DE69533151T2

DE69533151T2 - Alpha-1,3/4-Fucosidasegen

Info

Publication number: DE69533151T2
Application number: DE69533151T
Authority: DE
Inventors: Sano Otsu-shi Mutsumi; Takabatake Nagoya-shi Yuka; Mitta Tsuzuki-gun Masanori; Kato Uji-shi Ikunoshin
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2015-04-26
Also published as: JPH07308192A; US5637490A; EP0698664A1; JP4052605B2; DE69533151D1; EP0698664B1

Description

Industrieller Anwendungsbereich
Diese Erfindung betrifft eine Nukleotidsequenz, die für eine α-1,3/4-Fucosidase kodiert, die in der Zuckerkettentechnologie zum Analysieren, beispielsweise der Strukturen und Funktionen von Zuckerketten und Glycoproteinen anwendbar ist, und eine Aminosäuresequenz davon. Diese Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur industriellen Produktion einer α-1,3/4-Fucosidase unter Verwendung einer Transformante, in die ein rekombinantes Plasmid eingeführt wurde, das das α-1,3/4-Fucosidasegen enthält.
Stand der Technik
L-Fucose kommt hauptsächlich am nicht reduzierenden Ende von Zuckerketten vor als Zuckerbaustein von sogenannten Glycokonjugaten wie Glycoproteinen, Glycolipiden und Glycosaminoglycanen. Fucose mit einer α-1,3/4-Bindung ist in Lewis-Blutgruppenantigenen enthalten, in mit Tumoren assoziierten Antigenen oder Liganden von Selectinen, die Zelladhäsionsmoleküle sind. α-1,3/4-Fucosidase wurde als Reagens eingesetzt, das in hohem Maße geeignet ist, die Strukturen oder die Funktionen dieser Zuckerketten zu analysieren.
Bekannte Beispiele einer α-1,3/4-Fucosidase beinhalten α-Fucosidase I [Archives of Biochemistry and Biophysics, 181, 353–358 (1977); Journal of Biological Chemistry, 257, 8205–8210 (1982)] und α-Fucosidase III [Journal of Biological Chemistry, 265, 16472–16477 (1990)] aus Mandeln und eines aus Streptomyces [Journal of Biological Chemistry, 267, 1522–1527 (1992)].
Durch die Erfindung zu lösende Probleme
Das Verfahren zum Erhalt von α-Fucosidase aus Mandelmehl oder Mandelemulsin weist jedoch den Nachteil auf, dass Mandeln verschiedene Glycosidasen enthalten und es deshalb schwierig ist, die angezielte α-Fucosidase aus diesen Glycosidasen vollständig abzutrennen und dieses Enzym in hohem Maß zu reinigen. Beim Verfahren zum Erhalt von α-1,3/4-Fucosidase durch Kultivieren eines Actinomycetes, der zur Gattung Streptomyces gehört, ist es hingegen erforderlich, teure L-Fucose dem Medium zuzusetzen, um die Produktion des Enzyms zu induzieren. Dieses Verfahren leidet an einem weiteren Problem, dass andere Enzyme, darunter Protease und Lacto-N-biosidase, auch gebildet werden und es schwierig ist, die angezielte α-Fucosidase daraus abzutrennen und zu reinigen. Dementsprechend ist es erforderlich, ein Verfahren zur Erzeugung von α-1,3/4-Fucosidase mit einer höheren Reinheit zu geringeren Kosten auszubilden. Obwohl Verfahren zur Reinigung von α-1,3/4-Fucosidase aus Mandeln und einem Actinomycetes der Gattung Streptomyces wie oben beschrieben berichtet wurden, wurden bisher weder die Aminosäuresequenz noch die Genstruktur von α-1,3/4-Fucosidase aufgeklärt.
Es wurde auch ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von α-1,3/4-Fucosidase offenbart. Dementsprechend ermöglicht die Identifikation des Gens von α-1,3/4-Fucosidase, dieses Enzym in einem nicht verunreinigten und hochreinen Zustand durch Gentechnologie zu erzeugen. Es wird auch möglich, das Enzym zu erzeugen, das in der Glycotechnologie beispielsweise zum Analysieren der Strukturen und Funktionen von Zuckerketten und Glycoproteinen geeignet ist. Ferner ermöglicht die Identifikation der DNA-Sequenz dieses Enzyms die Suche nach dazu analogen Genen und Enzymen, die sich darin in der Sequenz unterscheiden, von denen aber erwartet wird, dass sie ähnliche enzymatische Aktivitäten aufweisen. Außerdem ist die der DNA-Sequenz dieses Enzyms entsprechende Aminosäuresequenz bei der Herstellung eines Antikörpers für dieses Enzyms geeignet.
Die vorliegende Erfindung kann ein α-1,3/4-Fucosidasegen, seine DNA-Sequenz, seine Aminosäuresequenz und ein Verfahren zur Herstellung der α-1,3/4-Fucosidase durch Gentechnologie zur Verfügung stellen.
Mittel zum Lösen der Probleme
Zusammengefasst betrifft der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung ein isoliertes α-1,3/4-Fucosidasegen. Insbesondere stellt sie ein α-1,3/4-Fucosidasegen zur Verfügung, das für eine Fraktion mit einer α-1,3/4-Fucosidaseenzymaktivität kodiert und einer von SEQ ID NO. 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht, und ein α-1,3/4-Fucosidasegen mit einer von SEQ ID NO. 2 gezeigten Aminosäuresequenz und ein α-1,3/4-Fucosidasegen, das mit dem oben genannten Gen, das der von SEQ ID NO. 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht, hybridisiert werden kann.
Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur industriellen Herstellung einer α-1,3/4-Fucosidase. Insbesondere stellt sie ein Verfahren zur Herstellung einer α-1,3/4-Fucosidase durch Kultivieren einer Transformante, in die ein rekombinantes Plasmid eingeführt ist, und Ernten der α-1,3/4-Fucosidase aus der Kultur zur Verfügung.
Die Erfindung wird unten weiter beschrieben, indem teilweise auf 1 Bezug genommen wird, die ein Diagramm ist, das die Korrelation zwischen PstI- und SalI-Fragmenten und Restriktionsenzymkarten zeigt, worin A die Restriktionsenzymkarte des PstI-Fragments mit einer Größe von 2,3 kb ist, während B die Restriktionsenzymkarte des SalI-Fragments mit einer Größe von 1,9 kb ist.
Um das oben genannte α-1,3/4-Fucosidasegen zu erhalten, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung α-1,3/4-Fucosidase aus Streptomyces sp. 142 hoch gereinigt und die N-terminale Aminosäuresequenz und die partiellen Aminosäuresequenzen derselben bestimmt. Ausgehend von der Information über diese Aminosäuresequenzen, führten sie anschließend eine PCR gemäß dem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern durch. Sie konnten jedoch kein α-1,3/4-Fucosidasegen erhalten, und sie konnten es auch nicht unter Verwendung dieser Primer als Sonde. Daher führten sie intensive Untersuchungen zu verschiedenen Bedingungen zur Durchführung von PCR durch. Als Folge davon erreichten sie die Amplifizierung eines Teils des α-1,3/4-Fucosidasegens unter Verwendung eines spezifischen Paars synthetischer Primer unter speziellen Bedingungen. Unter Verwendung des auf diese Weise amplifizierten Gens als Sonde, isolierten sie das Zielgen und bestimmten seine Nukleotidsequenz. Ferner konstruierten sie ein rekombinantes Plasmid, das in der Lage ist, aktive α-1,3/4-Fucosidase in einem Mikroorganismus zu exprimieren. Sie produzierten dann erfolgreich die α-1,3/4-Fucosidase unter Verwendung des Mikroorganismus, der durch das oben genannte Plasmid transformiert wurde, wodurch die vorliegende Erfindung erreicht wurde.
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher unter Heranziehung von Streptomyces sp. 142 als Beispiel beschrieben. Dieser Stamm ist in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 98583/1991 als Streptomyces sp. 142 beschrieben und seit 17. Februar 1994 unter dem Budapester Abkommen als FERM BP-4569 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, in 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan hinterlegt.
Zunächst wird eine rohe Enzymlösung aus Streptomyces sp. 142 bereitet und die α-1,3/4-Fucosidase in einem hohen Grad durch verschiedene chromatographische Techniken gereinigt.
Um die Information zur partiellen Aminosäuresequenz der gereinigten α-1,3/4-Fucosidase zu erhalten, wurde die gereinigte α-1,3/4-Fucosidase, zum Beispiel erhalten nach dem im Journal of Biological Chemistry, 267, 1522–1527 (1992) beschriebenen Verfahren, direkt einem Edman-Abbau und Analyse seiner Aminosäuresequenzen unterzogen. Alternativ kann sie der begrenzten Hydrolyse unter Verwendung einer Proteinhydrolase mit hoher Spezifität unterzogen werden, gefolgt von Abtrennung und Reinigung der so erhaltenen Peptidfragmente durch Umkehrphasen-HPLC. Es ist wirksam zum Analysieren der Aminosäuresequenzen der gereinigten Peptidfragmente. Auf Grundlage der Information über diese partiellen Aminosäuresequenzen, kann das α-1,3/4-Fucosidasegen generell nach dem PCR-Verfahren oder nach dem Hybridisierungsverfahren geklont werden.
1) PCR-Verfahren unter Verwendung von Kassetten-DNA
Eine genomische DNA extrahiert aus Streptomyces sp. 142 nach einem herkömmlichen Verfahren wird mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und dann mit einer synthetischen DNA (Kassetten-DNA) mit einer bekannten Sequenz verknüpft. Unter Verwendung des so erhaltenen Produkts als Templat wird eine PCR unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern durchgeführt, die nach einem herkömmlichen Verfahren in Abhängigkeit von der Information über die partiellen Aminosäuresequenzen aufgebaut wurden, und synthetischen Oligonukleotidprimern (Kassetten-Primer), die zur Kassetten-DNA komplementär sind. Auf diese Weise kann das angezielte DNA-Fragment amplifiziert werden. Als Kassetten-DNA oder Kassetten-Primer können zum Beispiel die von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellten verwendet werden. Die Kassetten-DNA enthält Sequenzen, die 2 Kassetten-Primern entsprechen. Es ist bekannt, dass das angezielte DNA-Fragment durch Ausführen der ersten PCR unter Verwendung des fern von der Restrikti onsenzymstelle gelegenen Primers und dann Ausführen der zweiten PCR unter Verwendung eines Teils der Reaktionsmischung der ersten PCR als Templat unter Verwendung des nahe der Restriktionsenzymstelle gelegenen Primers effektiv amplifiziert werden können. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung versuchten, das Gen der vorliegenden Erfindung nach diesem Verfahren zu erhalten. Zunächst wurden synthetische Oligonukleotidprimer FSE-1 (SEQ ID NO. 5) und 57R (SEQ ID NO. 6) entsprechend aus der N-terminalen Sequenz N-1 (SEQ ID NO. 3) und der partiellen Aminosäuresequenz 57 (SEQ ID NO. 4) synthetisiert. Die auf herkömmliche Weise aus Streptomyces sp. 142 extrahierte genomische DNA wird mit Restriktionsenzymen Sau3AI, BamHI, PstI und SalI verdaut und mit den entsprechenden Kassetten-DNAs (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verknüpft. Unter Verwendung dieser als Templat, wird eine PCR mit einer Kombination von FSE-1 mit C1-Primer (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und einer anderen Kombination von 57R mit C1-Primer vorgenommen. Die PCR wird gemäß einem in PCR Technology, herausgegeben von Erlich, veröffentlicht von Stockton Press (1989) beschriebenen Verfahren vorgenommen. Zum Beispiel kann sie unter Verwendung des GeneAmp PCR Reagent Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) vorgenommen werden. Die Reaktion wird zum Beispiel über 30 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C besteht. Unter Verwendung eines Teils der Reaktionsmischung wird PCR ferner unter denselben Bedingungen unter Verwendung einer Kombination von FSE-1 mit C2-Primer (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und einer anderen Kombination von 57R mit C2-Primer vorgenommen. Wenn die Reaktionsmischung durch Agarosegelelektrophorese analysiert wird, zeigt das α-1,3/4-Fucosidasegen der vorliegenden Erfindung kein spezifisch amplifiziertes DNA-Fragment. Es ist daher unmöglich, das α-1,3/4-Fucosidasegen der vorliegenden Erfindung nach diesem Verfahren zu klonen.
2) Übliches PCR-Verfahren
Das angezielte DNA-Fragment kann durch Ausführen einer PCR unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern amplifiziert werden, die auf Grundlage der Information über partielle Aminosäuresequenzen konstruiert wurden. Zunächst wird ein synthetischer Oligonukleotidprimer 57F (SEQ ID NO. 7) aus der partiellen Aminosäuresequenz 57 (SEQ ID NO. 4) synthetisiert, während Oligonukleotidprimer 39F (SEQ ID NO. 9) und 39R (SEQ ID NO. 10) aus der partiellen Aminosäuresequenz 39 (SEQ ID NO. 8) synthetisiert werden und die Oligonukleotidprimer 45F (SEQ ID NO. 12) und 45R (SEQ ID NO. 13) aus der partiellen Aminosäuresequenz 45 (SEQ ID NO. 11) synthetisiert werden.
Dann werden die Primer mit FSE-1 (SEQ ID NO. 5) und 57R (SEQ ID NO. 6) wie oben unter 1) beschrieben in den in Tabelle 1 angegebenen Kombinationen verwendet und eine PCR unter Verwendung der genomischen DNA von Streptomyces sp. 142 als Templat durchgeführt.
Tabelle 1
Die PCR wird zum Beispiel über 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C besteht. Wenn die Reaktionsmischung durch Agarosegelelektrophorese analysiert wird, werden amplifizierte DNA-Fragmente mit einer Größe von 200 pb bzw. 900 bp in einer Kombination aus FSE-1 (SEQ ID NO. 5) mit 45R (SEQ ID NO. 13) [d. h. die Kombination (3) in Tabelle 1] und einer Kombination von 45F (SEQ ID NO. 12) mit 39R (SEQ ID NO. 10) [d. h. die Kombination (9) in Tabelle 1] gefunden. Anderen Kombinationen zeigen entweder keine Amplifikation oder eine Anzahl von amplifizierten Produkten. Obwohl die Nukleotidsequenzen der spezifisch unter Verwendung der Kombinationen (3) und (9) in Tabelle 1 amplifizierten DNA-Fragmente nach einem üblicherweise im Fachbereich eingesetzten Verfahren bestimmt wurden, kann keine andere Sequenz gefunden werden, die dem Zielgen zu entsprechen scheint, als die Sequenzen der synthetisierten DNAs.
3) Hybridisierungsverfahren mit synthetischer DNA
Es wurde allgemein ein Verfahren verwendet, das Konstruieren synthetischer Oligonukleotide in Abhängigkeit von der Information über partielle Aminosäuresequenzen und Erfassen der Ziel-DNA durch Hybridisierung umfasst. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung versuchten, das α-1,3/4-Fucosidasegen der vorliegenden Erfindung nach diesem Verfahren zu erfassen.
Als Sonde für eine Southern Hybridisierung werden synthetische Oligonukleotide FSE (SEQ ID NO. 5) und 39F (SEQ ID NO. 7) verwendet, die oben unter 2) beim PCR-Verfahren beschrieben wurden, und synthetische Oligonukleotide 28F (SEQ ID NO. 15) und 32R (SEQ ID NO. 17), die entsprechend aus partiellen Aminosäuresequenzen 28 (SEQ ID NO. 14) und 32 (SEQ ID NO. 16) synthetisiert wurden. Die genomische DNA von Streptomyces sp. 142 wird auf herkömmlich Weise mit einem Restriktionsenzym BamHI, PstI, SacI oder SalI vollständig verdaut, durch Agarosegelelektrophorese getrennt und auf eine Polyamidmembran aufgetüpfelt. Die Hybridisierung kann unter den üblicherweise im Fachbereich eingesetzten Bedingungen vorgenommen werden. Zum Beispiel wird die Polyamidmembran in einer Prehybridisierungslösung, die 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardt's und 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthält, bei 65°C blockiert. Dann wird jedes synthetische Oligonukleotid markiert mit ³²P hinzugefügt und die erhaltene Mischung über Nacht bei 40°C stehen gelassen. Die Polyamidmembran wird mit 2 × SSC, das 0,1% SDS enthält, bei 50°C 30 Minuten lang gewaschen. Dann werden mit den synthetischen Oligonukleotidsonden hybridisierbare DNA-Fragmente autoradiographisch erfasst. Es wird kein mit Sonde 39F (SEQ ID NO. 7) hybridisierbares DNA-Fragment erfasst, während andere Sonden FSE-1 (SEQ ID NO. 5), 28F (SEQ ID NO. 15) und 32R (SEQ ID NO. 17) jeweils eine Anzahl von Banden auf der Strecke jedes Restriktionsenzymverdauungsprodukts zeigen. Es ist deshalb unmöglich, das angezielte α-1,3/4-Fucosidasegen zu spezifizieren.
Wie oben beschrieben ist es beim herkömmlichen Verfahren schwierig, das α-1,3/4-Fucosidasegen der vorliegenden Erfindung aus der genomischen DNA von Streptomyces sp. 142 nach dem herkömmlichen Verfahren zu klonen. Wenn die genomische DNA von Streptomyces sp. 142 als Templat verwendet wird, wird der Fortschritt der Polymerasekettenreaktion (PCR) inhibiert oder es erfolgt unspezifisches Verschmelzen. Es wird daher angenommen, dass das PCR-Verfahren unter der Inhibition der Amplifikation oder der Amplifikation unspezifischer DNA-Fragmente leidet, während das Hybridisierungsverfahren unter der Bildung von unspezifischen Hybriden leidet. Unter Berücksichtigung dieser Punkte haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die PCR unter solchen Bedingungen durchgeführt, dass sie Inhibition der Verlängerung der DNA-Strängen aufgrund der Bildung der sekundären Struktur vermeiden und unspezifische Verschmelzung minimieren.
Namentlich wird als Substrat in der PCR eingesetztes dGTP durch sein Derivat 2'-Deoxy-7-deazaguanosintriphosphat (dc⁷GTP) ersetzt und die Reaktion bei einer erhöhten Verschmelzungstemperatur von 60°C durchgeführt. Unter Verwendung eines Teils dieser Reaktionsmischung als Templat wird die zweite Reaktion unter Verwendung eines üblichen Substrats mit dGTP ausgeführt. Auf diese Weise wurde gefunden, dass ein Teil des angezielten α-1,3/4-Fucosidasegens zum ersten Mal unter Verwendung einer spezifischen Kombination von Primern amplifiziert wurde.
Nun wird dieser Prozess ausführlicher beschrieben. Zusätzlich zu den oben in 2) beschriebenen synthetischen Oligonukleotidprimern, werden synthetische Oligonukleotidprimer 28R (SEQ ID NO. 18) und 32F (SEQ ID NO. 19), die entsprechend aus den partiellen Aminosäuresequenzen 28 (SEQ ID NO. 14) und 32 (SEQ ID NO. 16) konstruiert sind, synthetisiert. Unter Verwendung der genomischen DNA von Streptomyces sp. 142 als Templat wird eine PCR unter Verwendung der Kombinationen an Primern wie in Tabelle 2 angegeben vorgenommen.
Tabelle 2
Die PCR wird zum Beispiel unter Verwendung des GeneAmp PCR Reagent Kit und unter Verwendung einer Mischung von dATP, dCTP, dTTP, dGTP und dc⁷GTP als Ersatz für die dNTP-Mischung über 25 Zyklen vorgenommen, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 60°C und 2 Minuten bei 72°C besteht. Unter Verwendung eines Teils dieser Reaktionsmischung als Templat und der üblichen dNTP- Mischung als Substrat, wird die PCR erneut mit den selben Zyklen durchgeführt. Ein Teil dieser Reaktionsmischung wird durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Getrennt davon wird ein Teil der ersten PCR-Mischung als Templat verwendet und die PCR durch Hinzufügen eines der Primer allein vorgenommen, um dadurch die unter Verwendung jedes der Primer allein amplifizierten DNA-Fragmente zu untersuchen. Tabelle 3 zeigt die auf diese Weise durch PCR amplifizierten DNA-Fragmente, wobei die unter Verwendung eines einzelnen Primers amplifizierten ausgeschlossen sind.
Tabelle 3
Die Nukleotidsequenzen dieser DNA-Fragmente werden nach einem Verfahren bestimmt, das üblicherweise im Fachbereich eingesetzt wird, wie das Dideoxykettenterminatorverfahren. Auf diese Weise wird eine der partiellen Aminosäuresequenz von α-1,3/4-Fucosidase entsprechende Sequenz in einer Region gefunden, wobei die Primersequenz des DNA-Fragments (140 bp) verfolgt wird, die unter Verwendung der Kombination 45F-32R [d. h. die Kombination (19) in Tabelle 2] amplifiziert wird. Auf diese Weise kann das angezielte α-1,3/4-Fucosidasegen erfolgreich erhalten werden.
Die genomische DNA von Streptomyces sp. 142 wird mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut. Dann wird eine Hybridisierung unter Verwendung des oben genannten PCR-Produkts als Sonde vorgenommen [d. h. das DNA-Fragment (140 bp) amplifiziert unter Verwendung der Kombination 45F-32R; SEQ ID NO. 20]. Auf diese Weise kann eine spezifisch mit der Sonde hybridisierbare Bande erfasst werden. Ein der so erfassten Bande entsprechendes DNA-Fragment wird nach einem üblicherweise im Fachbereich eingesetzten Verfahren aus dem Gel extrahiert, gereinigt und in einen Plasmidvektor integriert. Als Plasmidvektor können bekannte wie pUC18, pUC19, pUC119 und pTV118N verwendet werden, obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Als nächstes wird das rekombinante Plasmid in einen Wirt eingeführt, um dadurch den Wirt zu transformieren. Wenn Escherichia coli als Wirt verwendet werden soll, kann entweder ein wilder Stamm oder eine Variante dafür ausgewählt werden, so lange sie eine Transformation erfahren kann. Die Einführung kann nach einem üblicherweise im Fachbereich eingesetzten Verfahren vorgenommen werden, zum Beispiel dem in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschriebenen.
Nach Einführen des angezielten DNA-Fragments in den Wirt können Kolonien mit einem darin eingeführten Fremdgen in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Plasmidvektors gescreent werden, zum Beispiel im Falle von pUC19 durch Auswählen von Kolonien, die eine Toleranz für Ampicillin zeigen, oder die eine Toleranz für Ampicillin zeigen und auf einer Platte, die Ampicillin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthält, eine weiße Farbe aufweisen. Anschließend werden Kolonien mit einem Vektor, der das angezielte DNA-Fragment enthält, aus den oben genannten gescreent. Das Screening kann durch Koloniehybridisierung oder Plaquehybridisierung in Abhängigkeit vom Vektor durchgeführt werden. Es ist auch möglich, das PCR-Verfahren hierfür zu verwenden. Wenn der das angezielte DNA-Fragment enthaltende Vektor gescreent wird, kann die Nukleotidsequenz des in diesen Vektor eingesetzten angezielten DNA-Fragments nach einem üblichen Verfahren bestimmt werden, wie dem Dideoxykettenterminatorverfahren. Die auf diese Weise bestimmte Nukleotidsequenz wird mit den N-terminalen Analysedaten, den partiellen Aminosäuresequenzen, dem Molekulargewicht usw. von α-1,3/4-Fucosidase verglichen. Auf diese Weise können die Struktur des α-1,3/4-Fucosidasegens und die vollständige Aminosäuresequenz von α-1,3/4-Fucosidase aufgeklärt werden. Ein Beispiel der auf diese Weise erhaltenen Nukleotidsequenz ist durch SEQ ID NO. 2 gezeigt und eine Aminosäuresequenz, die für diese Nukleotidsequenz kodieren kann, ist durch SEQ ID NO. 1 gezeigt.
Der Wirt wird durch den das angezielte α-1,3/4-Fucosidasegen enthaltenden Vektor transformiert und dann die erhaltene Transformante unter üblicherweise eingesetzten Bedingungen kultiviert. Auf diese Weise kann ein Polypeptid oder ein Protein mit der α-1,3/4-Fucosidaseaktivität produziert werden. Es ist manchmal möglich, diese Polypeptid in Form eines Inklusionskörpers zu produzieren. Damit ein Expressionsvektor erhalten wird, kann das angezielte α-1,3/4-Fucosidasegen mit einem Vektor verbunden werden, der in der Lage ist, dieses in einem geeigneten Wirt zu exprimieren.
Als Wirt können Mikroorganismen, Tierzellen oder Pflanzenzellen verwendet werden. Die Expression kann zum Beispiel durch Untersuchen der α-1,3/4-Fucosidaseaktivität bestimmt werden. Die Aktivität kann zum Beispiel durch das im Journal of Biological Chemistry, 267, 1522–1527 (1992) beschriebene Verfahren unter Verwendung des Zellextrakts einer Rekombinante von Escherichia coli als Enzymlösung untersucht werden. Wenn die Expression der angezielten α-1,3/4-Fucosidase bestimmt ist, werden die optimalen Bedingungen für die Expression untersucht.
Die α-1,3/4-Fucosidase kann aus der Kultur der Transformante nach einem herkömmlichen Verfahren gereinigt werden. Wenn zum Beispiel Escherichia coli als Wirt verwendet wird, werden nach Beendigung der Kultivierung die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt. Dann werden die Zellen zum Beispiel durch Schallbehandlung zerstört und lösliche Fraktionen durch Zentrifugieren usw. aufgenommen. Dann werden diese Fraktionen nach verschiedenen chromatographischen Techniken wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, hydrophobe Chromatographie oder Affinitätschromatographie gereinigt. Auf diese Weise kann eine α-1,3/4-Fucosidase in hoher Reinheit erhalten werden. Wenn das Polypeptid in Form eines Inklusionskörpers erhalten wird, werden unlösliche Fraktionen, die den Inklusionskörper enthalten, aufgenommen. Nach dem Waschen wird der Inklusionskörper mit einem Protein lösenden Mittel solubilisiert, das üblicherweise im Fachbereich eingesetzt wird (zum Beispiel Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid) und wenn nötig nach verschiedenen chromatographischen Techniken wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, hydrophobe Chromatographie oder Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Rückbildung durch Dialyse, Verdünnung usw. kann die angezielte α-1,3/4-Fucosidaseverbindung erhalten werden, die ihre Aktivität behält. Falls erforderlich kann diese Verbindung nach verschiedenen chromatographischen Techniken weiter gereinigt werden. Auf diese Weise kann eine α-1,3/4-Fucosidaseverbindung mit einer erhöhten Reinheit erhalten werden.
Ferner wird erwartet, dass Gene aller Enzyme, die sich in der Sequenz etwas vom oben genannten Enzym unterscheiden, aber ähnliche Aktivitäten aufweist, durch eine Hybridisierung unter strengen Bedingungen unter Verwendung dieser so erhaltenen Gene als Sonde erhalten werden. Der hier verwendete Ausdruck „strenge Bedingungen" bedeutet die Bedingungen, wie sie unten beschrieben werden. Das heißt, eine Poly amidmembran mit darauf immobilisierten DNAs wird hybridisiert mit einer Sonde in einer Lösung, die 6 × SSC („1 × SSC" bedeutet 8,76 g Natriumchlorid und 4,41 g Natriumcitrat gelöst in 1 l Wasser), 1% Natriumlaurylsulfat, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 5 × Denhardt's (enthält 0,1% Anteile Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll) enthält, bei 65°C über 20 Stunden.
Das Zielgen, das für α-1,3/4-Fucosidase kodiert, kann zum Beispiel auf folgende Weise durch Hybridisierung erhalten werden. Zunächst werden Chromosomen-DNA erhalten aus einer Quelle des Zielgens oder cDNAs hergestellt aus mRNAs unter Verwendung einer Umkehrtranskriptase zu einem Plasmid- oder Phagenvektor verbunden und in einen Wirt eingeführt, um dadurch eine Bibliothek zu bilden. Dann wird diese Bibliothek auf einer Platte kultiviert und auf diese Weise gebildete Kolonien oder Plaques auf eine Nitrocellulose- oder Polyamidmembran transkribiert und die DNAs werden auf der Membran durch eine Denaturierungsbehandlung immobilisiert.
Anschließend wird diese Membran bei einer gegebenen Temperatur in einer Lösung gehalten, die eine Sonde enthält, die mit ³²P markiert wurde, um dadurch Hybride zwischen den DNAs und der Sonde zu bilden. Als Sonde kann ein für die in SEQ ID NO. 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder einen Teil davon kodierendes Gen verwendet werden. Zum Beispiel ist ein von SEQ ID NO. 2 gezeigtes Gen oder ein Teil davon verwendbar. Zum Beispiel können für die in den SEQ ID NO. 3, 4, 8, 11, 14 und 16 gezeigten Aminosäuresequenzen oder einen Teil davon kodierenden Gene verwendet werden. Zum Beispiel kann ein in SEQ ID NO. 20 gezeigtes Gen oder ein Teil davon dafür verwendet werden. Zum Beispiel wird die Membran mit darauf immobilisierten DNAs mit der Sonde in einer Lösung, die 6 × SSC, 1% Natriumlaurylsulfat, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 5 × Denhardt's (mit 0,1% Anteilen Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll) enthält, bei 65°C über 20 Stunden hybridisiert. Nach Beendigung der Hybridisierung werden unspezifisch adsorbierte Stoffe abgewaschen und mit der Sonde Hybride bildende Klone werden durch Autoradiographie usw. identifiziert. Diese Verfahrensweise wird wiederholt, bis ein einzelner Klon, der die Hybride bildet, erhalten ist. Der so erhaltene Klon weist ein Gen auf, das für das darin eingesetzte Teilprotein kodiert.
Die Nukleotidsequenz, des auf diese Weise erhaltenen Gens wird zum Beispiel auf folgende Weise bestimmt, um festzustellen, ob es das für die angezielte α-1,3/4-Fucosidase kodierende Genist.
Im Falle eines durch Hybridisierung erhaltenen Klons wird die Nukleotidsequenz auf folgende Weise bestimmt. Wenn die Transformante Escherichia coli ist, wird sie in einem Reagenzglas kultiviert usw. und das Plasmid wird daraus nach einem herkömmlichen Verfahren extrahiert. Dann wird das Plasmid mit Restriktionsenzymen gespalten und die Insertion herausgenommen und in M13 Phagenvektor subkloniert usw. Dann wird die Nukleotidsequenz nach der Dideoxymethode bestimmt. Wenn die Transformante ein Phage ist, kann die Nukleotidseqeunz fundamental durch ähnliche Schritte bestimmt werden. Die fundamentalen Verfahrensweisen von der Kultivierung bis zur Bestimmung der Nukleotidsequenz sind zum Beispiel in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben.
Um festzustellen, ob das erhaltene Gen das Zielgen zur Kodierung für α-1,3/4-Fucosidase ist, wird die auf diese Weise bestimmte Nukleotidsequenz mit dem α-1,3/4-Fucosidasegen der vorliegenden Erfindung und der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Aminosäuresequenz verglichen, um die Genstruktur und die Aminosäuresequenz derselben aufzuklären.
Wenn das erhaltene Gen nicht die ganze Region enthält, die für α-1,3/4-Fucosidase kodiert, werden ausgehend vom erhaltenen Gen syntheti sche DNA-Primer hergestellt und der fehlende Bereich durch PCR amplifiziert.
Alternativ wird die DNA-Bibliothek oder die cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines Fragments des erhaltenen Gens als Sonde weiter gescreent. Auf diese Weise kann die Nukleotidsequenz der gesamten Kodierungsregion der mit dem α-1,3/4-Fucosidasegen der vorliegenden Erfindung hybridisierbaren α-1,3/4-Fucosidase bestimmt werden.
Um ein Polypeptid, das die α-1,3/4-Fucosidaseaktivität aufweist, durch Gentechnologie zu erhalten, wird das erhaltene α-1,3/4-Fucosidasegen zunächst auf herkömmliche Weise mit einem Expressionsvektor verbunden, der das Gen in geeigneten Wirtszellen exprimieren kann, wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces, Hefen, Tierzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen. Dann wird er in Wirtszellen eingeführt, um dadurch eine Transformante zu bilden. Durch Kultivieren dieser Transformante kann das Polypeptid mit der α-1,3/4-Fucosidaseaktivität produziert werden. Ebenso kann ein α-1,3/4-Fucosidasepolypeptid frei von jeglicher Zuckerkette unter Verwendung von Zellen ohne Fähigkeit zur biologischen Synthese einer Zuckerkette (zum Beispiel Prokaryonten wie Escherichia coli und Bacillus subtilis oder verschiedene Zellen von Hefen, Tieren, Insekten und Pflanzen, die die Fähigkeit zur biologischen Synthese einer Zuckerkette verloren haben) als Wirt exprimiert werden.
In einigen Expressionssystemen wird das in der Transformante exprimierte Polypeptid in Form einer unlöslichen Substanz (Inklusionskörper) angesammelt. In einem solchen Fall wird diese unlösliche Substanz aufgenommen und zum Beispiel mit Harnstoff unter milden Bedingungen solubilisiert, und durch Entfernen des Denaturierungsmittels kann die Aktivität wiederhergestellt werden. Die Expression kann durch Untersuchen der α-1,3/4-Fucosidaseaktivität festgestellt werden. Die α-1,3/4-Fucosidaseaktivität kann zum Beispiel nach dem im Journal of Biological Chemistry, 267, 1522–1527 (1992) beschriebenen Verfahren untersucht werden.
Das Polypeptid mit der α-1,3/4-Fucosidaseaktivität kann aus der Transformante durch herkömmliche chromatographische Techniken gereinigt werden. Wenn zum Beispiel das Zielpolypeptid solubilisiert ist, werden die Zellen zerstört und der Überstand hydrophober Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie usw. unterzogen. Auf diese Weise kann das Zielpolypeptid erhalten werden. Wenn das Expressionsprodukt in Form einer unlöslichen Substanz angesammelt ist, werden die Zellen zerstört und der Niederschlag aufgenommen und mit einem Denaturierungsmittel wie Harnstoff solubilisiert. Danach wird das Denaturierungsmittel eliminiert. Nach Rückgewinnung kann das Zielpolypeptid mit der α-1,3/4-Fucosidaseaktivität nach solchen chromatographischen Techniken, wie sie oben beschrieben wurden, erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung stellt die primäre Struktur und die Genstruktur von α-1,3/4-Fucosidase zur Verfügung. Ferner macht die vorliegende Erfindung es möglich, die α-1,3/4-Fucosidase durch Gentechnologie zu produzieren. Unter Verwendung des gentechnologischen Prozesses der vorliegenden Erfindung kann eine α-1,3/4-Fucosidaseverbindung in hoher Reinheit zu geringen Kosten erhalten werden.
Zur weiteren ausführlicheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, und nicht als Einschränkung, werden die folgenden Beispiele angeführt.
Beispiel 1
Klonen des α-1,3/4-Fucosidasestrukturgens
(1) Extraktion und Reinigung von genomischer DNA
Streptomyces sp. 142 (FERM BP-4569), die α-1,3/4-Fucosidase produzieren, werden in 20 ml eines Mediums (pH 7,0) eingeimpft, das 1% L-Fucose, 0,01% Hefeextrakt, 0,03% Pepton, 0,05% MgSO₄7H₂O und 0,1% KH₂PO₄ enthält, und darin bei 30°C über 44 Stunden kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung werden die Zellen durch Zentrifugieren des Kulturmediums gesammelt, in flüssigen Stickstoff gegossen und in einem Mörser vollständig zerstört. Dann werden die zerstörten Zellen in Portionen zu einer zehnfachen Menge an Extraktionspuffer (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 20 μg/ml RNaseA, 0,5% SDS, pH 8,0) unter sanftem Rühren zugegeben. Nach Zugabe von 100 μl einer 10 mg/ml Lösung von Proteinase K wird die Mischung für 1 Stunde auf 37°C gehalten. Dann wurde sie auf Raumtemperatur abgekühlt und ein gleiches Volumen an gesättigter TE-Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) in Phenol/Chloroform hinzugegeben. Nach sanftem Rühren und Zentrifugieren der Mischung bei 3000 Upm über 10 Minuten wurde die obere Schicht aufgenommen (diese Verfahrensweise wird nachfolgend einfach als „Phenolextraktion" bezeichnet). Nach zweimaligem Wiederholen dieser Vorgehensweise werden der wässrigen Schicht 0,6 Äquivalentvolumen Isopropylalkohol zugegeben, gefolgt vom Zentrifugieren der Mischung bei 14000 Upm für 1 Minute. Dann wurde sie mit 70% Ethanol gespült und etwas luftgetrocknet. Auf diese Weise wurden ungefähr 440 μg genomische DNA erhalten.
(2) Bestimmung partieller Aminosäuresequenzen von α-1,3/4-Fucosidase
α-1,3/4-Fucosidase, die nach dem im Journal of Biological Chemistry, 267, 1522–1527 (1992) beschriebenen Verfahren gereinigt wurde, wurde auf herkömmliche Weise direkt dem Gasphasenabbauverfahren nach Edman unterzogen, um dadurch die N-terminale Aminosäuresequenz N-1 (SEQ ID NO. 3) zu bestimmen. Ferner wurde das Enzymprotein pyridylethyliert und mit Lysylendopeptidase verdaut. Die Mischung der auf diese Weise erhaltenen Peptidfragmente wurde durch HPLC abgetrennt und gereinigt. Dann wurde die Aminosäuresequenz jeder Peptidfraktion analysiert und auf diese Weise partielle Aminosäuresequenzen 57 (SEQ ID NO. 4), 39 (SEQ ID NO. 8), 45 (SEQ ID NO. 11), 28 (SEQ ID NO. 14) und 32 (SEQ ID NO. 16) bestimmt.
(3) Synthese von Primern und Amplifizierung durch PCR
Ein synthetischer Oligonukleotidprimer FSE-1 (SEQ ID NO. 5) wurde aus der oben in (2) bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenz N-1 (SEQ ID NO. 3) synthetisiert. Gleichermaßen wurden synthetische Oligonukleotidprimer 57F (SEQ ID NO. 7) und 57R (SEQ ID NO. 6) aus der partiellen Aminosäuresequenz 57 (SEQ ID NO. 4) synthetisiert; synthetische Oligonukleotidprimer 39F (SEQ ID NO. 9) und 39R (SEQ ID NO. 10) wurden aus der partiellen Aminosäuresequenz 39 (SEQ ID NO. 8) synthetisiert; synthetische Oligonukleotidprimer 45F (SEQ ID NO. 12) und 45R (SEQ ID NO. 13) wurden aus der partiellen Aminosäuresequenz 45 (SEQ ID NO. 11) synthetisiert; synthetische Oligonukleotidprimer 28F (SEQ ID NO. 15) und 28R (SEQ ID NO. 18) wurden aus der partiellen Aminosäuresequenz 28 (SEQ ID NO. 14) synthetisiert; und synthetische Oligonukleotidprimer 32F (SEQ ID NO. 19) und 32R (SEQ ID NO. 17) wurden aus der partiellen Aminosäuresequenz 32 (SEQ ID NO. 16) synthetisiert. Die oben in (1) hergestellte genomische DNA wur de als Templat eingesetzt, während Primer in Kombinationen wie in Tabelle 2 aufgeführt verwendet wurden. Dann wurde eine PCR in einem Reaktionssystem des GeneAmp PCR Reagent Kit (hergestellt von Takana Shuzo Co., Ltd.) vorgenommen, das 10 ng genomische DNA enthält, die 10 Minuten lang thermisch denaturiert wurde, und 25 pmol Anteile der synthetischen Oligonukleotidprimer unter Verwendung von 1,2 mM (Endkonzentration erscheint nachfolgend) dATP, 1,2 mM dCTP, 1,2 mM TTP, 0,9 mM dGTP und 0,3 mM dc⁷GTP (hergestellt von Boehringer) als Ersatz für die dNTP-Mischung. Das Volumen der Reaktionsmischung wurde durch Zusatz von 1,25 U Ampli Taq und sterilisiertem Wasser eingestellt und die erhaltene Mischung unter Verwendung einer automatischen Genamplifizierungsanlage (DNA Thermal Cycler, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) einer Amplifizierung unterzogen. Die Reaktion wurde über 25 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden bei 94°C (Denaturierung), 1 Minute bei 60°C (Verschmelzen der Primer) und 2 Minuten bei 72°C (Synthesereaktion) besteht. Anschließend wurde PCR nochmals unter den selben Bedingungen wie oben beschrieben vorgenommen, wobei 1 μl der oben erhaltenen Reaktionsmischung als Templat in 50 μl eines Reaktionssystems unter Verwendung des GeneAmp Reagent Kit und der üblichen dNTP-Mischung verwendet wurden. Eine 10 μl Portion der Reaktionsmischung wurde auf einem 3% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und die DNA mit Ethidiumbromid angefärbt, um dadurch amplifizierte DNA-Fragmente zu untersuchen. Die obige Vorgehensweise wurde unter Verwendung eines der Primer allein wiederholt, um dadurch die unter Verwendung jedes der Primer allein amplifizierten DNA-Fragmente zu untersuchen. Tabelle 3 zeigt die auf diese Weise durch PCR amplifizierten DNA-Fragmente, wobei die unter Verwendung eines einzelnen Primers ausgeschlossen sind. Die Nukleotidsequenzen dieser DNA-Fragmente wurden durch das Dideoxykettenterminatorverfahren bestimmt. Als Ergebnis wurde eine Sequenz, die der partiellen Aminosäuresequenz von α-1,3/4-Fucosidase entspricht, in einer Region gefunden, die der Primersequenz das DNA-Fragments (140 bp) folgt, das unter Verwendung der Kombination von 45F-32R amplifiziert wurde [d. h. der Kombination (19) in Tabelle 2]. Auf diese Weise konnte ein Teil des angezielten α-1,3/4-Fucosidasegens erfolgreich erhalten werden. Dieses durch die PCR amplifizierte DNA-Fragment wurde 45F-32R genannt (SEQ ID NO. 20).
(4) Klonen des DNA-Fragments, das α-1,3/4-Fucosidasegen in voller Länge enthält
50 μg der oben unter (1) hergestellten genomischen DNA werden mit 120 U Portionen eines Restriktionsenzyms BamHI, PstI, SacI oder SalI für jeweils 2 Stunden bei 37°C verdaut. Danach wurden 60 U jedes Restriktionsenzyms zugesetzt und die Reaktion für weitere 4 Stunden fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde der Phenolextraktion unterzogen und 10 μg der so erhaltenen DNA wurden auf einem 0,7% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde die DNA auf einer Polyamidmembran (Hybond-N⁺, hergestellt von Amersham) nach dem Southern Blottingverfahren (Idenshi Kenkyu-ho II, S. 218–221, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin) transkribiert. Als Sonde für die Hybridisierung wurde das DNA-Fragment 45F-32R (SEQ ID NO. 20), wie oben unter (3) erhalten, eingesetzt.
5 pmol dieses Fragments wurden unter Verwendung von MEGALABEL (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit ³²P markiert. Unter Verwendung des oben hergestellten Filters wurde bei 65°C über 3 Stunden in einer Lösung, die 6 × SSC („1 × SSC" bedeutet 8,77 g Natriumchlorid und 4,41 g Natriumcitrat gelöst in 1 l Wasser), 0,5% SDS, 100 mg/ml Heringsperma-DNA, 5 × Denhardt's (mit 0,1% Anteilen an Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll) enthält, eine Prehybridisierung vorgenommen. Anschließend wurde die markierte Sonde zugesetzt, so dass sich eine Konzentration von 1 pmol/ml ergibt, und Hybridisierung bei 65°C über Nacht vorgenommen. Dann wurde der Filter in 6 × SSC bei Raumtemperatur 10 Minuten lang, in 2 × SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur 10 Minuten lang und in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C 1 Stunde lang gewaschen und die überschüssige Feuchtigkeit entfernt. Dann wurde ein sensibilisiertes Papierblatt an der Membran angebracht und bei –70°C über Nacht eine Autoradiographie vorgenommen.
Als Ergebnis davon wurden mit der Sonde hybridisierbare Banden bei ungefähr 4,5 kb (im Falle des Verdauungsprodukts von BamHI), bei ungefähr 2,3 kb (im Falle des Verdauungsprodukts von PstI), bei ungefähr 10 kb (im Falle des Verdauungsprodukts von SacI) und bei ungefähr 1,9 kb (im Falle des Verdauungsprodukts von SalI) gefunden.
Die Verdauungsprodukte von PstI und SalI wurden in anschließenden Experimenten verwendet, da sie für die Handhabung zweckmäßig sind. 10 μg der genomischen DNA, die mit den Restriktionsenzymen verdaut wurde, wurden auf einem 0,7% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und die den bei der oben genannten Hybridisierung beobachteten Banden entsprechenden Teile wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Nach Extrahieren und Reinigen unter Verwendung von EASYTRAP (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden die so erhaltenen DNA-Fragmente in die PstI-Stelle oder SalI-Stelle von pUC19 eingesetzt.
Escherichia coli JM109 wurden durch diese Plasmide transformiert und in drei Petrischalen von 8,5 cm Durchmesser wurden 200 bis 1000 Kolonien pro Platte ausgebildet. Danach wurden 200 Kolonien pro Restriktionsenzym aus diesen Platten ausgewählt und auf einer Polyamidmembran (Hybond-N⁺ hergestellt von Amersham) transkribiert. Nach Verweilen bei 37°C über 3 Stunden, wurde die Polyamidmembran nacheinander auf einem Filterpapier angefeuchtet mit einer 0,5 M Lösung von NaOH und einer 1,5 M Lösung von NaCl 5 Minuten lang (Denaturierung) und einem weiteren Filterpapier befeuchtet mit einem 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und einer 3 M Lösung von NaCl 5 Minuten lang (Neutralisation) behandelt und mit 2 × SCC gespült. Unter Verwendung dieser Polyamidmembran und des DNA-Fragments 45F-32R (SEQ ID NO. 20) wurde eine Hybridisierung unter den selben Bedingungen wie oben beschrieben vorgenommen. Als Ergebnis wurden ein positives Signal bzw. zwei positive Signale vom PstI-Fragment und vom SalI-Fragment erhalten. Diese Escherichia coli JM109 Klone wurden P54, S30 bzw. S68 genannt.
Es wurden Plasmid-DNAs dieser Klone nach dem Alkalilyseverfahren hergestellt und entsprechend pUFSEP54, pUFSES30 und pUFSES68 genannt. Diese DNAs wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und die Spaltungsmuster durch Elektrophorese analysiert. Auf diese Weise wurde betätigt, dass Restriktionsenzymstellen (BamHI, KpnI, SacI, SmaI usw.) darin vorhanden sind. Als Folge dieser Analyse wurde erkannt, dass das Plasmid pUFSES30 mit dem Plasmid pUFSES68 identisch ist. Dementsprechend wurden pUFSEP54 und pUFSES30 in den folgenden Experimenten eingesetzt. Es wurde geschätzt, dass die Insertionen von pUFSEP54 und pUFSES30 eine Sequenz von ungefähr 800 bp gemeinsam aufweisen. Diese Klone wurden mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und einer Selbstligation unter Verwendung eines Ligationskits (DNA Ligation Kit, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unterzogen, so dass sich verschiedene Deletionsmutanten ergeben. Bei Bestimmung der Nukleotidsequenzen dieser Mutanten nach dem Dideoxyverfahren, wurde ein offenes Leseraster mit einer Größe von 1689 bp in den Insertionen über zwei Klone gefunden. Die bekannten Aminosäuresequenzen von α-1,3/4-Fucosidase wurde alle in diesem offenen Leseraster beobachtet. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde die vollständige Nukleotidsequenz und die primäre Struktur des α-1,3/4-Fucosidasegens bestimmt. 1 zeigt das Ergebnis. A ist die Restriktionsenzymkarte des PstI-Fragments mit einer Größe von 2,3 kb, während B die Restriktionsenzymkarte des SalI-Fragments mit einer Größe von 1,9 kb ist. Die Lage des α-1,3/4-Fucosidasegens ist in dieser Figur auch gezeigt, worin der Pfeil den Start der Kodierregion angibt, die dicke Linie eine Kodierregion von α-1,3/4-Fucosidase darstellt und der Teil zwischen SalI und PstI in der dicken Linie in A dem Teil zwischen SalI und PstI in der dicken Linie in B entspricht. Auf diese Weise kann die vollständige Länge des α-1,3/4-Fucosidasegens durch Kombinieren von A und B gefunden werden. Eine für α-1,3/4-Fucosidase kodierende Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO. 2 gezeigt und eine für diese Basensequenz kodierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO. 1 gezeigt.
Beispiel 2
Konstruktion von Plasmiden, die α-1,3/4-Fucosidase exprimieren
(1) Konstruktion von Plasmiden, die für Polypeptid auf der N-terminalen Seite von α-1,3/4-Fucosidase kodieren
Um ein Gen zu amplifizieren, das für ein Polypeptid auf der N-terminalen Seite von α-1,3/4-Fucosidase kodiert, wurden zwei synthetische Oligonukleotidprimer FSE-HNde (SEQ ID NO. 21) und S30RV (SEQ ID NO. 22) konstruiert und synthetisiert. Der Primer FSE-HNde ist ein 34mer mit HindIII- und NdeI-Stellen hinter einem 18mer, das der Sequenz mit den Basennummern 136 bis 153 (in der 5'-3'-Richtung) in der von SEQ ID NO. 2 gezeigten Nukleotidsequenz entspricht. Hingegen ist der Primer S30RV eine synthetische DNA eines 19mer, das der Sequenz mit den Basennummern 443 bis 461 (in der 3'-5'-Richtung) in der von SEQ ID NO. 2 gezeigten Nukleotidsequenz entspricht.
Ungefähr 100 pg des im obigen Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pUFSEP54, das als Templat verwendet wurde, wurde mit 10 μl eines Puffers zur Amplifizierung mit einer 10fachen Konzentration im GeneAmp PCR Reagent Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), 16 μl einer 1,2 mM dNEP-Mischung, 20 pmol des Primers FSE-HNde, 20 pmol des Primers S30RV und 2,5 U Ampli Taq vermischt. Zu der erhaltenen Mischung wurde sterilisiertes Wasser in solcher Menge hinzugefügt, dass ein Gesamtvolumen von 100 μl erhalten wurde. Dann wurde diese Mischung einer Amplifizierung unter Verwendung einer automatischen Genamplifizierungsanlage (DNA Thermal Cycler) unterzogen. Die PCR wurde über 25 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden bei 94°C (Denaturierung), 1 Minute bei 55°C (Verschmelzen der Primer) und 1,5 Minuten bei 72°C (Synthesereaktion) besteht. Eine 10 μl Portion der Reaktionsmischung wurde auf einem 3% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und die DNA wurde mit Ethidiumbromid angefärbt, um dadurch das Vorhandensein eines amplifizierten DNA-Fragments von 342 bp festzustellen, das erwartet wurde. Der Rückstand der PCR-Mischung wurde durch Ausfällen aus Ethanol aufkonzentriert und in zwei Portionen aufgeteilt. Eine dieser Portionen wurde mit HindIII und SalI gespalten und zwischen die HindIII- und SalI-Stellen von pTV119NNde [hergestellt durch Transformieren der NcoI-Stelle von pTV119N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) in die NdeI-Stelle] eingesetzt. Eine weitere Portion wurde mit NdeI und SalI gespalten und zwischen die NdeI- und SalI-Stellen von pTV119NNde eingesetzt. Diese Plasmide wurden entsprechend pTFSEF101N und pTFSEM101N genannt. Jedes Plasmid wurde in als Wirt verwendete Escherichia coli JM109 transformiert und die Plasmid-DNA nach dem Alkalilyseverfahren hergestellt. Anschließend wurde die Insertion durch PCR bestätigt und die Nukleotidsequenz der Insertion nach dem Dideoxykettenterminatorverfahren bestimmt.
(2) Konstruktion eines Plasmids, das für die vollständige Länge des α-1,3/4-Fucosidasegens kodiert
Das im obigen Beispiel 1 erhaltene Plasmid pUFSES30 wurde mit SalI verdaut und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Ein SalI-Fragment mit einer Größe von 1,9 kb wurde abgetrennt, extrahiert und gereinigt. Danach wurde das im obigen Beispiel 2-(1) erhaltene Plasmid pTFSEM101N mit SalI verdaut und das SalI-Fragment mit einer Größe von 1,9 kb darin eingesetzt, gefolgt von der Transformation in Escherichia coli JM109. Die Plasmid-DNA wurde nach dem Alkalilyseverfahren hergestellt und die Regeneration der SalI-Stelle wurde durch Verdauung mit SalI bestätigt. Danach wurde die Richtung der Insertion durch Verdauung mit SalI bestätigt. Das erhaltene für die vollständige Länge des α-1,3/4-Fucosidasegens kodierende Plasmid wurde pTFSEM201 genannt. Gleichermaßen wurde das im obigen Beispiel 2-(1) erhaltene Plasmid pTFSEF101N mit SalI verdaut und ein Plasmid pTFSEF201 mit dem SalI-Fragment von 1,9 kb als Insertion darin konstruiert. Dieses Plasmid enthielt eine Sequenz, die für 10 Aminosäurereste kodiert (Met Ala Met Ile Thr Pro Ser Phe His Met; SEQ ID NO. 23), was ein Peptid umfasst, das vom IacZα vor dem N-Terminal von α-1,3/4-Fucosidase herstammt. Daher wird erwartet, dass die Expression von α-1,3/4-Fucosidase in Form eines mit IacZα verschmolzenen Proteins unter Verwendung der SD-Sequenz von IacZ und dem Initiationskodon davon induziert wird.
Escherichia coli JM109 mit darin eingeführtem pTFSEM201 wird als Escherichia coli JM109/pTFSEM201 bezeichnet. Escherichia coli JM109 mit darin eingeführtem pTFSEF201 wird als Escherichia coli JM109/pTFSEF201 bezeichnet und wurde am 3. März 1994 als FERM P-14206 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan hinterlegt. Am 21. Dezember 1994 wurde es unter dem Budapester Abkommen als FERM BP-4950 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
Beispiel 3
Expression einer rekombinanten α-1,3/4-Fucosidase in Escherichia coli
(1) Expression eines α-1,3/4-Fucosidasepolypeptids in Escherichia coli
Escherichia coli JM109/pTFSEM201 oder Escherichia coli JM109/pTFSEF201, wie im obigen Beispiel 2 erhalten, wurden in 5 ml eines L-Mediums eingeimpft, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und darin unter Schütteln bei 37°C über Nacht kultiviert. Dann wurden 1% der Kultur erneut in 5 ml des selben Mediums eingeimpft. Wenn die Trübung (Absorption bei 600 nm) des Kulturmediums ungefähr 0,5 erreichte, wurde IPTG zur Kultur in solcher Menge zugegeben, dass sich eine Endkonzentration von 1 mM ergibt, und die Kultivierung wurde unter Schütteln bei 37°C über Nacht fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 100 μl des Kulturmediums zentrifugiert, um dadurch die Zellen zu sammeln. Dann wurden die Zellen mit einem 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) gewaschen, in 100 ml des selben Puffers suspendiert und durch Schallbehandlung zerstört. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand wurde zur Verwendung als Escherichia coli Extrakt aufgenommen. Dieser Extrakt und der Niederschlag wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Als Ergebnis wurde eine Bande, die anscheinend einer α-1,3/4-Fucosidase von ungefähr 55000 zuzuordnen sind, im Extrakt und im Niederschlag von Escherichia coli JM109/pTFSEF201 gefunden und daher wurde festgestellt, dass das α-1,3/4-Fucosidaseprotein darin exprimiert wurde. Hingegen wurde erkannt, dass das Enzymprotein kaum in Escherichia coli JM109/pTFSEM201 exprimiert wurde. Dementsprechend wurde die α-1,3/4-Fucosidaseaktivität des Zellextrakts von Escherichia coli JM109/pTFSEF201 gemäß dem im Journal of Biological Chemistry, 267, (3), 1522–1527 (1992) beschriebenen Verfahren untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, dass der Zellextrakt von Escherichia coli JM109/pTFSEF201 eine Aktivität von ungefähr 1 mU pro ml Kulturmedi um aufwies. Obwohl Escherichia coli JM109-Stämme, die das nicht für das α-1,3/4-Fucosidasestrukturgen kodierende pTV119Nde tragen, und pTEFSEF101N, das ausschließlich für den N-terminalen Teil kodiert, auf die selbe Weise behandelt wurden, konnte keine α-1,3/4-Fucosidaseaktivität darin beobachtet werden. Ausgehend von diesen Ergebnissen wird angenommen, dass der Hauptteil der von Escherichia coli JM109/pTFSEF201 produzierten α-1,3/4-Fucosidase in Form eines Inklusionskörpers unlöslich gemacht wurde.
(2) Expression von α-1,3/4-Fucosidase in Escherichia coli und Reinigung des Inklusionskörpers
Escherichia coli JM109/pTFSEF201 wurde in 10 ml eines L-Mediums eingeimpft, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und darin unter Schütteln bei 37°C 5 Stunden lang kultiviert. Dann wurde eine 5 ml Portion dieses Kulturmediums in 500 ml des selben Medium eingeimpft, das in einem 2-l-Erlenmeyerkolben enthalten ist, und unter Schütteln bei 100 Upm bei 37°C kultiviert. Wenn die Trübung (Absorption bei 600 nm) des Kulturmediums ungefähr 0,5 erreichte, wurde IPTG zur Kultur in solcher Menge zugegeben, dass sich eine Endkonzentration von 1 mM ergibt und die Kultivierung wurde unter Schütteln bei 37°C über Nacht fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und in 30 ml eines 10 mM Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) suspendiert, der 0,1 M NaCl und 1 mM EDTA enthält, gefolgt von Zerstörung durch Schallbehandlung. Dann wurde die Suspension zerstörter Zellen zentrifugiert und die unlöslichen Fraktionen, die den Inklusionskörper enthalten, wurden kombiniert und in 20 ml einer 1 M Sucroselösung suspendiert. Die Suspension wurde bei 18000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert, so dass ein Niederschlag erhalten wurde, der den Inklusionskörper enthält. Dann wurde er in 40 ml einer 2% Lösung Triton X-100, die 10 mM EDTA enthält, suspendiert und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Nach Abtrennen der unlöslichen Substanzen durch Zentrifugieren, wurde die obige Verfahrensweise wiederholt, um dadurch den Inklusionskörper zu waschen. Ein Teil des auf diese Weise erhaltenen Inklusionskörpers wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Als Ergebnis wurden mehr als die Hälfte der Proteine bei einer Position elektrophoretisiert, die einem Molekulargewicht von ungefähr 55000 entspricht. Es wurde daher angenommen, dass das Protein in mehr als der Hälfte der oben erhaltenen Inklusionskörperfraktion α-1,3/4-Fucosidase umfasst. Verglichen mit der Bande des gleichzeitig analysierten Rinderserumalbumins, wurde angenommen, dass dieses α-1,3/4-Fucosidaseprotein mindestens in einer Menge von ungefähr 10 mg pro Liter des Kulturmediums erhalten werden kann.
(3) Solubilisierung und Rückgewinnung des Inklusionskörpers
Ein 1/10 Anteil (entsprechend 100 ml des Kulturmediums) des oben erhaltenen Inklusionskörpers wurde in 1 ml eines 10 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 6,0) suspendiert, der 8 M Harnstoff und 10 mM Dithiothreitol enthält, und durch 1 Stunde lang Rühren bei Raumtemperatur solubilisiert. Nach Entfernen der darin verbliebenen unlöslichen Substanzen durch Zentrifugieren, wurde der selbe Puffer zum Überstand zugegeben, so dass ein Gesamtvolumen von 5 ml entsteht. Dann wurde es in ein Dialyserohr mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 10000 eingefüllt und gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0), der 0,6 M KCl enthält, bei 15°C über Nacht dialysiert. Das Rententat wurde zentrifugiert, um dadurch unlösliche Substanzen zu entfernen und so wurden 7 ml eines Überstands erhalten. Die α-1,3/4-Fucosidaseaktivität dieser Lösung wurde gemäß dem im Journal of Biological Chemistry, 267 (3), 1522–1527 (1992) beschriebenen Verfahren untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, dass dieser Überstand eine Aktivität von ungefähr 10 mU/mol aufwies. Es wurde daher gefunden, dass ungefähr 14 U der rekombinanten α-1,3/4-Fucosidase aus 1 l Kulturmedium von Escherichia coli JM109/pTFSEF201 mit dem Gen der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.
(4) Substratspezifität rekombinanter α-1,3/4-Fucosidase
10 μl der im obigen Beispiel 3-(3) erhaltenen Enzymlösung wurden zu einem 30 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0), der 100 pmol pyridylaminierte (PA-) Lacto-N-fucopentaose (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) enthält, hinzugefügt und bei 37°C über Nacht umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann gefriergetrocknet und einer Pyridylaminierung unter Verwendung von Glyco TAG (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unterzogen. Dann wurde die erhaltene Reaktionsmischung unter Verwendung einer Anionenaustauscher-HPLC-Säule auf Monosaccharide analysiert. Auf diese Weise konnte bestätigt werden, dass Fucose aus dem Substrat PA-Lacto-N-fucopentaose freigesetzt wurde.
Unter Verwendung verschiedener pyridylaminierter Oligosaccharide als Substrat wurden die α-1,3/4-Fucosidaseaktivitäten gemäß dem im Journal of Biological Chemistry, 267 (3), 1522–1527 (1992) beschriebenen Verfahren untersucht. Auf diese Weise wurde gefunden, dass dieses rekombinante Enzym spezifisch für α-1,3- und α-1,4-Fucosidasebindungen ist, aber weder bei α-1,2-Fucosidbindung noch bei α-1,6-Fucosidbindung irgendeine Wirkung zeigte. Es zeigt auch kaum eine Wirkung bei α-2,3-Sialyllacto-N-fucopentaose II. Diese Substratspezifität war vollständig die selbe wie die von α-1,3/4-Fucosidase von Streptomyces sp. 142.
Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden die Aminosäuresequenz und Nukleotidsequenz von α-1,3/4-Fucosidase zum ersten Mal durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt, was es möglich macht, ein α-1,3/4-Fucosidasegen zur Verfügung zu stellen. Ebenso stellt die vorliegende Erfindung ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der α-1,3/4-Fucosidaseaktivität durch Gentechnologie zur Verfügung. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine hohe Produktivität dieses Enzyms erreicht werden, ohne dass irgendeine Induktion unter Verwendung von L-Fucose erforderlich ist. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Ziele zur Verfügung, wodurch das Vorhandensein von α-1,3/4-Fucosidase oder die Expression derselben untersucht werden kann, was es möglich macht, Sonden und Primer ausgehend von diesen Nukleotidsequenzen herzustellen oder Antikörper ausgehend von den Aminosäuresequenzen herzustellen.
Sequenzliste

Claims

Ein isoliertes Gen, das über eine Sequenz verfügt, die für ein Polypeptid kodiert, das eine α-1,3/4-Fucosidaseaktivität aufweist, wobei das isolierte Gen ist: (a) ein isoliertes Gen, das für die Aminosäurensequenz der SEQ ID NO. 1 kodiert; (b) ein isoliertes Gen der SEQ ID NO. 2; oder (c) ein isoliertes Gen, das in der Lage ist mit (a) oder (b) in einer Lösung, die 6 × SSC, 1% Natriumlaurylsulfat, 100 μg/ml Lachssperma-DNA und 5 × Denhardt's enthält, bei 65°C für 20 Std. zu hybridisieren.
Ein Verfahren zur Herstellung von α-1,3/4-Fucosidase, umfassend Kultivieren eines Transformanten, in den ein rekombinantes Plasmid enthaltend ein isoliertes Gen entsprechend Anspruch 1 eingeführt wurde, und Abernten der α-1,3/4-Fucosidase aus der Kultur.