DE69025081T2

DE69025081T2 - DNS für Expression und Sekretion

Info

Publication number: DE69025081T2
Application number: DE69025081T
Authority: DE
Inventors: Yukio Kita; Yasushi Kojima; Yukiko Tsukuda
Original assignee: New Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1989-03-14
Filing date: 1990-03-14
Publication date: 1996-05-30
Anticipated expiration: 2010-03-15
Also published as: CA2012025A1; CA2012025C; EP0388166B1; DE69025081D1; US6075138A; EP0388166A1

Description

Diese Erfindung betrifft neue DNA betreffend die Expression und Sekretion eines Proteins, einen neuen, die DNA und eine für ein Protein codierende DNA enthaltenden Organismus und ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen unter Verwendung des neuen Mikroorganismus. Im besonderen betrifft die vorliegende Erfindung DNA, welche die Expression und Sekretion von Phenoloxidase betrifft, die aus einem Basidiomyceten (insbesondere einem Weißfäulnis Pilz wie Z.B. Coriolus hirsutus IFO 4917) stammt, welcher die Fähigkeit besitzt Phenoloxidase herzustellen und zu sezernieren, einen neuen, die DNA und eine für Protein codierende DNA enthaltenden Organismus und ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen unter Verwendung des neuen Organismus.
Der Begriff "Expression betreffende DNA" bezieht sich im allgemeinen auf einen Bereich, der stromaufwärts eines Strukturgens vorliegt und für die Transkriptionsinitiation erforderlich ist (Promotor). Der Begriff "Sekretion betreffende DNA" bezieht sich im allgemeinen auf eine DNA, die für ein Signalpeptid codiert.
Bisher wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, um den Zweck zu erfüllen eine Massenproduktion eines nützlichen Proteins unter Verwendung rekombinanter Gentechnik zu erreichen.
Rekombinante Gentechnik für die Massenherstellung eines nützlichen Proteins umfaßt im wesentlichen einen Wirt, einen Vektor und ein für ein nützliches Protein codierendes Gen.
Die Wirte, die für diese Technik nützlich sind umfassen Prokaryonten wie etwa Escherichia coli und Bacillus subtilis und Eukaryonten wie etwa Hefe, Tierzellen und Pflanzenzellen. Bei der Auswahl eines Wirts für eine bestimmte Rekombination werden die Eigenschaften des einer Expression unterworfenen Proteins und die Verwendung, für die das hergestellte Protein vorgesehen ist, in angemessener Weise berücksichtigt.
Was den für die Rekombination verwendeten Vektor anbelangt wurden bisher eine große Anzahl stark varuerender Vektoren entwickelt. Es gibt vier Grundfunktionen, die für einen Vektor erforderlich sind; (1) eine Fähigkeit mit einer DNA, welche für das vorgesehene Protein codiert, eine in vitro Rekombinante zu bilden, (2) eine Fähigkeit in der Zelle des vorgesehenen Wirts Wachstum zu erreichen, (3) eine Fähigkeit ein Einbringen in die Zelle des vorgesehenen Wirts zu erreichen und (4) eine Fähigkeit eine spezifische Bestimmung einer eine rekombinante DNA enthaltende Zelle zu bewirken. Um den Zweck einer Massenherstellung des nützlichen Proteins zu erfüllen, ist es für den Vektor erforderlich diese zusätzlichen Funktionen zu besitzen; z.B. (5) eine Fähigkeit einen starken Promotor und einen Terminator (Expression betreffende DNA-Sequenzen) zu besitzen und (6) eine Fähigkeit eine Signalsequenz (Sekretion betreffende DNA-Sequenzen) zu besitzen.
Ein starker Promotor ist für die Massenherstellung eines Proteins eine unentbehrliche Erfordernis. Die Sekretion eines in Massen hergestellten Proteins mittels einer Signalsequenz ist effektiv, um eine intrazelluläre Anhäufung eines für den Wirt schädlichen Proteins zu verhindern, eine Zersetzung eines Produkts durch eine Protease in der Zelle auszuschließen und das Reinigungsverfahren eines nützlichen Proteins zu vereinfachen und wirtschaftlich zu machen, was bisher einen hohen Arbeits- und Kostenaufwand mit sich gebracht hat.
Aufgrund der oben erwähnten Vorteile werden Anstrengungen in Forschung und Entwicklung starker Promotoren und Signalsequenzen, welche die Sekretionseffizienz steigern, fortgesetzt.
Für Escherichia coli als ein Prokaryont wurden ein PLOL Promotor für λ-Phage, ein lac Promotor für den Lactoseoperon, ein trp Promotor für den Tryptophanoperon, ein lpp Promotor und eine Signalsequenz für ein Außenmembranprotein-Gen und ein lacUV5 Promotor und ein tac Promotor als verbesserte Versionen davon entwickelt. Für Bacillus subtilis wurde ein penP für ein Penicillinaseenzym-Gen außerhalb der Bakterien und ein Promotor und eine Signalsequenz für eine α-Amylase entwickelt.
Für Hefen als ein Eukaryont wurde gezeigt, daß Promotoren für eine Gruppe glykolytischer Enzyme eine starke Expression und Überexpression von Proteinen bewirken. Beispielsweise wurden Promotoren und α-Faktoren und Signalsequenzen derartiger α- Faktoren für Gene, wie etwa 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), Glyceraldehydtriphosphorsäuredehydrogenase (GLD), Enolase (ENO), Triosephosphorsäureisomerase (TPI), Alkoholdehydrogenase (ADH), saure Phosphatase (PHO) und das Galactosemetabolismussystem (GAL) entwickelt und in die Praxis umgesetzt.
Die Anzahl der Fälle einer erfolgreichen Entwicklung von Promotoren, welche für Zellen höherer Tiere geeignet sind, ist noch gering. Obwohl Promotoren für das frühe Gen und das späte Gen des Virus SV40 eine zufriedenstellende Propagation in einer Affenzelle erreicht, wurden ein Promotor für ein ICP-Gen von HSV, ein Promotor für ein frühes Gen von Vaccina-Virus, ein Promotor für ein β-Actin aus Huhn, ein Promotor für ein EF-1α-Gen aus Mensch und ein IgG H-Ketten Promotor entwickelt, diese sind für den Zweck einer Massenherstellung nützlicher Proteine nicht geeignet.
Was Promotoren anbelangt, welche für rekombinate Gentechnik unter Verwendung einer Pflanze als Wirt geeignet sind, wurden ein Promotor für das 35S-Gen eines Blumenkohlmosaikvirus (cauliflower mosaic virus), ein Promotor für ein Nopalinsynthesegen eines Ti-Plasmids und ORF12-Promotor für ein Ri-Plasmid entwickelt. Diese Promotoren sind jedoch für den Zweck einer Überproduktion nützlicher Proteine wiederum nicht geeignet.
Vor kurzem wurde in der Literatur über die Entwicklung von Systemen für eine Sekretionsherstellung nützlicher Proteine unter Verwendung eines Schimmelpilzes, inbesondere der Gattung Aspergillus berichtet. Die Sekretionsherstellung derartiger Proteine wie Lipase und Prochymosin unter Verwendung eines Promotors für ein Glucoamylasegen von Aspergillus niger und einer Signalsequenz wurde z.B. in die Praxis umgesetzt.
Diese Aussage bedeutet nicht notwendigerweise, daß die Verwendung von Systemen, welche zur Expression und Sekretion in Schimmelpilz und der Gattung Aspergillus fähig sind, eine effiziente und sezernierende Überproduktion aller nützlichen Proteine erlaubt. Somit werden die Anstrengungen in Forschung und Entwicklung für ein System, welches zu einer effizienteren Expression und Sekretion fähig ist, fortgesetzt.
Zufällig wurde rekombinante Gentechnik unter Verwendung eines Basidiomyceten als Wirt bisher nicht eingeführt. Die Basidiomyceten umfassen zahlreiche nützliche Pilze, wie etwa eßbare Pilze, Pilze die physiologisch aktive Substanzen herstellen, Pilze, welche fähig sind, Lignin zu zersetzen und für biologischen Holzaufschluß und Biobleichen nützlich sind und Pilze, welche Cellulose zersetzen und Ligninkomponenten zu Zucker umwandeln. Versuche betreffend eine Verbesserung und Verstärkung der Eigenschaften dieser Pilze und zum Anzüchten dieser Pilze wurden bisher durchgeführt z.B. mit einem Verfahren, welches von Mating Gebrauch macht, einem Verfahren, welches vom Erwerben einer Variante Gebrauch macht und einem Verfahren, welches von Zellfusion Gebrauch macht. Falls ein Verfahren zum molekularen Züchten unter Verwendung der rekombinanten Gentechnik umgesetzt werden könnte, würde es einen einfachen Erwerb hervorragender Stämme erlauben.
Weiterhin sind, da die Sicherheit einer Verwendung von Basidiomyceten für Nahrungsmittel, ähnlich zu der von Aspergillus oryzae (Koji-Schimmelpilz) bereits festgestellt wurde, diese Basidiomyceten als Wirte zur Herstellung von Proteinen höchst nützlich. Über eine versuchte Verwendung einer filamentären Plasmid-DNA, welche in den Mitochondrien von Lentinus edodes (Shiitake) und Pleurotus ostreatus (Hiratake) vorkommt als einen Vektor für einen Basidiomyceten wurde berichtet ("Iden [genetics]" Vol. 42, Nr. 91 Seite 20 Shokabo, 1988). Es wurde jedoch gezeigt, daß die filamentäre Plasmid-DNA Nachteile aufweist, wie etwa eine mangelnde Stabilität im Wirt und sie wurde zur praktischen Verwendung bisher nicht perfektioniert.
Bisher wurde kein Promotor entwickelt, der für Basidiomyceten effektiv verwendet wird. In der Literatur wurde praktisch bisher über keine erfolgreiche Klonierung eines Gens berichtet, um einen Promotor bereitzustellen, ausgenommen einen Bericht betreffend ein Ligninase-Gen, welches erhalten wurde durch Klonieren mit einem Mikroorganismus der Gattung Phanerochaete chrysosporium. Dieses Gen ist gekennzeichnet durch Expression von Ligninase mittels Sekundärmetabolismus und das Ausmaß dieser Expression ist nicht besonders groß. Somit verdient es das Gen nicht als effektiver Promotor bezeichnet zu werden. Unter den Umständen wurde in der Industrie ein Wunsch zum Ausdruck gebracht, einen Promotor und eine Signalsequenz, welche fähig sind, eine effiziente Sekretion und Expression nützlicher Proteine mit Basidiomyceten zu bewirken, zu entwickeln. Für die somit gewünschte Promotor- und Signalsequenz ist es somit erforderlich, daß sie eine starke Expression in einer großen Vielzahl von Wirten hervorrufen und sie eine Signalsequenz besitzen, welche eine Sekretion eines durch die Expression hergestellten Proteins zuläßt.
Die Phenoloxidase ist ein nützliches Protein, da das Gen davon, wenn in verschiedene Organismen eingebracht und darin exprimiert, verwendet werden kann für biologischen Holzaufschluß, Biobleichen, Entfärbung von Fabrikabwässern und Vorbehandlung von Holz bei der Umwandlung in Zucker und anderweitig als ein Reagenz für klinische Untersuchung verwendet werden kann.
Das Gen, das für diese Phenoloxidase codiert, wurde von den jetzigen Erfindern entwickelt und identifiziert gemäß einem Klonierungsverfahren in Coriolus hirsutus IFO 4917, d.h. einem Weißfäulnis Pilz [japanische Patentanmeldung 88-175,235 und 88-175,236].
Ein Promotor und eine Signalsequenz, welche fähig sind eine Expression, insbesondere eine Sekretionsexpression dieses Phenoloxidasegens zu bewirken, müssen jedoch noch entwickelt werden.

[Der Erfindung zugrundeliegendes Problem]

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Promotor und eine Signalsequenz bereitzustellen, welche fähig sind, eine Sekretionsherstellung aller nützlichen Proteine in großen Mengen bereitzustellen, insbesondere einen derartigen Promotor und eine derartige Signalsequenz, welche sogar mit Basidiomyceten verwendbar sind.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine DNA (I) bereit, die für einen die Expression und Sekretion eines Proteins betreffenden Bereich codiert und die folgende Sequenz enthält:
Die Erfindung stellt auch eine DNA (II) bereit, die für einen die Expression und Sekretion eines Proteins betreffenden Bereich codiert und folgende Sequenz enthält:
Weiterhin stellt die Erfindung ein DNA-Molekül bereit, das für ein die Sekretion eines Proteins betreffendes Peptid codiert, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:
Dieses DNA-Molekül kann die folgende Sequenz umfassen:
Das Protein, dessen Expression und Sekretion die obigen DNA- Moleküle betreffen, kann eine Phenoloxidase sein.
Die Erfindung umfaßt einen nicht natürlichen Organismus, der ein Protein exprimiert und sezerniert von einer für das Protein codierenden DNA, welche mit einer Expression und Sekretion betreffenden DNA, wie oben definiert, verknüpft ist.
Dieser Organismus kann in Kultur gehalten werden und das Protein aus dem entstehenden Kulturmedium gewonnen werden.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches Verfahren umfaßt das Transformieren einer Zelle mit einer für das Protein codierenden DNA, welche mit einer Expression und Sekretion betreffenden DNA, wie oben definiert, verknüpft ist, das Kultivieren der Zelle und das Gewinnen des Proteins aus dem entstehenden Kulturmedium.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist eine physikalische Restriktionsendonukleasekarte des Phenoloxidase-Strukturgens, welches vom Chromosom stammt und der Expression und Sekretion betreffenden DNA.
Figur 2 ist eine Expression und Sekretion betreffende DNA (I) des aus dem Chromosom stammenden Phenoloxidasegens.
Figur 3 ist eine Expression und Sekretion betreffende DNA (II) des aus dem Chromosom stammenden Phenoloxidasegens.
Figur 4 ist eine physikalische Restriktionsendonukleasekarte des aus mRNA stammenden Phenoloxidasegens und von Sekretion betreffender DNA.
Figuren 5 und 6 zeigen die Konstruktion von Plasmiden unter Verwendung von DNA, welche die Expression und Sekretion des Phenoloxidasegens betrifft.
Die jetzigen Erfinder haben Phenoloxidasepromotoren untersucht, welche fähig sind eine Massenexpression nützlicher Proteine zu bewirken und Signalsequenzen, welche fähig sind eine effiziente Sekretion hergestellter Enzyme zu bewirken, wobei sie festgestellt haben, daß die Promotoren und Signalsequenzen von Phenoloxidasen, welche von verschiedenen Organismen (insbesondere Basidiomyceten) hergestellt werden, effektiv sind.
Sie haben festgestellt, daß insbesondere Basidiomyceten der Gruppe umfassend Coriolus hirsutus IFO 4917 geeignete DNA- Quellen sind, wie gezeigt durch die Tatsache, daß sie, wenn einer Flüssigkultur unterworfen, konstitutiv eine Massensekretionsproduktion von Phenoloxidasen erlauben. Es ist ihnen gelungen, DNA zu isolieren, welche die Expression und Sekretion derartiger Basidiomyceten, wie oben erwähnt, betreffen.
Die DNA, welche Expression betreffen, werden lediglich auf den Chromosomen, wie etwa von Basidiomyceten erhalten, und die DNA, welche Sekretion betreffen, können sowohl von Chromosomen als auch von mRNA von Basidiomyceten erhalten werden.
Die DNA, welche Expression und Sekretion betreffen, können ähnlich zu denjenigen, die in der japanischen Patentanmeldung 88-175,235 oder der japanischen Patentanmeldung 88-175,136 offenbart sind, von einer chromosomalen DNA-Bank oder einer cDNA-Bank mit einer synthetischen DNA-Sonde oder mit dem Strukturgen einer klonierten Phenoloxidase als Sonde isoliert werden.
Es wird zugelassen, daß die isolierte, Expression und Sekretion betreffende DNA eine Sekretionsproduktion von Phenoloxidase bewirkt, indem sie mit dem Phenoloxidase- Strukturgen verknüpft wird, dann mit einem geeigneten Vektor verknüpft wird und in eine Wirtszelle eingebracht wird, wie üblicherweise bei rekombinanter Gentechnik vorgegangen wird.
Die vorstehend erwähnten, Expression und Sekretion betreffenden DNA, wie vorstehend beschrieben, fördern die Expression und Sekretion von Phenoloxidasegenen. Die DNA- Sequenzen sind jedoch bei der Expression und Sekretion anderer Proteine als den vorstehend erwähnten Proteinen effektiv. Die DNA-Sequenzen, die für die vorstehend erwähnten Aminosequenzen codieren, sind nicht nur effektiv bei der Sekretion von Phenoloxidase sondern auch bei der Sekretion anderer Proteine.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr nachstehend ausführlich beschrieben.

(Herstellung einer DNA-Sonde)

Die DNA-Sonde, welche zum Selektieren des die Expression und Sekretion einer Phenoloxidase betreffenden DNA-Moleküls aus der aus Chromosomen zusammengesetzten chromosomalen DNA-Bank und der aus mRNA zusammengesetzten cDNA-Bank erforderlich ist, kann ähnlich sein zu der synthetischen DNA-Sonde, die die jetzigen Erfinder beim Klonieren des Phenoloxidasegens (japanische Patentanmeldung 88-175,235 und japanische Patentanmeldung 88-175,236) verwendet haben. Es ist andererseits zulässig, ein kloniertes Phenoloxidasestrukturgen oder ein auf Basis eines Strukturgens synthetisiertes DNA- Molekül als die Sonde zu verwenden.
Die Sequenz der synthetischen DNA-Sonde wird spezifisch auf Basis der Aminosäurepartialsequenz von Phenoloxidase bestimmt. Und die Aminosäurepartialsequenz von Phenoloxidase wird bestimmt durch Unterwerfen der Aminosäuresequenz vom N- Terminus von Phenoloxidase, hergestellt und gereinigt durch das in der japanischen Patentoffenlegungsschrift 86-285,989, der japanischen Patentoffenlegungsschrift 87-220,189, der japanischen Patentoffenlegungsschrift 87-220,190 und von gereinigter Phenoloxidsae, einem BRCN-Abbau [CO.o., R.D.: Methods Enzymol. 11, 315-317 (1967)] oder einem Trypsinabbau [Lin, L.-N. & Brandts, J.F.: Biochemistry 22, 553 (1983)] und Unterwerfen der Aminosäuresequenz vom N-Terminus des abgetrennten Polypeptids einem Edman-Abbauverfahren [Edman, P & Henshchen, A. Proteinsequence determination, 2. Auflage, Springer Verlag, Berlin, Seiten 232-279 (1975)].
Die Synthese der DNA-Sonde kann durchgeführt werden durch jedes Verfahren aus Phosphodiesterverfahren, Phosphotriesterverfahren, Phosphitverfahren und Amiditverfahren, welches eine verbesserte Version davon ist.
Es ist weiterhin zulässig als eine DNA-Sonde das Strukturgen der Phenoloxidase zu verwenden, welches den Stämmen zueigen ist, die von den jetzigen Erfindern kloniert wurden und im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter FERM BP-2793, FERM P-10055 und FERM P- 10061 hinterlegt wurden. Die auf Basis der Sequenz des Phenoloxidase-Strukturgens, das von den jetzigen Erfindern in der japanischen Patentanmeldung 88-175,235 und der japanischen Patentanmeldung 88-175,236 offenbart wurde, synthetisierte DNA-Sonde ist ebenfalls geeignet. (Herstellung chromosomaler DNA) Der Organismus von dem die Phenoloxidase stammt, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann ein beliebiger der Organismen sein, welche Phenoloxidase überhaupt besitzen. Unter anderen Organismen, von denen Phenoloxidase stammt, haben sich Weißfäulnis Pilze [wie etwa z.B. Coriolus hirsutus (IFO 4917), Coriolus versiolor (IFO 30340) und Lenzites edodes (IFO 8714)], welche Phenoloxidasen mit besonders hoher enzymatischer Aktivität herstellen und sezernieren, als wünschenswert herausgestellt.
Was die Zusammensetzung des Kulturmediums anbelangt, welches für das Wachstum und die Propagation eines Weißfäulnis Pilzes zu verwenden ist, können, während Glukose als eine Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, andere Kohlenstoffquellen, die von dem Weißfäulnis Pilz assimiliert werden können, verwendet werden. Während Hefeextrakte und Polypepton als Hauptstickstoffquellen verwendet werden, können anorganische Stickstoffverbindungen, wie etwa Ammoniumsalze und Nitrate und organische Stickstoff-enthaltende Substanzen, wie etwa Harnstoff und Kasein, die von dem Weißfäulnis Pilz assimiliert werden können, verwendet werden. Gegebenenfalls kann das Kulturmedium zusätzlich derartige anorganische Salze wie Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kallumsalze, Phosphate, Mangansalze, Zinksalze und Eisensalze und derartige Nährsubstanzen, wie etwa Maisquellwasser, Vitamine, Aminosäuren und Nukleinsäuren und wachstumsfördernde Substanzen beinhalten.
Ein Weißfäulnis Pilz wird in dem vorstehend erwähnten Kulturmedium angeimpft und darin kultiviert. Nach der Kultur werden die Zellen gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren, in einem Mörser gemahlen und durch das Phenolextraktionsverfahren extrahiert, um die chromosomale DNA abzutrennen. Die abgetrennte chromosomale DNA wird gereinigt, um eine chromosomale DNA zu erhalten, welche zur Konstruktion einer chromosomalen DNA-Bank verwendet wird.
Die Extraktion der chromosomalen DNA kann effizient erreicht werden durch Unterwerfen der gemahlenen Masse von Zellkörpern einer Proteinasebehandlung, bevor sie der Phenolextraktion von chromosomaler DNA unterworfen wird.

(Konstruktion einer chromosomalen DNA-Bank)

Der für die chromosomale DNA-Bank zu verwendende Vektor kann ein beliebiger der für diesen Zweck herkömmlicherweise verwendeten Vektoren sein. Im Fall eines Eukaryonten, der ein großes Volumen chromosomaler DNA hat, wird angenommen, daß es angemessen ist, einen Cosmidvektor zu verwenden, der aus einer geringen Anzahl von Vektoren ausgewählt wird. Das Verfahren dieser Erfindung wird nachstehend beschrieben werden unter der Annahme, daß ein Cosmidvektor als der Vektor verwendet wird.
Eine chromosomale DNA-Cosmidbank wird mit einem Cosmidvektor pHC79 [Hohn, B. und Collins, J. (1980) Gene 11, 291] als Vektor konstruiert. Der Cosmidvektor pHC79 ist in Form kommerzieller Produkte [wie etwa z.B. das unter der Produktbezeichnung 5358SA von Bethesda Research Laboratories vertriebene Produkt und das von Boehringer Mannheim-Yamanouchi K.K. unter der Produktbezeichnung "567795" vertriebene Produkt] verfügbar.
Chromosomale DNA-Fragmente mit Größen im Bereich von 32 bis 46 Kb (Kilobasenpaare) werden hergestellt durch Partialverdau der vorstehend erwähnten chromosomalen DNA mit einer Restriktrionsendonuklease (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und vertrieben unter der Produktbezeichnung "1082A"). Separat wird der Cosmidvektor pHC79 vollständig mit einer Restriktionsendonuklease BamHI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "1010S" vertrieben) verdaut, dephosphoryliert, mit den vorstehenden erwähnten partial verdauten Fragmenten chromosomaler DNA vereint und einer Reaktion mit einer T4 DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "2011A" vertrieben) zur Ligierung der DNA-Kette unterworfen.
Das demgemäß erhaltene Produkt dieser Ligierung wird mit Hilfe eines handelsüblichen in vitro Verpackungs-Kits [wie etwa z.B. das unter der Produktbezeichnung "N. 334Y" vertriebene Produkt der Amersham Japan Ltd. und das unter der Produktbezeichnung "P3151" vertriebene Produkt von Promega Corporation] in reife Phagenpartikel eingebracht, in einen E. coli Stamm DH 1 (ATCC 33849) infiziert, wobei etwa 50.000 Apr-Klone (Ampicillinresistent) pro 1 ug chromosomaler DNA erhalten werden. Die Klone werden als die Cosmidbank aus chromosomaler DNA verwendet.

(Klonierung eines die Expression und Sekretion eines Phenoloxidasegens betreffenden DNA-Moleküls)

Etwa 10.000 E. coli Rekombinanten in einer Cosmidbank werden in einem Ampicillin enthaltenden LB-Kulturmedium (enthaltend jeweils 10 g Bactotrypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 10 g Natriumchlorid und 15 g Agar pro Liter) kultiviert, um darin Kolonien zu bilden.
Die Kolonien werden auf einen handelsüblichen Nitrocelluloseoder Nylonfilter [wie etwa Z.B. das von Amersham Japan K.K. unter der Produktbezeichnung "RPN. 82C" vertriebene Produkt und das von Toyo Roshi K.K. unter der Produktbezeichnung "A0458082C" vertriebene Produkt] repliziert, um die DNA durch das herkömmliche Verfahren [Grunstein, N. & D. S. Hogness: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)] auf dem Filter zu immobilisieren.
Die DNA auf dem Filter und die synthetische DNA-Sonde, welche mit einem Radioisotop ³²P [hergestellt von Amersham Japan K.K. und unter der Produktbezeichnung "P810168" vertrieben] durch das in Richardson, C.C. (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54, 158 bis 161 markiert wurde, oder das Phenoloxidase- Strukturgen, welches durch das Nick-Translationsverfahren [Berg. P. (1977) J. Mol. Biol. 113, 237 bis 251] oder das Randomhexamer DNA Markierungsverfahren [Feinberg, A.P und Voegelstein B. (1983), 132, 6 bis 13] markiert wurde, werden hybridisiert, um auf die E. coli, welche eine die Expression und Sekretion des Phenoloxidase-Strukturgens betreffende DNA beinhalten, zu selektieren. Das Cosmid wird aus dem selektierten E. coli mittels des herkömmlichen Verfahrens extrahiert und wird gereinigt.
In dem in das Cosmid eingebauten chromosomalen DNA-Abschnitt wird der Teil, welcher die Expression und Sekretion des Phenoloxidasegens betrifft, eingegrenzt, zum Subklonieren mit einer Restriktionsendonuklease Hindill [hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "10605" vertrieben], EcoRI [hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "10405" vertrieben] oder SmaI [hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "1085A" vertrieben] geschnitten und nach Molekulargewicht durch das Agarosegelelektrophoreseverfahren aufgetrennt. Das auf dem Filter immobilisierte chromosomale DNA-Fragment und die mit ³²P markierte DNA-Sonde werden hybridisiert. Das mit der DNA-Sonde hybridisierende DNA- Fragment wird in den Plasmidvektor pUC19 [Yanisch-Perron, C. Vieira, J. und Messing, J (1985) Gene, 33, 103, Messing, J. (1983) Method in Enzymology, 101, 20-78, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "3219" vertrieben] subkloniert, um eine physikalische Restriktionsendonukleasekarte herzustellen.
Der Einbau des demgemäß erhaltenen DNA-Fragments, welches die für Expression und Sekretion des Phenoloxidasegens betreffende DNA enthält in die Vektor-DNA wird wie folgt durchgeführt. Vektor-DNA-Fragmente werden vorbereitet durch Schneiden der Vektor-DNA unter Verwendung einer geeigneten Restriktionsendonuklease. Dann wird das Gemisch des DNA- Fragments, enthaltend die für die Expression und Sekretion des Phenoloxidasegens betreffende DNA, mit dem Vektor-DNA-Fragment mit einer T4-DNA-Ligase behandelt. Die hierin geeigneten Vektor-DNA umfassen z.B. pBR322, PUC18 und PUC19 [hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter den Produktbezeichnungen "3050, 3218, 3219" etc. vertrieben]. Die hierin verwendbaren Restriktionsendonukleasen umfassen z.B. HindIII, EcoRI und PstI [hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "10735" vertrieben] und BamHI.
Die rekombinante DNA, welche die die Expression und Sekretion des Phenoloxidasegens betreffende DNA mit der Vektor-DNA ligiert hat, wird wie oben beschrieben gewonnen.
(Bestimmung der Basensequenz einer die Expression und Sekretion eines Phenoloxidasegens betreffenden DNA)
Das in den Plasmidvektor PUC19 subklonierte DNA-Fragment wird im Prinzip durch das Henikoff-Verfahren und das Yanisch- Perron-Verfahren [Henikoff, 5. (1984), Gene 28, 351 bis 359, Yanisch-Perron, C., Vieira, J. und Messing, J. (1985) Gene, 33, 103 bis 119] behandelt, um Deletionsmutanten herzustellen. Gegebenenfalls kann anstelle davon ein handelsüblicher Deletionskit [das unter der Produktbezeichnung "6030" von Takara Shuzo Co., Ltd. vertriebene Produkt] verwendet werden.
Die Deletionsmutanten werden durch das Dideoxyverfahren [Sanger, F. (1981) Science, 214, 1205 bis 1210] für eine Basensequenzierung untersucht. Gegebenenfalls kann stattdessen ein handelsüblicher Sequenzierkit [wie etwa z.B. das von Takara Shuzo Co., Ltd. unter der Produktbezeichnung "6010A, 6015A" vertriebene Produkt und das von Nippon Gene K.K. unter der Produktbezeichnung "317-01121" vertriebene Produkt] verwendet werden.

(Herstellung von mRNA)

Der Organismus, von dem Phenoloxidase abstammt, der zur Herstellung von mRNA verwendet werden kann, kann, ähnlich zu demjenigen der für die Herstellung der chromosomalen DNA verwendet wurde, ein beliebiger der Organismen sein, die überhaupt eine Phenoloxidase besitzen. Weißfäulnispilze [wie etwa z.B. Coriolus hirsutus IFO 4917, Coriolus versicolar IFO 30340, und Lenzites betulins IFO 8714], die ein Enzym mit besonders hoher Aktivität herstellen und sezernieren, werden vorteilhaft verwendet.
Ein derartiger Weißfäulnispilz wird in der gleichen Weise wie bei der Herstellung der chromosomalen DNA kultiviert. Wenn die Phenoloxidaseaktivität im Kulturmedium ihr Maximum erreicht, werden die Zellen gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Die Extraktion der Gesamt-mRNA, welche derartigen Proteinen wie Phenoloxidase aus dem Weißfäulnispilz entspricht, kann durch das herkömmliche Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Extraktion bewerkstelligt werden durch ein Verfahren, welches umfaßt das Mischen der Zellkörper von Weißfäulnispilz mit einem 2 bis 5-fachen Volumen eines oberf lächenaktiven Mittels wie NP-40, SDS oder Triton X-100 und einer Phenollösung, das Unterwerfen des entstehenden Gemisches einer physikalischen Behandlung wie Homogenisierung oder Gefrieren/Auftauen, wodurch die Zellkörper zerkleinert und solubilisiert werden, das Zentrifugieren des entstehenden Gemisches, das Abtrennen des Überstands von den abzentrifugierten Schichten und das Zugeben von kaltem Ethanol zum abgetrennten Überstand, wodurch die Präzipitation von RNA induziert wird. Alternativ kann die Extraktion durch das GTC- Verfahren bewerkstelligt werden, welches umfaßt das Zerkleinern eines Gewebes in einer Guanidinthiocyanatlösung, Verursachen einer Ethanolpräzipitation in der entstehenden Lösung und erneutes in Lösung bringen des Präzipitats mit Guanidinhydrochlond, wodurch eine Extraktion der Gesamt-mRNA bewirkt wird. Das Verfahren von Broda et al. [J. Microbiol. Methods 4 (1985) 155 bis 162] kann stattdessen verwendet werden. Andererseits kann die Extraktion der Gesamt-mRNA erreicht werden durch die Verwendung eines handelsüblichen RNA-Extraktionskits [hergestellt von Amersham Japan K.K. und unter der Produktbezeichnung "RPN. 1264" vertrieben]. Gegebenenfalls kann das Verfahren verwendet werden, welches umfaßt Verursachen einer Präzipitation eines Polysoms, welches gerade Phenoloxidase synthetisiert mit einem der Phenoloxidase entsprechenden Antikörper und Extrahieren der mRNA aus dem präzipitiertem Polysom mit einem oberflächenaktiven Mittel.
Die Poly(A)mRNA dieser Erfindung kann z.B. gereinigt werden durch das Verfahren, welches auf die Verwendung einer mit Oligo(dt) Cellulose oder Poly(U) Cellulose gepackten Adsorptionsäule zurückgreift oder durch das Fraktionierungsverfahren, welches auf die Sucrosedichtegradientenzentrifugation zurückgreift.
Die Gegenwart der der angestrebten Phenoloxidase entsprechenden mRNA in der wie oben beschrieben erhaltenen Gesamt-mRNA kann erreicht werden durch das Verfahren, welches umfaßt Translatieren der mRNA in ein Protein und Identifizieren dieses Proteins unter Verwendung eines entsprechenden Antikörpers. Spezifisch ist es möglich, die mRNA in das Protein zu translatieren mit Hilfe eines zellfreien Mediums, wie etwa z.B. Reticulocytenlysat oder Weizenkeimsystem, welche häufig bei der Translation von mRNA in ein Protein verwendet werden und zu bestätigen, daß die der Phenoloxidase entsprechende mRNA Aktivität aufweist.
Diese Bestätigung kann andererseits erreicht werden durch die Dot-Hybridisierung unter Verwendung einer Phenoloxidase-DNA- Sonde oder durch die Nothern-Blot-Hybridisierung.
Die wie oben beschrieben erhaltene mRNA wird zur in vitro Synthese einer cDNA verwendet. Die cDNA wird in einen geeigneten Vektor eingebaut und zur Konstruktion einer cDNA- Bank zum Klonieren der die Sekretion eines Phenoloxidasegens betreffenden DNA verwendet.

(cDNA-Synthese)

Die Verfahren, die für die Synthese von cDNA verfügbar sind umfassen z.B. das Gubler-Hoffman Verfahren, das Rand- Verfahren, das Okayama-Berg-Verfahren und die modifizierten Versionen davon. Die Synthese kann z.B. in vitro durch das folgende Verfahren durchgeführt werden. Mit der vorstehend erwähnten mRNA als eine Matrize und einem Oligo(dt) als einem Primer, wird mit einer reversen Transkriptase [hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "2610A" vertrieben] in der Gegenwart von dNTP (= dATP, dGTP, dCTP, dTTP) eine zu der mRNA komplementäre einzelsträngige cDNA synthetisiert. Dann wird eine doppelsträngige cDNA synthetisiert durch Einfügen eines Schnitts in die mRNA mit einer RNaseH (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "2150A" vertrieben) und verursachen, daß eine DNA-Polymerase I (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "2140A" vertrieben) in der Gegenwart von dNTP auf die mRNA als ein Primer wirkt. Dieses Syntheseverfahren wird erreicht unter der Verwendung eines handelsüblichen cDNA-Synthesekits [wie etwa dem Produkt von Amersham Japan K.K. mit der Produktbezeichnung "RPN. 1256Y" und dem unter der Produktbezeichnung "1013882" vertriebenen Produkt von Boehringer Mannheim-Yamanouchi K.K.].

(Konstruktion einer cDNA-Bank)

Es wird zugelassen mit der vorstehend erwähnten doppelsträngigen cDNA eine cDNA-Bank zu konstruieren, unter Anfügen synthetischer Linker jeweils an die entgegengesetzten Enden davon oder durch das Zufügen geeigneter Enden (wie etwa z.B. Poly C) daran mittels einer terminalen Transferase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "2230A" vertrieben) und Ligieren der cDNA in einen Plasmidvektor oder einen λ-Phagenvektor
Diese Konstruktion der cDNA-Bank kann bewerkstelligt werden z.B. durch Anfügen eines EcoRI-Linkers an die doppelsträngige cDNA mit einer aus dem Phagen T4 stammenden DNA-Ligase, dann Schneiden der doppelsträngigen cDNA mit einer Restriktionsendonuklease (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und unter der Produktbezeichnung "10405" vertrieben) wodurch eine doppelsträngiqe cDNA mit EcoRI adhäsiven Enden erhalten wird, Einbauen der doppelsträngigen cDNA in die EcoRI Stelle im Phagenvektor λgt11 und Unterwerfen des Produkts dieses Einbaus der in vitro Verpackung (mit dem von Amersham Japan K.K. hergestellten und unter der Produktbezeichnung "N.334Y" vertriebenen Verpackungsprodukt oder dem von Promega Corporation hergestellten und unter der Produktbezeichnung "P3151" vertriebenen).
Es ist ebenfalls zulässig, einen handelsüblichen cDNA-Bank Kit für λgt11 oder λgt10 [wie etwa z.B. das unter der Produktbezeichnung "RPN. 1280 oder RPN. 1257" vertriebene Produkt von Amersham Japan K.K. oder das unter der Produktbezeichnung "P3010" von Promega Corporation vertriebene Produkt] für die zur Diskussion stehende Konstruktion zu verwenden.
(Klonierung von die Sekretion eines Phenoloxidasegens betreffender DNA)
Die cDNA, welche die DNA enthält, die die Sekretion des aus der mRNA stammenden Phenoloxidasegens betrifft, wird durch Plaquehybridisierung oder Koloniehybridisierung unter Verwendung der mit einem Radioisotop markierten Phenoloxidase- DNA-Sonde kloniert.
Die demgemäß erhaltene, die Sekretion der Phenoloxidasegen- mRNA betreffende DNA kann bezüglich der Basensequenz bestimmt werden durch Subklonieren in einen geeigneten Vektor in der gleichen Weise wie bei der DNA, welche die Expression und Sekretion des Phenoloxidasegens betrifft, welche aus der chromosomalen DNA stammt.

(Sekretionsproduktion von Protein)

Die Nützlichkeit des die Expression und Sekretion des Phenoloxidase-Strukturgens betreffende DNA Moleküls, erhalten wie vorstehend beschrieben, liegt darin, ein Protein effizient herzustellen und zu sezernieren, durch Verknüpfen des DNA- Moleküls mit dem Proteinstrukturgen durch das herkömmliche Verfahren, Einbauen dieses Verknüpfungsprodukts in einen geeigneten Vektor und Einbringen des Einbauprodukts in den Mikroorganismus, eine Tierzelle und Pflanzenzelle als den Wirt des Vektors. Das Einbringen in den Wirtsorganismus kann z.B. erreicht werden durch das Verfahren welches umfaßt eine Verknüpfung zu bewirken mit dem Vektor des Plasmids, Cosmids, Phagen oder Virus und Bilden einer Rekombinante durch Transformation oder Transduktion oder durch das Verfahren welches umfaßt das Bilden der Rekombinante durch direktes Einbringen eines DNA-Moleküls wie etwa durch Elektroporation.
Verschiedene Wirte können hierin verwendet werden. Unter anderen Wirten haben sich Escherichia coli und andere Mikroorganismen die zur Gattung Escherichia gehören, Bacillus subtilis und andere Mikroorganismen die zur Gattung Bacillus gehören, Saccharomvces cerevisiae und andere Hefen der Gattung Saccharomyces, die Zellen von Tabak und Petunien und andere Pflanzen der Familie Solanaceae und kultivierte Tierzellen wie etwa BalbIC 3T3 als besonders wünschenswert herausgestellt.
Die Vektoren, die für diese Wirte geeignet sind, sind nachstehend angegeben.
Plasmidvektoren vom EK-Typ (stringenter Typ) wie etwa pSC101, pRK353, pRK646, pRK248 und pDF41; Plasmidvektoren vom EK-Typ (relaxierter Typ) wie etwa CalE1, pVH51, pAC105, RsF2124, pCR1, pMB9, BR313, pBR322, pBR324, pBR325, pBR327, pBR328, pKY2289, pKY2700, pKN80, pKC7, pKB158, pMX2004, pACYC1, pACYC184 und λdul; Phagenvektoren vom λgt-Typ wie etwa λgt λC, λgt λB λWES λB, λZJvir λB, λALO λB, λWES T5622, λDam und λgt11, Charonvektoren wie etwa Charon 4A, Charon 3A, Charon 16A, Cahron 13A, Charon 14A, Charon 15, Charon 8, Charon 10, Charon 17 und Charon 20, Vektoren der Tiolais-Gruppe wie etwa L512, λZEQS, λZYV5 , λZUV 2, λZUV 3, λYEQS 1, λYEQS , λYEQS 3, λBam und λS51, Plasmidvektoren von Bacillus subtilis, wie etwa pTA1015, pLS15, pTA1020, pLS28, pLS13,pTA1050, pTA1060, pTA1030 und pTA1031, Plasmidvektoren, welche von Staphylococcus stammen, wie etwa pT127, pC194, pC221, pC223, pUB112, pUB110, pSA0501, pSA0501 pSA2100, pE194, pTP4 und pTS, Hefevektoren wie etwa pJDB219, Yep13, YRp7, YIp1, pYC und pTC2, Pflanzenvektoren, umfassend verschiedene Vektoren, die von Ti-Plasmid abstammen und verschiedene Vektoren (einschließlich binäre Vektoren), welche von Cauliflower mosaic Virus abstammen und Tiervektoren, welche von SV&sub4;&sub0; abstammen, wie etwa pSVK+, pI-11β-, pAVHin+K+, pβ2X und pSXβ+. Im Falle eines von Ti-Plasmid abstammenden Pflanzenvektors, kann die hergestellte rekombinante DNA in die Wirtspflanze eingebracht werden durch vorläufiges Einbringen der rekombinanten DNA wie etwa in Agrobacterium tumefaciens T37 und Infizieren der Pflanzenzelle mit dem rekombinanten Mikroorganismus wie etwa durch Mischkultur.
Im Fall eines Systems, welches als seinen Wirt einen Organismus verwendet für welchen weder ein Wirt noch ein Vektor bereits entwickelt wurde, d.h. Schimmelpilze der Gattung Aspergillus und der Gattung Neurospora und Basidiomyceten, umfassend Coriolus hirsutus, Coriolus hirsutus, Lenzites betulins, Lenzite edodes und Pleurotus ostreatus, kann das DNA-Molekül mit dem Proteinstrukturgen, welches mit der eine Expression und Sekretion betreffenden DNA verknüpft ist, direkt in die Zelle eingebracht werden, beispielsweise durch das Polyethylenglykolverfahren, das Elektroporationsverfahren, das Teilchenbeschußverfahren und das Mikroinjektionsverfahren. In diesem Fall wird die Bequemlichkeit, mit der die Rekombinante zu selektieren ist verbessert, wenn ein eine Drogenresistenz vermittelndes Gen oder ein für die Ernährung wichtiges komplementierendes Gen mit dem oben erwähnten DNA-Molekül verknüpft ist. Weiterhin kann die Transformationseffizienz verbessert werden durch Überführen der Wirtszelle in einen Protoplasten unter geeigneten Bedingungen.
In der vorliegenden Erfindung werden Aminosäuren und Polypeptide abgekürzt in Übereinstimmung mit der Methode, der vom IUPAC-IUB Biochemischen Komitee zugestimmt wurde.
Beispielsweise werden die folgenden Abkürzungen verwendet.
Ala L-Alanin
Arg L-Arginin
Asn L-Asparagin
Asp L-Asparaginsäure
Cys L-Cysteine
Gln L-Glutamin
GLU L-Glutaminsäure
Gly Glycin
His L-Histidin
Ile L-Isoleucin
Leu L-Leucin
Lys L-Lysin
Met L-Methionin
Phe L-Phenylalanin
Pro L-Prolin
Ser L-Serin
Thr L-Threonin
Trp L-Tryptophan
Tyr L-Tyrosin
Val L-Valin
Die DNA-Sequenzen werden abgekürzt mit den Arten der Base, welche in den entsprechenden Deoxyribonukleotiden, die die Sequenzen bilden, enthalten sind. Beispielsweise werden die folgenden Abkürzungen verwendet.
A Adenin (für Desoxyadenylsäure)
C Cytidin (für Desoxycytidylsäure)
G Guanin (für Desoxyguanylsäure)
T Thymin (für Desoxythymidylsäure)
Diese Erfindung stellt eine DNA bereit zur Expression und Sekretion eines Gens eines Proteins, insbesondere des Gens von Phenoloxidase. Diese DNA ist effektiv bei Expression und Sekretion der Gene anderer Proteine als Phenoloxidase. Diese DNA stellt, indem sie mit dem Strukturgen von Phenoloxidase verknüpft wird und in einen Wirtsorganismus eingebracht wird, einen neuen Organismus bereit, welcher fähig ist, derartige Proteine wie Phenoloxidase in einer nennenswerten Menge zu exprimieren und zu sezernieren. Diese Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Herstellen des Proteins bereit durch Kultivieren dieses neuen Organismus. Durch dieses Herstellungsverfahren kann, da das Protein wie etwa Phenoloxidase aus den Zellkörpern des Wirts-Mikroorganismus heraus sezerniert wird, die intrazelluläre konzentrierte Anhäufung eines für den Wirt schädlichen Proteins verhindert werden, der Abbau des Produkts durch die intrazellulären Proteasen ausgeschlossen werden, das Proteinreinigungsverfahren, welches bisher einen großen Aufwand von Arbeit und Kosten erforderte, vereinfacht werden und die Herstellungskosten gesenkt werden.

BEISPIEL

Nunmehr wird eine Klonierung von Expression und Sekretion von Phenoloxidase-Strukturgenen betreffender DNA-Moleküle und die Sekretionsexpression von Proteinen nachstehend mit Bezug auf Arbeitsbeispiele ausführlich beschrieben. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß diese Erfindung nicht auf diese Arbeitsbeispiele beschränkt ist.

Beispiel 1: (Synthese einer DNA-Sonde)

Die Synthese einer DNA-Sonde wurde ausgeführt durch das Amiditverfahren unter Verwendung eines DNA-Synthesizers (hergestellt von Nippon Zeon Co., Ltd. und vertrieben unter der Markenbezeichnung "Genet A-III").
Die aus drei Basidiomyceten [Coriolus hirsutus IFO 4917, Coriolus versicolor IFO 30340 und Lenzites betulins IFO 8714] isolierten Phenoloxidasen wurden durch das Edman- Abbauverfahren analysiert, um deren Aminosäuresequenzen bis zu 25 Positionen vom N-Terminus zu bestimmen. Die Ergebnisse waren wie nachstehend gezeigt. Erste Position am N-Terminus Corioluz hiriutus Coriolus versicolar Lenzites betulins Die folgende DNA-Sonde wurde derart synthetisiert, um dem Anteil der vorstehend erwähnten Sequenz von Pro an Position 17 bis Val an Position 25 zu entsprechen. In der Formel bedeutet I Deoxymosin. 26mer-C (16-Gemisch) 26mer-D (8-Gemisch) Die Phenoloxidasen der drei Basidioinyceten wurden mit BrCN abgebaut und auf einer Reversphasen-Hochgeschwindigkeits- Flüssigchromatographie-Vorrichtung aufgetrennt um Polypeptide zu erhalten. Die Polypeptide wurden durch das Edman-Abbauverfahren analysiert, um Aminosäuresequenzen zu bestimmen. Die Ergebnisse waren wie nachstehend gezeigt.
Coriolus hirsutus Met-Ala-Phe-Asn-Phe
Coriolus versicolor Met-Ala-Phe-Asn-Phe
Lenzites betulins Met-Ala-Phe-Asn-Phe
Die folgende DNA-Sonde wurde derart synthetisiert, um der oben erwähnten Aminosäuresequenz zu entsprechen. 26mer-C (16-Gemisch) 3 26mer-D (8-Gemisch)
Aus den oben angegebenen Ergebnissen geht klar hervor, daß die von Basidiomyceten hergestellten und sezernierten Phenoloxidasen einen sehr hohen Homologiegrad bezüglich der Aminosäuresequenzen aufweisen, was darauf hinweist, daß Expression und Sekretion von Phenoloxidasegenen aller Basidiomyceten betreffende DNA unter Verwendung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten DNA-Sonden kloniert werden können. In den folgenden Arbeitsbeispielen werden daher Verfahren zum Klonieren von DNA-Molekülen betreffend Expression und Sekretion von Phenoloxidasegenen von Coriolus hirsutus IFO 4917 angegeben werden.

Beispiel 2: (Herstellung chromosomaler DNA)

In einem Erlenmeyer-Kolben mit einem Innenvolumen von 5 Liter und welcher 1 Liter YPD-Kulturmedium (enthaltend jeweils Hefeextrakt, 20 g Polypepton und 20 g Glucose pro Liter) enthielt, wurde Coriolus hirsutus IFO 4917 angeimpft und unter Schütteln 7 Tage bei 27ºC kultiviert. Nach der Kultur wurden die Zellen gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren, wobei etwa 20 g gefrorene Zellkörper erhalten wurden.
In einem Mörser wurden 10 g gefrorene Zellkörper unter flüssigem Stickstoff etwa 15 Minuten gemahlen. In 10 ml einer Pufferlösung (0,1 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M EDTA, pH 8), die zuvor auf 42ºC erwärmt worden war und Proteinase K (hergestellt von Boehringer Mannheim-Yamanouchi und vertrieben unter der Produktbezeichnung "161519") in einer Endkonzentration von 100 ug/ml enthielt, wurden 5 g der gemahlenen Zellkörper sanft gerührt und 2 Stunden reagieren gelassen. Aus dem entstehenden Reaktionsgemisch wurde die chromosomale DNA mit einem gleichen Volumen TE (10 mM Tris- HCl, 1 mM EDTA, pH 8) gesättigtem Phenol extrahiert. Die extrahierte chromosomale DNA wurde mit Ethanol präzipitiert, erneut in 5 ml TE gelöst und bei 37ºC 30 Minuten zur Entfernung von RNA mit RnaseA (Endkonzentration 100 ug/ml, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt. Die chromosomale DNA wurde einer Gleichgewichtsdichtegradienten- Zentrifugationstrennung (Beckman, Vti80 Rotor, 15ºC, 50.000 UPM, 16 Stunden) unter Verwendung von CsCl unterworfen, wobei 1,5 mg gereinigte chromosomale DNA erhalten wurden.

Beispiel 3:

(Konstruktion einer Cosmid-Bank aus chromosomaler DNA)

Die Menge von 250 um der oben erwähnten gereinigten chromosomalen DNA und eine dazu zugegebene Restriktionsendonuklease SAU3AI wurden einem Partialverdau bei 37ºC ausgesetzt. Durch Unterwerfen des entstehenden Partialverdauprodukts einer 5 bis 25 % Succhrosedichtegradienten-Zentrifugationstrennung (Beckman SW40Ti-Rotor, 15ºC, 22.500 UPM, 16 Stunden) wurden etwa 4 ug chromosomale DNA-Fragmente von 32 bis 46 Kb erhalten.
Cosmidvektoren wurden zugegeben und eine dazu zugefügte Restriktionsendonuklease BamHI wurden 12 Stunden bei 37ºC reagieren gelassen für einen kompletten Verdau und mit einer alkalischen Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und vertrieben unter der Produktbezeichnung "2250A") bei 37ºC für 30 Minuten zur Dephosphorylierung behandelt. Ein Gemisch von 10 ug des Phenol-extrahierten Cosmidvektors und 1 ug der chromosomalen DNA-Fragmente von 32 bis 46 Kb wurde über Nacht bei 15ºC in der Gegenwart einer T4 DNA Ligase reagieren gelassen um Ligierung der DNA-Kette zu bewirken.
Das entstehende Ligierungsprodukt wurde einer Verpackung unterworfen unter Verwendung eines in vitro Packaging-Kits, hergestellt von Amersham Japan, und dann in ein indiziertes Bakterium E. coli DHI infiziert. Als Ergebnis wurden etwa 50.000 Apr (Ampicillin-resistente) Stämme erhalten und und als eine Cosmidbank chromosomaler DNA verwendet.

Beispiel 4: (Klonierung von DNA betreffend Expression und Sekretion eines Phenoloxidase-Strukturgens)

Etwa 5.000 rekombinanten E. coli Stämmen aus der Cosmidbank wurde erlaubt, Kolonien auszubilden auf 20 Platten von LB- Agarkulturmedium, welches Ampicillin enthielt (Endkonzentration 50 ug/ml). Die Kolonien wurden auf zwei Nitrocellulosefilter (hergestellt von Amersham Japan K.K.) transferiert. Die Filter mit den Kolonien auf der Oberseite wurden auf Filterpapiere gegeben, die mit Alkalilösung (1,5M NaCl, 0,5M NaOH) getränkt waren und darauf 7 Minuten liegengelassen. Dann wurden die Filter auf Filterpapiere gegeben, die mit einer Neutralisationslösung (1,5M NaCl, 0,5M NaOH) getränkt waren und darauf 3 Minuten liegengelassen. Sie wurden dann auf Filterpapiere gegeben, die mit einer neutralen Lösung getränkt waren und darauf 3 Minuten liegengelassen. Die Filter wurden zweimal mit SSC (0,3M NaCl, 0,03M Trinatriumcitrat)gewaschen, an Luft getrocknet und 2 Stunden bei 80ºC behandelt um die DNA auf den Filtern zu fixieren.
Durch Markieren der synthetischen DNA-Sonden 15mer-A und B und 25mer-C und D mit dem Radioisotop (λ-³²P)ATP (hergestellt von Amersham Japan K.K.) und T4 Polynukleotidkinase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. und vertrieben unter der Produktbezeichnung "2021A") und Hybridisieren davon mit der auf den Filtern fixierten DNA wurden Klone erhalten, welche fähig waren mit den zwei Arten einer synthetischen DNA-Sonde des 15mers und 26mers zu hybridisieren, zwei positive E. coli Klone, die ein Cosmid beinhalteten, welches darin eine die Expression und Sekretion eines Phenoloxidasegens betreffende DNA enthielt. Es wird angenommen, daß Expression und Sekretion betreffende DNA-Moleküle in diesen Genen vorhanden waren.
Um den Teil einzugrenzen, der das die Expression und Sekretion des Phenoloxidase-Strukturgens betreffende DNA-Molekül in dem chromosomalen, in das Cosmid eingebauten DNA-Fragment enthielt und um den eingegrenzten Teil subzuklonieren, wurde das Cosmid mit einer Restriktionsendonuklease Hindih, EcoRI oder SmaI geschnitten, in Fragmente gemäß Molekulargewicht aufgetrennt durch Elektrophorese unter Verwendung eines 1 % Agarosegels auf einem Filter durch das Southern Blotting Verfahren fixiert (Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503 bis 517, 1975) und dann mit einer synthetischen DNA-Sonde, markiert mit ³²p (26mer-C, D und 15mer-A, B) hybridisiert. Als Ergebnis hybridisierten die zwei Klone beide, d.h. die 2smer-C, D Sonden mit den DNA-Fragmenten 5,3 Kb HindIII, 4,6 Kb EcoRI und 1,9 Kb 5mal und die 15mer-A, B Sonden mit den DNA-Fragmenten 5,3 Kb HindIII, 4,6 Kb EcoRI und 2,4 Kb SmaI.
Die DNA-Fragmente wurden in pUC19 subkloniert und zum Bilden einer physikalischen Restriktionsendonukleasekarte verwendet. Somit wurde festgestellt, daß die zwei Klone ein identisches Restriktionsmuster aufwiesen (Figur 1).

Beispiel 5: (Basensequenz einer Expression und Sekretion von Phenoloxidasegen betreffenden DNA)

Die 4,6 Kb EcoRI und 5,3 Kb HindIII DNA-Fragmente, die durch Subklonieren der zwei Klone in das Plasmid pUC19 erhalten worden waren, wurden mit einem Deletionskit, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. behandelt, um Deletionsmutanten in Abständen von 100 bis 200 bp zu bilden, mit einem Sequenzierungskit, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. untersucht, um die Basensequenzen von aus der chromosomalen DNA stammenden DNA, welche die Expression und Sekretion des stammenden Phenoloxidase-Strukturgens betreffen, zu bestimmen und gleichzeitig die Aminosäuresequenz zu bestimmen (Figuren 2, 3, 4 und 5).
Die EcoRI-Fragmente, d.h. OJ-POG-E1 und OJ-POG-E2, subkloniert in pUC-Vektor und betreffend Expression und Sekretion wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter FERM BP-2793 und FERM BP-2795 hinterlegt.

Beispiel 6: (Herstellung vom mRNA)

In einem Erlenmeyer-Kolben mit einem Innenvolumen von 5 Litern und der 1 Liter eines YPD-Kulturmediums (jeweils 10 g Hefeextrakt, 20 g Polypepton und 20 g Glucose pro Liter) enthielt, wurde Coriolus hirsutus IFO 4917 unter Schütteln 6 Tage bei 27ºC kultiviert. Nachdem bestätigt worden war, daß das Kulturmedium von den Mikroorganismen erzeugte und sezernierte Phenoloxidase enthielt, wurden die Zellen gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Demgemäß wurden etwa 20 g gefrorene Zellkörper erhalten.
Aus 5 g der eingefrorenen Zellkörper wurden durch das Verfahren von Broda et al. 11 mg Gesamt-mRNA extrahiert. Spezifisch wurde diese Ausbeute von 11 mg Gesamt-mRNA bewerkstelligt durch Mahlen von 5 g der gefrorenen Zellkörper in einem Stickstoff enthaltenden 100 ml-Wirbelmischer, Auflösen der gemahlenen Zellkörper in einem dreifachen Volumen einer TNS-Pufferlösung (1 % Triisopropylnapthalinsulfonsäure, 200 mM Tris-HCL, 25 mM EDTA (pH 7,8), 250 mM NaCl), Zentrifugieren der erhaltenen Lösung zum Abtrennen von Pellets, Zugeben von 0,5 g Phenol pro ml des Überstands zum Überstand, Halten des Überstands bei einer Temperatur von 50 bis 15ºC für weiteres Lösen, und nachdem das gesamte Phenol gelöst war, Zugeben zu der Lösung eines halben Volumens Chloroform, Zentrifugieren und Gewinnen des Überstands, zweifaches Extrahieren des Überstands mit Chloroform und Behandeln mit Ethanol um eine Präzipitation zu induzieren.
Wenn die Extraktion unter Verwendung eines handelsüblichen mRNA Extraktionskits (hergestellt von Amersham Japan K.K.) durchgeführt wurde, wurden aus 3 g eingefrorener Zellkörper 6,7 mg Gesamt-mRNA erhalten.
Durch das Northern-Blot-Hybridisierungsverfahren [Thomas, P. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA f17, 5201 (1980)] wurde unter Verwendung der Phenoloxidase-DNA-Sonde bestätigt, daß die durch die zwei oben beschriebenen Verfahren gewonnene Gesamt- mRNA, die aus dem Phenoloxidasegen stammende mRNA enthielt.
Durch das Verfahren von Maniatis et al. (Maniatis et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, 197 bis 199, 1982) wurden 5 mg der Gesamt-mRNA unter Verwendung einer Cellulose Oligo(dT)Säule behandelt, um Poly(A)mRNA zu isolieren. Demgemäß wurden etwa 100 ug gereinigte Poly(A)mRNA erhalten.

Beispiel 7: (cDNA Synthese)

Die Synthese von cDNA aus der aus dem Weißfäulnispilz (Coriolus hirsutus IFO 4917) stammenden Poly(A)mRNA wurde durchgeführt durch das Verfahren von Gulber und Hoffman [U. Gubler & B. J. Hoffman; Gene, 25, 263-269 (1983)] unter Verwendung eines von Amersham Japan K.K. hergestellten cDNA- Synthese-Sets.
Durch Zugeben von 5 ug Poly(A)mRNA 5 ug Oligo(dT) 12-18 (hergestellt von Pharmacia und unter der Produktbezeichnung "27-7858-01" vertrieben) in der Gegenwart von 50 Einheiten RNAse inhibierendes Enzym (HPRI), das aus Humanfötus stammte, und Verursachen, daß 100 Einheiten einer reversen Transkriptase bei 42ºC 1,5 Stunden auf das entstehende Gemisch einwirkten, wurde eine einzelsträngige cDNA in einer Ausbeute von etwa 30 % synthetisiert. Die derart erhaltene Reaktionslösung und 4 Einheiten E. coli Ribonuklease H und 115 Einheiten E. coli DNA Polymerase 1, die dazu zugegeben wurden, wurden 1 Stunde bei 12ºC und 1 Stunde bei 22ºC reagieren gelassen und danach 10 Minuten bei 70ºC stehengelassen, um das Enzym zu inaktivieren. Die derart erhaltene Reaktionslösung und 10 Einheiten T4 DNA Polymerase, die dazu zugegeben wurden, wurden 10 Minuten bei 37ºC reagieren gelassen, um eine doppelsträngige cDNA in einer Ausbeute von etwa 95 % zu erhalten.

Beispiel 8: (Konstruktion einer cDNA-Bank)

Eine cDNA-Bank wurde mit einem handelsüblichen λgt11 Klonierungssystem (hergestellt von Amersham Japan K.K.) konstruiert.
Einhundert (100) ug der doppelsträngigen cDNA und 20 Einheiten EcoRI Methylase wurden 1 Stunden bei 37ºC reagieren gelassen und ein EcoRI Linker wurde daran ligiert. Die entstehende Reaktionslösung und dazu zugegebene 16 Einheiten EcoRI wurden 2 Stunden bei 37ºC reagieren gelassen und dann zur Reinigung durch eine Sepharose CL-4B Säule geleitet. Das entstehende Reaktionsprodukt wurde einer Verknüpfungsreaktion mit 1 ug λgt11 Arm unterworfen und dann einer in vitro Verpackung [A. Becker & M. Gold; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, f12, 581 (1975)] um 106 rekombinante λ-Phagenpartikel zu erhalten. Mit den Phagenpartikeln wurde eine aus der mRNA von Coriolus hirsutus IFO 4917 stammende cDNA-Bank erhalten.

Beispiel 9: (Klonierung einer stromaufwärts liegenden DNA betreffend Sekretion des Phenoloxidase-Strukturgens, stammend aus mRNA)

Mit der in Beispiel 4 erhaltenen, aus der mRNA von Coriolus hirsutus IFO 4917 stammenden cDNA-Bank wurde ein E. coli Y 1090 Stamm infiziert und ein Plaque gebildet.
Der aus der mRNA stammende Klon, welcher die stromaufwärts liegende, Sekretion des Phenoloxidase-Strukturgens betreffende DNA enthielt, wurde ähnlich wie bei der Klonierung der aus chromosomaler DNA stammenden DNA betreffend die Expression und Sekretion des Phenoloxidase-Strukturgens mit dem Plaquehybridisierungsverfahren nach Benton und Davies [W. D. Benton & R. W. Davis; Science, 196, 180 (1977)] unter Verwendung einer mit einem Radioisotop markierten DNA-Sonde behandelt, wobei zwei Klone abgetrennt wurden.
Die Isolierung einer gereinigten aus der mRNA stammenden DNA aus dem λgt11-Phagen, die das Phenoloxidase-Strukturgen und das DNA-Molekül, das die stromaufwärts Sekretion des Gens betrifft, enthielt, wurde durchgeführt nach dem Verfahren von Thomas und Davis [M. Thomas & R. W. Davis: Journal of Molecular Biology, 91, 315 (1974)].

Beispiel 10: (Bestimmung der Basensequenz des DNA-Moleküls betreffend die Stromaufwärtssekretion eines Phenoloxidase-Strukturgens, aus mRNA stammend)

Die DNA der zwei in Beispiel 9 erhaltenen λgt11 Klone, die das Phenoloxidasegen und die die Sekretion davon betreffende DNA, stammend aus mRNA enthielten, wurden mit einer Restriktionsendonuklease ECORI geschnitten, um das eingefügte Phenoloxidasegen herauszuschneiden und dann in die Stellen der Plasmidvektoren pUC19 und pUC118 subkloniert.
Der durch Subklonieren in die Stelle von pUC19 erhaltene Klon wurde als OJ-POM 5 bezeichnet, und der durch Subklonieren in die Stelle von PUCllB erhaltene Klon als OJ-POM 2. (OJ-POM 5 und OJ-POM 2 wurden bei der Fermentation Research Industry, Agency of Industrial Science and Technology unter FERM P-10061 und FERM P-10055 hinterlegt).
Eine Karte von Restriktionsendonukleaseschnittstellen der subklonierten cDNA wurde durch das herkömmliche Verfahren hergestellt. Diese Karte ist in Figur 6 gezeigt.
Die Restriktionsendonukleasekarten von OJ-POM 5 und OJ-POM 2 waren zueinander identisch.
Ähnlich zur Sequenz des aus dem Chromosom stammenden DNA- Moleküls, das die Expression und Sekretion des Phenoloxidase- Strukturgens betraf, wurde die subklonierte cDNA mit einem handelsüblichen Deletionskit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um eine Deletionsmutante zu bilden und dann mittels des Dideoxyverfahrens behandelt unter Verwendung eines handelsüblichen M13-Sequenzierungskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), um die Basensequenz der die Sekretion des Phenoloxidasegens betreffenden, aus der mRNA stammenden DNA zu bestimmen. Gleichzeitig wurde die Gesamtaminosäuresequenz der Phenoloxidase bestimmt.
Es wurde festgestellt, daß die die Sekretion des Strukturgens betreffende DNA vollkommen mit dem Bereich übereinstimmte, der die chromosomale Sekretion betraf, wie in Figuren 2 und 3 veranschaulicht und es wurde festgestellt, daß sie einen Teil des die Expression betreffenden Bereichs enthielt. Beispiel 11: (Sekretionsexpression in Hefe)
Ein Plasmid mit dem Sekretion betreffenden DNA-Molekül, stammend aus der mRNA, und dem Phenoloxidase-Strukturgen, verbunden mit dem stromabwärts liegenden Ende des Hefepromotors GALL (pG1: ATCC 37305) wurde wie in Figur 8 veranschaulicht, konstruiert. Das pYK38 enthaltende Transformationsenzym SCSHY3/PYK38 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter FERM BP-2794 hinterlegt.
Die mit dem Plasmid transformierte Hefe SHY3 wurde in einem Glukosekulturmedium und in einem Galactosekulturmedium kultiviert. Im Glukosekulturmedium wurde Phenoloxidase weder im Kulturmedium noch in den Zellen nachgewiesen. Im Galactosekulturmedium wurde Phenoloxidase in einer Menge von 5 ug/ml sezernierend im Kulturmedium hergestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß das aus mRNA stammende, Sekretion betreffende DNA- Molekül in der Hefe ähnlich verwendbar ist und daß es die Sekretionswirkung erfüllt und in der Gegenwart eines zu einer AN-AUS-Steuerung fähigen Hefepromotors verwendbar ist.

Beispiel 12: (Manifestation einer Sekretion mit Coriolus hirsutus IFO 4917)

Ein Phenoloxidasegen EcoRI-Fragment mit einer Expression und Sekretion betreffenden DNA chromosomaler Abstammung (Figur 1) oder einer wie in Figur 7 gezeigten Phenoloxidase-Genkassette wurden unabhängig oder gemeinsam in die Vektoren pUC19 und YCp19 eingebaut und durch das Elektroporationsverfahren (P. K. Howard et al., Nucleic Acid Research, Vol. 16, 2613-2623) in einem Coriolus hirsutus IFO 4917 Protoplasten eingebracht. Die entstehenden Produkte wurden ausplattiert. Die demgemäß gebildeten Kolonien wurden isoliert und Flüssigkultur unterworfen. Demgemäß wurden Klone erhalten mit einer gegenüber dem ursprünglichen Gehalt mehrfach verstärkten Phenoloxidaseaktivität.
Die chromosomale DNA wurde aus den vorhandenen Klonen mit erhöhter Phenoloxidaseaktivität extrahiert und einer Southern Hybridisierung unter Verwendung eines Phenoloxidasegens unterzogen, um zu bestätigen, daß mehrere Kopien des Phenoloxidasegens in das Chromosom eingebaut waren.
Es wird angenommen, daß die Ergebnisse implizieren, daß die Sekretionsherstellung von Phenoloxidase durch die Amplifikation des Gens erhöht war. Somit wurde gezeigt, daß die die Expression und Sekretion des klonierten Phenoloxidasegens betreffende DNA in Basidiomyceten effektiv verwendet werden kann.

Claims

1. DNA (I), die für einen die Expression und Sekretion eines Proteins betreffenden Bereich codiert und die folgende Sequenz enthält:

2. DNA (II), die für einen die Expression und Sekretion eines Proteins betreffenden Bereich codiert und die folgende Sequenz enthält:

3. DNA, die für ein die Sekretion eines Proteins betreffendes Peptid, umfassend die folgende Aminosäuresequenz, codiert:

4. DNA, die für einen die Sekretion eines Proteins betreffenden Bereich codiert und die folgende Sequenz umfaßt:

5. DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Protein eine Phenoloxidase ist.

6. Nicht natürlicher Organismus, der ein Protein exprimiert und sezerniert von einer für das Protein codierenden DNA, welche mit einer DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche verknüpft ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches umfaßt das Transformieren einer Zelle mit einer für das Protein codierenden DNA, welche mit einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 verknüpft ist, das Kultivieren der Zelle und das Gewinnen des Proteins aus dem entstehenden Kulturmedium.

8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches umfaßt das Kultivieren eines Organismus nach Anspruch 6, und das Gewinnen des Proteins aus dem entstehenden Kulturmedium.