JPS60221091A - 新規プロモ−タ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、転写活性を強化した新規プロモーターに関す
る。

さらに詳しくは、大腸菌固有のプロモーターあるいは人
工的に造成されたプロモーター（以下プロモーターＡと
いう）の“−３５”領域の上流に存在する領域を、他の
プロモーター（以下プロモーターＢという）の該領域と
置き換えることによって構成される新規プロモーターに
関する。

近年、組換えＤＮＡ技術の発達により、微生物とくに大
腸菌を利用して異種蛋白質の大量生産が可能となってい
る。異種遺伝子の宿主細胞内での発現効率の向上は重要
な開発課題である。特に転写効率を高めるためには、転
写開始に必要な遺伝情報であるプロモーターとして、ラ
クトース（ｌａｃ）プロモーター（以下１ａｃプロモー
ターという）やトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター
く以下ｔｒｐプロモーターという）などが用いられ、さ
らにｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターのハイブ
リッド・プロモーター（ｔａｃプロモーター）も考案さ
れ、異種遺伝子の発現に応用さている（Ｋ、　Ｉｔａｋ
ｕｒａ　ら＋５ｃｉｅｎｃｅ　１９８　、１０５６−１
０６３（１９７７）Ｄ、Ｖ、　ＧｏｅｄｄｅＩ　ら：Ｎ
ａｔｕｒｅ　２８７．　４１１−４１６　（１９８０）
。

Ｈ，Ａ、ｄｅＢｏｅｒ　ら：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０．２ｌ−２５（１９８３）
　）。

ＲＮＡポリメラーゼが認識、結合し、転写を開始する領
域を“′プロモーター”と呼ぶが、この“プロモーター
”を構成するＤＮＡ塩基配列が転写効率を左右すること
は周知の事実である。

ＤＮＡ塩基配列の慣用の番号付け（ｎｕｍｂｅｒ　ｉｎ
ｇ）に従うと、大腸菌のプロモーターは−３５”近傍の
領域（この領域は一般に“−３５”領域と呼ばれている
）、“−１０”近傍（この領域は“−１０”領域あるい
はｐｒｉｂｎｏｗボックスと呼ばれている）および“＋
１”すなわち転写開始部位（この部位はほとんどのプロ
モーターにおいてアデニンかグアニンといったプリン塩
基となっている）から成る。“−３５”領域はＲＮＡポ
リメラーゼが認識する部位であるとされている。種々の
大腸菌プロモーターの塩基配列を統計的に解析した場合
に、そのコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　）配列は
ＴＧＴＴＧ八Ｃ八ＮへＴへ（Ａはアデニン、Ｔはチミン
、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンの塩基を示し、ＮはＡ、
Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれの塩基でもよいことを表わす）であ
ることが明らかにされており、この配列の中で高度に保
持された配列はＴＴＧ八〇へである。一方、“−１０″
領域はＲＮＡポリメラーゼが結合する部位であるとされ
ており、そのコンセンサス配列はＴＡＴＡＡＴＧである
。（Ｍ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　＆　Ｄ、　Ｃｏｕｒｔ：
八ｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ。

旦、３１９（１９７９）　） 真核細胞遺伝子の発現によく用いられるプロモーターと
しては、］ａｃＵＶ５プロモーターＣＦ、　Ｆｕｌｌｅ
ｒ：Ｇｅｎｅ　１９　、４３（１９８２）　：］、ｔｒ
ｐプロモーター［Ｇ、　Ｎ、　Ｂｅｎｎｅｔら：Ｊ、　
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、皿、１１３（１９７８）　：Ｄ、　
Ｖ、　Ｇｏｅｄｄｅｌら：〜ａｔｕｒｅ、　２Ｂ？　、
　４１１（１９８０）　）が知られている。Ｉａｃ　Ｉ
ＪＶ５プロモーターの場合、その゛−１０″領域（ＴＡ
ＴＡＡＴＧ＞は前出の大腸菌プロモーターの“−１０”
領域のコンセンサス配列と完全に一致しているが、その
“−３５″領域（Ｇ［’ＴＴＴＡＣＡ［：ＴＴＴ）はそ
のコンセンサス配列と一致しない。一方、ｔｒｐプロモ
ーターの場合は逆に、その“−３５”領域（ＴＧＴＴＧ
ＡＣＡＡＴＴＡ）はそのコンセンサス配列とほぼ一致し
ているが、その“−１Ｏ。

領域（ＴＴＡＡＣＴ八）はそのコンセンサス配列と一致
しない。

ジェネンティク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社のＨ，Ａ、　
ｄｅＢｏｅｒらは、ｔｒｐプロモーターおよびＩａｃ　
ＵＶ５　プロモーターのすぐれた点を生かし、ｔｒｐプ
ロモーターの“−３５”領域およびその上流にある５′
フランキング領域を含むＤＮＡ断片とｌａｃプロモータ
ーの“−１０”領域およびｌａｃオペレーターを含むＤ
ＮＡ断片を結合することによって、ｔａｃプロモーター
と呼ばれるハイブリッドプロモーターを構築し、ヒト成
長ホルモンの発現などに利用した。このｔａｃプロモー
ターにおいては、ｔｒｐプロモーター由来の“−３５″
領域とｌａｃプロモーター由来の“−１０”領域が、プ
ロモーターとして機能しうるように構成されており、両
方の領域ともそのコンセンサス配列とほぼ一致している
ことが特徴である（Ｈ，八、　ｄｅＢｏｅｒら：Ｐｒｏ
ｃ、　ＮａｔＬ八ｃａへ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０　．２
１（１９８３）　）　。

このようにして構築されたｔａｃプロモーターはｔｒｐ
プロモーターよりも約３．５倍、ｌａｃプロモーターよ
りも２〜３倍転写活性が強いことが示された。また、Ｈ
，八、　ｄｅＢｏｅｒらは、極めて強いプロモーターと
して知られるリボゾームＲＮＡオペロンのプロモーター
と１ａＣプロモーターのハイブリッドであるｒａｃプロ
モーターも構築し、ヒト成長ホルモンの発現に利用した
（特開昭５７−１９４７９０）。

このように、Ｈ，Ａ、　ｄｅＢｏｅｒらは、２種のプロ
モーターのすぐれた点を生かし、５′フランキング領域
と”　−３５’“領域を含むＤＮＡ断片と“−１０”領
域を含むＤＮＡ断片とを選択的かつ機能的に再結合し、
新規なハイブリッドプロモーターを構築する方法を考案
した。この方法は転写活性も強く、発現制御が可能なハ
イブリッドブロモ−クーの造成に有用であろうが、この
方法のみでは大腸菌の持つ転写能力を最大限に発揮した
プロモーターを構築できない。本発明者らは、このｔｒ
ｐプロモーター、ｔａｃプロモーターの転写活性をさら
に上昇させるために研究を重ねた。

１１、八、　ｄｅＢｏｅｒらが述べているようｉこ〔Ｈ
１八、　ｄｅＢｏｅｒら：“Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：５ｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ、”Ｒ，Ｌ
。

Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　らＭ、Ｊ、　Ｃｈａｍｂｅｒｌｉ
ｎ　１５集、　（Ｐｒａｅｇｅｒ社）、４６２１８１頁
（１９８２年）〕、プロモーターの強さを左右する因子
として、（１）　“−１０”領域の塩基配列、 （２）　−３５”領域の塩基配列、 （３）　“−１０″と“−３５”領域間の距離、（４）
　“−３５”領域の上流の５′フランキング領域のＡＴ
含量 （５）　これらの因子の特定の組合わせが挙げられる。

因子（１）、　（２）、　（３）がプロモーター強度を
大きく左右することが知られているが、本発明者らは因
子（４）もプロモーター強度に大きな影響を与えるであ
ろうと予想した。

いくつかの強い大腸菌プロモーターは、その５′フラン
キング領域がアデニン（Ａ）　とチミン（Ｔ）　に富ん
でおり、しかもΔとＴが連続してつながった部分（ＡＴ
）を含むことが知られている。

（Ｚ、　ｔｌｕｍａｙｕｎ　ら：ＪｌＭｏｌ、Ｂｉｏｌ
、１１２．２６５（１９７７）Ｇ、　Ｔ、Ｈｏｒｎら：
Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２５６．１９９８（１９８１
）Ｇ、Ｎ、Ｂｅｎｎｅｔら：Ｊ、　Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、
１２１．１１３　（１９７Ｂ）Ｋ、Ｎａｋａｍｕｒａ　
ら：Ｃｅ１ｌ　１８．１１０９　（１９７９）　）。

また、５′フランキング領域のＡＴ含量がプロモーター
強度に影響を与えることも知られている。

すなわち、Ｇ、Ｔ、　）ｔｏｒｎ　ら〔Ｇ、Ｔ、　Ｈｏ
ｒｎ　ら：Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｙ＋、　２５６．２００３（１９８１）　〕は
、λファージのＰ。

プロモーターのＡＴに富んだ５′フランキング領域を除
去した場合、そのプロモーター強度が減少することを示
した。またＲ、Ｄ、ＫｌｅｉｎらＣＪ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５７　、１２９５４（１９８２）　）は
ｌａｃプｏ％−り−の”　−３５”領域の上流に約７０
ｂｐの２木調ＤＮＡポリ（Ａ）　・ポリ（Ｔ）を挿入す
ることにより、ｌａｃプロモーターのｉｎ　ｖｉｔｒｏ
での転写活性が増強されることも示した。このことから
、５′フランキング領域にＡＴに富んだ配列を付与した
場合にプロモーター強度が上昇すると予想される。

Ｐｔプロモーターの５′フランキング領域も以下に述べ
る特徴を有する（第１表参照）。まず、ＡＴに富んだ部
分が２か所、その５′フランキング領域に含まれる。こ
の２か所のＡＴに富んだ部分は、Ｐｔプロモーターの転
写開始部位を＋１とする慣用の番号付けに従うと、−１
８６から−１５５と−１０１から−７５である。

第１表　ＰｔプロモーターのＤＮＡ塩基配列■ Ｇ、Ｔ、　Ｈｏｒｎ　らはこの両方の八Ｔに富んだ部分
を除去すると、Ｐｔプロモーターの強度は減少するが、
Ｐｔプロモーターの機能は変わらないことを示した。［
Ｇ、Ｔ、　Ｈｏｒｎ　ら：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋
ｎ、、　２５６゜２０（）３　（１９８１）　：］。ま
た−６０から−４９の部分には“−３５”領域に似た塩
基配列が存在し、この部分もブロモ−クー強度に関係あ
るかもしれない。

Ｐｔプロモーターの塩基配列についてであるが、“−３
５”領域および“−１Ｏ”領域ともに、それらのコンセ
ンサス配列にかなり近いが、完全に致してはいない。そ
のコンセンサス配列との−数件はｔｒｐプロモーターと
同程度であるにもかかわらず、ＰＬプロモーターがｔｒ
ｐプロモーターより転写活性が強いことは、５′フラン
キング領域の塩基配列の違いに起因している可能性があ
る。従って、５′フランキング領域をＰ、プロモーター
のものと置き換えたプロモーターは、その強度が高くな
るかもしれない。

この５′フランキング領域を置き換えるには、■、八へ
　ｄｅＢｏｅｒ　らが開発した方法、すなわち、５′フ
ランキング領域を含む“−３５”領域と“′−１Ｏ”領
域の間で組換え、新規なハイブリッドプロモーターを構
築する方法（特開昭５７ｉ９４７９０）を利用すること
もできるが、この方法は、”３５”領域と“’−１０”
領域の組合わせが変化し、プロモーター固有の機能をそ
こなう可能性がある。

例えば、非常にすぐれたｔａｃプロモーターの場合、そ
の５′フランキング領域を他のものと置き換え、さらに
強力なプロモーターを造成したいときにこの方法を用い
ると、ｔａｃプロモーターが固有に持つ’　−３５”領
域と“−３５″゛領域あるいは５′フランキング領域に
存在する適当な制限部位を利用して、他の５′フランキ
ング領域あるいは化学合成したＡＴに富んだＤＮＡ断片
を挿入することも可能であるし、“−１０”領域の組合
せが変化してしまう。そこで、本発明者らは、以下述べ
るように５′フランキング領域のみを置き換える方法、
すなわち“−３５”領域の近傍あるいはその上流の制限
部位を利用して５′フランキング領域のみを置き換える
方法を見出し本発明を完成するに至った。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、プロモーター（以下プロモーターＡという）
の５′フランキング領域を、他のプロモーター（以下プ
ロモーターＢという）の５′フランキング領域あるいは
化学合成したＤＮＡ断片と置き換えた新規プロモーター
を提供する。

プロモーターΔの具体例としては、大腸菌由来のトリプ
トファン（ｔｒｐ）オペロンのプロモーター（ｔｒｐプ
ロモーター）、ラクトース（ｌａｃ）オペロンのプロモ
ーター（ｌａＣプロモーｙ−＞またはｔｒｐプロモータ
ーとｌａｃプロモーターのハイブリッドプロモーターで
あるｔａｃプロモーターあるいは人工的に造成されたプ
ロモーターなどがあげられる。

プロモーターＢはプロモーターＡよりも転写活性が強い
ものが好ましいが、プロモーターＡと同等または弱いも
のでも、置き換えによって転写活性が強くなる場合もあ
る。

プロモーターＢの具体例としては、大腸菌由来のλファ
ージのＰ、プロモーター、ｐＨプロモーター、リボゾー
ムＲＮＡ　（ｒ　ｒｎ）プロモーターまたはリポプロテ
ィン遺伝子のプロモーターなどがあげられる。

プロモーターΔの５′フランキング領域へのプロモータ
ーＢの５′フランキング領域あるいは化学合成したＤＮ
Ａ断片の置き換えは、プロモーターＡの’　−３５”領
域の近傍あるいはその上流の制限部位または”　−３５
”領域あるいは５′フランキング領域に存在する適当な
制限部位を利用して行う。“”３５”領域内の制限部位
を利用する場合は、置き換えの後、“’　−３５”領域
の塩基配列が変化しないような制限部位を選ぶ必要があ
る。

またプロモーターへの５′フランキング領域をＢＡＬ３
１などのヌクレアーゼを用い除去した後、プロモーター
Ｂの５′フランキング領域あるいは化学合成したＤＮＡ
断片を挿入することもできる。

プロモーターＡの５′フランキング領域としては、たと
えば下記制限酵素で切り出される領域があげられる。

プロモーターＡ　５’フランキング領域ｔｒｐプロモー
ター　Ｈｉｎｃ　ｎ、Ｈｈａ　ｌ１ａｃプロモーター　
Δｌｕ　Ｉ ｔａｃプ０％−クー　Ｈｉｎｃ　ＩＩ、ｆｌｈａ　Ｉプ
ロモーターＢの５′フランキング領域としては、下記制
限酵素で切り出される領域があげられる。

プロモーターＢ　５′フランキンク領域ＰＬプロモータ
ー　旧ｎｃｌＩ、Ｂｇｌ　Ｕ、Ｐｖｕ　ＬＨｐａｌｌＰ
Ｒプロモーター　Ｈｉｎｃ　ＩＩ ｒｒｎ　プロモーター　１１ａｅ　ＩＩＩリポプロティ
ン遺伝子　５ａｕ３Ａ　Ｔａｑ　Ｉのプロモーター プロモーターＢの５′フランキング領域および化学合成
したＤＮＡ断片としては、ＡＴに富んだ領域およびＤＮ
Ａ断片が好適である。

以下、非常に強力なＰＬプロモーターの５′フランキン
グ領域を、ｔｒｐプロモーターやｔａｃプロモーターの
該領域と置き換える場合を例にとって、本発明をさらに
詳細に述べる。

第１表かられかるように、ＰＬプロモーターはその“−
３５パ領域中にＨ４ｎｃ１１部位を含む。

また、第２，３表かられかるように、ｔｒｐプロモータ
ーおよびｔａｃプロモーターも“−３５″′領域中に、
Ｐ、プロモーター内の）（ｉｎｃＩ［部位と同じ位置に
、）ｌｉｎｃＩＩ部位を含む。

第２表ｐにＹＰＩＧのｔｒｐ１叶−ター領域の［ｌＮＡ
塩基配列第３表ＰＴＡ［：１０のｔａｃ　Ｉプロトター
領域の［］ＮＡ塩基配列よって、゛これらのＨｉｎｃｎ
部位を利用して、ＰｔプロモーターのＨｉ　ｎ　ｃ　１
１部位の上流の領域とｔｒｐあるいはｔａｃプロモータ
ーの）（ｉｎｃＩＩ部位の下流の領域とを組換えた新規
なプロモーターを造成することができる（第４，５表参
照）。

第４表　ｐＧＩＩＡ２の１８ｔ″ＪＯモーター領域（７
）ＤＮＡ　塩基配列第５表　ｐＬＩＥｃｌの１ｅｃｌプ
ロモーター領域のＤＮＡ塩基配列ｐｒｏｍｏｔｅｒ）プ
ロモーターと呼称する。ｌｅｔおよびｌｅｃプロモータ
ーは“′−３５”領域内の旧ｎｃ１１部位を利用して造
成されるものであるが、組換えた後も’−３５”領域の
塩基配列は全く変わらないため、元のプロモーターであ
るｔｒｐおよびｔａｃプロモーターの機能をそこなわず
に転写活性が強くなる可能性がある。事実、後で述べる
ように、ｌｅｔプロモーターは、ｔｒｐプロモーターの
約１０倍、ｌｅｃプロモーターはｔａｃプロモーターの
約２倍の転写活性を有する。ｔｒｐプロモーターもｔａ
ｃプロモーターもその５′フランキング領域にＡＴに富
んだ部位を含んでいるのにもかかわらず（第２．３表参
照）、この５′フランキング領域をＰｔプロモーターの
ものと置き換えることによって、ｔｒｐおよびｔａｃプ
ロモーターの転写活性が大きく上昇したことは、Ｐｔプ
ロモーターの５′フランキング領域のＡＴ含量以外に、
特殊な塩基配列が転写活性の強化に寄与していることを
示唆していると考えられる。

このように’−３５”領域の近傍あるいは上流の制限部
位を利用して、５′フランキング領域のみを置き換える
ことが可能であるが、このような置き換えは他の方法を
用いても実行できる。たとえば、ｔａＣプロモーターの
５′フランキング領域をＰｔプロモーターの該領域と置
き換える場合には、ｔａｃプロモーターの上流にある適
当な制限部位（たとえば、第５図に示したｐＴΔＣＩＯ
のＥｃｏＲ１部位）からＢＡＬ３１などのエキソヌクレ
アーゼによって、その５′フランキング領域を除去した
後に、Ｐｔプロモーターの５′フランキング領域を含む
ＤＮＡ断片を挿入すれば、目的のｌｅｃプロモータ一様
のプロモーターを造成することができる。また”−３５
”領域の上流の制限部位に、他のプロモーターの５′フ
ランキング領域あるいは化学合成したＡＴに富んだＤＮ
Ａ断片を挿入することによっても、転写活性が強化され
たプロモーターを造成することが可能である。

ＤＮＡ断片の化学合成はＭ、Ｉｔｏ　ら：　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１０．１７７５　（１９８２
）　に記載の方法に従って行う。

上記のプロモーターを運ぶ組換えプラスミド作成に必要
な反応の条件を一般的に述べると、ＤＮＡの制限酵素に
よる消化は通常０．１〜２０μｇのＤＮＡを２〜２００
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ６，０〜９．５、好ましく
は１０〜４０　ｍＭ、　ｐＨ７，０〜８．０＞、Ｏ〜２
００ｍＭのＮａＣＡ、２〜２０ｍＭのＭｇＣｌ１．（好
ましくは５〜１０ｍＭ）中で制限酵素０．１〜１００単
位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対し１〜３単位の酵素
）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素に
よって異なる）において、１５分〜２４時間消化反応を
行う。反応の停止は通常５５〜７５℃で５〜３０分間加
熱することによるが、フェノールあるいはジエチルピロ
カーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方
法も用いることができる。制限酵素消化によって生成し
たＤＮＡ断片を精製する必要がある場合、低融点アガロ
ースゲル電気泳動法　（Ｌ、Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ　：
　八ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ且
、３０５　（１９７９））やポリアクリルアミドゲル電
気泳動法（Ａ、Ｍ、　Ｍａｘａｍら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５６０　（１９
７７））などの方法によって精製できる。

ＤＮＡ断片同士を結合させる場合は２〜２００ｍＭのＴ
ｒ　ｉ　５−ＨＣｊｉ！　（ｐＨ６，０〜９．５、好ま
しくは１０〜４０ｍＭ、　ｐＨ７，０〜８．０）、２〜
２０ｍＭのＭ　ｇ　ＣＩｌ　２　（好ましくは５〜１０
ｍＭ）、０．１〜１０ｍＭのＡＴＰ（好ましくは０．５
〜２．０ｍＭ）、１〜５０ｍＭのジチオスレイトール（
好ましくは５〜１０ｍＭ）中でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．
３〜１０単位を用いて、１〜３７℃（好ましくは３〜２
０℃）で１５分〜７２時間（好ましくは２〜２０時間）
結合反応を行う。この結合反応によって生じた組換え体
プラスミドＤＮＡを大腸菌に導入する必要がある場合は
、Ｃｏｈｅｎらの形質転換法（Ｓ、Ｎ、　Ｃｏｈｅｎら
：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

［ＵＳＡ　６９．２１１０　（１９７２））などを用い
てプラスミドＤＮＡを導入できる。また、さらに組換え
体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡを単離す
る必要がある場合は、後に述べる実施例１に示した方法
あるいはＢｉｒｎｂｏｉｍらの方法［ｔｌ、ＣｏＢｉｒ
ｎｂｏｉｍら：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
７　。

１５１３　（１９７９））などを用いて該ＤＮＡを単離
できる。単離されたプラスミドＤＮＡの構造は次のよう
にして解析する。プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制
限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動あるいはポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により切断部位を調べる。

さらにＤＮＡの塩基配列を決定する必要があるときは、
マキサム−ギルバート法〔ＡｏＭ、　Ｍａｘａｍら：　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ユ４，５６０　（１９７７））によ
って決定する。

以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。

以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明する。

実施例１゜ ｌｅｔプロモーターの造成および該プロモーターによる
ヒ）ＩＦＮ−ｒ遺伝子の発現：参考例１で造成されたプ
ラスミドｐＰｔＴ４（Ｐ、プロモーターを運ぶ）と参考
例３で造成されたＩＦＮ−ｒ発現プラスミドＩ）ＧＫＡ
２を組換えて、ｌｅｔプロモーター（ｔｒｐプロモータ
ーの５′フランキング領域をＰｔ　プロモーターの該領
域と置き換えたプロモーター）の制御下でヒトＩＦＮ−
ｒを発現するプラスミドｐ　Ｃ１，、ＨＡ　２を以下の
ようにして碍だ（第１図参照）。

約１０μｇのＩ）ＰＬＴ４プラスミドＤＮＡ　（約４．
７キロベース・ペアーズ；以下、Ｋｂと略記する）を１
０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、５
０ｍＭ　ＮａＣｊｉ’、７ｍＭ　ＭｇＣＣおよび５ｍＭ
　２−メルカプトエタノールを含む緩衝液（以下“′Ｙ
−５０緩衝液′″と略称する）５０μβ中に溶かし、２
０単位の制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製、以下制限酵素
については特記しない限り全て宝酒造社製）を加え、３
７℃で１時間消化反応を行った。続いて、４単位のＨｉ
ｎｃＩＩを加え、さらに１時間反応を行った。この反応
により、ＤＮＡはｐｓｔｌで完全に、）ｌｉｎｅｌＩで
部分的に消化された。６５℃、１０分間の熱処理後、低
融点アガロースゲル電気泳動法（Ｌ、Ｗｉｅｓｌｅｎｄ
ｅｒ　：Ａｎｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　９８．３０５　（１９７９）　〕（以下、特記しな
い限りミＤＮＡ断片の精製法はこの方法を用いる）を用
い、アンピシリンく以下、＾ｐと略記する）耐性遺伝子
の一部と、Ｐｔプロモーターの５′フランキング領域を
含む、約０．８６ＫｂのＰｓｔＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片を
精製した。

次に、ｔｒｐプロモーターの制御下でヒ）　ＩＦＮ−１
遺転子を発現するｐＧＫＡ２プラスミド（約５、２　Ｋ
　ｂ　、参考例３を参照）約１０μｇを５０μｌのＹ−
５０緩衝液中で、２０単位のＰｓｔｒによって、３７℃
で１時間消化反応を行った。続いて、４単位のＨｉｎｃ
ｎを加え、さらに１時間反応を行った。この反応により
、ＤＮＡはＰＳｔＩで完全に、Ｈｉｎｃｎで部分的に消
化された。６５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロ
ースゲル電気泳動法を用い、ｔｒｐプロモーターの大部
分、ヒ）　ＩＦＮ遺伝子、およびＡｐ耐性遺伝子の一部
を含む、約４．２　Ｋ　ｂのＨｉｎｃｌＩ−ＰｓｔＩ断
片を精製した。

このようにして得られたｐＰＬＴ４由来のＰｓｔＩ−Ｈ
ｉｎｃｎ断片（約０．０５μｇ）とｐＧＫΔ２由来のＨ
ｉｎｃｎ−’ＰｓｔＩ断片（約０．０５μｇ）を、２０
ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，６）、１０
ｍＭ　ＭｇＣＬ　、１０ｍＭジチオスレイトールおよび
０．５ｍＭ　ＡＴＰを含む緩衝液（以下、この緩衝液を
”Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液″′と略称とする）１０μ
β中、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下
同じ）により、４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プフラスミドＤＮＡで
大腸菌８８１０１株ＣＦ”　ｈｓｄ　Ｒｈｓｄ　Ｍｐｒ
ｏ　Ｉｅｕ　ｔｈｉ　ｒｐｓＬ　ｒｅｃＡ、Ｂｏｌｉｖ
ｅｒら、Ｇｅｎｅ２７５　（１９７７））をＣｏｈｅｎ
らの方法［：Ｓ、　Ｎ。

Ｃｏｈｅｎ　ら　：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６　９　。

２１１０　（１９７２＞：ｌ　（以下、大腸菌の形質転
換法はこの方法を用いる）によって形質転換し、Ａｐ耐
性株を得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを以
下に示す方法を用い単離した。

形質転換株を５０Ｍｇ　／ｍｌのアンピシリンを含む３
ｍｌのＬＧ培地〔バクトドリプトン１．０％、酵母エキ
ス０．５％、ＮａＣｊ？　０．５％、グルコース０．１
％、ｐＨ７，２）に接種し、３０℃で１５〜１８時間培
養した。培養液を１０，０００ｒｐｍ、　５分間遠心し
て集菌し、菌体を４００μｉの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−
Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝
液に懸濁し、ドライアイス・エタノール中で凍結させた
。２０℃で融解後、４０μ２の２．５ＭＫＣｌと４０μ
βの５ｍｇ／＋ｍｌリゾチーム（上記の緩衝液に懸濁）
を加え、水中で１５分間放置した。

上述の方法で凍結・融解を行った後、１５．００Ｏｒｐ
ｍ。

２０分間遠心し、上清を採取した。この上清をフェノー
ルとクロロホルムの混合液で抽出した後、２倍量のエタ
ノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。

生じたＤＮＡ断片を遠心で集め、５０Ｍｇ　／ｍｌのＲ
ＮａｓｅＡ　（Ｓ　ｉｇｍａ社製）を含む５０〜１００
μｌの１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ’　（ｐＨ７，
５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡに懸濁することにより、プラス
ミドＤＮＡの部分精製物が調製されたく以下、プラスミ
ドＤＮＡ単離法はこの方法を用いる）。

単離されたプラスミドＤ　Ｎ　、Ａの構造解析を行った
ところ、ＩＧＨＡ２株が持つプラスミドｐＧＨＡ２が目
的の構造を有することを確認した。

このｐＧＨΔ２においては、ｔｒｐプロモーターの５′
フランキング領域をＰＬプロモーターの該領域に置き換
えることによって造成されたｌｅｔプロモーターの下流
にヒ）ＩＦＮ−ｒ遺伝子が連結されている。なお、ｔｒ
ｐＬ遺伝子由来のシャインーダルガーノ配列（Ｓｈｉｎ
ｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列；以下、ＳＤ配列と略記する
）とＩＦＮ−γ遺伝子のΔＴＧ開始コドンの間の塩基配
列はｐＧＫΔ２と同じである（Ｍ並ＧＴＡＴＣＧＡＴＡ
ＡＧＣＴＴＡＴＧ　）。

第４表に造成された新規プロモーターであるｌｅｔプロ
モーターの塩基配列を示す。第４表に示すように、この
ｌｅｔブ０％−ターは、ＥｃｏＲＩ　（またはＸｈｏＩ
またはＢｇｌ■）およびＣ１ａＩ（またはＨｉｎｄＩＩ
Ｉ）で切り出されるポータプルプロモーターの形を有し
ている。

次に組換え体プラスミドｐＧＫΔ２を持つ大腸菌８８１
０１株（ＩＧＫΔ２株）とｐＧＨＡ２を持つ大腸菌ＪＡ
２２１株（ＩＣ；ＨΔ２株）のインターフェロン生産性
を以下の方法で調べた。

上記の菌株を１０ｍ１のＭＣＧ培地（Ｎａ２８ＰＯ４０
，６％、Ｋ　Ｈ２Ｐ　０４０．３％、Ｎ　ａ　ＣＩｌ　
０．５　％、ＮＨ，Ｃｊ！０．１％、ｙルコ−ス０．５
％、カサミノ酸０．５％、ＭｇＳＯ４１ｍＭ、サイアミ
ン塩酸塩４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７，２）に１白金耳植菌し
、３０℃で１５〜１８時間培養した。培養液ヲ８．００
Ｏｒｐｍ。

１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ　ＮａＣｌ１゜３０
ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ　（ｐＨ７，５）を含む
緩衝液で洗浄した。洗浄菌体を６７５μｌのＰＢＳ緩衝
液〔０，８％ＮａＣ１１，０，０２％ＫＣＡ、０．１１
５％Ｎ　ａ２ＨＰ　０４　、ｏ、　０２％に８２ＰＯ，
（ｐＨ７、４）　）に懸濁し、２５μｌのＯ，，２５Ｍ
　ＥＤＴＡと１０（ＩｕＡの１０ｍｇ／ｍｌシーチー４
　（蒸留水に溶解）を加え、０℃に３０分間放置した。

次に、５ＭＮａＣＪ！−５％ポリエチレングリコール＃
１０００を２００μｌ加え、凍結、融解を３回繰り返し
て菌体を破砕した。これを１５，０００ｒｐｍ　、　３
０分間遠心し、上清を採取した。上清中のインターフェ
ロンの量をアームストロングの方法ＣＪ、Ａ。

Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　；Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、　２１，７２３−７２５　（１９７１）　）に従って
定量した。ただし、ウィルスとしては５ｉｎｄｖｉｓ　
ｖｉｒｕｓ　、動物細胞としてはヒト羊膜細胞由来のエ
フエル・セル（ＦＬ　ｃｅｌｌ　）　’ｌｒ用いた。

インターフェロン活性の測定の結果、ｔｒｐプロモータ
ーの制御下でＩＦＮ−ｒ遺伝子が発現されるｐＧＫＡ２
プラスミドを持つＩＧＫＡ２株は約５Ｘ１０’車位／Ａ
、ｌｅｔプロモーターの制御下でＩＦＮ−ｒ遺伝子が発
現されるｐＧＨＡ２プラスミドを持つＩＧＨＡ２株は約
５Ｘ１０７単位／１のインターフェロンを生産すること
が判明した。プラスミドｐＧＫＡ２とｐＧＨＡ２はプロ
モータ一部分以外、全く同一の構造を有することを考え
合わせると、ｔｒｐプロモーターの５′フランキング領
域をＰＬプロモーターの該領域で置き換えたｌｅｔプロ
モーターはｔｒｐプロモーターの約１０倍の転写活性を
持つことが示された。また、このことはプロモーターの
５′フランキング領域がその転写活性に非常に大きな影
響を及ぼすことを示す。

ｐＧＫＡ２およびｐＧＨＡ２を含む大腸菌菌株は、工業
技術院微生物工業技術研究所（微工研）にＢｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ　ＧＫＡ　２　（ＦＥＲＭ　
Ｐ−６７９８）およびＩＧＨＡ２　（ＦＢＲＭＢＰ−４
００）として寄託されている。

実施例２゜ ＩｅｃＩプロモーターの造成： 参考例Ｉで造成されたプラスミドｐＰｔ’ｒ４（ＰＬプ
ロモーターを運ぶ）と参考例２で造成されたプラスミド
ｐ’ｒΔＣｌ０（ｔａｃｌプロモーターを運ぶ）を組換
えて、ｔａｃ　Ｉプロモーターの５′フランキング領域
が置き換えられたプロモーター（１ｅｃＩプロモーター
）を運ぶプラスミドｐＬＥｃ１を以下のようにして造成
した（第２図参照）。

ｔａｃｌプＣ１％−クーを運ぶｐＬＥｃ１プラスミド（
約２．６　Ｋ　ｂ　、参考例２を参照）約５μｇを５０
μβのＹ−５０緩衝液中で、１０単位のＰｓｔＩと１０
単位の）ｌｊｎｃｌｌによって、３７℃で２時間消化反
応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガ
ロースゲル電気泳動法を用い、ｔａＣＩプロモーターの
大部分、およびＡｐ耐性遺伝子の一部を含む、約１．６
　Ｋ　ｂの）（ｉｎｃＩＩ−Ｐｓｔｌ断片を精製した。

このようにして（尋られたｐＴＡＣ１０由来のＨｉｎｃ
ｎ−ＰｓｔＩ断片（約０．０５μｇ）と実施例１で精製
したｐＰＬＴ４由来のＰｓｔｌ−ＨｉｎｃＩＩ断片（約
０．０５μｇ）を、１０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝
液中、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにより、４℃で１８
時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡで大
腸菌ＪＡ２２１株ＣＦ−ｈ　ｓ　ｄ　Ｒ−ｈｓｄＭ＋　
ｔｒｐＥ５　１ｅｕ　１ａｃＹｒｅｃＡ１／Ｆ’　Ｉａ
ｃＩｑ　Ｉａｃ”　ｐｒｏ”　〕［：ＦＥＲＭ　ＢＰ−
４０５）を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形質転
換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、その構造解析を行
ったところ、Ｉ　ＬＥＣ１株が持つプラスミドｐＬＥｃ
１が目的の構造を有することを確認した。

このｐＬＥｃｌが持つＩｅｃｌプロモーターは、ｔａＣ
Ｉプロモーターの５′フランキング領域がＰ、プロモー
ターの該領域で置き換えられたプロモーターであり、第
５表に、その塩基配列を示す。

この１ｅｃＩプロモーターは、１ａｃＺ遺伝子由来のＳ
Ｄ配列の５塩基対（ｂａｓｅ　ｐａｉｒｓ　；以下ｂｐ
と略記する）下流にＰｖｕ１１部位を有しており、この
ＰｖｕｌＩ部位を利用すると、外来遺伝子の挿入および
ＳＤ配列とΔＴＧ開始コドン間の距離の調節が容易にで
きる。

ｐＬＥｃｌを含む大腸菌菌株は、微工研にＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉｌＬＥＣｌ　（ＦＥＲＭ　ＢＰ　−
４０１）として寄託されている。

実施例３． １ｅｃＩプロモーターによるヒトＩＦＮ−ｒ遺伝子の発
現； 参考例２で造成されたプラスミドｐＴＡＣ１０（ｔａｃ
ｌプロモーターを運ぶ）と参考例４て造成されたＩＦＮ
−ｒ発現プラスミドｐＧＴＣ３を組換えて、１ｅｃＩプ
ロモーター（ｔａｃＩプロモーターの５′フランキング
領域をＰＬプロモーターの該領域と置き換えたプロモー
ター）の制御下でヒトＩ　ＦＮ−ｒを発現するプラスミ
ドｐＧＨＢ３を以下のようにして得た（第３図参照）。

ｔａｃＩプロモーターの制御下でヒトＩＦＮ−Ｔ遺伝子
を発現するｐＧＴＣ３プラスミド（約５、ｌ　５Ｋｂ、
参考例４を参照）約１０μｇを５０μβのＹ−５０緩衝
液中で、２０単位のＰｓｔＩによって、３７℃で１時間
消化反応を行った。続いて、４単位のＨｉｎｃｎを加え
、さらに１時間で完全に、ＨｉｎｃＩＩで部分的に消化
された。

６５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電
気泳動法を用い、ｔａｃＩプロモーターの大部分、ヒ）
ＩＦＮ遺伝子、リポプロティン遺伝子の転写終結部位（
以下、ｌｐｐクーミネークーと略記する）、およびＡｐ
耐性遺伝子の一部を含む、約４．２　Ｋ　ｂのＨｉｎｃ
Ｉ［−ＰｓｔＩ断片を精製した。

このようにして（尋られたｐＧＴＣ３由来のＨｉｎｃＩ
［−ＰｓｔＩ断片（約０．０５μｇ）と実施例１で精製
したｐＰＬＴ４由来のＰｓｔＩ−Ｈｉｎｃｎ断片（約０
．０５μｇ）を、１０μβのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
中、１単位のＴ　４　ＤＮＡリガーゼにより、４℃で１
８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡで大
腸菌ＪＡ２２１株を形質転換し、Δｐ耐性株を得た。こ
の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、その構造
解析を行ったところ、１０８８３株が持つプラスミドｐ
ＧＨＢ３が目的の構造を有することを確認した。

このｐＧＨＢ３においては、ｔａｃ　Ｉプロモーターの
５′フランキング領域がＰ、プロモーターたＩｅｃｌプ
ロモーターの下流にヒトＩＦＮ−ｒ遺伝子が連結されて
いる。なお、１ａｃＺ遺伝子由来のＳＤ配列とＩＦＮ−
７−遺伝子のＡＴＧ開始コドンの間の塩基配列はｐＧＴ
Ｃ３と同じである（Ａμ但ＡＡＡＣＡＧ八へＣＴＴ匹）
　。

次に、組換え体プラスミドｐＧＴＣ３を持つ大腸菌ＪＡ
２２１株（ＩＧＴＣ３株）とｐＧＨＢ３を持つ大腸菌Ｊ
Ａ２２１株（ＩＧＨＢ３株）のインターフェロン生産性
を以下の方法で調べた。

上記の菌株を５ｍｌのＬＧ培地〔バクトドリプトン１％
、酵母エキス０．５％、ＮａＣβ　０．５％。

グルコース０．１％、ｐＨ７，２：］に接種し、−晩培
養した。この培養液を０．５ｍｌだけ、ｌ　Ｑｍｌのト
リプトファンを添加したＭＣＧ培地〔５０μｇ　／ｍＩ
のトリプトファンを含む〕に接種し、３０℃で培養した
。０Ｄｓｓｏが約１．０になったときに、１ｍＭイソプ
ロピルβ−Ｄ−チオガラクトサイド（ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ　β−Ｄ　−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ　；以
下、ＩＰＴＧと略記する）を添加し、さらに約４時間培
養を続け、集菌した。この菌体中のインターフェロン活
性は実施例１に示した方法に従い決定した。

インターフェロン活性の測定の結果、ｔａＣＩプロモー
ターの制御下でＩＦＮ−ｒ遺伝子が発現されるｐＧＴＣ
３プラスミドを持つＩＧＴＣａ株は約２Ｘ１０７単位／
β、Ｉｅｃｌプロモーター制御下でＩＦＮ−ｒ遺伝子が
発現されるｐＧＨＢ３プラスミドを持つ１０８８３株は
約４Ｘ１０’単位／ｌのインターフェロンを生産するこ
とが判明した。プラスミドｐｃ’ｒｃ３とｐＧＨＢ３は
プロモータ一部分以外、全く同一の構造を有することを
考え合わせると、ｔａｃ　Ｉプロモーターの５′フラン
キング領域をＰ、プロモーターの該領域で置き換えた１
ｅｃｌプロモーターはｔａｃＩプロモーターの約２倍の
転写活性を持つことが示された。また、このことは、実
施例１でも示したように、プロモーターの５′フランキ
ング領域がその転写活性に影響を及ぼすという結果を支
持する。

ｐＧＴＣ３およびｐＧＨＢ３を含む大腸菌菌株は、微工
研にＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ　Ｇ　Ｔ　
Ｃ３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４０２）およびＩＧＨＢ３（Ｆ
Ｆ、ＲＭ　ＢＰ−４０３）として寄託されている。

参考例１゜ ＰＬ　−Ｐｔｒｐ　２連結プモロークーを持つプラスミ
ドベクターｐＰｔＴ４の造成（第４図参照）：（ａ）Ｐ
Ｒ−Ｐｔ　−Ｐｔｒｐ　３連結プロモーターを持つｐＰ
ｔＴ２の造成： ＰＬ　プロモーターの供給源として、２フアージ由来の
ＤＮＡ断片がクローン化されたプラスミドｐＭＹ１２−
６を用いた。このｐＭＹｌｌ−６は、第４図に示すよう
に、ｃｌ遺伝子とＰＲプロモーターとｃＩＩ遺伝子の一
部を含むλフアージ由来のＤＮＡ断片とＰｔプロモータ
ーを含むλフアージ由来のＤＮＡ断片がプラスミドｐＢ
Ｒ３２２ｃＦ。

Ｂｏｌｉｖａｒら：Ｃ，ｅｎｅ２９５　（１９７７））
のＰｓｔ１部位とＢａｍＨＩ部位の間に挿入された構造
を有する。さらに詳しくは、Ｓａｎｇｅｒらが決定した
λファージの全ＤＮＡ塩基配列の番号づけに従えば［Ｆ
、　Ｓａｎｇｅｒら：　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１
６２．７２９（１９８２）　〕、　３７，００５〜３８
．１０３塩基のＰｓｔｌ−ＢｇＡＩＩ断片（ｃＩ遺伝子
、ＰＲプロモーターとＣ■遺伝子の一部を含む）と３５
．４６８〜３５．７１６塩基のＨａｅＩＩＩ−Ｂｇｊｉ
！ＩＩ断片（ＰＬプロモーターを含む）とを連結するこ
とによって生じたｐｓｔＩ末端とＨａ　ｅＩＩ［末端を
持つ１．３５０ｂｐのＤＮＡＤＮＡポリメラーゼ■によ
って修復されたＢａｍ８１部位の間に挿入された構造を
有する。なお、このｐＭＹｌ２−６の中のｃｌ遺伝子は
ｃＩ８５７という変異を持っているため、温度感受性を
示す。

ｐＭＹｌ、ｉ、６プラスミドＤＮＡ　（約４．６　Ｋ　
ｂ　）約４μｇを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｌ　（ｐ
Ｈ７，５）、１００ｍＭ　ＮａＣＪ！、７ｍＭ　ＭｇＣ
１！２および６ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む
緩衝液（以下“Ｙ−１００緩衝液″と略称する）４０μ
！中に溶かし、８単位の制限酵素ＢａｍＨＩを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。

続いて、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノー
ル沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量４０μｌの５０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）、７ｍＭＭｇＣｆ１２
．６ｍＭ　２−メルカプトエタノールぺ０．２５ｍＭ　
ｄＡＴＰ、０．２５ｒｎＭ　ｄＣＴＰ。

０．２５ｍＭ　ｄＧＴＰおよび０．２５ｍＭ　ｄＴＴＰ
を含む緩衝液（以下“ＤＮＡポリメラーゼ■緩衝液”と
略称する）に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断片（ペセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−社製、以下同じ）を加え、１５℃で２時間反応さ
せ、ＢａｍＨＩ消化によって生じた５′−突出末端を平
坦末端に変えた。反応をとエタノール沈殿の後、ＤＮＡ
断片を全量４０μｌのＹ−５０緩衝液にとかし、８単位
のＰｓｔｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電
気泳動法を用い、ｃｌ遺伝子、ＰＲおよびＰｔプロモー
ターを含む約１．３５　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を精製した
。

次にｔｒｐポータプル・プロモーターを持つｐＫＹＰ　
１００プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（Ｔ、　Ｎ１５ｈｉ　ら
：ＤＮＡ２，２６５〜２７３（１９８３）’）ｌ約５μ
ｇを４０μｌのＹ−１００緩衝液中で１０単位のＸｈｏ
ｌによって、３７℃で２時間消化した。続いて、フェノ
ールおよびクロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、Ｄ
ＮＡ断片を全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼ■緩衝液
に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（−［１
ｅｎｏｗ断片を加え、１５℃で２時間反応させ、Ｘｈｏ
Ｉ消化によって生じた５′−突出末端を平坦末端に変え
た。

反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出
とエタノール沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量４０μｍのＹ
−５０緩衝液に溶かし、１０単位のＰＳｔｌを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、低融点アガロースゲル電気泳動法を用い、ｔｒ
ｐプロモーターを含む大きい方のプラスミドＤＮＡ断片
（約３．７Ｋｂ）を精製した。

このようにして得たｐＫＹ１２−６由来の約１．３５Ｋ
ｂのＤＮＡ断片（約０．１μｇ）とｐＫＹＰ１００由来
の約３．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を、Ｔ　４　ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液２０μβ中、２単位の７４ＤＮＡリガーゼ
により、４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡで大
腸菌ＭＰ３４７株（Ｆ−１ａｃＺａｍＹ１４　↓工上ａ
ｍ　３　ヱ旦ユ　ｓｔｒΔ（Ａ上ユ庶２５２　至■８５
７　△Ｈユ））（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４０８＞をＣｏｈｅ
ｎらの方法によって形質転換し、テトラサイクリン（Ｔ
ｃ）耐性株を得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮ
Ａを単離し、その構造解析を行ったところ、ＩＰ、Ｔ２
株が持つプラスミドｐＰｔＴ２が目的の構造を有するこ
とを確認した。

ｐＭＹ１２−６およびｐＰｔＴ２を含む大腸菌菌株は、
それぞれＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ　ＭＹ
　１２２−６（ＦＥＲＢＰ−４０９）、Ｂｓｃｈｅｒｉ
−ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＰＬ　Ｔ２　（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ　−’４０７）として微工研に寄託されている。

（ｂ）ＰＬ　Ｐｔｒｐ　２連結プ０％−ターを持つプラ
スミドベクターｐＰＬＴ４の造成： Ｐａ　Ｐｔ　Ｐｔｒｐ３連結プロモーターからＰＲプロ
モーターおよびｃ■遺伝子の一部を除去することによっ
て生ずるＰＬ　−Ｐｔｒｐ　２連結プロモーターを、ア
ンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子およびＴｃ耐性遺伝子を
有するプラスミドに、両方の耐性が失われない部位に挿
入したプラスミド発現ベクター１）ＰＬＴ４を以下の手
順で造成した。

約５μｇのＩ）ＰＬＴ２プラスミドＤＮＡを５０μβの
Ｙ−１００緩衝液中で１０単位のＢｇＡｎによって、３
７℃で２時間消化反応を行なった。

続いて、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノー
ル沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量４０μｌのＤＮＡポリメ
ラーゼ■緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片を加え、１５℃で２時間反
応させ、ＢｇｌｌＴｌ消化によって生じた５′−突出末
端を平坦末端に変えた。

反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出
とエタノール沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量４０μ矛のＹ
−１００緩衝液に溶かし、１０単位のＢａｍＨＩを加え
、３７℃で２時間消化反応を行なった。６５℃、１０分
間の熱処理後、低融点連結プロモーターを含む約０．７
ＫｂのプラスミドＩ）ＮＡ断片を精製した。次に約５μ
ｇのｐＫＹＰ１００プラスミドＤＮＡを５０μβのＹ−
１００緩衝液中で１０単位のＸｈＯＩによって、３７℃
で２時間消化反応を行なった。続いて、フェノールおよ
びクロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、ＤＮＡ断片
を全量４０μβのＤＮＡポリメラーゼ■緩衝液に溶解し
、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ
断片を加え、１５℃で２時間反応させ、ＸｈｏＩ消化に
よって生じた５′−突出末端を平坦末端に変えた。反応
をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエ
タノール沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量４０μｌのＹ〜１
００緩衝液に溶かし、１０単位のＢａｍＨＩを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、低融点アガロースゲル電気泳動法を用い、大き
い方のプラスミドＤＮＡ断片（約４、　ＯＫ　ｂ　）を
精製した。このようにして得たｐ　Ｐ　ＬＴ２由来の約
０．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片（約０．０５μｇ）とｐＫ
ＹＰｌ　００由来の約４．ＱＫｂＯ）ＤＮＡｉｌｉ片（
０，１μｇ）を２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衡旅中
、２単位のＴ４ＤＮΔリガーゼにより４℃で１８時間結
合反応を行った。

ＤＮＡで大腸菌ＭＰ３４７株を形質転換し、Ａｐ耐性株
を得た。この中からＴｃ耐性株を選び、プラスミドＤＮ
Ａを単離し、その構造解析を行ったところ、ＩＰＬＴｄ
株が持つプラスミドｐＰｔＴ４が目的の構造を有するこ
とを確認した。

尚、ｐＰＬＴ４を含む大腸菌株はＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ　ＩＰＬＴ４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４０６＞と
して微工研に寄託さている。

参考例２゜ ｔａｃＩプＣ１％−クーを運ぶｐＴＡＣＩＯプラスミド
の造成： （ａ）　ｔ　ｒ　ｐプロモーターの“−３５″領域のみ
を含むＤＮＡ断片を運ぶｐＫＹＰ６およびｐ’ＫＹＰ３
０の造成： 大腸菌ｔｒｐオペロンの一部を運ぶｐＫＹＰｌプラスミ
ド（特開昭５６−２１３１９３）とｐＢＲ３２５プラス
ミドから、特開昭５６−２１３１９３の実施例１の（ｂ
）に示した方法とほぼ同じ手法により、ｔｒｐプロモー
ターの”−３５″”領域のみを含むＤＮＡ断片を運ぶｐ
ＫＹＰ６プラスミド（約７、３５　Ｋ　ｂ　）を造成し
た。このｐＫＹＰ６プラスミドは、ｔｒｐプロモーター
の“’−３５”領域のみを含むｐＫＹＰ　１由来のＥｃ
ｏＲＩ−Ｔａｑ　ｌＤＮＡ断片（約２．５　Ｋ　ｂ　）
がｐ、ＢＲ３２５プラスミドのＥｃｏＲＩ部位とＣｌａ
ｌ部位の間に挿入された形の構造を有する（第５図参照
）。

次に、約１０μｇのｐＫＹＰ６プラスミドＤＮＡを５０
μｌのＹ−５０緩衝液中、２０単位のＰｖｕｌｌと２０
単位の）ｌｉｎｄＩ［を加え、３７℃で２時間消化反応
を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロ
ースゲル電気泳動法を用い、ｔｒｐプロモーターの″−
３５″領域を含むＤＮＡ断片（約２４０　ｂｐ）を精製
した。

次に、約５μｇのｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを５０
μｌのＹ−１００緩衝液中に溶かし、１０単位のＥｃｏ
ＲＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。続いて
、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール沈殿
の後、ＤＮＡ断片を全量４０μｍのＤＮＡポリメラーゼ
■緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
■・ＫｌｅｎｏｗｌＤＮＡ断片５℃で２時間反応させ、
ＥＣ０ＲＩ消化によって生じた５′−突出末端を平坦末
端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロ
ロホルム抽出とエタノール沈殿の後、ＤＮＡ断片を５０
μｌのＹ−５０緩衝液１ヒ溶かし、１０単位の）（ｉｎ
ｄＩ［を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５
℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電気泳
動法を用い、大きい方のプラスミドＤＮＡ断片（約４．
３　Ｋ　ｂ　＞を精製した。

このようにして得られたｐＫＹＰ６由来の約２４０ｂｐ
のＤＮＡ断片（約０．０２μｇ）、ｐＢＲ３２２由来の
約４．３　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片（約０．１μｇ）および
２ピコモルの５′リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカ−（
ＧＧＡＡＴＴＣＣ；コラボレイティブ・リサーチ社製）
を２０μβのＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ緩衝液中、２
単位のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼにより４℃で１８時間結合
反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡで大
腸菌に２９４株［：Ｆ−ｈｓｄＲ−ｈｓｄＭ”　ｅｎｄ
ｏＩ−ｔｈｉ）［ＡＴＣＣ３１４４６゜Ｋ、　Ｂａｃｋ
ｍａｎら：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、、　ＵＳＡ　７３４１７４　（１９７６）　）を形
質転換し、Ａｐ耐性株を得た。

この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、その構
造解析を行ったところ、Ｉ　ＫＹＰ　３０株が持つプラ
スミドｐＫＹＰ３０が目的の構造を有することを確認し
たく第５図参照）。

（ｂ）　ｔ　ａ　ｃ　Ｉプロモーターを運ぶｐＴＡｃ１
０プラスミドの造成：　− ｔａｃ　Ｉプロモーターの構成成分であるｌａｃプロモ
ーターの“−１０”領域とｌａｃオペレーターの供給源
としてｐＬＡｃ１プラスミドを用いた。このｐＬＡｃ１
プラスミドは、１ａｃＵＶ５プロモーターを含む９５ｂ
ｐのＡｌｕｌ−Ａｌｕｌ断片がｐＢＲ３２２プラスミド
のＥｃｏＲＩ部位とＰｖｕｎ部位に挿入された形の構造
を有する（第５図参照）。Ａｌｕｌ末端とＰｖｕ　Ｕ末
端の再結合は、生じる塩基配列がＣＡＧＣＴＧとなるた
め、Ｐｖｕｎで再切断されうる。ｌａｃプロモーターの
上流には、ＢａｍＨ１リンカ−に由来するＢａｍ８１部
位が存在する（第５図参照）。１ａｃＬＩＶ５プロモー
ターに関しては、文献Ｂ、ｓ。

Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ　ら：“Ｔｈｅ　ｏｐｅｒｏｎ　”
　、　Ｊ、　ｔ（６ＭｉｌｌｅｒとＩＩｌ、Ｓ、Ｒｅｚ
ｎｊｋｏｌｌ　ｌｔＡ集、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ、　１９７Ｂ、　ｐ２２１）を参照。

約１０μｇのｐＬＡｃ１プラスミドＤＮＡを１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＮａＣｊ！
、７ｍＭ　ＭｇＣＬおよび６ｍＭ　２−メルカプトエタ
ノールを含む緩衝液（以下“Ｙ−１０緩衝液”と略称す
る）５０μβ中に溶かし、２０単位のＨｐａｌＩと２０
単位のＰｖｕｌｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。６５℃、１０分間の熱処理後、ｌａｃプロモータ
ーの“−１０”領域、ｌａｃオペレーター＄よび１ａｃ
ＺのＳＤ配列を含むＨｐａＩＩ−ＰｖｕＩ［ＤＮＡ断片
（５５ｂｐ）を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（
Ａ、　ＭｏＭａｘａｍら：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．　Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ７４、５６０　（１９７７）
）を用い精製した。

次に、参考例２の（ａ）で造成したｐＫＹＰ、３０プラ
スミド約５μｇを５０μｌのＹ−５０緩衝液中に溶かし
、１０単位のＣ１ａｌ　（ベーリンガー・マンハイム社
製、以下同じ）１０単位のｐｖｕｎおよび１５単位のＢ
ａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６
５℃、１０分間の熱処理後、ｔｒｐプロモーターの“−
３５″領域とＡｐ耐性遺伝子とを含む約２．６　Ｋ　ｂ
のＤＮＡ断片を低融点アガロースゲル電気泳動法を用い
精製した。

このようにして（尋られたｐＬＡｃ１由来の５５ｂｐの
ＤＮＡ断片（約１０ｎｇ）とｐＫＹＰ３０由来の約２．
６ＫｂのＤＮＡ断片（約５０ｎｇ）を２０μｌのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液中、２単位のＴ　４　ＤＮＡ　’）
ガーゼにより４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡで大
腸菌ＪＡ２２１株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。こ
の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、その構造
解析を行ったところ、ＩＴＡＣＩＯ株の持つプラスミド
ｐＴＡｃ１０が目的の構、造を有することを確認したく
第５図参照）。

組換え体プラスミドｐＴＡｃ１０を含む大腸菌菌株は、
微工研にＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ　ＧＴ
　Ｃ３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４０２）として寄託されてい
る。

参考例３゜ ヒ）ＩＦＮ−ｒを発現する組換え体プラスミドｐＧＫＡ
２の造成： 以下、プラスミド造成過程は第６図を参照のこと。

（ａ）発現ベクターｐＫＹＰ１１へのヒトＩＦＮ−ｒＤ
ＮＡの組み込みニ プラスミドｐ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　ｒ　−Ｇ　４　（ＡＴＣＣ
３９１２３から前述のプラスミド単離方法で採取した）
６μｇを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５
）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊＬ　、１０ｍＭジチオスレイト
ールおよび５０ｍＭ　ＮａＣｊ！を含む全量５０μβの
溶液に溶かし、制限酵素Ｐｖｕｌｌ　１２単位と旧ｎｄ
Ｉｎ１２単位を加え、３７℃で４時間消化反応を行った
。反応液を６５℃、７分間加熱処理して酵素を失活させ
、低融点アガロースゲル電気泳動法にて精製し、１．３
ＫｂのヒトＩＦＮ−γＤＮＡを含むＤＮＡ断片１．２μ
ｇを得た。

別にｐＫＹＰ　１１の４μｇをＩ２０ｍＭ　Ｔｒｌｓ−
Ｈ（１（ｐＨ７，５）、１０ｍ１　ＭｇＣｆ１２゜１０
ｍＭジチオスレイトールおよび５０ｍＭＮａＣｌ１を含
む全量４０μｌの溶液に溶かし、ＢａｍＨＩを３単位加
え、３７℃で３時間消化反応を行った。反応液を６５℃
、５分間加熱して酵素を失活させた。これにｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各々３０μＭになるように加え、
さらに８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１　（Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片、　Ｎｅｗ　Ｂｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ
ｓ社製。

１μｌ）を加えて１５℃で１時間埋め込み（ｆｉｌｌｉ
ｎ）反応させた。ＤＮＡポリメラーゼ■を失活させるた
め６８℃で１５分間加熱処理後、ＨｉｎｄＩＴＩＩＯ単
位を加え３７℃でさらに３時間消化反応してから、再び
６５℃で５分間加熱し、Ｈｉｎｄ■を失活させた。

このようにして得たプラスミドｐＫＹＰ１１の消化反応
液より低融点アガロースゲル電気泳動法にて精製し、Ｐ
ｔｒｐを含む約４．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片約２．５μ
ｇを得た。

ヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡを含むＤＮＡ断片（１，３Ｋｂ）
０．５μｇとプラスミドｐＫＹＰ１’ｌより得たＰｔｒ
ｐを含む約４．７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片１．０　μｇを
２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）。

６ｍＭ　ＭｇＣｆ１２．５ｍＭジチオスレイトールおよ
び５００μＭ　ＡＴＰを含む溶液２０μｍに溶かし、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ社製）４単位を加え、４℃で１８時間結合反応を
行った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて
常法通り大腸菌８８１０１株を形質転換し、Ａ　ｐ　１
１のコロニーを得た。このコロニーの培養液よりプラス
ミドを分離し、第６図に示したｐＧＣ７を得た。ｐＧＣ
７の構造は、ＨｉｎｄｌＩＩ。

ＢａｍＨＩ、Ｈｐａｌ、５ａｊ）Ｉ、ＥｃｏＲＩおよび
Ｃｊ！ａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により確
認した。ｐＧＣ７を含む大腸菌菌株は微工研にＢｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ　Ｇ　Ｃ７（Ｆ　Ｅ　Ｒ
ＭＰ−６８１４）として寄託されている。

（ｂ）組換え体プラスミドｐＧＫＡ２の造成：参考例３
（ａ）で得られたｐＧＣ７ＤＮＡ　６μｇを２ＱｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　Ｍｇ
ＣＣ，１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭ　Ｎ
ａＣｊ！を含む全量５０μｌの溶液に溶かし、制限酵素
Ｂ　ｓ　ｔ　Ｎ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｂｎｇ１ａｎｄＢｉｏ
１ａｂｓｎ製１ａｎｄＢｉｏえ、６０℃で３時間反応さ
せた後、６５℃で５分間加熱してＢｓｔＮＩを失活させ
た。次いでＮａＣ，１！を１５０ｍＭとなるように加え
、５ａｊｌ！１８単位を加えて３７℃でさらに３時間消
化反応を行った。再び６５℃で５分間加熱して５ａ１１
を失活させ、低融点アガロースゲル電気泳動法にて精製
し、ヒトＩＦＮ−ＴＤＮＡの大部分を含む約１１２５ｂ
ｐのＤＮＡ断片約０．８μｇを得た。

別にｐＫＹＰｌ　０の３μｇを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＪ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣＬ　。

１０ｍＭジチオスレイトールおよび１００ｍＭＮａＣβ
を含む全量４０μｌの溶液に溶かし、制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩ［とＳａｄ　Ｉを各々６単位ずつ加え、３７℃で３
時間消化反応を行った。６５℃で５分間加熱してＨｉｎ
ｄＩＩＩとＳａｄ　Ｉを失活させた。この消化反応液を
低融点アガロースゲル電気泳動法にて精製し、Ｐｔｒｐ
を含む約４．　Ｉ　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを
得た。

一方、成熟ヒ）ＩＦＮ−ｒポリペプチドのＮ末端はＣｙ
ｓであるので、成熟ＩＦＮ−ｒＤＮＡを発現させるため
には、５′末端のＴＧＴ　（Ｃｙｓ）の直前に開始コド
ン（ＡＴＣ；）を付与する必要があること、またｐｔ　
ｒｐの下流のＳＤ−配列とＡＴＧとの距離は、６〜１８
ｂｐの間の適当な長さが必要であることなどの理由から
、下記のＤＮＡリンカ−を合成した。

まず、１本鎖ＤＮＡ、　ｌ　３−ｍａｒと１５−ｍａｒ
を通常のトリエステル法［Ｒ，Ｃｒｅａ　ら：　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７５．５７６５　（１９７Ｂ
）　）により合成した。

１８−ｍｅｒおよび１５−ｍｅｒの各々２μｇを５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ２　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭ
ｇＣＬ　、５ｍＭジチオスレイトール、Ｏ，１ｍＭＥＤ
ＴＡおよび１ｍＭ　ＡＴＰを含む全量２０ｐｆｌの溶液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）を加えて、３７℃で６０
分間リン酸化反応を行った。

リン酸化した１８−ｍｅｒと１５〜ｍｅｒを２μｇずつ
混合し、７０℃で５分間加熱後室温に放置してアニーリ
ングを行うことにより上記構造を有するＤＮＡリンカ−
を得た。

上記で得たｐＧＣ７由来のＢｓ　ｔＮＩ−３ａｊ！　Ｉ
断片（１１２５ｂｐ）　０．４μｇと発現ベクターｐＫ
ＹＰ１０をＨｉｎｄＩＩＩと５ａ１１で消化して得たＤ
ＮＡ断片（４，ＩＫｂ）１．（Ｊｕｇを２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊｌ！　（ｐＨ７，５）、６ｍＭ　Ｍｇ（１！
２゜５ｍＭジチオスレイトールおよび５００ＢＭ　ＡＴ
Ｐを含む全量２５μにの溶液に溶かし、この混合溶液に
上記ＤＮＡＩＪンカーを約０．１μｇ加えた。この混合
液にさらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１
７時間詰合反応を行゛った。得られた組換え体プラスミ
ドの混合物を用いて、常法通り、大腸菌８８１０１株を
形質転換し　Ａ　Ｉ）　Ｒのコロニーを得た。このコロ
ニーの培養液よりプラスミドを分離し、第６図に示した
ｐＧＫＡ２を得た。

ｐＧＫＡ２の構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｃｊ！ａＩ。

ＨｉｎｄＩＩ［、ＢｓｔＮＩ、５ａｉｌで消化後、アガ
ロースゲル電気泳動により確認した。プラスミドｐＧＫ
Ａ２のＳＤ−配列（ＡＡＧＧ）から開始コドン（ＡＴＧ
）までの塩基配列は ＡＡＧＧＣ，ＴＡＴＣＧＡＴΔＡＧＣＴＴハ」旦である
ことを、マキサム・ギルバートの方法〔八、Ｍ、Ｍａｘ
ａｍ　ら　：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、。

７４、　５６０　（１９７７＞）で確言忍した。

ｐＧＫＡ２のヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡはＲｓａ　Ｉ部位を
有すること、このＤＮＡがコードするヒトＩＦＮ−ｒポ
リペプチドは９番目のアミノ酸がグルタミン（Ｇ　Ｉｔ
　ｎ　）である点で公知のものとは異なる。

さらに上記で用いた合成りＮＡは、Ｐ、　ＩＩｌ、　Ｇ
ｒａｙらが用いた合成りＮＡ とは下線の部分で異なる。このようにｐＧＫＡ２にはヒ
トＩＦＮ−ｒをコードするＤＮＡ領域内に〔ＣＣΔＧＧ
）なるＢｓｔＮＩに対する制限酵素部位が存在し、ｐＧ
ＫＡ２はこの点でも公知のものと異なる。またＳＤ配列
とＡＴＣ，間の距離と構造は、大腸菌での蛋白質の発現
に大きく影響するので重要であるが、ｐＧＫＡ２のＳＤ
−配列とＡＴＣ間の塩基配列は公知の組換え体プラスミ
ドｐＩＦＮ−ｒｔｒｐ４８　（Ｐ、Ｗ、Ｇｒａｙら）の
それとは明らかに異なるものである。

ｐＧＫＡ２を含む大腸菌は微工研にＢｓｃｈｅｒ　ｉｃ
ｈ　１ａｃｏｌｉ　ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　Ｐ−６７９
８＞として寄託されている。

参考例４゜ ｔａｃＩプロモーターの制御下でヒトＩ　ＦＮ−Ｔを発
現する組換え体プラスミドｐＧＴＣ３の造成： まず、組換え体プラスミドの第１段階として、ＩＦＮ−
ｒ発現プラスミドルＣ，ＫＡ２への大腸菌リポプロティ
イン（ｌｐｐ）遺伝子の転写終結部位（以下、ｌｐｐタ
ーミネータ−と略記する）の導入を、以下の（ａ）　、
　（ｂ）　、　（Ｃ）　、　（ｄ）の手順に従い行った
（第７図参照）。

（ａ）　ｐ　Ｇ　Ｂ　Ｄ　１の造成ニ ブラスミドＩ）ＩＦＮＴ−０４（約３．６Ｋｂ）２μｇ
を２０μｌのＹ−５０緩衝液中に溶かし、６単位のＰｖ
ｕＩＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った後、６
５℃、１０分間の熱処理によって反応を止めた。この消
化物０．１μｇを、５ピコモルの５′−リン酸化Ｂａｍ
ＨＩリンカ−（５−ｐｃｃＧＧＡＴｃｃＧＧ−３’　；
コラボレイティブ・リサーチ社製）の存在下、２０μｌ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、２単位のＴ　４　ＤＮ
Ａ　！Ｊガーゼにより４℃で１８時間結合反応を行った
。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌８８１０１株を形質転換させ、Ａｐ耐性のコロニ
ーを得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離
し、該ＤＮＡをＢａｍＨＩなどの制限酵素で消化するこ
とによりプラスミドの構造解析を行った結果、ｐｌ’Ｆ
Ｎｒ−Ｇ４のＰｖｕ１１部位にＢａｍＨＩＩＪンカーが
挿入された組換え体プラスミドｐＧＢＤｌが得られたこ
とを確δ忍した。

（ｂ）ｐＫＹＰ１４の造成： 次に、ｌｐｐターミネークーの供給源として用いた組換
え体プラスミドｐＫＹＰ　１４の造成について述べる。

ｔｒｐプロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹＰ１０〔特
開昭５８−１１０６００：］　５μｇを４０μｍのＹ１
００緩衝液に溶かし、１０単位のＢａｍＨＩを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。続いて、１μｍのｌ−
１００緩衝液、２．５μβのＬＭ　ＮａＣ１，５，５μ
ｌの蒸留水および２０単位の５ａｆｆｉ　１を加え、３
７℃でさらに２時間反応を行った。６５℃、１０分間の
熱処理後、低融点アガロースゲル電気泳動法を用い、大
きい方のプラスミドＤＮＡ断片（約４．９　Ｋ　ｂ　）
を精製した。一方、ｌｐｐターミネータ−を運ぶプラス
ミドｐｌＮ−ＩＩ−ＡＩ　［に、　Ｎａｋａｍｕｒａ　
ら：　Ｔｈｅ［ｉＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　１．７７１　
（１９８２））　（特開昭５７−１４０８００公報のｐ
ＫＥＮＯ４５と同じもの）５μｇを上と同じようにして
ＢａｍＨＩとＳａｊ！　１によって消化した。生じたｌ
ｐｐターミネータ−を含む約０．９５　Ｋ　ｂのＨｉｎ
ｄＩ［ｌ−５ａｉｌ断片を精製した。

このようにして得た約０．１μｇのｐＫＹＰ　１０由来
のＤＮＡ断片と約０，０５μｇのｐｌＮ−ｎ−Ａ１由来
のＤＮＡ断片を２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ−緩衝液
中で、１単位のＴ　４　ＤＮＡ　’）ガーゼを加え、４
℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
形質転換した大腸菌８８１０１株よりプラスミドＤＮＡ
を単離し、その構造解析を行ったところ、ＩＫＹＰ１４
株が持つプラスミドｐＫＹＰ１４の下流にｌｐｐターミ
ネークーが挿入されていることを確δ忍した。

（ｃ）ｐＧＢＪ２の造成： 上記（ａ）、（ハ）で得た組換え体プラスミドｐ’ＣＢ
Ｄ１とｐＫＹＰ’１４とを組み換えて、ＩＦＮ−ｒＤＮ
Ａの下流へのｌｐｐクーミネーターの挿入を以下のよう
に行った。

プラスミドｐＧＢＤ１　（約３．６Ｋｂ）５μｇを、１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭ　
ｇ　Ｃｊｉ’　２および５ｍＭ　２メルカプトエタノー
ルを含む緩衝液（以下、“Ｙ−０緩衝液”と略称する）
３０μ！中に溶かし、１０単位のＣｌａＩを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処
理に続き、水中で冷やした後、１０倍濃度のＹ−０緩衝
液を２μｆｆｉ、ＬＭ　Ｎａ（Ｊを５μｌ、蒸留水を１
２μｌ、そして制限酵素ＢａｍＨＩを２．０単位加え、
混合した後、３７℃で２時間消化反応を行った。この反
応により、プラスミドＤＮＡはＢａｍＨＩによって部分
的に消化された。生じたＩＦＮ−ｒＤＮＡを含むＣＡａ
ｌ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片（約１．３　Ｋ　ｂ　”）
を精製した。一方、１ｐｐクーミネークーを含むプラス
ミドｐＫＹＰ１４（約５．８Ｋｔｌ）５μｇを、５０μ
βのＹ−５０緩衝液中で、１０単位の（Ｊ！ａｌと２０
単位のＢａｍＨＩで一２時間消化した後、１ｐｐターミ
ネータ−を含む約５．　ＯＫ　ｂの大きい方のプラスミ
ドＤＮＡ断片を精製した。このようにして得たｐＫＹＰ
　１４由来のＤＮＡ断片（約０．１μｇ）とｐＧＢＤ１
由来のＤＮＡ断片（約０．０５μｇ）を２０μβのＴ　
４　ＤＮＡ　’）ガーゼ緩衝液中で、１単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得た、組換え体プラスミドを用い形質転
換した大腸菌８８１０１株よりプラスミドＤＮＡを単離
し、その構造解析を行ったところ、ＩＧＢＪ２株がもつ
プラスミドｐＧＢＪ２がＩＦＮ−丁ＤＮＡの下流にｌｐ
ｐクーミネーターが挿入されている構造を有することを
確認した。

（ｄ）　ｐ　Ｇ　Ｂ　Ｋ　３の造成− 上記（Ｃ）で得た組換え体プラスミドｐＧＢＪ２とＩＦ
Ｎ−ｒ発現プラスミドｐＧＫＡ２　Ｃ参考例３を参照〕
とを組換えて、ＩＦＮ−ｒＤＮＡの下流へ１ｐｐターミ
ネークーが挿入された構造を持つプラスミドｐＧＢＫ３
を以下のようにして構造した。

プラスミドｐＧＫＡ２　（約５．２　Ｋ　ｂ　）約５μ
ｇを３０μｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、１０単位以上
のＰｓｔｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理に続き、水中で冷やした後、
１０倍濃度のＹ−１５０緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　
５−ＨＣｊｌ！　（ｐＨ７，５＞　。

１５０ｍＭ　ＮａＣＪ！、　７ｍＭ　ＭｇＣｌ１２．お
よび６ｍＭ２−メルカプトエタノール〕　２μβ。

ＩＭ　ＮａＣｌ１３μｌ、蒸留水１４ｔｔ１１．　ソシ
テ１０単位の制限酵素Ｎ　ｃ　ｏ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂｊｏｌａｂｃ社製、以下同じ）を加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の
熱処理後、ＩＦＮ−γＤＮＡを含む約１．８５Ｋｂのプ
ラスミドＤＮＡ断片を精製した。次に、上で得た組換え
体プラスミドｐＧＢＪ２（約６．４　Ｋ　ｂ　）約５μ
ｇに対し、ｐＧＫＡ２に加えた処理と同じ処理を施し、
生じた約４．７　Ｋ　ｂのＰｓｔＩ−ＮｃｏＩプラスミ
ドＤＮＡ断片を精製した。このようにして得たｐＧＫＡ
２由来のＤＮＡ断片（約ｏ、　１μｇ）とｐＧＢＪ２由
来のＤＮＡ断片（約０．１μｇ）を２０μβのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ緩衝液中で１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、４℃で１８時間結合反応を行った。このようにして
得られた組換え体プラスミドを用い形質転換した大腸菌
ＨＢＩＯＩ株よりプラスミドＤＮＡを分離精製し、その
構造解析を行ったところ、ＩＧＢＫ３株が持つプラスミ
ドｐＧＢＫ３が目゛的の構造を有することを確認した。

（ｅ）ｐＧＥＤｌ３の造成： 上記（ｄ）で得たｐＧＢＫ３をもとに、ｔａｃＩプロモ
ーターの制御下でヒトＩＦＮ−ｒを発現する組換え体プ
ラスミドｐｃ’ｒｃ３を造成したが、そのためにまずｐ
ＧＢＫ３の１ｐｐターミネータ−の下流の領域を除去し
たｐＧＥＤ１３プラスミドを以下の手順で造成したく第
８図参照）。

５μｇのｐｃＢＫ３プラスミドＤＮＡを５０μｌのＹ−
１５０緩衝液中に溶かし、１０単位のＭｌｕ■と１５単
位のＳａｊ！　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。続いて、フェノールおよびクロロホルム抽出とエ
タノール沈殿の後、ＤＮＡ断片を全量４０μｌのＤＮＡ
ポリメラーゼ■緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ・Ｋｌｅｎｏｗ断片を加え、１５℃で２
時間反応させた。

６５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電
気泳動法を用い、大きい方のプラスミドＤＮＡ断片（約
５．　ｌ　Ｋ　ｂ　）を精製した。

このようにして得られたｐＧＢＫ３由来の約５．ＩＫｂ
のＤＮＡ断片を２０μ！のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中
、１単位のＴ　４　ＤＮＡ　リガーゼによって４℃で１
８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡで大
腸菌に２９４株を形質転換し１．、ｘ　ｐ耐性株を得た
。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、その
構造解析を行ったところ、ＩＧＥＤｌｓ株が持つプラス
ミドｐＧＥＤ１３は次の構造を有することが判明した。

すなわち、ｐＧＴｃ１３はｐＧＢＫ３のＩｐｐターミネ
ークーの下流の約６５０ｂｐの領域（Ｍ　Ｉ　ｕ　Ｉ部
位とＳａｌ　Ｉ部位の間）が除去された構造を有してお
り、Ｍｌｕ１部位とＳａｄ　１部位はＤＮＡポリメラー
ゼによって修復され、再結合した結果、Ｍ］ｕＩと５ａ
ＩｌＩで切断できる下記塩基配列となっている。

（ｆ）ｐＧＴＣ３の造成： 上で得たｐＧＥＤ１３プラスミドＤＮＡ５μｇを５０μ
ｌのＹ−５０緩衝液中に溶かし、１０単位のＨｉｎｄｌ
ｌｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。続いて
、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール沈殿
の後、ＤＮＡ断片を全量４０μｌのＤＮＡポリメラーゼ
■緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ・にＩｅｎｏｗ断片を加え、１５℃で２時間反応させ
たーフェノールおよびクロロホルム抽出とエタノール沈
殿の後、全量５０μｌのＹ−５０緩衝液に溶がし、１０
単位ＯＪ）　ｐ　Ｓ　ｔ　Ｉを加え、３７℃で２時間反
応させた。

６５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電
気泳動法を用い、大きい方のプラスミドＤＮＡ断片（約
４．　ＯＫ　ｂ　）を精製した。

次に、ｔａｃｌプロモーターを運ぶＤＴＡＣＩ　ｎプラ
スミド（参考例２で造成）約５μｇを５０μｌのＹ−５
０緩衝液に溶かし、１０単位のｐｖｕｌｌと１０単位の
Ｐｓｔｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６
５℃、１０分間の熱処理後、低融点アガロースゲル電気
泳動力を用い、ｔａｃ■ブロモ−クーを含むＤＮＡ断片
（約１．０５Ｋｂ）を精製した。

このようにして得られたｐＧＥＤｌ　３由来の約４．０
Ｋｂ（７）ＤＮＡ断片（約０．１　μｇ　）とｐＴＡＣ
１０由来の約１．０５Ｋｂ（１りＤＮＡ断片（約０．１
　ｐ　ｇ　）を２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中
、１単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼによって４℃で１８時
間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡで大
腸菌ＪＡ２２１株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。こ
の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、その構造
解析を行ったところ、ＩＧＴＣａ株が持つプラスミドｐ
ＧＴｃ３が、ｔａｃｌプロモーターの下流にＩＦＮ−γ
遺伝子が結合している構造を持つことを確認した。

次に、ｐＴＡｃｌｏのＰｖｕＨ末端とｐＧＥＤｌ３の修
復されたＨｉｎｄＩＩＩ末端が連結することによって生
じた塩基配列を調べるため、ｐｃＴｃ３のｔａｃ　Ｉプ
ｔ）％−ター内に−あるＨｉｎｃｌ１部位から下流の方
向に、マキサム・ギルバートの方法〔Ａ、　Ｍ、　Ｍａ
ｘａｍら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ。

ＵＳＡ　７４．５６０　（１９７７））を用い決定した
。その結果、１ａｃＺ遺伝子由来のＳＤ配列とＩＦＮ−
ｒ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの間に存在する連結部の塩
基配列は下記の通りであった。

連結部 組換え体プラスミドｐＧＴＣ３を含む大腸菌菌株は、微
工研にＢｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｉ　Ｇ　Ｔ
　Ｃ３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４’０２）として寄託されて
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＧＨＡ２の造成工程を示す。 第２図は、ｐＬＥｃｌの造成工程を示す。 第３図は、ｐＧＨＢ３の造成工程を示す。 第４図は、ｐＲＴ４の造成工程を示す。 第５図は、ｐＴＡｃｌｏの造成工程を示す。 第６図は、ｐＧＣ７およびｐＧＡ２の造成工程を示す。 第７図は、ｐＧＢＫ３の造成工程を示す。 第８図は、ｐ　Ｇ　Ｔ’Ｃ３の造成工程を示す。 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第 （σ） （ｂ） Ｐ昨Ａ　２　（５，２５Ｋｂ） 第６図 ：３（ＬＬ工　／’ＩＬＬＬ工 手続補正書 １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４１１３４号 ２、発明の名称 新規プロモーター ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社（ＴＢＬ　：　０３−
２０１−７２１１　内線２７５１＞代表者　木　下　祝
　部 ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１）　明細書第５９９行目の「大腸菌ＪＡ２２１株」
を「大腸菌８８１０１株」に訂正する。 （２）明細書第２７頁１７行目のｒｐＬＥｃＩＪをｒｏ
ＴＡｃｌ　０　ｌに訂正する。　２目、同第３１頁７行
目、同第３１頁８行目、同第４３頁１８行目および同第
５８頁１５行目のｒＪＡ２２１」の後に「（Ｆ’ｊ！ａ
ｃＩｑ）Ｊを加入する。 （４）明細書第２９頁１０行目〜１１行目［参考例２で
造成されたプラスミドｐＴＡｃ１０（ｔａｃｌプロモー
ターを運ぶ）」を［参考例１で造成されたプラスミドｐ
Ｐｔ　Ｔ４　（ＰＬプロモーターを運ぶ）」に訂正する
。 （５）明細書第４３頁２４行目〜同第４４頁１行目のｒ
ＩＧＴＣ３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４０２）ＪをｒＩＴＡｃ
ｌｏ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４０４）Ｊに訂正する。 （６）明細書筒４３頁１８行目の後の塩基配列中ｒｔｈ
ｙＪをｒｔｙｒＪに訂正する。 （７）明細書第５６頁２４行目のｒｐＧＴｃ１３Ｊをｒ
ｐＧＥＤ１３Ｊに訂正する。 （８）　明細書第５９頁「４、図面の簡単な説明」中、
第４行目のｒｐＲＴ４ＪをｒｐＰｔ　Ｔ４Ｊに訂正する
。 （９）明細書第５９頁「４、図面の簡単な説明」中、第
６行目のｒｐＧＡ２ＪをｒｐＧＫＡ２Ｊに訂正する。 手続補正書（方式） １．事件の表示 昭和５８年特許願第２４１１３４号 ２、発明の名称 新規プロモーター ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社昭和５９年３月７日（
発送日：昭和５９年３月２７日）５゜補正の対象 明　細　書 手続補正書　く自発） 昭和６０年１月３／日 特許庁長官　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４１１３４号 ２、発明の名称 新規プロモーター ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称　（
１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳細な説
明の欄および特許請求の範囲の欄 ５、補正の内容 を［固有に持つ５′フランキング領域と”−３５″領域
とが他のＤＮＡ断片によって同時に置き換わるために、
ｔａｃプロモーター固有の”−３５″′領域が失われる
。」に訂正する。 （３）明細書第２２頁１行目のｒ　（Ｌ、Ｗｉｅｓｌｅ
ｎｄｅｒ：　Ｊを［（Ｌ、　Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ　：
　Ｊに訂正する。 （４）明細書第２３頁７行目の「プフラスミド」を「プ
ラスミド」に訂正する。 （５）　明細書第２５頁１６行目の「１５〜１８」を「
１７」に訂正する。 （６）明細書第２７頁９行目の「参考例■」を「参考例
１」に訂正する。 （７〕　明細書第３６頁３行目のｒｐＫＹ１２−６Ｊを
ｒｐＭＹ１２−６Ｊに訂正する。 （８）明細書第３６頁１２行目の「△Ｈユ」を「△ＨＩ
Ｊに訂正する。 （９）明細書第４２頁１１行目のｒＲｅｚｎｉｋｏｌｌ
　ＪをｒＲｅｚｎｉｋｏｆｆ　Ｊに訂正する。 σＱ　明細書第４６頁１０行目のｒＰ−６８１４Ｊの後
にｒ、ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９７Ｊを加入する。 α０　明細書第５０頁７行目のｒＰ−６７９８Ｊの後に
ｒ、ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９６Ｊを加入する。 αつ　明細書第５４頁１６行目の「構造」を「造成」に
訂正する。 α■　明細書第５４頁２３行目のｒ　１０　ｍＭＪをｒ
ｌｏｏｍＭＪに訂正する。 ００　明細書箱５４頁２４行目のｒ１５０ｍＭｊをｒｌ
、５ＭＪに訂正する。 ａ９　明細書箱５４頁２４行目のｒ７ｍＭＪをｒ７０ｍ
ＭＪに訂正する。 ００　明細書第５５頁１行目のｒ６ｍＭＪを［６０ｍＭ
Ｊに訂正する。 αつ　明細書第５８頁５行目の「電気泳動力」を「電気
泳動法」に訂正する。 α０　特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 特許請求の範囲 （１）プロモーター（以下プロモーターＡという）の５
′フランキング領域を、他のプロモーター（以下プロモ
ーターＢという）の５′フランキング領域あるいは化学
合成したＤＮＡ断片と置き換えたプロモーター。 （２）プロモーターＡの”　−３５”領域の近傍あるい
はその上流の制限部位を利用して５′フランキング領域
を置き換えることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載のプロモーター。 （３）プロモーターＡの”　−３５”領域あるいは５′
フランキング領域に存在する適当な制限部位を利用して
、プロモーターＢの５′フランキング領域あるいは化学
合成したＤＮＡ断片を挿入することを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載のプロモーター。 （４）プロモーターＡの５′フランキング領域をエキソ
ヌクレアーゼなどを用い除去した後、プロモーターＢの
５′フランキング領域あるいは化学合成したＤＮＡ断片
を挿入することを特徴とする特許請求の範囲第２または
３項記載のプロモーター。 （５）プロモーターΔ、プロモーターＢが大腸菌のプロ
モーターであることを特徴とする特許請求の範囲第１〜
４項のいずれかに記載のプロモーター０ （６）プロモーターＢの５′フランキング領域または化
学合成したＤＮＡ断片が八Ｔに富んでおり、転写活性を
強める効果を持つことを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載のプロモーター。 （７）プロモーターＢがλファージのＰ、プロモーター
、ＰＲプロモーター、リボゾームＲＮＡ（ｒｒｎ）プロ
モーターまたはリポプロティン遺伝子ノプロモーターで
あることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のプロ
モーター。 （８）プロモーターＡがトリプトファン（ｔｒｐ）オペ
ロンのプロモーター（ｔｒｐプロモーター）、ラクトー
ス（ｌａｃ）オペロンのプロモーター（ｌａｃプロモー
ター）、あるいはｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモー
ターのノ飄イブリッド・プロモーターであるｔａｃプロ
モーターであることを特徴とする特許請求の範囲第５項
記載のプロモーター。 （９）プロモーターＡがｔｒｐプロモーターまたはｔａ
ｃプロモーターで、プロモーターＢがＰｔプロモーター
であることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のプ
ロモーター。 α■　特許請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかの
記載のプロモーターによってその発現が制御されている
外来遺伝子を含んでいる複製可能な組換え体プラスミド
。 （１１）　特許請求の範囲第一し」−項記載の組換え体
プラスミドを含む微生物。 （１２）　微生物が巳５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＩＧＨＡ２、同ＩＧＩ（８３同ＩＬＩＥＣＩで特徴づ
けられる特許請求の範囲第１１項記載の微生物。 手続補正書 １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４１１３４号 ２、発明の名称 新規プロモーター ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称　（１
０２）協和醗酵工業株式会社昭和６０年４月２５日（発
送日　同５月１４日）５、補正の対象 昭和５９年２月２３日付提出の手続補正書の手続補正書 昭和５９年２月２３日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４１１３４号 ２、発明の名称 新規プロモーター ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称　（１
０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳細な説明
の欄および図面の簡単な説明の欄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）プロモーター（以下プロモーターΔという）の５
   ′フランキンク領域を、他のプロモーター（以下プロモ
   ーターＢという）の５′フランキング領域あるいは化学
   合成したＤＮＡ断片と置き換えたプロモーター。 （２）プロモーターＡの”　−３５”領域の近傍あるい
   はその上流の制限部位を利用して５′フランキング領域
   を置き換えることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載のプロモーター。 （３）プロモーターへの”−３５”領域あるいは５′フ
   ランキング領域に存在する適当な制限部位を利用して、
   プロモーターＢの５′フランキング領域あるいは化学合
   成したＤＮＡ断片を挿入することを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載のブロモ−クー。 （４）プロモーターへの５′フランキング領域をエキソ
   ヌクレアーゼなどを用い除去した後、プロモーターＢの
   ５′フランキング領域あるいは化学合成したＤＮＡ断片
   を挿入することを特徴とする特許請求の範囲第２または
   ３項記載のプロモーター。 （５）プロモーターΔ、プロモーターＢが大腸菌のプロ
   モーターであることを特徴とする特許請求の範囲第１〜
   ４項のいずれかに記載のプロモーター。 （６）プロモーターＢの５′フランキング領域または化
   学合成したＤＮＡ断片がＡＴに富んでおり、転写活性を
   強める効果を持つことを特徴とする特許請求の範面第５
   項記載のプロモーター。 （７）フロモーターＢがλファージのＰＬプロモーター
   、Ｐ、プロモーター、リボゾームＲＮΔ（ｒｒｎ）プロ
   モーターまたはリポプロティン遺伝子のプロモーターで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のプロ
   モーター。 （８）プロモーターΔがトリプトファン（ｔｒｐ）オペ
   ロンのプロモーター（ｔｒｐプロモーター）、ラクトー
   ス（ｌａｃ）オペロンのプロモーター（Ｉａｃブロモ−
   クー）、あるいはｔｒｐプロモーターとＩａｃプロモー
   ターのハイブリッド・プロモーターであるｔａｃプロモ
   ーターであることを特徴とする特許請求の範囲第５項記
   載のプロモーター。 〔９〕プロモーターＡがｔｒｐプロモーク〜またはｔａ
   ｃプロモーターで、プロモーターＢがＰＬプロモーター
   であることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のプ
   ロモーター。 αＱ　特許請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかの
   記載のプロモーターによってその発現が制御されている
   外来遺伝子を含んでいる複製可能な組換え体プラスミド
   。 （１１）　特許請求の範囲第９項記載の組換え体プラス
   ミドを含む微生物。 （１２）　微生物がＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
   　１ＧＨＡ２、同ＩＧＨＢ３同ＩＬＥＣＩで特徴づけら
   れる特許請求の範囲第１１項記載の微生物。