DE60034318T2

DE60034318T2 - A-agarase und verfahren zur herstellung derselben

Info

Publication number: DE60034318T2
Application number: DE60034318T
Authority: DE
Inventors: Jun Terado-cho Muko-shi TOMONO; Yoshiko Higashiyama-ku Kyoto-shi NOMURA; Hiroaki Kusatsu-shi SAGAWA; Takeshi Hirosaki-shi SAKAI; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-02-23
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2020-02-22
Also published as: TWI224621B; CN1347452A; AU2575200A; US7604962B2; JP3916400B2; US6599729B2; US7351556B2; CN1179042C; KR20010102209A; US20020156240A1; US20080160584A1; US20060234355A1; WO2000050578A1; EP1156104A4; EP1156104A1; ATE359362T1; DE60034318D1; KR100612133B1; US7141402B2; EP1156104B1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine α-Agarase und ein Verfahren zur Herstellung derselben. Insbesondere betrifft die Erfindung eine α-Agarase, die für die Produktion von Agarooligosacchariden mit geringen Polymerisationsgraden, die verschiedene physiologische Aktivitäten aufweisen, aus Agarose geeignet ist, ein Verfahren zur Herstellung der α-Agarase und ein Gen, das die α-Agarase kodiert. Zusätzlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Agarooligosaccharids unter Verwendung der α-Agarase.
Technischer Hintergrund
Agarose ist der grundsätzliche Bestandteil von Agar. Agarose ist ein Polysaccharid, das eine Struktur hat, in der D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose abwechselnd durch α-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen miteinander verbunden sind. Agarose muss in kleinere Moleküle abgebaut werden, um Oligosaccharide aus Agar herzustellen. Zu diesem Zweck sind Verfahren, bei denen Agarose chemisch abgebaut wird, und Verfahren, bei denen Agarose enzymatisch verdaut wird, bekannt. Bei einem chemischen Abbauverfahren kann Agarose mit Hilfe einer Säure hydrolysiert werden. In diesem Fall werden hauptsächlich α-1,3-Bindungen gespalten. Zwei Enzyme, β-Agarase, die β-1,4-Bindungen in Agarose spaltet, und α-Agarase, die α-1,3-Bindungen in Agarose spaltet, sind für den Verdau von Agarose bekannt.
Durch Spaltung von Agarose an β-1,4-Bindungen erhaltene Oligosaccharide werden Neoagarooligosaccharide genannt. Neoagarooligosaccharide haben D-Galactose an ihren reduzierenden Enden und ihre Polymerisationsgrade werden durch gerade Zahlen angegeben. Auf der anderen Seite werden durch Spaltung von Agarose an α-1,3-Bindungen erhaltene Oligosaccharide Agarooligosaccharide genannt. Agarooligosaccharide haben 3,6-Anhydro-L-Galactose an ihren reduzierenden Enden und ihre Polymerisationsgrade werden in geraden Zahlen angegeben. Kürzlich wurde ge zeigt, dass Agarooligosaccharide, die 3,6-Anhydro-L-Galactose an ihren reduzierenden Enden haben, physiologische Aktivitäten wie Apoptose-induzierende Aktivität, karzinostatische Aktivität, verschiedene antioxidative Aktivitäten, immunoregulatorische Aktivität, antiallergische Aktivität, entzündungshemmende Aktivität und α-Glycosidase-inhibierende Aktivität aufweisen ( WO 99/24447 , japanische Patentanmeldung Nr. 11-11646 ). Basierend auf den physiologischen Aktivitäten können pharmazeutische Zusammensetzungen und funktionelle Nahrungsmittel oder Getränke, die die Agarooligosaccharide als ihre aktiven Inhaltsstoffe enthalten, bereitgestellt werden.
Es ist schwierig, die Größe der hergestellten Oligosaccharide in einem Verfahren, in dem Agarose chemisch abgebaut wird, zu steuern. Insbesondere ist es ziemlich schwierig, selektiv kleinere Oligosaccharide mit geringen Polymerisationsgraden herzustellen (z.B. T. Tokunaga et al., Bioscience & Industry, 49:734 (1991)). Wenn β-Agarase verwendet wird, können nur Neoagarooligosaccharide, die nicht die vorstehend beschriebenen physiologischen Aktivitäten haben, erhalten werden, da dieses Enzym nur β-1,4-Bindungen spaltet.
Es wird erwartet, dass Agarooligosaccharide, die physiologische Aktivitäten aufweisen, durch die Verwendung von α-Agarase, die eine α-1,3-Bindung-spaltende Aktivität aufweist, hergestellt werden. Bekannte α-Agarasen umfassen Enzyme, die durch den marinen Gram-negativen bakteriellen Stamm GJ1B (Carbohydrate Research, 66:207-212 (1978); dieser Stamm ist als Alteromonas agarlyticus Stamm GJ1B im European Journal of Biochemistry, 2 14: 599-607 (1993) bezeichnet) und ein Bakterium der Gattung Vibrio ( JP-A 7-322878 ; Stamm JT0107-L4) hergestellt werden. Jedoch ist es unmöglich, Agarobiose, die beachtenswerte physiologische Aktivitäten aufweist, durch die Verwendung der von Alteromonas agarlyticus Stamm GJ1B abgeleiteten α-Agarase herzustellen, da das Enzym nicht Hexasaccharide oder kürzere Oligosaccharide verdauen kann. Des Weiteren kann die von dem Bakterium der Gattung Vibrio abgeleitete α-Agarase nicht für die Herstellung von Agarooligosacchariden unter Verwendung von Agarose als Ausgangsmaterial verwendet werden, weil dieses Enzym nur eine Aktivität auf Hexasaccharide und kürzere Oligosaccharide aufweist und nicht auf Agarose wirkt.
Wie vorstehend beschrieben gibt es im Stand der Technik Probleme mit der Herstellung von kleineren Agarooligosacchariden wie Agarobiose und Agarotetraose, die 3,6-Anhydro-L-Galactose an ihren reduzierenden Enden haben und verschiedene physiologische Aktivitäten aufweisen.
Gegenstände der Erfindung
Der Hauptgegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Polypeptids, das eine α-Agarase-Aktivität aufweist und das für die effiziente Herstellung von kleineren Agarooligosacchariden verwendet werden kann, eines Gens, das das Polypeptid kodiert, eines Verfahrens zur Herstellung des Polypeptids und eines Verfahrens zur Herstellung der kleineren Agarooligosaccharide.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen Probleme haben die Erfinder versucht, ein Enzym zu erhalten, das α-1,3-Bindungen in Agarose spaltet und Agarooligosaccharide, die bemerkenswerte physiologische Aktivitäten aufweisen, herstellt. Als Ergebnis haben die Erfinder zwei mikrobielle Stämme gefunden, die Enzyme herstellen, die zu diesem Zweck geeignete Eigenschaften haben. Die von diesen Mikroorganismen hergestellten Enzyme wurden isoliert und ihre physikalischen und chemischen sowie enzymatischen Eigenschaften wurden bestimmt. Des Weiteren haben die Erfinder für diese Enzyme kodierende Gene isoliert und ein Verfahren zur leichten Herstellung von Polypeptiden mit α-Agarase-Aktivitäten mit Hilfe von Gentechnik unter Verwendung der Gene gefunden, wodurch die Erfindung fertig gestellt wurde.
Die Erfindung ist wie folgt zusammengefasst. Der erste Aspekt der Erfindung betrifft eine α-Agarase mit den nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

(1) Aktivität: Hydrolysiert eine α-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galactose und D-Galactose;
(2) Substratspezifität: Wirkt ein auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide, die länger als Agarohexaose sind, jedoch nicht auf Agarotetraose;
(3) Temperaturoptimum: Weist enzymatische Aktivität bei einer Temperatur von 55°C oder weniger auf; und
(4) Hitzestabilität: Behält 20% oder mehr ihrer Aktivität nach Behandlung bei 48°C für 30 Sekunden bei,

Der zweite Aspekt der Erfindung betrifft ein Gen, das für die α-Agarase des ersten Aspekts kodiert. Solche Gene sind beispielhaft wiedergegeben durch ein Gen, das eine Nukleotidsequenz, die aus 2247 Basen von der Basenzahl 529 bis zu der Basenzahl 2775 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 12 besteht, oder einer Nukleotidsequenz, in der eine oder mehrere Basen in der Nukleotidsequenz, die aus 2247 Basen besteht, substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, enthält, oder ein Gen, das eine Nukleotidsequenz, die aus 2301 Basen von der Basenzahl 550 bis zu der Basenzahl 2850 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 13 besteht, oder eine Nukleotidsequenz, in der eine oder mehrere Basen in der Nukleotidsequenz, die aus 2301 Basen besteht, substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, enthält.
Der dritte Aspekt der Erfindung betrifft ein Gen, das mit dem Gen des zweiten Aspekts unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und für eine α-Agarase mit den physikalischen und chemischen Eigenschaften der α-Agarase des ersten Aspekts kodiert.
Der vierte Aspekt der Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das das Gen des zweiten oder dritten Aspekts enthält.
Der fünfte Aspekt der Erfindung betrifft eine Transformante, die das rekombinante DNA-Molekül des vierten Aspekts trägt.
Der sechste Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der α-Agarase des ersten Aspekts, das ein Kultivieren eines Mikroorganismus, der fähig ist, die α-Agarase des ersten Aspekts zu produzieren (z.B. ein Mikroorganismus, der zu einer Gattung gehört, zu der der Mikroorganismus TKR1-7AGα (FERM BP-6990) oder der Mikroorganismus TKR4-3AGα (FERM BP-6991) gehört), und ein Gewinnen der α-Agarase aus der Kultur umfasst. Sowohl der Mikroorganismus TKR1-7AGα als auch TKR4-3AGα wurden gemäß dem Budapester Vertrag am 26. Januar 1999 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan unter den Zugangsnummern FERM BP-6990 bzw. FERM BP-6991 hinterlegt.
Der siebte Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der α-Agarase des ersten Aspekts, das ein Kultivieren der Transformanten des fünften Aspekts und ein Gewinnen der α-Agarase aus der Kultur umfasst.
Der achte Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Agarooligosaccharids, das ein Verdauen von Agarose unter Verwendung der α-Agarase des ersten Aspekts und ein Gewinnen eines Agarooligosaccharids aus dem sich ergebenden Aufschlussprodukt umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht den Verdau von Agarohexaose durch die erfindungsgemäße α-Agarase.
2 veranschaulicht den Verdau von Agarohexaose durch die erfindungsgemäße α-Agarase.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Soweit hierin verwendet, bezeichnet ein Oligosaccharid ein Saccharid bestehend aus zwei oder mehr und zehn oder weniger Monosacchariden. Ein Agarooligosac charid bezeichnet ein Oligosaccharid, das eine Struktur hat, in der D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose abwechselnd durch α-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen miteinander verbunden sind, und das 3,6-Anhydro-L-Galactose an seinem reduzierenden Ende hat. Ein Polysaccharid bezeichnet ein Saccharid mit Ausnahme von Monosacchariden und Oligosacchariden.
Die erfindungsgemäße α-Agarase ist ein Enzym, das eine α-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-Galactose und D-Galactose hydrolysiert. Sie kann sowohl auf Polysaccharide wie Agarose als auch auf Oligosaccharide wie Agarohexaose wirken. Beispiele davon umfassen eine α-Agarase, die durch den marinen Mikroorganismus TKR1-7AGα (FERM BP-6990) oder TKR4-3AGα (FERM BP-6991) hergestellt wird.
Agarase 1-7, hergestellt durch den Mikroorganismus TKR1-7AGα, und Agarase 4-3, hergestellt durch den Mikroorganismus TKR4-3AGα, sind Enzyme, die α-1,3-Bindungen zwischen 3,6-Anhydro-L-Galactose und D-Galactose in Polysacchariden und Oligosacchariden hydrolysieren. Diese Enzyme wirken auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide, die länger als Agarohexaose sind, sowie auf Neoagarohexaose und Neoagarooligosaccharide, die länger als Neoagarohexaose sind, ein.
Ein Verfahren zur Messung der Aktivitäten der vorstehend genannten zwei Enzyme und physikalische und chemische sowie enzymatische Eigenschaften der Enzyme sind nachstehend beschrieben.
(1) Verfahren zur Messung enzymatischer Aktivität
Die Aktivität der erfindungsgemäßen α-Agarase wird durch Durchführen einer enzymatischen Reaktion unter Verwendung von Agarose als Substrat und dann Quantifizieren der erhaltenen Agarotetraose gemessen. Insbesondere ist das Verfahren zur Messung einer enzymatischen Aktivität, das hierin zur Messung der Aktivität einer gereinigten Enzym-Präparation und eines Enzyms während des Verlaufs einer Reinigung verwendet wird, wie folgt.
Eine Lösung, die Agarose (Takara Shuzo, Code: 5003) bei einer Konzentration von 0,2% in 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid enthält, wird hergestellt. 180 μl dieser Lösung werden als Substrat mit 20 μl einer Enzymlösung gemischt. Das Gemisch wird bei 42°C für 30 bis 120 Mi nuten, vorzugsweise 60 Minuten reagieren gelassen, und wird dann auf 60°C für eine Minute erhitzt, um die Reaktion zu stoppen. 30 μl dieses Reaktionsgemisches werden auf eine TSKgel α-2500-Säule (innerer Durchmesser: 7,8 mm; Länge: 300 mm; Tosoh, Code: 18339) aufgetragen. Ein Peak wird bei einer Retentionszeit von etwa 26 Minuten unter Verwendung von 70% Acetonitrillösung als Eluent bei einer Flussrate von 0,8 ml/Minute eluiert. Agarotetraose, die als ein Ergebnis der enzymatischen Reaktion hergestellt wird, wird in dem Peak quantifiziert. Eine Einheit (1 U) ist definiert als die Menge des Enzyms, die 1 Mikromol Agarotetraose in 10 Minuten herstellt.
(2) Optimaler pH-Wert
Einem Enzym wurde erlaubt, auf Agarose als Substrat in einem Reaktionsgemisch, das unter Verwendung eines Acetatpuffers (pH 4,5), eines Malatpuffers (pH 5,5), eines Acetatpuffers (pH 6,0, 6,5) oder eines Tris-Hydrochloridpuffers (pH 7,0, 7,5, 8,8) hergestellt wurde, einzuwirken. Es wurde gezeigt, dass Agarase 1-7 und Agarase 4-3 ihre Agarose-verdauenden Aktivitäten unter neutralen bis schwach sauren Bedingungen bzw. unter schwach alkalischen bis schwach sauren Bedingungen aufweisen.
(3) Optimale Temperatur
Das erfindungsgemäße Enzym weist seine enzymatische Aktivität bei einer Temperatur von 55°C oder weniger auf. Es weist eine hohe Aktivität bei einer Temperatur im Bereich von 30 bis 48°C auf und weist die maximale Aktivität bei etwa 37 bis 42°C auf.
(4) Hitzestabilität
Verbleibende Aktivitäten der Enzym-Präparationen nach Behandlung bei 48°C, 50°C oder 60°C für 30 Sekunden wurden gemessen. Als Ergebnis wies Agarase 1-7 25% ihrer Aktivität nach Behandlung bei 48°C auf und Agarase 4-3 wies 22% ihrer Aktivität nach Behandlung bei 50°C auf.
(5) Molekulargewicht
Das Molekulargewicht von Agarase 1-7 wurde auf etwa 95000 abgeschätzt, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung eines 10-20% Polyacrylamid-Gradientengels bestimmt.
Das Molekulargewicht von Agarase 4-3 wurde durch Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugation unter Verwendung eines Glycerin-Dichtegradienten und von SDS-PAGE bestimmt. Als Ergebnis wurde das Molekulargewicht von Agarase 4-3 auf etwa 85000 geschätzt.
(8) Aminosäuresequenzierung durch Edman-Abbauverfahren
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen von Agarase 1-7 und Agarase 4-3 wie bestimmt durch das Edman-Abbauverfahren waren Asp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-Met-Phe bzw. Gly-Asp-Ile-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-Gly-Arg-Val-Ala. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen von Agarase 1-7 und Agarase 4-3 sind in SEQ ID NOs: 1 bzw. 2 gezeigt.
Wie nachstehend beschrieben wurden die Agarase 1-7 bzw. Agarase 4-3 kodierenden Gene isoliert. Auch wurden die durch diese Gene kodierten Aminosäuresequenzen bestimmt. Die durch das Agarase 1-7-Gen und das Agarase 4-3-Gen kodierten Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NOs: 14 bzw. 15 gezeigt. Das Polypeptid, das aus 749 Aminosäuren von der Aminosäurezahl 177 bis zu der Aminosäurezahl 925 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 besteht, und das Polypeptid, das aus 767 Aminosäuren von der Aminosäurezahl 184 bis zu der Aminosäurezahl 950 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 15 besteht, weisen beide die Aktivitäten der erfindungsgemäßen α-Agarase auf.
Die erfindungsgemäße α-Agarase kann aus einer Kultur gereinigt werden, die durch Kultivieren des Mikroorganismus TKR1-7AGα (FERM BP-6990) oder des Mikroorganismus TKR4-3AGα (FERM BP-6991) erhalten wurde. TKR1-7AGα und TKR4-3AGα wurden aus Meerwasser als Bakterien isoliert, die Agar aufnehmen. Sie haben die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.
Mikrobiologische Eigenschaften
(1) Morphologie
100 ml künstliches Meerwasser (Produktname: Jamarine S; Jamarine Laboratory) wurden hergestellt. 0,3 g Pepton (DIFCO, Code: 0123-17-3) und 0,02 g Hefeextrakt (DIFCO, Code: 0127-17-9) wurden zugegeben. Der pH-Wert wurde dann mit 3 M Natriumcarbonat auf 8,0 eingestellt. Das erhaltene Gemisch wurde in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben überführt. 0,1 g Agar (Nacalai Tesque, Code: 010-28) wurden zugegeben. Nach Sterilisation in einem Autoklaven wurde einer der vorstehend genannten Mikroorganismen in das Gemisch geimpft und bei 25°C bei 120 UpM über Nacht kultiviert. Die in den Kulturen gewachsenen Zellen von sowohl TKR1-7AGα als auch TKR4-3AGα waren stäbchenförmig und beweglich.
(2) Wachstum
100 ml künstliches Meerwasser (Produktname: Jamarine S; Jamarine Laboratory) wurden hergestellt. 0,3 g Pepton und 0,02 g Hefeextrakt wurden zugegeben. Der pH-Wert wurde dann mit 3 M Natriumcarbonat auf 8,0 eingestellt. 1,5 g Agar (Nacalai Tesque, Code: 010-28) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde zur Herstellung von Platten autoklaviert. Als die vorstehend benannten Mikroorganismen auf die Platten geimpft worden waren, wurde gezeigt, dass:

(a) sie gut bei 23-30°C wachsen; und
(b) das Agar-Gel mit dem Wachstum der Zellen verflüssigt wird. 100 ml künstliches Meerwasser (Produktname: Jamarine S; Jamarine Laboratory) wurden hergestellt. 0,3 g Pepton und 0,02 g Hefeextrakt wurden zugegeben. Der pH-Wert wurde dann mit 3 M Natriumcarbonat auf einen variierenden Wert eingestellt. Das erhaltene Gemisch wurde in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt. 0,1 g Agar wurden zugegeben. Nach Sterilisation in einem Autoklaven wurde einer der vorstehend genannten Mikroorganismen in das Gemisch geimpft. Dann wurde gezeigt, dass:
(c) sie gut bei pH 7,0 bis 8,5 wachsen.

TKR1-7AGα und TKR4-3AGα wurden gemäß dem Budapester Vertrag am 26. Januar 1999 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry unter der Zugangsnummer FERM BP-6990 bzw. FERM BP-6991 hinterlegt.
Informationen über die taxonomische Position von jedem der vorstehend genannten Mikroorganismen kann durch Analyse der Nukleotidsequenz des 16S-ribosomale RNA-kodierenden Gens, von dem bekannt ist, dass die Nukleotidsequenz spezifisch für jeden mikrobiellen Stamm ist, erhalten werden. Insbesondere wird chromosomale DNA aus den mikrobiellen Stämmen TKR1-7AGα und TKR4-3AGα extrahiert. PCRs werden unter Verwendung von Primern durchgeführt, die zur Amplifizierung einer Region des Gens oder eines Teils davon verwendet werden können. Nukleotidsequenzen der amplifizierten DNA-Fragmente werden bestimmt. Eine Homologiesuche unter Verwendung der GenBank-Datenbank gegen die bestimmten Sequenzen wird durchgeführt. Dann sind Mikroorganismen, die ähnliche Nukleotidsequenzen in der Region haben, d.h. taxonomisch nahe Mikroorganismen, bekannt.
DNA-Fragmente, die von 16S-ribosomale RNA-Genen in den Mikroorganismen TKR1-7AGα und TKR4-3AGα abgeleitet sind, wurden gemäß einem wie in Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology, 10:31-42 (1995) beschriebenen Verfahren amplifiziert. Primer 27f und 1492r, die in der Literatur beschrieben sind, wurden für die PCRs verwendet (Nukleotidsequenzen der Primer 27f und 1492r sind in SEQ ID NOs: 16 und 17 gezeigt). Die Nukleotidsequenzen der erhaltenen amplifizierten DNA-Fragmente wurden analysiert. Als Ergebnis wurden die folgenden Mikroorganismen gefunden, die jeweils eine Homologie von etwa 95% in der vorstehend genannten Region mit einem der Mikroorganismen, die die erfindungsgemäße α-Agarase herstellen, aufweisen:

TKR1-7AGα: Colwellia-artiges Bakterium;
TKR4-3AGα: Marines psychrophiles IC079.

Ein Medium, das eine Stickstoffquelle, eine anorganische Substanz und dergleichen, die durch jeden der Mikroorganismen verwendet werden können, so wie Agar, Agarose oder dergleichen als eine Kohlenstoffquelle enthält, kann als ein Medium für die Kultivierung des Mikroorganismus verwendet werden. Kommerziell erhältli ches Agar und Agarose kann verwendet werden. Beispiele von Stickstoffquellen beinhalten Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Trypton, Pepton und dergleichen. Hefeextrakt und Pepton werden vorzugsweise verwendet. Solch eine Stickstoffquelle kann auch als eine Kohlenstoffquelle zusätzlich zu Agar oder Agarose verwendet werden. Des Weiteren können Natriumchlorid, Eisencitrat, Magnesiumchlorid, Natriumsulfat, Calciumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbromid, Strontiumchlorid, Natriumborat, Natriumsilikat, Natriumfluorid, Ammoniumnitrat, Dinatriumhydrogenphosphat und dergleichen in Kombination als Salze verwendet werden.
Insbesondere kann vorzugsweise ein Medium verwendet werden, das durch Zugabe von Pepton, Hefeextrakt und Agar oder Agarose zu einem Medium bestehend aus künstlichem Meerwasser Jamarine S hergestellt wird. Es ist bevorzugt, Agar oder Agarose bei einer Konzentration von 0,1 bis 2,0% zuzugeben. Ein festes oder flüssiges Medium kann durch geeignetes Ändern der Konzentration von Agar oder Agarose hergestellt werden. Eine flüssige Kultur mit einer Konzentration von 0,1 bis 0,3% ist für den Zweck der Herstellung von Enzymen bevorzugt, während eine feste Kultur mit einer Konzentration von 1,2 bis 2,0% für den Zweck der Erhaltung von Zellen bevorzugt ist. Wenn Agarose mit einem geringen Schmelzpunkt für eine flüssige Kultur verwendet wird, kann sie mit einer Konzentration von 0,1 bis 1,0% verwendet werden.
Obwohl Kulturbedingungen mehr oder weniger abhängig von der Zusammensetzung des Mediums variieren, liegt die Kultivierungstemperatur bei 23 bis 30°C, vorzugsweise 25°C, der pH-Wert des Mediums bei 7,0 bis 8,5, vorzugsweise 7,2 bis 8,2, und die Kultivierungszeit bei 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise 24 bis 36 Stunden.
Die erfindungsgemäße α-Agarase, die während Kultivierung wie vorstehend beschrieben hergestellt wird, wird von den Zellen sekretiert. Dann werden die Zellen nach der Kultivierung mittels Zentrifugation, Filtration oder dergleichen entfernt, um einen Kulturüberstand zu erhalten.
Der erhaltene Kulturüberstand kann mittels Niederdruck-Konzentration oder Ultrafiltration zur Herstellung eines flüssigen Enzyms konzentriert werden. Alternativ kann der Kulturüberstand durch Lyophilisierung, Sprühtrocknung oder dergleichen zur Herstellung einer groben Enzympräparation in ein pulverförmiges Enzym umgewandelt werden. Die erfindungsgemäße α-Agarase kann durch ein herkömmliches Reinigungsverfahren wie Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder Lösungsmittelpräzipitation teilweise gereinigt werden. Des Weiteren kann eine gereinigte Enzympräparation, die zu einer einzelnen Bande nach Elektrophorese führt, mittels bekannten Reinigungsverfahren wie Säulenchromatographien (z.B. Anionenaustauschersäule und Gelfiltrationssäule) in Kombination erhalten werden.
Agarooligosaccharide wie Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose können durch Reaktion der so erhaltenen Kultur oder der erfindungsgemäßen α-Agarase in einem unterschiedlichen Grad an Reinheit mit einem in Rotalgen enthaltenen Polysaccharid wie Agar oder Agarose als Substrat hergestellt werden.
Agarose ist ein Polysaccharid, das eine Struktur hat, in der D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose abwechselnd miteinander durch α-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen verbunden sind. β-Agarase ist ein Enzym, das β-1,4-Bindungen in Agarose hydrolysiert. Oligosaccharide mit D-Galactose an ihren reduzierenden Enden, die durch die Wirkung dieses Enzyms hergestellt wurden, werden Neoagarooligosaccharide genannt und weisen nicht die für Agarooligosaccharide beobachteten physiologischen Aktivitäten auf. Wenn eine α-Agarase, die α-1,3-Bindungen in Agarose spaltet, verwendet wird, können Agarooligosaccharide mit 3,6-Anhydro-L-Galactose an ihren reduzierenden Enden hergestellt werden. Zwei Enzyme, die von Alteromonas agarlyticus Stamm GJ1B und einem Bakterium der Gattung Vibrio (Stamm JT0107-L4) abgeleitet sind, sind als α-Agarasen bekannt. Jedoch kann die von Alteromonas agarlyticus Stamm GJ1B hergestellte α-Agarase nicht auf Agarohexaose oder kürzere Oligosaccharide wirken, während die von dem Bakterium der Gattung Vibrio abgeleitete α-Agarase Agarose nicht verdauen kann. Daher war es unmöglich, Agarobiose oder Agarotetraose aus Agarose als Rohmaterial unter Verwendung einer bekannten α-Agarase effizient herzustellen.
Die erfindungsgemäße α-Agarase ist ein Enzym, das auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide länger als Agarohexaose wirkt, wie aus den vorstehend genannten physikalischen und chemischen Eigenschaften ersichtlich. Daher wirkt sie auf Agarose, um Agarooligosaccharide herzustellen. Des Weiteren kann sie die einzelne α-1,3-Bindung in Agarohexaose spalten, die als Ergebnis der Wirkung hergestellt wurde. Mit anderen Worten ist es dadurch, dass der erfindungsgemäßen α-Agarase ermöglicht wird, auf Agarose einzuwirken, möglich, Agarobiose und Agaro tetraose, ein Disaccharid und ein Tetrasaccharid, die gemäß herkömmlichen Verfahren kaum hergestellt worden sind, in großen Mengen zu erhalten.
Substratspezifitäten der bekannten α-Agarasen und der erfindungsgemäßen α-Agarase sind in Tabelle 1 gezeigt. In der Tabelle stellen die Zeichen + und – die Fähigkeit bzw. Unfähigkeit des Enzyms dar, das Substrat zu verdauen. Tabelle 1

Substrat Alteromonas agarlyticus GJ1B Bakterium der Gattung Vibrio (JT0107-L4) Agarase 1-7 Agarase 4-3

Agarose + – +

Agarohexaose – + +

Agarotetraose – + –
Die erfindungsgemäße α-Agarase wirkt auf Agarohexaose ein, um Agarobiose und Agarotetraose herzustellen.
Die Agarooligosaccharide, die mittels der erfindungsgemäßen α-Agarase hergestellt wurden, enthalten Agarobiose und Agarotetraose. Die Agarooligosaccharide können Agarohexaose oder Agarooligosaccharide länger als Agarohexaose enthalten, solange die Anwesenheit davon nicht den Zweck der Verwendung behindert. Agar, Agarose oder von Agar oder Agarose abgeleitete Oligosaccharide können als Rohmaterial für die Herstellung von Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose mittels der erfindungsgemäßen α-Agarase verwendet werden. Die für diese Wirkung der α-Agarase verwendeten Bedingungen sind nicht speziell eingeschränkt, solange das Enzym seine Aktivität unter den verwendeten Bedingungen aufweist. Zum Beispiel ist es bevorzugt, Agarase 1-7 zu erlauben, unter neutralen bis schwach sauren Bedingungen zu wirken, Agarase 4-3 zu erlauben, unter schwach alkalischen bis schwach sauren Bedingungen zu wirken, und beiden Enzymen zu erlauben, bei 37 bis 42°C zu wirken. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches ist nicht speziell eingeschränkt, solange es für die Wirkung des Enzyms geeignet ist.
Wie vorstehend beschrieben sind die Oligosaccharide, die mittels der erfindungsgemäßen α-Agarase hergestellt wurden, hauptsächlich Hexasaccharide oder kürzere Oligosaccharide mit geringen Polymerisationsgraden. Es ist jedoch möglich, gegebenenfalls Oligosaccharide mit unterschiedlichen Polymerisationsgraden durch geeignete Auswahl der Reaktionsbedingungen oder dergleichen herzustellen. Es ist auch möglich, Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose unabhängig durch Trennen und Reinigen der so erhaltenen Oligosaccharide zu erhalten.
Das erfindungsgemäße α-Agarase-Gen ist ein Gen, das für ein Polypeptid mit der vorstehend beschriebenen α-Agarase-Aktivität kodiert. Daher betrifft es eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Aminosäuresequenz für ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kodiert. Beispiele der erfindungsgemäßen α-Agarase-Gene beinhalten ein Gen, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für Agarase 1-7 abgeleitet von dem Mikroorganismus TKR1-7AGα (FERM 8P-6990) kodiert, und ein Gen, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für Agarase 4-3 abgeleitet von dem Mikroorganismus TKR4-3AGα (FERM BP-6991) kodiert. Gene, die für Agarase 1-7 und Agarase 4-3 kodieren, sind z.B. ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das aus 749 Aminosäureresten von der Aminosäurezahl 177 bis zu der Aminosäurezahl 925 in SEQ ID NO: 14 besteht, und ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das aus 767 Aminosäureresten von der Aminosäurezahl 184 bis zu der Aminosäurezahl 950 in SEQ ID NO: 15 besteht.
Die erfindungsgemäßen α-Agarase-Gene beinhalten auch eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz hat, in der eine oder mehrere Aminosäuren in der vorstehend erwähnten Aminosäuresequenz substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, und das eine α-Agarase-Aktivität aufweist.
Auch beinhalten die erfindungsgemäßen Gene ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die aus 2247 Basen von der Basenzahl 529 bis zu der Basenzahl 2775 in SEQ ID NO: 12 besteht, und ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die aus 2301 Basen von der Basenzahl 550 bis zu der Basenzahl 2850 in SEQ ID NO: 13 besteht. Die erfindungsgemäßen Gene beinhalten auch eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, in der eine oder mehrere Basen in der vorstehend genannten Nukleotidsequenz substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, und die ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kodiert.
Des Weiteren beinhalten die erfindungsgemäßen Gene eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die mit dem vorstehend genannten Gen unter stringenten Bedingungen hybridisiert und ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität ko diert. Hybridisierung kann gemäß eines Verfahrens wie z.B. in T. Maniatis et al. (Hrsg.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben durchgeführt werden. Die stringenten Bedingungen sind z.B. Inkubation mit einer Sonde bei 65°C über Nacht in einer Lösung, die 6 × SSC (1 × SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 Natriumcitrat, pH 7,0), 0,5% SDS, 5 × Denhardt's und 100 mg/ml Heringssperma-DNA enthält.
Das erfindungsgemäße α-Agarase-Gen kann z.B. wie folgt kloniert werden.
Genomische DNA wird von einem Mikroorganismus, der eine α-Agarase herstellt, präpariert. Die genomische DNA kann gemäß eines geeigneten bekannten Verfahrens präpariert werden. Zum Beispiel kann sie mittels bekannter Verfahren wie Lysozym-Behandlung, Protease-Behandlung, RNase-Behandlung, Phenol-Behandlung und Ethanolpräzipitation in Kombination präpariert werden. Die so erhaltene genomische DNA wird durch geeignete bekannte Mittel wie Ultraschall oder Verdau mit einem Restriktionsenzym abgebaut. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in einen Vektor (z.B. ein Plasmid-Vektor) gemäß eines herkömmlichen Verfahrens zum Erstellen rekombinanter DNA-Moleküle eingebaut. Die rekombinanten DNA-Moleküle werden dann in einen geeigneten Wirt (z.B. Escherichia coli) zum Erhalten von Transformanten eingebracht. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten DNA-Molekülen, Transformation und dergleichen können geeigneterweise abhängig von dem zu verwendenden Vektor und Wirt aus herkömmlichen Verfahren, z.B. den in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, beschriebenen, ausgewählt werden. Dadurch wird eine genomische Bibliothek erhalten, die eine Transformante enthält, die ein α-Agarase-Gen trägt.
Danach wird die genomische Bibliothek zur Auswahl der Transformanten, die das α-Agarase-Gen trägt, gescreent. Beispiele von Screening-Verfahren sind wie folgt.
(1) Screenen mittels Expression von α-Agarase-Aktivität als Index
Eine genomische Bibliothek wird auf Agarplatten wachsen gelassen. Eine Transformante, die ein α-Agarase-Gen trägt, exprimiert ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität. Das Polypeptid lysiert Agar-Gel durch die Wirkung seiner α-Agarase-Aktivität. Entsprechend wird eine Kolonie oder ein Plaque, die/das Agar-Gel in einer Agarplatte lysiert, ausgewählt.
(2) Screenen mittels Antikörper
Eine grobe, teilweise gereinigte oder gereinigte Enzympräparation einer α-Agarase wird wie vorstehend beschrieben hergestellt. Ein Anti-α-Agarase-Antikörper wird mittels der Präparation als Antigen gemäß eines herkömmlichen Verfahrens hergestellt.
Eine genomische Bibliothek wird auf Platten wachsen gelassen. Gewachsene Kolonien oder Plaques werden auf Nylon- oder Nitrocellulosefilter transferiert. Exprimierte rekombinante Proteine werden zusammen mit den Kolonien oder Plaques auf die Filter transferiert. Die rekombinanten Proteine auf den Filtern werden mit dem Anti-α-Agarase-Antikörper zur Identifizierung eines Klons, der mit dem Antikörper reagiert, umgesetzt.
Der Klon, der mit dem Antikörper reagiert, kann gemäß einem bekannten Verfahren, z.B. durch Reaktion eines Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörpers mit den Filtern, die mit dem Anti-α-Agarase-Antikörper reagiert wurden, Inkubation des Filters mit einem chromogenen Substrat und dann Detektion der entwickelten Farbe identifiziert werden.
Wenn ein Expressionsvektor, der zu einer hohen Expression eines Gens, das in den Vektor eingebaut wurde, führt, für die Herstellung der genomischen Bibliothek, die in dem Verfahren (1) oder (2) wie vorstehend beschrieben verwendet werden soll, verwendet wird, kann eine Transformante, die das Gen von Interesse trägt, leicht ausgewählt werden.
(3) Screenen durch Hybridisierung mittels DNA-Sonde
Eine genomische Bibliothek wird auf Platten wachsen gelassen. Gewachsene Kolonien oder Plaques werden auf Nylon- oder Nitrocellulosefilter transferiert. DNA wird durch Denaturierung auf die Filter immobilisiert. Die DNA auf den Filtern wird mit einer markierten Sonde gemäß eines herkömmlichen Verfahrens hybridisiert, um einen Klon zu identifizieren, der mit der Sonde hybridisiert.
Für dieses Screenen verwendete Sonden beinhalten ein Oligonukleotid, das basierend auf Informationen über die Aminosäuresequenz der α-Agarase wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, ein Oligonukleotid, das basierend auf Informationen über eine andere Aminosäuresequenz hergestellt wurde, und ein PCR-Fragment, das unter Verwendung von Primern amplifiziert wurde, die basierend auf Informationen über solch eine Aminosäuresequenz hergestellt wurden. Beispiele von für die Sonden verwendeten Markierungen beinhalten in nicht begrenzender Weise eine Radioisotopen-Markierung, eine Fluoreszenz-Markierung, eine Digoxigenin-Markierung und eine Biotin-Markierung.
Eine genomische Bibliothek, die mit Transformanten, die ein α-Agarase-Gen tragen, angereichert ist und wie folgt hergestellt wurde, kann als eine genomische Bibliothek zur Verwendung für das Screenen verwendet werden.
Gemäß eines herkömmlichen Verfahrens wird genomische DNA von einem Mikroorganismus, der eine α-Agarase herstellt, präpariert, mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt und dann auf einen Nylon- oder Nitrocellulosefilter geblottet. Die DNA auf dem Filter wird gemäß eines herkömmlichen Verfahrens mit der vorstehend beschriebenen markierten Sonde hybridisiert, um ein DNA-Fragment, das mit der Sonde hybridisiert, zu detektieren. DNA-Fragmente, die dem Signal entsprechen, werden von dem Agarose-Gel extrahiert und gereinigt.
Die so erhaltenen DNA-Fragmente werden in einen Vektor (z.B. ein Plasmid-Vektor) gemäß eines herkömmlichen Verfahrens eingebaut, um rekombinante DNA-Moleküle herzustellen. Die rekombinanten DNA-Moleküle werden dann in einen geeigneten Wirt (z.B. Escherichia coli) zum Erhalten von Transformanten eingebracht. Ein für den zu verwendenden Vektor geeignetes Transformationsverfahren kann aus herkömmlichen Verfahren, z.B. denen in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, beschriebenen, ausgewählt werden. Dadurch wird eine genomische Bibliothek, die mit Transformanten, die ein α-Agarase-Gen tragen, angereichert ist, erhalten.
Screenen kann durch Verwendung solch einer genomischen Bibliothek effektiver durchgeführt werden.
(4) In vitro-Klonierung mittels PCR
Das Gen von Interesse wird durch Screenen von Transformanten in den Verfahren (1) bis (3) wie vorstehend beschrieben kloniert. Mittels PCR kann Klonieren in vitro ohne Verwendung von Transformanten durchgeführt werden.
Genomische DNA wird von einem Mikroorganismus, der eine α-Agarase herstellt, präpariert. Die genomische DNA wird durch geeignete bekannte Mittel wie Ultraschall oder Verdau mit einem Restriktionsenzym abgebaut. Linker werden gemäß eines herkömmlichen Verfahrens an die so erhaltenen DNA-Fragmente ligiert.
Eine PCR wird unter Verwendung eines Oligonukleotids, das basierend auf Informationen über eine Aminosäuresequenz einer α-Agarase hergestellt wurde, und eines Oligonukleotids, das mit dem Linker hybridisiert, als Primer sowie der genomischen Bibliothek als Matrize durchgeführt. Das erhaltene Amplifikationsprodukt wird in einen Vektor (z.B. ein Plasmid-Vektor) gemäß eines herkömmlichen Verfahrens eingebaut.
Die Nukleotidsequenz des α-Agarase-Gens in der Transformanten, die das α-Agarase-Gen trägt und die wie vorstehend in (1) bis (3) beschrieben erhalten wurde, oder des rekombinanten DNA-Moleküls, das das α-Agarase-Gen enthält und das wie vorstehend in (4) beschrieben erhalten wurde, kann gemäß eines bekannten Verfahrens bestimmt werden. Wenn der Klon nicht das gesamte α-Agarase-Polypeptid kodiert, wird der gesamte offene Leserahmen für die α-Agarase durch Wiederholung eines Verfahrens aufgedeckt, das das Herstellen einer neuen Sonde basierend auf der bestimmten Nukleotidsequenz und das Screenen einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Sonde zum Erhalten eines neuen Klons umfasst. Ein Klon, der den gesamten, für die α-Agarase-kodierenden offenen Leserahmen enthält, kann z.B. basierend auf der so erhaltenen Information hergestellt werden.
Ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kann in großen Mengen durch Gentechnik hergestellt werden, wobei das die α-Agarase kodierende Gen, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, mit einem geeigneten Expressionsvektor verbunden ist.
Ein Verfahren zum Erhalten eines Gens für Agarase 1-7 wird im Folgenden kurz beschrieben.
Zellen, die durch Kultivieren von TKR1-7AGα erhalten wurden, werden mittels Lysozym lysiert und dann einem Entfernen von Proteinen, Ethanolpräzipitation und dergleichen zum Erhalten von genomischer DNA unterworfen. Die genomische DNA wird teilweise mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in einen Plasmid-Vektor (mit einem Ampicillin-Resistenzgen) zum Erstellen einer Plasmidbibliothek inseriert. Die Plasmidbibliothek wird zur Transformation von Escherichia coli verwendet. Transformanten werden auf LB-Agarmedium mit 1,5% (w/v) Agar und 50 μg/ml Ampicillin wachsen gelassen und bei 37°C 5 Tage kultiviert. Nach der Kultivierung werden Kolonien, bei denen Abbau des umgebenden Agars beobachtet wird, isoliert, in LG-Medium mit Ampicillin geimpft und kultiviert. Die α-Agarase-Aktivität wird für einen Rohextrakt, der von den Zellen präpariert wurde, bestimmt. Plasmid-DNA wurde gemäß eines herkömmlichen Verfahrens von einer Transformanten extrahiert, für die α-Agarase-Aktivität beobachtet wurde. Die Länge der in die Plasmid-DNA inserierten DNA wurde mit etwa 8 kb bestimmt. Dieses rekombinante Plasmid wird als pAA1 bezeichnet. Mit dem Plasmid transformiertes Escherichia coli wird bezeichnet und gekennzeichnet als Escherichia coli JM109/pAA1 und wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 26. Mai 1999 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-6992 hinterlegt.
Eine Analyse der Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das in das Plasmid pAA1 inseriert wurde, offenbarte, dass sie einen offenen Leserahmen (ORF), der ein Polypeptid bestehend aus 925 Aminosäuren kodiert, als eine für eine α-Agarase kodierende Region enthält. Die Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens und die durch den offenen Leserahmen kodierte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO: 12 bzw. 14 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 ist also ein Beispiel der erfindungsgemäßen Agarase. Ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der vorher bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase 1-7, P1, zeigt, dass Agarase 1-7 ein Polypeptid bestehend aus einer Aminosäuresequenz von der Aminosäurezahl 28 bis zu der Aminosäurezahl 925 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 ist und dass die Aminosäuresequenz durch eine Nukleotidsequenz von der Basenzahl 82 bis zu der Basenzahl 2778 (umfassend das Terminationscodon) in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 12 kodiert wird. Die Aminosäuresequenz, die aus den Aminosäuren 1 bis 27 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 besteht, wird für eine Signalsequenz gehalten. Des Weiteren weist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus 749 Resten von der Aminosäurezahl 177 bis zu der Aminosäurezahl 925 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 besteht, auch die Aktivität der erfindungsgemäßen α-Agarase auf.
Ein Verfahren zum Erhalten eines Gens für α-Agarase 4-3 ist nachstehend kurz beschrieben. Gemischte Primer 3 und 4 wurden basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz der Agarase 4-3, P2, dargestellt durch SEQ ID NO: 2, hergestellt. Die Sequenzen der gemischten Primer 3 und 4 sind in SEQ ID NO: 6 bzw. 7 gezeigt.
Chromosomale DNA, die aus TKR4-3AGα wie vorstehend für α-Agarase 1-7 beschrieben hergestellt wurde, wurde komplett mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. BamHI-Linker wurden an die Enden der verdauten DNA ligiert. Eine PCR wurde mittels der erhaltenen DNA als Matrize sowie des gemischten Primers 3 und des Primers C1, der in dem LA PCR in vitro cloning Kit (Takara Shuzo) enthalten ist, durchgeführt.
Als nächstes wurde eine PCR unter Verwendung des so erhaltenen Produkts der primären PCR als Matrize sowie des gemischten Primers 4 und des Primers C2, der in dem LA PCR in vitro cloning Kit (Takara Shuzo) enthalten ist, durchgeführt. Als Ergebnis wurde ein Amplifikationsprodukt von etwa 2 kb erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde als 4-3N bezeichnet.
Die Nukleotidsequenzen der terminalen Regionen des amplifizierten Fragments wurden analysiert. Primer 5 und 6, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 8 bzw. 9 gezeigt sind, wurden basierend auf der Nukleotidsequenz, die einer Region entspricht, die den N-terminalen Teil der Agarase kodiert, hergestellt. In ähnlicher Weise wurden Primer 7 und 8, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 10 bzw. 11 gezeigt sind, basierend auf der Nukleotidsequenz, die dem C-terminalen Teil der Agarase entspricht, hergestellt.
Wenn eine PCR wie vorstehend für 4-3N beschrieben, außer dass Primer 5 und 6 anstatt der gemischten Primer 3 und 4 verwendet wurden, durchgeführt wurde, wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,0 kb, 4-3UN, erhalten. In ähnlicher Weise wurde, wenn eine PCR unter Verwendung der Primer 7 und 8 durchgeführt wurde, ein DNA-Fragment von etwa 2,0 kb, 4-3C, erhalten. Eine Analyse der Nukleotidsequenzen der Fragmente 4-3UN und 4-3C unter Berücksichtigung der vorher bestimmten Nukleotidsequenz von 4-3N offenbarte einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid bestehend aus 951 Aminosäuren kodiert. Die Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens und die durch die Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens kodierte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO: 13 bzw. 15 gezeigt. In 4-3UN wurden eine Nukleotidsequenz für die Aminosäuresequenz P2, eine stromaufwärts gelegene, 183 Aminosäuren kodierende Nukleotidsequenz und eine weiter stromaufwärts gelegene SD-ähnliche Sequenz gefunden.
Folglich ist die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 15 ein Beispiel für die erfindungsgemäße Agarase. Ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der vorher bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase 4-3 zeigt, dass Agarase 4-3 ein Polypeptid ist, das aus einer Aminosäuresequenz von der Aminosäurezahl 184 bis zu der Aminosäurezahl 951 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 15 besteht, und dass die Aminosäuresequenz durch eine Nukleotidsequenz von der Basenzahl 550 bis zu der Basenzahl 2856 (einschließlich des Terminationscodons) in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 13 kodiert wird.
Die wie vorstehend beschrieben erhaltenen Aminosäuresequenzen von Agarase 1-7 und Agarase 4-3 sowie die Nukleotidsequenzen der Gene, die für diese Enzyme kodieren, weisen keine Homologie mit den Aminosäuresequenzen von β-Agarasen, die bekannte Agarose-verdauende Enzyme sind und die Agarose in einer im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Agarase unterschiedlichen Weise spalten, und den Nukleotidsequenzen der Gene, die die Enzyme kodieren, auf. Daher werden diese Sequenzen als absolut neu betrachtet.
Ein rekombinantes DNA-Molekül kann durch Verbinden eines für die erfindungsgemäße α-Agarase kodierenden Gens (z.B. das für Agarase 1-7 oder Agarase 4-3 kodierende Gen) mit einem geeigneten Vektor hergestellt werden. Des Weiteren kann eine Transformante durch Einbringen des rekombinanten DNA-Moleküls in einen geeigneten Wirt hergestellt werden. Die erfindungsgemäße α-Agarase wird in einer durch Kultivierung der Transformanten erhaltenen Kultur hergestellt. Daher ist es möglich, die erfindungsgemäße α-Agarase (z.B. Agarase 1-7 oder Agarase 4-3) in großen Mengen unter Verwendung der Transformanten herzustellen.
Eine mutierte α-Agarase kann durch Einbringen einer Mutation in ein für eine α-Agarase kodierendes Gen gemäß eines bekannten Verfahrens hergestellt werden. Beispiele für die Verfahren zum Einbringen einer Mutation, die verwendet werden können, beinhalten in nicht begrenzender Weise das Oligonukleotid-Doppel-Amber-Verfahren (Hashimoto-Gotoh, T. et al., Gene, 152:271-275 (1995)), das „gapped duplex"-Verfahren (Kramer, W. et al., Nucl. Acids Res., 12:9441 (1984); Kramer, W. et al., Methods in Enzymology, 154:350 (1987)) und das Kunkel-Verfahren (Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985); Kunkel, T.A., Methods in Enzymology, 154:367 (1987)).
Die α-Agarase von Interesse kann von einer Transformanten durch Expression eines Gens, das ein Polypeptid kodiert, in dem eine Signalsequenz an den N-Terminus der zu exprimierenden α-Agarase angefügt ist, sekretiert werden. Die Signalsequenz ist nicht auf eine spezifische begrenzt und ist z.B. die Signalsequenz von α-Agarase 1-7 dargestellt durch Aminosäurezahlen 1 bis 27 in SEQ ID NO: 14. Diese Signalsequenz ist durch eine Nukleotidsequenz von der Basenzahl 1 bis zu der Basenzahl 81 in SEQ ID NO: 12 kodiert.
Beispiele von Vektoren, die zum Erstellen der rekombinanten DNA-Moleküle verwendet werden können, beinhalten in nicht begrenzender Weise Plasmid-Vektoren, Phagen-Vektoren und Virus-Vektoren. Ein geeigneter Vektor kann abhängig von dem Zweck, für den die rekombinante DNA verwendet wird, ausgewählt werden. In Fällen, in denen ein rekombinantes DNA-Molekül zur Herstellung einer α-Agarase hergestellt wird, wird ein Vektor bevorzugt, der einen Promotor und/oder andere Regionen zur Expressionskontrolle enthält. Beispiele von solchen Plasmid-Vektoren beinhalten in nicht begrenzender Weise pKF19k, pT7BlueT und pET16b. Wirte, die zum Herstellen von Transformanten verwendet werden können, beinhalten in nicht begrenzender Weise Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen und Fadenpilze sowie kultivierte Zellen von Säugern, Fischen, Insekten und dergleichen. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das unter Verwendung eines für den Wirt geeigneten Vektors hergestellt wurde, wird zur Herstellung einer Transformanten verwendet.
Ein Verfahren zur Herstellung von Agarase 1-7 durch Gentechnik ist nachstehend kurz beschrieben.
Ein DNA-Fragment, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein Polypeptid mit z.B. einer Aminosäuresequenz kodiert, die bei der Aminosäurezahl 28 oder 177 in SEQ ID NO: 14 startet, wird durch eine PCR unter Verwendung des Plasmids pAA1, das das α-Agarase 1-7-Gen kodiert, als Matrize amplifiziert, um ein Plasmid, in dem das amplifizierte Fragment in einen geeigneten Plasmid-Vektor (z.B. pKF19k (Takara Shuzo), pT7BlueT (Takara Shuzo) oder pET16b (Takara Shuzo)) inseriert ist, herzustellen. Mit solch einem Plasmid transformiertes Escherichia coli (z.B. Escherichia coli JM109 oder BL21(DE3)pLysS) wird in einem geeigneten flüssigen Medium kultiviert. Induktion wird unter Verwendung von IPTG oder dergleichen durchgeführt, falls notwendig. Das Polypeptid, das durch das in das Plasmid inserierte DNA-Fragment kodiert wird, wird exprimiert. Die α-Agarase-Aktivität, die durch solch eine Transformante in einem Einheitsvolumen einer Kultur exprimiert wird, ist gewöhnlich höher als die für eine Kultur von TKR1-7AGα beobachtete.
Für Agarase 4-3 kann eine Transformante, die die α-Agarase exprimiert, mittels Gentechnik wie vorstehend für Agarase 1-7 beschrieben nach Amplifizierung eines DNA-Fragments, das eine Nukleotidsequenz enthält, die z.B. für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die bei der Aminosäurezahl 184 in SEQ ID NO: 15 startet, durch eine PCR unter Verwendung von chromosomaler DNA von dem Mikroorganismus TKR4-3α als Matrize hergestellt werden. Die erhaltene Transformante weist α-Agarase-Aktivität auf und die Aktivität in einem Einheitsvolumen einer Kultur ist gewöhnlich höher als die für eine Kultur von TKR4-3AGα beobachtete.
Die durch Gentechnik wie vorstehend beschrieben hergestellte erfindungsgemäße α-Agarase kann durch ein herkömmliches Reinigungsverfahren wie Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder Lösungsmittelpräzipitation teilweise gereinigt werden. Des Weiteren kann eine gereinigte Enzympräparation, die zu einer einzelnen Bande nach Elektrophorese führt, unter Verwendung von bekannten Reinigungsverfahren wie Säulenchromatographien (z.B. Anionenaustauscher-Säule und Gelfiltrations-Säule) in Kombination erhalten werden.
Agarooligosaccharide wie Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose können durch Reaktion der so erhaltenen erfindungsgemäßen rekombinanten α-Agarase in einem variablen Reinheitsgrad mit einem in Rotalgen enthaltenen Polysaccharid wie Agar oder Agarose als Substrat hergestellt werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung genauer, sind aber nicht begrenzend für den Schutzbereich davon zu verstehen.
Beispiel 1
Herstellung von α-Agarase aus TKR1-7AGα
Nach Reinigung der erfindungsgemäßen α-Agarase wurde die enzymatische Aktivität mittels Durchführen einer enzymatischen Reaktion unter Verwendung von Agarose L03 (Takara Shuzo, Code: 5003) als Substrat und danach Quantifizieren der erhaltenen Agarotetraose unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigchromatographie gemessen. Das Verfahren ist nachstehend genau beschrieben.
Eine Lösung, die Agarose L03 bei einer Konzentration von 0,2% in 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid enthielt, wurde hergestellt. 180 μl dieser Lösung wurden mit 20 μl einer Enzymlösung gemischt. Das Gemisch wurde bei 42°C 30 bis 120 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten reagieren gelassen und dann auf 60°C 1 Minute erhitzt, um die Reaktion zu stoppen. 30 μl dieses Reaktionsgemisches wurden auf eine TSKgel α-2500-Säule gegeben (innerer Durchmesser: 7,8 mm; Länge: 300 mm; Tosoh, Code: 18339). Ein Peak wurde bei einer Retentionszeit von etwa 26 Minuten unter Verwendung einer 70%igen Acetonitrillösung als Eluent bei einer Flussrate von 0,8 ml/Minute eluiert. Agarotetraose, die als Ergebnis der enzymatischen Reaktion hergestellt wurde, wurde in dem Peak quantifiziert. Ein Unit (1 U) der erfindungsgemäßen α-Agarase ist als die Menge des Enzyms definiert, die 1 Mikromol Agarotetraose in 10 Minuten herstellt.
100 ml künstliches Meerwasser (Produktname Jamarine S; Jamarine Laboratory) wurden hergestellt. Pepton (DIFCO, Code: 0123-17-3) und Hefeextrakt (DIFCO, Code: 0127-17-9) wurden bei Konzentrationen von 0,3% bzw. 0,02% zugegeben. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 3 M Natriumcarbonat auf 8,0 eingestellt. Das erhaltene Gemisch wurde in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert. 0,1 g Agar (Nacalai Tesque, Code: 010-28) wurden zugegeben. Nach Sterilisation in einem Autoklaven wurde der Mikroorganismus TKR1-7AGα in das Gemisch geimpft und bei 25°C und 120 UpM über Nacht kultiviert. Die erhaltene Kultur wurde als Vorkultur verwendet.
Die Hauptkultivierung wurde wie folgt durchgeführt. 3 l des vorstehend genannten Mediums wurden in einem 5 1-Glasfermentergefäß hergestellt und in einem Autoklaven sterilisiert. 30 ml der Vorkultur wurden in das Medium geimpft und bei 25°C und 250 UpM 24 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde dann bei 8000 × g 20 Minuten zentrifugiert, um etwa 3 l eines Überstands zu sammeln, von dem Zellen entfernt worden waren.
Die folgenden Verfahren wurden bei 4°C oder weniger durchgeführt.
Der Überstand wurde in eine Dialysemembran (Sanko Junyaku, Code: UC-36-32-100) gegeben und in etwa 500 g Polyethylenglycol über zwei Nächte zum Konzentrieren getaucht, bis das Volumen der internen Lösung etwa 100 ml betrug, und dann wurde zum Entsalzen gegen Puffer A (20 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Natriumchlorid) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule (φ 2 cm × 9,5 cm) gegeben, die mit 30 ml des starken Anionenaustauscher-Harzes Super Q (Tosoh, Code: 17227) gefüllt war und mit Puffer A äquilibriert worden war. Die adsorbierte α-Agarase wurde mittels eines linearen Gradientens von 10 mM bis 150 mM Calciumchlorid (gesamtes Elutionsvolumen: 600 ml) eluiert. Eine Fraktion von etwa 60 ml mit α-Agarase-Aktivität, die bei einer Calciumchlorid-Konzentration zwischen 50 mM und 100 mM eluierte, wurde gesammelt.
Diese Fraktion wurde zum Entsalzen gegen Puffer B (10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Natriumchlorid) dialysiert und dann auf eine mit 20 ml Super Q gefüllte Säule (φ 2 cm × 6,3 cm) gegeben. In diesem Fall wurde das adsorbierte Enzym mittels eines linearen Gradienten von 10 mM bis 1,0 M Natriumchlorid (gesamtes Elutionsvolumen: 200 ml) eluiert. Eine Fraktion von 40 ml mit α-Agarase-Aktivität, die bei etwa 0,5 M eluierte, wurde erhalten. Diese Fraktion wurde gegen Puffer B dialysiert und auf eine mit 10 ml DEAE-TOYOPEARL (Tosoh, Code: 007473) gefüllte Säule (φ 0,8 cm × 5,7 cm) gegeben. Eine Fraktion von etwa 20 ml mit α-Agarase-Aktivität wurde mittels eines linearen Gradienten von 10 mM bis 150 mM Calciumchlorid (gesamtes Elutionsvolumen: 100 ml) gesammelt.
Die Fraktion wurde dann mittels der Zentrifugations-Ultrafiltrationsmembran Centriprep-10 (Amicon, Code: 4304) auf etwa 1 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde unter Verwendung einer Säule (φ 0,8 cm × 60 cm), die mit Sephadex G-100 (Pharmacia, Code: 17-0060-01) gefüllt war und mit Puffer B äquilibriert worden war, einer Gelfiltration unterworfen, um eine Fraktion von etwa 15 ml mit α-Agarase-Aktivität zu erhalten. Diese Fraktion wurde auf eine Säule (φ 0,8 cm × 10 cm) mit 5 ml QAE-TOYOPEARL (Tosoh, Code: 14026) gegeben und unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 mM bis 150 mM Calciumchlorid (gesamtes Elutionsvolumen: 100 ml) eluiert, um eine α-Agarase-Fraktion von etwa 4 ml zu erhalten.
Eine Analyse der so erhaltenen α-Agarase-Fraktion durch SDS-PAGE offenbarte, dass das Enzym von Interesse fast zur Homogenität gereinigt war und dass das Molekulargewicht etwa 95000 betrug. Die gesamte Aktivität der so erhaltenen gereinigten α-Agarase-Präparation lag bei 45 U. Diese Fraktion wurde als Agarase 1-7 in den nachfolgenden Experimenten verwendet.
Beispiel 2
Herstellung von α-Agarase aus TKR4-3AGα
Der Mikroorganismus TKR4-3AGα wurde wie vorstehend für den Mikroorganismus TKR1-7AGα in Beispiel 1 beschrieben kultiviert, um etwa 3 l eines Kulturüberstands zu erhalten.
Der Kulturüberstand wurde in eine Dialysemembran (Sanko Junyaku, Code: UC-36-32-100) gegeben und in etwa 500 g Polyethylenglycol über zwei Nächte zum Konzentrieren getaucht, bis das Volumen der inneren Flüssigkeit etwa 300 ml betrug, und dann wurde gegen Puffer C (10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid, 50 mM Natriumchlorid) dialysiert. Etwa zwei Drittel des Dialysats wurden auf eine Säule (φ 2 cm × 9,5 cm) gegeben, die mit 30 ml Super Q gefüllt war und mit Puffer C äquilibriert worden war. Die adsorbierte α-Agarase wurde mittels eines linearen Gradienten von 10 mM bis 80 mM Calciumchlorid (gesamtes Elutionsvolumen: 400 ml) eluiert. Eine Fraktion von etwa 40 ml mit α-Agarase-Aktivität, die bei einer Calciumchloridkonzentration zwischen 40 mM und 50 mM eluierte, wurde gesammelt.
Diese Fraktion wurde mittels Centriprep-10 konzentriert und mit Puffer B zum Entsalzen verdünnt und dann auf eine mit 10 ml DEAE-TOYOPEARL gefüllte Säule (φ 1,5 cm × 5,7 cm) gegeben. Die adsorbierte α-Agarase wurde unter Verwendung ei nes linearen Gradienten von 10 mM bis 100 mM Calciumchlorid (gesamtes Elutionsvolumen: 100 ml) eluiert. Eine Fraktion von 9 ml mit α-Agarase-Aktivität, die bei einer Calciumchlorid-Konzentration von etwa 45 mM eluierte, wurde erhalten. Diese Fraktion wurde mittels Centriprep-30 (Amicon, Code: 4306) konzentriert, fünffach mit Puffer B verdünnt und dann auf eine Säule (φ 0,8 cm × 4 cm) gegeben, die mit 2 ml QAE-TOYOPEARL gefüllt war und mit Puffer B äquilibriert worden war. Eine Fraktion der auf der Säule adsorbierten α-Agarase wurde mittels eines linearen Gradienten von 10 mM bis 120 mM Calciumchlorid (gesamtes Elutionsvolumen: 40 ml) gesammelt.
Eine Analyse der so erhaltenen α-Agarase-Fraktion durch SDS-PAGE offenbarte, dass die α-Agarase fast zur Homogenität gereinigt war. Die gesamte erhaltene Aktivität betrug 1,53 U. Diese Fraktion wurde als Agarase 4-3 in den nachfolgenden Experimenten verwendet.
Beispiel 3
Untersuchung von verschiedenen Eigenschaften von Enzymen
(1) Substratspezifität und Wirkung
10 μl eines Reaktionspuffers (10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Natriumchlorid), der eins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus vier Arten von Agarooligosacchariden (Agarobiose, Agarotetraose, Agarohexaose und Agarooctaose) (jeweils bei einer Konzentration von 2,5 mM), drei Arten von Neoagarooligosacchariden (Neoagarobiose, Neoagarotetraose und Neoagarohexaose) (jeweils bei einer Konzentration von 2,5 mM) und Agarose L03 (bei einer Konzentration von 1%) enthielt, wurden hergestellt. 10 μl einer Lösung aus Agarase 1-7 oder Agarase 4-3 wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 42°C 30 Minuten reagieren gelassen. Die Reaktionsprodukte wurden einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Entwicklungslösung, die aus Chloroform: Methanol: Essigsäure = 3 : 3 : 1 zusammengesetzt war, unterworfen. Nach Entwicklung wurden die Reaktionsprodukte durch das Orzinol-Schwefelsäureverfahren bestätigt.
Als Ergebnis wurde gezeigt, dass sowohl Agarase 1-7 als auch Agarase 4-3 Agarohexaose, Agarooctaose, Neoagarohexaose und Agarose spalten.
Die Ergebnisse einer Dünnschichtchromatographie, die erhalten wurden, als Agarase 1-7 auf Agarohexaose wirken gelassen wurde, sind in 1 gezeigt.
Die Ergebnisse einer Dünnschichtchromatographie, die erhalten wurde, als Agarase 4-3 auf Agarohexaose wirken gelassen wurde, sind in 2 gezeigt. In den 1 und 2 sind die in den entsprechenden Spuren entwickelten Proben wie folgt: Spur 1: Agarobiose; Spur 2: Agarotetraose; Spur 3: Agarohexaose; Spur 4: mit der erfindungsgemäßen Agarase reagierte Agarohexaose; Spur 5: ein Gemisch aus Agarobiose und Agarotetraose. Wie aus diesen Figuren ersichtlich, verdaut die erfindungsgemäße α-Agarase Agarohexaose, um Agarobiose und Agarotetraose zu bilden.
(2) Identifizierung des Produkts der Reaktion mit α-Agarase
Agarase 1-7 oder Agarase 4-3 wurde zu 2,0 ml einer Lösung gegeben, die Agarose L03 bei einer Konzentration von 1,0% in 10 mM Tris-Hydrochiorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid enthielt. Das Gemisch wurde bei 42°C 60 Minuten reagieren gelassen. Nach Reaktion wurde ein Teil des Reaktionsgemisches auf eine Gelfiltrationssäule (Tosoh TSKgel α-2500) gegeben und unter Verwendung von 70% Acetonitril als Eluent bei einer Flussrate von 0,8 ml/Minute chromatographisch getrennt. Eine Fraktion, die bei einer Retentionszeit von etwa 26 Minuten eluierte, wurde gesammelt und zur Trockenheit mittels eines Rotationsverdampfers konzentriert. Das Gewicht des Produkts wurde auf etwa 4 mg bestimmt.
Eine Analyse der Fraktion durch magnetische Kernresonanz unter Verwendung des NMR-Systems JNM-EX270 FT (Nippon Denshi) bestätigte, dass die Substanz, die aus Agarose durch die Wirkung jedes der Enzyme gebildet wurde und in der Fraktion enthalten war, Agarotetraose war. Also wurde gezeigt, dass sowohl Agarase 1-7 als auch Agarase 4-3 die α-1,3-Bindung zwischen D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose in einem Agarose-Molekül zur Bildung von Agarooligosacchariden, die Agarotetraose enthalten, hydrolysieren.
(3) pH-Wert der Reaktion
10 μl eines Reaktionsgemisches, das 1% Agarose L03, 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid enthielt und dessen pH-Wert auf die folgenden Werte unter Verwendung der in Klammern angegebenen Puffer bei einer Endkonzentration von 10 mM eingestellt war, wurden hergestellt: 4,5 (Acetatpuffer); 5,5 (Maleatpuffer); 6,0, 6,5 (Acetatpuffer); oder 7,0, 7,5 oder 8,8 (Trispuffer). 10 μl einer Enzymlösung wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 42°C eine Stunde reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde einer Dünnschichtchromatographie unterworfen und unter Verwendung von Chloroform: Methanol: Essigsäure = 3 : 3 : 1 (v/v/v) entwickelt. Reaktionsprodukte wurden durch das Orzinol-Schwefelsäure-Verfahren bestätigt. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass Agarase 1-7 und Agarase 4-3 ihre Agaroseverdauenden Aktivitäten unter neutralen bis schwach sauren Bedingungen bzw. unter schwach alkalischen bis schwach sauren Bedingungen aufweisen.
(4) Optimale Temperatur
Die enzymatischen Aktivitäten von Agarase 1-7 und Agarase 4-3 wurden bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Für sowohl Agarase 1-7 als auch Agarase 4-3 betrug die Temperatur, bei der eine Inaktivierung des Enzyms unterdrückt war und die Reaktion rasch ablief, 37-42°C.
(5) Hitzestabilität
Eine gereinigte Enzymlösung von Agarase 1-7 oder Agarase 4-3 wurde auf 48°C, 50°C oder 60°C 30 Sekunden erhitzt. Eine Lösung, die Agarose L03 bei einer Konzentration von 0,2% in 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid enthielt, wurde dann zu der erhitzten Lösung gegeben. Das Gemisch wurde bei 42°C eine Stunde reagieren gelassen. Die Reaktion wurde durch Erhitzen für eine Minute in kochendem Wasser beendet. Reaktionsprodukte wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zum Messen von Aktivität quantifiziert. Als Ergebnis wies Agarase 1-7 25% ihrer Aktivität nach Behandlung bei 48°C auf und Agarase 4-3 wies 22% ihrer Aktivität nach Behandlung bei 50°C auf, wobei die Aktivität ohne Hitze-Behandlung als 100% definiert wurde.
(6) Molekulargewicht
Das Molekulargewicht von Agarase 1-7 wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Agarase 1-7 wurde unter Verwendung eines 10-20% Polyacrylamidgradientengels mit SDS zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad, Myosin (MG 200000), β-Galactosidase (MG 116250), Phosphorylase b (MG 97400), Rinderserumalbumin (MG 66200), Ovalbumin (MG 45000), Carbonsäureanhydrase (MG 31000), Trypsininhibitor (MG 21500), Lysozym (MG 14400)) elektrophoretisch getrennt. Das Molekulargewicht von Agarase 1-7 betrug etwa 95000 Dalton, wie basierend auf der Mobilität auf dem Gel bestimmt wurde.
Das Molekulargewicht von Agarase 4-3 wurde durch Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugation bestimmt. Ein Dichtegradient wurde durch Variieren der Konzentration von Glycerin von 15% bis 35% in einem Puffer, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, hergestellt. 4,8 ml von linearen Dichtegradienten wurden in zwei 5 ml-Zentrifugationsröhrchen hergestellt, so dass die unterste Schicht Glycerin bei einer Konzentration von 35% und die oberste Schicht Glycerin bei einer Konzentration von 15% enthielt. 100 μl einer Lösung, die 15 μl des Molekulargewichtsmarkers Low Range (Bio-Rad) und Glycerin bei einer Konzentration von 15% in dem vorstehend genannten Puffer enthielt, wurden in einem der Röhrchen als oberste Schicht aufgetragen. 100 μl der Enzympräparation von Agarase 4-3 wurde in dem anderen Röhrchen als oberste Schicht aufgetragen. Diese Zentrifugationsröhrchen wurden unter Verwendung eines Ausschwingrotors bei 45000 UpM und 4°C 21 Stunden zentrifugiert. Nach Zentrifugation wurden Fraktionen 1-20, die jeweils 250 μl des Puffers enthielten, von oben nach unten aus jedem Zentrifugationsröhrchen gesammelt. Die entsprechenden Fraktionen, die aus dem Zentrifugationsröhrchen gesammelt worden waren, zu dem der Molekulargewichtsmarker gegeben worden war, wurden einer SDS-PAGE unterworfen. Die entsprechenden Fraktionen, die von dem Zentrifugationsröhrchen gesammelt worden waren, zu dem die Enzympräparationen gegeben worden war, wurden einer SDS-PAGE unterworfen und eine Messung der enzymatischen Aktivitäten wurde durchgeführt. Ein Peak für die enzymatische Aktivität einer α-Agarase wurde für die Fraktionsnummern 8-10 ermittelt, die einem Molekulargewicht von etwa 65000 bis 85000 basierend auf den Ergebnissen der SDS-PAGE der Fraktionen, die den Molekulargewichtsmarker enthielten, entsprachen. Basierend auf diesen Ergebnissen sowie den Ergebnissen der SDS-PAGE der Fraktionen, die die Enzympräparation enthielten, wurde das Molekulargewicht der Agarase 4-3 auf etwa 85000 geschätzt.
(7) Aminosäuresequenz-Analyse durch das Edman-Abbau-Verfahren
Die Aminosäuresequenzen von α-Agarase 1-7 und α-Agarase 4-3, die in den Beispielen 1 und 2 erhalten wurden, wurden durch das Edman-Abbau-Verfahren be stimmt. Eine gereinigte Enzym-Präparation, die Agarase 1-7 oder Agarase 4-3 enthielt und 10 pmol des Enzymproteins entsprach, wurde einer SDS-PAGE unter Verwendung eines 10-20% Polyacrylamidgradientengels unterworfen. Nach Elektrophorese wurde das auf dem Gel getrennte Enzym auf eine ProBlot-Membran (Applied Biosystems) geblottet. Ein Teil der Membran, an die das Enzym adsorbiert war, wurde unter Verwendung eines G1000A-Proteinsequenzers (Hewlett Packard) analysiert. Als Ergebnis wurden die Aminosäuresequenz P1: Asp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-Met-Phe (SEQ ID NO: 1) und die Aminosäuresequenz P2: Gly-Asp-Ile-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-Gly-Arg-Val-Ala (SEQ ID NO: 2) für Agarase 1-7 bzw. Agarase 4-3 bestimmt.
Beispiel 4
Herstellung von Agarooligosacchariden
Agarose L03 wurde zu 2 ml eines Reaktionspuffers (10 mM Tris-Hydrochiorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Natriumchlorid) bei einer Konzentration von 1,0% (w/v) gegeben. Ferner wurden 2 U der gereinigten Präparation von Agarase 1-7 zugegeben. Das Gemisch wurde bei 42°C 16 Stunden reagieren gelassen. Nach Reaktion wurde das Reaktionsgemisch durch einen 0,22 μm-Filter (Millipore, Code: SLGVL040S) gefiltert. Das gefilterte Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter den gleichen Bedingungen wie denen, die für die Messung der Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms in Beispiel 1 verwendet wurden, analysiert, um die gebildeten Agarooligosaccharide zu bestimmen. Als Ergebnis wurden Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose in dem Reaktionsgemisch nachgewiesen. Also wurde bestätigt, dass die vorstehend genannte enzymatische Reaktion diese kleineren Agarooligosaccharide herstellt.
Beispiel 5
Präparation von chromosomaler DNA aus TKR1-7AGα und TKR4-3AGα
Künstliches Meerwasser (Produktname: Jamarine S; Jamarine Laboratory) wurde hergestellt. Pepton (DIFCO, Code: 0123-17-3) und Hefeextrakt (DIFCO, Code: 0127-17-9) wurden bei Konzentrationen von 0,3% (w/v) bzw. 0,02% (w/v) zugegeben. Der pH-Wert wurde dann auf 8,0 unter Verwendung von 3 M Natriumcarbonat eingestellt. Agar (Nacalai Tesque, Code: 010-28) wurde bei einer Konzentration von 0,1% (w/v) zugegeben. Das Gemisch wurde in einem Autoklaven sterilisiert. 10 μl einer Glycerin-Stammkultur eines der α-Agarase-produzierenden Stämme TKR1-7AGα und TKR4-3AGα wurden in 2 ml des Mediums geimpft und bei 25°C über Nacht kultiviert. 1 ml der Kultur wurde in 100 ml des gleichen Mediums geimpft und bei 25°C über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8000 g für 10 Minuten gesammelt. Die Zellen wurden in 10 ml Puffer A (100 mM Natriumchlorid, 100 mM Tris-Hydrochlorid (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0)) aufgenommen. 0,25 ml einer Lysozymlösung (20 mg/ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C eine Stunde inkubiert. 2,5 ml Puffer A mit SDS bei einer Konzentration von 5% wurden dann zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei 60°C 20 Minuten unter Schütteln inkubiert. 1,5 ml einer Protease K-Lösung (20 mg/ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C über Nacht inkubiert. Ein nahezu gleiches Volumen an Phenol wurde dann zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten leicht geschüttelt. Das Gemisch wurde bei 2000 g 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in kaltes Ethanol überführt. Chromosomale DNA wurde unter Verwendung eines Glasstabs aufgewickelt. Nach zweifacher Wiederholung der Prozedur wurden 50 μl einer RNase-Lösung (10 mg/ml) zugegeben und das Gemisch wurde bei 37°C 10 Minuten inkubiert. Die chromosomale DNA wurde aus der Lösung durch Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen und in 5 ml Puffer B (140 mM Natriumchlorid, 20 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 7,5)) aufgenommen. Die Suspension wurde gegen den gleichen Puffer über Nacht dialysiert. Dann wurden etwa 1,5 mg und etwa 3,1 mg chromosomale DNA von TKR1-7AGα bzw. TKR4-3AGα erhalten. Die Reinheit der DNA wurde basierend auf OD260 nm/280 nm untersucht. Der Wert war in jedem Fall etwa 1,8. Die chromosomale DNA wurde für Klonierung wie nachstehend beschrieben verwendet.
Beispiel 6
Klonierung des α-Agarase 1-7-Gens
10 μg der chromosomalen DNA von TKR1-7AGα, die teilweise mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut worden war, wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines Gels aus 1% Agarose mit geringem Schmelzpunkt unterworfen. Nach Färben mit Ethidiumbromid wurde ein Teil, der 4 bis 10 kb entsprach, unter ultravioletter Strahlung ausgeschnitten. Die DNA wurde aus dem Gel durch Hitze-Schmelzung gemäß einem herkömmlichen Verfahren extrahiert und gereinigt. Die zurückgewonnenen DNA-Fragmente wurden in eine BamHI-Stelle in dem Plasmid pUC19 (Takara Shuzo) unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) inseriert. Die Plasmidbibliothek wurde zur Transformation von Escherichia coli JM109 verwendet. Die Transformanten wurden auf LB-Agarmedium, das Agar bei einer Konzen tration von 1,5% (w/v) und Ampicillin bei einer Konzentration von 50 μg/ml enthielt, vermehrt. Nach Kultivierung bei 37°C über Nacht waren etwa 1000 Transformanten auf einer Platte gewachsen. 20 Platten wurden weiter bei 25°C vier Tage inkubiert. Als Ergebnis wurde der Abbau von umgebenden Agar für zwei Kolonien beobachtet. Jeder dieser Stämme wurde in 2 ml LB-Medium mit Ampicillin geimpft und bei 37°C über Nacht kultiviert. α-Agarase-Aktivität wurde für einen Rohextrakt, der aus den erhaltenen Zellen hergestellt worden war, bestimmt. Plasmid-DNA wurde von jeder Transformanten gemäß eines herkömmlichen Verfahrens extrahiert. Die Länge der inserierten DNA wurde durch Verdau mit dem Restriktionsenzym BamHI auf etwa 7,2 kb für jede der Transformanten bestimmt. Diese Hybridplasmide wurden als identisch zueinander basierend auf dem Restriktionsenzym-Verdau-Muster angesehen und als pAA1 bezeichnet. Mit dem Plasmid pAA1 transformiertes Escherichia coli wird als Escherichia coli JM109/pAA1 bezeichnet und gekennzeichnet und wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 26. Mai 1999 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) unter der Zugangsnummer FERM BP-6992 hinterlegt.
Ein gemischter Primer 1, dargestellt durch SEQ ID NO: 3, wurde basierend auf der Aminosäuresequenz von Agarase 1-7, P1, dargestellt durch SEQ ID NO: 1, entworfen. Eine PCR wurde unter Verwendung dieses Primers und eines Primers 2, dargestellt durch SEQ ID NO: 4, der spezifisch mit dem pUC-Vektor hybridisiert, sowie pAA1 als Matrize durchgeführt.
50 ng pAA1, 5 μl ExTaq-Puffer, 8 μl eines dNTP-Gemisches, 1 μl des gemischten Primers 1, 1 μl des Primers 2 und 0,5 μl TaKaRa ExTaq wurden in ein 0,5 ml-PCR-Röhrchen gegeben. Steriles Wasser wurde ferner zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 50 μl einzustellen. Nachdem die Lösung mit 50 μl Mineralöl überschichtet worden war, wurde das Röhrchen in ein automatisches Genamplifikations-Instrument (Thermocycler (Takara Shuzo)) gegeben. Nach Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten wurde eine PCR mit 30 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus Denaturierung bei 94°C für eine Minute, Anlagerung der Primer bei 50°C für 2 Minuten und Synthesereaktion bei 72°C für 3 Minuten. Nach der PCR wurde das gesamte Reaktionsgemisch einer Elektrophorese in einem Gel aus 1% Agarose mit geringem Schmelzpunkt unterworfen. Ein amplifiziertes DNA-Fragment von etwa 3,5 kb, das aus dem Gel ausgeschnitten wurde, wurde in pT7Blue (Novagen) ligiert. Die Nukleotidsequenz dieses DNA-Fragments wurde von der N-terminalen Seite gemäß dem Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerase bestimmt. Ein Primer, dargestellt durch SEQ ID NO: 5, wurde basierend auf der Sequenz, die wie vorstehend beschrieben bestimmt wurde, entwickelt. Die stromaufwärts gelegene Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung dieses Primers bestimmt. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass eine Nukleotidsequenz, die 27 Aminosäuren kodiert, stromaufwärts von der Nukleotidsequenz, die der Aminosäuresequenz P1, dargestellt durch SEQ ID NO: 1, entspricht, vorhanden ist, eine SD-ähnliche Sequenz in der weiter stromaufwärts gelegenen Region vorhanden ist und pAA1 einen offenen Leserahmen (ORF) enthält, der für ein Polypeptid, das aus insgesamt 925 Aminosäuren besteht, kodiert. Die Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens und die Aminosäuresequenz, die durch den offenen Leserahmen kodiert wird, sind in SEQ ID NO: 12 bzw. 14 gezeigt. Die N-terminale Sequenz der α-Agarase, die aus dem Mikroorganismus TKR1-7AGα gereinigt wurde, P1, stimmt mit der Sequenz der 28. bis 37. Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 13 überein.
Beispiel 7
Klonierung des α-Agarase 4-3-Gens
Gemischte Primer 3 und 4 wurden basierend auf den Sequenzen der Aminosäurezahlen 2-11 und 12-20 in der Aminosäuresequenz von Agarase 4-3, P2, dargestellt durch SEQ ID NO: 2, entworfen. Diese Primer wurden zur Klonierung eines Gens für Agarase 4-3 unter Verwendung des LA PCR in vitro Klonierungskits (Takara Shuzo) verwendet. Die Sequenzen der gemischten Primer 3 und 4 sind in SEQ ID NO: 6 bzw. 7 gezeigt.
Eine primäre PCR wurde wie folgt durchgeführt. Die chromosomale DNA, die aus TKR4-3AGα in Beispiel 5 präpariert worden war, wurde komplett mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. BamHI-Linker wurden an die Enden der verdauten DNA unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) ligiert. Ein Teil des Ligationsgemisches wurde in ein 0,5 ml-PCR-Röhrchen gegeben und 5 μl 10 × LA PCR-Puffer, 8 μl eines dNTP-Gemisches, 1 μl des gemischten Primers 3, 1 μl des Primers C1, der in dem LA PCR in vitro-Klonierungskit (Takara Shuzo) enthalten ist, und 0,5 μl TakaRa LATaq wurden zugegeben. Steriles Wasser wurde ferner zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 50 μl einzustellen. Nachdem die Lösung mit 50 μl Mineralöl überschichtet worden war, wurde das Röhrchen in ein automatisiertes Gen-Amplifikationsinstrument (Thermal Cycler (Takara Shuzo)) gegeben. Nach De naturierung bei 94°C für 2 Minuten wurde eine PCR mit 30 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus Denaturierung bei 94°C für eine Minute, Anlagerung der Primer bei 50°C für 2 Minuten und Synthesereaktion bei 72°C für 3 Minuten.
Eine sekundäre PCR wurde unter Verwendung des so erhaltenen Produkts der primären PCR durchgeführt. Eine PCR wurde unter Verwendung von 1 μl des Reaktionsgemisches nach der primären PCR als Matrize sowie einer Kombination des gemischten Primers 4 und des Primers C2, der in dem LA PCR in vitro-Klonierungskit (Takara Shuzo) enthalten ist, unter den gleichen Bedingungen wie denen, die für die primäre PCR verwendet wurden, durchgeführt. Nach Entfernung des überschichtenden Mineralöls wurden 5 μl des Reaktionsgemisches einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarose-Gel unterworfen und DNA wurde mit Ethidiumbromid angefärbt. Als Ergebnis wurde ein Amplifikationsprodukt von etwa 2 kb beobachtet und das DNA-Fragment wurde als 4-3N bezeichnet.
Dieses amplifizierte Fragment wurde aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten, gemäß eines herkömmlichen Verfahrens extrahiert und gereinigt und in den Vektor pT7Blue ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren von Escherichia coli JM109 verwendet. Die Nukleotidsequenzen der terminalen Regionen von 4-3N wurden gemäß dem Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren unter Verwendung der erhaltenen Transformanten bestimmt.
Primer wurden basierend auf den bestimmten Sequenzen der terminalen Regionen von 4-3N entworfen. DNA-Fragmente, die stromaufwärts und stromabwärts von 4-3N lagen, wurden unter Verwendung des LA PCR in vitro Klonierungskits (Takara Shuzo) kloniert.
Primer 5 und 6, dargestellt durch SEQ ID NO: 8 bzw. 9, die basierend auf der Sequenz der Region um den N-Terminus der terminalen Regionen von 4-3N, die wie vorstehend beschrieben bestimmt worden waren, entworfen worden waren, wurden zum Klonieren eines DNA-Fragments, das stromaufwärts von 4-3N gelegen war, verwendet. Eine Klonierung wurde wie vorstehend beschrieben für die Klonierung von 4-3N, außer dass die Temperatur der Anlagerung der Primer auf 55°C geändert wurde, durchgeführt. Als Ergebnis wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,0 kb erhalten und als 4-3UN bezeichnet.
Primer 8 und 9, dargestellt durch SEQ ID NO: 10 bzw. 11, die basierend auf der Sequenz der Region um den C-Terminus der terminalen Regionen von 4-3N, die wie vorstehend beschrieben bestimmt worden waren, entworfen worden waren, wurden zur Klonierung eines DNA-Fragments, das stromabwärts von 4-3N gelegen war, verwendet. Eine Klonierung wurde wie vorstehend beschrieben für die Klonierung von 4-3N, außer dass die Temperatur der Anlagerung der Primer auf 55°C geändert wurde, durchgeführt. Als Ergebnis wurde ein DNA-Fragment von etwa 2,0 kb erhalten und als 4-3C bezeichnet.
Jedes der so erhaltenen Fragmente 4-3UN und 4-3C wurde in den Vektor pP7Blue (Novagen) ligiert. Die Nukleotidsequenzen wurden gemäß dem Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren bestimmt. Analyse und Alignment der Nukleotidsequenzen der DNA-Fragmente 4-3N, 4-3UN und 4-3C, die wie vorstehend beschrieben bestimmt worden waren, offenbarte einen offenen Leserahmen (ORF), der ein aus 951 Aminosäuren bestehendes Polypeptid kodiert. Die Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens und die Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens kodiert wird, sind in SEQ ID NO: 13 bzw. 15 gezeigt. In 4-3UN wurden eine Nukleotidsequenz für die Aminosäuresequenz P2, eine stromaufwärts gelegene Nukleotidsequenz, die 183 Aminosäuren kodiert, und eine weiter stromaufwärts gelegene SD-ähnliche Sequenz gefunden. Die N-terminale Aminosäuresequenz, die für die α-Agarase, die aus dem Mikroorganismus TKR4-3 gereinigt worden war, bestimmt worden war, P2, stimmte mit der Sequenz der 184. bis 203. Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 15 überein.
Die Aminosäuresequenzen von Agarase 1-7 und Agarase 4-3, die wie vorstehend beschrieben erhalten worden waren, sowie die Nukleotidsequenzen der Gene weisen keine Homologie zu den Aminosäuresequenzen von β-Agarasen, die bekannte Agarose-verdauende Enzyme sind und die Agarose in einer im Vergleich mit der erfindungsgemäßen Agarase unterschiedlichen Weise spalten, und den Nukleotidsequenzen der Gene auf. Daher werden diese Sequenzen als absolut neu angesehen.
Beispiel 8
Herstellung eines Plasmids zur Expression von α-Agarase 1-7
Primer 10 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 18 wurde synthetisiert. Der Primer 10 ist ein Primer, der eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym NdeI an den Basenzahlen 8 bis 13 und eine Nukleotidsequenz, die einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 28 bis 31 in der Aminosäuresequenz der α-Agarase 1-7 (SEQ ID NO: 14) entspricht, an den Basenzahlen 14 bis 25 aufweist.
Eine PCR wurde unter Verwendung des Primers 10 und des Primers 2 (SEQ ID NO: 4), der mit einem Teil des Vektors pUC19 in pAA1 hybridisiert, sowie pAA1 als Matrize durchgeführt.
Jeweils 10 pmol des Primers 10 und des Primers 2, 10 ng pAA1, das in Beispiel 6 erhalten worden war, als Matrize, 5 μl 10 × ExTaq-Puffer, 8 μl eines dNTP-Gemisches und 0,5 μl TaKaRa ExTaq wurden in ein 0,5 ml-PCR-Röhrchen gegeben. Steriles Wasser wurde ferner zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 50 μl einzustellen. Das Röhrchen wurde in ein automatisiertes Gen-Amplifikationsinstrument (Thermal Cycler (Takara Shuzo)) gegeben. Nach Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten wurde eine PCR mit 25 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 94°C für eine Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten. Das PCR-Produkt wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert und entsalzt, mit den Restriktionsenzymen NdeI (Takara Shuzo) und BamHI (Takara Shuzo) doppelt verdaut und dann einer Elektrophorese auf einem 1,0%igen Agarose-Gel unterworfen. Das NdeI-BamHI-Verdauprodukt wurde getrennt, extrahiert und gereinigt. Das gereinigte Produkt wurde mit pKF19k (Takara Shuzo), das mit NdeI und BamHI verdaut worden war, gemischt und unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) ligiert. 10 μl des Ligationsgemisches wurden zur Transformation von Escherichia coli JM109 verwendet. Transformanten wurden auf LG-Medium mit Agar bei einer Konzentration von 1,5% (w/v) und Kanamycin bei einer Konzentration von 50 μg/ml vermehrt. Plasmide wurden von weißen Kolonien präpariert, DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt und ein Plasmid, in das das PCR-Produkt richtig inseriert worden war, wurde ausgewählt und als pAA201 bezeichnet. pAA201 ist ein Plasmid, das eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 28 bis 925 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 1-7 (SEQ ID NO: 14) kodiert.
Die Transformante, in die pAA201 eingebracht worden war, wurde in 2,5 ml LG-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin und 10 mM Calciumchlorid geimpft und bei 37°C über Nacht kultiviert. Ein Teil der Kultur wurde in 2,5 ml des gleichen frischen Mediums geimpft und bei 25°C kultiviert, bis eine exponentielle Wachstumsphase erreicht wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde IPTG bei einer Endkonzentration von 1,0 mM zugegeben. Die Kultivierung wurde über Nacht bei 15°C weitergeführt, um die Expression des Proteins von Interesse zu induzieren. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und in 150 μl einer Zellzerstörungslösung (20 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,0), 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Natriumchlorid) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall zerstört. Ein Extrakt des Überstands und ein Präzipitat wurden durch Zentrifugation voneinander getrennt und als Proben für die Messung von μ-Agarase-Aktivitäten unter Verwendung von Agarose als Substrat verwendet. Dann wurde Aktivität für den Extrakt festgestellt. Die Aktivität von 100 ml der Kultur war etwa 25-fach höher als die des Wildtyp-Stamms TKR1-7AGα.
Beispiel 9
Expressionssystem für α-Agarase 1-7 unter Verwendung des Vektors pT7BlueT
Primer 11 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 19 wurde synthetisiert. Der Primer 11 ist ein Primer, der eine Nukleotidsequenz, die einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 28 bis 33 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 1-7 (SEQ ID NO: 14) entspricht, bei den Basenzahlen 13 bis 30 aufweist.
Eine PCR wurde unter Verwendung des Primers 11 und des Primers 2 sowie pAA1 als Matrize durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde durch Elektrophorese auf einem 1,0%igen Agarose-Gel getrennt, extrahiert und gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wurde in pT7BlueT (Takara Shuzo), ein zum Klonieren entwickelter Vektor, ligiert, um einen Expressionsvektor herzustellen. Die für die PCR verwendeten Bedingungen waren diejenigen, die in Beispiel 8 beschrieben sind. DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt und ein Plasmid, in das das PCR-Produkt richtig inseriert war, wurde ausgewählt.
Das ausgewählte Hybridplasmid wurde als pAA301 bezeichnet. pAA301 ist ein Plasmid, das eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 28 bis 925 in der Aminosäuresequenz der α-Agarase 1-7 (SEQ ID NO: 14) kodiert, ähnlich wie pAA201.
pAA301 wurde zur Transformation von Escherichia coli JM109 verwendet und die erhaltene Transformante wurde in LH-Medium mit 50 μg/ml Ampicillin und 10 mM Calciumchlorid geimpft. Die Expression des Proteins von Interesse wurde mittels IPTG induziert und die α-Agarase-Aktivität wurde wie vorstehend in Beispiel 8 beschrieben bestimmt. Dann wurde für den Extrakt Aktivität festgestellt. Die Aktivität in 100 ml der Kultur war etwa 100-fach höher als die von TKR1-7AGα.
Beispiel 10
Expressionssystem für α-Agarase 1-7 unter Verwendung von pET16b
Primer 12 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 20 wurde synthetisiert. Der Primer 12 ist ein Primer, der eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz ist, die den Aminosäurezahlen 919 bis 924 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 1-7 (SEQ ID NO: 14) entspricht, bei den Basenzahlen 17 bis 34 und eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym BamHI bei den Basenzahlen 9 bis 14 aufweist.
Eine PCR wurde unter Verwendung des Primers 10 (SEQ ID NO: 18) und des Primers 12 (SEQ ID NO: 18) sowie pAA1 als Matrize unter Bedingungen wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Das amplifizierte Fragment wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert und entsalzt, mit NdeI (Takara Shuzo) und BamHI (Takara Shuzo) verdaut, durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt, extrahiert und gereinigt. Das Produkt wurde in pET16b (Takara Shuzo), das mit NdeI und BamHI verdaut worden war, ligiert. Das erhaltene Hybridplasmid wurde als pAA401 bezeichnet. pAA401 ist ein Plasmid, das eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 28 bis 925 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 1-7 (SEQ ID NO: 14) kodiert, ähnlich wie pAA201 und pAA301.
pAA401 wurde zur Transformation von Escherichia coli BL21(DE3)pLysS verwendet und die erhaltene Transformante wurde zum Bestimmen der α-Agarase-Aktivität wie vorstehend in Beispiel 8 beschrieben verwendet, außer dass Ampicillin als Wirkstoff anstelle von Kanamycin verwendet wurde. Dann wurde für den Extrakt Aktivität festgestellt. Die Aktivität in 100 ml der Kultur war etwa 100-fach höher als die von TKR1-7AGα.
Beispiel 11
Herstellung eines Plasmids zur Expression von α-Agarase 4-3
Primer 13 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 21 und Primer 14 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 22 wurden synthetisiert.
Der Primer 13 ist ein Primer, der eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym NdeI bei den Basenzahlen 12 bis 17 und eine Nukleotidsequenz, die einer Ami nosäuresequenz der Aminosäurezahlen 184 bis 187 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 4-3 (SEQ ID NO: 15) entspricht, bei den Basenzahlen 18 bis 29 aufweist.
Der Primer 14 ist ein Primer, der eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym BamHI bei den Basenzahlen 8 bis 13 und eine Sequenz, die mit einer Region stromabwärts von dem offenen Leserahmen des α-Agarase 4-3-Gens hybridisiert, das durch Klonierung erhalten worden war, aufweist.
Eine PCR wurde unter Verwendung der Primer 13 und 14 sowie der chromosomalen DNA des Wildtyp-Stamms TKR4-3AGα als Matrize durchgeführt. Ein Reaktionsgemisch für PCR, das 10 pmol jedes der Primer 13 und 14, 10 ng der chromosomalen DNA des Wildtyp-Stamms TKR4-3AGα, die mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut worden war, als Matrize und ExTaq (Takara Shuzo) enthielt, wurde hergestellt. Nach Denaturierung bei 94°C für zwei Minuten wurde eine PCR mit 25 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 94°C für eine Minute, 50°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten. Das erhaltene PCR-Produkt wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert und mit den Restriktionsenzymen NdeI (Takara Shuzo) und BamHI (Takara Shuzo) doppelt verdaut. Das NdeI-BamHI-Verdauprodukt wurde durch Elektrophorese auf einem 1,0% Agarose-Gel getrennt, extrahiert und gereinigt. Ein Hybridplasmid mit pKF19k wurde wie in Beispiel 8 beschrieben konstruiert und eine Transformation von Escherichia coli JM109 wurde durchgeführt. Plasmide wurden von den erhaltenen Transformanten präpariert und ein Plasmid, in das das PCR-Produkt in einer korrekten Orientierung inseriert worden war, wurde ausgewählt und als pAH101 bezeichnet. pAH101 ist ein Plasmid, das eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 184 bis 951 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 4-3 (SEQ ID NO: 15) kodiert.
Mit dem Plasmid pAH101 transformiertes Escherichia coli wird als Escherichia coli JM109/pAH101 bezeichnet und gekennzeichnet und wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 27. Januar 2000 am National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-7008 hinterlegt.
Die α-Agarase-Aktivität wurde für die Transformante, die pAH101 trägt, wie vorstehend in Beispiel 8 beschrieben bestimmt. Dann wurde Aktivität für den Extrakt festgestellt. Die Aktivität in 100 ml der Kultur war etwa 15-fach höher als die des Wildtyp-Stamms TKR4-3AGα.
Beispiel 12
Expressionssystem für α-Agarase 4-3 unter Verwendung von pET16b
Primer 15 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 23 wurde synthetisiert.
Der Primer 15 ist ein Primer, der eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym BamHI bei den Basenzahlen 10 bis 15 und einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz ist, die einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 945 bis 950 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 4-3 (SEQ ID NO: 15) entspricht, bei den Basenzahlen 18 bis 35 aufweist.
Eine PCR wurde unter Verwendung der Primer 13 und 15 sowie der chromosomalen DNA des Wildtyp-Stamms TKR4-3AGα, die in Beispiel 11 beschrieben ist, als Matrize unter Bedingungen wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Das amplifizierte Fragment wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert, mit NdeI und BamHI verdaut, durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt, extrahiert und gereinigt. Das Produkt wurde in pET16b (Takara Shuzo), das mit NdeI und BamHI verdaut worden war, ligiert. Das erhaltene Hybridplasmid wurde als pAH201 bezeichnet. pAH201 ist ein Plasmid, das eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 184 bis 950 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 4-3 (SEQ ID NO: 15) kodiert.
pAH201 wurde zur Transformation von Escherichia coli BL21(DE3)pLysS verwendet und die erhaltene Transformante wurde zur Bestimmung der α-Agarase-Aktivität wie vorstehend in Beispiel 8 beschrieben verwendet, außer dass Ampicillin als Wirkstoff anstelle von Kanamycin verwendet wurde. Dann wurde Aktivität für den Extrakt festgestellt. Die Aktivität in 100 ml der Kultur war etwa 75-fach höher als die von TKR4-3AGα.
Beispiel 13
Aktivität von modifiziertem Protein
Ein modifiziertes Protein wurde mittels Gentechnik wie nachstehend beschrieben hergestellt. Die α-Agarase-Aktivität des modifizierten Proteins wurde bestimmt.
Primer 16 mit der Sequenz von SEQ ID NO: 24 wurde synthetisiert.
Der Primer 16 ist ein Primer, der eine Nukleotidsequenz, die einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 172 bis 174 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 1-7 (SEQ ID NO: 14) entspricht, bei den Basenzahlen 3 bis 11, eine Nukleotidsequenz, die einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 177 bis 181 in der Aminosäuresequenz von α-Agarase 1-7 (SEQ ID NO: 14) entspricht, bei den Basenzahlen 18 bis 32 und eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym NdeI bei den Basenzahlen 12 bis 17 aufweist.
Eine PCR wurde unter Verwendung des Primers 16 und des Primers 2 (SEQ ID NO: 4) sowie von pAA1 als Matrize durchgeführt. Das Produkt wurde in pKF19k ligiert und eine Transformation von Escherichia coli JM109 wurde wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Plasmide wurden von den erhaltenen Transformanten präpariert. Ein Hybridplasmid, das durch Bestätigung der DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle erhalten wurde, wurde als pAA501 bezeichnet. pAA501 ist ein Plasmid, das ein Polypeptid, in dem ein Teil bis zu der Aminosäurezahl 176 in α-Agarase 1-7 deletiert ist, d.h. eine Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 177 bis 925 in SEQ ID NO: 14, kodiert.
Mit pAA501 transformiertes Escherichia coli JM109 wurde wie in Beispiel 8 beschrieben kultiviert und die Expression des durch pAA501 kodierten Proteins wurde mittels IPTG induziert und die Aktivität wurde bestimmt. Dann wurde α-Agarase-Aktivität für den Extrakt festgestellt.
Beispiel 14
Southern-Hybridisierung
Southern-Hybridisierung wurde gegen die chromosomale DNA des Wildtyp-Stamms TKR1-7AGα unter Verwendung des Fragments, das in den α-Agarase 4-3-Klon pAH101 inseriert worden war, als Sonde durchgeführt. Das folgende Verfahren wurde gemäß dem Protokoll für den DIG-DNA-Markierungs-/Detektionskit (Roche) durchgeführt. In diesem Fall wurde pAH101 mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI verdaut. Das erhaltene DNA-Fragment von etwa 2,4 kb wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt, extrahiert und gereinigt. Etwa 1,0 μg des gereinig ten Fragments wurden gemäß dem Protokoll des vorstehend genannten Kits markiert und als Sonde verwendet.
Etwa 2,0 μg der chromosomalen DNA aus TKR1-7AGα wurde mit BamHI verdaut und auf einem 1,0% Agarose-Gel elektrophoretisch getrennt. Die DNA-Fragmente wurden auf eine Nitrocellulosemembran (Amersham) unter Verwendung von 0,4 N Natriumhydroxid gemäß des herkömmlichen Verfahrens transferiert. Vorhybridisierung wurde dann bei 68°C eine Stunde durchgeführt. Die markierte Sonde wurde Hitze-denaturiert und zugegeben. Hybridisierung wurde bei 68°C über Nacht in einer Lösung durchgeführt, die 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardt's und 100 mg/ml Heringssperma-DNA enthielt. Die Membran wurde in 2 × SSC, 0,1% (w/v) SDS für 5 Minuten bei Raumtemperatur und danach 2 mal in 0,1 × SSC, 0,1% (w/v) SDS für 15 Minuten bei 68°C gewaschen, um überschüssige Sonde zu entfernen. Eine Detektionsreaktion wurde dann gemäß dem Protokoll durchgeführt. Als Ergebnis wurde eine Bande an einer Position beobachtet, die etwa 7,2 kb entsprach. Wie vorstehend beschrieben, konnte ein Gen, das eine aktive α-Agarase kodiert, das α-Agarase-Gen des Wildtyp-Stamms TKR1-7AGα, durch Durchführen einer Hybridisierung unter Verwendung des α-Agarase 4-3-Gens als Sonde unter stringenten Bedingungen nachgewiesen werden. Ein Vergleich der Gesamtsequenzen der offenen Leserahmen von Agarase 1-7 und Agarase 4-3 offenbarte, dass sie Homologien in der Aminosäuresequenz und der Nukleotidsequenz des Gens von 51% bzw. 61% teilen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die Erfindung stellt eine neue α-Agarase bereit. Es ist möglich, Agarooligosaccharide mit geringen Graden an Polymerisation und mit 3,6-Anhydro-L-Galactose an ihren reduzierenden Enden (z.B. Agarobiose und Agarotetraose) direkt aus Agarose durch Verwenden dieses Enzyms herzustellen. Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen α-Agarase hergestellten Agarooligosaccharide haben physiologische Aktivitäten wie Apoptose-induzierende Aktivität, karzinostatische Aktivität, verschiedene antioxidative Aktivitäten, immunoregulatorische Aktivität und antiallergische Aktivität. Daher sind sie auf dem Gebiet der pharmazeutischen Zusammensetzungen, Nahrungsmittel und Getränke verwendbar.
Die Erfindung offenbart zum ersten Mal eine Aminosäuresequenz und eine Nukleotidsequenz für eine α-Agarase. Daher ist es möglich, ein Gen, das ein Polypeptid mit α-Agarase-Aktivität kodiert, bereitzustellen. Die Erfindung stellt auch ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit α-Agarase-Aktivität durch Gentechnik unter Verwendung dieses Gens bereit.
Des Weiteren ist die Zugabe von Agarose zu einem Medium zur Induktion der Herstellung der α-Agarase in dem Herstellungsverfahren durch Gentechnik unter Verwendung des Gens nicht notwendig. Daher wird angenommen, dass bei Kultivierung Arbeit eingespart werden kann und das Enzym leicht zu reinigen ist.
Basierend auf der Tatsache, dass die Erfindung zum ersten Mal ein α-Agarase-Gen bereitstellt, ist es zusätzlich möglich, basierend auf der Information über dieses Gen ein rekombinantes Polypeptid, das durch das Gen kodiert wird, einen Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid oder ein Fragment davon bindet, sowie eine Sonde oder einen Primer, die/der spezifisch mit dem Gen hybridisiert, bereitzustellen.
Sequenzprotokoll-Freitext

SEQ ID NO: 1: N-terminale Aminosäuresequenz von Agarase 1-7.
SEQ ID NO: 2: N-terminale Aminosäuresequenz von Agarase 4-3.
SEQ ID NO: 3: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine PCR mit pAA1 als Matrize.
SEQ ID NO: 4: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine PCR mit pAA1 als Matrize.
SEQ ID NO: 5: Entworfener Oligonukleotidprimer für DNA-Sequenzierung von pAA1.
SEQ ID NO: 6: Entworfener Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung des DNA-Fragments 4-3N.
SEQ ID NO: 7: Entworfener Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung des DNA-Fragments 4-3N.
SEQ ID NO: 8: Entworfener Oligonukleotidprimer zur Klonierung des DNA-Fragments 4-3UN.
SEQ ID NO: 9: Entworfener Oligonukleotidprimer zur Klonierung des DNA-Fragments 4-3UN.
SEQ ID NO: 10: Entworfener Oligonukleotidprimer zur Klonierung des DNA-Fragments 4-3C.
SEQ ID NO: 11: Entworfener Oligonukleotidprimer zur Klonierung des DNA-Fragments 4-3C.
SEQ ID NO: 12: Nukleotidsequenz des ORFs des Agarase 1-7-Gens.
SEQ ID NO: 13: Nukleotidsequenz des ORFs des Agarase 4-3-Gens.
SEQ ID NO: 14: Aminosäuresequenz von Agarase 1-7.
SEQ ID NO: 15: Aminosäuresequenz von Agarase 4-3.
SEQ ID NO: 16: Entworfener Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung eines DNA-Fragments aus der ribosomalen 16S.
SEQ ID NO: 17: Entworfener Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung eines DNA-Fragments aus der ribosomalen 16S.
SEQ ID NO: 18: Entworfenes Oligonukleotid zum Erstellen eines Plasmids zur Expression von Agarase 1-7.
SEQ ID NO: 19: Entworfenes Oligonukleotid zum Erstellen eines Plasmids zur Expression von Agarase 1-7.
SEQ ID NO: 20: Entworfenes Oligonukleotid zum Erstellen eines Plasmids zur Expression von Agarase 1-7.
SEQ ID NO: 21: Entworfenes Oligonukleotid zum Erstellen eines Plasmids zur Expression von Agarase 4-3.
SEQ ID NO: 22: Entworfenes Oligonukleotid zum Erstellen eines Plasmids zur Expression von Agarase 4-3.
SEQ ID NO: 23: Entworfenes Oligonukleotid zum Erstellen eines Plasmids zur Expression von Agarase 4-3.
SEQ ID NO: 24: Entworfenes Oligonukleotid zum Erstellen eines Plasmids zur Expression von Agarase 1-7.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

α-Agarase mit den nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: (1) Aktivität: hydrolysiert eine α-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-galactose und D-Galactose; (2) Substratspezifität: wirkt ein auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide, die länger als Agarohexaose sind, jedoch nicht auf Agarotetraose; (3) Temperaturoptimum: weist enzymatische Aktivität bei einer Temperatur von 55°C oder weniger auf; und (4) Hitzestabilität: behält 20% oder mehr ihrer Aktivität nach Behandlung bei 48°C für 30 Sekunden bei, wobei die α-Agarase eine Aminosäuresequenz, die aus 749 Resten von der Aminosäurezahl 177 bis zu der Aminosäurezahl 925 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 besteht, Oder eine Aminosäuresequenz, in der eine Oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die aus 749 Resten besteht, substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, eine Aminosäuresequenz, die aus 767 Resten von der Aminosäurezahl 184 bis zu der Aminosäurezahl 950 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 15 besteht, oder eine Aminosäuresequenz, in der eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die aus 767 Resten besteht, substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, enthält.
α-Agarase gemäß Anspruch 1, die aus einem Mikroorganismus TKR1-7AGα (FERN BP-6990) oder einem Mikroorganismus TKR4-3AGα (FERN BP-6991) erhältlich ist.
Gen, das für die durch einen der Ansprüche 1-2 definierte α-Agarase kodiert.
Gen gemäß Anspruch 3, das aus einem Mikroorganismus TKR1-7AGα (FERM BP-6990) oder einem Mikroorganismus TKR4-3AGα (FERM BP-6991) erhältlich ist.
Gen gemäß Anspruch 3 oder 4, das für eine α-Agarase kodiert, die eine Aminosäuresequenz, die aus 749 Resten von der Aminosäurezahl 177 bis zu der Aminosäurezahl 925 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 besteht, oder eine Aminosäuresequenz, in der eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die aus 749 Resten besteht, substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, enthält.
Gen gemäß Anspruch 3 oder 4, das für eine α-Agarase kodiert, die eine Aminosäuresequenz, die aus 767 Resten von der Aminosäurezahl 184 bis zu der Aminosäurezahl 950 in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 15 besteht, oder eine Aminosäuresequenz, in der eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die aus 767 Resten besteht, substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, enthält.
Gen gemäß Anspruch 3 oder 4, das eine Nukleotidsequenz, die aus 2247 Basen von der Basenzahl 529 bis zu der Basenzahl 2775 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 12 besteht, oder eine Nukleotidsequenz, in der chic oder mehrere Basen in der Nukleotidsequenz, die aus 2247 Basen besteht, substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, enthält.
Gen gemäß Anspruch 3 oder 4, das eine Nukleotidsequenz, die aus 2301 Basen von der Basenzahl 550 bis zu der Basenzahl 2850 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 13 besteht, oder eine Nukleotidsequenz, in der eine oder mehrere Basen in der Nukleotidsequenz, die aus 2301 Basen besteht, substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder inseriert sind, enthält.
Gen, das mit dem durch einen der Ansprüche 3-8 definierten Gen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und für eine α-Agarase mit den nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften kodiert: (1) Aktivität: hydrolysiert eine α-1,3-Bindung zwischen 3,6-Anhydro-L-galactose und D-Galactose; (2) Substratspezifität: wirkt ein auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide, die länger als Agarohexaose sind, jedoch nicht auf Agarotetraose; (3) Temperaturoptimum: weist enzymatische Aktivität bei einer Temperatur von 55°C oder weniger auf; und (4) Hitzestabilität: behält 20% oder mehr ihrer Aktivität nach Behandlung bei 48°C für 30 Sekunden bei.
Rekombinantes DNA-Molekül, das das durch einen der Ansprüche 3-9 definierte Gen enthält.
Nicht-menschliche Transformante, die das durch Anspruch 10 definierte rekombinante DNA-Molekül trägt.
Verfahren zur Herstellung der durch einen der Ansprüche 1-2 definierten α-Agarase, das ein Kultivieren eines Mikroorganismus, der fähig ist, die durch einen der Ansprüche 1-2 definierte α-Agarase zu produzieren, und ein Gewinnen der α-Agarase aus der Kultur umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 12, das ein Kultivieren eines Mikroorganismus, der zu einer Gattung gehört, zu der ein Makroorganismus TKR1-7AGα (FERN BP-6990) oder ein Mikroorganismus TKR4-3AGα (FERN BP-6991) gehört, und ein Gewinnen der α-Agarase aus der Kultur umfasst.
Verfahren zur Herstellung der durch einen der Ansprüche 1-2 definierten α-Agarase, das ein Kultivieren der durch Anspruch 11 definierten Transformanten und ein Gewinnen einer α-Agarase aus der Kultur umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Agarooligosaccharids, das ein Spalten von Agarose unter Verwendung der durch einen der Ansprüche 1-2 definierten α-Agarase und ein Gewinnen eines Agarooligosaccharids aus dem sich ergebenden Spaltprodukt umfasst.