DE69327170T2

DE69327170T2 - Verbesserte indol-biosynthese

Info

Publication number: DE69327170T2
Application number: DE69327170T
Authority: DE
Inventors: Douglas Murdock
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-09-30
Publication date: 2000-06-21
Anticipated expiration: 2013-10-01
Also published as: DK0665892T3; EP0665892A1; US5494816A; JPH08502171A; FI119817B; DE69327170D1; CZ285620B6; WO1994008035A1; ES2139023T3; SK42295A3; EP0665892B1; FI951546L; RU95112462A; CA2146027A1; HU9500955D0; JP3429310B2; CA2146027C; MX9306149A; HUT72194A; AU675091B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Farbstoffbiosynthese durch Mikroorganismen, insbesondere die Synthese von Indigo durch Bakterien. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein effizientes, gut reguliertes Biosynthesesystem, worin ein Vorläufer für die Indigoproduktion durch Mikroorganismen, Indol, intrazellulär auf einem hohen Niveau aus Glucose hergestellt wird. Diese Indol-Biosynthese wird vermittelt durch ein exogenes Tryptophan-Operon, das modifiziert ist, um die Indol-Produktion anstelle von Trypthphan-Synthese zu fördern. Auf diese Weise hergestelltes Indol kann dann zu Indigo umgewandelt werden durch die Wirkung eines weiteren enzymatischen Systems, gefolgt von Exposition gegenüber Luft. Genauer gesagt erfolgt, wenn das hierin gelehrte modifizierte Tryptophan-Operon stabil in einem Mikroorganismus transformiert wird, das einen zusätzlichen geeigneten exogenen enzymatischen Stoffwechselweg beinhaltet, die Indigo-Biosynthese aus Glucose, wenn der Mikroorganismen-Wirtsstamm unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird.

Hintergrund der Erfindung

Der blaue Farbstoff Indigo ist einer der ältesten Farbstoffe, die der Menschheit bekannt sind. Seine Verwendung als ein Textilfarbstoff datiert zumindestens auf das Jahr 2.000 vor Christus zurück. Bis in das späte 19. Jahrhundert wurde Indigo, oder Indigotin im wesentlichen aus Pflanzen der Gattung Indigofera erhalten, die in Afrika, Asien, Ostindien und Südamerika weit verbreitet ist. Während die industrielle Revolution über Europa und Nordamerika im 19. Jahrhundert hinwegfegte, führte der Bedarf an der brillianten blauen Farbe des Farbstoffes zu seiner Entwicklung als einer der Haupthandelsprodukte zwischen Europa und dem fernen Osten. 1883 identifizierte Alfred von Baeyer die chemische Struktur von Indigo: C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub0;N&sub2;O&sub2;· 1887 wurde der erste kommerzielle chemische Herstellungsprozeß für Indigo entwickelt und er wird noch heute verwandt. Dieses Verfahren umfaßt die Fusion von Natriumphenylglycinat in einer Mischung aus kaustischer Soda und Sodamid, um Indoxyl zu produzieren. Im letzten Verfahrensschritt wird Indoxyl dann zu Indigo durch Exposition gegenüber Luft oxidiert.
Die kommerziellen chemischen Verfahren zum Herstellen von Indigo führen nicht nur zur Herstellung des Farbstoffes selbst, sondern auch zur Erzeugung von wesentlichen Mengen toxischer Abfallprodukte. Offensichtlich ist ein Verfahren wünschenswert, bei dem Indigo ohne Erzeugen von toxischen Nebenprodukten hergestellt werden kann. Eine derartiges umweltgerechtes Verfahren umfaßt die Indigobiosynthese durch Mikroorganismen.
Bei einer zufälligen Entdeckung fand Ensley et al. [(1983) Science, vol. 222, S. 167-69], daß ein DNA-Fragment aus einem übertragbaren Plasmid, das aus dem Bodenbakterium Pseudomonas putida isoliert war, Escherichia coli, der stabil mit einem Plasmid transformiert war, welches das Fragment beinhaltete, in die Lage versetzte, Indigo in der Gegenwart von Indol oder Tryptophan zu synthetisieren. Ensley et al. postulierten, daß Indol entweder als eine Mediumergänzung oder als ein Ergebnis des enzymatischen Tryptophan-Katabolismus hergestellt in cis-Indol-2,3-dihydrodiol und Indoxyl umgewandelt wurde durch das kürzliche identifizierte Multi-Untereinheitenenzym Naphthalin-Dioxygenase (NDO), das von dem P. putida-DNA-Fragment codiert wird. Das solchermaßen hergestellte Indoxyl wurde dann nach Exposition gegenüber Luft zu Indigo oxidiert.
Man hatte zuvor gefunden, das NDO die Oxidation des aromatischen Kohlenwasserstoffes Naphthalin in (+)-cis-(1R, 2S)-dihydroxy-1,2-dihydronaphthalin katalysiert [Ensley et al., (1982) J. Bact., Band 149, S. 948-54]. U.S-Patent Nr. 4,520, 103, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschreibt die mikrobielle Herstellung von Indigo aus Indol durch ein aromatisches Dioxygenase-Enzym, wie NDO. Das NDO-Enzym umfaßt multiple Untereinheiten: ein Reduktase-Polypeptid (Rd; Molekulargewicht etwa 37.000 Dalton (37 kD)); ein Eisen- Schwefel-Ferredoxin-Polypeptid (Fd; Molekulargewicht etwa 13 kD); und ein terminales Oxygenase-Eisen-Schwefel-Protein (ISP). ISP selbst ist zusammengesetzt aus vier Untereinheiten mit einer α&sub2;β&sub2;-Untereinheitenstruktur (ungefähre Molekulargewichte der Untereinheiten: α, 55 kD; β, 21 kD). Man weiß, daß ISP Naphthalin bindet und in Gegenwart von NADH, Rd, Fd und Sauerstoff es zu cis-Naphthalin-Dihydrodiol reduziert. Fd ist das Geschwindigkeitsbeschränkende Polypeptid in dieser Naphthalin-Oxidations-Katalyse. Siehe die gemeinsam übertragene, erlaubte aber noch nicht erteilte U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/389,738, eingereicht am 08/04/89, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird, für eine genaue Diskussion der verschiedenen NDO-Untereinheiten, und Wege, um sie zu Zwecken der Indigo-Biosynthese zu verbessern.
Zusätzlich können aromatische Dioxygenasen, die von NDO verschieden sind, auch für die biosynthetische Produktion von Indigo nützlich sein. Ensley et al. beobachteten auch, daß ein Dioxygenase-Enzym von einem weiteren Pseudomonas-Stamm, der in der Lage ist, Toluol abzubauen, auch in der Lage war, Indigo herzustellen, wenn das Kulturmedium mit Indol supplementiert war. Für Details, siehe U.S.-Patentnummer 4,520,103, oben.
Es ist seit langem bekannt, daß Mikroorganismen biosynthetische Stoffwechselwege für die Produktion von 21 essentiellen Aminosäuren enthalten, einschließlich der aromatischen Aminosäure L-Tryptophan. Die de novo-Synthesen von aromatischen Aminosäuren (Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin) teilen einen gemeinsamen Stoffwechselweg bis zur Bildung von Chorismat. Nach der Synthese von Chorismat werden spezifische Stoffwechselwege für eine jede der verschiedenen aromatischen Aminosäuren verwendet, um deren Synthese zu vervoll-ständigen.
Die bakterielle Biosynthese von Tryptophan aus Chorismat steht unter der Kontrolle des Tryptophan (trp)-Operons. Das trp-Operon, zusammengesetzt aus regulatorischen Regionen und fünf Strukturgenen ist intensiv untersucht worden infolge seiner komplexen und koordiniert regulierten Systeme. Die regulatorische und strukturelle Organisation des trp-Operons, zusammen mit den katalytischen Aktivitäten, die von den Strukturgenen des Operons kodiert werden, sind in Fig. 1 gezeigt. Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist die Umwandlung von Indol-3'-Glycerin-Phosphat (InGP) in Verbindung mit L-Serin, zu L- Tryptophan. Die Reaktion wird katalysiert durch das Multi-Untereinheiten-Enzym Tryptophansynthase (TS). Während der Reaktion wird Indol als ein Zwischenprodukt hergestellt. Das Indol wird jedoch sehr schnell mit L-Serin stöchiometrisch kombiniert, um L-Tryptophan herzustellen. Somit wird kein freies Indol als ein Ergebnis dieser InGP plus L-Serin Konversion zu Tryptophan hergestellt.
Yanofsky et al. [(1958) Biochem. Biophys. Acta., Band 28, S. 640-41] identifizierten jedoch eine Tryptophan-Synthase-Mutante, die zur Akkumulation von Indol führt. Diese spezielle Mutante war jedoch Gegenstand spontaner Reversion zum Wildtyp-Phänotyp, da die Mutation von einem einzelnen Nukleotid-Basenpaarenaustausch in einem Gen stammte, das für eine der Untereinheiten der Tryptophan-Synthase codiert. Yanofski et al. PROC. NATL. ACAD. SCI. Vol. 45 (1959) Seiten 1016-1026 offenbart die Isolierung von Mutanten mit akkumuliertem Indol, wobei eine dieser Mutationen im Carboxy-Ende der beta-Untereinheit liegt. Die funktionellen Ergebnisse von Aminosäuremutation sind jedoch weitgehend nicht vorhersehbar.
Somit war ein Ziel der vorliegenden Erfindung, stabile Tryptophan-Synthasemutanten zu erzeugen, die in der Lage sind, hohe intrazelluläre Indoltiter zu erzeugen. Wenn solche Indol- Akkumulierungsmutanten auch ein aromatisches Dioxygenase-Enzym wie NDO exprimieren, kann dieses akkumulierte Indol zu Indoxyl umgewandelt werden. Solchermaßen hergestelltes Indoxyl kann dann oxidiert werden zu Indigo nach Exposition gegenüber Luft. Durch kommerzielle Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie ist ein neues und umweltverträgliches biosynthetisches Indigoproduktionsverfahren entwickelt worden, das Mikroorganismen, die stabil mit exogenen DNA-Molekülen transformiert sind, die ein modifiziertes ftp- Operon und eine aromatische Dioxygenase-Enzym codieren, verwendet.

Begriffsdefinition

Die folgenden Begriffe werden wie hierin definiert verstanden werden, sofern nicht anderweitig angegeben. Derartige Definitionen schließen ohne Rezitation jene Bedeutungen ein, die mit diesen Begriffen verbunden sind, die den Fachleuten bekannt sind.
Ein trp-Operon, das nützlich ist, die Indolakkumulierung in Mikroorganismen zu gewährleisten, ist ein trp-Operon, das aus einen Mikroorganismus als ein gereinigtes DNA-Molekül isoliert worden ist, das einen enzymatischen Stoffwechselweg codiert, der in der Lage ist, die Biosynthese von L-Tryptophan aus Chorismat zu steuern. Die Indolakkumulierung wird ermöglicht durch Modifikation von einem oder mehreren der Strukturelemente und/oder regulatorischen Elemente des Stoffwechselwegs. Dieses modifizierte trp-Operon kann dann in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeführt werden. Es sollte festgehalten werden, daß der Begriff "Indolakkumulierung" nicht notwendigerweise anzeigt, daß Indol tatsächlich intrazellulär akkumuliert. Statt dessen kann dieser Begriff anzeigen, daß das Indol hergestellt und verfügbar gemacht wird als ein Substrat für intrazelluläre katalytische Reaktionen, die verschieden sind von der Bildung von L-Tryptophan. Im Kontext dieser Erfindung kann das "akkumulierte" Indol verbraucht werden bei der Umwandlung von Indol zu Indoxyl durch eine aromatische Dioxygenase wie NDO, oder es kann tatsächlich intrazellulär aufgebaut werden, wie es der Fall wäre, wenn das erwünschte Endprodukt Indol ist.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "verstärkte" Indolakkumulierung die intrazelluläre Produktion und/oder Akkumulierung von Indol jenseits dessen, die in der von Yanofsky et al., oben, identifizierten Mutante beobachtet wird, nämlich wenn Lysin ersetzt wird durch Asparagin an Aminosäureposition 382 des Tryptophansynthase-beta-Untereinheit-Polypeptids, oder durch einen rekombinanten Organismus, der für die gleiche Mutation codiert. Die Bestimmung, ob verstärkte Indolakkumulierung erfolgte, umfaßt einen Vergleich der Indolakkumulierung infolge neuer Analoga im Gegensatz zu dem Indol, das unter den gleichen Bedingungen akkumuliert wurde durch das Analog mit Asparagin an Aminosäureposition 382 der Tryptophan- Synthase-beta-Untereinheit.
Ein geeigneter Wirtsmikroorganismus ist ein autonomer einzelzelliger Organismus, der nützlich ist für mikrobielle Indol- und/oder Indigo-Produktion und umfaßt sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Mikroorganismen. Nützliche Eukaryonten schließen Organismen wie Hefe und Pilze ein. Prokaryonten, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, schließen Bakterien ein wie E. coli, P. putida und Salmonelle tryhimurium.
Biosynthetische Konversion von Indol zu Indigo soll Indoxyloxidation zu Indigo, vermittelt durch Luft, umfassen.
Ein hierin verwendetes DNA-Molekül kann regulatorische und/oder strukturelle genetische Information codieren. Ein DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung soll auch umfassen: Nukleinsäuremoleküle, die Sequenzen codieren, die komplementär zu den vorgesehenen sind; Nukleinsäuremoleküle (DNA oder RNA), die unter stringenten Bedingungen an jene Moleküle hybridisieren, die vorgesehen sind; oder jene Nukleinsäuremoleküle, die ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes an die vorgesehenen Moleküle hybridisieren würden oder ihre komplementären Stränge. "Stringente" Hybridisierungsbedingungen sind jene, die die Bildung doppelsträngiger Nukleinsäurehybride von nicht-komplementären oder fehlgepaarten einzelsträngigen Nukleinsäuren minimieren.
Zusätzlich kann die Hybridisierungsstringenz beeinflußt werden durch die verschiedenen Komponenten der Hybridisierungsreaktion, einschließlich Salzkonzentration, der Anwesenheit oder Abwesenheit von Formamid, der Nukleotidzusammensetzung der Nukleinsäuremoleküle etc. Die Nukleinsäuremoleküle, die für die vorliegender Erfindung nützlich sind, können entweder natürlich gewonnen oder synthetisch sein.
Ein "exogenes" DNA-Molekül ist ein solches, das in den Wirtsmikroorganismus mittels eines Verfahrens eingeführt wurde, wie Transformation, Transfektion, Konjugation, Elektroporation, etc. Es ist zu beachten, daß es möglich ist, daß die Wirtszelle, in die das "exogene" DNA- Molekül eingeführt worden ist, selbst in natürlicher Weise auch Moleküle beinhaltet, die die gleichen oder ähnliche Sequenzen codieren. Zum Beispiel wird anerkannt, daß, wenn E. coli in dieser Erfindung als der Wirtsstamm verwendet wird, der Wirt normalerweise, auf seinem Chromosom, natürlicherweise ein trp-Operon enthält, das in der Lage ist, die Synthese von L- Tryptophan von Chorismat unter Bedingungen zu steuern, die die trp-Operon-Expression erlauben. Ein derartiges Molekül wird als ein "endogens" DNA-Molekül bezeichnet.
Ein stabil transformierter Mikroorganismus ist ein solcher, der ein oder mehrere exogene, eingeführte DNA-Moleküle aufweist, so daß die eingeführten Moleküle in geeigneter Weise beibehalten, repliziert und segregiert werden. Stabile Transformation kann erfolgen durch chromosomale Integration oder durch ein extrachromosomales Element, wie einen Plasmidvektor. Ein Plasmidvektor ist in der Lage, die Expression von Polypeptiden zu steuern, die durch spezielle DNA-Moleküle codiert sind. Die Expression wird reguliert durch einen induzierbaren (oder reprimierbaren) Promotor, der hohe Transkriptionstiter von funktionell assoziierten DNA-Molekülen erlaubt, die spezifische Polypeptide codieren, wie die strukturellen Gene eines trp-Operons, das wie hierin beschrieben modifiziert ist.
Die folgenden Drei-Buchstaben-Abkürzungen für die 20 essentiellen Aminosäurereste werden in dieser Beschreibung benutzt: Ala (Alanin), Arg (Arginin), Asn (Asparagin), Asp (Asparginsäure), Cys (Cystein), Glu (Glutaminsäure), Gln (Glutamin), Gly (Glycin), His (Histidin), Ile (Isoleucin), Leu (Leucin), Lys (Lysin), Met (Methionin), Phe (Phenylalanin), Pro (Prolin), Ser (Serin), Thr (Threonin), Trp (Tryptophan), Tyr (Tyrosin) und Val (Valin).

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül vor, das ein Polypeptidanalog einer Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit codiert, wobei das DNA-Molekül die Substitution zweier Codons umfaßt, das erste Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; und das zweite Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;², wobei das ersten Codon einen Aminosäurerest codiert, der ausgewählt ist aus Pro, Val, Ile, Leu und Ala, an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; und das zweite Codon einen Aminosäurerest codiert, der ausgewählt ist aus Asn, Gly und Met, an dem Codon entsprechend der Aminosäureposition trpB³&sup8;², was, wenn in die Tryptophan-Synthase eingebaut, zu erhöhter Indolakkumulierung in einem rekombinanten Mikroorganismenwirt führt verglichen mit einer Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit mit Asn anstelle von Lys an Aminosäureposition 382. Bevorzugterweise codiert die Codonsubstitution an dem Codon entsprechend der Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; für Pro und/oder die Codonsubstitution an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;² für Met, optional umfaßt sie weiter die DNA-Sequenzen für ein oder mehrere Gene, die ausgewählt sind aus trpE, trpD, trpC und trpA.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül vor, das ein Polypeptidanalog einer Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit codiert, wobei das DNA- Molekül eine Substitution von zwei Codons umfaßt, das erste Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; und das zweite Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;², wobei das erste Codon einen Aminosäurerest codiert, der ausgewählt ist aus Pro, Val, Ile, Leu und Ala, an dem Codon entsprechend der Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; und das zweite Codon einen Aminosäurerest codiert, der ausgewählt ist aus Asn, Gly und Met, an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;², was, wenn in die Tryptophan-Synthase eingebaut, zu einer verringerten Bildung von Tryptophan aus Indol und Serin in einem rekombinanten Mikroorganismenwirt führt relativ zu einer Tryptophan-Synthase, die eine Tryptophan-Synthase-beta- Untereinheit umfaßt mit Asn anstelle von Lys an Aminosäureposition 382.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht ein Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit-Analog vor, das zu einer erhöhten Indolakkumulierung in einer rekombinanten Mikroorganismen- Wirtszelle führt verglichen mit einer Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit mit Asn anstelle von Lys an Aminosäureposition 382, wobei das Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit- Analog Aminosäurerestsubstitutionen an Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; und an Aminosäureposition trpB³&sup8;² umfaßt, der aus Pro, Val, Ile, Leu und Ala ausgewählte Aminosäurerest an Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; ist und der Aminosäiurerest, der ausgewählt ist aus Asn, Gly und Met, an Aminosäureposition trpB³&sup8;² ist. Aminosäurerestsubstitution an Aminosäureposition 379 ist bevorzugterweise Pro anstelle von Arg, während an Aminosäureposition 382 Lys durch Gly und insbesondere Met ersetzt sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform des Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheits-Analogs wird Arg durch Pro an Aminosäureposition 379 ersetzt und Lys durch Met an Aminosäureposition 382.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die stabile Transformation oder Transfektion einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle mit den DNA-Molekülen, die in einer Weise hierin gelehrt wird, die erlaubt, daß die Wirtszellen die codierte Tryptophan-Synthase-beta- Untereinheit unter geeigneten Bedingungen exprimieren. Der prokaryontische Wirt Escherichia coli stellt einen solchen bevorzugten Wirtsmikroorganismus dar.
Ein biologisch funktioneller Plasmid- oder viraler DNA-Vektor, der ein DNA-Molekül der Erfindung umfaßt, stellt einen weiteren Aspekt dieser Erfindung dar. In einer Ausführungsform wird eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle, wie E. coli, mit einem solchen biologisch funktionellen Vektor stabil transformiert oder transfiziert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt Verfahren für die Biosynthese von Indol und Indigo unter Verwendung der DNA-Moleküle der Erfindung. Die Indolproduktion durch Mikroorganismen kann vorgenommen werden durch stabiles Transformieren oder Transfizieren eines Wirtsmikroorganismus mit einem DNA-Molekül der Erfindung und Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Biosynthese von Indol erlauben. In ähnlicher Weise kann Indigo hergestellt werden durch weitere Transformation oder Transfektion des obigen Mikroorganismus mit einem DNA-Molekül, das ein aromatisches Dioxygenase- Enzym, wie Naphthalin-Dioxygenase, codiert. Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Moleküls erleichtern, das für das Tryptophan-Synthasebeta-Untereinheit-Analog und die aromatische Dioxygenase codiert, erlaubt intrazelluläre Indolakkumulierung und Umwandlung von Indol zu Indoxyl, welches dann zu Indigo durch Exposition gegenüber Luft oxidiert wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. I sieht eine physikalische Karte vor, die die verschiedenen regulatorischen und strukturellen Elemente des trp-Operons von E. coli identifiziert. Zusätzlich sind auch die verschiedenen Proteine beschrieben, die durch die strukturellen Gene codiert sind, und die dadurch katalysierten chemischen Reaktionen.
Fig. 2 veranschaulicht graphisch die Indolsynthese und -akkumulierung während einer 1 L- Fermentation von pYTrp#26.
Fig. 3 stellt graphisch 1 L-Fermentationen von Mutante 5 dar [(- -), ohne Anthranilat; (- -) mit 300 mg/L Anthranilat] und pYTrp#26 [(- -) mit Anhtranilat; (- -), ohne Anthranilat].
Viele Aspekte und Vorteile der Erfindung werden für die FacHleute offensichtlich werden nach Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung, welche eine Veranschaulichung der Durchführung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen vorsieht.

Detaillierte Beschreibung

Gegenwärtige Verfahren der biosynthetischen Indigoproduktion setzen nur die Biokonversion von Indol zu Indigo unter Verwendung einer aromatischen Dioxygenase wie NDO ein. Dies erfordert den Zusatz von Indol zum Kulturmedium, da keine intrazelluläre Indolakkumulierung in derartigen Systemen erfolgt. Zu der Kultur hinzugesetztes Indol kann jedoch für Mikroorganismen toxisch sein. Das Wachstum von E.coli kann inhibiert werden, wenn Indol im Medium vorhanden ist. Bang et al. [(1983) Biotechnology and Bioengineering, Band 25, S. 999-1011] beschrieben die Wirkungen des Hinzufügens von exogenem Indol zu E.coli, der in Schüttelkolben in Minimalmedien angezogen wird. Sie fanden, daß sich bei Konzentrationen von bis zu 0,025% das bakterielle Wachstum verringerte, sich die Zellen aber an die Gegenwart von Indol über die Zeit anpaßten. 0,03% Indol beschränkte jedoch das Wachstum erheblich, wobei keine offensichtliche Anpassung erfolgte, und Indolkonzentrationen über 0,04% das Wachstum insgesamt unterbanden. Zusätzlich fanden Bang et al., oben, daß die Synthese von L-Tryptophan inhibiert wurde, wenn Indol in Konzentrationen von mehr als 0,2 g/100 ml hinzugesetzt wurde.
Um die inhärenten Beschränkungen der Indigosynthese durch Indol- Mediumsupplementierung zu vermeiden, bedarf es eines Systems, welches zu einer endogenen Indolbiosynthese befähigt ist. Ein solches System kann das Überführen eines exogenen DNA-Moleküles, das eine DNA-Sequenz für ein trp-Operon codiert, das modifiziert ist, um die Indol-Produktion und -Akkumulierung zu fördern, in einen rekombinanten Wirtsorganismus verwenden, der bereits in der Lage ist, NDO (bevorzugterweise geändert, wie oben diskutiert) zu exprimieren. Ein derartiges System würde die Produktion von Indigo aus Glucose oder anderen Kohlenstoffquellen erlauben. Optimalerweise würde ein solches System das endogen produzierte Indol effizient in Indoxyl in einer Art und Weise umwandeln, die die intrazelluläre Indolakkumulierung vermeidet.
Es ist seit langem bekannt, daß Indol als eine Zwischenverbindung bei der L-Trypthophan- Biosynthese produziert wird. Das solchermaßen produzierte Indol existiert jedoch nur übergangsweise, d. h. es existiert nur während der Biokonversion von InGP und L-Serin zu L- Tryptophan. Kein lösliches freies Indol akkumuliert als Ergebnis diese Biokonversion, die durch das aus mehreren Untereinheiten bestehende Enzym Tryptophan-Synthase (TS) katalysiert wird. TS ist eines von mehreren Enzymen, die durch das trp-Operon codiert werden und ist intensiv untersucht worden. Siehe z. B. Hyde et al., (1990) Biotechnology, Band 8, S. 27- 32; Djavadi-Ohaniace et al., (1986) Biochemistry, Band 25, S. 2502-08; und Ahmed et al., (1986) Biochemistry, Band 25, S. 3118-24. Die durch die fünf Genprodukte katalysierten Reaktionen, die von dem trp-Operon codiert werden, sind in Fig. 1 dargestellt.
TS ist zusammengesetzt aus einer α&sub2;β&sub2;-Untereinheiten-Struktur. Die α-Untereinheit katalysiert die Umwandlung von InGP zu Indol und D-Glyceraldehyd-3'-Phosphat und weist ein ungefähres Molekulargewicht von 29 kD auf. Die β-Untereinheit, die ein ungefähres Molekulargewicht von 43 kD aufweist, und die Reaktion L-Serin plus Indol katalysiert, um L- Trypthophan herzustellen, wobei ein Molekül H&sub2;O in dem Prozeß freigesetzt wird. Die β- Untereinheiten existieren als ein Dimer, als die β&sub2;-Untereinheit bezeichnet. β&sub2; assoziiert mit zwei α-Untereinheiten, um das α&sub2;β&sub2;-TS-Holoenzym zu bilden, welches eine ausgedehnte αßßα-Quartärstruktur aufweist. Das Holoenzym katalysiert die Reaktion von L-Serin plus InGP, um L-Tryptophan, D-Glyceraldehyd 3'-Phosphat und ein Molekül H&sub2;O zu bilden. Es wird kein freies Indol produziert, da es ein "kanalisiertes" Zwischenprodukt ist, d. h. Indol, das an der aktiven Stelle der α-Untereinheit produziert wird, wird intramolekular durch interne Diffusion zu der aktiven Stelle der β-Untereinheit transferiert [Hyde et al., (1990), oben]. TS- Mutanten, die nicht in der Lage sind, in geeigneter Weise Indol von der aktiven Stelle der α- Untereinheit zu der aktiven Stelle der β-Untereinheit zu kanalisieren, oder die eine geänderte aktive Stelle der β-Untereinheit aufweisen, können unfähig sein, L-Serin mit Indol zu kombinieren und sie können deshalb bei der Indigosynthese nützlich sein, da freies lösliches Indol vorgesehen werden kann, auf das NDO einwirken kann.
Die DNA-Sequenz des trp-Operons von E. coli wurde 1981 von Yanofsky et al. publiziert [Nucl. Acids Res., Band 9, Nr. 24, S. 6647-6668]. Die fünf Strukturgene des Operons werden als eine polycistronische Botschaft mit einer Länge von etwa 6.800 Ribonukleotiden transkribiert. Das am meisten 5'-gelegene Gen, trpE, wird durch die Nukleotide 279-1841 dieser polycistronischen Boten-RNA (mRNA) codiert. Die Nukleotide 1841-3436 codieren für das trpD-Genprodukt, während trpC codiert wird durch die Nukleotide 3440 bis 4798. Da TS das Enzym ist, von dem bekannt ist, daß es Indol produziert und dann bei der Herstellung von Tryptophan verwendet, können die Gene, die die α- und β-Untereinheiten codieren, nämlich die trpA (mRNA-Nukleotide 6003-6809) und trpB (mRNA-Nukleotide 4810-6003) Gene in einen geeigneten Vektor subkloniert werden, so daß eine ortsspezifische Mutagenese durchgeführt werden kann, um das resultierende TS-Holoenzym unfähig zu machen, Indol mit Serin zu kombinieren, um Tryptophan zu bilden.
Wie kürzlich berichtet, wurde von Yanofsky et al., oben, (1958) eine Punktmutation nahe dem Carboxyterminus (C-Terminus) des trpB-Gens beobachtet, speziell an Aminosäureposition 382, die zu intrazellulärer Indol-Akkumulierung führt. Später hat man gefunden, daß dieser einzelne Nukleotidaustausch an der dritten Nukleotidposition erfolgt ist in dem Codon, das normalerweise Lysin codiert. Diese Mutation führte zu Asparagin, das Lysin an dieser Position ersetzte. Infolge des Charakters der Mutation als an der dritten Position befindlich und nachteiliger Wirkung auf die Fähigkeit der Zelle, Tryptophan zu synthetisieren, war sie sehr instabil und Gegenstand einer Reversion zum Wildtyp-Genotyp. Entsprechend wird eine konstruierte Mutation bevorzugterweise mehr als diesen einen Nukleotid-Basenpaar- Austausch umfassen, wann immer möglich, um eine spontane Reversion zur Wildtyp- Sequenz zu vermeiden.
Die weit bekannte Technik der ortsspezifischen Mutagenese sieht einen verfügbaren Mechanismus vor, wobei der Austausch von Lysin gegen Asparagin an dem Codon entsprechend Aminosäureposition 382 des trpB-Gens, bezeichnet als Lys³&sup8;² zu Asn³&sup8;², stabilisiert werden kann. Eine solche stabilisierte Form umfaßt die Erzeugung einer Doppelmutante an diesem speziellen Codon, entsprechend trpB-Aminosäureposition 382 (trpB³&sup8;²), und verhindert somit wirksam eine spontane Reversion zum Wildtyp-Genotyp und -Phänotyp. Zusätzlich können auch andere Aminosäuren an dieser Stelle ausgetauscht werden in dem Bemühen, die Indol- Akkumulierung zu verbessern oder zu verstärken, da man beobachtet hatte, daß eine Substitution an diesem speziellen trpB-Rest zu intrazellulärer Indol-Akkumulierung führt. Zum Beispiel können Substitutionen vorgenommen werden auf der Grundlage von Unterschieden in der Ladung oder Größe der Seitenkette. Ein solcher bevorzugter Austausch umfaßt die Sub stitution von Lysin durch Glycin an trpB³&sup8;². In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann Lysin an dieser Position gegen Methionin ausgetauscht werden, obwohl diese spezielle Substitution, während sie zu erhöhter Indol-Akkumulierung als die Asn³&sup8;²-Substitution von Yanofski et al., oben (1958), führt, weniger Indol produziert als die Gly³&sup8;²-Mutation.
Aminosäuresubstitutionen an Positionen, die verschieden sind von trpB³&sup8;² können sich auch also nützlich erweisen beim Erzeugen von Indol akkumulierenden Mutanten. Zum Beispiel kann eine Aminosäuresubstitution an trpB³&sup7;&sup9;, dargestellt durch Arginin in der Wildtyp-β- Untereinheit, zu einem sogar noch signifikanteren Umfang an Indolakkumulierung führen. Nützliche Aminosäuresubstitutionen an trpB³&sup7;&sup9; können das Ersetzen des Wildtyp-Rests durch Ala, Ile, Leu, Pro oder Val, zusätzlich zu anderen Aminosäureresten, umfassen. Tatsächlich sieht man, daß sich, wenn Arginin an trpB³&sup7;&sup9; ersetzt wird durch Prolin, Indol intrazellulär um einen Faktor 20 gegenüber dem Titer akkumuliert, der für die Mutation von Yanofsky et al. gefunden wurde. Es ist wahrscheinlich, daß andere Aminosäurepositionen in trpB auch in vorteilhafter Weise hinsichtlich Indolakkumulierung mutagenisiert werden können. Andere potentiell nützliche Änderungen können das Zerbrechen des Indol-"Kanals" umfassen und somit die Wanderung von Indol von der α-Untereinheit zu der β-Untereinheit des Tryptophan-Synthase-Holoenzyms verhindern. In ähnlicher Weise sind auch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen an Resten möglich, von denen man glaubt, daß sie bei der Umwandlung von Indol und L-Serin zu L-Tryptophan in der β-Untereinheit beteiligt sind. Siehe Hyde et al., oben (1990).
Es sollte festgehalten werden, daß zusätzlich zu Aminosäuresubstitutionen an speziellen Aminosäureresten die vorliegende Erfindung auch die Insertion von zusätzlichen Aminosäureresten an einer oder mehreren speziellen Positionen ins Auge faßt, ebenso wie die Deletion von einem oder mehreren spezifischen Resten. Zusätzlich fallen auch Kombinationen von verschiedenen nützlichen Mutationen, die erhöhte Indolakkumulierung verursachen, wie Aminosäuresubstitutionen, -Insertionen und/oder -Deletionen, auch in den Schutzumfang dieser Erfindung. Eine solcher Doppelmutanten, bezeichnet als pYTrp#26, umfaßt Aminosäuresubstitutionen an zwei verschiedenen Positionen. Genauer gesagt zeigt pYTrp#26 die folgenden Änderungen gegenüber der Wildtyp-β-Untereinheit: Arg³&sup7;&sup9; wurde geändert zu Pro³&sup7;&sup9; und Lysin an Position trpB³&sup8;² wurde ersetzt durch Methionin.
Über die obigen trpB-Mutationen hinaus können sich auch andere Mutationen innerhalb des trp-Operons als nützlich erweisen dafür, die Indolakkumulierung durch Mikroorganismen möglich zu machen. Von besonderem Interesse sind Mutationen in dem trpA-Gen, die nach Expression noch zu einer Untereinheit führen können, die in der Lage ist, in das TS- Holoenzym zusammengesetzt zu werden und die Umwandlung von InGP zu Indol und D- Glyceraldehyd-3'-phosphat zu katalysieren, aber nicht in der Lage ist, an dem erforderlichen Indol-"Kanalisieren" teilzunehmen, welches für die L-Tryptophan-Synthese erforderlich ist. Auch werden Mutationen, die in nachteiliger Weise die Fähigkeit dieser Region beeinflussen, das "Kanalisieren" von Indol zu erleichtern, durch die vorliegende Erfindung ins Auge gefaßt, da die β-Untereinheiten des TS-Holoenzyms etwa zwei Drittel des Indol-"Kanals" umfassen [Hyde et al., oben, (1990)]. Weiterhin kann die ortsspezifische Mutagenese verwendet werden, um Aminosäuresubstitutionen, -Deletionen and/oder -Insertionen an der aktiven Stelle der β-Untereinheit zu konstruieren. Zum Beispiel kann eine Aminosäuresubstitution an Lys&sup8;&sup7; in der β-Untereinheit eine β-Untereinheit produzieren, die noch in der Lage ist, sich zum TS- Holoenzym zusammenzubauen, die aber nicht in der Lage ist, die Biokonversion von L-Serin und Indol zu L-Tryptophan zu katalysieren.
Zusätzlich zu dem Vornehmen von spezifischen Aminosäureaustauschen in den verschiedenen Polypeptiden, die durch die Gene des trp-Operons codiert werden, kann ortsspezifische Mutagenese verwendet werden, um die strukturellen organisatorischen und/oder regulatorischen Regionen des trp-Operons zu ändern. Die regulatorischen Systeme des Operons sind komplex und koordiniert und umfassen wenigstens drei Regulationsebenen. Auf der Proteinebene, in Gegenwart von überschüssigem L-Tryptophan, erfährt Anthranilat-Synthase, ein Multi-Untereinheiten-Enzym, dessen Untereinheiten codiert werden durch die trpE- und trpD-Gene, eine Feedback-Inhibierung [Henderson et al., (1970) J. Biol. Chem., Band 245, Seiten: 1416-1423]. Auf der Transkriptionsebene, in der Gegenwart von einem Überschuß an L-Tryptophan, beschränken aktivierte trp-Repressor-Moleküle die Transkriptionsinitiation auf etwa 1% ihrer maximalen Rate. Unter diesen Bedingungen kann Attenuation (für eine Erklärung siehe Yanofsky, C. (1987) TIG, Band 3, Nr. 12, Seiten: 356-360; Yanofsky et al., (1981) oben), die sowohl die Transkriptions- als auch Translations-Regulation umfaßt, die Transkription struktureller Gene um einen weiteren Faktor von sechs unterdrücken, obwohl noch ein signifikantes Grundniveau der Expression des trp-Operons erfolgt, wenn ein Überschuß an L-Tryptophan vorhanden ist [Roesser et al., (1989), J. Biol. Chem., Band 264, Nr. 21, Sei ten: 2284-2288]. Somit können Mechanismen, die eine stringentere Kontrolle der Transkription und/oder Translation erlauben, für die Indol- und Indigo-Synthese nützlich sein.
Das Entfernen des endogenen trp-Promotors von Plasmid-Konstrukten, die das trp-Operon enthalten, kann eine verstärkte regulatorische Kontrolle vorsehen. In einer Ausführungsform kann das 7,4 kb Eco RI - Sal I-Fragment, das für das trp-Operon codiert, in den Expressionsvektor pAC 1 cloniert werden, dessen Konstruktion detailliert in der US Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/389,738, oben, beschrieben ist. Diese Konstruktion wird als pYTrp bezeichnet. Der pACI-Plasmid-Vektor verwendet den Hitze-induzierbaren PL-Promotor des Phagen Lambda, um die Expression von DNA-Sequenzen zu steuern, die unmittelbar stromabwärts eingefügt sind. Es ist zu beachten, daß Expressionsysteme, die den PL-Promotor verwenden, die Anwesenheit der Repressorprotein-Mutante c1857 für eine geeignete Regulation benötigen. Das auf niedrigem Niveau konstitutiv exprimierte Gen, das cI&sub8;&sub5;&sub7; codiert, kann in das Chromosom eines geeigneten Wirtsstammes inseriert sein, wie der E.coli-Stamm FMS (A. T. C. C. Zugangsnummer Nr. 53911) oder es kann auf einem Plasmid enthalten sein.
Konstrukte wie pYTrp können so modifiziert sein, daß sie verschiedene Mutanten umfassen, die in dieser Erfindung erwähnt sind. In einer Ausführungsform, bezeichnet als pYTrp#26, wurde ein DNA-Fragment, das ein modifiziertes trpB-Gen codiert, das ein Polypeptid codiert, das in der Lage ist, erhöhte Titer an interazellulärem Indol zu produzieren, in pYTrp nach Ausschneiden der Wildtypsequenz subcloniert. Wenn in einem 1 l (Liter)-Fermenter kultiviert, produzierte pYTrp#26 etwa 30% seiner Gesamtausbeute an Indol vor der PL- Temperaturinduktion. Wenn der endogene trp-Promotor aus dem pYTrp#26p-Konstrukt entfernt wurde, indem etwa 400 bp (Basenpaare) von stromaufwärtiger, nicht-codierender trp- Operon-DNA entfernt wurden, zeigte das neue Konstrukt, pYTrp#26p-, eine erheblich engere Regulation und erhöhtes Wirtszellenwachstum verglichen mit einem bakteriellem Stamm, der pYTrp#26 enthält.
Das pYTrp#26p--Konstrukt enthielt jedoch noch die trp-Attenuator-Region, die für bis zu 90% der trp-Operon-Repression in vivo verantwortlich sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde ein Plasmid, bezeichnet als pYTrp#26att-, konstruiert, indem sowohl die trp-Promotor- als auch die -Attenuatorregionen von dem exogenen trp-Operon-Konstrukt deletiert wurden. Somit können die Strukturgene für die Indol-produzierende trp- Operonkonstruktion einzig durch den Promotor reguliert werden, der konstruiert ist, um die Expression von inserierten heterologen DNA-Sequenzen voranzutreiben, wenn derartige Sequenzen in den Expressionsvektor kloniert sind. Um die Expression der inserierten trp- Struktur-Gene zu optimieren, kann eine starke ribosomale Bindungsstelle mit Konsensus- Abstand zwischen dem Promotor des Expressionsvektors, wie den PL, und dem 5'-Ende des trpE-Genes eingeführt werden.
Es können auch Plasmide; die verschieden sind von pAC1, beim Ausführen der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Das gesamte trp-Operon, oder eine der bevorzugten Varianten, wie hierin gelehrt, kann in ein Plasmid, wie pBR322, inseriert werden. In einer Ausführungsform wurde ein Konstrukt erzeugt, das als pBRYTrp bezeichnet wurde (das das trp-Operon von pYTrp#26p- enthielt). Derartige Konstruktionen können eine erhöhte oder im Falle von pBRYTrp#26p- eine reduzierte Expressionskontrolle der inserierten DNA-Sequenz(en) aufweisen. Eine verringerte Expressionkontrolle (vor thermischer Induktion) in Fällen, wo Plasmide mit einer hohen Kopiezahl wie pBR&sub3;&sub2;&sub2; in Verbindung mit dem PL-Promotor verwendet werden, beruht möglicherweise auf dem Austitrieren der geringen Anzahl von cI&sub8;&sub5;&sub7;- Repressormolekülen, die in der Wirtszelle vorhanden sind. Entsprechend kann es sein, daß sich, wenn Plasmide mit moderater bis hoher Kopienzahl in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendet werden, extern regulierte Promotoren, die von PL verschieden sind, als nützlich erweisen.
Eine weitere Modifikation, die man an einem Indol-produzierenden trp-Operon vornehmen kann, besteht darin, den 3' nicht-translatierten Teil des Operons vollständig oder teilweise zu deletieren. In E. coli, ebenso wie in dem 7,4 kb-Fragment, das als Ausgangsmaterial in dieser Erfindung verwendet wurde, enthält diese 3'-Region sowohl eine rho-abhängige als auch rhounabhängige Transkriptionsterminations-Sequenz. Das Entfernen von einer jeden oder beider dieser Sequenzen kann durch die Fachleute leicht vorgenommen werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist nur der rho-abhängige Terminator entfernt, wobei etwa 250 bp 3' des trpA-Gens deletiert werden. Sollten jedoch beide Terminationssequenzen entfernt werden, ist es bevorzugt, daß eine weiter Terminationssequenz in der Vektor-DNA vorhanden ist, die funktionell verbunden ist mit dem 3'-Ende des eingefügten trp-Operons, um eine ausreichende Transkriptionstermination zu gewährleisten.
Weitere nützliche Modifikationen eines trp-Operons, die beim Ausführen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können ebenfalls gemacht werden. Zum Beispiel ist bei dem natürli chen E. coli-trp-Operon beobachtet worden, daß das Initiationscodon der trpD- und trpA-Gene mit den Terminationscodons der trpE- bzw. trpB-Gene überlappen. Die DNA-Sequenz, 5'- TGATG-3', die bei diesen Überlappungen beteiligt ist, ist identisch. Yanofski et al., oben (1981). Diese Überlappung ist als "Translationskopplung" bezeichnet worden und ist möglicherweise eine evolutionär entwickelte Vorrichtung, die bei der Translation polycistronischer mRNAs verwendet wird, um eine im Verhältnis stehende Produktion von funktionell in Beziehung stehenden Polypeptiden oder äquimolare Produktion von Proteinen, die Bestandteile eines Multi-Enzymkomplexes sind, zu gewährleisten. Das et al., (1984) Nucl. Acid Res., Band 12, Nr. 11, S. 4757-4768. Die Translationsprodukte von sowohl trpE/trpD- als auch trpB/trpA-Boten bilden αßßα-Komplexe. Im Gegensatz dazu überlappt das trpC-Gen, das einzige Mitglied dieses Operons, welches nicht für ein Polypeptid codiert, das in ein Multi- Untereinheiten-Enzym eingebaut wird, weder mit dem trpD-Gen-Terminator noch den trpB- Initationssequenzen. Stattdessen wird das trpC-Gen von sechs nicht-translatierten Nukleotiden an seinem 5'-Ende und 14 nicht-translatierten Nukleotiden an seinem 3'-Ende flankiert.
Es kann wünschenswert sein, die Überlappungen, die in den trpE/trpD- und trpB/trpA- Sequenzen vorhanden sind, zu beseitigen. Dies kann erfolgen, indem ein kleines synthetisches doppelsträngiges DNA-Fragement hergestellt wird, das zwei Restriktionsstellen überspannt, oder durch ortsspezifische Mutagenese. Unter Verwendung eines jeden der beiden Ansätze kann die inserierte DNA-Sequenz so konstruiert werden, daß sie die Terminations- und Initiations-Codons physikalisch von den verschiedenen Genen trennt. Die zwischen den Terminations- und Initiations-Codons liegende Sequenz kann als reine Trenn-Sequenz dienen. Das et al., a. O., schlagen jedoch vor, daß die reine Trennung von translationell gekoppelten Boten zu verringerten Titern der Translationsprodukte führen kann. Somit sollte eine jegliche Trennung, die an diesen überlappenden Sequenzen vorgenommen wird, nicht lediglich zum Abtrennen sein. Stattdessen sollten derartige Sequenzen so konstruiert sein, daß nach Termination der Translation des mehr 5' gelegenen Boten eine Translationsinitiation des distaleren Gens durch dasselbe Ribosom möglich ist. Somit kann eine ribosomale Bindungsstelle und/oder eine oder mehrere Restriktionsenzym-Erkennungsstellen, um die Klonierbarkeit der verschiedenen trp-Operon-Gene zu verbessern, in einer solchen Trenn-Region umfaßt sein. Zusätzlich könnten die nicht-translatierten Regionen, die das trpC-Gen flankieren, auch modifiziert werden, um ein oder mehrere der oben erwähnten Möglichkeiten einzuschließen.
Es ist bekannt, daß das trp-Operon wenigstens sechs ribosomale Bindungsstellen enthält, die auch bekannt sind als Shine-Delgarno-Sequenzen [Yanofsky et al., oben, (1981)]. Einem jeden der fünf trp-Strukturgene und die Leadersequenz (die den Attenuator umfaßt) geht eine solche Sequenz voran. Im Falle von trpD, trpC, trpB und trpA ist jedoch die Shine-Delgarno- Sequenz innerhalb der codierenden Region des ihm unmittelbar vorangehenden Gens angeordnet. Somit kann es in einem Bemühen, die Translationseffizienz zu optimieren, wie im obigen Paragraph vorgeschlagen, bevorzugt sein, das Operon so zu modifizieren, daß ein jedes Gen von den anderen in ausreichendem Maße getrennt ist, um ribosomale Bindungsstellen in nicht-translatierten Regionen unmittelbar benachbart zum 5'-Ende eines jeden Gens zu erlauben. Derartige Modifikationen könnten für irgendeines, einige oder alle der fünf trp- Strukturgene vorgenommen werden, obwohl in den Fällen der trpE/trpD- und trpB/rpA- Gene die Aufmerksamkeit darauf gerichtet sein müßte, Terminations- und Initiations-Codons beizubehalten.
Das trp-Operon ist in E. coli nur de-reprimiert, wenn der Organismus auf eine Umgebung trifft, die hinsichtlich Tryptophan verarmt ist, oder der es an Tryptophan fehlt, obwohl ein kontinuierliches niedriges Maß an Expression zu allen Zeiten beobachtet wird, um auf Umweltstreß zu antworten. Als ein Ergebnis dieser nur intermittierenden De-Repression ist die Codon-Verwendung, die in den codierenden Regionen der trp-Strukturgene beobachtet wird, charakteristisch für jene, die in anderen moderat exprimierten E. coli-Genen beobachtet wird, d. h. sie ist nicht zufällig, aber weniger beschränkt als die Codon-Verwendung, die bei hoch exprimierten E. coli-Genen beobachtet wird. Da das Ziel der Erfindung die Entwicklung eines effizienten, kommerziell lebensfähigen biosynthetischen Indigo-Produktionssystems ist, kann es bevorzugt sein, eine Rate an Indolsynthese über derjenigen zu ermöglichen, die möglich ist unter Verwendung eines modifizierten, gleichwohl im wesentlichen natürlichen, trp-Operons. Entlang dieser Linien kann man ein trp-Operon konstruieren, das, vollständig oder teilweise, nur Codons enthält, die in hoch-exprimierten E. coli-Proteinen gefunden werden. Diese Codons, oft bezeichnet als "bevorzugte" Codons, sind in der Technik weithin bekannt. Um ein solch optimiertes Operon, oder einen Teil davon, zu erzeugen, könnte man die Verfahrensweisen verwenden, die von Stabinsky, U.S. Patent Nr. 4,897,471, beschrieben sind, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Sollte ein anderer Wirt als E. coli verwendet werden, wie eine Hefe oder ein anderer bakterieller Stamm, wäre es wünschenswert, Codons, die von diesem Organismus bevorzugt werden, beim Konstruieren eines trp-Operons gemäß dieser Erfindung zu verwenden.
Alle großen mikrobiellen Gruppen besitzen die Fähigkeit, Tryptophan unter geeigneten Bedingungen zu synthetisieren. Alle enterischen bakeriellen Arten scheinen trp-Operons zu beinhalten, die strukturell so organisiert sind, wie das in E. coli gefundene. Andere Bakterientypen weisen Gene auf, die verschiedene trp-Operon-Komponenten an verschiedenen chromosomalen Stellen codieren. Die Elemente dieser dispergierten Systeme können auch unabhängig reguliert sein. Zusätzlich enthalten die verschiedenen Komponenten der trp-Operons in derartigen Mikroorganismen potentiell Gene, die für Polypeptide mit unterschiedlichen Maßen an Aminosäurehomologie verglichen mit ihren Gegenstücken in E. coli codieren. Zum Beispiel ist das trpA-Gen, welches in dem zu E. coli nahen Verwandten S. typhimurium gefunden wird, zu 85% homolog auf dem Nukleotidniveau und zu 96% homolog auf dem Aminosäureniveau, wenn verglichen mit dem trpA-Gen und -Protein von E. coli. Es ist wahrscheinlich, daß größere Unterschiede zu anderen Mikroorganismen existieren, die zu E. coli weiter entfernt sind. Somit besteht im Umfang dieser Erfindung die Möglichkeit, daß ein hoch effizientes Hybrid-trp-Operon konstruiert werden könnte durch Einbau von Komponenten von verschiedenen trp-Operons von Mikroorganismen und daß, wenn solch ein Hybrid- Operon modifiziert ist, wie hierin gelehrt, es bei der Produktion von Indol auf hohem Niveau effizienter sein könnte als irgendein modifiziertes, aber nicht-hybridisiertes trp-Operon.
Da die Indigo-Biosynthese durch Mikroorganismen, die bei Indol-supplementiertem Medium fehlt, erfordert, daß die Mikroorganismen in der Lage sind, exogene enzymatische Stoffwechselwege zu synthetisieren, die sowohl in der Lage sind, Indol zu produzieren als auch dann die Umwandlung von Indol zu Indoxyl zu katalysieren, können verschiedenen Kombinationen von Plasmiden, die diese verschiedenen Stoffwechselwege codieren, verwendet werden. Um eine geeignete Beibehaltung, Segregation und Propagation eines Indigo-Produktionssystems zu gewährleisten, das mehr als ein Plasmid verwendet, müssen die Plasmide von verschiedenen Komplementationsgruppen sein. Zusätzlich kann die Transkription der Gene der zwei Stoffwechselwege unter der Kontrolle eines einzigen Typs von Promotor sein, so daß nach Induktion beide Stoffwechselwege transkribiert werden. Zum Beispiel kann in einem Zwei- Plasmid-System die Expression von beiden Stoffwechselwegen unter der Kontrolle des PL- Promotors oder einer geeigneten Alternative stehen. Alternativ kann jeder Stoffwechselweg unter der Kontrolle eines Promotors sein, der durch einen anderen Mechanismus induziert wird. Ein derartiges System würde die Induktion der zwei Stoffwechselwege zu verschiedenen Zeiten ermöglichen, sofern erwünscht. Auf diesem Wege könnte die Indol- Akkumulierung vor der NDO-Synthese beginnen. Alternativ könnte NDO vor der Transkription und Translation des modifizierten trp-Operons synthetisiert werden, möglicherweise um die Umwandlung von Indol zu Indigo zu ermöglichen, ohne daß erlaubt wird, daß intrazelluläres Indol vor seiner Biokonversion zu Indoxyl zu toxischen Titern akkumuliert wird.
Die Erzeugung eines Einzelplasmid-Systems, auf dem beide enzymatischen Stoffwechselwege enthalten sind, ist auch im Umfang der Erfindung. In einem solchen System kann wiederum jeder Stoffwechselweg einen Promotor des selben Typs verwenden und damit gleichzeitig die Expression beider Operons ermöglichen. Es ist jedoch auch möglich, daß ein jeder Stoffwechselweg einen durch unabhängige Mechanismen induzierbaren Promotor verwenden könnte und somit die Induktion eines jeden Stoffwechselwegs gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeiten ermöglicht. In einem noch weiteren Aspekt können beide Stoffwechselwege funktionell verbunden sein, so daß nur ein Promotor verwendet werden muß. Dieser einzelne Promotor würde die Transkription beider Operons erlauben. Die Operons könnten so angeordnet werden, daß der NDO-Stoffwechselweg benachbart zum regulierbaren Promotor ist, gefolgt von dem trp-Operon. In ähnlicher Weise könnte das trp-Operon vor dem NDO- Operon inseriert werden.
Zusätzlich ist es möglich, Indol- und/oder Indigoproduktionssysteme auf der Basis von Mikroorganismen zu entwickeln, wobei ein oder mehrere der Gene, die Polypeptide codieren, die in diesen Prozessen beteiligt sind, in das Chromosom des Wirtsmikroorganismus integriert sind, im Unterschied dazu, daß es/sie in einem oder mehreren extrachromosomalen Elementen angeordnet ist/sind. Eine schnelle und irreversible chromosomale Integration kann gesteuert werden durch ein Integrationsplasmid, das konstruiert ist, um (via Rekombination) klonierte DNA-Moleküle in das Chromosom des Wirtsmikroorganismus abzugeben. Derartige Integrationsplasmide, die die DNA-Moleküle enthalten, die integriert werden sollen, werden in die erwünschten Wirtsmikroorganismen transformiert. Derartige Plasmide sind zur Aufrechterhaltung, Propagation, Segregation und Kontrolle der Kopienanzahl befähigt. Zusätzlich können selektierbare Marker, wie ein oder mehrere Wirkstoffresistenzgene, enthalten sein. Essentiell ist der Einschluß von Integrationssequenzen, die in der Lage sind, das Translokationsereignis zu steuern. Derartige Integrationssequenzen können erhalten werden von einer Vielzahl von Bakteriophagen- und Plasmidquellen. Die DNA-Moleküle, die translatiert werden sollen, werden zusätzlich zu dem/den erwünschten Strukturgen(en) die erforderlichen regulatorischen Gene und/oder Elemente umfassen, die für eine geeignete Expressionsregula tion der eingeschlossenen Strukturgene erforderlich sind. Wenn sie einmal integriert sind/ist, können/kann das/die trp-Operongen(e) und/oder aromatische Dioxygenase codierende Molekül(e) unter geeigneten Bedingungen exprimiert werden und dadurch die intrazelluläre Indol- Produktion und/oder Indigo-Biosynthese erleichtern.
Die allgemein rekombinanten DNA-Techniken, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie DNA-Isolierung und -Reinigung, Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen, Konstruktion von rekombinanten Plasmiden, Einführung von DNA in Mikroorganismen und ortsspezifische Mutagenese, sind in vielen Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich Manniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory (1982) und Current Protocols in Molecular Biology, herausgegeben von Ausubel et al., Greene Publishing Associates und Wiley Interscience (1987).
Die folgenden Beispiel werden angeboten, um die vorliegende Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, zusätzlich sehen die Beispiele bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vor, sollen aber den Schutzumfang davon nicht beschränken.

BEISPIEL 1

Klonieren des trp-Operons

Das 7,4 kb-Fragment, das das gesamte trp-Operon codiert, wurde aus Plasmid pGX50 (NRRL B-12264) unter Verwendung von Eco RI bis Sal I ausgeschnitten. Nach Agarosegel- Reinigung wurde dieses Fragment dann in pAC1 ligiert, der zuvor mit Eco RI und Xho I verdaut worden war und dann mit Phosphatase behandelt wurde, um ein Reannealieren von Vektor und Polylinker zu vermeiden. Das sich ergebende Plasmidkonstrukt wurde als pYTrp bezeichnet.

BEISPIEL 2

Erzeugung von Indol akkumulierenden trpB-Mutanten

Um ein trp-Operon zu erzeugen, das in der Lage ist, die Akkumulierung von intrazellulärem Indol auf hohem Niveau zu steuern, wurde pYTrp dann mit Hpa I und Bam HI verdaut und dadurch ein 1, 2 kb Fragment freigesetzt, das die C-terminale Region des trpB-Gens in Verbindung mit dem gesamten trpA-Gen enthält. Nach Agarosegel-Reinigung des Hpa I/Bam HI- Fragmentes wurde es in Plasmid p1036 ligiert, welches zuvor mit Hpa I und Bam HI verdaut wurde. p1036 wurde erzeugt durch Substituieren des Sst I bis Aat II-Fragmentes (enthaltend ein Kanamycin-Resistenzgen) von pCFM836 (siehe U.S-Patent Nr. 4,710,473, welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) mit einem ähnlichen Fragment von pCFM636 (US- Patent Nr. 4,710,473, oben) und durch Substituieren der DNA-Sequenz zwischen den einzigen Aat II- und Eco RI-Restriktionsstellen (die einen synthetischen PL-Promotor enthalten) durch das folgende Oligonukleotid-Duplex:
SEQ ID NO: 1 : 5' CATCGATTCTAG 3'
SEQ ID NO: 2 : 3'TGCAGTAGCTAAGATCTTAA 5'
Das Klonieren des Hpa I/Bam HI-Fragmentes erzeugte das intermediäre Plasmid p1036A/B. p1036A/B wurde dann mit Eco RI und Bam HI verdaut und das 1.200 bp-Fragment, das die erwünschte Sequenz trägt, wurde gelgereinigt. Das sich ergebende gelgereinigte Fragment wurde dann in in ähnlicher Weise verdaute M13mp11-RF-DNA ligiert und in kompetente E. coli JM 109 durch Standardtechniken transformiert. Ein Plaque, von dem man gefunden hatte, daß er das erwünschte Konstrukt enthält, wurde isoliert und als mpA/B bezeichnet. Einzelsträngige (SS) DNA wurde dann aus mpA/B hergestellt, um als das Substrat für ortsspezifische Mutagenese entsprechend den Standardverfahren zu dienen.
Da bekannt war, daß kürzlich beobachtet worden war, daß eine spezielle trpB-Punktmutation an dem Codon entsprechend der Aminosäureposition 382 (wo Lys durch Asn ersetzt wurde) zur Produktion von nachweisbaren Mengen intrazellulären Indols führte [Yanofsky et al., oben, (1958)], wurden Oligonukleotide konstruiert und synthetisiert, um die Substitution des Wildtyprestes für eine weitere an dieser Position zu ermöglichen. Da die DNA-Sequenz des trp-Operons, und des trpB-Gens insbesondere, in der Literatur beschrieben worden ist, ist die Konstruktion von Oligonukleotiden, die hierin nützlich sind, leicht im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmannes. Die trpB-DNA-Sequenz [SEQ ID NO: 3] und die korrespondierende Aminosäuresequenz, die von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist, lautet wie folgt:
Jede hergestellte Substitution wurde so konstruiert, daß wenigstens zwei aufeinanderfolgende Nukleotide geändert wurden und damit die Wahrscheinlichkeit einer Reversion zum Wildtyp- Genotyp wesentlich verringert wurde. Mit diesen Oligonukleotiden zur Hand wurde dann eine ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von SS mpA/B-DNA durchgeführt.
Nach den Mutagenese-Reaktionen wurden die Produkte seriell verdünnt und in kompetente JM109 transformiert und plattiert. Nach einer Übernachtinkubation wurden Platten, die mehrere hundert Plaques für eine jede der verschiedenen Mutationen enthielten, mit Nitrozellulose überschichtet, was erlaubt, daß Phagen-Partikel überführt werden. Nach Denaturieren und Neutralisieren wurden die Filter, an die die SS-Phagen-DNA nun gebunden waren, unter Haus-Vakuum für 2 Stunden bei 80ºC gebacken. Die Filter wurden dann mit radiomarkierten Sonden hybridisiert, wie beschrieben in Manniatis et al., oben, wobei die Sonde dasjenige Oligonukleotid ist, das für die spezifische Mutagenesereaktion verwendet worden war. Nach Hybridisierung wurden die Filter unter stringenten Bedingungen gewaschen [2X SSC (1X SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 4ºC unter der theoretischen Schmelztemperatur], um nicht-spezifische Hybridisierung zu entfernen und dann autoradiographiert. Die verwendeten Waschbedingungen schwankten infolge der Verwendung von verschiedenen Sonden, von verschiedenen Längen und verschiedenen Sequenzen. Zu Zwecken von Hybridisierungen und Waschungen wurden Oligonukleotid- Schmelztemperaturen (TM) durch Zuweisung von 2ºC für jedes A oder T in der Sonde und 4ºC für jedes C oder G und Aufsummieren des Ergebnisses für jedes Oligonukleotid berechnet.
Unter Verwendung der Autoradiographie-Ergebnisse wurden mutmaßliche positive Plaques isoliert und wenigstens einer Runde einer Plaque-Reinigung unterzogen. Einer oder mehrere derjenigen Plaques, von denen man festgestellt hatte, daß sie stark mit ihrer spezifischen Sonde hybridisieren, wurde dann von seiner entsprechenden Platte entfernt, seriell verdünnt und verwendet, um eine frische JM109-Kultur in logarithmischer Phase zu tranfizieren. Nach einer kurzen Infektionsperiode wurden die Mischungen dann ausplattiert und zu wachsen er laubt. Die Nitrozellulosebindungs- und Hybridisierungsverfahrensweise wurde dann wieder für jegliche mutmaßliche Mutante durchgeführt.
Nach Bestätigung durch Hybridisierung, daß die erwünschte Mutante erhalten worden war, wurde RF-DNA für eine jede Mutante hergestellt. Diese RF-DNA wurde dann mit Hpa I und Bam HI verdaut und damit eine spezielle trpB-Mutante als ein Hpa I- bis Bam HI-Fragment ausgeschnitten. Für jede Mutante konnte dieses Fragment in pYTrp ligiert werden, welches zuvor mit Hpa I und Bam HI verdaut und gelgereinigt worden war. Diese Ligationsreaktionen wurden dann verwendet, um einen kompetenten E. coli-Stamm FMS zu transformieren. Eine Kolonie von einer jeden der sich ergebenden Transformanten wurde dann in einem Schüttelkolben unter Bedingungen kultiviert, die die Transkription und Translation der Plasmidgetragenen trp-Operon-Genen erlaubten. Ein derartiges Wachstum erfolgte durch Anziehen der Kultur in einem Minimal-Medium (zusammengesetzt aus 6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g NaCl und 1 g NH&sub4;Cl pro Liter) bei 30ºC auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,3, Verschieben der Temperatur auf 42ºC für 1,5 Stunden und dann Absenken der Temperatur auf 30ºC für 2 Stunden, wobei zu der Zeit 300 ug/ml Anthranilat hinzugesetzt wurde. Die Kulturen wurden dann weitere 7 Stunden angezogen, bevor sie geerntet und kolorimetrisch auf intrazelluläres Indol analysiert wurden.
Der kolorimetrische Indoltest filz jede Mutante wurde durchgeführt durch Extrahieren von 500 ul Zellen (wie oben angezogen) mit 500 ul Toluol. Die Extraktion wurde vorgenommen durch Vortexen der Zellen bei Raumtemperatur für 5 Min. Die organische Phase wurde dann entfernt. 100 ul der extrahierten organischen Phase wurden dann zu 5 ml Testmischung (5,56 g p-Methylaminobenzaldehyd in 1 l Ethanol-Säure (80 ml konzentrierte HCl + 920 ml Ethanol)) hinzugegeben, gevortext und dann bei Raumtemperatur für 15-20 Min. stehen gelassen, wobei nach der Zeit die OD&sub5;&sub4;&sub0; gemessen wurde. Die Ergebnisse wurden mit einer Indol- Standardkurve verglichen, die hergestellt wurde durch Messen der A540, die erzeugt wurde, wenn 0, 2, 4, 6, 8 oder 10 ug Indol (genommen von einer frisch hergestellten Indol- Stammlösung, 100 ug/ml dH&sub2;O), wie oben beschrieben, getestet wurden.
Die obigen Verfahrensweisen wurden verwendet, um eine Serie von Mutanten zu analysieren, die konstruiert wurden, um eine einzelne Aminosäuresubstitution bei trpB³&sup8;² einzuführen. Zusätzlich wurden auch Mutationen erzeugt an der Position entsprechend trpB³&sup7;&sup9;. Man hat gefunden, daß das Substituieren von Pro gegenüber dem Wildtyprest an dieser Position eine mehr als fünffache Erhöhung der Indolakkumulierung bewirkte verglichen mit der besten trpB³&sup8;²-Mutante, nämlich Gly³&sup8;². Da man gefunden hatte, daß zwei Stellen unabhängig in der Lage waren, intrazelluläre Indolakkumulierung zu erlauben, wurde eine Serie von Doppelmutanten, mit Änderungen sowohl an trpB³&sup7;&sup9; als auch trpB³&sup8;² erzeugt. Die verschiedenen erzeugten Mutanten und die Menge an Indol, die sie produzierten, sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
Keine der erzeugten Doppelmutanten wies jedoch eine verglichen mit Pro379 erhöhte Fähigkeit auf, Indol zu akkumulieren, obwohl in der Pro379/Met3g2-Doppelmutante, bezeichnet als pYTrp#26, 150 mg/l Indol nachgewiesen wurden. Dieser Indoltiter war etwa der gleiche wie er in der besten Einzelmutante, Pro379, nachgewiesen wurde. Das Sequenzieren von DNA wurde an einer jeden der Indol akkumulierenden Mutanten vorgenommen, um die Anwesenheit der angenommenen Änderungen zu bestätigen. Da pYTrp#26 fast genauso viel Indol produzierte wie eine jegliche Einzelmutante, wurde sie für das weitere Studium ausgewählt, da eine Reversion zum Wildtyp-Phänotyp und/oder -Genotyp in einer Doppelmutante viel weniger wahrscheinlich erfolgen würde.

BEISPIEL 3

Fermentation von Indol akkumulierenden Mutanten

Da Schüttelkulturstudien anzeigten, daß wesentliche Mengen an intrazellulärem Indol durch pYTrp#26 produziert werden konnten, wurden Fed batch-Fermentationen im kleinen Maßstab mit dieser und anderen Konstrukten durchgeführt, um die Indolproduktion und Akkumulierung in einem realistischeren industriellen Ansatz zu überprüfen. Die Fed batch- Fermentationen wurden durchgeführt in einem kleinen 1 l Chemostaten unter Kohlenstofflimitierenden Wachstumsbedingungen. Das anfängliche Batch-Medium wurde hergestellt in einer sterilen 2 l Flasche durch Vereinigen von zuvor hergestellten, sterilen Lösungen. Das Medium wurde hergestellt durch Kombinieren von 200 ml Lösung I (6 g Hefeextrakt plus dH&sub2;O auf ein Endvolumen von 200 ml), 200 ml Lösung 2 (3,75 g (NH4)2SO&sub4;, 8,4 g K&sub2;HPO&sub4; und 4,6 g KH&sub2;PO4 plus dH&sub2;O auf ein Endvolumen von 200 ml), 15 ml einer 40% Glucose- Lösung, 4,8 ml 1 M MgSO4, 2,4 ml einer Spurenmetallösung (Tabelle 2), 2,4 ml einer Vitamin- und Mineralienlösung (Tabelle 3), 775 ml dH&sub2;O, Ampicillin auf 100 ug/ml und 200 ul Antischaum.

TABELLE 2

Spurenmetallösung

Verbindung q/l

FeCl&sub3; · 6H&sub2;O 27,0 ± 0,3
ZnCl&sub2; 2,0 ± 0,03
CoCl&sub2; · 6H&sub2;O 2,0 ± 0,03
NaMoO&sub4; · 2H&sub2;O 2,0 ± 0,03
CaCl&sub2; · 2H&sub2;O 1,0 ± 0,02
CuCO&sub4; · 5H&sub2;O 1,9 ± 0,03
H&sub3;BO&sub3; 0,5 ± 0,01
MnCl&sub2; · 4H&sub2;O 1,6 ± 0,03
Natriumcitrat · 2H&sub2;O 73,5 ± 1,0
[Herzustellen durch Auflösen der Bestandteile in etwa 90% des gesamten Ansatzvolumens mit gereinigtem H&sub2;O; nach Lösen Einstellen des erwünschten Endansatzvolumens unter Verwendung von gereinigtem H&sub2;O; Sterilisieren durch Filtrieren durch einen 0,2 um Filter]

TABELLE 3

Vitamin- und Mineralienlösung

Verbindung q/l

Biotin 0,06 ± 0,001
Folsäure 0,04 ± 0,001
Pyridoxin 1,4 ± 0,03
Riboflavin 0,42 ± 0,008
Pantothensäure 5,4 ± 0,11
Niacin 6,1 ± 0,12

Verbindung ml/l

10 N NaOH 5,31 ± 0,11
[Herzustellen durch: (a) Lösen von Biotin, Folsäure und Riboflavin in etwa 4% des gesamten Ansatzvolumens unter Verwendung von gereinigtem H&sub2;O und 5,65 ± 1,9% des Gesamtansatzvolumens 10 N NaOH; nach Auflösen Einstellen auf 5% des Gesamtansatzvolumens unter Verwendung von gereinigtem H&sub2;O; (b) Auflösen von Pyridoxin und Niacin in etwa 2% des Gesamtansatzvolumens unter Verwendung von gereinigtem H&sub2;O und 94,2 + 0,19% des Gesamtansatzvolumens 10 N NaOH; nach Auflösen Einstellen auf 2,5% des Gesamtansatzvolumens unter Verwendung von gereinigtem H&sub2;O; (c) Auflösen von Pantothensäure in etwa 2% des Gesamtansatzvolumens unter Verwendung von gereinigtem H&sub2;O und 0,188 + 0,019% des Gesamtansatzvolumens 10 N NaOH; nach Auflösen, Einstellen auf 2,5% des Gesamtansatzvolumens unter Verwendung von gereinigtem H&sub2;O; (d) Kombinieren der in (a), (b) und (c) hergestellten Lösungen und Einstellen auf das Gesamtansatzvolumen unter Verwendung von gereinigtem H&sub2;O; und (e) Sterilisieren der Lösung durch Filtration durch einen 0,2 um Filter]
Das Batch-Medium wurde dann hinzugesetzt zu einem zuvor sterilisierten Chemostaten und auf 30ºC vorgeheizt. Das Rühren wurde auf 1.000 UpM eingestellt, die Luftflußrate wurde auf 3 l/min eingestellt und die pH-Kontrolleinrichtung wurde eingestellt, um einen LösungspH von 7,0 ± 0,2 beizubehalten unter Hinzufügen entweder von H&sub3;PO&sub4; oder NH&sub4;OH. Der Fermenter wurde dann auf eine End-OD&sub6;&sub0;&sub0; von etwa 0,02 - 0.03 inokuliert unter Verwendung einer frischen Übernachtkultur. Man erlaubt der Kultur, bei 30ºC zu wachsen, bis eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von etwa 8,7 erreicht wurde. An diesem Punkt wurde das Hinzufügen einer Feed-Lösung¹ (¹ Füge zu einer sterilen 500 ml Flasche die folgenden zuvor sterilisierten Lösungen hinzu: 60 ml Lösung 3 (15 g Hefeextrakt, 15 g Bacto-Trypton und dH&sub2;O auf 60 ml); 160 ml einer 63,5% Glucose-Lösung; 8 ml 1 M MgSO&sub4;, 2 ml Spurenmetalle, siehe oben; 2 ml Vitamine und Mineralien, siehe oben; und Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 um/ml.) angefangen entsprechend dem folgenden Schema:

OD&sub6;&sub0;&sub0; Zufuhr-Rate (ml/hr)

8,7 1,25
14,9 1,9
19,8 3,1
24,8 5,0
37,2 7,5
62,0 11,25
74,0 20,0
86,8 25,0
Wenn die Kultur eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 65 bis 75 erreichte, wurde die Transkription des modifizierten trp-Operons induziert durch Verschieben der Kulturtemperatur auf 42ºC für 1,5 Stunden. Nach Induktion wurde die Temperatur der Kultur schnell auf 30ºC eingestellt. Die Fermentation wurde dann für weitere 8 Stunden fortgesetzt.
Unter Verwendung des obigen Fermentationsverfahrens wurde die Indolsynthese und -akkumulierung in pYTrp#26 studiert. Die Ergebnisse erscheinen in Fig. 2. Zusätzlich wurde auch Mutante #5 (Tabelle 1, oben), die nur eine einzelne Mutation beinhaltete und ein intermediärer Indolproduzierer in Schüttelkulturen war, in dem 1 l-Fermenter getestet. Die Ergebnisse dieser Fermentationen erscheinen in Fig. 3. Wie gezeigt, produzierte pYTrp#26 etwa 1g/l Indol 13 Stunden nachdem die trp-Operon-Expression induziert worden war. Die Fähigkeit der Zellen, in Gegenwart von mehr als 0,04 bis 0,05% Indol zu wachsen, war auch unerwartet mit Blick auf den Stand der Technik. Siehe, zum Beispiel, Bang et al., oben, (1983). Die Optimierung der Fermentationsbedingungen sollte ein wesentlich erhöhtes Maß an Indolproduktion erlauben.

BEISPIEL 4

Deletion des Try-Operon-Promotors

Zusätzlich zum Erzeugen spezifischer Mutationen in speziellen Genen des trp-Operons, die konstruiert wurden, um eine Indolproduktion auf hohem Niveau zu ermöglichen, kann die Indolproduktion weiter verfeinert werden durch die Deletion des endogenen trp-Promotors. Das Entfernen dieses Promotors sollte die Effizienz der Transkription des Operons von dem PL-Promotor durch Beseitigen des Repressionspotentials durch das trp-Repressor-Protein erhöhen. Zusätzlich wird die Entfernung des trp-Promotors eine verbesserte Transkriptionsregulierung des trp-Operons ermöglichen, das bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nämlich durch Reduzieren der "Undichtigkeit", da der trp-Promotor nicht länger eine Transkriptionsinitüerung erlauben wird, selbst während PL reprimiert ist.
Die Entfernung des endogenen trp-Promotors wurde erreicht durch Verdauen von pYTrp#26 mit Xba I und Spe I, wobei die Xba I-Stelle in dem Polylinker des Plasmids ist und die Spe I- Stelle nahe des 3'-Endes des trp-Promotors sitzt. Die Entfernung dieses Fragments diente auch dazu, um etwa 400 bp von zusätzlicher DNA 5' des trp-Promtors zu entfernen. DaXba I und Spe I identische 3'-Überhänge nach dem Verdau ergeben, erlaubt die Entfernung des zwischengeschalteten Fragments auch, daß die komplementären "klebrigen Enden" zusammenkommen. Somit erlaubte man, nach Agarosegel-Reinigung, daß die klebrigen Enden des linearisierten Plasmids annelierten und die Sequenzen ligierten. Bei dem sich ergebenden Konstrukt wurden sowohl Xba I- als auch Spe I-Stellen verloren. Dieses neue trp-promotorlose Konstrukt wurde als pYTrp#26p- bezeichnet.
Schüttelkulturexperimente wurden dann durchgeführt, um die Indolproduktion in pYTrp# 26pmit derjenigen in pYTrp#26 zu vergleichen. Diese Studien zeigten, daß pYTrp#26p- soviel wie oder leicht mehr Indol herstellte und besser als pYTrp#26 reguliert zu sein schien.
Um die Schüttelkulturergebnisse zu untermauern und um einen Vergleich in einem kommerziell realistischeren Aufbau vorzunehmen, wurden 1 l-Fermentationen durchgeführt, worin beide Konstrukte auf Indolproduktion getestet wurden. Die Fermentationsbedingungen, die hier verwendet wurden, waren die gleichen wie jene in Beispiel 2 verwendeten. Diese Ergebnisse zeigten an, daß das neue promotorlose trp-Operonkonstrukt nicht nur mehr Indol als pYTrp#26 produzierte, sondern daß das promotorlose Konstrukt auch eine verbesserte Regulation der trp-Operon-Expression zeigte. Vor Temperaturinduktion des PL-Promotors produzierte pYTrp#26p- wenig oder kein Indol. Im Gegensatz dazu machte das pYTrp#26- Konstrukt etwa 30% seiner Gesamtindolausbeute vor der trp-Operon-Induktion. Diese verbesserte Regulierung schien auch die Wachstumsrate von pYTrp#26p-, verglichen mit pYTrp#26, zu erhöhen.

BEISPIEL 5

Deletion des Trp-Operon-Attenuators

Wie in Beispiel 4 beschrieben, kann die Deletion von endogen trp-regulatorischen Regionen von dem trp-Operon, das in dieser Erfindung verwendet wird, zu erhöhter Indol-Synthese führen. Über die Entfernung des trp-Promotors hinaus war es auch möglich, ein nützliches modifiziertes Operon zu erzeugen, das die trp-Attenuator-Region auch deletiert hatte. Da der Auenuator für bis zu 90% der Transkriptionsrepression des trp-Operons in vivo verantwortlich sein kann, erwartete man, daß das Entfernen dieser Region eine verbesserte Indolproduktionsrate erlauben würde.
Um den trp-Attenuator zu deletieren, der zwischen dem trp-Promotor und dem Amino- Terminus des trpE-Gens angeordnet ist, wurde ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, wobei eine einzige Xho I-Stelle neun Codons stromabwärts des Insertionscodons des trpE-Gens hinzugefügt wurde. Das Hinzufügen dieser Restriktionsstelle erlaubte die Beibehaltung der Wildtyp-Aminosäuresequenz des trpE-Gens infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes. Unter Verwendung dieser Stelle war es möglich, die native Promotor/Attenuator- Region dudrch Verdau mit Xho I und Xba I zu entfernen. Ein synthetischer Xho I/Xba I- Linker, konstruiert, um die neun 5'-Codons des trpE-Gens zu rekonstituieren, wurde dann verwendet, um das Konstrukt zu vervollständigen. Zusätzlich wurde der Linker konstruiert, um eine wirksame ribosomale Bindungsstelle mit Konsensus-Entfernung vom PL zu enthalten. Schließlich wurde das 3'-Ende des Linkers konstruiert, um die anfänglichen neun Codons für das trpE-Gen zu enthalten, und die verwendeten Codons sind jene, die von E. coli "bevor zugt" sind. Somit bestand das Ergebnis dieser Konstruktion, bezeichnet als pYTrp#26att-, darin, die trp-Promotor- und -Attenuator-Regionen zu deletieren; das trpE-Gen nahe dem PL zu positionieren, getrennt durch eine starke ribosomale Bindungsstelle; und ein trpE-Gen vorzusehen mit "bevorzugten" E coli-Codons in den ersten neuen Positionen des offenen Leserahmens des Gens.
Dieses Plasmid wurde dann in FM5 transformiert und in Schüttelkulturen mit FMS verglichen, die pYTrp#26p- enthielten. Man fand, daß der pYTrp#26att- -enthaltende Stamm langsamer als der mit pYTrp#26p- transformierte Stamm wuchs. Die Attenuator-defiziente Konstruktion erlaubte jedoch die Produktion von wesentlich mehr Indol.

BEISPIEL 6

Deletion des Rho-abhängigen Trp-Operon-Terminators

Zusätzlich zum Entfernen des trp-Promotors, Attenuators (oder beiden) und unwesentlicher nicht-codierender 5'-DNA vom trp-Operon ist es auch möglich, DNA 3' vom trpA-Gen zu deletieren. Gemäß diesen Leitlinien wurde eine DNA-Sequenz mit einer Länge von etwa 250 Basenpaaren, die einen rho-abhängigen Terminator enthält, von pYTrp#26 entfernt durch Verdauen des Plasmids mit Ssp I und Bam HI unter Verwendung einer 5'-Exonuclease- Aktivität, um den 5'-Überhang, der von dem Bam HI-Verdau übriggeblieben ist, zu entfernen; Reinigen des linearisierten Plasmids von dem kleinen, ausgeschnittenen Fragment; und Ligieren des sich ergebenden gelgereinigten, linearisierten Plasmids mit sich selbst. Wenn diese Konstruktion, die noch einen rho-unabhängigen Terminator 3' zum trpA-Gen enthält, hinsichtlich Indol-Produktion in Schüttelkulturen mit pYTrp#26 verglichen wurde, zeigte sich keine Verbesserung. Deletion dieser zusätzlichen DNA schien augenscheinlich keine nachteiligen Wirkungen auf die Indol-Produktion oder Plasmid-Stabilität zu haben, und somit kann die Deletion insoweit nützlich sein, als daß das Indol-produzierende trp-Operon weiter durch die Eliminierung zusätzlicher nicht-codierender DNA rationalisiert wurde.

BEISPIEL 7

Translozierte Wirtsstämme

Da die biosynthetische Indigo-Produktion aus Glucose sowohl einen enzymatischen Stoffwechselweg mit der Fähigkeit, intrazellulär Indol zu produzieren, benötigt als auch einen enzymatischen Weg, der die Fähigkeit besitzt, dieses Indol zu Indoxyl umzuwandeln, ist es notwendig, daß der Stamm, der Indigo produziert, beide Stoffwechselwege enthält. Ein Weg, auf dem dieses erreicht werden kann, besteht darin, einen jeden der beiden Stoffwechselwege (trp oder NDO) in das Chromosom eines geeigneten Wirtsbakteriums zu integrieren und, nach erfolgreicher Integration, den Wirt mit dem anderen Stoffwechselweg zu transformieren, so daß er extrachromosomal beibehalten wird.
In einem solchen Verfahren wurde das Indol-erzeugende trp-Operon aus pYTrp#26 als ein Aat I bis Bam HI-Fragment ausgeschnitten, mittels Agarosegel gereinigt und dann in den Translokationsvektor pCFM2202 inseriert, der ein DNA-Fragment von einem pBR322- Konstrukt enthält, das Tn5-Transposasegen umfaßt und die ISSOL-Insertionssequenz enthält, die an einer jeden Seite der zu integrierenden DNA für die chromosomale Integration essentiell ist [Sasakawa et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Band 79, Seiten 7450-7454]. Der Translokationsvektor sieht eine Selektion unter Verwendung des Antibiotikums Tetracyclin vor. Zusätzlich steuert er die Integration der erwünschten, eingefügten DNA-Sequenz, hier des modifizierten trp-Operons, zusammen mit dem Strukturgen für das cI&sub8;&sub5;&sub7;-regulatorische Element, welches selbst unter der Kontrolle eines konstitutiven Niedrige-Niveau-Promotors steht. Nach Zusammenbau wurde das trp-Operon-Integrationsplasmid als pCFM2202Trp bezeichnet und in E. coli-Stamm FM5 transformiert. Nach Transformation wurde der Stamm umbenannt in DM2.
Nach der Transformation wurden mehrere Transformanten ausgewählt und für 13 Generationen in nicht-selektivem Medium passagiert, um die Zellen von dem Plasmid zu "heilen". Nach dem Passagieren wurden Plasmid-defiziente Zellen, die ein trp-Operon enthielten, durch Kolonie-Hybridisierung identifiziert [Manniatas et al., oben] unter Verwendung einer für die #26 trpB-Genmutation spezifischen Oligonukleotidsonde. Mehrere Isolate wurden auf ihre Indol-Produktionsfähigkeit hin getestet. Man hat gefunden, daß der als DM2#26 bezeichnete translozierte Stamm der tüchtigste Indolproduzent der Translokanten war. DM2#26 wurde dann mit FMS verglichen, der mit pYTrp#26 transformiert war. Man fand, daß die translozierten Stämme nach Induktion etwa 20% mehr Indol produzierten als ihre Plasmidtragenden Geschwister, obwohl der Integrant langsamer wuchs als die Stämme, die das extrachromosomale Element enthielten. Schließlich wurde bei dem Versuch zu bewerten, ob DM2#26 Indigo produzieren könnte oder nicht, wenn er, versehen wird mit einem geeigneten Mechanismus zum Umwandeln von Indol in Indoxyl, mit pFd911ABC transformiert war. Man stellte fest, daß eine resultierende Transformante, die das integrierte modifizierte trp- Operon und einen Plasmidgetragenen NDO-Stoffwechselweg enthielt, in Schüttelkolben niedrige Titer an Indigo herstellte.
Während die vorliegende Erfindung hinsichtlich bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird verstanden, daß den Fachleuten Änderungen und Modifikationen im Lichte der obigen Beschreibung gewahr werden. Deshalb sollen die angefügten Ansprüche alle solche Veränderungen abdecken, die im Rahmen des Umfanges der Erfindung, wie beansprucht, erfolgen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN

(i) ANMELDER: Murdock, Douglas Craig
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verbesserte Indol-Biosynthese
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Amgen Inc.
(B) STRASSE: Amgen Center 1840 Dehavilland Drive
(C) ORT: Thousand Oaks
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 91320-1789
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette, 3,5 in. DS, 2,0 MB
(B) COMPUTER: Apple Macintosh
(C) BETRIEBSSYSTEM: Macintosh OS 7.0
(D) SOFTWARE: Microsoft Word Version 5.1a
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG: 02. Oktober 1992
(C) KLASSIFIKATION:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
CATCGATTCT AG 12

(3) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
AATTCTAGAA TCGATGACGT 20

(4) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GTT AAC CTT TCC GGT CGC GGC GAT AAA GAC ATC TTC 36 Val Asn Leu Ser Gly Arg Gly Asp Lys Asp Ile Phe

Claims

1. Ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül, das ein Polypeptidanalog einer Tryptophan- Synthase-beta-Untereinheit kodiert, wobei das DNA-Molekül die Substitution zweier Codons umfaßt und das erste Codon Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; entspricht und das zweite Codon Aminosäureposition trpB³&sup8;² entspricht, wobei das erste Godon einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Pro, Val, Ile, Leu und Ala, an dem Codon entsprechend der Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; codiert und das zweite Codon einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Asn, Gly und Met, an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;² codiert, was, wenn in Tryptophan-Synthase eingebaut, zu erhöhter Indolakkumulation in einem rekombinanten Mikroorganismenwirt relativ zu einer Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit mit Asn anstelle von Lys an Aminosäureposition 382 führt.

2. Ein DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Codonsubstitution an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; für Pro codiert.

3. Ein DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Codonsubstitution an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;² für Met codiert.

4. Ein DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das substituierte Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; für Pro kodiert und das substituierte Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;² für Met codiert.

5. Ein DNA-Molekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, das weiter die DNA- Sequenzen für ein oder mehrere Gene umfaßt, die ausgewählt sind aus trpE, trpD, trpC und trpA.

6. Ein gereinigtes und isoliertes DNA-Molekül, das ein Polypeptidanalog einer Tryptophan- Synthase-beta-Untereinheit codiert, wobei das DNA-Molekül Substitution zweier Codons umfaßt und das erste Codon Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; entspricht, und das zweite Codon Aminosäureposition trpB³&sup8;² entspricht, wobei das erste Codon einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Pro, Val, Ile, Leu und Ala, an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; codiert und das zweite Codon einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Asn, Gly und Met, an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;² codiert, was, wenn in Tryptophan-Synthase eingebaut, zu einer verringerten Bildung von Tryptophan aus Indol und Serin in einem rekombinanten Mikroorganismenwirt relativ zu einer Tryptophan-Synthase führt, die eine Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit umfaßt mit Asn anstelle von Lys an Aminosäureposition 382.

7. Ein Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit-Analog, das zu verstärkter Indol- Akkumulation in einer rekombinanten Mikroorganismenwirtszelle relativ zu einer Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit mit Asn anstelle von Lys an Aminosäureposition 382 führt, wobei das Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit-Analog Aminosäurerestsubstitutionen an Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; und Aminosäureposition trpB³&sup8;² umfaßt, wobei der aus Pro, Val, Ile, Leu und Ala ausgewählte Aminosäurerest an Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; vorliegt und der aus Asn, Gly und Met ausgewählte Aminosäurerest an Aminosäureposition trpB³&sup8;² vorliegt.

8. Ein Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit-Analog nach Anspruch 7, das Pro an Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; umfaßt.

9. Ein Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit-Analog nach Anspruch 7, das einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Gly und Met, an Aminosäureposition trpB³&sup8;² umfaßt.

10. Ein Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit-Analog nach Anspruch 9, das Met an Aminosäureposition trpB³&sup8;² umfaßt.

11. Ein Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit-Analog nach Anspruch 7, welches Pro an Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; und Met an Aminosäureposition trpB³&sup8;² umfaßt.

12. Eine Tryptophan-Synthase umfassend ein Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit-Analog nach einem der Ansprüche 7 bis 11.

13. Eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die stabil mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einer Art und Weise transformiert oder transfiziert ist, die erlaubt, daß die Wirtszelle die Tryptophan-Synthase unter geeigneten Bedingungen exprimiert.

14. Eine prokaryontische Wirtszelle nach Anspruch 13, die Escherichia coli ist.

15. Ein biologisch funktioneller Plasmid- oder viraler DNA-Vektor, der ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.

16. Eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die stabil mit einem DNA-Vektor nach Anspruch 15 in einer Art und Weise transformiert oder transfiziert ist, die erlaubt, daß die Wirtszelle die Tryptophan-Synthase unter geeigneten Bedingungen exprimiert.

17. Eine prokaryontische Wirtszelle nach Anspruch 16, die Escherichia coli ist.

18. Ein Verfahren zur Biosynthese von Indol in einem ausgewählten Wirtsmikroorganismus, das die Schritte umfaßt:

a) stabiles Transformieren oder Transfizieren des Mikroorganismus mit einem gereinigten oder isolierten DNA-Molekül, das ein Polypeptidanalog einer Tryptophan-Synthase-beta- Untereinheit codiert, wobei das DNA-Molekül Substitution zweier Codons umfaßt und das erste Codon Aminsoäureposition trpB³&sup7;&sup9; entspricht und das zweite Codon Aminosäureposition trpB³&sup8;² entspricht, wobei das erste Codon einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Pro, Val, Ile, Leu und Ala, an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; codiert und das zweite Codon einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Asn, Gly und Met, am Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;² codiert, was zu verstärkter Indolakkumulierung in einem rekombinanten Mikroorganismenwirt relativ zu einer Tryptophan-Synthase führt, die eine Tryptophan-Synthase-beta-Untereinheit umfaßt mit Asn anstelle von Lys an Aminosäureposition 382; und

b) Kultivieren des transformierten oder transfizierten Mikroorganismus von Teil a) unter Bedingungen, die intrazelluläres Indol produzieren.

19. Ein Verfahren nach Anspruch 18, wobei das substituierte Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; für pro codiert und das substituierte Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;² für Met codiert.

20. Ein Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei das DNA-Molekül in das Chromosom des Wirtsorganismus integriert ist.

21. Ein Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei das DNA-Molekül enthalten ist in einem extrachromosomalen Element, das in der Lage ist, die Expression von Genen, die in dem DNA-Molekül umfaßt sind, unter geeigneten Bedingungen zu steuern.

22. Ein Verfahren für die Biosynthese von Indigo in einem ausgewählten Wirtsmikroorganismus, das die Schritte umfaßt:

a) stabiles Transformieren oder Transfizieren des Mikroorganismus mit einem gereinigten oder isolierten DNA-Molekül, das ein Polypeptidanalog einer Tryptophan-Synthase-Beta- Untereinheit codiert, wobei das DNA-Molekül Substitution zweier Codons umfaßt und das erste Codon Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; entspricht und das zweite Codon Aminosäureposition trpB³&sup8;² entspricht, wobei das erste Codon einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Pro, Val, Ile, Leu und Ala, an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; codiert und das zweite Codon einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus Asn, Gly und Met an dem Codon entsprechend Aminosäureposition trpB³&sup8;² codiert, was zu erhöhter Indol- Akkumulation in einem rekombinanten Mikroorganismenwirt relativ zu einer Tryptophan- Synthase führt, die eine Tryptophan-Synthase-Beta-Untereinheit umfaßt mit Asn anstelle von Lys an Aminosäureposition 382;

b) stabiles Transformieren oder Transfizieren des Mikroorganismus mit einem DNA-Molekül, das aromatische Dioxygenase-Enzym codiert, das in der Lage ist, Indol zu Indoxyl zu transformieren;

c) Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Expression von Polypeptiden erleichtern, die durch die DNA-Moleküle von Teil a) und b) codiert sind, so daß die Expression dieser Polypeptide intrazelluläre Indol-Akkumulation und Umwandlung von Indol zu Indoxyl ermöglicht;

d) Oxidieren von Indoxyl zu Indigo; und

e) Aufarbeiten des solchermaßen hergestellten Indigos.

23. Ein Verfahren nach Anspruch 22, wobei das substituierte Codon entsprechend der Aminosäureposition trpB³&sup7;&sup9; für Pro codiert und das substituierte Codon entsprechend der Aminosäureposition trpB³&sup8;² für Met codiert.

24. Ein Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei das DNA-Molekül von Teil (a) in das Chromosom des Wirtsmikroorganismus integriert ist.

25. Ein Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei das DNA-Molekül von Teil (a) in einem extrachromosomalen Element enthalten ist, das in der Lage ist, die Expression von Genen, die in dem DNA-Molekül umfaßt sind, unter geeigneten Bedingungen zu steuern.

26. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei das DNA-Molekül, das ein aromatische Dioxygenase-Enzym codiert, in das Chromosom des Wirtsmikroorganismus integriert ist.

27. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei das DNA-Molekül, das ein aromatische Dioxygenase-Enzym codiert, in einem extrachromosomalen Element enthalten ist, das in der Lage ist, die Expression von Genen, die in dem DNA-Molekül umfaßt sind, unter geeigneten Bedingungen zu steuern.

28. Ein Verfahren nach Anspruch 22, 23 oder 25, wobei die DNA-Moleküle der Teile (a) und (b) in demselben extrachromosomalen Element enthalten sind und das extrachromosomale Element in der Lage ist, die Expression von Genen, die durch die DNA-Moleküle codiert werden, unter geeigneten Bedingungen zu steuern.