DE10064983A1

DE10064983A1 - Neue Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233)

Info

Publication number: DE10064983A1
Application number: DE2000164983
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Maurer; Roland Breves; Susanne Kaiser; Laura Polanyi; Angela Hellebrandt
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2000-12-23
Filing date: 2000-12-23
Publication date: 2002-07-18

Abstract

Eine neu gefundene alkalische Protease vom Subtilisin-Typ aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) eignet sich aufgrund ihrer natürlichen enzymatischen Eigenschaften besonders als waschaktive Komponente in Wasch- und Reinigungsmitteln, aber auch für zahlreiche andere Einsatzmöglichkeiten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein bislang unbekanntes proteolytisches Enzym, welches aus Bacilius alcalophilus (DSM 11233) erhältlich ist und sich aufgrund seiner natürlichen enzymatischen Eigenschaften besonders als waschaktive Komponente in Wasch- und Reinigungsmitteln, aber auch für zahlreiche andere Einsatzmöglichkeiten eignet.

Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilopeptidasen, Nagarsen, EC 3. 4. 21. 14) werden den Serin-Proteasen zugerechnet. Sie hydrolysieren Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Das pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich, oberhalb von pH 9. Subtilisine werden natürlicherweise von bestimmten Bacillus- Spezies produziert und sekretiert. Sie eignen sich für eine Vielzahl von technischen Verwendungsmöglichkeiten, insbesondere als aktive Inhaltsstoffe von Wasch- oder Reinigungsmitteln.

Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen oder Cellulasen werden seit Jahrzehnten als aktive Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln verwendet. Ihr jeweiliger Beitrag zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung des betreffenden Mittels ist im Fall von Protease die Fähigkeit zum Abbau proteinhaltiger Verunreinigungen, im Fall von Amylase der Abbau von stärkehaltigen Verunreinigungen und im Fall von Lipase die fettspaltende Aktivität. Cellulasen werden über ihre schmutzentfernende, das heißt primäre Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung hinaus, insbesondere wegen ihres Beitrags zur Sekundärwaschleistung eines Waschmittels und wegen ihrer Faserwirkung auf Textilien bevorzugt in Waschmitteln eingesetzt. Die jeweiligen Hydrolyseprodukte werden von den übrigen Wasch- oder Reinigungsmittel-Bestandteilen angegriffen, gelöst, emulgiert oder suspendiert oder aufgrund ihrer höheren Löslichkeit mit der Waschflotte ausgeschwemmt, so daß es zu Synergieeffekten zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen kommt.

Aufgrund ihrer geringen Substratspezifität, ihres günstigen pH-Optimums und ihrer Stabilität gegenüber Tensiden werden als Proteasen für Wasch- und Reinigungsmittel bevorzugt die alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ verwendet. Ihrer industriellen Produktion kommen ihre vergleichsweise leichte Gewinnbarkeit durch Fermentation der natürlichen Produzenten oder transgener Expressionsstämme und, da es sich um sekretierte Proteine handelt, ihre Aufreinigung aus dem Kulturmedium entgegen.

Die wichtigsten derzeit in Waschmitteln verwendeten Subtilisin-Proteasen sind folgende natürliche Moleküle, sowie die von diesen Wildtyp-Enzymen durch Mutagenese abgeleiteten Varianten:

- die Subtilisine 147 und 309 der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (WO 89/06279; Subtilisin 147 ist die Esperase®; Subtilisin 309 ist die Savinase®);
- die Protease 164-A1 der Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, und Vista Chemical Company, Austin, TX, USA (WO 93/07276);
- die Protease PB92 der Fa. Gist-Brocades, Delft, Niederlande, beziehungsweise der Fa. Genencor International Inc., Rochester, New York, USA (EP 328 229; Handelsname Maxacal®);
- die Protease K-16 der Fa. Kao Corp., Tokyo, Japan, (US 5344770);
- Subtilisin BPN' von Bacillus amyloliquefaciens;
- Subtilisin Carlsberg von Bacillus licheniformis und
- die Alkalische Protease aus Bacillus lentus der Henkel Research Corp., Santa Rosa, Kalifornien, USA (US 5352604), beziehungsweise von der Henkel KGaA (WO 92/21760).

Sie können wie folgt charakterisiert werden:
Die Subtilisine 147 und 309 und die von diesen durch weitere Punktmutationen abgeleiteten Enzyme werden in der Anmeldung WO 89/06279 offenbart. Gegenüber den Ausgangsmolekülen zeichnen sich die Punktmutanten durch erhöhte Oxidationsstbilität, erhöhte Aktivität und höhere Waschleistung aus.

Die mit der Anmeldung WO 93/07276 beanspruchte Protease 164-A1 ist über eine Anreicherungskultur für Mikroorganismen aus einem alkalischen Habitat erhalten worden, die zusätzlich in Gegenwart von Tensiden und Bleichmitteln wachsen. Es handelt sich also um eine Protease aus einem natürlichen Organismus, aus Bacillus spec., Stamm 164-A1, mit entsprechend geringerer Empfindlichkeit gegenüber denaturierenden Bedingungen.

Von Subtilisin 309 unterscheidet sich die nach dem produzierenden Bakterienstamm Bacillus nov. spec. 92 benannte Protease PB92 (oder Maxacal®; EP 0328229) in lediglich einer Aminosäure an der Position 87. Mit der genannten Anmeldung werden von der Protease PB92 weiter abgeleitete Punktmutanten offenbart.

Die Protease K-16 (US 5344770) stammt, ähnlich wie die Protease 164-A1, aus einem Screening nach Mikroorganismen, welche unter dem Einwirken oberflächenaktiver Stoffe noch lebensfähig sind. Sie wird gebildet von einer mit Bacillus subtilis verwandten Art, genannt Bacillus sp. ferm. BP-3376.

Subtilisin BPN', welches aus Bacillus amyloliquefaciens stammt, wird in den Arbeiten von Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol. Vol. 159, S. 811-819 und von J. A. Wells et at. (1983) in Nucleic Acids Research, Vol. 11, S. 7911-7925 behandelt.

Die Protease Carlsberg wird in der Publikation von E. L. Smith et al. von 1968 in J. Biol. Chem., Vol. 243, S. 2184-2191 vorgestellt; Varianten davon sind beispielsweise aus der Anmeldung WO 96/28566 bekannt.

Auch die Alkalische Protease der Anmeldungen US 5352604 und WO 92/21760 ist mikrobiellen Ursprungs. Sie stammt ursprünglich aus einem durch eine gezielte Suche gefundenen Bacillus lentus. Sie wird, gemäß der genannten Anmeldung, aber effektiver von einem entsprechend transformierten Bacillus licheniformis produziert.

Grundsätzlich ist man bei industriell verwendbaren Enzymen nicht auf die jeweiligen Originalstämme als Produzenten angewiesen. Die zugehörigen Gene können über gentechnische Methoden auf andere Bakterienstämme übertragen werden. Dafür eigenen sich besonders solche, die sich durch eine hohe Produktions- und/oder Sekretionsrate auszeichnen. Beispiele dafür befinden sind in den Anmeldungen EP 130 756 und US 5352604.

Obgleich sie von verschiedenen Organismen gebildet werden, zeigen die Subtilisin- Proteasen ausgesprochen hohe Homologien zueinander. In Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Aminosäuresequenz, Ladungsverteilung, hydrophoben und ionischen Wechselwirkungen weisen bereits die natürlich vorkommenden Proteasen signifikante Unterschiede auf. Diese bestehen beispielsweise in Aktivitäts- und Spezifitätsunterschieden, etwa hinsichtlich ihrer pH- oder Temperatur-Optima, und Stabilitätsunterschiede, hinsichtlich der Langzeitlagerung und der Verträglichkeit oder der Synergie mit anderen Verbindungen, etwa in Wasch- oder Reinigungslösungen.

Insbesondere auf der Suche nach geeigneten Wasch- und Reinigungsmittelzusammen setzungen ist es daher erforderlich, auf einen Grundstock an verschiedenen ähnlich wirkenden, aber spezifische Eigenheiten aufweisenden Proteinen zurückgreifen zu kön nen. Somit stellt auch jede neue Protease eine Bereicherung des Stands der Technik dar.

Ein parallel zur Suche nach neuen, natürlicherweise gebildeten Enzymen eingeschlagener Weg ist die Modifikation bekannter Enzyme, um sie hinsichtlich spezieller Anwendungsprofile, so etwa als aktive Komponenten in Wasch- oder Reinigungsmitteln zu verbessern. Zu den angestrebten Zielen gehören beispielsweise die Erhöhung ihrer Stabilität gegenüber dem Einfluß der verschiedenen Wasch- und Reinigungsmittel-Bestandteile, wie denaturierende Tenside oder Proteasen, Erhöhung ihrer Oxidations-Stabilität, Anpassung des pH- oder Temperatur-Optimums oder Senkung der allergenen Wirkung. Hierzu werden an sich bekannte Methoden, vor allem rekombinante DNA-Technologien angewendet, wie beispielsweise in den Anmeldungen EP 130 756 und EP 251 446 für die Variationen des Subtilisins aus Bacillus amyloliquefaciens offenbart wird. Beispiele für optimierte natürliche Enzyme sind die bereits oben erwähnten punktmutierten Subtilisin-Moleküle. Darüberhinaus offenbaren beispielsweise die Anmeldungen WO 95/10591, WO 98/20116 und EP 0 405901 Wasch- und Reinigungsmittelzusammensetzungen mit punktmutierten Subtilisin-Proteasen und WO 99/49057 solche mit Deletions- und Substitutionsmutationen.

Zur Optimierung der enzymatischen Eigenschaften sind auch chemische Modifikations reaktionen bekannt, wie beispielsweise in der Anmeldung DE 40 13 142 für alle Arten von Enzymen beschrieben worden ist.

Derartige Modifikationen sind jedoch nur jeweils auf die bekannten Enzyme, beziehungsweise deren Gene anwendbar. Somit stellt das Auffinden neuer Enzyme mit charakteristischen, a priori vorhandenen Eigenschaften eine immer wieder aktuelle Aufgabe dar, insbesondere zur Optimierung von enzymhaltigen Wasch- oder Reinigungsmitteln.

Der vorliegenden Erfindung lag also die Aufgabe zugrunde, eine weitere, noch nicht bekannte Protease aufzufinden, die sich insbesondere für die Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln eignet. Das Wildtyp-Enzym sollte sich dadurch auszeichnen, daß es bei Verwendung in einem entprechenden Mittel den für diesen Zweck etablierten Enzymen in der Waschleistung zumindest nahekommt.

Als Lösung dieser Aufgabe wurde überraschenderweise festgestellt, daß der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der Nummer DSM 11233 hinterlegte Stamm von Bacillus alcalophilus eine Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ sekretiert, die in ihrer primären Waschleistung den bekannten Waschmittelproteasen mindestens gleichwertig, im Einzelfall sogar überlegen ist. Die für dieses Enzym natürlicherweise codierende Nukleotidsequenz wird im Sequenzprotokoll unter der SEQ ID NO. 1 angegeben; deren natürliche Aminosäuresequenz wird im Sequenzprotokoll unter der SEQ ID NO. 2 angegeben. Diese unterscheidet sich von der des Subtilisins 309 (Savinase®), welches aufgrund der Aminosäuresequenz als die nächstähnliche Protease angesehen werden muß, in den drei Aminosäure-Positionen 230, 256 und 259 gemäß der Zählung der Protease Subtilisin BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens, beziehungsweise in den Positionen 224, 250 und 253 nach seiner eigenen Zählung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Subtilisin-Proteasen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie an der Position, die zu der Position 230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, den Aminosäurerest Valin aufweisen und an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Glycin aufweisen und an der Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Asparagin aufweisen.

Diesem Erfindungsgegenstand werden Subtilisin-Proteasen zugeordnet, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sich an der Position, die zu der Position 230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Serin und Valin oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Prolin, Serin, Threonin und Tyrosin oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Isoleucin, Leucin, Lysin, Prolin, Serin und Threonin, oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet.

Diesem Erfindungsgegenstand werden Subtilisin-Proteasen zugeordnet, deren Aminosäuresequenz in mindestens 262, 263 264 265 266 oder 267 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind. Ebenso werden ihm Subtilisin-Proteasen zugeordnet, deren Aminosäuresequenz in mindestens 268 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter zwei, vorzugsweise drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

Diesem Erfindungsgegenstand werden Subtilisin-Proteasen zugeordnet, deren Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, insbesondere in den für die proteolytische Aktivität verantwortlichen Bereichen.

Diesem Erfindungsgegenstand werden proteolytische Enzyme zugeordnet, die in wenigstens einer, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der antigenen Determinanten, die die Positionen 224, 250 oder 253 umfassen, mit dem in SEQ ID NO. 2 bezeichneten Protein übereinstimmen.

Diesem Erfindungsgegenstand werden proteolytisch aktive Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten oder proteolytisch aktive Fragmente eines der zuvor bezeichneten Proteine zugeordnet, insbesondere solche Fragmente oder solche Varianten, bei denen eine, vorzugsweise zwei, und ganz besonders bevorzugt drei der die Positionen 224, 250 und 253 in der SEQ ID NO. 2 umfassenden Sequenzbereiche in einer Größe von 20, vorzugsweise 10, ganz besonders bevorzugt 5 Aminosäuren enthalten sind.

Diesem Erfindungsgegenstand werden auch die zuvor bezeichneten proteolytischen Enzyme oder Fragmente zugeordnet, wenn sie zusätzlich derivatisiert sind.

Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands stellen proteolytische Enzyme, Fragmente oder Derivate dar, die natürlicherweise von biologischen Organismen, vorzugsweise von Mikroorganismen gebildet werden, besonders bevorzugt von gram-positiven Bakterien, ganz besonders bevorzugt von solchen der Gattung Bacillus und hierunter insbesondere von solchen der Spezies Bacillus alcalophilus (DSM 11233).

Ein zweiter Erfindungsgegenstand sind Nukleinsäuren, die für eines der Proteine des ersten Erfindungsgegenstand codieren. Diesem Erfindungsgegenstand werden für Subtilisin-Proteasen codierende Nukleinsäuren zugeordnet, deren Nukleotidsequenz mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz übereinstimmt, insbesondere in den für die proteolytische Aktivität des abgeleiteten Enzyms verantwortlichen Bereichen.

Ein dritter Erfindungsgegenstand sind Vektoren, die einen im zweiten Erfindungsgegenstand bezeichneten Nukleinsäurebereich enthalten und insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthalten, der für eines der zum ersten Erfindungsgegenstand gehörenden Proteine oder Derivate codiert. Diesem Erfindungsgegenstand werden als bevorzugte Ausführungsformen Klonierungs- und Expressionsvektoren zugeordnet, die einen zum zweiten Erfindungsgegenstand gehörenden Nukleinsäurebereich enthalten und insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthalten, der für eines der zum ersten Erfindungsgegenstand gehörenden Proteine oder Derivate codiert.

Ein vierter Erfindungsgegenstand sind Zellen, die einen Vektor nach dem dritten Erfindungsgegenstand enthalten, insbesondere Wirtszellen, die Proteine oder Derivate des ersten Erfindungsgegenstands exprimieren oder zu deren Expression angeregt werden können, insbesondere unter Einsatz eines Expressionsvektors dieses Erfindungsgegenstands. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands stellen als Wirtszellen Bakterien dar, insbesondere solche, die das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretieren. Weiter bevorzugte Ausführungsformen stellen Bakterien der Gattung Bacillus, insbesondere der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus dar. Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen eukaryontische Zellen dar, insbesondere solche, die das gebildete Protein posttranslational modifizieren.

Ein fünfter Erfindungsgegenstand sind Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Enzyms oder Derivats nach dem ersten Erfindungsgegenstand unter Verwendung einer Zelle, die dieses natürlicherweise bildet, insbesondere eine im ersten Erfindungs gegenstand benannte Zelle, oder unter Verwendung einer Wirtszelle gemäß dem vierten Erfindungsgegenstand und/oder unter Verwendung eines Vektors gemäß dem dritten Erfindungsgegenstand und/oder unter Verwendung einer Nukleinsäure gemäß dem zweiten Erfindungsgegenstand.

Ein sechster Erfindungsgegenstand sind Wasch- oder Reinigungsmittel, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein proteolytisches Enzym nach dem ersten Erfindungsgegenstand enthalten. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind solche Mittel, die zusätzlich weitere Enzyme, insbesondere andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen und/oder Lipasen enthalten.

Ein siebter Erfindungsgegenstand sind Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie allein oder neben anderen aktiven Inhaltsstoffen ein proteolytisches Enzym nach dem ersten Erfindungsgegenstand enthalten, insbesondere für natürliche Fasern und ganz besonders für Wolle oder Seide.

Ein achter Erfindungsgegenstand sind Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein proteolytisches Enzym nach dem ersten Erfindungsgegenstand aktiv wird, vorzugsweise in einer Menge von 0,35 mg bis 2 000 mg, besonders bevorzugt von 3 mg bis 1 500 mg pro Anwendung.

Ein neunter Erfindungsgegenstand sind Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein proteolytisches Enzym nach dem ersten Erfindungsgegenstand aktiv wird, insbesondere für Wolle oder Seide.

Ein zehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.

Ein elfter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln.

Ein zwölfter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur biochemischen oder molekularbiologischen Analyse, insbesondere im Rahmen eines enzymatischen Analyseverfahrens, besonders zur Endgruppenbestimmung und darunter ganz besonders im Rahmen einer Sequenzanalyse.

Ein dreizehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen.

Ein vierzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen.

Ein fünfzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung und ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder.

Ein sechzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben, besonders bevorzugt zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege und ganz besonders bevorzugt zur Oberflächenbehandlung von Wolle oder Seide.

Ein siebzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten.

Ein achtzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.

Ein neunzehnter Erfindungsgegenstand sind Kosmetika mit einem proteolytischen Enzym nach dem ersten Erfindungsgegenstand oder kosmetische Verfahren unter Einbeziehung eines solchen proteolytischen Enzyms oder die Verwendung eines solchen proteolytischen Enzyms zu kosmetischen Zwecken, insbesondere im Rahmen entsprechender Verfahren oder in entsprechenden Mitteln.

Unter einem Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist dreidimensionale Struktur annehmendes Polymer zu verstehen. In Tabelle 1 sind die 19 proteinogenen, natürlich vorkommenden L-Aminosäuren zusammengestellt, zusammen mit den 1- und 3-Buchstaben-Codes, mit denen sie auch in der vorliegenden Anmeldung abgekürzt werden.

Tabelle 1

Die proteinogenen Aminosäuren

Die Kombination einer dieser Bezeichnungen mit einer Nummer bezeichnet für das jeweilige Protein, welchen Aminosäure-Rest es in der jeweiligen Position trägt. So steht V224, beispielsweise für einen Valin-Rest in der Position 224, beginnend mit der Zählung am N-Terminus des betreffenden Proteins. Eine Punktmutation an dieser Stelle, beispielsweise gegen die Aminosäure Alanin würde gemäß dieser Nomenklatur mit der Bezeichnung V224A abgekürzt.

Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biochemische Funktion ausübt. Unter proteolytischen Enzymen oder Enzymen mit proteolytischer Funktion sind solche zu verstehen, die die Säureamidbindungen von Proteinen hydrolysieren, insbesondere solche, die im Inneren der Proteine liegen, und deshalb auch als endo-Peptidasen bezeichnet werden können.

Subtilisin-Proteasen sind solche endo-Peptidasen, die natürlicherweise von gram positiven Bakterien gebildet und zumeist sekretiert werden, oder von diesen, beispielsweise über molekularbiologische Methoden abgeleitet sind und sich über Teilbereiche, wie strukturbildende oder funktionstragende Regionen mit den natürlichen Subtilisin-Proteasen homologisieren lassen. Sie werden beispielsweise in dem Artikel "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enyzmes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996, dargestellt.

Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so daß dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N- terminalen Aminosäuren ausübt.

Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.

Die einem Protein entsprechende Informationseinheit wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet.

Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions- oder Insertionsmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen zu deletions insertions- oder substitutionsmutierten Genen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zelllinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom übrigen Genom unabhängig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfülllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.

Homologe oder ähnliche Bereiche von verschiedenen Proteinen sind solche mit vergleichbaren Funktionen, die sich durch Identität oder konservierte Austausche in der primären Aminosäuresequenz erkennen lassen. Sie umfassen einzelne Aminosäuren, kleinste Bereiche, sogenannte Boxen, die wenige Aminosäuren lang sind und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben, bis hin zu langen Bereichen in der primären Aminosäuresequenz. Unter den Funktionen der homologen Bereiche, insbeson dere der genannten Boxen sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasser stoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.

Das Maß für die Homologie ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Prozentsatz an Identität, wie er beispielsweise nach der von D. J. Lipman und W. R. Pearson in Science 227 (1985), S. 1435-1441 angegebenen Methode bestimmt werden kann. Die Homologie kann auf das gesamte Protein bezogen sein oder auf den jeweils zuzuordnenden Bereich mit entsprechender Funktion. Ein weiter gefaßter Homologie-Begriff bezieht auch konservierte Variationen, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität in die Betrachtung mit ein: so sind unter konservierten Austauschen solche zu verstehen, bei denen beispielsweise eine aliphatische Aminosäure (Gly, Ala, Val, Leu, Ile) gegen eine andere aliphatische Aminosäure ausgetauscht worden ist oder eine aromatische (Phe, Tyr, Trp) gegen eine andere aromatische oder, allgemein formuliert, eine Aminosäure gegen eine Aminosäure ausgetauscht ist, die, gegebenenfalls unter Berücksichtigung der jeweiligen chemischen Umgebung innerhalb des Proteins, eine ähnliche chemische Aktivität auszuüben vermag.

Homologie- oder Ähnlichkeitsangaben können sich sowohl auf die Aminosäuresequenz als auch auf die Nukleotidsequenz beziehen. Für letztere entfällt allerdings der weiter gefaßte Begriff an "konservierten" Austauschen und man spricht nur von dem Prozentsatz an Identität. Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so daß eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann. Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden.

Durch Vergleich mit bekannten Enzymen läßt sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid- Sequenz die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen.

Unter dem Begriff eines proteolytischen Enzyms oder dem einer Protease ist deshalb über die Funktionen der wenigen Aminosäurereste des katalytisch aktiven Zentrums hinaus alle Funktionen zu verstehen, wie sie sich durch das Einwirken des gesamten übrigen Proteins oder eines Teils oder mehrerer Teile des übrigen Proteins auf die eigentlich katalytisch aktiven Bereiche ergeben. Auch allein solche modifizierenden Funktionen oder Teilaktivitäten werden, sofern sie eine Proteolyse-Reaktion unterstützen, im Sinne der Erfindung als proteolytische Aktivität angesehen. Zu solchen Hilfsfunktionen oder Teilaktivitäten gehören beispielsweise die Bindung eines Substrats, eines Zwischen- oder Endprodukts, die Aktivierung oder die Inhibierung oder Vermittlung eines regulierenden Einflusses auf die hydrolytische Aktivität. Dabei kann es sich beispielsweise auch um die Ausbildung eines Strukturelements handeln, das fern vom aktiven Zentrum liegt. Die zweite Voraussetzung dafür, daß es sich um ein erfindungsgemäßes Protein handelt, ist allerdings, daß sich durch das chemische Verhalten der eigentlich aktiven Reste allein oder zusätzlich durch das Einwirken der modifizierenden Teile eine Hydrolyse von Peptid-Bindungen ergibt. Es ist darüberhinaus möglich, daß auch die Aktivitäten anderer Proteasen durch einen oder mehrere Teile, beispielsweise des erfindungsgemäßen Proteins qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Diese Beeinflussung anderer Faktoren wird als proteolytische Aktivität angesehen. Proteolytisch aktive Enzyme sind auch solche, deren Aktivität zu einem gegebenen Zeitpunkt, etwa duch einen Inhibitor blockiert ist. Entscheidend ist ihre prinzipielle Eignung zur entsprechenden Proteolyse-Reaktion.

Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine oder solche, die vollständig translatierten Genen entsprechen, und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines Substrats.

Den Fragmenten prinzipiell gleichartig, sind Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen; sie zeichnen sich diesen gegenüber jedoch dadurch aus, daß ihnen eher kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen fehlen.

Unter chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die natürlicherweise von verschiedenen Polypeptidketten aus demselben Organismus oder aus verschiedenen Organismen stammen. Dieses Vorgehen wird auch Shuffling- Mutagenese genannt. Der Sinn einer solchen Fusion kann beispielsweise darin bestehen, mithilfe des heranfusionierten erfindungsgemäßen Proteinteils eine enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf welche sich unterschiedliche Funktionen verteilen können. Zur Realisierung der letztgenannten Alternative ist es beispielsweise möglich, posttranslational oder erst nach einem Aufreinigungsschritt durch eine gezielte proteolytische Spaltung eine einzelne chimäre Polypeptidkette in mehrere zu zerlegen.

Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteinen sind solche Varianten zu verstehen, die über an sich bekannte Methoden durch Einfügen eines Nukleinsäure-, beziehungsweise Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in chimären Proteinen.

Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.

Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den Wirtsorganismus erfolgen. Hierfür können technisch molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Sie können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifikationen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefaßt.

Durch Isolierung aus dem Kulturüberstand (Beispiele 1 und 2) von Bacillus alcalophilus spec. DSM 11233 konnte ein erfindungsgemäßes Enzym einer besonders bevorzugten Ausführungsform gewonnen werden. Dieser Stamm ist gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen vom 28. April 1977 am 17.10.1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig (DSMZ) hinterlegt worden. Er trägt dort die Bezeichnung PEC30 - ID 96-877 und die Eingangsnummer DSM 11233. Die maßgeblichen Angaben über die Merkmale dieses biologischen Materials, wie sie von der DSMZ am 17.3.1997 bei der Hinterlegung bestimmt worden sind, werden in folgender Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Mikrobiologische Eigenschaften des Bacillus alcalophilus (DSM 11233). (Bestimmt von der DSMZ am 17.3.1997.)

Wie über diese Charakterisierung hinaus nun überraschenderweise festgestellt werden konnte, sekretiert dieser Stamm eine proteolytische Aktivität, die in den Ausführungs beispielen der vorliegenden Anmeldung untersucht worden ist und sich folgendermaßen biochemisch umreißen läßt: Es handelt sich um ein 27 kD-Protein, mit einem isoelektrischen Punkt oberhalb von 10 (Beispiel 4). Die maximale proteolytische Aktivität liegt bei 15minütiger Inkubation bei pH 11,5 und 50°C; als kinetische Parameter wurden mit dem Substrat AAPF-pNA für K_M der Wert 0,67 mM, für V_max ein Wert von 9,2 µmol/(ml.min) und für K_cat ein Wert von 138 s^-1 ermittelt; das Temperaturoptimum liegt bei 50°C und das pH-Optimum bei 11,5 (Beispiel 5).

Das Gen für dieses Protein ist nach Standard-Methoden, nämlich über PCR mit Consunsus-Primern und Klonierung der PCR-Produkte isoliert und anschließend sequenziert worden (Beispiel 1). Auf diesen Ergebnissen beruhen die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 angegeben Nukleotid-, beziehungsweise Aminosäuresequenzen.

Auf Aminosäure-Ebene muß Subtilisin 309 (Savinase®) als die nächstähnliche Protease angesehen werden. Von dessen Aminosäuresequenz unterscheidet sich das von Bacillus alcalophilus (DSM 11233) gebildete erfindungsgemäße Protein in den drei Aminosäure- Positionen 230, 256 und 259 in der Zählung der Protease Subtilisin BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens. Dies sind in der Zählung nach SEQ ID NO. 1 die Positionen 224, 250 und 253 der Subtilisin-Protease aus B. alcalophilus (DSM 11233).

Diese drei Positionen können zur Beschreibung aller erfindungsgemäßen Proteasen herangezogen werden. Sie stellen gewissermaßen einen Fingerabdruck oder jeweilige Fingerprint-Bereiche für alle erfindungsgemäßen Enzyme dar.

In der Position 224 der erfindungsgemäßen Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) befindet sich Valin; in der Position 250 befindet sich Glycin; und in der Position 253 befindet sich Asparagin. Subtilisin 309, beispielsweise, besitzt in diesen drei Positionen, wie aus den Alignments der Fig. 1 und 2 abgelesen werden kann, die Aminosäuren Alanin (in Position 224), Serin (in Position 250), beziehungsweise erneut Serin (in Position 253). BPN', beispielsweise, weist neben Abweichungen in anderen Bereichen, in diesen drei Positionen die Aminosäuren Alanin, Lysin, beziehungsweise Asparaginsäure auf. Anstelle des kleinen Methylrestes der Aminosäure Alanin, wie er in den beiden anderen genannten Proteasen an Position 224 liegt, liegt in dem Enzym von B. alcalophilus (DSM 11233) der raumfüllendere Isopropylrest; der eine Hydroxyl-Gruppe tragende, beziehungsweise stark basische Rest an der Position 250 der beiden anderen Proteasen wird in dem Enzym aus B. alcalophilus (DSM 11233) lediglich durch ein Proton eingenommen; und der eher neutrale, beziehungsweise saure Rest in Position 253 wird in dem Enzym aus B. alcalophilus (DSM 11233) durch einen eher alkalischen Rest eingenommen.

Man kann daraus folgern, daß zumindest in diesen Bereichen erfindungsgemäße Proteasen von den beiden genannten strukturelle Unterschiede und/oder Unterschide hinsichtlich der Oberflächenladung des Moleküls aufweisen. Solche Unterschiede können - ohne einen biochemischen Mechanismus postulieren zu wollen - beispielsweise die Wechselwirkung mit makromolekularen Substraten oder niedermolekularen Agentien erheblich beeinflussen oder Unterschiede hinsichtlich der Ladungsverteilung oder Stabilität der Gesamtmoleküle zur Folge haben. Beide Effekte könnten den jeweils beabsichtigten Verwendungszwecken erfindunsgemäßer Enzyme zugutekommen.

Eine Ausführungsform des ersten Erfindungsgegenstands stellt somit jede Subtilisin- Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie an der Position, die zu der Position 230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, den Aminosäurerest Valin aufweist und an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Glycin aufweist und an der Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Asparagin aufweist.

Da der Einfluß dieser drei Positionen auf die Gesamtaktivität von Subtilisin-Proteasen noch nicht systematisch untersucht ist, umfaßt der Erfindungsgedanke auch alle Varianten von Subtilisin-Proteasen, die in diesen drei Positionen andere Aminosäuren aufweisen, als die, die bisher beschrieben worden sind. Eine entsprechende Zusammenstellung befindet sich beispielsweise in dem Artikel "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enyzmes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996.

Diese Abgrenzung läßt sich somit folgendermaßen vornehmen: Eine weitere Ausführungsform des ersten Erfindungsgegenstands stellt somit jede Subtilisin-Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sich an der Position, die zu der Position 230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Serin und Valin oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Prolin, Serin, Threonin und Tyrosin oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Isoleucin, Leucin, Lysin, Prolin, Serin und Threonin, oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet.

Dabei sind Folgen von 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 und 2 Aminosäuren Länge zunehmend bevorzugt. Da sich die Substitution der genannten Aminosäuren durch Folgen von mehr als 20 Aminosäuren wahrscheinlich in so erheblicher Weise auf Sekundär- und Tertiärstrukturen der betreffenden Proteine auswirken, daß die proteolytische Funktion insgesamt beeinträchtigt sein dürfte, können größere Insertionen nicht mehr in diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgenommen werden.

Zu der gefundenen Protease aus B. alcalophilus (DSM 11233), deren Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. 2 angegeben ist, kann nach Subtilisin 309 (Savinase®) die Protease aus Bacillus lentus (BLAP) als die nächstähnliche Protease angesehen werden. Von dieser unterscheidet sich die Sequenz des Enzyms aus B. alcalophilus (DSM 11233) in den acht Positionen 99, 101, 103, 104, 163, 230, 256 und 259 in der Zählung der Protease Subtilisin BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens, beziehungsweise in den Positionen 97, 99, 101, 102, 157, 224, 250 und 253 in der Zählung nach SEQ ID NO. 2. Dies kann beispielsweise auch anhand der Fig. 1 und 2 nachvollzogen werden.

Somit fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung alle Subtilisin-Proteasen, deren Aminosäuresequenz in mindestens 262 und jeweils zunehmend bevorzugt in mindestens 263, 264, 265, 266 und 267 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmen, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind. Denn jede dieser drei Positionen ist für die erfindungsgemäße Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) charakteristisch. So weisen, wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt, die Proteasen BLAP, Savinase® und BPN' an der Position 224 den Aminosäure-Rest Alanin, an der Position 250 die Reste Serin, beziehungsweise Lysin und an der Position 253 die Reste Serin, beziehungsweise Asparaginsäure auf.

Darüber hinaus bevorzugt sind solche Subtilisin-Proteasen, deren Aminosäuresequenz in mindestens 268 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter zwei, vorzugsweise drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

Ganz besonders bevorzugt sind darüberhinaus Subtilisin-Proteasen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß ihre Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt. Dies gilt insbesondere für die Bereiche des Enzyms, die für die proteolytische Aktivität verantwortlich sind.

Unterschiede in der Sekundär- oder Tertiärstruktur von Proteinen können experimentell über Wechselwirkungen mit Antikörpern detektiert werden, denn deren Epitope sind auf spezifische Wechselwirkungen mit passenden dreidimensionalen Strukturen hin ausgebildet. Damit können Variationen in Proteinstrukturen erkannt werden, die bis auf die Einflüsse einzelner Aminosäuren zurückzuführen sind. Die auf diesem Prinzip beruhenden experimentellen Methoden sind im Stand der Technik etabliert und eignen sich besonders, um erfindungsgemäße Proteine von nicht-erfindungsgemäßen zu unterscheiden, und zwar insbesondere unter Bedingungen, in denen diese aktive Konformationen, das heißt aktive dreidimensionale Strukturen annehmen. Die erfindungsgemäßen Proteine einer Ausführungsform zeichnen sich über ihre proteolytische Funktion hinaus dadurch aus, daß sie in wenigstens einer, vorzugsweise zwei und besonders bevorzugt drei der antigenen Determinanten, die die Positionen 224, 250 oder 253 umfassen, mit dem in SEQ ID NO. 2 bezeichneten Protein übereinstimmen.

Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Methoden bekannt, um Gene zu mutieren und auf diese Weise entsprechende Proteinvarianten zu erzeugen. Diese Techniken sind auch auf erfindungsgemäße Proteine anwendbar, um sie hinsichtlich spezifischer Anwendungen weiterzuentwicklen. Von besonderer Bedeutung sind dabei einzelne Aminosäure-Austauche, sogenannte Punktmutationen. Entsprechende Varianten werden innerhalb der oben bezeichneten Bereiche in den vorliegenden Erfindungsgegenstand eingeschlossen.

Aber auch größere Bereiche erfindungsgemäßer Proteine können Mutationen unterworfen werden. Dies kann dann vorteilhaft sein, wenn bestimmte Teilaktivitäten ausgeschlossen, verstärkt oder mit anderen Funktionen verknüpft werden sollen. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen somit proteolytisch aktive Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten oder proteolytisch aktive Fragmente der zuvor bezeichneten Proteine dar. Dies gilt insbesondere für solche Varianten, bei denen ein, vorzugsweise zwei, und besonders bevorzugt drei der die Positionen 224, 250 und 253 nach SEQ ID NO. 2 umfassenden Bereiche enthalten sind. Denn diese verleihen den jeweiligen Varianten ihre erfindungsspezifischen Eigenschaften. Diese Sequenzbereiche besitzen zunehmend bevorzugt jeweils Größen von 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 Aminosäuren.

Die zuvor bezeichneten Proteine können beispielsweise durch Kopplung nieder- oder höher-molekularer chemischer Verbindungen oder durch chemische Modifikationen, wie sie beispielsweise in der Anmeldung DE 40 13 142 beschrieben sind, für ihren jeweiligen Anwendungszweck optimiert werden. Es können auch Modifikationen vorgenommen werden, die natürlicherweise von verschiedenen Organismen im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durchgeführt werden, wie beispielsweise die Bindung eines Fettsäurerestes nahe des N-Terminus. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen somit proteolytische Enzyme oder Fragmente dar, die zusätzlich derivatisiert sind.

Im Zusammenhang mit dem Einsatz erfindungsgemäßer Proteine in Wasch- oder Reinigungsmitteln ist beispielsweise die Kopplung mit anderen waschaktiven Substanzen oder Enzymen besonders sinnvoll. Vergleichbare Kopplungs-Ansätze werden beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 00/18865 und WO 00/57155 für Cellulose- Bindungsdomänen beschrieben.

Proteine, die zumindest eins der zuvor genannten Charakteristika aufweisen und aus natürlichen Quellen stammen, sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn sie aus Mikroorganismen stammen, besonders bevorzugt aus gram-positiven Bakterien, ganz besonders bevorzugt aus gram-positiven Bakterien der Gattung Bacillus; unter den Bacillus-Species ist Bacillus alcalophilus bevorzugt, und darunter besonders der Stamm B. alcalophilus (DSM 11233). Denn aus diesem wurde die Ausführungsform des erfindungsgemäßen Enzyms, deren zugehörige Sequenzen im Sequenzprotokoll angegeben sind, ursprünglich erhalten.

Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation eines Proteins kann ein solches mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. So zeigen bereits Kulturüberstände von B. alcalophilus (DSM 11233) eine proteolytische Aktivität, was zeigt, daß auch Rohextrakte proteolytische Verwendung finden können, etwa zum Inaktivieren anderer proteinogener Aktivitäten.

Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen des eigentlichen erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, daß es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine proteolytische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise vom Faltungszustand des Proteins abhängig sein oder aus der reversiblen Bindung eines oder mehrer Begleitstoffe aus der Präparation an ein erfindungsgemäßes Protein.

Nukleinsäuren bilden den Ausgangspunkt nahezu aller gängigen molekularbiologischen Untersuchungen und Weiterentwicklungen von Proteinen. Dazu gehören insbesondere die Sequenzierung der Gene und die Ableitung der zugehörigen Aminosäure-Sequenz, jede Art von Mutagenese und die Expression der Proteine. Solche Methoden sind beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, beschrieben.

Den zweiten Erfindungsgegenstand bilden somit Nukleinsäuren, die für die Proteine des ersten Erfindungsgegenstands codieren. Diese zugehörigen Gene stellen gewissermaßen die molekularbiologische Dimension der vorliegenden Erfindung dar.

Auf der Ebene der DNA können erfindungswesentlichen Enzyme über alle allgemein unter dem Begriff "Protein Engineering" zusammengefaßten Methoden auf verschiedene Anwendungen hin optimiert werden. Insbesondere können dadurch erreicht werden: eine Verbesserung der Oxidationsbeständigkeit des abgeleiteten Proteins, der Stabilität gegenüber denaturierenden Agentien oder Proteasen, gegenüber hohen Temperaturen, sauren oder stark alkalischen Bedingungen, eine Veränderung der Sensitivität gegenüber Calcium oder anderen Cofaktoren, eine Senkung der Immunogenität oder der allergenen Wirkung.

Zu erfindungsgemäßen mutierten Genen gehören beispielsweise solche, die für einzelne, gezielte Basenaustausche oder randomisierte Punktmutationen, für Deletionen einzelner Basen oder von Teilsequenzen, Fusionen mit anderen Genen oder Genfragmenten oder Inversionen verantwortlich sind. Derartige Mutationen oder Modifikationen können das von den betreffenden Nukleinsäuren abgeleitete Enzym für spezifische Anwendungen prädestinieren. Solch eine Mutagenese kann zielgerichtet oder über zufallsgemäße Methoden, beispielsweise mit einem anschließenden auf die Aktivität gerichteten Erkennungs- und/oder Auswahlverfahren (Screening und Selektion) an den klonierten Genen durchgeführt werden. Die mutierten Gene unterliegen dem Schutzbereich der hier beschriebenen Erfindung, wenn die von ihnen abgeleiteten Proteine innerhalb der oben bezeichneten Ähnlichkeitsbereiche liegen. Dies gilt insbesondere für die Teilbereiche, die einer der Aminosäure-Positionen 224, 250 oder 253 gemäß SEQ ID NO. 2 entsprechen.

Insbesondere bei den Nukleinsäuren, die für Proteinfragmente codieren, sind alle drei Leseraster sowohl in sense- als auch in antisense-Orientierung zu berücksichtigen. Denn solche Oligonukleotide können über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Ausgangspunkte zur Synthese verwandter Nukleinsäuren, z. B. aus anderen als den hier offenbarten Organismen verwendet werden. Solche Oligonukleotide werden, insbesondere, wenn sie einen der Bereiche überdecken, die den drei Aminosäure- Positionen 224, 250 oder 253 entsprechen, ausdrücklich in den Schutzbereich der vorliegenden Erfidung einbezogen. Das gilt auch für solche, die gerade in diesen Positionen variable Sequenzen aufweisen, so daß innerhalb einer Population vieler Primer auch mindestens einer vorliegen kann, der für solch eine Position für eine der SEQ ID NO. 1 entsprechende Teilsequenz codiert. Das gleiche gilt für Antisense- Oligonukleotide, die beispielsweise zur Expressions-Regulation eingesetzt werden können.

Besonders bevorzugt sind für Subtilisin-Proteasen codierende Nukleinsäuren, deren Nukleotidsequenz mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz übereinstimmt. Dies gilt insbesondere für die für die proteolytische Aktivität des abgeleiteten Enzyms verantwortlichen Bereiche.

Um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, werden sie geeigneterweise in Vektoren ligiert. Dazu gehören beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins. Einen Erfindungsgegenstand der vorliegenden Erfindung stellen somit Vektoren dar, die die oben bezeichneten Nukleinsäuremoleküle enthalten, insbesondere solche, die für die oben bezeichneten proteolytischen Enzyme codieren.

Bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands sind Klonierungsvektoren. Diese eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für die molekularbiologische Charakterisierung des betreffenden Gens. Gleichzeitig stellen sie transportierbare und lagerfähige Formen der beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die PCR oder In-vitro-Mutagenese-Verfahren. Bevorzugt sind solche Klonierungsvektoren, die Nukleinsäurebereiche enthalten, die für die oben bezeichneten proteolytischen Enzyme codieren.

Erfindungsgemäße Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die Nukleinsäuren des zweiten Erfindungsgegenstands in biologischen Produktionssystemen zu realisieren und damit die Proteine des ersten Erfindungsgegenstands zu produzieren. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die sämtliche zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus einem anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form einer sogenannten Expressionskassete angeordnet sein. Bevorzugt sind solche Expressionsvektoren, die Nukleinsäurebereiche enthalten, die für die oben bezeichneten proteolytischen Enzyme codieren.

Eine weitere Umsetzungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung stellen Zellen dar, die einen Vektor nach dem dritten Erfindungsgegenstand enthalten. Sie bilden somit die mikrobiologische Dimension der vorliegenden Erfindung, indem sie beispielsweise die Amplifikation der entsprechenden Gene, aber auch deren Mutagenese oder Transkription und Translation und letztlich die biotechnologische Produktion ermöglichen.

Eine Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands sind Wirtszellen, die eines der erfindungsgemäßen Proteine exprimieren oder zu deren Expression angeregt werden können. Sie ermöglichen damit deren biotechnologische Produktion. Sie müssen dafür das betreffende Gen, geeigneterweise über einen Vektor, erhalten haben, das heißt transformiert worden sein. Dieser Vektor kann in der Wirtszelle extrachromosomal als eigenes genetisches Element vorliegen oder in ein Chromosom integriert sein. Vorzugs weise handelt es sich dabei um einen der oben bezeichneten Expressionsvektoren.

Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden.

Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund entsprechender genetischer Elemente in ihrer Aktivität regulierbar sind, beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelldichte. Diese kontrollierbare Expression ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine.

Eine bevorzugte Ausführungsform stellen bakterielle Wirtszellen dar, insbesondere solche, die das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretieren. Denn Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Gram-positive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli, geben demgegenüber sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium ab, aus welchem sich nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt Bacillus alcalophilus (DSM 11233) selbst, um erfindungsgemäße Proteine (homolog) zu exprimieren.

Demgegenüber ist jedoch die heterologe Expression bevorzugt. Zu den für die heterologe Expression bevorzugten Bakterien gehören solche der Gattung Bacillus, insbesondere solche der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder andere Species oder Stämme von Bacillus alcalophilus.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellen eukaryontische Wirtszellen dar, insbesondere solche, die das gebildete Protein posttranslational modifizieren. Beispiele für geeignete Eukaryonten sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Zu den Modifikationen, die derartige Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccaride.

Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms oder Derivats dar. So können beispielsweise die oben bezeichneten DNA- und Aminosäuresequenzen, wie sie beispielsweise aus dem Sequenzprotokoll abgeleitet werden können, entsprechende Oligopeptide oder Oligonukleotide synthetisiert werden.

Ebenso können aufgrund der in der vorliegenden Anmeldung in Tabelle 2 angegebenen Stammeigenschaften von B. alcalophilus (DSM 11233) Methoden entwickelt werden, um natürliche Produzenten solcher Enzyme zu detektieren und die entsprechenden Proteine aus natürlichen, bislang noch nicht in dieser Hinsicht untersuchten Quellen zu isolieren. Zunehmend bevorzugt handelt es sich bei bei diesen natürlichen Organismen um die oben bereits bezeichneten Bakterienspecies. Solche Zellen können für entsprechende Herstellungsverfahren kultiviert und eingesetzt werden.

Demgegenüber ist die Herstellung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms oder Derivats mithilfe der oben bezeichneten transgenen Wirtszellen und/oder unter Verwendung eines der oben bezeichneten Vektoren und/oder unter Verwendung einer der oben bezeichneten Nukleinsäuren bevorzugt.

Denn diese Vektoren stellen bereits die zugehörige DNA in molekularbiologisch verwendbarer Form zur Verfügung, und die benannten transgenen Organismen können durch Etablieren geeigneter Bedingungen unmittelbar zur Produktion dieser Proteine veranlaßt werden.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird.

Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren muß für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden. Prinzipiell wird dabei folgendermaßen vorgegangen: Erfindungsgemäße Nukleinsäuren werden geeigneterweise in Form der DNA in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert. Dieser wird in die Wirtszelle transformiert, beispielsweise in Zellen eines leicht zu kultivierenden Bakterienstammes, der die Proteine, deren Gene unter der Kontrolle entsprechender genetischer Elemente stehen, in das umgebende Nährmedium ausschleust; regulierende Elemente dafür können beispielsweise vom Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden. Aus dem umgebenden Medium kann das erfindungsgemäße Protein über mehrere Aufreinigungsschritte, wie beispielsweise Fällungen oder Chromatographien, aufgreinigt werden. Ein Fachmann ist in der Lage, ein System, welches im Labormaßstab experimentell optimiert worden ist, auf einen großtechnischen Produktionsmaßstab zu übertragen.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Waschmittel oder Reinigungsmittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie zusätzlich ein erfindungsgemäßes Protein enthalten.

Damit sind alle denkbaren Reinigungsmittelarten gemeint, sowohl Konzentrate, als auch unverdünnt anzuwendende Mittel; zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet.

Jegliche Reinigungsmittelart stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, sofern sie um ein erfindungsgemäßes Protein bereichert ist.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach den Stand der Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Mittel. Dazu zählen beispielsweise feste, pulverförmige, flüssige, gelförmige oder pastöse Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt.

Neben einem erfindungswesentlichen Enzym enthält ein erfindungsgemäßes Mittel gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie Tenside, z. B. nichtionische, anionische und/oder amphotere Tenside, und/oder Bleichmittel, und/oder Builder, sowie gegebenenfalls weitere übliche Inhaltsstoffe.

Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann, beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C- Atomen, z. B. aus Kokos-, Palm-, Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C_12-14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C_9-11-Alkohol mit 7 EO, C_13-15-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C_12-18-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C_12-14-Alkohol mit 3 EO und C_12-18-Alkohol mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow range ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Talgfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO.

Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.

Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhafterweise eingesetzt werden kann, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkypolyglycoside genügen der allgemeinen Formel RO(G)_z, in der R einen linearen oder verzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Glycosylierungsgrad z liegt dabei zwischen 1,0 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1,0 und 2,0 und insbesondere zwischen 1,1 und 1,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare Alkylpolyglucoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.

Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N- dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanol amide können geeignet sein. Der Anteil dieser nichtionischen Tenside liegt vorzugsweise nicht über dem der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere bei nicht mehr als der Hälfte davon.

Weitere geeignete Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (II),

in der RCO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R¹ für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht. Bei den Polyhydroxyfettsäureamiden handelt es sich um bekannte Stoffe, die üblicherweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers mit Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Alkanolamin und nachfolgende Acylierung mit einer Fettsäure, einem Fettsäurealkylester oder einem Fettsäurechlorid erhalten werden können.

Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (III),

in der R für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R¹ für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R² für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C_1-4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest steht, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydrox ylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes.

[Z] wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers erhalten, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden.

Als anionische Tenside werden beispielsweise solche vom Typ der Sulfonate und Sulfate eingesetzt. Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C_9-13- Alkylbenzolsulfonate, Olefinsulfonate, d. h. Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansul fonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus C_12-18-Monoolefinen mit end- oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in Betracht. Geeignet sind auch Alkansulfonate, die aus C_12-18-Alkanen beispielsweise durch Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse beziehungsweise Neutralisation gewonnen werden. Ebenso sind auch die Ester von α-Sulfofettsäuren (Estersulfonate), z. B. die α-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren geeignet.

Weitere geeignete Aniontenside sind sulfierte Fettsäureglycerinester. Unter Fettsäureglycerinestern sind die Mono-, Di- und Triester sowie deren Gemische zu verstehen, wie sie bei der Herstellung durch Veresterung von einem Monoglycerin mit 1 bis 3 Mol Fettsäure oder bei der Umesterung von Triglyceriden mit 0,3 bis 2 Mol Glycerin erhalten werden. Bevorzugte sulfierte Fettsäureglycerinester sind dabei die Sulfierpro dukte von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise der Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Behensäure.

Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der Schwefelsäurehalbester der C₁₂-C₁₈-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der C₁₀-C₂₀-Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen, auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die C₁₂-C₁₆-Alkylsulfate und C₁₂-C₁₅-Alkylsulfate sowie C₁₄-C₁₅-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind geeignete Aniontenside.

Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C_7-21-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte C_9-11-Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C_12-18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet. Sie werden in Reinigungsmitteln aufgrund ihres hohen Schaumverhaltens nur in relativ geringen Mengen, beispielsweise in Mengen bis 5 Gew.-%, üblicherweise von 1 bis 5 Gew.-%, eingesetzt.

Weitere geeignete Aniontenside sind auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C_8-18-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside dar stellen (Beschreibung siehe unten). Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettal kohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzu setzen.

Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, z. B. Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.

Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.

Die Tenside können in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln insgesamt in einer Menge von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das fertige Mittel, enthalten sein.

Erfindungsgemäße Mittel können Bleichmittel enthalten. Unter den als Bleichmittel dienenden, in Wasser H₂O₂ liefernden Verbindungen haben das Natriumpercarbonat, das Natriumperborattetrahydrat und das Natriumperboratmonohydrat besondere Bedeutung. Weitere brauchbare Bleichmittel sind beispielsweise Peroxopyrophosphate, Citratperhydrate sowie H₂O₂ liefernde persaure Salze oder Persäuren, wie Persulfate beziehungsweise Perschwefelsäure. Brauchbar ist auch das Harnstoffperoxohydrat Percarbamid, das durch die Formel H₂N-CO-NH₂.H₂O₂ beschrieben werden kann. Insbesondere beim Einsatz der Mittel für das Reinigen harter Oberflächen, zum Beispiel beim maschinellen Geschirrspülen, können sie gewünschtenfalls auch Bleichmittel aus der Gruppe der organischen Bleichmittel enthalten, obwohl deren Einsatz prinzipiell auch bei Mitteln für die Textilwäsche möglich ist. Typische organische Bleichmittel sind die Diacylperoxide, wie zum Beispiel Dibenzoylperoxid. Weitere typische organische Bleichmittel sind die Peroxysäuren, wobei als Beispiele besonders die Alkylperoxysäuren und die Arylperoxysäuren genannt werden. Bevorzugte Vertreter sind die Peroxybenzoesäure und ihre ringsubstituierten Derivate, wie Alkylperoxybenzoesäuren; aber auch Peroxy-α-Naphthoesäure und Magnesium-monoperphthalat, die aliphatischen oder substituiert aliphatischen Peroxysäuren, wie Peroxylaurinsäure, Peroxystearinsäure, c-Phthalimidoperoxycapronsäure (Phthalimidoperoxyhexansäure, PAP), o-Carboxybenz amidoperoxycapronsäure, N-Nonenylamidoperadipinsäure und N-Nonenylamidoper succinate, und aliphatische und araliphatische Peroxydicarbonsäuren, wie 1,12- Diperoxycarbonsäure, 1,9-Diperoxyazelainsäure, Diperoxysebacinsäure, Diperoxybrassylsäure, die Diperoxyphthalsäuren, 2-Decyldiperoxybutan-1,4-disäure, N,N-Terephthaloyl di(6-aminopercapronsäure) können eingesetzt werden.

Der Gehalt der Mittel an Bleichmittel kann 1 bis 40 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, betragen, wobei vorteilhafterweise Perboratmonohydrat oder Percarbonat eingesetzt wird. Eine synergistische Verwendung von Amylase mit Percarbonat oder von Amylase mit Percarbonsäure wird mit den Anmeldungen WO 99/63036, beziehungsweise WO 99/63037 offenbart.

Um beim Waschen bei Temperaturen von 60°C und darunter, und insbesondere bei der Wäschevorbehandlung eine verbesserte Bleichwirkung zu erreichen, können die Mittel auch Bleichaktivatoren enthalten. Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C- Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl- 2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glycolurile, insbesondere 1,3,4,6- Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), acylierte Hydroxycarbonsäuren, wie Triethyl-O- acetylcitrat (TEOC), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, Isatosäureanhydrid und/oder Bernsteinsäureanhydrid, Carbonsäureamide, wie N- Methyldiacetamid, Glycolid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglycoldiacetat, Isopropenylacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und die aus den deutschen Patentanmeldungen DE 196 16 693 und DE 196 16 767 bekannten Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren in der europäischen Patentanmeldung EP 0 525 239 beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zucker derivate, insbesondere Pentaacetylglucose (PAG), Pentaacetylfructose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin beziehungsweise Gluconolacton, Triazol beziehungsweise Triazolderivate und/oder teilchenförmige Caprolactame und/oder Caprolactamderivate, bevorzugt N-acylierte Lactame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam und N-Acetylcaprolactam, die aus den internationalen Patentanmeldungen WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 und WO 95/17498 bekannt sind. Die aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 769 bekannten hydrophil substituierten Acylacetale und die in der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 770 sowie der internationalen Patentanmel dung WO 95/14075 beschriebenen Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch die aus der deutschen Patentanmeldung DE 44 43 177 bekannten Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Ebenso können Nitrilderivate wie Cyanopyridine, Nitrilquats, zum Beispiel N-Alkylammoniumacetonitrile, und/oder Cyanamidderivate eingesetzt werden. Bevorzugte Bleichaktivatoren sind Natrium-4- (octanoyloxy)-benzolsulfonat, n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), Undecenoyloxybenzolsulfonat (UDOBS), Natrium dodecanoyloxybenzolsulfonat (DOBS), Decanoyloxybenzoesäure (DOBA, OBC 10) und/oder Dodecanoyloxybenzolsulfonat (OBS 12), sowie N-Methylmorpholinum-acetonitril (MMA). Derartige Bleichaktivatoren können im üblichen Mengenbereich von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, enthalten sein.

Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. Bei diesen Stoffen handelt es sich um bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe wie beispielsweise Mn-, Fe-, Co-, Ru- oder Mo-Salenkomplexe oder -carbonylkomplexe. Auch Mn-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- und Cu-Komplexe mit N-haltigen Tripod-Liganden sowie Co-, Fe-, Cu- und Ru-Amminkomplexe sind als Bleichkatalysatoren geeignet, wobei solche Verbindungen bevorzugt eingesetzt werden, die in der DE 197 09 284 A1 beschrieben sind. Gemäß WO 99/63038 vermögen auch Acetonitril-Derivate und gemäß WO 99/63041 bleichaktivierende Übergangsmetallkomplexverbindungen in Kombination mit Amylasen eine bleichaktivierende Wirkung zu entfalten.

Erfindungsgemäße Mittel enthalten in der Regel einen oder mehrere Builder, insbesonde re Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und - wo keine ökologischen Grün de gegen ihren Einsatz sprechen - auch die Phosphate. Letztere sind insbesondere in Reinigungsmitteln für das maschinelle Geschirrspülen bevorzugt einzusetzende Gerüst stoffe.

Zu nennen sind hier kristalline, schichtförmige Natriumsilicate der allgemeinen Formel NaMSi_xO_2x+1.yH₂O, wobei M Natrium oder Wasserstoff bedeutet, x eine Zahl von 1,6 bis 4, vorzugsweise 1,9 bis 4,0 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2,3 oder 4 sind. Derartige kristalline Schichtsilicate werden beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 0 164 514 beschrieben. Bevorzugte kristalline Schichtsilicate der angegebenen Formel sind solche, in denen M für Natrium steht und x die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl β- als auch δ-Natriumdisilicate Na₂Si₂O₅.yH₂O bevorzugt. Im Handel befinden sich derartige Verbindungen beispielsweise unter der Bezeichnung SKS® (Fa. Clariant). So handelt es sich bei SKS-6® vorwiegend um ein δ-Natriumdisilicat mit der Formel Na₂Si₂O₅.yH₂O, bei SKS-7® vorwiegend um das β-Natriumdisilicat. Durch Reaktion mit Säuren (z. B. Citronensäure oder Kohlensäure) entsteht aus dem δ-Natriumdisilicat Kanemit NaHSi₂O₅.yH₂O, im Handel unter den Bezeichnungen SKS-9® beziehungsweise SKS-10® (Fa. Clariant). Von Vorteil kann es auch sein, chemische Modifikationen dieser Schichtsilicate einzusetzen. So kann beispielsweise die Alkalität der Schichtsilicate geeignet beeinflußt werden. Mit Phosphat beziehungsweise mit Carbonat dotierte Schichtsilicate weisen im Vergleich zu dem δ-Natriumdisilicat veränderte Kristallmorphologien auf, lösen sich schneller und zeigen im Vergleich zu δ-Natriumdisilicat ein erhöhtes Calciumbindevermögen. So sind Schichtsilicate der allgemeinen Summenformel xNa₂O.ySiO₂.zP₂O₅, in der das Verhältnis x zu y einer Zahl 0,35 bis 0,6, das Verhältnis x zu z einer Zahl von 1,75 bis 1200 und das Verhältnis y zu z einer Zahl von 4 bis 2800 entsprechen, in der Patentanmeldung DE 196 01 063 beschrieben. Die Löslichkeit der Schichtsilicate kann auch erhöht werden, indem besonders feinteilige Schichtsilicate eingesetzt werden. Auch Compounds aus den kristallinen Schichtsilicaten mit anderen Inhaltsstoffen können eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere Compounds mit Cellulosederivaten, die Vorteile in der desintegrierenden Wirkung aufweisen und insbesondere in Waschmitteltabletten eingesetzt werden, sowie Compounds mit Polycarboxylaten, z. B. Citronensäure, beziehungsweise polymeren Polycarboxylaten, z. B. Copolymeren der Acrylsäure, zu nennen.

Einsetzbar sind auch amorphe Natriumsilikate mit einem Modul Na₂O : SiO₂ von 1 : 2 bis 1 : 3, 3, vorzugsweise von 1 : 2 bis 1 : 2,8 und insbesondere von 1 : 2 bis 1 : 2,6, welche löseverzögert sind und Sekundärwascheigenschaften aufweisen. Die Löseverzögerung gegenüber herkömmlichen amorphen Natriumsilikaten kann dabei auf verschiedene Weise, beispielsweise durch Oberflächenbehandlung, Compoundierung, Kompaktierung/ Verdichtung oder durch Übertrocknung hervorgerufen worden sein. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter dem Begriff "amorph" auch "röntgenamorph" verstanden. Dies heißt, daß die Silikate bei Röntgenbeugungsexperimenten keine scharfen Röntgenreflexe liefern, wie sie für kristalline Substanzen typisch sind, sondern allenfalls ein oder mehrere Maxima der gestreuten Röntgenstrahlung, die eine Breite von mehreren Gradeinheiten des Beugungswinkels aufweisen. Es kann jedoch sehr wohl sogar zu besonders guten Buildereigenschaften führen, wenn die Silikatpartikel bei Elektronenbeugungs experimenten verwaschene oder sogar scharfe Beugungsmaxima liefern. Dies ist so zu interpretieren, daß die Produkte mikrokristalline Bereiche der Größe 10 bis einige Hundert nm aufweisen, wobei Werte bis max. 50 nm und insbesondere bis max. 20 nm bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt sind verdichtete/kompaktierte amorphe Silikate, compoundierte amorphe Silikate und übertrocknete röntgenamorphe Silikate.

Ein ggf. einsetzbarer, feinkristalliner, synthetischer und gebundenes Wasser enthaltender Zeolith ist vorzugsweise Zeolith A und/oder P. Als Zeolith P wird Zeolith MAP® (Handelsprodukt der Firma Crosfield) besonders bevorzugt. Geeignet sind jedoch auch Zeolith X sowie Mischungen aus A, X und/oder P. Kommerziell erhältlich und im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbar ist beispielsweise auch ein Co- Kristallisat aus Zeolith X und Zeolith A (ca. 80 Gew.-% Zeolith X), das von der Firma CONDEA Augusta S. p. A. unter dem Markennamen VEGOBOND AX® vertrieben wird und durch die Formel

nNa₂O.(1-n)K₂O.Al₂O₃.(2-2,5)SiO₂.(3,5-5,5)H₂O

beschrieben werden kann. Geeignete Zeolithe weisen eine mittlere Teilchengröße von weniger als 10 µm (Volumenverteilung; Meßmethode: Coulter Counter) auf und enthalten vorzugsweise 18 bis 22 Gew.-%, insbesondere 20 bis 22 Gew.-% an gebundenem Wasser.

Selbstverständlich ist auch ein Einsatz der allgemein bekannten Phosphate als Buildersubstanzen möglich, sofern ein derartiger Einsatz nicht aus ökologischen Gründen vermieden werden sollte. Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatrium- beziehungsweise Pentakaliumtriphosphat (Natrium- beziehungsweise Kalium tripolyphosphat) in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie die größte Bedeutung.

Alkalimetallphosphate ist dabei die summarische Bezeichnung für die Alkalimetall- (insbesondere Natrium- und Kalium-)-Salze der verschiedenen Phosphorsäuren, bei denen man Metaphosphorsäuren (HPO₃)_nund Orthophosphorsäure H₃PO₄ neben höhermolekularen Vertretern unterscheiden kann. Die Phosphate vereinen dabei mehrere Vorteile in sich: Sie wirken als Alkaliträger, verhindern Kalkbeläge auf Maschinenteilen beziehungsweise Kalkinkrustationen in Geweben und tragen überdies zur Reinigungsleistung bei.

Natriumdihydrogenphosphat, NaH₂PO₄, existiert als Dihydrat (Dichte 1,91 gcm^-3, Schmelzpunkt 60°) und als Monohydrat (Dichte 2,04 gcm^-3). Beide Salze sind weiße, in Wasser sehr leicht lösliche Pulver, die beim Erhitzen das Kristallwasser verlieren und bei 20 80669 00070 552 001000280000000200012000285918055800040 0002010064983 00004 805500°C in das schwach saure Diphosphat (Dinatriumhydrogendiphosphat, Na₂H₂P₂O₇, bei höherer Temperatur in Natiumtrimetaphosphat (Na₃P₃O₉) und Maddrellsches Salz (siehe unten), übergehen. NaH₂PO₄ reagiert sauer; es entsteht, wenn Phosphorsäure mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und die Maische versprüht wird. Kaliumdihydrogenphosphat (primäres oder einbasiges Kaliumphosphat, Kaliumbiphosphat, KDP), KH₂PO₄, ist ein weißes Salz der Dichte 2,33 gcm^-3, hat einen Schmelzpunkt 253° [Zersetzung unter Bildung von Kaliumpolyphosphat (KPO₃)_x] und ist leicht löslich in Wasser.

Dinatriumhydrogenphosphat (sekundäres Natriumphosphat), Na₂HPO₄, ist ein farbloses, sehr leicht wasserlösliches kristallines Salz. Es existiert wasserfrei und mit 2 Mol. (Dichte 2,066 gcm^-3, Wasserverlust bei 95°), 7 Mol. (Dichte 1,68 gcm^-3 Schmelzpunkt 48° unter Vertust von 5H₂O) und 12 Mol. Wasser (Dichte 1,52 gcm^-3, Schmelzpunkt 35° unter Verlust von 5H₂O), wird bei 100° wasserfrei und geht bei stärkerem Erhitzen in das Diphosphat Na₄P₂O₇ über. Dinatriumhydrogenphosphat wird durch Neutralisation von Phosphorsäure mit Sodalösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator hergestellt. Dikaliumhydrogenphosphat (sekundäres od. zweibasiges Kaliumphosphat), K₂HPO₄, ist ein amorphes, weißes Salz, das in Wasser leicht löslich ist.

Trinatriumphosphat, tertiäres Natriumphosphat, Na₃PO₄, sind farblose Kristalle, die als Dodecahydrat eine Dichte von 1,62 gcm^-3 und einen Schmelzpunkt von 73-76°C (Zersetzung), als Decahydrat (entsprechend 19-20% P₂O₅) einen Schmelzpunkt von 100°C und in wasserfreier Form (entsprechend 39-40% P₂O₅) eine Dichte von 2,536 gcm^- ³ aufweisen. Trinatriumphosphat ist in Wasser unter alkalischer Reaktion leicht löslich und wird durch Eindampfen einer Lösung aus genau 1 Mol Dinatriumphosphat und 1 Mol NaOH hergestellt. Trikaliumphosphat (tertiäres oder dreibasiges Kaliumphosphat), K₃PO₄, ist ein weißes, zerfließliches, körniges Pulver der Dichte 2,56 gcm^-3, hat einen Schmelzpunkt von 1340° und ist in Wasser mit alkalischer Reaktion leicht löslich. Es entsteht z. B. beim Erhitzen von Thomasschlacke mit Kohle und Kaliumsulfat. Trotz des höheren Preises werden in der Reinigungsmittel-Industrie die leichter löslichen, daher hochwirksamen, Kaliumphosphate gegenüber entsprechenden Natrium-Verbindungen vielfach bevorzugt.

Tetranatriumdiphosphat (Natriumpyrophosphat), Na₄P₂O₇, existiert in wasserfreier Form (Dichte 2,534 gcm^-3, Schmelzpunkt 988°, auch 880° angegeben) und als Decahydrat (Dichte 1,815-1,836 gcm^-3, Schmelzpunkt 94° unter Wasserverlust). Beide Substanzen sind farblose, in Wasser mit alkalischer Reaktion lösliche Kristalle. Na₄P₂O₇ entsteht beim Erhitzen von Dinatriumphosphat auf < 200° oder indem man Phosphorsäure mit Soda im stöchiometrischem Verhältnis umsetzt und die Lösung durch Versprühen entwässert. Das Decahydrat komplexiert Schwermetall-Salze und Härtebildner und verringert daher die Härte des Wassers. Kaliumdiphosphat (Kaliumpyrophosphat), K₄P₂O₇, existiert in Form des Trihydrats und stellt ein farbloses, hygroskopisches Pulver mit der Dichte 2,33 gcm^-3 dar, das in Wasser löslich ist, wobei der pH-Wert der 1%igen Lösung bei 25° 10,4 beträgt.

Durch Kondensation des NaH₂PO₄ beziehungsweise des KH₂PO₄ entstehen höhermolekulare Natrium- und Kaliumphosphate, bei denen man cyclische Vertreter, die Natrium- beziehungsweise Kaliummetaphosphate und kettenförmige Typen, die Natrium- beziehungsweise Kaliumpolyphosphate, unterscheiden kann. Insbesondere für letztere sind eine Vielzahl von Bezeichnungen in Gebrauch: Schmelz- oder Glühphosphate, Grahamsches Salz, Kurrolsches und Maddrellsches Salz. Alle höheren Natrium- und Kaliumphosphate werden gemeinsam als kondensierte Phosphate bezeichnet.

Das technisch wichtige Pentanatriumtriphosphat, Na₅P₃O₁₀ (Natriumtripolyphosphat), ist ein wasserfrei oder mit 6H₂O kristallisierendes, nicht hygroskopisches, weißes, wasserlösliches Salz der allgemeinen Formel NaO-[P(O)(ONa)-O]_n-Na mit n = 3. In 100 g Wasser lösen sich bei Zimmertemperatur etwa 17 g, bei 60° ca. 20 g, bei 100° rund 32 g des kristallwasserfreien Salzes; nach zweistündigem Erhitzen der Lösung auf 100° entstehen durch Hydrolyse etwa 8% Orthophosphat und 15% Diphosphat. Bei der Herstellung von Pentanatriumtriphosphat wird Phosphorsäure mit Sodalösung oder Natronlauge im stöchiometrischen Verhältnis zur Reaktion gebracht und die Lösung durch Versprühen entwässert. Ähnlich wie Grahamsches Salz und Natriumdiphosphat löst Pentanatriumtriphosphat viele unlösliche Metall-Verbindungen (auch Kalkseifen usw.). Pentakaliumtriphosphat, K₅P₃O₁₀ (Kaliumtripolyphosphat), kommt beispielsweise in Form einer 50 Gew.-%-igen Lösung (< 23% P₂O₅, 25% K₂O) in den Handel. Die Kaliumpolyphosphate finden in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie breite Verwendung. Weiter existieren auch Natriumkaliumtripolyphosphate, welche ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind. Diese entstehen beispielsweise, wenn man Natriumtrimetaphosphat mit KOH hydrolysiert:

(NaPO₃)₃ + 2KOH → Na₃K₂P₃O₁₀ + H₂O

Diese sind erfindungsgemäß genau wie Natriumtripolyphosphat, Kaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus diesen beiden einsetzbar; auch Mischungen aus Natriumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Gemische aus Natriumtripolyphosphat und Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat sind erfindungsgemäß einsetzbar.

Als organische Cobuilder können in den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere Polycarboxylate oder Polycarbonsäuren, polymere Polycarboxylate, Polyasparaginsäure, Polyacetale, ggf. oxidierte Dextrine, weitere organische Cobuilder (siehe unten) sowie Phosphonate eingesetzt werden. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben.

Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren, Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht zu vermeiden ist, sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der Polycarbonsäuren wie Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Zuckersäuren und Mischungen aus diesen.

Auch die Säuren an sich können eingesetzt werden. Sie besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch- oder Reinigungsmitteln, sofern nicht der sich durch die Mischung der übrigen Komponenten ergebende pH-Wert gewünscht ist. Insbesondere sind hierbei system- unbd umweltverträgliche Säuren wie Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide können als pH-Regulatoren dienen. Derartige Regulatoren sind in den erfindungemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.

Als Builder sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70 000 g/mol.

Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen M_w der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.

Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2 000 bis 20 000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2 000 bis 10 000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3 000 bis 5 000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein.

Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2 000 bis 70 000 g/mol, vorzugsweise 20 000 bis 50 000 g/mol und insbesondere 30 000 bis 40 000 g/mol. Die (co-)polymeren Polycarboxylate können entweder als Pulver oder als wässerige Lösung eingesetzt werden. Der Gehalt der Mittel an (co-)polymeren Polycarboxylaten kann von 0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-%, betragen.

Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie beispielsweise Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer enthalten.

Insbesondere bevorzugt sind auch biologisch abbaubare Polymere aus mehr als zwei verschiedenen Monomereinheiten, beispielsweise solche, die als Monomere Salze der Acrylsäure und der Maleinsäure sowie Vinylalkohol beziehungsweise Vinylalkohol- Derivate oder die als Monomere Salze der Acrylsäure und der 2-Alkylallylsulfonsäure sowie Zucker-Derivate enthalten.

Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Acrolein und Vinylacetat aufweisen.

Ebenso sind als weitere bevorzugte Buildersubstanzen polymere Aminodicarbonsäuren, deren Salze oder deren Vorläufersubstanzen zu nennen. Besonders bevorzugt sind Polyasparaginsäuren beziehungsweise deren Salze und Derivate.

Weitere geeignete Buildersubstanzen sind Polyacetale, welche durch Umsetzung von Dialdehyden mit Polyolcarbonsäuren, welche 5 bis 7 C-Atome und mindestens 3 Hydroxylgruppen aufweisen, erhalten werden können. Bevorzugte Polyacetale werden aus Dialdehyden wie Glyoxal, Glutaraldehyd, Terephthalaldehyd sowie deren Gemischen und aus Polyolcarbonsäuren wie Gluconsäure und/oder Glucoheptonsäure erhalten.

Weitere geeignete organische Buildersubstanzen sind Dextrine, beispielsweise Oligomere beziehungsweise Polymere von Kohlenhydraten, die durch partielle Hydrolyse von Stärken erhalten werden können. Die Hydrolyse kann nach üblichen, beispielsweise säure- oder enzymkatalysierten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich um Hydrolyseprodukte mit mittleren Molmassen im Bereich von 400 bis 500 000 g/mol. Dabei ist ein Polysaccharid mit einem Dextrose-Äquivalent (DE) im Bereich von 0,5 bis 40, insbesondere von 2 bis 30 bevorzugt, wobei DE ein gebräuchliches Maß für die reduzierende Wirkung eines Polysaccharids im Vergleich zu Dextrose ist, welche ein DE von 100 besitzt. Brauchbar sind sowohl Maltodextrine mit einem DE zwischen 3 und 20 und Trockenglucosesirupe mit einem DE zwischen 20 und 37 als auch sogenannte Gelbdextrine und Weißdextrine mit höheren Molmassen im Bereich von 2 000 bis 30 000 g/mol.

Bei den oxidierten Derivaten derartiger Dextrine handelt es sich um deren Umsetzungsprodukte mit Oxidationsmitteln, welche in der Lage sind, mindestens eine Alkoholfunktion des Saccharidrings zur Carbonsäurefunktion zu oxidieren. Besonders bevorzugte organische Builder für erfindungsgemäße Mittel sind oxidierte Stärken, beziehungsweise deren Derivate aus den Anmeldungen EP 472 042, WO 97/25399, und EP 755 944.

Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise Ethylendiamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird Ethylendiamin- N,N'-disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate und Glycerintrisuccinate. Geeignete Einsatzmengen liegen in zeolithhaltigen und/oder silicathaltigen Formulierungen zwischen 3 und 15 Gew.-%.

Weitere brauchbare organische Cobuilder sind beispielsweise acetylierte Hydroxycarbonsäuren beziehungsweise deren Salze, welche gegebenenfalls auch in Lactonform vorliegen können und welche mindestens 4 Kohlenstoffatome und mindestens eine Hydroxygruppe sowie maximal zwei Säuregruppen enthalten.

Eine weitere Substanzklasse mit Cobuildereigenschaften stellen die Phosphonate dar. Dabei handelt es sich insbesondere um Hydroxyalkan- beziehungsweise Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1-Hydroxyethan- 1,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriamin pentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, z. B. als Hexanatriumsalz der EDTMP beziehungsweise als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.

Darüberhinaus können alle Verbindungen, die in der Lage sind, Komplexe mit Erdalkaliionen auszubilden, als Cobuilder eingesetzt werden.

Buildersubstanzen können in den erfindungsgemäßen Mitteln gegebenenfalls in Mengen bis zu 90 Gew.-% enthalten sein. Sie sind vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-% enthalten. Erfindungsgemäße Waschmittel weisen Buildergehalte von insbesondere 5 Gew.-% bis 50 Gew.-% auf. In erfindungsgemäßen Mitteln für die Reinigung harter Oberflächen, insbesondere zur maschinellen Reinigung von Geschirr, beträgt der Gehalt an Buildersubstanzen insbesondere 5 Gew.-% bis 88 Gew.-%, wobei in derartigen Mitteln vorzugsweise keine wasserunlöslichen Buildermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel zur insbesondere maschinellen Reinigung von Geschirr sind 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% wasserlöslicher organischer Builder, insbesondere Alkalicitrat, 5 Gew.-% bis 15 Gew.-% Alkalicarbonat und 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% Alkalidisilikat enthalten.

Lösungsmittel, die in den flüssigen bis gelförmigen Zusammensetzungen von Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden können, stammen beispielsweise aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glycolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanolen, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykol-methylether, Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propylether, Dipropylenglykolmonomethyl-, oder - ethylether, Di-isopropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol- t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel.

Lösungsmittel können in den erfindungsgemäßen flüssigen bis gelförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln in Mengen zwischen 0,1 und 20 Gew.-%, bevorzugt aber unter 15 Gew.-% und insbesondere unterhalb von 10 Gew.-% eingesetzt werden.

Zur Einstellung der Viskosität können der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein oder mehrere Verdicker, beziehungsweise Verdickungssysteme zugesetzt werden. Diese hochmolekularen Stoffe, die auch Quell(ungs)mittel genannt werden, saugen meist die Flüssigkeiten auf und quellen dabei auf, um schließlich in zähflüssige echte oder kolloide Lösungen überzugehen.

Geeignete Verdicker sind anorganische oder polymere organische Verbindungen. Zu den anorganischen Verdickern zählen beispielsweise Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäuern und Bentonite. Die organischen Verdicker stammen aus den Gruppen der natürlichen Polymere, der abgewandelten natürlichen Polymere und der vollsynthetischen Polymere. Solche aus der Natur stammenden Polymere sind beispielsweise Agar-Agar, Carrageen, Tragant, Gummi arabicum, Alginate, Pektine, Polyosen, Guar-Mehl, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine und Casein. Abgewandelte Naturstoffe, die als Verdicker verwendet werden, stammen vor allem aus der Gruppe der modifizierten Stärken und Cellulosen. Beispielhaft seien hier Carboxymethylcellulose und andere Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose sowie Kernmehlether genannt. Vollsynthetische Verdicker sind Polymere wie Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen, Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine, Polyamide und Polyurethane.

Die Verdicker können in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-%, und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1,5 Gew.-%, bezogen auf die fertige Zusammensetzung, enthalten sein.

Das erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel kann gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyte und weitere Hilfsstoffe, wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbüber tragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffe, Farb- und/oder Duftstoffe, sowie mikrobielle Wirkstoffe und/oder UV-Absorbenzien enthalten.

Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6- amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4- Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.

Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxy propylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.

Um einen Silberkorrosionsschutz zu bewirken, können in erfindungsgemäßen Reinigungs mitteln für Geschirr Silberkorrosionsinhibitoren eingesetzt werden. Solche sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise Benzotriazole, Eisen(III)-chlorid oder CoSO₄. Wie beispielsweise aus der europäischen Patentschrift EP 0 736 084 B1 bekannt ist, sind für die gemeinsame Verwendung mit Enzymen besonders geeignete Silberkorrosions inhibitoren Mangan-, Titan-, Zirkonium-, Hafnium-, Vanadium-, Cobalt- oder Cersalze und/oder -komplexe, in denen die genannten Metalle in einer der Oxidationsstufen II, III, IV, V oder VI vorliegen. Beispiele für derartige Verbindungen sind MnSO₄, V₂O₅, V₂O₄, VO₂, TiOSO₄, K₂TiF₆, K₂ZrF₆, Co(NO₃)₂, Co(NO₃)₃, sowie deren Gemische.

"Soil-Release"-Wirkstoffe oder "Soil-Repellents" sind zumeist Polymere, die bei der Verwendung in einem Waschmittel der Wäschefaser schmutzabstoßende Eigenschaften verleihen und/oder das Schmutzablösevermögen der übrigen Waschmittelbestandteile unterstützen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei deren Einsatz in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen beobachtet werden.

Besonders wirksame und seit langer Zeit bekannte Soil-Release-Wirkstoffe sind Copolyester mit Dicarbonsäure-, Alkylenglykol- und Polyalkylenglykoleinheiten. Beispiele dafür sind Copolymere oder Mischpolymere aus Polyethylenterephthalat und Polyoxyethylenglykol (DT 16 17 141, beziehungsweise DT 22 00 911). In der deutschen Offenlegungsschrift DT 22 53 063 sind saure Mittel genannt, die unter anderem ein Copolymer aus einer dibasigen Carbonsäure und einem Alkylen- oder Cycloalkylenpolyglykol enthalten. Polymere aus Ethylenterephthalat und Polyethylenoxid terephthalat und deren Einsatz in Waschmitteln sind in den deutschen Schriften DE 28 57 292 und DE 33 24 258 und der Europäischen Patentschrift EP 0 253 567 beschrieben. Das europäische Patent EP 066 944 betrifft Mittel, die einen Copolyester aus Ethylenglykol, Polyethylenglykol, aromatischer Dicarbonsäure und sulfonierter aromatischer Dicarbonsäure in bestimmten Molverhältnissen enthalten. Aus dem europäischen Patent EP 0 185 427 sind Methyl- oder Ethylgruppen-endverschlossene Polyester mit Ethylen- und/oder Propylen-terephthalat- und Polyethylenoxidterephthalat- Einheiten und Waschmitel, die derartiges Soil-release-Polymer enthalten, bekannt. Das europäische Patent EP 0 241 984 betrifft einen Polyester, der neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten auch substituierte Ethyleneinheiten sowie Glycerineinheiten enthält. Aus dem europäischen Patent EP 0 241 985 sind Polyester bekannt, die neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten 1,2-Propylen-, 1,2-Butylen- und/oder 3-Methoxy-1,2-propylengruppen sowie Glycerineinheiten enthalten und mit C₁- bis C₄- Alkylgruppen endgruppenverschlossen sind. Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 272 033 sind zumindest anteilig durch C_1-4-Alkyl- oder Acylreste endgruppenverschlossene Polyester mit Poly-propylenterephthalat- und Polyoxyethylenterephthalat-Einheiten bekannt. Das europäische Patent EP 0 274 907 beschreibt sulfoethyl-endgruppenverschlossene terephthalathaltige Soil-release- Polyester. Gemäß der europäischen Patentanmeldung EP 0 357 280 werden durch Sulfonierung ungesättigter Endgruppen Soil-Release-Polyester mit Terephthalat-, Alkylenglykol- und Poly-C_2-4-Glykol-Einheiten hergestellt. Die internationale Patentanmeldung WO 95/32232 betrifft saure, aromatische schmutzablösevermögende Polyester. Aus der internationalen Patentanmeldung WO 97/31085 sind nicht polymere soil-repellent-Wirkstoffe für Materialien aus Baumwolle mit mehreren funktionellen Einheiten bekannt: Eine erste Einheit, die beispielsweise kationisch sein kann, ist zur Adsorption auf die Baumwolloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkung befähigt, und eine zweite Einheit, die hydrophob ausgebildet ist, ist verantwortlich für das Verbleiben des Wirkstoffs an der Wasser/Baumwolle-Grenzfläche.

Zu den für den Einsatz in erfindungsgemäßen Textilwaschmitteln in Frage kommenden Farbübertragungsinhibitoren gehören insbesondere Polyvinylpyrrolidone, Polyvinyl imidazole, polymere N-Oxide wie Poly-(vinylpyridin-N-oxid) und Copolymere von Vinyl pyrrolidon mit Vinylimidazol.

Beim Einsatz in maschinellen Reinigungsverfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C₁₈-C₂₄-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, ggf. silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bistearylethylendiamid. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, z. B. solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Pa raffinhaltige Schauminhibitoren, an eine granulare, in Wasser lösliche, beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamiden bevorzugt.

Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen kann darüber hinaus abrasiv wirkende Bestandteile, insbesondere aus der Gruppe umfassend Quarzmehle, Holzmehle, Kunststoffmehle, Kreiden und Mikroglaskugeln sowie deren Gemische, enthalten. Abrasivstoffe sind in den erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 15 Gew.-%, enthalten.

Farb- und Duftstoffe werden Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt, um den ästhetischen Eindruck der Produkte zu verbessern und dem Verbraucher neben der Wasch- und Reinigungsleistung ein visuell und sensorisch "typisches und unverwechselbares" Produkt zur Verfügung zu stellen. Als Parfümöle beziehungsweise Duftstoffe können einzelne Riechstoffverbindungen, z. B. die synthetischen Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind z. B. Benzylacetat, Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzyl carbinylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenyl glycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden z. B. die linearen Alkanale mit 8-18 C-Atomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen z. B. die Jonone, α- Isomethylionon und Methyl-cedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene wie Limonen und Pinen. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Solche Parfümöle können auch natürliche Riechstoffgemische enthalten, wie sie aus pflanzlichen Quellen zugänglich sind, z. B. Pine-, Citrus-, Jasmin-, Patchouly-, Rosen- oder Ylang-Ylang-Öl. Ebenfalls geeignet sind Muskateller, Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeeröl, Vetiveröl, Olibanumöl, Galbanumöl und Labdanumöl sowie Orangenblütenöl, Neroliol, Orangenschalenöl und Sandelholzöl. Üblicherweise liegt der Gehalt von Wasch- und Reinigungsmitteln an Farbstoffen unter 0,01 Gew.-%, während Duftstoffe bis zu 2 Gew.-% der gesamten Formulierung ausmachen können.

Die Duftstoffe können direkt in die Wasch- und Reinigungsmittel eingearbeitet werden, es kann aber auch vorteilhaft sein, die Duftstoffe auf Träger aufzubringen, die die Haftung des Parfüms auf dem Reinigungsgut verstärken und durch eine langsamere Duftfreisetzung für langanhaltenden Duft, insbesondere von behandelten Textilien sorgen. Als solche Trägermaterialien haben sich beispielsweise Cyclodextrine bewährt, wobei die Cyclodextrin-Parfüm-Komplexe zusätzlich noch mit weiteren Hilfsstoffen beschichtet werden können. Ein weiter bevorzugter Träger für Duftstoffe ist der beschriebene Zeolith X, der anstelle von oder in Mischung mit Tensiden auch Duftstoffe aufnehmen kann. Bevorzugt sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, die den beschriebenen Zeolith X und Duftstoffe, die vorzugsweise zumindest teilweise an dem Zeolithen absorbiert sind, enthalten.

Bevorzugte Farbstoffe, deren Auswahl dem Fachmann keinerlei Schwierigkeit bereitet, besitzen eine hohe Lagerstabilität und Unempfindlichkeit gegenüber den übrigen Inhaltsstoffen der Mittel und gegen Licht sowie keine ausgeprägte Substantivität gegenüber Textilfasern, um diese nicht anzufärben.

Zur Bekämpfung von Mikroorganismen können Wasch- oder Reinigungsmittel antimikrobielle Wirkstoffe enthalten. Hierbei unterscheidet man je nach antimikrobiellem Spektrum und Wirkungsmechanismus zwischen Bakteriostatika und Bakteriziden, Fungistatika und Fungiziden usw. Wichtige Stoffe aus diesen Gruppen sind beispielsweise Benzalkoniumchloride, Alkylarylsulfonate, Halogenphenole und Phenolmercuriacetat. Die Begriffe antimikrobielle Wirkung und antimikrobieller Wirkstoff haben im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre die fachübliche Bedeutung, die beispielsweise von K. H. Wallhäußer in "Praxis der Sterilisation, Desinfektion- Konservierung : Keimidentifizierung-Betriebshygiene" (5. Aufl. - Stuttgart; New York Thieme, 1995) wiedergegeben wird, wobei alle dort beschriebenen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung eingesetzt werden können. Geeignete antimikrobielle Wirkstoffe sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen der Alkohole, Amine, Aldehyde, antimikrobiellen Säuren beziehungsweise deren Salze, Carbonsäureester, Säureamide, Phenole, Phenolderivate, Diphenyle, Diphenylalkane, Harnstoffderivate, Sauerstoff-, Stickstoff-acetale sowie -formale, Benzamidine, Isothiazoline, Phthalimidderivate, Pyri dinderivate, antimikrobiellen oberflächenaktiven Verbindungen, Guanidine, anti mikrobiellen amphoteren Verbindungen, Chinoline, 1,2-Dibrom-2,4-dicyanobutan, Iodo-2- propyl-butyl-carbamat, Iod, Iodophore, Peroxoverbindungen, Halogenverbindungen sowie beliebigen Gemischen der voranstehenden.

Der antimikrobielle Wirkstoff kann dabei ausgewählt sein aus Ethanol, n-Propanol, i- Propanol, 1,3-Butandiol, Phenoxyethanol, 1,2-Propylenglykol, Glycerin, Undecylensäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Dihydracetsäure, o-Phenylphenol, N-Methylmorpholin acetonitril (MMA), 2-Benzyl-4-chlorphenol, 2,2'-Methylen-bis-(6-brom-4-chlorphenol), 4,4'- Dichlor-2'-hydroxydiphenylether (Dichlosan), 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether (Trichlosan), Chlorhexidin, N-(4-Chlorphenyl)-N-(3,4-dichlorphenyl)-harnstoff, N,N'-(1,10- decan-diyldi-1-pyridinyl-4-yliden)-bis-(1-octanamin)-dihydrochlorid, N,N'-Bis-(4-chlorphe nyl)-3,12-diimino-2,4, 11,13-tetraaza-tetradecandiimidamid, Glucoprotaminen, antimikro biellen oberflächenaktiven quaternären Verbindungen, Guanidinen einschl. den Bi- und Polyguanidinen, wie beispielsweise 1,6-Bis-(2-ethylhexyl-biguanido-hexan)-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-tetrahydochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-phenyl- N₁,N₁-methyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o- chlorophenyldiguanido- N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid,1,6-Di-(N₁,N₁'-2,6- dichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid,1,6-Di-[N₁,N₁'-beta-(p- methoxyphenyl)diguanido-N₅,N₅]-hexane-dihydrochlorid,1,6-Di-(N₁,N₁'-alpha-methyl- .beta.-phenyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid,1,6-Di-(N₁,N₁'-p- nitrophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N₁,N₁'- phenyldiguanido-N₅,N₅')-di-n-propylether-dihydrochlorid, omega:omega'-Di-(N₁,N₁'-p- chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')-di-n-propylether-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-2,4- dichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-p- methylphenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid,1,6-Di-(N₁,N₁'-2,4,5- trichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid,1,6-Di-[N₁,N₁'-alpha-(p- chlorophenyl)ethyldiguanido-N₅,N₅'] hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N₁,N₁'-p- chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')m-xylene-dihydrochlorid, 1,12-Di-(N₁,N₁'-p- chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')dodecan-dihydrochlorid, 1,10-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido- N₅,N₅')-decan-tetrahydrochlorid, 1,12-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido-N₅,N₅')dodecan tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid, Ethylen-bis-(1- tolyl biguanid), Ethylen-bis-(p-tolyl biguanide), Ethylen-bis-(3,5-dimethylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(p-tert-amylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(nonylphenylbiguanid), Ethylen-bis- (phenylbiguanid), Ethylen-bis-(N-butylphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,5- diethoxyphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,4-dimethylphenyl biguanid), Ethylen-bis (o diphenylbiguanid), Ethylen-bis (mixed amyl naphthylbiguanid), N-Butyl-ethylen-bis- (phenylbiguanid), Trimethylen bis (o-tolylbiguanid), N-Butyl-trimethyle- bis-(phenyl biguanide) und die entsprechenden Salze wie Acetate, Gluconate, Hydrochloride, Hydrobromide, Citrate, Bisulfite, Fluoride, Polymaleate, N-Cocosalkylsarcosinate, Phosphite, Hypophosphite, Perfluorooctanoate, Silicate, Sorbate, Salicylate, Maleate, Tartrate, Fumarate, Ethylendiamintetraacetate, Iminodiacetate, Cinnamate, Thiocyanate, Arginate, Pyromellitate, Tetracarboxybutyrate, Benzoate, Glutarate, Monofluorphosphate, Perfluorpropionate sowie beliebige Mischungen davon. Weiterhin eignen sich halogenierte Xylol- und Kresolderivate, wie p-Chlormetakresol oder p-Chlor-meta-xylol, sowie natürliche antimikrobielle Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft (z. B. aus Gewürzen oder Kräutern), tierischer sowie mikrobieller Herkunft. Vorzugsweise können antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindungen, ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft und/oder ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft, äußerst bevorzugt mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft aus der Gruppe, umfassend Coffein, Theobromin und Theophyllin sowie etherische Öle wie Eugenol, Thymol und Geraniol, und/oder mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft aus der Gruppe, umfassend En zyme wie Eiweiß aus Milch, Lysozym und Lactoperoxidase, und/oder mindestens eine antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindung mit einer Ammonium-, Sulfonium-, Phosphonium-, Iodonium- oder Arsoniumgruppe, Peroxoverbindungen und Chlorverbindungen eingesetzt werden. Auch Stoffe mikrobieller Herkunft, sogenannte Bakteriozine, können eingesetzt werden.

Die als antimikrobielle Wirkstoffe geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen (QAV) weisen die allgemeine Formel (R¹)(R²)(R³)(R⁴) N⁺ X^- auf, in der R¹ bis R⁴ gleiche oder verschiedene C₁-C₂₂-Alkylreste, C₇-C₂₈-Aralkylreste oder heterozyklische Reste, wobei zwei oder im Falle einer aromatischen Einbindung wie im Pyridin sogar drei Reste gemeinsam mit dem Stickstoffatom den Heterozyklus, z. B. eine Pyridinium- oder Imidazoliniumverbindung, bilden, darstellen und X^- Halogenidionen, Sulfationen, Hydroxidionen oder ähnliche Anionen sind. Für eine optimale antimikrobielle Wirkung weist vorzugsweise wenigstens einer der Reste eine Kettenlänge von 8 bis 18, insbesondere 12 bis 16, C-Atomen auf QAV sind durch Umsetzung tertiärer Amine mit Alkylierungsmitteln, wie z. B. Methylchlorid, Benzylchlorid, Dimethylsulfat, Dodecylbromid, aber auch Ethylenoxid herstellbar. Die Alkylierung von tertiären Aminen mit einem langen Alkyl-Rest und zwei Methyl-Gruppen gelingt besonders leicht, auch die Quaternierung von tertiären Aminen mit zwei langen Resten und einer Methyl-Gruppe kann mit Hilfe von Methylchlorid unter milden Bedingungen durchgeführt werden. Amine, die über drei lange Alkyl-Reste oder Hydroxy- substituierte Alkyl-Reste verfügen, sind wenig reaktiv und werden bevorzugt mit Dimethylsulfat quaterniert.

Geeignete QAV sind beispielweise Benzalkoniumchlorid (N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl ammoniumchlorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-Dichlorbenzyl-dimethyl-C12- alkylammoniumchlorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumchlorid (Benzyl-dodecyl-bis- (2-hydroxyethyl)-ammonium-chlorid), Cetrimoniumbromid (N-Hexadecyl-N,N-trimethyl ammoniumbromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumchlorid (N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[p- (1,1,3,3-tetramethylbutyl)-pheno-xy]ethoxy]ethyl]-benzylammoniumchlorid, CAS No. 121- 54-0), Dialkyldimethylammonium-chloride wie Di-n-decyl-dimethyl-ammoniumchlorid (CAS No. 7173-51-5-5), Didecyldi-methylammoniumbromid (CAS No. 2390-68-3), Dioctyl dimethyl-ammoniumchloric, 1-Cetylpyridiniumchlorid (CAS No. 123-03-5) und Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1) sowie deren Mischungen. Besonders bevorzugte QAV sind die Benzalkoniumchloride mit C₈-C₁₈-Alkylresten, insbesondere C₁₂-C₁₄-Aklyl- benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid.

Benzalkoniumhalogenide und/oder substituierte Benzalkoniumhalogenide sind beispielsweise kommerziell erhältlich als Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/Sherex und Hyamine® ex Lonza, sowie Bardac® ex Lonza. Weitere kommerziell erhältliche antimikrobielle Wirkstoffe sind N-(3-Chlorallyl)-hexaminiumchlorid wie Dowicide® und Dowicil® ex Dow, Benzethoniumchlorid wie Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, Methylbenzethoniumchlorid wie Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, Cetylpyridiniumchlorid wie Cepacolchlorid ex Merrell Labs.

Die antimikrobiellen Wirkstoffe werden in Mengen von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 Gew.-% bis 0,8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,005 Gew.-% bis 0,3 Gew.-% und insbesondere von 0,01 bis 0,2 Gew.-% eingesetzt.

Die Mittel können UV-Absorbenzien (UV-Absorber) enthalten, die auf die behandelten Textilien aufziehen und die Lichtbeständigkeit der Fasern und/oder die Lichtbeständigkeit sonstiger Rezepturbestandteile verbessern. Unter UV-Absorber sind organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, z. B. Wärme wieder abzugeben.

Verbindungen, die diese gewünschten Eigenschaften aufweisen, sind beispielsweise die durch strahlungslose Desaktivierung wirksamen Verbindungen und Derivate des Benzophenons mit Substituenten in 2- und/oder 4-Stellung. Weiterhin sind auch substituierte Benzotriazole, in 3-Stellung Phenylsubstituierte Acrylate (Zimtsäurederivate, gegebenenfalls mit Cyanogruppen in 2-Stellung), Salicylate, organische Ni-Komplexe sowie Naturstoffe wie Umbelliferon und die körpereigene Urocansäure geeignet. Besondere Bedeutung haben Biphenyl- und vor allem Stilbenderivate wie sie beispielsweise in der EP 0728749 A beschrieben werden und kommerziell als Tinosorb® FD oder Tinosorb® FR ex Ciba erhältlich sind. Als UV-B-Absorber sind zu nennen: 3- Benzylidencampher beziehungsweise 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, z. B. 3-(4-Methylbenzyliden)campher, wie in der EP 0693471 B1 beschrieben; 4- Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2- ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4- (Dimethylamino)benzoesäureamylester; Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4- Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimt säureisoamylester, 2-Cyano-3,3-phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene); Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4- isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester; Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'- methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon; Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester; Triazinderivate, wie z. B. 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1'-hexyloxy)-1,3,5-triazin und Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb® HEB); Propan-1,3-dione, wie z. B. 1-(4-tert.Butylphenyl)-3- (4'methoxyphenyl)propan-1,3-dion; Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1 beschrieben. Weiterhin geeignet sind 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze; Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2- Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze; Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie z. B. 4-(2-Oxo-3-bornylidenmethyl)benzol-sulfonsäure und 2- Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)sulfonsäure und deren Salze.

Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion, 4-tert.- Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789), 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan- 1,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 197 12 033 A1 (BASF). Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse, vorzugsweise nanoisierte Metal loxide beziehungsweise Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente bereits für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, d. h. hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind ummantelte Titandioxide, wie z. B. Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex® T2000 (Merck; als hydrophobe Coatingmittel kommen dafür bevorzugt Silicone und besonders bevorzugt Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P. Finkel in SÖFW-Journal 122 (1996), S. 543 zu entnehmen.

Die UV-Absorbenzien werden üblicherweise in Mengen von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,03 Gew.-% bis 1 Gew.-%, eingesetzt.

Zu den für Wasch- und Reinigungsmitteln üblichen Inhaltsstoffen werden im allgemeinen auch wasch-, bzw. reinigungsaktive Enzyme gerechnet. Gleichzeitig stellen Wasch- oder Reinigungsmittel, die über ein erfindungsgemäßes Protein hinaus durch zusätzlich weitere Enzyme gekennzeichnet sind, bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Dazu gehören beispielsweise andere Proteasen, aber auch Oxidoreductasen, Cutinasen, und/oder Esterasen, und besonders bevorzugt Lipasen, Amylasen und/oder Cellulasen. Deren besonders gewünschte Beiträge zu der Gesamtwaschleistung betreffender Mittel sind bereits in der Einleitung benannt worden. Weitere Enzyme erweitern die Reinigunsgleitung entsprechender Mittel um ihre jeweils spezifische enzymatische Leistung.

Dafür kommen in erster Linie aus Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, gewonne ne Enzyme in Frage. Sie werden in bekannter Weise durch Fermentationsprozesse aus geeigneten Mikroorganismen gewonnen, die zum Beispiel in den deutschen Offenlegungsschriften DE 19 40 488, DE 20 44 161, DE 22 01 803 und DE 21 21 397, den US-amerikanischen Patentschriften US 3 632 957 und US 4 264 738, der euro päischen Patentanmeldung EP 006 638 sowie der internationalen Patentanmeldung WO 91/912792 beschrieben sind. Falls es sich bei der erfindungsgemäß hergestellten Zu bereitung um eine proteasehaltige Zubereitung handelt, kann die Proteaseaktivität bis zu 1 500 000 Proteaseeinheiten pro Gramm Zubereitung betragen (PE, bestimmt nach der in Tenside, Bd. 7 (1970), S. 125-132 beschriebenen Methode), vorzugsweise liegt sie bei 150 000 bis 350 000 PE, insbesondere 160 000 PE bis 300 000 PE, pro Gramm Zubereitung.

Ein erfindungsgemäßes Protein kann besonders während der Lagerung durch Stabilisatoren beispielsweise vor Denaturierung, Zerfall oder Inaktivierung, etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden.

Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren, die bei Verdünnung des Mittels in der Waschflotte abdissozieren. Benzamidin-Hydrochlorid und Leupeptin sind für diesen Zweck etabliert. Häufig werden Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester verwendet, darunter vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa gemäß WO 95/12655 ortho-substituierte, gemäß WO 92/19707 meta- substituierte und gemäß US 5 972 873 para-substituierte Phenylboronsäuren, beziehungsweise deren Salze oder Ester. In den Anmeldungen WO 98/13460 und EP 583 534 werden Peptidaldehyde, d. h. Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, und zwar solche aus 2-50 Monomeren, zur reversiblen Inhibierung von Wasch- und Reinigungsmittelproteasen offenbart. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehört u. a. Ovomucoid (WO 93/00418). Beispielsweise mit der Anmeldung WO 00/01826 werden spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren für die Protease Subtilisin zur Verwendung in Protease-haltigen Mitteln offenbart, und mit WO 00/01831 entsprechende Fusionsproteine aus Protease und Inhibitor.

Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und - propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C₁₂, wie beispielsweise aus den Anmeldungen EP 0 378 261 und WO 97/05227 bekannt ist, wie Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Mit der Anmeldung DE 196 50 537 werden für diesen Zweck endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate offenbart. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich ein enthaltenes Enzym zu stabilisieren.

Niedere aliphatische Alkohole, v. a. aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit sind weitere häufig eingesetzte Enzymstabilisatoren. Ebenso werden Calciumsalze verwendet, wie beispielsweise Calciumacetat oder das in der Patentschrift EP 0 028 865 für diesen Zweck offenbarte Calcium-Formiat, und Magnesiumsalze, etwa gemäß der europäischen Anmeldung EP 0 378 262.

Polyamid-Oligomere (WO 99/43780) oder polymere Verbindungen wie Lignin (WO 97/00932), wasserlösliche Vinyl-Copolymere (EP 828 762) oder, wie in EP 702 712 offenbart, Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym- Präparation u. a. gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert-Schwankungen. Polyamin-N-Oxid-enthaltende Polymere (EP 587 550 und EP 581 751) wirken gleichzeitig als Enzymstabilisatoren und als Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere Stabilisatoren sind die in WO 97/05227 neben anderen Bestandteilen offenbarten linearen C₈-C₁₈ Polyoxyalkylene. Alkylpolyglycoside könnten wie in den Anmeldungen WO 97/43377 und WO 98/45396 die enzymatischen Komponenten des erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und sogar in ihrer Leistung steigern. Vernetzte N- haltige Verbindungen, wie in WO 98/17764 offenbart, erfüllen eine Doppelfunktion als Soil-release-Agentien und als Enzym-Stabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches Polymer wirkt in einer Mischung mit anderen Stabilisatoren gemäß der Anmeldung WO 97/32958 stabilisierend auf eine Cellulase, so daß sich solche oder ähnliche Bestandteile auch für das erfindungswesentliche Enzym eignen könnten.

Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen, wie u. a. in EP 780 466 offenbart, die Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall. Schwefelhaltige Reduktionsmittel sind beispielsweise aus den Patentschriften EP 0 080 748 und EP 0 080 223 bekannt.

Andere Beispiele sind Natrium-Sulfit (EP 533 239) und reduzierende Zucker (EP 656 058).

Vielfach werden auch Kombinatonen von Stabilisatoren verwendet, beispielsweise aus Polyolen, Borsäure und/oder Borax in der Anmeldung WO 96/31589, die Kombination von Borsäure oder Borat, reduzierenden Salzen und Bernsteinsäure oder anderen Dicarbonsäuren in der Anmeldung EP 126 505 oder die Kombination von Borsäure oder Borat mit Polyolen oder Polyaminoverbindungen und mit reduzierenden Salzen, wie in der Anmeldung EP 080 223 offenbart. Die Wirkung von Peptid-Aldehyd-Stabilisatoren wird gemäß WO 98/13462 durch die Kombination mit Borsäure und/oder Borsäurederivaten und Polyolen gesteigert und gemäß WO 98/13459 durch die zusätzliche Verwendung von Calcium-Ionen noch weiter verstärkt.

Mittel mit stabilisierten Enzymaktivitäten stellen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Besonders bevorzugt sind solche mit Enzymen, die auf mehrere der dargestellten Weisen stabilisiert sind.

Da erfindungsgemäße Mittel in allen denkbaren Formen angeboten werden können, stellen erfindungsgemäße Enzyme, bzw. Proteine in allen bekannten und für die Zugabe zu den jeweiligen Mitteln zweckmäßigen Formulierungen jeweilige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Dazu gehören beispielsweise flüssige Formulierungen, feste Granulate oder Kapseln.

Die verkapselte Form bietet sich an, um die Enzyme vor anderen Bestandteilen, wie beispielsweise Bleichmitteln, zu schützen oder um eine kontrollierte Freisetzung (controlled release) zu ermöglichen. Je nach der Größe dieser Kapseln wird nach Milli- Mikro- und Nanokapseln unterschieden, wobei Mikrokapseln für Enzyme besonders bevorzugt sind. Solche Kapseln werden beispielsweise mit den Patentanmeldungen WO 97/24177 und DE 199 18 267 offenbart. Eine mögliche Verkapselungsmethode besteht darin, daß die Proteine, ausgehend von einer Mischung der Proteinlösung mit einer Lösung oder Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat, in dieser Substanz verkapselt werden. Ein solches Verkapselungsverfahren wird mit der deutschen Anmeldung DE 199 56 382 mit dem Titel "Verfahren zur Herstellung von mikroverkapselten Enzymen" beschrieben.

Im Fall fester Mittel können die Proteine beispielsweise in getrockneter, granulierter und/oder verkapselter Form eingesetzt werden. Sie können separat, d. h. als eigene Phase, oder mit anderen Bestandteilen zusammen in derselben Phase, mit oder ohne Kompaktierung zugesetzt werden. Sollen mikroverkapselte Enzyme in fester Form verarbeitet werden, so kann das Wasser mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aus den sich aus der Aufarbeitung ergebenden wäßrigen Lösungen entfernt werden, wie Sprühtrocknung, Abzentrifugieren oder durch Umsolubilisieren. Die auf diese Weise erhaltenen Teilchen haben üblicherweise eine Teilchengröße zwischen 50 und 200 µm.

Flüssigen, gelförmigen oder pastösen erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme, und auch das erfindungswesentliche Protein ausgehend von einer nach dem Stand der Technik durchgeführten Proteingewinnung und Präparation in konzentrierter wäßriger oder nichtwäßriger Lösung, Suspension oder Emulsion zugesetzt werden, aber auch in Gelform oder verkapselt oder als getrocknetes Pulver. Derartige erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe hergestellt, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können.

Neben der primären Waschleistung können die in Waschmitteln enthaltenen Proteasen ferner die Funktion erfüllen, andere enzymatische Bestandteile durch proteolytische Spaltung zu aktivieren oder nach entsprechender Einwirkzeit zu inaktivieren, so wie beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/29426 oder EP 747 471 offenbart worden ist. Vergleichbare regulatorische Funktionen sind auch über das erfindungsgemäße Enzym möglich. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind ferner solche Mittel mit Kapseln aus proteasesensitivem Material, welche beispielsweise von erfindungsgemäßen Proteinen zu einem beabsichtigten Zeitpunkt hydrolysiert werden und ihren Inhalt freisetzen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei anderen mehrphasigen Mitteln erzielt werden.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie allein oder neben anderen Inhaltsstoffen ein erfindungsgemäßes proteolytisches Enzym enthalten. Denn insbesondere natürliche Fasern, wie beispielsweise Wolle oder Seide, zeichnen sich durch eine charakteristische, mikroskopische Oberflächenstruktur aus. Diese kann, wie am Beispiel der Wolle im Artikel von R. Breier in Melliand Textilberichte vom 1.4.2000 (S. 263) ausgeführt worden ist, langfristig zu unerwünschten Effekten, wie etwa Verfilzung führen. Zur Vermeidung solcher Effekte werden die natürlichen Rohstoffe mit erfindunsgemäßen Mitteln behandelt, welche beispielsweise dazu beitragen, die auf Proteinstrukturen beruhende geschuppte Oberflächenstruktur zu glätten und damit einem Verfilzen entgegenwirken. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform stellen derartige Mittel für Wolle oder Seide dar.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Mittel mit einer erfindungsgemäßen Protease so konzipiert, daß es regelmäßig als Pflegemittel verwendet werden kann, beispielsweise indem es dem Waschprozeß zugesetzt, nach dem Waschen angewendet oder unabhängig von dem Waschen appliziert wird. Der gewünschte Effekt besteht darin, eine glatte Oberflächenstruktur des Textils zu erhalten und/oder Schädigungen des Gewebes vorzubeugen und/oder zu verringern.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes proteolytisches Enzym aktiv wird.

Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, daß in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder daß das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Reinigungsmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Das gleiche gilt für Verfahren zur maschinellen Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff feste Stoffe zusammengefaßt werden. Derartige Verfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um erfindungsgemäße Proteine bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.

Bevorzugt ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Enzyms in einer Menge von 0,35 mg bis 2 000 mg, besonders bevorzugt von 3 mg bis 1 500 mg pro Anwendung.

Da das erfindungsgemäße Enzym natürlicherweise bereits eine proteinauflösende Aktivität besitzt und diese auch in Medien entfaltet, die sonst keine Reinigungskraft besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, daß gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen als einzige reinigungsaktive Komponente das erfindungsgemäße Enzym aufgebracht wird. Dies stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes proteolytisches Enzym aktiv wird. Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich um Wolle oder wollhaltige Textilien oder um Seide oder seidenhaltige Textilien.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar. Denn erfindungsgemäße Enzyme können, insbesondere entsprechend den oben beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Um bevorzugte Ausführungsformen handelt es sich bei der Verwendung außerhalb eines maschinellen Verfahrens, beispielsweise bei der Handwäsche oder bei der manuellen Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln dar. Denn, wie bekannt ist, können Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. Diesen ansonster eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es aber auch möglich, daß durch Proteolyse eine andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt, wie dies beispielsweise in der Anmeldung WO 00/01831 offenbart worden ist. Ein anderes Beispiel für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle seiner Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird. Erfindungsgemäße Proteine werden somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur biochemischen oder molekularbiologischen Analyse, insbesondere im Rahmen eines enzymatischen Analyseverfahrens dar. Erfindungsgemäß und nach Römpp, "Lexikon Chemie" (Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag, 1999) wird unter der enzymatischen Analyse jede biochemische Analytik verstanden, die sich spezifischer Enzyme oder Substrate bedient, um einerseits Substrate in ihrer Identität oder ihrer Konzentration oder andererseits Enzyme in Identität oder Aktivität zu bestimmen. Anwendungsgebiete sind beispielsweise die klinische Chemie, Lebensmittelchemie, Molekularbiologie, Biotechnologie, Botanik, Mikrobiologie, Zoologie oder Pharmakologie.

Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung, insbesondere im Rahmen einer Sequenzanalyse dar. Diese wird eingesetzt, um Makromoleküle, insbesondere Proteine zu bestimmen. Sofern für eine solche Analyse eine Protease oder ein Fragment einer Protease verwendet wird, eignet sich dafür auch die erfindungsgemäße Protease. Dies ist insbesondere für die Analyse von Proteinsequenzen denkbar. Denn dafür werden die interessierenden Proteine im allgemeinen zunächst chemisch mit Proteasen gespalten, bevor die erhaltenen Fragmente einem weiteren Abbau, z. B. dem Edman-Abbau unterworfen werden.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen dar. So kann es im Verlauf der Aufreinigung von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen beispielsweise notwendig sein, diese von Proteinverunreinigungen zu befreien. Dabei kann es sich beispielweise um niedermolekulare Verbindungen, insbesondere mit pharmakologischer Bedeutung handeln, aber auch um alle anderen Zellinhalts- oder Speicherstoffe oder sogar um Proteine selbst handeln. Dies ist sowohl im Labormaßstab, als auch in großtechnischer Dimension, beispielsweise nach der fermentativen Herstellung eines Wertstoffes durchführbar.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen chemischen Verbindungen dar. Dies geschieht in Umkehrung der von ihnen natürlicherweise katalysierten Reaktion, beispielsweise dann, wenn Proteinfragmente miteinander verknüpft werden oder an eine nicht überwiegend aus Protein bestehende Verbindung Aminosäuren gebunden werden sollen. Derartige Verwendungsmöglichkeiten werden beispielsweise in der Anmeldung EP 380362 vorgestellt. Je nach Reaktionsbedingungen eignet sich für ein solches Verfahren eine alkalische Protease wie die der vorliegenden Erfindung.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen dar, wenn diese von Protein-Verunreinigungen befreit werden sollen. Hier sind nicht-mikrobiologisch zu erhaltende Rohstoffe, etwa aus der Landwirtschaft gemeint.

Eine bevorzugte Ausführungsform stellt die Verwendung zur Oberflächenbehandlung, und ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder dar. Dieses ist ein aufgrund seiner wirtschaftlichen Bedeutung besonders bevorzugter Rohstoff. So werden im Verlauf des Gerbverfahrens, inbesondere im Schritt der alkalischen Weiche (Römpp, "Lexikon Chemie", Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag, 1999) wasserlösliche Proteine mithilfe proteolytischer Enzyme, z. B. auch bakteriellen Ursprungs aus dem Hautmaterial herausgelöst. Hierfür eignen sich, insbesondere wenn alkalische Bedingungen herrschen, erfindungsgemäße Proteasen.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung dar. Dabei geht es in erster Linie um natürlicherweise mit ihnen verbundenen Proteine. Ein Beispiel dafür ist die Aufarbeitung von Baumwolle, die in einem als Schlichten bezeichneten Prozeß von den Kapselbestandteilen befreit werden muß; ein anderes die Behandlung von Wolle; ähnlich gestaltet sich auch die Verarbeitung von Rohseide. Enzymatische Verfahren sind vergleichbaren chemischen Verfahren besonders in ihrer Umweltverträglickeit überlegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäße Proteine dazu verwendet, um Schutzschichten von Textilien, insbesondere Zwischenprodukten oder Werkstoffen zu entfernen oder ihre Oberfläche zu glätten, bevor sie in einem nachfolgenden Verarbeitungsschritt weiterbearbeitet werden.

In jeweils besonders bevorzugten Ausführungsformen werden erfindungsgemäße Proteine zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, insbesondere zur Oberflächenbehandlung von Wolle oder Seide verwendet. Dies gilt sowohl für die Herstellung für derartige Textilien, als auch für die Pflege während des Gebrauchs, beispielsweise im Zusammenhang mit der Textilreinigung.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Behandlung von photographischen Filmen dar, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten. Denn mit solchen Schutzschichten, insbesondere solchen aus Silbersalz-haltigen Gelatin-Emulsionen werden Filme, wie beispielsweise Röntgenfilme beschichtet, welche nach der Belichtung vom Trägermaterial abgelöst werden müssen. Hierfür können insbesondere unter alkalischen Reaktionsbedingungen erfindungsgemäße Proteasen verwendet werden.

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Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln dar. So werden Proteasen schon von alters her zur Lebensmittelherstellung verwendet. Ein Beispiel dafür ist die Verwendung von Lab für den Reifungsprozeß von Käse oder anderen Milchprodukten. Solche Prozesse können um ein erfindungsgemäßes Protein bereichert oder vollständig von ihm durchgeführt werden. Auch kohlenhydratreiche Lebensmittel oder Lebensmittelrohstoffe für Nicht-Ernährungszwecke, wie beispielsweise Mehl oder Dextrin, können mit entsprechenden Proteasen behandelt werden, um sie von begleitenden Proteinen zu befreien. Auch für solche Anwendungen ist eine erfindungsgemäße Protease geeignet, insbesondere dann, wenn sie unter alkalischen Bedingungen durchgeführt werden sollen.

Entsprechendes gilt für die Futtermittelherstellung. Hier kann es neben einer vollständigen Befreiung von Proteinen auch von Interesse sein, die proteinhaltigen Ausgangsstoffe oder Stoffgemische mit Proteasen lediglich kurze Zeit zu behandeln, um sie für die Haustiere leichter verdaulich zu machen.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen kosmetische Mittel mit einem erfindungsgemäßen proteolytischen Enzym oder kosmetische Verfahren unter Einbeziehung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms oder die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zu kosmetischen Zwecken, insbesondere im Rahmen entsprechender Verfahren oder in entsprechenden Mitteln dar.

Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozeß der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venerol., Bd. 71 (1991), S. 471-474). Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen, beispielsweise gemäß der Anmeldungen WO 95/07688 oder WO 99/18219. Der Einsatz einer Subtilisin-Proteae für kosmetische Zwecke wird beispielsweise in WO 97/07770 beschrieben. Auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwikender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, eignen sich als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln.

Dementsprechend wird auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel ist in diesen Anspruch eingeschlossen.

Beispiele Beispiel 1 Klonierung der maturen Protease

Nach Standardmethoden präparierte chromosomale DNA aus B. alcalophilus (DSM 11233) diente als Matrize für die PCR-Amplifikation des Genfragments, das für die von ihm erhältliche Alkalische Protease codiert. Diese PCR erfolgte mit den Primern P1: 5'-GGC GCA ATC AGT GCC ATG GGG-3' und P2: 5'-CGT CTT CGC CGT TGT GCG ATT-3'. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in einen geeigneten Vektor kloniert (p- GEMTeasy®, Fa. Promega, Madison, Wisconsin, USA) und mehre unabhängige Isolate sequenziert. Die erhaltene DNA-Sequenz sowie die daraus abgeleitete Proteinsequenz sind im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1, beziehungsweise SEQ ID NO. 2 dargestellt.

Für die Expression dieser Protease wurde nach Standardmethoden die Fusion mit einer geeigneten Expressionskassette erzeugt, die Pomotor, Signal- und Propeptid einer Subtilisinprotease umfaßte, und in den Wirt Bacillus subtilis DB 104 zur Expression gebracht. Die in den Kulturüberstand sekretierte mature Protease wurde entweder direkt, das heißt im Kulturüberstand, oder nach ihrer Aufreinigung charakterisiert.

Beispiel 2 Kultivierung eines Protease-produzierenden Stamms

Der mit der in Beispiel 1 beschriebenen Expressionskassette für das erfindungsgemäße Protein transformierte Wirtstamm Bacillus subtilis DB 104 wurde in einem Medium, bestehend aus 10 g/l Casitone, 20 g/l, Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l, NaCl, 27 g/l, Natrium-Succinat und 2 g/l, Glucose in bidestilliertem Wasser kultiviert.

Beispiel 3 Gewinnung und Aufreinigung der Protease

Über folgende Aufreinigungsschritte wurde aus dem Kulturmedium einer 100 ml-Kultur eines nach den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Produktionsstamms ein singuläres Enzym erhalten: Dialyse des Überstands einer stationären Kultur gegen 20 mM HEPES/NaOH- Puffer, pH 7,8, Anionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose® (Fa. Pharmacia- Amersham Biotech, Schweden), Kationenaustauschchromatographie an S-Sepharose® (Fa. Pharmacia-Amersham) und erneute Dialyse gegen bidestilliertes Wasser.

Das proteolytische Enzym konnte 46fach mit einer Ausbeute von ca. 52% aufgereinigt werden, das heißt, aus 100 ml Kulturlösung wurden auf diese Weise 3,22 mg eines gemäß SDS-Gelektrophorese und Coomassie-Färbung reinen Proteins gewonnen.

Beispiel 4 SDS-Polyacrylgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung

Bei denaturierender SDS-Polyacrylgelelektrophorese im FAST®-System der Fa. Pharmacia-Amersham Biotech, Schweden, weist das proteolytische Enyzm aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) ein Molekulargewicht von 27 kD auf.

Gemäß isoelektrischer Fokussierung liegt der isoelektrische Punkt des proteolytischen Enyzms aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) oberhalb von 10.

Beispiel 5 Enzymatische Eigenschaften Aktivität

Die Aktivität des nach Beispiel 3 aufgreinigten erfindungsgemäßen Proteins wurden mit Casein als Substrat ermittelt. Bei 15minütiger Inkubation bei pH 11,5 und 50°C war die Protease maximal aktiv.

Mit dem Substrat Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid wurden als kinetische Parameter für K_M 0,67 mM, für V_max 9,2 µmol/(ml.min) und für K_cat 138 s^-1 ermittelt.

Temperatur-Abhängigkeit

Bei jeweils 15minütiger Inkubation bei pH 8,5 wurde bei Bestimmung mit Casein als Substrat das Temperaturoptimum der Protease-Aktivität aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) mit einem Wert von 50°C ermittelt. Im Bereich zwischen 50 und 65°C weist das Enzym 60% der maximalen Aktivität auf; ab 70°C fällt die Aktivität auf unter 20% des Werts von 50°C ab.

pH-Abhängigkeit

Das pH-Optimum des proteolytischen Enyzms aus Bacillus alcalophilus(DSM 11233) liegt bei Bestimmung mit Casein als Substrat bei 11,5. Bei pH 12 konnten nur noch 40% der maximalen Aktivität gemessen werden. Bei pH 8 konnten noch 50% der maximalen Aktivität bestimmt werden. Unterhalb von pH 6 war keine Aktivität meßbar.

Temperatur- und pH-Stabilität

Die pH- und Temperaturstabilität des Enzyms wurde noch einmal kombiniert bei 50°C und Inkubation in Glycin-NaOH-Puffer, pH 11, und bei 60°C und Inkubation in Glycin-NaOH- Puffer, pH 10, über verschiedene Zeiträume überprüft. Die Aktivität lag in beiden Fällen über einen Zeitraum von mehr als einer Stunde oberhalb von 50% des Maximalwertes von pH 11,5 und 50°C. Damit konnte noch einmal bestätigt werden, daß das proteolytische Enzym aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) gegenüber alkalischen pH- Werten und hohen Temperaturen bemerkenswert stabil ist.

Beispiel 6 Kompatibilität mit üblichen Inhaltsstoffen von Wasch- und Reinigungsmitteln

Die Eignung des erfindungsgemäßen Enzyms als aktive Komponente in Wasch- und Reinigungsmitteln wurde mit einem Stabilitätstest unter Waschbedingungen untersucht. Dafür wurde es über einen langen Zeitraum einer Waschlösung von 5 g Universalwaschmittel in 1 l destilliertem Wasser ausgesetzt. Das Mittel setzte sich folgendermaßen zusammen (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 4% lineares Alkylbenzolsulfonat, Na-Salz, 4% C₁₂-C₁₈-Fettalkoholsulfat, Na-Salz, 5,5% C₁₂-C₁₈- Fettalkohol mit 7 EO, 1% Natrium-Seife, 11% Natriumcarbonat, 2,5% amorphes Natriumdisilikat, 20% Natriumperborat-Tetrahydrat, 5,5% TAED, 25% Zeolith A, 4,5% Polycarboxylat, 0,5% Phosphonat, 2,5% Schauminhibitorgranulat, 5% Natriumsulfat, 1% Proteasegranulat, Rest: Wasser, optischer Aufheller, Parfüm, Salze.

Bei diesem Versuch zeigte sich erst nach mehreren Tagen eine Abnahme an proteolytischer Aktivität, und erst nach 6 Tagen ein vollständiger Aktivitätsverlust, während das Enzym bei Lagerung in Puffer seine enzymatische Aktivität lange auf hohem Niveau behielt.

Dieser Versuch belegt die Eignung des erfindungsgemäßen Enzyms als proteolytische Komponente eines Wasch- oder Reinigungsmittels. Denn bei erfindungsgemäßem Gebrauch braucht eine enzymatische Aktivität in der Waschflotte selten länger als eine Stunde anzuhalten, und während der Lagerung wirken in bevorzugten Ausführungsformen enzymhaltiger Mittel entsprechende Stabilisatoren einem Abbau der Enzyme entgegen.

Beispiel 7 Waschleistung

Zur Untersuchung der Waschleistung der erfindungsgemäßen Protease wurden Miniwaschversuche unternommen. Dafür wurde in drei parallelen Versuchsansätzen die Waschmittelgrundrezeptur des Beispiels 6, jedoch ohne Proteasegranulat in der Ausgangsmischung jeweils aktivitätsgleich mit den für Waschmittel optimierten Proteasen Savinase® (Hersteller: Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark), Alkalischer Protease aus Bacillus lentus gemäß Anspruch 2 der Patentanmeldung WO 92/21760 und der erfindungsgemäßen Protease versetzt.

Weiße Baumwolllappen wurden standardisiert mit den Anschmutzungen Blut, Milch und Tusche versehen und in Lösungen von jeweils 5 g der drei verschiedenen, mit den Proteasen versetzten Waschmitteln in 100 ml destilliertem Wasser bei 50°C unter vollständiger Benetzung geschwenkt. Nach 15, 30, 45 und 60 min wurden jeweils einzelne Lappen entnommen und photometrisch der erzielte Reinheitsgrad gemessen. Dafür wurde der Wert des absorbierten sichtbaren Lichts jeweils vor und nach dem Waschen bestimmt und beide Werte jeweils in Relation zueinander gesetzt. Daraus ergibt sich als Meßwert die Änderung der Farbmaßzahl (dF). Je stärker sich die auf die Anschmutzungen zurückzuführende Farbe gegenüber dem Ausgangswert ändert, desto besser ist die erzielte Waschleistung. Unterschiede zwischen den drei Meßreihen liefern die Beiträge der Proteasen zu den Waschleistungen der jeweiligen Mittel. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3

Vergleich der Waschleistungen der neu gefundenen Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) mit der aus Bacillus lentus und Savinase® in ansonsten übereinstimmenden Waschmittelrezepturen

Die Protease aus B. lentus zeigt eine eindeutige Waschleistung, doch sind ihre Werte zu allen Zeitpunkten die niedrigsten. Die Savinase® zeigt eine mit dem Zeitverlauf kontinuierlich steigende Waschleistung, die bis 30 min über der der erfindungsgemäßen Protease liegt. Ab 45 min führt jedoch diese zu den besten Waschleistungen. Ab einer Einwirkzeit von 45 min ist die Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) somit zwei bislang verwendeten Waschmittelproteasen in ihrer Waschleistung überlegen. Sie führt auch bei einer Einwirkzeit von 60 min zu dem absolut besten Ergebnis. Dies überrascht umso mehr, als es sich dabei um ein Wildtyp-Enzym handelt und nicht um eines wie Savinase®, das für diese spezielle Anwendung optimiert worden ist.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1: Alignment der Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) mit denen von zwei bekannten Enzymen; Zählung nach Savinase®.
Darin bedeuten:
BLAP: Alkalische Protease aus Bacillus lentus (US 5352604, WO 92/21760);
Savinase: Das Handelsprodukt Savinase® der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (WO 89/06279; Subtilisin 309);
Protease (DSM 11233): Das erfindungsgemäße proteolytische Enzym aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233).

Fig. 2: Alignment der Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) mit denen von drei bekannten Enzymen; Zählung nach BPN'.
Darin bedeuten:
BLAP: Alkalische Protease aus Bacillus lentus (US 5352604, WO 92/21760);
Savinase: Das Handelsprodukt Savinase® der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (WO 89/06279; Subtilisin 309);
Protease (DSM 11233): Das erfindungsgemäße proteolytische Enzym aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233);
BPN': Subtilisin BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens gemäß J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Vol. 11, S. 7911-7925, erhältlich unter der Eintragungsnummer X00165 bei der Datenbank des EMBL, in Cambridge, Großbritannien (http:/ /www.ebi.ac.uk).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Subtilisin-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß sie an der Position, die zu der Position 230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, den Aminosäurerest Valin aufweist und an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Glycin aufweist und an der Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Asparagin aufweist.

2. Subtilisin-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß sich an der Position, die zu der Position 230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Serin und Valin oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Prolin, Serin, Threonin und Tyrosin oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Isoleucin, Leucin, Lysin, Prolin, Serin und Threonin, oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet.

3. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 262 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

4. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 263 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

5. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 264 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

6. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 265 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

7. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 266 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

8. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 267 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

9. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 268 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter zwei, vorzugsweise drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.

10. Subtilisin-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, insbesondere in den für die proteolytische Aktivität verantwortlichen Bereichen.

11. Proteolytisches Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es in wenigstens einer, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der antigenen Determinanten, die die Positionen 224, 250 oder 253 umfassen, mit dem in SEQ ID NO. 2 bezeichneten Protein übereinstimmen.

12. Proteolytisch aktive Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvariante oder proteolytisch aktives Fragment eines der in den Ansprüchen 1 bis 11 bezeichneten Proteine, insbesondere solch ein Fragment oder solche eine Variante, bei der eine, vorzugsweise zwei, und besonders bevorzugt drei der die Positionen 224, 250 und 253 in der SEQ ID NO. 2 umfassenden Sequenzbereiche in einer Größe von 20, vorzugsweise 10, ganz besonders bevorzugt 5 Aminosäuren enthalten sind.

13. Proteolytisches Enzym oder Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich derivatisiert ist.

14. Proteolytisches Enzym, Fragment oder Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es natürlicherweise von einem biologischen Organismus, vorzugsweise von einem Mikroorganismus gebildet wird.

15. Proteolytisches Enzym, Fragment oder Derivat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium handelt.

16. Proteolytisches Enzym, Fragment oder Derivat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gram-positiven Bakterium um eines der Gattung Bacillus handelt.

17. Proteolytisches Enzym, Fragment oder Derivat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus alcalophilus (DSM 11233) handelt.

18. Nukleinsäure, die für eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine codiert.

19. Für eine Subtilisin-Protease codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz übereinstimmt, insbesondere in den für die proteolytische Aktivität des abgeleiteten Enzyms verantwortlichen Bereichen.

20. Vektor, der einen in den Ansprüchen 18 oder 19 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält und insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthält, der für eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine oder Derivate codiert.

21. Klonierungsvektor, der einen in den Ansprüchen 18 oder 19 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält und insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthält, der für eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine oder Derivate codiert.

22. Expressionsvektor, der einen in den Ansprüchen 18 oder 19 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält und insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthält, der für eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine oder Derivate codiert und dessen Biosynthese ermöglicht.

23. Zelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 22 enthält.

24. Wirtszelle, die eines der in Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine oder Derivate exprimiert oder zu dessen Expression angeregt werden kann, insbesondere unter Einsatz eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 22.

25. Wirtszelle gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Bakterium ist, insbesondere eines, das das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretiert.

26. Wirtszelle gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Bakterium der Gattung Bacillus, insbesondere der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus ist.

27. Wirtszelle gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine eukaryontische Zelle ist, insbesondere eine, die das gebildete Protein posttranslational modifiziert.

28. Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Enzyms oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 unter Verwendung einer Zelle, die dieses natürlicherweise bildet, insbesondere eine gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder unter Verwendung einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27 und/oder unter Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22 und/oder unter Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19.

29. Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein proteolytisches Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält.

30. Mittel nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich weitere Enzyme, insbesondere andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen und/oder Lipasen enthält.

31. Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, dadurch gekennzeichnet, daß es allein oder neben anderen aktiven Inhaltsstoffen ein proteolytisches Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält, insbesondere für natürliche Fasern und ganz besonders für Wolle oder Seide.

32. Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein proteolytisches Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 aktiv wird, vorzugsweise in einer Menge von 0,35 mg bis 2 000 mg, besonders bevorzugt von 3 mg bis 1 500 mg pro Anwendung.

33. Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein proteolytisches Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 aktiv wird, insbesondere für Wolle oder Seide.

34. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.

35. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln.

36. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur biochemischen oder molekularbiologischen Analyse, insbesondere im Rahmen eines enzymatischen Analyseverfahrens.

37. Verwendung nach Anspruch 36 zur Endgruppenbestimmung, insbesondere im Rahmen einer Sequenzanalyse.

38. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen.

39. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen.

40. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder.

41. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben.

42. Verwendung nach Anspruch 40 und/oder 41 zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, insbesondere zur Oberflächenbehandlung von Wolle oder Seide.

43. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten.

44. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.

45. Kosmetika mit einem proteolytischen Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder kosmetische Verfahren unter Einbeziehung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zu kosmetischen Zwecken, insbesondere im Rahmen entsprechender Verfahren oder in entsprechenden Mitteln.