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ES2368718T3 - Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones. - Google Patents

Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones. Download PDF

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ES2368718T3
ES2368718T3 ES05006461T ES05006461T ES2368718T3 ES 2368718 T3 ES2368718 T3 ES 2368718T3 ES 05006461 T ES05006461 T ES 05006461T ES 05006461 T ES05006461 T ES 05006461T ES 2368718 T3 ES2368718 T3 ES 2368718T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
subtilisin
protease
bacillus
variant
amino acid
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES05006461T
Other languages
English (en)
Inventor
Volker Schellenberger
James T. Kellis
Christian Paech
Joanne Nadherny
Donald P. Naki
Ayrookaran J. Poulose
Katherine D. Collier
Robert M. Caldwell
André C. BAECK
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Procter and Gamble Co
Danisco US Inc
Original Assignee
Procter and Gamble Co
Danisco US Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Una variante de proteasa-subtilisina 309 que comprende un conjunto de sustituciones seleccionado del grupo: V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; V68A/S103A/V104I/N140D/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; N43S/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; N43K/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; N43D/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/K237E/Q245R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252S; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V/R275H; V68A/S103A/V104I/G159D/T224A/A232V/Q236H/Q245R/L257V; G61E/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N43D/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S212P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/Q236H; 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V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/S256E; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/S256R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/T260R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/L257R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/G258D; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/N261R; V68A/S103A/V104I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245V/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A228V/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G61E/V68A/S103A/V104I/S130A/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G61E/S103A/V104I/A133V/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248G/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/N218S/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G20R/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/N76D/E89D/S103A/V104I/G159D/P210L/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G61E/V68A/S103A/V104I/G159D/S160V/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S3L/G61E/V68A/N76D/S103A/V104I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G61E/V68A/S103A/V104I/G159D/Y167F/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G97E/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S99E/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101E/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G102A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/S106E/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/Q109E/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/N261R; S103A/V104I/Q109R/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/N184D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/S166D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/L217E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G20R/N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/Q206R/L217E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/Q206R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/N184G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/V244T/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/V244A/Q245R/N248D/N252K; K27N/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; T38G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/S256R; Q12R/N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/N185D/Q206E/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/E2 71Q; S101G/S103A/V104I/G159D/N185D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/Q206E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/T213Q/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98L/G102A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/G102A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; Q12R/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98L/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G102A/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/Q109R/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/S130G/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S130G/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S128G/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S128L/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S101G/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/S128G/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/S128L/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/P131V/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98V/S101G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S99G/S101G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/Y209W/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/P210I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/V205I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/A230V/Q236H/Q245R; S101G/S103A/V104I/G159D/A194P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; and N76D/S101G/S103A/V104I/G159D/A194P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; en donde las posiciones de los restos aminoácidos corresponden a las posiciones pertinentes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

Description

Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones.
Antecedentes de la Invención
Las serina–proteasas son un subgrupo de carbonil–hidrolasas. Las mismas comprenden una clase diversa de enzimas que tienen una extensa gama de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R. Sci. Amer., 131: 74–88. A pesar de su diversidad funcional, la maquinaria catalítica de las serina–proteasas ha sido abordada por al menos dos familias de enzimas genéticamente distintas: 1) las subtilisinas y 2) las serina–proteasas de mamífero afines a la quimotripsina y serina–proteasas bacterianas homólogas (v.g., tripsina y S. gresius tripsina). Estas dos familias de serina–proteasas exhiben mecanismos de catálisis notablemente similares. Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem.,
46: 331–358. Adicionalmente, aunque la estructura primaria no está emparentada, la estructura terciaria de estas dos familias de enzimas reúne una tríada catalítica conservada de aminoácidos constituida por serina, histidina y aspartato.
Las subtilisinas son serina–proteasas (PM aprox. 27.500) que son secretadas en grandes cantidades por una gran diversidad de especies de Bacillus y otros microorganismos. La secuencia proteínica de la subtilisina ha sido determinada a partir de al menos nueve especies diferentes de Bacillus. Markland, F.S., et al. (1983), Hoppe– Seyler's Z., Physiol. Chem., 364: 1537–1540. La estructura cristalográfica tridimensional de las subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis y varias variantes naturales de B. lentus ha sido consignada. Estos estudios indican que aunque la subtilisina no está emparentada genéticamente con las serina–proteasas de mamífero, tiene una estructura de sitio activo similar. Las estructuras cristalinas de rayos X de inhibidores peptídicos unidos covalentemente que contienen subtilisina (Robertus, J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11: 2439–2449) o complejos de productos (Robertus. J.D., et al. (1976), J. Biol. Chem., 251: 1097–1103) han proporcionado también información concerniente al sitio activo y a la hendidura supuesta de unión al sustrato de la subtilisina. Adicionalmente, se ha llevado a cabo un gran número de mutagénesis cinéticas y químicas (Biol. Chem., 244: 5333– 5338) y orientadas extensas (Wells y Estell (1988) TIBS 13: 291–297).
La publicación internacional WO 91/00345 (Novo Nordisk A/S) describe subtilisina-proteasas mutadas, que tienen una carga electrostática neta, para usar en composiciones detergentes.
La publicación internacional WO 95/10615 (Genencor International, Inc.) describe variantes de subtilisina que tienen una pluralidad de sustituciones de aminoácidos, incluyendo en la posición 76 y en una o más de las posiciones 99, 101, 103, 104, 107, 123, 27, 105, 109, 126, 128, 135, 156, 166, 195, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260 y/o 274
Sumario de la Invención
La invención proporciona una variante de proteasa subtilisina 309 que comprende un conjunto de sustituciones que se seleccionan del grupo:
V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K;
V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R;
V68A/S103A/V104I/N140D/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K;
N43S/VN68A/S103AN104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K;
N43K/V68AS103AN104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R;
N43D/V68A/S103AN104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K;
V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V;
V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D;
V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/K237E/Q245R;
V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252S;
V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V/R275H;
V68A/S103A/V104I/G1159D/T224A/A232V/Q236H/Q245R/L257V;
G61E/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
N43D/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
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S103A/V104I/G159D/S166D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/L217E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G20R/N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/Q206R/L217E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/Q206R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/N184G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/V244T/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/V244A/Q245R/N248D/N252K; K27N/S103AN104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; T38G/S103AN104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/S256R; Q12R/N62D/S103A/V1041/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/N185D/Q206E/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N2 52K/E271Q; S101G/S103A/V04I/G159D/N185D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/Q206E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/T213Q/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98L/G102A/S1103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/G102A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; Q12R/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98L/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G102A/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/Q109R/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/S130G/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S130G/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S128G/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S128L/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S101G/S103A/V1041/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V1041/S128G/G1159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V1041/S128L/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/P131V/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98V/S101G/S103A/V1041/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S99G/S101G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/Y209W/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
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S101G/S103A/V104I/G159D/P210I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
S101G/S103A/V104I/G159D/V205I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
S101G/S103A/V104I/G159D/A230V/Q236H/Q245R;
S101G/S103A/V104I/G159D/A194P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; y
N76D/S101G/S103A/V104I/G159D/A194P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
en donde las posiciones de los residuos aminoácidos se corresponden con las posiciones pertienentes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
La invención también proporciona un método para producir una variante de la proteasa subtilisina de Bacillus que tiene un comportamiento frente al lavado mejor que un precursor de la proteasa subtilisina de Bacillus en al menos una formulación detergente y/o al menos en un grupo de condiciones de lavado, que comprende introducir en dicho presursor de la proteasa subtilisina de Bacillus un grupo de sustituciones como las descritas anteriormente.
La invención también proporciona un DNA que codifica una variante de proteasa como la descrita anteriormente, así como un vector de expresión que contiene dicha secuencia de DNA, y una célula huésped transformada con dicho vector de expresión, así como métodos para generar la misma.
La invención también proporciona una composición limpiadodra o una composición para tratar un tejido que comprende la variante de proteasa de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figs. 1 A–C representan la secuencia de DNA y de aminoácidos para la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gen.
La Fig. 2 representa los residuos de aminoácidos conservados entre las subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens (BPN') y Bacillus lentus (tipo salvaje).
Las Figs. 3A y 3B representan la secuencia de aminoácidos de cuatro subtilisinas. La línea superior representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de la subtilisina de Bacillus amynoliquefaciens (a la que se hace referencia también en ocasiones como subtilisina BPN'). La segunda línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus subtilis. La tercera línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de B. licheniformis. la cuarta línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus (a la que se hace referencia también como subtilisina 309 en el documento PCT WO89/06276). El símbolo * designa la ausencia de residuos de aminoácidos específicos en comparación con la subtilisina BPN'.
Descripción Detallada de la Invención
Las proteasas son carbonil–hidrolasas que actúan generalmente para escindir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Tal como se utiliza en esta memoria, "proteasa" significa una proteasa existente naturalmente o una proteasa recombinante.
En la presente invención se describen enzimas proteasa que son variantes de proteasa-subtilisina no naturales que tienen una diferente actividad proteolítica, estabilidad, especificidad de sustrato, perfil de pH y/o eficiencia característica en comparación con el precursor de proteasa-subtilisina del que se deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. Específicamente, tales variantes de proteasa tienen una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se deriva por sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una proteasa precursora con aminoácidos diferentes. La proteasa precursora puede ser una proteasa existente naturalmente o una proteasa recombinante.
A todo lo largo de esta solicitud se hace referencia a diversos aminoácidos por medio de los códigos comunes de una y de tres letras. Dichos códigos están identificados en Dale, M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Apéndice B.
Las variantes de proteasa útiles en esta memoria de derivan preferiblemente de una subtilisina de Bacillus, por ejemplo de la subtilisina de Bacillus lentus y/o subtilisina 309.
Las subtilisinas son proteasas bacterianas o fúngicas que actúan generalmente para escindir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Tal como se utiliza en esta memoria, "subtilisina" significa una subtilisina existente naturalmente o una subtilisina recombinante. Se conocen una serie de subtilisinas existentes naturalmente que son producidas y a menudo secretadas por diversas especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de esta serie no son totalmente homólogas. Sin embargo, las subtilisinas de esta serie exhiben el mismo tipo o un tipo similar de actividad proteolítica. Esta clase de serina–proteasas comparte una secuencia de aminoácidos común que define una tríada catalítica que distingue las mismas de la clase de serina–proteasas afines
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a la quimotripsina. Las subtilisinas y las serina–proteasas afines a la quimotripsina tienen ambas una tríada catalítica que comprende aspartato, histidina y serina. En las proteasas afines a la subtilisina, el orden relativo a estos aminoácidos, leyendo desde el término amino al término carboxi, es aspartato–histidina–serina. En cambio, en las proteasas afines a la quimotripsina, el orden relativo es histidina–aspartato–serina. Por ello, se hace referencia en esta memoria a la subtilisina como una serina–proteasa que tiene la tríada catalítica de las proteasas afines a la subtilisina. Ejemplos incluyen, pero sin carácter limitante, las subtilisinas identificadas en la Fig. 3 de esta memoria. Generalmente y para los propósitos de la presente invención, la numeración de los aminoácidos en las proteasas corresponde a los números asignados en la secuencia de la subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens presentada en la Fig. 1.
Las expresiones "subtilisina recombinante" o "proteasa recombinante" hacen referencia a una subtilisina o proteasa en la cual la secuencia de DNA que codifica la subtilisina o proteasa está modificada para producir una secuencia variante (o mutante) de DNA que codifica la sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos existente naturalmente. Métodos adecuados para producir dicha modificación, y que pueden combinarse con los expuestos en esta memoria, incluyen los expuestos en la Patente U.S. RE 24.606; la Patente U.S. 5.204.015 y la Patente U.S. 5.185.258, la Patente U.S. 5.700.676; la Patente U.S. 5.801.038, y la Patente U.S. 5.763.257.
Una "variante de proteasa" tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de aminoácidos de una "proteasa precursora". Las proteasas precursoras incluyen proteasas existentes naturalmente y proteasas recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa se "deriva" de la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora por la sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Dicha modificación es de la "secuencia de DNA precursora" que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora en lugar de la manipulación de la enzima proteasa precursora per se. Métodos adecuados para dicha manipulación de la secuencia de DNA precursora incluyen métodos descritos en esta memoria, así como métodos conocidos por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos EP 0 328299, WO89/06279 y las Patentes y Solicitudes de los EE.UU. a las que ya se ha hecho referencia en esta memoria).
Los números de posiciones de aminoácidos se refieren a los asignados a la secuencia de subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens presentada en Fig. 1. La invención, sin embargo, no está limitada a la mutación de esta subtilisina particular sino que se extiende a proteasas precursoras que contienen residuos de aminoácidos en posiciones que son "equivalentes" a los residuos particulares identificados en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. En una realización preferida de la presente invención, la proteasa precursora es subtilisina de Bacillus lentus y las sustituciones se hacen en las posiciones de residuo de aminoácidos equivalentes en B. lentus correspondientes a las arriba enumeradas.
Una posición de residuo (aminoácido) de una proteasa precursora es equivalente a un residuo de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens si la misma es homóloga (es decir, correspondiente en posición en la estructura primaria
o terciaria) o análoga a un residuo o porción específico(a) de dicho residuo en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (es decir, que tiene la misma o similar capacidad funcional para combinarse, reaccionar, o interaccionar químicamente).
A fin de establecer homología con la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una proteasa precursora se compara directamente con la secuencia primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y particularmente con una serie de residuos que se sabe son invariantes en subtilisinas para las cuales se conoce la secuencia. Por ejemplo, la Fig. 2 de esta memoria muestra los residuos conservados entre subtilisina de B. amyloliquefaciens y B. lentus. Después de la alineación de los residuos conservados, permitiendo las inserciones y deleciones necesarias a fin de mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de residuos conservados por deleción e inserción arbitrarias), se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. La alineación de los residuos conservados debería conservar preferiblemente el 100% de dichos residuos. Sin embargo, la alineación de más de 75% o de una proporción tan pequeña como 50% de residuos conservados es también adecuada para definir residuos equivalentes. La conservación de la tríada catalítica, Asp32/His64/Ser221 debería mantenerse. Siezen et al. (1991) Protein Eng. 4(7): 719–737 muestra la alineación de un gran número de serina–proteasas. Siezen et al. hacen referencia a la agrupación como subtilasas o serina–proteasas semejantes a subtilisina.
Por ejemplo, en Fig. 3, la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ( carlsbergensis) y Bacillus lentus están alineadas para proporcionar la cantidad máxima de homología entre las secuencias de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que hay varios residuos conservados contenidos en cada secuencia. Estos residuos conservados (como entre BPN' y B. lentus) se identifican en Fig. 2.
Estos residuos conservados, por tanto, pueden ser utilizados para definir los residuos de aminoácidos equivalentes correspondientes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en otras subtilisinas tales como subtilisina de Bacillus lentus (publicación PCT No. WO89/06279 publicada el 13 de julio de 1989), la enzima precursora de proteasas preferida en esta memoria, o la subtilisina a la que se hace referencia como P892 (EP 0 328 299), que es
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altamente homóloga a la subtilisina preferida de Bacillus lentus. Las secuencias de aminoácidos de ciertas de estas subtilisinas se alinean en las Figs. 3A y 3B con la secuencia de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para producir la homología máxima de residuos conservados. Como se puede ver, existen varias deleciones en la secuencia de Bacillus lentus en comparación con la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Así, por ejemplo, el aminoácido equivalente para Val165 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en las otras subtilisinas es isoleucina para B. lentus y B. licheniformis.
Pueden definirse también "residuos equivalentes" por determinación de homología al nivel de la estructura terciaria para una proteasa precursora cuya estructura terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se definen como aquéllos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácido particular de la proteasa precursora y la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C y O sobre O) están dentro de 0,13 nm y preferiblemente 0,1 nm después de la alineación. La alineación se consigue después que se ha orientado y posicionado el modelo óptimo para dar la superposición máxima de coordenadas atómicas de los átomos de las proteínas distintos de hidrógeno de la proteasa en cuestión a la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. El modelo óptimo es el modelo cristalográfico que da el factor R mínimo para datos de difracción experimentales a la resolución más alta posible.
Los residuos equivalentes que son funcionalmente análogos a un residuo específico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se definen como aquellos aminoácidos de la proteasa precursora que pueden adoptar una conformación tal que los mismos alteran, modifican o contribuyen a la estructura de la proteína, la fijación de sustrato
o la catálisis de una manera definida y atribuida a un sitio específico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Adicionalmente, los mismos son aquellos residuos de la proteasa precursora (para la cual se ha obtenido una estructura terciaria por cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga en tal grado que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo dado pueden no satisfacer los criterios de equivalencia sobre la base de ocupación de una posición homóloga, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo están dentro de 0,13 nm de los átomos correspondientes de la cadena lateral de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Las coordenadas de la estructura tri–dimensional de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se exponen en la Publicación EPO No. 0 251 446 (equivalente a la Patente U.S. 5.182.204, cuya descripción se incorpora en esta memoria por referencia) y pueden utilizarse como se ha reseñado anteriormente para determinar residuos equivalentes al nivel de la estructura terciaria.
Algunos de los residuos identificados para sustitución son residuos conservados, mientras que otros no lo son. El caso de los residuos que no se conservan, la sustitución de uno o más aminoácidos está limitada a sustituciones que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a una encontrada en la naturaleza. En el caso de los residuos conservados, dichas sustituciones no deben dar como resultado una secuencia existente naturalmente. Las variantes de proteasa de la presente invención incluyen las formas maduras de variantes de proteasa, así como las formas pro y prepro de tales variantes de proteasa. Las formas prepro son la construcción preferida, dado que esto facilita la expresión, secreción y maduración de las variantes de proteasa.
"Prosecuencia" hace referencia a una secuencia de aminoácidos unida a la porción N–terminal de la forma madura de una proteasa que, cuando se separa, da como resultado la aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas proteolíticas se encuentran en la naturaleza como productos proenzímicos de traducción y, en ausencia de procesamiento post–traduccional, se expresan de esta manera. Una prosecuencia preferida para producción de variantes de proteasa es la prosecuencia supuesta de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, aunque pueden utilizarse otras prosecuencias de proteasa.
Una "secuencia señal" o "presecuencia" hace referencia a cualquier secuencia de aminoácidos unida a la porción N– terminal de una proteasa o a la porción N–terminal de una proproteasa que puede participar en la secreción de las formas madura o pro de la proteasa. Esta definición de secuencia señal es una definición funcional, que pretende incluir todas aquellas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N–terminal del gen de proteasa que participan en la realización de la secreción de proteasa en condiciones nativas. La presente invención utiliza dichas secuencias para efectuar la secreción de las variantes de proteasa como se definen en esta memoria. Una secuencia señal posible comprende los siete primeros residuos de aminoácidos de la secuencia señal de la subtilisina de Bacillus subtilis condensados al resto de la secuencia señal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).
Una forma "prepro" de una variante de proteasa está constituida por la forma madura de la proteasa que tiene una prosecuencia enlazada operativamente al término amino de la proteasa y una secuencia "pre" o "señal" enlazada operativamente al término amino de la prosecuencia.
"Vector de expresión" hace referencia a una construcción de DNA que contiene una secuencia de DNA que está enlazada operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de dicho DNA en un hospedador adecuado. Tales secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una
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secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de fijación de ribosoma de mRNA adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente una inserción genómica potencial. Una vez transformado en un hospedador adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma hospedador, o puede, en algunos casos, integrarse en el genoma propiamente dicho. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se utilizan en ocasiones de modo intercambiable dado que el plásmido es la forma utilizada más comúnmente de vector en la actualidad. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir tales otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que se conocen en la técnica, o puedan llegar a conocerse.
Las "células hospedadoras" utilizadas en la presente invención son generalmente hospedadores procariotas o eucariotas que se han manipulado preferiblemente por los métodos descritos en la Patente U.S. RE 34.606 para hacerlos incapaces de secretar endoproteasa enzimáticamente activa. Una célula hospedadora preferida para expresión de proteasa es la cepa de Bacillus BG2036 que es deficiente en proteasa neutra enzimáticamente activa y proteasa alcalina (subtilisina). La construcción de la cepa BG2036 se describe en detalle en la Patente U.S.
5.264.366. Otras células hospedadoras para la expresión de proteasa incluyen Bacillus subtilis I168 (descrito también en la Patente U.S. RE 34.606 y la Patente U.S. 5.264.366, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria por referencia), así como cualquier cepa adecuada de Bacillus tal como B. licheniformis, B. lentus, etc.
Las células hospedadoras se transforman o transfectan con vectores construidos utilizando técnicas de DNA recombinante. Tales células hospedadoras transformadas son capaces de replicar vectores que codifican las variantes de proteasa o expresar la variante de proteasa deseada. En el caso de vectores que codifican la forma pre
o prepro de la variante de proteasa, dichas variantes, cuando se expresan, son secretadas típicamente por la célula hospedadora al medio de la célula hospedadora.
"Enlazado operativamente", cuando describe la relación entre dos regiones de DNA, significa simplemente que las mismas son afines funcionalmente una a otra. Por ejemplo, una presecuencia está enlazada operativamente a un péptido si la misma funciona como una secuencia señal, participando en la secreción de la forma madura de la proteína que implica más probablemente la escisión de la secuencia señal. Un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el mismo controla la transcripción de la secuencia; un sitio de fijación de ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el mismo está posicionado de tal modo que permite la traducción.
Los genes que codifican la proteasa precursora existente naturalmente se pueden obtener de acuerdo con los métodos generales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos comprenden generalmente la síntesis de sondas marcadas que tienen secuencias supuestas que codifican regiones de la proteasa de interés, preparación de genotecas genómicas a partir de organismos que expresan la proteasa, y escrutinio de las genotecas respecto al gen de interés por hibridación a las sondas. Los clones que se hibridan positivamente se mapean y secuencian seguidamente.
La proteasa clonada se utiliza luego para transformar una célula hospedadora a fin de expresar la proteasa. El gen de proteasa se liga luego a un plásmido de alto número de copias. Este plásmido se replica en hospedadores en el sentido de que contiene los elementos bien conocidos necesarios para replicación del plásmido, un promotor enlazado operativamente al gen en cuestión (que puede ser suministrado como el propio promotor homólogo del gen si el mismo es reconocido, es decir transcrito, por el hospedador), una región de terminación de la transcripción y poliadenilación (necesaria para estabilidad del mRNA transcrito por el hospedador a partir de gen de proteasa en ciertas células hospedadoras eucariotas) que es exógena o es suministrada por la región terminadora endógena del gen de proteasa y, deseablemente, un gen de selección tal como un gen de resistencia a antibióticos que permite el mantenimiento continuo en cultivo de células hospedadoras infectadas con el plásmido por crecimiento en medios que contienen antibiótico. Los plásmidos de número de copias alto contienen también un origen de replicación para el hospedador, permitiendo con ello que se generen grandes números de plásmidos en el citoplasma sin limitaciones cromosómicas. No obstante, está dentro del alcance de esta invención la integración de copias múltiples del gen de proteasa en el genoma hospedador. Esto es facilitado por organismos procariotas y eucariotas que son particularmente susceptibles de recombinación homóloga.
El gen puede ser un gen natural de B. lentus. Alternativamente, puede producirse un gen sintético que codifica una proteasa precursora existente naturalmente o mutante. En un enfoque de este tipo, se determina la secuencia de DNA y/o de aminoácidos de la proteasa precursora. Después de ello se sintetizan fragmentos múltiples y solapantes de DNA sintético monocatenario que, después de hibridación y ligación, producen un DNA sintético que codifica la proteasa precursora. Un ejemplo de construcción de un gen sintético se expone en el Ejemplo 3 de la Patente U.S.
5.204.015.
Una vez que el gen de la proteasa precursora existente naturalmente o sintético ha sido clonado, se realizan varias modificaciones para incrementar el uso del gen más allá de la síntesis de la proteasa precursora existente naturalmente. Tales modificaciones incluyen la producción de proteasas recombinantes como se expone en la Patente U.S. RE 34.606 y la Publicación EPO No. 0 251 446, y la producción de variantes de proteasas descritas en esta memoria.
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El método siguiente de mutagénesis de casete puede utilizarse para facilitar la construcción de las variantes de proteasa de la presente invención, aunque pueden utilizarse otros métodos. En primer lugar, el gen existente naturalmente que codifica la proteasa se obtiene y se secuencia total o parcialmente. Después de ello, se escanea la secuencia en busca de un punto en el cual se desee hacer una mutación (deleción, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Las secuencias que flanquean este punto se evalúan en cuanto a la presencia de sitios de restricción para reemplazar un segmento corto del gen con una agrupación de oligonucleótidos que, una vez expresada, codificará diversos mutantes. Tales sitios de restricción son preferiblemente sitios singulares dentro del gen de la proteasa a fin de facilitar el reemplazamiento del segmento de gen. Sin embargo, puede utilizarse cualquier sitio de restricción conveniente que no sea demasiado redundante en el gen de proteasa, con tal que los fragmentos de gen generados por digestión de restricción puedan reensamblarse en la secuencia apropiada. Sí no están presentes sitios de restricción en localizaciones situadas dentro de una distancia conveniente del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), tales sitios se generan por sustitución de nucleótidos en el gen de tal manera que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados se cambien en la condición final. La mutación del gen a fin de cambiar su secuencia para conformarse a la secuencia deseada se realiza por extensión con el iniciador M13 de acuerdo con métodos conocidos generalmente. La tarea de localización de regiones flanqueantes adecuadas y evaluación de los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitio de restricción convenientes se hace rutinaria por la redundancia del código genético, un mapa de enzimas de restricción del gen y el gran número de enzimas de restricción diferentes. Obsérvese que si está disponible un sitio de restricción flanqueante conveniente, el método anterior precisa ser utilizado solamente en conexión con la región flanqueante que no contiene un sitio.
Una vez que se ha clonado el DNA existente naturalmente o DNA sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones a mutar se digieren con las enzimas de restricción cognadas y se ligan al gen una pluralidad de casetes de oligonucleótidos complementarias de los términos extremos. Por este método se simplifica la mutagénesis, dado que todos los oligonucleótidos pueden sintetizarse de tal modo que tengan los mismos sitios de restricción, y no son necesarios enlazadores sintéticos en ningún caso para crear los sitios de restricción.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "actividad proteolítica" se define como la tasa de hidrólisis de enlaces peptídicos por miligramo de enzima activa. Existen muchos procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica (K.M. Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter, compilador, 1988). Además de o como alternativa a la actividad proteolítica modificada, las enzimas variantes de la presente invención pueden tener otras propiedades modificadas tales como Km, kcat, relación kcat/Km y/o especificidad de sustrato modificada y/o perfil de actividad de pH modificado. Estas enzimas pueden adaptarse para el sustrato particular cuya presencia se anticipa, por ejemplo, en la preparación de péptidos o para procesos hidrolíticos tales como usos de colada.
En un aspecto de la invención, el objetivo es asegurar una proteasa variante que tiene una eficiencia de lavado alterada, preferiblemente mejorada en comparación con una proteasa precursora en al menos una formulación de detergente y/o en al menos una serie de condiciones de lavado.
Existen una diversidad de condiciones de lavado que incluyen formulaciones detergentes variables, volumen de agua de lavado, temperatura de agua de lavado, y duración del tiempo de lavado a las que podría estar expuesta una variante de proteasa. Por ejemplo, las formulaciones detergentes utilizadas en diferentes áreas tienen concentraciones diferentes de sus componentes relevantes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, un detergente europeo tiene por regla general aproximadamente 4500–5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado, mientras que un detergente japonés tiene por regla general aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. En Norteamérica, particularmente en los Estados Unidos, un detergente tiene por lo general aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.
Un sistema de baja concentración de detergente incluye detergentes en los cuales están presentes menos de aproximadamente 800 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses se consideran típicamente sistemas de baja concentración de detergente, dado que los mismos tienen aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.
Una concentración media de detergente incluye detergentes en los cuales están presentes entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Los detergentes de Norteamérica están considerados generalmente como sistemas de concentración media de detergente, dado que los mismos tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Brasil tiene por regla general aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.
Un sistema de alta concentración de detergente incluye detergentes en los cuales están presentes más de aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Los detergentes europeos se consideran generalmente como sistemas de alta concentración de detergente, dado que los mismos tienen aproximadamente 4500–5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.
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Los detergentes de Latinoamérica son generalmente detergentes mejoradores de fosfatos con altas jabonaduras, y la gama de detergentes utilizada en Latinoamérica puede caer tanto en las concentraciones de detergente media como alta, dado que los mismos están comprendidos entre 1500 ppm y 6000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.
Como se ha mencionado arriba, Brasil tiene como valor típico aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras geografías de detergentes mejoradores de fosfato con altas jabonaduras, no limitadas a otros países de Latinoamérica, pueden tener sistemas de alta concentración de detergente hasta aproximadamente 6000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.
A la vista de lo que antecede, es evidente que las concentraciones de composiciones detergentes en las soluciones típicas de lavado (en todo el mundo) varían desde menos de aproximadamente 800 ppm de composición detergente ("geografías de baja concentración de detergente"), por ejemplo aproximadamente 667 ppm en Japón, hasta entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm ("geografías de concentración media de detergente"), por ejemplo aproximadamente 975 ppm en U.S. y aproximadamente 1500 ppm en Brasil, hasta más de aproximadamente 2000 ppm ("geografías de alta concentración de detergente"), por ejemplo aproximadamente 4500 ppm a aproximadamente 5000 ppm en Europa y aproximadamente 6000 ppm en las geografías que emplean mejoradores de fosfato con altas jabonaduras.
Las concentraciones de las soluciones típicas de lavado se determinan empíricamente. Por ejemplo, en los EE.UU., una máquina lavadora típica contiene un volumen de aproximadamente 64,4 l de solución de lavado. De acuerdo con ello, para obtener una concentración de aproximadamente 975 ppm de detergente en la solución de lavado tienen que añadirse aproximadamente 62,79 g de composición detergente a los 64,4 l de solución de lavado. Esta cantidad es la cantidad típica medida en el agua de lavado por el usuario que utiliza la copa de medida provista con el detergente.
Como ejemplo adicional, diferentes geografías utilizan diferentes temperaturas de lavado. La temperatura del agua de lavado en Japón es típicamente menor que la utilizada en Europa.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención incluye una variante de proteasa que exhibe una eficiencia de lavado mejorada en al menos una serie de condiciones de lavado.
Las variantes de proteasa de la invención pueden ser útiles en la formulación de diversas composiciones detergentes de formulaciones para cuidado personal tales como champúes o lociones. Varios compuestos conocidos son agentes tensioactivos adecuados útiles en composiciones que comprenden los mutantes de proteasa de la invención. Éstos incluyen detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, o de ion dipolar, como se describe en los documentos U.S. 4.404.128 concedido a Barry J. Anderson y U.S. 4.261.868 concedido a Jirl Flora, et al. Una formulación detergente adecuada es la descrita en el Ejemplo 7 de la Patente U.S. 5.204.015. La técnica está familiarizada con las diferentes formulaciones que pueden utilizarse como composiciones de limpieza. Además de composiciones de limpieza típicas, se comprende fácilmente que las variantes de proteasa de la presente invención pueden utilizarse para cualquier propósito para el que se utilicen proteasas nativas o de tipo salvaje. Así, estas variantes pueden utilizarse, por ejemplo, en aplicaciones de jabón en barra o líquido, formulaciones para cuidado de vajillas, soluciones o productos para limpieza de lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de residuos, aplicaciones textiles, como enzimas de fusión–escisión en la producción de proteínas, etc. Las variantes de la presente invención pueden comprender eficiencia mejorada en una composición detergente (en comparación con el precursor). Tal como se utiliza en esta memoria, la eficiencia mejorada en un detergente se define como el aumento de limpieza de ciertas manchas sensibles a enzimas tales como grasa o sangre, tal como se determina por evaluación visual después de un ciclo de lavado estándar.
Las proteasas de la invención pueden formularse en detergentes conocidos en polvo y líquidos que tienen pH comprendido entre 6,5 y 12,0 a niveles de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5% (preferiblemente 0,1% a 0,5%) en peso. Estas composiciones detergentes de limpieza pueden incluir también otras enzimas tales como proteasas, amilasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas conocidas, así como mejoradores y estabilizadores.
La adición de las proteasas de la invención a composiciones de limpieza convencionales no crea ninguna limitación especial de uso. Dicho de otro modo, cualesquiera temperaturas y pH adecuados para el detergente son adecuados también para las presentes composiciones con tal que el pH esté dentro del intervalo arriba indicado, y la temperatura sea inferior a la temperatura descrita de desnaturalización de la proteasa. Adicionalmente, las proteasas de la invención pueden utilizarse en una composición de limpieza sin detergentes, sea nuevamente solas o en combinación con mejoradores y estabilizadores.
La presente invención se refiere también a composiciones de limpieza que contienen las variantes de proteasa de la invención. Las composiciones de limpieza pueden contener además aditivos que se utilizan comúnmente en composiciones de limpieza. Éstos pueden seleccionarse, pero sin carácter limitante, de blanqueantes, agentes tensioactivos, mejoradores, enzimas y catalizadores de blanqueo. Resultaría fácilmente evidente para una persona con experiencia ordinaria en la técnica qué aditivos son adecuados para inclusión en las composiciones. La lista proporcionada en esta memoria no es en modo alguno exhaustiva y debería tomarse solamente como ejemplos de
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aditivos adecuados. Será también inmediatamente evidente para una persona con experiencia ordinaria en la técnica utilizar sólo aquellos aditivos que son compatibles con las enzimas y otros componentes de la composición, por ejemplo, agentes tensioactivos.
Cuando está presente, la cantidad de aditivo presente en la composición de limpieza es de aproximadamente 0,01% 5 a aproximadamente 99,9%, con preferencia aproximadamente 1% a aproximadamente 95%, y de modo más preferible aproximadamente 1% a aproximadamente 80%.
Las proteasas variantes de la presente invención pueden incluirse en piensos para animales, tales como parte de aditivos para piensos animales como se describe, por ejemplo, en los documentos U.S. 5.612.055; U.S. 5.314.692; y
U.S. 5.147.642.
10 Un aspecto de la invención es una composición para el tratamiento de un producto textil que incluye proteasas variantes de la presente invención. La composición puede utilizarse para tratar por ejemplo seda o lana como se describe en publicaciones tales como RD 216.034; EP 134.267; U.S. 4.533.359; y EP 344.259.
Lo que sigue se presenta a modo de ejemplo y no debe interpretarse como limitación del alcance de las reivindicaciones.
15 Ejemplo 1
Se produjeron y purificaron un gran número de variantes de proteasa utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Todas las mutaciones se realizaron en subtilisina GG36 de Bacillus lentus. Las variantes se muestran en la Tabla 1. Las variantes incluyen las que son según la invención, como se define en las reivindicaciones, y las que se proporcionan para comparar.
TABLA 1
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Ejemplo 2
Un gran número de las variantes de proteasas producidas en el Ejemplo 1 se ensayaron respecto a eficiencia en dos tipos de detergente y condiciones de lavado utilizando un ensayo de micromuestras descrito en "An improved 5 method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition", documento U.S. No. de Serie 60/068.796.
La Tabla 2 enumera las proteasas variantes ensayadas y los resultados de los ensayos en dos detergentes diferentes. Para la columna A, el detergente era 0,67 g/l de Ariel Ultra filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 51,4 mg/l de dureza mixta Ca2+/Mg2+, y se utilizaron 0,3 ppm de enzima en
10 cada pocillo a 20ºC. Para la columna B, el detergente era 3,38 g/l de Ariel Futur filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 256,8 mg/l de dureza mixta ca2+/Mg2+, y se utilizaron 0,3 ppm de enzima en cada pocillo a 40ºC.
TABLA 2
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Ejemplo 3
La Tabla 3 enumera las proteasas variantes ensayadas del Ejemplo 1 y los resultados de los ensayos en cuatro detergentes diferentes. Se realizaron los mismos ensayos de eficiencia que en el Ejemplo 2 sobre las proteasas 5 variantes indicadas con los detergentes siguientes. Para la columna A, el detergente era 0,67 g/l de Ariel Ultra filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 51,4 mg/l de dureza mixta ca2+/Mg2+, y se utilizaron 0,3 ppm de enzimas en cada pocillo a 20ºC. Para la columna B, el detergente era 3,38 g/l de Ariel Futur filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 256,8 mg/l de dureza mixta Ca2+/Mg2+, y se utilizaron 0,3 ppm de enzima en cada pocillo a 40ºC. Para la columna C, se utilizaron
10 3,5 g/l de detergente HSP1 (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 137,0 mg/l de dureza mixta Ca2+/Mg2+, y 0,3 ppm de enzima en cada pocillo a 20ºC. Para la columna D, se utilizaron 1,5 ml/l de detergente Tide KT (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 51,4 mg/l de dureza mixta Ca2+/Mg2+, y 0,3 ppm de enzima en cada pocillo a 20ºC.
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Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una variante de proteasa-subtilisina 309 que comprende un conjunto de sustituciones seleccionado del grupo: V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; V68A/S103A/V104I/N140D/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; N43S/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; N43K/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; N43D/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/K237E/Q245R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252S; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V/R275H; V68A/S103A/V104I/G159D/T224A/A232V/Q236H/Q245R/L257V; G61E/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N43D/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S212P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/E271V; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/L217I/Q236H/E271V; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236R; V68A/L75R/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/A114V/V121I/G159D/Q236H/Q245R; Q12R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Y209S/Q236H/T253K; V68A/N76D/S103A/V104I/N117K/G159D/N184S/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245L; V68A/N76D/S103A/V104I/N123S/G159D/Q236H/H249Y; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/H249Q; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R/N261D; V68A/N76D/S103A/V104I/S141N/G159D/Q236H/Q245R/T255S; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R/R247H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A174V/N204D/Q236H/Q245R;
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    V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/N204D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/A133V/G159D/N218D/Q236H/Q245R: V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A194I/V203A/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/P210R/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V; N76D/S103A/V104I/A232V/Q236H/Q245R/L257V; N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Y209W/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/G211R/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/G211V/A232V/Q236H/Q245R; Q12R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Y214L/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A215R/A232V/Q236H/Q245R; Q12R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; G20R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/S259G; V68A/N76D/S87R/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/T260V; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N261G; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N261W; N76D/S103A/V104I/A232V/Q236H/S242P/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/P210L/A232V/Q236H/Q245R; Q12R/A48V/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; N76D/S103A/V104I/A232V/Q236H/Q245R; N76D/S103A/V104I/G159D/Y192F/A232V/Q236H/Q245R; N76D/S103A/V104I/V147I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248S/K251R; Q12R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/A272S; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/N183K/Q206L/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/S256R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q206R/A232V/Q236H/Q245R; K27R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/N116T/G159D/R170S/N185S/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/Y209W/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/Q109R/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G20R/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/Y209F/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
    ES 2 368 718 T3
    V68A/S103A/V104I/G159D/N185D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/P210R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/N185D/P210L/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/P210L/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S212C/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S212E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/T213E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/T213S/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/A103V/V104I/G159D/T213E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A215V/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A215R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S216T/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S216V/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S216C/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/N173D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/Q206R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252F; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252L; P55S/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252F; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/T255V; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/S256N; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/S256E; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/S256R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/T260R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/L257R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/G258D; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/N261R; V68A/S103A/V104I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245V/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A228V/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G61E/V68A/S103A/V104I/S130A/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G61E/S103A/V104I/A133V/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248G/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/N218S/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G20R/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
    ES 2 368 718 T3
    V68A/N76D/E89D/S103A/V104I/G159D/P210L/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G61E/V68A/S103A/V104I/G159D/S160V/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S3L/G61E/V68A/N76D/S103A/V104I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G61E/V68A/S103A/V104I/G159D/Y167F/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G97E/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S99E/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101E/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G102A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/S106E/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/Q109E/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/N261R; S103A/V104I/Q109R/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/N184D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/S166D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/L217E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G20R/N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/Q206R/L217E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/Q206R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/N184G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/V244T/Q245R/N248D/N252K; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/V244A/Q245R/N248D/N252K; K27N/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; T38G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/S256R; Q12R/N62D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/G159D/N185D/Q206E/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K/E2 71Q; S101G/S103A/V104I/G159D/N185D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/Q206E/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/T213Q/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98L/G102A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/G102A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
    ES 2 368 718 T3
    Q12R/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98L/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/G102A/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G102A/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/Q109R/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/S130G/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S130G/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S128G/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/S128L/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S101G/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/S128G/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N62D/S103A/V104I/S128L/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/P131V/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; A98V/S101G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S99G/S101G/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/S212G/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/Y209W/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/P210I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/V205I/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; S101G/S103A/V104I/G159D/A230V/Q236H/Q245R; S101G/S103A/V104I/G159D/A194P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; and N76D/S101G/S103A/V104I/G159D/A194P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; en donde las posiciones de los restos aminoácidos corresponden a las posiciones pertinentes de la subtilisina de
    Bacillus amyloliquefaciens.
  2. 2.
    Un DNA que codifica una variante de proteasa subtilisina 309 de la reivindicación 1.
  3. 3.
    Un vector de expresión que comprende el DNA de la reivindicación 2.
  4. 4.
    Una célula hospedadora transformada con el vector de expresión de la reivindicación 3.
  5. 5.
    Una composición de limpieza que comprende la variante de proteasa subtilisina 309 de la reivindicación
    1.
  6. 6. Una comida para animales que comprende la variante de proteasa subtilisina 309 de la reivindicación 1.
  7. 7.
    Una composición para tratar un producto textil que comprende la variante de proteasa subtilisina 309 de la reivindicación 1.
  8. 8.
    Un método para producir una variante de proteasa subtilisina de Bacillus que tiene unas características de lavado mejores que las de un precursor de proteasa subtilisina de Bacillus en al menos una formulación detergente y/o en al menos un conjunto de condiciones de lavado, que comprende introducir en dicho precursor de proteasa subtilisina de Bacillus un conjunto de sustituciones seleccionado del grupo:
    V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K;
    V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
    V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R;
    ES 2 368 718 T3
    V68A/S103A/V104I/N140D/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; N43S/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; N43K/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; N43D/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/K237E/Q245R; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N252S; V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V/R275H; V68A/S103A/V104I/G159D/T224A/A232V/Q236H/Q245R/L257V; G61E/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; N43D/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S212P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/E271V; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/L217I/Q236H/E271V; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236R; V68A/L75R/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/A114V/V121I/G159D/Q236H/Q245R; Q12R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Y209S/Q236H/T253K; V68A/N76D/S103A/V104I/N117K/G159D/N184S/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245L; V68A/N76D/S103A/V104I/N123S/G159D/Q236H/H249Y; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/H249Q; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R/N261D; V68A/N76D/S103A/V104I/S141N/G159D/Q236H/Q245R/T255S; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q236H/Q245R/R247H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A174V/N204D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/N204D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/A133V/G159D/N218D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A194I/V203A/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A;
    ES 2 368 718 T3
    V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/P210R/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V; N76D/S103A/V104I/A232V/Q236H/Q245R/L257V; N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/L257V; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Y209W/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/G211R/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/G211V/A232V/Q236H/Q245R; Q12R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Y214L/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A215R/A232V/Q236H/Q245R; Q12R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; G20R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/S259G; V68A/N76D/S87R/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/T260V; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N261G; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N261W; N76D/S103A/V104I/A232V/Q236H/S242P/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/P210L/A232V/Q236H/Q245R; Q12R/A48V/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; N76D/S103A/V104I/A232V/Q236H/Q245R; N76D/S103A/V104I/G159D/Y192F/A232V/Q236H/Q245R; N76D/S103A/V104I/V147I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248S/K251R; Q12R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/A272S; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/N183K/Q206L/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/S256R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/Q206R/A232V/Q236H/Q245R; K27R/V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/N116T/G159D/R170S/N185S/A232V/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R; S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/Y209W/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/Q109R/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; G20R/V68A/S103A/V104I/G159D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/Y209F/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/N185D/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/P210R/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/N185D/P210L/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/P210L/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; V68A/S103A/V104I/G159D/S212C/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K;
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    15 S101G/S103A/V104I/G159D/A230V/Q236H/Q245R; S101G/S103A/V104I/G159D/A194P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; and N76D/S101G/S103A/V104I/G159D/A194P/A232V/Q236H/Q245R/N248D/N252K; en donde las posiciones de los restos de aminoácidos corresponden a las posiciones pertinentes de la subtilisina de
    Bacillus amyloliquefaciens.
    20 9. El método de la reivindicación 8, en el que un DNA que codifica el precursor de la proteasa subtilisina de Bacillus se modifica para producir una variante de DNA que codifica la variante de la proteasa subtilisina de Bacillus.
    ES 2 368 718 T3
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