DE3220333C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft 27-Desamidosecretin (die "27" kann im folgenden manchmal weggelassen sein) und seine Herstellung durch Gentechnologie unter Verwendung eines Strukturgens für Desamidosecretin, welches chemisch synthetisiert wurde (vgl. die Patentansprüche).

Secretin ist eine Verbindung, die als gastrointestinales Hormon bekannt ist. Es ist bekannt, daß es verschiedene physiologische Aktivitäten aufweist, um die Sekretion von Wasser und Bicarbonaten aus dem Pankreas zu aktivieren, und es wurde praktisch für einen Pankreas-Funktionstest und als therapeutisches Mittel für duodenalen Ulcer verwendet.

Secretin ist ein Polypeptid der folgenden Formel:

Zur Herstellung dieses Secretins wurden solche Verfahren, wie die Extraktion von natürlich vorkommendem Secretin [Acta Chemica Scandinavica, 15, 1790, (1961); (1)], welches normales, vom Schwein stammendes Secretin enthält. Es wurde jedoch nachgewiesen, daß die Aminosäuresequenz von Rindersecretin gleich ist wie die von Schweinesecretin. Weiterhin wurde eine chemische Synthese [Chemical Industry, 1966, 1757, (2a); Journal of the American Chemical Society, 89, 6753 (1967), (2b)] durchgeführt. Bei allen diesen Verfahren treten jedoch Nachteile auf, wie die Kosten, die Schnelligkeit, die Produktionsausbeute, etc.. Bei dem bekannten Verfahren, bei dem das Secretin aus dem Dünndarm von Schweinen extrahiert und gereinigt wird, tritt die Schwierigkeit auf, daß die Vielzahl der gastrointestinalen Hormone (Motilin, VIP, CCK-PZ, GIP, GLI, usw.) einen genauen Bioassay oder Radioimmunoassay des Secretins stört.

In der Zwischenzeit haben die Entwicklungen bei der sog. Gentechnologie, bei der synthetische Gene verwendet werden, solche Fortschritte gemacht, daß verschiedene physiologisch aktive Polypeptide jetzt technisch unter Verwendung dieser Technologie hergestellt werden können. Dementsprechend ist es möglich, wenn Secretin gemäß der Gentechnologie hergestellt werden kann, Schlüssel für die Lösung der Probleme zu finden, wie sie oben bei den bekannten Herstellungsverfahren auftreten.

Obgleich es allgemein geklärt wurde, daß die Herstellung eines Polypeptids durch Gentechnologie unter Verwendung synthetischer Gene möglich ist, indem man das Strukturgen chemisch synthetisiert, das Gen in ein entsprechendes Plasmid als Vektor einsetzt, einen geeigneten Wirt transformiert und das gewünschte Polypeptid bildet und gewinnt, indem man den Transformanten züchtet, ist es nicht notwendigerweise möglich, vorab festzustellen oder vorherzusagen, ob gemäß diesem Verfahren ein besonders gewünschtes Polypeptid, das die gewünschte physiologische Aktivität aufweist, hergestellt werden kann.

Diese Schwierigkeiten bedeuten im Falle von Secretin, daß das Ende des Strukturgens DNA, das das Polypeptid ausdrückt, notwendigerweise das Codon aufweisen muß, das Valin entspricht, da das C-Ende des Secretin-Polypeptids ein Amid von Valin ist, wie oben erwähnt, und daher muß das gebildete Polypeptid ein C-Ende, das Valin ist, besitzen. Aufgrund dieser Überlegungen ist es sehr zweifelhaft, ob das erhaltene Polypeptid die physiologische Aktivität, die Secretin eigen ist, aufweist.

Es wurde nun gefunden, daß das Strukturgen, welches ein Secretinderivat, dessen C-Ende Valin ist, nicht in Form des Amids aufweist, nämlich Desamidosecretin, chemisch synthetisiert werden kann; daß das Gen in ein geeignetes Plasmid als Vektor unter Bildung eines Chimären- Plasmids eingesetzt werden kann; daß die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit dem Chimären-Plasmid wie auch die Bildung und Gewinnung von Desamidosecretin durch Züchten des Transformanten möglich sind; daß das gebildete Desamidosecretin eine Aktivität aufweist, die ähnlich ist wie die von Secretin; und daß weiterhin ein Expressionssystem von Lactoseoperon bei der Herstellung von Desamidosecretin verwendet werden kann und daß die Ausbeute an Desamidosecretin wesentlich erhöht werden kann, wenn man dieses Expressionssystem verwendet.

Die Erfindung betrifft 27-Desamidosecretin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Polypeptid der Aminosäure- Sequenzformel

His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu- Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-
Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-OH

darstellt, worin Val-OH anzeigt, daß das C-Ende des Polypeptids, welches Valin enthält, eine Carbonsäure ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des 27-Desamidosecretins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• (1) chemisch ein Strukturgen synthetisiert, das dem Polypeptid His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu- Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-
  Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Valentspricht,
• (2) das Strukturgen in ein Vektorplasmid, welches sich von pBR322 ableitet, unter Bildung eines Chimärenplasmids einsetzt,
• (3) ein E. coli mit dem Chimärenplasmid transformiert, und
• (4) den entstehenden Transformanten züchtet und das gebildete Desamidosecretin gewinnt.

Bevorzugt verwendet man bei dem Verfahren als E. coli E. coli K12C600 = FERM BP-115 und als Vektorplasmid pBR322. Es ist weiterhin bevorzugt, daß man als Chimärenplasmid pMG einsetzt, welches darin eingebaut das Strukturgen in der Pst-I-Erkennungsstelle von pBR322 enthält.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des 27-Desamidosecretins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• (1) chemisch ein Strukturgen synthetisiert, das dem Polypeptid His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu- Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-
  Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Valentspricht,
• (2) in ein Vektorplasmid, das sich von pBR322 ableitet und ein Lactoseoperon enthält, das Strukturgen unter Bildung eines Chimärenplasmids einsetzt,
• (3) ein E. coli mit dem Chimärenplasmid transformiert, und
• (4) den entstehenden Transformant züchtet und das gebildete Desamidosecretin gewinnt.

Es ist bevorzugt, daß man als E. coli E. coli XA35 = FERM BP-116 einsetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 27- Desamidosecretin umfaßt in seiner allgemeinsten Form folgende Stufen:

• (1) Herstellung eines Chimären-Plasmids, das ein Fragment eines Strukturgens für ein Desamidosecretin enthält, das einem Polypeptid entspricht, bei dem die Aminosäure am C-Ende des Secretins Valin ist, und wobei das Chimären-Plasmid in einer vorbestimmten Wirtszelle wachsen kann und das Strukturgen für ein Desamidosecretin in der Wirtszelle ausdrücken kann;
• (2) Transformieren der Wirtszelle mit dem Chimären- Plasmid; und
• (3) Züchten des entstehenden Transformans und Gewinnung des gebildeten Desamidosecretins.

Ein typisches Beispiel für Wirtszellen, die bei dem Transformationsverfahren, wie oben definiert, verwendet werden können, ist Escherichia coli, das zum Genus Escherichia gehört, und das Lactoseoperon stammt von Escherichia coli.

Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 27-Desamidosecretin können alternativ als Verfahren definiert werden, das darin besteht, daß man einen Desamidosecretin erzeugenden Mikroorganismus, der zu Escherichia coli gehört und in den ein Plasmid eingearbeitet wurde, das das Desamidosecretin-Strukturgen enthält, züchtet, und daß das bei der Ausnutzung des Lactoseoperons in Escherichia coli gebildete Desamidosecretin gewonnen wird.

Entsprechend der Lehre der vorliegenden Erfindung, können die Probleme, die bei der Extraktion und Reinigung von natürlichem Secretin auftreten, vermieden werden, wenn der Extrakt von Rekombinationsgen erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial verwendet wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, eine oder mehrere Arten der Aminosäuren, die das Peptid darstellen, zu ändern, wodurch es möglich wird, die Korrelationen zwischen den Strukturen und den Aktivitäten der Peptidhormone zu untersuchen. Dies bedeutet in anderen Worten, daß erfindungsgemäß ein Verfahren zur leichten Herstellung eines beliebigen, gewünschten, mit Aminosäure substituierten Derivats eines physiologisch aktiven Peptids zur Verfügung gestellt wird. Die Bildung eines Polypeptid-Derivats durch Manipulation von Genen ist das beste Verfahren im Hinblick auf die Tatsache, daß die Bildung eines hochmolekularen Polypeptid- Derivats durch chemische Synthese entsprechend den derzeit verfügbaren Verfahren sehr schwierig ist.

Durch die Verwendung des Wirt-Vektor-Systems, das bei dem bevorzugten Verfahren zur Herstellung des Desamidosecretins, wie oben erwähnt, verwendet wird, ist es möglich, Desamidosecretin mit einer Secretinaktivität herzustellen, die etwa 3×10⁴ Molekülen/1 Wirtszelle entspricht, was einer praktisch annehmbaren Ausbeute gleichkommt. Ausgedrückt als Fusionsprotein, wie nachstehend erläutert, beträgt die Ausbeute 2,85×10⁵ Moleküle/ Zelle, wobei dieser Wert eine hohe Ausbeute bei der Herstellung von Desamidosecretin angibt, und wobei diese hohe Ausbeute möglich wird, indem man unter Verwendung des Chimären-Plasmids erfindungsgemäß in Bakterien ohne zerstörende (proteolytische) Wirkung durch Proteasen eine Merkmalsexpression hervorruft.

Es existieren Polypeptide mit Ausnahme von Secretin mit einem C-Ende in Form eines Amids, und die vorliegende Erfindung erschließt die Herstellung von Desamidderivaten solcher anderen Polypeptide wie auch die Expression ihrer physiologischen Aktivitäten.

(1) Desamidosecretin

Das erfindungsgemäße 27-Desamidosecretin ist ein Polypeptid, das durch die Aminosäuresequenz der folgenden Formel (I) dargestellt wird:

His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser- Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu- Leu-Gln-Gly-Leu-Val-OH (I).

In der Formel (I) bedeuten His und die anderen Bezeichnungen die bekannten Symbole für Aminosäuren, wie Hystidin, etc.

Das Polypeptid unterscheidet sich von dem Secretinpolypeptid darin, daß das Valin am C-Ende nicht in Form eines Amids (Val-NH₂), sondern in Form des Carboxyls (Val-OH) vorliegt.

Das Desamidosecretin, das eine physiologische Aktivität aufweist, die ähnlich ist wie die von Secretin, wie eine Wirkung, daß es die Sekretion des Pankreassaftes aktiviert, kann selbst als ein dem Secretin ähnliches, physiologisch aktives Polypeptid verwendet werden. Andererseits kann das Desamidosecretin als Secretin verwendet werden, nachdem es am C-Ende-Carboxylmolekülteil amidiert wurde. Die Amidierung kann nach einem reinen chemischen Verfahren, einem enzymatischen Verfahren oder einem biologischen Verfahren in vivo durchgeführt werden.

(2) Herstellung von Desamidosecretin

Das Desamidosecretin wird, obgleich es durch Modifizierung des C-Endes von Secretin hergestellt werden kann, bevorzugt erfindungsgemäß nach gentechnologischen Verfahren erzeugt, indem man ein Strukturgen für dieses Polypeptid chemisch synthetisiert, ein Plasmid herstellt, so daß das Polypeptid ausgedrückt werden kann, eine Wirtszelle mit dem Plasmid transformiert, das gewünschte Polypeptid durch Züchten des Transformans bildet und das Desamidosecretin gewinnt.

(1) Strukturgen (1) Aufbau des Gens

Die Grundsequenz von DNA, aus der das Strukturgen von Secretin besteht, ist unbekannt. Daher werden von einigen Codonen, die die Aminosäuren, die das Peptid darstellen, vorzeichnen, solche für die Synthese der DNA ausgewählt, die die folgenden Bedingungen erfüllen:

• (i) es sollte so kontrolliert sein, daß der Bereich, der an A-T-Grund- bzw. Basenpaaren angereichert ist, nicht unmittelbar dem Bereich folgt, der an G-C-Grund- bzw. Basenpaaren angereichert ist; und
• (ii) es sollte so kontrolliert werden, daß jedes der im folgenden beschriebenen synthetischen Fragmente nicht eine unerwünschte, komplementäre Basensequenz intramolekular oder intermolekular aufweist.

Es ist weiterhin wegen der leichten Selektion des transformierten Stammes bevorzugt, das Strukturgen so zu entwerfen, daß darin eine oder mehrere Erkennungsbasensequenzen für das Restriktionsenzym enthalten sind. Im Falle von Desamidosecretin ist es bevorzugt, daß das Gen die Erkennungsbasensequenz von Hinf I und Hae II aufweist.

Aufgrund dieser Überlegungen sind typische Beispiele von Codonen, die Aminosäuren in dem Desamidosecretin- Strukturgen ausdrücken bzw. vorzeichnen, die folgenden.

Dementsprechend besitzt eine bevorzugte Ausführungsform des Strukturgens für das erfindungsgemäße Desamidosecretin eine Basensequenz, wie sie im folgenden in den Versuchsbeispielen und in der Zeichnung dargestellt wird (wobei in der Zeichnung die Basensequenz natürlich der Molekülteil von CAC ist, der His bis GTT, entsprechend Val, entspricht).

Es wird ein doppelstrangiges Polydesoxyribonucleotid verwendet, welches ein Strukturgen umfaßt, das das 27- Desamidosecretin, wie oben ausgeführt, ausdrückt, und eine bevorzugte Ausführungsform des Strukturgens besitzt die im folgenden dargestellte Basensequenz.

Das Verfahren zum Ausdrücken bzw. für die Expression eines solchen Strukturgens ist in Einzelheiten z. B. in der JA-OS 92696/1979 beschrieben. Wenn pBR 322 als Plasmid verwendet wird, in das das Gen eingearbeitet werden soll, und wenn das Desamidosecretin als Fusionsprotein mit dem Lactamaseoperon davon ausgedrückt werden soll, ist die Stelle, an der das Gen eingearbeitet wird, geeigneterweise die Erkennungsstelle im Operon für das Restriktionsenzym Pst I. Das heißt, das Codon ATG für Methionin, welches die Stelle ist, die durch Bromcyan angegriffen wird, wird an der 5′-Endenseite des Strukturgens vorgesehen, während eine oder mehrere Stoppcodone an dem 3′-Ende vorgesehen sind. Daher werden für die Synchronisierung mit dem Raster [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America, 75, 3737 (1978); (3)], beginnend mit dem Startcodon des Lactamasegens, die Basen randomartig in Zahlen von 2 + 3n (n = 0, 1, 2, . . .) ausgewählt, dem Gen an der 5′-Seite von ATG und weiterhin Pst I-Erkennungsbasensequenzen für die Bildung der kohäsiven Enden an beiden Enden verliehen. Im allgemeinen werden Strukturgene so vorgezeichnet und synthetisiert [Science, 198, 1056 (1977, (4a); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 75, 5765 (1978), (4b); Nature, 281, 18 (1979), (4c); Biochemistry, 1980, 6096 (1980), (4d)], daß die beiden kohäsiven Enden freiliegen. Gegebenenfalls können jedoch auch beide Enden glatte Enden sein, wofür es erforderlich ist, zwei oder mehrere Basen, die randomartig ausgewählt sind, an weiteren, äußeren Teilen der Erkennungsbasensequenz vorzusehen, um die Hydrolysewirksamkeit des Restriktionsenzyms zu verbessern.

Die optischen Paare von Basen, die an der 5′-Stelle von ATG vorgesehen sind, sind 3m-Paare (3m + 1)-Paare oder (3m + 2)-Paare, wobei m eine ganze Zahl von 0 oder 1 oder mehr bedeutet.

Unter Beachtung dieser Überlegungen ist eine bevorzugte Ausführungsform des Gens für das Desamidosecretin, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, dasjenige, das in den folgenden Versuchsbeispielen näher erläutert wird.

Ein bevorzugtes Gen für das Desamidosecretin besitzt die im folgenden angegebene Struktur:

(2) Synthese

Für die Synthese des Gens, das, wie oben beschrieben, entworfen bzw. konstruiert wurde, kann jeder der beiden +- und --Stränge in mehrere Fragmente geteilt werden. Diese Fragmente können chemisch synthetisiert werden und dann werden die entsprechenden Fragmente miteinander verbunden. Es ist bevorzugt, jeden Strang in etwa 16 Fragmente zu teilen, wovon jedes 9 bis 16 Basen enthält, so daß sich 6 bis 7 Basen überlappen. Als Syntheseverfahren für jedes Fragment kann man das Diesterverfahren [Science, 203, 614 (1979); (5)], das Triesterverfahren [Nucleic Acids Research, 8, 5491 (1980), (6a); Nucleic Acids Research, 8, 5193 (1980), (6b); Tetrahedron Letters, 21, 4159 (1980), (6c); Nucleic Acids Research, 8, 2331 (1980), (6d)], das Verfahren mit fester Phase [supra; (4a) bis (4d)], das Flüssigkeitsphasenverfahren oder das Verfahren, bei dem ein Enzym verwendet wird, [The Journal of Biological Chemistry (J.Biol.Chem.), 241, 2014 (1966), (7a); Nucleic Acids Research, 1, 1665 (1974), (7b)] verwenden. Im Hinblick auf die Synthesezeit, die Ausbeute und die Reinigung ist das Verfahren mit fester Phase entsprechend dem Triesterverfahren besonders bevorzugt.

Hinsichtlich der Einzelheiten für die Synthese wird auf die zahlreichen, aufgeführten Literaturstellen und die folgenden Versuchsbeispiele verwiesen.

(3) Reinigung

Wenn ein Oligonucleotid synthetisiert wird, wird die Abtrennung und Reinigung des Endprodukts im allgemeinen schwieriger mit der Ausdehnung der Stranglänge. Insbesondere werden bei dem synthetischen Verfahren mit fester Phase Oligonucleotidblöcke, die auf geeignete Weise geschützt werden, stufenweise kondensiert, und daher kann eine Reinigung nach an sich bekannten Verfahren, wie Gelfiltration, Gelelektrophorese, Ionenaustauschsäule, Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie, etc., nicht leicht durchgeführt werden.

In einer Säule mit Umkehrphase differiert die Retentionszeit stark, abhängig davon, ob das Oligonucleotid eine lipophile Schutzgruppe umfaßt oder nicht. Dementsprechend kann bei der Verwendung in der letzten Kondensationsstufe eines Oligonucleotidblocks mit einer Schutzgruppe, die bei den Bedingungen, bei denen die anderen Schutzgruppen entfernt werden, stabil ist, gefolgt von einer geeigneten Entfernung der anderen Schutzgruppen, ein Gemisch aus Oligonucleotiden mit den stabilen Schutzgruppen nur in dem gewünschten Endprodukt erhalten werden. Unter Ausnutzung der lipophilen Natur der Schutzgruppe, kann das gewünschte Endprodukt von dem Gemisch von nichtumgesetzten Species mittels einer Säule mit Umkehrphase abgetrennt werden; auf diese Stufe folgt die Entfernung der Schutzgruppe unter Bildung des gewünschten Oligonucleotids. Gemäß diesem Verfahren kann das so synthetisierte Oligonucleotid wirksam aus dem Gemisch der nichtumgesetzten Species abgetrennt und gereinigt werden.

(4) Phosphorylierung und Verknüpfung

Die so hergestellten, synthetischen Fragmente werden anschließend miteinander unter Verwendung einer DNA- Ligase verknüpft. Zur Herstellung der synthetischen Fragmentsubstrate für das Enzym ist es erforderlich, die 5′-Hydroxylgruppe in den Fragmenten zu phosphorylieren. Zu diesem Zweck wird im allgemeinen Polynucleotidkinase verwendet, aber die chemische Phosphorylierung kann ebenfalls durchgeführt werden [Nucleic Acids Research, 8, 5753 (1980), (8)]. Obgleich die Verknüpfung der Fragmente im allgemeinen unter Verwendung von DNA-Ligase erfolgt, ist es weiterhin möglich, das Verfahren zu verwenden, bei dem die Phosphorsäuregruppen an den 5′-Enden nach geeigneten Verfahren (z. B. Imidazolylierung) aktiviert und chemisch mit dem Strang an der entgegengesetzten Seite als Templat verknüpft werden [Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 26, 2396, (1978), (9)].

(2) Herstellung eines Vektors mit Lactoseoperon

Bei dem bevorzugten Verfahren zur Herstellung von 27- Desamidosecretin gemäß der Erfindung ist es möglich, verschiedene Plasmide zu verwenden, die das gesamte oder einen Teil des Lactoseoperons von E. coli-Chromosom DNA enthalten und in der Lage sind, in E. coli zu wachsen. Die Herstellung dieser Plasmide kann entsprechend herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind, durchgeführt werden. Die das Lactoseoperon enthaltende DNA kann direkt aus E. coli- Chromosomen erhalten werden, aber verschiedene Transduktionsphagen, die das gesamte oder einen Teil des Lactoseoperons enthalten (z. B. Pldl, F′-lac, Φ 80dplac, g h80dlac, λplac, etc.), können hergestellt werden, und daher kann der erforderliche Anteil an Lactoseoperon zweckdienlich aus diesen Phagen entnommen werden. Damit das Plasmid in E. coli wachsen kann, ist es erforderlich, den notwendigen Teil des obigen Lactoseoperons mit einem anderen Plasmid von E. coli (z. B. pBR322, pSC101, λ dVl) unter Bildung eines einzigen Plasmidvektors zu verknüpfen.

Gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung wird die Transduktionsphage λ plac5 [Nature, 224, 768 (1969); (23)] als DNA enthaltendes Lactoseoperon verwendet. λ plac5-DNA kann beispielsweise aus E. coli PK1512, einem lysogenen Bakterium, nach an sich bekannten Verfahren [Extra Volumes of "Protein, nucleic acid & enzyme", Last vol., S. 19 (1973); (20)] erhalten werden. Dieses λ plac5 hat den Bereich von dem Mittelweg in dem i- Gen bis zum Mittelweg des y-Gens des Lactoseoperons und besitzt bevorzugt kein anderes E. coli-Gen als das Lactoseoperon [supra; (20)], und daher ist es bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Als Plasmid von E. coli verwendet man pBR322, das aus solchen Gründen ausgewählt wurde, daß es eins der am leichtesten verfügbaren Plasmide ist und daß die gesamte Basensequenz bestimmt bzw. vorgezeichnet ist und daß es gegenüber Ampicillin und Tetracyclin resistente Markierungsgene aufweist.

Weiterhin wird in Verknüpfung mit diesen Genen jedes Gen ( λ plac5 und pBR322) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII behandelt und das Fragment von 3,8 Md (Mega- Dalton) [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 73, 3900 (1977); (15)] für λ plac5 und das größere Fragment [Gene, 2, 95 (1977); (16)] für pBR322 werden entnommen und miteinander verknüpft, so daß der erwünschte Plasmidvektor erreicht wird. Dieser Vektor wird bei der vorliegenden Erfindung als "pRE" bezeichnet.

Das Lactoseoperon aus E. coli-Chromosom wurde für die Expression des gewünschten Desamidosecretins aus den Gründen ausgewählt, weil das Fremdgen in das z-Gen in dem Lactoseoperon an der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms von EcoRI eingesetzt werden kann, das in Form eines Proteins, das mit ß-Galactosidase [supra, (4a); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76, 106 (1979), (17)] fusioniert ist, ausgedrückt werden kann, daß ein Protein in großer Menge gebildet werden kann, daß induzierte Bildung durchgeführt werden kann, wenn ein geeigneter Wirt- Mikroorganismus verwendet wird, und daß das Produkt leicht und auf stabile Art als Fusionsprotein in im wesentlichen reiner Form isoliert werden kann.

Es ist somit bevorzugt, daß der Vektor, der erfindungsgemäß hergestellt wird, nur eine Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms EcoRI aufweist, und zu diesem Zweck verwendet man die DNA-Fragmente, die man erhält, indem man g plac5 und pBR322 mit EcoRI bzw. HindIII, wie oben beschrieben, spaltet, die ihrerseits wieder miteinander verbunden sind.

(3) Chimären-Plasmid (1) Herstellung

An einer geeigneten Stelle in dem Vektor, der so bestimmt wurde, daß er das Fremdgen, wie oben beschrieben, ausdrücken kann, wird das zuvor erwähnte Desamidosecretin- Strukturgen eingesetzt bzw. eingearbeitet. Die Einsetzung bzw. Einarbeitung per se kann nach einem an sich bekannten Verfahren, das auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt ist, erfolgen. Hinsichtlich der Einzelheiten des verwendeten Verfahrens wird auf die folgenden Versuchsbeispiele verwiesen.

Entsprechend einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird pBR322 als Vektorplasmid verwendet, und das Gen wird an seiner PstI-Erkennungsstelle unter Bildung des Chimären-Plasmids eingesetzt. Bei der vorliegenden Erfindung wird dieses Chimären-Plasmid als "pMG" bezeichnet.

Die Hauptgründe, weshalb pBR322 als Vektorplasmid ausgewählt wird, sind die, daß es eines der am leichtesten zugänglichen Plasmide ist, daß die gesamte Basensequenz bestimmt ist und daß es gegenüber Ampicillin und Tetracyclin resistente Markierungsgene aufweist. pBR322- Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 37017 hinterlegt. Die Hauptgründe, weshalb die PstI-Stelle als Platz für die Einarbeitung des Gens ausgewählt wurde, sind, daß das Lactamaseoperon als solches verwendet werden kann, daß das Suchen für das Transformans leicht durchgeführt werden kann, da sich die Ampicillin-Resistenz (Ap^r) zu einer Ampicillin-Empfänglichkeit (Ap^s) ändert, und daß nur eine PstI-Stelle in pBR322 vorhanden ist.

Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung von 27- Desamidosecretin entsprechend einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird pRE 1, das im folgenden näher erläutert wird, als Vektorplasmid eingesetzt, und ein Gen, das das Desamidosecretin-Strukturgen enthält, wird an der EcoRI-Erkennungsstelle unter Bildung eines Chimären-Plasmids eingesetzt. Bei der vorliegenden Erfindung wird dieses Chimären-Plasmid als "pLS" bezeichnet.

Bei dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das das obige Strukturgen enthaltende Gen das bevorzugte, d. h. es hat die Basensequenz, die in der Zeichnung dargestellt wird. Zur Einarbeitung dieses Gens, das Erkennungsstellen des Restriktionsenzyms Pst I an seinen beiden Enden trägt, in pRE 1 ist es erforderlich, die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen Pst I zu EcoRI umzuwandeln.

(2) Linker

Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Desamidosecretins wird eine doppelstrangige DNA für den Linker zwischen dem das Strukturgen enthaltenden Gen und pRE 1 benötigt. Das heißt, die doppelstrangige DNA muß zwei Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme Pst I und EcoRI aufweisen, wobei beide Paare zwischen beiden Restriktionsenzym-Erkennungsstellen 3n + 1 (n = 1, 2, 3, . . .) sind, so daß sie mit dem Leseraster für die Translation, beginnend mit dem Startcodon von ß-Galactosidase-Gen, synchronisiert werden können (die Arten der Basenpaare können randomartig ausgewählt werden, solange kein Nonsenscodon auftritt). Es ist lediglich erforderlich, daß der Teil für den Linker schließlich die obige Funktion ausübt und daß es möglich ist, den Linker gemäß dem Verfahren zu erhalten; bei dem das obige Strukturgen synthetisiert wird. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird gemäß einem Beispiel eines solchen synthetischen Verfahrens der Linker erhalten, indem man das im folgenden beschriebene Verfahren verwendet.

Zuerst wird eine einstrangige DNS, wie im folgenden gezeigt, mit Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme Pst I und EcoRI entwickelt.

worin 1, 2, 9-12, 19, 20 randomartig ausgewählt werden können, solange sie die folgenden Bedingungen erfüllen.

• Bedingung (1): 1 und 10, 2 und 9, 11 und 20 und 12 und 19 sind je ein Paar von Basen, die zueinander komplementär sind;
• Bedingung (2): die Sequenz 9, 10, 11 ist kein sog. Nonsenscodon.

Die so konstruierte, einstrangige DNA (die in der vorliegenden Anmeldung als "Prälinker" bezeichnet wird), bedingt wegen ihrer eigenen Komplementärität, nimmt eine langkettige, doppelstrangige DNA-Struktur an mit einer Zahl von Einschnitten (gespaltene Stellen ohne Spalt, die auf einem der beiden Stränge von DNA gebildet werden). Dementsprechend kann eine doppelstrangige DNA ohne Spalt daraus durch Einfluß einer DNA-Ligase auf sie gebildet werden. Die so hergestellte, doppelstrangige DNA ist eine doppelstrangige Poly-DNA mit alternierenden Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme Pst I und EcoRI, nämlich sich wiederholende Basensequenzen 1 bis 20, wie oben, aufweist.

Durch Behandlung der doppelstrangigen DNA mit dem Restriktionsenzym PstI kann ein Linker von PstI-EcoRI- PstI mit kohäsiven Enden erhalten werden.

Allgemein gesagt, besitzt der Linker mit Erkennungsstellen für zwei Restriktionsenzyme verschiedene Verwendungen und die Ziele wurden gemäß dem Stand der Technik erreicht, wenn zwei Arten von Oligomeren verwendet wurden. Die hier entwickelte Idee ermöglicht das Erreichen des Ziels unter Verwendung einer Art von Oligomeren nach dem oben beschriebenen Verfahren, und die einstrangige DNA ist für die im folgenden angegebene Expression geeignet.

wobei X und X′ und Y und Y′ irgendeine der gewünschten Basen (A, G, C, T) sind, die miteinander komplementär sind (n und m = 0, 1, 2, . . .). Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet A EcoRI und B Pst I und n + m = 3p + 1 (p = 1, 2, . . .), worin p bevorzugt 1 oder 2 bedeutet.

(3) Bestimmung der Richtung

Die Bestimmung der Richtung des 27-Desamidosecretin-Gens, das in das Plasmid eingearbeitet wird, kann durchgeführt werden, indem man die spezifische Stelle, die in dem Strukturgen enthalten ist, mit einem Enzym (Hae II), das die spezifische Stelle erkennt, spaltet, eine andere Stelle an einer bestimmten Lage außerhalb des Strukturgens spaltet und die Größe des erhaltenen Fragments analysiert.

(4) Transformation (1) Wirtszelle

Ein typisches Beispiel einer Wirtszelle, die unter Verwendung des Chimären-Plasmids, das darin das Desamidosecretin- Strukturgen, wie oben beschrieben, wie das obige pMG, eingearbeitet enthält, transformiert werden kann, ist ein E. coli-Stamm K12C600, FERM BP-115, hinterlegt bei dem Institute of Fermentation Research, Agency of Industrial Science and Technology, Japan. Der E. coli- Stamm K12C600 wird in der Literatur beschrieben [Nature, 217, 1110, (1968); (24)], und seine bakteriologischen Eigenschaften werden dort ebenfalls beschrieben [supra; (24)].

Ein weiteres Beispiel für das Chimären-Plasmid, das darin eingearbeitet das Desamidosecretin-Strukturgen, wie oben beschrieben, enthält, ist pLS, wie pLS 58, das bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren für die Herstellung von Desamidosecretin verwendet wird. Ein typisches Beispiel der Wirtszelle, die unter Verwendung von pLS 58 transformiert wird, ist der E. coli-Stamm XA35, der zu Escherichia coli gehört, welcher sich von dem bekannten Stamm, dem E-coli K12-Stamm [Microbiological Reviews, 44, 1-50, (1980); (22)] ableitet und die im folgenden angegebene Eigenschaft aufweist, wobei sich die verbleibenden Eigenschaften nicht von denen des K12-Stamms unterscheiden.

[Sm^r, Lac^-(i₃^-, z^-)]

Die Transformation mit dem Chimären-Plasmid, das darin eingearbeitet das Desamidosecretin-Strukturgen erfindungsgemäß enthält, ist bei allen E. coli-Stämmen möglich. Damit man jedoch das Desamidosecretin als Fusionsprotein mit ß-Galactosidase gewinnen kann, ist es bevorzugt, einen Stamm zu verwenden, der arm ist an dem Gen der ß-Galactosidase, um die Anwesenheit von normaler ß-Galactosidase, vermischt mit dem Protein, zu verhindern. Allgemein gesagt, wird die Bildung des Proteins durch das Repressorgen (i-Gen) des Lactoseoperons kontrolliert. Wenn man daher einen wilden Typ E. coli verwendet, ist die induzierte Produktion des Fusionsproteins mit einem Inducer, z. B. IPTG (Isopropylthiogalactosid) möglich. Wenn man einen Stamm mit einem Gen hoher Temperaturempfindlichkeit verwendet, kann das Fusionsprotein induziert werden, indem man die Temperatur erhöht. Wenn man einen Stamm verwendet, der an dem i-Gen verarmt ist, kann das Fusionsprotein immer hergestellt werden [The operon, 31 (1980) (abgefaßt von J.H. Miller und W.S. Resnikoff; veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory); (18)].

Bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des Desamidosecretins wird der E. coli- Stamm XA35, der ein Stamm ist, der an den Genen der ß- Galactosidase und i-Gen verarmt ist, verwendet.

Die Transformation mit dem Plasmid, das darin eingearbeitet das Desamidosecretin-Strukturgen enthält, ist nicht auf E. coli als Wirt beschränkt. Ein geeigneter Wirt kann ebenfalls aus einem großen Spektrum von Bakterienspecies ausgewählt werden, wenn ein geeigneter Vektor ausgewählt wird, wie es auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt ist. Ein typisches Beispiel einer Wirtszelle wird in der JA-OS 92696/1979 beschrieben.

(2) Transformation

Der Transformationsvorgang selbst kann nach an sich bekannten Verfahren erfolgen, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt sind. Hinsichtlich der Einzelheiten der verwendeten Verfahren wird auf im folgenden aufgeführte Versuchsbeispiele verwiesen.

(3) Transformant

Ein typisches Beispiel eines Transformanten ist ein Transformant, den man durch Transformieren von K12C600 mit pMG erhält. Bei der vorliegenden Erfindung wird dieses als K12C600 (pMG103) bezeichnet. Der Transformant K12C600 (pMG103) besitzt die im folgenden angegebenen, genetischen Eigenschaften:

[m^-, r^-, F^-, lacY, Leu, Thr, tonA, supE, recBC]

Ein weiteres Beispiel von Transformanten ist ein Transformant, den man erhält, indem man den E. coli-Stamm XA35, der bei dem bevorzugten Verfahren für die Herstellung des erfindungsgemäßen Desamidosecretins verwendet wird, wie oben beschrieben, mit pLS 58 transformiert. Dies wird bei der vorliegenden Erfindung als E. coli XA35 (pLS58) bezeichnet.

Der Transformant, der E. coli-Stamm XA35 (pLS58), unterscheidet sich von dem E. coli-Stamm XA35 in den folgenden Eigenschaften, was aus den folgenden Versuchsbeispielen hervorgeht.

[Ap^r, Lac⁺].

(4) Herstellung von Desamidosecretin

Das Desamidosecretin kann durch Züchten der so transformierten Bakterien nach an sich bekannten Verfahren gebildet werden. Hinsichtlich der Einzelheiten wird auf die folgenden Versuchsbeispiele verwiesen.

Versuchsbeispiele Beispiel 1 Aufbau des Desamidosecretingens

(1) Ein Gen mit der Basensequenz, bestehend aus einer Kombination der Blöcke A, B und C, wie in der Zeichnung angegeben, wurde entwickelt. Diese Blöcke umfassen die im folgenden aufgeführten Fragmente.

(2) Das Aufbauverfahren wird im folgenden näher erläutert.

• Die Codone werden, wie in der Zeichnung dargestellt, ausgewählt.
• (2) Das Codon ATG für Methionin wird zu dem N-Ende addiert, so daß das Polypeptid, das synthetisiert wurde, an dieser Stelle durch chemische Behandlung (+CNBr) gespalten wird.
• (3) Zu dem C-Ende addiert man zwei Translationsstopp- Codone (TAG oder TGA), so daß kein überflüssiges Peptid gebildet wird.
• (4) Für den Zweck der Synchronisierung mit dem Raster, beginnend mit dem Startcodon des Lactamase-Gens, werden zwei ausgewählte Basenpaare (im allgemeinen 2 + 3n; n = 0, 1, 2, 3, . . .) stromaufwärts an das Methionin addiert.
• (5) Pst I-Stellen werden an beiden Enden addiert.
  Irgendeine gewünschte Zahl an Basenpaaren kann unmittelbar vor der Pst I-Stelle an der stromabwärtigen Seite addiert werden, wenn dies für die Synthese jedes Fragments zweckdienlich ist.
• (6) Schließlich werden zwei Paare von beliebig ausgewählten Basen an beiden Enden addiert, um die Hydrolysewirksamkeit des Restriktionsenzyms Pst I zu erhöhen.

Das wie oben beschrieben aufgebaute Gen enthält die Hinf I-Stelle und die Hae II-Stelle in dem 27-Desamidosecretin- Strukturgen.

Chemische Synthese des Fragments (1) Synthese

Die Synthese der Fragmente wird entsprechend dem in der Literatur beschriebenen Festphasen-Verfahren [supra; (6a)] durchgeführt. Die Isolierung und Reinigung der synthetischen Fragmente wurden nach dem im folgenden beschriebenen, verbesserten Verfahren durchgeführt. Die Syntheseausbeuten der entsprechenden Fragmente sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

(2) Reinigung

Zu 50 mg eines Harzes, welches die Synthese der festen Phase erleidet, werden 0,5 M α-Picolinsäure-aldoxim- tetramethylguanidin und 100 bis 200 µl eines Gemisches aus Dioxan und Wasser (1 : 1) [Tetrahedron Letters, 1978, 2727, (1978); (14)] zugegeben, und das Gemisch wird mehrere Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann werden 2 ml konz. wäßrigen Ammoniaks zu dem Gemisch gegeben, welches seinerseits über Nacht bei dichtem Verschließen mit einem Stopfen bei 55°C stehengelassen wird. Das entstehende Gemisch wird zur Abtrennung des Harzes filtriert, und das Filtrat wird konzentriert und der Gelfiltration unterzogen. Die Eluierung erfolgt mit 50 mM TEAB-Puffer (pH 7,5), und die in das Leervolumen eluierten Fraktionen werden gesammelt. Diese werden konzentriert und auf HPLC für eine Säule mit Umkehrphase C-18 angewendet ("Radial Pack A", Durchmesser 8 cm×10 cm). Die Eluierung erfolgt mit 0,01 M Äthylendiamin- diacetat-Puffer (pH 7,8) mit einem Konzentrationsgradienten des Acetonitrils von 10 bis 32% bei einer Strömungsrate von 2 ml/min im Verlauf von 16 min. Die innerhalb von 11 bis 12 min eluierten Fraktionen werden gesammelt. Während dieses Vorgangs werden Oligonucleotide ohne Tritylgruppe als Injektionspeak eluiert. Das Eluat wird konzentriert und nach Zugabe von 1 ml 80%iger Essigsäure 15 min bei Zimmertemperatur stehengelassen. Tritanol wird durch Extraktion entfernt, und die wäßrige Schicht wird konzentriert und erneut auf die Säule mit Umkehrphase gegeben. Bei den gleichen Bedingungen, wie zuvor beschrieben, erfolgt die Eluierung mit einem Konzentrationsgradienten des Acetonitrils von 0 bis 20% und die innerhalb von 12 bis 13 min eluierten Fraktionen werden gesammelt.

Phosphorylierung

Jedes Fragment (30 µg) wird in 30 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst und 60 µCi (19,8 pMol) [γ³²P]-ATP und 2 µl (9 Einheiten) T4 Polynucleotidkinase werden zu der Lösung zugesetzt, so daß man insgesamt 50 µl erhält. Dann wird 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 10 Äquiv., bezogen auf das Fragment von ATP und T4 Polynucleotidkinase (9 Einheiten), zu dem Gemisch zugegeben und dann wird 20 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird beendigt, indem man 2 min bei 100°C erhitzt, und das Produkt wird durch Gelfiltration gereinigt. Jedes Fragment wird durch 20%ige Gelelektrophorese bestätigt.

Verknüpfung der Fragmente

Jeweils 0,05A₂₆₀ von S-1, S-2, S-3, S-4 und S-6 werden in einem Puffer [20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT (Dithiothreitol), 0,2 mM ATP (Adenosintriphosphat)] gelöst, so daß man eine Lösung mit einer Gesamtmenge von 30 µl erhält. 1 µl (150 Einheiten) von T4-DNA-Ligase wird zu der Lösung gegeben und das Gemisch wird über Nacht bei 10°C stehengelassen. Die Reaktion wird durch 8%ige Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt. Auf ähnliche Weise werden die Blöcke B und C synthetisiert.

Die Reaktionsgemische der Blöcke A und B werden zusammen vermischt und nach Zugabe von 3 µl von 0,2 mM ATP und 1 µl (150 Einheiten) Te-DNA-Ligase wird das Gemisch über Nacht bei 10°C stehengelassen. Nachdem die Reaktion durch 8%ige Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt wurde, wird das Reaktionsgemisch aus Block C zugegeben und die Reaktion kann auf ähnliche Weise über Nacht ablaufen. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch 5%ige Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt.

Das Reaktionsgemisch wird 15 min bei 68°C erhitzt und dann auf Zimmertemperatur abgekühlt. Dann werden 15 µl 0,5M NaCl und 80 Einheiten des Restriktionsenzyms Pst I zugesetzt und die Mischung wird über Nacht bei 37°C stehengelassen. Die Reaktion wird gestoppt, indem man 1 min bei 90°C erhitzt, und das Reaktionsgemisch wird durch 5%ige Polyacrylamidgelelektrophorese einer Abtrennung unterworfen. Die Bande mit der längsten Kettenlänge wird herausgeschnitten und bei einer 1%igen Agarosegelelektrophorese, wobei die Agarose einen niedrigen Schmelzpunkt aufweist, für die Extraktion der erhaltenen Bande überführt.

Cloning

Das Plasmid pBR322 (4 µg) wird zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 50 µl) aus 100 mM Tris-HCl-Puffer, 5 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl gegeben und die Reaktion wird unter Verwendung von 6 Einheiten des Restriktionsenzyms Pst I 2 h bei 37°C durchgeführt. Dann wird die Reaktion durch 15minütiges Erhitzen bei 68°C beendigt. Das obige Synthesegen wird zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Verknüpfungsreaktion wird auf ähnliche Weise unter Verwendung von T4 DNA-Ligase durchgeführt.

Unter Verwendung von 5 µl des entstehenden Reaktionsgemisches, welches äquivalent zu 0,68 µg pBr322 DNA ist, erfolgt die Transformation von E. coli Stamm K12C600 entsprechend dem Verfahren von Kuschner [Genetic Engineering 1978, 17 (1978); (10)] in einer P-3 physikalischen Containment facility [Guidelines for Recombinant DNA Experiment, herausgegeben im August 1979; (11)].

Der transformierte Stamm wird auf einer L-Platte (1% Bactotripton, 0,5% Bactohefeextrakt, 0,5% HCl, 1,5% Bactoagar), enthaltend 10 µg/ml Tetracyclin (Tc), selektiert, und 500 Stämme unter den erhaltenen, transformierten Stämmen werden auf ihre Resistenz gegenüber Ampicillin (Ap) geprüft und 45 Stämme von Tc^r/Ap^s transformierten Stämmen werden isoliert. Für Rückbeziehungszwecke werden diese mit C600 (pMG 101) - C600 (pMG 145) bezeichnet.

Unter den transformierten Stämmen von Tc^r/Ap^s werden 8 Stämme [C600 (pMG 101) - C600 (pMG 108)] beliebig ausgewählt, und das Plasmid DNA wird durch Gleichgewichtssedimentation mittels Cäsiumchlorid-Dichtegradienten, enthaltend Äthidiumbromid, isoliert. Das so isolierte Plasmid DNA wird als pMG 101 - pMG 108 bezeichnet.

Bestätigung der Richtung

Das Plasmid (5 µg) wird in einem Gemisch (30 µl) von 10 mM Tris-HCl-Puffer, 66 mM MgCl₂, 6 mM ß-Mercaptoäthanol und 60 mM NaCl gelöst. 30 Einheiten des Restriktionsenzyms Hae III werden zu der Lösung gegeben und anschließend wird 1 h bei 37°C erhitzt. Die Fragmente von 375 bp werden mittels Gelelektrophorese mit 1,5%iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt extrahiert. Die so extrahierten Fragmente werden auf ähnliche Weise unter Verwendung von 18 Einheiten des Restriktionsenzyms Hae II hydrolysiert und das Produkt, zu 191 bp und 176 bp hydrolysiert, bestimmt durch 5%ige Polyacrylamidgelelektrophorese, wird als Plasmid mit der richtigen Richtung bewertet.

Identifizierung des Fusionsproteins mit Minizellen

Minizellen erzeugende E. coli (F^-, thr⁺, ara⁺, leu⁺, azi^s, tonA^s, minA, minB, gal⁺, g ^-, sfr^r, malA, xyl, mtl, thi, sup^-) wird mit pMG 103 und pBr322 gemäß dem Verfahren von Kuschner [supra; (10)] transformiert, wobei ein Transformant von Tc^r/Ap^s gebildet wird.

Der Transformant wird in 20 ml von Davis Minimum-Kulturmedium, enthaltend 0,5% Casaminosäure, Thymin (20 µg/ml), Thiamin (2 µg/ml) und Tetracyclin (10 µg/ ml), 16 h bei 37°C vorgezüchtet und unter Inokulieren mit 10 ml Vorkultur in 500 ml des gleichen Mediums (ohne Gehalt an Tetracyclin) erfolgt die Züchtung weiter bis OD₆₂₀ = 0,6 bis 0,8. Die Kulturbrühe wird mittels einer Hitachi Refrigerated Centrifuge (Modell RPR-9, bei 3000 U/min) während 12 min zentrifugiert, um die Wirtszellen zu entfernen, und weiter 25 min bei 8500 U/min zur Bildung von Minizellenpellets zentrifugiert. Die Minizellenpellets werden durch Suspension in 25 ml To-Puffer (1 M Tris-HCl, pH 7,3, MgSO₄ · 7 H₂O 150 mg, 1 ml 1%ige Gelatine, 0,25 ml 1M CaCl₂/1 l H₂O) gewaschen. Die Suspension wird 15 min bei 10 000 U/min (in einem RPR-20 Rotor) zentrifugiert, und die entstehenden Minizellenpräzipitate werden in 1 ml Tl-Puffer suspendiert. Die entstehende Suspension wird einer 10%-15%-20% stufenweisen Dichtegradienten-Zentrifugation (bei 4000 U/min in einem RPRS-4 Rotor während 25 min) zur Gewinnung der Minizellen unterworfen. Die Minizellen-Suspension wird weiterhin in 20 ml Tl-Puffer suspendiert und ähnliche Verfahren werden wiederholt.

Die Minizellen werden in 1 ml Davis Minimum-Kulturmedium, enthaltend jeweils 50 µg/ml als Endkonzentration von 18 Aminosäuren (Alanin, Valin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Glycin, Serin, Threonin, Cystin, Tyrosin, Asparagin, Aspartinsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin), 20 µg/ml Thymin und 2 µg/ml Thiamin, suspendiert und 12 min unter Schütteln bei 37°C erhitzt. Nach Zugabe von 20 µCi (³⁵S)-Methionin [NEN (New England Nuclear) = 1260,1 Ci/ mMol] und 5 µ Ci (³H)-Leucin (NEN = 115,2 Ci/mMol) zu der Suspension wird das Gemisch weiterhin 10 min erhitzt. Unmittelbar danach wird der gleiche Puffer, enthaltend 50 mM NaN₃, 100 µg/ml Methionin und 100 µg/ml Leucin, zu dem Gemisch zugesetzt. Dann erfolgt eine Zentrifugation bei 3000 U/min während 20 min zur Gewinnung der Minizellen, die ihrerseits in 20 µl eines Proben-Puffers [6 ml Wasser, 1 ml (1,25 Mol) Tris-HCl (pH 6,8), 0,4 g SDS (Natriumdodecylsulfat), 2 ml Glycerin, 1 ml 2-Mercaptoäthanol, 4 mg BPB (Bromphenolblau)] suspendiert und 3 min bei 100°C erhitzt werden. Dann werden 18 µl dieser Suspension einer Abtrennung mittels SDS-Polyacrylamid- Elektrophorese unterworfen.

In den Zellen von E. coli K12C600 (pBr 322) (FERM P- 6017) wurde ß-Lactamase synthetisiert und eine Bande, die einem Molekulargewicht von etwa 29 Kilodalton entspricht, tritt in dem Elektrophoresegel auf. Es wird jedoch kein solches Protein von etwa 29 Kilodalton in den Extrakten der Zellen von E. coli K12C600 (pMG 103) festgestellt. Stattdessen tritt ein Polypeptid von etwa 24 Kilodalton als neue Bande auf. Dies ist eindeutig das Genprodukt, welches gebildet wurde und durch pMG 103 codiert wurde und welches im Zusammenhang mit dem Verschwinden der ß-Lactamase-Bande steht. Das pMG 103 besitzt eine Struktur, bei der ein Teil des ß-Lactamasegens von pBR 322 (Codierung von 182 Aminosäuren von dem Amino-Ende des Signalpeptids des Strukturproteins von ß-Lactamase) stromabwärts davon für die Transkription mit dem 27-Desamidosecretingen (Codierung von 27 Aminosäuren) verknüpft ist, und sein Genprodukt muß als Fusionsprotein des ß-Lactamasefragments (182 Aminosäuren)-27-Desamidosecretin (27 Aminosäuren) angesehen werden. Das Molekulargewicht des Fusionsproteins wird zu 23,4 Kilodalton berechnet, und daher wird die neu auftretende Bande in den E. coli K12C600 (pMG 103)-Extrakten diesem Fusionsprotein zugeordnet.

Reinigung des Proteins

Die E. coli K12C600 (pMG 103) werden einer Schüttelzüchtung in 3 l Luriabrühe bei 37°C unterworfen und zentrifugiert, wenn die Konzentration der Mikroorganismen etwa 1×10⁹ Zellen/ml erreicht hat. Die entstehenden Pellets werden mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)/1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Pellets werden erneut in dem gleichen Puffer suspendiert. Die Suspension wird mit EDTA bei einer Endkonzentration von 10 mM bei 0°C während 5 min behandelt und anschließend mit Eiweißlysozym bei einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml bei 0°C während 30 min behandelt, um eine sphäroplastische Bildungs- Lyse zu erreichen. Das entstehende Lysat wird mittels einer Kubota Ultraschallwellen-Erzeugungsvorrichtung "Insonator 200 M" bei einer maximalen Output (200 W) während 10 min zur vollständigen Zerstörung der Bakterienzellen unterworfen. Auf diese Stufe folgt eine Zentrifugenabtrennung (unter Verwendung einer Hitachi Refrigerated Centrifugal Machine, Modell 20 PR52, mit RPR-20-2 Rotor, bei 18 000 U/min während 30 min bei 0°C) zur Entfernung der Zellendebris. Zu dem erhaltenen, überstehenden Material (110 ml) gibt man Magnesiumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und dann wird das Gemisch zentrifugiert (mittels des obigen Rotors bei 8000 U/min während 10 min bei 0°C). Zu der überstehenden Lösung gibt man 400 µg DNase I und 5 mg RNase I, um die Behandlung während 1 h bei 4°C durchzuführen. Dann werden die Proteine und Peptide mit 80%igem gesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzt. Die durch Zentrifugieren (mittels des RPR 20-2 Rotors, bei 8000 U/min während 10 min bei 0°C) erhaltenen Präzipitate werden in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gelöst mit dem gleichen Puffer entsalzt und zentrifugiert (unter den obigen Bedingungen). Dann wird Aceton bis zu einer Endkonzentration von 75% zu der überstehenden Lösung zugesetzt und die gebildeten Niederschläge werden über Nacht mit 1,0 g Bromcyanin in 20 ml 80%iger Ameisensäure behandelt. Nach dem Verdampfen wird der Rückstand mit 40 ml Isopropanol extrahiert und anschließend mit einem gleichen Volumen Methanol. Anschließend erfolgt eine erneute Verdampfung und der Rückstand wird in 0,1N Essigsäure gelöst. Nach Entfernung der unlöslichen Stoffe durch Zentrifugieren (3000 bis 4000 G während 5 min) erfolgt eine Gelfiltration mittels einer Sephadex G-25-Säule, und die Fraktionen mit Molekulargewichten von 1000 bis 10 000 werden gesammelt und lyophilisiert.

Bioassay

Die so erhaltene, lyophilisierte Probe wird nach dem Bioassay-Verfahren [The Japanese Journal of Pharmacology, 21, 325 (1971); (12)] analysiert, gemäß dem die erhaltene, lyophilisierte Probe in 2 ml als Gesamtvolumen einer isotonischen Natriumchloridlösung gelöst wird. Jeweils aliquote Teile von 0,25 ml werden intravenös in die Leistengegend von 5 Ratten injiziert. Die Mengen an Pankreassaft, die aus einem künstlichen Pankreasschlauch sekretiert werden, werden in Intervallen von 10 min gemessen, und die Erhöhung in der Menge wird als biologische Aktivität von Secretin bestimmt. Als Standard-Secretin wird Secrepan in Mengen von 0,25 E/kg und 0,50 E/kg den gleichen Ratten zuvor intravenös injiziert, und die Mengen an sekretiertem Pankreassaft werden gemessen, um das Übereinstimmen mit der Eisai-Einheit festzustellen (im wesentlichen gleich der Crick Harper Raper-Einheit). Als Folge stellt man fest, daß die aus E. coli K12C600 (pMG 103) erhaltenen Proben eine Erhöhung an sekretiertem Pankreassaft von 202% ± 76 (Durchschnitt ± Standardabweichung) 10 min nach der Injektion und von 180% ± 87,6 20 min nach der Injektion ergeben. Andererseits ergibt Secrepan eine Erhöhung von 162% ±28 bzw. 206% ±58 nach 10 bzw. 20 min im Falle von 0,25 E/kg-Injektionen und von 159,8% ±83,7 bzw. 250,8% ±216,5 10 min und 20 min nach der Injektion von 0,5 E/kg. Diese Werte (als Ergebnis des t-Testes) zeigen, daß diese Werte einen signifikanten Unterschied von p < 0,05 ergeben. Andererseits beobachtet man, wenn man die Probe, die man erhält, indem man von den Extrakten der Bakterienzellen ausgeht, die aus dem Clon erhalten werden, der lediglich pBR 322 enthält und frei vom Desamidosecretingen ist, nach dem gleichen Verfahren prüft, keine Erhöhung in der Menge an sekretiertem Pankreassaft. Dies zeigt, daß eine Substanz mit secretinartiger, biologischer Aktivität in den Zellen von E. coli K12C600 (pMG 103) gebildet wird, während die Bildung einer solchen Substanz in den Zellen von E. coli K12C600 (pBR322) nicht beobachtet wird. Wenn man die erhöhten Mengen an sekretiertem Pankreassaft aus Proben, die aus E. coli K12C600 (pMG 103) erhalten werden, auf eine gerade Linie aufträgt, die man erhält, indem man ein semilogarithmisches Zeichenpapier mit den erhöhten Mengen an sekretiertem Pankreassaft als Ordinate verwendet, und die Secrepan-Einheiten als Abszisse (logarithmische Skala) aufträgt, so kann die Secretin-Einheit durch Extrapolationsverfahren bestimmt werden (vorausgesetzt, daß eine lineare Beziehung erhalten wurde) und beträgt 0,17 bis 0,24 Eisai-Einheiten (= 0,17 bis 0,24 Crick Harper Raper-Einheiten)/0,25 ml/ kg Ratte. Wenn man die Berechnung unter Beachtung des Körpergewichts der Ratten durchführt, wird dieser Wert auf 0,051 bis 0,072 E/0,25 ml/Ratte kalibriert, wobei die Gesamtaktivität 0,408 bis 0,576 E für die Gesamtmenge von 2 ml beträgt. Da bekannt ist, daß Secretin, wenn es die höchste Reinheit besitzt [Chemische Berichte, 105, 2508 (1972), (13a); Chemische Berichte, 105, 2515 (1972), (13b)], eine spezifische Aktivität von 16 000 CHR-Einheiten/mg besitzt, entsprechen die Werte von 0,408 bis 0,576 E 25,5 bis 36 ng der Secretinmenge. Dies entspricht 7,15 bis 10,1 pMol Secretinmolekülen, was anzeigt, daß ein Desamidosecretin mit einer Aktivität, entsprechend 4,3 bis 6,1×10¹² Secretinmolekülen, biosynthetisiert wurde. Da das Desamidosecretin unter Verwendung von etwa 3×10¹² Zellen E. coli K12C600 (pMG 103) als Ausgangsmaterial hergestellt wurde, wurden mindestens 1,4 bis 2,0 Moleküle, äquivalent zu Secretin/eine Bakterienzelle, isoliert.

Radioimmunoassay

Die Probe wird mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/0,1% Rinderserumalbumin verdünnt. Der Radioimmunoassay der verdünnten Probe wird unter Verwendung von "Secretin kit Daiichi" entsprechend dem angegebenen Verfahren durchgeführt, um seine Aktivität zu bestimmen.

Beispiel 2

Die Stufen für die Verknüpfungsreaktion zwischen den Fragmenten werden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Herstellung von λ plac5-DNA und pBR322-DNA

λ plac5-DNA wird aus dem lysogenen Bakterium E. coli PK 1512 (IFO 14149) erhalten und die Verfahren zur Herstellung erfolgten gemäß dem Verfahren von Oshima [supra; (20)].

pBR322 wird aus E. coli K12C600 (pBR322) (FERM-P 6017) erhalten und die Verfahren zur Herstellung erfolgten gemäß dem Verfahren von Kahn et al [Methods in Enzymology, 68, 265 (1979); (21)].

Herstellung von pRE1

λ plac5-DNA (10 µg) wird zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 20 µl) aus 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 7 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl gegeben, und die Reaktion erfolgt unter Verwendung von 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms Hind III während 2 h bei 37°C. Anschließend werden mittels Gelelektrophorese mit 1%iger Agarose 3,8 Megadalton von DNA-Fragmenten gereinigt.

pBR322-DNA (1 µg) wird zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 10 µl), ähnlich dem obigen Gemisch, gegeben, und die Reaktion erfolgt unter Verwendung von 1 Einheit des Restriktionsenzyms EcoRI und 1 Einheit des Restriktionsenzyms Hind III während 2 h bei 37°C. Anschließend werden 2,6 Megadalton DNA-Fragmente mittels 1%iger Agarosegelelektrophorese gereinigt.

Die resultierenden Fragmente werden zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 10 µl) aus 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 20 mM DTT und 1 mM ATP gegeben, und die Reaktion erfolgt unter Verwendung von 30 Einheiten T4DNA-Ligase während 24 h bei 14°C.

Unter Verwendung des Reaktionsgemisches wird die Transformation des E. coli Stamms XA35 gemäß dem Verfahren von Kuschner [supra; (10)] in einer p-1 physikalischen Containment facility [supra; (11)] durchgeführt.

Der transformierte Stamm wird auf einer L-Platte (1% Bactotrypton, 0,5% Bactohefeextrakt, 0,5% NaCl, 1,5% Bactoagar), enthaltend Ap (20 µg/ml), ausgewählt; die erhaltenen, transformierten Stämme werden auf einer Platte aus EMB-lac (2,25% Bacto-EMB-Brühe, 1,5% Bactoagar) reproduziert. Die zu Lac⁺ (rote Kolonie) umgewandelten Stämme werden ausgesucht. Unter diesen Stämmen werden 5 Stämme randomartig ausgewählt, um ein Plasmid herzustellen, das mit verschiedenen Arten von Restriktionsenzymen analysiert wird. Dabei wird festgestellt, daß die vier Stämme aus 3,8 Megadalton-Fragmenten von λ plac5DNA, verknüpft mit EcoRI-HindIII-Fragment von pBR322 DNA, bestehen. Von diesen Stämmen wird ein Stamm als E. coli XA35 (pRE 1) bezeichnet. Das heißt, das Transformans E. coli XA35 (pRE 1) unterscheidet sich von dem zuvor erwähnten E. coli-Stamm XA35 in den folgenden Eigenschaften.

[Ap^r, Lac⁺].

Linker

Die Synthese eines Fragments mit der Basensequenz CTGAATTCAGCTCTGCAGAG wird durchgeführt. Die Synthese und die Reinigung erfolgen gemäß den oben beschriebenen Verfahren zur Synthese und Reinigung der entsprechenden Strukturgene (Ausbeute = 40%). In der vorliegenden Erfindung wird diese einstrangige DNA als "Prälinker" bezeichnet.

Der Prälinker (15 µg) wird zusammen mit 20 Einheiten T4-Polynucleotidkinase 40 min bei 37°C in einem Gemisch (Gesamtmenge = 30 µl) aus 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA, 10 mM DTT und 0,2 mM ATP inkubiert. Die Reaktion wird durch 2minütiges Erhitzen bei 60°C beendigt. Nach 1stündigem Stehenlassen des Gemisches bei Zimmertemperatur werden 300 Einheiten (1 µl) T4-DNA-Ligase zugesetzt und die Reaktion wird über Nacht bei 14°C durchgeführt. Durch Erhitzen während 2 min bei 60°C wird die Reaktion beendigt. Das Gemisch wird 1 h bei Zimmertemperatur stehengelassen und 20 Einheiten Restriktionsenzym Pst I werden zugesetzt, um die Reaktion während 5 h durchzuführen. Durch Erhitzen während 2 min bei 60°C wird die Reaktion beendigt. Man erhält so 15 µg Pst I-Eco RI- Pst I-Linker.

Herstellung des EcoRI-EcoRI-Strukturgens

Der zuvor hergestellte PstI-EcoRI-PstI-Linker (4 µg) und das obengenannte PstI-PstI-Strukturgen von Beispiel 1 (0,6 µg) werden zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 35 µg) aus 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 7 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl gegeben, und die Reaktion wird unter Verwendung von 300 Einheiten T4-DNA-Ligase 24 h bei 14°C durchgeführt. Dann wird die Reaktion durch Erhitzen bei 68°C während 10 min beendet, gefolgt von einem allmählichen Abkühlen des Reaktionsgemisches.

Zu dem erhaltenen Reaktionsgemisch gibt man das Restriktionsenzym EcoRI (100 Einheiten) und führt die Umsetzung 5 h bei 37°C durch. Anschließend wird das DNA-Fragment mit 120 Basenpaaren mittels 5%iger Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt.

Herstellung von pLS und Clonbildung

0,25 µg pRE1 werden zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 4 µl) aus 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 7 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl gegeben und die Reaktion erfolgt unter Verwendung von 1 Einheit Restriktionsenzym EcoRI während 1 h bei 37°C.

Das so hergestellte Plasmid pRE1 (gespalten mit EcoRI) (0,25 µg) und 0,02 µg EcoRI-EcoRI-Strukturgen werden zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 10 µl) aus 50 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 20 mM DTT und 1 mM ATP gegeben, und die Reaktion wird unter Verwendung von 30 Einheiten T4-DNA-Ligase während 24 h bei 14°C durchgeführt.

Unter Verwendung des erhaltenen Reaktionsgemisches erfolgt die Transformation des E. coli-Stamms XA35 gemäß dem Verfahren von Kuschner [supra; (10)] in einer P-3 physikalischen Containment facility [supra; (11)].

Der transformierte Stamm wird auf einer L-Platte ausgewählt, die Ap (20 µg/ml) enthält, wie zuvor beschrieben. Die entstehenden, transformierten Stämme werden auf der EMB-lac-Platte (wie oben beschrieben) für die weitere Selektion des Lac⁺-Stamms kopiert. Unter diesen Stämmen werden 200 Stämme zur Herstellung des Plasmids DNA ausgewählt, dessen Strukturen durch das Restriktionsenzym PstI oder HaeII analysiert wurden, und es wurde bestätigt, daß 11 Stämme das obige Strukturgen enthalten.

Bestimmung der Richtung

Der folgende Versuch wird für jedes Plasmid der 11 Stämme mit dem Strukturgen durchgeführt.

Das Plasmid (20 µg) wird zu einem Gemisch (Gesamtmenge = 20 µl) aus 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 66 mM MgCl₂ und 60 mM NaCl gegeben und dann gibt man zusätzlich 20 Einheiten Restriktionsenzym HaeII zu der Lösung. Anschließend erfolgt eine Inkubation während 2 h bei 37°C. Aus dem entstehenden Gemisch werden mittels 1%iger Agarosegelelektrophorese Fragmente von etwa 1 Megadalton und Fragmente von etwa 0,7 Megadalton extrahiert. Die entsprechenden Fragmente werden mit dem Restriktionsenzym EcoRI gemäß dem oben beschriebenen Verfahren gespalten und einer 15%igen Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen. Das Plasmid, bei dem nach der Elektrophorese die DNA-Fragmente mit 40 Basenpaaren aus dem Fragment von etwa 1 Megadalton und das DNA-Fragment mit 80 Basenpaaren aus dem Fragment von etwa 0,7 Megadalton erhalten wurden, wird als das Plasmid angesehen, in das das Strukturgen in der richtigen Richtung eingesetzt bzw. eingebaut wurde.

Aus diesen Versuchen ergibt sich, daß 5 Stämme des Plasmids unter den 11 Stämmen des Plasmids mit dem Strukturgen die richtige Richtung aufweisen. Einer dieser Stämme wurde beliebig ausgewählt und als E. coli XA35 (pLS58) bezeichnet.

Identifizierung und Reinigung des Fusionsproteins

E. coli XA35 (pLS58) wird der Schüttelkultivierung in 1 l Luria-Brühe mit einem Gehalt von 20 µg/ml Ampicillin bei 37°C unterworfen, bis die Zahl der Bakterienzellen 5×10⁸ Zellen/ml erreicht hat. Dann werden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gesammelt und in einem Gemisch (Gesamtmenge = 100 ml) aus 10 mM Tris- HCl-Puffer (pH 7,5)/10 mM MgCl₂ suspendiert, und die Suspension wird mittels der Ultraschallwellen- Erzeugungsvorrichtung "Insonator 200 M" während 30 min zur Zerstörung der Bakterienzellen behandelt.

Die so erhaltene Lösung (2 µl) wird der 7,5%igen SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen, wobei eine Proteinbande mit einer Größe von 120 000 Dalton festgestellt wird. Keine solche Bande wird in dem Extrakt festgestellt, den man auf ähnliche Weise aus den Bakterien ohne Plasmidgehalt (E. coli-Stamm XA35) erhält. Daraus kann geschlossen werden, daß dieses Protein sich von dem Plasmid pLS58 ableitet.

Es wurde weiterhin bestätigt, daß das Protein eine Größe aufweist, die im wesentlichen gleich ist wie die von ß-Galactosidase [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 1507, (1977); (19)] aus E. coli, was nicht im Gegensatz zu der Größe (117 873 Dalton) des Fusionsproteins von Desamidosecretin und ß-Galactosidase steht.

Daraus kann man schließen, daß dieses Protein mit etwa 120 000 Dalton das Fusionsprotein ist, und die Reinigung des Proteins wurde durchgeführt.

Der durch Ultraschallzerstörung erhaltene Extrakt wird einer Zentrifugierung unterworfen und die Präzipitate werden gewonnen. Das Fusionsprotein wird im wesentlichen in den Präzipitaten isoliert. Die Präzipitate werden in einem Gemisch (Gesamtmenge = 100 ml) aus 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) und 1 mM MgCl₂ suspendiert und einer Zentrifugierung unterworfen, gefolgt von der Gewinnung der Präzipitate. Dieser Vorgang wird zweimal zur Entfernung von wasserlöslichen Materialien wiederholt.

Der entstehende Niederschlag wird in einem Gemisch (Gesamtmenge = 100 ml) aus 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 1 mM MgCl₂, 10 mM NaCl und 7 M Harnstoff gelöst und auf eine Säule (5 cm ⌀×3 cm) aus DEAE-Cellulose, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war, gegeben.

Nach dem Waschen mit 20 ml des gleichen Puffers wird die Säule weiterhin mit 100 ml eines ähnlichen Puffers gewaschen, dessen NaCl-Konzentration zu 50 mM geändert war. Dann wird das Fusionsprotein mit 150 ml eines ähnlichen Puffers, dessen NaCl-Konzentration zu 150 mM geändert war, eluiert.

Zu dem resultierenden Eluat gibt man ß-Mercaptoäthanol bis zu einer Endkonzentration von 1% und dialysiert das Gemisch dreimal gegenüber 5 l Wasser. Das Dialysat wird zentrifugiert, um das Fusionsprotein als Niederschlag zu gewinnen. Das entstehende Fusionsprotein ergibt eine im wesentlichen einfache Bande bei der SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese in einer Menge von etwa 28 mg/1 l Kulturbrühe, berechnet aus der Absorption bei 280 nm. Dieser Wert entspricht etwa 280 000 Molekülen/ Zelle.

Das gereinigte Fusionsprotein wird in 2 ml 70%iger Ameisensäure gelöst und mit 100 mg Bromcyan während 18 h behandelt. Nach dem Verdampfen wird der Rückstand mit 5 ml Isopropanol und dann mit 5 ml Methanol extrahiert. Auf die Extraktion erfolgt eine Lyophilisierung.

Bioassay

Die so erhaltene, lyophilisierte Probe wird gemäß einem Bioassayverfahren [The Japanese Journal of Pharmacology, 21, 325 (1971); (12)] analysiert, bei dem die lyophilisierte Probe in 25 ml (Gesamtvolumen) isotonischer Natriumchloridlösung gelöst wird. Aliquote Teile von jeweils 50 µl werden intravenös in die Leistengegend von 5 Ratten injiziert. Die Mengen an Pankreassaft, die ausgeschieden werden und aus einem künstlichen Pankreasschlauch fließen, werden in Intervallen von 5 min gemessen. Das Inkrement wird als biologische Aktivität des Secretins bestimmt. Als Standard-Secretin wird Secrepan in Mengen von 1 Einheit, 2 Einheiten und 4 Einheiten/Ratte zuvor intravenös den gleichen Ratten injiziert, und die Mengen an sekretiertem Pankreassaft werden gemessen, um die Übereinstimmung mit der Eisai-Einheit (im wesentlichen gleich zu der Crick Harper Raper-Einheit) festzustellen.

Als Ergebnis stellt man fest, daß die aus E. coli XA35 (pLS58) erhaltenen Proben eine Erhöhung an sekretiertem Pankreassaft ergeben. Andererseits beobachtet man keine Erhöhung in der Menge an sekretiertem Pankreassaft, wenn die Probe entsprechend dem gleichen Verfahren geprüft wird, die man erhält, wenn man die Extrakte der Bakterienzellen als Ausgangsmaterial verwendet, die man aus einem Clon erhält, das lediglich pRE1 aufweist und frei von Desamidosecretingen ist. Dies zeigt an, daß eine Substanz mit secretinartiger biologischer Aktivität in den Zellen von E. coli XA35 (pLS58) gebildet wird, während keine derartige Bildung einer solchen Substanz in den Zellen von E. coli XA35 (pRE1) auftritt.

Trägt man die erhöhten Mengen an sekretiertem Pankreassaft aus den mittels E. coli XA35 (pLS58) erhaltenen Proben auf eine gerade Linie auf, die man erhält, indem man ein semilogarithmisches Zeichenpapier verwendet, wobei die erhöhten Mengen an sekretiertem Pankreassaft als Ordinate verwendet werden und die Secrepan-Einheiten als Abszisse (logarithmische Skala), so kann die Secretin-Einheit nach einem Interpolationsverfahren bestimmt werden und beträgt 3 Eisai-Einheiten/50 µl/ Ratte, welches etwa 1500 Eisai-Einheiten als 25 ml isotonische Natriumchloridlösung, die die lyophilisierte Probe enthält, entspricht. Da bekannt ist, daß das Secretin, welches auf die höchste Reinheit gereinigt wurde, [Chemische Berichte, 105, 2508 (1972), (13a); Chemische Berichte, 105, 2515 (1972), (13b)], eine spezifische Aktivität von 16 000 CHR-Einheiten/mg aufweist, 1500 Einheiten entsprechen etwa 26 nMol Secretinmolekülen, zeigt dies an, daß ein Desamidosecretin mit einer Aktivität entsprechend 1,6×10¹⁶ Secretinmolekülen biosynthetisiert wurde. Da das Desamidosecretin unter Verwendung von etwa 5×10¹¹ Zellen E. coli XA35 (pLS58) als Ausgangsmaterial hergestellt wurde, werden mindestens 3×10⁴ Moleküle, äquivalent dem Secretin/ 1 Bakterienzelle, isoliert.

Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, daß das synthetische 27-Desamidosecretingen durch den Einfluß von E. coli Lactoseoperon-Aktivator in den Zellen von E. coli XA35 (pLS58) ausgedrückt wird und das daraus entstehende Produkt, nämlich 27-Desamidosecretin, zeigt eine Aktivität, die ähnlich ist wie die von Secretin.

Radioimmunoassay

Die Probe wird mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/0,1% Rinderserumalbumin verdünnt. Der Radioimmunoassay der verdünnten Probe wird unter Verwendung von "Secretinkit Daiichi" nach dem zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt, um ihre Aktivität zu bestimmen.

(4) Aufbauzeichnung des Gens

In dem folgenden Diagramm ist die Basensequenz des Gens, welches das 27-Desamidosecretin-Strukturgen enthält, getrennt in den Blöcken A, B und C dargestellt, wobei a ein mögliches Basenpaar, b die PstI-Stelle, c ein mögliches Basenpaar, d ein Startcodon, e die HinfI- Stelle und f die HaeII-Stelle bedeuten.

(5) Hinterlegung der Mikroorganismen

E. coli K12C600; E. coli XA35 und sein Transformans E. coli XA35 (pRE1) mit dem Plasmid pRE1 wurden gemäß dem Budapester Vertrag für die internationale Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke der Patentverfahren am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM), 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japan, unter FERM BP-115 am 9. Juni 1981; FERM BP-116 am 7. Januar 1982; und FERM BP-117 am 7. Januar 1982 hinterlegt. Das Plasmid pBR322 wurde bei FERM in Form eines Transformans von E. coli K12C600 mit pBR322, nämlich E. coli K12C600 (pBR322), unter FERM P-6017 am 9. Juni 1981 hinterlegt.

E. coli K12C600 (pMG 103), welches das Transformans mit dem Chimären-Plasmid pMG ist, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter ATCC 39042 am 26. Januar 1982 hinterlegt.

E. coli PK 1512, welches das λ plac5 lysogene Bakterium ist, wurde bei dem Institute for Fermentation, Juso- Hommachi, 2-17-85, Yodogawa-Ku, Osaka-Shi, Japan, unter IFO Nr. 14149 am 1. Februar 1982 hinterlegt.

E. coli XA35 (pLS58), welches das Transformans mit dem Chimären-Plasmid ist, wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei ATCC unter ATCC 39040 am 11. Januar 1982 hinterlegt.

(6) Literaturverzeichnis

(1)Acta Chemica Scandinavica, 15, 1790, (1961);

(2)a) Chemical industry, 1966, 1757b) Journal of the American Chemical Society, 89, 6753, (1967);

(3)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 75, 3737, (1978);

(4)a) Science, 198, 1056, (1977),b) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 75, 5765, (1978),c) Nature, 281, 18, (1979),d) Biochemistry, 1980, 6096, (1980);

(5)Science, 203, 614, (1979);

(6)a) Nucleic Acids Research, 8, 5491, (1980),b) Nucleic Acids Research, 8, 5193, (1980),c) Tetrahedron Letters, 21, 4159, (1980),d) Nucleic Acids Research, 8, 2331, (1980);

(7)a) The Journal of Biological Chemistry (J.Biol.Chem), 241, 2014, (1966),b) Nucleic Acids Research, 1, 1665, (1974);

(8)Nucleic Acids Research, 8, 5753, (1980);

(9)Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 26, 2396 (1978);

(10)Genetic Engineering, 1978, 17, (1978);

(11)Guidelines for Recombinant DNA Experiment, herausgegeben im August 1979;

(12)The Japanese Journal of Pharmacology, 21, 325, (1971);

(13)a) Chemische Berichte, 105, 2508, (1972),b) Chemische Berichte, 105, 2515, (1972);

(14)Tetrahedron Letters, 1978, 2727, (1978);

(15)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 73, 3900, (1977);

(16)Gene, 2, 95, (1977);

(17)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76, 106, (1979);

(18)The operon, 31 (1980) (verfaßt von J.H. Miller und W.S. Resnikoff; herausgegeben von Cold Spring Harbor Laboratory);

(19)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 1507, (1977);

(20)Extra Volumes of "Protein, nucleic acid & enzyme", Last vol., S. 19, (1973);

(21)Methods in Enzymology, 68, 265, (1979);

(22)Microbiological Reviews, 44, 1-50, (1980);

(23)Nature, 224, 768, (1969);

(24)Nature, 217, 1110, (1968).

Claims (14)

1. 27-Desamidosecretin, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid der Aminosäure- Sequenzformel His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu- Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-
Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-OHdarstellt, worin Val-OH anzeigt, daß das C-Ende des Polypeptids, welches Valin enthält, eine Carbonsäure ist.

2. Verfahren zur Herstellung des 27-Desamidosecretins des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

• (1) chemisch ein Strukturgen synthetisiert, das dem Polypeptid His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu- Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-
  Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Valentspricht,
• (2) das Strukturgen in ein Vektorplasmid, welches sich von pBR322 ableitet, unter Bildung eines Chimärenplasmids einsetzt,
• (3) ein E. coli mit dem Chimärenplasmid transformiert, und
• (4) den entstehenden Transformanten züchtet und das gebildete Desamidosecretin gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als E. coli E. coli K12C600 = FERM BP-115 einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vektorplasmid pBR322 einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chimärenplasmid pMG einsetzt, welches darin eingebaut das Strukturgen in der Pst-I-Erkennungsstelle von pBR322 enthält.

6. Verfahren zur Herstellung des 27-Desamidosecretins des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

• (1) chemisch ein Strukturgen synthetisiert, das dem Polypeptid His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu- Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-
  Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Valentspricht,
• (2) in ein Vektorplasmid, das sich von pBR322 ableitet und ein Lactoseoperon enthält, das Strukturgen unter Bildung eines Chimärenplasmids einsetzt,
• (3) ein E. coli mit dem Chimärenplasmid transformiert, und
• (4) den entstehenden Transformanten züchtet und das gebildete Desamidosecretin gewinnt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als E. coli E. coli XA35 = FERM BP-116 einsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das von E. coli stammende Lactoseoperon einsetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Vektorplasmid einen Teil oder das gesamte Lactoseoperon von E. coli enthält und in E. coli wachsen kann.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Vektorplasmid aus einer Transduktionsphage hergestellt wird, die das gesamte oder einen Teil des Lactoseoperons und ein von pBR322 abgeleitetes Plasmid enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Transduktionsphage aus der Gruppe pldl, F′-lac, Φ 80dplac, λ h80dlac und λ plac auswählt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phage λ plac5 einsetzt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vektorplasmid pRE einsetzt, welches das 3,8 Md des Fragments von λ plac5, verbunden mit dem größeren Fragment der Fragmente, aufweist, die man durch Digestion von pBR322 mit EcoRI und Hind III erhält.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das Chimärenplasmid pLS einsetzt, welches ein Produkt ist, das man erhält, wenn man das Strukturgen in pRE an seiner EcoRI-Erkennungsstelle einsetzt.