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Die Erfindung betrifft die Anwendung der rekombinanten DNA-Technik
auf Säuerungsbakterien, insbesondere auf Säuerungsbakterien für die
Molkereiindustrie, wobei ein neuer Klonierungsvektor für diese Bakterien
entwickelt wird.
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Milchsäurebakterien werden in großem Umfang als Säuerungsmittel
sowohl in der Nahrungsmittelindustrie als auch in der Landwirtschaft
verwendet. In der Landwirtschaft werden Säuerungsinokulationen in einigen
Ländern insbesondere für die Futterkonservierung eingesetzt. In der
Nahrungsmittelindustrie werden Säuerungsmittel insbesondere in der
Molkerei-, Back- und Fleischverarbeitungsindustrie eingesetzt. In Finnland
stellt die Molkereiindustrie mit Abstand den größten Anwender von
Säuerungsmitteln dar.
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Molkereisäuerungsmittel werden zur Herstellung von Butter,
Sauermilch, Yoghurt, Kefir und insbesondere gereiftem Käse verwendet. Die
wichtigste Funktion eines Säuerungsmittel ist dabei eine wirksame
Fermentation von Milchzucker (Lactose) zu Milchsäure. Ferner bilden bestimmte
Säuerungsbakterien Aromastoffe (Diacetyl, Aceton und dergl.). Aus
Säuerungsbakterien freigesetzte Enzyme (Proteasen, Peptidasen) sind
vermutlich ebenfalls beim Reifungsprozeß von Käse von Bedeutung.
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Die rekombinante DNA-Technik kann in großem Umfang bei der
Erforschung und der Produktentwicklung von Säuerungsmitteln eingesetzt
werden. Bei einem Versuch, Säuerungsmittel zu entwickeln, deren
Eigenschaften optimiert sind, die stabil sind und auf vorhersagbare Weise wirken,
ist es wichtig, die Wirkung der Kopienzahl oder Aktivität von Genen, die
beispielsweise für wesentliche Säuerungseigenschaften kodieren, auf ein
gewunschtes Verfahren zu untersuchen. Im Hinblick auf die eingeführte
Verwendung von Säuerungsbakterien in Nahrungsmitteln sowie im Hinblick
auf deren anerkannt sichere Anwendung ist es auch möglich, deren
Verwendung bei neuen gewerblichen Verfahren, z.B. bei der Herstellung von
Fremdproteinen, in Erwägung zu ziehen.
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Die rekombinante DNA-Technik erfordert sowohl ein funktionsfähiges
Transformationssystem als auch ein geeignetes Vektorplasmid. Das
Transformationssystem soll in ausreichendem Maße wirksam sein, um eine
Klonierung in einem gewunschten Wirtsorganismus unter Verwendung von
Ligationsgemischen zu ermöglichen. Ein guter Vektor soll seinerseits folgende
Eigenschaften aufweisen:
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- geringe Größe,
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- hohe Kopienzahl,
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- leichte Selektierbarkeit, beispielsweise auf der Basis von
Antibiotika-Resistenzgenen,
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- Restriktionsenzym-Schnittstellen, die sich zum Klonieren eignen,
vorzugsweise sogenannte Insertionsinaktivierungsstellen innerhalb des
Gens, und
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- Fähigkeit zur Replikation und Fähigkeit zur Expression von
Selektionsgenen in unterschiedlichen Wirten.
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Unter den wichtigsten Gruppen von Säuerungsbakterien sind die
genetischen Eigenschaften der Streptokokken der sogenannten N-Gruppe
(Streptococcus lactis, S. lactis subsp. diacetylactis und S. cremoris) am
besten bekannt.
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Die wichtigsten Säuerungseigenschaften dieser Bakterien (Verwertung
von Lactose, bestimmte Proteinasen, Bildung von Aromastoffen) sind sehr
allgemein plasmidkodiert (10). Die Streptokokken der N-Gruppe weisen
zahlreiche kryptische Plasmide auf.
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Eine funktionsfähige Protoplasten-Transformationstechnik wurde
kürzlich für die Streptokokken der N-Gruppe entwickelt (15). Es wurden
auch Versuche gemacht, für diese Bakterien geeignete Klonierungsvektoren
zu entwickeln.
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In den Niederlanden haben J. Kok et al. einen Vektor entwickelt,
der auf dem kryptischen Plasmid pWVOI von S. cremoris basiert und als
Selektionsgene die Erythromycin- und Chloramphenicol-Resistenzgene der
Staphylococcus aureus-Plasmide pE194 und pC194 aufweist. Das erstgenannte
Plasmid enthält die Erkennungsstelle des BclI-Restriktionsenzyms. Dieser
als pGK12 bezeichnete Vektor weist 4,9 kb (1 kb = 1000 Basenpaare) auf
und enthält ferner die einzelnen Schnittstellen der ClaI- und
HpaII-Enzyme außerhalb der Resistenzbereiche. Außer in den Streptokokken der N-
Gruppe wird der Vektor auch in Bacillus subtilis und Escherichia coli
repliziert (6). Unter Verwendung des Vektors ist es möglich, ein aus dem
Plasmid stammendes Proteasegen von S. cremoris zu klonieren (7).
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In England haben M. Gasson et al. eine weitere Vektorkonstruktion
auf der Basis des pSH71-Plasmids aus S. Lactis entwickelt. Ein
Chloramphenicol- und Kanamycin-Resistenzgene enthaltendes Fragment des B.
subtilis-Plasmids pBD64 wird in das Plasmid inseriert. Die resultierenden
rekombinanten Plasmide (pCK1, pCK17 und pGK21) enthalten die
BglII-Erkennungsstelle innerhalb des Kanamycin-Resistenzbereiches und zusätzlich in
anderen Bereichen BamHI-, EcoRI-, PvuII- und XbaI-Erkennungsstellen.
Daneben enthalten die Plasmide pCK17 und pCK21 ferner eine ClaI-Erkennungs
stelle. Die Größe der Plasmide liegt im Bereich von 5,5 bis 5,9 kb.
Ähnlich wie pGK12 werden die Vektoren auch in B. subtilis und E. coli
repliziert (4).
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Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen neuen
Klonierungsvektor bereitzustellen, der sich von den vorstehend beschriebenen dadurch
unterscheidet, daß er wesentlich vielseitigere Klonierungsmöglichkeiten
und eine höhere Kopienzahl aufweist. Das Vektorplasmid besitzt ein
breites Wirtsspektrum (die Streptokokken der N-Gruppe, E. coli, B. subtilis),
und sowohl von Streptokokken als auch von anderen Bakterien stammende
Gene können in dieses Plasmid kloniert werden, und folglich kann die
Expression in verschiedenen Wirten untersucht werden. Auf diese Weise ist
es möglich, für wichtige Säuerungseigenschaften kodierende Gene zu
isolieren und die entsprechenden Genprodukte zu analysieren. Genvarianten,
von denen festgestellt wird, daß sie zur Verwendung als Säuerungsmittel
am besten geeignet sind, können in die Säuerungsmittelstämme
zurückübertragen werden, wodurch die genetische Zusammensetzung verwertbarer
Säuerungsmittel optimiert wird. Der Vektor kann auch für die Produktion von
Fremdproteinen entweder in den Streptokokken der N-Gruppe oder in
herkömmlicheren Produktionswirten verwendet werden. Diese Wirte
(hauptsächlich B. subtilis und E. coli) können auch für die Massenproduktion
von Genprodukten, die aus Streptokokken stammen und für einen
Nutzungszweck geeignet sind, verwendet werden.
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Das erfindungsgemäße Plasmid pVS2 basiert auf einem ClaI-Fragment
mit 1,7 kb aus dem kryptischen S. lactis-Plasmid pSH71 (3). Ein
Chloramphenicol-Resistenzgen aus dem S. sanguis-Plasmid pGB301 (1) und ein
Erythromycin-Resistenzgen aus dem Stach. aureus-Plasmid pE194 (14) sind
darin inseriert. Zwischen diesen Resistenzbereichen befindet sich ein
Fragment mit 0,35 kb aus dem E. coli-Vektor pBR322 (12). Die gesamte
Größe des Plasmids beträgt 5,0 kb.
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Das Plasmid pVS2 enthält die folgenden einzelnen
Restriktionsstellen: ClaI, BclI, HindIII und BstEII. Außerdem befinden sich zwei
HoaII-Stellen zwischen HindIII und BstEII in einem Abstand von neun
Basenpaaren voneinander, so daß sie in der Praxis eine einzelne
Restriktionsstelle bilden. Die Schnittstelle von BclI liegt im
Erythromycin-Resistenzgen und die BstEII-Stelle im Chloramphenicol-Resistenzgen, so daß
diese beiden Stellen Insertionsinaktivierungsstellen sind.
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Da der Erythromycin-Resistenzbereich zwischen den ClaI- und
HindIII-Stellen liegt, kann das Erythromycin-Resistenzgen inaktiviert
oder deletiert werden, und zwar nicht nur durch einen einfachen
BclI-Verdau, sondern auch durch eine doppelten Verdau mit ClaI-BclI, BclI-
HindIII, ClaI-HindIII, ClaI-HpaII und BclI-HpaII.
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Da durch die Enzyme ClaI, HpaII, TagI, AccI und AcyI gespaltene DNA
in die Restriktionsstellen ClaI und HoaII inseriert werden kann, und
entsprechend durch die Enzyme BamHI, BalI, BglII, MboI, SauIIIA und XhoII
erhaltene DNA-Fragmente in die Restriktionsstelle BclI inseriert werden
können, ist der Erythromycin-Resistenzbereich besonders geeignet für die
"forced cloning"-Methode. Bei dieser Methode werden die freien DNA-Enden
sowohl des zu klonierenden Fragments als auch des Klonierungsvektors
mittels zweier verschiedener Enzyme gebildet. Der Vektor kann z.B. durch
die Enzyme ClaI und BclI gespalten werden, während die Enden des zu
klonierenden Fragments die Formen HpaII und BamHI aufweisen.
Gegebenenfalls kann die "forced cloning"-Methode auch auf den
Chloramphenicol-Resistenzbereich angewandt werden, und zwar mittels eines doppelten Verdaus
mit BstEII-HnaII oder mit BstEII-HindIII. Der Streptococcus lactis-Stamm
VS135, der das Vektorplasmid pVS2 enthält, ist unter der Nummer DSM 3749
bei der Hinterlegungsstelle "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen"
hinterlegt. Das Hinterlegungsdatum ist der 2. Juni 1986.
Beschreibung der Figuren
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Die Figur erläutert die Konstruktion des Plasmids pVS2. (Die für
die Konstruktion wesentlichen Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme
sind im Plasmid gekennzeichnet. Die Erkennungsstellen basieren auf den
bisher veröffentlichten Restriktionskarten der Plasmide (Druckschriften
1, 3, 12 und l4), mit Ausnahme der ClaI-Stelle der Plasmide pGB301 und
pSH71, die während der Konstruktion bestimmt wurden.)
Materialien und Methoden
1) Plasmide und ihre Isolierung
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Die für die Konstruktion des Plasmids pVS2 verwendeten Plasmide und
ihre Wirtsstämme sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Plasmide wurden aus
Streptokokken nach der Methode von Gasson (3), aus E. coli nach der
Methode von Birnboim (2) und aus Staph. aureus nach der Methode von Guerry
et al. (5) isoliert.
2) Medien
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M17-Nährbouillon oder Agar mit zugesetzter Glucose (13) wurde als
Kulturmedium für Streptokokken verwendet. Bei der Behandlung der
Protoplasten
wurde 0,4 in Saccharose als osmotischer Stabilisator verwendet. E.
coli wurden in LB-Nährbouillon oder auf LB-Agar, hergestellt gemäß
Maniatis et al. (8), gezüchtet.
3) Restriktionsenzyme und DNA-Ligasen
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Die verwendeten Restriktionsenzyme und die verwendete T4-DNA-Ligase
wurden von der Fa. Boehringer Mannheim (Bundesrepublik Deutschland)
bezogen und gemäß den Anweisungen von Maniatis et al. (8) verwendet.
Tabelle 1. Plasmide für die Konstruktion des Vektors pSV2 und Wirtsstämme dieser Plasmide
Plasmid
Größe des Plasmid (kb)
Selektionsgene
Druckschrift
Wirtsstam
Herkunft des Stammes
kryptisch
M.Gasson, The National Institute for Research in Dairying, Reading, England
Ein Stamm von Valio, beschrieben in Druckschrift 15
R. Novick, The public Health Research Institute of the City of New York Inc., New York, USA
Ampr = Ampicillin-Resistenz
Cmr = Chloramphenicol-Resistenz
Emr = Erythromycin-Resistenz
Tetr = Tetracyclin-Resistenz
E.coli RN4378 basierte auf E Coli AB259 (9)
4) Transformation
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E. coli AB259 (9) und S. lactis MG1614 (3) wurden als
Rezipientenstämme bei den Transformationstests verwendet. AB259 wurde vom "Public
Health Research Institute of the City of New York Inc." und MG1614 vom
"National Institute for Research in Dairying (Reading, England)" bezogen.
Keiner der Stämme weist eigene Plasmide auf.
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Die Standardmethode von Mandel und Higa gemäß Maniatis et al. (8)
wurde bei der E. coli-Transformation verwendet. Die Selektionsmedien
enthielten Ampicillin (50 µg/ml) und entweder Chloramphenicol (5 µg/ml)
oder Erythromycin (50 µg/ml).
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Die S. lactis-Transformationen wurden, wie von v. Wright et al.
(15) beschrieben, durchgeführt. Entweder Chloramphenicol (5 µg/ml) oder
Erythromycin (2,5 µg/ml) wurden für die Selektion verwendet.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Klonierung der Antibiotika-Resistenzgene in S. lactis-Plasmiden und
Konstruktion des Vektors nVS2
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Die verschiedenen Phasen des Verfahrens sind in der Figur
beschrieben.
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Ein etwa 5 kb großes Fragment des Plasmids pGB301 mit einem
Chloramphenicol-Resistenzgen wurde in den E. coli-Vektor pBR322 an der
ClaI-Stelle inseriert. Dies führte zu dem Plasmid pVC5 mit etwa 8,3 kb.
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Das Plasmid pVC5 wurde mit den Enzymen ClaI und HpaII doppelt
verdaut. Das resultierende Fragment mit etwa 2,8 kb und mit einem
Chloramphenicol-Resistenzgen wurde in ein 1,7-kb-Fragment, das aus pSH71
durch einen ClaI-Verdau erhalten wurde, inseriert, und das resultierende
rekombinante Plasmid wurde in S. lactis transformiert. Das erhaltene
Plasmid mit 4,5 kb wurde als pVS1 bezeichnet.
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Ein Erythromycin-Resistenzgen wurde aus pE194 durch Schneiden
dieses Plasmids mittels ClaI-HpaII-Doppelverdau und durch Insertion des
resultierenden Fragments von etwa 1,2 kb in pBR322 an der ClaI-Stelle
isoliert. Das erhaltene Plasmid wurde als pVC6 bezeichnet.
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Schließlich wurde pVS1 mit den Enzymen ClaI und BclI verdaut und
pVC6 entsprechend mit den Enzymen ClaI und BamHI. Das resultierende, von
pVC6 abgeleitete ClaI-BamHI-Fragment mit etwa 1,6 kb und mit einem
Erythromycin-Resistenzbereich wurde in ein 3,3-kb-Fragment, das die
Replikationsgene von pVS1 und ein Chloramphenicol-Resistenzgen enthielt,
inseriert. Das erhaltene Hybridplasmid wurde zur Transformation von S. lactis
verwendet. Dies führte zu einem Plasmid pVS2 mit Chloramphenicol- und
Erythromycin-Doppelresistenz.
Beispiel 2
Übertragung des Vektors pVS2 auf verschiedene Wirtsbakterien
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Die Transformation in E. coli wurde gemäß Standardmethoden unter
Verwendung von Erythromycin-Chloramphenicol-Platten zur Selektion
durchgeführt.
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Kompetente Zellen des Stamms BD170 (bezogen vom "Public Health
Research Institute of the City of New York Inc.") wurden als Rezipienten
bei der Transformation in B. subtilis verwendet. Chloramphenicol (5
µg/ml) wurde zur Selektion verwendet.
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Sowohl E. coli als auch B. subtilis wurden gut mit dem Plasmid pVS2
transformiert, und beide Resistenzgene wurden in diesen Wirten
exprimiert.
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Das Plasmid pVS2 wurde auf die Stämme Streptococcus cremoris SSC179
und S. lactis subsp. diacetylactis SSD194 durch
Protoplasten-Transformation unter Verwendung der gleichen Methode wie bei dem S. lactis-Stamm
MG1614 übertragen. Chloramphenicol-Resistenz wurde zur Selektion
verwendet. Die Transformationsfrequenzen waren niedrig ( 100/µg DNA bei dem
Stamm SSD194, 10/µg DNA bei dem Stamm SSC179). Alle Transformanten
waren gegenüber Erythromycin resistent, und das neue Plasmid, dessen Größe
der von pVS2 entsprach, wurde elektrophoretisch aus zufällig ausgewählten
Transformanten identifiziert.
Beispiel 3
Klonierung der lactose-abbauenden Gene des S. lactis-Plasmids
pLP712
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Für die Klonierung wurde pVS2 mit BclI und das lactose-abbauende S.
lactis-Plasmid pLP712 aus (3) mit BglII verdaut. Das resultierende BglII-
Fragment wurde nach der Schrotschuß-Methode in pVS2 an der BclI-Stelle
kloniert. Die resultierenden Transformanten, die resistent gegenüber
Chloramphenicol, aber empfindlich gegenüber Erythromycin waren, wurden
auf ihre lactose-abbauenden Eigenschaften untersucht. Alle
lactose-positiven Transformanten enthielten ein Plasmid mit etwa 20 kb. Entsprechend
befinden sich die Gene für den Lactose-Abbau in dem Plasmid pLP712 in
einem BglII-Fragment B mit etwa 15 kb. Dies entspricht der vorläufigen
Restriktionskarte, die für das Plasmid veröffentlicht wurde (3).
Beispiel 4
Klonierung des Thermonucleasequens aus Stanh. aureus in E. coli und
S. lactis
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Das E. coli-Plasmid pFOG301 (11) mit dem Thermonuclease-Gen aus
Staph. aureus wurde mit dem HpaII-Enzym verdaut, und das erhaltene
Fragment mit etwa 1,4 kb und dem Thermonucleasegen wurde nach der
Schrotschuß-Methode in pVS2 an der ClaI-Stelle kloniert. E. coli wurde mit
einem Ligationsgemisch transformiert, und die Transformanten wurden mit
einem Erythromycin-Chloramphenicol-Doppelverdau selektiert. Die
erhaltenen Transformanten wurden auf ihre Thermonuclease-Aktivität
getestet. DNA wurde aus zwei positiven Transformanten abgetrennt, und S.
lactis wurde mit den erhaltenen Plasmiden (beide mit etwa 6,5 kb)
transformiert. Alle erhaltenen Transformanten wiesen eine
Thermonuclease-Aktivität auf.
Beispiel 5
"Forced cloning" innerhalb des Erythromycin-Resistenzbereiches
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Das Plasmid pVS2 wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und BclI
verdaut. Entsprechend wurde das schleimbildende Plasmid aus einem
Milchsäuerungsbakterienstamm mit den Enzymen ClaI und BglII doppelt verdaut.
Die DNA-Proben wurden im Verhältnis 1:3 gemischt und ligiert. S. lactis
MG1614 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert. Die Selektion wurde
auf der Basis der Chloramphenicol-Resistenz durchgeführt. Die
Transformanten wurden auch auf ihre Erythromycin-Resistenz untersucht. Zwei
gegenüber Chloramphenicol resistente und gegenüber Erythromycin
empfindliche Transformanten wurden für weitere Tests ausgewählt. Eine davon
enthielt ein Plasmid mit etwa 7,2 kb und die andere ein Plasmid mit etwa
10,5 kb. Die durchgeführten Restriktionstests zeigten, daß jedes Plasmid
inserierte DNA in einem Bereich zwischen den ClaI- und
BclI-Erkennungsstellen des Plasmids pVS2 enthielt.
Beispiel 6
Inaktivierung des Chloramphenicol-Resistenzgens durch Insertion an
der BstEII-Stelle
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Das Plasmid pVS2 wurde mit den Restriktionsenzymen HpuII
(Erkennungsstelle außerhalb des Chloramphenicol-Resistenzbereiches) und
BstEII (Erkennungsstelle innerhalb des
Chloramphenicol-Resistenzbereiches) verdaut. Chromosomale DNA des Stamms Strentococcus lactis
SSL135 wurde entsprechend mit den Enzymen ClaI und BstEII verdaut
(doppelter Verdau, da BstEII eine relativ seltene Restriktionsstelle
ist). Die DNA-Proben wurden im Verhältnis 1:3 gemischt und ligiert. E.
coli wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert, und die Selektion
basierte auf der Erythromycin-Resistenz. Die resultierenden Transformanten
wurden auch auf ihre Chloramphenicol-Resistenz getestet. Sechs
Transformanten, die resistent gegenüber Erythromycin und empfindlich gegenüber
Chloramphenicol waren, wurden für weitere Tests ausgewählt. Jede enthielt
ein Insert in dem Bereich zwischen den HpaII- und BstEII-Stellen des
Plasmids pVS2. Die Größen der Inserts variierten zwischen 0,6 und 5,0 kb.
Druckschriften
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