DD291093A5 - Recombinierende dna-sequenzen und ihr verfahren zur herstellung des menschlichen proapolipoprotein a-i - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinierende DNA-Sequenzen, die eine Sequenz umfassen, die fuer das menschliche Proapolipoprotein A-I kodieren, in dem ein Teil der natuerlichen kodierenden Sequenz durch eine DNA-Sequenz ersetzt worden ist, die fuer die gleichen Aminosaeuren kodiert, jedoch in einer unterschiedlichen Nucleotidsequenz besteht, so dasz die Bildung von nadelfoermigen Strukturen begrenzt oder verhindert wird; sie liefert Klonierungs- und Darstellungsvektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten, Zellkulturen oder Mikroorganismen, die mit diesen Darstellungsvektoren transformiert worden sind und Verfahren, die sie zur Herstellung von Proapolipoprotein A-I verwenden, das in der Medizin zur Bekaempfung artherosklerotischer Gefaeszerkrankungen verwendet werden kann.{DNA-Sequenzen, rekombinierend; Proapolipoprotein A-1, kodierend; Klonierungs-Darstellungsrektoren; DNA-Segment, enthaltend; Proapolipoprotein-A1-Herstellung; Arzneimittel; Gefaeszerkrankungen, artherosklerotisch}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Gegenstand dieser Erfindung sind neue rekombinierende DNA-Sequenzen, die eine Kodiersequenz für das menschliche Proapolipoprotein A-I besitzen, Klonierungs- und Darstellungsvektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten, die mit diesen Darstellungsvektoren transformierten Wirtszellen sowie Verfahren zur Herstellung des menschlichen Proapolipoproteins A-I unter Verwendung der neuen rekombinierenden DNA-Sequenzen, der Vektoren und Transformanten. Das erfindungsgemäß hergestellte Proapolipoprotein A-I ist in der Medizin zur Bekämpfung artherosklerotischer Gefäßkrankheiten anwendbar.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das menschliche Apolipoprotein A-I (Apo A-I) ist die wichtigste Proteinkomponente der High-Density-Lipoproteine (HDL) und der Chylomikronen der Lymphe. Die Leber und der Dünndarm sind die primären Zentren für die Synthebe des Apo A-I. Das Apo A-I wird in diesen Organen in Form eines Proteinvorläufers (Präproapo A-I) synthetisiert. Im Inneren der Zelle erfolgt eine Aufspaltung des Präpeptids, und das Proapo A-I wird in das Blut und in die Lymphe sekretiert.

Das Proopo A-I enthält eeche zusätzliche Aminosäuren (Arg-Hle-Phe-Trp-Gln-Gln), die an der Aminoondgruppe des Apa A-I fixiert sind. Gelangt das Proapo A-I In den vasskulären Bereich, wird es In vivo von olnom spezifischen protoolytischon Enzym, der Apo A-I-Propoptidaso, zu Apo A-I mature aufgospalton.

Das Apo A-I mature ist ein einzolnos nicht glykolislortos Polypoptid von bokonntor Soquonz, das aus 2Ί3 Aminosäuren bostoht (H.B. BREWER und Mitarb., Biochem. Biophys. Res. Comnuin. 80. (1978), 623-630). Es dient als Kofaktor für das Plasmaenzym dos Lecithins: Cholostorol-Acyltranstoraso, das für dlo 3ildung dor moiston Choloetorol-Estor im Plasma vorantwortlich ist. Fohlor in don Strukturen odor in dor Biosynthoso dos Apolipoprotolns können zu Störungon im Systom zum Transport dor Plasmalipido und zur Herausbildung oinor Erkrankung dor Koronarartorion führen. Man hat nachgowioson, daß oln niodrigor Apo A-I und HDL-Gohalt oinon großon Risikofaktor in bozug auf Herzanfälle (Herzinfarkt) und auf andero aothorosklorotischo Gofäßkrankhoiton darstollt. Veränderungen im Goncodo insbesondere für das Apo A-I sind mit oinor Vorringorung dos HDL-Gehalts sowie mit frühzeitig auftrotondon Erkrankungen dor Koronararterien in Zusammenhang gebracht worden. Das Apo A-I und die HDL sind wichtigo Bestandtoilo dos Plasmas. Sio sind am Transport des Cholostorols aus don poriphoren Gewoben (Arterion) In die Leber (man bozoichnot Ihn auch als den umgekehrton Cholostorol-Transport) beteiligt, von wo es vom Organismus ausgeschieden wird. Da eine Anhäufung des Cholostorols in den Arterion das charaktoristischo Merkmal und der essontiollo Mechanismus der Atherosklerose ist, könnto die Stimulierung des umgekehrten Cholesterol-Transports mit Hilfe dos Apo A-I den atherosklerotischon Prozeß vorlangsamen und umkehren und damit die Gefahr von Herzanfällen herabsetzen, Die Maturation von Proapo A-I zu Apo A-I kann quantitativ außerhalb der Zelle mit einer Vorweilzoit Im Blut von weniger als 12 Stunden erfolgen. Da Proapo A-I der wichtigste, wenn nicht sogar der einzige Vorläufer des Apo A-I mature ist, könnto es in einer Ersatztherapie immer dann verwendet werden, wenn der HDL-Gohalt durch erblich bedingte odor erworbene Defizienz sinkt. Angosichts dos thorapeutischon Wortes dos Apo A-I im allgomeinon haben dio Wissenschaftler nach Verfahren geforscht, die es ermöglichen, das Apo A-I in großon Mengen herzustellen. Zu diosen Vorfahren gehört traditionoll die Roindarstollung dos Apo A-I aus dom Blutplasma.

Mehrere Publikationen (P. CHEUN und L. CHAN, nudele Acids Res., 11₁ [1983], 3703-3715; JJ. SEILHAMER und Mitarb., DNA, 3, 11984], 309-317) und die japanische Patentanmeldung Nr. 96998/86) haben gezeigt, daß die komplementäre Kodier-DNAfür das prä- Proapo A-I durch bekannte genetische Technologien hergestellt werden kann.

R.Lorenzetti und Mitarb. (FEBS Lett. 194, (1986), 343-346) haben nachgewiesen, daß das Apo A-I in E.coli in Form eines nicht spaltbaren, mit der Beta-Galactosidase fusionierton Proteins ausgedrückt wordon kann. Die Versuche, das Apo A-I maturo in Form eines nicht fusionierten Proteins auszudrücken sind bisher jedoch erfolglos geblieben.

In der oben genannten japanischen Patentanmeldung Nr. 969986 wird die Darstellung eines dem menschlichen Apolipro-Protein A-I ähnlichen Proteins in E, coil beschrieben, das von einem Plasmid pJAIE-l mit einem Strukturgen dos Apo A-I unter der Kontrolle des tacPromotors umgewandelt wird. Das Strukturge ι ist jedoch unvollständig und besteht aus don Codonen für die Aminosäuren +4 bis +243, denen ein Codon ATG zur Initiierung dor Translation vorausgeht. Daraus ergibt sich, daß das erzeugte Darstellungsprodukt das N-terminale Methionin (entsprechend dem Codon ATG) enthält, das bei seiner therapeutischen Verwendung zu Nebenerscheinungen führen kann. J. B. MALLORY und Mitarbeiter (J. Biol. Chem. 262, (19871, 4241-4247; internationale Patentanmeldung PCT WO 86/04920 und 87/02062) beschreiben die Darstellung des menschlichen Apolipoproteins A-I in den Eizellen von chinesischen Hamstern (tierische Zellkultur). Die verwendete Konstruktion enthält das vollständige Gen dos menschlichen prä-Proapolipoproteins A-I. Die Eizellen von chinesischen Hamstern scheinen die Proapo-Form in die Form Apo mature umzuwendein, da nur 5 bis 10% des sekretierten Apo A-I-Proteins Proapo A-I sind, während der übrige Teil das Protein Apo A-I mature ist. Die Produktivität des Systems ist relativ gering, da 0,5 x 10 Zellen lediglich 25-30 \ig/ mol Apo A-I in 24 Stunden sekretioren. In der internationalen Patentanmeldung PCT WO 87/02062 beziehen sich einige Anwondungsbeispiele auf die Darstellung des menschlichen Apolipoproteins A-I in anderen Wirten, z. B. E.coli (Bakterienwirt) und S. cerevlsiae (Hefe). Keine der verwendeten Konstruktionen enthält jedoch die genetische Information für die Proapo-Form, und das dargestellte Protein ist nicht das menschliche Proapolipoprotein A-I.

Ziel der Erfindung

Mit der vorliegenden Erfindung werden rekombinierende DNA-Sequenzen, die für das menschlichu Proapolipoprotein A-1 kodieren, bereitgestellt.

Weiterhin werden Klonierungs- und Darstellungsrektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten, die mit diesen Darstellungsrektoren transformierten Wirtszellen sowie Verfahren zur Herstellung des menschlichen Proapolipoproteins A-1, das in der Medizin zur Bekämpfung artherosklerotischer Gefäßerkrankungen verwendbar ist, zur Verfügung gestellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Mittel und die Methoden zur Herstellung des menschlichen Proapolipoproteins A-I mit der rekombinierenden DNA-Technik zur Verfügung zu stellen, d.h. zur Herstellung des Proteins Proapo A-I mature, das durch das spezifische proteolytische Apo-A-I-Eniym gespalten werden kann. Unter dem Ausdruck „mature", so wie er hier gebraucht wird, versteht man nicht nur das menschliche Proapo A-I an sich, sondern auch das entsprechende Protein, dessen erste Aminosäure das Methionin ^!st und dessen Präsenz auf das ATG-Codon zur Initiation der Translation in die Konstruktion des Darstellungsvektor zurückzuführen ist.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Konstruktion von Klonierungs- und Darstellungsvektoren, die eine Kodierungs-DNA-Sequenz für das menschliche Proapo A-I enthält. Auf diese Art und Weise werden die Vergrößerung und folglich auch die Herstellung des menschlichen Proteins Proapo A-I mature ermöglicht. Das bezieht sich auch auf das met-Proapo A-I, auf seine Fusionskonjugate oder seine Konjugate mit dem N-terminalen Signal. Außerdem bezieht sich diese Erfindung auf lebensfähige zellkulturen oder auf Mikroorganismen, die genetisch modifiziert worden sind, da sie dtrartige Vektoren beinhalten und menschliches Proapo-A-I-Polypeptid produzieren können. Diese Erfindung stellt das menschliche Proapo A-I zusätzlich in einem physikalischen Zustand her, der sich von dem unterscheidet, den man vorfindet oder den man aus einer natürlichen Quelle oder einem natürlichen Milieu erhält; aufgrund seiner Herstellungsmethode ist das menschliche Proapo A-I im wesentlichen frei von den gewöhnlichen endogenen Proteinen und von anderen ursprünglichen Stoffen und Substanzen.

Dioso Erfindung bozioht sich auf die Produktion des monschlichon Proopo A-I mit Hllfo dor 1 ochnlk dor rekombinlorondon DNA in ollon Aspokten; sio ist nicht so zu Interpretieren, daß sie «Ich auf dio spezifischen Details beschränkt, dio im Rahmen der Erfindung boichrioben und dargelegt werden.

Ein grundlegender Aspokt der vorliogondon Erfindung betrifft die Produktion oines Proteins, das in dem menschlichen Proapo A-I mature besteht oder es enthält und des demzufolge In vivo und In vitro In monschlichos Apo A-I mature durch dio proteolytlscho Wirkung der Apo-A-IPropeptidaso verwandelt werden kann. Das Produkt monschlichos Proapo A-I kann so, wie es ist, zu thorapeutischon Zwockon verwondot worden; man kann auch das mot-Proapo A-I vorwondon, wenn dio Präsonz dos Mothionyl-Radikals pharmazeutisch akzeptiert wordon kann, da diosos Produkt im Blutkreislauf auf natürlichem Wege und in wirksamer Woiso durch die natürliche Propeptidase zu authontischom Menschlichem Apo A-I maturo umgewandelt werden kann. Wenn man will, kann dos menschlicho Proapo A-I in don Mikroorganismen oder in den ausgewählten Zollkulturon produziert wordon, die in dor Lage sind, das N-terminolo Methionin zu verarbeiten, und die demzufolge das menschliche Proapo A-I in oinor Form horstollon können, dio kein N-torminolos Mothionin enthalt. Jo nach dom, ob das monschlicho Proapo A-I oin N-torminalos Radikal onthält odor nicht, kann In vitro gospalton und so monschlichos Apo A-I mature hergestellt werden, das zu therapeutischen Zwockon verwendet werden kann. Das gleiche trifft zu auf din Fusionskonjugato und dio Konjugate, die das N-torminole Signal dos Proapo A-I beinhalten. Die Spaltung erzeugt authentisches menschliches Apo A-I, das von N-torminalem Methionin frei ist.

Ein zweiter wichtiger Aspekt dieser Erfindung bostoht in dor Vorwondung einer modifiziorton Sequenz, die mindestens für einen Teil dos Moleküls dos menschlichen Proepo A-I kodiert. Diese modifizierte Kodiersequenz vorbessert dio Wirksamkeit dor Translation durch die Reduzierung odor sogar die Verhinderung der Bildung von nadeiförmigen Strukturen. Es ist möglich, das R. LORENZETTI und Mitarb. (FEBS Lett. 194, (1986], 343-346) die Darstellung eines nicht fusionierten Proteins Apo A-I maturo nicht beobachten konnten, da dio DNA-Konstruktionen nadolförmigo Strukturen auf akzeptierbare Art und Woiso bilden konnten, wodurch eine sehr unwirksame Darstellung horboigeführt wurde. Man hat überrascht festgestellt, daß eine wirksame Darstellung erreicht werden kann, wenn man in geeigneter Weise einigo Codono in der Sequenz modifiziert, die für die Aminosäuren -6 bis +14 des menschlichen Proapo A-I kodiort. Der Ausdruck „in geeigneter Weise", der hier gebracht wird, bedeutet, daß einige der natürlichen Codono durch andere Codone ersetzt werden, die entsprechend dem genetischen Code die gleichen Aminosäuren vertreten. Dieser Ausdruck besagt außerdem, daß alle gemeinsam vorgenommenen Modifikationen zur Reduzierung odor sogar Verhinderung der Bildung nadeiförmiger Strukturen führon. Es kommt darauf an, daß sich dio Modifikationen der DNA-Sequenz nie nt auf die Natur des Spaltungszentrums der Propoptidase auswirken und daß die von der Propeptidase erkannte Soquenz von Aminosäuren in der Konstruktion erhalten bleibt.

Auf der Ebene der Proteine bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das menschliche Proapo A-I als das Produkt einer Zellkultur oder eines genetisch modifizierten Mikroorganismus. Dieses menschliche Proapo A-I kann in Form eines Proapo A-I mature, in Form eines Proapo A-I mature mit vorangehendem Methioninrest, in Form eines fusionierten Proteins, wie z. B. die Proapo-A-I-Beta-Galactosidase, und in Form der Verbindung prä-Proapo A-I dargestellt werden. Das erreichte Produkt ist im wesentlichen von gewöhnlichen endogenen Proteinen und anderen Substanzen frei, die ursprünglich alle auf die natürliche Quelle (Blutplasma) des betreffenden Proteins zurückgingen. Die Zellkultur bzw. der für die Produktion verwendete Mikroorganismus ist nicht auf spezifische Zellstämme oder Organismen beschränkt: Es können sowohl die prokaryoten als auch die eurokaryoten Zellen verwendet werden, einschließlich der tieriscchen und menschlichen Zellstämme. Zur Verdeutlichung soll hier das Beispiel dor Darstellung in der Bakterie E.coil (stellvertretend für die prokaryoten Zellen) und in der Hofe sr-ccharomyces cerevlslae sowie in den mit Baculovirus infizierten Insektenzellen (stellvertretend für die eukaryoten Zellen) angeführt werden.

Auf der Ebene der Proteine bezieht sich die vorliegende Erfindung ebenfalls auf das menschliche Apo A-I, das durch die Bearbeitung des weiter oben hergestellten menschlichen Proapo A-I durch die Apo-A-I-Propeptidase erzeugt worden ist. Dieses menschliche Apo-A-I wird mit der authentischen Form des menschlichen Apo A-I mature identisch sein und keinen N-terminalen Methionin-Rest enthalten.

Auf der Ebene der Anwendung bezieht sich diese Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die das menschliche Proapo A-I und/oder das oben genannte menschliche Apo A-I umfassen und außerdem mindestens einen pharmazeutischen akzeptierbaren Träger, ein Lösungsmittel, ein Verdünnungsmittel oder einen in Übereinstimmung mit der Art der Verabreichung und den geltenden Anforderungen bei dor Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen ausgewählten Excipienten beinhalten.

In bezug auf die DNA bezieh ich diese Erfindung auf eine rekombinierende DNA-Sequenz, zu der eine Sequenz gehört, die für das menschliche Proapolipoprotein A-I kodiert. In dom menschlichen Propaolipoprotein A-I ist ein Teil der natürlichen Kodiersequenz durch ein DNA-Fragment ersetzt worden, das für die Aminosäuren kodiert, jedoch in einer unterschiedlichen Nucleotidsequenz besteht, so daß die Bildung von nadeiförmigen Strukturen eingeschränkt bzw. ganz verhindert wird. Gemäß einer bevorzugten spezifischen Form der Realisierung ist die natürliche Sequenz, die für die Aminosäuren -6 bis +14 des Proapo A-I kodiert, durch folgende Sequenz (ein einziger angegebener Strang) ersetzt worden: 5'-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTg-S' Diese Sequenz umfaßt ein zusätzliches ATG-Codon zur Initiation der Translation und modifizierte Codons für die Rückstände der Aminosäuren -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 und +14.

Im Zusammenhang mit der DNA bezieht sich diese Erfindung auch auf replizierbare Klonierungsvektoren und auf Darstellungsvektoren, die die oben genannte rekombinierende DNA-Sequenz umfassen, die für das menschlicne Proapo A-I kodiert. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die rekombinierenden Plasmide pULB9292, pULB 9296, pULB9299, pNIVH 612 und ρNiIVH 613, deren Konstruktion nachstehend beschrieben wird. Die an erster Stelle genannten Plasmide pUL9291 und pUL9292 enthalten das modifizierte Strukturgen des Proapo A-I, dem ein ATG-Codon vorausgeht und das unter der Kontrolle des Promotors P_L der Lambda-Phage steht. Diese Plasmido sind Darstellungsvektoren, die für E, coil geeignet sind und die Synthese des menschlichen Proapo A-I (mögliche Spaltung durch die Propeptidase zur Herstellung eines authentischen menschlichen Apo A-I mature) steuern.

Wird das Plasmid pULB9296 in E.coil eingeführt, steuert es die Darstellung eines fusionierten Proteins, das die Beta-Galactosidaso und das menschliche Proapo A-I unter der Kontrolle der Zone des Promotors Iac von E.coll enthalt. Da das Fusionsprodukt noch die Spaltungssequenz der Propeptidase enthälts, kann es gespalten und somit authentisches menschliches Apo A-I erzeugt werden.

Das Plnsmid pULB9299 ist ein Darstollungsvektor, dor sich für verschiedene Hefearten eignet u.io die Zonen des Promotors und dos Terminators dor Transkription dos ARQ3 zur Gewährleistung oinor wirksamen Darstellung in dor Hefe umfaßt. Das erhaltene menschliche Proapo A-I kann durch die Propoptidase gespalten werden, wodurch authentisches menschliches Apo A-I mature geliefert wird.

Das Plasmid pNIV11612 onthält das Strukturgen des Proapo A-I₁ fusioniert mit dor DNA-Sequenz dos Signalpeptids des Proteins OmpA von E.coil und unter der Kontrollo dos Promotors Ipp (Lipoprotoin) und dos Promotors-Oporator Iac. In der Konstruktion stoht die für das Signalpoptid von ompA kodoorondo Sequenz vor dor Soquonz dos Proapo A-I ohne ATG-Codon zur Initiation dor Translation. Das Plasmid ist ein für E.coil geeigneter Sokrotlonsvoktor und steuert die Synthese des menschlichen Prcapo A-I, das im Periplasma ohne N-terminales Methionin sokrotiort werden k 'nn. Das Plasmid pNIVI1613 ict ein Transfer-Vektor für die Einführung der Sequenz von DNAc dos menschlichen Proapo A-I in di η Baculovirus. Er umfaßt den Polyhedrin-Promotor des Bakulovirus und da3 Strukturgen dos Proapo A-I, einschließlich dos ATG-Codons zur Initiation dor Translation. Gomoinsam mit dem wildon Baculovirus-Stamm (Autographacalifornlca nuclear polyhedrosis virus, AcNPV), steuert das Plasmid pNIVI1613 die Synthese des Proapo A-I in don Insektenzollon und kann frei von Mothionin nach Modifikationen nach dor Translation in don Insektenzollen vorkommen.

Schließlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf Zellkulturon und Mikroorganismen, die durch einen Klonierungs- oder einen Darstellungsvektor (vgl. die oben beschriebenen Vektoren) transformiert worden sind. Sie bezieht sich außerdem auf Zellkulturen und transformierte Mikroorganismen, die in der Lage sind, das menschliche Proapo A-I zu produzieren. Der Ausdruck „transformiert", so wie er hier gebraucht worden ist, hat dio sehr weit go'faßto Bedeutung von „genetisch modifiziert" und ist auf keinen Fall auf den eng gefaßten Begriff „bakterielle Transformation" beschränkt. Je nach der Art des verwendeten Vektors und des ausgewählten Wirts kann jedes kompatible Verfahren der Gentechnik für die Durchführung der gewünschten genetischen Modifikation, einschließlich der Transfektion, der Transduktion usw. verwendet werden. Dio gemäß dor Erfindung hergestellten Zellkulturon und Mikroorganismen können für eine industriemäßige Produktion des menschlichem Proapolipoprotoins A-I vorwendet werden.

Die hidr beschriebene Erfindung ist unter anderem unter Verwendung des Stamms MM 294 des Mikroorganismus E,coll K12 (endoA thl-, hsdR, sup E) realisiert worden. Dieser Stamm ist in der American Type Culture Collection (ATCC Nr. 33625) ohne Einschränkung hinsichtlich seiner Zugänglichkeit deponiert. Es können jedoch auch verschiedene andere Stämme verwendet werden, zu denen bekannte E.coll-Stömme gehören wie E.coll B, E-collx 1776(ATCC Nr.31537, deponiert am 3. Juli 1979, ohne Einschränkung), E. coil AR58, abgeleitet von N99 (ATCC Nr. 33956), mit clll-, el 857, bio-, Delta-H-Funktionen ohne Lambda, verkauft von PL-PHARMACIA (J.E. MOTT und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, [1985), 88-92; G.DEVARE und Mitarbeiter, Cell, 36, (19841,43-49), E.coll JM101 (ATCC Nr.33876) J.MESSING und Mitarbeiter, Nucleic Acids Res.9, (1981), 309-321), odor E.coll JA221 (Ipp-, hdsM*, trpE5, louB6, lacY, recAI/F', lad⁰, lac⁺, pro*) (J.GHRAYEB und Mitarbeiter, EMBO J.3, (1984], 2437-2442) oder andere Mikrobenstämme, von denen viele in Institutionen zur Aufbewahrung von anerkannten Mikroorganismen deponiert und dort zugänglich sind, wie z. B . in der American Type Culture Collection (ATCC) -vgl. die Kataloglisten der ATCC. Zu diesen anderen Mikroorganismen gehören z. B. die Bacilli wie Bacillus subtllls und andere Enterobacteriaceae, von denen hier nur Salmonella Typhlmurlum und Serratla marcesans als Beispiele genannt seien. Dabei werden Plasmide verwendet, die repliziert werden und die heterologe Gensequenzen darstellen können. Die bei Bakterien, z. B. bei E. coil verwendbaren Darstellungsplasmide erhält man gewöhnlich aus dom als Vektor verwendeten Plasmid pBR302 (deponiert in der ATCC unter der Nr. 37017), indem man in geeigneter Art und Weise die heterologe Gensequenz gleichzeitig mit den Signalen zur Initiation und zur Beendigung der Translation in die direkte Lektürephase mit einem funktionellen Promotor einbezieht und dabei die natürlichen oder synthetisch geschaffenen Restriktionszentren ausnutzt. Der Vektor wird ein oder mehrere charakteristische Gene zur phenotypischen Selektionen und einen Replikationsursprung zur Gewährleistung der Amplifikation im Wirt tragen. Auch hier kann das hetorologo Insert so angeordnet werden, daß es gleichzeitig mit einer fusionierten prä-Sequenz, die z.B. von don Genen des lac-Systems stammen, dargestellt wird. Darstellungsvektoren für Baculovirus, z. B. pAcRPS und pAcYM 1 (Y. MATSUURA und Mitarbeiter, J. Gen. Virol. 68, [1987], 1233-1250) und den wilden Baculovirus (Autographa californlca nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) werden gegenwärtig in starkem Maße eingesetzt. Sie sind in der Literatur detailliert beschrieben und können im Prinzip bei der TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION bezogen werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann man auch verschiedene Insektenzellen als Wirt für kompatible Darstellungsvektoren verwenden, z. B. Zellen von Spodoptera fruglperda SF9 (M. D.SUMMER und G.E.SMITH. A Mamual of Methods of Baculovirus Vectors and Insect cell culture Procedures, Texas University, College. Station, (1987); ATCC CRL1711).

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann man auch verschiedene Hefestämme verwenden, die kompatible Darstellungsvektoren enthalten, wie z.B. das Plasmid yRp7 (D.T.STINCHCOMB und Mitarbeiter, Nature, 282, (1979], 39-43), das sowohl in E.coli als auch in der Hefe, insbesondere in Saccharomycee cerevisiao zur Selektion und gleichzeitig zur Replikation in der Lage ist. Folgende Hefestämme können verwendet werden; der Stamm RH219 (G. MIOZZARI und Mitarbeiter, J. Bactoriol. 134, [1967B], 48-59), deponiert bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkung (ATCC Nr.44076), der Stamm 10544c (T. CABEZON. und Mitarb. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, (1984], 6594-6598), der den Genotyp leu2-3, Ieu2-112, pep4-3 (M. HOYLAERTS und Mitarb., FEBS lett. 204, [1986], 83-87), hat, und der bradotryphe Stamm Ic 1697d (argJ, Ieu2-1) für das Arginin (ATCC Nr. 20631).

Für die Darstellung eines heterologen Gens wie das DNAc für das menschliche Proapo A-I in der Hefe muß man einen Plasmidvektor konstruieren, der vier Komponenten enthält.

Die erste Komponente ist das Fragment, das die Transformation von E. coil und der Hefe ermöglicht und das demzufolge ein von jedem Organismus stammendes Seiektionsgen besitzen muß. Das kann das für die Resistenz gegenüber Ampiciliin verantwortliche und von E. coil stammende Gen (vgl. „AmpA") und das kann das von der Hefe stammende Gen Ieu2 sein. Diese Komponente erfordert außerdem einen Replikationsursprung von jedem Organismus, um in der Plasmid-DNA in den beiden Organismen zu verbleiben. Das kann der von pBR322 stammende Ursprung von E. coil und das können der Ursprung arsl des Chromosons III der Hefe oder der Replikationsursprung der zirkulären DNA 2 μ sein.

Die zweite Plasmidkomponente ist eine in 5' gelegene Sequenz eines Hefegens, das stark dargestellt ist, damit die Transkription eines unterhalb gelegenen Strukturgenr anfordert wird. Die in 6' gelegene Sequenz kann die von den Genen TDH3 oder ARQ3 der Hefe sein. Das Fragment wird so kor.*ir 'lert, daß die Struktursequenzon von TDH3 oder ARQ3 eliminiert und durch eine Sequenz ersetzt werden, die alternativ«! nustriktlonszontron wie z. B. die Restriktionszentron Ncol oder BamHI enthält, damit die in 5' gelegene Sequenz bequem an eins Strukturgon gekoppelt werden kann.

Die dritte Komponente des Systems ist ein Strukturgen, das so konstruiert ist, daß es sowohl ein ATG-Signal zur Initiation der Translation als auch ein Signal zur Beendigung der Translation enthalt.

Die vierte Komponente ist eine DNA-Soquen: der Hefe, die die in 3' golegone Sequenz eines Hefegens mit den entsprechenden Signalen zur Beendigung der Transkription und der Polyadonylation beinhaltet. So können z. B. Plasmide konstruiert wci den, die die Produktion des menschlichen Proapo A-I in der Hefe steuern, indem man Genfragmente für das menschliche Proar o-A-l-Polypeptid in das BamHI-Zentrum des in der europäischen Patentanmeldung Nr. 151102 beschriebenen Darstellungsplasmids BamHI einfügt.

Ausführungsbeispiele

In nachfolgenden Beispielen wurden bevorzugte Vektorkonstruktionen, die gemäß der Erfindung eine rekombinierende DNA-Sequenz enthalten, die Bedingungen, unter denen diese Vektoren eingesetzt worden können, sowie Details der Erfindung beschrieben. In diesem Zusammenhang soll auf die Abbildungen verweisen werden:

- Die Abbildungen IA und B zeigen die Sequenz der Nucleotide und Aminosäuren des menschlichen prä-Proapo-A-l. Dio Nucleotidsequenz der Messenger-RNA des menschlichen prä-Proapo A-I wurde durch die Analyse der DNA-Sequenz der DNAc des Klons pULB 1609 bestimmt. Dio in dem Signalpeptid, in dem Propeptid und in dem Polypeptid Apo A-I mature vorgesehenen Aminosäuren sind auf der Grundlage des ersten Aminosäurerückstandes des Apo-A-I-Proteins aufgezeigt und numeriert. Hervorgehoben ist die Zone, die der synthetischen DNA-Sonde entspricht, die zur Isolierung des Klons verwendet wurde. Folgende Einzelbuchstaben wurden als Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren verwendet: E - Glutaminsäure, C Cystein, H - Histidin, I - Isoleucin, K- Lysin, L- Leucin, M- Methionin, N -Asparagin, P- Prolin, Q -Glutamin, R -Arginin, S Serin, T - Threonin, V - Valin, W - Tryptophan und Y - Tyrosin.

- Die Abbildung 2 ist eine schematische Darstellung eines Oligonucleotidapters für die Konstruktion eines DNA-Fragments, das für die 6 Aminosäuren des Propeptids und für die 14 Aminosäuren des Polypeptids Apo A-I mature kodiert, mit dem ATG-Codon zur Initiation. Die Pfeile zeigen auf die für die Synthetisierung des Fragments Ncol-Ball von 65/61 Basenpaaren (bp) verwendeten Oligonucleotide.

- Die Abbildung 3 zeigt die Konstruktion des Plasmids pULB9291, das die Zonen zur Regulierung von Pu Lambda und die Nucleotidsequenz des Proapo A-I trägt.

- Die Abbildung 4 zeigt die Konstruktion des Plasmids pULB9296, das den Promotor Iac von E. coil und eine mit der Sequenz des Proapo Λ-Ι fusionierte Betagalactosidasenucleotidsequenz trägt.

- Die Abbildung 5 zeigt die Konstruktin des Plasmids pULB9299, das die Zonen zur Regulierung des ARG3 der Hefe und die Nucleotidsequenz des Proapo A-I trägt.

- Die Abbildungen 6A, B und C zeigen die Konstruktion des Plasmids pNIV11612, das die Regulierungszonen Iac und läpp, die Kodiersequenz für das Signalpeptid ompA und die Nucleotidsequenz des Proapo A-I trägt.

- Die Abbildung 7 zeigt die Konstruktion des Plasmids pNIV11613, das die Zonen zur Regulierung des Polyhedringens und die Nucleotidsequenz des Proapo A-I beinhaltet.

Herstellurfg der RNA: Die Gesamt-RNA der menschlichen Leber wird durch die Gut idinchlorid-Methode (R. A. COX, Methods Enzymol. XII, part B, [1986], 120-129) hergestellt. Dieses Präparat der Gesamt-RNA wird anschließend auf einer Oligo(dT)-Zellulose-Kolonne passiert, damit man die Gesamt-PolyA⁺RNAs erhält (T.MANIATIS und Mitarb., in Molecular Cloning [Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982)). Aus 10g menschlicher Leber erhält man 200μο PolyA*RNAs.

Synthese in vitro der komplementären DNA (DNAc)

Die Reaktion zur reversen Transkription, anfangs 0,1 bis 5\ig PoIyA⁺RNAs, werden mit Oligo(dT)12-18 (etwa "\\ig; Herkunft: BOEHRINGER) eingeleitet, Anschließend wird die einsträngige DNAc zu einem Doppelstrangmolekül (DNAcds) mit dem gleichen reversen Transkriptaseenzym umgewandelt. Die DNAScds-Präparate, im allgemeinen 1 pg, werden mit der S 1-Nuclease bearbeitet, damit offene Extremitäten geschaffen werden. Dem Fachmann ist die Verfahrensweise wohlbekannt, sie ist von T. MANIATIS und Mitarb., op. cit., im Detail beschreiben worden. Anschließend wird die DNAcds durch Oligo(dC)-Extensionen nach dem von LVILLA-KOMAROFF und Mitarb, beschriebenen Verfahren (Pros. Natl. Acad. Scie. USA, 75, (1978], 3727-3731) gestreckt. Gewöhnlich bearbeitet man 100ng DNAcds mit dem terminalen Deoxynucleotidyl-Transferase-Enzym. Im allgemeinen werden den Extremitäten 3' der DNAcds-Moleküle Extensionen von einer Länge von 15 Basen hinzugefügt.

Klonierung des gestreckten DNAcds im Plasmidvektor dBR322

Die DNA des Plasmidvektors pBR322 wird durch das Enzym Pstl linearisiert und durch die Oligo(dG)-Extensionen nach der von R. M. LAWN und Mitarb, beschriebenen Methode (Nucleic Acids Res. 9, [1981), 6103-6114) gestreckt. Die mit den Oligo(dC)-Extensionen gestreckte DNAcds wird im äquimolekularen Verhältnis der durch die Oligo(dG)-Extensionen gestreckten DNA des pBR322 gemischt. Gewöhnlich werden 50μς der Mischung zur Rezirkularisation des Plasmids hybridisiert. Die Bedingungen sind dem Fachmann wohlbekannt und von R. M. LAWN und Mitarb., op. cit., detailliert beschrieben worden. Das Hybridisierungsgemisch wird anschließend zur Umwandlung der kompetenten Zellen des Stammes MM294 von E.coil, z.B. nach der von R. M. LAWN und Mitarb., op. cit., beschriebenen Methods verwendet. Mehrere Hundert Transformanten werden durch Selektion nach dem Wachstum auf Tetracyclin-Medium hergestellt, wobei die Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum durch das Plasmid pBR322 herbeigeführt worden ist. Die Transformanten wurden ebenfalls auf ihre Sensibilität gegenüber Ampicillin getestet. Die Transformanten, die eine Sensibilität aufweisen, enthalten ein Chimäre-Plasmid, da die Insertion der Fremd-DNA in den Vektor das Gen des Ampicillins inaktiviert.

Sieben der DNAc-Bank

Die E. coll-Transformenten werden mit Hilfe dar synthetiichen Oligonucleotide, die an ihrer 5'-Extremität mit ""gekennzeichnet sind und einem Fragment des Apo-A-I-Gens entsprechen, gesiebt. DIo Nucleotidsequenz des menschlichen Apo A-I ist bekannt (siehe P.CHEUNG und L.CHAN, op. cit., und J. J.SEILHAMER und Mitarb., op. clt.); es ist domzufoloo praktisch, nach dem Verfahren von N. D. SINHA und Mitarb. (Nicleic Acids Res., 12, (If) 1,4539-4657) eine Oligonucleotidsonde mit einer Lange von 22 Basen entsprechend der 5'-Extromität des Gens chemisch zu synthetisieren. Pie folgende Sequenz wurde ausgewählt: 5'-GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCg-S'. Vor seiner Verwendung in Hybridisierungsversuchen wird das synthetische Oligonucleotid an seiner 5'-Extremität mit Hilfe der Polynucleotid-Kinase von 14 (P-L Biochemicals) und von (Gamma~")ATP phosphoryliort. Die Bedingungen für die Markierung und die Hybi idisiorung sind dem Fachmann wühlbekannt und von T. MANIÄTIS und Mitarb., op. cit., und von A. BOLLEN und Mitarb. (DNA, 2, (1983], 255-264) detailliert beschrieben worden.

Konstruktion des Darstellungsplasmids Die Methoden zur Herstellung der DNA für die Isolierung von DNA-Fragmenten ebenso wie die Bedingungen zur Analyse durch Restriktionsonzyme und die Bedingungen zur' * bindung der Fragmente sind dem Fachmann sehr gut bekannt und von R. M. LAWN und Mitarb., op. cit., und T. CABE JN und Mitarb., op. cit., detailliert beschrieben worden. Sie können hier

angewendet werden.

Die Synthese der Fragmente zur Verbindung des Promotors dor Darstellungsvektoren mit der 5'-Extremität des Gens werden

nachstehend beschrieben.

Synthese des Fragments Ncol-Ba 1 -I

Auf der Abbildung 2 sind detailliert die Prii.iipien dargestellt, die der Konzentration der Oligonucleotide 35mer, 30mer, 18mor und 43mer, die in der Synthese des Fragments Ncol-Bail von 65/61 bp verwendet wurden, zugrundeliegen. Die synthetischen Fragmente 30mer und 18mer werden an ihren 5' Extremitäten mit Hilfe der Polynucleotid-Kinase von T4 (-L Biochemicals) phosphoryliert. 1 \ig jedes Oligonucleotids, einschließlich des nicht hybridisierten 35mers und des 43mers, wird 3 Minuten lang bei 95⁰C in 300 mM Natriumazetat (pH 7,0) hybridisiert und anschließend langsam auf 4⁰C gekühlt. Das Hybridisierungsgemisch wird so, wie es ist, in dem Klonierungsverfahren für die Konstruktion der Darstellungsplasmide verwendet.

Analyse der DNA-Seo.uenz Die Analyse der DNA-Sequenz wird nach der von A. M. MAXAM und W. GILBERT (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, (1977), 560-564)

und von F. SÄNGER und Mitarb. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, [1977], 5463 -5467) beschrieLianen Methode vorgenommen.

Analyse der Proteine

Bei der Fermentierung von Stämmen, die die Darstellungsplasmide des menschlichen Proapo A-I, pULB9291, pULB9292, pULB9296 und pULB9299 (Transformiert entsprechend in den Stämmen AR58 und JM101 von E. coil und in dem Stamm 10S44c von Hefe) tragen, entstehen in verschiedenen Etappen Zellrückstände mit einer optischen Dichte von 1 Einheit bei 630 nm (1 OD₆₃₀). Jede Probe wird in einem Puffer 5OmM Tr is-HCI, pH 6,8, der 2 % Natriumdodecylsulfat (DSS), 6 M Harnstoff, 10% Glycerol und 5% 2-Mercaptoäthanol enthält, suspendiert und drei Minuten lang bei Siedetemperatur erhitzt. Die Proben werden einer Elektrophorese in Polyacrylamid-uel (U. K. LAEMMLI, Nature, 227, [1970], 680-685) unterzogen. Die Gesamtproteine werden mit Coomassie-Blau entwickelt, und las synthetisierte menschliche Proapo A-I wird mit dem immunologischen Erkennungsverfahren nach EIeIc rophorese-Transfer identifiziert (vgl. A. BOLLEN und Mitarb,, op. cit.).

Konstruktion der rekombinierenden Vektoren für die Darstellung des menschlichen Proapo A-I in der Bakterie, in der Hefe und in den mit Baculovirus infizierten Insektenzellen

1. DNAc-Klon für das menschliche prä-Proapo A-I (Abbildung 1)

Mehrere Hundert Transformanten, die durch die DNAcds-Klonierung entstanden sind und der PoIyA⁺ der menschlichen Leber in der Zone Pstl von pBR322 entsprechen, werden mit Hilfe der oben beschriebenen synthetischen Sonde Apo A-122mer gesiebt. Einer der Klone gibt während des Versuchs ein intensives Hybridisierungssignal ab. Dieser mit pULB1609 bezeichnete Klon wird isoliert, und der in dem rekombinierenden Plasmid vorhandene DNA-Insort wird durch Analyse der DNA-Sequenz gekennzeichnet. Seine Länge entspricht 878 Basenpaaren (bp); er kodiert für das komplette Polypeptid prä-Proapo A-I. Aus Abbildung 1 ist zu entnehmen, daß das Monierte DNAc-Fragment in 5' und in 3' (19 bzw. 55bp) nicht kodierende Zonen, die für den Peptidvorläufer (aa-24 bis aa-7) kodierende Sequenz von 54 bp, die für das Propeptid (aa-6 bis aa-1) kodierende Sequenz von 18bp sowie die für das Apo A-I mature (aal bis aa243) kodierende und das Codon zur Beendigung djr Translation umfassende Sequenz trägt. Die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Proteinsequenz entspricht voll und ganz der fü. das prä-Proapo A-I aus dem Protein und den unabhängig isolierten DNAc-Klonen (W. C. BARKER und Mitarbeiter, Comp. Biochem. Pysiol. 57B, [1977] 309-315; japanische Patentanmeldung NR.96998/86; P.CHEUNG und L.CHAN, op. cit., und J. J.SEILHAMER und Mitarbeiter, op. cit.) gefundenen Aminosäuresequenz.

2. Konstruktion eines bakteriellen Darstellungsvektors, der die DNAc-Sequenzdes menschlichen Proapo A-I enthält: pULB9291 (Abb.2und3)

pULB9291, ein das menschliche Proapo A-I produzierendes Plasmid, wird konstruiert, indem ein von dem Klon pULB1609 stammendes Segment hinter dem regulierbaren Promotor P_L Lambda (Abb.3) plaziert wird. Die Konstruktion dieses Darstellungsplasmids erfordert die Synthese von DNA-Fragmenten, die eine Restriktionszone Ncol, ein ATG-Codon zur Initiation der Translation und die Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuren an der Aminoextremität des Strukturgens des menschlichen Proapo A-I bis zur ersten Restriktionseinzelzone Ball (Abb. 2) kodiert, enthält.

Dieser Adapter wird durch chemische Verfahren (N. D. SINHEA und Mitarb., op. cit.) synthetisier;. Man stellt vier synthetische Oligonucleotide her. Nach ihrer Hybridisierung kodieren sie für das dem ATG-Codon zur Initiation der Translation entsprechende Methionin, für die 6 dem Propeptid entsprechenden Aminosäuren und für die ersten 14 Aminosäuren des menschlichen Apo A-I

mature (Abbildung 2). Der synthetische Adapter ist so konzipiort, das die Bildung von sekundären Struktu ren an der 5'-Extremitätdes Gens auf ein Minimum reduziert wird. Um das zu realisieren, entsprechen die zur Kodierung der Rückstände der

Amlnosäuren-6,-1,1,3,4,5,6,7,10,11 und 12 selektloniertenCodone nicht den natürlichen Codonen, die man in der DNAc des Klons pULB1609 beobachtet. Der oben beschriebene synthetische Adapter wird verwendet, um ein von pULB1609 stammendes DNA-Fragment von 744 db mit

dem Promotor Pl Lambda in dem Darstellungsplasmid pULB1221 zu vorbinden.

Die Konstruktion des Darstellungsvektors pULB1221 wird in der europäischen Patentanmeldung 186.643 beschrieben. Sie

umfaßt drei grundlegende Etappen, von denen von dem Plasmid pCQV2 ausgegangen wird. Das Plasmid pCQV2 ist von

C.QUEEN in J. Mol. Appl. Genet. 2, (1983), 1-10 beschrieben worden und ist frei zugänglich. Die Auswahl dieses spezifischen Vektors ist nicht obligatorisch. Man kann jeden anderen Vektor verwenden, der einen Promotor

und unterhalb dieses Promotors ein geeignetes Zentrum ncoll besitzt. Etwa 0,1 pg der synthetischen Fragmente, wie sieobenstehend beschrieben worden sind, werden mit Hilfe der DNA-Ligase T4 an etwa 1 pg des Fragments Ba11-Pstl mit 744 bp, dievon pULB1609 stammen, und mit etwa 1 pg des Plasmidvektors pULB1221, geschnitten mit Ncol und Ball, verbunden.

Vor der Ausführung der Verbhdung ν irdo das Fragment Ba11-Pstl mit 744 bp mit der DNA-Polymeraso von T4 so bearbeitet, daß

die in 3' überragenden Extremitäten zu offenen Extremitäten umgewandelt wurden. Das Verfahren ist dem Fachmann gutbekannt und von T. MANIATIS und Mitarbeiter, opcit, detailliert beschrieben worden.

Nachdem die rekonstruierten Plasmide in den kompetenten Zellen des Stammes AR 58 von E. coil vergrößert worden sind,

werden sie durch Analyse der Restriktionszentren und durch die DNA-Sequenz der synthetischen Fragmente und der

Verbindung<uentren charakterisiert. Ein rekombinierendes Plasmid, pULP9291, genügt allen Kriterien, da es die Fragmente in

der richtigen Richtung und Reihenfolge besitzt. Es wurde für die Darstellungsuntersuchungen verwendet.

3. Konstruktion eines bakteriellen Darstellungsvektors, der die fusionierten Sequenzen enthält, die der Beta-Galactosidasb und dem menschlichen Proapo A-I entsprechen: pULB9296 (Abbildung 4)

In dieser Konstruktion wird die DNA-Sequenz, die für das menschliche Proapo A-I kodiert, in der korrekten Lektürephase unterhalb der DNA-Sequenz der Beta-Galactosidase fusioniert. Das Gen der Beta-Galactosidase ist in dem Darstellungsplasmid E. coil pUR288 (frei zugänglich: U.RUTHER und B.MÜLLER-BILL, EMBO J.2, (1983), 1791-1794) vorhanden, der einen wirksam induzierbaren Promotor Iac und geeignete Restriktionszentren in der Sequenz der Beta-Galactosidase trägt. Das geeignete rekombinierende Plasmid wird so, wie es in Abbildung 4 dargestellt wird, konstruiert.

In erster Linie wird die DNA des Plasmids pUR288 nacheinander von BamHI zerschnitten, mit DNA-Polymerase von T4 bearbeitet und erneut von Sail zerschnitten. In zweiter Linie wird ein DNA-Fragment von 805bp nacheinander durch Digestion mit Koni von pULB9291, durch Bearbeitung mit der DNA-Polymerase von T4 bearbeitet und schließlich durch Digestion mit Sail von pULB9291 isoliert. Die beiden Fiag.nente werden in molarem Verhältnis mit Hilfe der DNA-Ligase von T4 miteinander verbunden, und das dabei entstandene Plasmid wird zur Umwandlung der kompetenten Zellen des Stammes JM101 von E.coil, einem allseitig und frei zugänglichen Stamm (ATCC Nr. 33876) verwendet. Dio Transformanten werden mit Hilfe der Pestriktionsanalyse auf die richtige Ausrichtung der Sequenz des menschlichen Proapo A-I im Verhältnis zu dem Gen der Beta-Galactosidase und auf das Vorhandensein eines bei der Verbindung der beiden Sequenzen rekonstituierten Zenstrums BamHI überprüft. Dabei zeigt sich, ob die Sequenz des menschlichen Proapo A-I unterhalb der DNA-Sequenz der Beta-Galactosidase und in ier korrekten Lektürephase gut fusioniert ist. Einer der Transformanten, der das Plasmid pULB9296 enthält, genügt allen Kriterien und ist in den Darstellungsversuchen verwendet worden.

4. Konstruktion eines Plasmids zur Darstellung von Hefe als Träger der DNAc-Sequenz des menschlichen Proapo A-I: pULB9299 (Abbildung 5)

In dieser Konstruktion wurde die DNAc-Sequenz, die für das menschliche Proapo A-I kodiert, zwischen den Signalen des Promotors und des Terminators, die von einem Hefedarstellungsplasmid getragen werden, kloniert. Für diesen Versuch wurde der Hefedarstellungsvektor pRIT10774 ausgewählt. Die Konstruktion des Darstellungsplasmids ist in der europäischen Patentanmeldung 151.102 beschrieben. Es wird einerseits aus dem Plasmid pRIT10749, deponiert bei der ATCC unter der Zugangsnummer 39133 in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Abkommens von Budapest, und andererseits aus dem Trägervektor YEp 13 für E.coli-S.cerevlslae, beschrieben von J. R. BRDACH und Mitarbeiter, in: Gene, 8, (1979), 121-133, und zugänglich in der ATCC unter der Nummer 37115 k« nstruiert. Der Vektor pRIT10774 kann sowohl in E. coil als auch in der Hefe repliziert werden, er trägt den Promotor und den Tei ninator der Transkription dor Ornithin-Carbamoyl-Transferase (ARG3), die durch ein einzelnes Restriktionszentrum BAMHI getrennt sind, dau für die Insertion einer Fremd-DNA mit einem eigenen ATG-Codon zur Initiation der Translation geeignet ist. Außerdem trägt der Vektor die Sequenzen 2 μ der Hefe, metabolische Marker für die Selektion in der Hefe und den Selektionsmarker AmpA als Träger in E.coll. Er ist nicht der einzige Vektor, der für die Darstellung des menschlichen Proapo A-I in den Hefen verwendet werden kann: Jeder andere Vektor für Hefe, der Signale zur Regulierung trägt, kann benutzt werden und wird zu qualitativ vergleichbaren Ergebnissen führen. Die in Abbildung 5 dargestellte Konstruktion geht folgendermaßen vor. Die DNA des Plasmids pRIT 10774 wird mit Hilfe des Enzyms BamHI linearisiert und mit der DNA-Plymerase von T4 behandelt.

Andererseits wird ein DNA-Fragment von 810bp durch Digestion mit den Enzymen Asp718 und Sail und anschließender Beai bettung mit der DNA-Polymerase von T4 von pULB9291 isoliert. Dieses Fragment kodiert für das menschliche Proapo A-I und enthält das ATG-Codon zur Initiation der Translation. Die beiden auf die oben beschriebene Art und Weise hergestellten Fragmente werden in äquimolekularem Verhältnis mit Hilfe der DNA-Liga'a von T4 miteinander verbunden und für die Umwandlung der kompetenten Zellen von E. coil MM294 verwendet. Pia Transformanten werden durch Restriktionsanalyse kontrolliert, um die korrekte Ausrichtung der DNA-Sequenz des Proar ο A-I im Verhältnis zu der Sequenz des Promotors des arg3 zu überprüfen. Einer der Transformanten enthält ein rbkombiniereiides Plasmid, pULB9299, das dieser Bedingung genügt. Das Plasmid pULB9299 wird in E. coil vergrößert und für die Umwandlung der Sphäroplasten der Hefe Saccharomyces cerevislae. Stamm 10S44c(pep4-3, Inu2-3,leu2-112); (T.CABEZON und Mitarb., op. cit.) verwendet.

Die Verwendung des Stanmes Ic 1679d (ATCC Nr. 20631) wurde zu qualitativ vergleichbaren Ergebnissen führen. Die Hefetransformanten wurden anschließend für die Darstellung des menschlichen Proapo A-I getestet.

5. Konstruktion eines bakeriellen Sekretionsvektors, der die DNAc-Sequenz dos menschlichen Proapo A-I enthält: pNIVI1612 (Abbildungen 6 A, B und C)

In dieser Konstruktion wird die DNA-Sequenz, die für das menschliche Proapo A-I kodiert, in der korrekten Lektürephase unterhalb der DNA-Sequenz des Signalpeptids des Proteins OmpA von E.coli fusioniert. Der Sokretionsvoktor plB-lll-ompA-2 (J.GHRAYEB und Mitarb., EMBO J. 3, [19841,2437-2442) wurde für diesen Versuch ausgewählt. Dieser Vektor und sein Wirtsstamm E.coli JA221 sind auf Anfrago beim „Department of Biochemistry of the State University of New York", in Stony Brook, zugänglich.

Der Sekretionsvektor trägt einen starken Promotor Ipp (Lipoprotein), ein Fragment dos Operationspromotors Iac, die Sequenz lad dos Reprossors Iac und geeignete Restriktionszentren, die unmittelbar nach der für das Signalpeptid des Gens ompA kodierenden Sequenz angeordnet sind. Das geeignete rekombinioronde Plasmid wird entsprechend der Darstellung auf den Abbildungen 6A, B und C konstruiert. Zunächst wird der Sokrotionsvektor plN-lll-ompa-2 mit EcoRI linourisiert und mit der DNA-Polymorase von T4 bearbeitet. Dann wird oin DNA-Fragment von 805bp durch Digestion mit den nacheinander eingesetzten Restriktionsenzymen Kpnl und Sail und anschließender Behandlung mit dor DNA-Polymerase von T4 herausgeschnitten. Dieses Fragment kodiert für das menschliche Proapo A-I und enthält den ATG-Codon zur Initiation der Translation. Die beiden wie obenstehend erhaltenen Fragmente werden in äquimolekularem Verhältnis mit Hilfe der DNA-Ligase von T4 miteinander verbunden, und die Mischung wird zur Umwandlung dor kompetenten Zellen des Stammes JA221 von Ecoli vorwendet, die auf dem Medium M9 (J. H. MILLER, in: „Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laborytory, Cold Spring Harbor, New York, 1972, S.431), bestehend aus 20mg/l Tryptophan, 20mg/l Leucin, 2 g/l Lactose und 50mg/l Ampicillin, kultiviert worden sind. Die Transformationen werden nach Ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin ausgewählt und mit einem synthetischen 18-mer-Oligonuclootid (dasselbe, das in der Synthese des Adaptors verwendet worden ist; vgl. Abbildung 2) gesiebt.

Die ausgewählten Transformanten worden durch Restriktionsanalyse kontrolliert, um die korrekte Ausrichtung der DNA-Sequenz des Proapo A-I im Verhältnis zu der von dem Sekretionsvektor (bei der Verbindung der beiden Sequenzen rekonstituiertes Zontrum EcorRI) getragenen Signalpeptidsequenz zu überprüfen. Einer der Transformatoren trägt ein rekombinierendes Plasmid, das dieser Bedingung genügt. Die überschüssige Sequenz, die von der in der folgenden Nucleotidsoquonz hervorgehobenen Konstruktion mit dem Adapter stammt.

5' GTAGCG GAG GCC QCT GAA TTC VTG AGA CAT TTC TGG 3' VaI Ala Gin Ala Ala GIu Phe Met Arg His Phe Trp aa-ti wird durch gesteuerte Mutagenese eliminiert. Zu diesem Zweck wird das folgende 24-mer-Oligonucleotid synthetisiert

Signalpeptid-> <— Proapo A-I

5' GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG 3'

VaI Ala Gin AIa Arg His Phe Trp

das von den zwölf überschüssigen Basen frei ist und das man verwendet, um die von dem Adapter stammendo überschüssige Sequenz mit 12 Basen zu eliminieren.

Für die Mutageneso verwendet man das Amersham-Systom. Dieses System basiert auf der Methode von F. ECKSTEIN und Mitarb. (Nucleic Acids Rs. 13, [1985], 8765-8785). Diese Methode gewährleistet eine hohe Ausbeute und den höchstmöglichen Wirkungsgrad: 95%.

Zunächst wird die zu mutagenisiorende DNA-Zone in einem Vektor M13 kloniert. Zu diesem Zwecke wird das DNA-Fragment Xbal-Ball des rekombinierenden Plasmids plN-llompA-2, das das Gen des Proapo A-I trägt, in den durch Xbal und Hindll zerschnittenen Vektor M13mp19 eingefügt. Der Vektor M13mp19 ist im Handel erhältlich; man kann ihn bei Amersham (Buckingshamshire, Großbritannien) erwerben. Danach wird das 24mer-Oligonucleotid-Mutagen mit der Einkettenmatrix hybridisiert und durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase in Anwesenheit von DNA-Ligase von T4 verlängert, um einen Heteroduplex-Mutanten zu produzieren.

Die selektive Elinimiorung des nicht mutierenden Stranges wird durch die Einbeziehung eines Thionucleotids in den mutierenden Strang während der Synthese In vitro und durch die Spaltung durch NCiI des nicht phosphorothionatierten Stranges ermöglicht. Derartige Spaltungen führen zu Zentren für die Exonucloase III, die den nicht mutierenden Strang degerieren. Der mutierende Strang wird also als Metrix für die Rekonstruktion des doppelsträngigen Zirkularmoleküls verwendet, wodurch ein mutierendes Homoduplex-Molokül geschaffen wird. Die Mutagenese wird durch die Sequenzanalyse d6r Verbindung zwischen dem Signalpeptid und dem Beginn des Gens dos Proapo A-I überprüft. Das rekombinierendo l'lasmid pNIVI1612 wird rekonstruiert, indem man das Fragment Xbal-Hlndlll des Vektors pUN-ll-ompA-2 mit dem Fragment Xbal-Ball, das von den 12 überschüssigen Basen befroit worden ist, und mit dem Fragment Ball-Hlndlli des Gens dos Proapo A-I verbindet.

Die drei Fragmente werden mit Hilfe der DNA-Ligase von T4 verbunden, und das Gemisch wird zur Umwandlung der kompetenten Zellen von E. coil Ja221 entsprechend der oben gegebenen Beschreibung verwendet. Die Transformanton worden nach ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin selektiert und mit dem oben genannten 18mer-Oligonuclootid gesiebt. Einer der Transformanten trägt ein rekombinierendes Plasmid pNIVI1612. In der Endkonstruktion steht die für das Signalpeptid ompA kodierende Sequenz vor der kompletten Proapo-A-I-Sequenz ohne ATG Codon (Abbildungen 6A, Bund C). Die Transformanten E. coil werden anschließend für die Darstellung des menschlichen Proapo A-I getestet.

6. Konstrukti jn eines Transfer-Vektors für die Einführung der DNAc-Sequonz dos menschlichen Proopo A-I In don Baculovirus: pNIVI1613{Abb,7)

Das die DNA-Sequenz des Proapo A-I tragenden Plasmlds pNIVI1613 wird konstruiert, Indem man ein von dem Klon pULB9291 stammendes Segment unterhalb des Promotors des Polyhodringons dos Baculovirus plaziert (Abbildung 7). In diesen Vorsuchen vorwendet man den Transfer-Vektor pAcRP6 dos Baculovirus (Y. MATSUURA und Mitarb., J. Gen. Virol. 67, (19861,1515-1529) man erhält ihn vom „Department of Microbiology and Immunology" der Universität von Ottawa. Das Plasmid trägt don Promotor dos Polyhedringens bis zu dem Nucleotid -7 in >Ί jr Führungssoquonz in 5'; Hirn fohlt das ATG-Codon des Polyhyyodrins und die 170 erstem Nucleotide der für das Polyhedrin kodierenden Soquonz. Ein goc ignotes Zentrum BamHI wird unterhalb dos Nucleotide -7 lokalisiert. Die auf Abbildung 7 dargestellte Konstruktion wird auf folgende Art und Weise realisiert. Die DNA dos Plasmide pAcRPÖ wird mit Hilfo von BamHI linearisiert. Außerdem wird ein DNA-Fragmont von 810bp djrch Digestion mit den Restriktionsenzymen Asp718 und Sail aus pULB9291 ausgeschnitten. Dieses Fragment kodiert für das menschliche Proapo A-I und enthält das ATG-Codon zur Initiation der Translat'on. Die beiden Fragmente worden in äquimolekularom Verhältnis zusammen mit DNA-Polymerase von T4 bearbeitet, mit Hilfe der DNA-Ligase von T4 verbunden und für die Umwandlung der kompetenten Zellen dos Stammes AR58 von E. coil verwendet. Die Transformanton werden nach ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin selektiert, niv Hilfe oinos mit"" markierten synthetischen 35mer-Oligonuclootids (vgl. Abbildung 2), das einem Teil der DNA-Soquenz des Proapo A-I entspricht, gesiebt und durch Restriktionsanalyse zur Überprüfung dor korrekten Ausrichtung der DNA-Sequenz des Proapo A-I im Verhältnis zum Promotor des Polyhedringens kontrolliert. Einer der Transformanten trägt ein rekombinierendes P.ismid, pNIVI1613, das dieser Bedingung genügt. Es wurdo in den Darstellungsversuchen verwendet.

7. Produktion dos menschlichen Proapo A-I für die transformierten Mikroorganismen

Es werden Kulturen von 20ml des Stammes AR58 oder JM101 von E, coil, die durch pULB9291 bzw. pULB9296 transformiert worden sind, in reichem und mit 50Mg/ml Ampicillin versetztem Medium (Nährbouillon LB, vgl. T. MANIATIS und Mitarb., op. cit., für die experimentellen Details) kultiviert, bis die optische Dichte 0,6 bei 630nm erreicht ist. Im Falle von pULB9291 wird die Induktion des Promotors P_L Lambda realisiert, indem die anfänglichen Wachstumsbedingungen der Kultur von 3O⁰C auf 42°C angehoben und damit 'Jer Respressor dos Promotors P₁ Lambda inaktiviert wird (M. ROSENBERG und Mitarb., Methods Enzymol. 101, [1983] 123-138). Die Induktion wird 20 Minuten lang durchgeführt.

Im Falle von pULB9296 wird die Induktion des Promotors Iac realisiert, indem man der bei 37"C gehaltenen Kultur den chemischen Induktor IPTG (Isopropyl-Beta-D-Thiogalactosid) zusetzt, bis eine Endkonzentration von 1 mM erreicht is' (R. LORENZETTI und Mitarb., op. cit.). Die Induktion wird 60 Minuten lang durchgeführt.

Andererseits werden durch pULB9299 transformierte Kulturen von 20ml Hefezellen 10S44c bei 30°C in azotiertem und mit Glukose (1 %) versetztem Basismedium für Hefe (Difco) kultiviert, bis dio optische Dichte 0,3 bis 620 nm erreicht ist. Es wird kein Induktor benötigt, da die Darstellung in diesem spezifischen Fall konstitutiv ist.

Man entnimmt den oben beschriebenen Kulturen Proben von 1 ml und zentrifugiert sie 5 Minuten lang bei 15000g. Die entstandenden Rückstände werden wie folgt in siedendem Natrium-Dodecylsulfat (DSS) gelöst. Die Rückstände werden in 50μΙ Pufferlösung der Probe in Suspension gebracht; der Puffer enthält DSS (5OmM Tris-HCI, pH 6,8,2% DSS, 6M Harnstoff, 5% 2-Mercaptoäthynolund 10% Glycerol) und wird 3 Minuten lang bei 100°C erhitzt. Die Extrakte werden anschließend 10 Minuten lang bei 15000g zentrifugiert. Damit sind die Proben für die Analyse durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese bei 15% oder 7,5% in Anwesenheit von DSS unter denaturierenden Bedingungen (U. K. LAEMMLI, op. cit.) bereit.

Nach der Elektrophorese werden die Polyacrylgele kurz mit 40ml destilliertem Wassor und mit 40ml Natriumphosphatpuffer 5OmM mit einem pH-Wert 7,5 gewaschen. Die Proteine werden anschließend elektrisch während einer Zeit von 2 Stunden bei 60 V und 1,5 A im gleichen Phosphatpuffer aus den Gelen auf Nitrozellulose-Blätter transferiert (T. CABEZON und Mitarb., op. cit.). Die Nitrozelluloseblätter werden mit Albumin (1 %) in 5OmM Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,5 gesättigt und anschließend bei Umgebungstempo. atur eine Nacht lang in Anwesenheit von Kaninchenserum (menschliches Anti-Apo A-I) bei einer Verdünnung von 1/500 (und von monoclonalen Antibeta-Galactosidase-Antikörpern der Maus im Falle von pULB9296) in dem gleichen albuminfreien Puffer inkubiert.

Die Blätter werden 5mal mit 40ml des gleichen Phosphatpuffors gewaschen und anschließend in 40ml Phosphatpuffer, der 10Mg/ml Kaninchen-Antikörper-toder Maus-Antikörper-)Serum enthält, inkubiert und mit der Peroxydase markiert. Nach vier Stunden Inkubation bei Umgebungstemperatur werden die Blätter erneut 5mal in 40ml Phosphatpuffer gewaschen und schließlich durch dio Zugabe von 50ml einer Lösung eines chromogenen Substrats (10mg Diaminobenzidin, 100μΙ Harnstoffperoxyd bei 10% und 10OmM Tris-HCI mit einem pH-Wert 7,6) entwickelt.

Im Falle von pULB9291 und von pULB9299 findet man ein einzelnes Produkt, das mit den Antikörpern des menschlichen Anti-Apo A-I roagiert. Es hat ein Molekulargewicht, das dom eines Vergleichsmusters von natürlichem Apo A-I entspricht. Im Falle von pULB9296 findet man bei der die Summe der Beta-Galactosidase-Polypeptide und das Proapo A-I (144 kDA) vorgesehenen Dimension ein fusioniertes Polypeptid, das mit dem menschlichen Anti-Apo-A-I-Serum und mit dem Anti-Beta-Galaetosidase-Serum reagiert. Diese Dimensionen sind vorher mit Hilfe einer Eichkurve bestimmt worden, die auf der Migration von auf den gleichen Gelen wie die Zellextrakte plazierten Mustermolekulargewichten basiert. In einem anderen Versuch werden Kulturen von 20ml des durch pNIVI1612 transformierten Stammes JA221 von E.coll in reichem und mit 50μg/ml Ampicillin versetzten Medium (Nährbouillon LB, vgl. T. MANIATIS und Mitarb,, op. cit.) so lange kultiviert, bis die optische Dichte 0,6 bis 630 erreicht. Die Induktion des Promotors Iac wird vorgenommen, indem man der bei 37⁰C inkubierten Kultur den chemischen Induktor IPTG (Isopropyl-Beta-D-Thiogalactosid) zusetzt, bis die Endkonzentration 2mM beträgt. Die Induktion wird 60 Minuten lang fortgesetzt. Den Kulturen werden Proben von 1 ml entnommen, anschließend wird bei 15000g 5 Minuten lang zentrifugiert. Die erhaltenen Rückstände werden einem leichten osmotischen Schock ausgesetzt, um die Periplasma-Fraktion freizusetzen (D. KOSHLAND und D. BUTSTEIN, Cell, 20, (1980), 747-760). Die freigesetzte Fraktion wird in dem Probenpuffer, der das oben genannte DSS, jedoch keinen Harnstoff enthält, in Suspension gebracht, bis zum Siedepunkt erhitzt, zentrifugiert und einer Elektrophorese auf Polyacrylamid-Gel bei 12,5% und in Anwesenheit von DSS mit anschließender Immunbestimmung nach elektrophoretischem Transfer unterzogen. Eine Fraktion des synthetisierten Proapo A-I wurde in dor Zelle und nicht im Periplasma aufgefunden. Das ist entweder auf die Tatsache zurückzuführen, daß kein Proapo A-I sekretiert worden ist, oder es liegt daran, daß der osmotische Schock nicht optimal war. Die Haup fraktion des Proapo A-I wurde nach dem osmotischen Schock im Medium freigesetzt, was darauf deutet, daß das Protein ir den Zellen gut sekretiert worden ist.

8. Produktion des menschlichen Proapo A-I durch von Baculovirus Infizierte Insektenzollen

Das rekombinierende Plasmid pNIVI1613 wird zusammen mit dem wilden Boculovirua-Stamm verwendet, um die Zollen von Spodoptora Iruglperda in Kultur zu kolnfizieren. Das Aussondern der rekomblniero (lon Viren ohne Polyhodrin liefert rekombinierende Zonen. Der rekombinierende, aus einer Zono durch Säuberung yowonnone Virus wird für die Infizierung dor Insektenzellen ^erwondet. Das Verfahren ist dem Fachmann gut bekannt und von M. D.SUMMERS und G,E.SMITH in: „A Manual of Methode for Baculovirus Vectors and Insect cell culture Procedures, Toxas University, Collogo Station, (1987)" detailliert beschrieben worden. Der rekombinierende Virus wurde für die Produktion von Proapo A-I immunologisch noch Eloktrophorof d-Transfer und durch Elektrophorese auf Polyacrylamld-Gel bei 12,5% in Anwosonhoit von DSS nach Lysis dor Zellen mit Hil.o des Puffers RIPA (0,05 Puffer Tris-HCI, pH 7,2 mit einem Gehalt von 0,15 M NaCI, 1 % Triton X100,0,1 % DSS, 0,1 % Natriumdosoxycholat und 1 niM Phonylmothylsulfonylflorid (FPMS]) und nach Behandlung mit siedondem DSS getostet. Es wurdo ein einziges Produkt gefunden, das mit den Antikörpern dos monschlk hen Anti-Apo A-I reagierte. Es hat ein Molekulargewicht, das mit dem einer Vorgleichsprobe von natürl chom Apo λ-Ι entspricht, und das dargestellte Protoin bildet den Hauptbestandteil der Gesamtproteine, Die Konzentration mit Proapo A-I pro Liter Nährmedium, gemessen durch einfache radiale Immundiffusion (G. MANCINI und Mitarb., Immunochem. 2, (1965), 235-254) wird auf etwa 100mg geschätzt.

9. Zytoplasmische Produktion des menschlichen Proapo A-I in E. coil Verwendung eines definierten Minimalmediums Das Plasmid pULB9292 wurde für die zytoplasmische Produktion des menschlichen Proapo A-I durch E.coll in einem Minimalmedium verwendet. pULB9292 wird konstruiert, indem man das Fragment EcoRI-Ncol des Plasmids pULB9291, der für den Promotor P₁. Lambda kodiert, mit dem gleichen Fragment EcoRINcol des Plasmids pOTS vertauscht (M.ROSENBERG und Mitarb., Methods Enzymol. 101, (1983|, 123-138). Das Fragment EcoRI-Ncol des Voktors pÜTS (G. DEVARE und Mitarb., Cell, 36, [19841,43-49) enthält auch den wirksamen und regulierbaren Promotor Pl der Lambdo-Phage. Auf einem definierten Minimalmedium läßt man Kulturen von 20ml des mit pULB9292 transformierten Stammes AR58 von E. coil wachsen. Das Minimalmedium hat folgende Zusammensetzung (pro Liter): 3g Na₂HPO₄ · 2H₂0,3g KH₂PO₄,0,5g NaCI, 1 g NH₄CI, 1,37niM MgSO₄' 7H₂0,29,5μΜ FeCI₃ - 6H₂0,10g Glukose, 1 mg Vitamin B1,50mg Ampicillin, Nährbouillon LB 1/20 (v/v). Die Zollen werden in dem Minimalmedium kultiviert, bis die optische Dichte 0,5 bei 630 nm beträgt. Die Induktion dos Promotors Pl Lambda wird vorgenommen, indem man die anfänglichen Wachstumsbedingungen der Kultur von 30°C auf 42⁰C erhöht, so daß der Reprossor des Promotors P₁ Lambda inaktiviert wird (M. ROSENBERG und Mitarbeiter, op. cit.). Die Induktion wird 60 Minuten lang fortgesetzt. Den Kulturen werden Proben von 1 ml entnommen, die man in der French-Presse passiert und bei 15000g5 Minuten lang zentrifugiert. Das gesamte Zellextrakt, das man dabei erhält, oder der Rückstand werden mit DSS bei Siedetemperatur behandelt, so wie in Abschnitt 7 beschrieben worden ist. Nach Elektrophorese und clektrophoretischom Transfer findet man ein einziges Produkt, das mit den Antikörpern des menschlichen Anti-Apo A-I reagiert. Es hat ein Molekulargewicht, das mit dem eines Vergleichsmustors von natürlichem Apo A-I übereinstimmt. Der in aem definierton Minimalmedium dargestellte Gehalt an Proapolipoprotein A-I stellt 13,5% der Gosamlproteino dar, was einer Konzentration entspricht, die für das Proapo A-I auf etwa 270mg pro Liter Nährmedium angenommen wird.

10. Isolierung, Reinigung und Charakterisieiung des durch die transformierten Mikroorganismen «zeugten menschlichen Proapo A-I

10.1. Isolierung und Reinigung

Die Rohextrakte des rekombinierenden Proapo A-I werden 15 Minuten lang bei 4000g zentrifugiert, der Rückstand wird herausgenommen. Was obenauf schwimmt, wird 2 Stunden lang bei 100000g zentrifugiert. Der erhaltene Rückstand wird in einer minimalen Menge eines Puffers (TEN100), der aus 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5; 1 mM d.EDTA, 10OmM NaCI; 1,75pg/ml FPMS und 100 pg/mlNatriummerthiolat (Natriumsalz der Äthylmercuri-Thiosalicyl-Säure) besteht, in Suspension gebracht, und die Suspension sowie das, was obenauf schwimmt, werden getrennt mit Hilfe des gleichen Puffers auf das Anfangsvolumen des Extrakts eingestellt. Anschließend wird das Protoin aus den beiden Suspensionen ausgefällt, indem man steigende Isopropylalkohol-Konzentrationen verwendet. Man bestimmt die radiale Immundiffusion (G. MANCINI und Mitarb., op. cit.), indem man ein kommerzielles Vergleichsmuster verwendet, wobei die ausgefällte Proteinfraktion jeder Suspension, die den größten Teil der Immunreaktivität enthält, dem menschlichen Apo A-I entspricht. Jede auf diese Art und Weise hergestellte Fraktion wird durch Chromatographie auf einer Kolonne Sephacryl S200 gereinigt, wobei der glelcho Puffer als Eluierungsmittel verwendet wird. Man nimmt Fraktionen von 0,9ml ab und bestimmt in jeder Fraktion durch radiale Limundiffuslon die Gesamtmenge von Protein, das eine Immunreaktivität besitzt, die der des Apo A-I entsprK ht. Das Molekulargewicht dos in den Fraktionen eluierten Proteins wird durch Eichung der Kolonne mit Eichnormalen für das Molekulargewicht, wie sie für die Aldolase, das Rinderserumalbumin, das Ovalbu.nin, das Chymotrypsinogen und das Cytochrom C bekannt sind, unter gleichen Bedingungen ermittelt. Die Reinheit des Proapo A-I pro mg Gesamtprotein in den rekcmbinierendes Proapo A-I enthaltenden Hauptfraktionen, ausgedrückt in mg Protein, das die gleiche Immunreaktivität wie ein kommerzielles Etalon Apo A-I enthält, wird mit 95% angenommen.

10.2. Charakterisierung

10.2.1. Physikalische Eigenschaften des rekombiniorenden Proapo A-I

Führt man mit dem gereinigten und isolierten rekombinierten Proapo A-I des obenauf schwimmenden Rückstandes und des bei

der Zentrifugiorung bei 100000g entstandenen Rückstandes eine isoelektrische Fokussierung nach dem Verfahren von

N. CATSIMPOOLAS (Anal. Biochem. 26, (1969), 54-62) durch und wendet man dabei einen autogenerierten pH-Gradienten vor> 4

auf 6 an, erhält man ein einzelnes Band mit einem isoelektrischen Punkt, der bei 4,95 angenommen wird. Das plasmatisci.cmenschliche Apo A-I erscheint etwas sauer und hat einen mit 4,75 angenommenen isoelektrischen Punkt. Diese Differenz von0,2 Einheiten für den pH-Wert zwischen den Werten der isoelektrischen Punkte des rekombinierenden Proapo A-I und demplasmatischen Apo A-I stimmt gut mit der bekannten Differenz zwischen den Werten der isoelektrischen Punkte des

Plasmatischen Apo A-I und plasmatischen Proapo A-I überein, die mit 0,17 angegeben worden ist (G. L. MILLS und Mitarb., Lab. Techn. Biochem. Mol. Biol. 14, (1984), 244-245).

In bezug auf das Molokulargowlcht bestehen das rekomblnierendo Proapo A-I sowohl dos Rückstandes als auch des obenauf schwimmendon Rückstandes In einer einzigen Polypeptldkotto, die identische Molekulargewichte von 29,9 ± 1,4 kDa aufwoisen. Das plasmatische menschliche Apo A-I erschoint etwas kleinor, sein Molekulargewicht botrögt 29,3 ± 1,3kDa.

10.2,2. Aufstellen oinor Poptidkarte dos rokombiniorondon Proapo A-1 mit Hilfe von BNPS-Skatol

Die chomischo Aufspaltung wurde mit Hilfe von 3Bromo-3-mothyl-2-((-nltrophenyl)thlol)-3H-indol (BNPS-Skatol) gomäß dom Verfahron von A.FONTANA (Mothcds Enzymol. 25. |1972|, 419-423) vorgonommen. Man löst 5 bis 10Mg der Präparate

gereinigten Protoins in 100μΙ einor Lösung mit 0,15% (v/v) Phenol in einer wfißrlgon Lösung mit 50% (v/v) Essigsäure.

Anschließend gibt man 5Ol einor Lösung von 4,8mg BNPS-Skatol pro ml elskaltor Essigsäure und inkubiort 72 Stunden lang boi

25⁰C. Danach gibt man 50μΙ 2-Morcaptoäthanol hinzu und inkubiort ein orneutes Mal 5 Stunden lang bei 37¹C. Die Probonwerdon verdampft, erneut in 100μΙ Wassor golöst und 3mal durch 200μΙ Äthylazotat oxtrahiert. Die organischen Phasen wordenhorausgonommon, die wäßrigen Phason wordon lyophiüsiert und durch Elektrophorese auf Polyacrylamid-DSS-Golanalysiert.

Im Falle einor chemischen Aufspaltung durch BNPS-Skatol können dio Größo und dio Zahl dor von dom Apo A-I stammondon Fragmente mohr odor wonigor genau vo.hergesagt werden, da untor den vorwendeten Versuchsbodingungen das BNPS-Skatol

selektiv nach den Trypthophan-Rückstöndon zerschneidet. Nimmt man in jedem Spaltzontrum eine Wirksamkeit von 100% an,so ist das größte Fragment, das man erwarten kann, einC-termlnalesFragmontvon 15,4 kDa. Dio Molekulargewichte derverbleibenden Fragmente liegen zwir ion 0,5 und 5,3kDa, sie sind also zu kloin, um registriert zu werden.

Im Falle einer inkompletten Aufspaltung wird das Fragment von 15,4kDa in Richtung der N-torminalon Extremität „vorlängort",

wobei Fragmente von 20,7kDo, 23,1 kDa und 27,6kDa gebildet werdon. Diese vouusgesohenon Werte wordon für dasmenschliche plasmatische Apo A-I ebonso wie für die vorschiodenon gereinigten Präparate des rekombinierendon Proapo A-Isehr gut realisiert.

Claims (13)

1. Rokombinierende DNA-Sequei ι, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Sequenz umfaßt, die für das menschliche Proapollpoprotein A-I kodiert, In der ein Teil der natürlichen Kodiersequenz durch ein DNA-Fragment ersetzt worden ist, das für die gleichen Aminosäuren kodiert, jodoch in einer unterschiedlichen Nucleotidsoquenz bosteht, so daß die Bildung von nadeiförmigen Strukturen eingeschränkt bzw. verhindert werden kann.

2. Rekombiniorendo DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die natürliche Sequenz, die für die Aminosäuren -6 bis +14 des Proapolipoproteins A-I kodiert, durch folgende Sequenz (ein einziger angegebener Strang) ersetzt worden ist:

5' ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGASTTAAGGACTTG-3 Die genannte Sequenz umfaßt ein zusätzliches ATG-Codon zur Initiation der Translation und modifilierte Codone für die Rückstände der Aminosäuren -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, + 11 und+14.

3. Repliziorbarer Klonierungsvoktor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine rekombinierende DNA-Sequenz gemäß dem Anspruch 1 oder 2 enthält.

4. Darstellungsvoktor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine rokombinierbare DNA-Sequenz gemäß dem Anspruch 1 oder 2 enthält, die operativ mit einer regulierenden und von Signalen zur Initiation und zur Beendigung der Translation umgebenden DNA-Sequenz verbunden ist.

5. Darstellungsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die regulierende DNA-Sequenz eine Zone des Promotors P der Lambda-Phage umfaßt.

6. Darstellungsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz des menschlichen Proapolipoproteins A-I unterhalb der DNA-Sequenz der Beta-Galactosidase fusioniert worden ist und daß die regulierende DNA-Sequenz die Zone des Promotors Iac umfaßt.

7. Darstellungsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die regulierende DNA-Sequenz die Zone des Promotors und des Terminators der Transkription des ARG3 der Hefe umfaßt.

8. Darstellungsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz des menschlichen Proapolipoproteins, das kein ATG-Codon besitzt, unterhalb der DNA-Sequenz des Signalpeptids des Proteins OmpA von E. coil fusioniert ist und daß die regulierende DNA-Sequenz die Zonen des Promotors Ipp und des Operationspromotors Iac umfaßt.

9. Darstellungsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die regulierende DNA-Sequenz die Zone des Promotors des Baculoviruspolyhedringens umfaßt.

10. Rekombinierendes Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der aus pULB9291, pULB9292, pULB9296, pULB9299, pNIVI1612 und pNIVI1613 bestehenden Gruppe ausgewählt worden ist.

11. Zellkulturen oder transformierte Mikroorganismen mit einem Darstellungsvektor nach einem der Ansprüche 4 bis 9.

12. Zellkulturen oder transformierte Mikroorganismen mit einem rekombinierendem Plasmis gemäß Anspruch 10.

13. Verfahren zur Herstellung des menschlichen Proapolipoproteins A-I, dadurch gekennzeichnet, daß man unter geeigneten Kulturbedingungen eine Zelle oder einen transformierten Mikroorganismus gemäß dem Anspruch 11 oder 12 kultiviert und daß man das so erzeugte menschliche Proapolipoprotein A-I gewinnt.