CN117721095A - 脂肪酶变体及包含表面活性剂和脂肪酶变体的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂肪酶变体和组合物，这些组合物包含(i)至少一种表面活性剂和(ii)至少一种本发明的脂肪酶变体。此外，本发明涉及使用这些组合物的方法。
Description
本申请是申请日为2017年6月26日、优先权日为2016年6月30日，申请号为201780033465.9、发明名称为“脂肪酶变体及包含表面活性剂和脂肪酶变体的组合物”的发明专利申请的分案申请。
序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
技术领域
本发明涉及脂肪酶变体以及包含本发明的脂肪酶变体和一种或多种表面活性剂(优选地阴离子表面活性剂)的组合物，其中这些变体包含相对于亲本脂肪酶的修饰并且任选地展示出相比于亲本脂肪酶的改变的特性，例如在洗涤过程中的活性、洗涤性能、洗涤剂稳定性和/或储存稳定性。本发明的组合物作为例如清洁或洗涤剂组合物(例如衣物洗涤洗涤剂组合物)并且包括与此类洗涤剂组合物组合使用的辅助组合物是合适的。这些组合物可以是任何形式，例如液体、凝胶或粉末形式。
背景技术
酶作为洗涤配制品的部分已经在洗涤剂工业中使用了数十年。脂肪酶是重要的生物催化剂，其已显示可用于各种应用并且大量的不同脂肪酶已经被鉴定并且许多已被商品化。
脂肪酶已经被用于组合物中，从而用于通过水解甘油三酯以产生脂肪酸来去除脂质污渍。当前清洁和/或织物护理组合物包括许多活性成分，这些成分干扰脂肪酶去除脂质污渍的能力。因此，需要可以在用于清洁的组合物的严苛环境中起作用的脂肪酶。本申请的目的是提供具有有利特征的脂肪酶，如当应用在清洁剂组合物中时具有改进的性能的脂肪酶。
已经对洗涤剂组合物进行了描述，但是对改进的洗涤剂组合物仍然有持续的需求，其中这些酶在洗涤剂组分例如高浓度的表面活性剂的存在下在洗涤剂组合物中保持活性和稳定性。还存在对如下的改进的洗涤剂组合物的需求，其中酶和洗涤剂组分的组合作用导致改进的性能。因此，本发明的一个目的是提供此类酶和组合物。
发明内容
本发明涉及脂肪酶变体以及包含一种或多种表面活性剂和本发明的脂肪酶变体的组合物。
诸位发明人惊奇地发现了在阴离子表面活性剂特别是分别地醇醚硫酸盐(AEOS)或直链烷基苯磺酸盐(LAS)的存在下相对于如SEQ ID NO:1所示的亲本脂肪酶(LIPOLASETM)具有改进的脂肪酶活性的脂肪酶变体。诸位发明人还惊奇地发现了在直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)的存在下以及任选地在螯合剂或低水硬度(通常地低于8°dH)下具有增加的脂肪酶活性的脂肪酶变体。
因此，在第一方面，本发明涉及亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
(a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
(b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
(c)具有脂肪酶活性。
本发明的脂肪酶变体相对于亲本脂肪酶特别是如SEQ ID NO:1所示的脂肪酶具有增加的相对活性(即，高于1.00)(参见实例4)。
如实例4中所述来测定该相对活性，并且其在优选的实施例中是高于1.10，优选地高于1.50，优选地高于2.00，优选地高于2.50，优选地高于3.00，更优选地高于3.50，特别地高于4.00，特别地高于5.00，特别地高于6.00，特别地高于7.00，特别地高于8.00，特别地高于9.00，特别地高于10.00，特别地高于11.00，特别地高于12.00，特别地高于13.00，特别地高于14.00，特别地高于15.00，特别地高于16.00，特别地高于17.00，特别地高于18.00，特别地高于19.00，特别地高于20.00，特别地高于21.00，特别地高于22.00，特别地高于23.00，特别地高于24.00，特别地高于25.00，例如在1.10和25之间的范围内，例如在1.50和20.00之间的范围内，例如在2.00和15.00之间的范围内，例如在3.00和10.00之间的范围内。
在实施例中，该相对活性是在一种或多种阴离子表面活性剂的存在下测定的。在实施例中，该相对活性是在一种或多种非离子表面活性剂的存在下测定的。在实施例中，该相对活性是在一种或多种阴离子表面活性剂和一种或多种非离子表面活性剂的存在下测定的。在实施例中，可以进一步存在螯合剂。
在实施例中，该相对活性是在LAS的存在下测定的。
在实施例中，该相对活性是在AEOS的存在下测定的。
在实施例中，该相对活性是在LAS和AEO的存在下测定的。
在实施例中，该相对活性是在LAS、AEO和螯合剂(例如EDTA)的存在下测定的。
在实施例中，该相对活性是在实例4中在表面活性剂溶液A中测定的。
在实施例中，该相对活性是在实例4中在表面活性剂溶液B中测定的。
在实施例中，该相对活性是在实例4中在表面活性剂溶液C中测定的。
在实施例中，该相对活性是在实例4中在表面活性剂溶液D中测定的。
在实施例中，该相对活性是在实例4中在表面活性剂溶液E中测定的。
在实施例中，该相对活性是在实例4中在表面活性剂溶液F中测定的。
在实施例中，该相对活性是在实例4中在表面活性剂溶液G中测定的。
本发明还涉及一种组合物，其包含(i)表面活性剂和(ii)亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
(a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
(b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
(c)具有脂肪酶活性；并且
(d)与亲本脂肪酶相比具有改进的活性。
本发明还涉及根据所披露的实施例中的任一个的组合物在衣物洗涤或工业清洁中的用途。
本发明还涉及一种洗涤方法，该洗涤方法包括用根据所披露的实施例中的任一个的洗涤剂组合物，优选地在50℃或更低的温度下，或更优选地在40℃或更低的温度下，或更优选地在30℃或更低的温度下，或甚至更优选地在20℃或更低的温度下洗涤织物。
在一方面，本发明涉及一种亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中
(a)所述变体具有下组取代中的一个：
；和
(b)所述变体具有脂肪酶活性并进一步具有与如SEQ ID NO:1所示的亲本脂肪酶相比增加的相对活性；和
(c)所述亲本脂肪酶衍生自疏绵状嗜热丝孢菌。
序列表综述
SEQ ID NO:1是脂肪酶(LipolaseTM)的氨基酸序列
SEQ ID NO:2是融合α-淀粉酶(LABM)的氨基酸序列
SEQ ID NO:3是蛋白酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:4是蛋白酶(NeutraseTM)的氨基酸序列
SEQ ID NO:5是蛋白酶(金属蛋白酶)的氨基酸序列
SEQ ID NO:6是蛋白酶(TY145)的氨基酸序列
定义
如本文所使用的术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂肪分解酶”、“脂肪酯酶”、“脂肪分解多肽”和“脂肪分解蛋白”是指如酶命名法中所定义的EC 3.1,1类别中的一种酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)、角质酶活性(EC 3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)。出于本发明的目的，脂肪酶活性是重折叠脂肪酶的活性，并根据实例部分中所述的程序确定(脂肪酶测定：对脂肪酸pNP酯的水解活性)。在一方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:1的多肽的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的脂肪酶活性。
如本文所使用的术语“亲本”或“亲本脂肪酶”是指对其进行取代以产生本发明的脂肪酶变体的脂肪酶。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
如本文所使用的术语“与……对应的”是指用来确定序列中的特定氨基酸的方式，其中参考了特定氨基酸序列。例如出于本发明的目的，当参考特定氨基酸位置时，技术人员会能够将另一氨基酸序列与所述已经被参考的氨基酸序列进行比对，从而确定哪一个特定氨基酸可能在所述另一氨基酸序列中是感兴趣的。已经在本文其他地方描述了另一氨基酸序列与例如如在SEQ ID NO:1中阐明的序列或本文列出的任何其他序列的比对。可使用替代性比对方法，并且这些比对方法是本领域技术人员熟知的。
如本文所使用的，术语“序列同一性”是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性，其由参数“序列同一性”所描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数可以是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：
(相同残基×100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)
可替代地，所使用的参数可以是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：
(同一的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-在比对中的空位总数)
如本文所使用的术语“表面活性剂”是指本领域中的表面活性剂的任何常规理解，其可以是阴离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的和/或阳离子的或其混合物。在具体的实施例中，该洗涤剂组合物包含一种或多种非离子表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。典型地，表面活性剂按重量计以从大约0.1％至60％，如大约1％至大约40％、或大约3％至大约20％、或大约3％至大约10％的水平存在。本发明的表面活性剂可优选地以这样的浓度存在，使得它主要以胶束形式存在，即浓度高于主洗液中的临界胶束浓度。如本文所使用的术语“临界胶束浓度”是指表面活性剂或表面活性剂混合物的胶束浓度，并且其由许多因素决定，例如pH、温度、离子强度等。为了确定表面活性剂或表面活性剂的混合物是否以临界胶束浓度或高于临界胶束浓度的浓度存在于主洗涤溶液中，可以使用许多不同的方法。
如本文所使用的术语“胶束”是指在水溶液中自发且可逆地形成两亲分子(例如表面活性剂)的水溶性聚集体。
当提及本文的脂肪酶变体时，术语“改进的特性”是指与脂肪酶变体相关的特征，其与亲本脂肪酶例如具有SEQ ID NO:1的序列的亲本脂肪酶相比或与具有所述变体的相同氨基酸序列但在一个或多个所述指定位置不具有改变的脂肪酶相比有所改进。此类改进的特性包括但不限于：洗涤性能、脂肪酶活性、恶臭减少、热活性曲线、热稳定性、pH活性曲线、pH稳定性、底物特异性、改进的表面特性、产物特异性、增加的稳定性(包括在主要洗涤过程中的稳定性)、在储存条件下的改进的稳定性和化学稳定性。
术语“改进的脂肪酶活性”在本文中被定义为酶水解脂酰基酯(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯)的能力。这将有助于通过将疏水性甘油三酯转化为脂肪酶催化的更亲水和水溶性反应产物来除去待清洁物体上存在的脂质或含脂质污渍。洗涤性能可以通过计算在以下方法部分中的AMSA说明中定义的所谓G/Int值来定量。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。
术语“清洁”涵盖所有类型的清洁，包括衣物洗涤、硬表面清洁、工业清洁和机构清洁。
如本文所使用的术语“改进的洗涤性能”是指酶促进去除待清洁物体上存在的脂质或含脂质污渍的能力。
术语“稳定性”包括储存稳定性和在使用期间(例如在洗涤过程)中的稳定性，并且反应了作为时间函数的根据本发明的脂肪酶变体的稳定性，例如当脂肪酶变体置于溶液中特别是在洗涤剂溶液中时，保留多少活性。该稳定性受到许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂、表面活性剂的量等。
术语“改进的稳定性”或“增加的稳定性”在本文被定义为作为脂肪酶变体的变体相对于该亲本脂肪酶、相对于具有所述变体的相同氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置处不具有改变的脂肪酶、或相对于SEQ ID NO:1的稳定性展示出在溶液中增加的稳定性。术语“改进的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改进的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”。可以如实例中所述测量酶的稳定性。
术语“改进的化学稳定性”在此被定义为变体酶在一种或多种天然存在的或合成的、降低亲本酶的酶活性的化学品存在下孵育一段时间之后表现为保留酶活性。改进的化学稳定性还可使得这些变体在此类化学品存在下能更好地催化反应。在本发明的一个具体方面，改进的化学稳定性是洗涤剂特别是液体洗涤剂的改进的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”具体地是当将酶变体混合到液体洗涤剂配制品(尤其是根据表1所述的液体洗涤剂配制品)中，然后储存在15℃和50℃之间(例如20℃、30℃、或40℃)的温度下持续至少一周时，酶活性的改进的稳定性。
术语“改进的热活性”意指变体在特定温度下相对于亲本或相对于具有SEQ IDNO:1的脂肪酶的温度依赖的活性曲线展示改变的温度依赖的活性曲线。热活性值提供了变体在一定温度范围内增强水解反应的催化的效率的测量。
术语“改进的洗涤性能”在本文被定义为变体相对于亲本酶、相对于具有SEQ IDNO:1的多肽、或相对于具有所述变体的相同氨基酸序列但在一个或多个所述指定位置处不具有改变的酶的洗涤性能例如通过增加的去污而展示出改进的洗涤性能。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤中的洗涤性能。如本文“洗涤性能”定义下所述的，洗涤性能可以被量化。
如本文所使用的术语“阴离子表面活性剂”是指阴离子表面活性剂的非限制性实例，其包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、烯磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐和二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)如十二烷基硫酸钠(SDS)、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也称作醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
如本文所使用的术语“两种或更多种表面活性剂的混合物”是指至少两种表面活性剂的组合，其可以是同一组表面活性剂的组合，例如一种阴离子表面活性剂和第二种阴离子表面活性剂的组合，或者它可以是不同组的表面活性剂的组合，例如一种阴离子表面活性剂和一种非离子表面活性剂。
如本文所使用的术语“非离子表面活性剂”是指非离子表面活性剂的非限制性实例，其包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。
如本文所使用的，术语“织物”或“衣服”是指任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非编织材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。
如本文所使用的，术语“纺织品”是指编织织物，连同适合于转化为或用作纱线、编织、针织以及非编织织物的短纤维和长丝。该术语涵盖从天然以及合成(例如制造的)纤维制成的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。
术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于用于硬表面清洁的组合物，例如口腔洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。
术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶的量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，例如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、棒状)组合物等。术语变体的“有效量”是指达到所希望的水平的酶活性(例如在定义的洗涤剂组合物中)的前述变体的量。
如本文所使用的术语“水硬度”或“硬度”(degree of hardness)或“dH”或“°dH”是指德国硬度(German degrees of hardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。
如本文所使用的术语“产生的水硬度”是指在洗涤循环期间在洗涤水中测量的水硬度。洗涤循环可以是洗涤过程的洗涤循环。洗涤循环是指一个过程(例如洗涤过程)的一部分，其中水中补充有组合物，例如洗涤剂组合物。
本文使用的术语“相关洗涤条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。
如本文所使用的术语“污渍去除酶”描述帮助从织物或硬表面去除污渍或污垢的酶。污渍去除酶对特定底物起作用，例如，蛋白酶对蛋白质起作用、淀粉酶对淀粉起作用、脂肪酶和角质酶对脂质(例如来自动物或植物材料的脂肪和油中的酰酯)起作用、果胶酶对果胶起作用并且半纤维素酶对半纤维素起作用。污渍通常是具有不同组分的复杂混合物的沉积物，这导致材料自身局部变色或者在物体上留下粘性表面，该粘性表面可以吸引溶解于洗涤液中的污垢从而导致被玷污的区域变色。当酶对其存在于污渍中的特定底物起作用时，该酶降解或部分降解其底物，从而帮助在洗涤过程中去除与底物相关的污垢和污渍组分。例如，当蛋白酶对草地污渍起作用时，它降解草中的蛋白组分并且允许在洗涤期间释放绿色/棕色。
在此上下文下，术语“减少的量”意指在其他方面相同的条件下，该组分的量小于将用于参比过程中的量。在优选的实施例中，该量被减少例如至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％或如另外本文所述的。
术语“低洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。亚洲(例如，日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度体系。
术语“中洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度体系。
术语“高洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度体系。
如本文所使用的术语“另外的酶”是指包含在组合物中的第二种酶或另外的酶。另外的酶可以是除脂肪酶之外的另一种酶类的任何酶，但它也可以包含第二种/另外的脂肪酶，即根据本发明的组合物包含多于一种脂肪酶，例如两种或更多种脂肪酶。
术语“α-淀粉酶”和“淀粉酶”可以互换地使用并且构成本发明范围内的相同含义和目的。
如本文所使用的，术语“α-淀粉酶变体”是指与“亲本α-淀粉酶”相比，在一个或多个(例如，若干个)位置处包括一个改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的α-淀粉酶。取代意指将占据一个位置的氨基酸用不同的氨基酸置换；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在与占据一个位置的氨基酸相邻处添加氨基酸，例如1至10个氨基酸，优选地1至3个氨基酸。氨基酸取代可以把天然氨基酸换成另一种天然存在的氨基酸，或换成非天然存在的氨基酸衍生物。这些α-淀粉酶变体具有其衍生自的成熟亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶活性的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
如本文所使用的术语“α-淀粉酶活性”是指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，这些水解酶构成一组催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖水解的酶。因此，如本文所使用的术语“α-淀粉酶”是指具有α-淀粉酶活性的酶(酶类：EC 3.2.1.1)，其水解大的、经α键连接的多糖(如淀粉和糖原)的α键，产生葡萄糖、麦芽糖和短链寡糖。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定α-淀粉酶活性。在一个实施例中，本发明的变体具有SEQ ID NO:2的多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
术语“蛋白酶”在本文被定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组(包括其十三个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考来自NC-IUBMB的Enzyme Nomenclature 1992[1992年酶命名法],学术出版社(Academic Press),圣地亚哥,加利福尼亚州，分别包括在Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1994,223,1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1995,232,1-6；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1996,237,1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1997,250,1-6；以及Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],1999,264,610-650中出版的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程学]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白质水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内切肽酶(EC 3.4.21)。出于本发明的目的，根据下面实例1中所描述的程序确定蛋白酶活性。本文描述的这些蛋白酶变体具有SEQ ID NO:3、4、5或6的成熟多肽的蛋白酶活性的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
如本文所使用的，术语“蛋白酶活性”是指水解肽键的活性。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定蛋白酶活性。在一个实施例中，本发明的这些变体具有SEQ IDNO:3、4、5或6的多肽的蛋白酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
如本文所使用的，术语“蛋白酶变体”是指相比于其亲本在一个或多个(或一个或若干个)位置处包括改变(即取代、插入和/或缺失(优选取代))的具有蛋白酶活性的蛋白酶，该亲本是具有所述变体的相同氨基酸序列但在一个或多个所述指定位置处不具有改变的蛋白酶。
术语“修饰”在本文其他地方进行描述。该术语是如本文描述的术语“取代”、“插入”和“缺失”的总体名称。
如本文所使用的术语“螯合剂(chelating agent或chelator)”是指与某些金属离子形成分子的化学品，从而使这些离子失活以致于使他们不能与其他元素进行反应，因此是通过形成螯合物而抑制化学活性的一种结合剂。螯合是在配体与单一中心原子之间形成或存在的两种或更多种单独的结合。配体可以是任何有机化合物、硅酸盐或磷酸盐。在本文上下文中，术语“螯合剂(chelating agent)”包括可与金属离子(如钙和镁)形成水溶性复合物的螯合剂(chelant)、螯合剂(chelating agent)、螯合剂(chelating agent)、络合剂(complexing agent)、或螯合剂(sequestering agent)。螯合作用描述螯合配体对金属离子的亲和力相对于类似的一组非螯合配体对相同金属的亲和力的增强。螯合剂具有与金属离子(特别是钙(Ca2+)离子)结合的能力，并且已经被广泛用在通常用于洗涤(如衣物洗涤或餐具洗涤)的洗涤剂和组合物中。然而，螯合剂显示其自身会抑制酶活性。术语螯合剂(chelating agent)与“络合剂(complexing agent)”或“螯合剂(chelating agent)”或“螯合剂(chelant)”在本文中可互换使用。
许多脂肪酶的活性对钙敏感。螯合剂的存在可能损害酶活性。螯合剂对脂肪酶活性的影响可以是通过从脂肪酶中去除钙离子，所述脂肪酶具有在对稳定性和/或活性重要的位置上结合的钙。可替代地，螯合剂可间接影响脂肪酶活性，例如，通过影响钙离子与产生的游离脂肪酸之间的相互作用或钙与表面活性剂离子之间的相互作用或其组合。脂肪酶的钙敏感性可以通过在强螯合剂存在下测试给定脂肪酶的活性来确定。
对螯合剂进行表征：如上所述，螯合作用(chelate effect或chelating effect)描述螯合配体对金属离子的亲和力相对于一组类似的非螯合配体对相同金属的亲和力的增强。然而，螯合作用的强度可通过多种类型的测定或测量方法确定，由此根据其螯合作用(或强度)对螯合剂进行区分和排位。
在优选的测定中，螯合剂可以通过它们在pH 8.0下将游离钙离子(Ca2+)的浓度从2.0mM降低至0.10mM或更低的能力来表征，例如通过使用基于由M.K.Nagarajan等人,JAOCS[美国油脂化学协会杂志],第61卷,第9期(1984年9月),第1475-1478页描述的方法的测试。使用基于Nagarajan等人的方法表征螯合剂的实例描述于实例1中。优选地，在本发明的上下文中的螯合剂涵盖如下螯合剂，当在pH 8.0在21℃测定时，其在低于10mM、优选地低于9.5mM、优选地低于9mM、优选地低于8.5mM、优选地低于8mM、优选地低于7.5mM、优选地低于7mM、优选地低于6.5mM、优选地低于6mM、优选地低于5.5mM、优选地低于5mM、优选地低于4.5mM、优选地低于4mM、优选地低于3.5mM、优选地低于3mM、优选地低于2.5mM、优选地低于2mM、优选地低于1.5mM或优选地低于1mM的浓度下，能够将游离钙离子的浓度从2.0mM降低至0.1mM或更低。
优选地，该螯合剂涵盖如下螯合剂，当在80mM氯化钾和49mM EPPS((4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸))中在pH 8在21℃测量时，其在低于10mM、优选地低于9.5mM、优选地低于9mM、优选地低于8.5mM、优选地低于8mM、优选地低于7.5mM、优选地低于7mM、优选地低于6.5mM、优选地低于6mM、优选地低于5.5mM、优选地低于5mM、优选地低于4.5mM、优选地低于4mM、优选地低于3.5mM、优选地低于3mM、优选地低于2.5mM、优选地低于2mM、优选地低于1.5mM或优选地低于1mM的浓度下，能够将游离钙离子的浓度从2.0mM降低至0.1mM。在特别优选的实施例中，当在80mM氯化钾和49mM EPPS中，在pH 8和21℃并且使用用于测定游离钙浓度的钙离子选择性电极测量时，该螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2.0mM降低至0.1mM(如在实例1中所描述)。因此优选地，这些螯合剂涵盖如下螯合剂，当在pH 8.0和21℃测试时，其在低于10mM、优选地低于9.5mM、优选地低于9.0mM、优选地低于8.5mM、优选地低于8.0mM、优选地低于7.5mM、优选地低于7.0mM、优选地低于6.5mM、优选地低于6.0mM、优选地低于5.5mM、优选地低于5.0mM、优选地低于4.5mM、优选地低于4.0mM、优选地低于3.5mM、优选地低于3.0mM、优选地低于2.5mM、优选地低于2.0mM、优选地低于1.5mM或优选地低于1.0mM的浓度下，能够将游离钙离子的浓度从2.0mM降低至0.10mM(如在实例1中所述)。
典型的螯合剂的实例及其在pH 8.0在49mM EPPs缓冲液和80mM氯化钾中将游离钙离子浓度从2.0mM降低至0.1mM的能力如下所示。按照实例1中描述的程序确定了将游离钙离子浓度从2.0mM降低至0.1mM所需的螯合剂浓度：“用于测量游离钙的测定”：
| mM | 相对于柠檬酸盐 | |
| 柠檬酸盐 | 8.36 | 1.00 |
| EGTA | 2.60 | 0.33 |
| EDTA | 1.90 | 0.21 |
| HEDP | 1.60 | 0.20 |
| DTPA | 1.87 | 0.24 |
| DTPMP | 1.17 | 0.15 |
| MGDA | 2.56 | 0.33 |
在特别优选的实施例中，当在80mM氯化钾和49mM EPPS中，在pH 8和21℃，在9mM至0.5mM、优选地9mM至1mM、优选地8mM至1mM、优选地7mM至1mM、优选地6mM至1mM、优选地5mM至1mM、优选地4mM至1mM、优选地3mM至1mM、优选地2mM至1mM、优选地9.0mM至1.5mM、优选地8.0mM至1.5mM、优选地7.0mM至1.5mM、优选地6.0mM至1.5mM、优选地5.0mM至1.5mM、优选地4.0mM至1.5mM、优选地3.0至1.5mM、优选地2.5mM至1.0mM、优选地2.0mM至1.1mM、优选地1.85mM至1.0mM的浓度下测量时，这些螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2.0mM降低至0.10mM。
游离钙离子浓度从2.0mM Ca2+降低至0.10mM对应于水硬度从200ppm(作为CaCO3，在酸性CO2的存在下为Ca(HCO3)2的形式)降低至10ppm。最低助洗剂水平从螯合剂的钠盐并基于100％干燥螯合剂来计算。
该螯合剂的螯合作用还可相对于柠檬酸盐测量。能够将游离钙离子浓度的量从2.0mM降低至0.10mM的柠檬酸盐的浓度被指定为值1并且将这些螯合剂的结果与该值进行比较。当在pH 8.0和21℃测量时，比柠檬酸盐的浓度低0.9倍以下，例如低0.8倍以下、例如低0.7倍以下、例如低0.6倍以下、例如低0.5倍以下、例如低0.4倍以下、例如低0.3倍以下、例如低0.2倍以下、例如低0.1倍以下的浓度的根据本发明的优选的螯合剂能够将游离钙浓度从2.0mM降低至0.10mM。当在pH 8.0和21℃，使用用于确定游离钙浓度的钙离子选择性电极测量时，当在80mM氯化钾和49mM EPPS中在21℃和pH 8.0测量时，比柠檬酸盐的浓度低0.9倍以下，例如低0.8倍以下、例如低0.7倍以下、例如低0.6倍以下、例如低0.5倍以下、例如低0.4倍以下、例如低0.3倍以下、例如低0.2倍以下、例如低0.1倍以下的浓度的根据本发明的优选的螯合剂能够将游离钙浓度从2.0mM降低至0.10mM。
在特别优选的实施例中，当在pH 8.0和21℃测量时，在比能够将游离钙离子浓度从2.0mM降低至0.10mM的柠檬酸盐的浓度低1.0倍至0.1倍以下，例如低0.9倍至0.1倍以下、例如低0.8倍至0.1倍以下、例如低0.7倍至0.1倍以下、例如低0.6倍至0.1倍以下、例如低0.5倍至0.1倍以下、例如低0.4倍至0.1倍以下、例如低0.35倍至0.1倍以下、例如低0.3倍至0.1倍以下的螯合剂浓度下，该螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2.0mM降低至0.10mM。术语“助洗剂”可以通过M.K.Nagaraja等人,JAOCS[美国油脂化学协会杂志],第61卷,第9期(1984年9月),第1475-1478页中描述的测试来进行分类以确定在pH 8下将水硬度从溶液中的2.0mM(作为CaCO3)降低至0.10mM所需的最小助洗剂水平。助洗剂可以具体地为与例如钙和镁离子形成水溶性络合物的螯合剂。如本文所使用的术语“辅助组合物”是指任何不被认为涵盖在术语“洗涤剂组合物”中的组合物。因此，辅助组合物可以是“预处理组合物”，即在主洗涤之前施用于待清洁材料的组合物，“浸泡组合物”，即用于在主洗涤之前通过浸泡进行预处理的组合物，或“加强组合物”，即用于提高在主洗涤中使用的洗涤剂的洗涤性能的组合物。术语“辅助组合物”意指针对所希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、棒状、糊状、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选地与用于该组合物中的酶可相容。在一些实施例中，颗粒组合物处于“压缩”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。
如本文所使用的术语“主洗涤”是指整个洗涤循环中的步骤中的一个，其通常由以下步骤组成：预处理、预洗涤、主洗涤、漂洗和干燥。在一些情况下，不需要预处理或预洗涤步骤。该辅助组合物主要用于预处理、预洗涤或主洗涤步骤。通常在主洗涤步骤中添加用于衣物洗涤的洗涤剂组合物。在评估洗涤性能时，最经常在洗涤、漂洗和干燥步骤之后进行评估。
变体命名规则
出于本发明的目的，可以将SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6中披露的多肽用于确定另一种多肽中对应的氨基酸残基。将另一种多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中披露的多肽(这取决于它是脂肪酶、α-淀粉酶或蛋白酶)进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势],16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定对应于在SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干种计算机程序，使用其相应的默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多种序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010，Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)。
当其他酶与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6的多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可以使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则甚至可以实现更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有目的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
当必须鉴定相应的氨基酸位置时确定使用哪种比对工具是在技术人员的知识范围内。因此，考虑了在本发明的上下文中可以使用本领域技术人员发现合适的任何可用的比对工具。
在描述本文所述的酶变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。氨基酸位置表示为H1、G109等。
本文所述的变体与亲本多肽相比包含一个或多个修饰。因此，变体可以包含保守修饰，具体而言，此类保守修饰可以是保守取代。保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代包括：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Asn/Gln、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Glu/Gln、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质使得多肽的物理化学性质发生改变。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、经取代的氨基酸。因此，在位置G109处的甘氨酸被丙氨酸取代表示为“Gly109Ala”或“G109A”。多个突变由加号(“+”)或由逗号(“,”)分开，例如“Gly109Ala+Leu173Pro”或“G109A,L173P”表示在位置109和173处的甘氨酸(G)和亮氨酸(L)分别被丙氨酸(A)和脯氨酸(P)取代。如果在给定位置中可以取代多于一种氨基酸，那么将这些氨基酸以分隔号(例如/)列出或分开。因此，如果根据本发明的Ala和Pro两者都可以被取代，代替占据位置109的氨基酸，这被表示为X109A/P，其中本实例中的X表明不同酶可以是亲本，例如像具有SEQ ID NO:1的α-淀粉酶或与其具有至少75％同一性的α-淀粉酶。因此，在一些情况下，将这些变体表示为109A/P或X109A/P，表明将被取代的氨基酸取决于亲本酶而变化。
缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置181处的精氨酸的缺失表示为“Arg181*”或“R181*”。多个缺失由加号(“+”)或逗号分开，例如“Arg181*+Gly182*”或“R181*+G182*”或“R181*,G182*”。
插入：另外的氨基酸残基的插入，例如像在G#1之后插入赖氨酸可表示为：Gly#1GlyLys或G#1GK。可替代地，另外的氨基酸残基的插入，如在G109之后插入赖氨酸可表示为：*109aL。当插入多于一个的氨基酸残基，例如像在109之后插入Lys和Ala时，这种插入可表示为：Gly109GlyLysAla或G109GKA。在此类情况下，还可以通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基位置编号处来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号，在这个实例中：*109aK*109bA。
总而言之，取代、缺失和插入在此可以被称为“修饰”。因此，除非上下文另有说明，应当理解的是，本文描述的任何变体包括修饰，例如取代、缺失和/或插入。
多个修饰：包含多个修饰的变体由加号(“+”)、分隔号(“/”)或由逗号(“，”)分开，例如，“Gly109Pro+Lys391Ala”或“G109P,K391A”表示在位置109处的甘氨酸和在位置391处的赖氨酸分别如上所述被脯氨酸和丙氨酸取代。
不同修饰：在可以在一个位置上引入不同的修饰的情况下，这些不同的修饰由分隔号(“/”)或由逗号(“，”)分开，例如“Gly109Pro,Lys”或“G109P,K”表示在位置109处的甘氨酸被脯氨酸或赖氨酸取代。因此，“Gly109Pro,Lys+Lys391Ala”指示了以下变体：“Gly109Pro+Lys391Ala”、“Gly109Lys+Lys391Ala”或“G109P,K+K391A”。
具体实施方式
本发明涉及脂肪酶变体以及包含一种或多种表面活性剂和本发明的一种或多种脂肪酶变体的组合物。
本发明的脂肪酶变体
在第一方面，本发明涉及亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
(a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
(b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
(c)具有脂肪酶活性。
术语“变体”意指通过人工修饰的变体。在一方面，该变体是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、以及至少90％纯的，如通过SDS PAGE所确定的。术语“修饰”在本文其他地方进行描述。该术语是如本文描述的术语“取代”、“插入”和“缺失”的总体名称。
如本文所使用的术语“与……对应的”是指用来确定序列中的特定氨基酸的方式，其中参考了特定氨基酸序列。例如出于本发明的目的，当参考特定氨基酸位置时，技术人员会能够将另一氨基酸序列与所述已经被参考的氨基酸序列进行比对，从而确定哪一个特定氨基酸可能在所述另一氨基酸序列中是感兴趣的。已经在本文其他地方描述了另一氨基酸序列与例如如在SEQ ID NO:1中阐明的序列或本文列出的任何其他序列的比对。可使用替代性比对方法，并且这些比对方法是本领域技术人员熟知的。
与亲本脂肪酶相比，本文所述的脂肪酶变体具有改进的活性，并且与亲本脂肪酶特别是SEQ ID NO:1相比任选地具有改进的气味减少。在某些实施例中，该脂肪酶变体进一步具有改进的稳定性。相应地，该脂肪酶变体在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的位置上包含至少一个修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰。
在优选的实施例中，本发明的脂肪酶变体包含取代E1C+N233C和一个或多个另外的取代。
根据本发明的组合物的脂肪酶变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％但小于100％的序列同一性。相应地，在一个实施例中，该脂肪酶变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％，例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，该脂肪酶变体在选自与SEQ ID NO:1的E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的位置中的两个位置上包含修饰。因此，在具体的实施例中，该脂肪酶变体在选自下组的两个位置上包含修饰，该组由以下组成：E1+V2、E1+N33、E1+F51、E1+E56、E1+L69、E1+K98、E1+V176、E1+H198、E1+E210、E1+Y220、E1+L227、V2+N33、V2+F51、V2+E56、V2+L69、V2+K98、V2+V176、V2+H198、V2+E210、V2+Y220、V2+L227、N33+F51、N33+E56、N33+L69、N33+K98、N33+V176、N33+H198、N33+E210、N33+Y220、N33+L227、F51+E56、F51+L69、F51+K98、F51+V176、F51+H198、F51+E210、F51+Y220、F51+L227、E56+L69、E56+K98、E56+V176、E56+H198、E56+E210、E56+Y220、E56+L227、L69+K98、L69+V176、L69+H198、L69+E210、L69+Y220、L69+L227、K98+V176、K98+H198、K98+E210、K98+Y220、K98+L227、V176+H198、V176+E210、V176+Y220、V176+L227、H198+E210、H198+Y220、H198+L227、E210+Y220、E210+L227和Y220+L227，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在具体的实施例中，该脂肪酶变体在选自与位置E1、V2、D27、N33、G38、F51、E56、L69、D96、K98、D111、G163、V176、H198、E210、Y220、L227、T231、N233、N233、D254和P256对应的位置中的两个位置上包含修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。因此，在具体的实施例中，该脂肪酶变体在选自下组的两个位置上包含修饰，该组由以下组成：E1+V2、E1+D27、E1+N33、E1+G38、E1+F51、E1+E56、E1+L69、E1+D96、E1+K98、E1+D111、E1+G163、E1+V176、E1+H198、E1+E210、E1+Y220、E1+L227、E1+T231、E1+N233、E1+D254、E1+P256、V2+D27、V2+N33、V2+G38、V2+F51、V2+E56、V2+L69、V2+D96、V2+K98、V2+D111、V2+G163、V2+V176、V2+H198、V2+E210、V2+Y220、V2+L227、V2+T231、V2+N233、V2+D254、V2+P256、D27+N33、D27+G38、D27+F51、D27+E56、D27+L69、D27+D96、D27+K98、D27+D111、D27+G163、D27+V176、D27+H198、D27+E210、D27+Y220、D27+L227、D27+T231、D27+N233、D27+D254、D27+P256、N33+G38、N33+F51、N33+E56、N33+L69、N33+D96、N33+K98、N33+D111、N33+G163、N33+V176、N33+H198、N33+E210、N33+Y220、N33+L227、N33+T231、N33+N233、N33+D254、N33+P256、G38+F51、G38+E56、G38+L69、G38+D96、G38+K98、G38+D111、G38+G163、G38+V176、G38+H198、G38+E210、G38+Y220、G38+L227、G38+T231、G38+N233、G38+D254、G38+P256、F51+E56、F51+L69、F51+D96、F51+K98、F51+D111、F51+G163、F51+V176、F51+H198、F51+E210、F51+Y220、F51+L227、F51+T231、F51+N233、F51+D254、F51+P256、E56+L69、E56+D96、E56+K98、E56+D111、E56+G163、E56+V176、E56+H198、E56+E210、E56+Y220、E56+L227、E56+T231、E56+N233、E56+D254、E56+P256、L69+D96、L69+K98、L69+D111、L69+G163、L69+V176、L69+H198、L69+E210、L69+Y220、L69+L227、L69+T231、L69+N233、L69+D254、L69+P256、D96+K98、D96+D111、D96+G163、D96+V176、D96+H198、D96+E210、D96+Y220、D96+L227、D96+T231、D96+N233、D96+D254、D96+P256、K98+D111、K98+G163、K98+V176、K98+H198、K98+E210、K98+Y220、K98+L227、K98+T231、K98+N233、K98+D254、K98+P256、D111+G163、D111+V176、D111+H198、D111+E210、D111+Y220、D111+L227、D111+T231、D111+N233、D111+D254、D111+P256、G163+V176、G163+H198、G163+E210、G163+Y220、G163+L227、G163+T231、G163+N233、G163+D254、G163+P256、V176+H198、V176+E210、V176+Y220、V176+L227、V176+T231、V176+N233、V176+D254、V176+P256、H198+E210、H198+Y220、H198+L227、H198+T231、H198+N233、H198+D254、H198+P256、E210+Y220、E210+L227、E210+T231、E210+N233、E210+D254、E210+P256、Y220+L227、Y220+T231、Y220+N233、Y220+D254、Y220+P256、L227+T231、L227+N233、L227+D254、L227+P256、T231+N233、T231+D254、T231+P256、N233+D254、N233+P256和D254+P256，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该脂肪酶变体在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的三个位置上包含修饰。因此，在一个实施例中，该脂肪酶变体在选自下组的三个位置上包含修饰，该组由以下组成：E1+V2+N33、E1+V2+F51、E1+V2+E56、E1+V2+L69、E1+V2+K98、E1+V2+V176、E1+V2+H198、E1+V2+E210、E1+V2+Y220、E1+V2+L227、E1+N33+F51、E1+N33+E56、E1+N33+L69、E1+N33+K98、E1+N33+V176、E1+N33+H198、E1+N33+E210、E1+N33+Y220、E1+N33+L227、E1+F51+E56、E1+F51+L69、E1+F51+K98、E1+F51+V176、E1+F51+H198、E1+F51+E210、E1+F51+Y220、E1+F51+L227、E1+E56+L69、E1+E56+K98、E1+E56+V176、E1+E56+H198、E1+E56+E210、E1+E56+Y220、E1+E56+L227、E1+L69+K98、E1+L69+V176、E1+L69+H198、E1+L69+E210、E1+L69+Y220、E1+L69+L227、E1+K98+V176、E1+K98+H198、E1+K98+E210、E1+K98+Y220、E1+K98+L227、E1+V176+H198、E1+V176+E210、E1+V176+Y220、E1+V176+L227、E1+H198+E210、E1+H198+Y220、E1+H198+L227、E1+E210+Y220、E1+E210+L227、E1+Y220+L227、V2+N33+F51、V2+N33+E56、V2+N33+L69、V2+N33+K98、V2+N33+V176、V2+N33+H198、V2+N33+E210、V2+N33+Y220、V2+N33+L227、V2+F51+E56、V2+F51+L69、V2+F51+K98、V2+F51+V176、V2+F51+H198、V2+F51+E210、V2+F51+Y220、V2+F51+L227、V2+E56+L69、V2+E56+K98、V2+E56+V176、V2+E56+H198、V2+E56+E210、V2+E56+Y220、V2+E56+L227、V2+L69+K98、V2+L69+V176、V2+L69+H198、V2+L69+E210、V2+L69+Y220、V2+L69+L227、V2+K98+V176、V2+K98+H198、V2+K98+E210、V2+K98+Y220、V2+K98+L227、V2+V176+H198、V2+V176+E210、V2+V176+Y220、V2+V176+L227、V2+H198+E210、V2+H198+Y220、V2+H198+L227、V2+E210+Y220、V2+E210+L227、V2+Y220+L227、N33+F51+E56、N33+F51+L69、N33+F51+K98、N33+F51+V176、N33+F51+H198、N33+F51+E210、N33+F51+Y220、N33+F51+L227、N33+E56+L69、N33+E56+K98、N33+E56+V176、N33+E56+H198、N33+E56+E210、N33+E56+Y220、N33+E56+L227、N33+L69+K98、N33+L69+V176、N33+L69+H198、N33+L69+E210、N33+L69+Y220、N33+L69+L227、N33+K98+V176、N33+K98+H198、N33+K98+E210、N33+K98+Y220、N33+K98+L227、N33+V176+H198、N33+V176+E210、N33+V176+Y220、N33+V176+L227、N33+H198+E210、N33+H198+Y220、N33+H198+L227、N33+E210+Y220、N33+E210+L227、N33+Y220+L227、F51+E56+L69、F51+E56+K98、F51+E56+V176、F51+E56+H198、F51+E56+E210、F51+E56+Y220、F51+E56+L227、F51+L69+K98、F51+L69+V176、F51+L69+H198、F51+L69+E210、F51+L69+Y220、F51+L69+L227、F51+K98+V176、F51+K98+H198、F51+K98+E210、F51+K98+Y220、F51+K98+L227、F51+V176+H198、F51+V176+E210、F51+V176+Y220、F51+V176+L227、F51+H198+E210、F51+H198+Y220、F51+H198+L227、F51+E210+Y220、F51+E210+L227、F51+Y220+L227、E56+L69+K98、E56+L69+V176、E56+L69+H198、E56+L69+E210、E56+L69+Y220、E56+L69+L227、E56+K98+V176、E56+K98+H198、E56+K98+E210、E56+K98+Y220、E56+K98+L227、E56+V176+H198、E56+V176+E210、E56+V176+Y220、E56+V176+L227、E56+H198+E210、E56+H198+Y220、E56+H198+L227、E56+E210+Y220、E56+E210+L227、E56+Y220+L227、L69+K98+V176、L69+K98+H198、L69+K98+E210、L69+K98+Y220、L69+K98+L227、L69+V176+H198、L69+V176+E210、L69+V176+Y220、L69+V176+L227、L69+H198+E210、L69+H198+Y220、L69+H198+L227、L69+E210+Y220、L69+E210+L227、L69+Y220+L227、K98+V176+H198、K98+V176+E210、K98+V176+Y220、K98+V176+L227、K98+H198+E210、K98+H198+Y220、K98+H198+L227、K98+E210+Y220、K98+E210+L227、K98+Y220+L227、V176+H198+E210、V176+H198+Y220、V176+H198+L227、V176+E210+Y220、V176+E210+L227、V176+Y220+L227、H198+E210+Y220、H198+E210+L227、H198+Y220+L227和E210+Y220+L227，其中根据SEQID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该脂肪酶变体在与位置E1、V2、D27、N33、G38、F51、E56、L69、D96、K98、D111、G163、V176、H198、E210、Y220、L227、T231、N233、N233、D254和P256对应的三个位置上包含修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。因此，在具体的实施例中，该脂肪酶变体在选自下组的三个位置上包含修饰，该组由以下组成：E1+V2+D27、E1+V2+N33、E1+V2+G38、E1+V2+F51、E1+V2+E56、E1+V2+L69、E1+V2+D96、E1+V2+K98、E1+V2+D111、E1+V2+G163、E1+V2+V176、E1+V2+H198、E1+V2+E210、E1+V2+Y220、E1+V2+L227、E1+V2+T231、E1+V2+N233、E1+V2+D254、E1+V2+P256、E1+D27+N33、E1+D27+G38、E1+D27+F51、E1+D27+E56、E1+D27+L69、E1+D27+D96、E1+D27+K98、E1+D27+D111、E1+D27+G163、E1+D27+V176、E1+D27+H198、E1+D27+E210、E1+D27+Y220、E1+D27+L227、E1+D27+T231、E1+D27+N233、E1+D27+D254、E1+D27+P256、E1+N33+G38、E1+N33+F51、E1+N33+E56、E1+N33+L69、E1+N33+D96、E1+N33+K98、E1+N33+D111、E1+N33+G163、E1+N33+V176、E1+N33+H198、E1+N33+E210、E1+N33+Y220、E1+N33+L227、E1+N33+T231、E1+N33+N233、E1+N33+D254、E1+N33+P256、E1+G38+F51、E1+G38+E56、E1+G38+L69、E1+G38+D96、E1+G38+K98、E1+G38+D111、E1+G38+G163、E1+G38+V176、E1+G38+H198、E1+G38+E210、E1+G38+Y220、E1+G38+L227、E1+G38+T231、E1+G38+N233、E1+G38+D254、E1+G38+P256、E1+F51+E56、E1+F51+L69、E1+F51+D96、E1+F51+K98、E1+F51+D111、E1+F51+G163、E1+F51+V176、E1+F51+H198、E1+F51+E210、E1+F51+Y220、E1+F51+L227、E1+F51+T231、E1+F51+N233、E1+F51+D254、E1+F51+P256、E1+E56+L69、E1+E56+D96、E1+E56+K98、E1+E56+D111、E1+E56+G163、E1+E56+V176、E1+E56+H198、E1+E56+E210、E1+E56+Y220、E1+E56+L227、E1+E56+T231、E1+E56+N233、E1+E56+D254、E1+E56+P256、E1+L69+D96、E1+L69+K98、E1+L69+D111、E1+L69+G163、E1+L69+V176、E1+L69+H198、E1+L69+E210、E1+L69+Y220、E1+L69+L227、E1+L69+T231、E1+L69+N233、E1+L69+D254、E1+L69+P256、E1+D96+K98、E1+D96+D111、E1+D96+G163、E1+D96+V176、E1+D96+H198、E1+D96+E210、E1+D96+Y220、E1+D96+L227、E1+D96+T231、E1+D96+N233、E1+D96+D254、E1+D96+P256、E1+K98+D111、E1+K98+G163、E1+K98+V176、E1+K98+H198、E1+K98+E210、E1+K98+Y220、E1+K98+L227、E1+K98+T231、E1+K98+N233、E1+K98+D254、E1+K98+P256、E1+D111+G163、E1+D111+V176、E1+D111+H198、E1+D111+E210、E1+D111+Y220、E1+D111+L227、E1+D111+T231、E1+D111+N233、E1+D111+D254、E1+D111+P256、E1+G163+V176、E1+G163+H198、E1+G163+E210、E1+G163+Y220、E1+G163+L227、E1+G163+T231、E1+G163+N233、E1+G163+D254、E1+G163+P256、E1+V176+H198、E1+V176+E210、E1+V176+Y220、E1+V176+L227、E1+V176+T231、E1+V176+N233、E1+V176+D254、E1+V176+P256、E1+H198+E210、E1+H198+Y220、E1+H198+L227、E1+H198+T231、E1+H198+N233、E1+H198+D254、E1+H198+P256、E1+E210+Y220、E1+E210+L227、E1+E210+T231、E1+E210+N233、E1+E210+D254、E1+E210+P256、E1+Y220+L227、E1+Y220+T231、E1+Y220+N233、E1+Y220+D254、E1+Y220+P256、E1+L227+T231、E1+L227+N233、E1+L227+D254、E1+L227+P256、E1+T231+N233、E1+T231+D254、E1+T231+P256、E1+N233+D254、E1+N233+P256、E1+D254+P256、V2+D27+N33、V2+D27+G38、V2+D27+F51、V2+D27+E56、V2+D27+L69、V2+D27+D96、V2+D27+K98、V2+D27+D111、V2+D27+G163、V2+D27+V176、V2+D27+H198、V2+D27+E210、V2+D27+Y220、V2+D27+L227、V2+D27+T231、V2+D27+N233、V2+D27+D254、V2+D27+P256、V2+N33+G38、V2+N33+F51、V2+N33+E56、V2+N33+L69、V2+N33+D96、V2+N33+K98、V2+N33+D111、V2+N33+G163、V2+N33+V176、V2+N33+H198、V2+N33+E210、V2+N33+Y220、V2+N33+L227、V2+N33+T231、V2+N33+N233、V2+N33+D254、V2+N33+P256、V2+G38+F51、V2+G38+E56、V2+G38+L69、V2+G38+D96、V2+G38+K98、V2+G38+D111、V2+G38+G163、V2+G38+V176、V2+G38+H198、V2+G38+E210、V2+G38+Y220、V2+G38+L227、V2+G38+T231、V2+G38+N233、V2+G38+D254、V2+G38+P256、V2+F51+E56、V2+F51+L69、V2+F51+D96、V2+F51+K98、V2+F51+D111、V2+F51+G163、V2+F51+V176、V2+F51+H198、V2+F51+E210、V2+F51+Y220、V2+F51+L227、V2+F51+T231、V2+F51+N233、V2+F51+D254、V2+F51+P256、V2+E56+L69、V2+E56+D96、V2+E56+K98、V2+E56+D111、V2+E56+G163、V2+E56+V176、V2+E56+H198、V2+E56+E210、V2+E56+Y220、V2+E56+L227、V2+E56+T231、V2+E56+N233、V2+E56+D254、V2+E56+P256、V2+L69+D96、V2+L69+K98、V2+L69+D111、V2+L69+G163、V2+L69+V176、V2+L69+H198、V2+L69+E210、V2+L69+Y220、V2+L69+L227、V2+L69+T231、V2+L69+N233、V2+L69+D254、V2+L69+P256、V2+D96+K98、V2+D96+D111、V2+D96+G163、V2+D96+V176、V2+D96+H198、V2+D96+E210、V2+D96+Y220、V2+D96+L227、V2+D96+T231、V2+D96+N233、V2+D96+D254、V2+D96+P256、V2+K98+D111、V2+K98+G163、V2+K98+V176、V2+K98+H198、V2+K98+E210、V2+K98+Y220、V2+K98+L227、V2+K98+T231、V2+K98+N233、V2+K98+D254、V2+K98+P256、V2+D111+G163、V2+D111+V176、V2+D111+H198、V2+D111+E210、V2+D111+Y220、V2+D111+L227、V2+D111+T231、V2+D111+N233、V2+D111+D254、V2+D111+P256、V2+G163+V176、V2+G163+H198、V2+G163+E210、V2+G163+Y220、V2+G163+L227、V2+G163+T231、V2+G163+N233、V2+G163+D254、V2+G163+P256、V2+V176+H198、V2+V176+E210、V2+V176+Y220、V2+V176+L227、V2+V176+T231、V2+V176+N233、V2+V176+D254、V2+V176+P256、V2+H198+E210、V2+H198+Y220、V2+H198+L227、V2+H198+T231、V2+H198+N233、V2+H198+D254、V2+H198+P256、V2+E210+Y220、V2+E210+L227、V2+E210+T231、V2+E210+N233、V2+E210+D254、V2+E210+P256、V2+Y220+L227、V2+Y220+T231、V2+Y220+N233、V2+Y220+D254、V2+Y220+P256、V2+L227+T231、V2+L227+N233、V2+L227+D254、V2+L227+P256、V2+T231+N233、V2+T231+D254、V2+T231+P256、V2+N233+D254、V2+N233+P256、V2+D254+P256、D27+N33+G38、D27+N33+F51、D27+N33+E56、D27+N33+L69、D27+N33+D96、D27+N33+K98、D27+N33+D111、D27+N33+G163、D27+N33+V176、D27+N33+H198、D27+N33+E210、D27+N33+Y220、D27+N33+L227、D27+N33+T231、D27+N33+N233、D27+N33+D254、D27+N33+P256、D27+G38+F51、D27+G38+E56、D27+G38+L69、D27+G38+D96、D27+G38+K98、D27+G38+D111、D27+G38+G163、D27+G38+V176、D27+G38+H198、D27+G38+E210、D27+G38+Y220、D27+G38+L227、D27+G38+T231、D27+G38+N233、D27+G38+D254、D27+G38+P256、D27+F51+E56、D27+F51+L69、D27+F51+D96、D27+F51+K98、D27+F51+D111、D27+F51+G163、D27+F51+V176、D27+F51+H198、D27+F51+E210、D27+F51+Y220、D27+F51+L227、D27+F51+T231、D27+F51+N233、D27+F51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ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该组合物包含如下脂肪酶变体，该脂肪酶变体包含至少一个以下修饰：E1C、V2Y、D27R、N33K、G38A、F51V、E56K、L69R、D96E、K98I、D111A、G163K、V176L、H198S、E210K、Y220F、L227G、T231R、N233R、N233C、D254S和P256T，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该脂肪酶变体包含与选自下组的取代对应的两个取代，该组由以下组成：E1C+V2Y、E1C+D27R、E1C+N33K、E1C+G38A、E1C+F51V、E1C+E56K、E1C+L69R、E1C+D96E、E1C+K98I、E1C+D111A、E1C+G163K、E1C+V176L、E1C+H198S、E1C+E210K、E1C+Y220F、E1C+L227G、E1C+T231R、E1C+N233R、E1C+N233C、E1C+D254S、E1C+P256T、V2Y+D27R、V2Y+N33K、V2Y+G38A、V2Y+F51V、V2Y+E56K、V2Y+L69R、V2Y+D96E、V2Y+K98I、V2Y+D111A、V2Y+G163K、V2Y+V176L、V2Y+H198S、V2Y+E210K、V2Y+Y220F、V2Y+L227G、V2Y+T231R,V2Y+N233R,V2Y+N233C、V2Y+D254S、V2Y+P256T、D27R+N33K、D27R+G38A、D27R+F51V、D27R+E56K、D27R+L69R、D27R+D96E、D27R+K98I、D27R+D111A、D27R+G163K、D27R+V176L、D27R+H198S、D27R+E210K、D27R+Y220F、D27R+L227G、D27R+T231R、D27R+N233R、D27R+N233C、D27R+D254S、D27R+P256T、N33K+G38A、N33K+F51V、N33K+E56K、N33K+L69R、N33K+D96E、N33K+K98I、N33K+D111A、N33K+G163K、N33K+V176L、N33K+H198S、N33K+E210K、N33K+Y220F、N33K+L227G、N33K+T231R、N33K+N233R、N33K+N233C、N33K+D254S、N33K+P256T、G38A+F51V、G38A+E56K、G38A+L69R、G38A+D96E、G38A+K98I、G38A+D111A、G38A+G163K、G38A+V176L、G38A+H198S、G38A+E210K、G38A+Y220F、G38A+L227G、G38A+T231R、G38A+N233R、G38A+N233C、G38A+D254S、G38A+P256T、F51V+E56K、F51V+L69R、F51V+D96E、F51V+K98I、F51V+D111A、F51V+G163K、F51V+V176L、F51V+H198S、F51V+E210K、F51V+Y220F、F51V+L227G、F51V+T231R、F51V+N233R、F51V+N233C、F51V+D254S、F51V+P256T、E56K+L69R、E56K+D96E、E56K+K98I、E56K+D111A、E56K+G163K、E56K+V176L、E56K+H198S、E56K+E210K、E56K+Y220F、E56K+L227G、E56K+T231R、E56K+N233R、E56K+N233C、E56K+D254S、E56K+P256T、L69R+D96E、L69R+K98I、L69R+D111A、L69R+G163K、L69R+V176L、L69R+H198S、L69R+E210K、L69R+Y220F、L69R+L227G、L69R+T231R、L69R+N233R、L69R+N233C、L69R+D254S、L69R+P256T、D96E+K98I、D96E+D111A、D96E+G163K、D96E+V176L、D96E+H198S、D96E+E210K、D96E+Y220F、D96E+L227G、D96E+T231R、D96E+N233R,D96E+N233C、D96E+D254S、D96E+P256T、K98I+D111A、K98I+G163K、K98I+V176L、K98I+H198S、K98I+E210K、K98I+Y220F、K98I+L227G、K98I+T231R、K98I+N233R、K98I+N233C、K98I+D254S、K98I+P256T、D111A+G163K、D111A+V176L、D111A+H198S、D111A+E210K、D111A+Y220F、D111A+L227G、D111A+T231R、D111A+N233R、D111A+N233C、D111A+D254S、D111A+P256T、G163K+V176L、G163K+H198S、G163K+E210K、G163K+Y220F、G163K+L227G、G163K+T231R、G163K+N233R、G163K+N233C、G163K+D254S、G163K+P256T、V176L+H198S、V176L+E210K、V176L+Y220F、V176L+L227G、V176L+T231R、V176L+N233R、V176L+N233C、V176L+D254S、V176L+P256T、H198S+E210K、H198S+Y220F、H198S+L227G、H198S+T231R、H198S+N233R、H198S+N233C、H198S+D254S、H198S+P256T、E210K+Y220F、E210K+L227G、E210K+T231R、E210K+N233R、E210K+N233C、E210K+D254S、E210K+P256T、Y220F+L227G、Y220F+T231R、Y220F+N233R、Y220F+N233C、Y220F+D254S、Y220F+P256T、L227G+T231R、L227G+N233R、L227G+N233C、L227G+D254S、L227G+P256T、T231R+N233R、T231R+N233C、T231R+D254S、T231R+P256T、N233R+N233C、N233R+D254S、N233R+P256T、N233C+D254S、N233C+P256T和D254S+P256T，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该脂肪酶变体包含与选自下组的取代对应的三个取代，该组由以下组成：E1C+V2Y+D27R、E1C+V2Y+N33K、E1C+V2Y+G38A、E1C+V2Y+F51V、E1C+V2Y+E56K、E1C+V2Y+L69R、E1C+V2Y+D96E、E1C+V2Y+K98I、E1C+V2Y+D111A、E1C+V2Y+G163K、E1C+V2Y+V176L、E1C+V2Y+H198S、E1C+V2Y+E210K、E1C+V2Y+Y220F、E1C+V2Y+L227G、E1C+V2Y+T231R、E1C+V2Y+N233R、E1C+V2Y+N233C、E1C+V2Y+D254S、E1C+V2Y+P256T、E1C+D27R+N33K、E1C+D27R+G38A、E1C+D27R+F51V、E1C+D27R+E56K、E1C+D27R+L69R、E1C+D27R+D96E、E1C+D27R+K98I、E1C+D27R+D111A、E1C+D27R+G163K、E1C+D27R+V176L、E1C+D27R+H198S、E1C+D27R+E210K、E1C+D27R+Y220F、E1C+D27R+L227G、E1C+D27R+T231R、E1C+D27R+N233R、E1C+D27R+N233C、E1C+D27R+D254S、E1C+D27R+P256T、E1C+N33K+G38A、E1C+N33K+F51V、E1C+N33K+E56K、E1C+N33K+L69R、E1C+N33K+D96E、E1C+N33K+K98I、E1C+N33K+D111A、E1C+N33K+G163K、E1C+N33K+V176L、E1C+N33K+H198S、E1C+N33K+E210K、E1C+N33K+Y220F、E1C+N33K+L227G、E1C+N33K+T231R、E1C+N33K+N233R、E1C+N33K+N233C、E1C+N33K+D254S、E1C+N33K+P256T、E1C+G38A+F51V、E1C+G38A+E56K、E1C+G38A+L69R、E1C+G38A+D96E、E1C+G38A+K98I、E1C+G38A+D111A、E1C+G38A+G163K、E1C+G38A+V176L、E1C+G38A+H198S、E1C+G38A+E210K、E1C+G38A+Y220F、E1C+G38A+L227G、E1C+G38A+T231R、E1C+G38A+N233R、E1C+G38A+N233C、E1C+G38A+D254S、E1C+G38A+P256T、E1C+F51V+E56K、E1C+F51V+L69R、E1C+F51V+D96E、E1C+F51V+K98I、E1C+F51V+D111A、E1C+F51V+G163K、E1C+F51V+V176L、E1C+F51V+H198S、E1C+F51V+E210K、E1C+F51V+Y220F、E1C+F51V+L227G、E1C+F51V+T231R、E1C+F51V+N233R、E1C+F51V+N233C、E1C+F51V+D254S、E1C+F51V+P256T、E1C+E56K+L69R、E1C+E56K+D96E、E1C+E56K+K98I、E1C+E56K+D111A、E1C+E56K+G163K、E1C+E56K+V176L、E1C+E56K+H198S、E1C+E56K+E210K、E1C+E56K+Y220F、E1C+E56K+L227G、E1C+E56K+T231R、E1C+E56K+N233R、E1C+E56K+N233C、E1C+E56K+D254S、E1C+E56K+P256T、E1C+L69R+D96E、E1C+L69R+K98I、E1C+L69R+D111A、E1C+L69R+G163K、E1C+L69R+V176L、E1C+L69R+H198S、E1C+L69R+E210K、E1C+L69R+Y220F、E1C+L69R+L227G、E1C+L69R+T231R、E1C+L69R+N233R、E1C+L69R+N233C、E1C+L69R+D254S、E1C+L69R+P256T、E1C+D96E+K98I、E1C+D96E+D111A、E1C+D96E+G163K、E1C+D96E+V176L、E1C+D96E+H198S、E1C+D96E+E210K、E1C+D96E+Y220F、E1C+D96E+L227G、E1C+D96E+T231R、E1C+D96E+N233R、E1C+D96E+N233C、E1C+D96E+D254S、E1C+D96E+P256T、E1C+K98I+D111A、E1C+K98I+G163K、E1C+K98I+V176L、E1C+K98I+H198S、E1C+K98I+E210K、E1C+K98I+Y220F、E1C+K98I+L227G、E1C+K98I+T231R、E1C+K98I+N233R、E1C+K98I+N233C、E1C+K98I+D254S、E1C+K98I+P256T、E1C+D111A+G163K、E1C+D111A+V176L、E1C+D111A+H198S、E1C+D111A+E210K、E1C+D111A+Y220F、E1C+D111A+L227G、E1C+D111A+T231R、E1C+D111A+N233R、E1C+D111A+N233C、E1C+D111A+D254S、E1C+D111A+P256T、E1C+G163K+V176L、E1C+G163K+H198S、E1C+G163K+E210K、E1C+G163K+Y220F、E1C+G163K+L227G、E1C+G163K+T231R、E1C+G163K+N233R、E1C+G163K+N233C、E1C+G163K+D254S、E1C+G163K+P256T、E1C+V176L+H198S、E1C+V176L+E210K、E1C+V176L+Y220F、E1C+V176L+L227G、E1C+V176L+T231R、E1C+V176L+N233R、E1C+V176L+N233C、E1C+V176L+D254S、E1C+V176L+P256T、E1C+H198S+E210K、E1C+H198S+Y220F、E1C+H198S+L227G、E1C+H198S+T231R、E1C+H198S+N233R、E1C+H198S+N233C、E1C+H198S+D254S、E1C+H198S+P256T、E1C+E210K+Y220F、E1C+E210K+L227G、E1C+E210K+T231R、E1C+E210K+N233R、E1C+E210K+N233C、E1C+E210K+D254S、E1C+E210K+P256T、E1C+Y220F+L227G、E1C+Y220F+T231R、E1C+Y220F+N233R、E1C+Y220F+N233C、E1C+Y220F+D254S、E1C+Y220F+P256T、E1C+L227G+T231R、E1C+L227G+N233R、E1C+L227G+N233C、E1C+L227G+D254S、E1C+L227G+P256T、E1C+T231R+N233R、E1C+T231R+N233C、E1C+T231R+D254S、E1C+T231R+P256T、E1C+N233R+N233C、E1C+N233R+D254S、E1C+N233R+P256T、E1C+N233C+D254S、E1C+N233C+P256T、E1C+D254S+P256T、V2Y+D27R+N33K、V2Y+D27R+G38A、V2Y+D27R+F51V、V2Y+D27R+E56K、V2Y+D27R+L69R、V2Y+D27R+D96E、V2Y+D27R+K98I、V2Y+D27R+D111A、V2Y+D27R+G163K、V2Y+D27R+V176L、V2Y+D27R+H198S、V2Y+D27R+E210K、V2Y+D27R+Y220F、V2Y+D27R+L227G、V2Y+D27R+T231R、V2Y+D27R+N233R、V2Y+D27R+N233C、V2Y+D27R+D254S、V2Y+D27R+P256T、V2Y+N33K+G38A、V2Y+N33K+F51V、V2Y+N33K+E56K、V2Y+N33K+L69R、V2Y+N33K+D96E、V2Y+N33K+K98I、V2Y+N33K+D111A、V2Y+N33K+G163K、V2Y+N33K+V176L、V2Y+N33K+H198S、V2Y+N33K+E210K、V2Y+N33K+Y220F、V2Y+N33K+L227G、V2Y+N33K+T231R、V2Y+N33K+N233R、V2Y+N33K+N233C、V2Y+N33K+D254S、V2Y+N33K+P256T、V2Y+G38A+F51V、V2Y+G38A+E56K、V2Y+G38A+L69R、V2Y+G38A+D96E、V2Y+G38A+K98I、V2Y+G38A+D111A、V2Y+G38A+G163K、V2Y+G38A+V176L、V2Y+G38A+H198S、V2Y+G38A+E210K、V2Y+G38A+Y220F、V2Y+G38A+L227G、V2Y+G38A+T231R、V2Y+G38A+N233R、V2Y+G38A+N233C、V2Y+G38A+D254S、V2Y+G38A+P256T、V2Y+F51V+E56K、V2Y+F51V+L69R、V2Y+F51V+D96E、V2Y+F51V+K98I、V2Y+F51V+D111A、V2Y+F51V+G163K、V2Y+F51V+V176L、V2Y+F51V+H198S、V2Y+F51V+E210K、V2Y+F51V+Y220F、V2Y+F51V+L227G、V2Y+F51V+T231R、V2Y+F51V+N233R、V2Y+F51V+N233C、V2Y+F51V+D254S、V2Y+F51V+P256T、V2Y+E56K+L69R、V2Y+E56K+D96E、V2Y+E56K+K98I、V2Y+E56K+D111A、V2Y+E56K+G163K、V2Y+E56K+V176L、V2Y+E56K+H198S、V2Y+E56K+E210K、V2Y+E56K+Y220F、V2Y+E56K+L227G、V2Y+E56K+T231R、V2Y+E56K+N233R、V2Y+E56K+N233C、V2Y+E56K+D254S、V2Y+E56K+P256T、V2Y+L69R+D96E、V2Y+L69R+K98I、V2Y+L69R+D111A、V2Y+L69R+G163K、V2Y+L69R+V176L、V2Y+L69R+H198S、V2Y+L69R+E210K、V2Y+L69R+Y220F、V2Y+L69R+L227G、V2Y+L69R+T231R、V2Y+L69R+N233R、V2Y+L69R+N233C、V2Y+L69R+D254S、V2Y+L69R+P256T、V2Y+D96E+K98I、V2Y+D96E+D111A、V2Y+D96E+G163K、V2Y+D96E+V176L、V2Y+D96E+H198S、V2Y+D96E+E210K、V2Y+D96E+Y220F、V2Y+D96E+L227G、V2Y+D96E+T231R、V2Y+D96E+N233R、V2Y+D96E+N233C、V2Y+D96E+D254S、V2Y+D96E+P256T、V2Y+K98I+D111A、V2Y+K98I+G163K、V2Y+K98I+V176L、V2Y+K98I+H198S、V2Y+K98I+E210K、V2Y+K98I+Y220F、V2Y+K98I+L227G、V2Y+K98I+T231R、V2Y+K98I+N233R、V2Y+K98I+N233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20F+L227G+T231R、Y220F+L227G+N233R、Y220F+L227G+N233C、Y220F+L227G+D254S、Y220F+L227G+P256T、Y220F+T231R+N233R、Y220F+T231R+N233C、Y220F+T231R+D254S、Y220F+T231R+P256T、Y220F+N233R+N233C、Y220F+N233R+D254S、Y220F+N233R+P256T、Y220F+N233C+D254S、Y220F+N233C+P256T、Y220F+D254S+P256T、L227G+T231R+N233R、L227G+T231R+N233C、L227G+T231R+D254S、L227G+T231R+P256T、L227G+N233R+N233C、L227G+N233R+D254S、L227G+N233R+P256T、L227G+N233C+D254S、L227G+N233C+P256T、L227G+D254S+P256T、T231R+N233R+N233C、T231R+N233R+D254S、T231R+N233R+P256T、T231R+N233C+D254S、T231R+N233C+P256T、T231R+D254S+P256T、N233R+N233C+D254S、N233R+N233C+P256T、N233R+D254S+P256T和N233C+D254S+P256T，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在优选的实施例中，本发明的脂肪酶变体包含以下组的取代之一，使用SEQ IDNO:1进行编号：
在一个实施例中，该脂肪酶变体进一步包含选自下组的取代之一：S54T、S83T、G91A、A150G、I255A和E239C。
在一个实施例中，该亲本脂肪酶是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的序列同一性的脂肪酶。
在一个实施例中，该亲本脂肪酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中，该亲本脂肪酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在实施例中，该亲本脂肪酶包含具有以下取代的SEQ ID NO:1的氨基酸或由其组成：E1C+N233C。
本发明的组合物
在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含(i)至少一种表面活性剂和(ii)亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
(a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
(b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
(c)具有脂肪酶活性；并且
(d)与亲本脂肪酶相比具有改进的活性。
如本文所使用的术语“组合物”是指适用于从织物、硬表面或类似材料中去除污渍的任何种类的组合物。在一些实施例中，该组合物可以是洗涤剂组合物、预处理组合物、浸泡组合物或加强组合物。确定何时组合物可以被认为是洗涤剂组合物是在技术人员的知识范围内。如本文所使用的术语“预处理组合物”是指特别在洗涤织物之前使用的组合物，其中将该预处理组合物施用于织物并在洗涤织物之前放置一段时间。如本文所使用的术语“浸泡组合物”是指特别是在洗涤织物之前使用的组合物，其中在洗涤织物之前将织物留在水和浸泡组合物的溶液中一段时间。该浸泡组合物还可用于在餐具洗涤之前浸泡硬表面，例如厨房用具等。如本文所使用的术语“加强组合物”是指用作添加剂、作为洗涤剂组合物如衣物洗涤洗涤剂组合物的助剂的组合物，其中该加强组合物对待去除的污渍具有有益效果。特别地，它可以是用于从织物消散污渍的加强组合物(如果是衣物洗涤过程)，或者是从硬表面消散污渍的加强组合物(如果是餐具洗涤过程)。
术语“脂肪酶变体”具有与本文其他地方所定义的相同的含义和目的。
因此，本发明涉及一种组合物，其包含(i)至少一种表面活性剂和(ii)亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
(a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
(b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
(c)具有脂肪酶活性；并且
与亲本脂肪酶相比具有改进的活性。
应当理解的是，在本发明的上下文中，“脂肪酶变体”或“该脂肪酶变体”意指“至少一种脂肪酶变体”，除非与上下文有所矛盾，例如“一种脂肪酶变体”。因此，根据本发明的组合物在所有实施例中将包含至少一种脂肪酶变体。这同样适用于蛋白酶或α-淀粉酶或其任何变体。
据信，在组合物中组合至少一种表面活性剂和脂肪酶可以改善组合物的整体性能。此外，当与如本文所述的脂肪酶变体组合时，甚至可以降低表面活性剂的浓度，并且获得相同的效果，例如性能。
在一个实施例中，该表面活性剂的浓度是该组合物的至少3wt％，例如至少4wt％、例如至少5wt％、例如至少6wt％、例如至少7wt％、例如至少8wt％。应当理解的是，组合物中表面活性剂的浓度可以是相同的，但是一旦该组合物用于例如衣物洗涤过程中，该表面活性剂的浓度就会改变并且可能在洗涤循环期间发生变化。优选地，在例如衣物洗涤过程中表面活性剂或表面活性剂混合物的浓度应该以高于临界胶束浓度的浓度存在于主洗涤液中，这意味着这些表面活性剂在主洗涤液中主要以胶束形式存在。临界胶束浓度可能受到从组合物的脂肪酶变体的活性形成的脂肪酸、甘油单酯和甘油二酯的影响。
在一个实施例中，该至少一种表面活性剂包含阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐(LAS)或醇醚硫酸盐(AEOS)。
在一个实施例中，该组合物包含阴离子表面活性剂醇醚硫酸盐(AEOS)。在另一个实施例中，该组合物包含一种或多种非离子表面活性剂，例如AEO。
在一个实施例中，该至少一种表面活性剂是两种或更多种表面活性剂的混合物。本发明的表面活性剂可以优选地是两种或更多种表面活性剂的组合，例如表面活性剂的混合物。通过组合如本文所述的表面活性剂和脂肪酶变体，可以获得组合物的改进的效果。
在具体的实施例中，该至少一种表面活性剂是第一表面活性剂和第二表面活性剂的混合物。
在具体的实施例中，该第一表面活性剂是第一阴离子表面活性剂并且该第二表面活性剂是第二阴离子表面活性剂。
在另一个具体实施例中，该第一表面活性剂是阴离子表面活性剂并且该第二表面活性剂是非离子表面活性剂。
在具体的实施例中，该阴离子表面活性剂是直链烷基苯磺酸盐(LAS)或AEOS，并且所述非离子表面活性剂是醇乙氧基化物(AEO)。缩写AEOS和AES是指醇醚硫酸盐，其也称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐。
在一个实施例中，该阴离子表面活性剂的浓度是该组合物的2wt％和14wt％之间，例如3wt％和13wt％之间，例如该组合物的5wt％和12wt％之间，并且该非离子表面活性剂的浓度是5wt％和13wt％之间，例如6wt％和12wt％之间。在优选的实施例中，直链烷基苯磺酸盐(LAS)的浓度是7wt％和12wt％之间，醇醚硫酸盐(AEOS)为3wt％和7wt％之间并且醇乙氧基化物(AEO)为6wt％和11wt％之间。
在一个实施例中，该第一表面活性剂和该第二表面活性剂以3:1、2:1、1:1的比例存在于组合物中。在实施例中，该第一表面活性剂与该第二表面活性剂之间的比可以是在10:1至1:10，例如5:1至1:5、或3:1至1:3的范围内。在优选的实施例中，该第一表面活性剂与该第二表面活性剂的比是2:1。如本文所使用的术语“该第一表面活性剂与该第二表面活性剂的比”是指组合物中这两种表面活性剂的量或浓度。因此，当该比被确定为例如2:1时，它意味着该第一表面活性剂的量或浓度以该第二表面活性剂的量或浓度的两倍存在。因此，更具体地，该第一表面活性剂能以10wt％的浓度存在，然后如果这两种表面活性剂的比是2:1，则该第二表面活性剂以5wt％的浓度存在。
根据本发明的组合物还包含亲本脂肪酶的脂肪酶变体。与亲本脂肪酶相比，本文所述的脂肪酶变体具有改进的活性，并且与亲本脂肪酶相比任选地具有改进的气味减少。在某些实施例中，该脂肪酶变体进一步具有改进的稳定性。相应地，该脂肪酶变体在与SEQID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的位置上包含至少一个修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰。
根据本发明的组合物的脂肪酶变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少99％但小于100％的序列同一性。相应地，在一个实施例中，该脂肪酶变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，该脂肪酶变体在选自与SEQ ID NO:1的E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的位置中的两个位置上包含修饰。因此，在具体的实施例中，该脂肪酶变体在选自下组的两个位置上包含修饰，该组由以下组成：E1+V2、E1+N33、
E1+F51、E1+E56、E1+L69、E1+K98、E1+V176、E1+H198、E1+E210、E1+Y220、E1+L227、V2+N33、V2+F51、V2+E56、V2+L69、V2+K98、V2+V176、V2+H198、V2+E210、V2+Y220、V2+L227、N33+F51、N33+E56、N33+L69、N33+K98、N33+V176、N33+H198、N33+E210、N33+Y220、N33+L227、F51+E56、F51+L69、F51+K98、F51+V176、F51+H198、F51+E210、F51+Y220、F51+L227、E56+L69、E56+K98、E56+V176、E56+H198、E56+E210、E56+Y220、E56+L227、L69+K98、L69+V176、L69+H198、L69+E210、L69+Y220、L69+L227、K98+V176、K98+H198、K98+E210、K98+Y220、K98+L227、V176+H198、V176+E210、V176+Y220、V176+L227、H198+E210、H198+Y220、H198+L227、E210+Y220、E210+L227和Y220+L227，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在具体的实施例中，该脂肪酶变体在选自与位置E1、V2、D27、N33、G38、F51、E56、L69、D96、K98、D111、G163、V176、H198、E210、Y220、L227、T231、N233、N233、D254和P256对应的位置中的两个位置上包含修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。因此，在具体的实施例中，该脂肪酶变体在选自下组的两个位置上包含修饰，该组由以下组成：E1+V2、E1+D27、E1+N33、E1+G38、E1+F51、E1+E56、E1+L69、E1+D96、E1+K98、E1+D111、E1+G163、E1+V176、E1+H198、E1+E210、E1+Y220、E1+L227、E1+T231、E1+N233、E1+D254、E1+P256、V2+D27、V2+N33、V2+G38、V2+F51、V2+E56、V2+L69、V2+D96、V2+K98、V2+D111、V2+G163、V2+V176、V2+H198、V2+E210、V2+Y220、V2+L227、V2+T231、V2+N233、V2+D254、V2+P256、D27+N33、D27+G38、D27+F51、D27+E56、D27+L69、D27+D96、D27+K98、D27+D111、D27+G163、D27+V176、D27+H198、D27+E210、D27+Y220、D27+L227、D27+T231、D27+N233、D27+D254、D27+P256、N33+G38、N33+F51、N33+E56、N33+L69、N33+D96、N33+K98、N33+D111、N33+G163、N33+V176、N33+H198、N33+E210、N33+Y220、N33+L227、N33+T231、N33+N233、N33+D254、N33+P256、G38+F51、G38+E56、G38+L69、G38+D96、G38+K98、G38+D111、G38+G163、G38+V176、G38+H198、G38+E210、G38+Y220、G38+L227、G38+T231、G38+N233、G38+D254、G38+P256、F51+E56、F51+L69、F51+D96、F51+K98、F51+D111、F51+G163、F51+V176、F51+H198、F51+E210、F51+Y220、F51+L227、F51+T231、F51+N233、F51+D254、F51+P256、E56+L69、E56+D96、E56+K98、E56+D111、E56+G163、E56+V176、E56+H198、E56+E210、E56+Y220、E56+L227、E56+T231、E56+N233、E56+D254、E56+P256、L69+D96、L69+K98、L69+D111、L69+G163、L69+V176、L69+H198、L69+E210、L69+Y220、L69+L227、L69+T231、L69+N233、L69+D254、L69+P256、D96+K98、D96+D111、D96+G163、D96+V176、D96+H198、D96+E210、D96+Y220、D96+L227、D96+T231、D96+N233、D96+D254、D96+P256、K98+D111、K98+G163、K98+V176、K98+H198、K98+E210、K98+Y220、K98+L227、K98+T231、K98+N233、K98+D254、K98+P256、D111+G163、D111+V176、D111+H198、D111+E210、D111+Y220、D111+L227、D111+T231、D111+N233、D111+D254、D111+P256、G163+V176、G163+H198、G163+E210、G163+Y220、G163+L227、G163+T231、G163+N233、G163+D254、G163+P256、V176+H198、V176+E210、V176+Y220、V176+L227、V176+T231、V176+N233、V176+D254、V176+P256、H198+E210、H198+Y220、H198+L227、H198+T231、H198+N233、H198+D254、H198+P256、E210+Y220、E210+L227、E210+T231、E210+N233、E210+D254、E210+P256、Y220+L227、Y220+T231、Y220+N233、Y220+D254、Y220+P256、L227+T231、L227+N233、L227+D254、L227+P256、T231+N233、T231+D254、T231+P256、N233+D254、N233+P256和D254+P256，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该脂肪酶变体在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的三个位置上包含修饰。因此，在一个实施例中，该脂肪酶变体在选自下组的三个位置上包含修饰，该组由以下组成：E1+V2+N33、E1+V2+F51、E1+V2+E56、E1+V2+L69、E1+V2+K98、E1+V2+V176、E1+V2+H198、E1+V2+E210、E1+V2+Y220、E1+V2+L227、E1+N33+F51、E1+N33+E56、E1+N33+L69、E1+N33+K98、E1+N33+V176、E1+N33+H198、E1+N33+E210、E1+N33+Y220、E1+N33+L227、E1+F51+E56、E1+F51+L69、E1+F51+K98、E1+F51+V176、E1+F51+H198、E1+F51+E210、E1+F51+Y220、E1+F51+L227、E1+E56+L69、E1+E56+K98、E1+E56+V176、E1+E56+H198、E1+E56+E210、E1+E56+Y220、E1+E56+L227、E1+L69+K98、E1+L69+V176、E1+L69+H198、E1+L69+E210、E1+L69+Y220、E1+L69+L227、E1+K98+V176、E1+K98+H198、E1+K98+E210、E1+K98+Y220、E1+K98+L227、E1+V176+H198、E1+V176+E210、E1+V176+Y220、E1+V176+L227、E1+H198+E210、E1+H198+Y220、E1+H198+L227、E1+E210+Y220、E1+E210+L227、E1+Y220+L227、V2+N33+F51、V2+N33+E56、V2+N33+L69、V2+N33+K98、V2+N33+V176、V2+N33+H198、V2+N33+E210、V2+N33+Y220、V2+N33+L227、V2+F51+E56、V2+F51+L69、V2+F51+K98、V2+F51+V176、V2+F51+H198、V2+F51+E210、V2+F51+Y220、V2+F51+L227、V2+E56+L69、V2+E56+K98、V2+E56+V176、V2+E56+H198、V2+E56+E210、V2+E56+Y220、V2+E56+L227、V2+L69+K98、V2+L69+V176、V2+L69+H198、V2+L69+E210、V2+L69+Y220、V2+L69+L227、V2+K98+V176、V2+K98+H198、V2+K98+E210、V2+K98+Y220、V2+K98+L227、V2+V176+H198、V2+V176+E210、V2+V176+Y220、V2+V176+L227、V2+H198+E210、V2+H198+Y220、V2+H198+L227、V2+E210+Y220、V2+E210+L227、V2+Y220+L227、N33+F51+E56、N33+F51+L69、N33+F51+K98、N33+F51+V176、N33+F51+H198、N33+F51+E210、N33+F51+Y220、N33+F51+L227、N33+E56+L69、N33+E56+K98、N33+E56+V176、N33+E56+H198、N33+E56+E210、N33+E56+Y220、N33+E56+L227、N33+L69+K98、N33+L69+V176、N33+L69+H198、N33+L69+E210、N33+L69+Y220、N33+L69+L227、N33+K98+V176、N33+K98+H198、N33+K98+E210、N33+K98+Y220、N33+K98+L227、N33+V176+H198、N33+V176+E210、N33+V176+Y220、N33+V176+L227、N33+H198+E210、N33+H198+Y220、N33+H198+L227、N33+E210+Y220、N33+E210+L227、N33+Y220+L227、F51+E56+L69、F51+E56+K98、F51+E56+V176、F51+E56+H198、F51+E56+E210、F51+E56+Y220、F51+E56+L227、F51+L69+K98、F51+L69+V176、F51+L69+H198、F51+L69+E210、F51+L69+Y220、F51+L69+L227、F51+K98+V176、F51+K98+H198、F51+K98+E210、F51+K98+Y220、F51+K98+L227、F51+V176+H198、F51+V176+E210、F51+V176+Y220、F51+V176+L227、F51+H198+E210、F51+H198+Y220、F51+H198+L227、F51+E210+Y220、F51+E210+L227、F51+Y220+L227、E56+L69+K98、E56+L69+V176、E56+L69+H198、E56+L69+E210、E56+L69+Y220、E56+L69+L227、E56+K98+V176、E56+K98+H198、E56+K98+E210、E56+K98+Y220、E56+K98+L227、E56+V176+H198、E56+V176+E210、E56+V176+Y220、E56+V176+L227、E56+H198+E210、E56+H198+Y220、E56+H198+L227、E56+E210+Y220、E56+E210+L227、E56+Y220+L227、L69+K98+V176、L69+K98+H198、L69+K98+E210、L69+K98+Y220、L69+K98+L227、L69+V176+H198、L69+V176+E210、L69+V176+Y220、L69+V176+L227、L69+H198+E210、L69+H198+Y220、L69+H198+L227、L69+E210+Y220、L69+E210+L227、L69+Y220+L227、K98+V176+H198、K98+V176+E210、K98+V176+Y220、K98+V176+L227、K98+H198+E210、K98+H198+Y220、K98+H198+L227、K98+E210+Y220、K98+E210+L227、K98+Y220+L227、V176+H198+E210、V176+H198+Y220、V176+H198+L227、V176+E210+Y220、V176+E210+L227、V176+Y220+L227、H198+E210+Y220、H198+E210+L227、H198+Y220+L227和E210+Y220+L227，其中根据SEQID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该脂肪酶变体在与位置E1、V2、D27、N33、G38、F51、E56、L69、D96、K98、D111、G163、V176、H198、E210、Y220、L227、T231、N233、N233、D254和P256对应的三个位置上包含修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。因此，在具体的实施例中，该脂肪酶变体在选自下组的三个位置上包含修饰，该组由以下组成：E1+V2+D27、E1+V2+N33、E1+V2+G38、E1+V2+F51、E1+V2+E56、E1+V2+L69、E1+V2+D96、E1+V2+K98、E1+V2+D111、E1+V2+G163、E1+V2+V176、E1+V2+H198、E1+V2+E210、E1+V2+Y220、E1+V2+L227、E1+V2+T231、E1+V2+N233、E1+V2+D254、E1+V2+P256、E1+D27+N33、E1+D27+G38、E1+D27+F51、E1+D27+E56、E1+D27+L69、E1+D27+D96,E1+D27+K98、E1+D27+D111、E1+D27+G163、E1+D27+V176、E1+D27+H198、E1+D27+E210、E1+D27+Y220、E1+D27+L227、E1+D27+T231、E1+D27+N233、E1+D27+D254、E1+D27+P256、E1+N33+G38、E1+N33+F51、E1+N33+E56、E1+N33+L69、E1+N33+D96、E1+N33+K98、E1+N33+D111、E1+N33+G163、E1+N33+V176、E1+N33+H198、E1+N33+E210、E1+N33+Y220、E1+N33+L227、E1+N33+T231、E1+N33+N233、E1+N33+D254、E1+N33+P256、E1+G38+F51、E1+G38+E56、E1+G38+L69、E1+G38+D96、E1+G38+K98、E1+G38+D111、E1+G38+G163、E1+G38+V176、E1+G38+H198、E1+G38+E210、E1+G38+Y220、E1+G38+L227、E1+G38+T231、E1+G38+N233、E1+G38+D254、E1+G38+P256、E1+F51+E56、E1+F51+L69、E1+F51+D96、E1+F51+K98、E1+F51+D111、E1+F51+G163、E1+F51+V176、E1+F51+H198、E1+F51+E210、E1+F51+Y220、E1+F51+L227、E1+F51+T231、E1+F51+N233、E1+F51+D254、E1+F51+P256、E1+E56+L69、E1+E56+D96、E1+E56+K98、E1+E56+D111、E1+E56+G163、E1+E56+V176、E1+E56+H198、E1+E56+E210、E1+E56+Y220、E1+E56+L227、E1+E56+T231、E1+E56+N233、E1+E56+D254、E1+E56+P256、E1+L69+D96、E1+L69+K98、E1+L69+D111、E1+L69+G163、E1+L69+V176、E1+L69+H198、E1+L69+E210、E1+L69+Y220、E1+L69+L227、E1+L69+T231、E1+L69+N233、E1+L69+D254、E1+L69+P256、E1+D96+K98、E1+D96+D111、E1+D96+G163、E1+D96+V176、E1+D96+H198、E1+D96+E210、E1+D96+Y220、E1+D96+L227、E1+D96+T231、E1+D96+N233、E1+D96+D254、E1+D96+P256、E1+K98+D111、E1+K98+G163、E1+K98+V176、E1+K98+H198、E1+K98+E210、E1+K98+Y220、E1+K98+L227、E1+K98+T231、E1+K98+N233、E1+K98+D254、E1+K98+P256、E1+D111+G163、E1+D111+V176、E1+D111+H198、E1+D111+E210、E1+D111+Y220、E1+D111+L227、E1+D111+T231、E1+D111+N233、E1+D111+D254、E1+D111+P256、E1+G163+V176、E1+G163+H198、E1+G163+E210、E1+G163+Y220、E1+G163+L227、E1+G163+T231、E1+G163+N233、E1+G163+D254、E1+G163+P256、E1+V176+H198、E1+V176+E210、E1+V176+Y220、E1+V176+L227、E1+V176+T231、E1+V176+N233、E1+V176+D254、E1+V176+P256、E1+H198+E210、E1+H198+Y220、E1+H198+L227、E1+H198+T231、E1+H198+N233、E1+H198+D254、E1+H198+P256、E1+E210+Y220、E1+E210+L227、E1+E210+T231、E1+E210+N233、E1+E210+D254、E1+E210+P256、E1+Y220+L227、E1+Y220+T231、E1+Y220+N233、E1+Y220+D254、E1+Y220+P256、E1+L227+T231、E1+L227+N233、E1+L227+D254、E1+L227+P256、E1+T231+N233、E1+T231+D254、E1+T231+P256、E1+N233+D254、E1+N233+P256、E1+D254+P256、V2+D27+N33、V2+D27+G38、V2+D27+F51、V2+D27+E56、V2+D27+L69、V2+D27+D96、V2+D27+K98、V2+D27+D111、V2+D27+G163、V2+D27+V176、V2+D27+H198、V2+D27+E210、V2+D27+Y220、V2+D27+L227、V2+D27+T231、V2+D27+N233、V2+D27+D254、V2+D27+P256、V2+N33+G38、V2+N33+F51、V2+N33+E56、V2+N33+L69、V2+N33+D96、V2+N33+K98、V2+N33+D111、V2+N33+G163、V2+N33+V176、V2+N33+H198、V2+N33+E210、V2+N33+Y220、V2+N33+L227、V2+N33+T231、V2+N33+N233、V2+N33+D254、V2+N33+P256、V2+G38+F51、V2+G38+E56、V2+G38+L69、V2+G38+D96、V2+G38+K98、V2+G38+D111、V2+G38+G163、V2+G38+V176、V2+G38+H198、V2+G38+E210、V2+G38+Y220、V2+G38+L227、V2+G38+T231、V2+G38+N233、V2+G38+D254、V2+G38+P256、V2+F51+E56、V2+F51+L69、V2+F51+D96、V2+F51+K98、V2+F51+D111、V2+F51+G163、V2+F51+V176、V2+F51+H198、V2+F51+E210、V2+F51+Y220、V2+F51+L227、V2+F51+T231、V2+F51+N233、V2+F51+D254、V2+F51+P256、V2+E56+L69、V2+E56+D96、V2+E56+K98、V2+E56+D111、V2+E56+G163、V2+E56+V176、V2+E56+H198、V2+E56+E210、V2+E56+Y220、V2+E56+L227、V2+E56+T231、V2+E56+N233、V2+E56+D254、V2+E56+P256、V2+L69+D96、V2+L69+K98、V2+L69+D111、V2+L69+G163、V2+L69+V176、V2+L69+H198、V2+L69+E210、V2+L69+Y220、V2+L69+L227、V2+L69+T231、V2+L69+N233、V2+L69+D254、V2+L69+P256、V2+D96+K98、V2+D96+D111、V2+D96+G163、V2+D96+V176、V2+D96+H198、V2+D96+E210、V2+D96+Y220、V2+D96+L227、V2+D96+T231、V2+D96+N233、V2+D96+D254、V2+D96+P256、V2+K98+D111、V2+K98+G163、V2+K98+V176、V2+K98+H198、V2+K98+E210、V2+K98+Y220、V2+K98+L227、V2+K98+T231、V2+K98+N233、V2+K98+D254、V2+K98+P256、V2+D111+G163、V2+D111+V176、V2+D111+H198、V2+D111+E210、V2+D111+Y220、V2+D111+L227、V2+D111+T231、V2+D111+N233、V2+D111+D254、V2+D111+P256、V2+G163+V176、V2+G163+H198、V2+G163+E210、V2+G163+Y220、V2+G163+L227、V2+G163+T231、V2+G163+N233、V2+G163+D254、V2+G163+P256、V2+V176+H198、V2+V176+E210、V2+V176+Y220、V2+V176+L227、V2+V176+T231、V2+V176+N233、V2+V176+D254、V2+V176+P256、V2+H198+E210、V2+H198+Y220、V2+H198+L227、V2+H198+T231、V2+H198+N233、V2+H198+D254、V2+H198+P256、V2+E210+Y220、V2+E210+L227、V2+E210+T231、V2+E210+N233、V2+E210+D254、V2+E210+P256、V2+Y220+L227、V2+Y220+T231、V2+Y220+N233、V2+Y220+D254、V2+Y220+P256、V2+L227+T231、V2+L227+N233、V2+L227+D254、V2+L227+P256、V2+T231+N233、V2+T231+D254、V2+T231+P256、V2+N233+D254、V2+N233+P256、V2+D254+P256、D27+N33+G38、D27+N33+F51、D27+N33+E56、D27+N33+L69、D27+N33+D96、D27+N33+K98、D27+N33+D111、D27+N33+G163、D27+N33+V176、D27+N33+H198、D27+N33+E210、D27+N33+Y220、D27+N33+L227、D27+N33+T231、D27+N33+N233、D27+N33+D254、D27+N33+P256、D27+G38+F51、D27+G38+E56、D27+G38+L69、D27+G38+D96、D27+G38+K98、D27+G38+D111、D27+G38+G163、D27+G38+V176、D27+G38+H198、D27+G38+E210、D27+G38+Y220、D27+G38+L227、D27+G38+T231、D27+G38+N233、D27+G38+D254、D27+G38+P256、D27+F51+E56、D27+F51+L69、D27+F51+D96、D27+F51+K98、D27+F51+D111、D27+F51+G163、D27+F51+V176、D27+F51+H198、D27+F51+E210、D27+F51+Y220、D27+F51+L227、D27+F51+T231、D27+F51+N233、D27+F51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ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该组合物包含如下脂肪酶变体，该脂肪酶变体包含至少一个以下修饰：E1C、V2Y、D27R、N33K、G38A、F51V、E56K、L69R、D96E、K98I、D111A、G163K、V176L、H198S、E210K、Y220F、L227G、T231R、N233R、N233C、D254S和P256T，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该脂肪酶变体包含与选自下组的取代对应的两个取代，该组由以下组成：E1C+V2Y、E1C+D27R、E1C+N33K、E1C+G38A、E1C+F51V、E1C+E56K、E1C+L69R、E1C+D96E、E1C+K98I、E1C+D111A、E1C+G163K、E1C+V176L、E1C+H198S、E1C+E210K、E1C+Y220F、E1C+L227G、E1C+T231R、E1C+N233R、E1C+N233C、E1C+D254S、E1C+P256T、V2Y+D27R、V2Y+N33K、V2Y+G38A、V2Y+F51V、V2Y+E56K、V2Y+L69R、V2Y+D96E、V2Y+K98I、V2Y+D111A、V2Y+G163K、V2Y+V176L、V2Y+H198S、V2Y+E210K、V2Y+Y220F、V2Y+L227G、V2Y+T231R,V2Y+N233R,V2Y+N233C、V2Y+D254S、V2Y+P256T、D27R+N33K、D27R+G38A、D27R+F51V、D27R+E56K、D27R+L69R、D27R+D96E、D27R+K98I、D27R+D111A、D27R+G163K、D27R+V176L、D27R+H198S、D27R+E210K、D27R+Y220F、D27R+L227G、D27R+T231R、D27R+N233R、D27R+N233C、D27R+D254S、D27R+P256T、N33K+G38A、N33K+F51V、N33K+E56K、N33K+L69R、N33K+D96E、N33K+K98I、N33K+D111A、N33K+G163K、N33K+V176L、N33K+H198S、N33K+E210K、N33K+Y220F、N33K+L227G、N33K+T231R、N33K+N233R、N33K+N233C、N33K+D254S、N33K+P256T、G38A+F51V、G38A+E56K、G38A+L69R、G38A+D96E、G38A+K98I、G38A+D111A、G38A+G163K、G38A+V176L、G38A+H198S、G38A+E210K、G38A+Y220F、G38A+L227G、G38A+T231R、G38A+N233R、G38A+N233C、G38A+D254S、G38A+P256T、F51V+E56K、F51V+L69R、F51V+D96E、F51V+K98I、F51V+D111A、F51V+G163K、F51V+V176L、F51V+H198S、F51V+E210K、F51V+Y220F、F51V+L227G、F51V+T231R、F51V+N233R、F51V+N233C、F51V+D254S、F51V+P256T、E56K+L69R、E56K+D96E、E56K+K98I、E56K+D111A、E56K+G163K、E56K+V176L、E56K+H198S、E56K+E210K、E56K+Y220F、E56K+L227G、E56K+T231R、E56K+N233R、E56K+N233C、E56K+D254S、E56K+P256T、L69R+D96E、L69R+K98I、L69R+D111A、L69R+G163K、L69R+V176L、L69R+H198S、L69R+E210K、L69R+Y220F、L69R+L227G、L69R+T231R、L69R+N233R、L69R+N233C、L69R+D254S、L69R+P256T、D96E+K98I、D96E+D111A、D96E+G163K、D96E+V176L、D96E+H198S、D96E+E210K、D96E+Y220F、D96E+L227G、D96E+T231R、D96E+N233R,D96E+N233C、D96E+D254S、D96E+P256T、K98I+D111A、K98I+G163K、K98I+V176L、K98I+H198S、K98I+E210K、K98I+Y220F、K98I+L227G、K98I+T231R、K98I+N233R、K98I+N233C、K98I+D254S、K98I+P256T、D111A+G163K、D111A+V176L、D111A+H198S、D111A+E210K、D111A+Y220F、D111A+L227G、D111A+T231R、D111A+N233R、D111A+N233C、D111A+D254S、D111A+P256T、G163K+V176L、G163K+H198S、G163K+E210K、G163K+Y220F、G163K+L227G、G163K+T231R、G163K+N233R、G163K+N233C、G163K+D254S、G163K+P256T、V176L+H198S、V176L+E210K、V176L+Y220F、V176L+L227G、V176L+T231R、V176L+N233R、V176L+N233C、V176L+D254S、V176L+P256T、H198S+E210K、H198S+Y220F、H198S+L227G、H198S+T231R、H198S+N233R、H198S+N233C、H198S+D254S、H198S+P256T、E210K+Y220F、E210K+L227G、E210K+T231R、E210K+N233R、E210K+N233C、E210K+D254S、E210K+P256T、Y220F+L227G、Y220F+T231R、Y220F+N233R、Y220F+N233C、Y220F+D254S、Y220F+P256T、L227G+T231R、L227G+N233R、L227G+N233C、L227G+D254S、L227G+P256T、T231R+N233R、T231R+N233C、T231R+D254S、T231R+P256T、N233R+N233C、N233R+D254S、N233R+P256T、N233C+D254S、N233C+P256T和D254S+P256T，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该脂肪酶变体包含与选自下组的取代对应的三个取代，该组由以下组成：E1C+V2Y+D27R、E1C+V2Y+N33K、E1C+V2Y+G38A、E1C+V2Y+F51V、E1C+V2Y+E56K、E1C+V2Y+L69R、E1C+V2Y+D96E、E1C+V2Y+K98I、E1C+V2Y+D111A、E1C+V2Y+G163K、E1C+V2Y+V176L、E1C+V2Y+H198S、E1C+V2Y+E210K、E1C+V2Y+Y220F、E1C+V2Y+L227G、E1C+V2Y+T231R、E1C+V2Y+N233R、E1C+V2Y+N233C、E1C+V2Y+D254S、E1C+V2Y+P256T、E1C+D27R+N33K、E1C+D27R+G38A、E1C+D27R+F51V、E1C+D27R+E56K、E1C+D27R+L69R、E1C+D27R+D96E、E1C+D27R+K98I、E1C+D27R+D111A、E1C+D27R+G163K、E1C+D27R+V176L、E1C+D27R+H198S、E1C+D27R+E210K、E1C+D27R+Y220F、E1C+D27R+L227G、E1C+D27R+T231R、E1C+D27R+N233R、E1C+D27R+N233C、E1C+D27R+D254S、E1C+D27R+P256T、E1C+N33K+G38A、E1C+N33K+F51V、E1C+N33K+E56K、E1C+N33K+L69R、E1C+N33K+D96E、E1C+N33K+K98I、E1C+N33K+D111A、E1C+N33K+G163K、E1C+N33K+V176L、E1C+N33K+H198S、E1C+N33K+E210K、E1C+N33K+Y220F、E1C+N33K+L227G、E1C+N33K+T231R、E1C+N33K+N233R、E1C+N33K+N233C、E1C+N33K+D254S、E1C+N33K+P256T、E1C+G38A+F51V、E1C+G38A+E56K、E1C+G38A+L69R、E1C+G38A+D96E、E1C+G38A+K98I、E1C+G38A+D111A、E1C+G38A+G163K、E1C+G38A+V176L、E1C+G38A+H198S、E1C+G38A+E210K、E1C+G38A+Y220F、E1C+G38A+L227G、E1C+G38A+T231R、E1C+G38A+N233R、E1C+G38A+N233C、E1C+G38A+D254S、E1C+G38A+P256T、E1C+F51V+E56K、E1C+F51V+L69R、E1C+F51V+D96E、E1C+F51V+K98I、E1C+F51V+D111A、E1C+F51V+G163K、E1C+F51V+V176L、E1C+F51V+H198S、E1C+F51V+E210K、E1C+F51V+Y220F、E1C+F51V+L227G、E1C+F51V+T231R、E1C+F51V+N233R、E1C+F51V+N233C、E1C+F51V+D254S、E1C+F51V+P256T、E1C+E56K+L69R、E1C+E56K+D96E、E1C+E56K+K98I、E1C+E56K+D111A、E1C+E56K+G163K、E1C+E56K+V176L、E1C+E56K+H198S、E1C+E56K+E210K、E1C+E56K+Y220F、E1C+E56K+L227G、E1C+E56K+T231R、E1C+E56K+N233R、E1C+E56K+N233C、E1C+E56K+D254S、E1C+E56K+P256T、E1C+L69R+D96E、E1C+L69R+K98I、E1C+L69R+D111A、E1C+L69R+G163K、E1C+L69R+V176L、E1C+L69R+H198S、E1C+L69R+E210K、E1C+L69R+Y220F、E1C+L69R+L227G、E1C+L69R+T231R、E1C+L69R+N233R、E1C+L69R+N233C、E1C+L69R+D254S、E1C+L69R+P256T、E1C+D96E+K98I、E1C+D96E+D111A、E1C+D96E+G163K、E1C+D96E+V176L、E1C+D96E+H198S、E1C+D96E+E210K、E1C+D96E+Y220F、E1C+D96E+L227G、E1C+D96E+T231R、E1C+D96E+N233R、E1C+D96E+N233C、E1C+D96E+D254S、E1C+D96E+P256T、E1C+K98I+D111A、E1C+K98I+G163K、E1C+K98I+V176L、E1C+K98I+H198S、E1C+K98I+E210K、E1C+K98I+Y220F、E1C+K98I+L227G、E1C+K98I+T231R、E1C+K98I+N233R、E1C+K98I+N233C、E1C+K98I+D254S、E1C+K98I+P256T、E1C+D111A+G163K、E1C+D111A+V176L、E1C+D111A+H198S、E1C+D111A+E210K、E1C+D111A+Y220F、E1C+D111A+L227G、E1C+D111A+T231R、E1C+D111A+N233R、E1C+D111A+N233C、E1C+D111A+D254S、E1C+D111A+P256T、E1C+G163K+V176L、E1C+G163K+H198S、E1C+G163K+E210K、E1C+G163K+Y220F、E1C+G163K+L227G、E1C+G163K+T231R、E1C+G163K+N233R、E1C+G163K+N233C、E1C+G163K+D254S、E1C+G163K+P256T、E1C+V176L+H198S、E1C+V176L+E210K、E1C+V176L+Y220F、E1C+V176L+L227G、E1C+V176L+T231R、E1C+V176L+N233R、E1C+V176L+N233C、E1C+V176L+D254S、E1C+V176L+P256T、E1C+H198S+E210K、E1C+H198S+Y220F、E1C+H198S+L227G、E1C+H198S+T231R、E1C+H198S+N233R、E1C+H198S+N233C、E1C+H198S+D254S、E1C+H198S+P256T、E1C+E210K+Y220F、E1C+E210K+L227G、E1C+E210K+T231R、E1C+E210K+N233R、E1C+E210K+N233C、E1C+E210K+D254S、E1C+E210K+P256T、E1C+Y220F+L227G、E1C+Y220F+T231R、E1C+Y220F+N233R、E1C+Y220F+N233C、E1C+Y220F+D254S、E1C+Y220F+P256T、E1C+L227G+T231R、E1C+L227G+N233R、E1C+L227G+N233C、E1C+L227G+D254S、E1C+L227G+P256T、E1C+T231R+N233R、E1C+T231R+N233C、E1C+T231R+D254S、E1C+T231R+P256T、E1C+N233R+N233C、E1C+N233R+D254S、E1C+N233R+P256T、E1C+N233C+D254S、E1C+N233C+P256T、E1C+D254S+P256T、V2Y+D27R+N33K、V2Y+D27R+G38A、V2Y+D27R+F51V、V2Y+D27R+E56K、V2Y+D27R+L69R、V2Y+D27R+D96E、V2Y+D27R+K98I、V2Y+D27R+D111A、V2Y+D27R+G163K、V2Y+D27R+V176L、V2Y+D27R+H198S、V2Y+D27R+E210K、V2Y+D27R+Y220F、V2Y+D27R+L227G、V2Y+D27R+T231R、V2Y+D27R+N233R、V2Y+D27R+N233C、V2Y+D27R+D254S、V2Y+D27R+P256T、V2Y+N33K+G38A、V2Y+N33K+F51V、V2Y+N33K+E56K、V2Y+N33K+L69R、V2Y+N33K+D96E、V2Y+N33K+K98I、V2Y+N33K+D111A、V2Y+N33K+G163K、V2Y+N33K+V176L、V2Y+N33K+H198S、V2Y+N33K+E210K、V2Y+N33K+Y220F、V2Y+N33K+L227G、V2Y+N33K+T231R、V2Y+N33K+N233R、V2Y+N33K+N233C、V2Y+N33K+D254S、V2Y+N33K+P256T、V2Y+G38A+F51V、V2Y+G38A+E56K、V2Y+G38A+L69R、V2Y+G38A+D96E、V2Y+G38A+K98I、V2Y+G38A+D111A、V2Y+G38A+G163K、V2Y+G38A+V176L、V2Y+G38A+H198S、V2Y+G38A+E210K、V2Y+G38A+Y220F、V2Y+G38A+L227G、V2Y+G38A+T231R、V2Y+G38A+N233R、V2Y+G38A+N233C、V2Y+G38A+D254S、V2Y+G38A+P256T、V2Y+F51V+E56K、V2Y+F51V+L69R、V2Y+F51V+D96E、V2Y+F51V+K98I、V2Y+F51V+D111A、V2Y+F51V+G163K、V2Y+F51V+V176L、V2Y+F51V+H198S、V2Y+F51V+E210K、V2Y+F51V+Y220F、V2Y+F51V+L227G、V2Y+F51V+T231R、V2Y+F51V+N233R、V2Y+F51V+N233C、V2Y+F51V+D254S、V2Y+F51V+P256T、V2Y+E56K+L69R、V2Y+E56K+D96E、V2Y+E56K+K98I、V2Y+E56K+D111A、V2Y+E56K+G163K、V2Y+E56K+V176L、V2Y+E56K+H198S、V2Y+E56K+E210K、V2Y+E56K+Y220F、V2Y+E56K+L227G、V2Y+E56K+T231R、V2Y+E56K+N233R、V2Y+E56K+N233C、V2Y+E56K+D254S、V2Y+E56K+P256T、V2Y+L69R+D96E、V2Y+L69R+K98I、V2Y+L69R+D111A、V2Y+L69R+G163K、V2Y+L69R+V176L、V2Y+L69R+H198S、V2Y+L69R+E210K、V2Y+L69R+Y220F、V2Y+L69R+L227G、V2Y+L69R+T231R、V2Y+L69R+N233R、V2Y+L69R+N233C、V2Y+L69R+D254S、V2Y+L69R+P256T、V2Y+D96E+K98I、V2Y+D96E+D111A、V2Y+D96E+G163K、V2Y+D96E+V176L、V2Y+D96E+H198S、V2Y+D96E+E210K、V2Y+D96E+Y220F、V2Y+D96E+L227G、V2Y+D96E+T231R、V2Y+D96E+N233R、V2Y+D96E+N233C、V2Y+D96E+D254S、V2Y+D96E+P256T、V2Y+K98I+D111A、V2Y+K98I+G163K、V2Y+K98I+V176L、V2Y+K98I+H198S、V2Y+K98I+E210K、V2Y+K98I+Y220F、V2Y+K98I+L227G、V2Y+K98I+T231R、V2Y+K98I+N233R、V2Y+K98I+N233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20F+L227G+T231R、Y220F+L227G+N233R、Y220F+L227G+N233C、Y220F+L227G+D254S、Y220F+L227G+P256T、Y220F+T231R+N233R、Y220F+T231R+N233C、Y220F+T231R+D254S、Y220F+T231R+P256T、Y220F+N233R+N233C、Y220F+N233R+D254S、Y220F+N233R+P256T、Y220F+N233C+D254S、Y220F+N233C+P256T、Y220F+D254S+P256T、L227G+T231R+N233R、L227G+T231R+N233C、L227G+T231R+D254S、L227G+T231R+P256T、L227G+N233R+N233C、L227G+N233R+D254S、L227G+N233R+P256T、L227G+N233C+D254S、L227G+N233C+P256T、L227G+D254S+P256T、T231R+N233R+N233C、T231R+N233R+D254S、T231R+N233R+P256T、T231R+N233C+D254S、T231R+N233C+P256T、T231R+D254S+P256T、N233R+N233C+D254S、N233R+N233C+P256T、N233R+D254S+P256T和N233C+D254S+P256T，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在优选的实施例中，该脂肪酶变体包含以下组的取代之一，使用SEQ ID NO:1进行编号：
在一个实施例中，包含在本发明的组合物中的该脂肪酶变体进一步包含选自下组的取代之一：S54T、S83T、G91A、A150G、I255A和E239C。
在一个实施例中，该亲本脂肪酶是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少99％、例如100％的序列同一性的脂肪酶。
在一个实施例中，该亲本脂肪酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少99％、例如100％的序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中，该亲本脂肪酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。包含一种或多 种表面活性剂的本发明的组合物
洗涤剂组合物A。在实施例中，本发明的组合物包含本发明的脂肪酶变体和直链烷基苯磺酸盐(LAS)。在洗涤溶液中，该直链烷基苯磺酸盐(LAS)能以0.1-10mM，例如1-5mM，例如2mM的浓度存在。根据本发明，与亲本特别是SEQ ID NO:1(LIPOLASETM)相比，该脂肪酶活性在洗涤溶液中增加(参见实例4)。在优选的实施例中，该组合物包含以下脂肪酶变体：
洗涤剂组合物B.在实施例中，本发明的组合物包含本发明的脂肪酶变体和醇醚硫酸盐(AEOS)。在洗涤溶液中，该醇醚硫酸盐(AEOS)能以0.1-10mM，例如1-5mM，例如2mM的浓度存在。根据本发明，与亲本特别是SEQ ID NO:1(LIPOLASETM)相比，该脂肪酶活性在洗涤溶液中增加(参见实例4)。在优选的实施例中，该组合物包含如下组的取代之一：
| E1C H198Y N233C |
| E1C H198T N233C |
| E1C H198G N233C |
| E1C H198S N233C |
| E1C H198L N233C |
| E1C H198G N233C |
洗涤剂组合物C.在实施例中，本发明的组合物包含本发明的脂肪酶变体以及直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)。在实施例中，表面活性剂之间的比可以是3:1、2:1、1:1，例如在从10:1至1:10，例如5:1至1:5、或3:1至1:3的范围内。在优选的实施例中，该比是2:1。在实施例中，在洗涤溶液中的总表面活性剂浓度是从0.1至15mM，例如0.5-10mM，特别是1-5mM。在洗涤溶液中，该直链烷基苯磺酸盐(LAS)能以0.1-10mM，例如1-5mM，例如2mM的浓度存在。在实施例中，醇乙氧基化物(AEO)在洗涤溶液中以0.05-5mM，例如0.5-3mM，例如1mM的浓度存在。根据本发明，与亲本特别是SEQ ID NO:1(LIPOLASETM)相比，该脂肪酶活性在洗涤溶液中增加(参见实例4)。在优选的实施例中，该组合物包含如下组的取代之一：
洗涤剂组合物D.在实施例中，本发明的组合物包含本发明的脂肪酶变体以及直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)。在实施例中，表面活性剂之间的比可以是3:1、2:1、1:1，例如在从10:1至1:10，例如5:1至1:5、或3:1至1:3的范围内。在优选的实施例中，该比是2:1。在实施例中，在洗涤溶液中的总表面活性剂浓度是从0.01至1.5mM，例如0.05-1.0mM，特别是0.1-0.5mM。在洗涤溶液中，直链烷基苯磺酸盐(LAS)能以0.01-1.0mM，例如0.1-0.5mM，例如0.2mM的浓度存在。在实施例中，醇乙氧基化物(AEO)在洗涤溶液中能以0.005-0.5mM，例如0.05-0.3mM，例如0.1mM的浓度存在。根据本发明，与亲本脂肪酶特别是SEQ ID NO:1(LIPOLASETM)相比，该脂肪酶活性在洗涤溶液中增加(参见实例4)。在优选的实施例中，该组合物包含以下组的取代之一，使用SEQ ID NO:1进行编号：
洗涤剂组合物E。在实施例中，本发明的组合物包含本发明的脂肪酶变体以及直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)。在实施例中，表面活性剂之间的比可以是3:1、2:1、1:1，例如在从10:1至1:10，例如5:1至1:5、或3:1至1:3的范围内。在优选的实施例中，该比是2:1。在实施例中，在洗涤溶液中的总表面活性剂浓度是从0.005至0.75mM，例如0.025-0.5mM，特别是0.05-0.25mM。在洗涤溶液中，直链烷基苯磺酸盐(LAS)能以0.005-0.5mM，例如0.05-0.25mM，例如0.01mM的浓度存在。在实施例中，醇乙氧基化物(AEO)在洗涤溶液中能以0.0025-0.25mM，例如0.025-0.15mM，例如0.05mM的浓度存在。根据本发明，与亲本脂肪酶特别是SEQ ID NO:1(LIPOLASETM)相比，该脂肪酶活性在洗涤溶液中增加(参见实例4)。在优选的实施例中，该组合物包含以下组的取代之一，使用SEQ ID NO:1进行编号：
洗涤剂组合物F。在实施例中，本发明的组合物包含本发明的脂肪酶变体以及直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)和螯合剂，例如EDTA。在实施例中，表面活性剂之间的比可以是3:1、2:1、1:1，例如在从10:1至1:10，例如5:1至1:5、或3:1至1:3的范围内。在优选的实施例中，该比是2:1。该螯合剂能以0.1-10mM，例如1-5mM，例如约2mM的浓度存在于洗涤溶液中。在实施例中，在洗涤溶液中的总表面活性剂浓度是从0.1至15mM，例如0.5-10mM，特别是1-5mM，尤其是约2mM。在洗涤溶液中，直链烷基苯磺酸盐(LAS)能以0.1-10mM，例如1-5mM，例如约2mM的浓度存在。在洗涤溶液中，醇乙氧基化物(AEO)能以0.05-5mM，例如0.5-3mM，例如约1mM的浓度存在。根据本发明，与亲本脂肪酶特别是SEQ ID NO:1(LIPOLASETM)相比，该脂肪酶活性在洗涤溶液中增加(参见实例4)。在实施例中，该洗涤溶液可以具有从约0°dH至约30°dH，例如0和15°dH之间、例如0和10°dH之间、例如3和20°dH之间、例如10和20°dH之间、或例如高于20°dH的水硬度。在优选的实施例中，该组合物包含以下组的取代之一，使用SEQ ID NO:1进行编号：
洗涤剂组合物G。在实施例中，本发明的组合物包含本发明的脂肪酶变体以及直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)。在实施例中，表面活性剂之间的比可以是3:1、2:1、1:1，例如在从10:1至1:10，例如5:1至1:5、或3:1至1:3的范围内。在优选的实施例中，该比是2:1。在洗涤溶液中，总表面活性剂浓度可以是从0.1至15mM，例如0.5-10mM，特别从1至5mM，尤其约2mM。在洗涤溶液中，直链烷基苯磺酸盐(LAS)能以0.1-10mM，例如1-5mM，例如约2mM的浓度存在。在洗涤溶液中，醇乙氧基化物(AEO)能以0.05-5mM，例如0.5-3mM，例如约1mM的浓度存在。根据本发明，与亲本脂肪酶特别是SEQ ID NO:1(LIPOLASETM)相比，该脂肪酶活性在洗涤溶液中增加(参见实例4)。在优选的实施例中，该组合物包含以下组的取代之一，使用SEQ ID NO:1进行编号：
另外的酶
在一个实施例中，该组合物进一步包含至少一种另外的酶，例如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、另一种脂肪酶、β-葡聚糖酶和/或甘露聚糖酶。
如本文所使用的，术语“另外的酶”是指可以进一步包括在本发明的洗涤剂组合物中的一组酶。此类酶可以是被认为可用于本发明的洗涤剂组合物中的任何酶。
在一个实施例中，该至少一种另外的酶是α-淀粉酶变体，其在与SEQ ID NO:1的位置H1、N54、V56、K72、G109、F113、R116、T134、W140、W159、W167、Q169、Q172、L173、A174、R181、G182、D183、G184、W189、E194、N195、V206、G255、N260、F262、A265、W284、F289、G304、G305、W347,K391、Q395、W439、W469、R444、F473、G476和G477对应的一个或多个位置上包含修饰，其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:2具有至少75％但小于100％的序列同一性并且其中所述α-淀粉酶变体具有α-淀粉酶活性。
向根据本发明的组合物中加入另外的酶可以是有利的。此类另外的酶可以选自基于它们在包含表面活性剂的组合物中的稳定性而选择的酶变体，因为此类的另外的酶可以是对表面活性剂敏感的。在具体的实施例中，该至少一种α-淀粉酶变体包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、或十三个以下的修饰：H1*、H1A、N54S、V56T、K72R、G109A、F113Q、R116Q、R116H、T134E、W140Y、W140F、W140H、W159Y、W159F、W159H、W167Y、W167H、W167F、Q169E、Q172K、Q172G、Q172N、L173P、A174*、A174S、R181*、G182*、D183*、G184*、G184T、W189Y、W189F、W189H、W189E、W189D、W189Q、W189N、E194D、E194N、E194S、N195F、V206L、V206F、V206Y、G255A、N260G、N260P、N260A、N260G、N260P、N260A、A265G、W284G、W284H、F289H、G304K、G304R、G304Q、G304E、G305K、G305R、G305Q、G305E、W347Y、W347F、W347H、K391A、Q395P、W439N、W439Q、W439T、R444Q、W469T、W469N、F473R、G476R、G476Q、G476E、G476K、G477K、G477R、G477Q和G477E，其中根据SEQ IDNO:2进行位置编号，并且其中该α-淀粉酶变体是如下亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该亲本与SEQ ID NO:2具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、例如至少75％、例如至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％或100％的序列同一性。
在优选的实施例中，该至少一种α-淀粉酶变体在与SEQ ID NO:2的位置181、182、183和184对应的两个或更多个位置处包含缺失和/或取代，其中该α-淀粉酶变体与SEQ IDNO:1具有至少75％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％但小于100％的序列同一性。
因此，在一个实施例中，该至少一种α-淀粉酶变体在与SEQ ID NO:2的R181+G182；R181+D183；R181+G184；G182+D183；G182+G184或D183+G184对应的位置上包含缺失。
在具体的实施例中，该至少一种α-淀粉酶变体包含以下修饰中的一个或多个：H1*、H1A、N54S、V56T、K72R、G109A、F113Q、R116Q、R116H、T134E、W140Y、W140F、W140H、W159Y、W159F、W159H、W167Y、W167H、W167F、Q169E、Q172K、Q172G、Q172N、L173P、A174*、A174S、R181*、G182*、D183*、G184*、G184T、W189Y、W189F、W189H、W189E、W189D、W189Q、W189N、E194D、E194N、E194S、N195F、V206L、V206F、V206Y、G255A、N260G、N260P、N260A、N260G、N260P、N260A、A265G、W284G、W284H、F289H、G304K、G304R、G304Q、G304E、G305K、G305R、G305Q、G305E、W347Y、W347F、W347H、K391A、Q395P、W439N、W439Q、W439T、R444Q、W469T、W469N、F473R、G476R、G476Q、G476E、G476K、G477K、G477R、G477Q和G477E以及R181+G182；R181+D183；R181+G184；G182+D183；G182+G184或D183+G184的成对缺失中的一个(根据SEQID NO:2进行编号)，其中该α-淀粉酶变体是如下亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该亲本与SEQ ID NO:2具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、例如至少75％、例如至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％或100％的序列同一性。
因此，在一个实施例中，该α-淀粉酶变体选自下组，该组由以下组成：
H1*+N54S+V56T+G109A+Q169E+Q172K+A174*+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+G109A+R116H+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+F113Q+R116Q+W167F+Q172G+A174S+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+K391A+P473R+G476K；
H1*+N54S+V56T+G109A+F113Q+R116Q+Q172N+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+A265G+K391A+P473R+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+F113Q+W167F+Q172R+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+R116H+T134E+W167F+Q172G+L173V+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+G255A+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+R116H+T134E+W167F+Q172G+L173V+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+G255A+K391A+Q395P+T444Q+P473R+G476K；
H1*+N54S+V56T+G109A+T134E+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+G255A+K391A+G476K；以及
H1*+N54S+V56T+G109A+W167F+Q172E+L173P+A174K+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，并且其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:2的多肽共享至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％但小于100％的序列同一性，并且其中所述α-淀粉酶变体具有α-淀粉酶活性。
在另一个或另外的实施例中，该另外的酶是蛋白酶。相应地，在一个实施例中，该至少一种另外的酶是具有蛋白酶活性的蛋白酶，其中所述蛋白酶选自下组：
(a)与SEQ ID NO:4、5或6的序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的序列同一性的蛋白酶；
(b)在与SEQ ID NO:7的位置171、173、175、179或180对应的一个或多个位置处包含取代的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体与SEQ ID NO:7具有至少75％但小于100％的序列同一性；以及
(c)与SEQ ID NO:3中的蛋白酶相比，在与位置32、33、48、49、50、51、52、53、54、58、59、60、61、62、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、116、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、150、152、153、154、155、156、158、159、160、161、164、169、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、197、198、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、和216对应的一个或多个位置处包含修饰的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体与SEQ ID NO:4具有至少75％的序列同一性。
在具体的实施例中，该蛋白酶是(a)中的蛋白酶。
在另一个具体实施例中，该蛋白酶是(b)中的蛋白酶。在一个实施例中，该蛋白酶是(b)中的变体，其在与位置171、173、175、179或180对应的至少一个位置上包含取代，并且其中与SEQ ID NO:7的位置171对应的位置上的氨基酸选自下组，该组由W、K、E、D和N组成；和/或与SEQ ID NO:7的位置173对应的位置上的氨基酸是P；和/或与SEQ ID NO:7的位置175对应的位置上的氨基酸选自下组，该组由A、V和P组成；和/或与SEQ ID NO:7的位置179对应的位置上的氨基酸选自下组，该组由C、V、Q、S、T、E、H、K、M、N、Y和A组成；和/或与SEQ IDNO:7的位置180对应的位置上的氨基酸是Y。
在一个实施例中，该组合物包含至少一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体是Savinase(SEQ ID NO:4)变体。该Savinase变体是如下亲本蛋白酶的变体，该亲本蛋白酶与SEQ IDNO:4具有至少70％的序列同一性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、但小于100％的序列同一性。
因此，在一个实施例中，该蛋白酶是与SEQ ID NO:3中的蛋白酶相比，在与位置32、33、48、49、50、51、52、53、54、58、59、60、61、62、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、116、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、150、152、153、154、155、156、158、159、160、161、164、169、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、197、198、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、和216对应的一个或多个位置上包含修饰的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体与SEQ ID NO:4具有至少75％的序列同一性。
在具体的实施例中，在(c)中的所述蛋白酶变体中的至少一个位置上的修饰选自下组，该组由以下组成：9、15、27、42、52、55、56、59、60、66、74、85、97、99、101、102、104、116、118、154、156、157、158、161、164、176、179、182、185、188、198、199、200、203、206、210、211、212、216、230、232、239、242、250、253、255、256和269，其中根据SEQ ID NO:4进行编号。
在优选的实施例中，该蛋白酶变体包含以下取代中的一个或多个：S9E、S9R、A15T、K27R、N42R、G52S、S55P、T56P、G59D、G59E、N60D、N60E、V66A、N74D、S85N、S85R、S97A、S97E、S97D、S99E、S99D、S99G、S99N、S99H、S99M、S101A、V102I、V102N、S104A、G116V、G116R、S154D、A156E、G157S、G157D、G157P、S158E、Y161A、R164S、Q176E、N179E、S182E、Q185N、A188P、N198D、V199I、Q200L、Y203W、S206G、S210V、L211D、L211Q、L211E、N212D、N212E、N212S、M216S、M216A、Q230H、Q239R、N242D、S250D、S253D、N255W、N255D、N255E、L256E、L256D和R269H，其中根据SEQ ID NO:4进行编号。
在进一步优选的实施例中，该蛋白酶变体具有蛋白酶活性并且包含以下取代中的一个或多个：S9R、A15T、V68A、N218D、或Q245R(根据SEQ ID NO:4进行编号)，其中该蛋白酶变体是如下亲本蛋白酶的蛋白酶变体，该亲本蛋白酶与SEQ ID NO:4具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、例如至少75％、例如至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、或100％的序列同一性。
因此，在另一个具体实施例中，该蛋白酶是(c)中的蛋白酶。在一个实施例中，该蛋白酶是(c)中的变体，其包含以下取代中的一个或多个：S9E、S9R、A15T、K27R、N42R、G52S、S55P、T56P、G59D、G59E、N60D、N60E、V66A、N74D、S85N、S85R、S97A、S97E、S97D、S99E、S99D、S99G、S99N、S99H、S99M、、S101A、V102I、V102N、S104A、G116V、G116R、S154D、A156E、G157S、G157D、G157P、S158E、Y161A、R164S、Q176E、N179E、S182E、Q185N、A188P、N198D、V199I、Q200L、Y203W、S206G、S210V、L211D、L211Q、L211E、N212D、N212E、N212S、M216S、M216A、Q230H、Q239R、N242D、S250D、S253D、N255W、N255D、N255E、L256E、L256D和R269H，其中根据SEQ ID NO:4进行编号。
在另外的或替代性的实施例中，该另外的酶是脂肪酶，例如脂肪酶变体。然而，该组酶(或称为“另外的酶”)可以是蛋白酶、淀粉酶或任何其他酶类的不同变体。
在另一个实施例中，该洗涤剂组合物包含多于一种另外的酶，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种另外的酶。
在一个实施例中，根据本发明的组合物包含两种或更多种酶，例如至少三种酶，更优选地至少四种或五种酶。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、半纤维素分解活性或果胶溶解活性。
根据本发明的组合物可以包含一种或多种另外的酶，例如碳水化合物活性酶，像糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶、脂肪酶、角质酶、氧化酶(例如漆酶)、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是内切-β-1,4-葡聚糖酶(其具有与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％的同一性的序列)或族44木葡聚糖酶(该木葡聚糖酶具有与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％同一性的序列)。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、CellucleanClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
合适的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。该甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属(Bacillus)或腐质霉属(Humicola)的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或特异腐质霉(H.insolens)。合适的甘露聚糖酶描述于WO 1999/064619中。可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。
合适的另外的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,Protein Engng.[蛋白质工程学]4(1991)719-737和Siezen等人,Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是通过在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸来表征的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)、以及衍生自纤维单胞菌属(Cellumonas)的糜蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO 95/23221中)、及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP1921148中)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如衍生自解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选的蛋白酶变体可以包括以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN'编号)。
合适的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、和(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPreferenzTm、PurafectPurafectPurafectEffectenzTm、 以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
合适的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体酶或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括如在EP 258068和EP 305216中所述的来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为疏棉状腐质霉))的脂肪酶、来自腐质霉属(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO 96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)菌株(这些假单胞菌属菌株中的一些现在重命名为伯克氏菌属(Burkholderia))(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012))的脂肪酶、GDSL型链霉菌属(Streptomyces)(WO 10/065455)脂肪酶、来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(WO 10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(Pseudomonasmendocina)(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(WO 11/084412)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(WO 11/084417)脂肪酶、来自枯草芽孢杆菌(WO 11/084599)的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO 12/137147)的脂肪酶。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
可以与本发明的变体一起使用的合适的其他淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如从在GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株获得的α淀粉酶。
不同的合适的淀粉酶包括具有在WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是具有在位置181和182处的缺失和在位置193处的取代的那些。
其他合适的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。这种杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或者
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
其他可以使用的淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712的SEQID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO 01/66712的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
进一步的合适的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个处具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或者
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
进一步的合适的淀粉酶是具有WO 13184577中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K、以及G477K，和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
E187P+I203Y+G476K
E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K
其中这些变体任选地进一步包含在位置241处的取代和/或在位置178和/或位置179处的缺失。
进一步的合适的淀粉酶是具有WO 10104675中的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQ ID NO:1的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K、以及G478K，和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：N21D+D97N+V128I，其中这些变体任选地进一步在位置200处包含取代和/或在位置180和/或位置181处包含缺失。
其他合适的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别地优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体，以及在选自下组的一个或多个位置处另外具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是在所有这些位置处另外具有取代的变体。
其他的实例是淀粉酶变体，例如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、Stainzyme TM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X和BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S2000、Preferenz S100和PreferenzS110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。
合适的过氧物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
根据本发明的洗涤剂组合物还可以包含另外的酶，例如果胶裂解酶(例如PectawashTM)、叶绿素酶等。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包括在根据本发明的洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，特别是非尘化颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘化颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16个到50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；含有从12个碳原子至20个碳原子并且存在15个至80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
在一个实施例中，在脂肪酶变体中修饰的数目为1至30，例如1至20、1至10和1至5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个修饰。
在一个实施例中，在脂肪酶变体中修饰的数目为1至20，例如1至10和1至5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。
可以根据本领域已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如通过这样的技术确定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
在本发明的上下文中，已经从亲本酶制备了任何变体，即，脂肪酶、α-淀粉酶或蛋白酶变体。此类亲本酶被定义为包含如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6所列的氨基酸序列或由其组成的多肽。因此，已经从亲本酶制备这些变体。亲本酶可以通过序列同源性进行鉴定。出于本发明的目的，在该上下文中，通过参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间的同源性，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如上所述的Needleman-Wunsch算法来确定的。除了氨基酸比对之外，来自程序的结果还计算两个序列之间的“百分比同一性”。
基于这一描述，对于本领域技术人员而言，鉴别可以如本文所述进行修饰的合适的同源α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶是常规的。
基本上同源的亲本变体可以具有一个或多个(若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入，在本上下文中，术语“一个或多个”与术语“若干个”可互换使用。这些改变优选地具有微小的性质，即，不会显著地影响蛋白或多肽的三维折叠或活性的如上所述的保守氨基酸取代以及其他取代；典型地为一个至约30个氨基酸的小缺失；和小的氨基末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基，多达约20-25个残基的小接头肽，或有利于纯化的小的延伸(亲和标记物)，如聚组氨酸段或蛋白质A(Nilsson等人,1985,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]4:1075；Nilsson等人,1991,Methods Enzymol.[酶学方法]198:3)。通常还参见Ford等人,1991,Protein Expression and Purification[蛋白表达与纯化]2:95-107。
尽管如上所述的这些改变优选地具有微小的性质，但是此类改变还可以是实质的性质，例如均作为氨基末端或羧基末端延伸的多达300个氨基酸或更多个氨基酸的较大的多肽的融合。
亲本酶可以是(a)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽具有至少70％序列同一性的多肽。
因此，该亲本脂肪酶与具有SEQ ID NO:1的多肽具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、或100％的序列同一性，该亲本脂肪酶具有脂肪酶活性。
因此，该亲本α-淀粉酶与具有SEQ ID NO:2的多肽具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、或100％的序列同一性，该亲本α-淀粉酶具有α-淀粉酶活性。
因此，该亲本蛋白酶与具有SEQ ID NO:2、3、4、5或6的多肽具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、或100％的序列同一性，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。
这些亲本酶可以是杂合的多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合并且由此提供融合的亲本酶。术语“融合”和“杂合”在此可互换使用，但是构成相同的含义和目的，并且不应以任何限制的方式理解。
通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽还可以包括在两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins[蛋白质]；Structure,Function,and Genetics[结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
该亲本酶可以从任何属的有机体中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从……中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。
存在于根据本发明的组合物中的变体可以通过用于获得具有特定酶活性的变体的方法制备，其中该方法包括以下步骤：(a)在本文所指定的一个或多个(例如，若干个)位置处向亲本酶中引入修饰；和(b)回收该变体。
技术人员将会知道如何准备变体。然而，可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许该质粒的黏性末端以及插入片段彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990，Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。
任何定点诱变方法可用于本发明。存在许多可以用于制备变体的可商购的试剂盒。
合成基因的构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码目的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，例如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所描述的基于多重微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，所述相关的筛选程序例如由以下文献所披露的那些：Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；US5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中个体氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，然而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
除了酶，根据本发明的组合物还可以包含另外的组分。因此，在一个实施例中，该组合物进一步包含至少一种螯合剂；和/或至少一种表面活性剂；和/或至少一种聚合物；和/或至少一种水溶助剂；和/或至少一种助洗剂和/或共助洗剂；和/或至少一种香料；和/或至少一种漂白系统。
另外的组分的选择处于本领域技术人员能力范围内并且包含常规的成分(包括下文所述的示例性非限制性组分)。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
可以将脂肪酶变体或任何其他的酶变体以对应于以下各项的量添加至组合物中：每升洗涤液中0.001-100mg的蛋白质，例如0.01-100mg的蛋白质、优选地0.005-50mg的蛋白质、更优选地0.01-25mg的蛋白质、甚至更优选地0.05-10mg的蛋白质、最优选地0.05-5mg的蛋白质、并且甚至最优选地0.01-1mg的蛋白质。
可以将脂肪酶变体以对应于以下各项的量添加至洗涤剂组合物中：每克洗涤剂组合物中0.001-100mg的蛋白质，例如0.01-100mg的蛋白质、优选地0.005-50mg的蛋白质、更优选地0.01-25mg的蛋白质、甚至更优选地0.05-10mg的蛋白质、最优选地0.05-5mg的蛋白质、并且甚至最优选地0.01-1mg的蛋白质。
该脂肪酶变体可以使用稳定剂来稳定，这些稳定剂可以是选自下组，该组包含丙二醇、甘油、糖、糖醇、乳酸、硼酸、硼酸盐、和苯基硼酸衍生物(例如如下的那些：其中在该苯基硼酸衍生物中的残基R是C1-C6烷基基团，并且在这些烷基基团中更优选CH3、CH3CH2或CH3CH2CH2)。该苯基硼酸衍生物中的残基R还可以是氢。苯基硼酸衍生物的一个实例是具有以下式的4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)：
苯基硼酸衍生物可以另外在苯基环上具有其他化学修饰，并且具体地，它们可以含有一个或多个甲基、氨基、硝基、氯、氟、溴、羟基、甲酰基、乙基、乙酰基、叔丁基、茴香基、苄基、三氟乙酰基、N-羟基琥珀酰亚胺、叔丁氧羰基、苯甲酰基、4-甲基苄基、硫代茴香基(thioanizyl)、硫代甲苯基(thiocresyl)、苄基氧基甲基、4-硝基苯基、苄基氧基羰基、2-硝基苯甲酰基、2-硝基苯基氧硫基、4-甲苯磺酰基、五氟苯基、二苯基甲基、2-氯苄基氧基羰基、2,4,5-三氯苯基、2-溴苄基氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基、三苯基甲基、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基残基或基团或其组合。所有的稳定剂可以按所有质子化或去质子化形式存在于本发明的洗涤剂组合物中。此外，所有这些化合物(特别是其去质子化形式)可以与阳离子缔合。在这方面优选的阳离子是单价或多价的(特别是二价的)阳离子，特别是Na离子(Na+)、K离子(K+)、Li离子(Li+)、Ca离子(Ca2+)、Mg离子(Mg2+)、Mn离子(Mn2+)和Zn离子(Zn2+)。本发明的组合物可以包含两种或更多种稳定剂，例如像选自下组的那些，该组由以下组成：丙二醇、甘油、4-甲酰基苯基硼酸和硼酸盐。一个实例是包含4-甲酰基苯基硼酸和/或硼酸盐的本发明的组合物。该苯基硼酸衍生物可以按从0.00001至5.0wt％、优选地从0.0001至3.0wt％、从0.001至2.0wt％、从0.005至1.0wt％、从0.01至0.5wt％、从0.02至0.3wt％的量包含在洗涤剂组合物中。优选地，该硼酸/硼酸盐是按从0.001至5.5wt.％，并且愈加优选地从0.01至4.5wt.％、从0.05至3.5和从0.1至3、0.4至2.49、0.5至1.5wt.％的量包含在该组合物中。添加硼酸盐和4-甲酰基苯基硼酸的组合已经被发现是特别有效的，导致在组合物中酶稳定性的高的增加。优选地，该硼酸/硼酸盐以从0.001至5.5wt.％，并且愈加优选地从0.075至4.5wt.％、从0.09至3.5wt.％以及从0.1至2.49wt.％的量，并且该苯基硼酸衍生物以从0.001至0.08wt.％，并且愈加优选地从0.003至0.06wt.％、从0.005至0.05wt.％、从0.007至0.03wt.％、以及从0.009至0.01wt.％的量包含在洗涤剂组合物中。特别优选的是添加1.0至2.0wt％的量的4-甲酰基苯基硼酸组合1.0wt％硼酸盐。
根据本发明的组合物可以包含脂肪酶变体，这些脂肪酶变体也可以使用如在WO2005/105826和WO 2009/118375中所述的肽醛或肽酮来稳定。根据本发明的组合物的另一个实例涉及包含如本文所述的脂肪酶变体的洗涤剂组合物，其中该洗涤剂配制品是如在WO97/07202(其通过引用特此结合)中所披露的。
根据本发明的组合物还可以包含另外的表面活性剂，这些另外的表面活性剂可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的、或其混合物。在具体的实施例中，该洗涤剂组合物包含一种或多种非离子表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。典型地，所述一种或多种表面活性剂按重量计以从约0.1％至60％，例如约1％至大约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择一种或多种表面活性剂，并且包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当被包括在其中时，组合物将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、二甲基双十八烷基氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、以及其组合、烷基季铵化合物、烷氧基化的季铵(AQA)。
当被包括在其中时，组合物将通常包含按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当被包括在其中时，组合物将通常包含按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、及其组合。
根据本发明的组合物的又另一种组分是水溶助剂。
水溶助剂是以下化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007),Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高黏度。
因此，根据本发明的组合物可以包含按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
组合物的另一组分可以是助洗剂和/或共助洗剂。术语“助洗剂”可以通过M.K.Nagaraja等人,JAOCS[美国油脂化学协会杂志],第61卷,第9期(1984年9月),第1475-1478页中描述的测试来进行分类以确定在pH 8下将水硬度从溶液中的2.0mM(作为CaCO3)降低至0.10mM所需的最小助洗剂水平。助洗剂可以具体地为与例如钙和镁离子形成水溶性络合物的螯合剂。如本文所使用的术语“螯合剂(chelating agent或chelator)”是指与某些金属离子形成分子的化学品，从而使这些离子失活以致于使他们不能与其他元素进行反应，因此是通过形成螯合物而抑制化学活性的一种结合剂。螯合是在配体与单一中心原子之间形成或存在的两种或更多种单独的结合。配体可以是任何有机化合物、硅酸盐或磷酸盐。因此，在一个实施例中，根据本发明的组合物可以包含按重量计约0至65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。助洗剂和/或共助洗剂可以特别地是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤、ADW和硬表面清洁洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
根据本发明的组合物还可以包含按重量计0-65％，例如约5％至约40％的洗涤剂共助洗剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或与助洗剂，例如沸石助洗剂结合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。进一步的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐)以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US5977053中。
组合物的又另一组分可以是漂白系统。因此，在一个实施例中，根据本发明的洗涤剂组合物可以包含按重量计0-10％，例如约1％至约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤、ADW和硬表面清洁洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸和其混合物。合适的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))、及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括与过酸形成漂白活化剂组合的基于过氧化物的漂白系统，这些系统可以包含例如无机盐，包括碱金属盐例如过硼酸盐的钠盐(通常为单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。漂白活化剂在此意指与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。如此形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的合适的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。合适的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸钠、双过氧化十二酸、4-(十二烷基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)，和/或WO 98/17767中披露的那些。目的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酯(像Triacin)具有以下优点，其是环境友好的，因为其最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且其是有效的漂白活化剂。最后，ATC为衣物洗涤添加剂提供良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，例如6-(酞酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三基和异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、WO 2007/087242中。合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
组合物的另一种组分是聚合物。因此，在一个实施例中，根据本发明的组合物包含聚合物。
因此，根据本发明的组合物可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物(如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸双季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。
组合物的又另一种组分可以是织物调色剂。因此，在一个实施例中，根据本发明的洗涤剂组合物包含织物调色剂。
根据本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂(例如染料或色素)，当织物调色剂配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与包含所述洗涤剂组合物的洗涤液接触时，所述织物调色剂可以沉积到织物上，从而通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色调。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少一部分可见光光谱时，它们改变表面的色彩。合适的织物调色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如描述于WO2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226(通过引用特此结合)中。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的调色剂还披露于例如WO 2007/087257、WO 2007/087243中。
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂(包括黏土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
根据本发明的组合物还可以包含分散剂。具体而言，粉状洗涤剂可以包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。合适的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉末洗涤剂],Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]第71卷,马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc)中。根据本发明的洗涤剂组合物还可以包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。根据本发明的洗涤剂组合物还可以优选地包含另外的组分，这些组分可以使正在被清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，该增亮剂优选以约0,01％至约0,5％的水平存在。在该组合物中可以使用适合在衣物洗涤洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下的钠盐：4,4’-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐，4,4’-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4”-萘-1.,2’:4,5)-1,2,3-三唑-2”-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)，巴塞尔，瑞士获得的Tinopal DMS和Tinopal CBS。Tinopal DMS是4,4’-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。Tinopal CBS是2,2’-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals andChemicals)，孟买，印度供应。适合使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。
合适的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
根据本发明的组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如基于棉布和聚酯的织物)去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是非离子或阴离子的基于对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接合共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents[粉末洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。该核心结构可以包含聚烯亚胺结构或聚烷醇胺结构，如在WO 2009/087523中详述(通过引用特此结合)。此外，任意接合共聚物是合适的污垢释放聚合物。合适的接合共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO2006/108856和WO 2006/113314中(通过引用特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如在EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(二者通过引用特此结合)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。根据本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他合适的辅料包括但不限于防缩剂、防皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、用于液体洗涤剂的结构化剂(structurants)和/或结构弹力剂。
因此，在一个具体实施例中，该组合物进一步包含至少一种螯合剂；和/或至少一种表面活性剂；和/或至少一种聚合物；和/或至少一种水溶助剂；和/或至少一种助洗剂和/或共助洗剂；和/或至少一种香料；和/或至少一种漂白系统。
组合物的配制品
根据本发明的组合物可以处于任何常规形式，例如棒状，均匀的片剂，具有两层或更多层的片剂，常规的或压缩的粉末，颗粒，糊状，凝胶，或常规的、压缩的或浓缩的液体。相应地，在一个实施例中，该组合物是洗涤剂组合物或辅助组合物。在一个实施例中，该辅助组合物是预处理组合物。在另一个实施例中，该组合物是浸泡组合物。在又另一个实施例中，该组合物是加强组合物。在任一辅助组合物中，该组合物能以任何形式配制，例如液体、凝胶、粉末或颗粒。
在一个实施例中，根据本发明的洗涤剂组合物是液体衣物洗涤洗涤剂组合物或粉末衣物洗涤洗涤剂组合物。
如本文所使用的术语“液体衣物洗涤洗涤剂组合物”是指处于稳定的液体形式并且用于洗涤织物的方法中的洗涤剂组合物。因此，该洗涤剂组合物被配制为流体形式。
如本文所使用的术语“粉末衣物洗涤洗涤剂组合物”是指用于洗涤织物的方法中的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物处于固体形式，例如颗粒、非尘化的颗粒或粉末。
洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器给药单位的形式。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了内部体积。所述内部体积可以分成袋的室。优选的薄膜是聚合材料，优选被制成薄膜或薄片的形式的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，其包含可水解降解的和水溶性的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在商品参考号M8630下，如由克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)，盖里(Gary)，印第安纳州(Ind.)，美国销售)加增塑剂，如甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。袋可以包含固体衣物洗涤清洁组合物或部分组分以及/或者液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与含有固体的室不同。参考：(US2009/0011970A1)。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。因此，可以避免组分间的不良的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起所选的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％并且高达95％的水，如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包含于水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
方法和用途
在一个方面，本发明涉及如本文所述的组合物在衣物洗涤中的用途。相应地，本发明涉及一种组合物的用途，该组合物包含(i)至少一种表面活性剂和(ii)亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
(a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
(b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
(c)具有脂肪酶活性；并且
与亲本脂肪酶相比，在衣物洗涤中具有改进的活性。
在一个实施例中，如本文所述的组合物的用途是在衣物洗涤中。
根据本发明的组合物可以例如配制为手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适用于预处理玷污的织物的衣物洗涤添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物。因此，在一个实施例中，该组合物是液体衣物洗涤洗涤剂组合物或粉末衣物洗涤洗涤剂组合物。
清洁过程或者纺织品保养过程可以例如是衣物洗涤过程，家用硬表面清洁操作被认为涵盖了硬表面，例如浴室砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆的清洁。衣物洗涤过程可以例如是家庭衣物洗涤，但是它也可以是工业衣物洗涤。用于洗涤织物和/或衣服的过程可以是如下的一个过程，该过程包括用包含洗涤剂组合物和至少一种蛋白酶变体的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是包含洗涤剂组合物的水性洗涤溶液。
经过洗涤、清洁或者纺织品保养过程的织物和/或衣服可以是常规的可洗涤的衣物，例如家庭衣物。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣服和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛巾布。这些织物可以是基于纤维素的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。这些织物还可以是基于非纤维素的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳香族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及基于纤维素和基于非纤维素的纤维的共混物。共混物的实例是棉布和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。
最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或新酶相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)具有替代和/或改进的特性时，需要新酶来实现与传统洗涤剂组合物比较时类似或改进的洗涤性能。
典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正在被清洁的污渍消散和分散并随后被清洗出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且很多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。而其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中去除金属离子来软化洗涤水。
这些酶组合物可以进一步包含如下的至少一种或多种：衣物洗涤中的表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator或chelating agent)、漂白系统或漂白组分。
表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator或chelating agent)、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的脂肪酶变体的情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator或chelating agent)、漂白系统和/或漂白组分的量可以有所减小。优选地，作为表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator或chelating agent)、漂白系统和/或漂白组分的至少一种组分以这样的量存在，所述量比该组分在未添加本发明脂肪酶变体的系统中的量(如这种组分的常规量)少1％、例如少2％、例如少3％、例如少4％、例如少5％、例如少6％、例如少7％、例如少8％、例如少9％、例如少10％、例如少15％、例如少20％、例如少25％、例如少30％、例如少35％、例如少40％、例如少45％、例如少50％。洗涤剂组合物还可以是如下的组合物，该组合物不含至少一种组分，该组分是助洗剂、螯合剂(chelator或chelatingagent)、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。
在一个实施例中，该用途是在低温下，如低于50°、如低于45℃、如低于40℃、如低于35℃、如低于30℃、如低于25℃、如低于20℃、如低于15℃下进行的衣物洗涤中。
如本文所使用的术语“低温”是指5-50℃，例如5-45℃、优选5-40℃、更优选5-30℃、更优选5-20℃、最优选5-15℃，并且特别是5-10℃的温度。
在一个实施例中，组合物的用途是在低温下，如低于50℃、如低于45℃、如低于40℃、如低于35℃、如低于30℃、如低于25℃、如低于20℃、如低于15℃下进行的衣物洗涤中。
洗涤方法
根据本发明的组合物理想地适用于衣物洗涤应用。因此，在一个方面，本发明涉及进行衣物洗涤的方法，该方法包括用如本文所述的组合物洗涤衣服，优选地在50℃或更低的温度，例如40℃或更低的温度、或更优选地在30℃或更低的温度、或甚至更优选地在20℃或更低的温度进行该洗涤。相应地，该洗涤方法包含用一种组合物洗涤织物，该组合物包含(i)至少一种表面活性剂和(ii)亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220和L227对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
c)具有脂肪酶活性；并且
优选地在50℃或更低的温度下，优选地在40℃或更低的温度下，或更优选地在30℃或更低的温度下，或甚至更优选地在20℃或更低的温度下，与亲本脂肪酶相比具有改进的活性。
在一个实施例中，在所述衣物洗涤过程中所述表面活性剂的浓度是至少0.005g/L洗涤水，例如至少0.007g/L，例如至少0.01g/L，或者例如至少0.1g/L。
在一个实施例中，在所述衣物洗涤过程中所述表面活性剂的浓度是至少1g/L洗涤水，例如至少2g/L，例如至少3g/L，或者例如4g/L。
在一个实施例中，在所述衣物洗涤过程中所述表面活性剂的浓度是在0.05至10g/L洗涤水范围内，例如在0.1-8g/L之间，例如在0.1-6g/L之间，或例如在0.2-6g/L洗涤水之间。
这些方法包括用于洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含洗涤剂组合物的清洁衣物洗涤溶液进行接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约11.5的pH。可以在溶液中按以下浓度使用组合物：从约100ppm，优选地500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。
在具体实施例中，按以下pH执行该洗涤方法：从约5.0至约11.5、或者从约6至约10.5、约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9、或者约7至约8、约8至约11、约8至约10、约8至约9、约9至约11、约9至约10、约10至约11，优选约5.5至约11.5。
清洁过程中的水硬度由水中的水硬度和/或由洗涤剂组合物中螯合剂的存在决定。
在具体实施例中，按以下硬度执行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型的欧洲洗涤条件下，硬度是约16°dH，在典型的美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型的亚洲洗涤条件下，是约3°dH，然而，洗涤条件可根据水的来源而局部地变化。
在一个实施例中，根据本发明的组合物用于衣物洗涤过程中，其中所得的水硬度是在0和30°dH之间，例如在0和15°dH之间、例如在0和10°dH之间、例如在3和20°dH之间、例如在10和20°dH之间、或者例如高于20°dH。
在具体实施例中，洗涤过程在从10分钟到超过400分钟的一段时间内进行。因此，在一个实施例中，该用途在衣物洗涤过程中，其中该洗涤循环是少于360分钟，例如少于280分钟、例如少于150分钟、例如少于100分钟、例如少于50分钟、例如少于30分钟、例如少于15分钟、或例如少于10分钟。
在一个实施例中，该方法是用根据本发明的组合物预处理织物的方法，该方法包括以下步骤：向所述织物中添加所述组合物，和将该组合物留在织物上一段时间，以及从所述织物上漂洗掉所述组合物。
用于在上述方法中使用的组合物可以进一步包含至少一种如以上部分中列出的另外的酶，例如选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶，例如蛋白酶、脂肪酶和角质酶；糖酶，例如淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、和果胶酶；或其组合。
在以下编号的段落中描述了本发明：
1.一种亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
(a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220、L227和K237对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
(b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
(c)具有脂肪酶活性。
2.根据段落1所述的变体，其中所述脂肪酶变体在以下位置中的至少一个上包含修饰：E1、V2、D27、N33、G38、F51、E56、L69、D96、K98、D111、G163、V176、H198、E210、Y220、L227、T231、N233、K237、D254和P256，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
3.根据段落1或2所述的变体，其中所述脂肪酶变体包含以下修饰中的至少一个：E1C、V2Y、D27R、N33K、N33Q、G38A、F51V、E56K、L69R、D96E、D96L、K98I、K98Q、D111A、G163K、V176L、H198S、E210K、Y220F、L227G、T231R、N233R、N233C、K237C、D254S和P256T，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
4.根据段落1-3中任一项所述的变体，其中所述脂肪酶变体进一步包含选自下组的取代之一：S54T、S83T、G91A、A150G、I255A和E239C。
5.根据段落1-4中任一项所述的变体，其中所述脂肪酶变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％但小于100％的序列同一性。
6.根据段落1-5中任一项所述的变体，其中所述亲本脂肪酶是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如至少100％序列同一性的脂肪酶。
7.根据段落1-6中任一项所述的变体，其中该脂肪酶变体包含取代E1C+N233C和一个或多个另外的取代。
8.根据段落1-7中任一项所述的变体，其中该变体包含以下组的取代之一或由其组成，使用SEQ ID NO:1进行编号：
9.如段落1-8中任一项所述的变体，其中该变体具有脂肪酶活性，例如与亲本脂肪酶特别是如SEQ ID NO:1所示的脂肪酶相比增加的相对活性。
10.一种组合物，其包含(i)至少一种表面活性剂和(ii)亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体
(a)在与SEQ ID NO:1的位置E1、V2、N33、F51、E56、L69、K98、V176、H198、E210、Y220、L227和K237对应的至少一个位置上包含修饰；并且任选地进一步在与SEQ ID NO:1的位置D27、G38、D96、D111、G163、T231、N233、D254和P256对应的至少一个位置上包含修饰；
(b)与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性；
(c)具有脂肪酶活性；并且
(d)与亲本脂肪酶相比具有改进的活性。
11.如段落10所述的组合物，其包含如段落1-9中任一项所述的脂肪酶变体。
12.根据段落10或11所述的组合物，其中所述表面活性剂的浓度是所述组合物的至少3wt％，例如至少4wt％、例如至少5wt％、例如至少6wt％、例如至少7wt％、例如至少8wt％。
13.根据段落10-12中任一项所述的组合物，其中所述至少一种表面活性剂包括阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐(LAS)或醇醚硫酸盐(AEOS)。
14.根据段落10-13中任一项所述的组合物，其中所述至少一种表面活性剂是两种或多种表面活性剂的混合物。
15.根据段落10-14中任一项所述的组合物，其中所述至少一种表面活性剂是第一表面活性剂和第二表面活性剂的混合物。
16.根据段落10-15中任一项所述的组合物，其中所述第一表面活性剂是第一阴离子表面活性剂并且所述第二表面活性剂是第二阴离子表面活性剂。
17.根据段落10-16中任一项所述的组合物，其中所述第一阴离子表面活性剂是直链烷基苯磺酸盐(LAS)并且所述第二阴离子表面活性剂是醇醚硫酸盐(AEOS)。
18.根据段落10-17中任一项所述的组合物，其中所述第一表面活性剂是阴离子表面活性剂并且所述第二表面活性剂是非离子表面活性剂。
19.根据段落18所述的组合物，其中所述阴离子表面活性剂是直链烷基苯磺酸盐(LAS)或醇醚硫酸盐(AEOS)并且所述非离子表面活性剂是醇乙氧基化物(AEO)。
20.根据段落10-19中任一项所述的组合物，其中在清洁过程中总表面活性剂浓度是从0.1至15mM之间，例如0.5-10mM，特别地从1-5mM，浓度是在0.01和10mM之间。
21.根据段落10-20中任一项所述的组合物，其中所述第一表面活性剂和所述第二表面活性剂以3:1、2:1、1:1的比例，例如从10:1至1:10，例如5:1至1:5、或3:1至1:3的范围存在于所述组合物中。
22.根据段落10-21中任一项所述的组合物，其中所述脂肪酶变体在以下位置中的至少一个上包含修饰：E1、V2、D27、N33、G38、F51、E56、L69、D96、K98、D111、G163、V176、H198、E210、Y220、L227、T231、N233、K237、D254和P256，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
23.根据段落10-22中任一项所述的组合物，其中所述脂肪酶变体包含以下修饰中的至少一个：E1C、V2Y、D27R、N33K、N33Q、G38A、F51V、E56K、L69R、D96E、D96L、K98I、K98Q、D111A、G163K、V176L、H198S、E210K、Y220F、L227G、T231R、N233R、N233C、K237C、D254S和P256T，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
24.根据段落10-23中任一项所述的组合物，其中该脂肪酶变体包含取代E1C+N233C和一个或多个另外的取代。
25.根据段落10-24中任一项所述的组合物，其中所述脂肪酶变体进一步包含选自下组的取代之一：S54T、S83T、G91A、A150G、I255A和E239C。
26.根据段落10-25中任一项所述的组合物，其中所述脂肪酶变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％但小于100％的序列同一性。
27.根据段落10-26中任一项所述的组合物，其中所述亲本脂肪酶是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的脂肪酶。
28.根据段落10-27中任一项所述的组合物，其包含直链烷基苯磺酸盐(LAS)和如段落1-9中任一项所述的脂肪酶变体，特别是包含以下组的取代之一的脂肪酶变体，使用SEQ ID NO:1进行编号：
29.根据段落10-27中任一项所述的组合物，其包含醇醚硫酸盐(AEOS)和如段落1-9中任一项所述的脂肪酶变体，特别是包含以下组的取代之一的脂肪酶变体，使用SEQ IDNO:1进行编号：
| E1C+H198Y+N233C |
| E1C+H198T+N233C |
| E1C+H198G+N233C |
| E1C+H198S+N233C |
| E1C+H198L+N233C |
| E1C+H198G+N233C |
30.根据段落10-27中任一项所述的组合物，其包含直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)以及如段落1-9中任一项所述的脂肪酶变体，特别是包含以下组的取代之一的脂肪酶变体，使用SEQ ID NO:1进行编号：
31.根据段落10-27中任一项所述的组合物，其包含直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)以及如段落1-9中任一项所述的脂肪酶变体，特别是包含以下组的取代之一的脂肪酶变体，使用SEQ ID NO:1进行编号：
32.根据段落10-27中任一项所述的组合物，其包含直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)以及如段落1-9中任一项所述的脂肪酶变体，特别是包含以下组的取代之一的脂肪酶变体，使用SEQ ID NO:1进行编号：
33.根据段落10-32中任一项所述的组合物，其进一步包含助洗剂，特别是螯合剂，例如EDTA，特别以0.001和100mM之间，例如0.01和10mM之间，例如0.1-5mM的浓度。
34.根据段落33所述的组合物用于清洁中，其中所得的水硬度是在0和30°dH之间，例如在0和15°dH之间、例如在0和10°dH之间、例如在3和20°dH之间、例如在10和20°dH之间、或者例如高于20°dH。
35.根据段落33或34所述的组合物，其包含直链烷基苯磺酸盐(LAS)、醇乙氧基化物(AEO)和螯合剂，例如EDTA以及如段落1-9中任一项所述的脂肪酶变体，特别是包含以下组的取代之一的脂肪酶变体，使用SEQ ID NO:1进行编号：
36.根据段落10-35中任一项所述的组合物，其包含直链烷基苯磺酸盐(LAS)和醇乙氧基化物(AEO)以及如段落1-9中任一项所述的脂肪酶变体，特别是包含以下组的取代之一的脂肪酶变体，使用SEQ ID NO:1进行编号：
| E1C+H198Y+N233C |
| E1C+H198T+N233C |
| E1C+H198G+N233C |
| E1C+H198S+N233C |
| E1C+H198L+N233C |
| E1C+H198G+N233C |
37.根据段落10-36中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种另外的酶，例如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、另一种脂肪酶、β-葡聚糖酶和/或甘露聚糖酶。
38.根据段落37所述的组合物，其中所述至少一种另外的酶是α-淀粉酶变体，该变体在与SEQ ID NO:1的位置H1、N54、V56、K72、G109、F113、R116、T134、W140、W159、W167、Q169、Q172、L173、A174、R181、G182、D183、G184、W189、E194、N195、V206、G255、N260、F262、A265、W284、F289、G304、G305、W347、K391、Q395、W439、W469、R444、F473、G476和G477对应的一个或多个位置上包含修饰，其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:2具有至少75％但小于100％的序列同一性并且其中所述α-淀粉酶变体具有α-淀粉酶活性。
39.根据段落38所述的组合物，其中所述α-淀粉酶变体选自下组，该组由以下组成：
H1*+N54S+V56T+G109A+Q169E+Q172K+A174*+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+G109A+R116H+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+F113Q+R116Q+W167F+Q172G+A174S+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+K391A+P473R+G476K；
H1*+N54S+V56T+G109A+F113Q+R116Q+Q172N+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+A265G+K391A+P473R+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+F113Q+W167F+Q172R+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+R116H+T134E+W167F+Q172G+L173V+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+G255A+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+R116H+T134E+W167F+Q172G+L173V+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+G255A+K391A+Q395P+T444Q+P473R+G476K；
H1*+N54S+V56T+G109A+T134E+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K；
H1*+N54S+V56T+K72R+G109A+A174S+G182*+D183*+N195F+V206L+G255A+K391A+G476K；以及
H1*+N54S+V56T+G109A+W167F+Q172E+L173P+A174K+G182*+D183*+N195F+V206L+K391A+G476K。
40.根据段落37所述的组合物，其中所述至少一种另外的酶是具有蛋白酶活性的蛋白酶，其中所述蛋白酶选自下组：
a)与SEQ ID NO:4、5、或6的序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的蛋白酶；
b)在与SEQ ID NO:7的位置171、173、175、179或180对应的一个或多个位置处包含取代的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体与SEQ ID NO:7具有至少75％但小于100％的序列同一性；以及
c)与SEQ ID NO:3中的蛋白酶相比，在与位置32、33、48、49、50、51、52、53、54、58、59、60、61、62、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、116、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、150、152、153、154、155、156、158、159、160、161、164、169、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、197、198、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、和216对应的一个或多个位置处包含修饰的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体与SEQ ID NO:4具有至少75％的序列同一性。
41.根据段落40所述的组合物，其中所述蛋白酶是(a)中的蛋白酶。
42.根据段落40所述的组合物，其中所述蛋白酶是(b)中的蛋白酶。
43.根据段落37或39中任一项所述的组合物，其中所述蛋白酶是(b)中的所述变体，该变体在与位置171、173、175、179或180对应的至少一个位置上包含取代，并且其中与SEQ ID NO:7的位置171对应的位置上的氨基酸选自下组，该组由W、K、E、D和N组成；和/或与SEQ ID NO:7的位置173对应的位置上的氨基酸是P；和/或与SEQ ID NO:7的位置175对应的位置上的氨基酸选自下组，该组由A、V和P组成；和/或与SEQ ID NO:7的位置179对应的位置上的氨基酸选自下组，该组由C、V、Q、S、T、E、H、K、M、N、Y和A组成；和/或与SEQ ID NO:7的位置180对应的位置上的氨基酸是Y。
44.根据段落40所述的组合物，其中所述蛋白酶是(c)中的蛋白酶。
45.根据段落37或40中任一项所述的组合物，其中所述蛋白酶是(c)中的所述变体，该变体包含以下取代中的一个或多个：S9E、S9R、A15T、K27R、N42R、G52S、S55P、T56P、G59D、G59E、N60D、N60E、V66A、N74D、S85N、S85R、S97A、S97E、S97D、S99E、S99D、S99G、S99N、S99H、S99M、、S101A、V102I、V102N、S104A、G116V、G116R、S154D、A156E、G157S、G157D、G157P、S158E、Y161A、R164S、Q176E、N179E、S182E、Q185N、A188P、N198D、V199I、Q200L、Y203W、S206G、S210V、L211D、L211Q、L211E、N212D、N212E、N212S、M216S、M216A、Q230H、Q239R、N242D、S250D、S253D、N255W、N255D、N255E、L256E、L256D和R269H，其中根据SEQ ID NO:4进行编号。
46.根据段落10-45中任一项所述的组合物，其中在所述脂肪酶变体中的修饰的数目是1至20，例如1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。
47.根据段落10-46中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种螯合剂；和/或至少一种聚合物；和/或至少一种水溶助剂；和/或至少一种助洗剂和/或共助洗剂；和/或至少一种香料；和/或至少一种漂白系统。
48.根据段落10-47中任一项所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物或辅助组合物。
49.根据段落48所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物是液体衣物洗涤洗涤剂组合物或粉末衣物洗涤洗涤剂组合物。
50.根据段落49所述的组合物，其中所述辅助组合物是预处理组合物、浸泡组合物或加强组合物。
51.根据段落10-50中任一项所述的组合物在衣物洗涤或工业清洁中的用途。
52.根据段落10至51中任一项所述的组合物的用途，其中所述用途是在衣物洗涤过程中，其中所得的水硬度是在0和30°dH之间，例如在0和15°dH之间、例如在0和10°dH之间、例如在3和20°dH之间、例如在10和20°dH之间、或者例如高于20°dH。
53.根据段落10-52中任一项所述的组合物的用途，其中所述用途是在衣物洗涤过程中，其中洗涤循环是少于360分钟，例如少于280分钟、例如少于150分钟、例如少于100分钟、例如少于50分钟、例如少于30分钟、例如少于15分钟、或例如少于10分钟。
54.根据段落53所述的组合物的用途，其中在所述衣物洗涤过程中所述表面活性剂的浓度是至少0.005g/L洗涤水，例如至少0.007g/L、例如至少0.01g/L、或例如至少0.1g/L、或例如至少1g/L、例如至少2g/L、例如至少3g/L、或例如4g/L洗涤水，或在0.05-10g/L洗涤水之间，例如在0.1-8g/L之间、例如在0.1-6g/L之间、或例如在0.2-6g/L洗涤水之间的范围内。
55.一种洗涤方法，该洗涤方法包括用根据段落10-50中任一项所述的组合物，优选地在50℃或更低的温度下、或更优选地在40℃或更低的温度下、或更优选地在30℃或更低的温度下、或甚至更优选地在20℃或更低的温度下洗涤织物。
56.一种用根据段落10-50中任一项所述的组合物预处理织物的方法，该方法包括以下步骤：向所述织物中添加所述组合物，和将该组合物留在织物上一段时间，以及从所述织物上漂洗掉所述组合物。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例实例1-测定
对硝基苯基(pNP)测定(一般脂肪酶活性测定)：
可以通过使用对硝基苯基酰基酯作为底物的动力学测定来确定脂肪酶的水解活性。
可以将以下这些底物在DMSO中的100mM储备溶液在测定缓冲液(50mM Tris；pH7.7；0.4％ TritonX-100)中稀释至1mM 25的终浓度：对硝基苯基丁酸酯(C4)、对硝基苯基己酸酯(C6)、对硝基苯基癸酸酯(C10)、对硝基苯基月桂酸酯(C12)和对硝基苯基棕榈酸酯(C16)(所有都来自西格玛奥德里奇丹麦公司(Sigma-Aldrich Danmark A/S)，KirkebjergAllé 84，2605布隆德比目录号：C4：N-9876，C6：N-0502，C10：N-0252，C12：N-2002，C16：N-2752)。
可以将在50mM Hepes(pH 8.0)；10ppm TritonX-100；+/-20mM CaCl2中的本发明的脂肪酶、亲本脂肪酶和适当的对照(例如缓冲液(阴性)、LipolaseTM&LipexTM(阳性))按0.01mg/mL；5x10-3 mg/mL；2.5x10-4mg/mL；和1.25x10-4 mg/ml的终浓度添加至96孔能肯(NUNC)板(目录号：260836，Kamstrupvej 90，DK-4000，罗斯基勒)中的底物溶液中。可以在Spectra max 190(分子设备股份有限公司(Molecular Devices GmbH)，俾斯麦林(Bismarckring)39号，里斯河畔比伯拉赫(Biberach an der Riss)88400，德国)上，以10秒间隔，在405nm处监测由对硝基苯基酰水解而释放的对硝基苯酚，持续5分钟。可以将变体对一个或多个底物的水解活性与亲本脂肪酶对一个或多个底物的水解活性进行比较。
相对洗涤性能(RP(洗涤))
为了评估在衣物洗涤中的洗涤性能，可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽和盖子，盖子针对所有槽开口强力挤压衣物洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈摇动以使测试溶液与纺织品接触并以规则的、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。
在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：
表1：实验条件
通过添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝4:1:7.5)将水硬度调节为15°dH。
表2：标准洗涤剂B
表3：标准洗涤剂A
通过向测试系统添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)，可以将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。表4：标准洗涤剂X
*在没有AEO的情况下混合标准洗涤剂X。在洗涤之前，单独地添加AEO。
通过向测试系统添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝2:1:4.5)，可以将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表5：标准洗涤剂Z
*在没有AEO的情况下混合标准洗涤剂Z。在洗涤之前，单独地添加AEO。
通过向测试系统添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)，可以将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。用4M NaOH调节pH。
表6：具有漂白剂的标准洗涤剂Z
*在没有AEO的情况下混合标准洗涤剂Z。在洗涤之前，单独地添加AEO。
表7：标准洗涤剂A’
通过向测试系统添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)，可以将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并且使用滤纸将过量的水从纺织品中去除，并且之后立即将纺织品在100℃干燥15分钟。
将洗涤性能测量为所洗涤的脏纺织品的颜色变化。该污物可以是与胭脂树红混合的乳脂。胭脂树红包含着色剂降胭脂树素，其通过具有pH依赖性颜色变化作为pH指示剂起作用。脂肪酶活性导致游离脂肪酸从乳脂酰基甘油释放，并且这导致pH降低并且由此导致降胭脂树素pH指示剂的颜色变化。脂肪酶洗涤性能因此可以被表示为当用白光照射时，从所洗涤的脏纺织品反射-发射的光的颜色变化程度。
使用专业平板扫描仪(EPSON EXPRESSION 10000XL，阿特亚公司(Atea A/S)，Lautrupvang 6，2750巴勒鲁普，丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤的脏纺织品的图像。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。
归因于脂肪酶活性的颜色变化被测量为相对于光强度值(Int)的绿光(G)的反射-发射的变化，该变化计算为：
相对于参比脂肪酶，脂肪酶的相对洗涤性能(RP(洗涤))被计算为：
RP(洗涤)＝(G/Int(变体)-G/Int(无酶))/(G/Int(参比脂肪酶)-G/Int(无酶))。
如果脂肪酶表现优于参比(RP(洗涤)>1)，则认为脂肪酶展示出改进的洗涤性能。在本发明的上下文中，参比酶是相对于测试的脂肪酶具有单个氨基酸取代的脂肪酶。
通过固相微萃取气相色谱法测量进行的气味检测。
使用以下方法，通过固相微提取气相色谱法(SPME-GC)测量来自脂肪酶洗涤的布样的丁酸释放(气味)。
如上文规定的洗涤乳脂胭脂树红染色的EMPA221棉纺织品，并且在洗涤后，使用滤纸从纺织品中去除过量的水，并且其后将纺织品在25℃下干燥2h。用四片洗涤并干燥的纺织品(直径5mm)进行每次SPME-GC测量，这些纺织品被转移到气相色谱仪(GC)小瓶并且小瓶是封闭的。将样品在30℃下孵育24小时，并且随后加热至140℃持续30分钟，并且储存在20℃-25℃下至少4小时，之后进行分析。在配备有Stabilwax-DAw/Integra-Guard柱(30m，0.32mm ID和0.25um df)和Carboxen PDMS SPME纤维(85微米)的Varian 3800GC上进行分析。对每个GC小瓶的采样在50℃下用SPME纤维在纺织品片之上的顶部空间(head space)中进行8分钟，且随后将采样的化合物注射到柱上(注射器温度＝250℃)。柱流速＝2ml氦气/分钟。柱烘箱温度梯度：0分钟＝50℃、2分钟＝50℃、6分钟45秒＝240℃、11分钟45秒＝240℃。使用火焰离子化检测器(Flame Ionization Dector，FID)进行检测，并且使用可靠的标准鉴定出丁酸的保留时间。
脂肪酶的相对气味释放(RP(气味))是从脂肪酶洗涤的布样释放的丁酸量(峰面积)与从参比脂肪酶洗涤的布样释放的丁酸量(峰面积)之间的比率，计算比率之前，两个值均针对从非脂肪酶洗涤的布样(空白)释放的丁酸量(峰面积)进行了校正。参比脂肪酶是相对于测试的脂肪酶具有单个氨基酸取代的多肽。根据以下公式计算多肽的相对气味性能(RP(气味))：
RP(气味)＝(气味(脂肪酶)-气味(无酶))/(气味(参比脂肪酶)-气味(无酶))
其中，气味是测量的从纺织品表面释放的丁酸(峰面积)。
α-淀粉酶活性测定-pNP-G7测定
可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷的缩写的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶裂解的嵌段寡糖。裂解之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放游离PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。包含G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏公司/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸，pH 7.0)。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、≥4kU/L的α-葡糖苷酶。
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-pNP底物混合，产生底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM MOPS，0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))，1mM CaCl2，pH 8.0。
程序：
将待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板中并添加80μl底物工作溶液来进行测定。将溶液混合并在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。
在一组给定的条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(吸光度/分钟)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。
α-淀粉酶活性测定-Phadebas活性测定
α-淀粉酶活性还可以通过使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学公司(Magle Life Sciences)，隆德(Lund)，瑞典))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在620nm测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将待分析的α-淀粉酶样品稀释于具有所希望的pH的活性缓冲液中。将两个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。将30μl稀释的淀粉酶样品添加至150μl底物并混合。在37℃孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg离心MTP 5分钟。将100μl转移至新的MTP并且测量620nm的吸光度。
该α-淀粉酶样品应稀释成使得620nm的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
α-淀粉酶活性测定-Amylazyme活性测定
α-淀粉酶活性还可以通过使用包括已经与乳糖和硬脂酸镁混合并且压片的AZCL-直链淀粉的淀粉酶底物(Amylazyme Test，由梅格泽姆公司(Megazyme)提供的用于谷类和细菌淀粉酶的测定法)的方法来确定。将蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联直链淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了直链淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在590nm测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将待分析的α-淀粉酶样品稀释于具有所希望的pH的活性缓冲液中。将两个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。接下来，将25μl稀释的淀粉酶样品添加到150μl底物中并混合。将混合物在37℃孵育10分钟。通过添加25μl 1M NaOH并且混合来停止反应。将MTP在4000xg离心5分钟，随后将100μl转移至新的MTP，并在590nm处测量吸光度。
蛋白酶活性测定：
1)Suc-AAPF-pNA活性测定：
蛋白水解活性可以通过使用Suc-AAPF-PNA底物的方法来确定。Suc-AAPF-PNA是N-琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且它是可以被内切蛋白酶切割的一种嵌段肽。在切割后，游离PNA分子被释放出来，并且它具有黄颜色并且因此可以通过可见光分光光度法在波长405nm进行测量。该Suc-AAPF-PNA底物由巴亨公司(Bachem)制造(目录号L1400，溶解于DMSO中)。
待分析的蛋白酶样品被稀释在残余活性缓冲液(100mM Tris pH 8.6)中。通过转移60μl的稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加140μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mMTris pH 8.6)中进行该测定。将该溶液在室温混合并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。
在一组给定的条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(吸光度/分钟)与所讨论的蛋白酶的比活性(活性/mg酶)成正比。应该将蛋白酶样品稀释至其中斜率为线性的水平。
用于测量游离钙离子的测定
以下测定可用于测量溶液中的游离钙离子，并且因此用于测定螯合剂(chelatingagent或chelant)在pH 8下将游离钙离子(Ca2+)浓度从例如2.0mM降低至0.10mM的能力。
测定原理：
将不同量的螯合剂添加至2.0mM Ca2+的溶液中并且通过使用钙离子选择性电极在固定的pH和温度下确定游离Ca2+浓度。将游离钙浓度从2.0mM降低至0.10mM所需要的螯合剂浓度可以从测量的游离钙浓度相对于螯合剂浓度的图确定。在本测定中，将游离钙浓度从2.0mM减降低至0.10mM所需要的螯合剂的浓度在氯化钾和49mM EPPS中、在pH 8、在21℃下测量。
溶液：
电解质溶液：在超纯水(Milli-Q水)中的4M氯化钾。
pH 8缓冲液：50mM EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)，使用最低量的1N氢氧化钠调节至pH 8.0。
钙储备溶液：在pH 8缓冲液中的25mM Ca2+，由CaCl2·2H2O制备。
螯合剂储备溶液：在pH 8缓冲液中的15mM螯合剂(基于100％干螯合剂)，使用最低量的1M NaOH或1M HCl重新调节至pH 8.0。
使用超纯水(Milli Q水)用于制备全部缓冲液和溶液。
设备：
来自赛默科技公司(Thermo Scientific)的钙离子选择性电极(目录号9720BNWP)，针对氯化钙标准溶液进行校准。按照电极后面的指南所述校准电极。
程序：
制备一系列的小瓶，每个含有4mL的钙储备溶液(最终浓度为2.0mM)、1mL电解质溶液(最终浓度为80mM氯化钙)、不同量的螯合剂储备溶液(0–45mL)，并且使用pH 8缓冲液用于调节总体积至50mL。在该测定中的EPPS的最终浓度是49mM。°mM游离钙离子至低于0.10mM的值，或者在测定中的最终螯合剂浓度是高于10.0mM。数据点的合适数量是8个或更多。将初始的2.0mM游离钙离子降低至0.10mM所需的螯合剂浓度是从通过内插法测得的游离钙离子浓度相对于螯合剂浓度的图得到。
将溶液平衡至所需温度，在本测定中该温度为21℃。
实例2
表达本发明的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体的米曲霉(Aspergillus oryzae)
转化体的发酵将含有200ml MDU2(参见WO 1995017513 A1)的摇瓶用所需的转化
体进行接种。使摇瓶在30℃下在200RPM振荡下生长150小时。传递培养液用于测试。
实例3
在脂肪酶活性测试之前絮凝和离心培养液
将等分试样的40mL培养液用0.8mL氯化铝水合物溶液(来自巴斯夫公司(BASF)的
Magnasol 4710G，30％-60％)絮凝，然后在5℃以13,000rpm离心10分钟。将上清液通过0.45
μm无菌过滤器(Minisart NML，来自赛多利斯公司(Sartorius)的亲水物)过滤，并储存在-
20℃直至使用。
实例4
用pNP-酰基酯底物进行脂肪酶活性测定
进行该实验以确定在一种或多种表面活性剂和其他试剂(参见下面的“表面活性剂溶液”表)作为洗涤相关条件的模型的存在下脂肪酶变体的脂肪酶活性。
原理：将酶样品在所需组成和水硬度的洗涤剂溶液中在pH 8.0下用pNP-酰基酯(pNP-棕榈酸酯或-戊酸酯)进行孵育。通过脂肪酶水解底物产生了对硝基苯酚，该对硝基苯酚的形成在405nm下用分光光度法进行。对硝基苯酚的形成速率是校正空白后脂肪酶活性的量度。
脂肪酶参比：示出为SEQ ID NO:1(LIPOLASETM)的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶
化学品：
HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)、
pNP-棕榈酸酯
pNP-戊酸酯
AEO：醇乙氧基化物，来自斯泰潘公司(Stepan)的Bio-soft N25-7(平均Mw 516g/mol)
LAS：烷基苯磺酸钠；来自挪威Unger Fabrikker公司的Thonyl P 85(平均Mw286g/mol)
AEOS：月桂基醚硫酸钠，来自Danlind/Linds公司(丹麦)的SLES 28(平均Mw 385g/mol)
EDTA：乙二胺四乙酸(或2,2’,2”,2”’-(乙烷-1,2-二基二次氮基)四乙酸)，Titriplex III
CaCl2 2H2O
NaOH：氢氧化钠
乙醇：≥99.5％乙醇
试剂：
HEPES缓冲液：用超纯水(Milli-Q水)制备的56mM HEPES，用1M NaOH调节至pH 8.5
pNP-棕榈酸酯储备溶液：在乙醇中的10mM pNP-棕榈酸酯
pNP-棕榈酸酯工作溶液：在表面活性剂溶液中的0.33mM pNP-棕榈酸酯
pNP-戊酸酯储备溶液：在乙醇中的62.7mM
pNP-戊酸酯工作溶液：在表面活性剂中的0.33mM
脂肪酶稀释溶液：0.1mM AEO
LAS储备溶液：50mM LAS
AEOS储备溶液：50mM AEOS
AEO储备溶液：50mM AEO
EDTA储备溶液：100mM
表面活性剂溶液
程序
1)用脂肪酶稀释溶液将酶样品稀释至0.2ppm。
2)由pNP-棕榈酸酯或pNP-戊酸酯储备溶液和表面活性剂溶液制备底物工作溶液
3)将20μL稀释的酶样品(来自(1)中)转移至96孔微量滴定板中
4)添加180μL底物工作溶液(来自(2)中)
5)在添加底物工作溶液之后，立即在室温(25℃)下每隔20秒在405nm处测量吸光度持续长达300秒，在第一次读数之前震荡10秒。在来自分子仪器公司(MolecularDevices)的SpectraMax M2上测量吸光度。
对于空白，用20μL脂肪酶稀释溶液代替稀释的酶。
每个样品在每个平板上以一式三份运行，其中还包括3个空白，与酶样品相同的浓度的参考一式三份，以及由0.1、0.2、0.4和0.6ppm脂肪酶(SEQ ID NO:1–LIPOLASETM)制成的标准曲线。
将活性计算为OD405 nm对时间的曲线的斜率，然后通过减去空白来校正。相对于该参考的活性给出了这些活性。
包含表面活性剂溶液A的组合物中与SEQ ID NO:1相比的相对脂肪酶活性
包含表面活性剂溶液B的组合物中与SEQ ID NO:1相比的相对脂肪酶活性
包含表面活性剂溶液C的组合物中与SEQ ID NO:1相比的相对脂肪酶活性
包含表面活性剂溶液D的组合物中与SEQ ID NO:1相比的相对脂肪酶活性
包含表面活性剂溶液E的组合物中与SEQ ID NO:1相比的相对活性
包含表面活性剂溶液F的组合物中与SEQ ID NO:1相比的相对活性
包含表面活性剂溶液G的组合物中与SEQ ID NO:1相比的相对活性
Claims (23)
1.一种亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中(a)所述变体具有下组取代中的一个：
(b)所述变体具有脂肪酶活性并进一步具有与如SEQ ID NO:1所示的亲本脂肪酶相比增加的相对活性；和
(c)所述亲本脂肪酶衍生自疏绵状嗜热丝孢菌。
2.一种组合物，其包含(i)至少一种表面活性剂和(ii)权利要求1中所述的脂肪酶变体。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述至少一种表面活性剂是第一表面活性剂和第二表面活性剂的混合物。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述至少一种表面活性剂包括阴离子表面活性剂。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述至少一种表面活性剂包括直链烷基苯磺酸盐(LAS)或醇醚硫酸盐(AEOS)。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的组合物，其中所述第一表面活性剂是阴离子表面活性剂并且所述第二表面活性剂是非离子表面活性剂。
7.根据权利要求2-5中任一项所述的组合物，其包含直链烷基苯磺酸盐(LAS)和如权利要求1中所述的脂肪酶变体。
8.根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含助洗剂。
9.根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含螯合剂。
10.根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含EDTA。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中EDTA的浓度在0.001和100mM之间。
12.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种另外的酶。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述另外的酶是淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、另一种脂肪酶、β-葡聚糖酶和/或甘露聚糖酶。
14.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种螯合剂；和/或至少一种聚合物；和/或至少一种水溶助剂；和/或至少一种助洗剂和/或共助洗剂；和/或至少一种香料；和/或至少一种漂白系统。
15.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物或辅助组合物。
16.根据权利要求2-15中任一项所述的组合物在衣物洗涤或工业清洁中的用途。
17.根据权利要求2-15中任一项所述的组合物的用途，其中所述用途是在衣物洗涤过程中，其中洗涤循环是少于360分钟或少于10分钟。
18.一种洗涤方法，该洗涤方法包括用根据权利要求2-15中任一项所述的组合物洗涤织物。
19.权利要求18的方法，其中在50℃或更低的温度下洗涤织物。
20.一种用根据权利要求2-15中任一项所述的组合物预处理织物的方法，该方法包括以下步骤：向所述织物中添加所述组合物，和将该组合物留在织物上一段时间，以及从所述织物上漂洗掉所述组合物。
21.一种洗涤方法，该洗涤方法包括用根据权利要求2-15中任一项所述的组合物洗涤织物。
22.根据权利要求52的方法，其中在50℃或更低的温度下洗涤织物。
23.一种用根据权利要求2-15中任一项所述的组合物预处理织物的方法，该方法包括以下步骤：向所述织物中添加所述组合物，和将该组合物留在织物上一段时间，以及从所述织物上漂洗掉所述组合物。
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