Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie,
genauer der Gentechnik. Insbesondere betrifft die
Erfindung die Clonierung des Gens für β-Galactosidase aus
einer Streptomyces-Art in geeignete Vektoren, die
Expression eines solchen clonierten Gens in anderen
Streptomyces-Arten, das Verfahren zum Nachweis und zur
Identifizierung eines solchen Gens durch Überwachen der in
das Wachstumsmedium ausgeschiedenen β-Galactosidase und
die Verwendung eines solchen clonierten Gens für
verschiedene gentechnische Zwecke.
Hintergrundinformation
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Obwohl die Actinomyceten mehr als die Hälfte der bekannten
Antibiotika mit wertvollen klinischen und sonstigen
Anwendungen als Sekundärmetaboliten produzieren, und so
als Hauptziel gentechnischer Manipulationen erkannt sind,
müssen viele Probleme gelöst werden, bevor spezifische
nützliche Gene erfolgreich identifiziert und cloniert
werden ("Molecular Breeding and Genetics of Applied
Microorganisms", Hrsg. Sakaguchi und Okanishi, Academic
Press (New York) Kodansha Ltd. (Tokyo) 1980, S. 130-131).
Bis zur vorliegenden Erfindung wurde die Clonierung eines
β-Galactosidasegens aus einer Streptomyces-Art in einen
geeigneten Vektor mit anschließender Einführung und
Expression eines solchen Vektors nicht beschrieben.
Die früheren Arbeiten betrafen die Entwicklung anderer
Clonierungssysteme oder Vektoren für Streptomyceten (Bibb
et al., Nature 274 (1978), 398-400; Hayakawa et al., J.
Antibiot. XXXII(12) (1979), 1348-1350; Okanishi et al., J.
Antibiot. XXXIII(1) (1980), 88-91; Bibb et al., Nature
284 (1980), 526-531; Thompson et al., Nature 286 (1980),
525-527; Suarez at al., Nature 286 (1980), 527-529; Bibb
et al., Mol. Gen. Genet. 184 (1981), 230-240; Bibb,
"Microbiology-1981", Schlessinger, Hrsg., American Society
for Microbiology (Washington D.C.), (1981), 367-370 und
Hopwood et al., "Microbiology-1981" (1981), a.a.O., 376-
379), die Clonierung und Expression von Genen, die aus
Eschericha coli stammen, in Streptomyces-Arten (Schottel
et al., J. Bacteriol. 146 (1981), 360-368) und die
Clonierung von Genen aus Streptomyceten in Escherichia
coli ("Molecular Breeding and Genetics of Applied
Microorganisms", a.a.O., 130-137). Chater et al., Current
Topics in Microbiol. and Immunol. 96 (1982), 69-95 gaben
einen Überblick über das Clonieren von Genen in
Streptomyces. Auf diese Druckschrift wird hiermit Bezug
genommen, als wäre sie vollständig beschrieben.
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Die Arbeit mit verschiedenen β-Galactosidasegenen, ihre
Expression und die Anwendung dieser Expression als Test-
oder Nachweisverfahren wurde von Rose et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78(4) (1981), 2460-2464, bezüglich der
Expression von Hefegenen, fusioniert mit
β-Galactosidasegenen aus Escherichia coli in Hefe, von Casadaban et al.,
J. Mol. Biol. 138 (1980), 179-207, bezüglich der Fusion
von β-Galactosidasegenen mit Promotoren in Escherichia
coli und eines Tests nach der Transformation, und von
Talmadge et al., Nature 294 (1981), 176-178, bezüglich der
Konstruktion von Escherichia coli, enthaltend ein Plasid,
das ein β-Galactosidase-Preproinsulin-Fusionsprotein
codiert, beschrieben.
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Collinge et al., US-A-3,816,259, beschreiben, daß ein
Streptomyces coelicolor-Präparat β-Galactosidase-Aktivität
besaß.
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Im allgemeinen kann die Aktivität von Promotoren durch
Messen der Menge des Genprodukts getestet werden, das als
Folge der Transkription ausgehend von einem bestimmten
Promotor gebildet wird. Die Menge des gebildeten
Genprodukts wird unter Verwendung einer spezifischen
Eigenschaft dieses Genprodukts, beispielsweise der
enzymatischen Aktivität, bestimmt. Bei der Untersuchung der
Genexpression oder der Konstruktion von Vektoren mit hoher
Expression, die auf sehr effizienten Promotoren beruht,
wird das Gen, das natürlicherweise von einem derartigen
Promotor aus exprimiert wird, durch das Strukturgen
ersetzt, dessen Produkt leichter gemessen werden kann. Das
lacZ-Gen aus Escherichia coli (Casadaban et al. (1980),
a.a.O.) wird zu diesem Zweck häufig verwendet.
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Eine Vielzahl chromogener Substrate wie 5-Brom-4-chlor-
3-indolyl-β-D-galactosidase (als "X-gal" bezeichnet) oder
o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (als "ONPG" bezeichnet) kann
verwendet werden, um die enzymatische Aktivität zu messen,
wie von Miller in "Experiments in Molecular Genetics",
Cold Spring Harbor Laboratories (Cold Spring Harbor, New
York) (1972) beschrieben. Diese Substrate sind
vorteilhaft, da die Wirksamkeit eines Promotors, fusioniert mit
einem Gen für ein Enzym, das mit dem Substrat reagieren
kann, wie dem lacZ-Gen, durch Züchten des Organismus auf
einem das Substrat enthaltenden Festagarmedium, und
Beobachten der Enzym-Substrat-Reaktion, überwacht werden
kann. So können gleichzeitig mehrere hundert
Einzelkolonien auf ihre Fähigkeit, das Gen zu exprimieren,
bewertet werden. Damit können relativ seltene Ereignisse,
wie das Auftreten eines sehr effizienten Promotors,
nachgewiesen werden. Die β-Galactosidase-Expression kann
in einem solchen Verfahren für einen Test auf die
Gentranskription und zum Nachweis und zur Isolierung von
Mutanten verwendet werden, die eine Überproduktion eines
besonders gewünschten Proteins zeigen, wie eines Enzyms,
das an der Antibiotikabildung beteiligt ist.
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Um einen solch wirkungsvollen Schritt, wie vorstehend
beschrieben, sinnvoll zu verwenden, ist es von
wesentlicher Bedeutung, daß das gewählte Substrat Gelegenheit
hat, mit dem Enzym zu reagieren. Wenn das Enzym
intrazellulär vorliegt, wie im Fall der von Escherichia coli
gebildeten β-Galactosidase, muß das Substrat in die Zelle
eindringen, damit die Enzym-Substrat-Reaktion ablaufen
kann. Bei Streptomyces lividans gelangen jedoch die
üblicherweise verwendeten Substrate, X-gal und ONPG, nur
schlecht in die Zelle, was durch Vergleich der
intrazellulären β-Galactosidaseaktivität eines geeigneten Organismus
mit der Farbbildung auf Platten bestätigt wurde. Beispiels
weise wurde gefunden, daß keine signifikante Farbreaktion
mit ganzen Zellen und mit entweder OPNG oder X-gal
auftrat, obwohl die intrazelluläre Aktivität, gemessen mit
Zellextrakten und mit ONPG als Substrat, sehr hoch (300
nmol/mg Protein/min) war. Ferner unterscheiden sich die
Actinomyceten von vielen anderen Mikroorganismen durch die
Bildung eines Luftmycels, das die Zellen räumlich vom
Substrat trennt, wodurch der Zugang des Substrats zu den
Zellen weiter beschränkt wird (Kalakoutskii et al.,
Bacteriol. Review 40(2) (1976), 469-524).
Zusammenfassung der Erfindung
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Bestimmte Stämme von Streptomycesarten erzeugen
natürlicherweise eine ausscheidbare β-Galactosidase, die
im folgenden als Streptomyces-β-Galactosidase bezeichnet
wird. Das Enzym ist für den Abbau bestimmter
β-Galactoside, wie Lactose, nützlich und kann als Diagnose- oder
Laborreagenz verwendet werden. Das Enzym ist von natürlich
vorkommenden Verunreinigungen frei, weil es teilweise oder
vollständig gereinigt ist, oder weil es von einem
heterologen Wirt oder nach anderen, nicht-natürlichen Verfahren
erzeugt wird.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein DNA-
Fragment, das den Promotor des Streptomyces-
β-Galactosidasegens, nicht verknüpft mit dem Streptomyces-
β-Galactosidasegen, enthält.
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Andere Aspekte der Erfindung betreffen Vektoren, die diese
Fragmente enthalten, und damit transformierte
Mikroorganismen.
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Alle diese erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind ebenso
wie andere hier beschriebene leicht entsprechend dieser
Erfindung anzuwenden und gelten als weitere Aspekte
derselben Erfindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
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Figur 1 zeigt eine mit einer Endonuclease bestimmte
Restriktionskarte von pSKL-1.
Beschreibung der Erfindung
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Im folgenden werden verschiedene DNA-Fragmente aus
Streptomyces beschrieben, bei denen man fand, daß sie ein
Gen enthalten, das die Expression einer sezernierten
β-Galactosidase verursachen kann. Es ist möglich, daß das
erfindungsgemäße Genprodukt etwas anderes als die
sezernierte β-Galactosidase ist. Beispielsweise kann das
Genprodukt ein regulatorisches Protein sein, das einen
β-Galactosidase-Stoffwechselweg aktiviert. Jedenfalls wird
das Gen hier als Streptomyces-β-Galactosidasegen
bezeichnet, weil die Expression des erfindungsgemäßen
Gens zur Produktion der Streptomyces-β-Galactosidase in
Wirten führt, die normalerweise keine meßbaren Mengen an
β-Galactosidase bilden.
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Es versteht sich, daß Derivate der hier beschriebenen
Fragmente auch zur Expression der
Streptomyces-β-Galactosidase oder eines verwandten Polypeptids, d.h. eines mit
der β-Galactosidaseaktivität, führen können. Solche
Derivate, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung
fallen, schließen beispielsweise Rumpffragmente und
Fragmente ein, die sich durch eine Substitution, ein
Hinzufügen oder eine Deletion einer oder mehrerer
Desoxyribonucleotide, einschließlich vielleicht einer oder
mehrere Restriktionsenzymspaltstellen, unterscheiden,
wobei die Unterschiede die β-Galactosidaseaktivität der
erhaltenen Produkte nicht wesentlich beeinflussen.
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Die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente sind rekombinante
DNA-Moleküle, d.h. einzel- oder doppelsträngige DNA-
Sequenzen, die aus den größeren Molekülen, in denen sie
natürlicherweise vorkommen, wie chromosomaler DNA, oder
aus ihren natürlichen Wirten isoliert wurden, oder die
teilweise oder vollständig synthetisiert wurden, und die
mit anderen DNA-Fragmenten unter Bildung von
Expressionseinheiten oder Clonierungs- oder Expressionsvektoren
verknüpft werden können.
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Die Streptomyces β-Galactosidasegen-Expressionseinheit
wurde ursprünglich auf einer 16 kb Sph I-Region
chromosomaler DNA des S. lividans-Stammes 1326 isoliert.
Die 16 kb Sph I-Region wurde wie folgt kartiert:
Restriktionsenzym
Ort (kb)
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Diese Tabelle wird hier für den weiteren Bezug auf DNA-
Fragmente, die in der Sph I-Region natürlicherweise
vorkommen, verwendet. So wird beispielsweise das 1,0 kb
Bgl II (2,7) - Bgl II (3,7)-Fragment als solches
bezeichnet, unabhängig davon, ob weitere Desoxyribonucleotide
stromaufwärts und/oder stromabwärts davon vorliegen.
Die angegebenen Orte sind ungefähre Angaben. Es können
auch andere Schnittstellen der gleichen oder anderer
Restriktionsenzyme vorhanden sein. Beispielsweise wurde
die Pst I (8,8) - Bam HI (11,6) - Region in der 7 kb Pst I
- Sph I-Region wie folgt weiter kartiert:
Restriktionsenzym
Ort (kb)
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Die gesamte Genexpressionseinheit kann durch Spalten von
chromosomaler DNA mit Sph I oder mit Pst I und Sph I und
Selektion auf das Pst I (8,8) - Sph I (15,5)-Fragment
erhalten werden. Dieses oder andere Fragmente dieser
Region chromosomaler DNA können nach bekannten Techniken
in einen Vektor, beispielsweise einen Phagen oder ein
Plasmid, cloniert werden. Gemäß einer anderen
Ausführungsform kann beispielsweise die Genexpressionseinheit ganz
oder teilweise sequenziert werden und Teile davon kÖnnen
synthetisiert werden. Diese können direkt als
regulatorische oder codierende Sequenzen oder zur
Konstruktion anderer Fragmente, wie Hybridpromotoren oder
hybride codierende Sequenzen, oder zum Absuchen auf
ähnliche Regionen in anderen Organismen nach Standard-
Hybridisierungstechniken verwendet werden.
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Eine Transkriptionsstartstelle wurde etwa 300 Basen
stromaufwärts (5') von der Xmn I (9,9)-Spaltstelle
identifiziert, was auf Ergebnissen einer S1-Kartierung
beruht. Dies scheint die Transkriptionsstartstelle des
Streptomyces β-Galactosidasegens zu sein.
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Eine Promotorregion, einschließlich der
Transkriptionsstartstelle, kann aus der Pst I (8,8) - Xmn I (9,9) -
Region durch Spalten mit Pst I und Xmn I isoliert werden.
Der auf diesem Fragment isolierte Promotor wird als
P3-Promotor bezeichnet. Ein solches Fragment, das den
P3-Promotor trägt, kann von den 3'- und 5'- Enden
herabverdaut werden, um nicht-wesentliche Sequenzen zu
entfernen und ein P3-Fragment mit einer
Translationsstartstelle, einer Shine-Dalgarno-Sequenz und/oder einer
Transkriptionsstartstelle herzustellen. Das Entfernen
einer großen Anzahl von 5'- nicht-codierenden Sequenzen
verringert die Wirksamkeit des Promotors. Für die
Expression heterologer Proteine aus Nicht-Streptomyceten
kann es sich als zweckmäßig erweisen, eine N-terminale
codierende Sequenz aus Streptomyces, beispielsweise den
N-terminalen Teil der codierenden Sequenz für die
Streptomyces-β-Galactosidase, aufzunehmen, wobei diese
Sequenz für den Transport des Proteins zur oder durch die
Membran hindurch nützlich sein kann.
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Die codierende Sequenz für Streptomyces-β-Galactosidase
kann in ähnlicher Weise auf einem Pst I (8,8) - Sph I
(15,5) - Fragment isoliert werden. Die Insertion von
Translationsstoppcodons in die Stu I (12,0)-Spaltstelle
führte zum Verlust der β-Galactosidaseaktivität. Die
Sequenzen nahe dem 5'-Ende der codierenden Region scheinen
an der Sezernierung beteiligt zu sein. Solche Sequenzen
können nach bekannten Verfahren isoliert werden, wie von
Silhavy et al., in US-A-4,336,336 für die Verknüpfung mit
heterologen, d.h. Nicht-Streptomyces-β-Galactosidase,
codierenden Sequenzen für Proteine beschrieben, die
normalerweise nicht sezerniert werden, und in Phase mit
einem Promotor zur Expression eines sezernierten
Fusionsproteins verknüpft sind.
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In einem beispielhaften Verfahren wird der Streptomyces
lividans-Stamm 1326 (National Collection of Industrial
Bacteria, Aberdeen, Schottland, Nummer 11416; Bibb et al.,
Mol. Gen. Genetics 184 (1981), 230-240; Krasilnikov et
al., "The Biology of Certain Groups of Actinomycetes",
Krasilnikov, Hrsg., Science Press (Moskau) 1965, 109-
110), der ein Gen enthält, das β-Galactosidase codiert,
die natürlicherweise in ihrem Ursprungsstamm ausgeschieden
wird, nach Standardtechniken, wie der von Chater et al.,
a.a.O. beschriebenen, gewonnen. Ein DNA-Fragment, das das
Streptomyces-β-Galactosidasegen enthält, wird durch
Behandeln der DNA mit einer Restriktionsendonuclease
isoliert. Wenn die Enzym-Substrat-Reaktion einen schlecht
diffundierbaren Farbstoff ergibt, kann die enzymatische
Aktivität durch die Bildung eines Hofes eines gefärbten
Farbstoffes um eine erzeugende Kolonie auf einer
Agarplatte bei Test nach diesem Verfahren bestimmt werden.
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Das bevorzugte chromogene Substrat ist X-gal, weil das
Produkt ein solcher schlecht diffundierbarer Farbstoff
ist. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens ist so, daß
eine erzeugende Kolonie unter 300 bis 500 Kolonien auf
einer einzelnen Petrischale (90 mm Durchmesser)
identifiziert werden kann.
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Das wie vorstehend beschrieben isolierte Gen, das von
Streptomyces stammt, kann leicht in einer anderen
Streptomycesart, wie Streptomyces griseus, Streptomyces
aureofaciens, Streptomyces fradiae, Streptomyces niveus und
anderen, ebenso wie in anderen Mikroorganismen exprimiert
werden. Geeignete Wirte können nach bekannten
Routineverfahren isoliert ausgewählt werden, bei denen man das
Gen in einem vorgegebenen Wirt cloniert und dann, wie hier
beschrieben, auf β-Galactosidase-Aktivität selektioniert.
Streptomyces lividans, Streptomyces albus und Streptomyces
griseus sind die bevorzugten Wirtsarten.
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Eine Vielzahl von Vektoren ist für diese Erfindung
geeignet, und die Wahl eines vorteilhaften Vektors fällt
in den Entscheidungsbereich eines Fachmanns auf dem
betreffenden Gebiet. Beispiele für geeignete Vektoren sind
die Plasmide pIJ6 (Thompson et al., Nature 286 (1980),
525-527), pIJ101 (Chater et al., a.a.O.) und andere, die
in dem letztendlich gewählten Wirtsstamm replizieren
können und eine leichte Selektion auf die Anwesenheit des
Vektors in einem solchen Stamm gestatten. In ähnlicher
Weise können verschiedene Standard-Nährmedien verwendet
werden. Das Plasmid pIJ6 ist der bevorzugte Vektor.
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Das Einschleusen eines Plasmidvektors, der das gewünschte
DNA-Fragment enthält, in Mikroorganismen kann nach
üblichen Transformationsmethoden erreicht werden, obwohl
andere Verfahren wie Transduktion oder Konjugation mit
geeigneten Wirten angewendet werden können. Solche
Verfahren sind im Stand der Technik beschrieben und
bekannt.
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Die folgenden Beispiele sollen eine ausführliche
Beschreibung der vorliegenden Erfindung und der Art ihrer
Ausführung geben, aber nicht deren Umfang, Anwendbarkeit
oder Nützlichkeit beschränken.
Beispiel 1
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Chromosomale DNA aus dem Streptomyces lividans-Stamm 1326
(Bibb et al., (1981), a.a.O.) wurde unter Verwendung des
von Chater at al., a.a.O., beschriebenen Verfahrens
isoliert. Das aus Streptomyces lividans (Thompson et al.,
(1980), a.a.O.) isolierte Plasmid pIJ6 wurde als
Clonierungsvektor verwendet, da dieses Plasmid das Gen für
Thiostrepton-Resistenz trägt, das als selektiver Marker
zur Selektion auf das Plasmid in einem gegebenen
Thiostrepton-empfindlichen Stamm wie 1326 und dessen Derivaten
nützlich ist. Die Behandlung der chromosomalen DNA und der
pIJ6-DNA mit der Restriktionsendonuclease Sph I oder Pst I
ergab DNA-Fragmente mit einer überstehenden komplementären
3'-DNA-Sequenz. Die pIJ6-DNA wurde zusätzlich mit
alkalischer Phosphatase behandelt, um die Wiederherstellung des
Clonierungsvektors ohne eine zusätzliche DNA-Insertion zu
verhindern. Die durch Sph I und Pst I erzeugten DNAs (5 ug
chromosomale DNA, 1 ug pIJ6-DNA) wurden getrennt bei 16ºC
sieben Tage lang unter Verwendung von Standardverfahren
ligiert. Die ligierten DNAs wurden im wesentlichen nach
dem von Chater et al., a.a.O., beschriebenen Verfahren zur
Transformation verwendet, wobei etwa 2x10&sup7; Protoplasten,
die vom Streptomyces lividans-Stamm 1326-9 stammten, einer
Nitrosoguanidin-induzierten Mutante des Stammes 1326 ohne
jegliche Aktivität einer sezernierten β-Galactosidase
verwendet wurde. Die Protoplasten wurden auf Platten mit
Regenerationsmedium ausgestrichen und 18-24 Stunden bei
28ºC inkubiert. Die Platten wurden mit einem
Weichagargemisch (0,4% Agar in Wasser), das 100 ug/ml Thiostrepton
zur Selektion auf transformierte Nachkommen und 150 ug/ml
X-gal enthielt, überschichtet. Die Platten wurden weitere
2 bis 6 Tage bei 28ºC inkubiert und dann das Auftreten der
charakteristischen blauen Kolonien gezählt.
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Von über 10 000 Thiostrepton-resistenten Kolonien aus der
Sph I-Clonierung färbten sich 9 blau; aus etwa der
gleichen Anzahl an Kolonien aus der Pst I-Clonierung
färbte sich eine blau. Die Plasmid-DNA aller blauen
Kolonien wurde isoliert und analysiert.
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Sowohl die Plasmin-DNA aus der Sph I-Clonierung als auch
aus der Pst I-Clonierung hatte eine gemeinsame, aus dem
Chromosom stammende Region, die zuvor nicht auf dem
Plasmid pIJ6 vorhanden war.
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Zuerst glaubte man auf der Basis der angenommenen pIJ6-
Struktur, daß diese Region das
Streptomyces-β-Galactosidasegen enthielt. Es wurde angenommen, daß die gesamte
Sph I-Insertion nur etwa 10 kb umfaßte. Wie in weiteren
folgenden Beispielen gezeigt, wurde anschließend entdeckt,
daß trotz der Lokalisierung des Gens auf der Sph
I-Insertion
die gemeinsame Region die 7 kb Pst I (8,8) - Sph I
(15,5) - Region ist.
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Ein 32 kb - Plasmid, das aus der Sph I-Clonierung stammte,
wurde als "pSKL-1" bezeichnet. Die Spaltung mit den
Restriktionsendonucleasen wurde nach dem Standardverfahren
durchgeführt. Das Plasmid aus der Pst I-Clonierung wurde
als "pX" bezeichnet. pSKL-1 wird durch die in Figur 1
gezeigte Restriktionskarte wiedergegeben.
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Die aus pSKL-1 isolierte Plasmid-DNA wurde zur
Transformation von Streptomyces lividans 1326-9 verwendet. Über
70% der Thiostrepton-resistenten Nachkommen zeigten die
Aktivität einer sezernierten β-Galactosidase, was das
Vorliegen und die Expression des Gens auf dem Plasmid
anzeigte. Die Enzymmengen der Zellextrakte des mit pSKL-1
transformierten Stammes, Stamm 1326-9/pSKL-1, erhöhten
sich, in einigen Fällen sogar 100fach, was somit die
Anwesenheit des Gens auf dem Plasmid zeigte. Die
Ergebnisse eines Versuches sind in der folgenden Tabelle 1
gezeigt.
Tabelle 1
β-Galactosidaseaktivität (nmol/mg Protein/min)
Kohlenstoffquelle des Wachtumsmediums
Stamm
Glucose
Lactose
Galactose
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Wie in Tabelle 1 angegeben, bildeten einige 1326-9-
Kulturen mehr nicht-sezernierte β-Galactosidase in
Gegenwart von Galactose als einige 1326-Kulturen.
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Transformanten mit dem pSKL-1-Plasmid erzeugten dunklere
blaue Kolonien als die ursprünglichen 1326-Stämme, was die
Nützlichkeit des DNA-Fragments, das das β-Galactosidasegen
eingebaut in Vektoren mit hoher Expression enthielt,
zeigte.
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Die β-Galactosidase-Expression von einem Plasmid aus ist
weniger stabil im Stamm 1326-9 als im Stamm 1326. Dies ist
vermutlich auf die Rekombination mit chromosomaler DNA
zurückzuführen.
Beispiel 2
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Das Plasmid pSKL-1 wurde nach den vorstehend beschriebenen
Verfahren auch in den Streptomyces griseus-Stamm BC6,
ATCC Nr. 10137 transformiert, einen Stamm, der
natürlicherweise keine sezernierte β-Galactosidase besitzt. Die
Nachkommen des Stammes BC6, der pSKL-1 enthielt (Stamm
BC6/pSKL-1), bildeten jedoch die
Streptomyces-β-Galactosidase. pSKL-1 wurde auch in Streptomyces albus
transformiert, der natürlicherweise β-Galactosidase-defizient
ist. Die erhaltenen Transformanten bildeten die
Streptomyces-β-Galactosidase. Diese Ergebnisse zeigen die
Anwendbarkeit und die Nützlichkeit des Streptomyces-
β-Galactosidasepromotors und der codierenden Sequenz in
anderen Streptomyces-Wirten.
Beispiel 3
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Ein als pSKL-4 identifiziertes pSKL-1-Derivat wurde als
spontane Deletion von pSKL-1 isoliert. pSKL-4 umfaßte das
7 kb Pst I - Sph I - Fragment, aber der größte Teil, etwa
8,5 kb, der chromosomalen DNA stromaufwärts von der Pst I
-Spaltstelle, war deletiert. Streptomyces albus, der
natürlicherweise β-Galactosidase-defizient ist, wurde mit
pSKL-4 transformiert. Die erhaltenen Transformanten
bildeten die Streptomyces-β-Galactosidase mit ähnlichen
Ergebnissen, wie mit den pSKL-1-Transformanten im
vorstehenden Beispiel 2 erhalten wurden.
Beispiel 4
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Das Bgl II-Fragment wurde aus pSKL-1 zur Herstellung von
pBB2B deletiert. Das Plasmid pBB2B ist mit Ausnahme der
Deletion des Bgl II-Fragments mit pSKL-1 identisch.
S.lividans 1326 wurde mit pBB2B transformiert und dessen
β-Galactosidaseausscheidung nach 14 und 24 Stunden mit der
eines mit pSKL-1 transformierten 1326-Stammes verglichen.
Es wurden die in der folgenden Tabelle 2 gezeigten
Ergebnisse erhalten.
Tabelle 2
ß-Galactosidaseaktivität (nmol/mg Zellen/min)
(Kohlenstoffquelle: Galactose)
Stamm
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Der Überstand aus der 1326/pSKL-1-Kultur enthielt die
Streptomyces-β-Galactosidase, wie durch die Aktivität und
Protein-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gezeigt wurde. Der
Überstand der 1326/pBB2B-Kultur zeigte diese Eigenschaft
nicht.
Beispiel 5
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Um das Ausschleusen eines Proteins, das normalerweise
nicht sezerniert wird, zu zeigen, wurde die lacZ-
codierende Sequenz von E. coli (Casadaban et al., J. Mol.
Biol. 138 (1980), 179) mittels eines BamHI-Linkers mit der
Xmn I-Spaltstelle in der 7 kb Pst I -Sph I-Region in Phase
verknüpft, um das Plasmid p3SSx8lacZ herzustellen, und ein
β-Galactosidase-negativer S. lividans 1326-Stamm damit
transformiert. Die β-Galactosidase-Aktivität in den
Kulturüberständen und in den Zellextrakten dieser
Transformanten wurde mit der β-Galactosidaseaktivität aus
dem gleichen Stamm, der mit einem das Streptomyces -
β-Galactosidasegen enthaltenden Plasmid (pBST13), mit
einem das E. coli lacZ-Gen enthaltenden Plasmid (keine
Signalsequenz) (pDSK) und mit einer Kontrolle (kein
Plasmid) transformiert war, verglichen. Die Zellen wurden
in Glucose 24 Stunden lang und dann in Galactose 30
Stunden lang gezüchtet. Die folgenden Ergebnisse wurden
erhalten:
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p3SSx8lacZ 371 598
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pBST 13 1543 631
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pDSK 13 60
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Kontrolle 6,7 13,3
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Die Streptomyces lividans Stämme 1326 und 1326-9 und ein
Stamm, der pIJ6 enthält, sind der Öffentlichkeit aus
verschiedenen Quellen zugänglich. Um die Verfügbarkeit weiter
zu gewährleisten, wurden diese Stämme bei der Agricultural
Research Culture Collection in Peoria, Illinois, am 1.
Juni 1982 ohne Beschränkungen bezüglich der Verfügbarkeit
hinterlegt. Sie erhielten die Hinterlegungsnummern 15091,
15090 beziehungsweise 15092.
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Während die obige Beschreibung der näheren Erläuterung der
Erfindung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen dient,
ist die Erfindung nicht auf die genauen, beispielhaft hier
erläuterten Ausführungsformen festgelegt, sondern umfaßt
vielmehr alle Modifikationen davon, die unter den
Schutzumfang der folgenden Patentansprüche fallen.
Insbesondere ist die Erfindung nicht auf Fragmente mit den
beispielhaft gezeigten
Restriktionsendonucleasespaltstellen oder DNA-Sequenzen beschränkt, insofern als solche
Spaltstellen und Sequenzen variieren oder variiert werden
können, ohne die Erfindung im Wesen zu beeinträchtigen.