Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
-
Die Erfindung betrifft ein rekombinantes Plasmid, das
zur Expression einer Lipase, welche vom Stamm Pseudomonas
fragi IFO 12049 abgeleitet ist (nachstehend einfach als
Lipase bezeichnet), in Escherichia coli mit guter Effizienz
befähigt ist, ein Escherichia coli, das mit dem vorstehenden
rekombinanten Plasmid transformiert ist und ein Verfahren zur
Herstellung der vorstehenden Lipase.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein
rekombinantes Plasmid, das zur Expression von Lipase in
Escherichia coli mit guter Effizienz befähigt ist, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß dann, wenn ein Lipasegen durch
Genmanipulation in einen Expressionsvektor, welcher zur
Expression eines Fremdgens in Escherichia coli befähigt ist,
insertiert wird, wobei ein neues rekombinantes Plasmid
gebildet wird, ein fusionierter Promotor (tac-Promotor) eines
Promotors des Tryptophan-Operons von Escherichia coli und eines
Lactose-Operons von Escherichia coli als Vektor des
Multicopy-Typs, der in Escherichia coli repliziert, verwendet
wird. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen
Escherichia coli-Stamm, der mit dem vorstehenden Plasmid
transformiert ist und weiter ein Verfahren zur Herstellung
einer Lipase unter Verwendung des Escherichia coli-Stamms.
Beschreibung des Standes der Technik
-
Lipasen wurden als Lipid-hydrolysierende Enzyme, für die
Verarbeitung von Ölen und Fetten, als Arzneimittel zur
klinischen Diagnose, als Detergenz, als verdauungsförderndes
Mittel usw. eigesetzt. Darüber hinaus sind sie in den letzten
Jahren wichtige Enzyme, die die Hydrolyse, Synthese oder
Konversion von Estern bei der Synthese chemischer Produkte,
insbesondere optisch aktiver Verbindungen, katalysieren.
-
Ferner war bekannt, daß Bakterien der Gattung
Pseudomonas Lipasen synthetisieren, die als Katalysator für die
Hydrolyse, Synthese oder Konversion von Estern nützlich sind
(Japanische offenlegungsschrift Nr. Sho 62-166,898/1987).
-
Das spezifische Merkmal der von Bakterien der Gattung
Pseudomonas synthetisierten Lipasen ist im Hinblick auf die
industrielle Nutzung von Interesse. Deren Synthese wird
jedoch durch Expression von gewöhnlich nur einem Gen, das in
der chromosomalen DNA des Lipase-synthetisierenden Bakteriums
enthalten ist, bewirkt. Es war daher schwierig, die Synthese
der Lipase in einem Schritt zu verbessern.
-
Aufgrund der Entwicklung der rekombinanten
DNA-Technologie wurde es in den letzten Jahren möglich, Gene in solche
umzuwandeln, die aufgrund deren Isolierung eine höhere
Aktivität aufwiesen, oder die Nukleotidsequenz zu transformieren.
Es wurden daher Untersuchungen durchgeführt, industriell in
teressante Proteine zu schaffen.
-
Insbesondere bei der Erforschung der Synthese eines
nützlichen Proteins mittels rekombinanter DNA-Technologie ist
die Verwendung von Escherichia coli als Wirt äußerst
wirkungsvoll, da verschiedene Faktoren, die bei der Synthese
einer Substanz eine Rolle spielen, ermittelt wurden und
Expressionsvektoren entwickelt und verbessert wurden.
-
Die hier genannten Erfinder isolierten vorher ein
Lipasegen aus dem Pseudomonas fragi-Stamm IFO 12049, bestimmten
dessen Primärstruktur und exprimierten erfolgreich eine
Lipase in Escherichia coli als Wirt (Japanische Patentanmeldung
Nr. Sho 63-187,684). Die dadurch exprimierte Menge war jedoch
so gering, daß es dringend erforderlich war, ein
rekombinantes Plasmid-Wirt-System auszuwählen und zu entwickeln, in dem
die Expression einer Lipase in Escherichia coli mit guter
Effizienz möglich ist.
-
Von einem derartigen Standpunkt ausgehend, um ein
geeignetes Expressionsplasmid zur Steuerung der Expression
einer Lipase in Escherichia coli in guter Effizienz zu
entwikkein, richteten die hier genannten Erfinder ihr Augenmerk und
ihre Untersuchungen auf die Kopienzahl der
Expressionsvektoren in Escherichia coli und auf den Promotor. Als Ergebnis
wurde gefunden, daß es bei Verwendung eines
Replikationsursprungs eines Multicopy-Plasmids vom PUC-Typ als Replikator
des Expressionsvektors und zusätzlicher Verwendung des tac-
Promotors als Promotor msglich ist, die Expression der Lipase
in Escherichia coli mit guter Effizienz zu bewirken, wobei
die vorliegende Erfindung auf der Grundlage des vorstehend
Gefundenen vollendet wurde.
Zusammenfassung der Erfindung
-
Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich ist, ist es die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, durch Genmanipulation ein
rekombinantes Plasmid zur Expression einer Lipase in
Eschenchia coli zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, eine
Lipase in Escherichia coli mit guter Effizienz zu
exprimieren, Escherichia coli-Stämme zur Verfügung zu stellen, die
mit dem Plasmid transformiert wurden und zur Herstellung
einer Lipase mit guter Effizienz geeignet sind und ein
Verfahren zur Herstellung einer Lipase mit sehr guter Effizienz in
Übereinstimmung mit den spezifischen Eigenschaften derartiger
Escherichia coli-Stämme zur Verfügung zu stellen.
-
Die vorliegende Erfindung besteht aus den folgenden
Bestandteilen:
-
(1) einem rekombinanten Plasmid zur Expression von Lipase,
welches umfaßt
-
(a) einen Vektor vom Multicopy-Typ, der in Escherichia
coli replizieren kann,
-
(b) einen fusionierten Promotor (tac-Promotor) aus einem
Promotor des Tryptophan-Operons von Escherichia coli und
einem Promotor des Lactose-Operons von Escherichia coli,
und
-
(c) die folgende DNA-Sequenz, die eine Lipase codiert,
welche vom Pseudomonas fragi-Stamm IFO 12049 abgeleitet
ist und unter der Kontrolle des fusionierten Promotors
steht:
-
(2) einem Escherichia coli-Stamm, welcher mit einem in Punkt
(1) aufgeführten rekombinanten Plasmid transformiert wurde.
-
(3) einem Verfahren zur Herstellung einer Lipase, welches
die Verwendung eines in Punkt (2) aufgeführten Escherichia
coli-Stamms umfaßt.
Kurze Beschreibung der Figuren
-
Fig.1 zeigt ein Flußdiagramm, welches die
Konstruktionsschritte des Plasmids pTC-1 genau erläutert.
-
Fig.2 zeigt ein Flußdiagramm, welches die
Konstruktionsschritte des Plasmids pTCE-lip und pTCS-lip genau erläutert.
-
Fig.3 zeigt eine DNA-Sequenz zwischen der SD-Sequenz und
dem Lipase Startcodon ATG in dem Plasmid pTCE-lip und dem
Plasmid pTCS-lip.
Genaue Erläuterung der bevorzugten Ausführungsformen
-
Nachstehend wird der Aufbau und die Wirksamkeit der
vorliegenden Erfindung beschrieben.
-
Als Vektor, der für das erfindungsgemäße rekombinante
Plasmid verwendet wird, ist es möglich ein DNA-Fragment zu
verwenden, das in Escherichia coli als Wirt stabil
beibehalten wird und das einen Plasmid-Replikator
(Replikationsursprung) vom Multicopy-Typ besitzt, und der in Escherichia
coli replizieren kann, d.h. wirksam funktionieren kann. Als
Plasmid-Replikator können jene vom Plasmidtyp pUC usw.
verwendet werden.
-
Darüber hinaus enthalten diese Plasmide zweckmäßig Gene,
die bei Einbringen eines rekombinanten Plasmids in ein
Wirtsbakterium einen selektiven Marker darstellen, beispielsweise
verschiedene Gene, die Resistenz gegen Ampicillin oder
Kanamycin usw. bewirken können.
-
Der für das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid
verwendete tac-Promotor kann aus dem trp-Promotor und dem lac-
Promotor nach dem von E. Amann et al. (Gene 25 (1983), 167)
geschilderten Verfahren konstruiert werden.
-
Ferner kann der tac-Promotor aus einem geeigneten
Vektor, der den tac-Promotor enthält, wie durch den Vektor PKK
223-3 beispielhaft dargestellt (von Pharmacia Co., Ltd.
hergestellt), herausgeschnitten werden. Darüber hinaus ist es
bevorzugt, daß der tac-Promotor die SD (Shine-Dalgarno)
-Sequenz enthält.
-
Desweiteren sollte, damit dieser tac-Promotor zur
Expression des Lipasegens wirksam arbeitet, die Sequenz
zwischen der SD-Sequenz des tac-Promotors und dem Startcodon,
ATG, des Lipasegens ebenfalls berücksichtigt werden.
Beispielsweise ist eine Sequenz bevorzugt, wie sie von den hier
genannten Erfindern im nachstehend aufgeführten Beispiel
gezeigt wird.
-
In dem erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid kann eine
Sequenz, die bereits von den hier genannten Erfindern aus dem
Pseudomonas fragi-Stamm IFO 12049 kloniert und in der
Japanischen Patentanmeldung Nr. Sho 63-187,684 offenbart wurde
(welche eine DNA-Sequenz ist, die in dem vorstehenden
Bestandteil (1) beschrieben ist), als DNA-Sequenz verwendet
werden, die ein Lipasegen codiert, das stromabwärts eines
tac-Promotors angeordnet ist, wobei natürlich auch eine DNA-
Sequenz verwendet werden kann, welche ein Lipasegen codiert,
das dem vorstehenden Gen funktionell äquivalent ist.
-
In dem erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid kann als
Terminator für die mRNA, welcher derart eingebaut ist, daß er
stromabwärts der DNA-Sequenz angeordnet ist, die ein
Lipasegen codiert, jeder Terminator verwendet werden, der in
Escherichia coli wirksam funktioniert, wobei jedoch die Verwendung
eines Terminators mit hoher Aktivität, beispielsweise rrnB
oder trpA, hinsichtlich des Ausgleichs eines Promotors mit
hoher Promotor-Aktivität, wie dem tac-Promotor, bevorzugt
ist.
-
Wenn das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid mit dem
vorstehenden Aufbau in Escherichia coli als Wirtsbakterium
eingebracht wird, ist es möglich die Expression einer Lipase
zu bewirken, die in Escherichia coli als Wirt eine erhöhte
Effizienz aufweist.
-
Hinsichtlich der Expression von Lipase ist es bei
Verwendung eines einen Lactose-Repressor produzierenden
Bakteriums als Wirtsbakterium möglich, die Expression mit Hilfe
von Lactose oder Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu
induzieren.
-
Als Beispiele für dieses Bakterium können JM 109
[Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33
(1985), 103], D1210 [Sadler, S.J., Tecklenburg, M. and Betz,
J.L., Gene 8 (1980), 279] usw. verwendet werden.
-
Des weiteren ist es möglich, die Expression von Lipase
auch ohne Verwendung einer induzierenden Substanz, wie IPTG,
zu bewirken, wenn ein Bakterium als Wirtszelle verwendet
wird, das keinen Lactose-Repressor produziert. Als Beispiele
für dieses Bakterium können JM 83 [Messing, J., Crea, R. and
Seeberg, P.H., Nucl. Acid. Res. 2 (1981), 309] usw. verwendet
werden.
-
In jedem Fall können die Kulturbedingungen entsprechend
der spezifischen Eigenschaften des als Wirt verwendeten
Escherichia coli so bestimmt werden, daß die Expression von
Lipase mit hoher Effizienz bewirkt wird.
-
Eine Probe von Escherichia coli, die, wie vorstehend
beschrieben, unter Bedingungen eingestellt ist, bei denen die
Lipase-Expression mit hoher Effizienz bewirkt werden kann,
wird durch Natriumdodecylsulfat
(SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese bis auf Polypeptid-Ebene in ihre Bestandteile
aufgetrennt.
-
Die derart aufgetrennten Polypeptide werden dann auf
geeignete Art und Weise angefärbt und sichtbar gemacht. Die
Bestätigung der Expression von Lipase in Escherichia coli durch
das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid erfolgt durch einen
Vergleich des Musters der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese,
wobei eine auf dieselbe Art und Weise eingestellte Probe von
Escherichia coli, die ein Plasmid ohne Lipasegen enthalten,
als Kontrolle verwendet wird.
-
Des weiteren kann die Bestimmung der Aktivität der in
Escherichia coli exprimierten Lipase gemäß einem
Bestimmungsverfahren erfolgen, bei dem eine Fettsäure die durch eine
Lipase-Funktion freigesetzt wird, unter Verwendung von
emulgiertem Olivenöl als Substrat titriert wird, oder gemäß einem
Verfahren, bei dem ein im Handel erhältliches Kit zur Messung
der Lipaseaktivität verwendet wird, usw..
-
Es ist daher erfindungsgemäß möglich geworden, ein von
einem Pseudomonas Bakterium stammendes Lipasegen in
Eschenchia coli mit höherer Effizienz zu exprimieren, und es ist
zudem möglich geworden, die gleiche Lipase, wie die von einem
Pseudomonas Bakterium stammende Lipase, welche für
kommerzielle Zwecke verwendet werden kann, oder dessen Variante,
die im wesentlichen dieselben spezifischen Eigenschaften
besitzt, zur Verfügung zu stellen.
-
Die vorliegende Erfindung wird anhand von Beispielen
ausführlicher beschrieben, welche dadurch jedoch nicht als
eingeschränkt angesehen werden sollte.
Beispiel 1
(Konstruktion des Plasmids pTCE-lip pTCS-lip)
(1) Konstruktion des Plasmids pTC1 entsprechend der Schritte
von Fig. 1:
-
Zuerst wurde ein einen Replikationsursprung (on)
enthaltendes DNA-Fragment mit Hilfe eines bekannten
Elektrophorese-Verfahrens aus einem Gemisch von DNA-Fragmenten
abgetrennt und gewonnen, das durch Spalten des Plasmids pUC9
[Vieira, J. and Messing, J., Gene 19 (1982), 259, Yanisch-
Perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33 (1985), 103]
mit den Restriktions-enzymen PvuII ScaI erhalten wurde,
während ein einen tac-Promotor enthaltendes DNA-Fragment mit
Hilfe eines bekannten Elektrophorese-Verfahrens aus einem
Gemisch von DNA-Fragmenten abgetrennt und gewonnen wurde, das
durch Spalten des Plasmids pKK223-3 (von Pharmacia Co., Ltd.
hergestellt) mit den Restriktionsenzymen ScaI NruI erhalten
wurde.
-
Anschließend wurden die beiden so erhaltenen
DNA-Fragmente in Anwesenheit von T4 DNA-Ligase umgesetzt und
nachfolgend das so gebildete Reaktionsprodukt gemäß dem Verfahren
von Hanahan [Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557] in
Escherichia coli eingebracht und das so gebildete Produkt auf
einer 50 mg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Medium Platte (das
Medium: 1% Bacto-Trypton 0,5% Hefeextrakt 0,5% NaCl 1,5%
Agar, eingestellt auf pH 7,2) gezüchtet. Nach dem Züchten
wurden die Plasmide aus den gegen Ampicillin resistenten
Koionien, die sich auf der Platte gebildet hatten, einzeln
gewonnen und nachfolgend wurde eine Restriktionskarte der
entsprechenden Plasmide erstellt, eine Kolonie, die das Plasmid
pTC1 des in Fig.1 gezeigten Aufbaus enthielt, identifiziert
und das Plasmid pTC1 aus der Kolonie isoliert.
(2) Konstruktion der Piasmide pTCE-lip und pTCS-lip,
dargestellt in den Schritten von Fig. 2:
(2-1) Konstruktion von pTCE-lip
-
Zuerst wurde die Schnittstelle für das Restriktionsenzym
Ncoi in der Nähe des 5'-Endes des Lipasegens pFL-2, das ein
von dem Pseudomonas fragi Stamm IFO 12049 abstammendes
Lipasegen enthielt, welches gemäß dem in der japanischen
Patentanmeldung Nr. Sho 63-187,684 offenbarten Verfahren der
hier genannten Erfinder konstruiert wurde, nach einem für
bestimmte Stellen spezifischen Mutagenese-Verfahren [Morinaga,
Y., Frances-chini, T., Inouye, S and Inouye M., Biotechnology
2 (1984), 636] eingebracht.
-
Genauer, unter Verwendung des aus 16 Nudeotiden
bestehenden Oligonucleotids 5'-CGTCCATGG*TCAATCC-3' (*: geänderte
eingeführte Stelle), das komplementär zur DNA-Sequenz des
Lipase Startcodons des Plasmids pFL-2 ist, wurde eine
Schnittstelle für das Restriktionsenzym NcoI genau vor dem Lipase
Startcodon eingeführt.
-
Das so erhaltene Plasmid wurde mit den
Restriktionsenzymen NcoI ScaI gespalten und nachfolgend wurde mit Hilfe des
Elektrophoreseverfahrens ein 1 Kb DNA-Fragment, das das
Lipasegen enthielt, abgetrennt und gewonnen, das dann mit dem
Klenow Fragment behandelt wurde, wobei dieses mit glatten
Enden versehen wurde.
-
Unabhängig davon wurde das Plasmid pTCL, das gemäß dem
vorstehend, in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt
worden war, mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und das
gespaltene pTC1 wurde anschließend mit dem Klenow-Fragment
behandelt, wobei dieses mit glatten Enden versehen wurde. Das
so erhaltene, von pTC1 abgeleitete DNA-Fragment, das glatte
Enden aufwies, wurde mit dem zuvor erhaltenen, ein Lipasegen
enthaltenden 1 Kb DNA-Fragment in Anwesenheit von T4
DNA-Ligase umgesetzt, wobei ein wie in Fig. 2 konstruiertes Plasmid
erhalten wurde.
-
Ob das gewünschte Plasmid erhalten worden war oder
nicht, wurde in diesem Fall durch die Reaktion mit T4 DNA
Ligase, Transformation in Escherichia coli, und nachfolgendes
Züchten des so erhaltenen Materials auf einem LB-Medium, das
Ampicillin enthielt, Herstellen eines Plasmids aus einer
gegen Ampicillin resistenten Kolonie, die darauf gebildet wurde
und Erstellen einer Restriktionskarte davon bestätigt.
(2-2) Konstruktion des Plasmids pTCS-lip
-
Das vorstehend, in Punkt (2-1) erhaltene Plasmid, bei
dem die NcoI Schnittstelle genau vor dem Startcodon des
Lipasegens eingeführt wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen
NcoI-EcoRI gespalten und dann mit Hilfe des Elektrophorese-
Verfahrens ein 1,1 Kb DNA-Fragment, das das Lipasegen
enthält, abgetrennt und gewonnen.
-
Dieses 1,1 Kb-Fragment und ein 3,1 Kb-Fragment, das
durch Spalten des Plasmids pTV118N (von Takara Shuzo Co.,
Ltd. hergestellt) mit den Restriktionsenzymen NcoI-EcoRI
erhalten wurde, wurden in Anwesenheit von T4-DNA-Ligase
umgesetzt, wobei das Plasmid pNE118 lip, wie in Fig. 2
konstruiert, erhalten wurde.
-
Dieses Plasmid pNE118 lip wurde mit dem
Restriktionsenzym NcoI gespalten, und dann mit dem Klenow-Fragment
behandelt, wobei dieses mit glatten Enden versehen wurde. Danach
wurde mit dem Restriktionsenzym Hindih gespalten und mit
Hilfe des Elektrophorese-Verfahrens ein 1,2 Kb DNA-Fragment,
das ein Lipasegen enthielt, abgetrennt und gewonnen.
-
Dieses 1,2 Kb Fragment und das 4,4 Kb-Fragment, das
durch Spalten des vorstehend unter Punkt (1) erhaltenen
Plasmids pTC1 mit den Restriktionsenzymen SmaI, HindIII erhalten
worden war, wurde in Anwesenheit von T4-DNA-Ligase umgesetzt,
wobei das Plasmid pTCS-lip, konstruiert wie in Fig.2,
erhalten wurde.
-
Ob das gewünschte Plasmid erhalten worden war oder nicht
wurde in diesem Fall dadurch bestätigt, daß das mit der T4-
DNA-Ligase erhaltene Produkt in Escherichia coli eingebracht
wurde und nachfolgend das so erhaltene Material auf
LB-Medium, das Ampicillin enthielt, gezüchtet wurde, und aus einer
sich darauf bildenden, gegen Ampicillin resistenten, Kolonie
ein Plasmid isoliert und eine Restriktionskarte davon
angefertigt wurde.
(3) DNA-Sequenz zwischen einem Startcodon ATG des
Lipasegens des Piasmids pTCE-lip, pTCS-lip und der vom
tac-Promotor stammenden SD-Sequenz:
-
Um die DNA-Sequenz zwischen dem Startcodon ATG des
Lipasegens des pTCE-lip und des vorstehend unter Punkt (2)
erhaltenen pTCS-lip, und der vom tac-Promoter stammenden
SD-Sequenz zu bestätigen, wurde die Nucieotidsequenz unter
Verwendung von M13-Sequenzier-Kits (von Takara Shuzo Co., Ltd.
hergestellt), nach dem Verfahren von Hatton et al. [M. Hatton
and Y. Sasaki, Anal. Biochem. 152 (1986), 232] bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Beispiel 2: (Expression von Lipase in Escherichia coli)
-
Die in Beispiel 1 erhaltenen Lipase-Expressionsplasmide
pTCE-lip und pTCS-lip, wurden jeweils in Escherichia coli JM
109 ( lac Iq-bildende Bakterien) [Yanisch-Perron, C., Vieira,
J. and Messing, J. Gene 33 (1985), 103] eingebracht und die
so erhaltene Substanz nachfolgend über Nacht bei 37ºC einer
Schüttelkultur in LB-Medium mit Ampicillin (50 mg/ml)
unterzogen. Die so erhaltene Kulturlösung (100 ml) wurde dann in 5
ml LB-Medium mit Ampicillin (50 mg/ml) neu angeimpft und die
so erhaltene Kultur wurde erneut einer Schüttelkultur bei 37
ºC unterzogen, nach zwei Stunden wurde IPTG zu einer
Endkonzentration von 0,6 mM zugegeben und weiter bei 37 ºC
geschüttelt. Drei Stunden nach der Zugabe wurde 1 ml der
Kulturiösung durch Zentrifugation aufgetrennt und die Escherichia
coli Bakterienzellen wurden isoliert.
-
Den Bakterienzellen wurden 500 ml 20 mM Tris-HCL
Pufferlösung (pH: 8,0) zugesetzt, und sie wurden nachfolgend darin
suspendiert und mittels Ultraschall Generator (SONIFIRE 250
Type , von BRANSON Co., Ltd. hergestellt) aufgeschlossen.
-
Ein Teil der so erhaltenen Probe aufgebrochener
Bakterienzeilen wurde mit der gleichen Menge einer
Proben-Pufferlösung (10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol und 2,3 % SDS,
0,0625 M Tris-HCl, pH 6,8) gemischt. Nachfolgend wurde das
Gemisch für 5 Minuten gekocht und die so erhaltene Substanz
einer SDS-15%-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach dem
Verfahren von Laemmli [U.K. Laemmli, Nature 227 (1970), 680]
unterzogen und das Polypeptid in dem Gel mit Coomassie Blue
Lösung angefärbt.
-
Gleichzeitig wurden Zellen vom JM 109 (pTC1)-, vom JM
109 (pTCE-lip)- und vom JM 109 (pTCS-lip)-Stamm, die nicht
der Induktion der Produktion mittels IPTG unterzogen worden
waren, in derselben Art und Weise als Kontroliproben
hergestellt und nachfolgend elektrophoretisch aufgetrennt. Durch
Vergleich der elektrophoretischen Muster mit denen der
Kontroliproben wurde die Expression von von Lipasegenen
stammenden
Polypeptiden, die mit IPTG in JM 109 (pTCE-lip) und JM
109 (pTCS-lip) induziert worden waren, bestätigt.
Beispiel 3: (Bestimmung der Lipaseaktivität)
-
Die Lipaseaktivität wurde unter Verwendung eines Lipase
Kits 5, einem in Handel erhältlichen, von Dainippon Seiyaku
Co., Ltd. hergestellten Produkt, bestimmt. Dementsprechend
wurde die Bestimmung im Prinzip wie folgt durchgeführt:
Dimethylcapryltributyrat wird durch eine Lipase
hydrolysiert, wobei Dimethylcaprol gebildet wird, das quantitativ
mit 5,5'-Dithio-bis-(2-Nitrobenzoesäure) zu gelber 5-Thio-2-
nitrobenzoesäure reagiert.
-
Genauer, ein farbentwickelndes Reagens (1 ml), eine
Probe (50 ml) und ein Esterase-Hemmer (20 ml) wurden in
Probenröhrchen eingebracht und nachfolgend gemischt, die
entsprechenden Röhrchen in einem Bad mit konstanter Temperatur
plaziert und 5 Minuten bei 30 ºC stehen gelassen. Dann wurden
100 ml Substratlösung zugegeben und unmittelbar danach wurde
30 Minuten bei 30ºC unter Lichtabschirmung inkubiert, danach
wurde eine Reaktions-Stop-Lösung (2ml) zugegeben, gemischt
und das Röhrchen unter Lichtabschirmung gehalten und
innerhalb einer Stunde wurde die Absorption bei 412 nm, mit Wasser
als Kontrolle gemessen. Ein Unterschied in der Absorption der
so erhaltenen Substanz und der Kontrolle von 0,001 ist als 1
BALB-Einheit definiert.
-
Als Meßprobe wurde ein Überstand verwendet (12 000 Upm x
15 Minuten, unter Verwendung einer HIMAC CR 15B , von Hitachi
Co., Ltd.), der durch Behandlung von Zellen mit Ultraschall
erhalten wurde, die entsprechend dem Verfahren von Beispiel 2
durch Induktion mit IPTG (0,6 mM) und nachfolgendem Züchten
der so erhaltenen Substanz für 3 Stunden erhalten worden
waren.
-
Die entsprechenden Lipase-Aktivitäten vom JM 109 (pTCE-
hp) Stamm, JM 109 (pTCS-lip) Stamm (jeweils erfindungsgemäß)
und vom JM 109 (pFL-2) Stamm (offenbart in der Japanischen
Patentanmeldung Nr. Sho 63-187684) waren 220 BALB-Einheiten,
300-BALB Einheiten und 130 BALB-Einheiten, jeweils pro ml
Kulturlösung.
-
In den vorstehenden Beispielen wurden, wenn nicht
anderweitig angegeben, das Plasmid unter Verwendung eines
Restriktionsenzyms, T4-DNA-Ligase und Klenow-Fragment, die
Behandlung des DNA-Fragments und die Herstellung des Plasmids
aus Bakterienzellen entsprechend herkömmlicher Verfahren
durchgeführt. Als Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurden
die von Nippon Gene Co., Ltd. hergestellten verwendet und als
Klenow-Fragment, das von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellte.