DE69111456T2

DE69111456T2 - Eine methode für die schnelle selektion von effizienten sekretionsvektoren.

Info

Publication number: DE69111456T2
Application number: DE69111456T
Authority: DE
Inventors: Vasantha Nagarajan
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1990-08-28
Filing date: 1991-08-28
Publication date: 1996-02-22
Anticipated expiration: 2011-08-29
Also published as: KR920702422A; EP0546049A1; JPH05509001A; AU8492291A; EP0546049B1; ES2076544T3; DK0546049T3; CA2067249A1; DE69111456D1; WO1992003560A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum schnellen Auswählen eines Vektors, das die Sekretion eines Proteins durch Bakterien, die zur Herstellung dieses Proteins transformiert sind, maximiert.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

B. subtilis, ein grampositives Bakterium, weist ein hohes Potential für die Herstellung kommerziell wichtiger Proteine auf, da es, genetisch manipuliert, an verschiedene Nährstoffund physikalische Wachstumsbedingungen angepaßt werden kann, und da es für Menschen nicht pathogen oder toxisch ist. Darüber hinaus synthetisieren, translozieren und sezernieren diese Bakterien unter angemessenen Bedingungen spezielle Proteine relativ frei von anderen Proteinen, wodurch die Reinigung dieser Proteine erleichtert wird.
Es besteht im allgemeinen Einvernehmen darüber, daß die Translocation sezernierter Proteine durch Bakterienmembranen ein Signalpeptid erfordert. Während eine Anzahl von Studien in Richtung auf das Verständnis der Rolle des Signalpeptids bei der Proteinausscheidung durchgeführt worden ist, wird der Mechanismus einer solchen Translocation und der genauen Weise, auf die das Signalpeptid die Translocation und die Entfernung des Signalpeptids aus dem Komplex aus Signalpeptid-reifem Peptid beeinflußt, um sezerniertes reifes Protein zu ergeben, nicht vollständig verstanden.
Vektoren, die die Sekretion einer Anzahl verschiedener heterologer Proteine durch B. subtilis ermöglichen, sind dargelegt worden. Siehe Nagarajan et al., U.S.-Patent 4 801 537, C. Stephens et al., U.S.-Patent 4 769 327, und Biotechnology Handbook 2, Bacillus, C. R. Harwood, Hrsg., Plenum Press, New York (1989). Diese umfassen Vektoren, die auf Genen für Exoenzyme wie Amylase, Protease, Levansaccharase und β-Lactamasen basieren.
Palva et al. demonstrierten die Sekretion des heterologen Proteins β-Lactamase von E. coii durch 3. subtilis (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5582 - 5586, (1982)) und von menschlichem Leukocyten-Interferon (Gene 22, 229 - 235, (1983)> durch das Transformieren der Bakterien mit einem Vektor, worin die Gene für β-Lactamase von E. coli und menschliches Leukocyten-Interferon operativ mit dem Promotor, der Ribosomen-Bindungsstelle und der Signalsequenz des Gens für α-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens verbunden waren. Sie fanden, daß nur eine geringe Interferonmenge sezerniert wird.
Schein et al., Biotechnoiogy 4, 719 - 725, (1986), führten Untersuchungen durch, um zu sehen, warum die Interferon-Ausbeuten so gering waren. Sie verwendeten, wie Palva et al., im wesentlichen denselben Vektor, außer daß die Signalseguenz für α-Amylase genau mit dem ersten Codon der reifen Interferon- Sequenz verschmolzen war. Die Mengen an sezerniertem Interferon betrugen nach wie vor nur etwa 1 bis 3 % von denen von α- Amylase. Aus sorgfältigen Analysen folgerten sie, daß die verminderten Interferon-Ausbeuten nicht auf die Expression des heterologen Interferon-Gens in B. subtilis zurückzuführen waren, sondern auf die Unfähigkeit von B. subtilis, wirksam zu translozieren und/oder den Komplex aus Interferon-Signal- Peptid in das reife Interferon zu spalten, zurückzuführen waren.
Ulmanen et al., J. of Bacterioi., Vol. 162, S. 176 - 182, (1985), konstruierten, wie Palva et al. und Schein et al., einen Sekretionsvektor, indem sie die Promotor- und die Signalsequenz des α-Amylase-Gens von Bacillus amyloliquefaciens in einem Plasmid verbanden, dann durch Verwendung des Vektors die Expression und Sekretion der heterologen Gene, die für TEM-β-Lactamase und das Glycoprotein E1 des Semliki-Forest- Virus kodieren, mit dem von Bacillus amyloliquefaciens in B. subtilis, transformiert durch die so geschaffenen Vektoren, verglichen. Die Ausbeute im Medium (sezerniert) an TEM-α- Lactamase betrug etwa 10 %, und die von E1 betrug etwa 0,01 % von der von α-Amylase. Die Autoren folgerten, daß die geringe Ausbeute von TEM-α-Lactainase auf den Abbau durch Wirts-Proteasen zurückzuführen war, während die geringe Ausbeute von E1 auf die leistungsschwache Sekretion zurückzuführen war.
Auf Levansaccharase basierende Sekretions-Vektoren wurden von Dion et al., Biochimie 71, 747 - 755, (1989), angegeben. Dion et al. erhielten geringe Mengen an Maus-Interferon, verglichen mit Levansaccharase. Die geringe Ausbeute war nicht auf die Sekundärstruktur des Spaltungsbereiches zurückzuführen. Die Autoren schlugen vor, das sie auf eine nicht verstandene grundlegende Unverträglichkeit zwischen der Signalsequenz des Levansaccharase-Gens von B. subtiiis und des α2-Gens für Maus- Interferon zurückzuführen war.
Himeno et al., FEMS Microbiology Letters 35, 17 - 21, (1986), konstruierten zwei Sekretions-Vektor-Plasmide, die sich dahingehend unterschieden, daß eines die Signalsequenz des Penicillinase-Gens (pen P-Vektor) von Bacillus licheniformis und das andere die Signalsequenz des α-Amylase-Gens (amyT- Vektor) von Bacillus stearotherinophilus aufwies. Die Experimentatoren verbanden dann operativ die DNA-Sequenzen, die 1) Penicillin P, 2) Amylase T und 3) menschliche Speichel-α- Amylase kodierten, mit jedem der Vektoren, und bestimmten die Produktion und die Sekretion in das Medium der drei Proteine durch B. subtilis, das durch jeden der Vektoren transformiert war. Sie fanden, daß das Gen für menschliche Speichel-α-Amylase in keinem der Vektoren exprimiert wurde; Penicillin P wurde wirksam sezerniert, wenn es in beiden Vektoren enthalten war; α-Amylase wurde wirksam sezerniert, wenn sie in amyT-Vektor enthalten war, aber nur zu etwa 3 % der obigen Wirksamkeit, wenn sie im penP-Vektor enthalten war. Sie folgerten, daß nicht nur eine Signalsequenz und ein reifer Teil des extrazellulären Enzyms, sondern auch die Kombination der beiden für die Sekretion des Proteins wichtig ist. Es bestehen mehrere Unterschiede zwischen den Mechanismen der Sekretion von Penicillinase und α-Amylase, und diese umfassen die Entfernung und Freisetzung des Signals in das Wachstumsmedium. Diese Unterschiede werden im Buch von Lampen et al., Genetics and Biotechnology of Bacilli, S. 129 - 140, Academic Press (1984), worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird, diskutiert. Die Sekretion von Penicillinase in das Wachstumsmedium erfordert, daß nacheinander Mehrfachspaltungen und der folgende Satz von Ereignissen auftreten: a) Spaltung des Signalpeptids, b) Modifizierung in ein membrangebundenes Intermediat, c) anschließende Spaltung, und d) Freisetzung in das Wachstumsmedium, wie von Himeno et al., s.o., gezeigt wurde. Im Gegensatz dazu erfordert die Sekretion von α-Amylase eine einzige Spaltung des Signalpeptids und die Freisetzung in das Wachstumsmedium. Folglich ermöglichen es die von Himeno et al. beschriebenen Vektoren einem nicht, den wirksamsten Sekretionsvektor für B. subtilis zu identifizieren, da Vektoren auf der Grundlage von Penicillinase immer membrangebundene Intermediate aufweisen und weniger wirksam als Vektoren auf der Grundlage von Amylase sind.
Aus den verschiedenen Sekretions-Vektoren, die bis heute konstruiert worden sind, ist klar, daß die Sekretions-Wirksamkeit von heterologen Proteinen unterschiedlich ist und daß die Ursache für den beobachteten Unterschied nicht verstanden ist. Folglich ist nicht vorhersagbar, welche Kombination aus Signalpeptid und reifem Protein zu einer wirkungsvollen Sekretion des reifen Proteins führt. Daher besteht eine Notwendigkeit für ein Verfahren, mit dem schnell identifiziert werden kann, welcher Sekretionsvektor die wirksame Sekretion eines beliebigen Proteins ermöglicht, das man in genetisch veränderten B. subtilis herzustellen wünscht. Das Verfahren dieser Erfindung ist darauf ausgerichtet, eine Lösung für dieses Erfordernis verfügbar zu machen, indem die leichte Kombination der Promotoren, ribosombindende Sequenzen und Signalpeptide kodierenden DNA-Sequenzen aus verschiedenen Quellen mit der ein Polypeptid oder Protein von Interesse kodierenden DNA ermöglicht wird und bestimmt wird, welche Kombination die beste Sekretion von reifem Polypeptid oder Protein ergibt.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Auswählen eines Vektors, der die Sekretion eines reifen Proteins durch Bakterien der Gattung Bacillus maximiert, wie in Anspruch 1 angegeben.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Definitionen werden hier verwendet und sollten zur Interpretation der Ansprüche herangezogen werden.
Ein "Vorstufen-Protein" ist ein Proteinprodukt, das das Signalpeptid und das reife Protein vollständig umfaßt.
Das "reife Protein" ist das endgültige Proteinprodukt, an das kein Teil des Signalpeptids gebunden ist.
Ein "erwünschtes Protein" ist ein beliebiges, als wertvolles Produkt betrachtetes Protein, das aus gentechnisch veränderten Bakterien erhalten werden soll.
Der "Sekretions-Wirkungsgrad" ist der Grad, bis zu dem ein Vorstufen-Protein in ein reifes Protein umgewandelt wird.
Ein "Signalpeptid" ist ein aminoterminales Polypeptid, das dem sezernierten reifen Protein vorhergeht. Das Signalpeptid wird davon abgespalten und ist folglich nicht im reifen Protein vorhanden. Signalpeptide haben die Funktion des Steuerns und des Translozierens von sezernierten Proteinen durch Zellmembranen. Das Signalpeptid wird auch als Signalprotein bezeichnet.
"Verträgliche Restriktionsstellen" sind unterschiedliche Restriktionsstellen, die, wenn sie gespalten werden, Nucleotid-Enden ergeben, die ohne zusätzliche Modifikation ligasiert werden können.
"apr" ist das Gen für alkalische Protease.
"bar" ist das Gen für extrazelluläre Ribonuclease.
"sacb" oder "lvs" ist das Gen für Levansaccharase.
"npr" ist das Gen für neutrale Protease.
Ein "Schaukel-Phagemid" ist ein Vektor, der normalerweise doppelsträngig ist und den Replikationsursprung sowohl für E. coli als auch für B. subtilis und darüber hinaus den intragenen Bereich zur Herstellung der einsträngigen DNA enthält.
Die Begriffe "Peptid", "Polypeptid" und "Protein" werden austauschbar verwendet.
Die Begriffe "Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle" und "Restriktionsstelle" werden austauschbar verwendet.
Geeignete Verfahren zur Genmanipulation, wie sie hier eingesetzt werden, sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual - Bände 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1989), worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird, und in den Anleitungen, die kommerziell erhältlichen Sätzen zur Genmanipulation beigefügt sind, beschrieben. Bakterienkulturen und Plasmide, die zur Ausführung dieser Erfindung erforderlich sind, sind kommerziell erhältlich und werden, zusammen mit ihren Quellen, im Text und in den folgenden Beispielen identifiziert.
Geeignete Wirtsbakterien für die Vektoren dieser Erfindung umfassen grampositive Bakterien, die zur Gattung Bacilius gehören. Diese können vom Bacillus Genetics Stock Center (BGSC), The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210, oder von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, erhalten werden. Besonders bevorzugt ist B. subtilis.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt das Vergleichen von zwei oder mehr Sekretions-Vektoren auf ihren Sekretions-Wirkungsgrad für ein beliebiges erwünschtes Protein. Proteine von Interesse, die durch das Verfahren und den Vektor dieser Erfindung sezerniert werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf:

I. Industrielle Enzyme aus Thermophilen und Mesophilen

a) Protease
b) Esterase
c) Pectinase
d) Xylanase
e) Amylase
f) Cellulase
g) Levanase
h) Lipase
i) Rnase
j) Nucleotidase
k) Transfructosylase
l) Lactase
m) Glucose-Isomerase
n) Phosphatase

II. Biotinbindende Proteine

Avidin
Streptavidin

III. Immunoglobinbindende Proteine

a) Protein A
b) Protein G
c) Protein L

IV. Immunoglobine

Rezeptor-Proteine

VI. Strukturproteine

Actin
Fibrin
Collagen
Seideproteine
Elastin

VII. Virenproteine

a) Protease
b) Reverse Transcriptase
c) Hüllproteine

VIII. Antigene aus Mikroben und Protozoen

Beispiele für solche Proteine umfassen, sind aber nicht darauf begrenzt, das Staphylococcus-Protein A, Levansaccharase, Barnase oder Streptavidin.
Sekretions-Vektoren dieser Erfindung umfassen eine regelbare Promotor-Sequenz, die die Transcription steuert, eine Sequenz für eine ribosombindende Stelle, die die Translation steuert, und eine Sequenz für ein Signalpeptid, die die Translocation des Peptids durch die Bakterienmembran und die Abspaltung des Signalpeptids vom reifen Protein ermöglicht.
Die erste erforderliche Komponente ist ein Vektor, in den den Promotor, die Ribosom-Bindungsstelle und das Signalpeptid kodierende DNA-Sequenzen aus verschiedenen Genen manipuliert werden können. Geeignete Vektoren sind solche, die mit dem verwendeten Bakterium kompatibel sind. Zum Beispiel umfassen für B. subtilis solche geeigneten Vektoren Schaukelvektoren von E. coli-B. subtilis. Sie weisen verträgliche Durchführungssequenzen und Replikations-Startpunkte auf. Sie sind vorzugsweise mehrfach kopierend und weisen ein selektives Markergen auf, zum Beispiel ein Gen für das Kodieren der antibiotischen Resistenz. Zum Beispiel ist PTZIBR ein Phagemid, der von Pharmacia, Piscataway, NJ 08854 erhältlich ist und E. coli Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht, und pC194 vom BGSC verleiht E. coli und B. subtilis Resistenz gegenüber Chloramphenicol (cmr).
Die den Promotor&sub1; die Ribosom-Bindungsstelle und das Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenzen können aus einem beliebigen Gen stammen, das ein sezerniertes Produkt kodiert. Die den Promotor und die Ribosom-Bindungsstelle kodierenden DNA-Sequenzen können auch von einem unterschiedlichen Gen als dem, das das Signalpeptid kodiert, stammen. Diese den Promotor, die Ribosom-Bindungsstelle und das Signalpeptid kodierenden DNA- Sequenzen können durch Mittel isoliert werden, die den Fachleuten wohlbekannt sind, und veranschaulichende Beispiele sind in der Literatur dokumentiert. Siehe Biotechnology Handbook 2 Bacillus, C. R. Harwood, Hrsg., Plenum Press, New York, New York (1989). Die Promotoren in den DNA-Sequenzen können entweder konstitutiv oder induzierbar sein und so die unterschiedliche Regulierung der resultierenden Sekretions-Vektoren erlauben. Sobald die beste Sequenz des Signalpeptids ausgewählt ist, wird es für möglich gehalten, daß Promotoren von verschiedenen Quellen und unter verschiedenen Arten von Steuerung unabhängig voneinander mit Ribosom-Bindungsstellen und Signalsequenzen assoziiert werden können, um den Modus der Regulation zu bewirken, der die beste Ausbeute eines erwünschten Proteins ergibt.
Die Hinzufügung einer Bindungsstelle zur Spaltung der Restriktions-Endonuclease an das 3'-Ende der das Signalpeptid kodierenden DNA wird ebenfalls leicht durch Mittel bewerkstelligt, die den Fachleuten wohlbekannt sind, und wird durch Sambrook et al., s.o., beschrieben. Ein besonders nützliches Mittel zum Hinzufügen der Bindungsstelle zur Spaltung der Restriktions-Endonuclease an das 3'-Ende der das Signalpeptid kodierenden DNA ist das Hinzufügen durch herkömmliche Mittel der ortsspezifischen Mutagenese, wie von Vasantha et al., Gene, 76, 53 - 60, (1989) beschrieben wird. Die Mittel zum Isolieren von DNA-Sequenzen, die ein erwünschtes Protein kodieren, und die Hinzufügung von Restriktionsstellen an das 5'-Ende der DNA-Sequenz ist den Fachleuten wohlbekannt und wird durch Sambrook et al., s.o., beschrieben. Es kann eine beliebige Stelle der Restriktions-Endonuclease verwendet werden, aber die Verwendung einer Restriktionsstelle, die für diesen Vektor einzigartig ist, ist wünschenswert. Die Stelle der Restriktions-Endonuclease am 3'-Ende der das Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz und am 5'-Ende der das erwünschte Protein kodierenden DNA-Sequenz müssen verträglich sein. Geeignete verträgliche Restriktionsstellen sind im Fachgebiet wohlbekannt. Siehe zum Beispiel die Tabelle zur Verträglichkeit von Restriktions-Fragmenten im Katalog 1988 - 1989 von New England Biolabs, New England Biolabs Inc., Beverly, MA 01915 (1988). Bevorzugt zur Verwendung hier ist EcoRV. Die einen Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle und ein Signalpeptid kodierenden kombinierten DNA-Sequenzen mit einer Restriktionsstelle an ihrem 3'-Ende und die reife Polypeptide oder Proteine kodierenden DNA-Sequenzen mit einer verträglichen Restriktionsstelle an ihrem 5'-Ende können operativ durch herkömmliche Techniken integriert werden (Sambrook et al., s.o.; Harwood, s.o.). Sobald mehrere Vektoren, jeweils mit einen Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle und ein Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenzen aus verschiedenen Genen und verträglichen Restriktionsstellen am 3'-Ende der das Signalpeptid kodierenden Sequenz verfügbar sind und jede mit der ein erwünschtes Protein kodierenden DNA-Sequenz kombiniert ist, werden die Vektoren zum Transformieren eines geeigneten Bakteriums verwendet. Ein herkömmliches Verfahren zum Transformieren von B.-subtilis-Bakterien wird von Vasantha et al., J. of Bacteriol. 159, 811 - 819, (1984), beschrieben. Standardmäßige mikrobiologische Verfahren, die den Fachleuten wohlbekannt sind, können zum Wachstum und zur Erhaltung von Bakterienkulturen verwendet werden.
Der Wirkungsgrad, mit dem das reife Protein in das Medium sezerniert wird, wird bestimmt durch mit radioaktiver Markierung transformierte Bakterien, die die Vektoren enthalten, und das Immunopräzipitieren des geklonten erwünschten Polypeptids mit Antikörpern, die für jedes Polypeptid spezifisch sind, wie von Nagarajan, Methods in Enzylnology 185, 214 - 223, (1990), beschrieben, und das Bestimmen des Verhältnisses aus Vorstufen-Protein und reifem Protein zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Zugabe des radioaktiven Materials. Die immunopräzipitierten Proteine werden durch Elektrophorese an Polyacrylamid-Gel getrennt und durch Autoradiographie veranschaulicht. Das Vorstufen-Protein hat immer eine größere Abmessung als das reife Protein, da es sowohl das gesamte Signalpeptid als auch das reife Polypeptid enthält.
Sobald bestimmt worden ist, welche transformierten Bakterien das erwünschte Protein am wirkungsvollsten sezerniert, kann der Vektor durch Standardverfahren zum Gewinnen von Plasmiden gewonnen werden, wie von Vasantha et al., J. of Bacteriol. 159, 811 - 819, (1984), beschrieben.
Aus den Beispielen ist klar, daß der Sekretions-Wirkungsgrad von Polypeptiden in Abhängigkeit vom Signalpeptid und dem reifen Peptid im Vektor variiert. Durch Vergleichen des Sekretions-Wirkungsgrades eines beliebigen erwünschten Proteins, das leicht in Vektoren eingebaut werden kann, die die DNA enthalten, die unterschiedliche Signalpeptide mit einer verträglichen Restriktionsstelle an ihrem 3'-Ende kodieren, ist es möglich, denjenigen Vektor auszuwählen, der die beste Sekretion des reifen erwünschten Proteins ergibt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Verfahren der vorliegenden Erfindung, wobei nicht beabsichtigt ist, daß sie sie in irgendeiner Weise einschränken. Es wurden in den folgenden Beispielen vier Sekretionsvektoren konstruiert und verwendet, um das Verfahren der Erfindung zu veranschaulichen. Im folgenden wird die Quelle der den Promotor, die Ribosom- Bindungsstelle und das Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenzen für 1) das Gen für alkalische Protease von B. amyloliquefaciens, 2) das Gen für Barnase von B. amyloliquefaciens, 3) das Gen für Levansaccharase von B. amyloliquefaciens, und 4) das Gen für neutrale Protease von B. amyloliquefaciens angegeben.

BEISPIEL l

A) KONSTRUKTION EINES VEKTORS, DER DIE DNA-SEQUENZ FÜR DEN PROMOTOR, DIE RIBOSOM-BINDUNGSSTELLE UND DAS SIGNALPEPTID AUS DEM GEN FÜR ALKALISCHE PROTEASE VERWENDET

Das Gen für alkalische Protease wurde aus B. amyloliquefaciens durch konventionelle Mittel isoliert, zum Beispiel, wie früher von Vasantha et al., J. Bacteriol. 159, 811 - 819, (1984), beschrieben. Es wurde in pBE20, einen Schaukel-Phagemid von E.coli - B. subtilis, insertiert, der durch das Ligasieren von pTZIBR (Pharmacia, 800 Centennial Ave., Piscataway, NT. 08854) und pC194 (Bacillus Genetic Stock Center (BGSC), Ohio State University, Columbus, Ohio) konstruiert wurde. Der resultierende Vektor ist pBE25, ein Schaukel-Phagemid von E.coli - B. subtilis, der das Gen für alkalische Protease (apr) aus B. amyioliquefaciens enthält. Eine Restriktionsstelle für EcoRV wurde am 3'-Ende der das Signalpeptid des Gens für alkalische Protease kodierenden DNA-Sequenz durch herkömmliche Mittel der ortsspezifischen Mutagenese eingebaut, zum Beispiel wie von Vasantha et al., Gene, 76, 53 - 60, (1989), beschrieben, was zu pBE26 führt.

B) KONSTRUKTION EINES VEKTORS, DER DIE DNA-SEQUENZ FÜR DEN PROMOTOR, DIE RIBOSOM-BINDUNGSSTELLE UND DAS SIGNALPEPTID VOM GEN FÜR BARNASE VERWENDET

pBE22 ist ein Schaukel-Phagemid von E. coli - B. subtilis, der das Gen für Barnase (extrazelluläre Ribonuclease) von B. amyloiiquefaciens enthält. pBE22 wurde durch das Subklonen eines Ecorl-Fragmentes von pMT71 (erhalten von Dr. Robert Hartley, National Institute of Health, Bethesda, Maryland) (Paddon et al., J. Bacteriol. 171, 1185 - 1187 (1989), durch Standard-DNA-Rekombinations-Techniken (Sambrook et al., s.o.) in pBE20 konstruiert. Die Herstellung von pBE20 wird hiernach in Abschnitt C) beschrieben. Eine EcoRV-Stelle wurde einen einzelnen Codon stromabwärts vom Barnase-Signal durch ortsspezifische Mutagenese eingebaut (Vasantha & Filpula, s.o.).

C) KONSTRUKTION EINES VEKTORS, DER DIE DNA-SEQUENZ FÜR DEN PROMOTOR, DIE RIBOSOM-BINDUNGSSTELLE UND DAS SIGNALPEPTID VOM GEN FÜR LENVANSACCHARASE VERWENDET

pBE20 wurde konstruiert, indem mit HINDIII aufgeschlossenes pTZ18R (Pharmacia, 800 Centennial Ave., Piscataway NJ 08854), das einen Replikationsstartpunkt für E. coli, einen F1-ori und den Marker ampr für antibiotische Resistenz enthält, mit mit HindIII aufgeschlossenem pC194 (Bacillus Stock Center, Ohio State University, Columbus, OH 43210), einem Plasmid von Staphylococcus aureus, das ein mehrfach kopierendes Plasmid in B. subtilis ist und das einen Marker für Chloramphenicol- Resistenz zur Selektion in B. subtilis trägt, ligasiert wurde.
pBE301 wurde wie folgt hergestellt. Das Gen sacb (BamP] von B. amyloliquefaciens, das Levansaccharase (sacB) kodiert, wurde aus einer λ-ZAP-Bibliothek des Chromosoms von B. amyloliquefaciens unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden als einem Mittel zur Indentifizierung von Klonen, die die entsprechenden Sequenzen enthalten, isoliert. Die λ-Bibliothek von B. amyloliquefaciens wurde unter Verwendung der kommerziell verfügbaren, mit ECORI aufgeschlossenen λ-ZAP-DNA und des Giga pack plus (Stratagene, 1109 North Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037) in Einklang mit den Hersteller-Anleitungen konstruiert. Es wurden zwei Oligonucleotid-Sonden mit jeweils 30 Basen synthetisiert. Die Sonde 52142-2NP wies die Sequenz GACGTTGGGACAGCTGGCCATTACAAAAC auf und die Sonde 52142-3NP wies die Sequenz ATGAACGGCAAATGGTACCTGTTCACTGAC auf. Eine Probe zu einem Mikroliter (400 ng) jeder Sonde wurde am 5'- Ende mit ³²P-λ-ATP markiert, wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 122, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982), beschrieben. Gleiche Mengen der beiden Sonden wurden gesammelt und vermischt. (Alle in Maniatis et al. beschriebenen Verfahren sind im Fachgebiet üblich.) E.-coli-Bakterien, Stamm 884, wurden als Wirtszellen verwendet und mit 5 Mikrolitern des λ-ZAP- Phagen von B. amyloliquefaciens infiziert. Die infizierten Zellen wurden auf 8 NZYM-Platten mit dem Plattengieß-Verfahren unter Verwendung von 3,0 ml ZZYM-Top-Agar auf eine Konzentration von 1000 bis 1500 Plaque/Platte plattiert. Die Platten wurden bei 37 ºC über Nacht inkubiert. Die DNA von den resultierenden Platten wurde auf Nitrocellulose-Filter transferiert. Die Filter wurden dann unter Verwendung der radioaktiv markierten Oligonucleotid-Sonden auf die Gegenwart des Gens sac[BamP] von B. amyloliquefaciens gescreent. Die markierten Proben (60 ng) wurden auf den Nitrocellulose-Filtern in 6X SSC/0,5 % SDS-Puffer 16 Stunden lang bei 37 ºC hybridisiert. Die Nitrocellulose-Filter wurden in 6X SSC/0,1 % SDS-Puffer gewaschen. Das erste Waschen fand bei Raumtemperatur und das zweite bei 37 ºC statt. Die anschließenden Autoradiographien der Filter offenbarten 5 Klone, die mit den Sonden hybridisierten. Die Filter wurden wiederum bei 37 ºC gewaschen. Die resultierenden Autoradiographien der Filter zeigten zwei Klone (bezeichnet als 2A und 2C) an, die möglicherweise DNA enthielten, die an die Sonden hybridisiert war. Mit den Sonden hybridisierende Plaques wurden isoliert und die Phagen darin nach Maniatis et al., s.o., gereinigt. Die Infektions- und Screening-Verfahren wurden wiederholt (sekundärer Screen), und etwa 20 % und 80 % der Plaques aus den Klonen 2A bzw. 2C hybridisierten mit den Sonden. Positive Plaques von diesen sekundären Screens wurden dann ausgewählt, Phagen hergestellt, und weiter gescreent. Autoradiographien der tertiären Screens zeigten, daß alle Plaques die Oligonucleotid-Sonden hybridisierten. Die λ-ZAP-Phagen-Klons 2A und 2C, die die mutmaßlichen Gensequenzen sacB[BamP] enthielten, wurden in Blue- Script-Plasmid-Vektoren konvertiert, indem die Anleitungen des Herstellers (Stratagene, 1109 North Torrey Pines Road, La Jolla, Ca 92037) befolgt wurden. Das resultierende Blue- Script-Plasmid des λ-ZAP-2C-Klons wurde als pBE301 bezeichnet. Das sacB[BamP]-Fragment aus pBE301 wurde als ein EcoRV-XbaI- Fragment isoliert und an ein Saml-XbaI-Fragment von pBE20 ligasiert, was zu pBEsol führte. p8E504 wurde aus pBE501 durch Hinzufügen von zwei neuen Restriktionsstellen in das Signalpeptid mittels ortsspezifischer Mutation hergestellt. Diese zugefügten Stellen veränderten die Aminosäuresequenz des Signalpeptids nicht.
In pBE504 wurde, um die heterologen Genfusionen zu erleichtern, zwei Kodons stromabwärts von der das Signalpeptid verarbeitenden Stelle eine EcoRV-Stelle geschaffen, indem der Mutagen-Phagemid-in-vitro-Mutagenese-Satz von BioRad (BioRad Laboratories, 1414 Harbor way South, Richmond, CA94804) verwendet wurde, was zu pBE311 führte.

D) KONSTRUKTION EINES VEKTORS UNTER VERWENDUNG DER DNA-SEQUENZ FÜR DEN PROMOTOR, DIE RIBOSOM-BINDUNGSSTELLE UND DAS SIGNALPEPTID AUS DEM GEN FÜR NEUTRALE PROTEASE

Das Gen für die neutrale Protease wurde aus B. amyloliquefaciens isoliert, wie von Vasantha et al., J. Bacteriol. 159, 811 - 819 (1984) beschrieben, und führte zum Plasmid pBE9. Die DNA-Sequenz für den npr-Promotor, die Ribosom-Bindungsstelle und das Signalpeptid wurde durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Thermocyclers von Perkin Elmer isoliert. Zwei Oligonucleotide, (5'CGGACGATATCCTCAGCGGCCTG3' und 5'ATGCATGGTACCGATCTAACATTTTCCCC3') , die mit dem npr-Gen reassoziierten, wurden für die PCR-Reaktion verwendet und pBEg wurde als Matrize verwendet. Die Oligonucleotide wurden so entworfen, daß das am 5'-Ende des Promotors reassoziierende Oligonucleotid eine KpnI-Stelle kodiert. Das an das 3'-Ende des Kodierungsbereiches des Signalpeptids reassoziierte Oligonucleotid kodierte eine ECORV-Stelle. Das PCR-Produkt wurde aufkonzentriert und mit dem Klenow-Fragment behandelt, um abgerissene Enden auszufüllen, gefolgt vom Aufschluß mit KpnI und EcoRV. Dieses Kpnl-EcoRV-Fragment mit 340 bp wurde unter Verwendung von Geneclean nach der Anleitung des Herstellers (Geneclean Kit, P. O. Box 2284, La Jolla, CA 92038) gereinigt und ergab den npr-Promotor, die Ribosom-Bindungsstelle und das Signalpeptid für heterologe Genverschmelzungen.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel zeigt, wie mehrere verschiedene Signalpeptide zu einem beliebigen gegebenen reifen heterologen Gen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Sekretionsvektors verschmolzen werden können. Die Position der ECORV-Stelle mit Bezug auf die Bearbeitungsstelle des Signalpeptids ist angezeigt. Die primäre Aminosäure-Sequenz des Signalpeptids ist ebenfalls dargestellt. Die Signalpeptide teilen keine priinäre Aminosäure-Homologie und teilen dennoch bestimmte gemeinsame strukturelle Merkmale. Die Signalpeptide apr, npr, bar und sacB scheinen ähnlich zu sein und die Vorhersage darüber, welches Signalpeptid beim Transportieren eines heterologen Proteins besser funktioniert, scheint nicht möglich zu sein.
Das Staphylococcen-Protein A, Barnase und Levansaccharase wurden als heterologe Proteine verwendet. Die Erzeugung der EcoRV-Stelle in Barnase und Levansaccharase ist in Beispiel 1 B und C beschrieben. Eine EcoRV-Stelle im Staphylococcen- Protein A wurde wie unten ausgeführt geschaffen.
Die Quelle für das Gen für Staphylococcen-Protein A (spa) war ein Plasmid pRIT5, das von Pharmacia, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08854, erhalten wurde. pRIT 5 wurde mit Bcl 1 aufgeschlossen und der 5'-Überhang wurde ausgefüllt, um ein stumpfes, mit EcoRV verträgliches Ende zu erzeugen,und später mit Pst geschnitten und an pBE26 ligasiert, das mit EcoRV und Pst aufgeschlossen war. pie ligasierte DNA wurde verwendet, um B. subtilis zu transformieren, und die Transformanten wurden für die Produktion von Protein A durch den Kolonie- Immunoassay gescreent, wie von Nagarajan, s.o., beschrieben. Die Plasmid-DNA wurde aus den Protein A produzierenden Kolonien isoliert und hatte sowohl die ECORV-Stelle als auch die Bcl-1-Stelle verloren. Eine EcoRV-Stelle wurde durch ortsspezifische Mutagenese an der Verbindung Bcl-1-EcoRV wieder geschaffen und das resultierende Plasmid wurde als pBE45 bezeichnet und wies den apr-Promotor und das Signalpeptid auf, die mit dem Staphylococcen-Protein A (apr-spa) verschmolzen waren. TABELLE 1 Quelle des Gens Hybridgen&spplus; Plasmid Signal * Reif &spplus; Die Verschmelzungen wurden an der EcoRV-Stelle durchgeführt. Das das Signalpeptid kodierende Fragment konnte als Kpn-EcoRV-Fragment isoliert werden. Umfaßt den Bereich, der den Promotor, die Ribosom-Bindungsstelle und das Signalpeptid kodiert.
Der tiefgestellte Index ss bezeichnet die Signalsequenz.

BEISPIEL 3

Beispiel 3 veranschaulicht, wie der Sekretions-Wirkungsgrad sowohl durch das Signalpeptid als auch durch das reife Protein, anstatt entweder durch das Signalpeptid oder die reife Sequenz allein, bestimmt wird.
Zellen von B. subtilis wurden in synthetischem Medium gezogen und mit ³H-Leucin markiert, wie durch Borchert und Nagarajan, J. Bacteriol. 173: 276 - 282 (1991) beschrieben, mit den folgenden Modifikationen. Stämme, die die Verschmelzungen Apr, Bar und Npr trugen, wurden 30 Minuten, nachdem die Zelldichte O.D. 600 = 0,5 erreicht hatte, markiert. SacB-Verschmelzungen enthaltende Stämme wurden mit 2 %iger Saccharose induziert, wenn die Zelldichte einen O.D. von 600 = 0,5 erreichte, und nach 30 Min. markiert. Bakterien wurden 60 Sekunden lang mit ³H-Leucin markiert und das radioaktive Material wurde durch die Zugabe von nicht markiertem Leucin ausgetrieben, und Proben wurden nach 0, 1 und 2 Minuten genommen. Zum Zeitpunkt 0 der Austreibperiode wurde ein aliquoter Teil in ein Rohr überführt, das 50 uM Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazin (CCCP) enthielt, und 2 Minuten lang inkubiert. Die Proben wurden für die Immunopräzipitation verarbeitet und getrennt. Borchert und Nagarajan, J. Bacteriol. 173: 276 - 282 (1981).
Die Mobilität des Vorstufen-Proteins (Signalpeptid + reifes Protein) und des reifen Proteins ist in einem SDS- Polyacrylamid-Gel aufgrund der Größenunterschiede verschieden. Das Verhältnis zwischen der Vorstufe und dem reifen Protein zum Zeitpunkt 0 der Austreibperiode ist für die verschiedenen Hybridproteine unterschiedlich.
Die Raten bei der Verarbeitung des Signalpeptids von Levansaccharase, Barnase und Protein A waren unterschiedlich, wenn sie mit dem Signalpeptid Apr verschmolzen waren. Auf vergleichbare Weise waren die Raten bei der Verarbeitung des Signalpeptids von Levansaccharase, Barnase und Protein A unterschiedlich, wenn sie mit dem Signalpeptid Npr verschmolzen waren. Der relative Sekretions-Wirkungsqrad der verschiedenen Verschmelzungen ist in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Signalpeptid Reifes Protein
Der relative Wirkungsgrad der Sekretion der reifen Proteine wurde auf der Grundlage von Pulse-Chase-Experimenten bestimmt. Die Rate der Verarbeitung des Signalpeptids, die ein Hinweis für den Sekretions-Wirkungsgrad ist, wurde durch das Vorstufen-Protein und nicht durch entweder das Signalpeptid oder das reife Protein allein bestimmt.
Aus der vorhergehenden Beschreibung kann ein Fachmann leicht die wesentlichen Merkmale dieser Erfindung bestimmen und, ohne von ihrem Rahmen abzuweichen, verschiedene Veränderungen und Modifikationen an der Erfindung durchführen, um sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen.

Claims

1. Verfahren zum Auswählen eines gentechnisch veränderten Vektors, der die Sekretion eines reifen Proteins durch Bakterien der Gattung Bacillus maximiert, umfassend:

(A) in wenigstens zwei verschiedenen Vektoren das operative Verbinden einer das reife Protein kodierenden ersten DNA-Sequenz mit einer ein Signal-Protein kodierenden zweiten DNA-Sequenz, die darüber hinaus mit einer einen Promoter und eine Ribosom-Bindungsstelle kodierenden dritten DNA-Sequenz operativ verbunden ist, wobei die in jedem Vektor die Signal- Proteine kodierenden DNA-Sequenzen voneinander verschieden sind und das jedes reife Protein kodierende 5'-Ende der DNA-Sequenz eine Restriktions- Endonucleasen-Stelle enthält, die mit der Restriktions-Endonucleasen-Stelle am 3'-Ende der das Signal-Protein kodierenden DNA-Sequenz verträglich ist, wobei die Restriktions-Endonucleasen-Stelle in jedem der verschiedenen Vektoren verträglich ist;

(B) das Transformieren von Bakterien der Gattung Bacillus mit den Vektoren von (A);

(C) das Züchten der transformierten Bakterien unter Bedingungen, die zur Expression der Vektoren geeignet sind, wobei ein ein Signal-Protein und ein reifes Protein umfassendes Vorläufer-Protein exprimiert werden und ein reifes Protein abgesondert wird;

(D) Das Bestimmen des Verhältnisses von Vorläufer-Protein zu abgesondertem reifem Protein und

(E) Das Selektieren desjenigen Vektors aus den transformierten Bakterien der Gattung Bacillus, der am wirkungsvollsten ein Vorläufer-Protein in ein reifes Protein umwandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in einem der Vektoren die sowohl das Signal-Protein als auch das reife Protein kodierenden DNA-Sequenzen von einem einzigen Gen stammen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Bakterium B. subtilis ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die operativ mit der das Signal-Protein kodierenden DNA- Sequenz verbundenen Promotor- und Ribosom-Bindungsstellen aus demselben Gen wie das Signal-Protein stammen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die operativ mit der das Signal-Protein kodierenden DNA- Sequenz verbundenen Promotor- und Ribosom-Bindungsstellen aus einem anderen Gen als dem Signal-Protein stammen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das reife Protein Staphylococcus-Protein A umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das reife Protein Levansaccharase umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das reife Protein Barnase umfaßt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das reife Protein Streptavidin umfaßt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das reife Protein aus der aus industriellen Enzymen, biotinbindenden Proteinen, Immunoglobulin-bindenden Proteinen, Immunoglobulinen, Rezeptor-Proteinen, viralen Proteinen und Antigenen mikrobiellen und protozoischen Ursprungs bestehenden Gruppe ausgewählt ist.