DE69428854T2

DE69428854T2 - Bacteriocine aus Streptococcus thermophilus

Info

Publication number: DE69428854T2
Application number: DE69428854T
Authority: DE
Inventors: Jacques Edouard Germond; Olivier Marciset; Beat Mollet
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-08-19
Publication date: 2002-04-11
Anticipated expiration: 2014-08-20
Also published as: FI952080A0; EP0643136B1; ZA946620B; MX194616B; PH31943A; BR9405576A; NZ273567A; CZ113995A3; ES2165860T3; HUT72547A; RU95109910A; KR0183187B1; WO1995006736A1; CA2148223C; KR950704499A; CA2148223A1; MY113279A; PL308541A1; CN1114112A; US5683890A

Description

Die Erfindung betrifft zwei Bakteriocine aus Streptococcus (S.) thermophilus, einen diese Baceriocine produzierenden Stamm von S. thermophilus, ein Verfahren zur Herstellung dieser Bakteriocine aus diesem Stamm sowie Verwendungen dieser Bakteriocine und/oder dieses Stamms bei der Herstellung von Nahrungsmitteln oder Kosmetika.

Stand der Technik

Ein Bakteriocin ist eine antibakterielle Substanz oder ein Wirkstoff gegen Bakterien, der einen Proteinteil besitzt, der an der antibakteriellen oder antibiotischen Wirkung beteiligt ist. Ein Bakteriocin besitzt im allgemeinen ein enges Wirkungs- oder Hemmungsspektrum, das häufig auf Arten beschränkt ist, die mit der es produzierenden Bakterienart verwandt sind.
Gegenwärtig sind vier Bakteriocine aus S. thermophilus bekannt.
Das erste weist insbesondere eine Molekulargewicht von 10 bis 20 kD auf, eine Thermolabilität bei 90ºC und eine Pepsinempfindlichkeit (Smazny et al., Deutsche Molkerei-Zeitung, 105: 15, 460-464, 1984).
Das zweite, das mit seinem Bakterienhemmungsspektrum in EP 443543 beschrieben wird, besitzt insbesondere die Fähigkeit, das Wachstum von Bakterien der Gattung Staphylokokke und Pseudomonas zu hemmen, und die Unfähigkeit, das Wachstum von Bakterien der Gattung Lactokokken und Enterokokken und der Art Bacillus cereus zu hemmen.
Das dritte, das von Pulusani et al. beschrieben wird (J. of Food Science, 44: 2, 575-578, 1979), hemmt Pseudomonas stark, ist nicht gegenüber Pepsin empfindlich und enthält Zuckerrückstände.
Das vierte schließlich, das von Cilano et al. beschrieben wird (Microbiologie-Nutrition, 8, 21-30, 1990), ist nicht gegenüber Pepsin empfindlich, enthält Rückstände von Zuckern und wird von einer Membran mit einer Porosität von 100 kD zurückgehalten.
Nun besitzt S. thermophilus eine große Bedeutung im Nahrungsmittelbereich, da er insbesondere an der Erzeugung von Milchprodukten, wie beispielsweise Joghurt und verschiedenen Käsen, beteiligt ist. Andererseits gibt es sehr wenige Bakteriocine, die gleichzeitig gegen Bacilli, Clostridia und Listeria aktiv sind. Es könnte also sehr zweckmäßig sein, mit anderen Worten, es besteht ein Bedarf danach, über eine breitere Palette von Bakteriocinen zu verfügen, die von Repräsentanten dieser Art erzeugt werden, um insbesondere über ein breiteres antibakterielles Hemmungsspektrum insbesondere im Zusammenhang mit dieser Art von Produkten verfügen zu können.
Ziel der Erfindung ist es, dieses Bedürfnis zu befriedigen.

Zusammenfassung der Erfindung

Einer der Gegenstände der Erfindung ist die Kennzeichnung der Aminosäuresequenz von zwei neuen Bakteriocinen aus S. Thermophilus sowie ihr Signalpeptid, das ihre Exkretion gestattet.
Gegenstand der Erfindung sind ferner die Nukleotidsequenzen, die für diese beiden Bakteriocine kodieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist der im nachstehenden beschriebene Stamm von S. thermophilus CNCM I-1351, der die beiden erfindungsgemäßen Bakteriocine produzieren kann.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren das Verfahren zur Herstellung eines Extrakts von wenigstens einem erfindungsgemäßen Bakteriocin.
Ein letzter Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung der erfindungsgemäßen Bakteriocine und die Verwendung ihrer Nukleotidsequenz sowie ihr Sequenzsignal.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Man hat einen Stamm S. thermophilus CNCM I-1351 aus einem fermentierten Milchprodukt aus der Tschechoslowakei isoliert und mit Überraschung festgestellt, dass er die bemerkenswerte Eigenschaft besitzt, das Wachstum einer breiten Palette von Bakterien zu hemmen. Dieser Stamm wurde am 5.8.93 gemäß dem Budapester Vertrag bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, INSTITUT PASTEUER, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS CEDEX 15, Frankreich, hinterlegt, wo er die Nr. I-1351 erhielt.
Es folgen Einzelheiten dieses Stamms, die insbesondere seine Morphologie, die Fermentation der Zucker und anderes betreffen:

Morphologie

- Ketten bildende Kokken, nicht begeißelt. Keine Bildung von Sporen.
- Grampositive, katalasenegative und fakultativ anaerobe Mikroorganismen.

Fermentation der Zucker:

Erzeugung von Milchsäure aus D-Glucose, Lactose, Saccharose, Raffinose. Keine Milchsäureerzeugung aus Mannose, Fructose, Galactose.

Anderes:

Stamm, der mindestens zwei Bakteriocine, ein Immunitätsprotein für die Bakterocine und Exopolysaccharide mit texturierenden Eigenschaften erzeugt.
Der Kulturüberstand des Stamms CNCM I-1351 besitzt also ein relativ breites antibakterielles Wirkungsspektrum. Von den gegenüber diesem Überstand empfindlichen Bakterien sind beispielsweise zu nennen: Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis biovar diacetylactis, Lactococcus cremoris, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc mesenteroides, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Proprionibacterium, Listeria innocUA, Listeria momocytogenes, Micrococcus varians, und die Sporen und vegetativen Zellen von Clostridium botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium bifermentans, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus und Bacillus cereus (Bacteries lactiques, Band 1, 1994, édition Lorica).
Aus diesem Stamm CNCM I-1351 konnte man zwei Proteinfaktoren, Bakteriocine genannt, isolieren, die für diese antibakterielle Wirkung verantwortlich sind.
Zu diesem Zweck weist das erste erfindungsgemäße Bakteriocin, in der vorliegenden Beschreibung "Thermophilin 1" genannt, die in der nachstehenden Liste der Sequenzen beschriebene Sequenz SEQ ID NO: 1 auf.
Außerdem kann man davon ausgehen, dass dieses Bakteriocin eine antibakterielle Aktivität mit einem breiteren oder spezifischeren Spektrum für eine Bakterienart oder -gattung als das von Thermophilin 1 haben kann, wenn es eine Sequenz aufweist, die sich von der Sequenz SEQ ID NO: 1 beispielsweise durch eine Substitution, eine Deletion und/oder eine Insertion mindestens einer Aminosäure unterscheidet. Es ist nämlich bereits aus EP 521240 bekannt, dass Nisin Z ein interessanteres Spektrum als Nisin A besitzt, während es sich von Nisin A nur durch eine Substitution einer Aminosäure unterscheidet.
Das zweite erfindungsgemäße Bakteriocin, im nachstehenden "Thermophilin 2" genannt, weist die in der nachstehenden Sequenzenliste beschriebene Sequenz SEQ ID NO: 2 auf. Man kann ebenfalls davon ausgehen, dass dieses Bakteriocin eine antibakterielle Aktivität besitzen kann, wenn es eine Sequenz aufweist, die sich von der Sequenz SEQ ID NO: 2 beispielsweise durch eine Substitution, eine Deletion und/oder eine Insertion einer Aminosäure unterscheidet.
Die Nukleotidsequenzen, die für Thermophilin 1 und Thermophilin 2 kodieren, sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung, da sie jeweils dazu verwendet werden können, durch Transformation beispielsweise Bakterien, Hefen oder Pflanzen die Fähigkeit zu verleihen, gewisse Bakterien zu inhibieren. Diese Nukleotidsequenzen können somit infolge der Degeneration des genetischen Kodes relativ variabel sein und können insbesondere in einem Operon des Stamms CNCM I-1351 enthalten sein, der die in der nachstehenden Sequenzenliste beschriebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 3 hat.
Insbesondere kann man die Nukleinsäuresequenz verwenden, die die Nukleotide 221 bis 475 der Sequenz SEQ ID NO: 3 umfasst, die mit ihrem Signalpeptid für das Thermophilin 1 kodiert. Es ist jedoch interessanter, nur die für das Signalpeptid kodierende Sequenz des Nukleotids 221 bis 288 der Sequenz SEQ ID NO: 3 zu verwenden, um sie mit einem Gen von Interesse zu fusionieren, um die Exkretion des durch dieses betreffende Gen kodierten Proteins durch einen Stamm von Streptococcus thermophilus zu gestatten. Ebenso ist es interessanter, nur die für das exkretierte Thermophilin 1 kodierende Sequenz des Nukleotids 289 bis 475 der Sequenz SEQ ID NO: 3 zu benutzen, um sie mit einem Sequenzsignal in einem Expressionsplasmid fusionieren zu können, so dass es beispielsweise in einem anderen Mikroorganismus als S. thermophilus exprimiert wird.
Ebenso kann man die die Nukleotide 495 bis 686 aufweisende Nukleinsäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 3 verwenden, die mit ihrem Signalpeptid für das Thermophilin 2 kodiert. Es ist jedoch interessanter, nur die für das Signalpeptid kodierende Sequenz des Nukleotids 495 bis 557 der Sequenz SEQ ID NO: 3 zu verwenden, um die Exkretion jedes mit diesem Peptid fusionierten Proteins durch einen Stamm von Streptococcus thermophilus zu gestatten. Ebenso ist es interessanter, nur die für das exkretierte Thermophilin 2 kodierende Sequenz des Nukleotids 558 bis 686 der Sequenz SEQ ID NO: 3 zu benutzen, um sie mit einem Sequenzsignal in einem Expressionsplasmid fusionieren zu können, so dass es beispielsweise in einem anderen Mikroorganismus als S. thermophilus exprimiert wird.
Da man festgestellt hat, dass manche andere Stämme von S. thermophilus als der Stamm CNCM I-1351 ein ähnliches Inhibitionsspektrum wie der Stamm CNCM I-1351 und diesem gegenüber eine Resistenz aufweisen (insbesondere die im nachstehenden beschriebenen Stämme Sfi12 und 25), ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Stämme mindestens eines der erfindungsgemäßen Bakteriocine gleichzeitig mit einem diese Resistenz verschaffenden Immunitätsprotein produzieren können.
In dem Verfahren zur Herstellung eines Extrakts, der wenigstens ein erfindungsgemäßes Bakteriocin enthält, kultiviert man einen Stamm von S. thermophilus, der wenigstens eines dieser Bakteriocine produziert, in einem Medium und unter Bedingungen, die für das Wachstum von S. thermophilus günstig sind, bis das Medium 10&sup7; bis 10&sup9; Keime des Stamms pro ml enthält, zentrifugiert die erhaltene Kultur und stellt danach einen Extrakt des Überstands her, der wenigstens eines der genannten Bakteriocine enthält.
Zur Herstellung dieses Extrakts kann also der Stamm von S. thermophilus, der wenigstens eines der erfindungsgemäßen Bakteriocine produziert, insbesondere der Stamm S. thermophilus CNCM I-1351, in einem Medium und unter Bedingungen kultiviert werden, die für das Wachstum von S. thermophilus günstig sind. Man kann ihn insbesondere beispielsweise in einem MSK-Medium (Kuhmagermilch, ergänzt mit Hefeextrakt) oder in einem HJ- Medium (Ultrafiltrationspermeat von Kuhmilch, ergänzt durch Hefeextrakt und Soyton) kultivieren. Man kultiviert ihn vorzugsweise in einem für Streptokokken selektiven Medium wie dem Medium M 17 (beschrieben von P.E. Terzaghi et al., J. Appl. Microbiol., 29, 807-813, 1975), das durch 0,5-2% eines durch S. thermophilus fermentierbaren Zuckers, insbesondere beispielsweise Saccharose, Lactose oder Glucose, ergänzt ist.
Ein derartiges Medium kann hergestellt werden, indem man 95 ml eines Basismediums und 5 ml einer Lösung von 10 g vergärbarem Zucker auf 100 ml Wasser mischt, wobei die Lösung von vergärbarem Zucker und das Basismedium jeweils getrennt während 15 min bei 121ºC sterilisiert wurden und das Basismedium hergestellt wurde, indem die folgenden Bestandteile in 950 ml kochendem Wasser aufgelöst wurden:
- Caseintrypsinhydrolysat 2,5 g
- Fleischpepsinhydrolysat 2,5 g
- Sojapapainhydrolysat 5,0 g
- Hefeextrakt 2,5 g
- Fleischextrakt 5,0 g
- beta-Glycerophosphat 19 g
- Mg-Sulfat 0,25 g
- Ascorbinsäure 0,5 g
Man kann diesen Stamm in diesem für das Wachstum von S. thermophilus günstigen Medium beispielsweise während 2-8 h kultivieren, bis das Medium etwa 10&sup7;-10&sup9; Keime des Stamms pro ml enthält, wobei ein Wert von etwa 10&sup8; Keime/ml einerseits einer bei 600 nm (OD&sub6;&sub0;&sub0;) gemessenen optischen Dichte von etwa 3,6 und andererseits der Konzentration entspricht, die in einer Kuhmilch zu dem Zeitpunkt erreicht wird, zu dem sie unter der Einwirkung der durch den kultivierten Stamm Erzeugten Ansäuerung koaguliert.
Zur Herstellung eines Rohextrakts dieses Überstands kann man jede geeignete Fällungsmethode verwenden, wie beispielsweise eine Fällung mit Trichloressigsäure, ein "salting out" oder eine Fällung mit Lösungsmittel. Zur Herstellung dieses Rohextrakts stellt man vorzugsweise den pH des Überstandes mit H&sub3;PO&sub4; auf 1,0-2,0 ein, scheidet einen Niederschlag ab und führt eine oder mehrere nachfolgende Fällungen mit Hilfe von Trichloressigsäure durch, wobei man nach jeder mir Hilfe von Trifluoressigsäure wieder in wässrige Suspension bringt.
Eine Verwendung der erfindungsgemäßen Bakteriocine und/oder eines diese Bakteriocine erzeugenden Stammes von Streptococcus thermophilus ist bei der Herstellung von Nahrungsmitteln oder Kosmetika vorgesehen.
Insbesondere kann man eine Kultur dieses Stamms von Streptococcus thermophilus als Hefe bei der Herstellung von Käse verwenden, insbesondere von Käse vom Typ Mozarella (um die Löcher zu vermeiden, die durch Bacillus polymixa erzeugt werden, dessen Sporen bei der Fermentation überleben), vom Typ Schweizer Käse (wie Gruyère oder Emmentaler, zur Bekämpfung der Verunreinigung durch Clostridium tyrobutyricum), vom Typ Vacherin (zur Bekämpfung der Verunreinigung durch Listeria monocytogenes) und vom Typ Molkekäse oder bei der Herstellung von Sauermilchprodukten, insbesondere beispielsweise Joghurt oder Pulvermilch für Kindernahrungsmittel-Zusammensetzungen.
Insbesondere kann man diesen Stamm von Streptococcus thermophilus in Kombination mit einem gegenüber dem Thermophilin mäßig empfindlichen Stamm von Lactobacillus bulgaricus (beispielsweise den im nachstehenden beschriebenen Stamm YL5) in Milch kultivieren, um die Nachsäuerung von Joghurt durch L. bulgaricus zu vermeiden.
Man kann diese Bakteriocine auch insbesondere in Form von Rohextrakt oder gereinigtem Extrakt verwenden oder man kann diesen Stamm beispielsweise als Zusatz oder Wirkstoff gegen pathogene Bakterien verwenden, und zwar insbesondere bei der Herstellung von Fleischprodukten wie Pasteten, als Wirkstoff gegen das Wachstum von Sporen von Clostridia, insbesondere Clostridium botulinum, oder bei der Herstellung von Cremes oder Lotionen, als Wirkstoff gegen pathogene Bakterien der Haut oder bei der Herstellung von Produkten für die Mundhygiene, als Wirkstoff gegen pathogene Bakterien der Mundhöhle, insbesondere gegen Streptococcus sobrinus.
Die erfindungsgemäßen Bakteriocine werden im nachstehenden vermittels ihrer verschiedenen mikrobiologischen, biochemischen und genetischen Daten, die ihre Eigenschaften veranschaulichen, genauer gekennzeichnet. Die Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht.

Antibakterielle Aktivitätseinheit - "Agar-Well-Test"

In der vorliegenden Beschreibung wird die antibakterielle Aktivität in willkürlichen Einheiten definiert.
Eine willkürliche Einheit (UA) ist definiert als der Kehrwert des höchsten Verdünnungsgrads, bei dem eine Probe noch eine antibakterielle in dem Test zeigt, der dem Fachmann unter dem Namen "Agar-Well-Test" bekannt ist, ein englischer Ausdruck, der sich auf die im Agar erzeugten Vertiefungen bezieht.
Eine Standardprobe eines Überstands einer Kultur von S. thermophilus gemäß der Erfindung, die bei den in Beispiel 1 beschriebenen Standardbedingungen hergestellt wurde, weist typischerweise eine Aktivität von 32 UA auf einem Volumen von 70 ul auf. Das bedeutet also eine Aktivität von 460 UA/ml.
Ein Standardrohextrakt des Bakteriocins, der aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Kulturüberstand durch eine Klärung und zwei darauffolgende aufeinander folgende Fällungen mit Trichloressigsäure, wobei nach jeder mit Hilfe von Trifluoressigsäure wieder in wässrige Suspension gebracht wird, hergestellt wird, besitzt typischerweise eine Aktivität von etwa 1,4·10&sup5; UA/ml.
Mit diesem Agar-Well-Test bestimmt man, ob eine Probe bei einem gegebenen Verdünnungsgrad noch eine antibakterielle Wirkung zeigt.
Zu diesem Zweck gießt man in eine Petrischale 35 ml Medium M17, dem man 1% Saccharose und 1,5% Agar beigibt.
Man beeimpft 5 ml Medium M17, dem man 1% Saccharose und 0,75% Agar beigibt, mit 5 ul einer während der vorhergehenden Nacht hergestellten Kultur eines Stammes von S. thermophilus, der eine typische Empfindlichkeit gegenüber dem vorliegenden Bakteriocin aufweist (Typindikator), im vorliegenden Fall beispielsweise des Stamms Sfi3.
Man gießt die 5 ml auf die 35 ml und lässt es während 15 min unter laminarer Strömung trocknen. Man stellt auf dem Kulturmedium Löcher mit einem Durchmesser von 5 mm her.
Man gießt die zu testende Probe in diese Löcher, und zwar 70 ul pro Loch. Man inkubiert während 6 h unter Anaerobiose bei 42ºC. Während dieser Inkubation keimt der Typindikatorstamm, und es werden Inhibitionshöfe sichtbar. Der Verdünnungsgrad, bei dem eine Probe keine antibakterielle Aktivität mehr aufweist, ist der Verdünnungsgrad, ab welchem man keinen Inhibitionshof mehr erkennt.

Inaktivierung durch Enzyme

Auf Agar, der auf die oben beschriebene Weise mit dem Typindikatorstamm beimpft wurde, bestimmt man mit Hilfe dieses Agar- Well-Tests, ob die vorliegenden Bakteriocine durch verschiedene Enzyme inaktiviert wurden oder nicht.
Bei allen verwendeten Enzymen, mit Ausnahme von Lipase, gibt man dem 33fach verdünnten Standardrohextrakt in dem vom Enzymlieferanten empfohlenen Puffer 1 ug/ml auf 10 mg/ml Enzym so bei, dass man Proben von 70 ul mit 300 UA erhält. Man lässt das Enzym 30 min bei der vom Lieferanten empfohlenen Temperatur wirken, bevor das Ganze in die Vertiefung des Agar-Well- Tests eingebracht wird.
Bei handelsüblicher Lipase dagegen versetzt man 100 ul einer 200 ug/ml Lipase enthaltenden Lösung zunächst mit einer Mischung von Inhibitoren (EDTA 1,25 M; 0,25% Pepstatin A (p4265 Sigma); 0,25% E-64 (E3132 Sigma); 0,25% A-Protinin (A1153 Sigma)), lässt die Inhibitoren während 45 min bei Raumtemperatur wirken, gibt dann 5 ul (450 UA) verdünnten Standardrohextrakt bei, den man 30 min bei 37ºC reagieren lässt und bringt dann 70 ul der Mischung in die Vertiefung des Agar-Well-Tests ein.
Für die Lösungen werden die folgenden Puffer benutzt:
- pH 2,0: 100 mM mit NaOH eingestellte Maleinsäure
- pH 7,0: 100 mM Phosphatpuffer (K&sub2;HPO&sub4;/KH&sub2;PO&sub4;)
- pH 7,5: 100 mM Phosphatpuffer (K&sub2;HPO&sub4;/KH&sub2;PO&sub4;)
- pH 7,75: 100 mM Tris.Cl.
Man vergleicht den Durchmesser des Inhibitionshofs mit dem Vergleichsdurchmesser des Hofs, der ohne Enzymbeigabe erhalten wird und der bei jedem Puffer und bei jeder Inkubationstemperatur etwa 14 mm beträgt.
Die bei den getesteten Enzymen erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angeführt. In dieser Tabelle wird das Enzym mit seinem Typ, dem Namen des Lieferanten und der Artikelnummer des Lieferanten bezeichnet. Die Inaktivierung des Bakteriocins wird in Abhängigkeit von der Konzentration des beigegebenen Enzyms angegeben. Die Zahl 0 bedeutet, dass kein Hofmehr auftritt, mit anderen Worten, dass die antibakterielle Aktivität des vorliegenden Bakteriocins durch Inkubation mit dem Enzym beeinträchtigt wurde. Die Zahl 14 gibt an, dass noch ein Hof von 14 mm vorliegt, der der vollen antibakteriellen Aktivität des Bakteriocins entspricht. Tabelle I
Alle Proteasen unterdrücken die antibakterielle Aktivität des Überstands, was darauf hinweist, dass ein Proteinteil an dieser Aktivität beteiligt ist.
Die Tatsache, dass kein Einfluss der Katalase auf die antibakterielle Aktivität der Bakteriocine beobachtet wird, zeigt auch, dass die Hemmung des Wachstums des Typindikatorstamms nicht auf die antibakterielle Aktivität von H&sub2;O&sub2; zurückzuführen ist, das für eine der Aktivität der Bakteriocine ähnliche Aktivität bekannt ist, da H&sub2;O&sub2; durch die Katalase hätte abgebaut werden müssen.
Ferner weist die Tatsache, dass man keine Inaktivierung der antibakteriellen Aktivität durch die α-Amylase beobachtet, darauf hin, dass durch die α-Amylase hydrolysierbare Zucker fehlen, die an dieser antibakteriellen Aktivität beteiligt sind.
Außerdem zeigt die Tatsache, dass die Lipase keinen Einfluss auf die antibakterielle Aktivität hat, auch das Fehlen einer an dieser Aktivität beteiligten Lipidfraktion.

Inhibitionsspektrum

Mit Hilfe des Agar-Well-Tests mit Agar, der mit verschiedenen Stämmen von Sporen oder Bakterien beimpft wurde, bestimmt man, ob der Kulturüberstand des Stamms CNCM I-1351, der die beiden erfindungsgemäßen Bakteriocine produziert, eine das Wachstum dieser verschiedenen Bakterien hemmende Aktivität aufweist, mit anderen Worten, man bestimmt ein Inhibitionsspektrum dieses Überstands.
Zu diesem Zweck beobachtet man die Wirkung der Hemmung des Wachstums des getesteten Stamms, die durch eine Überstandsprobe mit einer Aktivität von 300 UA mit pH 7,0 erzeugt wird, im Vergleich zu der Wirkung von normalerweise gleich null derselben Probe, die zuvor durch eine Inkubation bei 37ºC während 30 min in Gegenwart von 5 ug/ml Proteinase K desaktiviert wurde.
Zur Durchführung dieser Versuche verwendet man Gewebekulturplatten FALCON 3046 Multiwell. Man bedeckt 6 ml Medium M17, das außerdem 1% Lactose und 1,5% Agar enthält (Medium M17L), mit 700 ul Medium M17, das außerdem 1% Lactose und 0,6% Agar enthält, das mit 1% einer Kultur des zu testenden Stamms beimpft wurde, die während der vorhergehenden Nacht hergestellt wurde und die bis zu einer DO&sub6;&sub0;&sub0; von 0,1 verdünnt wurde.
Wenn der zu testende Stamm ausgehend von Sporen wachsen soll, beimpft man mit 10&sup5;-10&sup6; Sporen pro ml Bedeckungsmedium.
Wenn der zu testende Stamm nicht ein Lactococcus, ein Streptococcus oder ein Enterococcus ist, ersetzt man das Medium M17 durch ein für das Wachstum der betreffenden Bakterie günstiges Standardmedium, und zwar insbesondere durch das außerdem 2% Glucose enthaltende Medium MRS für Lactobacilli, Pediococci, Leuconostoc und Bifidobacteria (Sanofi Diagnostics Pasteur, Frankreich), durch das Medium RCM für Sporen oder vegetative Zellen von Clostridia (Oxoid, England) und durch das Medium BHI (Difco, USA) für die anderen zu testenden Bakterien.
Man stellt zwei Löcher mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Tiefe von 5 mm pro Platte her. Man bringt in eines der Löcher eine Probe von 70 ul mit 300 UA des vorliegenden Bakteriocins ein und in das andere dieselbe, zuvor desaktivierte Probe. Man inkubiert bei einer für das Wachstum des getesteten Stamms günstigen Temperatur während der Zeit, die erforderlich ist, damit er die Schale mit einem sichtbaren Bakterienrasen bedeckt.
Man kennzeichnet die Wirkung oder den Grad der Hemmung durch den Durchmesser des beobachteten Inhibitionshofs. Die Inhibition wird als sehr stark angesehen (++++), wenn der Hof einen Durchmesser von 16-18 mm besitzt, stark (+++) bei einem Durchmesser von 11,5-15,5 mm, mittel (++) bei einem Durchmesser von 7,5-11 mm, schwach (+) bei einem Durchmesser von 5-7,5 mm und null (-), wenn man keinen Hof beobachtet.
Man testet auf diese Weise mehr als 74 Stämme von Milchsäurebakterien verschiedener Arten und Unterarten und stellt fest, dass etwa nur 7% von ihnen gegenüber dem Überstand resistent sind. Die Einzelheiten des Ergebnisses dieses Tests sind in der nachstehenden Tabelle II angeführt. In dieser Tabelle II, wie in den folgenden Tabellen, ist die Bezeichnung oder angegebene Stammnummer die Nummer, die ihm in der Sammlung Nestlé (Anschrift: NESTEC S.A., Centre de Recherche, Vers-chez-les- Blanc, CH-1000 Lausanne 26, Schweiz) zugeteilt wurde. Die angegebene Temperatur ist die Inkubationstemperatur während des Tests. Tabelle II
Auf dieser Tabelle II stellt man fest, dass das Inhibitionsspektrum des Überstands in sofern eng ist, als bei manchen Arten von Lactobacilli, wie beispielsweise Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis und Lactobacillus bulgaricus, der Inhibitionsgrad heterogen ist. Bei anderen Arten dagegen, wie beispielsweise L. fermentum, L. helveticus und den Lactococci, ist der Inhibitionsgrad homogen.
Dies ist insofern interessant, als innerhalb ein und derselben Art ein Stamm schwer von einem anderen zu unterscheiden ist. Man kann also eine interessante Verwendung des Überstands oder der gereinigten Bakterien für die Unterscheidung von industriellen Stämmen in Betracht ziehen.
Man kann auch die Verwendung eines Stamms, der wenigstens eines der erfindungsgemäßen Bakteriocine produziert, in Kultur mit einem anderen Milchsäurebakterienstamm vorsehen, der gegenüber dem oder den im Medium produzierten Bakteriocinen resistent oder wenig empfindlich ist. Man kann auf diese Weise beispielsweise Joghurts herstellen, die eine geringe Nachsäuerung zeigen.
Ferner stellt man fest, dass der Überstand das Wachstum von sechs Nisin produzierenden Stämmen von L. lactis inhibiert. Dies beweist, dass das vorliegende Bakteriocin nicht Nisin ist. Dies wird dadurch bestätigt, dass das vorliegende Bakteriocin durch 10 ug/ml Trypsin inaktiviert wird (vgl. Tabelle I), was bei Nisin nicht der Fall ist.
Das Inhibitionsspektrum des Überstands einer Kultur, die die beiden erfindungsgemäßen Bakteriocine produziert, ist jedoch in sofern auch breit, als es nicht auf die Milchsäurebakterienarten beschränkt ist, sondern sich auch auf andere Grampositive Bakterienarten erstreckt, und zwar beispielsweise insbesondere auf die Nahrungsmittelbakterien Bifidobacteria, auf die unerwünschten oder pathogenen Bakterien Propionobacterium, Listeria innocUA, Listeria monocytogenes und Micrococcus varians, und auf die Sporen und Zellen von zahlreichen pathogenen Bakterien der Gattung Clostridia und Bacilli, wie es die in der nachstehenden Tabelle II aufgeführten Ergebnisse bestätigen: Tabelle III
Aufgrund der in dieser Tabelle III dargestellten Ergebnisse können unter anderem interessante Verwendungen dieses Überstands oder der gereinigten Bakterien als Zusatz bei der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten als Wirkstoff gegen pathogene Agenzien in Betracht gezogen werden, und zwar insbesondere beispielsweise in Fleischprodukten gegen Clostridia, in Käsen gegen Listeria monocytogenes und C. tyrobutyricum oder in Frischteigen oder Saucen für Frischteige gegen Bacilli, auf die genau die oben genannten Stämme zurückgehen.
Die vorliegenden Bakteriocine üben keine das Wachstum von Gram-Bakterien hemmende Wirkung aus, wie die in der nachstehenden Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse zeigen. Tabelle IV

Wärmeresistenz, Beständigkeit

Die Bakteriocine, die in dem Extrakt vorliegen, der bei den in Beispiel 1 dargestellten Bedingungen erhalten wird, besitzen keine gute Lagerbeständigkeit bei 4ºC, wenn der Extrakt nicht zuvor erhitzt wurde. Dagegen besitzen sie eine gute Lagerbeständigkeit, wenn der Extrakt beispielsweise mindestens 15 min auf 90-121ºC plötzlich erhitzt wurde.
Insbesondere hat man festgestellt, dass mehr als 50% der Aktivität eines solchen Extrakts nach 5 Monaten Lagerung bei 4ºC erhalten bleibt, wenn man den Extrakt zuvor beispielsweise in einem Wasserbad 20 min auf 94ºC erhitzt. Ferner hat man festgestellt, dass 100% der Aktivität beibehalten werden, nachdem man diesen Extrakt während 60 min auf 100ºC erhitzt hat (dieser Versuch wird im thermostatgesteuerten Ölbad an 1 ml des konzentrierten oder nicht konzentrierten Überstands einer Kultur eines Stamms von S. thermophilus gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgenommen).
Dagegen behalten die erfindungsgemäßen Bakteriocine beispielsweise nach einer Sterilisationsbehandlung von 30 min bei 121ºC nur etwa ein Drittel ihrer Aktivität bei (der Versuch wurde an 40 ml nicht konzentriertem Überstand einer Kultur eines Stamms von S. thermophilus gemäß dem vorliegenden Verfahren durchgeführt).
Durch Ultrafiltrationstests auf Amicon-Filtern, worauf eine Elektrophorese auf Gel (SDS-PAGE) folgt, stellt man fest, dass die erfindungsgemäßen Bakteriocine im Überstand einer Kultur von S. thermophilus, insbesondere im Überstand der in Beispiel 1 erhaltenen Standardkultur, in Form von Aggregaten mit einem Molekulargewicht (PM) über 10 kDa vorliegen, wovon 67% ein PM unter 100 kDa und 33% ein PM über 100 kDa aufweisen.

Reinigung der Bakteriocine

In der folgenden Beschreibung beziehen sich die Prozentsätze von Trifluoressigsäure und Acetonitril auf das Volumen.
Man stellt 1 Liter einer Kultur des Stamms CNCM I-1351 in einem mit 1% Saccharose versetzten Medium M17 während 6 h bei 42ºC unter Anaerobiose her.
Man gibt dann der Kultur direkt 20 g Harz XAD-7 (Sigma) bei und rührt 1 h leicht bei 4ºC. Dann filtriert man die Mischung über ein Filter Schleicher&Schvell (Deutschland) Nr. 604 und wäscht das auf dem Filter zurückgehaltene Harz mit 1 Liter einer Essigsäurelösung 50 mM pH 5,2, um die Bakterien abzuscheiden. Dann bringt man das Harz in eine Säule und eluiert die Bakteriocine mit 45 ml einer Lösung, die 70% Acetonitril und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthält. Man erhält ein ElUAt, das die beiden Bakteriocine enthält.
Dann trennt man diese beiden eluierten Bakteriocine auf die folgende Weise:
Zunächst reduziert man das ElUAtvolumen auf 24 ml durch Zentrifugation/Lyophilisation (Speedvac, Savant Instrument), stellt dann das erhaltene Volumen auf eine Konzentration von NaCl von 2 M und Tris.Cl von 250 mM mit pH 8 bis zu einem Volumen von 50 ml ein, bringt dieses Volumen auf eine Säule mit hydrophober Interaktion Phenyl Superose HR 16/10 (Pharmacia), die zuvor durch einen Tris.Cl 50 mM pH8 und NaCl 2 M enthaltenden Puffer äquilibriert wurde. Dann leitet man mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min nacheinander ein: 200 ml des vorhergehenden Puffers, 100 ml eines linearen Gradienten, der mit dem vorhergehenden Puffer beginnt und mit einer Lösung Tris.Cl 50 mM pH8 endet, 100 ml der vorhergehenden Lösung, 60 ml reines Wasser, 60 ml der Lösung Tris.Cl 50 mM pH8 und schließlich 60 ml reines Wasser.
Dann verdünnt man 50 ul jeder am Austritt der Säule gewonnenen Fraktion in 50 ul TFA 0,1% und testet dann die antibakterielle Aktivität jeder Mischung mit Hilfe des oben beschriebenen Agar-Well-Tests.
Man beobachtet, dass die Fraktionen des 470ten bis 490ten ml eine antibakterielle Aktivität aufweisen. Man mischt diese Fraktionen, reduziert das Volumen dieser Mischung durch Zentrifugation/Lyophilisation auf 1 ml und bringt dieses reduzierte Volumen auf eine Säule Pep RPC HR 5/5 (Pharmacia), die zuvor durch eine Lösung von TFA 0,1%, in der vorliegenden Beschreibung "Lösung A" genannt, äquilibriert wurde. Man stellt ferner eine Lösung "B" her, die 70% Acetonitril und 0,097% TFA enthält. Dann führt man in die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min nacheinander ein: 1 ml der Lösung A, 9 ml eines linearen Gradienten, der mit der Lösung A beginnt und mit einer Mischung 50/50 der Lösungen A und B endet, 2 ml der letztgenannten Mischung, 7 ml eines linearen Gradienten, der mit dieser letztgenannten Mischung beginnt und mit einer zweiten 20/80-Mischung der Lösungen A und B endet, 2 ml eines Gradienten, der mit dieser zweiten Mischung beginnt und mit der Lösung B endet, und dann 2 ml der letztgenannten Lösung.
Man bestimmt nun die antibakterielle Aktivität der aus der Säule austretenden Fraktionen mit Hilfe des Agar-Well-Tests. Alle Fraktionen vom 14. bis zum 22. ml weisen eine antibakterielle Aktivität auf. Dagegen treten zwei mehrheitliche Proteinpeaks, die bei einer optischen Dichte von 215 nm beobachtet werden, in den Fraktionen 15 und 21 (in Milliliter) auf.

Sequenzierung der Bakteriocine

Man seqenziert den N-terminalen Teil der Proteine in den Fraktionen 15, 18, 20, 21 und 22 unter Verwendung eines automatischen Sequenzers 4774 von Applied Biosystem.
Man stellt dabei in der Fraktion 15 das Vorliegen eines Peptids mit einer Sequenz von 48 Aminosäuren fest, die bezüglich des N-terminalen Teils mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 identisch ist. Ein anderes in der Fraktion 21 mehrheitlich vorliegendes Peptid weist auch eine Sequenz von 23 Aminosäuren auf, die hinsichtlich des N-terminalen Teils mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 identisch ist.
Diese Ergebnisse zeigen also, dass der Stamm CNCM I-1351 zwei Peptide produziert, die eine antibakterielle Aktivität aufweisen. Das unterschiedliche Aussehen der Inhibitionshöfe, die zwischen den Fraktionen 15 und 21 erhalten werden, lässt jedoch eine unterschiedliche antibakterielle Aktivität des Thermophilins 1 und des Thermophilins 2 der vorliegenden Erfindung vermuten.
Andererseitsd analysiert man die Amonosäurenzusammensetzung der Fraktionen 15 und 21, die zuvor 24 h bei 100ºC mit HCl 6 N hydrolysiert wurden, durch die bekannte Methode der "Derivatisation mit Dabsychlorid". Die Ergebnisse zeigen, dass die Aminosäurenzusammensetzung jeder Fraktion bereits ihrer jeweiligen Peptidsequenz zu entsprechen scheint.
Schließlich unterzieht man die Fraktionen 15 und 21 einer Massenspektrometrie und stellt bei Thermophilin 1 ein Molekulargewicht von etwa 5800 Dalton und bei Thermophilin 2 ein Molekulargewicht von etwa 3900 Dalton fest.

Sequenzierung der Gene der Bakterien

Man stellt auf herkömmliche Weise die degenerierten Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 her, die in der nachstehenden Sequenzenliste beschrieben werden und die dem N- terminalen Teil bzw. dem C-terminalen Teil des Peptids des zuvor sequenzierten Thermophilins 1 entsprechen.
Dann macht man einen Teil der Mischung von Sequenzen SEQ ID NO: 6 durch Einwirkung von T4-Polynukleotidkinase radioaktiv, wie im Laborhandbuch "Molecular cloning, a laboratory manUAl" (second édition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989), im nachstehenden "Maniatis" genannt, beschrieben wird.
Dann führt man eine PCR ("polymerase chain reaction") mit Hilfe der beiden nicht radioaktiven Mischungen von degenerierten Sequenzen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 an einem Chromosomen- DNA-Präparat des Stamms CNCM I-1351 durch, wie im Handbuch "PCR technologie" (H. A. Erdlich editor, M stockton press, London) beschrieben wird.
Man entwickelt dann auf einem Elektrophoresegel ein Band von 128 Basenpaaren (pb), das gemäß Maniatis eluiert wird. Ein Teil wird dann direkt in dem Plasmid pGEM-T (Promega) geklont, indem man sich an die Empfehlungen des Lieferanten hält, und dann mit der "Dideoxynukleotiden"-Methode gemäß Maniatis sequenziert, indem die universellen Sonden von pUC19 verwendet werden. Man erhält auf diese Weise eine Sonde mit der Sequenz SEQ ID NO: 8, die in der nachstehenden Sequenzenliste beschrieben wird und die einer Sequenz entspricht, die für die Aminosäuren 9 bis 47 des Thermophilins 1 kodiert. Dann wird der andere Teil des eluierten Bandes von 128 pb gemäß der "random priming" genannten Methode nach Maniatis radioaktiv gemacht.
Andererseits führt man eine Verdauung eines Chromosomen-DNA- Präparats des Stamms CNCM I-1351 durch EcoRI und HindIII aus, indem man sich an die Empfehlungen des Enzymlieferanten hält, lässt dann 10 ug Verdauungsprodukt auf einem analytischen Elektrophoresegel wandern, überträgt in alkalischem Medium die DNA des Gels auf eine Membran "Zeta probe" (Biorad), prähybridisiert die Membran bei 54ºC während der Nacht in einem Medium, das SSC 6X, 1% SDS und 1% Magermilch enthält, hybridisiert diese Membran mit der radioaktiven degenerierten Sonde SEQ ID NO: 6 in dem vorhergehenden Hybridisierungsmedium zuerst während 18 h bei 54ºC, indem die Temperatur alle 3 h um 2ºC gesenkt wird, und dann während 24 h bei 42ºC. Dann wäscht man die Membran 2 min dreimal nacheinander in SSC 6X bei Raumtemperatur und während 1 min in SSC 6X bei 47ºC. Dann wird die Membran auf einem Autoradiographiefilm abgelichtet. Alle diese Schritte werden gemäß dem Handbuch Maniatis durchgeführt.
Man entwickelt nun ein Band von 3,6 kb, das uns erlaubt, in einem präparativen Gel der Chromosomen-DNA (300 ug) des Stamms CNCM I-1351, das unter denselben Bedingungen wie oben ausgeführt wird, den Gelteil zu lokalisieren, der das uns interessierende DNA-Stück enthält. Man schneidet diesen Gelteil aus, eluiert ihn auf herkömmliche Weise und ligiert die eluierte DNA mit dem Vektor pUC19 (Messing et al., Methods Enzymol., 101: 20, 1983), der zuvor mit EcoRI und Hindill hydrolysiert wurde. Diese Schritte werden gemäß dem Handbuch Maniatis durchgeführt.
Dann transformiert man auf herkömmliche Weise den zuvor kompetent gemachten Stamm Escherichia coli B234 (Sammlung Biocentre, Universität Basel, Schweiz) mit dem Ligationsmedium. Die transformierten Zellen werden dann durch α-Komplementierung selektiert. Dann überträgt man mit der "colony lift" genannten Methode gemäß Maniatis 300 transformierte Kolonien auf ein Filter, lysiert sie, hybridisiert sie mit der radioaktiven Sequenz SEQ ID NO: 8 und lichtet das Filter auf einem Autoradiographiefilm ab.
Man stellt auf dem Film 13 Kolonien fest, die ein Plasmid aufweisen, das sich mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 hybridisieren kann. Man selektiert zwei dieser Kolonien, extrahiert daraus auf herkömmliche Weise die Plasmid-DNA und sequenziert mit der "Didesoxynukleotiden"-Methode das in den beiden selektierten Plasmiden pUC19 geklonte DNA-Fragment mit Hilfe von universellen pUC19-Sonden und dann von Sonden die auf den auf diese Weise erhaltenen Sequenzen basieren.
Man erhält auf diese Weise eine Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 3, die in der nachstehenden Sequenzenliste beschrieben wird und die bei den beiden selektierten Plasmiden identisch ist. Diese Sequenz enthält somit ein Operon, das für zwei Proteine kodiert, die die Aminosäurensequenzen SEQ ID NO: 4, die vor Reifung dem Thermophilin 1 entspricht, und SEQ ID NO: 5 haben, die vor Reifung dem Thermophilin 2 entspricht (siehe nachstehende Sequenzenliste). Eine dritte Phase der offenen Ablesung beginnt ferner ab dem Nukleotid 679 dieser Sequenz und muß sicher dem Immunitätsgen entsprechen.
Vergleicht man die N-terminalen Peptidsequenzen der gereinigten Bakterien und die Aminosäurensequenzen der durch die kodierenden Phasen des Operon SEQ ID NO: 3 kodierten Proteine, so kann man bestimmen, dass das Protein der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 (Thermophilin 1) ein Leaderpeptid von 23 Aminosäuren aufweist, das ein Glycin-Glycin-Motiv besitzt, das für eine Klasse von Bakteriocinen von Milchsäurebakterien charakteristisch ist. Die molare Masse des Thermophilins 1, die aus seiner Nukleinsäuresequenz errechnet wurde, entspricht schließlich dem durch Spektrometrie gefundenen Wert, d. h. sie beträgt etwa 5800 Dalton.
Ebenso besitzt das Protein der Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 5 (Thermophilin 2) ein Leaderpeptid von 21 Aminosäuren, das ein Glycin-Glycin-Motiv besitzt, das für eine Klasse von Bakteriocinen von Milchsäurebakterien charakteristisch ist. Die molare Masse des Thermophilins 2, die aus seiner Nukleinsäuresequenz errechnet wurde, entspricht dem durch Spektrometrie gefunden Wert, d. h. sie beträgt etwa 3900 Dalton.

Rolle der verschiedenen Bakteriocine

Bei der Sequenz von Thermophilin 1 wurde eine Homologie mit dem ersten Peptid des Operons von "Lactococein M" gefunden (Klaenhammer et al., FEMS Micro. Rew., 12, 39-86, 1993). Diese Homologie betrifft die Wiederholung eines GA-Motivs. Ferner wurde bei Thermophilin 2 eine Homologie mit einem Gen des Operons "Lacticin F" (Klaenhammer et al., siehe oben) gefunden, und zwar in der Datenbank GenEMBL unter Verwendung des Programms TFASTA von GCG.
Die beiden Operons Lactococein M und Lactacin F kodieren für Porationskomplexe, bei denen mehrere Peptide auftreten. Es ist also möglich, dass das oben beschriebene Operon für Peptide kodieren kann, die gemeinsam in einem Porationskomplex wirken.
Dennoch ist nicht ausgeschlossen, dass die beiden Bakteriocine unabhängig voneinander wirken, und zwar aufgrund des etwas unterschiedlichen Inhibitionshofs, der bei den beiden Thermophilinen im oben beschriebenen Agar-Well-Test beobachtet wurde.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung des Herstellungsverfahrens und der Verwendungen des erfindungsgemäßen Bakteriocins. Die Prozentsätze beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht.

Beispiel 1

Man beimpft ein mit 1% Saccharose versetztes Kulturmedium M17 mit 1% (V/V) eine Kulturmediums, das 10&sup8; Keime des Stamms S. thermophilus CNCM I-1351 pro ml enthält. Man inkubiert 6 h bei 42ºC unter Anaerobiose, wonach das Medium etwa 10&sup8; Keime des Stamms pro ml enthält und eine DO&sub6;&sub0;&sub0; von 3,6 aufweist.
Man zentrifugiert die auf diese Weise erhaltene Standardkultur. Man gewinnt den Rückstand (Standard). Man säuert mit H3PO4 auf pH 1,5 an, gewinnt einen Niederschlag, den man durch Zentrifugation abscheidet, und gewinnt einen sauren Fällungsüberstand.
Man fällt die in diesem enthaltenen Bakteriocine mit 10% Trichloressigsäure aus. Man gewinnt die ausgefällten Bakteriocine und bringt sie mit 0,2%iger (V/V) Trifluoressigsäure wieder in wässrige Suspension.
Man fällt die Bakteriocine mit 10%iger Trichloressigsäure wieder aus. Man gewinnt die ausgefällten Bakteriocine, wäscht sie mit 100%igem Aceton und bringt sie mit 0,2%iger (V/V) Trifluoressigsäure wieder in wässrige Suspension.
Man erhält einen Standardrohextrakt der vorliegenden Bakteriocine, der eine Aktivität von 1,4·10&sup5; UA/ml aufweist.
Die nachstehende Tabelle VI enthält verschiedene Angaben über die Merkmale eines Liters Standardüberstand und über die von 18 ml Standardrohextrakt, d. h. von dem daraus gezogenen Konzentrat, und zwar insbesondere über Proteingehalt und antibakterielle Aktivität. Tabelle VI

Beispiel 2

Man stellt ofengekochte Joghurts her, die den erfindungsgemäßen Stamm S. thermophilus CNCM I-1351 und die oben genannten Stämme S. thermophilus ST11 (resistent gegen die erfindungsgemäßen Bakteriocine, aber ohne antibakterielle Aktivität) und L. bulgaricus YL5 enthalten.
Man stellt auf diese Weise eine Milch auf der Basis von Vollmilch mit 3,7% Fett und 2,5% Magermilchpulver her. Man pasteurisiert 40 l dieser Milch bei 92ºC während 6 min, homogenisiert dann bei 75ºC und 150 bar (zwei Stufen) und kühlt sie auf eine Temperatur von ungefähr 42ºC.
Man reaktiviert die lyophilisierten Stämme S. thermophilus CNCM I-1351, S. thermophilus ST11 und L. bulgaricus YL5 mit mehreren aufeinanderfolgenden Vorkulturen in einem sterilen MSK-Medium (10%iges rekonstituiertes Magermilchpulver, das 0,1% eines handelsüblichen Hefeextrakts enthält).
Man beimpft die sterile Milch mit 1% (V/V) der dritten Vorkultur jedes Stamms S. thermophilus im Koagulationsstadium des Mediums und mit 2% (V/V) der dritten Vorkultur des Stamms L. bulgaricus im Koagulationsstadium des Mediums. Man inkubiert die Milch bei 42ºC bis zu einem pH von etwa 4,65 und kühlt dann auf 4ºC.
Zum Vergleich stellt man einen herkömmlichen Joghurt auf dieselbe Weise wie oben her, und zwar mit den oben beschriebenen Stämmen S. thermophilus YS5 und Sfi3 und dem Stamm L. bulgaricus YL18, die gewöhnlich für die Joghurtherstellung verwendet werden.
Die nachstehende Tabelle veranschaulicht die Merkmale der erhaltenen Produkte, und zwar insbesondere ihr pH während der Lagerung bei 4ºC.

Beispiel 3

Man stellt Mozarella-Käse auf herkömmliche Weise mit Hilfe eines Stamms S. thermophilus CNCM I-1351 her.

Beispiel 4

Man stellt 10 Liter einer Kultur des Stamms S. thermophilus CNCM I-1351 in einem mit 1% Saccharose versetzten Medium M17 während 6 h bei 42ºC unter Anaerobiose her. Man gibt dann der Kultur direkt 200 g Harz XAD-7 (Sigma) bei, rührt das Ganze 1 h bei 4ºC leicht. Man filtert die Mischung über ein Filter Schleicher&Schvell (Deutschland) Nr. 604 und wäscht das auf dem Filter zurückgehaltene Harz mit 10 Liter einer Essigsäurelösung 50 mM pH 5,2, um die Bakterien abzuscheiden. Man gibt dem Harz dann 450 einer Lösung bei, die 100%iges Ethanol und Ammoniumacetat 20 mM enthält, filtert das Ganze zur Entfernung des Harzes und lyophilisiert das Filtrat, bis man ein die erfindungsgemäßen Bakteriocine enthaltendes Pulver erhält, das in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden kann.
Man bestimmt die antibakterielle Aktivität dieses Pulvers, das zuvor in Wasser verdünnt wurde, im oben beschriebenen Agar- Well-Test. Dieses Pulver weist 10&sup7; UA/g Pulver auf.
Schließlich gibt man einer Fleischpastete während ihrer Herstellung auf traditionelle Weise 0,5 g/kg dieses Pulvers bei. Man erhält eine Fleischpastete, die 5·10³ UA/g von Bakteriocinen enthält, die die Entwicklung von pathogenen Bakterien, insbesondere von Clostridia, vollständig inhibieren können.

Beispiel 5

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung einer hydratisierenden Creme zur Hautpflege, die 0,05 g/kq des in Beispiel 4 beschriebenen Pulvers enthält, d. h. 5·10² UA/g von Bakteriocinen, die die Entwicklung von ungewünschten Bakterien auf der Haut inhibieren können.
Zur Herstellung dieser Emulsion mischt man die Bestandteile der Lipidphase A und erhitzt sie auf 75ºC. Man stellt die wässrige Phase B her und erhitzt sie ebenfalls auf 75ºC, dann gibt man sie der Lipidphase A unter langsamem Rühren bei und kühlt unter langsamem Rühren auf Raumtemperatur, d. h. etwa 25ºC, ab. Bei dieser Temperatur gibt man langsam die Bestandteile C in der Reihenfolge der Rezeptur bei.

Lipidphase A

Peg-6-Stearat, Glycerat und Peg-20-cethylether (peg: Polyethylenglykol) 15
Vaselinöl 5
Weizenkeimöl, stabilisiert mit 0,1% Phenylindanen (antioxidierend) und 1% Sojaphospholipiden (vgl. EP 94109355.1) 3
Süßmandelöle 2
Cetylalcohol 1
Isostearyl-Isostearat 2
2-Octyl-dodecyl-myristat 1
Lanolinwachs 1

wässrige Phase B

Methylisothiazolin 0,1
entmineralisiertes Wasser 59,6
menschl. Placentaprotein 2

Zusätze C

Propylenglykol und Calendulaextrakt 2
50% in entmineralisiertem Wasser lösliches Collagen 5,8
Parfum 0,3
2,5% Pulver von Bakteriocinen gem. Beisp. 4 in entmin. Wasser 0,2

Beispiel 6

Man gibt einem Zahnreinigungswasser 0,5 g/kg des in Beispiel 4 beschriebenen Pulvers von Bakteriocinen bei. Dieses Wasser kann auf diese Weise die Entwicklung von pathogenen Bakterien der Mundhöhle, insbesondere Streptococcus sobrinus, inhibieren.

Beispiel 7

Man stäubt eine Lösung, die das Bakteriocinpulver von Beispiel 4 zu 1% verdünnt in Wasser enthält, auf ein Nahrungsmittelprodukt auf, das sterilisiert werden soll, um einer Postkontamination bei der Verpackung zu verhüten.

Claims

1. Bakteriocin aus Streptcoccus thermophilus, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 aufweist.

2. Bakteriocin aus Streptococcus thermophilus, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 aufweist.

3. Nukleotidsequenz, die für eines der Bakteriocine aus Streptococcus thermophilus nach einem der Ansprüche 1 und 2 kodiert.

4. Sequenz nach Anspruch 3, die die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 3 aufweist, die für die Bakteriocine nach den Ansprüchen 1 und 2 kodiert.

5. Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotide 221 bis 475 der Sequenz SEQ ID NO: 3 aufweist.

6. Nukleotidsequenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotide 289 bis 475 der Sequenz SEQ ID NO: 3 aufweist.

7. Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotide 495 bis 686 der Sequenz SEQ ID NO: 3 aufweist.

8. Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotide 558 bis 686 der Sequenz SEQ ID NO: 3 aufweist.

9. Nukleotidsequenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotide 221 bis 228 der Sequenz SEQ ID NO: 3 aufweist.

10. Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotide 495 bis 557 der Sequenz SEQ ID NO: 3 aufweist.

11. Peptidsignal aus Streptococcus thermophilus, das von den Nukleinsäuresequenzen nach den Ansprüchen 9 und 10 kodiert wird.

12. Stamm von Streptococcus thermophilus CNCM I-1351, der wenigstens eines der Bakteriocine nach den Ansprüchen 1 und 2 produziert.

13. Verfahren zur Herstellung von wenigstens einem Bakteriocin nach den Ansprüchen 1 und 2, bei dem man einen Stamm von Streptococcus thermophilus, der wenigstens eines der genannten Bakteriocine produziert, in einem Medium und unter Bedingungen kultiviert, die für das Wachstum von Streptococcus thermophilus günstig sind, bis das Medium von 10&sup7; bis 10&sup9; Keime des genannten Stamms pro ml enthält, die erhaltene Kultur zentrifugiert, und danach einen Extrakt des Überstands herstellt, der wenigstens eines der genannten Bakteriocine enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem man zur Herstellung eines Extrakts von wenigstens einem der genannten Bakteriocine, die in dem Überstand enthalten sind, den pH des Überstandes mit H&sub3;PO&sub4; auf 1,0 bis 2,0 einstellt, einen Niederschlag abscheidet und eine oder mehrere nachfolgende Fällungen mit Trichloressigsäure durchführt, wobei man nach jeder mit Hilfe von Trifluoressigsäure wieder in wässrige Suspension bringt.

15. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Stamm von Streptococcus thermophilus der Stamm CNCM L-1351 ist, der die genannten Bakteriocine produziert.

16. Verwendung wenigstens eines Bakteriocins aus den Ansprüchen 1 und 2 und/oder eines Stammes von Streptococcus thermophilus, der wenigstens eines der genannten Bakteriocine produziert, bei der Herstellung von Nahrungsmitteln oder Kosmetika.

17. Verwendung nach Anspruch 16 einer Kultur des Stamms von Streptococcus thermophilus als Ferment bei der Herstellung von Käsen oder bei der Herstellung von Sauermilchprodukten.

18. Verwendung nach Anspruch 16 von wenigstens einem der genannten Bakteriocine oder des genannten Stammes als Zusatz oder Wirkstoff gegen pathogene Bakterien, insbesondere bei der Herstellung von Fleischprodukten wie Schäumen, als Wirkstoff gegen Chlostridium botulinum, oder bei der Herstellung von Cremes oder Lotionen, als Wirkstoff gegen pathogene Bakterien der Haut, oder bei der Herstellung von Produkten für die Mundhygiene, als Wirkstoff gegen pathogene Bakterien der Mundhöhle, insbesondere gegen Streptococcus sobrinus.

19. Verwendung nach Anspruch 16 eines Bakteriocins in Form eines Extraktes, wie er bei dem Verfahren nach Anspruch 13 erhalten wird.

20. Verwendung von wenigstens einer der Nukleinsäuresequenzen nach den Ansprüchen 3 bis 8, um durch Transformation Bakterien, Hefen oder Pflanzen die Fähigkeit zu verleihen, bestimmte Bakterien zu inhibieren.

21. Verwendung einer der Nukleinsäuresequenzen nach den Ansprüchen 9 und 10 als Sequenzsignal, das man mit einem Gen von Interesse fusioniert, um durch Transformation einem Stamm von Streptococcus thermophilus die Fähigkeit zu verleihen, das kodierte Protein mit dem genannten Gen von Interesse zu exkretieren.