DE69210733T2

DE69210733T2 - Analoga von menschlichem Wachstumshormon und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE69210733T2
Application number: DE69210733T
Authority: DE
Inventors: Susanna Campagnoli; Giuliano Galli; Guido Grandi; Y Ros Immaculada Margarit
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1991-09-27
Filing date: 1992-09-25
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2012-09-26
Also published as: DE69210733D1; EP0534568B1; EP0534568A2; EP0534568A3; JPH05310794A; IT1251895B; ITMI912582A1; ES2087434T3; DK0534568T3; ITMI912582A0; ATE138098T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Mutanten von menschlichem Wachstumshormon, Mittel und Methoden zu deren Herstellung und deren Verwendung im therapeutischen Bereich.
Das menschliche Wachstumshormon (hGH) wird während der gesamten Lebenszeit eines Menschen und in einer größeren Menge in der Pubertät in der Hypophyse sekretiert. In seiner reifen Form besteht es aus einer einzigen Polypeptidkette aus 191 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von etwa 22.000 Dalton.
Das menschliche Wachstumshormon ist durch eine vielfältige biologische Aktivität gekennzeichnet.
Seine Haupteigenschaft ist jedoch die Wachstumsförderung des menschlichen Körpers (Skelett, Bindegewebe, Muskeln und Eingeweide wie Leber, Darm und Nieren). Das menschliche Wachstumshormon erfüllt seine Tätigkeit durch Wechselwirkung mit spezifischen, in der Zellmembran vorhandenen Rezeptoren.
Bis vor kurzem war die einzige Hormonquelle die aus Leichen extrahierte menschliche Hypophyse, da Wachstumshormone tierischen Ursprungs keine signifikante biologische Aktivität auf den Menschen ausüben.
Die geringe Verfügbarkeit dieses Hormons hat daher seine Anwendung auf die Behandlung von Dysfunktionen der Hypophyse beschränkt, obgleich seine Wirksamkeit in der Behandlung von Krankheits zuständen wie Verbrennungen, Dystrophie, Pseudoarthrose und Knochenbrüchen unter Beweis gestellt wurde.
Mit der Entwicklung der rekombinanten DNA-Techniken war es möglich, das menschliche Wachstumshormon in besser geeigneten Größenördnungen durch Züchtungsverfahren unter Verwendung von Mikroorganismen, die durch einen Vektor mit dem für dieses Hormon codierenden Gen transformiert wurden, herzustellen.
Im speziellen wurden Verfahren entwickelt, welche proteolytische Enzyme mit Schnittspezifität zur Abtrennung von N- oder C-endständigen Peptidverlängerungen, welche an das hGH durch Genmanipulation angehängt worden waren, verwendeten.
Beispielsweise beschreibt die Patentanmeldung EP 321 940 ein Verfahren, in welchem das reife menschliche Wachstumshormon (191 Aminosäuren) als ein an seinem N-endständigen Aminosäurerest (Phe) an das Nonapeptid mit der Sequenz Met-Glu-Glu-Leu- Met-Ile-Glu-Gly-Arg- fusioniertes Produkt (Precursor) exprimiert ist, was den Zweck hat, die Reinigung dieses Produktes zu erleichtern und seine Löslichkeit zu verbessern, wenn es in B.subtilis-Zellen exprimiert wird.
Das Verfahren umfaßt das Abtrennen dieses Nonapeptids durch enzymatisches Schneiden mit dem Enzym Faktor Xa. Obwohl die Schnittspezifität hoch ist, vor allem weil die Sequenz Ile- Glu-Gly-Arg-hGH erkannt und die Peptidbindung zwischen Arg und Phe (erste hGH-Aminosäure) hydrolysiert wird, zeigt die elektrophoretische Analyse des Hydrolyseprodukts neben dem reifen Hormon das Auftreten von zwei anderen Proteinverbingungen.
Diese Verbindungen, welche 5-10 % des Gesamtproteins ausmachen können, wenn die Hydrolysereaktion bis zur Erzielung einer 50 %igen Umwandlung des Precursors in das Hormon ausgeführt wird, müssen der Hydrolyse der Peptidbindung zwischen Arg 134 und Thr 135 durch den Faktor Xa zugeschrieben werden.
Die Tatsache, daß der Verdau des Precursors mit Faktor Xa unterbrochen wird, wenn eine etwa 50 %ige Hydrolyse erreicht ist, und der Bedarf an weiteren Reinigungstufen zur vollständigen Abtrennung des hGH von den Enzymabbauprodukten bedeutet, daß die endgültige Ausbeute an reifem hGH gering ist.
Es ist auch - wie im Falle von Polypeptiden generell - bekannt, daß das hGH bei oraler oder intravenöser Verabreichung durch die im Gastrointestinaltrakt und im Blut vorhandenen proteolytischen Enzyme abgebaut wird, welche es rasch zu Oligopeptiden mit keiner oder nur verminderter biologischer Aktivität hydrolysieren.
Beispielsweise hydrolysiert die Blutprotease Plasmin das menschliche Wachstumshormon bei Arg 134 unter Ausbildung von zwei Fragmenten 1-134 und 141-191 mit verminderter biologischer Aktivität (0,3-14 %) im Vergleich mit dern natürlichen (nichthydrolysierten) hGH [Li C.H. und Beweley (PNAS, 73:1476-1479, 1976)].
Die in vivo-Zerstörung des menschlichen Wachstumshormons vermindert daher die verfügbare hGH-Menge und erfordert demnach die Verabreichung von großen Tagesdosen dieses Hormons.
Es wurde nun gefunden, diese Nachteile durch Herstellung von hGH-Mutanten überwinden zu können.
Im spezielleren hat die Anmelderin entsprechend den Lehren der vorliegenden Erfindung gefunden, daß durch Ersetzen des Argininaminosäurerestes in Position 134 der Aminosäuresequenz des natürlichen menschlichen Wachstumshormons durch einen anderen Aminosäurerest hGH-Mutanten erhalten werden, welche gegenüber einem Enzymabbau ohne Änderung ihrer biologischen Aktivität stabil sind.
Diese Substituierungen können durch Mutagenisieren des Gens, das für das hGH codiert, durch das ortsspezifische Mutageneseverfahren durchgeführt werden.
Trotz des Potentials dieser Technik, Produkte mit speziellen Eigenschaften zu schaffen, beschränken verschiedene Faktoren die generelle Verwendung von ortsspezifischen Mutagenesemethoden.
Diese Beschränkungen sind auf unzureichende Kenntnis der Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität in Polypeptiden und ihrer Aktionsmechanismen zurückzuführen, sodaß die Wirkung der Veränderung der Aminosäurensequenz nicht vorhergesagt und in physikochemischen und funktionellen Eigenschaften mengenmäßig ausgedrückt werden kann.
In dieser Hinsicht verursachen die in der Aminosäuresequenz eines Polypeptides zur Veränderung einer oder mehrerer Eigenschaften eingeführten Mutationen häufig eine unerwünschte Verminderung in der biologischen Aktivität. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung von beständigen Mutanten von menschlichem Wachstumshormon mit einer besseren Stabilität gegenüber einem Enzymabbau und mit unveränderter biologischer Aktivität.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer DNA-Sequenz, die das mutagenisierte Strukturgen des menschlichen Wachstumshormons enthält, welches für eine Mutante von menschlichem Wachstumshormon mit verbesserter Stabilität gegenüber Enzymabbau und mit unveränderter biologischer Aktivität codiert.
Ein weiteres Ziel der vorliegende Erfindung ist die Schaffung eines in Bacillus subtilis replikativen Expressionsklonierungsvektors, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die das mutagenisierte Strukturgen von menschlichem Wachstumshormon enthält, das für eine Mutante von menschlichem Wachstumshormon mit verbesserter Stabilität gegenüber Enzymabbau und unveränderter biologischer Aktivität codiert.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines von diesem Vektor transformierten Bacillus subtilis-Stammes.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer Mutante von menschlichem Wachstumshormon, umfassend das Kultivieren eines Bacillus-subtilis-Stammes, der durch einen in Bacillus subtilis replikativen Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz mit einem Gehalt an mutagenisiertem Strukturgen von menschlichem Wachstumshormon, das für eine Mutante von menschlichem Wachstumshormon mit verbesserter Stabilität gegenüber Enzymabbau und mit unveränderter biologischer Aktivität codiert, transformiert ist, in einem geeigneten Kulturmedium; Auflösen der Zellen und Abtrennen des löslichen Precursors der Mutante, Hydrolysieren dieses löslichen Precursors mit dem Enzym Faktor Xa, und schließlich Abtrennen und Reinigen der solcherart erhaltenen reifen Mutante von menschlichem Wachstumshormon.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Mutante von menschlichem Wachstumshormon als aktives Grundprinzip bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche diese Mutanten als aktives Grundprinzip enthalten.
Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen des folgenden Textes und der folgenden Beispiele erkennbar.
Im speziellen sind Mutanten von menschlichem Wachstumshormon gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest Arginin (Arg) in Position 134 der Aminosäuresequenz des natürlichen menschlichen Wachstumshormons durch einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der aus L-Alanin (Ala), L-Leucin (Leu), L-Threonin (Thr), L-Phenylalanin (Phe), L-Prolin (Pro) und L-Histidin (His) bestehenden Gruppe, ersetzt ist
Gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden jene Mutanten von menschlichem Wachstumshormon hGH, in welchen der Aminosäurerest Arg 134 durch den Aminosäurerest L-His oder L- Leu ersetzt ist.
Die hGH-Mutanten gemäß der vorliegenden Erfindung werden durch ein Verfahren hergestellt, umfassend:
a) Einführen einer Mutation in ein für das menschliche Wachstumshormon codierendes Strukturgen unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutagenese-Technik;
b) Klonieren des in Stufe a) erhaltenen mutagenisierten Gens in einem in Bacillus subtilis replikativen Expressionsklonierungsvektor;
c) Transformieren eines Bacillus subtilis mit dem in Stufe b) erhaltenen rekombinanten Vektor;
d) Kultivieren eines wie in Stufe c) transformierten Bacillus subtilis-Stammes in einem geeigneten Kulturmedium;
e) Auflösen der Bacillus subtilis-Zellen und Abtrennen des Überstandes, der den löslichen Precursor der Mutante enthält;
f) Hydrolysieren des löslichen Precursors dieser Mutante mit dem Enzym Faktor Xa; und schließlich
g) Abtrennen und Reinigen der solcherart erhaltenen reifen Mutante des menschlichen Wachstumshormons von dem Kulturmedium.
Von den verschiedenen ortsspezifischen Mutagenese-Techniken, welche auf einer DNA-Sequenz gezielt Modifikationen hervorrufen, sind diejenigen am weitesten verbreitet, die synthetische Einfachhelix-Oligonucleotide verwenden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde die von Zoller M.J. und Smith M. (1982. Nucl. Acid. Res., 10, 6487-6500) beschriebene Methode verwendet, umfassend:
1) Insertion des hGH-Gens (Target-Sequenz) in einen Phagen vom Typ M13 oder in ein davon abgeleitetes Plasmid und Ausbildung in Einzelstrangform zur Verwendung als Matrize für die Synthese des mutanten Gens;
2) Synthese eines Oligonucleotids, das zu der zu mutagenisierenden Sequenz komplementär ist, ausgenommen einen inneren Bereich, der die Mutation bestimmt;
3) Anelierung des synthetischen Oligonucleotids an die Matrize. Das Oligonucleotid wirkt als Primer für die Synthese des zweiten modifizierten Stranges;
4) Rekonstitution der Doppelhelix-Zirkularstruktur mittels einer Polymerisationsstufe und in vitro-Ligation, wobei ein Strang der Parentalstrang ist, während der andere die gewünschte Mutation trägt;
5) Anwendung der Doppelhelix-Form zum Transformieren von kompetent gemachten Wirtszellen zur Ausbildung einer Population von Klonen vom Mutanten- und Wild-Typ;
6) Selektion der mutanten Klone durch Hybridisierung mit spezifischen Oligonudeotiden&sub1; Sequenzieren der erhaltenen Klone oder Restriktionsanalyse.
Gemäß dem Verfahren der vorliegende Erfindung wurde im speziellen das DNA-Fragment EcorRI-HindIII von etwa 619 Basenpaaren, umfassend die Nucleotidsequenz (Strukturgen), die für das reife menschliche Wachstumshormon codiert, das an seinem 5'Ende mit der für das Nonapeptid codierenden Sequenz Met-Glu- Glu-Leu-Met-Ile-Glu-Gly-Arg verschmolzen ist, aus dern Plasmid pSM274 (CBS 75.288) durch Digestion mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII isoliert.
Dieses DNA-Fragment wurde dann in den Phagen M13mp9, der zuvor mit den erwähnten Restriktionsenzymen verdaut worden war, durch Ligation in einem nach bekannten Methoden arbeitenden Ligasegemisch eingeführt.
Das Ligasegemisch wurde dann zum Transformieren von Escherichia coli (E.coli)-Zellen verwendet, die gemäß Dagert M. und Erlich (1979, Gene, 6:23) kompetent gemacht worden waren, wobei die Transformanten über einem geeigneten Kulturmedium ausgewählt wurden.
Der aus einer der positiven Plaques hergestellte Einfachhelixstrang wurde als Matrize zum Einführen der gewünschten Mutationen verwendet. Die folgenden synthetischen Oligonucleotide wurden zu diesem Zwecke verwendet:
Das erste wurde zum Zwecke der Substituierung von Arg 134 durch die Aminosäure Ala synthetisiert und das zweite zur Gewinnung von Randommutationen, welche praktisch zu Substitutionen mit jeder beliebigen anderen Aminosäure führen können. Außerdem umfassen beide Oligonudeotide eine weitere Mutation, die befähigt ist, BamHI in situ zu schaffen, ohne die Proteinsequenz im Nahbereich der gewünschten Substituierung zu verändern. Diese Stelle ermöglicht eine rasche Identifizierung der Mutanten durch einfache Restriktionsanalyse.
Diese Oligonudeotide wurden nach bekannten Methoden unter Verwendung eines automatischen Synthesegerätes synthetisiert.
Die Einfachhelix wurden dann an das synthetische Oligonucleotid aneliert, um als Primer für die Synthese des zweiten modifizierten Stranges zu wirken.
Nach der Durchführung der gewünschten Mutationen wurden eine Polymerisationsstufe und eine in vitro-Ligation verwendet, um die Doppelhelix-Zirkularstruktur der Targetsequenz zu bilden, von der ein Strang den Parentalstrang darstellt, während der andere die gewünschte Mutation trägt. Das DNA-Fragment von 619 bp mit dem Gehalt an mutagenisiertem hGH-Strukturgen wurde dann in einen in Bacillus subtilis replikativen Klonierungsvektor eingeführt, wobei dieses Fragment unter der Regelung von Sequenzen korrekt positioniert wurde, die seine Expression im Wirtsstamm regulieren.
Hiefür geeignete Vektoren können unter im Handel erhältlichen Plasmiden oder von autorisierten Sammlungszentren ausgewählt werden. Das Plasmid pSM 214 ATCC 67320 wurde bevorzugt verwendet.
Das korrekte Einführen des Fragments von 619 bp mit dern Gehalt an mutagenisiertem hGH-Gen wurde durch elektrophoretische Analyse auf Agarosegel (0,8 %) nach der DNA-Digestion mit den Enzymen EcoRI und HindIII verifiziert.
Die Plasmide mit einem Gehalt an mutagenisierten Genen Arg134TAla,Arg134TLeu, Arg134TThr, Arg134TPhe, Arg134TPro und Arg134THis wurden PSM386, PSM387, PSM388, PSM389, PSM390 bzw. PSM391 genannt und wurden am American Type Culture Center registriert, wo sie die folgenden Hinterlegungsnummern erhielten: ATCC 68657, ATCC 68658, ATCC 68661, ATCC 68662, ATCC 68660 und ATCC 68659. Die erhaltenen rekombinanten Plasmide können in einen Wirtsmikroorganismus eingeführt werden, der aus der Bacillus subtilis-Gruppe ausgewählt wird, wie beispielsweise Bacillus subtilis SMS 108 NRRLB-15898 oder Bacillus subtilis CBS 433.90, ein asporogener Stamm.
In der Praxis wurden Bacillus subtilis SMS 108-Stämme mit diesen Plasmiden transformiert und in einem geeigneten Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralsalzquellen bei einer Temperatur von oder von etwa 37ºC während der Zeit, die zur Ausbildung des gewünschten Produktes notwendig war, kultiviert.
Die Kulturen wurden lysiert, und die löslichen Proteine wurden durch Zentrifugieren der Zell-Lysate gewonnen. Eine Analyse der erhaltenen überstände bestatigte das Vorliegen der hGH-Mutanten.
Die Proteinlösungen wurden dann durch Ionenaustauschchromatographie und hydrophobe chromatographie gereinigt, wobei die Fragmente mit dern Gehalt an löslichen Precursoren der hGH-Mutanten aufgefangen wurden. Diese Lösungen wurden konzentriert und mit dem Enzym Faktor Xa digeriert, um das N-endständige Nonapeptid von dem Precursor dieser Mutanten abzutrennen.
Die Hydrolysereaktion wurde bei Umgebungstemperatur unter Zugabe von gereinigtem Faktor Xa (45 Einheiten; 2 mg/ml, 914 Einheiten/ml) zu jeder Lösung durchgeführt.
Die Digestion der hGH-Mutanten mit Faktor Xa ermöglicht ein Ansammeln der reifen Hormonform (191 Aminosäuren), ohne zur Bildung der in Position 134 hydrolysierten Form der Aminosäure Anlaß zu geben.
Die reifen Mutanten gemäß der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von einer oder von mehreren herkömmlichen Chromatographiemethode(n) gereinigt werden. Die biologische Aktivität der Mutanten gemäß der vorliegenden Erfindung wurde in vitro nach einer Rezeptor-Analyse unter Verwendung der von Tsushima T. und Friesen H.G., J. Clin. Endocrinol., Metab., 37: 337, (1973), beschriebenen Methode bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß diese Mutanten eine Bindungsaffinität zu dern Wachstumshormonrezeptor aufwiesen, der mit jener des nichtmodifizierten hGH vergleichbar war.
Die hGH-Mutanten gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen die folgenden Vorteile gegenüber natürlichem hGH:
- größere in vivo-Stabilität gegenüber einer Blutproteaseeinwirkung und folglich eine längere Dauer der biologischen Aktivität als bei natürlichem hGH. Dies ermöglicht eine Senkung der Tagesdosis von menschlichem Wachstumshormon;
- eine höhere Ausbeute bei einem Mutantenherstellungsverfahren unter Verwendung von Faktor Xa zum spezifischen Abtrennen des an diese gebundenen Nonapeptids.
Die hGH-Mutanten gemäß der vorliegenden Erfindung können als aktives Grundprinzip in der Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Herstellung von Dosierungsformen verwendet werden, die zur oralen oder parenteralen Verabreichung geeignet sind.
Die Menge an in einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltener Verbindung kann entsprechend den verschiedenen Parametern, wie Beschaffenheit der Zusammensetzung, einschließlich der speziellen darin enthaltenen Verbindung, und der Verabreichungsmethode, variieren.
Die Mutanten gemäß der vorliegenden Erfindung können in Dosierungseinheiten in Abhängigkeit von der Methode der Verabreichung formuliert werden. Zusätzlich zu den hGH-Mutanten als aktives Grundprinzip können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung Stabil isatoren, Adjuvantien, Konservierungsmittel, Antioxidantien, Emulgatoren, Antiflockungsmittel, Puffer und Desaggregatoren, ausgewählt aus jenen, die mit den Verbindungen selbst kompatibel und pharmakologisch annehmbar sind, enthalten.
Im Falle von oralen Formulierungen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie bei Pharmazeutika bekannt, auch Geschmacksstoffe enthalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Figur 1

Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von hGH und Mutanten in dem der ortsspezifischen Mutagenese unterzogenen Bereich.

Figur 2

Kinetik der Hydrolyse von hGH und der Mutante Arg134TLeu hGH durch Faktor Xa. Aliquote der Hydrolysegemische wurden zu verschiedenen Zeiten (0,2, 0,8 und 24 Stunden) auf Acrylamidgel aufgebracht und nach der elektrophoretischen Analyse mit Comassie-Blau angefärbt. Eine Anhäufung von Strangbrüchen im Falle von Wild-Typus hGH wird ersichtlich. Diese Form ist in dem mutagenisierten Protein nicht vorhanden.
Die folgenden Versuchsbeispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

BEISPIEL 1

Klonieren des Fragments EcoRI-HindIII von pSM274 mit einem Gehalt an hGH-Gen

Das Plasmid pSM274 (CBS 75.288) (1 µg) und die replikative Form des Phagen M13mp9 (1 µg) wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (Boehringer) bei 37ºC während 1 Stunde getrennt verdaut. Die Reaktionen wurden in 40 µl eines Reaktionsgemisches, bestehend aus 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM MgCl&sub2;, 100 TNM NaCl und 1 mM 2-Mercaptoethanol, in Gegenwart von 4 Einheiten (U) von EcoRI und HindIII durchgeführt. Nach dem Inaktivieren der Enzyme bei 65ºC während 10 Minuten wurden 2 µl jedes Reaktionsgemisches auf Agarosegel (0.8 %) aufgebracht, um die vollständige Digestion der DNA zu verifizieren.
12 µl des pSM274 Reaktionsgemisches (300 ng pSM274) und 4 µl des M13mp9 Reaktionsgemisches (100 ng M13mp9) wurden zu 40 µl eines Ligasegemisches mit einem Gehalt an 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol (DTT) und 1 mM ATP zugesetzt, und die DNA wurde in Gegenwart von 1U der T4 DNA- Ligase (Boehringer) bei 14ºC während 14 Stunden ligiert.
Ein Aliquot (10 ml) des Ligasegemisches wurde verwendet, um E.coli 71/18(BRL)-Zellen zu transformieren, welche mit Calciumchlorid kompetent gemacht worden waren, wie von Dagert und Ehrlich beschrieben (Gene, 6:23. (1979)).
Die Transformanten wurden auf YT-Agarplatten ( 8 g/l Trypton (DIFCO), 5 g/l Hefeextrakt (DIFCO), 5 g/l NaCl) mit einem Gehalt an 40 µg/ml X-GAL (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-galactopyranosid) und 125 µg/ml IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) ausgewählt. Durch ein Vorgehen in der oben beschriebenen Weise wurden zahlreiche rekombinante (weiße) Plaques erhalten, die von den nichtrekombinanten (blauen) leicht zu unterscheiden waren.
Eine dieser rekombinanten Plaques wurde verwendet, um eine E.coli 71/18 (BRL)-Kultur zu infizieren, aus welcher anschließend die replikative DNA-Doppelhelixform des Phagen extrahiert wurde.
Diese DNA wurde dann mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII unter den obenstehenden Bedingungen verdaut, um das Vorhandensein des EcoRI-HindIII-Fragments von 619 Basenpaaren mit einem Gehalt an aus pSM274 isoliertem hGH-Gen zu verifizieren.
Die Einfachhelix-DNA-Form, hergestellt wie von Messing J. ("Methods in Enzymology", Bd. 101, 1983) beschrieben, wurde dann als Matrix in den ortsspezifischen Mutageneseversuchen zum Ersatz von Arginin in Position 134 verwendet.

BEISPIEL 2

Ortsspezifische Mutagenese

Eine ortsspezifische Mutagenese wurde unter Verwendung des Systems "Oligonucleotid-gerichtete in vitro-Mutagenese, 2. Version", erhältlich von der Firma Amersham, unter den von der Lieferfirma beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Zwei Oligodeoxynudeotide mit den folgenden Sequenzen wurden als Primer verwendet:
Der erste Primer wurde zum Zweck der Substitution von Arg134 durch die Aminosäure Ala synthetisiert, und der zweite zur Erzielung der Randommutationen, welche praktisch zu Substitutionen mit einer beliebigen anderen Aminosäure führen könnten. Außerdem umfaßten beide Primer eine weitere Mutation, die zur Schaffung von BamHI in situ ohne Veränderung der Proteinsequenz im Nahbereich der gewünschten Substitution befähigt war. Diese Stelle ermöglicht eine rasche Identifizierung der Mutanten durch eine einfache Restriktionsanalyse.
Die Oligonudeotide wurden durch bekannte Methoden unter Verwendung des One Plus DNA-Synthesizers (Beckman) synthetisiert und anschließend an den 5'-Enden in 30 µl Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM ATP und 2 Einheiten von Kinasepolynucleotid (Boehringer) phosphoryliert. Die Reaktion wurde bei 37ºC während 45 Minuten durchgeführt.
Die im Mutagenesekit beschriebenen Reaktionen, welche wie folgt zusammengefaßt werden können, wurden dann durchgeführt:
1 - Anelieren zwischen phosphoryliertem Primer und der Einfachhelix des rekombinanten Phagen;
2 - in vitro-Synthese der Doppelhelix-Phagen-DNA in Gegenwart von Polymerase, Ligase und dTTP, dCTP, dGTP, dATP und dem Adenosylphosphorothioatanalogon;
3 - Schneiden der als Matrix verwendeten DNA-Helix mit dem Enzym NciI mit dessen anschließender vollständiger Abtrennung mit Hexonudease III;
4 - Synthetisieren der Doppelhelix-DNA in Gegenwart von Polymerase, Ligase und dNTP;
5 - Transformieren von kompetenten E.coli-Zellen mit der Doppelhelix-DNA;
6 - Initial-Identifizierung der Mutanten durch Restriktionsanalyse der replikativen Formen (Doppelhelix-DNA) der rekombinanten Phagen.
Fünf rekombinante Phagen, welche aus dern BamHI-Restriktionsenzym in dern hGH-Gen herausgeschnitten wurden, wurden durch Sequenzieren der DNA unter Verwendung der von Sanger und Coulson (1979) (J. Mol. Biol., 94:441) beschriebenen Methode weiter analysiert. Der zum Sequenzieren verwendete Primer hatte die Sequenz CTA GAG GAA GGC ATC CAA und hybridisierte auf dern hGH- Gen im Nahbereich des für Arginin in Position 134 codierenden Bereichs. Die Sequenzen der fünf DNA sind in Figur 1 dargestellt und zeigen deutlich, daß das Arginin durch die Aminosäurereste Phe, Leu, Pro, Thr und His substituiert wurde.

BEISPIEL 3

Transfer der Mutationen in das Plasmid pSM274

Die Doppelhelix-DNA (1,6 µg) der mutagenisierten Phagen wurden getrennt mit 2 Einheiten von EcoRI und Hindih unter den oben erwähnten Bedingungen verdaut. Nach dem Verifizieren der Vollständigkeit der Restriktion durch elektrophoretische Analyse auf Agarosegel (0,8 %) wurden sechs Ligasegemische hergestellt, die jeweils 1,5 µg von jeder der verdauten Phagen-DNA und 0,5 µg an pSM274, das zuvor mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut worden war, enthielten. Die Ligationsreaktion wurde in 100 µl Reaktionsgemisch mit der eingangs beschriebenen Zusammensetzung in Gegenwart von 1 Einheit T4-Ligase durch Inkubieren bei 14ºC während 14 Stunden durchgeführt.
Die Ligasegemische wurden verwendet, um Bacillus subtilis SMS108-Zellen (NRRLB-15898), die, wie von Contente und Dubnau, (1979) (Mol. Gen. Genet. 167, 251) beschrieben, kompetent gemacht worden waren, zu transformieren. Die Transformanten wurden auf Platten von VY-Agar-Kulturmedium (0,8 % Trypton (DIFCO), 0,5 % Hefeextrakt (DIFCO), 0,5 % NaCl) mit einem Gehalt an 5 µg/ml Kanamycin und 5 µg/ml Chloramphenicol selektiert.
Die gegenüber beiden Antibiotika resistenten gebildeten Klone wurden zur Herstellung von Plasmid-DNA, wie von Birnboim und Doly, Molecular Cloning (1979), beschrieben, verwendet.
Die Verifizierung der korrekten Insertion des das mutagenisierte hGH-Gen tragenden Fragments von 619 bp wurde durch elektrophoretische Analyse auf Agarosegel (0,8 %) nach der DNA- Digestion mit den Enzymen EcoRI und HindIII durchgeführt.
Die die mutagenisierten Gene Arg134TAla, Arg134TLeu, Arg134TThr, Arg134TPhe, Arg134TPro und Arg134THis enthaltenden Plasmide wurden mit pSM386, pSM387, pSM388, pSM389, pSM390 bzw. pSM391 bezeichnet.

BEISPIEL 4

Herstellung und Reinigung von hGH-Mutanten

Einzelkolonien der sechs Klone mit einem Gehalt an die Arg134-Mutationen tragenden Plasmiden wurden zum Beimpfen von 250 ml VY-Kulturmedium mit einem Gehalt an 5 µg/ml Chloramphenicol verwendet. Nach dern Vermehren bei 37ºC über Nacht wurden die Zellen zum Zentrifugieren bei 5000 UpM während 10 Minuten gepoolt, dann in 50 ml Tris-HCl 20 mM pH 7,5 resuspendiert, neuerlich zentrifugiert und anschließend in 10 ml Tris-HCl 20 mM pH 7,5, 1 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) resuspendiert. Die Zellen wurden durch drei aufeinanderfolgende Passagen in einer French Press bei 18.000 psi lysiert, und die löslichen Proteine wurden durch Zentrifugieren der Zell-Lysate während 30 Minuten bei 30,000 UpM gewonnen. Eine Analyse von Aliquoten (5 µl) der erhaltenen Überstände auf SDS-Polyacrylamidgel 12,5 % bestätigte das Vorhandensein von hGH-Mutanten. Die Proteinlösungen wurden dann in eine Q-Sepharose -Fast Flow-Säule (Pharmacia, 1x7 cm), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl pH 6,5, bei einem Durchsatz von 15 ml/Stunde eingeführt. Die Säule wurde dann mit dern Ausgleichspuffer gewaschen und die Proteine wurden mit 50 ml eines NaCl-Gradienten von 0 bis 0,15 M eluiert, wobei die Fraktionen alle 6 Minuten aufgefangen wurden (etwa 1,5 ml pro Fraktion).
Die Fraktionen wurden durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid 12,5 % analysiert.
Die hGH-Mutanten wurden in 7 Fraktionen eluiert. Die gesammelten Fraktionen (etwa 10 ml) hatten einen Gesamtproteingehalt von etwa 2,5-3,0 mg.
Die nach dem Poolen der Fraktionen erhaltenen Lösungen wurden auf eine 1 M NaCl-Konzentration eingestellt und dann in eine Phenyl-Sepharose -Säule(Pharmacia) (1x7 cm), äquilibriert in 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1M NaCl, bei einem Durchsatz von 15 ml/Stunde eingespeist.
Nach dem Waschen der Säule mit dern Ausgleichspuffer wurden die Proteine mit 20 mM Tris-HCL pH 7,5 eluiert. Die Mutanten von menschlichem Wachstumshormon wurden in 5 Fraktionen aufgefangen. Die gepoolten Fraktionen (etwa 7,5 ml) hatten einen Gesamtproteingehalt von etwa 1,5-2,0 mg. Die die sechs hGH-Mutanten enthaltenden Lösungen, mit 0,2 M Tris auf einen pH-Wert von 8 eingestellt, wurden vor der Digestion mit Rinderenzym Faktor Xa zum Abtrennen des N-endständigen Nonapeptids in Centriprep 10 (AMICON) auf ein Endvolumen von 0,5-0,6 ml konzentriert.
Die Hydrolysereaktionen wurden bei Umgebungstemperatur durch Zusetzen von 50 µl Faktor Xa (2 mg/ml) zu jeder Lösung, der durch Aktivieren von Rinderfaktor Xa, gereinigt wie von N. Hashimoto et al. (J. Biochem. 97:1347, 1985) beschrieben mit Schlangengift, immobilisiert auf mit BrCN aktivierter Sepharose 4B, erhalten worden war, durchgeführt.
Auf die Hydrolyse folgte eine Entnahme von 5 µl-Proben und deren Überprüfung auf SDS-Polyacrylamid.
Unter den eingehaltenen Versuchsbedingungen erreichten die Enzymreaktionen nach etwa 24-30 Stunden ihr Ende.
Die Digestion der hGH-Mutanten mit Faktor Xa ermöglichte eine Ansammlung der reifen Form (191 Aminosäuren) des Hormons, ohne zur Bildung der bei der Aminosäure in Position 134 (Figur 2) hydrolysierten Form Anlaß zu geben.
Die Mutanten wurden schließlich nach dern Verdünnen der Proben mit 5 ml 20 mM Tris-HCl pH 6,5 Puffer in einer Q-Sepharose -Fast-Flow-Säule (Pharmacia) (1x7 cm), äquilibriert mit dem gleichen Verdünnungspuffer, gereinigt.
Die Säule wurde dann mit dern Äquilibrierungspuffer gewaschen und die Proteine wurden mit 50 ml eines NaCl-Gradienten von 0 bis 0,15 M eluiert, wobei die Fraktionen alle 6 Minuten aufgefangen wurden (etwa 1,5 ml pro Fraktion).
Die Mutanten von menschlichem Wachstumshormon wurden in 5 Fraktionen (7,5 ml Gesamtvolumen) mit einer Reinheit über 95 % (0,5-1,0 mg Gesamtproteine) aufgefangen.

BEISPIEL 5

Rezeptorassay

Das Ziel dieses Versuchs war die Bewertung des Effektes, der durch individuelle Aminosäuresubstitutionen in Position 134 der Sequenz des menschlichen Wachstumshormons auf das Vermögen des Hormons, sich an seinen Rezeptor zu binden, hervorgerufen wurde.
Der Versuch wurde an einer an mikrosornalen Lebermembranen angereicherten Fraktion ausgeführt, die aus einem in fortgeschrittenener Schwangerschaft befindlichen Kaninchen isoliert worden war, wie von Tsushima T. und Friesen H.G., "Radioreceptor Assay for Growth Hormone", J. Clin. Endocrinol. Metab., 37:337, (1973), beschrieben, wobei die ¹²&sup5;I-hGH radioaktiven Binde- und Mutantenlösungen zum Aufbau der Standardkurven verwendet wurden.
Die Proben wurden bei Umgebungstemperatur zwei Stunden lang in 50 mM Tris-HCl-Puffer, 15 mM CaCl&sub2; und 5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), pH 7,6, inkubiert. Die Bindungsreaktion wurde durch Zusetzen von 2,5 ml Natriumacetat, pH 5,4, mit einem Gehalt an 0,1 % BSA zu jedem Proberöhrchen blockiert.
Die Proberöhrchen enthielten etwa 70.000 Impulse pro Minute von ¹²&sup5;I-hGH-radioaktivem Binder, 100 µl einer hepatischen Mikrosomalsuspension (250 µg Proteine) und sowohl natürliches hGH als auch die zu bestimmende Mutante in einer Endkonzentration von 2,5 bis 1000 ng/ml. Die in der nachstehenden Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse zeigen&sub1; daß die Arg 134-Substitutionen der hGH-Sequenz die tertiäre hGH-Struktur in jenem Teil des Moleküls, der mit dern Membranrezeptor in Wechselwirkung tritt, nicht wesentlich verändern. TABELLE 1 Untersuchtes Produkt IC&sub5;&sub0; (ng/ml)±S.E. % Aktivität VS 212/5
IC&sub5;&sub0; ist die Menge des Verdrängers, der befähigt ist, die spezifische Bindung an den Rezeptor um 50 % zu senken.

SEQUENZLISTE

SEQ ID NO.1

SEQUENZART: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
STRANGART: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
Met Glu Glu Leu Met Ile Glu Gly Arg 9

SEQ ID NO.2

SEQUENZART: Nucleotid
SEQUENZLÄNGE: 30 Basenpaare
STRANGART: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
EIGENSCHAFTEN: Primer
GAAGATGGAT CCCCCGCAAC TGGGCAGATG 30

SEQ ID NO.3

SEQUENZART: Nucleotid
SEQUENZLÄNGE: 30 Basenpaare
STRANGART: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
EIGENSCHAFTEN: Primer
GAAGATGGAT CCCCCNNNAC TGGGCAGATG 30

SEQ ID NO.4

SEQUENZART: Nucleotid
SEQUENZLÄNGE: 18 Basenpaare
STRANGART: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
EIGENSCHAFTEN: Primer
CTAGAGGAAG GCATCCAA

SEQ ID NO.5

SEQUENZART: Nucleotid
SEQUENZLÄNGE: 10 Basenpaare
STRANGART: Einzeistrang
TOPOLOGIE: linear
EIGENSCHAFTEN: Primer
CTAGAGGAAG GCATCCAA

Claims

1. Gegenüber einem Enzymabbau beständige Mutanten von menschlichem Wachstumshormon mit unveränderter biologischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest Arginin in Position 134 der Aminosäuresequenz des natürlichen menschlichen Wachstumshormons durch wenigstens einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der aus L-Alanin, L-Leucin, L-Threonin, L-Phenylalanin, L-Prolin und L-Histidin bestehenden Gruppe, ersetzt ist.

2. Mutante nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest Arginin in Position 134 durch L-Alanin ersetzt ist.

3. Mutante nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest Arginin in Position 134 durch L-Leucin ersetzt ist.

4. Mutante nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest Arginin in Position 134 durch L-Threonin ersetzt ist.

5. Mutante nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest Arginin in Position 134 durch L-Phenylalanin ersetzt ist.

6. Mutante nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest Arginin in Position 134 durch L-Prolin ersetzt ist.

7. Mutante nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest Arginin in Position 134 durch L-Histidin ersetzt ist.

8. Eine DNA-Sequenz, umfassend das Strukturgen, das für eine Mutante des menschlichen Wachstumshormons, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, codiert.

9. Klonierungsvektor mit einem Gehalt an einer DNA-Sequenz, die das Strukturgen umfaßt, welches für eine Mutante des menschlischen Wachstumshormons, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, codiert.

10. Vektor nach Anspruch 9, ausgewählt aus der Gruppe, die aus in Bacillus subtilis replikativen Expressionsplasmiden besteht.

11. Mit einem Plasmid nach Anspruch 10 transformierter Bacillus subtilis-Stamm.

12. Bacillus subtilis SMS108 (pSM 386) ATCC 68657

13. Bacillus subtilis SMS108 (pSM 387) ATCC 68658

14. Bacillus subtilis SMS108 (pSM 388) ATCC 68661

15. Bacillus subtilis SMS108 (pSM 389) ATCC 68662

16. ßacillus subtilis SMS108 (pSM 390) ATCC 68660

17. Bacillus subtilis SMS108 (pSM 391) ATCC 68659

18. Mutante des menschlichen Wachsturnshormons, wie in Anspruch 1 beansprucht, erhältlich nach einem Verfahren, das umfaßt:

a) Kultivieren eines Bacillus-subtilis-Stammes, der durch ein Plasmid gemäß Anspruch 11 transformiert ist, in einem geeigneten Kulturmedium;

b) Auflösen der Zellen und Abtrennen des löslichen Precursors der Mutante, worin der N-endständige Phenylalaninaminosäurerest an das Nonapeptid mit der Sequenz Met-Glu-Glu- Leu-Met-Ile-Glu-Gly-Arg- fusioniert ist;

c) Hydrolysieren dieses löslichen Precursors mit dem Enzym Faktor Xa; und schließlich

d) Abtrennen und Reinigen der solcherart erhaltenen reifen Mutante von menschlichem Wachsturnshormon.

19. Mutante von menschlichem Wachstumshormon nach Anspruch 18, worin der Bacillus Bacillus subtilis SMS108 (pSM 386) ATCC 68657 ist.

20. Mutante von menschlichem Wachstumshormon nach Anspruch 18, worin der Bacillus Bacillus subtilis SMS108 (pSM 387) ATCC 68658 ist.

21. Mutante von menschlichem Wachstumshormon nach Anspruch 18, worin der Bacillus Bacillus subtilis SMS108 (pSM 388) ATCC 68661 ist.

22. Mutante von menschlichem Wachstumshormon nach Anspruch 18, worin der Bacillus Bacillus subtilis SMS108 (pSM 389) ATCC 68662 ist.

23. Mutante von menschlichem Wachstumshormon nach Anspruch 18, worin der Bacillus Bacillus subtilis SMS108 (pSM 390) ATCC 68660 ist.

24. Mutante von menschlichem Wachstumshormon nach Anspruch 18, worin der Bacillus Bacillus subtilis SMS108 (pSM 391) ATCC 68659 ist.

25. Mutante von menschlichem Wachstumshormon nach Anspruch 1, zur Verwendung als Wirkstoff in der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen.

26. Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Behandlung von Dysfunktionen der Hypophyse, Verbrennungen, Dystrophie, Pseudoarthrose und Knochenbrüchen geeignet ist, mit einem Gehalt an einer Mutante von menschlichem Wachstumshormon gemäß Anspruch 1 als aktivem Wirkstoff.