DE3783191T2

DE3783191T2 - Verfahren und mittel zur herstellung eines proteins mit der gleichen igg-spezifizitaet wie protein g.

Info

Publication number: DE3783191T2
Application number: DE8787902174T
Authority: DE
Inventors: Ingmar Flock; Bengt Mikael Guss; Martin Lindberg; Erik Uhlen
Original assignee: Pharmacia LKB Biotechnology AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1986-03-21
Filing date: 1987-03-20
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2007-03-21
Also published as: SE459662B; DE3783191D1; JPS63503032A; EP0262192A1; JPH08205876A; ATE83801T1; US5756670A; WO1987005631A1; DE262192T1; SE8601325L; EP0262192B1; US5976861A; JPH08205875A; SE8601325D0; JP2764022B2; JP2514061B2; JP2764021B2

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnologie und betrifft rekombinante DNA-Moleküle, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die ein Protein oder Polypeptid der gleichen IgG- Spezifität wie Protein G aus dem Streptokokkenstamm G148 der Gruppe G codiert. Ferner umfaßt die Erfindung Mikroorganismen, die die vorstehend genannten Moleküle enthalten und ihre Verwendung zur Herstellung des vorstehend genannten Proteins oder Polypeptids.
Die Existenz von bakteriell erzeugten Proteinen oder Polypeptiden, die selektiv an den Fc-Teil der Immunglobuline binden, ist seit Jahrezehnten bekannt. Unter solchen Proteinen ist das am gründlichsten erforschte das Protein A aus Staphylococcus aureus; und dies ist in der Tat das einzige Protein dieser Gruppe, das eine gewerbliche Bedeutung erlangt hat (Protein A und Protein A Sepharose von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden). Sjöquist (FEBS Letters 28(1) (1972) S. 73-76 und US-Patente 3,850,798 und 3,995,018) entdeckte, daß eine Komponente des Protein A-IgG-Systems bei Immobilisierung auf einem unlöslichen Polymeren zur Bindung der anderen Komponente verwendet werden konnte, und es wurde somit möglich, das Protein in großem Maßstab zu reinigen und auch ein sehr einfaches und selektives Verfahren zur Isolierung von Antikörpern zu entwickeln. Die Spezifität des Proteins für verschiedene unterschiedliche Immunglobuline wurde in großem Detail untersucht; vergleiche beispielsweise Forsgren, A. et al., Staphylococci and Staphylococcal Infections 2 (1983), S. 429-479, Academic Press Inc. (London). Eine bemerkenswerte Besonderheit dieses Proteins ist seine niedrige Affinität für die IgG-Untergruppe IgG&sub3; des Humansystems. Angesichts der Tatsache, daß diese Untergruppe etwa 8% des Gesamt-IgG-Gehalts in Serum ausmacht, werden ergänzende Reinigungsstufen zur Isolierung aller IgG-Klassen benötigt.
Jedoch zeigte bereits 1973 Kronvall (J. Immunol. 111(5) (1973) S.1401-6), daß auch die Streptokokken der Gruppen C und G Komponenten auf ihrer Oberfläche tragen, die eine Affinität für IgG besitzen. Diese Versuche zeigten weiterhin, daß ihre Reaktivität in dieser Hinsicht eine Nicht-Immunreaktivität war, d.h. das Immunglobulin wurde nicht über seine Antigen-bindenden Stellen in den Fab-Anteilen gebunden, und die Ergebnisse zeigten, daß auch IgG&sub3; in diesem System gebunden wurde. Es wurde später gefunden, daß diese Fc-bindende Komponente proteinischer Natur ist und ihr wurde der Name "Protein G" gegeben. Daher würde als eine Ergänzung zu dem Staphylococcus aureus Protein A oder als Gesamt- oder Teilersatz davon Protein G eine natürliche Wahl unter bakteriell erzeugten Proteinen, die an den Fc-Teil der Immunglobuline der Klasse IgG binden können, sein, beispielsweise zum Zweck der Reinigung von IgG (U.S. 3,995,018). Aber das Protein wurde nicht in größerem Ausmaß untersucht, was auf Probleme, die mit dessen Freisetzung aus dem Bakterium verbunden sind, zurückzuführen ist.
In dem Journal of Immunol. 133(2) S. 969 veröffentlicheten Björck und Kronvall 1984 ein Verfahren, mit dem kleine Mengen des Proteins aus dem Bakterium mittels enzymatischen Abbaus mit Papain freigesetzt wurden. Dieses Verfahren ergibt ein Material, das die Durchführung begrenzter Struktur- und Funktionsstudien erlaubt, aber die Ausbeuten sind für eine kommerzielle Verwendung, beispielsweise für die Reinigung von monoklonalen Antikörpern, viel zu niedrig. Ganz im allgemeinen kann es auch schwierig sein, ein homogenes und reproduzierbares Produkt mit einem solchen Verfahren zu erhalten. Ferner sind Streptokokken pathogen und benötigen die Verwendung von komplexen Kulturmedien, was mit Komplikationen bei Kulturen in großem Maßstab verbunden ist. Es besteht somit ein Bedürfnis nach einem neuen Verfahren zur Erzeugung von Fc-bindenden Proteinen oder Fragmenten davon aus Streptococcen der Typen C und G.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Protein oder Polypeptid mit der gleichen IgG-Spezifität wie Protein G aus dem Streptococcenstamm G 148 der Gruppe G besitzt, codiert. Die natürliche Quelle für diese Nukleotidsequenz ist natürlich der erwähnte Bakterienstamm, aber es ist leicht vorstellbar, daß man auch auf synthetisch erzeugte Moleküle, insbesondere für die aktiven Polypeptide, zurückgreifen kann. Der Ausdruck "aktive Polypeptide" in diesem Zusammenhang bedeutet Polypeptide, die die vorstehend genannte IgG- Spezifität besitzen.
Zur Erzeugung des erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküls kann ein geeignetes Klonierungsvehikel, beispielsweise eine Plasmid- oder Phagen-DNA mit Hilfe eines Restriktionsenzyms geschnitten werden, worauf die DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein oder Polypeptid codiert, in die Schnittstelle unter Bildung des rekombinanten DNA-Moleküls inseriert wird. Dieses allgemeine Verfahren ist an sich bekannt und verschiedene Techniken zur Spaltung und Ligasierung der DNA-Sequenzen wurden in der Literatur beschrieben (vergleiche beispielsweise U.S. 4,237,224); aber nach bestem Wissen wurden diese Techniken im vorliegenden Proteinsystem nicht verwendet. Wenn der Bakterienstamm Streptococcus G148 als Quelle der gewünschten Nukleotidsequenz verwendet wird, ist es möglich, diese Sequenz zu isolieren und in einen geeigneten Vektor so einzuführen, wie es in dem folgenden experimentellen Teil beschrieben ist.
Wirte, die verwendet werden können - d.h. Mikroorganismen, die zur Erzeugung des Proteins oder von aktiven Fragmenten davon veranlaßt werden - können bakterielle Wirte, wie Stämme von beispielsweise Escherichia, Bacillus, Streptococcus, Staphylococcus und ferner Hefen und andere eukariotische Zellen in Kultur umfassen. Unter den bakteriellen Wirten sind die vom grampositiven Typ bevorzugt und zwar wegen der Tatsche, daß ihre Zellwand nur ein Membransystem enthält. Wenn das Protein oder das aktive Fragment in Kombination mit einem im System passenden Signalpeptid gebildet wird, dann wird das Produkt direkt in das Medium sezerniert. Zahlreiche Signalpeptide wurden in den vergangenen Jahren publiziert, vergleiche beispielweise WO 84/00774; für einen Fachmann ist es gut bekannte Routine, Signalpeptide zu wählen und anzuwenden, die geeignet sind, eine gute Sekretion in verschiedenen bakteriellen Systemen zu ergeben. Zum Erhalt einer maximalen Expression können regulatorische Elemente wie Promotoren und Ribosomen-bindende Sequenzen auf an sich bekannte Weise variiert werden.
Die Erfindung umfaßt somit rekombinante DNA-Moleküle, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die ein Protein oder Polypeptid mit der gleichen IgG-Spezifität wie Protein G aus Streptococcus G148 codiert. Wie aus dem Versuchteil dieser Beschreibung hervorgeht, besitzt das Protein G-Gen die folgenden Nukleotidsequenzen C1, C2 und C3, die für IgG- bindende Polypeptide codieren:
Die Erfindung betrifft somit rekombinante DNA-Moleküle, die eine oder mehrere der genannten Nukleotidsequenzen oder analoge Sequenzen enthalten. Der Ausdruck "analoge Sequenzen" bedeutet Sequenzen, die für Polypeptide mit der zuvor erwähnten IgG-Spezifität codieren.
Ferner umfaßt die Erfindung Vektoren wie beispielsweise Plasmide und Phagen, die eine solche Nukleotidsequenz enthalten und Mikroorganismen, insbesondere Bakterien wie beispielsweise Stämme von Escherichia, Bacillus und Staphylococcus, in die ein solcher Vektor eingeführt wurde. Alternativ kann eine solche Nukleotidsequenz in das natürliche Genmaterial des Mikroorganismus integriert werden.
Die Anmeldung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung eines Proteins oder Polypeptids mit der gleichen IgG-Spezifität wie Protein G aus Streptococcus G148. Gemäß diesem Verfahren wird ein, wie oben beschriebener, Mikroorganismus in einem geeigneten Medium gezüchtet, worauf das entstandene Produkt mittels affinitäts-chromatographischer Reinigung mit Hilfe von IgG in Bindung an einen unlöslichen Träger, oder mittels eines anderen Trennverfahrens, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie isoliert wird.
Vektoren, insbesondere Plasmide, die die für das Protein G codierende Nukleotidsequenz enthalten, können vorteilhafterweise mit einer leicht spaltbaren Restriktionsschnittstelle mittels einer Nukleotidsequenz, die ein anderes Produkt codiert, versehen werden. Diese Vektoren können an die, für das Protein G-codierende Nukleotidsequenz fusioniert werden, um somit ein sogenanntes Fusionsprotein zu exprimieren. Das Fusionsprotein kann nach einem Verfahren, bei dem dessen Eigenschaft, an IgG zu binden, verwendet wird, isoliert werden, worauf die andere Komponente des Systems, sofern erwünscht, aus dem Fusionsprotein freigesetzt werden kann. Diese Technik wurde ausführlich in WO 84/03103 bezüglich des Protein A Systems beschrieben und ist auch in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf analoge Weise anwendbar. Da Protein G und Protein A Bindungseigenschaften, die partiell einander komplementär sind, besitzen, ist ein Fusionsprotein, das diese beiden Komponenten enthält, ein potentiell attraktives Produkt. Gemäß einem Aspekt der voliegenden Erfindung wird eine Nukleotidsequenz wie zuvor definiert an eine Gensequenz, die für Protein A oder ein aktives Fragment davon codiert, in einem Fusionsvektor und folglich in einem Molekül, das für ein Fusionsprotein mit kombinierten Bindungseigenschaften von Protein A und Protein G codiert, fusioniert. Vektoren und Mikroorganismen, wie zuvor definiert, die aber diese spezifische Nukleotidsequenz enthalten, bilden einen weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung. Ein weiterer Gesichtspunkt ist das Fusionsprotein oder Polypeptid, das die kombinierten Bindungseigenschaften von Protein A und Protein G enthält, das von der genannten Nukleotidsequenz codiert wird, oder auf äquivalentem Weg erzeugt wird.

Ausgangsmaterialien und allgemeine Verfahren

Streptococcus G148, das ein Humangruppen G-Stamm ist, wurde von Statens Veterinärmedicinska Anstalt (SVA), Uppsala, Schweden bezogen.
Die E.coli-Stämme HB101 (Boyer, HW und Roulland-Dussoix, D, J. Mol. Biol. 41(1969) S. 459-472) und JM 105 (Messing, J. und Carlsson, J., J. Biotechnol. 1(1984) S. 253-264) wurden als bakterielle Wirte für die zu erzeugenden Plasmide verwendet und die Stämme NM538 und NM539 wurden zur Klonierung mit dem lambda-Vektor EMBL3a (Frischauf, A-M et al., J. Mol. Biol. 170(1983) S. 827-842) verwendet. Die verwendeten Plasmidvektoren waren pUC13, pUC18, und pUC19 (Norrander, J. et al., Gene 26(1983), S. 101-106), und pBR322 (Bolivar, F et al. Gene 2 (1977) S. 95-113).

Kulturmedien

Das im folgenden beschriebene Medium wird zur Züchtung von E. coli Bakterien verwendet. Die angegebenen Mengen beziehen sich auf 1 Liter Medium.
Trypton Soja Bouillon (Oxoid Ltd Basingstoke, Hants., England) 30 g
Hefeextrakt (Oxoid) 10 g
D-Glucose 40 g
NH&sub4;Cl 2.5 g
Na&sub2;HPO&sub4;.2H&sub2;O 7,5 g
KH&sub2;PO&sub4; 3,0 g
Na&sub2;SO&sub4;.10H&sub2;O 2,5 g
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,2 g
CaCl&sub2;.2H&sub2;O 0,5 mg
FeCl&sub3;.6H&sub2;O 16,7 mg
ZnSO&sub4;.7H&sub2;O 0,18 mg
CuSO&sub4;.5H&sub2;O 0,16 mg
MnSO&sub4;.4H&sub2;O 0,15 mg
CoCl&sub2; 0,10 mg
NaEDTA 20,1 mg
Das im folgenden beschriebene Medium wird zur Züchtung von Streptococcus G148 verwendet. Auch hier beziehen sich die Mengen auf die Gehalte pro Liter Kulturmedium.
Hefeextrakt (Oxoid) 50 g
Trypton Soja Bouillon (Oxoid) 30 g
L-Alanin 0,69 g
L-Asparagin 0,30 g
L-Arginin 0,50 g
L-Glutamin 0,43 g
Glycin 0,28 g
L-Histidin 0,15 g
L-Isoleucin 0,22 g
L-Leucin 0,33 g
L-Lysin 0,27 g
L-Methionin 0,09 g
L-Phenylalanin 0,35 g
L-Prolin 0,50 g
L-Serin 0,26 g
L-Threonin 0,20 g
L-Tryptophan 0,07 g
L-Tyrosin 0,03 g
L-Valin 0,26 g

Herstellung von DNA

Streptococcus G148 Zellen wurden in Todd-Hewitt-Medium (Oxoid Ltd Basingstoke, Hants., England) gezüchtet. Die Zellen wurden gewaschen und dann in einem zellfreien Medium aus Streptomyces griseus 9179 (1/20 des Originalvolumens) resuspendiert, worauf Lysocym bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt wurde. Der Streptomyces-Stamm, der von Dr. W. Köhler, Institut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, DDR, erhalten worden war, wurde wie von Prauser und Köhler in Zeitschrift für allg. Mikrobiologie Bd. 5 (4) (1965) S. 308-314 beschrieben, gezüchtet, um die lytische Aktivität zu induzieren. Wenn die Streptococcus- Zellen in dem Medium 2 Stunden bei 37ºC inkubiert worden waren, wurde die DNA, wie von Marmur, J, J. Mol. Biol. 3(1961) S. 208-218 beschrieben, extrahiert.
Plasmid-DNA aus E. coli wurde durch alkalische Extraktion (Birnboim, HC et al. Nucleic Acids Res. 7(1979) S. 1513- 1523) hergestellt.
Lambda-DNA wurde, wie von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1982) beschrieben, hergestellt.
Die Plasmidtransformationen wurden, wie von Morrison et al. (Methods Enzymol. 68(1979) S. 326-331) beschrieben, durchgeführt.
Die Restriktions-Endonukleasen, T4 DNA-Ligase, DNA- Polymerase I und Klenow-Fragmente wurden von New England Biolabs (Boston, USA) oder von Boehringer Mannheim (Mannheim, BRD) bezogen und entsprechend den Anweisungen der Hersteller verwendet.

Beispiel 1. Isolierung eines Lambda-Klons, der Polypeptide die IgG-bindende Aktivität besitzen, codiert

Eine Genbank für Streptococcus G148 wurde analog, wie von Frischauf et al. (1983, siehe oben) beschrieben, hergestellt.
Die Streptococcus-DNA wurde mit Sau3A teilabgebaut und in einen BamHI-geschnittenen Lambda-Vektor EMBL3a ligasiert. Die ligasierte DNA wurde in vitro in Farbenteilchen verpackt, die dann E. coli NM539-Zellen infizieren konnten. Die entstandene Phagenbank wurde auf IgG-bindende Aktivität untersucht, wobei die Phagen zu diesem Zweck auf Agarplatten titriert wurden, die über Nacht bei 37ºC inkubiert wurden. Am nächsten Tag wurden Platten mit einer Plaque-Frequenz von 10³ - 10&sup4; ausgewählt. Ein Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schüll, Membranfilter BA85 (0,45 Mikrometer) Dassel, BRD) wurde auf jede der ausgewählten Platten gelegt. Man ließ das Blotten bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten ablaufen, und danach wurden die Filter 1 Stunde in Phosphat-gepufferte Natriumchloridlösung (PBS), die Tween 20 bis zu einer Konzentration von 0,1% enthielt, eingetaucht. Die Filterpapiere wurden dann auf eine Petrischale, die etwa 10&sup7; cpm 125I-markierte Kaninchen-IgG-Antikörper (spezifische Aktivität 7 mCi/mg) in PBS unter Zusatz von 0,05% Tween 20 (PBST) enthielt, überführt. Nach einer 2-stündigen Inkubationsperiode bei Raumtemperatur wurden die Filterpapiere zweimal 10 Minuten lang in PBST gewaschen und dann getrocknet. Die autoradiographische Analyse der Filterpapiere zeigte die positiven Lambda-Klone an, die Polypeptide, welche die radioaktiven Antikörper binden, erzeugten. Diese Klone wurden auf der Original-Agarplatte ausgewählt und wieder analysiert. Schließlich wurde ein Klon mit der Bezeichnung "Lambda SPG1" für die anschließenden Verfahren ausgewählt. Eine weitere Möglichkeit zusätzlich zu den oben aufgezählten Systemen ist natürlich die Vermehrung von Lambda SPG1 in geeigneten E. coli-Stämmen zur Bildung des gewünschten Proteins.

Beispiel 2. DNA Sequenzierung

Der Lambda-Vektor EMBL3a besitzt eine derartige Struktur, daß DNA-Fragmente, die an die BamHI-Schnittstellen gebunden sind, auf beiden Seiten von SalI-Schnittstellen flankiert sind. Die Spaltung der Lambda SPG1 DNA mit SAlI ergab 2 Fragmente von etwa 2,1 Kilobasenpaaren (kb) beziehungsweise 12 kb, welche sich von dem Streptococcus-DNA-Fragment, das ursprünglich inseriert worden war, ableiten. Diese beiden Fragmente wurden in SalI-geschnittenen pUC19 ligasiert, wodurch die zwei rekombinanten Plasmide pSPG1 und pSPG8, welche 2,1 kb beziehungsweise 12 kb-Fragmente enthielten. Die Transformanten von E. coli HB101, die die jeweiligen Plasmide enthielten, wurden in Luria-Bouillon (Maniatis et al.) unter Zusatz von Ampicillin bis zu einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm/ml gezüchtet, worauf das Zell-Lysat (Löfdahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), S. 697-701) auf die IgG-bindende Aktivität getestet wurde. Dies wurde mittels des Hemagglutinationstests (Guss et al., Eur. J. Biochem. 153 (1985) S. 579-585) durchgeführt. Ein E. coli-Klon, der das Plasmid pSPG1 enthielt, war in diesem Test positiv.
Das Plasmid pSPG1, das einen IgG-bindenden Teil des Protein G Gens aus Streptococcus G148 enthielt, wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen abgebaut. So gebildete DNA-Fragmente wurden in die replikative Form des Phagen M13 kloniert, und dann in den E. coli-Stamm JM105 transformiert. Die Nukleotidsequenz der inserierten DNA-Fragmente wurde mittels des sogenannten Dideoxy-Verfahrens (Sanger F., Nicklen, S. und Coulson, AR (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463- 5467) analysiert.
Figur 1 (a) zeigt die Restriktionskarte von pSPG1. Ein 1,5 kb EcoRI/HindIII Fragment, das den Bereich von 0,28 bis 1,73 kb in Figur 1 (a) umfaßte, wurde in pUC18 und pUC19 kloniert, wodurch pSPG2 beziehungsweise pSPG3 entstanden. Ihre vollständige Sequenz ist in Figur 2 gezeigt. Die Regionen, die in dieser Sequenz lokalisiert werden können, sind in Figur 1(b) dargestellt, worin die repetitiven Strukturen A1, A2 und A3 jeweils 24 Aminosäuren codieren und von den Sequenzen B1 und B2 (51 Aminosäuren), die ebenfalls repetitiv sind, unterbrochen sind, gezeigt sind. An eine sogenannte Spacerregion S schließen sich die repetitiven Regionen C1, C2 und C3, die jeweils 55 Aminosäuren entsprechen und von den Regionen D1 und D2 (15 Aminosäuren) unterbrochen sind, an. Als nächstes folgt ein hydrophiler Teil, W, der eine Struktur besitzt, die ähnlich der, der sogenannten Xr-Region des Protein A Systems ist (Guss et al. (1984) Eur. J. Biochem. 138, S. 413-420).
Die Ergebnisse aus der Aminosäureanalyse der Produkte aus pSPG1, pSPG2 und pSPG3 (Figur 1c) zeigten bei Vergleich mit dem Protein A System, daß sowohl die W als auch die M Regionen an der Zellwand - Zellmembran Wechselwirkung beteiligt sind. Die anderen Regionen konnten einer genaueren Untersuchung mit Hilfe einer Anzahl von Subklonen pSPG4 bis pSPG7 (Figur 1 c) unterworfen werden. In dieser Figur sind Sequenzen, die ein IgG-bindendes Produkt codieren mittels eines "+" Zeichens angegeben, während der Rest mittels eines "-" Zeichens gekennzeichnet ist. Es wurde gefunden, daß pSPG4 und pSPG7 nicht-bindende Produkte codieren. Somit ist der Teil der Sequenz, der bindende Polypeptide exprimiert in den C-Regionen, das heißt, C1, C2 und C3 lokalisiert.
In Figur 3 werden die homologen Regionen C1, C2, C3 ebenso wie die Regionen D1 und D2 verglichen. Diese Figur zeigt die Aminosäuresequenz von C1 und D1 und kennzeichnet das Auftreten von Abweichungen davon in C2 und C3, beziehungsweise D2. Fälle, in denen eine unterschiedliche Nukleotidsequenz die gleiche Aminosäure kodiert, sind durch "*" angegeben. Wie zu sehen ist, gibt es nur sehr wenige Fälle, in denen Abweichungen in der Nukleotidsequenz so waren, daß sie zu Expression einer unterschiedlichen Aminosäure führen.

Beispiel 3

(a) Reinigung von Protein G aus Streptococcus G148

Das Bakterium wurde in einem Tryptonmedium (siehe oben) in einem 12-Liter Fermenter gezüchtet. Am Ende der logarithmischen Phase wurden die Bakterien durch Zentrifugation gewonnen. Die Ausbeute betrug etwa 100 g Bakterien (Feuchtgewicht). Die Freisetzung des Zellwandproteins (Protein G) aus den Bakterien wurde, wie von Björck und Kronvall beschrieben (Zitat oben) durchgeführt. Kurz gesagt, man suspendiert dabei die Bakterien (10% Gewicht/Volumen) in 10 mM Trishydroxyethyl-Aminomethan (Tris), pH 8,0. Zum Abbau der Bakterien wurden pro ml Bakteriensuspension 100 Mikroliter 0,4 M L- Cystein (Sigma) und 80 Mikrogramm Papain (Sigma, p-3125) aufgelöst im gleichen Puffer zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC auf einem Schütteltablett inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen wurde Iodacetamid (Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 6 mM zugesetzt. Der Überstand, etwa 1 Liter, wurde aus dem Gemisch durch Zentrifugation entfernt, worauf Protein G mittels einer chromatographischen Trennung isoliert wurde.
In einem ersten Schritt wurde der pH-Wert der Probe auf pH 8,0 mit NaOH eingestellt und dann wurden 100 ml DEAE Sephacel (Pharmacia AB) equilibriert in 10 mM Tris (HCl), pH 8,0 zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang gerührt und danach wurde das Gel nach Waschen mit dem Equilibrierungspuffer in eine Säule (K25/40, Pharmacia AB) gepackt. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten 500 ml von 0 bis 0,5 M NaCl eluiert. Die Protein G-haltigen Fraktionen wurden mittels Immundiffusion gegen polyklonales IgG detektiert und dann, unter Bildung einer Probe, vereinigt.
In einem zweiten Schritt wurde die Probe (etwa 220 ml) mit einem gleichen Volumen von PBST (30 mM Na-PO&sub4;, 0,12 M NaCl, pH 7,2, und enthaltend 0,05% Tween 20) verdünnt, und mit 15 ml IgG-Sepharose 4B (Pharmacia AB) vermischt. Nach 2,5-stündigem Rühren wurde das Gel auf einem Glasfilter gewaschen und in eine K16/20 Säule (Pharmacia AB) gepackt. Das Protein wurde dann aus dem Gelbett durch isokratische Elution mit 0,1 M Glycin (HCL), pH 2,5 (Flußrate 10 ml/Stunde) freigesetzt. Es wurde mit Hilfe einer PD-10 Säule (Pharmacia AB) bis zu 30 mM Na-PO&sub4;, pH 7,2 entsalzt.
Das Protein wurde dann durch analytische Chromatographie auf einer Mono Q HR 5/5 Säule (Pharmacia AB) charakterisiert. Die Chromatogramme zeigten, daß die Ergebnisse sehr von der Art auf die die Papain-Extraktion durchgeführt worden war, abhingen. Zwei hervorstechende Peaks einschließlich einiger kleinerer Peaks mit Protein G Aktivität wurden festgestellt. Die SDS-Elektrophorese zeigte zwei Proteinbanden entsprechend einem Molekulargewicht von 10 000 und einem Molekulargewicht von 15 000. Tabelle 1 zeigt die Reaktivität des Protein G aus Enzym-abgebautem Streptococcus G148 zusammen mit den entsprechenden Werten, die bei dem Verfahren nach Beispiel 3(b) unten erhalten worden waren.

(b) Reinigung und Charakterisierung von Protein G gebildet von einem E. coli-Stamm

Ein E. coli-Stamm, der das Plasmid pSPG1 (vergleiche oben) enthielt, wurde zur Herstellung von Protein G verwendet.
Das Bakterium wurde in einem 12-Liter Fermenter in einem Standard E. coli-Medium (vergleiche oben) gezüchtet. Am Ende der logarithmischen Phase wurden die Zellen durch Zentrifugation getrennt. Etwa 560 g Bakterien (Feuchtgewicht) wurden erhalten. Diese wurden in 560 ml PBS gesuspendiert und in einer Mühle (Dyno-Mill Type KDL, Willy A. Bachofen AG, Maschinenfabrik, Schweiz) vermahlen. Das Vermahlen wurde mit 0,1 - 0,2 mm Glaskugeln unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 3 000 Umdrehungen/Minute und einer Flußrate von 5,7 l/Stunde durchgeführt. Der überstand, etwa 1,480 ml, wurde durch Zentrifugation abgetrennt.
Die chromatographische Reinigung wurde analog, wie in Beispiel 3(a) beschrieben, durchgeführt, wobei der Hauptunterschied war, daß der Affinitäts-chromatographische Schritt vor dem Ionen-Austausch Schritt durchgeführt wurde. Wenn das gereinigte Protein analysiert wurde, wurde gefunden, daß es zwei Hauptfraktionen mit einem Molekulargewicht von 30 000 beziehungsweise 40 000 enthielt. Dies sollte mit den Werten 10 000 beziehungsweise 15 000 verglichen werden, die im Falle des Papain-abgebauten Streptococcus erhalten wurden. Jedoch war die IgG-Reaktivität die gleiche; vergleiche Tabelle 1.
Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der Aminosäurezusammensetzungen von (i) Protein G aus Papain-extrahiertem Streptococcus G148 (Beispiel 3a) und (ii) einem Protein, das von E. coli (Beispiel 3b) gebildet wurde.
Die Tabelle 3 vergleicht Protein A und Protein G bezüglich ihrer Affinität für verschiedene Immunglobuline. Die Tabelle zeigt die Menge des jeweiligen Immunglobulins, das für eine 50%-ige Inhibierung der Bindung zwischen Enzym-konjugiertem polyklonalem KaninchenIgG und immobilisiertem Protein A beziehungsweise Protein G benötigt wird. Angesichts der Affinitätsunterschiede, wie aus den Ergebnissen hervorgeht, ist daß das zuvor erwähnte Protein A - Protein G Fusionsprotein eine interessante Anwendung des Gegenstands der vorliegenden Erfindung, wie in dem folgenden Beispiel 4 gezeigt. Folglich werden auch Fusionsproteine in Betracht gezogen, die aktive Protein A und Protein G Fragmente enthalten, wobei "aktiv" sich auf die Immunglobulin-bindende Eigenschaft bezieht.

Beispiel 4. Konstruktion von Plasmid-Vektoren, die Immunglobulin-bindende Aktivitäten von Protein G oder einem Fusionsprotein aus Protein A und Protein G codieren

Bei der in diesem Beispiel beschriebenen Konstruktionsarbeit wurde auf weitere Hersteller (Pharmacia AB, Schweden, und IBI (International Biotechnologies Inc., New Haven)) außer den oben erwähnten, zurückgegriffen, um die verschiedenen Restriktions-Endonukleasen und die T4 DNA-Polymerase zu beziehen. Die Enzyme wurden nach den Empfehlungen der Hersteller verwendet. Zwischen jedem Schritt in dem Konstruktionsverfahren wurde Inaktivierung und Entfernung des verwendeten Enzyms (unter Verwendung einer Phenol/Chloroform Extraktion) durchgeführt, und daran anschließend eine Ethanolfällung der DNA. Schließlich wurden die DNA-Proben in einem geeigneten Puffer resuspendiert. Der E. coli-Stamm TGI (Carter et al (1985) Nucleic Acids Res. 12: 4431-4443) wurde verwendet. Nach Transformation der ligasierten Proben in E.coli-Zellen wurden die rekombinanten Klone auf Ampicillinresistenz selektioniert.

Konstruktion von pUG26.

Ein Subklon mit der Bezeichnung pG107, der das etwa 1,8 kb lange EcoRI/SalI-Fragment (Position 0,3 bis 2,1 in Figur 1C) aus pSPG1 (Beispiel 2) in Insertion zwischen den EcoFI/SalI-Schnittstellen in pBR322 enthielt, wurde zur Isolierung eines DNA-Fragments, das die Immunglobulin-bindenden Regionen von Protein G kodiert, verwendet. Wie schematisch in Figur 4 gezeigt, wurde das pG107 mit ThaI abgebaut und anschließend mit einem 8-mer Oligonukleotid-Adapter (Pharmacia AB, Schweden, Kat. Nr. 27-7730- 01) mit der Erkennungsstelle für BamHI ligasiert. Die ligasierte Probe wurde mit BstNI geschnitten und anschließend mit Klenow-Fragmenten und den vier Desoxynukleotiden zur Auffüllung der BstNI-Restriktionsschnittstelle inkubiert, wodurch stumpfe Enden erzeugt wurden. An das zuletzt genannte Verfahren schloß sich eine BamHI-Behandlung an und die Probe wurde einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterworfen. Ein DNA-Fragment mit etwa 830 Nukleotiden (n.t.) wurde ausgeschnitten, eluiert und gereinigt. Eine schematische Zeichnung dieses Fragments ist in Figur 4 gezeigt. Dieses Fragment wurde in pTZ18R (Pharmacia AB, Schweden, Kat. Nr. 27-4984-01), das zuvor mit XbaI abgebaut worden war, ligasiert und anschließend mit dem Klenow- Fragment und den vier Desoxynukleotiden zur Auffüllung der XbaI-Restriktionsschnittstelle inkubiert, wodurch ein stumpfes Ende geschaffen wurde. Schließlich wurde mit BamHI abgebaut. Dann wurde das gereinigte Fragment mit dem BamHI/stumpfen Ende, das die Immunglobulin-bindenden Regionen von Protein G enthielt, in pTZ18R ligasiert, wodurch BamHI/stumpfe Enden erzeugt wurden. Nach Ligasierung wurde die Probe in gefrierfähige E. coli-Zellen transformiert und ein Klon, der bezüglich der Erzeugung von Protein G positiv war, und die Bezeichnung pUG26 hatte und das Protein G-Fragment beherbergte, wurde isoliert. Eine schematische Zeichnung von pUG26 ist in Figur 4 gezeigt.

Konstruktion von pUG27.

Ein Derivat von pTZ18R wurde konstruiert und enthielt ein Oligonukleotid mit der Bezeichnung Universal Translation Terminator (Pharmacia AB, Schweden, Kat. Nr. 27-4890-01), das im folgenden als UTL abgekürzt wird. Die Konstruktion des Vektors pTZ18RUTL ist ebenfalls schematisch in Figur 5 gezeigt. Der pTZ18R wurde mit PstI abgebaut und anschließend mit T4 DNA-Polymerase zum Abbau der klebrigen Enden inkubiert, wodurch stumpfe Enden erzeugt wurden, an die die UTL-Adapter ligasiert wurden. Nach Ligasierung wurde die Probe in gefrierfähige E. coli-Zellen transformiert und ein Klon, der einen UTL-Adapter in Insertion in eine modifizierte PstI-Schnittstelle enthielt, wurde isoliert und erhielt die Bezeichnung pTZ18RUTL.
Das Plasmid pUG26 wurde mit EcoRI/SalI abgebaut und die abgebaute Probe wurde dann einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterworfen. Ein DNA-Fragment von etwa 860 Nukleotiden, das für die Immunglobulin-bindenden Regionen von Protein G kodierte, wurde ausgeschnitten, eluiert und gereinigt. Dieses Fragment wurde in einem EcoRI/SalI-abgebauten Vektor pTZ18RUTL (Figur 5) ligasiert.
Nach Ligasierung wurde die Probe in gefrierfähige E. coli- Zellen transformiert und ein Klon, der positiv bezüglich der Erzeugung von Protein G war und die Bezeichnung pUG27 hatte, wurde isoliert.
Eine schematische Zeichnung von pUG27 ist in Figur 5 gezeigt.

Endkonstruktion von pAG1.

Um ein DNA-Fragment, das den Protein A-Promotor und Ribosomen-bindende Sequenzen zusammen mit dem Teil, der die Signalsequenz und die Immunglobulin- bindenden Regionen E, D, A, B und C kodiert, enthielt, zu isolieren, wurde ein Plasmid mit der Bezeichnung pSPA8 (Uhlen et al 1983. Gene, 23, 369-378) verwendet. Dieses Plasmid wurde mit BstNI abgebaut und anschließend mit dem Klenow-Fragment und den vier Desoxynukleotiden zur Auffüllung der BstNI-Schnittstelle inkubiert, wodurch stumpfe Enden erzeugt wurden. Daran schloß sich ein Abbau mit EcoRI an. Nach Abbau wurde die Probe einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterworfen. Ein DNA-Fragment von etwa 1200 Nukleotiden, das die oben beschriebenen Regionen von Protein A enthielt, wurde ausgeschnitten, eluiert und gereinigt. Dieses Fragment wurde in EcoRI/SmaI-abgebautes pUG27 (Figur 5) ligasiert. Nach Ligasierung wurde die Probe in gefrierkompetente E. coli-Zellen transformiert und ein Klon mit dem Plasmid pAG1 wurde isoliert. Das Plasmid beherbergte das Protein A-Fragment (Figur 5). Das pAG1-Plasmid codiert für ein Fusionsmolekül, das schematisch in Figur 6 gezeichnet ist, worin eine ausführlichere Beschreibung der verschiedenen Verbindungen enthalten ist.

Konstruktion eines Plasmid-Vektors, der so konstruiert ist, daß er extrazelluläres Protein G exprimiert.

Die Konstruktion des pE1-Plasmids ist schematisch in Figur 7 gezeigt. Das pEZZ-Plasmid (Nilsson et al (1986) Protein Engineering, im Druck) wurde verwendet. Das pEZZ-Plasmid wurde mit AccI abgebaut und anschließend in niedriger Konzentration (1 mg/l) religasiert um die Region zwischen den AccI-Schnittstellen zu deletieren. Die ligasierte Probe wurde in gefrierfähige E. coli-Zellen transformiert und ein Klon mit der Bezeichnung pE1 , der die beiden ZZ-Regionen nicht enthielt, wurde isoliert.
Das Plasmid pUG27 wurde mit BamHI/HindIII abgebaut und die abgebaute Probe wurde einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterworfen und ein DNA-Fragment von etwa 840 Nukleotiden, das die Immunglobulin-bindenden Regionen von Protein G enthielt, wurde ausgeschnitten, eluiert und gereinigt. Dieses Fragment wurde in BamH1/HindIII-abgebaute pE1-Plasmide ligasiert.
So wurde nach der Ligasierung der BamHI/HindIII-Fragmente von pUG27 in BamHI/HindIII-abgebautes pE1 die Probe in gefrierfähige E. coli-Zellen transformiert und ein Klon, der positiv bezüglich der Erzeugung von Protein G war, und die Bezeichnung pEG1 hatte und das Protein G-Fragment beherbergte, wurde isoliert.

Expression und Reinigung der pAG1 und pEG1-abgeleiteten Proteine

E. coli-Zellen, die das Plasmid pAG1 beziehungsweise pEG1 beherbergten, wurden in einem Liter E. coli-flüssigem Kulturmedium (vergleiche oben), das mit Ampicillin supplementiert war (Endkonzentration 100 Mikrogramm/ml) über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Das Wachstumsmedium aus den über-Nacht- Kulturen wurde durch Zentrifugation gewonnen und anschliessend der IgG-Affinitätschromatographie nach Nilsson et al 1986 (Protein Engineering, in Druck) unterworfen.
Die erhaltenen gereinigten Proteine wurden unter Verwendung von SDS-PAGE analysiert und die Molekulargewichte entsprachen denen, die aus der abgeleiteten Nukleotidsequenz (etwa 31 000 für das pEG1-Gen-Produkt und etwa 66 000 für das pAG1-Gen-Produkt) berechnet wurden.

Vergleichende Immunglobulin-Bindungs-Studien

Die Immunglobulin-Bindungs-Affinitäten, für die von pAG1 und pEG1-kodierten Proteine, hier Protein AG beziehungsweise Protein G bezeichnet, wurden mit einem handelsüblichen Protein A, erhalten von Pharmacia AB, Schweden, verglichen. Die Immunglobulin-bindende Aktivität der verschiedenen Proteine wurde unter Verwendung einer kompetitiven ELISA-Technik nach Guss et al (EMBO J. 5, 1567-1575 (1986)) analysiert. Die verschiedenen Immunglobuline wurden auf ihre Fähigkeit, die Bindung zwischen alkalischer Phosphatase-konjugierten polyklonalen Kaninchen-IgG-Antikörpern und immobilisiertem handelsüblichem Protein A und den Proteinen AG und G zu inhibieren, getestet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 4 und 5 dargestellt. Es wird darauf hingewiesen, daß die Figuren in diesen Tabellen gegen die Bindungsaktivität an polyklonales Kaninchen-IgG standardisiert wurden.
Die Figuren in Tabelle 4 zeigen, daß Protein A eine höhere Affinität als Protein G, abgeleitet von pEG1 gegen polyklonales IgG von Menschen, Meerschweinchen, Hund, Schwein und Maus besitzt. Im Gegensatz dazu zeigt Protein G, abgeleitet von pEG1 eine stärkere Wechselwirkung mit polyklonalem IgG aus Kuh, Pferd, Ziege und Schaf. Alle drei Proteine zeigen Wechselwirkungen in der gleichen relativen Stärke gegen polyklonales Kaninchen-IgG und binden polyklonales Hühner- IgG nicht. Tabelle 4 zeigt auch die Bindungsaktivität des Fusionsproteins AG, exprimiert aus pAG1. Protein AG besitzt eine Affinität gegen alle Spezies von polyklonalem IgG, die Protein A und/oder Protein G binden. So vereinigt, wie in Tabelle 4 gezeigt, Protein AG sowohl Protein A als auch Protein G-bindende Aktivitäten.
Die Affinitäten von Protein A, G und AG gegen verschiedene Human-Myelom-Immunglobuline sind in Tabelle 5 gezeigt. Protein A zeigt hohe Affinität gegen IgG1, IgG2 und IgG4, aber nicht gegen IgG3, im Gegensatz zu Protein G, das eine hohe Affinität gegenüber allen IgG-Unterklassen zeigt. Protein AG zeigt eine hohe Affinität gegen alle IgG-Unterklassen, ausgenommen IgG3, an das es mit geringerer Affinität als Protein G, aber höherer als Protein A bindet. Keines der Proteine A, G oder AG zeigt irgendeine Affinität gegen Myelome der IgM und IgD-Klassen.

Schlußfolgerungen

Die in diesem Beispiel gezeigten Ergebnisse zeigen, daß das Plasmid pEG1 ein Protein mit der entsprechenden IgG-Bindungsspezifität wie Protein G, das von pSPG1 codiert wird, codiert.
Ferner besitzt das Fusionsprotein AG, das von pAG1 codiert wird, in einem Molekül die kombinierten IgG-Bindungsspezifitäten der zwei getrennten Proteine A und G. Tabelle 1 Immunglobulinaffinität von Protein G aus Papain-extrahiertem Streptococcus G148 und aus E. coli, enthaltend ein Plasmid, das das Protein G gemäß den Beispielen codiert. Die Essays wurden mittels Immundiffusion durchgeführt und die dargestellten Ergebnisse sind wie folgt: direkte Präzipitation, (2); Fähigkeit, die Präzipitationsreaktion zwischen polyklonalem Rinder-IgG und Protein G zu inhibieren (1); weder Inhibition noch Präzipitation (0). IgG Klasse Streptococcen E. coli Polyklonales IgG Mensch Kaninchen Kuh Pferd Ziege Meerschweinchen Schaf Hund Schwein Ratte Maus Huhn Monoklonales Maus-Ig 1) (Human IgE) Ig Klasse Streptococcen E. coli Human-Myeloma-Proteine IgG 1 Lambda IgG 1 Kappa IgG 2 Lambda IgG 2 Kappa IgG 3 Lambda IgG 3 Kappa IgG 4 Lambda IgG 4 Kappa IgM IgA IgD +) nicht bestimmt 1) Identifiziert durch die Namen der einzelnen monoklonalen Antikörper Tabelle 2 Vergleich der Aminosäuregehalte von gereinigtem Protein G (bestimmt in den zwei Hauptproteinfraktionen) bei Ableitung von (i) Papainextrahiertem Streptococcus G148 und (ii) E. coli tragen ein Plasmid, das Protein G gemäß Beispiel 3(b) codiert. Die Ergebnisse sind in mol-Prozent angegeben. Streptococcen G148 E. coli Aminosäure Fraktion I Fraktion II Asparagin + Asparaginsäure Threonin Serin Glutamin + Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Lysin Histidin Arginin Cystein Tryptophan 1) nicht bestimmt Tabelle 3 Vergleich von Protein A und Protein G bezüglich ihrer Affinität zu verschiedenen Immunglobulinen. Die Tabelle zeigt die Menge des jeweiligen Immunglobulins, die für eine 50 %- ige Hemmung der Bindung zwischen Enzym-konjugiertem polyklonalem IgG und immobilisiertem Protein A beziehungs Protein G benötigt wird. Nichtreaktivität wird durch "-" bezeichnet. Menge (ng), die für eine 50 %-ige Hemmung benötigt wird Immunglobulin Protein G Protein A polyklonales IgG Mensch Kaninchen Kuh Pferd Ziege Meerschweinchen Schaf Hund Schwein Ratte Maus Huhn Human-Myeloma-Proteine IgG1 Lambda IgG1 Kappa IgG2 Lambda IgG2 Kappa IgG3 Kappa IgG4 Lambda IgG4 Kappa IgM Tabelle 4 Relative Mengen von polyklonalem IgG aus verschiedenen Arten, die benötigt werden, um eine 50 %-ige Hemmung der Bindung zwischen Enzym-markiertem Kaninchen-polyklonalem-IgG und immobilisierten Proteinen A, G oder AG*) zu ergeben. Art Kaninchen Mensch Kuh Pferd Ziege Meerschweinchen Schaf Hund Schwein Ratte Maus Huhn *) Schlüssel zu der Tabelle: Die Zahlen wurden gegen polyklonales Kaninchen-IgG standardisiert. Tabelle 5 Relative Mengen der verschiedenen Human-Myeloma-Immunglobuline, die benötigt werden, um eine 50 %-ige Hemmung der Bindung zwischen Enzym-markiertem Kaninchen, polyklonalem IgG und immobilisierten Proteinen A, G oder AG zu ergeben *). IgG1 Lambda IgG1 Kappa IgG2 Lambda IgG2 Kappa IgG3 Kappa IgG4 Lambda IgG4 Kappa IgM IgD *) Schlüssel zu der Tabelle: Die Zahlen wurden gegen polyklonales Kaninchen-IgG standardisiert.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die ein Protein oder Polypeptid codiert, das dieselbe IgG-Spezifität wie Protein G aus Streptococcus G148 besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere der folgenden Nukleotidsequenzen enthält:

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nukleotidsequenz

enthält.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nukleotidsequenz

enthält.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nukleotidsequenz

enthält.

5. Plasmid oder Phage, enthaltend eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1-4.

6. Mikroorganismus, enthaltend mindestens ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1-4.

7. Mikroorganismus, enthaltend mindestens ein Plasmid oder einen Phagen nach Anspruch 5.

8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids, das dieselbe IgG-Spezifität wie Protein G aus Streptococcus G148 besitzt, dadurch gekennzeichnet

- daß man mindestens ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1-4 in einen Mikroorganismus inseriert

- diesen Mikroorganismus in einem geeigneten Medium züchtet

- das so gebildete Protein mittels affinitäts-chromatographischer Reinigung mit Hilfe von, an einen unlöslichen Träger gebundenem IgG, isoliert.

9. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die Protein G oder ein aktives Fragment davon, codiert, in Fusion an eine Gen-Sequenz, die Protein A oder ein aktives Fragment davon, codiert.

10. Plasmid oder Phage, enthaltend eine fusionierte Nukleotidsequenz nach Anspruch 9.

11. Mikroorganismus, enthaltend mindestens ein Plasmid oder einen Phagen nach Anspruch 10.

12. Fusionsprotein oder Polypeptid, enthaltend die kombinierten Bindungseigenschaften von Protein A und Protein G, gebildet unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach Anspruch 9.