung Brevibacterium und Corynebacterium heraus (europäisches Patent Nr. 89 400 197.3) und insbesondere der Brevibacterium- Stamm R312 (CBS 717.73). Zusätzlich besitzen Stämme wie Rhodococcus diese enzymatische Aktivität.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Charakterisierung und Reinigung dieser enantioselektiven Amidaseaktivitäten sowie die Clonierung und Sequenzierung des genetischen Materials, das für deren Expression notwendig ist. In den folgenden Ausführungen wird der Ausdruck "Amd" verwendet, um alle enantioselektiven Amidaseaktivitäten zu bezeichnen. Der Ausdruck "Amd-Sequenz" bezeichnet Nucleotidsequenzen, die die Amidaseaktivitäten codieren.
Insbesondere liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, hohe Expressionshöhen dieser enantioselektiven Amidasen in verschiedenen wirtsorganismen unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken zu erhalten.
Die Erfindung betrifft daher die DNA-Sequenzen, die diese Polypeptide mit enantioselektiven Amidaseaktivität, insbesondere hinsichtlich racemischen 2-Arylpropionamiden codieren, ausgewählt aus der Nucleotidsequenz, die die enantioselektive Amidaseaktivität von Brevibacterium R312 (gemäß Fig. 8) oder die enantioselektive Amidase von Rhodococcus (gemäß Fig. 13) codiert sowie jede beliebige degenerierte Sequenz, die das gleiche Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft auch Sequenzen, die mit diesen DNA-Sequenzen oder mit Fragmenten davon hybridisieren, und die Polypeptide mit enantioselektiven Amidaseaktivität codieren. Die Erfindung betrifft auch die Gene, die diese DNA-Sequenzen enthalten.
Untersuchungen zur Homologie zwischen den Peptidsequenzen dieser Amidasen zeigen eine hochkonservierte Region, die für die beobachtete Aktivität verantwortlich ist. Diese Region entspricht den Aminosäuren 137 bis 193 der in Fig. 13 gezeigten Peptidsequenz (Nucleotide 618 bis 788) und den Aminosäuren 159 bis 215 der Peptidsequenz der Amidase von Brevibacterium R312, die vorstehend beschrieben wurde, mit der sie eine strenge Homologie teilt (67 %).
Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einem Gesichtspunkt eine DNA-Sequenz, wie vorstehend beschrieben&sub1; die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens die Sequenz für die Aminosäuren 137 bis 193 in Fig. 13 oder 159 bis 215 in Fig. 8 oder eine Peptidsequenz mit mindestens 50 % Homologie dazu codiert.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die Gesamtheit oder einen Teil der Amd-Sequenz gemäß den Fig. 8 und 13 oder eine Variante davon enthält. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet "variante" alle Sequenzen, die die Eigenschaften der anfänglichen Sequenz beibehalten, selbst wenn sie Veränderungen als Ergebnis von beispielsweise Mutationen, Deletionen, Insertionen oder der Degeneriertheit des genetischen Codes enthalten.
Genauer enthält die DNA-Sequenz die in den Fig. 8 oder 13 dargestellte Sequenz.
Diese Sequenzen können nach verschiedenen Methoden erhalten werden. Die allgemeine Strategie ist die Clonierung des genomischen DNA-Fragments, das das gewünschte Polypeptid codiert, mit Hilfe von von dem gereinigten Polypeptid abgeleiteten Nucleotidsonden. Unter Verwendung verschiedener Methoden einschließlich der Primer-Verlängerung, Restriktionsenzyme, Insertion von Adaptoren oder Ligierung von Linker-oligonucleotiden kann eine Nucleotidinsertion, die die gewünschte DNA-Sequenz enthält, konstruiert werden. Sie kann dann nach in der Literatur beschriebenen Techniken kartiert und sequenziert werden.
Andere Techniken können ebenfalls verwendet werden und umfassen die Verwendung von DNA und/oder eine teilweise oder vollständige chemischen Synthese. Diese Techniken sind gut bekannt, und die in den Fig. 8 und 13 beschriebenen Strukturen erlauben die Isolierung einer äquivalenten Sequenz in jedem Mikroorganismus unter Verwendung klassischer Techniken.
In der Tat, nachdem die Homologie zwischen den verschiedenen enantioselektiven Amidasen nachgewiesen wurde, erlaubt die vorliegende Erfindung die Erzeugung von Sonden, die zur Identifikation hybridisierender Gene (d.h. Genen mit einer ausreichenden Homologie) in jeder beliebigen Genbank dienen können. Es ist dann leicht zu bestätigen, daß solche Gene eine enantioselektive Amidase codieren. So ist es möglich, große Amidasemengen in jedem Mikroorganismus zu erhalten. Es ist auch möglich, daß neue enantioselektive Amidaseaktivitäten nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Polypeptide, die eine enantioselektive Amidaseaktivität besitzen, die mindestens eine der folgenden Peptidsequenzen enthalten:
- Sequenzen mit den Aminosäuren 137 bis 193 in Fig. 13
- Sequenzen mit den Aminosäuren 159 bis 215 in Fig. 8
- Sequenzen, die mindestens 50 % Homologie mit diesen Sequenzen teilen.
Die Erfindung betrifft ferner neue Polypeptide, deren Struktur sich von den vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen ableitet und die eine enantioselektive Amidaseaktivität besitzen. Diese Polypeptide werden durch Extraktion und Reinigung aus Kulturen von natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen erhalten. Die Reinigung wird in einer Aufeinanderfolge von Stufen, bestehend aus der Herstellung des Rohextrakts der Kultur, Ammoniumsulfatfraktionierung des Extrakts und Reinigung mittels Chromatographie und Gelfiltration durchgeführt. Einzelheiten sind in den Beispielen angegeben.
Genauer betrifft die Erfindung die enantioselektiven Amidasen von Brevibacterium R312 und Rhodococcus.
Die Erfindung betrifft auch transformierte Mikroorganismen, die mindestens eine Expressionskassette für die vorstehend genannten DNA-Sequenzen enthalten. Diese Kassetten umfassen bevorzugt eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, die unter die Kontrolle von regulatorischen DNA-Sequenzen gestellt wurde, die deren Expression in dem gewünschten Wirt gewährleisten. Diese Kassette kann in das Wirtsgenom integriert oder in ein Plasmid, das einen selektierbaren Marker und einen in dem Wirt funktionellen Replikationsorigin trägt, insertiert werden.
Eine der Interessen der vorliegenden Erfindung ist die Expression dieser Polypeptide unter künstlichen Bedingungen, d.h. die Expression einer heterologen Sequenz in einer bestimmten Zelle, deren Kulturbedingungen besonders vorteilhaft sind und/oder die Expression einer homologen Sequenz unter der Kontrolle von mindestens teilweise heterologen Regulatorsignalen, um die Produktion zu erhöhen und/oder die Kulturbedingungen zu verbessern.
Die die Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kontrollierenden DNA-Sequenzen tragen bevorzugt eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion. Diese Region enthält einen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle, die homolog oder heterolog zu der des Peptidprodukts ein kann.
Die Wahl der Regulatorregion hängt von dem zu verwendenden Wirt ab. Insbesondere kann für prokaryotische Wirte der heterologe Promotor aus starken bakteriellen Promotoren, wie Promotoren des Tryptophanoperons Ptrp, des Lactoseoperons Plac, des rechten oder linken Promotors des Bakteriophagen Lambda PR und PL, den starken Promotoren der Corynebacterien-Phagen oder selbst homologen Promotoren von Corynebacterien ausgewählt werden. Genauer ist im Falle des rechten Promotors von Lambda die temperaturempfindliche Form PRcIts bevorzugt. Für eukaryotische Organismen, wie Hefe, können die Promotoren der glycolytischen Hefegene verwendet werden, wie die Promotoren der Gene Phosphoglyceratkinase (PGK), Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GPD), Lactase (LAC4) und Enolase (ENO).
Wenn der Wirtsmikroorganismus prokaryotisch ist, leiten sich die Ribosomenbindungsstellen bevorzugt von entweder dem cII-Gen von Lambda oder von homologen Genen von Corynebakterien ab.
Eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, die in dem Wirt funktionell ist, wird an das 3'-Ende der codierenden Sequenz angefügt. Das Plasmid trägt auch eine oder mehrere Marker, die eine Selektion des rekombinanten Wirts erlauben. Dominante Marker sind bevorzugt, wie diejenigen, die Antibiotikaresistenz verleihen, wie gegen Ampicillin oder Streptomycin oder gegen andere Toxine.
Die zu verwendenden Wirtsmikroorganismen umfassen insbesondere Enterobakterien, wie E. coli und Corynebakterien der Gattung Corvnebacterium, Brevibacterium oder Rhodococcus.
Natürlich können auch andere Zelltypen, basierend auf dem gleichen Prinzip, verwendet werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft die vorstehend beschriebenen Plasmide, die mindestens eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, eine DNA- Sequenz, die das gewünschte Polypeptid codiert, und einen selektierbaren Marker enthalten.
Die Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen transformierten Mikroorganismen hinsichtlich ihrer Anwendung zur Herstellung der enantioselektiven Amidasen sowie ihrer Verwendung für die enantioselektive Synthese von Säuren aus racemischen Amiden.
Das Verfahren zur Herstellung der enantioselektiven Amidasen betrifft die Züchtung der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen unter Bedingungen, die die Expression der die enantioselektive Amidase codierenden Sequenz erlaubt, gefolgt von der Trennung der Mikroorganismen von der Amidase, die produziert wurde.
Genauer betrifft die Erfindung die Verwendung der rekombinanten Mikroorganismen oder Polypeptide, die bereits beschrieben wurden, zur enantioselektiven Synthese von 2- Arylpropionsäuren aus den entsprechenden racemischen 2-Arylpropionamiden.
Gemäß einer der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird ein empfohlenes Verfahren beschrieben, das darin besteht, daß man ein Stereoisomeres einer organischen Säure aus dem entsprechenden racemischen Amid herstellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das racemische Amid mit dem, wie vorstehend beschrieben, transformierten Mikroorganismus oder einem, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen Polypeptid in Kontakt gebracht wird, und das so erhaltene Stereoisomere isoliert wird.
Unter den Amiden, die diesem Verfahren unterworfen werden können, werden das racemische Ketoprofenamid genannt, aus dem S(+)-Ketoprofen - das in der pharmazeutischen Industrie nützlich ist - hergestellt werden kann.
Die folgenden Beispiele und Figuren kennzeichnen die Erfindung näher und erläutern ihre Vorteile. Sie gelten jedoch als erläuternd und nicht als begrenzend.

Beschreibung der Figuren

- Fig. 1:

A. Peptidsequenzen (N-terminal und intern), erhalten aus der gereinigten Amidase von Brevibacterium R312.
B. Oligonucleotidsonde, abgeleitet von dem internen Peptidfragment.

- Fig. 2:

A. Strategie zur Entwicklung der Sonde Sq 918 aus dem N-terminalen Peptidfragment, abgeleitet von der Amidase von Brevibacterium R312.
B. Spezifische Sonde Sq 918.

- Fig. 3:

A. Hybridisierungsprofil der Sonde sq 918 mit der gesamten genomischen DNA von Brevibacterium R312, gespalten mit EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SmaI und SphI.
B. Hybridisierungsprofil der Sonde Sq 762 mit der gesamten genomischen DNA aus Brevibacterium R312, gespalten mit BamHI, BglII, EcoRI, KpnI, PstI, SalI, SmaI, SphI, SstI und XhoI.

- Fig. 4:

Restriktionskarten der Plasmide pXL1650 und pXL1651.

- Fig. 5:

Restriktionskarte des 5,4 kb-PstI-Fragments, enthaltend das enantioselektive Amidasegen von Brevibacterium R312.
Sequenzierstrategie des BamHI-PstI-Fragments, enthaltend das enantioselektive Amidasegen von Brevibacterium R312.

- Fig. 7:

Analyse der offenen Leseraster des sequenzierten Fragments.
Nucleotid- und Peptidsequenzen des enantioselektiven Amidasegens von Brevibacterium R312.

- Fig. 9:

Restriktionskarte des Plasmids pXL1724.

- Fig. 10:

Restriktionskarte des Plasmids pXL1751.

- Fig. 11:

Restriktionskarte des Plasmids pXL1752.

- Fig. 12:

12,5%iges SDS-Polyacrylamidgel nach Coomassie-Blue- Färbung, welches die Expression der enantioselektiven Amidase von Brevibacterium R312 in den Stämmen E. coli B und E. coli K12 E103S zeigt. Jede Bahn entspricht einer Proteinmenge, die 60 µl der Kultur bei einer O.D. von 2,1 (E103S) oder 0,7 (E. coli B) äquivalent ist. T, beschallt (pXL1029 und pXL906) enthält das IL1-β-Gen unter der Kontrolle des PRcIts- bzw. Ptrp-Promotors.

- Fig. 13:

Nucleotid- und Peptidsequenzen des enantioselektiven Amidasegens von Rhodococcus (BamHI-Fragment aus dem Plasmid pXL1836)

- Fig. 14:

Restriktionskarte des Schaukelvektors pSV73.

- Fig. 15:

Restriktionskarte des Expressionsplasmids pYG811B.

- Fig. 16:

Restriktionskarte des Expressionsplasmids pYG817B.

- Fig. 17

Restriktionskarte des Expressionsplasmids pYG822.

Ausgangsplasmide

Das Plasmid pXL1029 wurde in Jung et al. (1988), Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 139, 129-146 beschrieben. Es trägt ein EcoRI-NdeI-Fragment, das PRcITs-RBScIIΔtRI enthält.

Beispiel 1

Identifikation und Reinigung der enantioselektiven Amidase von Brevibacterium R312.

1.1. Identifikation

(R,S)-2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid (HPP-Amid), ein Derivat von 2-Aryloxypropionamid, ist ein besseres Substrat für die enantioselektive Amidase als 2-Arylpropionamidderivate, insbesondere 2-Phenylpropionamid und 2-(3-Benzoylphenyl)propionamid. Ferner ist die Selektivität der Amidase gegenüber dem R-Enatiomeren des HPP-Amids für die Selektivität gegenüber dem 5-Enantiomeren der 2-Arylpropionamidderivate repräsentativ.
Als Folge wurde die enantioselektive enzymatische Aktivität unter Verwendung von 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid als Substrat nachgewiesen. Die Reaktion wurde bei 25ºC unter Rühren in einem Puffer aus 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, in Gegenwart von Brevibacterium R312 durchgeführt; sie wurde durch Zugabe eines Gemisches aus 0,05 M Phosphorsäure, Acetonitril und 1 N HCl in einem Verhältnis von 55/40/5 (Vol./Vol.) gestoppt. Nach Zentrifugation der Kultur wurde der überstand mittels Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Hibar-Merck PP-18,5 p.m) analysiert. Die Elution wurde mit einer Lösung aus 0,005 M Phosphorsäure und Acetonitril (85/15) (Vol./Vol.) durchgeführt. Die jeweiligen Konzentrationen an HPP-Amid und HPP-Säure wurden durch Vergleichen der Elutions-Peaks mit einem Standard vermessen. Für dieses Substrat wird der Enantiomerenüberschuß als (R - S)/(R + S) x 100 definiert, worin R und S die jeweiligen Konzentrationen der R- und S-Enantiomeren der HPP- Säure sind. Der Enantiomerenüberschuß wurde entweder aus einer polarimetrischen Messung (unter Verwendung der Absorption von Natrium bei 589 nm) oder mittels HPLC unter Verwendung einer chiralen Säule abgeleitet.
Die mit ganzen Zellen bzw. einem löslichen Extrakt erhaltenen Aktivitäten betrugen 15 E/mg bzw. 24 E/mg Protein (1 E = 1 µmol pro h gebildete HPP-Säure). Der Enantiomerenüberschuß von (R)-HPP-Säure betrgt 95 %. Diese Ergebnisse zeigen, daß Brevibacterium R312 eine enantioselektive Amidaseaktivität besitzt, die racemische 2-Arylpropionamide in die entsprechenden S-Säuren hydrolysieren kann. Dies wurde durch die Hydrolysen von racemischem 2-Phenylpropionamid und racemischem 2-(3-Benzoylphenyl)propionamid in die jeweiligen entsprechenden S-Säuren mit einem Enantiomerenüberschuß von mehr als 93 % bestätigt.

1.2 Reinigung

Die Reinigung wurde bei 4ºC durchgeführt. Zellen (40 g Trockengewicht Brevibacterium R312) wurde aufgetaut und in 300 ml Puffer A (50 mM Natriumphosphat, pH 7, 5 mM β-Mercaptoethanol) suspendiert. Die Zellen wurden dann durch Beschallen aufgebrochen, und die Membrantrümmer wurden durch Zentrifugation bei 20.000 UpM für 30 min entfernt. 30 ml überstand wurde mit 25 ml einer 10%igen Streptomycinsulfatlösung langsam unter Rühren versetzt. Nach 45 min wurde die Lösung wie vorstehend geklärt und der so erhaltene überstand wurde mit Ammoniumsulfat behandelt. Die Proteinfraktion, die zwischen 80,8 % und 56,6 % Sättigung mit Ammoniumsulfat ausfiel, wurde durch Zentrifugation gewonnen und in 35 ml Puffer A aufgelöst und dann langsam gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die so erhaltene Lösung wurde auf eine 20%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat eingestellt, zentrifugiert, dann auf eine Phenyl-Sepharose CL-4B-Säule (Pharmacia), die mit Puffer A bei einer 20%igen Sättigung mit Ammoniumsulfat äquilibriert worden war, aufgebracht. Die aktiven Fraktionen wurden mit dem gleichen Puffer eluiert, dann durch Ultrafiltration auf ein Volumen von 18 ml unter Verwendung einer Amicon-Diaflo PM10-Zelle konzentriert. Glycerin (10 %) wurde dann der konzentrierten Lösung zugesetzt und die so erhaltene Lösung wurde auf eine Ultrogel AcA 44-Säule (IBF-Biotechnics, Frankreich), die zuvor mit 50 mM Tris-HCl, pH 7, 100 mM NaCl äquilibriert worden war, aufgebracht. Fraktionen, die die höchste spezifische Aktivität enthielten (etwa 32 % der auf die Säule geladenen Gesamtaktivität) wurden gewonnen, eingeengt und einer ergänzenden Filtrationsstufe auf dem gleichen Gel unterworfen. Parallel dazu wurden Fraktionen, die die höchste spezifische Aktivität enthielten (etwa 30 % des auf die Säule geladenen Gesamtproteins) mit SDS-PAGE analysiert und gelagert. Die Enantioselektivität des gereinigten Proteins wurde ebenfalls bestimmt.
Dieses Reinigungsverfahren führte zu einem zu mehr als 80 % reinen Enzym mit einer spezifischen Aktivitt von 815 E/mg. In dieser Stufe ist eine Hauptbande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 59 +/- 5 KD, die mindestens 80 % der Gesamtproteine entspricht, auf SDS-PAGE sichtbar. Ferner entspricht die von einer HPLC-TSK 3000-Säule eluierte Amidaseaktivität einem Molekulargewicht von 122 KD, was anzeigt, daß das Enzym in einer dimeren Form vorliegt.
Die Tabelle 1 zeigt die charakteristischen Eigenschaften der verschiedenen Fraktionen. Diese Tabelle beschreibt die verschiedenen Reinigungsstufen der enantioselektiven Amidase von Brevibacterium R312:
- aus 40 g feuchten Zellen, nach Fällung mit Streptomycinsulfat
- eine Einheit (E) entspricht 1 µmol pro h gebildeter HPP-Säure unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen. Tabelle 1

Beispiel 2

Clonierung der enantioselektiven Amidase von Brevibacterium R312

2.1 Ableitung der Proteinsequenzen

Die Peptidsequenzen, die jeweils dem N-terminalen Ende (27 Reste) und einem internen tryptischen Fragment (21 Reste) der enantioselektiven Amidase von Brevibacterium R312 entsprachen, wurden unter Verwendung des gereinigten Enzyms bestimmt.
Dazu wurden 3 nmol des Amidasepräparats reduziert und carboxymethyliert. Die Proteinhauptkomponente wurde dann entsalzt und durch Umkehrphasen-HPLC bis zur Homogenität gereinigt. Die N-terminale Sequenz wurde dann nach dem Edman- Verfahren des automatischen Sequenzabbaus unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 470A-Geräts bestimmt. Die in Fig. 1A dargestellte Sequenz wurde so erhalten. Um die weiteren internen Sequenzen zu erhalten, wurde die gleiche Proteinmenge mit Trypsin gespalten. Die reduzierten und carboxymethylierten Fragmente wurden dann mittels Umkehrphasen- HPLC (2,1 x 10 mm, Durchfluß 0,2 ml/min) unter Verwendung des folgenden Elutionspuffers getrennt: ein Gradient von bis 50 % Acetonitril in 0,07 % Trifluoressigsäure. Das in einem gut abgetrennten Peak eluierende Peptid (bei 40,8 % Acetonitril) wurde sequenziert (Fig. 1A).

2.2 Konstruktion der Nucleotidsonden

Zwei Strategien wurden verfolgt.
Bei der ersten Strategie wurde eine 29-mere Sonde (59 % minimale Homologie) konstruiert, wobei der Codongebrauch des Tryptophanoperons von Brevibacterium lactofermentum berücksichtigt wurde (7,7 kb-Sequenz, enthaltend 6 Cistrons: Matsui et al., Mol. Gen. Genet. 209, 5. 299, 1987) und wobei die Sequenz IDGALGSYDV des internen Fragments (mit einer kleineren durchschnittlichen Degeneriertheit) verwendet wurde. Der nichtcodierende Strang wurde unter Berücksichtigung der relativen thermodynamischen Neutralität der G:T- Paarung und durch Einschleusung mehrerer Degeneriertheiten, um die durchschnittliche theoretische Frequenz der in Betracht gezogenen Codons zu maximieren (88 % bezüglich der Verwendung der gewählten Codons) synthetisiert. Diese Überlegungen führten zu einem GC-Gehalt der Sonde von etwa 69 %. Die Sequenz der Sonde (Sq 762) ist in Fig. 1B gezeigt.
Bei der zweiten Strategie wurde das von Girges et al. (Nucleic Acids Res. 16, S. 10371, 1988) beschriebene PCR- Verfahren verwendet, um eine genaue Nucleotidsonde aus einem einem stark degenerierten Codon entsprechenden Peptid zu erhalten. Dazu wurden 25-mere Oligonudeotide (siehe die unterstrichenen Sequenzen in Fig. 2A) synthetisiert, die allen Möglichkeiten der Codierung des ersten oder der letzten fünf Codons der N-terminalen Peptidsequenz entsprachen, und jeweils EcoRI- bzw. HindIII-Spaltstellen an ihren 5'-Stellen trugen. Diese 25-meren wurden verwendet, um eine enzymatische Amplifikation genomischer DNA von Brevibacterium R312 zu primen. Nach 30 Amplifikationszyklen wurde das betreffende Fragment auf einem Gel gereinigt, dann zwischen die HindIII- und EcoRI-Spaltstellen des Bakteriophagen M13mp19 insertiert. In der Tat wurden zwei verschiedene Hybridisierungstemperaturen der Primer (45ºC und 48ºC) verwendet, wodurch die zwei infragekommenden Fragmente erhalten wurden. So wurden nach der Clonierung der Fragmente mehrere Clone aus jeder Temperatur sequenziert und verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2A gezeigt. Es ist zu erkennen, daß abgesehen von den durch die Primer eingeführten Degeneriertheiten ein DNA-Fragment (einzigartig zwischen den Primern), das das N-terminale Ende der Amidase codiert, gut amplifiziert war. Ein synthetisches 40-meres Oligonucleotid (Sq 918) entsprechend diesem internen Fragment wurde daher für den Rest der Clonierung als genaue Sonde für das N-terminale Ende der Amidase verwendet. Die Fig. 28 zeigt die Nucleotidsequenz der spezifischen Sonde sq 918.
Die zwei Sonden Sq 762 und Sq 918 wurden dadurch erhalten und wurden durch 5'-Phosphorylierung mit ³²P markiert.

2.3 Clonierung des Gens, das die enantioselektive Amidase von Brevibacterium R312 codiert

Diese Strategie bestand darin, daß man zuerst die Spezifität der Sonden bestätigte und die Natur des durch einen Southern Blot zu donierenden genomischen DNA-Fragments bestimmte. In kürze, genomische DNA von Brevibacterium R312 wurde alternativ mit mehreren Restriktionsenzymen entsprechend der möglichen Clonierungsstellen und insbesondere Stellen, die in der mehrstelligen Clonierungsregion der pUC- Plasmide vorhanden waren, gespalten. Insbesondere wurde PstI verwendet. Nach Elektrophorese durch ein Agarosegel und Transfer auf eine Nylonmembran wurden die verschiedenen Spaltansätze mit den Sonden Sq 762 und Sq 918 hybridisiert. Die in Fig. 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die zwei Sonden eine ausreichende Spezifität unter den Hybridisierungsbedingungen zeigten (fast ein Fragment hybridisierte für jede Spaltung). Ferner kann man, da die zwei Sonden fast das gleiche Hybridisierungsprofil ergeben, zu der Annahme geführt werden, daß die Hybridisierungssignale des nachgesuchten Gens ziemlich spezifisch sind, und daß das nach tryptischer Spaltung erhaltene interne Peptid sehr nahe dem N-terminalen Ende ist. Insbesondere zeigt der Hybrisierungsabdruck die Existenz eines einzigartigen 5,4 kg PstI-Fragments, das stark mit den zwei Sonden hybrisierte. Es wurde daher beschlossen, dieses Fragment zu donieren.
Für die Clonierung wurden alle Fragmente mit einer ungefähren Größe zwischen 4,6 und 5,5 kb und 5,5 bis 6,5 kb als Ergebnis der PstI-Spaltung der gesamten genomischen DNA von Brevibacterium R312 auf Agarose gereinigt, elektroeluiert und an mit PstI gespaltenen pUC19 ligiert. Nach der Transformation des E. coli-Stamms DH5α wurden 500 weiße Kolonien auf einem X-gal-Medium erhalten, die theoretisch rekombinanten Mikroorganismen entsprechen. Jede Kolonie wurde einzeln isoliert, auf eine Nylonmembran überführt, dann durch Hybridisierung mit der ³²P-markierten Sq 918-Sonde analysiert. Zwei done hybridisierten sehr stark; sie wurden isoliert und in den folgenden Stufen verwendet.
Die zwei rekombinanten Plasmide pXL1650 und pXL1651, isoliert aus diesen zwei donen, wurden mit verschiedenen Methoden einschließlich Restriktionskartierung, Teilsequenzierung unter Verwendung der Sonden als Sequenzier-Primer und Southern Blot, analysiert. Die Fig. 4 zeigt, daß die zwei Plasmide die gleiche 5,4 kb PstI-Insertion in den zwei Orientierungen enthalten. Die Fig. 5 zeigt die Restriktionskarte dieses Fragments. Diese zwei Plasmide enthalten in der Tat Sequenzen, die die charakterisierten Peptide codieren, wobei das tryptische Fragment sich an das N-terminale anschließt (Fig. 8). Ferner zeigen diese Ergebnisse, daß das Gen, das die enantioselektive Amidase von Brevibacterium R312 codiert, auf einem 2,3 kb-BamHI-PstI-Fragment, das in der Richtung BamHI gegen PstI orientiert ist, lokalisiert ist. Unter Angabe der Position des 5'-Endes der codierenden Sequenz und in Kenntnis, daß dieses Enzym durch höchstens 2 kb (57 bis 63 KD-Monomeres gemäß den Einschätzungen der Erfinder) codiert wird, steht fest, daß das vollständige Gen in dem BamHI-PstI-Fragment enthalten war, das daher sequenziert wurde.

Beispiel 3

Sequenz des BamHI-PstI-Fragments, das das Gen enthält. das die enantioselektive Amidase von Brevibacterium R312 enthält

Die Sequenzierstrategie für das BamHI-PstI-Fragment ist in Fig. 6 gezeigt. Die verschiedenen Sequenzen wurden alle durch das Kettenterminationsverfahren (Sequenase-Kit in Gegenwart von 7-Deaza-dGTP; (³&sup5;S)-dATP) entweder auf einzelsträngigen M13-Matrizen, die Subfragmente trugen, oder direkt auf dem Plasmid pXL1650 erhalten. Dazu wurden mehrere spezifische Primer ebenfalls synthetisiert. Der durchschnittliche GC-Gehalt der erhaltenen Sequenz beträgt 61,5 %. Die Fig. 7 zeigt eine Analyse der offenen Leseraster; man kann erkennen, daß das offene Leseraster, das der Amidase entspricht, 521 Aminosäuren codiert, ein Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 54671. Der GC-Gehalt in diesem offenen Leseraster beträgt jeweils 65,8 %, 52,5 % und 70 % für die erste, zweite und dritte Codonposition, was eine typische Verteilung in codierenden Sequenzen von GC-reichen Mikroorganismen ist. Die Fig. 8 zeigt die vollständige Sequenz des BamHI-PstI-Fragments.

Beispiel 4

Expression des Gens, das die enantioselektive Amidase von Brevibacterium R312 codiert. in E. coli

4.1 Konstruktion der Plasmide

Mehrere Plasmide wurden konstruiert, in denen das Strukturgen der Amidase, das eine homologe Ribosomenbindungsstelle (RBS) oder die RBS aus dem CII-Gen von Lambda enthält, unter die Kontrolle seines eigenen Promotors, des Promotors des Tryptophanoperons oder des rechten temperaturempfindlichen Promotors von Lambda gesetzt wurde. Das Plasmid pXL1650 (Fig. 4) wurde durch Insertion des 5,4 kb- Fragments als Ergebnis der PstI-Spaltung der gesamten genomischen DNA von Brevibacterium R312 in die einzigartige PstI-Spaltstelle des Plasmids pUC19 erhalten. Dieses Plasmid trägt daher der Promotor des Lactoseoperons Plac, gefolgt von einer Ribosomenbindungsstelle und dem Strukturgen, das die enantioselektive Amidase von Brevibacterium R312 codiert, sowie von einem Marker, der Ampicillinresistenz codiert.
Das Plasmid pXL1724 (Fig. 9) enthält das 2,3 kb-BamHI- PstI-Fragment, herausgeschnitten aus dem 5,4 kb-PstI-Fragment unter der Kontrolle des Promotors des Tryptophanoperons von E. coli. Bei dieser Konstruktion gingen dem Amidasegen von Brevibacterium R312 daher 58 Basenpaare stromaufwärts des ATG-Codons, das seine eigene Ribosomenbindungsstelle enthält, voraus (Fig. 8).
Die beiden anderen Konstruktionen wurden hergestellt, worin das Strukturgen, das die enantioselektive Amidase von Brevibacterium R312 codiert, unter die Kontrolle von heterologen Promotoren mit heterogen Bindungsstellen gestellt wurde. Diese Plasmide (pXL1751 und pXL1752) wurden wie folgt erhalten:
Das Plasmid pXL1724 wurde durch PCR mutagenisiert, um eine NdeI-Stelle (CATATG) gegen das ATG-Codon, das stromaufwärts des Strukturgens der Amidase gelegen ist, zu substituieren. Die Amplifikation wurde unter Verwendung eines Primers, der der NdeI-Stelle entsprach und mit dem ATG- Startcodon hybridisierte, und einem Primer entsprechend einer XhoI-Stelle, die stromabwärts des ATG-Codons gelegen war, durchgeführt. Das amplifizierte Fragment wurde dann durch Spaltung mit NdeI und XhoI herausgeschnitten.
- Verwendung des Promotors Ptrp:
In das mit EcoRI und XhoI gespaltene Plasmid pXL1724 wurde ein EcoRI-NdeI-Fragment, das den Ptrp-Promotor und die Ribosomenbindungsstelle des lambda-cII-Gens, worin die Terminationssequenz tR&sub1; deletiert war, und die 5'-Region des Amidasestrukturgens (Fragment NdeI-XhoI) trug, insertiert. Dieses erzeugte das Plasmid pXL1751 (Fig. 10).
- Verwendung des Promotors PRcIts:
Die gleiche Strategie wurde verwendet, diesmal unter Verwendung des EcoRI-NdeI-Fragments aus dem Plasmid pXL1029, das den PRcIts-Promotor und die Ribosomenbindungsstelle des lambda-cII-Gens ohne die Terminationssequenz tR&sub1; enthielt. Dies erzeugte das Plasmid pXL1752 (Fig. 11).

4.2 Expression des Amidasegens von Brevibacterium R312 in E. coli B und E. coli K12 E103S

Die Plasmide pXL1751 und pXL1752 wurden verwendet, um die Stämme E. coli B bzw. E. coli K12 E103S nach dem Calciumchloridverfahren zu transformieren. Die Selektion der rekombinanten Mikroorganismen wurde in einem Ampicillinmedium durchgeführt.
Die Expression der enantioselektiven Amidase von Drevibacterium R312 wurde nach Beschallung der Zellen, mit SDS-PAGE der Rohfraktionen oder nach Zentrifugation des Pellets und des Überstands gemessen. Die Ergebnisse in Fig. 12 zeigen eineri hohen Grad der Amidaseexpression entsprechend bis zu 20 % Gesamtprotein.

Beispiel 5

Verwendung der enantioselektiven Amidase von Brevibacterium R312 zur enantioselektiven Synthese von 2- Arylpropionsäuren

Die folgenden Stämme wurden bei den folgenden Versuchen verwendet:
E. coli (pXL1751) - die Amidase-codierende Sequenz steht unter der Kontrolle des Promotors des Tryptophanoperons.
E. coli (pXL1752) - die Amidase wird durch Erhöhen der Temperatur von 30ºC auf 42ºC am Ende der exponentiellen Phase produziert (PR-Promotor von Lambda unter der Kontrolle des temperatursensitiven Repressors cIts).
Zwei Kontrollstämme wurden ebenfalls verwendet:
E. coli (pXL906) - aquivalent E. coli (pXL1751), worin das Amidasegen duche das IL1β-Gen ersetzt ist.
E. coli (pXL1029) - äquivalent E. coli (pXL1752), worin das Amidasegen durch das IL1β-Gen ersetzt ist.
F.
Das folgende Verfahren wurde verwendet, um die Aktivität dieser Mikroorganismen zu testen:
Eine Zellsuspension, die unter geeigneten induzierenden Bedingungen gezüchtet wurde, wurde zu einer Lösung aus:
- Hydroxy-4-phenoxy-2-propionamid (HPPAm) oder
- Phenyl-2-propionamid (PPAm) oder
- Ketoprofenamid (KAm) beispielsweise gegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde dann in einem Puffer, der Acetonitril : N Salzsäure (90:10) (Vol./Vol.) enthielt, verdünnt, und die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC aufgetrennt, und die Amidaseaktivität wurde berechnet. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse zeigen die Effizienz dieses Systems.
Die Tabelle 2 zeigt die spezifische Aktivität von Brevibacterium R312, produziert in E. coli unter induzierten Bedingungen gegenüber den racemischen Substraten HPPAm, PPAm und KAm sowie dem Enantiomerenüberschuß der produzierten chiralen Säuren. Bei diesem Versuch wurden E. coli-Stämme, die die Plasmide pXL1751 (Amidase) oder pXL906 (Kontrolle) beherbergten, bei 37ºC gezüchtet. Tabelle 2
Tabelle 3 zeigt die spezifische Aktivität der Amidase von Brevibacterium R312 (Expressionsplasmid pXL1751), produziert in E. coli, der bei 28ºC unter induzierenden oder reprimierten Bedingungen gezüchtet wurde, gegenüber den racemischen Substraten KAm sowie dem Enantiomerenüberschuß der produzierten chiralen Säure. Tabelle 3
nd = nicht bestimmt. ee: Enantiomerenüberschuß (%).
Anmerkung (1) = Trp: L-Tryptophan.
Daher können E. coli-Stämme, die das Amidasegen von Brevibacterium R312 (Genotyp Amd&spplus;) beherbergen, effizient die folgenden drei Amide hydrolysieren (Phänotyp AmD&spplus;):
- 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid (HPPAm)
- 2-Phenylpropionamid (PPAm)
- Ketoprofenamid (KAm).
Der erhaltene Enantiomerenüberschuß war immer größer als 93 %.

Beispiel 6

Reinigung der enantioselektiven Amidase von Rhodococcus

I. Assay auf die enzymatische Aktivität

Die aktive Fraktion wurde 30 min lang bei 30ºC in 500 µl Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM DTT, 18 mM 2- Phenylpropionamid) inkubiert. Nach der Inkubation wurden 2 ml eines Gemisches aus Acetonitril/HCl 1 N (90/10) und dann 2 ml eines Gemisches aus 50 mM H&sub3;PO&sub4;/CH&sub3;CN (75/25) dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 5000 UpM wurde ein Aliquot des Überstands der HPLC unterworfen, um die Reaktionsprodukte zu messen.
- Säule: Nucleosil 5-C18 25 cm
- Elutionsmittel: 50 mM H&sub3;PO&sub4;/CH&sub3;CN (75/25)
- Beladung: 10 µl
- Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Eine Aktivitätseinheit ist als die Menge Enzym definiert, die notwendig ist, um 1 µmol 2-Phenylpropionamid pro h zu hydrolysieren.

II. Reinigungsprotokoll

6.1 Herstellung des Enzymextrakts

7 g Zellen wurden in 15 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM DTT suspendiert und 15 min lang bei 4ºC beschallt. Der rohe Enzymextrakt wurde durch 1stündige Zentrifugation bei 50.000 UpM gewonnen.

6.2 Erste Ionenaustauschchromatographie

20 ml eines Rohextrakts wurden mit 20 ml Puffer A (25 InM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM DTT) versetzt. Die Probe wurde auf eine Mono-Q-HR-10/10-Säule (Pharmacia), die mit Puffer A äquilibriert war, mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurden die Proteine mit einem linearen 1stündigen Gradienten von 0,1 bis 1 M KCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min eluiert. Die Fraktionsgröße betrug 6 ml. Die Amidase eluierte in 18 ml bei etwa 0,3 M KCl.

6.3 Zweite Ionenaustauschchromatograpie

Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und auf 2 ml unter Verwendung eines Centriprep-Ultrafiltrationssystems (Amicon) konzentriert. Nach Verdünnung mit 6 ml Puffer A wurden 4 ml der Probe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min in eine Mono-Q-HR-5/5-Säule, die in Puffer A äquilibriert worden war, injiziert. Die Proteine wurden mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M KCl in Puffer A eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und auf 15 % Glycerin (Vol./Vol.) eingestellt, dann auf 1 ml wie vorstehend konzentriert.

6.4 Hydrophobe Chromatographie

1 ml Puffer B (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM DTT, 1,7 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;) wurde zu der Probe gegeben, die dann (in zwei Injektionen) in eine Phenylsuperose-HR-5/5-Säule (Pharmacia) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,25 ml/min injiziert wurde. Die Proteine wurden bei 0,5 ml/min mit einem abnehmenden linearen Gradienten von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (1,7 M bis 0 M) in 25 ml eluiert. Die Fraktionsgröße betrug 0,5 ml. Die aktiven Fraktionen wurden auf 15 % Glycerin eingestellt, dann auf 1 ml mit Puffer A verdünnt.

6.5 Hydroxylapatitchromatographie

Die Probe wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min in eine Bio-Gel-HPHT-Säule, äquilibriert (Bio-Rad) mit Puffer C (85 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM DTT, 10 µM CaCl&sub2;, 15 % Glycerin), injiziert. Die Amidase wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer 0,35 M Kaliumphosphat, pH 7,5, 0,5 mM DTT, 10 µM CaCl&sub2;, 15 % Glycerin in Puffer C, in 20 min eluiert.
Diese Stufen erlauben die Reinigung eines Enzyms mit einer spezifischen Aktivität von 988 E/mg Protein bis zur Homogenität.
Das dadurch erhaltene Enzym liegt in der Form eines Dimeren aus identischen Untereinheiten mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 53 +/- 2 KD vor.

Beispiel 7

Clonierung des diese Amidase codierenden Gens

Nach einer weiteren Reinigungsstufe auf TSK-G3000 SW wurde das Enzym sequenziert. Das N-terminale Ende war einer Edman-Typ-Chemie nicht zugänglich, und so wurde eine vollständige Trypsinhydrolyse durchgeführt, und drei HPLC-Fraktionen des Hydrolysats - 123, 124 und 162 - ergaben Peptide, die den Erhalt einer zweifelsfreien Sequenz erlaubten. Aus der aus der Fraktion 123 erhaltenen Sequenz wurde eine 32- mere Nucleotidsonde synthetisiert, entsprechend einem Gemisch aus 8 Oligonudeotiden und enthaltend 7 Inosine in mindestens dreifach degenerierten Positionen: Sonde A (aus Peptid 123)
Die Effizienz dieser Sonde, die am 5'-Ende mit ³²P markiert war, wurde durch einen Southern-Transfer auf genomische DNA aus zuvor mit einem der folgenden Restriktionsenzyme gespaltenem Rhodococcus: SstI, SphI, SmaI, PstI, KpnI, EcoRI, SalI und BamHI getestet. Die Versuchsbedingungen waren wie folgt: Hybridisierungspuffer, 5x SSC, 5x Denhardt, 0,1 % SDS, 50 mM NaPO&sub4;, pH 6,5, 250 µg/ml Lachssperma-DNA; die Hybridisierungstemperaturen betrugen 50ºC oder 55ºC (zwei Versuche); die Waschbedingungen waren 1 h in 6x SSC bei Raumtemperatur und 5 min in 2x SSC, 0,1 % SDS bei 50ºC.
Unter diesen Bedingungen ergab die Sonde A starke eindeutige Signale; insbesondere mit den BamHI-, KpnI-, SstI-, SmaI-, SalI- und PstI-Spaltungen wurde eine einzelne genomische Bande gefunden, die stark mit der Sonde A hybridisierte. Für die PstI-Spaltung entspricht die Größe des Hybridisierungssignals gegen die Sonde A einem genomischen Fragment von etwa 3,2 kb.
Die 3 bis 4 kb PstI-Spaltungsfragmente der genomischen DNA wurden so durch präparative Elektrophorese durch Agarose, gefolgt von Elektroelution, gereinigt, dann an das Plasmid pUC19, das mit PstI gespalten worden war, ligiert. Nach der Transformation des E. coli-Stamms DH5α wurden 600 Clone, die auf LB-Amp-X-gal weiß waren, einzeln aufgenommen und mit Sonde A durch Koloniehybridisierung unter stringenten Bedingungen, die den Southern-Bedingungen ähnlich sind, abgesucht. Die 9 done mit besonders stark hybrisierenden Signalen wurden dann durch Restriktionsspaltung der Plasmid- DNA analysiert. Von 6 dieser Clone, in die klar das gleiche 3,2 kb Fragment in den zwei Orientierungen insertiert war, wurden 2 Clone, die jede Orientierung (pXL1835 und pXL1836) wiedergaben, ausführlicher analysiert (ausführliche Kartierung, Southern-Analyse), wodurch bestätigt wurde, daß das gewünschte Fragment erhalten worden war.

Beispiel 8

Sequenz des 32 kb PstI-Fragments

Die vollständige Nucleotidsequenz des 3,2 kb PstI-Fragments wurde für die zwei Stränge bestimmt. Der GC-Gehalt dieses Fragments betrug 62,4 %, ähnlich dem GC-Gehalt von R312 (etwa 62 %). Die Analyse der Sequenz zeigte ein offenes Leseraster von 1386 Nucleotiden (Position 210 bis 1595), die ein Polypeptid von 462 Aminosäuren (berechnetes Molekulargewicht 48.554) codierten, das die drei Peptide enthielt, die zuvor durch Sequenzierung der tryptischen Fragmente erhalten worden waren. Dieses offene Leseraster ist in einem subclonierten BamHI-Fragment eingeschlossen, dessen Nucleotidsequenz in Fig. 13 gezeigt ist.
Die 3 unterstrichenen Peptidsequenzen entsprechen den direkt aus den tryptischen Fragmenten des gereinigten Enzyms bestimmten Peptidfragmenten (Peptid 123, 124 und 162). Die unterstrichene Nucleotidsequenz entspricht der (degenerierten) Sonde, die zur Clonierung des Gens verwendet wurde. Die gesperrt geschriebene Peptidsequenz entspricht den Resten 137 bis 193, die zwischen den enantioselektiven Amidasen des Brevibacterium-Stamms R312 und dem Stamm der Gattung Rhodococcus (siehe nachstehend) stark konserviert sind.
Dieses offene Leseraster stellt das Strukturgen der enantioselektiven Amidase dar.

Beispiel 9

Homologien zwischen verschiedenen Amidasen: Identifikation einer für die Amidaseaktivität charakteristischen Sequenz

Ein Vergleich der Peptidsequenzen der enantioselektiven Amidase von R312 (Fig. 8) und der in Fig. 13 gezeigten Amidase zeigt eine starke Homologie bei etwa 2/3 der Sequenz zwischen den Resten 150 und 300 von R312 (50 % strikte Identität), wobei die Homologie 67 % zwischen den Resten 159 und 215 erreicht.
Eine Suche der GENPRO-Genbank nach homologen Sequenzen zeigt einige starke Homologien zwischen der 150- bis 200- Region und den Sequenzen der Acetamidase von Aspergillus nidulans, den Indolacetamidhydrolasen (IAH) von Pseudomonas syringae und Bradyrhizobium japonicum, dem tms2-Protein von Agrobacterium tumefaciens und den 6-Aminohexanoat-cyclischen Dimerhydrolasen (ACDH) von Flavobacterium-Stamm K172 und Pseudomonas-Stamm NK87.
Die Tabelle 4 zeigt die Homologie der Peptide 137-193 der vorstehend beschriebenen Amidase mit den jeweiligen Stellen dieser anderen Enzyme (ausgedrückt als % strikte Identität der Aminosäuren): Tabelle 4
Diese stark konservierte Region ist höchstwahrscheinlich für die Aktivität dieser Enzyme verantwortlich (katalytische Stelle).

Beispiel 10

Expression der enantioselektiven Amidase in E. coli

Um die Identifikation der Phase, die die enantioselektive Amidase codiert, zu bestätigen, wurde ein NdeI-Spaltstelle (CATATG) mittels PCR in dem vermuteten ATG-Codon in Position 210 (Fig. 13) erzeugt und das Fragment zwischen diese Stelle und der SalI-Stelle in Position 1683, das nur die Amidase-codierende Region enthielt, wurde unter die Kontrolle von Signalen, die in E. coli für die Transkriptionsinitiation (Promotoren Ptrp oder RR) und die Translation (Ribosomenbindungsstelle cII) funktionell sind, gestellt. Die dadurch erhaltenen Vektoren (pXL1893, Ptrp; und pXL1894, PR-cIts) sind den Vektoren pXL1752 und pXL1751 ähnlich und exprimieren die Amidase von R312, wie vorstehend beschrieben. Die Expression aus den Plasmiden pXL1893 und pXL1894 wurde in E. coli B und E. coli K12 E103S untersucht. Ein Protein, das gleichzeitig mit der gereinigten Amidase wanderte, wurde spezifisch bei 42ºC in Gegenwart des Plasmids pXL1894 produziert.

Beispiel 11

Expression der enantioselektiven Amidase in Corynebakterien

1. Konstruktion der Expressionsvektoren
Diese Vektoren leiten sich von replizierenden Vektoren für Corynebakterien ab. Sie umfassen
- ein Replicon von E. coli
- ein Replicon von Corynebakterien
- einen selektierbaren Marker
- eine Amd-Sequenz.
Vektor pSV73 (Fig. 14): dieses Plasmid leitet sich von dem Plasmid pSR1 von C. glutamicum (Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162, 591, 1985) durch Insertion des Plasmids pUC8, das ein E. coli-Replicon enthält, ab und das Kanamycin-Resistenzgen ist auf dem Transposon Tn903 vorhanden.
Dieses Plasmid wurde zur Konstruktion der verschiedenen Expressionsvektoren für die in Fig. 13 gezeigten Amd-Sequenzen verwendet, insbesondere:
- Die Vektoren pYG811A und B (Fig. 15). Diese Expressionsvektoren werden durch Clonierung der Amd-Sequenz, die in dem in Fig. 13 dargestellten SalI-Fragment enthalten ist, in die SalI-Spaltstelle von pSV73 in beide Orientierungen erhalten.
- Die Vektoren pYG817A und B (Fig. 16). Diese Expressionsvektoren werden durch Clonierung der in dem in Fig. 13 dargestellten BamHI-Fragment enthaltenen Amd-Sequenz in die BglII-Spaltstelle von pSV73 in beide Orientierungen erhalten.
- Vektor pYG822 (Fig. 17). Dieser Expressionsvektor leitet sich von pSV73 durch Insertieren einer Expressionskassette, die die Amd-Sequenz, die in Fig. 13 gezeigt ist, enthält, zwischen die Sall- und BglII-Spaltstellen unter Kontrolle des Ptrp-Promotors des Tryptophanoperons von E. coli.
- Andere cryptische Corynebakterienplasmide können für die Konstruktion der Expressionsvektoren für die Amd-Sequenz verwendet werden, die in Corynebakterien funktionell sind. Beispielsweise erlaubte das Plasmid pX18, das aus B. lactofermentum (Yeh et. al., Gene, 47, 301-306, 1986) isoliert wurde, die Konstruktion der Schaukelvektoren pYG820A und pYG820B, die in Brevibacterium R312 replizieren können und daher als Empfänger für Clonierungs- und Expressionsversuche in mehreren Corynebakterien verwendet werden können.

2. Transformation von Corynebakterien

Alle bekannten Transformationstechniken können verwendet werden und insbesondere die von Yoshima et al. a.a.O. beschriebene Protoplastenregenerationstechnik. Jedoch zeigten die Anmelder, daß die Elektroporationstechnik sehr effizient ist, wodurch die Transformationsfrequenz auf 1000fach erhöht wird.
Die SDS-PAGE-Analyse von beschallten Zellen wird verwendet, um die intrazelluläre Expression des Enzyms in den rekombinanten Wirten zu untersuchen.

Beispiel 12

Enzymatische Katalyse

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von Amd-Typ- Proteinen oder der rekombinanten Mikroorganismen, die diese Proteine exprimieren, für die enantioselektive Synthese von optisch aktiven organischen Säuren durch Hydrolyse der entsprechenden racemischen Amide.

1. Herstellung der Zellen

Die verschiedenen Stämme wurden in 2 l-Erlenmeyer-Kolben in 600 ml Medium bei 28ºC unter geeigneten Kulturbedingungen unter Rühren von 150 Umdrehungen/min gezüchtet. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen geerntet, in einer Lösung aus NaCl (9 g/l) gewaschen und bei -18ºC gelagert.

2. 2-Phenylpropionamid als Substrat

Das Protokoll ist wie folgt:
Das 2-Phenylpropionamid und die Zellsuspension wurden in einen mit einem Rührer ausgestatteten Kolben gegeben, und das Volumen wurde mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, auf 5 ml eingestellt. Der Kolben wurde in einem thermostatisierten Kristallbehälter bei 25ºC unter einstündigem Rühren gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit einer Lösung aus Acetonitril/HCl (9/1), (Vol./Vol.), verdünnt und die Bakterien und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Die Zusammensetzung bezüglich Säure und Amid wurde mittels HPLC bestimmt.
Die mit Brevibacterium R312 und Brevibacterium lactofermentum (ATCC 21086) erhaltenen Ergebnisse sind wie folgt: Tabelle 5

3. Racemisches Ketoprofenamid als Substrat

Wie in Tabelle 6 gezeigt, ist klar, daß rekombinante Corynebakterien, die die Amidase aus Rhodococcus exprimieren, signifikant höhere Aktivitäten ergaben als die mit pSV73 transformierten Kontrollzellen. Tabelle 6
nd = nicht bestimmt. ee: Enantiomerenüberschuß (S+ Ketoprofen).
Anmerkung (1) = IBN: Isobutyronitril; IBNAm: Isoburyramid.

Claims

1) DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit enantioselektiver Amidaseaktivität codiert, ausgewählt aus:

- der Sequenz, die die enantioselektive Amidase von Brevibacterium R312 gemäß Figur 8 codiert, und der Sequenz, die die enantioselektive Amidase von Rhodococcus gemäß Figur 13 codiert,

- einem Analogon dieser Sequenzen, das das gleiche Protein codiert, aber eine Folge der Degeneriertheit des genetischen Codes ist,

- DNA, die mit einer dieser Sequenzen oder mit einem Fragment davon hybridisiert und ein Polypeptid mit enantioselektiver Amidaseaktivität codiert.

2) DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichne t, daß sie mindestens die Sequenz, die die Aminosäuren 137 bis 193 gemäß Figur 13 oder die Aminosäuren 159 bis 215 gemäß Figur 8 oder eine Peptidsequenz mit mindestens 50% Homologie zu diesen Sequenzen codiert, umfaßt.

3) DNA mit der codierenden Region der Sequenz gemäß Figur 8.

4) DNA mit der codierenden Region der Sequenz gemäß Figur 13.

5) Gen, enthaltend die DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6) Polypeptid mit einer enantioselektiven Amidaseaktivität, gekennzeichnet durch die Sequenzen gemäß Figur 8 oder 13.

7) Polypeptid mit einer enantioselektiven Amidaseaktivität und mit mindestens einer Sequenz, ausgewählt aus

- den Sequenzen mit den Aminosäuren 137 bis 193 gemäß Figur 13,

- den Sequenzen mit den Aminosäuren 159 bis 215 gemäß Figur 8,

- den Sequenzen mit mindestens 50% Homologie mit den vorstehenden Sequenzen.

8) Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es nicht natürlichen Ursprungs ist.

9) Transformierter Mikroorganismus, in den mindestens eine Expressionskassette mit einer Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 unter der Kontrolle von DNA-Sequenzen, die die Expression dieser Sequenz in dem Wirtsorganismus gewährleisten, eingeschleust wurde.

10) Mikroorganismus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichne t, daß die DNA-Sequenzen, die die Expression einer Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 gewährleisten, eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion enthalten.

11) Mikroorganismus nach Anspruch 9, worin die Transkriptions- und Translationsinitiationsregion eine Promotorsequenz und eine Ribosomenbindungsstelle enthält.

12) Mikroorganismus nach Anspruch 11, worin die Promotorsequenz und die Ribosomenbindungsstelle bezüglich des produzierten Peptids homolog oder heterolog sind.

13) Mikroorganismus nach Anspruch 12, gekennzeichnet, dadurch daß die Promotorsequenzen aus den starken Promotoren von Corynebacterium-Phagen, dem Ptrp-Promotor des Tryptophanoperons, dem Plac-Promotor des lac-Operons, dem linken Promotor PL des Phagen Lambda oder dem rechten Promotor PR des Phagen Lambda ausgewählt sind.

14) Mikroorganismus nach Anspruch 13, worin der Promotor aus dem Ptrp-Promotor des Tryptophanoperons und dem rechten Promotor PRcIts des Phagen Lambda ausgewählt ist.

15) Mikroorganismus nach Anspruch 9, worin die Ribosomenbindungsstelle von dem cII-Gen des Phagen Lambda oder von homologen Genen von Corynebakterien abgeleitet ist.

16) Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette auf einem Plasmid vorhanden ist, das auch ein Selektionsmittel trägt.

17) Mikroorganismus nach Anspruch 16, worin das Selektionsmittel ein selektierbarer Marker ist, der Antibiotikaresistenz verleiht.

18) Mikroorganismus nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid den Ptrp- Promotor des Tryptophanoperons, die Ribosomenbindungsstelle des cII-Gens des Phagen Lambda ohne die Transkriptionsterminationssequenz tR1, die das enantioselektive Amidasegen von Brevibacterium R312 codierende DNA und ein Ampicillinresistenz verleihendes Gen enthält.

19) Mikroorganismus nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid den temperaturempfindlichen rechten Promotor des Phagen Lambda PRcIts, die Ribosomenbindungsstelle des CII-Gens des Phagen Lambda ohne die Transkriptionsterminationssequenz tR1, die das enantioselektive Amidasegen von Brevibacterium R312 codierende DNA und ein Ampicillinresistenz verleihendes Gen enthält.

20) Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß er aus den Stämmen E.coli, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhodococcus ausgewählt ist.

21) Mikroorganismus nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß er der Stamm E.coli B oder E.coli K12 E103S ist.

22) Verfahren zur Produktion einer enantioselektiven Amidase, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 9 bis 21 unter Bedingungen züchtet, die die Expression der die Amidase codierenden Sequenz erlauben, und nach der Züchtung den Mikroorganismus abtrennt und die Amidase extrahiert.

23) Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur beschallt, mit Ammoniumsulfat fraktioniert, auf Phenyl-Sepharose chromatographiert und einer doppelten Gelfiltration unterwirft.

24) Verfahren zur Produktion eines Stereoisomeren einer organischen Säure aus dem entsprechenden racemischen Amid, dadurch gekennzeichnet, daß man das racemische Amid in Kontakt mit einem Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 9 bis 21 oder einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 bis 8 bringt und nach der Reaktion das Stereoisomere isoliert.

25) Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Amid racemisches 2- Arylpropionamid ist, und die Säure eine (S)-Säure ist.

26) Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das racemische 2-Arylpropionamid Ketoprofenamid ist, und die Säure S(+)-Ketoprofen ist.

27) Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Amid ein racemisches 2- Aryloxypropionamid ist, und die Säure das entsprechende R-Stereoisomere ist.