JP2002512528A - ストレプトコッカス イクイの保護ｍ−様タンパク質をコードする化合物及びその検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本願発明はストレプトコッカス イクイ（ＳｅＭ）の保護Ｍ−様タンパク質をコードする分子化合物、それによってコードされるアミノ酸化合物、及びこれらがコードする遺伝子化合物又は細胞成分のいずれかを組入れる物質の組成物に関する。例えば、本願明細書に記載するアミノ酸化合物を利用するワクチン又はこのアミノ酸化合物を作るために有用なベクター及びセルラインが本願発明の対象物である。本願発明はウマのＳ．ｅｑｕｉ−特異的免疫応答を刺激する方法を提供する。本願発明はストレプトコッカス イクイ用の診断検定をまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトコッカス イクイの保護Ｍ−様タ ンパク質をコードする化合物及びその検定 本願は１９９７年６月２４日付に出願された仮特許出願ＵＳ６０／０５０，５ ７７号に基づいて優先権を主張する。本願発明はアメリカ合衆国政府ＵＳＤＡ− ＮＲＩＣＧＰナンバー９５−０１８３７の許可によって開発された。従って、ア メリカ合衆国政府は本願発明に一定の権利をもつ。 発明の背景 本願発明は一般にストレプトコッカス イクイ（Streptococcus equi）（Ｓｅ Ｍ）の保護Ｍ−様タンパク質をコードする分子化合物、それによってコードされ るアミノ酸化合物、及びこれらがコードするコード化合物又は細胞成分のいずれ かを組入れる物質の組成物に関する。例えば、本願明細書に記載するアミノ酸化 合物を利用するワクチン又はこのアミノ酸化合物を作るために有用なベクター及 びセルラインが本願発明の対象物である。本発明はウマのＳ．ｅｑｕｉ−特異的 免疫応答を刺激する方法を提供する。本願発明はストレプトコッカス イクイ用 の診断検定をまた提供する。 ストレプトコッカス イクイ、ランスフィールド グロープ Ｃ ストレプト コッカス（Lancefield group C Streptococcus）は腺疫、鼻咽喉及びイクイダエ (Equidae)の排出リンパ節の高い伝染性疾病を引き起こす。５８ｋＤ食作用阻止 性Ｍ−様タンパク質（ＳｅＭ）は主要な毒性因子及び保護抗原であり、そして細 菌表面上のＣ３ｂの沈着を制限することにより且つフィブリノーゲンに直接に結 合することによって機能する。ボスクウイッチ及びチモニー（Boschwitz and Ti money)、１７ミクロバイアル パソジェニー（Microbial Pathogenesusis）１２ １（１９９４）及びボスクウイッチ及びチモニー、６２ インフェクト、イムン (Infect．Immun.)３５１５（１９９４）。 従来、ウマ農場のＳ．ｅｑｕｉの大発生は疑わしい動物の隔離；餌、馬衣及び 厩舎の殺菌処理；及び指摘されたときの抗生物質の投与によって避けられ且つ処 理されてきた。無毒性のＳ．ｅｑｕｉ又はそのフラクションが記載されているが 、成功率は少なかった。米国特許第５，１８３，６５９号明細書はウマの鼻咽頭 の抗体応答を刺激したワクチンを記載しているが、このワクチンは、注射したウ マに毒力及び時折膿傷の発生への復帰変異の危険性があり、多くのワクチンとし ての制限をもった。 Ｓ．ｅｑｕｉは冒された動物の鼻汁及びリンパ節からの膿汁中に流される。微 生物の通常の研究室での検出は、鼻汁綿棒、鼻汁洗浄液及び膿傷からの膿汁の細 菌培養を必要とし、そしてその結果は背景濃度、少量の有機体、又はエス・ズー エピデミカス（S．zooepidemicus）及び他のβ−溶血性連鎖球菌によってたびた び異なる。培養及び同定の完了には２〜３日かかる。これは大発生の早い段階で ウマを隔離し得るように、腺液の高度な感染性性質及び膿汁を流すウマを速やか に確認する要求のために過度の長い期間がかかる。 発明の概要 本願発明の目的はＳｅＭをコードする分子化合物、及びこれらの化合物がコー ドするコード化合物又は細胞成分のいずれかを組入れる物質の組成物を提供する ことにある。 従って、本願発明の目的は記載される化合物を使用するベクター、セルライン 及び膜製剤を提供する。 本願発明の他の目的はストレプトコッカス イクイの検出用の検定方法を提供 する。 本願発明の他の目的及び特徴は下記に詳細な記載、実施例及び請求の範囲から 明らかになるであろう。 図１はＳｅＭのヌクレオチド及び推論されたアミノ酸配列である。塩基及びア ミノ酸位置を左側に示す。推定のプロモター及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ） をボックスに入れ、そしてシグナル及び膜アンカー配列を太字で示す。繰り返し にアンダーラインを引いてある。 図２はＳｅＭ及び組換えＳｅＭのそれぞれに対する抗血清２１６及び９６３と Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１の溶解分離物、ＳｅＭ０２及びＳ．ｅｑｕｉのミュータノ リジン抽出物の反応を示すイムノブロットである。 図３は組換えＳｃＭに対する抗血清と一連の時間的に且つ地理的に分離された 隔離物のミュータノリジン抽出物の反応を示すイムノブロットである。 図４は回復期（８週）のウマの鼻洗浄液中のＩｇＡによって認識される線状エ ピトープを示すイムノブロットである。 図５は腺疫から採取後８週を過ぎたウマ血清中抗体と反応するＳｅＭの領域を 説明するグラフである。 発明の詳細な記載 本願発明は下記の配列の化合物からなる核酸化合物を提供する。 ［配列番号１（Ｓ．ｅｑｕｉのＭ−タンパク（ＳｅＭ）遺伝子）］。オープン リーデングフレームは３４１で開始し、塩基１９３４まで続く。好ましくは、化 合物は配列番号１である。しかしながら、配列番号１を相補する又は配列番号１ の部分を相補する化合物がまた提供される。配列番号１の好ましい部分は塩基番 号３４１〜１９４３として上記記載のものである。その上に、塩基番号４５２〜 ほぼ１３３１によって定義される化合物はまた好ましい（配列番号４）。 当業者が認め得る如く、上記に例示されたＤＮＡ化合物は有用な相補的ＲＮＡ 配列に関するものを容易に教示できる。任意のそのようなＲＮＡ配列は本願発明 の範囲内にあるとまた考慮される。本願明細書の記載において、ＤＮＡ及びＲＮ Ａ化合物のこのグループは「核酸化合物」と呼称される。 さらに、本願発明の核酸化合物（又は核酸化合物の複合コピー）によってトラ ンスフェクトされた細胞がまた提供される。配列番号１でトランスフェクトされ た細胞又はそのタンパクが好ましい。そのような細胞は原核又は真核細胞であっ て良い。好ましい細胞は大腸菌(E．coli)、酵母菌(S．cerevisiae)、サルモネラ 菌(Salmonella spp)を包含する。本願発明の核酸（又は核酸化合物の複合コピー ）によってトランスフェクトされたベクターがまた提供される。好ましいベクタ ーはポックスアウイルス、デノウイルス又は他のウイルス性ベクターを包含する 。 核酸化合物は当業者にはプライマーを用いるＰＣＲによって、又はジーンバン ク、受託番号Ｕ７３１６２から得られる。ベクター及びセルラインは当業者には また得ることができる。 さらに、アミノ酸化合物がまた提供される。 この配列は配列番号２である。本願発明は上記配列の部分をまた含む。上記配 列の最も好ましい部分は残基３７〜３３０（配列番号５）である。しかし、当業 者はいずれかの抗原タンパクが商業的に重要であり、本願発明の範囲に入ること を認める。 アミノ酸化合物は微生物のオーバーエクスプレション及び精製によって、又は ある場合には従来のペピチド合成によって得ることができる。 従って、Ｓ．ｅｑｕｉ用のワクチンが本願発明によって提供される。鼻腔内に 又は経口的に投与されるワクチンが好ましい態様である。本願発明のワクチンは 配列番号２又はその部分を含むことができる。 本願発明のワキチンは任意の製薬的に許容し得る製剤であり得る。例えば、配 列番号５は、デブス（Debs）他の２６５ J．Biol．chem．１０１８９（１９９０ ）に記載されている、周知の方法に従って水性媒質中でバイレヤー小胞（リポソ ーム）中に組み込まれる。任意の入手し得るキャリヤー又はリポソーム形成脂質 がＳｅＭ抗原を誘発する任意の製剤で利用し得る。例えば、ポリ−ＤＬ−ラクチ ド−コ−グリコリドが配列番号５を含む鼻腔内スプレー製剤で利用できる。コレ ラ毒素のＢ−サブユニットの少量等の粘膜に対する抗原の放出を増大するアジュ バントを包含する製剤がまた本願発明の範囲に入る。 本願発明は配列番号２又はその部分を投与することからなるウマのＳ．ｅｑｕ ｉ−特異的免疫応答を刺激する方法を提供する。抗原は鼻腔内又は経口的導入が 好ましい。 最後に、本願発明はポリメラーゼチェインレアクションによってウマのＳ．ｅ ｑｕｉの存在を決定する方法を提供する。本願発明のポリメラーゼチェインレア クション診断検定は本願明細書に記載する配列のプライマーが開始物質の一部と して使用しさえすれば、周知の方法に従って達成できる。ＰＣＲの方法は多くの 雑誌及び参考書で知ることができる。例えば、このＰＣＲ診断方法はTechniques inPCR，PCR，Current Protocols in Molecular Biology or Hanianisに従って 達成できる。当業者は、好ましいプライマーは少なくとも５０％ＧＣ含量、典型 的に１９〜２３塩基対の長さであり、標的ＤＮＡの二重セクションにアニーリン グできないものであることを知っている。 実施例 実施例１： ＳｅＭのクローニング、配列決定及び発現 Ｓ．ｅｑｕｉＣＦ３２の染色体ＤＮＡをＴｓｐ５０９Ｉ（New England Biolab s Inc.，ベバリー ＭＡ）で部分的に消化し、そして３−８ｋｂフラグメントが ＥｃｏＲＩ（Stratagene.，ラジョラ ＣＡ）で消化されたλＺＡＰＩＩに結合 した。パッケイジング（ギガパックＩＩ）（Stratagene.，ラジョラ ＣＡ）及 びＥ．ｃｏｌｉＸＬＩ−ＢｌｕｅＭＲＦ（Stratagene.，ラジョラ ＣＡ）への ランスフェクションの後に、ライブラリーを培養し、増幅しそして７％ＤＭＳＯ 中で−７０℃貯蔵した。このライブラリーをＳｅＭの酸抽出４１ｋＤａフラグメ ントに対するウサギ２１６抗血清（１：４０００希釈）を使用して重複ニトロセ ルロースディスク上でスクリーニングした。全てのプラークが陽性シグナルを与 えるまで数個の反応プラークをスクリーンした。これらのファージ溶解物中のタ ンパクをＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、血清２１６でイムノブロットした。 ＳｅＭをコードする３．５ｋｂを含有するプラスミドを陽性ファージから摘出し た。得たプラスミドはｐＳｅＭ０１と命名した。ヌクレオチドの配列決定は自動 化環状シークエンシングによってｐＳＫ中のＳ．ｅｑｕｉインサートのＨｉｎｄ ＩＩＩ、ＰｖｕＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントについて実施 された。配列はＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング アメリカ、サン ジエゴ ＣＡ）によって配列され結合された。このシグナル配列を除くＳｅＭを 鋳型及びプリマーＳｅＭ−Ｆ（ｇｃｇｇａｔｃＣＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡ ＧＴＣＧＴ）（配列番号６）及びＳｅＭ−Ｒ（ｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＡＧＣＴＴ ＡＧＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧ）（配列番号７）としてｐＳｅＭ０１によるポリメ ラーゼチェインレアクション（ＰＣＲ）を使用するｐＥＴ１５ｂ（Novagen，マ ジソン、ＷＩ）発現ベクターのＢａｍＨ１にサブクローンした。得たプラスミド をｐＳｅＭ０２と命名し、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーム した。組換えＳｅＭをＨｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（Novagen，マジソン、Ｗ Ｉ）上でアフィニティー クロマトグラフィーによってＢＬ２１の溶解物から単 離した。 結合配列の分析はＳｅＭ遺伝子（図１）をコードする１６０５ヌクレオチドの １つの読み取り枠の存在を示した（図１）。ＳｅＭの翻訳は計算した分子量５８ ．２５１及び８．６７のｐＩをもつ５３５アミノ酸の塩基性（ＣＨ＋４．５）の プレタンパク質を示した。Ｎ末端アミノ酸配列（残基３７−５２）はＳ．ｅｑｕ ｉの酸抽出物から精製された４１ｋＤａＳｅＭフラグメントの直接ミクロ配列決 定によって得られたもの同一であった。予言されたアミノ酸配列は連鎖球菌表面 タンパク質の特徴を示す。シグナル配列は３６残基である。成熟タンパク質のＮ 末端は有効正電荷をもつ、アンカー膜スパンニング領域及び電荷テイル配列は他 の群Ａ及びＣ連鎖球菌配列のこれらと類似する。２つの直接反復（２１残基）は 残基２２６と２６７との間に配置される。３〜６残基の長さで変化する他の短い 直接反復はこの分子のカルボキシ末端ハーフに生ずる。翻訳タンパク質の二次構 造の分析はほぼ残基１２０〜４８０に延在するアルファヘリクスの広範囲の領域 を示す。この二次構造の断定は約残基１２０及び４８０〜５００に達することを 示す。 実施例２： アミノ酸配列決定 実施例３に記載される如く精製された酸抽出ＳｅＭ（２ｍｇ）を予備ＳＤＳＰ ＡＧＥのために１．５ｍｍの厚さのアクリルアミド（９％）ゲノ上の２ｃｍの広 さのスロットに載せた。このゲルをタンパク質を載せる前に１００Ｖで４０分間 ０．１ｍＭのチオグリコール酸で予備実験した。電気泳動後に、イモビロンＰ（ ミリポア）、ＳｅＭの主要な４１及び４６ｋＤａフラグメントへの電気泳動移動 を４０％メタノール中の０．０２５％クーマシエ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルー 及び５％酢酸で１分間染色し、次いで３０％メタノール及び５％氷酢酸中で２分 間脱色することによって同定した。４１ｋＤａバンドを摘出し、ミクロ配列分析 をケンタキー大学のマクロモレクラー合成研究所の（バイオ合成に適用される） モデル４７７Ａ パルス液相シークエンサーで実施した。 実施例３：タンパク質抽出 Ｍ−様タンパク質をホットアシド抽出（ランスフィールド及びパールマン(Lan cefield and Perlmann)．96 J．Exp．Med．71(1952)）し、そして１０ｍＭ燐酸 塩緩衝液ｐＨ７．２のヒドロキシアパタイトのカラムに吸着させた。このＭ−様 タンパク質０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ₄で溶離し、セファデックスＧ２５で脱塩さ せ、そして凍結乾燥した。ペレットを２５％アセトニトリル＋０．５％トリフル オロ酢酸に溶解し、ウオーター６５０パンタク質精製システム（Waters，マール バラ、ＭＡ）に結合されたフェニルＲＰ逆相カラム（Bio-Rad，サンフランシス コ ＣＡ）に充填した。タンパク質を２５−６５％アセトニトリル＋０．５％Ｔ ＦＡのライナーグレジエントを使用して溶離した。ＳｅＭ特異的ウサギ抗血清を 用いて硝酸セルロース上にドットイムノブロット法をピークをスクリーンするた めに用いた。ＳｅＭタンパク質を含有するピークがほぼ４２％アセトニトリルの 濃度で溶離した。種々の実験から陽性ピークをプールし、そしてさらに同じカラ ムで精製した。精製タンパク質を凍結乾燥し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そして−２ ０℃で貯蔵した。Ｓ．ｅｑｕｉ菌株のムタノリジン抽出物を前記した如く（ガラ ン及びチモニー（Galan and Timoney，26 J．Clin．Microbiol．1142(1988)）、 実施した。 実施例４：抗血清 ヒドロキシアパタイト及び逆相クロマトグラフィーの組み合せによって抗血清 を作った。ニュージーランドのホワイトウサギ（２１６）に完全なフロイントア ジュバント中の５０μｇのＳｅＭを皮下注射し、その後３週間の間隔で不完全な フロイントアジュバントに乳化された類似の投与量で２回皮下注射した。血清を ８週間培養した。ウサギ９６３をイー・コリ超音波処理からの組換えＳｅＭで同 様に高度免疫した。インサートなしにプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅを含有するＥ． ｃｏｌｉ ＮａｖａＢｌｕｅの溶解物でウサギＥｃを免疫した。成体ＩＣＲマウ スをＨＩＳ−Ｔａｇクロマトグラフィーによってイー・コリ超音波処理からの精 製されたＳｅＭ２５μｇで免疫した。精製ＳｅＭ（２５μｇ）を５μｇのミコー ル酸ジペプチド（ＭＤＰ）及びアルヒドロゲル（３０％）と混合し、１００ｍｌ の投与量で皮下注射した。２５μｇＳｅＭを含有するがＭＤＰを含有しない２回 の皮Ｆブースター投与を１０日及び２０日後に投与した。マウスを２８日目に採 決した。全ての抗血清を使用するまで−７０℃に貯蔵した。 実施例５：イムノブロッティング 連鎖球菌抽出物のタンタク質又はイー・コリ超音波処理からの精製されたタン パク質をＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって 分離し、ニトロセルロースのシートにエレクトロブロッティングし、そしてＰＢ Ｓで１：２００に希釈された適切な抗血清中で、次いでパーオキシダーゼ結合パ ンタク質Ｇ（１：４０００）中でインキュベートした。反応バンドを基質として ４−クロロ−１−ナフトール（０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いることによって視覚化 した。 ｒｅｃＳｅＭに対するウサギ９６３抗血清はＳ．ｅｑｕｉのミュータノリジン 抽出物中の５８ｋＤａと反応し、そしてｐＳｃＭ０２を含有するＥ．ｃｏｌｉＢ Ｌ２１によって発現された僅かに大きい６０ｋＤａと反応した（図２）。同じタ ンパク質バンドがＳｅＭの４１ｋＤａフラグメントに対するウサギ２１６抗血清 によって確認された。図３は米国及びヨーロッパで異なる時に採取された一連の Ｓ．ｅｑｕｉ単離物のミュータノリジン抽出物のイムノブロットプロフィールを 示す。ｒｅｃＳｅＭに対する抗血清は全ての抽出物において５８及び５６ｋＤａ の２つのタンパク質バンドを認識した。 実施例６：ＥＬＩＳＡ アガロースの分離用電気泳動によって精製されたＳｅＭの酸抽出フラグメント （４１ｋＤａ）をポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Coster，25880，Corning G lass Company，コ−ニング、ＮＹ）のコートウエル（２．５ｍｇ／ウエル）に使 用した。０．０５ツイーン２０及び１％ウシ血清アルブミンを含有する０．１Ｍ 燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）中で洗いそしてブロッキングした後に、ＰＢＳ中の１ ：８０及び１：２００にそれぞれ希釈されたマウス又はウサギ血清をウエルの全 く同じものを３つにして加えた。３７℃で３時間のインキュベーションの後に、 結合したＩｇＧをぺルオキシダーゼ結合タンパク質Ｇ（１：４０００）又はウサ ギ抗−マウスＩｇＧ、次いでＯ−フェニレンジアミン（０．０００１ｍＭ）溶液 で検出した。３つの読みの平均ＯＤ値を抗原及びＰＢＳを含有するウエルに対し てブランクにした。 実施例７：オプソニン検定 ウマ好中球を新しく集めたヘパリンで凝血防止されたウマ血液から不連続パー コール勾配によって分離した（ピコック（Pycock）他、42 Res．Sci．411(1987) ）。血液の７ｍｌからの好中球を、２４ウエル細胞培養クラスター（Coster．ケ ンブリッジ、Ｍａｓｓ）のウエルに全く同じものを３つにして加えたＲＰＭ１（ Gibco,グランド アイランド、ＮＹ）及び８０ｍｌアリコート（6X105セル）中 に懸濁した。各ウエルは円形グラスオーバースリップ（１２ｍｍ直径）を含有し た。細胞クラスターを５％ＣＯ₂中３７℃で２時間インキュベートし、そしてこ の細胞をＰＢＳで一度洗って非付着性の好中球を除いた。試験微生物（Ｓ．ｅｑ ｕｉ ＣＦ３２及びＳ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ Ｗ６０）を０．２％イー スト抽出物をもつＴＨＢ中３７℃で一晩０．６のＯＤまで成長させた。培養液の ２０ｍｌを２５ｍｌ血清に加え、そして４５０ｍｌＲＰＭＩを加えた。このプレ ートを３７℃で３０分間穏やかに振った後に、カバースリップを１０％ホルマリ ン中に固定されたＰＢＳ（ｐＨ７．２）で一度洗い、そしてギエムサ（Gi emsa）で染色した。次いで、１００細胞に対して結合した連鎖球菌をもつ好中球 の数を各血清について計量してパーセントで表現した。全ての検定は同じ３つの もので行った。免疫及び制御血清のオプソニン活性の相違を３つの実験の平均に 基づくスチューデントのｔテスト（無対の観察）によって統計的に評価した。 精製した組換えＳｅＭで免疫されたマウスからの血清は非免疫マウス血清より もＳ．ｅｑｕｉに対して１５倍大きい（ｐ＜０．０１）オプソニン活性を示した 。また、これらの血清はＳｅＭの４１ｋＤａフラグメントに対するＥＬＩＳＡに よって強い抗体応答を示した（実施例６）。 実施例８：フィブリノゲン結合検定 ウマフィブリノゲン（０．５ｍｇ／ウエル）を９６ウエルポリスチレンＥＬＩ ＳＡプレート（Costar）のウエルに拘束した。洗い且つブロキンググした後に、 組換えＳｅＭ（０．４ｍｇ／ウエル）を別個に全く同じものを３つにして加え、 ３７℃で２時間インキュベートした。洗った後に、ウサギ抗血清対ＳｅＭの４１ ｋＤａフラグメントの１：８０希釈液を適切なウエルに加え、３７℃で２時間イ ンキュベートした。コントロールウエルはフィブリノゲンが除かれたウエルから 構成された。ウエルを免疫化前に同じウサギからのなる血清で処理した。フィブ リノゲンに固定されたＳｅＭに結合した特異的ウサギ抗体の量をＥＬＩＳに記載 された如く検出した。 ＳｅＭはＥＬＩＳプレートのウエル上に固定したウマフィブリノゲンに対して 強い結合を示した。ブロックされたウエル表面へのタンパク質の非−特異的結合 にっいての補正後のフィブリノゲンに結合したＳｅＭの平均ＥＬＩＳ値（±ＳＤ ）は０．９±０．１であった。 実施例９：ヌクレオチド配列受託番号 ＳｅＭのヌクレオチド配列のジーンバンク受託番号はＵ７３１６２である。 実施例１０：ホモロジー シグナル及び膜アンカー配列を除いては、ジーンバンクのデータベースにはグ ループＡ又はＧＭタンパク質配列をもつＳｅＭのホモロジーは検出されなかった 。ＳｅＭはそのシグナル（３９％同一）及び膜アンカー（６６％同一）配列の間 にこのデータベースのものと幾つかのホモロジーを示した。 実施例１１：回復期のウマのＳｅＭ−結合抗体の存在 腺疫からの採取後８週間たったウマ血清中の抗体と反応するＳｅＭの領域を図 ３に示す。ほとんどのウマはＳｅＭの中央領域（残基１７０〜２７０）上にエピ トープに対する応答を示した。ＳｅＭのＮ末端第３及びカルボキシ末端領域は極 めて大きく変化し得る。いずれのウマもペプチド１５１−１６６のみに応答しな かった。回復期（８週）の鼻洗浄液中のＩｇＡによって認識される線状エピトー プは血清抗体と反応する同じ領域上で見つけられる（図４）。多重エピトープが 標的にされ、そして血清抗体の場合における如く、個々のウマの応答にはかなり の変化がある。 実施例１２：非暴露の満１年ポニーの免疫化 満３年ウェールズ種ポニーの２つのグループをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１で作られ たＭ−タンパク質（ＳｅＭ、アミノ酸２３１−３３０）のカプセル化された組換 え融合ペプチドによって及び宿主イー・コリのみのカプセル化された抽出物によ って免疫した。カプセル化されたタンパク質（１００μｇ）を鼻アトマイザーを 用いて日に１回各鼻孔中にスプレーした。１５０及び３５０μｇのブスター投与 量を７日及び４２日のそれぞれに与えた。血清及び鼻洗浄液を１日、７日、２１ 日及び４２日に採取し、そして血清中のＳｅＭ−特異的ＩｇＧ及び鼻洗浄液中の ＩｇＡについて検定した。 ＳｅＭに対する特異的粘膜ＩｇＡ応答が２１日に３頭のポニーの２頭で証明さ れた。イー・コリ抽出物のみで免疫された３頭の対照ポニーはいずれもＳｅＭに 応答しなかった。いずれのポニーでも血清抗体応答は検出されなかった。これら の研究はカプセル化された連鎖球菌ペプチドを使用することによってウマの選択 的誘発特異的粘膜抗体応答の可能性を立証する。 実施例１３：ＰＣＲ診断検定 鼻綿棒（Precision Dynamic Corp．サンフランシスコ、ＣＡ；Culture，Baxte r Healthcare Corp.，ディアフィールド、ＩＬ）を、農場Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの腺 疫の臨床診断後１〜５日に冒された且つ暴露されたウマから採取した。何頭かの ウマをその後３週間かけて１回以上サンプル化した。鼻洗浄液を英国の農場で１ ５及び８５日にウマから採取し、その後２頭のウマに対する暴露を臨床腺疫と混 ぜた。これらの全てのウマは混合暴露の１７日以内に腺疫を生じた。鼻洗浄液を 鼻孔に１５ｃｍ挿入された８ｍｍの直径ラテックス管を介して５０ｍｌ燐酸塩緩 衝塩水（ｐＨ７．２）を滴下しそして排出された流体を集めることによって採取 した。この流体を３０００ｇで遠心分離し、ペレット化した有機堆積物を培地及 びＰＣＲから分離した。綿棒及び鼻洗浄ペレットをコロンビアＣＮＡウマ血液ア ガー(Columbia CNA horse blood agar)で培養し、３７℃で１８時間インキュベ ートした。ベータ溶血性コロニーを継代培養（サブカルチャー）し、これらの発 酵挙動をラクトース、ソルビトール及びトレハロースブロス中で試験した。これ らの糖類のいずれも発酵させなかった粘液様のベータ溶血性コロニーをＳ．ｅｑ ｕｉとして同定した。 鼻綿棒及び洗浄液からのＰＣＲ用ＤＮＡを次のように調製した。綿棒チップを ３００μｌの滅菌水に入れ、かき混ぜた。チップを除き、流体を１４，０００ｇ で１０分間遠心分離した。沈降物を２０μｌのＫ−緩衝液(1X Gen Amp Buffer I I．PerkinElmer．0.5% Tween 20,100μg/ml Proteinase K)に再懸濁した。鼻洗 浄ペレットを同じ量のＫ−緩衝液に懸濁した。この懸濁液を５５℃で３０分間イ ンキューベートし、５分間沸騰させ、そして１４，０００ｇで５分間遠心分離し た。３０μｌの全量中のＰＣＲのための反応混合物をＧｅｎ Ａｍｐ バファー ＩＩ中に作られ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５ユニット のＴａｑポリメラーゼ、０．２５μＭのＳｅＭ６及びＳｅＭ７プライマー、及び ２−５μｌサンプルを含有した。このプライマー配列は５’−ＴＧＣＡＴＡＡＡ ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣ（ＳｅＭ７−（塩基２３９−２５８）配列番号８）及 び５’−ＧＡＴＴＣＧＧＴＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＧ（ＳｅＭリバース（塩基８ ８９−９１８）配列番号９）であった。無機オイル（３０μｌ）を加えて反応混 合物をシールした。サイクリングを次の通り実施した。−９２℃で２分間；９２ ℃で１分間：５８℃で１分間：７２℃で１分間（３０回）；７２℃で５分間；４ ℃で最終。ＰＣＲ生成物を臭化エチジウムアガロース電気泳動によって分離した 。プライマーＳｅＭ６及び７によって増幅されたこのＳｅＭはフラグメントは６ ７９塩基対であった。 ＰＣＲは培養によって陽性であった１５の１４を含む３７試料中の６７９塩基 対ＤＮＡフラグメントを検出した。 本願発明は十分に説明されているけれども、種々の変化及び変更は当業者にと って明らかであることは注意されるべきである。そのような変化及び変更は添 付した請求の範囲に定義されている如く、本願発明の範囲内に含まれると理解さ れるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:46） 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19 5/00 Ａ 1:42） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アルチウシン，セルゲイ アメリカ合衆国ケンタッキー州 40503 レキシントン コモンウェルス ドライブ 250

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１の式で表される化合物を含む化合物。 ２．配列番号１である請求項１記載の化合物。 ３．請求項１の化合物を含む原核生物細胞。 ４．請求項１の化合物を含む真核生物細胞。 ５．イー・コリである請求項３記載の細胞。 ６．サルモネラ ｓｐｐである請求項３記載の細胞。 ７．配列番号１又はそのタンパク質の式で表される化合物。 ８．請求項７の化合物を含むワクチン。 ９．配列番号５である請求項７記載の化合物。 10．リボソームに組み入れられる請求項９記載の化合物。 11．コレラ毒素のβ−サブユニットをさらに含む請求項１０記載の化合物。 12．請求項９の化合物を投与することからなる、ウマにＳ．ｅｑｕｉ−特異的免 疫を誘発する方法。 13．ウマから生物学的サンプルを採取し、 ＰＣＲ用サンプルを調製し、 配列番号１に対する適当なプライマーを用いてＰＲＣを実施し、 最終生成物を電気泳動に付し、そして 適当は大きさのフラグメントの存在又は不存在を確認することを特徴とするＳ． ｅｑｕｉによって感染されたウマを同定する方法。 14．使用されるプライマーが配列番号８及び配列番号９である請求項１３記載の 方法。