DE69409354T2

DE69409354T2 - Dextranase, Herstellungsverfahren und dafür kodierende DNS

Info

Publication number: DE69409354T2
Application number: DE69409354T
Authority: DE
Inventors: Hernan Roca Campana; Alvarez Jose Alberto Cremata; Dania Mateu Curbelo; Boada Julio Marcos Delgado; Fernandez Rossana Garcia; Garcia Bianca Mar A Garcia; Martinez Maria Elena Gonzalez; Martinez Luis S Herrera; Efrain Rodriguez Jimenez; Clark Emilio Margollez; Cordova Vivian Morera; Carlos Fernandez Patron; Perez-Castaneda Manuel Raices
Original assignee: CIGB
Current assignee: CIGB
Priority date: 1993-12-14
Filing date: 1994-12-13
Publication date: 1998-07-23
Anticipated expiration: 2014-12-14
Also published as: DE69409354T3; ATE164627T1; AU8027494A; AU685181B2; US5637491A; DK0663443T4; DE69409354D1; BR9404998A; CO4440441A1; ES2117203T5; EP0663443B1; EP0663443A1; EP0663443B2; ES2117203T3; DK0663443T3; ZA949799B

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und Biotechnologie und insbesondere ein Verfahren zur Isolierung und Expression eines für eine Dextranase kodierenden Gens in Hefe.

Hintergrund der Erfindung

Dextranase (1,6-α-D-Glucan-6-glucanohydrolase; EC 3.2.1.11) ist ein Enzym, das Dextran hydrolysiert. Dextran ist ein Polymeres von α-D-Glucopyranosen, die vorwiegend über 1,6-Glycosidbindungen gebunden sind.
Das ursprüngliche Interesse für Dextranase beruhte auf seiner Verwendung bei der gewerblichen Herstellung von klinischem Dextran, das als Ersatzprodukt oder Streckmittel für Blut verwendet wird (S. Tam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 73 (1976), S. 2128). Aufgrund seiner Fähigkeit zur Hydrolyse von Dextran hat sich Dextranase auch als sehr wertvoll zur Hydrolyse des Dextrans erwiesen, das durch Einwirkung von Mikroorganismen gebildet wird und zu Zahnkaries oder Zahnverfall führt. So wird die Einverleibung dieses Enzyms in Zahnpasta oder andere orale Reinigungsmittel in Betracht gezogen, um eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung bei Karies zu erzielen; vgl. beispielsweise die US-Patente 3 991 177, 4 115 546, 4 140 758, 4 335 101, 4 438 093, 4 466 954, 4 469 673, 5 000 939 und 5 145 665.
Ferner wird Dextranase in der Zuckerindustrie eingesetzt. Dextran ist kein natürlicher Bestandteil von Zuckersaft, wird aber durch Bakterien der Spezies Leuconostoc gebildet, die in beschädigtem Zuckerrohr und Säften, die vor einer Verarbeitung durch die Eindampfvorrichtungen länger stehenbleiben, wachsen. Dextran ist ein Polymeres, das in Lösung eine hohe Viskosität aufweist. Diese erhöhte Viskosität erschwert die Klärung und das Eindampfen von Säften und deren Konzentration zu Melassen, wenn der Dextrangehalt sich einem Wert von 1000 ppm der festen Saftbestandteile nähert. Gewerbliche Dextranasen werden zum Abbau des Polymeren zu kleineren Molekülen, die keine übermäßige Viskosität hervorrufen, eingesetzt. In einer Rohrzuckerraffinerie zeigt dextranhaltiger Saft nicht nur eine geringe Filtrationsgeschwindigkeit und eine schlechte Kristallisation von Saccharose, sondern stellt auch die Ursache für ernsthafte Qualitätsprobleme des Endprodukts dar.
Dextran wird auch gelegentlich bei der Verarbeitung von Zuckerrüben gebildet, insbesondere wenn diese während der Ernte und der Lagerung Einfrier- und Auftauzyklen ausgesetzt werden. Wenn es dazu kommt, kann Dextranase entsprechend den vorstehenden Angaben für Rohrzucker eingesetzt werden.
Die Verwendung von Dextranase zur Hydrolyse von in Zuckerrohrsäften auftretendem Dextran ermöglicht auch eine Erhöhung der Ausbeute bei der Zuckerherstellung (F. K. E. Imrie et al., Sugar Technol. Rev., Bd. 1 (1972), S. 291-361; R. P. Fulcher und P. A. Inkerman, Proc. Queensl. Soc. Sugar Cane Technol., Bd. 43 (1976), S. 295-305; P. A. Inkerman und G. James, Proc. Queensl. Soc. Sugar Cane Technol., Bd. 43 (1976), S. 307- 320; P. A. Inkerman und L. Riddell, Proc. Queensl. Soc. Sugar Cane Technol., Bd. 44 (1977), S. 215-223; P. A. Inkerman, Proc. Int. Sugar Cane Technol., Bd. 17 (1980), S. 2411-2427; S. Barfoed und A. Mollgaard, Zuckerindustrie (Berlin), Bd. 112(5) (1987), S. 391-395; C. F. Brown und P. A. Inkerman, J. Agric. Food Chem., Bd. 40(2) (1992), S. 227-233). Verschiedene Mikroorganismen sind zur Bildung von Dextranase befähigt. Dazu gehören Pilze der Gattungen Penicillium, Aspergillus, Fusarium und Chaetomium; Lactobacillus, Streptococcus- und Flavobacterium-Bakterien und Hefen, wie Lipomyces starkeyi; vgl. z. B. die US-Patente 2 742 399, 3 663 371, 3 875 009, 3 912 594, 4 732 854 und 4 820 640.
Die gewerbliche Herstellung von Dextranase erfolgt durch Fermentierung entweder mit Penicillium sp. (Novo, 1977, Dextranase Novo 25L; ein Dextran zersetzendes Enzym für die Zuckerindustrie; Produktdaten-Informationsblatt 112-GB, Novo Enzyme Division, Hagsvaerd, Dänemark) oder durch Chaetomium sp. (Miles, 1986, Dextranex; Pilz-Dextranase für die Rohrzuckerindustrie; Technisches Informationsblatt L-1475, Miles Laboratories, Inc. Elkhart, Ind., USA). Jedoch stellt keiner dieser Pilze eine von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) anerkannte enzymatische Quelle dar (D. W. Koenig und D. F. Day, Applied and Environmental Microbiology, Bd. 55(8) (1989), S. 2079-2081).
Hefe stellt mittlerweile einen in der Nahrungsmittelindustrie und neuerdings auch bei der Herstellung von pharmazeutischen Produkten weit verbreiteten Mikroorganismus dar. Hefe kann auch im Vergleich zu Pilzen zu einer höheren Zelldichte innerhalb kürzerer Zeit wachsen und stellt daher einen geeigneten Wirt für die gewerbliche Herstellung von sezernierten Proteinen dar.
Nur drei Arbeitsgruppen berichten über die Klonierung von Genen, die für Dextranasen aus verschiedenen Bakterien kodieren (J. F. Barrett et al., Infection and Immunity, Bd. 55(3) (1987), S. 792-802; P. Lawman et al., Journal of Bacteriology, Bd. 173(23) (1991), S. 7423-7428 und M. Okushima et al., Jpn. J. Genet., Bd. 66 (1991), S. 173-187). Von diesen Gruppen wurde nur eine Nucleotidsequenz veröffentlicht (M. Okushima et al., Jpn. J. Genet., Bd. 66 (1991), S. 173-187). Bisher wurden keine Berichte über die molekulare Klonierung oder Sequenzierung von irgendwelchen Pilzgenen, die für Dextranase kodieren, noch Arbeiten über die heterologe Expression von Dextranase in Hefe veröffentlicht.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Der neue Aspekt dieser Erfindung besteht in der Identifizierung der Nucleotidsequenz, die für eine Dextranase des Pilzes Penicillium minioluteum kodiert, und in dessen Expression in der Hefe Pichia pastoris, um hohe Konzentrationen dieses Enzyms in sezernierter Form zu erhalten. Das in Pichia pastoris-Zellen erzeugte Enzym ist dadurch charakterisiert, daß es im Vergleich zum natürlichen Pilz-Enzym aus Penicillium minioluteum eine höhere thermische Stabilität aufweist. Der neue rekombinante Stamm kann bei der gewerblichen Herstellung von Dextranase verwendet werden. Im Hinblick auf die Sequenzierungsdaten (SEQ. Id. Nr. 1) ist diese neue Nucleotidsequenz, die für eine Pilz-Dextranase kodiert, nicht mit der Nucleotidsequenz homolog, die für bakterielle Dextranase kodiert, über die Okushima et al., (Jpn. J. Genet., Bd. 66 (1991), S. 173-187) berichten.
Die der Erfindung zugrundeliegende technische Lösung bezieht sich auf die Bereitstellung der Nucleotidsequenz einer cDNA-Kopie von mRNA, die für ein aus Penicillium minioluteum-Pilz isoliertes Dextranase-Enzym kodiert (SEQ. Id. Nr. 1 und SEQ. Id. Nr. 2). Die Dextranase-cDNA wurde auf einen Pichia pastoris-Expressionsvektor übertragen. Dieses rekombinante Plasmid wurde zur Bereitstellung von Hefetransformanten verwendet, die zur Sekretion von hohen Dextranase-Konzentrationen befähigt sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1: Konstruktion des Plasmids pPDEX1 zur Expression von Dextranase-cDNA aus Penicillium minioluteum in Pichia pastoris.
Fig. 2: Doppelt reziproke Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung (Modifikation gemäß Lineweaver-Burk), angewandt auf die anfänglichen Werte der Dextran-Depolymerisationsgeschwindigkeit (IDR-Werte) unter Verwendung von natürlicher und rekombinanter Dextranase.
Fig. 3: Einfluß des pH-Werts auf die Bestimmung der enzymatischen Aktivität, ausgedrückt als % relative Aktivität in bezug auf den Maximalwert für natürliche und rekombinante Dextranase.
Fig. 4: pH-Stabilität von natürlicher und rekombinanter Dextranase, ausgedrückt als % Restaktivität (100% Aktivität beim pH-Wert 4,5) nach 30-minütiger Inkubation bei 50ºC bei einem gegebenen pH-Wert.
Fig. 5: Einfluß der Temperatur auf die Bestimmung der enzymatischen Aktivität, ausgedrückt als % relative Aktivität in bezug auf den Maximalwert für natürliche und rekombinante Dextranase.
Fig. 6: Thermische Stabilität von natürlicher und rekombinanter Dextranase, ausgedrückt als Reaktionsgeschwindigkeit der Denaturierung aus der Arrhenius-Gleichung. Es wird logk (k = Geschwindigkeitskonstante der Denaturierung) gegen 1/T (T = Temperatur in ºKelvin x 10&sup5;) aufgetragen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine isolierte und gereinigte DNA mit einer Nucleotidsequenz bereit, die im wesentlichen der Nucleotidsequenz im Dextranase-Gen gemäß der Darstellung in SEQ. Id. Nr. 1 des Pilzes Penicillium minioluteum entspricht oder damit hybridisiert.
Der Ausdruck "eine Nucleotidsequenz im Dextranase-Gen" soll mehrere Möglichkeiten umfassen. Eine Option ist eine DNA, die das gesamte Dextranase-Gen abdeckt, d. h. das Gen einschließlich der Regulations- und Kodierungssequenzen. Eine weitere Option ist eine DNA, die im wesentlichen aus der Kodierungssequenz oder aus einem Teil der Kodierungssequenz besteht und bei der die Dextranase-Promotorregion fehlt. Eine derartige Möglichkeit ist eine Dextranase-cDNA, die durch reverse Transkription aus Dextranase-mRNA erhalten worden ist. Die Erfindung umfaßt auch eine DNA, die im wesentlichen aus dem Dextranase-Promotor besteht und bei der die Dextranase-Kodierungsregion fehlt. Ferner betrifft die Erfindung Oligonucleotide von ausreichender Länge, so daß sie für Dextranase-DNA oder RNA spezifisch sind Derartige Oligonucleotide können sich als für Dextranase spezifische Sonden oder Primer eignen und besitzen üblicherweise eine Länge von etwa 7 oder 8 oder vorzugsweise von etwa 9 oder 10 Nucleotiden bis zu etwa 40 oder 50 Nucleotiden und vorzugsweise bis zu etwa 25 oder 30 Nucleotiden oder über 50 Nucleotiden bis zur vollständigen Länge des Gens.
Der Ausdruck "eine Nucleotidsequenz, die im wesentlichen entspricht oder hybridisiert mit" soll einzelsträngige oder doppelsträngige DNA umfassen. Im Fall von einzelsträngiger DNA soll dieser Wortlaut sowohl die entsprechende als auch die komplementäre Sequenz umfassen.
Die Entsprechung muß nicht 100%ig sein, d. h. eine DNA mit einer bestimmten Homologie zu der in SEQ. Id. Nr. 1 gezeigten Sequenz soll darunter fallen. DNA, die eine Homologie von mindestens 60% und vorzugsweise eine Homologie von mindestens 70% zu dieser Sequenz aufweist, soll unter diesen Ausdruck fallen. Es ist insbesondere beabsichtigt, eine DNA abzudecken, die die gleiche Funktion und/oder Wirkung besitzt, selbst wenn sich die Sequenz von der in SEQ. Id. Nr. 1 gezeigten Sequenz unterscheidet. Daher sollen Veränderungen in der Dextranase-Promotorregion, die nicht die Promotorfunktion dieser Sequenz beeinträchtigen, unter die Erfindung fallen. Gleichermaßen soll die Erfindung beliebige Veränderungen in der Dextranase-Kodierungsregion umfassen, die entweder zu der gleichen Aminosäuresequenz oder zu einer Aminosäuresequenz, die trotz einer oder mehrerer Abweichungen von der originalen Aminosäuresequenz die Dextranase-Aktivität behält, umfassen.
Beispielsweise soll die Erfindung nicht nur die genomische DNA und cDNA abdecken, die für das Dextranase-Enzym des Pilzes Penicillium minioluteum kodiert, sondern auch DNA, die für verwandte Dextranase-Enzyme kodiert, z. B. eine DNA, die für das Dextranase-Enzym von verwandten Pilzen kodiert, wie Penicillium funiculosum, Penicillium aculeatum und Penicillium pinophilum. Dextranase-Enzyme gelten als verwandt, wenn sie eine ähnliche Dextranase-Aktivität besitzen und/oder durch den gleichen anti-Dextranase-Antikörper erkannt werden und/oder durch DNA mit einer Homologie von mindestens 60 oder 70% kodiert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die DNA eine Nucleotidsequenz, die für ein Enzym mit Dextranase-Aktivität kodiert. Vorzugsweise kodiert diese Nucleotidsequenz für das Dextranase-Enzym des Pilzes Penicillium minioluteum. Diese Nucleotidsequenz kodiert im wesentlichen für die in SEQ. Id. Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz Insbesondere besteht diese Nucleotidsequenz im wesentlichen aus den Nucleotiden #1226 bis #2947 von SEQ. Id. Nr. 1.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung um faßt diese DNA eine Nucleotidsequenz für die Promotorregion des Dextranase-Gens des Pilzes Penicillium minioluteum. Insbesondere besteht diese Nucleotidsequenz im wesentlichen aus den Nucleotiden innerhalb der Region der Nucleotide #1 bis #1079 von SEQ. Id. Nr. 1.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Polynucleotid bereitgestellt, das eine DNA gemäß der vorstehenden Definition (eine für Dextranase spezifische DNA) und eine Nucleotidsequenz eines Klonierungs- oder Expressionsvektors umfaßt, wobei dieses Polynucleotid dazu befähigt ist, die Expression eines Proteins in einem geeigneten Wirt herbeizuführen. Vorzugsweise ist dieses rekombinante Polynucleotid dazu befähigt, die Expression eines Proteins mit Dextranase-Aktivität in einem geeigneten Wirt zu dirigieren, wobei es sich bei dem Wirt vorzugsweise um eine Hefe und insbesondere um die Hefe Pichia pastoris handelt. Ein besonders bevorzugtes Beispiel eines rekombinanten Polynucleotids, das zum Dirigieren der Expression eines Dextranase-Enzyms in Hefe, wie Pichia pastoris, befähigt ist, ist das Plasmid pPDEX1.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Polynucleotid gemäß der vorstehenden Definition transformiert ist. Vorzugsweise handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Hefe, insbesondere um die Hefe Pichia pastoris. Ein besonders bevorzugtes Beispiel für eine derartige Wirtszelle ist der Pichia pastoris- Stamm MPDEX1.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung besteht in einer proteinhaltigen Substanz mit Dextranase-Aktivität, wobei diese Substanz ein Polypeptid, das im wesentlichen eine gemäß SEQ. Id. Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, oder ein Fragment davon umfaßt. Der hier verwendete Ausdruck "im wesentlichen" soll sämtliche proteinhaltigen Substanzen mit einer Homologie von mindestens 60% und vorzugsweise von mindestens 70% mit SEQ. Id. Nr. 2 umfassen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die proteinhaltige Substanz mit Dextranase-Aktivität ein Temperaturoptimum für die enzymatische Aktivität im Bereich von 55 bis 60ºC sowie eine prozentuale N-Glycosylierung von 13 bis 15% und eine Halbwertszeit bei 50ºC von etwa 7,6 Stunden auf.
Die Erfindung betrifft das Enzym, unabhängig davon, wie es hergestellt worden ist, beispielsweise durch rekombinante DNA-Technik/Gentechnik, chemische Synthese, enzymatischen Abbau oder eine Kombination davon. Ferner umfaßt die Erfindung nicht nur das Enzym als solches, sondern auch in Form von Fusionsproteinen mit Dextranase-Aktivität.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung einer proteinhaltigen Substanz mit Dextranase-Aktivität, das die Expression in Hefe einer DNA gemäß der hier gegebenen Definition, die für ein Dextranase-Enzym kodiert, umfaßt. Vorzugsweise erfolgt diese Expression in der Hefe Pichia pastoris. Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren gemäß der hier gegebenen Definition, wobei das gebildete Dextranase-Enzym aus dem Wachstumsmedium isoliert wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Hydrolyse von Dextran, das das Kontaktieren von Dextran unter geeigneten Dextran-Depolymerisationsbedingungen mit einem Dextranase-Enzym oder mit Zellen, die ein Dextranase-Enzym bilden, und gegebenenfalls die Gewinnung der gebildeten Dextran-Depolymerisationsprodukte umfaßt, wobei es sich beim Dextranase- Enzym um eine proteinhaltige Substanz gemäß der hier gegebenen Definition oder um eine proteinhaltige Substanz, die gemäß einem der hier definierten Verfahren erhalten worden ist, handelt.

Hinterlegung von Stämmen

Das Plasmid pp57 wurde am 22. August 1994 gemäß dem Budapester Vertrag bei Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM-LMBP- Collection) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer LMBP3116.
Die Stämme Penicillium minioluteum Dierckx (HI-4) und Pichia pastoris MP36 wurden am 22. August 1994 gemäß dem Budapester Vertrag bei der Mycotheque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL), Belgien, hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern MUCL 38929 bzw. MUCL 38930.

Beispiele

Diese Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu beschränken.

Beispiel 1

Dextranase-Induktionskinetik; in vitro-Translation der mRNA und Immunopräzipitation der Translationsprodukte

Die Dextranase-Induktionskinetik des Pilzes Penicillium minioluteum wurde in einem 5 Liter fassenden B. E. Marubishi-Fermenter (Tokyo, Japan) mit einem Gehalt an 3,5 Liter Medium der nachstehenden Zusammensetzung ermittelt: 0,7% NaNO&sub3;, 0,07% MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,35% KH&sub2;PO&sub4;, 0,002% Hefeextrakt und 2% natives Dextran aus einer Kultur von Leuconostoc mesenteroides (M. Raices et al., Biotecnologia Aplicada, Bd. 8(2) (1991), S. 248-255).
Dextranase-Induktionsuntersuchungen für andere Mikroorganismen haben die Abwesenheit einer enzymatischen Aktivität in Kulturen mit einem Gehalt an Glucose als Kohlenstoffquelle ergeben (J. Fukumote et al., J. Biochem., Bd. 69 (1971), S. 1113-1121; L. G. Simonson et al., Mycology, Bd. 67 (1975), S. 845-851; M. Madhu et al., Enzyme Microb. Technol., Bd. 6, S. 217-220). Um den Einfluß von Glucose auf die Enzym-Induktion in diesem Pilz zu analysieren wurde eine Kultur unter Zugabe von 2% Glucose anstelle von Dextran hergestellt.
Die Fermenter wurden mit Myzel, das mit 0,9% NaCl gewaschen worden war, beimpft. Die Fermentation wurde 100 Stunden durchgeführt, wobei die Temperatur auf 28ºC, der pH-Wert bei 5,5, die Rührgeschwindigkeit bei 300 U/min und die Belüftungsgeschwindigkeit auf 1 Vol./min gehalten wurden. Die Dextranase-Aktivität wurde gemäß Kosaric et al. (Biotech. Bioeng., Bd. XV (1973), S. 729-741) bestimmt. 1 Einheit (1 U) Dextranase ist definiert als die Enzymmenge, die 1 uMol Glucose-Äquivalente in 1 Minute aus T-2000-Dextran (Pharmacia) beim pH-Wert 5 und 40ºC freisetzt. Die reduzierenden Zucker wurden kolorimetrisch mit Dinitrosalicylsäure-Reagenz bestimmt (DNSA-Verfahren) (G. L. Miller, Anal. Chem., Bd. 31 (1959), S. 426-428).
Dextranase-Enzymaktivität in der Dextran-Kultur wurde nach 40-stündiger Fermentation festgestellt, wonach ein Anstieg dieser Aktivität bis zu einem Wert von 380 U/ml der Kultur folgte. Dagegen zeigte die in Gegenwart von Glucose gezüchtete Kultur keine Dextranase-Aktivität. Die Anwesenheit des Enzyms wurde auch durch Elektrophorese in 12,5% Polyacrylamid-Gel (PAGE) mit 1% Dextranblau (Pharmacia) und durch Western- Blotting (H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1979), S. 4350-4354; T. Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH, (1989), N. Y., USA) unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der in einem gegen gereinigte Dextranase aus dem Pilz Penicillium minioluteum immunisierten Kaninchen erzeugt worden war (M. Raices et al., Biotecnologia Aplicada, Bd. 8(2) (1991), S. 248-255), festgestellt. Beide Verfahren bestätigten die Anwesenheit des Enzyms nur in der mit Dextran induzierten Kultur nach 40-stündiger Fermentation.
Das in Dextran- oder Glucosemedien als Kohlenstoffquellen gezüchtete Pilzmyzel wurde durch Zentrifugation nach verschiedenen Fermentationszeiten (48, 56 und 72 Stunden) gewonnen. Die gesamte zelluläre RNA wurde unter Anwendung des Guanidiniumthiocyanat-Extractionsverfahrens von Chirgwin et al., (Biochem., Bd; 18 (1979), S. 5294-5299) isoliert. Die Poly (A)&spplus;-Fraktion wurde durch Chromatographie an einer oligo (dT)-Cellulosesäule (Sigma Chemical Company, USA) gemäß dem Verfahren von Avid und Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 69 (1972), S. 1408-1412) gereinigt. Die verschiedenen Fraktionen wurden in vitro in Kaninchen-Retikulozytenlysate (Kaninchen-Retikulozytenlysat, mit Nuclease translatiert, Promega) unter Verwendung von ³&sup5;S-Methionin (Amersham) übertragen. Die Translationsprodukte wurden gemäß Dobberstein et al. (Cell, Bd. 17 (1979), S. 759-769) mit Antidextranase-Immunoserum der Immunopräzipitation unterworfen. Die Immunopräzipitate wurden durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese analysiert.
Die in vitro-Translation der aus der in Dextran gezüchteten Kultur isolierten Poly (A)&spplus;-RNAs ergab zwei Polypeptide von ähnlichem Molekulargewicht, die durch den polyklonalen Antidextranase-Antikörper immunopräzipitiert wurden. Diese Polypeptide finden sich reichlich in der nach 56 Stunden isolierten mRNA-Population. Ihre Molekulargewichte liegen geringfügig über dem von natürlicher gereinigter Dextranase aus Penicillium minioluteum (67 kDa). Die aus der in Glucose gezüchteten Kultur isolierte mRNA führte nicht zur Synthese von Polypeptiden, die durch den Antidextranase-Antikörper immunopräzipitiert wurden.

Beispiel 2

Isolierung von für Penicillium minioluteum-Dextranase kodierender cDNA

Auf der Basis der Ergebnisse der in vitro-Translation und Immunopräzipitation wurden 5 ug Poly (A)&spplus;-RNA des 56 Stunden-Kulturwachstums zur Synthese von cDNA unter Verwendung des Stratagene-cDNA-Synthesekits eingesetzt (W. D. Huse et al., Strategies, Bd. 1 (1988), S. 1-3). Diese cDNA wurde mit dem EcoRI-XhoI-verdauten pBluescript II SK verknüpft (J. M. Short et al., Nucleic Acids Research, Bd. 16 (1988), S. 7583). Das Ligationsprodukt wurde in E. coli Stamm MC1061 transformiert (P. S. Meissner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 4171), wobei man auf diese Weise eine cDNA-Bank aus der dextraninduzierten Kultur konstruierte.
Die cDNA-Klone, die den differentiell regulierten Genen in der induzierten Kultur (in Dextran gezüchtet) in bezug zur nicht-induzierten Kultur (in Glucose gezüchtet) entsprachen, wurden durch differentielles Screening (plus-minus) gemäß den Angaben von Maniatis et al. (Molecular Cloning, 1989, CSH, N.Y., USA) isoliert. Zwei mit ³²P markierte cDNA-Sonden wurden aus 1 ug der Poly (A)&spplus; RNAs nach 56 Stunden der induzierten und nicht-induzierten Kulturen unter Verwendung von [α-³²P]-dATP (Amersham) synthetisiert. Die radioaktiv markierten Sonden wurden getrennt hybridisiert, um Kopien der gleichen cDNA-Bank zu duplizieren. Die Klone wurden ausgewählt, die nur mit der cDNA-Sonde aus der induzierten Kultur hybridisierten. Eine Kreuzhybridisierung unter den Klonen ermöglichte die Identifizierung von vier unterschiedlichen nicht-homologen Gruppen, die in der Bank 2,1%, 1,3%, 0,4% und 0,25% ausmachten. Die Northern-Blotting-Analyse (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 1989, CSH, N.Y. USA) der induzierten und nicht-induzierten Poly (A)&spplus;-RNAs unter Verwendung eines cDNA-Fragments aus jeder Gruppe von Klonen als Sonde bestätigte, daß diese cDNA-Fragmente Genen entsprachen, die differentiell in diesen Zellkulturen (induziert und nicht-induziert) exprimiert wurden, da die einzelnen Sonden nur mit der Poly (A)&spplus;-RNA aus der dextraninduzierten Kultur hybridisierten.
Um den Dextranase-cDNA-Klon zu identifizieren, wurde das T7-RNA-Polymerase-Promotor-Expressionssystem, das von Studier und Moffat (J. Mol. Biol., Bd. 189 (1986), S. 113) entwickelt wurde, herangezogen. Zu diesem Zweck wurde ein cDNA-Fragment für jede der vier Gruppen von Klonen ausgewählt und in pET-3a-, pET-3b- bzw. pET-3c-Vektoren subkloniert (F. W. Studier et al., Methods Enzymology, Bd. 185 (1990); T. Maniatis et al., Molecular doning, CSH, 1989, N.Y., USA). Diese Vektoren wurden vorher mit BamHI gespalten, an den Enden mit Klenow-Fragment gefüllt und mit alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) behandelt.
Die mit cDNA-Inserts verknüpften pET-3a-, pET-3b- und pET-3c-Vektoren wurden in E. cdi Stamm BL21(DE3)-pLysS durch Selektion auf Resistenz gegen Ampicillin und Chloramphenicol transformiert. BL21(DE3)-pLysS ist ein Lysogen, das das Bacteriophagen-T7-Polymerase-Gen unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors sowie auch das pLysS-Plasmid trägt, das Resistenz gegen Chloramphenicol verleiht und T7-Lysozym bildet, was die Wirtstoleranz gegenüber toxischen Zielplasmiden erhöht (B. A. Moffat et al., Cell, Bd. 49 (1987), S. 221-227; Inouye et al., J. Biol. Chem., Bd. 248 (1973), S. 7247; F. W. Studier et al., Methods Enzymology, 1990, S. 185).
Die cDNA-Fragmente, die mit dem Beginn des Gens 10 des T7-Bacteriophagen verbunden waren, wurden in B121(DE3)-pLysS als Fusionsproteine nach Induktion des Systems mit IPTG (Isopropylthio-β-D-galactosid) in einer Endkonzentration von 1 mM exprimiert. Die Western-Blotting-Analyse ergab ein Protein, das durch den polyklonalen Antidextranase-Antikörper erkannt wurde, wobei dieses Protein durch eine Transformante gebildet wurde, die das pETDX-Plasmid enthielt, das durch Subklonieren des HincII- cDNA-Fragments aus PBCDX-Plasmid in den pET-3a-Vektor konstruiert wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß das pBCDEX-Plasmid eine cDNA enthält, die für Penicillium minioluteum-Dextranase kodiert und daß diese cDNA der in der Bank am stärksten vertretenen Gruppe von Klonen entspricht (2,1%).
Die Dextranase-cDNA-Nucleotidsequennz enthält vier ATGs in der 5'- Region dieser Sequenz (vgl. SEQ. Id. Nr. 1), die mögliche Translationsstartstellen wiedergeben, da der Leseraster, den sie erzeugen, mit dem durch die pETDEX-Plasmidsequenz (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463-5467), mit der die Dextranase-Proteinexpression in E. coli erhalten wurde, bestimmten Raster zusammenfällt.
Die N-terminale Region von Dextranase, die von Penicillium minioluteum in das Medium sezerniert wurde, wurde dem Edman-Abbau unterworfen (P. Edman, Acta Chem. Scand., Bd. 4 (1950), S. 283-293). Eine Fraktion dieses gereinigten Proteins (M. Raices et al., Biotecnologia Aplicada, Bd. 8(2) (1991), S. 248-255) wurde auf einen vorher mit Methanol aktivierten PVDF-Filter (Polyvinylidendifluorid, Millipore) aufgetragen. Der Edman-Abbau wurde gemäß Silva et al. (EP-0 474 313 A2) unter Verwendung des Knauer-Sequenzierautomaten, Modell 810 in Verbindung mit einem HPLC-System (Hochleistungs-Flüssigchromatographie) durchgeführt, um auf diese Weise die Phenylthiohydantoin-Derivate der Aminosäuren (PTH- Aminosäuren) nachzuweisen. Diese Technik ergab folgende N-terminale Sequenz des Moleküls Met Gly Thr Thr Asn Asn Thr His Cys Gly Ala Asp Phe Cys Thr Trp (SEQ. Id. Nr. 3).
Diese Sequenz stimmt mit der Sequenz der ersten 16 Aminosäuren überein, die ab dem vierten ATG, das in der Dextranase-cDNA-Nucleotidsequenz identifiziert wurde (SEQ. Id. Nr. 1 und SEQ. Id. Nr. 2), translatiert wurden.
Wenn die von der cDNA-Sequenz zwischen dem ersten oder zweiten ATG bis zum vierten ATG translatierte Aminosäuresequenz (SEQ. Id. Nr. 1) analysiert wurde, ließen sich die folgenden üblichen Eigenschaften für Signalpeptide feststellen: der aminoterminalen Region folgt eine größere, stark hydrophobe Region, die eine α-Helix-Konformation aufweisen kann und am Carboxyl-Terminus von einer leicht hydrophilen Region flankiert ist.

Beispiel 3

Molekulare Klonierung von Dextranase-Genom-DNA

Chromosomale DNA aus Penicillium minioluteum wurde unter Anwendung des Verfahrens von Raeder und Broda (Lett. Appl. Microb., Bd. 1 (1985), S. 17-20) isoliert und durch Southern-Blotting analysiert. Die Genom-DNA wurde mit BamHI verdaut und mit einer Sonde, die eine Dextranase-cDNA-Sequenz enthielt, hybridisiert. Die Analyse ergab nur eine einzige Bande von etwa 9 kb. Dieses Ergebnis wurde als Grundlage zur Konstruktion einer Genbank in E. coli herangezogen.
Die mit BamHI verdaute chromosomale DNA wurde durch Sedimentation durch einen 10-40%-Saccharosegradienten gemäß Maniatis et al. (Molecular Cloning, CSH, 1989, N.Y., USA) fraktioniert. DNA-Fragmente von geeigneter Größe (über 6 kb) wurden mit dem Vektor pUC19 (C. Yanisch-Perron et al., Gene, Bd. 33 (1985), S. 103-119), der vorher mit BamHI gespalten und mit Phosphatase behandelt worden war) verknüpft und in E. coli Stamm MC1061 (P. S. Meissner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 4171) transformiert.
Der genomische Klon wurde in dieser Bank durch Hybridisierung mit der Dextranase-cDNA-Sonde identifiziert. Das isolierte rekombinante Plasmid wurde mit BamHI verdaut, wobei sich ergab, daß die Größe des genomischen Inserts (9 kb) der Größe entsprach, die vorher durch Southern- Blotting-Analyse von chromosomaler DNA erhalten wurde.
Ein im genomischen BamHI-Insert enthaltenes Fragment von 3629 bp, das das Dextranase-Gen einschließt, wurde sequenziert (SEQ. Id. Nr. 1), wobei das Verfahren von Sanger et al. herangezogen wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463-5467). Aus dem Vergleich der cDNA- und Genomsequenzen kamen wir zu dem Schluß, daß das Penicillium minioluteum-Dextranase-Gen in seiner Nucleotidsequenz keine Introns einschließt.

Beispiel 4

Homologie zwischen Dextranase-Genen von verschiedenen Pilzen, die dieses Enzym bilden

Zur Prüfung der bestehenden Homologie zwischen dem Dextranase-Gen von Penicillium minioluteum und analogen Genen von anderen, Dextranase bildenden Pilzen wurden folgende Pilzstämme der IMI-Sammlung (International Mycological Institute) verwendet:
1. Paecilomyces lilacinus (IMI 027 830);
2. Penicillium funiculosum (IMI 040 235);
3. Penicillium aculeatum (IMI 040 588);
4. Penicillium pinophilum (IMI 087 160);
5. Penicillium verruculosum (IMI 079 196).
Diese Stättime wurden in einem Reismedium (gewaschene und 15 Minuten bei 121ºC sterilisierte Reiskörner) gezüchtet, um eine Sporenbildung einzuleiten. Die Sporen wurden als Inokulum zur Entwicklung von Biomasse in flüssigem YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glucose) vom pH- Wert 5 unter 48-stündiger Züchtung bei 23ºC verwendet. Die gewonnene Biomasse wurde zur Isolierung von chromosomaler DNA gemäß den Angaben von Raeder und Broda (Lett. Appl. Microb., Bd. 1 (1985), S. 17-20) verwendet. Die aus jedem Stamm isolierte chromosomale DNA wurde durch Southern- Blotting gemäß Maniatis et al. (Molecular Cloning, CSH, 1989, N.Y., USA) analysiert. Genomische DNAs wurden mit BamHI verdaut und mit einer Sonde, die die Dextranase-cDNA-Sequenz des Pilzes Penicillium minioluteum enthielt, hybridisiert. Die als Ergebnis des Southern-Blotting beobachteten Hybridisierungsbanden zeigen, daß es eine starke Homologie zwischen den Dextranase-Genen von Penicillium funiculosum (IMI 040 235), Penicillium aculeatum (IMI 040 588), Penicillium pinophilum (IMI 087 160) und dem isolierten Penicillium minioluteum-Dextranase-Gen gibt. Jedoch wurden für chromosomale DNAs, die den Pilzen Paecilomyces lilacinus (IMI 027 830) und Penicillium verruculosum (IMI 079 196) entsprachen, keine Hybridisierungssignale beobachtet.
Um festzustellen, ob die durch diese Pilze gebildeten Dextranasen durch den polyklonalen Antikörper erkannt wurden, der mit aus Penicillium minioluteum gereinigtem Dextranase-Protein (Beispiel 1) erhalten wurde, wurden insgesamt 106 Sporen als Inokulum für 200 ml eines flüssigen Lösungsmediums mit 0,7% NANO&sub3;, 0,07% MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,35% KH&sub2;PO&sub4;, 0,002% Hefeextrakt und 2% nativem Dextran aus einer Leuconostoc mesenteroides-Kultur (M. Raices et al., Biotecnologia Aplicada, Bd. 8(2) (1991), S. 248-255) verwendet. Die Kulturen wurden 100 Stunden bei 26ºC inkubiert. Die Dextranase-Aktivität wurde im flüssigen Kulturüberstand nachgewiesen.
Zur Gewinnung des Dextranase-Enzyms wurden die Überstände eingeengt und ausgesalzt. Zu diesem Zweck wurden die Überstände gefriergetrocknet und in 10 ml destilliertem Wasser resuspendiert, um eine Dialyse in destilliertem Wasser durchzuführen. Anschließend wurden die Proben gefriergetrocknet, in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert und auf einer P2- Säule (Biorad, USA) ausgesalzt.
Die Western-Blotting-Analyse der Proben, die Penicillium funiculosum (IMI 040 235), Penicillium aculeatum (IMI 040 588) und Penicillium pinophilum (IMI 087 160) entsprachen, ergaben Proteinbanden von ähnlichem Molekulargewicht (67 kDa), die durch den polyklonalen Antidextranase-Antikörper gegen das Penicillium minioluteum-Dextranase-Protein erkannt wurden. Infolgedessen werden die Dextranase-Enzyme, die durch den Antidextranase-Antikörper erkannt werden, von den gleichen Pilzen, die eine DNA-Homologie mit dem Penicillium minioluteum-Dextranase-Gen zeigten, gebildet.

Beispiel 5

Expression von für Penicillium minioluteum-Dextranase kodierender cDNA in Pichia pastoris

Die für Dextranase kodierende cDNA wurde aus dem PBCDEX-Plasmid durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) amplifiziert. Das amplifizierte Fragment, ausgehend vom vierten ATG (entsprechend dem N-Terminus der vom Pilz Penicillium minioluteum sezernierten Dextranase; vgl. Beispiel 2) wurde in den PPS7-Vektor bei Fusion mit der SUC2-Gen-Signalsequenz von Saccharomyces cerevisiae inseriert, um eine Expression in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris unter der Kontrolle des methanolgesteuerten Alkohol-oxidase (AOX1)-Promotors, der für die Expression von Fremdproteinen in diesem Wirt verwendet wird (EP-438 200 A1), durchzuführen.
Beim PPS7-Plasmid (Fig. 1) handelt es sich um einen Pichia pastoris- Integrationsvektor, der für die heterologe Genexpression in diesem Wirt bestimmt ist. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pUC18 (C. Yanisch-Perron et al., Gene, Bd. 33 (1985), S. 103-119), das in E. coli repliziert werden kann und das Ampicillin-Resistenzgen trägt. Außerdem enthält dieser Vektor auch ein 1,15 kb-Fragment (PAOX1) des methanolgesteuerten Alkoholoxidase-Promotors gefolgt von der SUC2-Gen-Signalsequenz (sp SUC2) von Saccharomyces cerevisiae, die Transkriptions-Terminatorsequenz (GAPt) des Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Gens von Saccharomyces cerevisiae, das Saccharomyces cerevisiae HIS3-Gen und die 3'-Region (2,1 kb) des AOX1-Gens (3'AOX1). Dieser Vektor wurde mit NcoI gespalten, mit Mungobohnen-Nuclease stumpfendig gemacht und mit alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) gemäß Maniatis et al. (Molecular Cloning, CSH, 1989, N.Y., USA) behandelt.
Die beiden Oligonucleotid-Primer DX1, 5'-ATGGGCACTACGAATAATACCCAT (SEQ. Id. Nr. 4) und DXS, 5'-GGAAACCTGGAAATGTCCTTAT (SEQ. Id. Nr. 5), wurden zur Isolierung der cDNA-Dextranase durch PCR aus dem Plasmid pBCDEX gemäß Saiki et al., Science, Bd. 239 (1988), S. 487-491) verwendet. Das isolierte Fragment wurde unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und in den pPS7-Vektor subkloniert (Fig. 1).
Das durch Subklonieren der Dextranase-cDNA in den PPS7-Vektor konstruierte Plasmid pPDEX1 (Fig. 1) wurde mit PvuII verdaut und in den Mutantenstamm Pichia pastoris MP36 (his3&supmin;) unter Anwendung des von Meilhoc et al. (Bio/Technology, Bd. 8 (1990), S. 223-227) beschriebenen Elektroporationsverfahrens transformiert. Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit zum Wachstum auf G-Medium (P. Galzy und P. P. Slonimski, C. R. Acad. Sci. Paris, Bd. 245 (1975), S. 2423-2427) mit einem Gehalt an 2% Glucose (Histidin-Mangelmedium) durch Komplementierung der Mutation his3&supmin; in Pichia pastoris mit dem H153-Gen aus Saccharomyces cerevisiae selektiert (V. Yong et al., Biotecnologia Aplicada, Bd. 9 (1992), S. 55-61). Die gezüchteten Kolonien wurden auf eine Platte mit einem G-Medium und 0,4% Dextranblau (Pharmacia) übertragen. Die Dextranase-Expression wurde mit Methanoldampf induziert. Wenige Stunden nach der Induktion bildeten die Transformanten Höfe einer Dextran-Hydrolyse.
Die Dextranase-Expression wurde in Schüttelkolben mit 15 Transfermanten, die Aktivität auf den Dextranblau-Platten zeigten, untersucht. Zellen, die 22 Stunden bei 30ºC in 50 ml G-Medium mit einem Gehalt an 2% (Vol./Vol.) Glycerin gezüchtet worden waren, wurden zentrifugiert, gewaschen und im gleichen Medium mit einem Gehalt an 1% (Vol./Vol.) Methanol anstelle von Glycerin für die weitere Inkubation resuspendiert. Während des Wachstums wurden jeweils nach 12 Stunden 0,5% (Vol./Vol.) Methanol für eine Gesamtzeit von 100 Stunden zugegeben.
Die Dextranase-Aktivität in Proben des Kulturüberstands wurde gemäß den vorstehenden Angaben in Beispiel 1 bestimmt. Sämtliche Transformanten zeigten eine progressive Aktivitätszunahme des Kulturüberstands nach Induktion mit Methanol. Die MPDEX1-Transformante ergab 100 U/ml Dextranase- Aktivität im Kulturüberstand und wurde für weitere Dextranase-Expressionsuntersuchungen ausgewählt. Die aus dem MPDEX1-Stamm isolierte und mit EcoRI verdaute chromosomale DNA wurde durch Southern-Blotting analysiert. Die Analyse zeigt klar, daß die transformierende DNA den AOX1-Locus durch doppelte Kreuzrekombination aufbrach.
Die Dextranase-Expression im MPDEX1-Stamm wurde auch in einem 5 Liter fassenden Laboratoriumsferttienter (Arbeitsvolumen 3,5 Liter) (B. E. Marubishi, Tokyo, Japan) mit einem Gehalt an großtechnischem Medium (0,13% (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,09% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,05% Harnstoff und Melassen, die insgesamt 5% reduzierende Zucker ergeben) untersucht. Der Fermenter wurde bis zu einem OD&sub5;&sub3;&sub0;-Wert von 0,2 inokuliert. Nach Erreichen eines OD&sub5;&sub3;&sub0;- Werts von 60 wurde die Kultur mit Methanol induziert. Die Methanol-Zufuhrgeschwindigkeit wurde während einer 120-stündigen Züchtung allmählich auf 3,5 g/h pro Liter Kultur erhöht. Während dieses Fermentationsvorgangs wurde die Rührgeschwindigkeit von 350 U/min auf 750 U/min gesteigert, wobei die Temperatur auf 30ºC, der pH-Wert auf 5,2 und die Belüftungsgeschwindigkeit auf 1 vvm (Volumenteile pro Minute) gehalten wurden.
Die Dextranase-Aktivität im Kulturüberstand nahm nach der Methanolinduktion progressiv zu und erreichte einen Wert von 2500 U/ml (2,6 g in das Wachstumsmedium sezernierte Dextranase pro Liter Kultur). Nachdem die Zellen einer mechanischen Lysis mit Glaskügelchen gemäß Maniatis et al. (Molecular Cloning, CSH, 1989, N.Y., USA) unterworfen worden waren, wurde festgestellt, daß die Menge der in das Wachstumsmedium sezernierten Dextranase 85% der von den Zellen gebildeten Gesamtmenge entsprach. Somit ergibt sich bei diesem Wirt eine effiziente Sekretion der Dextranase in das Wachstumsmedium. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Konzentration der von dieser rekombinanten Hefe in das Wachstumsmedium sezernierten Dextranase (2500 U/ml; 2,6 g/Liter) bei annähernd der gleichen Fermentationszeit in einem 3,5 Liter-Ansatz signifikant größer als die vom Pilz Penicillium minioluteum sezernierte Konzentration (380 U/ml; 0,4 g/Liter) ist.
Eine Vergrößerung des Maßstabs wurde in einem 300 Liter fassenden Fermenter (200 Liter Arbeitsvolumen) (B. E. Marubishi, Tokyo, Japan) in großtechnischem Medium durchgeführt. Der Fermenter wurde bis zu einem OD&sub5;&sub3;&sub0;-Wert von 0,2 inokuliert. Nach Erreichen eines OD&sub5;&sub3;&sub0;-Werts von 70 wurde die Kultur mit Methanol induziert. Die Methanol-Zufuhrgeschwindigkeit wurde allmählich während einer Wachstumsdauer von 80 Stunden auf 3,5 g/h pro Liter Kultur erhöht. Während des Fermentationsvorgangs wurde die Rührgeschwindigkeit von 350 U/min auf 750 U/min erhöht, wobei die Temperatur auf 30ºC, der pH-Wert auf 5,2, das gelöste O&sub2; auf 20% und die Belüftungsgeschwindigkeit auf 1 vvm gehalten wurden. Nach Induktion mit Methanol stieg bei diesem Verfahren im vergrößerten Maßstab die Aktivität der extrazellulären Dextranase auf 2700 U/ml (2,8 g/Liter) innerhalb einer Fermentationszeit von 100 Stunden.

Beispiel 6

Strukturelle Charakterisierung von rekombinanter, in Pichia pastoris exprimierter Dextranase und Vergleich mit natürlicher Dextranase aus dem Pilz Penicillium minioluteum

Das rekombinante Enzym wurde aus dem Fermentationskulturüberstand (Beispiel 5) durch aufeinanderfolgende 15-minütige Zentrifugationsvorgänge mit 8000 U/min vor und nach 1-stündigem Erwärmen auf 50ºC gereinigt. Der Überstand wurde gegen 10 mM Ammoniumacetat-Puffer (pH-Wert 5) dialysiert und auf eine FFQ-Anionenaustauschersäule (125 x 18 mm, Pharmacia), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgesetzt. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 10 bis 750 mM Ammoniumacetat (pH-Wert 5) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Das erhaltene Chromatogramm ergab eine nicht-zurückgehaltene Fraktion und einen Hauptpeak, der mit einer Retentionszeit von 50 min nach Auftragen des Gradienten eluiert wurde. Beim Hauptpeak handelte es sich um den einzigen Peak, der eine Dextranase-Aktivität zeigte und eine einzige Bande bei SDS-Pelyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE-SDS) sowie bei Western-Blotting unter Verwendung von Kaninchen-Antidextranase- Antikörper (Beispiel 1) oder Erkennung mit einem spezifischen Lectin für Mannesylierung, Concanavalin A: Meerrettich-peroxidase (Cen A:HRP), zeigte. Sowohl die Elektrephorese als auch der Western-Blet zeigten eine doppelte Bande für das natürliche Produkt, wie von Raices et al. angegeben wurde (Bietecnologia Aplicada, Bd. 8(2) (1991), S. 248-255), während das rekombinante Produkt nur eine einzige Bande ähnlich der bei natürlicher Dextranase beobachteten schwereren Bande ergab. Es wurde auch festgestellt, daß das rekembinante Enzym die gleiche spezifische Aktivität wie das natürliche Enzym im Bereich von 950-1000 U/mg Protein behält.
Gemäß der Bestimmung der gesamten Kohlenhydrate durch das Phenol- Schwefelsäure-Verfahren (M. Dubeis et al., Anal. Chem., Bd. 28 (1956), S. 350) wurde festgestellt, daß der prozentuale Glycesylierungsanteil des natürlichen Enzyms 4-5% betrug, während sich für das rekembinante Enzym 13-15% ergaben (etwa das 3-fache). Die festgestellte Glycesylierung war vorwiegend mit Oligomannosid-Strukturen N-verknüpft, wie die Identifikatienstests mit Cen A:HRP und auch die Deglycosylierung mit PNGase F (Beehringer Mannheim) ergaben. Diese Tests zeigten auch, daß es nur einige N-Glycesylierungsstellen gab, da die Größendifferenz zwischen dem nativen Enzym und dem deglycosylierten Enzym bei Behandlung mit Ende H und PNGase F klein waren, was mit den Ergebnissen zusammenfällt, die den Ergebnissen der Aminosäuresequenz des Proteins (SEQ. Id. Nr. 2), abgeleitet aus der Nucleetidsequenz, entsprachen, wo nur drei N-Glycesylierungsstellen aufgefunden wurden. Ferner wurde mittels eines DIG-Glycan-Differenzierungskits (Beehringer Mannheim) gezeigt, daß es keine O-Glycosylierung gibt.
Die N-terminalen Sequenzen von natürlicher und rekembinanter Dextranase waren beim automatischen Edman-Abbau identisch (Beispiel 2). Ein Vergleich der Peptidkarten beider Proteine nach Verdau mit Trypsin (Beehringer Mannheim) in einem Enzym:Substrat-Verhältnis von 1:100 (Gew./Gew.) in 100 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 8) bei 4-stündiger Behandlung bei 37ºC und Fraktionierung in einer C4-Umkehrphasen-HPLC-Säule (4,6 x 250 mm) mit einem linearen Gradienten von 1 bis 60% Acetonitril mit 0,05% TFA für 120 min ergab, daß in beiden Fällen die Hauptfragmente die gleiche Retentionszeit und ein sehr ähnliches allgemeines Elutionsprefil zeigten. Einige Fragmente wurden aus dem rekombinanten Enzymchromatogramm ausgewählt und durch Massenspektrometrie unter Verwendung von Xenon-Fast Atom Bembardment als Ionisierungsquelle (FAB/MS) sequenziert. Einige Peptide wurden einem "linked scan" (gleichzeitiges elektrisches und magnetisches Feld-Abtasten) unterworfen, um eine Sequenzierung gemäß Gonzales et al. (Analytical Biochemistry, Bd. 205 (1992), S. 151-158) durchzuführen. Die Peptidsequenzen entsprachen Fragmenten der mit dem Dextranase-Gen translatierten Sequenz (SEQ. Id. Nr. 2).

Beispiel 7

Biochemische Charakterisierung von rekombinanter Dextranase und Vergleich mit dem natürlichen Enzym aus dem Pilz Penicillium minioluteum

a) Bestimmung von Km und Vmax

Eine Dextran T-2000 (Pharmacia)-Depolymerisatienskinetik wurde bei 25ºC bei einer konstanten Enzymkonzentratien von 0,1276 U/ml durchgeführt, wobei die Substratkenzentratien von 0,8 bis 3,5 mg/ml variierte. Die verbleibende Dextrankonzentration wurde durch den Nicholsen-Hersley- Trübungstest (J. Agr. Feed Chem., Bd. 7 (1959), S. 640-643) bestimmt. Die anfänglichen Depolymerisatiensgeschwindigkeiten (IDR, in mg Dextran pro ml pro Minute) wurden berechnet, indem man die Reaktionsgeschwindigkeit auf eine Reaktion erster Ordnung für Substratkonzentrationen von 0,8 bis 2,6 mg/ml und auf eine Reaktion 0. Ordnung für Substratkonzentrationen von mehr als 2,6 mg/ml einstellte.
Die Lineweaver-Burk-Modifikation der Michaelis-Menten-Gleichung wurde auf die erstgenannten Daten (Fig. 2) angewandt, um die Km und Vmax- Werte sowohl für das natürliche als auch für das rekombinante Enzym zu bestimmen. Es zeigte sich, daß diese kinetischen Parameter für beide Enzyme gleich waren, wie aus Tabelle 1 hervorgeht. Tabelle 1 Vergleich der kinetischen Parameter Km und Vmax für natürliche (Penicillium minioluteum) und rekombinante Dextranase (MPDEX1)

b) Einfluß des pH-Wert-Werts auf die enzymatische Aktivität; Stabilität bei verschiedenen pH-Werten

Relative Aktivitätswerte (angegeben als % der maximalen Aktivität) wurden bei verschiedenen pH-Werten von 2 bis 9 gemessen. Es wurde festgestellt, daß der optimale pH-Wert für die Aktivität 5 beträgt. Er ist sowohl für das natürliche als auch für das rekombinante Enzym ähnlich (Fig. 3).
Eine Stabilitätszunahme (gemessen als % restliche Aktivität nach 30- minütiger Inkubation des Enzyms bei 50ºC) des rekombinanten Enzyms in bezug zum natürlichen Enzym im pH-Bereich von 5,5 bis 7 wurde beobachtet (Fig. 4). Außerdem wurde die Stabilität beider Enzyme durch pH-Werte unter 3,5 erheblich beeinträchtigt.

c) Einfluß der Temperatur auf die enzymatische Aktivität) Stabilität bei verschiedenen Temperaturen

Die relativen Aktivitäten beider Enzyme wurden bei verschiedenen Temperaturen gemessen (Fig. 5). Sowohl das natürliche als auch das rekembinante Enzym waren gegenüber Temperaturveränderungen empfindlich. Das erstgenannte Enzym zeigte eine optimale Aktivität bei 30-40ºC und das zweite bei 55-60ºC. Eine Temperaturvariatien von +/-10ºC brachte eine Verringerung der maximalen Aktivität von 20-40% sowohl für das natürliche als auch für das rekombinante Enzym mit sich.
Die thermische Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man die Temperatur veränderte und die Restaktivität nach verschiedenen Inkubatienszeiten maß. Die Enzym-Denaturierungsreaktion entsprach einer Kinetik erster Ordnung.
leg(%Akt.) = k*t + 2 (1),
wobei
%Akt. = Restaktivität des Enzyms,
k = Geschwindigkeitskenstante der Denaturierungsreaktien und
t = Zeit.
Nach Auftragen von log(k) gegen 1/T (angegeben in Kelvin gemäß der Arrhenius-Gleichung, Fig. 6) und unter Berücksichtigung der Gleichung (1) wurde die Halbwertszeit (t1/2) bei verschiedenen Temperaturen als die Zeitspanne bestimmt, nach der das Enzym 50% der ursprünglichen Aktivität verloren hatte. Die bei 30 und 50ºC ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2 Vergleich der berechneten Halbwertszeit (t1/2) für das natürliche und das rekombinnante Enzym
Die Tatsache, daß das rekombinante Enzym eine höhere thermische Stabilität und eine höhere Stabilität im pH-Bereich von 5,5 bis 7 aufweist als das natürliche Enzym, und auch die optimale Temperaturaktivität bei 55-60ºC stellen für die Verwendung dieses Enzyms in der Zuckerindustrie einen Vorteil dar.

Tabelle 3

Sequenziertes Fragment aus einem genomischen Klon, enthaltend das Dextranase-Gen des Pilzes Penicillium minioluteum

Die klenierte cDNA begann bei Nucleotid #1080 und endete beim Nucleetid #3187. Die vier ATGs in der 5'-Region der cDNA-Sequenz begannen bei den Nucleotiden #1124, #1133, #1190 bzw. #1226. Die Aminosäuresequenz des sekretierten Dextranase-Enzyms wurde aus der Dextranase-cDNA-Sequenz des Pilzes Penicillium minieluteum abgeleitet. Die unterstrichenen Sequenzen entsprechen den Peptidsequenzen aus durch den MPDEX1-Stamm gebildeter rekombinanter Dextranase. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte und gereinigte DNA mit einer Nucleotidsequenz, die im wesentlichen einer Nucleotidsequenz im Dextranase-Gen gemäß der Darstellung in SEQ. Id. Nr. 1 des Pilzes Penicillium minioluteum entspricht oder damit hybridisiert.

2. Isolierte und gereinigte DNA nach Anspruch 1, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Enzym mit Dextranase-Aktivität kodiert.

3. Isolierte und gereinigte DNA nach Anspruch 2, die eine Nucleotidsequenz umfaßt, die für das Dextranase-Enzym des Pilzes Penicillium minioluteum kodiert.

4. Isolierte und gereinigte DNA nach Anspruch 2, wobei die Nucleotidsequenz im wesentlichen für die in SEQ. Id. Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz kodiert.

5. Isolierte und gereinigte DNA nach Anspruch 2, wobei die Nucleotidsequenz im wesentlichen aus den Nucleetiden #1226 bis #2947 von SEQ. Id. Nr. 1 besteht.

6. Isolierte und gereinigte DNA nach Anspruch 1, umfassend eine Nucleetidsequenz aus der Premeterregion des Dextranase-Gens des Pilzes Penicillium minioluteum.

7. Isolierte und gereinigte DNA nach Anspruch 6, wobei die Nucleotidsequenz im wesentlichen aus den Nucleotiden innerhalb der Region der Nucleotide #1 bis #1079 von SEQ. Id. Nr. 1 besteht.

8. Rekembinantes Pelynucleotid, umfassend die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und eine Nucleetidsequenz eines Klonierungs- oder Expressionsvektors, wobei das Polynucleotid dazu befähigt ist, die Expression eines Preteins in einem geeigneten Wirt zu dirigieren.

9. Rekombinantes Pelynucleetid nach Anspruch 8, das dazu befähigt ist, die Expression eines Preteins mit Dextranase-Aktivität in einem geeigneten Wirt zu dirigieren.

10. Rekombinantes Polynucleotid nach Anspruch 8, das dazu befähigt ist, die Expressien eines Proteins mit Dextranase-Aktivität in einer Hefe zu dirigieren.

11. Rekombinantes Polynucleotid nach Anspruch 8, das dazu befähigt ist, die Expressien eines Preteins mit Dextranase-Aktivität in der Hefe Pichia pastoris zu dirigieren.

12. Rekombinantes Polynucleotid nach Anspruch 8, wobei es sich um das in Fig. 1 dargestellte Plasmid pPDEX1 handelt.

13. Wirtszelle, transformiert mit dem rekombinanten Polynucleotid nach einem der Ansprüche 8 bis 12.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, bei der es sich um eine Hefe handelt.

15. Wirtszelle nach Anspruch 13, bei der es sich um die Hefe Pichia pastoris handelt.

16. Wirtszelle nach Anspruch 13, bei der es sich um Pichia pastoris Stamm MPDEX1 handelt, der durch Transformation des in Fig. 1 dargestellten Plasmids pPDEX1 in Pichia pastoris Stamm MP36 (MUCL 38930) erhalten werden ist.

17. Proteinhaltige Substanz mit Dextranase-Aktivität, die ein Polypeptid mit im wesentlichen der in SEQ. Id. Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, oder ein Fragment desselben mit Dextranase-Aktivität.

18. Proteinhaltige Substanz mit Dextranase-Aktivität nach Anspruch 17, das eine optimale Temperatur für die enzymatische Aktivität im Bereich von 55 bis 60ºC aufweist sowie eine prozentuale N-Glycesylierung von 13 bis 15% und bei 50ºC eine Halbwertszeit von etwa 7,6 Stunden aufweist.

19. Verfahren zur Herstellung einer preteinhaltigen Substanz mit Dextranase-Aktivität, umfassend die Expression einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die für ein Dextranase-Enzym kodiert, in Hefe.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Expressien in der Hefe Pichia pastoris durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Dextranase-Enzym aus dem Wachstumsmedium isoliert wird.

22. Verfahren zur Hydrolyse von Dextran, umfassend das Kontaktieren von Dextran unter geeigneten Dextran-Depolymerisationsbedingungen mit einem Dextranase-Enzym oder mit Zellen, die ein Dextranase-Enzym bilden, und gegebenenfalls Gewinnen der gebildeten Dextran-Depolymerisationsprodukte, wobei es sich beim Dextranase-Enzym um eine proteinhaltige Substanz gemäß Anspruch 17 oder 18 oder um eine proteinhaltige Substanz, die gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 19-21 erhalten werden ist, handelt.