FI77056C - Vektorplasmid som laempar sig foer syrningsmedel, speciellt foer mejerisyrningsmedel. - Google Patents
Vektorplasmid som laempar sig foer syrningsmedel, speciellt foer mejerisyrningsmedel. Download PDFInfo
- Publication number
- FI77056C FI77056C FI862683A FI862683A FI77056C FI 77056 C FI77056 C FI 77056C FI 862683 A FI862683 A FI 862683A FI 862683 A FI862683 A FI 862683A FI 77056 C FI77056 C FI 77056C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- plasmid
- vector
- resistance gene
- clai
- foer
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 62
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 22
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 claims description 21
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 8
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 claims description 7
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 2
- 241001478240 Coccus Species 0.000 claims 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 101100515516 Arabidopsis thaliana XI-H gene Proteins 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical group CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- QACUPNAKIPYZAW-RMQWDSPGSA-N O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O QACUPNAKIPYZAW-RMQWDSPGSA-N 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 235000015155 buttermilk Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000015141 kefir Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/31—Endoribonucleases active with either ribo- or deoxyribonucleic acids and producing 3'-phosphomonoesters (3.1.31)
- C12Y301/31001—Micrococcal nuclease (3.1.31.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
1 77056
Hapatteille, erityisesti meijerihapatteille soveltuva vektoriplasmidi
Keksinnössä on kyse yhdistelmä-DNA-tekniikan sovelta-5 misesta hapatebakteereihin, erityisesti meijeriteollisuuden hapatebakteereihin, joille on kehitetty uusi kloonaus-vektori.
Maitohappobakteereilla on laaja käyttö hapatteissa sekä elintarviketeollisuudessa että maataloudessa. Maatalou-10 dessa hapateymppejä käytetään eräissä maissa erityisesti rehun säilöntään. Elintarviketeollisuudessa hapatteiden käyttäjiä ovat erityisesti meijeri-, leipomo- ja lihan-jalostusteollisuus. Suomessa meijeriteollisuus on ylivoimaisesti suurin hapatteiden käyttäjä.
15 Meijerihapatteita käytetään voin, piimän, jogurtin, kefiirin ja etenkin kypsytettyjen juustojen valmistukseen. Hapatteen tärkein tehtävä on tällöin maitosokerin (laktoosin) tehokas fermentoiminen maitohapoksi. Tämän lisäksi eräät hapatebakteerit tuottavat aromiaineita (diasetyyliä, 20 asetoiinia yms.). Hapatebakteereista vapautuvilla entsyymeillä (proteaasit, peptidaasit) on myös ilmeisesti merkitystä juuston kypsymisprosessissa.
Yhdistelmä-DNA-tekniikalla on paljon sovellutusmahdollisuuksia hapatetutkimuksessa ja -tuotekehittelyssä. Py-25 rittäessä kehittämään ominaisuuksiltaan optimoituja, stabiileja ja ennustettavasti toimivia hapatteita, on tärkeää selvittää esim. keskeisiä hapateominaisuuksia koodaavien geenien kopioluvun tai aktiivisuuden vaikutus haluttuun prosessiin. Muistaen hapatebakteerien vakiintuneen elintar-30 vikekäytön ja tunnustetun turvallisuuden tulisi myös harkita niiden käyttöä uusiin teollisiin prosesseihin, esim. vierasproteiinien tuottoon.
Yhdistelmä-DNA-tekniikan edellytyksenä on sekä toimiva transformaatiosysteemi että sopiva vektoriplasmidi.
35 Transformaatiosysteemin tulisi olla niin tehokas, että kloonaus haluttuun isäntäorganismiin ligaatioseoksia käyttäen 2 77056 onnistuu. Hyvällä vektorilla puolestaan tulee olla seuraa-vat ominaisuudet: - pieni koko - korkea kopioluku 5 - helppo esim. antibioottiresistenssigeeneihin perustuva selektoitavuus - kloonaukseen sopivat restriktioentsyymien leikkauskohdat, mieluiten ns. insertioinakti-vaatiokohtina selektiogeenien sisältä 10 - kyky kahdentua ja ekspressoida selektiogeenit eri isännissä Tärkeistä hapatebakteeriryhmistä ns. N-ryhmän streptokokit (Streptococcus lactis, Str. lactis subsp. diacetylactis ja Str. cremoris) ovat geneettisiltä ominaisuuksiltaan parhai-15 ten tunnettuja. Näillä bakteereilla tärkeimmät hapateomi-naisuudet (laktoosin käyttö, tietyt proteinaasit, aromiaineiden tuotto) ovat hyvin yleisesti plasmidien koodaamia (10). N-ryhmän streptokokeilla esiintyy myös runsaasti kryptisiä plasmideja.
20 N-ryhmän streptokokeille on äskettäin kehitetty toi miva protoplastitransformaatiotekniikka (15). Myös näille bakteereille soveltuvia kloonausvektoreita on pyritty kehittämään.
Alankomaissa J. Kok tutkimusryhmineen on kehittänyt 25 Str. cremoriksen kryptiseen pWVOI plasmidiin perustuvan vektorin, jossa selektiogeeneinä ovat Staphylococcus aureus plasmidien pEl94 ja pC194 erytromysiini- ja kloramfeni-koliresistenssigeenit. Ensiksimainittu sisältää Bell restriktioentsyymin tunnistuskohdan. Tämän pGK12-nimisen 30 vektorin koko on 4,9 kb (1 kb = 1000 emäsparia), ja se sisältää resistenssialueiden ulkopuolella vielä yksittäiset Clal ja Hpall entsyymien leikkauskohdat. Vektori replikoi-tuu, N-ryhmän streptokokkien lisäksi, myös Bacillus subti-liksessa ja Escherichia collssa (6). Vektoria käyttäen on 35 pystytty kloonaamaan Str. cremoriksen plasmidiperäinen pro-teaasigeeni (7).
3 77056
Englannissa M. Gasson ryhmineen on kehittänyt toisen vektorikonstruktion käyttäen pohjana Str. lactis plasmidia ja pSH71. Tähän plasmidiin on liitetty kloramfenikoli- ja kanamysiiniresistenssigeenit sisältävä B. subtilis plasmi-5 din pBD64 fragmentti. Syntyneissä rekombinanttiplasmideissa (pCK1, pCKl7 ja pCK21) on Bglll tunnistuskohta kanamysiini-resistenssialueella ja lisäksi muualla BämHI, EcoR1, PvuII ja Xbal tunnistuskohdat. Näiden ohella on plasmideissa pCK17 ja pCK21 vielä Clal tunnistuskohta. Plasmidien koot 10 vaihtelevat 5,5 - 5,9 kb:hen. Vektorit pystyvät, pGK12:n tavoin, replikoitumaan myös B. subtiliksessa ja E. colissa (4) .
Tämän hakemuksen kohteena on N-ryhmän streptokokeille kehitetty uusi kloonausvektori, joka eroaa edelläkuvatuista 15 niitä huomattavasti monipuolisempien kloonausmahdollisuuk- siensa suhteen. Vektoriplasmidilla on laaja isäntäspektri (N-ryhmän streptokokit, E. coli, B. subtilis), ja siihen pystytään kloonaamaan sekä streptokokeista että muista bakteereista peräisin olevia geenejä ja siten tutkimaan niiden 20 ekspressoitumista eri isännissä. Näin on mahdollista eristää tärkeitä hapateominaisuuksia koodaavat geenit, ja tutkia niiden geenituotteet. Hapatekäytön kannalta parhaiksi havaitut geenivariantit voidaan palauttaa hapatekantoihin ja siten optimoida käyttöhapatteiden geneettinen koostumus.
25 Vektoria voidaan myös soveltaa vierasproteiinien tuottoon joko N-ryhmän streptokokeissa tai perinteellisemmissä tuo-tantoisännissä. Viimeksimainittuja (lähinnä B. subtilista tai E. colia) voidaan myös käyttää streptokokkiperäisten hyötykäyttöön soveltuvien geenituotteiden massatuotantoon.
30 Keksinnön kohteena olevan plasmidin pVS2:n pohjana on
Str. lactis kryptisen plasmidin pSH71 (3) 1,7 kb:n suuruinen Clal-fragmentti. Tähän on liitetty kloramfenikoliresis-tenssigeeni Str. sanguis plasmidista pGB301 (1) sekä ery-tromysiiniresistenssigeeni Staph, aureus plasmidista pE194 35 (14). Näiden resistenssialueiden välissä on E. coli vekto rista pBR322 (12) saatu 0,35 kb:n fragmentti. Koko plasmidin suuruus on 5,0 kb.
4 77056
Plasmidi pVS2 sisältää yksittäisinä seuraavat re-striktiokohdat: Clal, Bell, Hindlll ja BstEII. Lisäksi Hindlll:n ja BstEII:n välissä on kaksi Hpall-kohtaa 9 emäs-parin päässä toisistaan muodostaen siten käytännössä yhden 5 restriktiokohdan. Bell tn leikkauskohta sijaitsee erytromy-siiniresistenssigeenissä ja BstEII-kohta kloramfenikoli-resistenssigeenissä, joten nämä kaksi kohtaa ovat insertio-inaktivaatiokohtia.
Koska erytromysiiniresistenssialue sijaitsee Clal ja 10 Hindlll kohtien välissä, voidaan erytromysiiniresistenssi- geeni inaktivoida tai poistaa, paitsi yksinkertaisella Bcll-digestiolla, myös Clal-Bcll, Bcll-Hindlll, Clal-Hindlll, Clal-Hpall ja BclI-Hpall kaksoisdigestiolla.
Koska Clal ja Hpall restriktiokohtiin voidaan liittää 15 entsyymeillä Clal, Hpall, TagI, Accl ja Acyl pilkottua DNA:ta ja BclI-restriktiokohtaan vastaavasti entsyymeillä BamHI,
Bell, Bglll, Mbol, SauIIIA ja XhoII aikaansaatuja DNA-frag-mentteja, on pVS2:n erytromysiiniresistenssialue erittäin sovelias ns. "forced cloning" kloonaukseen. Tässä menetel-20 mässä sekä kloonattavan fragmentin että kloonausvektorin vapaat DNA:n päät on muodostettu kahdella eri entsyymillä. Vektori voidaan esimerkiksi katkaista entsyymeillä Clal ja Bell kloonattavan fragmentin päiden ollessa muotoa Hpall ja BamHI. Haluttaessa voidaan "forced cloning"-menetelmää so-25 veltaa myös kloramfenikoliresistenssialueelle käyttäen hy väksi BstEII-Hpall tai BstEII-Hindlll kaksoisdigestioita. Streptococcus lactis-kanta VS 135, joka sisältää vektoriplas-midin pVS2 on talletettu numerolla DSM 3749 talletus-laitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.
30 Talletuspäivämäärä 2.6.1986.
Kuvion selitys
Kuviossa on esitetty plasmidi pVS2:n kokoaminen. (Plasmideihin on merkitty työn kannalta oleelliset rest-riktioentsyymien tunnistuskohdat. Tunnistuskohdat perustu-35 vat plasmideista ennestään julkaistuihin restriktiokarttoi- hin (viitteet 1, 3, 12 ja 14) plasmidien pGB301 ja pSH71 Clal-kohtia lukuunottamatta, jotka määritettiin työn aikana).
5 77056
Aineisto ja menetelmät 1) Plasmidit ja niiden eristys
Plasmidi pVS2:n kokoamiseen käytetyt plasmidit ja niiden isäntäkannat on esitetty taulukossa 1. Plasmidit eris-5 tettiin streptokokeista Gassonin (3), E. colista Birnboimin (2) ja Staph, aureuksesta Guerry ym:n (5) menetelmiä käyttäen.
2) Alustat
Streptokokkien kasvualustana oli glukoosilla supple-10 mentoitu M17-liemi tai -agar (13). Protoplasteja käsiteltäessä käytettiin 0,4 M sakkaroosia osmoottisena stabilaatto-rina. E, coli kasvatettiin Maniatis ym:n (8) mukaan valmistetussa LB-liemessä tai LB-agarilla.
15 3. Restriktioentsyymit ja DNA-ligaasi Käytetyt restriktioentsyymit ja T-4-DNA-ligaasi oli hankittu Boehringer-Mannheimilta (FRG), ja niitä käytettiin Maniatis ym:n (8) ohjeiden mukaan.
6 77056
CU
P
-H G Xl to x: -ph CU- LO U -H o
O H (Τ' <— -H -P >H
•H iti C rH tn <C
-P (U -H :t0 X» C £ W
tö tn T3 -en 3 H <U 20 2 (i) m to en ft z
:nj Ph 1) 4J CU XJ
H CU Ph C CU CU U HH Xi
<D Xl H fö -P XI H O H
p ΟηΕηο-λ;-ρε-ι(Οο
to 3 P &1 -H <U>1>H
C Xl - e to -H - tn -p e rH e cu ή £ > x: eu -h s
<Ö etj O -P >1 "H O O PS U CU
XI en 3 H -P 3 Ή 2 :t0 C tn -P -H C C-P > XI <1) -P (0 (0-Ht0t0 O-P O-PjC- C CO-PQ-H-HtOZrH-P· :to C tn t3 ή > tou
en (0 · G G C iO 3 · CU Ή G
H « SH-Hpq > Xi PS K O H
e
CU
td <N
•H ^ •r| W »3·
G CD CO CN
ro Z
to h- r- PS
•ro o w oo S > en r- -P 3 co •h to en en cu
Ό -P ·Η -H HZ
•H C-P -P G PS
£ tO U O to
en M ro to -H
tO etO f—i i—i · i—I
rH -P XI O
ft G · ft U
:iti H H fö
-P tn -p -P -P
>i h to www -P — <U en -P —- >1 :td (U tr,
Xi -P m
•rl CO H— HS· <N «N
G -H r- T- ffl CU > < <u tn -h
-H rH
e l e H O
tO O <U -P -H U
O -H G H CU tn -H -rt x; 4J.P-H £ E-t h en eo to
OxI-hx» w tncentnw x; eucft h in 0) e e
rH CU >, H H ft C-PCUCU G
cn eueuH £ ££ a) en u u o w wtjiw u w< -p -h tn tn > tn tn -h -h to a -h tu en tn e tn h cu eu to C (U -H H H ·η H C — H r-H -H -H xl
H -H XJ -H O G G O
o Ό x; C X ή -h ft -p -H '— t— ΓΟ ΓΟ ·Η -H ·Η -rt y q -- h h h -H e tn r—i e CU tnOCN ΟΊ ΓΟ·<3· rH <U >h xl
> (0 Xi i—I M-t £ ί>Η CO
rH o -h £ o tn r- CU XI tn tO H (0 ro . -H H -P H ^ <- ft O >1 -P z E rH h eu as
o -H to X CU -P
Xi Ό -H
x; -rl r- CN II II II II rH
3 £ T- o HT CN O
rH enr- ro σι ro H H U
3 tOK CQ r- OS OH H -P
(0 rH W U WCQ £££<!)·
Eh ft ft ft ftft «3 U W Eh W
7 77056 4) Transformaatio
Transformaatiokokeissa käytettiin resipienttikantoi-na E. coli AB259:ää (9) ja Str. lactis MG1614:ta (3). AB259 oli saatu The Public Health Research Institute of the City 5 of New York Incrstä ja MG1614 The National Institute for
Research in Dairying -tutkimuslaitoksesta (Reading, Englanti) . Kummassakaan kannassa ei ennestään ole omia plasmideja.
E. coli -transformaatiossa käytettiin Mandelin ja Higan standardimenetelmää Maniatis ym:n mukaan (8). Selek-10 tioalustat sisälsivät ampisilliinia (50 yug/ml) sekä joko kloramfenikolia (5 yug/ml) tai erytromysiiniä (50 yug/ml) .
Str. lactis -transformaatiot suoritettiin v. Wright ym:n (15) kuvaamalla tavalla. Selektioon käytettiin joko kloramfenikolia (5 yug/ml) tai erytromysiiniä (2,5 yug/ml).
15 Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla.
Esimerkki 1
Antibioottiresistenssigeenien kloonaus Str, lactis plasmideihin ja vektori pVS2:n kokoaminen 20 Työn eri vaiheita on esitetty kuviossa.
Plasmidista pGB301 liitettiin n. 5 kb:n suuruinen kloramfenikoliresistenssigeenin sisältävä fragmentti E. coli vektorin pBR322 Clal-kohtaan. Tuloksena oli n. 8,3 kb:n plasmidi pVC5.
25 Plasmidi pVC5 kaksoiddigestoitiin Clal ja Hpall ent syymeillä. Saatu n. 3,8 kb:n kloramfenikoliresistenssigee-nin sisältävä fragmentti liitettiin Clal-digestjolla pSH71:stä saatuun 1,7 kb:n fragmenttiin ja saatu rekombi-nanttiplasmidi transformoitiin Str. lactikseen. Saadulle 30 5,5 kb:n plasmidille annettiin nimeksi pVSl.
Erytromysiiniresistenssigeeni eristettiin pE194:stä pilkkomalla kyseinen plasmidi Clal-Hpall kaksoisdigestiolla ja liittämällä saatu n. 1,2 kb:n fragmentti pBR322:n Clal-kohtaan. Saatu plasmidi nimettiin pVC6:ksi.
35 Lopuksi pVSl digestoitiin entsyymeillä Clal ja Bell ja pVC6 vastaavasti entsyymeillä Clal ja BamHI. Saatu pVC6:n s 77056 n. 1,6 kb:n Cläl-BamHI-fraqmentti, joka sisältää erytro-mysiiniresistenssialueen, liitettiin pVS1:n replikaatio-geenit ja kloramfenikoliresistenssigeenin sisältävään 3,3 kb:n fragmenttiin. Saadulla hybridiplasmidilla transformoi-5 tiin Str. lactis. Tuloksena oli n. 5,0 kb:n kloramfenikoli-erytromysiini-kaksoisresistenssiplasmidi pVS2.
Esimerkki 2
Vektori pVS2:n siirto eri isäntäbakteereihin
Transformaatio E. coliln suoritettiin standardimene- 10 telmin käyttäen selektioon erytromysiini-kloramfenikolimal-joja.
Transformaatiossa B. subtilikseen käytettiin resipient-teinä kompetentteja BD170-kannan soluja (saatu The Public Health Research Institute of the City of New York Inc:stä).
15 Selektioon käytettiin kloramfenikolia (5 μg/ml).
Sekä E. coli että B. subtilis transformoituivat hyvin plasmidilla pVS2, ja kumpikin plasmidin resistenssigeeneistä ekspressoitui näissä isännissä.
Esimerkki 3 20 Str. lactis plasmidin pLP7l2 laktoosinhajotusgee- nien kloonaus
Kloonausta varten pVS2 digestoitiin Bell:llä ja Str. lactis laktoosinhajotusplasmidi pLP712 (3) Bglll:11a. Saadut B£lII-fragmentit "shot gun" kloonattiin pVS2:n Bell-kohtaan.
25 Saadut kloramfenikoliresistentit, mutta erytromysiinisensi-tiiviset, transformantit testattiin laktoosinhajotuskyvyn suhteen. Kaikki laktoosipositiiviset transformantit sisälsivät n. 20 kb:n kokoisen plasmidin. Tämän mukaan laktoosinha jotusgeenit plasmidissa pLP712 sijaitsevat n. 15 kb Bglll 30 fragmentissa B. Tämä sopii hyvin plasmidista julkaistuun alustavaan restriktiokarttaan (3).
Esimerkki 4
Staph, aureus termonukleaasigeenin kloonaus E. coliin ja Str. lactikseen 35 Staph, aureuksen termonukleaasigeenin sisältävä E. coli plasmidi pFOG301 (11) digestoitiin Hpall-entsyymillä.
9 77056 ja saatu n. 1,4 kb termonukleaasigeenin sisältävä fragmentti "shot gun" kloonattiin pVS2:n Clal-kohtaan. Ligaatio-seoksella transformoitiin E, coli, ja transformantit poimittiin erytromysiini-kloramfenikoli-kaksoisdigestiolla.
5 Saadut transformantit testattiin termonukleaasiaktiivisuu- den suhteen. Kahdesta positiivisesta transformantista eristettiin DNA, ja saaduilla plasmideilla (molemmat n. 6,5 kb) transformoitiin Str. lactis. Termonukleaasiaktiivisuus todettiin kaikissa tuloksessa saaduissa transformanteissa.
10 Esimerkki 5
Isäntäspektri
Uusina koeisäntinä N-ryhmän streptokokkien joukosta käytettiin Streptococcus cremoris SSC179 ja Str. lactis subsp diacetylactis SSD194 kantoja. Plasmidi pVS2 siirret-15 tiin kyseisiin kantoihin protoplastitransformaation avulla käyttäen samoja menetelmiä kuin Str. lactis MGl614-kannalle. Selektioon käytettiin kloramfenikoliresistenssiä. Transfor-maatiofrekvenssit olivat alhaiset ( 100/ug DNA SSDl94-kan-nalla, 10 ug/DNA SSCl79-kannalla). Kaikki transformantit 20 olivat erytromysiiniresistenttejä, ja pVS2:ta kooltaan vastaava uusi plasmidi pystyttiin osoittamaan elektroforeetti-sesti sattumanvaraisesti valikoiduista transformanteista.
.:: Esimerkki 6 "Forced cloning" erytromysiiniresistenssialueella 25 Plasmidi pVS2 digestoitiin restriktioentsyymeillä
Clal ja Bell. Vastaavasti viilihapatekannasta peräisin oleva limanmuodostusplasmidi pVS2 kaksoisdigestoitiin entsyymeillä Clal ja Bglll. DNA:t sekoitettiin 1:3 ja ligoitiin. Ligaatioseoksella transformoitiin S. lactis MG1614. Selek-30 tio perustui kloramfenikoliresistenssiin. Transformantit testattiin myös erytromysiiniresistenssin suhteen. Kaksi kloramfenikoliresistenttiä-erytromysiinisensitiivistä transformanttia valittiin jatkotutkimuksiin. Toinen sisälsi n. 7,2 kb plasmidin ja toinen n. 10,5 kb plasmidin.
35 Restriktiokokein voitiin osoittaa kummankin sisältävän in-sertoitunutta DNA:ta plasmidi pVS2:n Clal ja Bell tunnis-tuskohtien välisellä alueella.
10 77056
Esimerkki 7
Kloramfenikoliresistenssigeenin inaktivaatio inser-tiolla BstEII-kohtaan
Plasmidi pVS2 digestoitiin restriktioentsyymeillä 5 HpuII (tunnistuskohdat kloramfenikoliresistenssialueen ul kopuolella) ja Bstll (tunnistuskohta kloramfenikoliresis-tenssialueen sisällä). Streptococcus lactis SSLl35-kannan kromosomaalista DNA:ta digestoitiin vastaavasti entsyymeillä Clal ja BstEII (kaksoisdigestiot, koska BstEII on suh-10 teellisen harvinainen restriktiokohta). DNA:t sekoitettiin 1:3 ja ligoitiin. Ligaatioseoksella transformoitiin E. coli selektion perustuessa erytromysiiniresistenssiin. Saadut transformantit testattiin myös kloramfenikoliresistenssin suhteen. Kuusi erytromysiiniresistenttiä kloramfenikoli-15 sensitiivistä transformanttia valittiin jatkotutkimuksiin.
Kukin sisälsi insertin pVS2 plasmidin Hpall ja BstEII kohtien välisellä alueella. Inserttien koot vaihtelivat välillä 0,6 - 5,0 kb.
Kirjallisuusviitteet 20 1. Behnke, D. ja Gilmore, M.S. (1981) Location of antibiotic resistance determinants, copy control and replication functions of the double selective streptococcal cloning vector pGB301. Mol. Gen. Genet. 184, 115-120.
2. Birnboim, H.C. (1983) A rapid alkaline extraction 25 method for the isolation of plasmid DNA. In Wu, R., Grossman, L., and Moldave, K. (editors) Methods in Enzymology 100, 243-255, Academic Press Inc., New York.
3. Gasson, M.J. (1983) Plasmid complements of Streptococcus lactis NCD0712 and other lactic streptococci 30 after protoplast induced curing. J. Bacteriol. 154, 1-9.
4. Gasson, M.J. ja Anderson, P.H. (1985) High copy number plasmid vectors for use in lactic streptococci, FEMS Microbiol. Lett. 30, 193-196.
5. Guerry, P., Le Blanc, D.J. ja Falkow, S. (1973) 35 General method for isolation of plasmid deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol. 116, 1064-1066.
77056 11 6. Kok, J., van der Vossen, J.M.B.M. ja Venema, G. (1984) Construction of plasmid cloning vector for lactic streptococci which also replicate in Bacillus subtilis and Escherichia coli. Appi. Environ. Microbiol. £8, 726-731.
5 7. Kok, J., von Dijl, J.M., van der Vossen, J.M.B.M.
ja Venema, G. (1985) Cloning and expression of a Streptococcus cremoris proteinase in Bacillus subtilis and Streptococcus lactis. Appi. Environ. Microbiol. 50, 94-101.
8. Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J.
10 (1982) Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory.
9. Marinus, M.G.(1973) Location of DNA methylation genes of the Escherichia coli K-12 genetic map. Mol. Gen. Genet. 127, 47-55.
15 10. McKay, L.L. (1983) Functional properties of plas mids in lactic streptococci. Antoine van Leeuwenhoek 49, 259-274.
11. Shortle, D. (1983) A genetic system for analysis of staphylococcal nuclease. Gene 22, 181-189.
.. . 20 12. Sutcliffe, J.G. (1978) pBR322 restriction map marked from the DNA requence: Accurate DNA size markers up to 4361 nucleotide pairs long. Nucleic Acids Res. 5, 2721.
13. Terzaghi, B.E. ja Sandine, W.E. (1975) Improved .’·! medium for lactic streptococci and their bacteriophages.
25 Appi. Microbiol. 29_, 807-813.
- - 14. Weisblum, B., Graham, M.Y. ja Dubnau, D. (1979)
Plasmid copy number control: Isolation and characterization of high copy-number mutants of plasmid pE194. J. Bacteriol. 137, 635-643.
30 15. von Wright, A., Taimisto, A.-M. ja Sivelä, S.
- (1985) Effect of Ca2+ ions on the plasmid transformation of Streptococcus lactis protoplasts. Appi. Environ. Microbiol. 50, 1100-1102.
Claims (3)
1. Kloonausvektori, jonka avulla voidaan siirtää vierasta DNA:ta N-ryhmän streptokokkeihin, Escherichia 5 coliin ja Bacillus subtilikseen, tunnettu siitä, että vektorin kantaosa on Streptococcus lactis plasmidin pSH71 1,7 kb:n kokoinen Clal-fraqmentti, johon on liitetty erytromysiiniresistenssigeeni Staphylococcus aureus plas-midista pEl94 ja kloramfenikoliresistenssigeeni Strepto-10 coccus sanguis plasmidista pGB301, ja näiden väliin plasmi-dista pBR322 peräisin oleva 0,35 kb:n Clal-BamHI-fragment-ti, jolloin kloonausvektorin koko on 5,0 kb, ja se sisältää järjestyksessä seuraavat restriktioentsyymien leikkaus-kohdat: Clal, Bell, Hindlll, kaksi 9 emäsparin toisistaan 15 erottamaa Hpall-kohtaa ja BstEII-kohdan siten, että Bell inaktivoi erytromysiiniresistenssigeenin, ja että erytromysiiniresistenssigeeni sijaitsee restriktioentsyymien Clal ja Hindlll leikkauskohtien välissä, ja jolloin vektori sisältää kaksi antibioottiresistenssigeeniä, joista kumpikin 20 inaktivoituu yhdellä, mutta toisiinsa verrattuna erilaisella restriktioentsyymillä, joiden leikkauskohdat yhdessä resistenssigeenien ulkopuolisten restriktioentsyymien leikkauskohtien kanssa mahdollistavat "forced cloning"-mene-telmän käytön, ja jolloin vieras DNA näihin kohtiin liit-25 tyneenä saadaan ekspressoitumaan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kloonausvektori, tunnettu siitä, että mihin tahansa vektorissa olevaan restriktioentsyymileikkauskohtaan on liitetty vierasta DNA:ta.
3. Streptococcus lactis VS 135, DSM 3749.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI862683A FI77056C (fi) | 1986-06-24 | 1986-06-24 | Vektorplasmid som laempar sig foer syrningsmedel, speciellt foer mejerisyrningsmedel. |
| DE8787108790T DE3783812T2 (de) | 1986-06-24 | 1987-06-19 | Fuer saeuerungsmittel geeignetes vektorplasmid, insbesondere fuer molkereisaeuerungsmittel. |
| EP19870108790 EP0251064B1 (en) | 1986-06-24 | 1987-06-19 | A vector plasmid suited for souring agents, dairy souring agents in particular |
| JP62157462A JPS63109784A (ja) | 1986-06-24 | 1987-06-24 | 酸味剤、特に、乳製品酸味剤に適したベクタ−プラスミド |
| US07/065,882 US4977088A (en) | 1986-06-24 | 1987-06-24 | Vector plasmid suited for souring agents, dairy souring agents in particular |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI862683A FI77056C (fi) | 1986-06-24 | 1986-06-24 | Vektorplasmid som laempar sig foer syrningsmedel, speciellt foer mejerisyrningsmedel. |
| FI862683 | 1986-06-24 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI862683A0 FI862683A0 (fi) | 1986-06-24 |
| FI862683A7 FI862683A7 (fi) | 1987-12-25 |
| FI77056B FI77056B (fi) | 1988-09-30 |
| FI77056C true FI77056C (fi) | 1989-01-10 |
Family
ID=8522836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI862683A FI77056C (fi) | 1986-06-24 | 1986-06-24 | Vektorplasmid som laempar sig foer syrningsmedel, speciellt foer mejerisyrningsmedel. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4977088A (fi) |
| EP (1) | EP0251064B1 (fi) |
| JP (1) | JPS63109784A (fi) |
| DE (1) | DE3783812T2 (fi) |
| FI (1) | FI77056C (fi) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5827552A (en) * | 1988-11-22 | 1998-10-27 | Gist-Brocades B.V. | Production of fermented food products |
| US5639648A (en) * | 1988-11-21 | 1997-06-17 | Genencor International, Inc. | Production of fermented food |
| WO1991009131A1 (en) * | 1989-12-20 | 1991-06-27 | Valio Finnish Cooperative Dairies Association | Cloning vector for use in lactic acid bacteria |
| EP0487159A1 (en) * | 1990-11-23 | 1992-05-27 | Unilever N.V. | A food-grade vector suitable for transforming a food-grade host cell, use of said vector for transforming food-grade host cells, and use of said transformed cells in biotransformation processes |
| FR2798669B1 (fr) * | 1999-09-17 | 2004-02-20 | Agronomique Inst Nat Rech | Souche de lactobacillus delbrueckii et son utilisation pour le criblage de plasmides |
| EP1634948A1 (en) | 2004-09-10 | 2006-03-15 | Basf Aktiengesellschaft | Means and methods for preventing and/or treating caries |
| EP2133414A1 (en) | 2008-06-11 | 2009-12-16 | Basf Se | Uses and methods for preventing and /or treating oral malodour |
| JP2014508136A (ja) | 2011-01-24 | 2014-04-03 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 口腔衛生を向上させる組成物 |
| ES2710435T3 (es) | 2013-03-13 | 2019-04-25 | Novozymes As | Nuevas cepas de Lactobacillus y sus usos |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2048894A (en) * | 1979-05-11 | 1980-12-17 | Gist Brocades Nv | Plasmid |
-
1986
- 1986-06-24 FI FI862683A patent/FI77056C/fi not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-06-19 DE DE8787108790T patent/DE3783812T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-19 EP EP19870108790 patent/EP0251064B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-24 US US07/065,882 patent/US4977088A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-24 JP JP62157462A patent/JPS63109784A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI77056B (fi) | 1988-09-30 |
| DE3783812D1 (de) | 1993-03-11 |
| US4977088A (en) | 1990-12-11 |
| EP0251064A1 (en) | 1988-01-07 |
| FI862683A7 (fi) | 1987-12-25 |
| JPS63109784A (ja) | 1988-05-14 |
| FI862683A0 (fi) | 1986-06-24 |
| DE3783812T2 (de) | 1993-06-03 |
| EP0251064B1 (en) | 1993-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rauch et al. | Characterization of the novel nisin-sucrose conjugative transposon Tn5276 and its insertion in Lactococcus lactis | |
| Maguin et al. | Efficient insertional mutagenesis in lactococci and other gram-positive bacteria | |
| Podbielski et al. | Novel series of plasmid vectors for gene inactivation and expression analysis in group A streptococci (GAS) | |
| De Vos et al. | Structure and expression of the Lactococcus lactis gene for phospho-β-galactosidase (lacG) in Escherichia coli and L. lactis | |
| Somkuti et al. | Distribution and analysis of plasmids in Streptococcus thermophilus | |
| Von Wright et al. | Isolation of a replication region of a large lactococcal plasmid and use in cloning of a nisin resistance determinant | |
| Le Loir et al. | Direct screening of recombinants in gram-positive bacteria using the secreted staphylococcal nuclease as a reporter | |
| Smith et al. | Physical and functional characterization of the Bacillus subtilis spoIIM gene | |
| FI77056C (fi) | Vektorplasmid som laempar sig foer syrningsmedel, speciellt foer mejerisyrningsmedel. | |
| Wood et al. | Genetics of lactic acid bacteria | |
| EP0529088B1 (en) | NOVEL PLASMID pBUL1 DERIVED FROM LACTOBACILLUS AND DERIVATIVE THEREOF | |
| Perez-Martinez et al. | Protein export elements from Lactococcus lactis | |
| EP0677110B2 (en) | Recombinant lactic acid bacterium containing an inserted promoter | |
| Klessen et al. | Complete secretion of activable bovine prochymosin by genetically engineered L forms of Proteus mirabilis | |
| WO1985003945A1 (en) | Recombinant plasmids; bacteria containing such recombinant plasmids; process for preparing fermented food products, animal feedstuffs, ingredients thereof or proteins using such bacteria | |
| van der Vossen et al. | Production of acidocin B, a bacteriocin of Lactobacillus acidophilus M46 is a plasmid-encoded trait: plasmid curing, genetic marking by in vivo plasmid integration, and gene transfer | |
| Pedersen et al. | Genetic analysis of the minimal replicon of the Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis citrate plasmid | |
| Simons et al. | Integration and gene replacement in the Lactococcus lactis lac operon: induction of a cryptic phospho-beta-glucosidase in LacG-deficient strains | |
| De Oliveira et al. | Genetic analysis of the bacteriocin‐encoding plasmids pRJ6 and pRJ9 of Staphylococcus aureus by transposon mutagenesis and cloning of genes involved in bacteriocin production | |
| US5939317A (en) | Use of a Sec-dependent secretion system for secreting proteins that are usually secreted by a Sec-independent secretion system, bacteria containing it and their use | |
| IE59562B1 (en) | Method for preparing proteins using transformed lactic acid bacteria | |
| Teuber | Strategies for genetic modification of lactococci | |
| WO1994006917A1 (en) | Production of desired proteins or polypeptides by culturing a transformed lactic acid bacterium | |
| AU638042B2 (en) | Modified proteases and their use in foodstuffs | |
| EP0380823B1 (en) | Genetically manipulated lactic acid bacteria and their use in the manufacture of cheese, as well as recombinant plasmids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: VALIO MEIJERIEN KESKUOSUUSLIIKE |
|
| MA | Patent expired |