SE466259B - Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal - Google Patents

Description

466 259 10 15 20 25 30 35 2 -receptorn från grupp A-streptokocker har kallats protein Arp. Vissa stammar av den anaeroba bakterien Clostridium perfringens binder företrädesvis IgM men också IgA och IgG. Denna bindningsförmàga är beroende av ett cellbak- terieytprotein (protein P). Nyligen isolerades ett bak- terieprotein, protein L, med unika bindningsegenskaper för L-kedjor, från Peptococcus magnus. Protein L har visats binda IgG, IgA och IgM från homo och åtskilliga däggdjurs- arter. Bland gram-negativa bakterier har Ig-receptorer rapporterats bland djurpatogener. Brucella abortus binder bovint IgM och Taylorella equigenitalis, en bakterie som är veneriskt patogen för hästar, binder equint IgG. Ny- ligen rapporterades Haemophilus somnus binda bovint IgG.

För ca 10 år sedan rapporterades Haemophilus influen- zae och Moraxella (Branhamella) catarrhalis ha en hög bindningskapacitet för humant IgD (Forsgren, A. och Grubb, A., J. Immunol. l22:l468, 1979).

Föreliggande uppfinningen beskriver solubiliseringen och reningen av ett H. influenzae ytprotein som är ansva- rigt för interaktionen med IgD. Den beskriver också klo- ningen, expressionen och nukleotidsekvensen av den IgD- -bindande genen från H. influenzae i Escherichia coli.

Dessutom beskrivs de IgD-bindande egenskaperna hos denna molekyl, benämnd protein D, som befanns vara skild från tidigare beskrivna Ig-bindande proteiner. Protein D be- fanns bara reagera med IgD och inte med andra humana immunoglobulinklasser. Sålunda kan protein D vara ett viktigt verktyg för studier, separation och påvisande av IgD pà samma sätt som protein A och protein G tidigare har använts för IgG. Protein D kan också vara ett värdefullt verktyg ensamt och i kombination med andra molekyler (t ex proteiner och polysackarider) i stimuleringen av immun- systemet via en interaktion med B-lymfocyter. Protein D är icke identiskt med något tidigare beskrivet protein fràn H. influenzae. 10 15 20 25 30 35 466 259 3 H. influenzae är en vanlig human parasit och sjuk- domsalstrande bakterie som koloniserar slemhinnor i övre luftvägarna och förorsakar sjukdom genom spridning eller invasion. En viktig särskiljande egenskap mellan H. in- fluenzae-isolat är om de är inkapslade eller ej. Inkaps- lade H. influenzae typ b är en vanlig orsak till bakte- riell meningit och andra invasiva infektioner hos barn under 4 års ålder i Europa och USA. Icke inkapslad (non- -typable) H. influenzae förorsakar sällan invasion hos friska barn och vuxna men är en vanlig orsak till öronin- flammation hos barn och anses vara en förorsakande patogen bakterie vid bihåleinflammation hos både vuxna och barn.

H. influenzae har också ofta isolerats i varigt sekret från patienter med cystisk fibros och kronisk luftrörs- katarr och har nyligen beskrivits som en viktig orsak till lunginflammation.

Ett vaccin bestående av renad typ b-kapselpolysacka- rid har visats vara effektivt mot H. influenzae typ b- -sjukdom hos barn i åldrarna 2 till 5 år. Eftersom barn under 2 år svarar dåligt mot detta vaccin, har konjugerade vacciner med ökad immunogen förmåga utvecklats genom att kovalent binda kapselpolysackarid till vissa proteiner.

Emellertid har polysackaridvacciner, okonjugerade och kon- jugerade, inget värde mot icke-typbara H. influenzae-sjuk- domar. Sålunda har andra cellytekomponenter, särskilt yttermembranproteiner (OMP), blivit undersökta som tänkba- ra vaccinkandidater både mot typ b och icke-typbar H. in- fluenzae. (EP 0 281 673, EP 0 320 289.) Yttermembranet hos H. influenzae är typiskt för gram- -negativa bakterier och består av fosfolipider, lipopoly- sackarid (LPS) och omkring 24 proteiner. Fyra olika Haemo- philus ytterproteiner har visats vara mål för antikroppar som är skyddande vid experimentell Haemophilus-sjukdom.

Dessa inkluderar det Pl värmemodifierbara huvudyttermem- branproteinet, P2 porinproteinet, P6 lipoproteinet och ett ytprotein med en molekylvikt av ca 98000 (98 K-proteinet).

Av dessa har åtminstone antikroppar mot P2-proteinet vi- 466 259 10 15 20 25 30 35 4 sats skydda vid experimentell infektion med heterologa (Loeb, M. R., 55:26l2, 1987; Munson Jr, R. S. et al, J. Clin. Invest. 72:677, 1983; Munson Jr, R. S. och Granoff, D. M., Infect. Immun. 49:544, 1985 och Kimura, A. et al, Infect. Immun. l94:495, 1985).

Analys av icke-typbara H. influenzae-stammar har vi- Haemophilus-stammar. Infect. Immun. sat en uttalad skillnad i yttermembransammansättning bland dessa (se Murphy et al, "A subtyping system for nontypable Haemophilus influenzae based on outer membrane proteins", J. Infect. Dis. l47:838, 1983; Barenkamp et al, "Outer membrane protein and biotype analysis of pathogenic non- typable Haemophilus influenzae", Infect. Immun. 30:709, 1983).

Om man kunde finna ett ytexponerat antigen (immuno- gen) som är bevarat i alla stammar av H. influenzae skulle det vara ett värdefullt verktyg vid utvecklandet av en me- tod att identifiera H. influenzae i kliniska prover och Den aktuella uppfinningen visar att protein D med en identisk synbar molekylvikt (42000) och som reagerar med tre olika mono- klonala antikroppar och humant IgD kunde påvisas hos alla av 116 undersökta H. influenzae-stammar (inkapslade och dessutom som ett vaccin mot H. influenzae. icke inkapslade). Dessutom kunde protein D påvisas hos ytterligare tvà besläktade Haemophilus-arter, nämligen H. haemolyticus och H. aegypticus.

Sålunda i enlighet med den aktuella uppfinningen an- visas ett ytexponerat protein som är bevarat hos många stammar av Haemophilus influenzae eller besläktade Haemo- philus-arter, som har en synbar molekylvikt av 42000 och förmåga att binda humant IgD. Uppfinningen innefattar även naturligt förekommande och artificiellt modifierade vari- anter av sagda protein, och också immunogena eller IgD- -bindande delar av sagda protein och varianter. Proteinet kallas protein D och har aminosyrasammansättningen som anges i fig 9. 10 15 20 25 30 35 4664259 5 Det anvisas också en plasmid eller fag som innehåller en genetisk kod för protein D eller de ovan definierade varianterna eller delarna.

Dessutom anvisas det en icke human värd som innehål- ler ovannämnda plasmid eller fag som har förmåga att pro- ducera sagda protein eller varianter därav eller delar därav. Värden kan väljas bland bakterier, jäst eller väx- ter. För närvarande är E. coli att föredra.

En annan aspekt av uppfinningen anvisar ett DNA-seg- ment utgörande en DNA-sekvens som kodar för protein D eller sagda varianter därav, eller för sagda delar. DNA- -sekvensen visas i fig 9.

Ytterligare en annan aspekt är att uppfinningen an- visar en rekombinant DNA-molekyl innehållande en nukleo- tidsekvens som kodar för protein D, eller sagda varianter eller delar därav, vars nukleotidsekvens kan kombineras med en annan gen.

En plasmid eller en fag innehållande den sammansmälta nukleotidsekvensen definierad ovan kan också konstrueras.

Dessutom kan en plasmid eller fag inkorporeras i en icke human värd såsom bakterie, jäst eller växter. För närvarande är E. coli att föredra som värd.

Uppfinningen innefattar också ett fusionsprotein eller polypeptid i vilket protein D, eller sagda varianter eller delar, kan kombineras med en annan molekyl med an- vändning av en rekombinant DNA-molekyl, definierad ovan.

Dessutom kan en fusionsprodukt, i vilken protein D, eller sagda varianter eller delar, är kovalent eller på annat sätt bundet till ett protein, kolhydrat eller matris (sådana som guld, "Sephadex"-partiklar, polymera ytor) konstrueras.

Uppfinningen innefattar även ett vaccin som innehål- ler protein D eller sagda varianter eller delar. Andra former av vacciner innehållande samma protein D eller varianter eller delar kombinerade med annat vaccin, eller kombinerat med en immunogen del av en annan molekyl. 466 259 10 15 20 25 30 35 6 Det anvisas också en hybridomcell med förmåga att producera en monoklonal antikropp mot en immunogen del av protein D, eller av naturligt förekommande eller artifici- ellt modifierade varianter därav.

Dessutom anvisas det en renad antikropp som är speci- fik mot en immunogen del av protein D eller av naturligt förekommande eller artificiellt modifierade varianter där- av. Denna antikropp kan användas som en metod att påvisa närvaron av Haemophilus influenzae eller relaterade Haemo- philus-arter i ett prov genom att utsätta sagda prov för antikroppen i närvaro av en indikator.

Uppfinningen innefattar också en metod att påvisa närvaron av Haemophilus influenzae eller relaterade Haemo- philus-arter i ett prov genom att bringa nämnda prov i kontakt med en DNA-sond eller genetisk tändsats konstrue- rad att motsvara nukleinsyrorna som kodar för protein D, eller för naturligt förekommande eller artificiellt modi- fierade varianter därav, eller för en immunogen eller IgD- -bindande del av sagda protein eller varianter.

Protein D, eller sagda varianter eller delar, kan också användas i en metod att påvisa IgD. Under sådana förhållanden kan proteinet märkas eller bindas till en matris.

Slutligen innefattar uppfinningen en metod att sepa- rera IgD med användning av protein D, eller sagda varian- ter eller delar, företrädesvis bundet till en matris.

MATERIAL OCH METODER Bakterier 116 H. influenzae-stammar representerande serotyperna a-f och icke-typbara och dessutom bakteriestammar repre- senterande 12 arter besläktade till H. influenzae erhölls fràn olika laboratorier i Danmark, Sverige och USA.

Odlingsförhållanden Alla stammar av Haemophilus, Ekinella och Acinoba- cillus odlades på chokladagar. H. ducreyi odlades i mik- roaerofil miljö vid 37°C och alla andra Hameophilus-stam- mar i en miljö innehållande 5% koldioxid. 30 isolat av H. 10 15 20 25 30 35 4660259 7 influenzae odlades också över natten vid 37°C i hjärn- -hjärtinfusionsbuljong (Difco Lab., Inc., Detroit, Mi.) med tillsats av nikotinamidadenindinukleotid och hemin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), båda vid en koncent- ration av 10 pg/ml.

Immunoglobuliner och proteiner IgD-myelomproteiner från fyra olika patienter renades som beskrivits tidigare (Forsgren, A. och Grubb, A., J.

Immunol. 122:1468, 1979). Åtta olika humana IgG-myelompro- teiner representerande alla fyra subklasser och båda L- -kedjetyperna, tre olika IgM-myelomproteiner och ett IgA- -myelomprotein isolerades och renades i enlighet med standardmetoder. Humant polyklonalt IgG, serumalbumin och plasminogen köptes från Kabi Vitrum AB, Stockholm, Sverige och humant IgE erhölls från Pharmacia IgE RIACT kit (Phar- macia Diagnostic AB, Uppsala, Sverige). Bovint serumalbu- min, humant och bovint fibrinogen och humant transferrin köptes eller erhölls som gáva. 1251-IgD-bindningsanalys Bindningsanalysen utfördes i plaströr. I korthet blandades 4xl08 bakterieceller i en volym av 100 pl fos- fatbuffrad koksaltlösning (PBS) med tillsats av 5% humant l25I-IgD i samma buffert serumalbumin (HSA) med 100 pl av (radioaktiviteten justerades till 7-8x104 cpm, ungefärli- gen 40 ng). Efter 30 min inkubation vid 37°C tillsattes 2 ml iskyld PBS (innehållande 0,l% Tween 20) till rören.

Suspensionen centrifugerades vid 4,599xg i 15 min och supernatanten avlägsnades. Radioaktiviteten i den àter- stående bakteriefällningen mättes i en gammaräknare (LKB Wallac Clingamma 1271, Abo, Finland). Aterstàende radio- aktivitet från inkuberingsblandningar som ej innehöll bak- terier (bakgrund) var 2,5%. Proven testades alltid i trip- likat och varje experiment upprepades åtminstone tvà gånger, om inte annat anges. 466 259 10 15 20 25 30 35 Monoklonala antikroppar Inavlade honmöss BALB/c (àlder 8 till 14 veckor) im- muniserades med en injektion i buken av 25 pg renat pro- tein D (25 pg/50 ul) i Freunds fullständiga adjuvans (300 pl) följt av två injektioner i buken av protein D (15 pg) i Freunds ofullständiga adjuvans (300 pl), 3 och 7 veckor senare. I vecka 9 tappades blod från djurens svan- sar, serum separerades och testades för anti-protein D-ak- tivitet i ett enzymimmunotestsystem (ELISA). Musen med det bästa immunsvaret gavs en ny intravenös injektion av pro- tein D (2 pg) i 150 ul PBS. En dag efter den sista injek- tionen opererades mjälten ut och mjältcellerna preparera- des för produktion av monoklonala antikroppar (De St Groth SF, Scheidegger SJ, J. Immunol. Methods 35:l, 1980). Efter 10 till 14 dagar (i genomsnitt 12 dagar) testades hybrido- men för produktion av antikroppar mot protein D i ett en- zymbundet testsystem (ELISA) och hybriderna som produce- rade de högsta titrarna av antikroppar klonades och expan- derades med odling i RPMI cellodlingsmedium innehållande 10% fetalt bovint serum. Sammanlagt erhölls 68 kloner pro- ducerande antikroppar mot protein D. Tre av hybridomen ut- valdes för ytterligare odling i samma medium. Alla cellin- jer frystes ner i närvaro av dimetylsulfoxid och 90% fe- talt bovint serum i flytande kväve.

SDS-PAGE och påvisande av protein D på membran SDS-PAGE (polyakrylamidgelelektrofores), med använd- ning av en modifierad Laemmli-gel, preparerades och använ- des enligt det förfarande som beskrivits av Lugtenberg et al (FEBS Lett. 58:254, 1975), med användning av en poly- akrylamidkoncentration av 11%. Prover av rått Sarcosyl- -extrakt av H. influenzae och besläktade bakteriearter förbehandlades med 5 min kokning i provbuffert innehål- lande 0,06M av Tris hydroklorid (pH 6,8), 2% (vikt/volym) SDS, 1% (volym/volym) ß-ME, 10% glycerol och 0,03% (vikt/volym) bromfenolblàtt. Elektroforesen genomfördes vid rumstemperatur med användning av PROTEIN II vertikal elektroforescell (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) vid 10 15 20 25 30 35 4ss_259 9 40 mA per gel konstant strömstyrka. Färgning av proteiner i gelar gjordes med comassieblàtt i en blandning av meta- nol, ättiksyra och vatten väsentligen som beskrivits av Weber och Osborn (J. Biol. Chem. 244:4406, 1969). Protein- banden överfördes också till cellulosanitratmembran (Sar- torius, Västtyskland) med hjälp av elektrofores från SDS polyakrylamidgeler. Elektroforetisk överföring utfördes i en Trans-Blot-cell (Bio-Rad) vid 50 V under 90 min. Elekt- rodbufferten bestod av 0,025M Tris, pH 8,3, O,192M glycin och 20% metanol. Membranen tvättades i l h vid rumstempe- ratur i en l,5% äggalbumin-Tris balanserad koksaltbuffert (OA-TBS), pH 7,4, för att mätta ytterligare bindningsstäl- len.

Efter åtskilliga tvättningar med Tris balanserad buf- fert (TBS) inkuberades membranen över natten vid rumstem- peratur i 1% OA-TBS-buffert innehållande IgD (20 pg/ml) för att påvisa IgD-bindande band, tvättades sedan två gånger med TBS. Membranen inkuberades sedan med peroxidas- bundna get-anti-humant IgD (Fc) (Nordic Immunology, Tii- burg, Nederländerna) i 1-2 h vid rumstemperatur; efter åtskilliga tvättar med Tween-TBS framkallades membranen med 4-kloro-1-naftol och väteperoxid. Protein D identifi- erades också med användande av anti-protein D musmonoklo- nala antikroppar l6ClO, 2OG6 och l9B4 vid en spädning av 1:50 i 1% OA-TBS. Protein l och protein 2 av H. influenzae identifierades med användande av anti-P2 musmonoklonal antikropp 9F5 (Dr. Eric J. Hansen, Dallas, Texas, USA) vid en spädning av l:lOO0 och kanin-anti-Pl-serum (Dr. Robert S. Munson, St. Louis, Mo, USA) vid en spädning av l:200.

Solubilisering och rening av protein D från H. influenzae I korthet suspenderades 3 g av bakterier i 10 ml av 10 mM HEPES Tris-buffert (pH 7,4) innehållande 0,0lM EDTA och ultraljudsbehandlades tre gånger i en ultraljudsappa- rat (MSE) i l min under kylning i ett isbad. Efter ultra- ljudsbehandlingen tillsattes Sarcosyl (natriumlaurylsarko- sinat) i en slutlig koncentration av 1% (vikt/volym). Sus- pensionerna inkuberades vid rumstemperatur i l h under om- 466 259 10 15 20 25 30 35 10 skakning och ultraljudsbehandlades igen Zxl min på is och inkuberades åter vid rumstemperatur i 30 min. Efter cent- rifugering vid 12000 g under 15 min vid 4°C togs superna- tanten tillvara och centrifugerades igen vid 105000 g un- der 1,5 h vid 4°C.

Sarkosyl-extrakt preparerade från H. influenzae stam NT 772 som beskrivits ovan och applicerades pà SDS-PAGE.

Efter elektrofores skars smala gelremsor ut, protein över- fördes till membran och det IgD-bindande bandet pàvisades med Western blot-undersökning med användning av IgD och peroxidasbundna get-anti-human IgD antikroppar på samma sätt som beskrivits ovan (se SDS-PAGE och pàvisande av protein D pà membran). Genom att jämföra med det IgD-bin- dande bandet pà membranet (Western blot) kunde det riktiga bandet i gelen identifieras och skäras ut. Elektroforetisk eluering av de IgD-bindande molekylerna (protein D) utför- des och SDS avlägsnades från den proteininnehàllande lös- ningen genom utfällning i kaliumfosfatbuffert enligt Susuki och Terrada ((Anal. Biochem. l72:259, 1988). Ka- liumfosfat i en slutlig koncentration av 20 mM tillsattes och efter inkubering vid 4°C över natten kunde SDS-fäll- ningen avlägsnas genom centrifugering vid 12000 g. Däref- ter justerades kaliuminnehállet till 60 mM och efter 4 h vid 4°C utfördes centrifugering som ovan. Slutligen kon- centrerades supernatanten och omfattande dialys utfördes.

Dot blot analys Proteiner applicerades på cellulosanitratmembran (Schleicher & Schuell, Dessel, Västtyskland) manuellt med användande av en dot blot-apparat (Schleicher & Schuell).

Efter mättning inkuberades membranen över natten i rums- temperatur i 1% OA-TBS innehållande 1251-märkt proteinsond (5-l0xl05 cpm/ml), tvättades fyra gånger med TBS innehål- lande 0,02% Tween 20, lufttorkades och autoradiograferades vid -70°C med användande av Kodak CEA.C röntgenfilm och Kodak X-Omat reguljär framkallningsskärm (Eastman Kodak, Rochester, NY). 10 15 20 25 30 35 466 259 11 Aminosyrasekvensanalys Automatiserad aminosyrasekvensanalys utfördes med en Applied Biosystems 470A gas-vätske-fastfassekvenator (A) med detektionssystem för frigjorda fenyltiohydantoinderi- vat av aminosyror från Applied Biosystems (Model l20A PTH Analyzer).

Bakteriestammar, plasmider, bakteriofager och odlingsme- dier använda för kloning av protein D H. influenzae, icke-typbar stam 772, biotyp 2, isole- rades från ett näs- och svalgprov vid avdelningen för me- dicinsk mikrobiologi, Malmö Allmänna Sjukhus, Universite- tet, Lund, Sverige. E. coli JM83 användes som mottagare för plasmiderna pUC18 och pUCl9 och derivat av dessa. E. coli JMlOl och JMl03 användes som värdorganismer för bak- teriofagerna M13mpl8 och mpl9. H. influenzae odlades i hjärt-hjärnbuljong (Difco Lab., Inc., Detroit, Mi.) med tillsats av NAD (nikotinadenindinukleotid) och hemin (Sig- ma Chemical Co., St Louis, Mo.) vardera vid 10 pg/ml. E. coli-stammarna odlades i L-buljong eller i 2xYT-medier.

L-agar och 2xYT-agar innehöll dessutom l,5% agar per li- ter. L-buljong och L-agar var när så anges tillsatta med ampicillin (Sigma) 100 pg/ml.

DNA-preparationer Kromosomalt DNA preparerades frán H. influenzae-stam 772 med användande av en modifiering av en metod enligt Berns och Thomas (J. Mol. Biol. l1:476, 1965). Efter fenolzkloroform:isoamylalkohol (25:24:l) extraktionssteget fälldes DNA med etanol. DNA löstes i 0,1xSSC (1xSSC:0,15 M NaCl och 0,015 M natriumcitrat) och RNase behandlades i 2 h vid 37°C. RNase avlägsnades med två kloroformzisoamyl- alkohol (24:l) extraktioner. DNA bandades i en cesiumklo- rid-etidiumbromidjämviktsgradient.

Plasmid-DNA och den replikativa formen av fag Ml3 från E. coli JMlOl erhölls genom alkalisk lysprocedur efterföljd av ytterligare rening i cesiumklorid-etidium- bromidgradient. I vissa fall preparerades plasmid-DNA med användande av Quiagen plasmid DNA kit (Diagen GmbH, Düs- seldorf, Västtyskland). 466 259 10 15 20 25 30 35 12 Enkelsträngat (ss) DNA från fag M13 kloner preparera- des från enskilda plack (Messing, J. Meth. Enzymol l0lC:20, 1983).

Molekylär kloning av protein D-genen Ett H. influenzae genbibliotek konstruerades från 40 pg av H. influenzae stammen 772 DNA som delvis digere- rats med 1,2 enheter Sau3A i 1 h vid 37°C. Kluvet DNA fraktionerades på sockergradient (Clark-Curtiss, J. E. et al., J. Bacteriol. 16l:l093, 1985). Fraktioner innehållan- de DNA-fragment av passande storlek (2-7 kilobaspar (kbp)) polades och DNA bands till defosforylerad BamHI digererat pUCl8 under standardiserade förhållanden (Maniatis, T. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 1982). Bind- ningsblandningen överfördes i den kompetenta E. coli JM83 genom högvoltselektrofores med hjälp av en Gene Pulser TM/Pulse kontrollapparat från Bio-Rad Lab. (Richmond, CA).

Bakterierna odlades ut på L-agar med tillsats av ampicil- lin och X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolyl-ß-D-galaktopyra- nosid).

Koloniimmunoanalys För koloniimmunopàvisning användes E. coli transfor- manter odlade över natten på L-agar. Dessa överfördes till cellulosanitratfilter (Sartorius GmbH, Göttingen, Väst- tyskland) genom att täcka agarplattor med torra filter.

Plattorna lämnades under 15 min innan filtren avlägsnades och exponerades för mättad kloroformànga i 15 min. Åter- stående proteinbindande ställen på filtren blockerades genom inkubering av filtren i Tris-balanserad koksaltlös- ning innehållande ovalbumin i 30 min (TBS-ova: 50 mM Tris- -HCl, 154 mM NaCl, 1,5% ova.; pH 7,4). Efter blockering inkuberades filtren i ordning med (i) odlingssupernatanter innehållande musmonoklonala antikroppar (MAbs) riktade mot protein D i en spädning av 1:10 i TBS-ova, (ii) peppar- rotsperoxidasbundna kanin-anti-mus IgG (DAKOPATTS A/S, Glostrup, Danmark) i TBS-ova i en spädning av 1:2000 i TBS-ova och (iii) 4-kloro-1-naftol och HZOZ. Filtren tvättades 3xl0 min i tvättbuffert (TBS-0,05% Tween 20) TC 10 15 20 25 30 35 466 259 13 mellan varje steg. Alla inkuberingarna gjordes vid rums- temperatur.

Kolonierna undersöktes för IgD-bindande bindning ge- nom att inkubera andra filter med renat humant myelom-IgD, kanin-anti-humant IgD (6-kedjor) (DAKOPATTS), peppar- rotsperoxidasbundna get-anti-kanin-immunglobuliner (Bio-Rad Lab.) och 4-kloro-l-naftol och H O 2 2 Restriktionsendonukleasanalys och DNA-manipulationer SOITI OVÖD .

Plasmid och fag-DNA digererades med restriktionsendo- nukleaser enligt tillverkarens instruktioner (Boehringer Mannheim mbH, Mannheim, Tyskland, och Beckman Instruments, Inc., England). Restriktionsenzymfragment för kloning àskádliggjordes med lágenergi-UV-ljus och avlägsnades från 0,7-l,2% agarosgeler innehållande O,5% etidiumbromid. DNA- -banden extraherades med en GenecleanTM kit (BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) som anvisas av tillverkaren.

Bindning utfördes med 14 DNA-ligas (Boehringer Mann- heim) under standardiserade förhållanden (Maniatis et al., 1982). Bindningsblandningarna användes för att transfor- mera kompetenta E. coli-celler.

Fortskridande deletioner av rekombinantplasmiden pHIC348 för sekvensproceduren utfördes genom att variera tiden för endonukleas III-digesion av Kpnl-BamHI-öppnat plasmid-DNA (Henikoff, S. Gene 28:351, 1984). För avlägs- nande av de resulterande enkelsträngade ändarna användes bönnukleas. Båda nukleaserna erhölls från Bethesda Re- search Laboratories Inc. (Gathersburg, Md.).

Protein D-extraktion från E. coli E. coli-celler uttryckande protein D fick växa i L-buljong med tillsatt ampicillin till tidig logaritmisk fas och utsattes sedan för osmotisk chock. Efter avlägs- nande av den periplasmatiska fraktionen lyserades cellerna med Na0H (Russel, M. och Model. P., Cell 28:177, 1982) och den cytoplasmatiska fraktionen separerades från membran- fraktionen genom centrifugering. Periplasmatiska och cyto- plasmatiska proteiner utfälldes med 5% tri-kloroättiksyra. 466 259 10 15 20 25 30 35 14 DNA-sekvenering och sekvensmanipulationer Nukleotidsekvensen bestämdes med direkt plasmidsekve- nering (Chen, E. Y. och Seeburg, P. H., DNA 4:l65, 1985) av subkloner och deletionsderivat av plasmid pHIC348 med användning av en kedjeavslutningsmetod med a[35S]-dATP (Amersham) och SequenaseTM, version 2 (United States Bio- chemical Corp., Cleveland, Ohio) enligt de protokoll som levererats av tillverkaren. Delar av sekveneringsprocedu- ren gjordes med enkelsträngat M13 DNA innehållande frag- ment härledda från pHIC348. Autoradiografi utfördes med Fuji röntgenfilm.

RESULTAT Utbredning av protein D i Haemophilus influenzae Totalt 116 H. influenzae-stammar, erhållna från kul- tursamlingar och nyisolerade från näs-svalgprover, valdes för IgD-bindningsexperimenten. Elva av stammarna var in- kapslade representerande serotyperna a-f, och 105 stammar var icke inkapslade (icke-typbara). Dessa 105 stammar tillhörde biotyp I (21 stammar), biotyp II (39 stammar), biotyp III (14 stammar), biotyp IV (2 stammar) och biotyp I (5 stammar). Av de icke inkapslade stammarna biotypades ej 31 stammar men dessa testades för IgD-bindning.

Ca 4xl08 kolonibildande enheter av H. influenzae-bak- terier odlade pà chokladagar blandades och inkuberades med 40 ng av radioaktivmärkt humant myelom IgD. Därefter till- sattes en större volym (2 ml) av PBS-innehållande Tween 20. Bakterierna centrifugerades ner och radioaktiviteten i fällningen mättes. Alla H. influenzae isolat band IgD i hög grad (38-74%) (fig 1). Det var ingen skillnad i den IgD-bindande förmågan mellan olika serotyper (a-f) av in- kapslad H. influenzae. Inte heller var det någon skillnad mellan olika biotyper av icke inkapslade stammar. 30 stam- mar representerande olika sero- och biotyper odlades också i hjärn-hjärtinfusionsbuljong, När dessa stammar som odla- des i flytande medium jämfördes med samma bakterier odlade pá chokladagar kunde ingen skillnad i IgD-bindningskapaci- tet påvisas. 10 15 20 25 30 35 4ss_2s9 15 Protein D solubiliserades från alla 116 H. influen- zae-stammarna med ultraljudsbehandling och Sarkosyl- -extraktion. Därefter separerades extrakten innehållande protein D i SDS-gelelektrofores. Proteiner färgades eller överfördes (electroblotted) till cellulosanitratmembran och undersöktes med human IgD-prob och tre olika musmono- klonala antikroppar riktade mot protein D. Många protein- band kunde påvisas i alla SDS-geler men elektrofores av extrakt från alla H. influenzae-stammar gav ett protein- band med en synbar molekylvikt av 42000 (42 kilodalton).

IgD och också alla tre antiprotein-D-monoklonala antikrop- parna (l6Cl0, 20G6 och l9B4) band till samma band efter elektrofores av alla extrakt och efter överförande till membran och undersökning med blot-teknik.

Bakteriestammar av 12 olika arter taxonomiskt besläk- tade med H. influenzae (H. ducreyi, H. paraphrophilus, H. parasuis, H. parainfluenzae, H. haemolyticus, H. parahae- molyticus, H. aphrophilus, H. segnis, H. aegypticus, H. haemoglobinophilus, E. corrodens, A. actinomycetemcomi- 1251-märkt humant IgD. Dessutom testades råa Sakrosyl-extrakt från tans) testades för sin kapacitet att binda samma bakterie med Western blot-analys med IgD och tre anti-protein D monoklonala antikroppar (MAbs 16Cl0, 2OG6, l9B4).

Av alla tolv testade arter band bara H. haemolyticus (5/5 stammar) och H. aegypticus (2/2 stammar) radioaktivt IgD, 21-28% respektive 41-48%, i det direkta bindningssys- temet (fig 2). I Western blot-analys påvisade IgD och alla tre monoklonala antikropparna ett enstaka proteinband med en synbar molekylvikt av 42000 (42 kilodalton).

Ingen av 6 stammar av H. paraphrophilus, ll av H. parainfluenzae, 8 av H. aphrophilus och 3 av A. actinomy- cetemcomitans band radioaktivt IgD i direkt bindningsför- sök eller reagerade med IgD i Western blot-analys. Emel- lertid reagerade extrakt av alla dessa bakteriestammar med två eller tre av de monoklonala antikropparna i Western blot-analys uppvisande ett enstaka 42 kilodalton protein- 466 259 10 15 20 25 30 35 16 band. Western blot-analys av tre stammar av E. corrodens visade ett enstaka högmolekylärt band (90 kilodalton) med monoklonal antikropp 16010 i alla tre bakteriestammarna. I ett extrakt av en av stammarna pàvisades ett enstaka 42 kilodalton band med de två andra monoklonala antikroppar- na. Två stammar av H. ducreyi, H. parasuis (2 stammar), H. parahaemolyticus (2 stammar), H. sengius (2 stammar), H. haemoglobinophilus (l stam) band inte radioaktivt IgD i direktbindningsförsök och Sarkosyl-extrakt av samma bakte- rier gav inget protein och i Sarkosyl-extrakt från samma bakterier kunde inget proteinband påvisas med IgD eller de tre monoklonala antikropparna.

Solubilisering av protein D Tre olika stammar av H. influenzae (två icke-typbara stammar, 772 och 3198 och en typ B, Minn A.) odlades över natt i buljong. Från början utfördes försök att solubili- sera protein D enligt en väl etablerad metod för isolering av H. influenzae yttermembranproteiner genom sonikering, avlägsnande av celldebris med centrifugering och extrak- tion av supernatanten med Sarkosyl åtföljt av ultracentri- fugering (Barenkamp SJ och Munson RS, J. Infect. Dis. l43:668, 1981). Fällningarna (celldebris) (d) och super- natanterna (s) efter sonikering liksom fällningar (p) och supernatanter (ss) efter Sarkosyl-behandling och ultra- centrifugering undersöktes med SDS-PAGE. Proteiner färga- des eller överfördes till Immobilon-membran och undersök- tes med humant IgD-myelomprotein följt av inkubering med peroxidasmärkta anti-human-IgD-antikroppar och substrat.

Som visas i fig 3 solubiliserade sonikeringsproceduren proteiner inklusive protein D effektivt. Emellertid kunde IgD-bindande molekyler (protein D) också påvisas i cell- debris, dvs de hade ej solubiliserats vid sonikering. Ut- bytet av IgD-bindande molekyler i supernatanten varierade mellan olika experiment. Fig 3 visar också att protein D till största delen kunde påvisas i den Sarkosyl-lösliga supernatanten efter ultracentrifugering. I motsats har tidigare beskrivna yttermembranproteiner från H. influen- 10 15 20 25 30 35 4ee 259 17 zae (protein l till 6) lätt solubiliserats med sonikering och betraktas som Sarkosyl-lösliga.

För att förbättra utbytet av protein D försöktes àt- skilliga extraktionsmetoder. I de följande experimenten sonikerades bakterierna och hela bakteriesuspensionen extraherades i olika detergenter (Sarkosyl, NP-40, Triton X-100 och Tween 80). Celldebris avlägsnades med centrifu- gering (l2000 g) och supernatanten ultracentrifugerades.

De så erhållna celldebris (d), supernatanterna (s) och fällningarna (p) analyserades med SDS-PAGE och elektro- överförande till membran och åtföljande undersökning med IgD-sond. Som visas i fig 4 solubiliserade Sarkosyl-be- handling protein D effektivt och mycket lite protein D återstod i celldebris och fällning. NP-40, Triton X-100 och Tween 80 lösgjorde protein D mindre effektivt.

Försök utfördes också att lösgöra protein D från bak- terierna med lysozym och olika proteolytiska enzymer (pa- pain, pepsin och trypsin) vid olika koncentrationer. Av enzymen solubiliserade bara lysozym protein D (fig 4).

Rening av protein D Protein D solubiliserades genom Sarkosyl-extraktion av hela bakterier som beskrives ovan och rening utfördes med SDS-PAGE av supernatanten efter ultracentrifugering.

Efter elektrofores skars smala gelband ut, proteiner över- fördes till membran och det IgD-bindande bandet (protein D) påvisades med Western blot-analys. Gelskivor innehål- lande proteinband motsvarande de IgD-bindande molekylerna skars ut från gelen och solubiliserades med elektronisk eluering. Vid förnyad elektrofores av det renade protei- net, protein D (D), påvisades ett enstaka band (42 kilo- dalton) (fig 5) utan pàvisbara nedbrytningsprodukter.

För att bekräfta att protein D inte var identiskt med tidigare beskrivna yttermembranproteinerna l eller 2 med molekylvikter av 49 respektive 39 kilodalton undersöktes debris (d) och supernatanter (s) efter Sarkosyl-extraktion av hela H. influenzae-bakterier med SDS-PAGE, överfördes till Immobilon-filter och blot-analyserades med antikrop- 466 259 10 15 20 25 30 35 18 par mot protein 1 och protein 2 och också med humant IgD.

Som synes i fig 5 migrerade protein D olika från protein 1 och protein 2.

Bindningsegenskaper hos protein D Interaktionen mellan protein D och humant IgD veri- fierades ytterligare med gelfiltreringsexperiment där 1251-protein D eluerades tillsammans med IgD när en bland- ning av de två proteinerna filtrerades på en Sephadex G-200-pelare (fig 6c). Protein D undersökt ensamt på samma pelare eluerades något efter 43 kilodalton standardprotein (äggalbumin), vilket bekräftar den synbara molekylvikten av 42 kilodalton för protein D.

Radioaktivt märkt protein D studerades ytterligare i olika dot blot-experiment för att ytterligare undersöka bindningsspecificiteten hos molekylen. Fig 7 visar att protein D effektivt band två högt renade humana IgD mye- lomproteiner. En distinkt reaktion kunde påvisas vid 0,15 respektive 0,3 pg av de två IgD-proteinerna. Två ytterli- gare IgD myelomproteiner som också testades med samma tek- nik kunde också distinkt påvisas vid 0,3 pg (data ej visa- de). I dot blot-undersökningar band IgD-Fab-fragment och IgD-Fc-fragment protein D vid 2:5 respektive 1,2 pg. Däre- mot visade 8 olika IgG-myelomproteiner representerande alla subklasser och L-kedjetyper ingen synlig reaktion med protein D vid 5 pg. Inte heller kunde någon reaktion mel- lan protein D och tre monoklonala IgM, en monoklonal IgA- -preparation, polyklonalt IgE eller några ytterligare pro- teiner påvisas. Emellertid påvisas med polyklonalt IgG en svag reaktion vid 5 pg (fig 7).

Kloning av protein D-genen DNA isolerat från H. influenzae 772 digererades par- tiellt med Sau3A och anrikades för fragment i storleks- ordningen 2 till 7 kilo baspar (kbp) genom fraktionering på en sockergradient. Dessa fragment bands till BamHI-sku- ren och fosfatasbehandlad vektor pUC18. E. coli JM 83 celler transformerades med bindningsblandningen med hög- voltselektroporering som utodlades pá agarplattor där man 10 15 20 25 30 35 466 259 19 selekterade för resistens mot ampicillin. Enskilda kolo- nier överfördes till cellulosanitratfilter och undersöktes med en blandning av monoklonala antikroppar som beskrivits i material och metoder.

Bland 15000 undersökta kolonier befanns 60 vara posi- tiva. Åtta positiva kolonier plockades ut och undersöktes och utsattes för ytterligare tvâ undersökningsomgàngar.

Alla kloner förblev positiva under reningen. De renade klonerna undersöktes för IgD-bindning med humant IgD, kanin-anti-humant IgD och peroxidasmärkta get-anti- -kanin-IgG i en koloniimmunoundersökning som beskrivs i material och metoder. Alla var positiva beträffande IgD- -bindning. Dessutom befanns alla kloner binda alla tre monoklonala antikropparna individuellt.

Restriktionsenzymanalys av plasmid-DNA fràn de posi- tiva klonerna visade att alla utom en klon bar ett 3,3 kbp inlägg med två interna Sau3A-ställen. En klon innehöll yt- terligare ett 2,0 kbp Sau3A-fragment. En av de mindre re- kombinantplasmiderna pHIJ32 valdes för ytterligare karak- tärisering. En partiell restriktionsenzymkarta etablerades för inlägget i H. influenzae DNA i pHIJ32 (fig 8). För att identifiera regionen kodande för protein D subklonades restriktionsenzymfragment i pUC18. De resulterande trans- formanterna testades för uttryck av protein D med använd- ning av koloniimmunoblot-analys som beskrivits ovan. Dessa experiment visade att de plasmider innehållande ett 1,9 kbp HindIII-ClaI-fragment från ena änden av inlägget tillät uttryck av det IgD-bindande proteinet. Denna rekom-- binantplasmid, kallad pHIC348, behölls för ytterligare experiment. Protein D-genen klonad i pHIC348 uttrycks från en promotor i pUCl8. Detta visades genom att klona HindIII-Clal-fragmentet av pHIJ32 i den motsatta riktning- en i pUCl9. Alla transformanter uttryckte IgD-bindning som kan förväntas om genen är under kontroll av en endogen promotor. Transformanter bärande HindIII-Clal-fragmentet i motsatt riktning till pHIC348 växte dåligt och autolysera- de under odling. Detta berodde förmodligen pá att lacZ- 466 259 10 15 20 25 30 35 20 -promotorn av pUCl9 var orienterad i samma riktning som promotorn hos protein D, vilket ledde till överuttryck av protein D, vilket var letalt för bakterierna. I pHIC348 var lacZ-promotorn i motsatt riktning jämfört med protein D-promotorn.

DNA-sekvensanalys av protein D-genen Nukleotidsekvensen i bàda strängarna av inlägget från pHIC348 bestämdes antingen med direkt plasmid-sekvenering av subkloner och strykningskonstruktioner eller genom sub- kloning av restriktionsfragment i fagerna Ml3mpl8 och Ml3mpl9. Kommersiellt tillgängliga universella och omvända Ml3-tändsatser användes. Sekvenering gjordes över alla restriktionsenzymställen använda i subkloning och sekvene- ringsstrategin visas i fig 8.

DNA-sekvensen (fig 9) visar en öppen läsram av W 1092 bp med början vid ett ATG-kodon vid position 204 och avslutning i positionen 1296 med ett TAA stoppkodon. Den öppna läsramen motsvarar ett protein av 364 aminosyrares- ter. Tio nukleotider uppströms från metioninkodonet finns en sekvens, AAGGAG, som är komplementär till 3'-änden av l6S rRNA av E. coli (Shine, J, och Dalgarno, L. Proc.

Natl. Acad. sei. UsA, 71=1342, 1974). Avståndet mellan centrum av detta föreslagna ribosombindande ställe (rbs) och startkodonet är 13 bp i jämförelse med det genomsnitt- liga avståndet av 10 bp i E. coli. Den 5'-flankerande regionen, uppströms om det föreslagna rbs visar närvaron av tänkbara promotorer. Sekvenserna i -10-regionen, TAAAAT (151-156) och i -35-regionen, TTGCTT (127-132), visar homologi med konsensussekvensen i E. coli-promotorer (Rosenberg, M. och Court, D., Annu. Rev. Genet, l3:319, 1979) och är identisk med promotorer som igenkänns av E. coli RNA-polymeras. Avståndet mellan de förmenta -l0- och -35-sekvenserna är 18 bp, vilket skall jämföras med det favoriserade värdet av 17 bp.

Mellan positionen 1341 och 1359 är en inverterad upprepning med potential att bilda en stam- och öglestruk- tur. Denna upprepning liknar emellertid inte en typisk rho-oberoende transkriptionsterminator. 10 15 20 25 30 35 466 259 21 Protein D-struktur _ Genen för protein D kodar för ett protein av 364 aminosyrarester härledda fràn nukleotidsekvensen (fig 9).

Den N-terminala aminosyrasekvensen har typiska karaktä- ristika för en bakteriell lipoproteinsignalpeptid (Vlasuk et al, J. Biol. Chem. 258:7141, 1983) med en sträcka av hydrofoba och basiska aminosyror vid den N-terminala änden följd av en hydrofob region av 13 rester och med en glycin i den hydrofoba kärnan. Den förmenta signalpeptiden slutar med en konsensussekvens Leu-Ala-Gly-Cys, vilken igenkänns av enzymsignalpeptidas II (SpaseII). Den primära transla- tionsprodukten har en härledd molekylvikt av 41.821 dal- ton. Klyvning av SpaseII skulle resultera i ett protein av 346 aminosyror med en kalkylerad molekylvikt av 40.068 dalton i kontrast till den beräknade storleken av den mog- na protein D-molekylen av omkring 42 kilodalton. Modifie- ringar efter translation av preproteinet kan förklara den- na skillnad. Åtskilliga försök att bestämma den amino-ter- minala aminosyrasekvensen i protein D utfördes genom att applicera omkring 1000 pmol av proteinet i en automatisk aminosyrasekvenator. Eftersom inga aminosyrafenyltiohydan- toinderivat erhölls är förmodligen den aminoterminala än- den av den enkla IgD-receptorpolypeptiden blockerad.

Protein D uttryckt i E. coli JM83 bärande pHIC348 analyserades i immunoblot-experiment (fig 10). Cytoplasma- tiska, periplasmatiska och membranfraktioner från celler i sen logaritmisk fas separerades på en SDS-gel och överför- des med elektrofores till ett Immobilon-filter. Ett prote- in som binder alla tre anti-protein D-monoklonala anti- kropparna (l6Cl0, 20G6 och l9B4) och radioaktivt märkt IgD kunde påvisas i alla tre fraktionerna (spár 2-4) frán E. coli JM83/pHIC348 som ett enkelt band med en beräknad molekylvikt av 42 kilodalton, dvs liknande eller samma som protein D preparerat fràn H. influenzae (spár 1, fig 10).

Nukleotidsekvensen och den härledda aminosyrasekven- sen av H. influenzae 772 protein D jämfördes med andra proteiner av känd sekvens för att bestämma homologi med användning av datorsökning i EMBL och genbankdatabiblio- 466 259 10 15 20 25 30 35 22 tek. Bortsett fràn likheter i signalsekvens kunde ingen homologi àterfinnas.

SAMMANFATTNING Ett nytt ytexponerat protein hos H. influenzae eller relaterade Haemophilus-arter beskrives. Proteinet som kal- las protein D är en Ig-receptor för humant IgD och har en synbar molekylvikt av 42000. Protein D kan pàvisas i alla undersökta 116 inkapslade och icke inkapslade isolat av H. influenzae som studerats. Proteinet från alla bakterie- stammar visar förutom samma synbara molekylvikt immunogena likheter eftersom protein D från alla stammar reagerar med tre olika musmonoklonala antikroppar och monoklonalt hu- mant IgD. En metod för rening av protein D beskrives. Klo- ning av protein D-genen från H. influenzae i E. coli be- skrives liksom nukleotidsekvens och härledd aminosyrasek- vens motsvarande en molekylvikt av 41821 dalton inklude- rande en förment signalsekvens bestående av 18 aminosyror innehållande en konsensussekvens Leu-Ala-Gly-Lys för bak- teriella lipoproteiner.

Claims (22)

10 15 20 25 30 35 466 259 23 PATENTKRAV

1. Ytexponerat protein som finns bevarat i många stammar av Haemophilus influenzae eller besläktade Haemo- philus-arter med en synbar molekylvikt av 42000 och för- måga att binda IgD, eller naturligt förekommande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter.

2. Protein enligt krav l med den aminosyrasekvens som beskrivs i fig 9, eller naturligt förekommande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter.

3. Plasmid eller fag innehållande en genetisk kod för ett protein av Hameophilus influenzae eller relaterade Haemophilus-arter, vilket protein har en synbar molekyl- vikt av 42000 och förmåga att binda IgD, eller för natur- ligt förekommande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller för en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter.

4. Icke human värd inehållande en plasmid eller en fag såsom definieras i krav 3 och med förmåga att produce- ra sagda protein eller varianter eller delar av sagda pro- tein eller varianter, vilken värd är vald bland bakterie, jäst och växter.

5. Värd enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d av att den är E. coli.

6. DNA-segment innehållande en DNA-sekvens vilken kodar för ett protein av Haemophilus influenzae eller be- släktade Haemophilus-arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och förmåga att binda humant IgD, eller för naturligt förekommande eller konstgjort modifie- rade varianter därav, eller för en immunogen eller IgD- -bindande del av sagda protein eller varianter.

7. DNA-segment enligt krav 6, vari DNA-sekvensen är den som är specificerad i fig 9. 466 259 10 15 20 25 30 35 24

8. Rekombinant-DNA-molekyl innehållande en nukleo- tidsekvens som kodar för ett ytexponerat protein av Haemo- philus influenzae eller relaterade Haemophilus-arter, vil- ket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och en förmåga att binda humant IgD, eller för naturligt förekom- mande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller för en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter, vars nukleotidsekvens är bunden till en annan gen.

9. Plasmid eller fag innehållande en bunden nukleo- tidsekvens enligt krav 8.

10. Icke-human värd innehållande åtminstone mid eller fag enligt krav 9, vilken värd är vald en plas- bland bakterier, jäst eller växter.

ll. Värd enligt krav 10, att den är E. coli. k ä n n e t e c k n a d av

12. Fusionsprotein eller polypeptid, i vilken ett yt- exponerat protein av Haemophilus influenzae eller besläk- tade Haemophilus-arter, vilket protein har en molekylvikt av 42000 och förmåga att binda humant IgD, eller naturligt förekommande eller konstgjorda modifierade varianter där- av, eller en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter, är kombinerat med andra proteiner med användning av rekombinant-DNA-molekyl enligt krav 8.

13. Fusionsprodukt, i vilken ett ytexponerat protein från Haemophilus influenzae eller besläktade Haemophilus- -arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och förmåga att binda humant IgD, eller naturligt förekom- mande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter, är kovalent eller på något annat sätt bundet till ett protein, kolhydrat eller matris.

14. Vaccin innehållande ett ytexponerat protein från Haemophilus influenzae eller relaterade Haemophilus-arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och för- màga att binda humant IgD, eller naturligt förekommande eller konstgjort modifierade varianter därav eller en immunogen eller IgD-bindande del därav. 10 15 20 25 30 35 466 259 25

15. Vaccin innehållande ett ytexponerat protein från Hameophilus influenzae eller besläktade Haemophilus-arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och för- måga att binda humant IgD, eller naturligt förekommande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller en immunogen eller IgD-bindande del därav, kombinerat med ett annat vaccin.

16. Vaccin innehållande ett ytexponerat protein från Haemophilus influenzae eller besläktade Haemophilus-arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och för- måga att binda humant IgD, eller naturligt förekommande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller en immunogen eller IgD-bindande del därav, kombinerat med en immunogen del av en annan molekyl.

17. Hybridomcell som kan producera monoklonala anti- kroppar mot en immunogen del av ett ytexponerat protein från Haemophilus influenzae eller besläktade Haemophilus- -arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och kapacitet att binda humant IgD.

18. Renad antikropp specifikt riktad mot en immunogen del av ett ytexponerat protein från Haemophilus influenzae eller Hameophilus-arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och förmåga att binda humant IgD.

19. Förfarande för pávisande av närvaron av Haemo- philus influenzae och relaterade Haemophilus-arter i ett prov genom att utsätta sagda prov för antikroppen i krav 18 i närvaro av en indikator.

20. Förfarande för påvisande av närvaron av Haemo- philus influenzae eller besläktade Haemophilus-arter i ett prov genom att kontakta sagda prov med en DNA-sond eller tändsats konstruerad att motsvara nukleinsyrorna som kodar för ett ytexponerat protein från Haemophilus influenzae eller besläktade Haemophilus-arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och en kapacitet att binda hu- mant IgD, eller för naturligt förekommande eller konst- gjort modifierade varianter därav, eller för en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter. 466 259 10 15 20 25 30 35 26

21. Förfarande för pàvisande av IgD med användning av ett ytexponerat protein från Haemophilus influenzae eller besläktade Haemophilus-arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och kapacitet att binda humant IgD, eller naturligt förekommande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter, eventuellt märkta och/- eller bundna till en matris.

22. Förfarande för separation av IgD med användning av ytexponerat protein fràn Haemophilus influenzae eller besläktade Haemophilus-arter, vilket protein har en synbar molekylvikt av 42000 och förmåga att binda humant IgD, eller naturligt förekommande eller konstgjort modifierade varianter därav, eller en immunogen eller IgD-bindande del av sagda protein eller varianter, eventuellt bundna till en matris.