JPWO2005035586A1

JPWO2005035586A1 - 融合蛋白質組成物

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Publication number: JPWO2005035586A1
Application number: JP2005514675A
Authority: JP
Inventors: 設楽　研也; 研也設楽; 保坂　絵美; 絵美保坂; 暁人夏目; 雅子脇谷; 内田　和久; 和久内田; 佐藤　光男; 光男佐藤; 尚子大貫; 中村　和靖; 和靖中村
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 2003-10-08
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2007-11-22
Also published as: WO2005035586A1; CA2542046A1; US20080241884A1; EP1688439A4; EP1688439A1; AU2004279742A1

Abstract

エフェクター機能が増強された医薬品として有用な抗体Ｆｃ領域の融合蛋白質組成物が求められている。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体Ｆｃ領域の融合蛋白質分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である融合蛋白質組成物、該融合蛋白質組成物を生産する形質転換体、該融合蛋白質組成物の製造方法および該融合蛋白質組成物を含有する医薬を提供する。

Description

本発明は、結合性蛋白質とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質分子からなる融合蛋白質組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である融合蛋白質組成物、該組成物を生産する形質転換体、該組成物の製造法および該組成物からなる医薬品に関する。

抗体は、その抗原と特異的に結合し、Ｆｃ領域に特異的な受容体でエフェクター細胞に発現する細胞膜発現型Ｆｃ受容体を介して、ナチュラルキラー細胞、活性化マクロファージ等のエフェクター細胞の細胞障害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）を誘導する。
抗体においては、近年、Ｒｉｔｕｘａｎによる非ホジキン白血病患者の治療、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎによる乳癌患者の治療において、該抗体医薬が患者のエフェクター細胞に強い抗体依存性細胞性細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）を惹起した場合には、より高い治療効果が得られている（Ｂｌｏｏｄ，９９，７５４，２００２；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２１，３９４０，２００３；Ｃｌｉｎ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１０，５６５０，２００４）。
抗体の可変領域は、抗原との特異的結合に関係するドメインである。一方、抗体の定常領域は、抗体分子の安定化や抗体のエフェクター機能を担うドメインである。特に、ＩｇＧクラスの抗体Ｆｃ領域（抗体重鎖のヒンジ領域以降の領域）はエフェクター細胞上のＦｃ受容体の一員であるＦｃγＩＩＩａを介して、ＡＤＣＣ活性を示す。従って、特定の分子との結合活性を有する蛋白質分子（以下、結合性蛋白質という）と融合蛋白質は、抗体分子と同様に、特定の分子と結合することができ、かつ、Ｆｃ領域が介するＡＤＣＣ活性を持つ。
これまでに、種々の結合性蛋白質とＦｃ領域との融合蛋白質が作製されており、該蛋白質の持つＡＤＣＣ活性について検討されている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７９９５（１９９３）］。例えば、抗体に類似した形状の分子として、抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）と軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）を含む蛋白質分子である一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと表記する）のＦｃ融合蛋白質がＡＤＣＣ活性を持つことが知られている。例えば、癌細胞の表面抗原として知られているＴＡＧ−７２（Ｔｕｍｏｒ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−７２）に対するマウスモノクローナル抗体（以下、抗ＴＡＧ−７２抗体と記す）から作製したｓｃＦｖとのＦｃ融合蛋白質（以下、ｓｃＦｖ−Ｆｃと表記する）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２６１，１９９（２００２）］はＴＡＧ−７２陽性細胞に対してＡＤＣＣ活性を持つ。また、メラノーマ患者より作製した抗体のファージライブラリーを、メラノーマ細胞に対してパニングを行うことによって得られたｓｃＦｖ−Ｆｃはメラノーマ細胞に特異的なＡＤＣＣ活性を示した。［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１６２７（１９９９）］。
融合させるｓｃＦｖは、一つには限られない。ｓｃＦｖ−ＦｃのＮ末端にもう一つのｓｃＦｖを連結させた分子はｓｃＦｖ_２−Ｆｃと呼ばれ、ｓｃＦｖの由来となる抗体の特異性により、二種類の結合特異性をあわせ持つ。このような分子では、抗原への結合活性が低下することが知られているが［Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１１２３（２０００）］、そのＡＤＣＣ活性は確認されていない。近年、医薬品の併用療法など、複数種の標的分子への同時作用による薬効の向上が有望視されており、抗体医薬の分野でも、二種の標的分子に対して特異的に結合する、二重特異性抗体が知られている。二重特異性抗体は一剤で二種類の分子を標的とするため、薬効の相加効果、相乗効果が期待されている。
また、ｓｃＦｖ以外の結合性蛋白質としては、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシス誘導シグナル分子、共刺激分子、増殖因子あるいは分化誘導因子などが知られている。該結合蛋白質の受容体とＦｃとの融合蛋白質は多数報告されており、例えば可溶型腫瘍壊死因子−α受容体ＩＩ（以下、ｓＴＮＦＲＩＩと表記する）とＦｃとの融合蛋白質であるＥｔａｎｅｒｃｅｐｔ［ＵＳＰ５６０５６９０］、抗原提示細胞上に発現しているｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ３（以下、ＬＦＡ−３と表記する）とＦｃとの融合蛋白質であるＡｌｅｆａｃｅｐｔ（ＵＳＰ５９１４１１１）、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ−４（ＣＴＬＡ−４）と融合蛋白質［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１，１８６９（１９９５）］、インターロイキン−１５と抗体Ｆｃとの融合蛋白質［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，５７４２（１９９８）］、ファクターＶＩＩとＦｃとの融合蛋白質［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，１２１８０（２００１）］、インターロイキン１０とＦｃとの融合蛋白質［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，５５９０（１９９５）］、インターロイキン２とＦｃとの融合蛋白質［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，９１５（１９９１）］、ＣＤ４０とＦｃとの融合蛋白質［Ｓｕｒｇｅｒｙ，１３２，１４９（２００２）］およびＯＸ４０とＦｃとの融合蛋白質［Ｊ．Ｌｅｕ．Ｂｉｏｌ．，７２，５２２（２００２）］などが挙げられる。これらの中で、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、Ａｌｅｆａｃｅｐｔはすでに医薬品として利用されている。しかしながら、一般に融合蛋白質の標的分子に対する結合活性は抗体の抗原に対する結合活性と比較して低く［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７９９５（１９９３）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３０１，４１８（２００２）］、天然型のままで医薬品として利用できる融合蛋白質は限られている。
ＡＤＣＣ活性は、ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体のＦｃ領域とＦｃγレセプター（以下、ＦｃγＲと表記する）との相互作用を介して誘導される。抗体とＦｃγＲとの結合においては、抗体のヒンジ領域及びＣ領域の第２番目のドメイン（以下、Ｃγ２ドメインと表記する）に結合している糖鎖の重要性が示唆されている［ＣｈｅｍｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）］。
抗体ＩｇＧ分子のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の非還元末端へのガラクトースの付加、および還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性があることが知られており［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，１３０（１９９７）］、特に糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加により、抗体のＡＤＣＣ活性が大きく低下することが報告されている［ＷＯ００／６１７３９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６（２００３）］。
融合蛋白質は、遺伝子組換え技術を利用し、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞などを宿主細胞として製造されるが、発現させた融合蛋白質の糖鎖構造は宿主細胞によって異なることが考えられる。
例えば、抗体生産細胞内のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）の活性を低下または欠失することにより、Ｆｃ領域を有する抗体分子からなる組成物中で、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還先末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を増加させることができることが知られている［ＷＯ０２／３１１４０］。

本発明の目的は、結合性蛋白質とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質からなる融合蛋白質組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である融合蛋白質組成物、該融合蛋白質組成物を生産する形質転換体、該融合蛋白質組成物の製造方法および該融合蛋白質組成物を含有する医薬等を提供することにある。本発明の融合蛋白質は高い細胞傷害活性を有するため、治療の標的となる細胞を患者の体内から減少させる治療に有用である。高い細胞傷害活性を有する融合蛋白質を治療に用いることにより、化学療法、放射性同位元素標識体などと併用が不要となることから患者への副作用を軽減させることが期待される。また、患者への治療薬の投与量を減少させることで患者への負担の軽減などが期待される。
本発明は、以下の（１）〜（３９）に関する。
（１）結合性蛋白質とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質分子からなる医薬融合蛋白質組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である融合蛋白質組成物。
（２）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である、（１）に記載の融合蛋白質組成物。
（３）抗体Ｆｃ領域がヒト抗体のＩｇＧクラスである、（１）または（２）に記載の融合蛋白質組成物。
（４）抗体Ｆｃ領域がヒト抗体のＩｇＧ１クラスである、（３）に記載の融合蛋白質組成物。
（５）抗体融合蛋白質組成物が、ヒト抗体のＩｇＧ１クラス重鎖定常領域ドメイン２（ＣＨ_２）を含む（４）に記載の融合蛋白質組成物。
（６）融合蛋白質組成物が、ヒト抗体ヒンジ領域、抗体のＩｇＧ１クラス重鎖定常領域ドメイン２（ＣＨ_２）および抗体重鎖定常領域ドメイン３（ＣＨ_３）を含む（５）に記載の融合蛋白質組成物。
（７）結合性蛋白質が、抗体の結合性断片、可溶性受容体およびリガンド蛋白質からなる群から選ばれる蛋白質を少なくとも１つ含む（１）〜（６）のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物。
（８）抗体の結合性断片が、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖を少なくとも１つ含む（７）に記載の融合蛋白質組成物。
（９）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖が、一本鎖抗体である（８）に記載の融合蛋白質組成物。
（１０）抗体の結合性断片が、一本鎖抗体である（７）に記載の融合蛋白質組成物。
（１１）抗体の結合性断片が、二種類の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖を含む（７）に記載の融合蛋白質組成物。
（１２）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖が、一本鎖抗体である（１１）に記載の融合蛋白質組成物。
（１３）抗体の結合性断片が、二重特異性一本鎖抗体である（７）に記載の融合蛋白質組成物。
（１４）可溶性受容体が、可溶型ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ）受容体ＩＩである（７）に記載の融合蛋白質組成物。
（１５）可溶性受容体が、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む（１５）に記載の融合蛋白質組成物。
（１６）融合蛋白質が、ＦＥＲＭＢＰ−８４９９により生産される（１４）または（１５）に記載の融合蛋白質組成物。
（１７）リガンド蛋白質が、ＬＦＡ−３（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅＦｕｎｃｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎ−３）である（７）に記載の融合蛋白質組成物。
（１８）リガンド蛋白質が、配列番号６５で示されるアミノ酸配列を含む（１６）に記載の融合蛋白質組成物。
（１９）融合蛋白質が、ＦＥＲＭＢＰ−８５００により生産される（１７）または（１８）に記載の融合蛋白質組成物。
（２０）融合蛋白質組成物が、２量体である（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物。
（２１）（１）〜（２０）のいずれか１項に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（２２）宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素を失活するようにゲノムが改変された細胞である、（２１）に記載の形質転換体。
（２３）宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞である、（２２）に記載の形質転換体。
（２４）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）およびＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）からなる群から選ばれる酵素である、（２２）または（２３）に記載の形質転換体。
（２５）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（２４）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２６）ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（２４）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
（２７）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（２４）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２８）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（２４）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
（２９）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである（２２）または（２３）に記載の形質転換体。
（３０）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（２９）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３１）α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（２９）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（３２）宿主細胞が、下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれる細胞である（２１）〜（３１）のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｇ）胚性幹細胞；
（ｈ）受精卵細胞。
（３３）形質転換体がＦＥＲＭＢＰ−８４９９である（２１）〜（３２）のいずれか１項に記載の形質転換体。
（３４）形質転換体がＦＥＲＭＢＰ−８５００である（２１）〜（３２）のいずれか１項に記載の形質転換体。
（３５）（２１）〜（３４）のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に融合蛋白質組成物を生成蓄積させ、該抗体組成物を採取し、精製する、（１）〜（２０）のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物の製造方法。
（３６）（３５）に記載の製造方法により得られる、（１）〜（２０）のいずれか１項に記載の抗体融合蛋白質組成物。
（３７）（１）〜（２０）および（３６）のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物を有効成分として含有する医薬。
（３８）（１）〜（２０）および（３６）のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物を有効成分として含有する医薬が、腫瘍、炎症性疾患または自己免疫疾患の予防薬または治療薬。
（３９）腫瘍が、血液腫瘍または癌である（３８）に記載の疾患の予防薬または治療薬。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は２００３年１０月８日に出願された日本国特許出願２００３−３５０１５８号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書および図面に記載される内容を包含する。
本発明の結合性蛋白質とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である融合蛋白質組成物としては、結合性蛋白質とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質組成物であって、該Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である融合蛋白質組成物があげられる。
本発明において抗体Ｆｃ領域としては、抗体エフェクター活性を有する抗体サブクラスの抗体由来のＦｃ領域であればよく、医薬品としての利用の点から、好ましくはヒトＩｇＧクラス由来の抗体Ｆｃ領域が、特に好ましくはヒトＩｇＧ１クラス由来の抗体Ｆｃ領域が用いられる。ＩｇＧクラス抗体由来の抗体Ｆｃ領域とは、重鎖定常領域ドメイン２（以下、ＣＨ_２と記す）ドメイン３（以下、ＣＨ_３と記す）を含むポリペプチド鎖のことをいう。
抗体エフェクター活性としては、抗体依存性細胞性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と記す）あるいは補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）などがあげられる。ＡＤＣＣ活性は、抗体Ｆｃ領域と抗体Ｆｃ受容体であるＦｃγ受容体とが結合して発現される細胞傷害活性である。ＣＤＣ活性は、抗体Ｆｃ領域と補体成分とが結合して発現される細胞傷害活性である。
抗体Ｆｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合する。従って、Ｆｃ融合蛋白質の１ポリペプチド鎖につき１本の糖鎖が結合している。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の側鎖を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどを有するコンプレックス型（複合型）糖鎖をあげることができる。
本発明において、Ｎ−グルコシド結合複合型糖鎖としては、下記化学式１で示される。

本発明において、フコースが結合していない糖鎖としては、上記で示された化学式中、還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにはフコースが結合されていないものであればよく、非還元末端の糖鎖の構造はいかなるものでもよい。
したがって、本発明の抗体組成物としては、上記の糖鎖構造を有していれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
本発明において、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないとは、実質的にフコースが結合していないことをいう。実質的にフコースが結合していない融合蛋白質組成物とは、具体的には、後述の４に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度の融合蛋白質組成物である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることを意味する。糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない本発明の融合蛋白質組成物は、高いＡＤＣＣ活性を有する。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する融合蛋白質分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する融合蛋白質分子の割合は、融合蛋白質分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６，１５７７（１９８３）］によって分析することで決定することができる。
本発明で用いられる結合性蛋白質としては、特定の生体内物質と特異的に結合できる蛋白質があげられる。特定の生体内物質としては、蛋白質性の高分子、糖鎖、細胞膜の構成成分などの疾患の病変細胞の表面に疾患特異的に発現している生体内物質があげられる。具体的には、種々の腫瘍細胞に発現する受容体、ガングリオシド、膜アンカー型抗体、膜アンカー型酵素などがあげられる。
結合性蛋白質が特異的に結合するとは、結合性蛋白質が特定の物質と結合できることをいい、一般的には１種類の結合性蛋白質は数種類の物質に、好ましくは２〜３種類の物質に、より好ましくは１種類の物質に結合することをいう。
結合性蛋白質としては、特定の生体内物質に結合する領域を含んでいればよく、結合性蛋白質の一部の領域または全部でもよい。また、同一の結合性蛋白質の２ヶ所以上の領域を抗体ＦＣ領域と結合させることもできる。
さらに、本発明においては、同一または異なる結合性蛋白質を抗体ＦＣ領域と結合させることもでき、結合させる結合性蛋白質の数は、１以上であればよい。
本発明の結合性蛋白質としては、具体的には、抗体の結合性断片、受容体のリガンド、可溶性の受容体、核酸結合蛋白質、細胞膜結合蛋白質、脂質結合蛋白質、脂肪酸結合蛋白質、糖あるいは糖鎖結合蛋白質、酵素の基質のドミナントネガティブ体および酵素のドミナントネガティブ体などがあげられるが、抗体、抗体の結合性断片、受容体のリガンドおよび可溶性の受容体などが好適に用いられる。
本発明に用いられる抗体としては、疾患の病変細胞あるいは病変細胞の表面に発現している生体内物質に結合するモノクローナル抗体があげられる。モノクローナル抗体は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４，（１９９８）に記載の公知の方法、生体から取得した抗体産生細胞を不死化して株化する方法および人工の抗体ファージライブラリーから、パンニングにより抗体および抗体遺伝子を選択するファージディスプレー法などにより取得することができる。
本発明において、結合性蛋白質として抗体の結合性断片を用いることができる。該抗体の結合性断片は、上記のモノクローナル抗体から、消化酵素を用いて消化する方法、あるいは該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から抗体をコードする遺伝子を取得し、蛋白質工学的手法を用いる方法により、作製することができる。
抗体の結合性断片としては、抗体の可変領域の一部あるいは全部を含み、該抗体に対応する抗原への結合活性を保持した結合性断片があげられる。抗体の可変領域の一部を含む抗体断片は、必要に応じて、好みの形状で発現させるように設計でき、抗体Ｆｃ領域と連結するために適当なアミノ酸配列を挿入することもできる。非ヒト動物由来の抗体であれば、フレームワークのアミノ酸配列をヒト抗体由来の配列と置換して、免疫原性を低くすることも可能である。抗体の結合性断片としては、以下に示す、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）、ｓｃＦｖ多量体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆａｂは、抗体分子を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体分子のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆ（ａｂ’）_２は、抗体分子を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、製造することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）_２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと記す）を用いて、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨの順で連結されたポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
ｓｃＦｖは、抗体分子のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖ多量体は、複数のｓｃＦｖを適当なペプチドリンカーを用いて、ｓｃＦｖ−（Ｐ−ｓｃＦｖ−）_Ｎのように連結されたポリペプチド鎖で、各ｓｃＦｖに対応するそれぞれの抗原に対する結合活性を有する。例えば、二種類のｓｃＦｖを同一ポリペプチド鎖中に含むｓｃＦｖ_２（二重特異性一本鎖抗体）などがあげられる。ｓｃＦｖ多量体に含まれる個々のｓｃＦｖの組み合わせは、どの様な組み合わせであってもよく、同一のｓｃＦｖが複数個の組み合わせまたは複数種類のｓｃＦｖの組み合わせでもよい。
ｓｃＦｖ多量体は、上記ｓｃＦｖと同様にして蛋白質工学的手法を用いて製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｄｉａｂｏｄｙが持つ二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
ｄｉａｂｏｄｙは、抗体分子のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが１２残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
ｄｓＦｖは、抗体分子のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
ＣＤＲを含むペプチトは、抗体分子のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の融合蛋白質組成物に用いられる抗体の結合性断片としては、ｓｃＦｖが好適に用いられる。ｓｃＦｖは、一種類の抗体由来のｓｃＦｖであってもよいし、二種類の抗体由来の二種類のｓｃＦｖを一本のポリペプチド鎖として発現させ、一本のポリペプチド鎖中に二種類の結合特異性を有するｓｃＦｖ_２であってもよい。ｓｃＦｖとしては任意の抗体から作製したｓｃＦｖであればいかなるものでもよいが、具体的には、癌細胞の表面抗原として知られているＴＡＧ−７２に対するマウスモノクローナル抗体のそれぞれ配列番号９、１０、１１で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１２、１３、１４で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ、配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨおよび配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬを含むｓｃＦｖまたは配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖなどがあげられる。また、癌細胞の表面抗原として知られているＭＵＣ１に対するマウスモノクローナル抗体のそれぞれ配列番号６６、６７、６８で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号６９、７０、７１で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ、配列番号７２で示されるアミノ酸配列をからなる抗体ＶＨおよび配列番号７３で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬを含むｓｃＦｖまたは配列番号７４で示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖなどもあげられる。
ｓｃＦｖ_２としては、任意のｓｃＦｖを組み合わせたものであればいかなるものでもよく、ｓｃＦｖは同一であっても、異なっていてもよい。具体的には、それぞれ配列番号９、１０、１１で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１２、１３、１４で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むｓｃＦｖからなるｓｃＦｖ_２、それぞれ配列番号６６、６７、６８で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号６９、７０、７１で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むｓｃＦｖからなるｓｃＦｖ_２、それぞれ配列番号９、１０、１１で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１２、１３、１４で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ、およびそれぞれ配列番号６６、６７、６８で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号６９、７０、７１で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むｓｃＦｖからなるｓｃＦｖ_２、配列番号１５で示されるアミノ酸配列をからなる抗体ＶＨおよび配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬを含むｓｃＦｖからなるｓｃＦｖ_２、配列番号７２で示されるアミノ酸配列をからなる抗体ＶＨおよび配列番号７３で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬを含むｓｃＦｖからなるｓｃＦｖ_２、配列番号１５で示されるアミノ酸配列をからなる抗体ＶＨおよび配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬを含むｓｃＦｖ、および配列番号７２で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨおよび配列番号７３で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬを含むｓｃＦｖからなるｓｃＦｖ_２、配列番号７５で示されるアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ_２または配列番号７６で示されるアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ_２などがあげられる。
本発明において、可溶性受容体としては、細胞表面に発現しているリガンドに結合できる受容体であればいかなるものでもよく、このような受容体のリガンド結合領域を、リガンドに対する結合活性を保持した形で蛋白質工学的手法により作製することができる受容体なども包含される。具体的には、可溶型ＴＮＦ（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ）ＩＩ受容体または配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む可溶性受容体などがあげられる。
本発明において、受容体のリガンド蛋白質としては、ヒト体内の細胞表面に発現している受容体のリガンド蛋白質があげられる。該リガンド蛋白質は、対応する特定の受容体に結合可能であれば、該受容体の活性に影響を及ぼしてもよい。例えば、リガンド蛋白質の結合により該受容体が介在する情報伝達経路が活性化されてもよいし、該情報伝達系を不活化してもよく、また、該情報伝達系に影響を与えなくてもよい。リガンドの結合により受容体が介在する情報伝達系が活性化されるリガンドとは、野生型リガンドまたはアゴニスト活性を有するペプチドなどがあげられる。リガンドの結合により受容体が介在する情報伝達系を不活化させるリガンド蛋白質とは、野生型リガンドのドミナントネガティブ体またはアンタゴニスト活性を有するペプチドなどがあげられる。
本発明の受容体のリガンドとしては、具体的にはＬＦＡ−３（ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＦｕｎｃｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎ−３）または配列番号６５で示されるアミノ酸配列を含むリガンド蛋白質などがあげられる。
本発明の抗体Ｆｃ領域としては、ＦｃγＩＩＩａ受容体との結合に直接関与している抗体重鎖定常領域ドメイン２（以下、ＣＨ_２と記す）が少なくとも１つ含まれていればよい。
本発明の融合蛋白質組成物としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｆ）があげられる。本発明の融合蛋白質組成物は、単量体、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成していてもよい。以下において、ＣＨ_２および抗体重鎖定常領域ドメイン３（以下、ＣＨ_３と記す）は、ヒトＩｇＧ１クラスであることが好ましい。
（ａ）結合性蛋白質−ＣＨ_２；
（ｂ）結合性蛋白質−ＣＨ_２−ＣＨ_３；
（ｃ）ＣＨ_２−結合性蛋白質；
（ｄ）ＣＨ_２−ＣＨ_３−結合性蛋白質；
（ｅ）結合性蛋白質−ＣＨ_２−結合性蛋白質；
（ｆ）結合性蛋白質−ＣＨ_２−ＣＨ_３−結合性蛋白質；
上記（ａ）〜（ｆ）の連結されたポリペプチド鎖において、結合性蛋白質は、１つ以上の結合性蛋白質が含まれていればよい。また、１つのポリペプチド鎖中に２つの結合性蛋白質のポリペプチド鎖が含まれている融合蛋白質の場合には、２つの結合性蛋白質が結合できる生体内物質は同一でも、異なっていてもよい。
本発明において、融合蛋白質は上記（ａ）〜（ｆ）の各蛋白質を構成要素として結合したものであってもよい。ここで各構成要素は同一であっても、異なっても、よく、同一の順番の繰り返しでもよい。上記（ａ）〜（ｆ）の各構成要素の間は、直接各構成要素を連結してもよいし、抗体定常領域に由来するヒンジ配列などのリンカーを介して結合してもよい。さらに、結合性蛋白質の結合特異性および抗体Ｆｃ領域のエフェクター活性に大幅な変化を生じない程度に、各構成要素のアミノ酸残基に１つ以上のアミノ酸を付加、欠失および／または置換させてもよい。
本発明の形質転換体としては、融合蛋白質分子をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体であって、本発明の融合蛋白質組成物を生産する形質転換体であればいかなる形質転換体でも包含される。具体的な例としては、融合蛋白質分子をコードするＤＮＡを以下の（ａ）または（ｂ）などの宿主細胞に導入して得られる形質転換体があげられる。
（ａ）細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された細胞；
（ｂ）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された細胞。
上述において、酵素が失活するようにゲノムが改変されたとは、該酵素の発現を欠失させるように該酵素をコードする遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、または該酵素を失活させるように該酵素をコードする遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することをいう。変異を導入するとは、ゲノ厶上の塩基配列を欠失、置換、挿入および／または付加させるといった塩基配列の改変を行うことをいう。このように改変されたゲノム遺伝子の発現または活性が完全に抑制されることをゲノム遺伝子がノックアウトされるという。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）などがあげられる。
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼとしては、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
などがあげられる。
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼとしては、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
などがあげられる。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼとしては、
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
などがあげられる。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼとしては、
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
などがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、α１，６−フコシルトランスフェラーゼがあげられる。
本発明において、α１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡがコードする蛋白質、
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡまたは、
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｈ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｉ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｊ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
等があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号５または６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号５または６で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１、３、５または６で表される塩基配列からなるＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ１：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、３、５または６で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素活性を有する蛋白質、または配列番号７または８で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，８４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号１、３、５または６で表される塩基配列を有するＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において配列番号２、４、７または８であらわされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性、またはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質としては、具体的には、それぞれ配列番号２、４、７または８で表されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質などをあげることができる。
また、本発明に用いられる宿主細胞、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活した宿主細胞を取得する方法としては、目的とする酵素を失活させることができる手法であれば、いずれの手法でも用いることができる。上述の酵素を失活させる手法としては、
（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などがあげられる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａＬｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞を言う。有効濃度とは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞（以下、親株とも称す）が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノ厶遺伝子が改変される以前の細胞が成育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上である。
生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよく、通常のレクチンの有効濃度は１０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬである。
本発明の融合蛋白質組成物を生産させる宿主細胞としては、本発明の融合蛋白質分子を発現できる上記宿主細胞であればいかなる細胞も包含する。例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられる。これらの細胞としては、後述１に記載のものがあげられ、特に、動物細胞の中でも、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などが好ましい。
本発明の形質転換株としては、具体的には、本発明のＴＡＧ（Ｔｕｍｏｒ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）−７２に結合性を有する融合蛋白質の遺伝子を組み込んだチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の形質転換株ＫＣ１２００、可溶型ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ）受容体ＩＩの融合蛋白質の遺伝子を組み込んだチャイニーズハ厶スター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の形質転換株ＫＣ１１９４およびＬＦＡ−３（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅＦｕｎｃｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎ−３）の融合蛋白質の遺伝子を組み込んだチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の形質転換株ＫＣ１１９８があげられる。なお、上記のＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の形質転換株は、平成１５年９月３０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、ＫＣ１１９４はＦＥＲＭＢＰ−８４９９として、ＫＣ１１９８はＦＥＲＭＢＰ−８５００として、また、平成１５年１０月３日付けでＫＣ１２００はＦＥＲＭＢＰ−８５０３として寄託されている。
以下に、本発明の融合蛋白質組成物を生産する細胞の作製方法、本発明の融合蛋白質組成物の製造方法および本発明の融合蛋白質組成物の分析方法ならびに利用方法について説明する。
１．本発明の融合蛋白質組成物を生産する宿主細胞の作製
本発明の融合蛋白質を生産する細胞（以下、本発明の細胞と称す）は、以下に述べる手法により、本発明の融合蛋白質組成物を生産するために用いる宿主細胞を作製し、該宿主細胞に後述２に記載の方法により、融合蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより、作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（以下、Ｆｘと表記する）などがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド法（以下、ＲＤＯ法と表記する）、ＲＮＡインターフェアレンス法（以下、ＲＮＡｉ法と表記する）、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）アンチセンス法又はリボザイム法による本発明の細胞を作製するための宿主細胞の作製
本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９（１９９３）、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１７，１０９７（１９９９）、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５，１０８３（１９９５）、細胞工学，１３，２５５（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイ厶を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生した融合蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の組成物を作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能であるか、ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖蛋白質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖蛋白質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などを用いて、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法があげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生した融合蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、下記に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞のｍＲＮＡは市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてもよいし、以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰ）法［ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）］等があげられる。
さらに、ＦａｓｔＴｒａｃｋｍＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などの市販のキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｌａｓｍｉｄＣｌｏｎｉｎｇ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、ＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＣ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＹ１０８８［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＹ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーは、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げて、完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［Ｇｅｎｅ，１３８，１７１（１９９４）；Ｇｅｎｅ，２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製して以下の解析に用いてもよい。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）］等を用いて、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを使用し、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて増幅することにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
取得した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定したＣＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラ厶を用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したＤＮＡがデータベース中の遺伝子の中で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１または３に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号５または６に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステ厶（ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ社）やＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ^ＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）などを用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノ厶ＤＮＡを取得することもできる。
取得した細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定したゲノムＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したＤＮＡがデータベース中の遺伝子の中で細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを取得することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１１０、１１１、１１２および１１３に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号５５に記載の塩基配列があげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイ厶は、公知の方法またはＤＮＡ合成機により調製することができる。具体的には、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成して調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
（ｂ）相同組換え法による本発明の融合蛋白質組成物を作製するための宿主細胞の作製
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用いて染色体を改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９９４）、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノ厶ＤＮＡを調製する。
ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、染色体上の標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素のゲノ厶ＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号１１０、１１１、１１２および１１３に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号５５に記載の塩基配列があげられる。
染色体上の標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、置換型、挿入型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノ厶ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）］やＰＣＲ法［ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
（ｃ）ＲＤＯ方法による本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡあるいはゲノ厶ＤＮＡを上記１の（１）の（ａ）に記載の方法を用い、調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノ厶ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載のｃＤＮＡの調製方法などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ｂ）に記載のゲノムＤＮＡの調製方法などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにサブクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記１の（１）の（ａ）に記載の、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述１の（５）に記載の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述４または後述５に記載の産生した融合蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
ＲＤＯは、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，１３８６（１９９６）；ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，４，２８５（１９９８）；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２５，１４６２（１９９７）；ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，５，１９６０（１９９９）；ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，５，１９６０（１９９９）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７５，８２９（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８７７４（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８７６８（１９９９）；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２７，１３２３（１９９９）；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．，１１１，１１７２（１９９８）；ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，１６，１３４３（１９９８）；ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，１８，４３（２０００）；ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，１８，５５５（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（ｄ）ＲＮＡｉ法による本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを上記１の（１）の（ａ）に記載の方法を用い、ｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子を設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したｃＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生した融合蛋白質分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生した融合蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載されたｃＤＮＡの調製方法などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６（１９９８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１５５０２（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ，３９５，８５４（１９９８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，５０４９（１９９９）；Ｃｅｌｌ，９５，１０１７（１９９８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４５１（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１３９５９（１９９８）；ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２，７０（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，２５，３５（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生した融合蛋白質分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子に突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生した融合蛋白質分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（２）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
これらの酵素は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、ＧＭＤを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
大腸菌由来のＧＭＤの立体構造を解析した結果、４つのアミノ酸（１３３番目のトレオニン、１３５番目のグルタミン酸、１５７番目のチロシン、１６１番目のリシン）が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，２（２０００）］。すなわち、立体構造の情報にもとづきこれら４つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。一方、ＧＭＤの補酵素ＮＡＤＰや基質であるＧＤＰ−マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、ＧＭＤの酵素活性を担うこれら４つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。大腸菌由来のＧＭＤのドミナントネガティブ体の作製の結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、例えば、ＣＨＯ細胞由来のＧＭＤ（配列番号２）では、１５５番目のトレオニン、１５７番目のグルタミン酸、１７９番目のチロシン、１８３番目のリシンを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子（以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する）を用い、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）、ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９９４）等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生した融合蛋白質分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とする細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生した融合蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（３）酵素に突然変異を導入する手法
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子に突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
酵素に突然変異を導入する方法としては、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産した融合蛋白質分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレー厶シフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。産生した融合蛋白質分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、本項の１の（５）に記載の方法があげられる。
（４）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、ＧＭＤ、Ｆｘなどがあげられる。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法としては、例えば、本項１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、本項１の（５）に記載の方法があげられる。産生した融合蛋白質分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述４または後述５に記載の方法があげられる。
（５）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
本発明の融合蛋白質組成物を作製するために用いる宿主細胞は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１２，５１（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａＬｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。
具体的には、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度の上述のレクチンを含む培地で１日〜２週間、好ましくは１日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養容器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、本発明のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
２．融合蛋白質組成物の製造方法
融合蛋白質組成物は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｐｒａｃｔｉｃｅ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３、ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９６等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
本発明の融合蛋白質分子の全長ｃＤＮＡを調製し、該融合蛋白質分子をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、発現ベクターを作製する。
該発現ベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、融合蛋白質組成物を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、融合蛋白質を発現できるものであればいずれも用いることができる。
融合蛋白質分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素、すなわち細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活した細胞を選択するか、または前述１に示された種々の人為的手法により得られた細胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする融合蛋白質分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
ｃＤＮＡは、前記１．の（１）の（ａ）に記載のｃＤＮＡの調製方法に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とする融合蛋白質分子をコードするｃＤＮＡに特異的なプローブまたはプライマー等を用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
発現ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９９４）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９９４）］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、発現ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記発現ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ厶法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
発現ベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
融合蛋白質遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質の発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された融合蛋白質組成物を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に融合蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、融合蛋白質組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ厶、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウ厶等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３〜９に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｅｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、融合蛋白質分子をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを保持する酵母、動物細胞、昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、融合蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物より融合蛋白質組成物を採取することにより、融合蛋白質組成物を製造することができる。
融合蛋白質遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
融合蛋白質組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる融合蛋白質分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
融合蛋白質組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，８２２７（１９８９）；ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該融合蛋白質組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、融合蛋白質分子をコードするＤＮＡ、および融合蛋白質分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に融合蛋白質分子を発現させることにより、目的とする融合蛋白質組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
融合蛋白質分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された融合蛋白質組成物は、例えば融合蛋白質組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、融合蛋白質組成物の精製標品を得ることができる。
また、融合蛋白質組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として融合蛋白質組成物の不溶体を回収する。回収した融合蛋白質組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該融合蛋白質組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該融合蛋白質組成物の精製標品を得ることができる。
融合蛋白質組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該融合蛋白質組成物あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、融合蛋白質組成物の精製標品を得ることができる。
以下に、本発明の融合蛋白質組成物の具体的な製造方法について説明する。
（１）融合蛋白質発現用ベクターの構築
融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨ等をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨなどをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）及びヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成るゲノムＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体の定常領域をコードする遺伝子を組込み発現できる発現ベクターが用いられる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
融合蛋白質発現用ベクターは、発現させる融合蛋白質の形状に合った形のベクターを用いればよく、例えば、抗体のＦｃ領域に抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の両方を用いる場合には、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖がそれぞれ別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデ厶型と表記する）のどちらでも用いることができる。融合蛋白質発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での融合蛋白質のＨ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］。タンデム型の融合蛋白質発現ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１０３５（２０００）］、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８）］などがあげられる。
構築した融合蛋白質発現用ベクターは、本発明の融合蛋白質の動物細胞での発現に使用できる。
（２）結合性蛋白質をコードするｃＤＮＡの取得
結合性蛋白質をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
例えば、結合性蛋白質が一本鎖抗体である場合には、抗体を産生するハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として用い、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域或いはＶ領域をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
また、結合性蛋白質が、蛋白質性のリガンドまたは可溶性の受容体である場合には、該結合性蛋白質を発現することが知られている細胞株または組織から、上記と同様の方法でｃＤＮＡを取得することができる。
細胞または組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウ厶法［ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、ＦａｓｔＴｒａｃｋｍＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１−３４］、或いは市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｌａｓｍｉｄＣｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、ＬａｍｂｄａＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、大腸菌の株としては、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の結合性蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンを選択する方法としては、アイソトープ或いは蛍光などで標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１−３４］により目的の結合性蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
さらに、結合性蛋白質のアミノ酸配列または該蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列がすでに公知である場合には、以下の方法を用いても製造することができる。
アミノ酸配列が公知である場合には、コドンの使用頻度［ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮して該可変領域をコードするＤＮＡ配列を設計し、設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。塩基配列が公知である場合には、その情報を基に１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。
（３）結合性蛋白質のアミノ酸配列の解析
決定した塩基配列から結合性蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、既知のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｔ）で結合性蛋白質の全アミノ酸配列［ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが目的とする結合性蛋白質の完全長を含んでいるかを確認することができる。
（４）融合蛋白質をコードするｃＤＮＡの構築
融合蛋白質をコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、構築する融合蛋白質の形状に従って、アミノ酸一次配列を設計する。設計したアミノ酸配列は、コドンユセージを考慮に入れて、ＤＮＡ配列に変換する。変換したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを設計、合成し、それらをＰＣＲ法により連結させ、目的のＤＮＡ配列を構築することができる。
融合蛋白質の形状によって、結合蛋白質をコードするｃＤＮＡのみを上記の方法で作成し、抗体定常領域をコードするｃＤＮＡを持つ発現ベクターに導入し、所望の融合蛋白質発現ベクターを構築できる。また、結合性蛋白質と抗体Ｆｃ領域とが連結した形でｃＤＮＡを上記の方法で構築し、適当な発現ベクターのプロモーター下に挿入して、所望の融合蛋白質発現ベクターを構築することも可能である。
（５）融合蛋白質発現ベクターの構築
本項２の（１）に記載の融合蛋白質発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ等をコードする遺伝子の上流に、本項２の（４）で構築した融合蛋白質をコードするｃＤＮＡを挿入し、融合蛋白質発現ベクターを構築することができる。例えば、本項２の（４）で融合蛋白質を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入し、融合蛋白質発現ベクターを構築することができる。このとき、必要に応じてヒト抗体のＣＨあるいはＣＬをコードする遺伝子は所望のアミノ酸配列をコードする領域のみを残して、発現ベクターとすることもできる。
（６）融合蛋白質の安定的生産
本項２の（４）および（５）に記載の融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することにより融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞への融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等があげられる。
融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞等があげられる。
融合蛋白質発現ベクターの導入後、融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に融合蛋白質を生成蓄積させることができる。培養上清中の融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４（１９９８）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用して融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ８（１９８８）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化融合蛋白質の分子量は、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１２（１９８８）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした融合蛋白質組成物の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法により融合蛋白質組成物を製造することができる。
すでに宿主細胞が融合蛋白質組成物を発現する能力を有する場合には、上記１に記載した方法を用いて融合蛋白質組成物を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする融合蛋白質組成物を精製することにより、本発明の融合蛋白質組成物を製造することができる。
３．融合蛋白質組成物の活性評価
精製した融合蛋白質組成物の蛋白量、抗原との結合活性あるいはＡＤＣＣ活性を測定する方法としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１２（１９８８）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ（１９９６）等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、融合蛋白質組成物が融合蛋白質の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］。
ＡＤＣＣ活性は、ＮＫ細胞、好中球、単球、マクロファージなどのエフェクター細胞の活性化の結果、生じると考えられており、中でもＮＫ細胞が、主要な役割を果たしている［Ｂｌｏｏｄ，７６，２４２１（１９９０）、ＴｒｅｎｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．，２２，６３３（２００１）、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，５０３（２００１）］。
ＮＫ細胞上に発現しているＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＩａであり、従って、抗体のＡＤＣＣ活性はＦｃγＩＩＩａに対する結合性の強さと相関するので、融合蛋白質組成物のＦｃγＩＩＩａに対する結合性から、融合蛋白質組成物の有するＡＤＣＣ活性を予測することができる。融合蛋白質組成物のＦｃγＩＩＩａに対する結合性を測定する方法は、ＥＬＩＳＡ法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４（１９９８）、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ，１９９６］に類似の方法で測定することができる。
具体的には、ＥＬＩＳＡプレートに固定化したＦｃγＩＩＩａに融合蛋白質組成物を反応させ、ＦｃγＩＩＩａに結合した融合蛋白質組成物を検出する方法や、ＥＬＩＳＡプレートに固定化した抗原等の基質に融合蛋白質組成物抗体を結合させ、次いで抗原等の基質に結合した融合蛋白質組成物に標識化したＦｃγＩＩＩａを反応、検出することにより融合蛋白質組成物のＦｃγＩＩＩａに対する結合性を評価することができる。
ＦｃγＩＩＩａは、上記１項に記載の方法によりヒト末梢血などからｃＤＮＡを取得し、適当な発現ベクターに組み込み発現させ、取得できる。ＦｃγＩＩＩａを発現させる場合には、適当なタグ分子と融合させて、標識化することができる。
また、融合蛋白質組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
４．融合蛋白質組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた融合蛋白質組成物の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、融合蛋白質分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
融合蛋白質組成物の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（１），２８３（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
融合蛋白質分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、融合蛋白質組成物をヒドラジン分解して、融合蛋白質組成物から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
５．融合蛋白質分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
融合蛋白質組成物は、融合蛋白質のＦｃ領域に結合する糖鎖構造が異なった融合蛋白質分子から構成されている。本発明の融合蛋白質組成物は、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が１００％であり、高いＡＤＣＣ活性を示す特徴を有している。このような融合蛋白質組成物は、上記４．に記載の融合蛋白質組成物の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた融合蛋白質分子の糖鎖構造の識別は、文献［ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
融合蛋白質組成物を構成する融合蛋白質分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である融合蛋白質組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと融合蛋白質分子の複合体の量を測定する。
融合蛋白質分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａｌｅｃｔｉｎ）、ＡＡＬ（ＡｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａＬｅｃｔｉｎ）、ＡＣＬ（ＡｍａｒａｎｔｈｕｓｃａｕｄａｔｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（ＢａｕｈｉｎｉａｐｕｒｐｕｒｅａＬｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（ＤａｔｕｒａｓｔｒａｍｏｎｉｕｍＬｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（ＤｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆｌｏｒｕｓＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（ＥｌｄｅｒｂｅｒｒｙＢａｌｋＬｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（ＥｒｙｔｈｒｉｎａｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉＬｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（ＥｕｏｎｙｍｕｓｅｕｒｏｐａｅｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（ＧａｌａｎｔｈｕｓｎｉｖａｌｉｓＬｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（ＧｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａＬｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（ＨｅｌｉｘｐｏｍａｔｉａＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（ＨｉｐｐｅａｓｔｒｕｍＨｙｂｒｉｄＬｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（ＬｏｔｕｓｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（ＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＬｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（ＭａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓＬｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（ＭａｃｌｕｒａｐｏｍｉｆｅｒａＬｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（ＮａｒｃｉｓｓｕｓｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（ＰｅａｎｕｔＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（ＰｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓＥｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（ＰｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓＬｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（ＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（ＳｏｐｈｏｒａｊａｐｏｎｉｃａＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（ＳｏｙｂｅａｎＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（ＵｌｅｘｅｕｒｏｐａｅｕｓＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（ＶｉｃｉａｖｉｌｌｏｓａＬｅｃｔｉｎ）、ＷＦＡ（ＷｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）があげられる。
Ｎ−グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（ＬｅｎｓＣｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａＬｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）を挙げることができる。
６．本発明の融合蛋白質組成物の利用
本発明の融合蛋白質組成物は高いＡＤＣＣ活性を有する。高いＡＤＣＣ活性を有する融合蛋白質は、腫瘍、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、微生物感染を伴う疾患などの各種疾患の予防および治療において有用である。
腫瘍としては、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病等の急性白血病、リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫、ＮＫ／Ｔ細胞性リンパ腫などのＴ細胞性腫瘍、慢性白血病などの白血病、骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫などの血液腫瘍および癌などの悪性腫瘍が含有される。
炎症性疾患としては、急性あるいは慢性の気道過敏性や気管支喘息、アトピー性皮膚炎を含むアトピー性皮膚疾患、アレルギー性鼻炎または花粉症などの炎症性疾患、慢性副鼻腔炎、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患などの炎症性疾患が包含される。
自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、メモリーＴ細胞による抗原提示が関与する免疫システム異常に起因する疾患が包含される。メモリーＴ細胞とは、主にＣＤ４５ＲＯ陽性を示す活性化Ｔ細胞を示し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）より抗原の情報を受け取り、免疫システムを活性化する細胞群を示す。
循環器疾患としては、動脈硬化症、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧、脳卒中、腎不全、大動脈瘤、閉塞性動脈硬化症、原発性肺高血圧症が含有される。
微生物感染を伴う疾患としては、レトロウイルスのヒトＴ細胞ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、肝炎ウイルス、エプスタイン−バー（ＥＢ）ウイルス、カポジ肉腫関連ウイルス、肝炎ウイルス等の感染によるウイルス性感染症、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌等の感染による細菌性感染症、白癬菌等の感染による真菌感染症が含有される。
本発明の融合蛋白質組成物は高い細胞傷害活性を有するため、従来の融合蛋白質組成物では治癒することができない、上述の腫瘍、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、微生物感染を伴う疾患などの各種疾患の患者を治療することができる。
以下に、本発明の融合蛋白質において、結合性蛋白質としての抗体の結合性断片に使用できる腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、または微生物感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体［ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．，１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）］、抗ＣＤ５２抗体［Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３（１９８８）］、抗ＭＡＧＥ抗体［ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３（２０００）］、抗ＨＭ１．２４抗体［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７（１９９９）］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９（２０００）］、抗ＦＧＦ８抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１（１９８９）］、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５−１６４６３（１９９０）］、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗インスリン様増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＭＳＡ抗体［Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６（１９９８）］、抗血管内皮細胞増殖因子抗体［ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５７，４５９３（１９９７）］または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８（２０００）］などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１（１９９８）］、抗腫瘍壊死因子抗体［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６−７８０，１９９９）、抗ケモカイン抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９（１９９４）］または抗ケモカイン受容体抗体［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３（１９９７）］などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００（１９９７）］または抗血液凝固因子抗体［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８（２０００）］などがあげられる。
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１（２０００）］などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体または抗ベロ毒素抗体［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６（１９９９）］などがあげられる。
上記抗体は、ＡＴＣＣ（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
以下に、本発明の上記の抗体以外の結合性蛋白質と抗体Ｆｃ領域の融合抗体の具体例を述べる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患に関連する結合性蛋白質のＦｃ融合蛋白質の具体例としては、ｓＴＮＦＲＩＩのＦｃ融合蛋白質であるｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（ＵＳＰ５６０５６９０）、抗原提示細胞上に発現しているＬＦＡ−３のＦｃ融合蛋白質であるａｌｅｆａｃｅｐｔ（ＵＳＰ５９１４１１１）、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ−４（ＣＴＬＡ−４）のＦｃ融合蛋白質［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１，１８６９（１９９５）］、インターロイキン−１５のＦｃ融合蛋白質［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，５７４２（１９９８）］、ファクターＶＩＩのＦｃ融合蛋白質［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，１２１８０（２００１）］、インターロイキン１０のＦｃ融合蛋白質［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，５５９０（１９９５）］、インターロイキン２のＦｃ融合蛋白質［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，９１５（１９９１）］、ＣＤ４０のＦｃ融合蛋白質［Ｓｕｒｇｅｒｙ．１３２，１４９（２００２）］、Ｆｌｔ−３（ｆｍｓ−ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ）のＦｃ融合蛋白質［Ａｃｔａ．Ｈａｅｍａｔｏ．，９５，２１８（１９９６）］およびＯＸ４０のＦｃ融合蛋白質［Ｊ．Ｌｅｕ．Ｂｉｏｌ．，７２，５２２（２００２）］などがあげられる。これらの他にも、各種ヒトＣＤ分子［ＣＤ２、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１３７］や接着分子［ＡＬＣＡＭ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄｌｅｕｋｏｃｙｔｅｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｃａｄｈｅｒｉｎｓ、ＩＣＡＭ（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３］、サイトカイン受容体（以下、受容体をＲと表記する）（ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ）、ケモカイン、細胞死誘導シグナル分子［Ｂ７−Ｈ１、ＤＲ６（Ｄｅａｔｈｒｅｃｅｐｔｏｒ６）、ＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ−１）、ＴＲＡＩＬＲ１］、共刺激分子［Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ２、ＩＣＯＳ（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）］、増殖因子（ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＨＧＦＲ）あるいは分化誘導因子（Ｂ７−Ｈ３）、活性化因子（ＮＫＧ２Ｄ）、シグナル伝達分子（ｇｐ１３０）および該結合蛋白質の受容体やリガンドと抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質は多数報告されている。
本発明により得られる融合蛋白質組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、Ｆｃ融合蛋白質組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該Ｆｃ融合蛋白質組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該Ｆｃ融合蛋白質組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該Ｆｃ融合蛋白質組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。
また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、Ｆｃ融合蛋白質組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３６，３７３（１９９３）；ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。

第１図は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの造成工程を示した図である。
第２図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８対立遺伝子を１コピー破壊したヘミノックアウトクローンのゲノ厶サザンの解析結果を示した図である。レーンは左からそれぞれ分子量マーカー、ヘミノックアウトクローン５０−１０−１０４および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のゲノムサザンである。
第３図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８両対立遺伝子を破壊したダブルノックアウトクローンＷＫ７０４のゲノムサザン解析結果を示した図である。矢印は、相同組換えが起こった際に検出される陽性断片の検出位置を示す。
第４図は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のＦＵＴ８両対立遺伝子を破壊したダブルノックアウトクローンより薬剤耐性遺伝子を除去したクローンのゲノムサザン解析結果を示した図である。レーンは左からそれぞれ分子量マーカー、ダブルノックアウトクローンの薬剤耐性遺伝子除去クローン４−５−Ｃ３、ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４、ヘミノックアウトクローン５０−１０−１０４および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のゲノムサザンである。
第５図は、プラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＨを示した図である。
第６図は、プラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＬを示した図である。
第７図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃを示した図である。
第８図は、精製した抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の還元状態および非還元状態におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンを示した図である。蛋白質の染色は、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で行った。
第９図は、各種抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−ＦｃのＪｕｒｋａｔ細胞に対する、蛍光抗体法における結合活性を示した図である。横軸に蛍光強度を、縦軸に細胞数をそれぞれ示す。Ａは抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）、Ｂは抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、Ｃは陰性対照であるＫＭ８４０４での結果をそれぞれ示す。１は抗体非添加、２は抗体濃度５０μｇ／ｍｌ、３は抗体濃度２μｇ／ｍｌでの結果をそれぞれ示す。
第１０図は、各種抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃの抗原であるＴＡＧ−７２に対する、ＥＬＩＳＡ法における結合活性を示した図である。横軸にサンプル濃度を、縦軸に各サンプル濃度における吸光度をそれぞれ示す。●は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２ｓｃｆｖ−Ｆｃ（＋）、△が陰性対照であるＫＭ８４０４をそれぞれ示す。
第１１図は、各種抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃの抗原ＴＡＧ−７２非存在下でのｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。横軸にサンプル濃度を、縦軸に各サンプル濃度における吸光度をそれぞれ示す。●は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。ＡはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、ＢはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）での結果をそれぞれ示す。
第１２図は、各種抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃの抗原ＴＡＧ−７２存在下でのｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。横軸にサンプル濃度を、縦軸に各サンプル濃度における吸光度を示す。●は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。ＡはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、ＢはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）での結果をそれぞれ示す。
第１３図は、各種抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−ＦｃのＪｕｒｋａｔ細胞およびＲａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸にサンプル濃度を、縦軸に各サンプル濃度におけるＡＤＣＣ活性（％）をそれぞれ示す。●は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。ＡはＪｕｒｋａｔ細胞、ＢはＲａｊｉ細胞での結果をそれぞれ示す。
第１４図は、プラスミドｐＮＵＴＳの造成工程を示した図である。
第１５図は、プラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃの造成工程を示した図である。
第１６図は、精製した各種ｓｃＦｖのＦｃ融合蛋白質の還元状態および非還元状態におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンを示した図である。蛋白質の染色は、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で行った。レーン１は、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）を、レーン２は、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）を、レーン３は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）を、レーン４は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）を、レーン５は、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）を、レーン６は、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）を、レーン７は、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）を、レーン８は、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。
第１７図は、各種抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−ＦｃのＴ４７Ｄ細胞またはＲａｊｉ細胞に対する、蛍光抗体法における結合活性を示した図である。横軸に蛍光強度を、縦軸に細胞数をそれぞれ示す。ＡはＴ４７Ｄ細胞に、ＢはＲａｊｉ細胞に対する結果をそれぞれ示す。１は５０μｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、２は５０μｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）、３はｓｃＦｖ−Ｆｃ非添加での結果をそれぞれ示す。
第１８図は、各種抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃの抗原であるＭＵＣ１に対する、ＥＬＩＳＡ法における結合活性を示した図である。横軸に抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の濃度を、縦軸に吸光度をそれぞれ示す。●は抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）を、○は抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。ＡはＭＵＣ１を、Ｂは陰性対照であるＴＡＧ−７２を抗原として用いた結果をそれぞれ示す。
第１９図は、各種抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃの抗原ＭＵＣ１非存在下でのｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。横軸に抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の濃度を、縦軸に吸光度をそれぞれ示す。●は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、○は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。Ａは、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）での、Ｂは、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）での結果をそれぞれ示す。
第２０図は、各種抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃの抗原ＭＵＣ１存在下でのｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を示した図である。横軸に抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の濃度を、縦軸に吸光度をそれぞれ示す。●は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、○は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。Ａは、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）での、Ｂは、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）での結果をそれぞれ示す。
第２１図は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−ＦｃのＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸にサンプル濃度を、縦軸に各サンプル濃度におけるＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。●は抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、○は抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。ＡはＴ４７Ｄ細胞、ＢはＲａｊｉ細胞での結果をそれぞれ示す。
第２２図は、プラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃの造成工程を示した図である。
第２３図は、プラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃの造成工程を示した図である。
第２４図は、各種ｓｃＦｖ_２−ＦｃのＲａｊｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＴ４７Ｄ細胞に対する、蛍光抗体法における結合活性を示した図である。横軸に蛍光強度を、縦軸に細胞数をそれぞれ示す。ＡはＲａｊｉ細胞に、ＢはＪｕｒｋａｔ細胞に、ＣはＴ４７Ｄ細胞に対する結果を示す。１は７５μｇ／ｍＬのｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、２は７５μｇ／ｍＬのｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）、３は７５μｇ／ｍＬのｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、４は７５μｇ／ｍＬのｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）、５はｓｃＦｖ_２−Ｆｃ非添加での結果をそれぞれ示す。
第２５図は、各種ｓｃＦｖ_２−ＦｃのＴＡＧ−７２に対する、ＥＬＩＳＡ法における結合活性を示した図である。横軸にｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度における吸光度をそれぞれ示す。▲は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、△は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）、●は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。Ａは各種抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ、Ｂは各種抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃでの結果をそれぞれ示す。
第２６図は、各種ｓｃＦｖ_２−ＦｃのＭＵＣ１に対する、ＥＬＩＳＡ法における結合活性を示した図である。横軸にｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度における吸光度をそれぞれ示す。▲は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、△は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）、●は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。Ａは各種抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ、Ｂは各種抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃでの結果をそれぞれ示す。
第２７図は、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−ＦｃのｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。横軸にサンプル濃度を、縦軸に各サンプル濃度における吸光度をそれぞれ示す。▲は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、△は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。ＡはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ＢはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）での結果をそれぞれ示す。
第２８図は、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃの抗原非存在下でのｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。横軸にサンプル濃度を、縦軸に各サンプル濃度における吸光度をそれぞれ示す。●は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。ＡはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ＢはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）での結果をそれぞれ示す。
第２９図は、各種ｓｃＦｖ_２−Ｆｃの抗原存在下でのｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性を示した図である。▲は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、△は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）、●は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。ＡはＴＡＧ−７２存在下での、ＢはＭＵＣ１存在下での結果をそれぞれ示す。
第３０図は、各種ｓｃＦｖ_２−ＦｃのＪｕｒｋａｔ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸にｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度におけるＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。図のＡ中の▲は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、△は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）を、図のＢ中の●は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。
第３１図は、各種ｓｃＦｖ_２−ＦｃのＴ４７Ｄ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸にｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度におけるＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。図のＡ中の▲は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、△は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）を、図のＢ中の●は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。
第３２図は、各種ｓｃＦｖ_２−ＦｃのＲａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸にｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ濃度におけるＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。図のＡ中の▲は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、△は抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）を、図のＢ中の●は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、○は抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。
第３３図は、プラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−１を示した図である。
第３４図は、プラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−２を示した図である。
第３５図は、プラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを示した図である。
第３６図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを示した図である。
第３７図は、精製したｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元状態および非還元状態における電気泳動パターンを示した図である。蛋白質の染色は、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で行った。
第３８図は、各種ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの抗ＴＮＦＲＩＩ抗体に対する、ＥＬＩＳＡ法における結合活性を示した図である。横軸にｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度における抗ＴＮＦＲＩＩ抗体との結合活性をそれぞれ示す。○はｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）、●はｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）をそれぞれ示す。
第３９図は、各種ｓＴＮＦＲＩＩ−ＦｃのｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。横軸にｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度における結合活性をそれぞれ示す。○はｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）、●はｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）をそれぞれ示す。ＡはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、ＢはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）での結果をそれぞれ示す。
第４０図は、各種ｓＴＮＦＲＩＩ−ＦｃのマウスＴＮＦ−αに対する中和活性を示した図である。横軸にｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度におけるＴＮＦ−α中和活性をそれぞれ示す。●はｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）、○はｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）での結果をそれぞれ示す。
第４１図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ△１−１２ＴＮＦ−αの造成工程を示した図である。
第４２図は、ＴＮＦ−α／ＥＬ４および親株であるＥＬ４細胞の膜型ヒトＴＮＦ−αの発現をフローサイトメーターを用いて解析した図である。
第４３図は、各種ｓＴＮＦＲＩＩ−ＦｃのＴＮＦ−α／ＥＬ４細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸にｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度におけるＡＤＣＣ活性（％）をそれぞれ示す。●がｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）、○がｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）の活性をそれぞれ示す。
第４４図は、プラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ＬＦＡ−３−Ｆｃを示した図である。
第４５図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＬＦＡ−３−Ｆｃを示した図である。
第４６図は、精製したＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）の還元状態および非還元状態におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンを示した図である。蛋白質の染色は、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で行った。
第４７図は、各種ＬＦＡ−３−ＦｃのＣＤ２発現細胞株に対する、蛍光抗体法における結合活性を示した図である。横軸にＬＦＡ−３−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ＬＦＡ−３−Ｆｃ濃度における平均蛍光強度をそれぞれ示す。●はＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）、○はＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。
第４８図は、各種ＬＦＡ−３−ＦｃのｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。横軸にＬＦＡ−３−Ｆｃ濃度を、縦軸に各ＬＦＡ−３−Ｆｃ濃度における結合活性をそれぞれ示す。○はがＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）、●はＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）の活性をそれぞれ示す。ＡはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）型、ＢはｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）型での結果をそれぞれ示す。
第４９図は、各種ＬＦＡ−３−ＦｃのＪｕｒｋａｔ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸はＬＦＡ−３−Ｆｃ濃度を、縦軸は各ＬＦＡ−３−Ｆｃ濃度におけるＡＤＣＣ活性（ＯＤ４９０）それぞれ示す。●はＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）、○はＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）をそれぞれ示す。
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［実施例１］
ゲノム上のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ８と表記する）両対立遺伝子を破壊したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
ＦＵＴ８両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノ厶領域を欠失させたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株を以下の手順で造成した。
１．チャイニーズハ厶スターＦＵＴ８遺伝子のエクソン２を含むターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築
ＷＯ０２／３１１４０の実施例１３の第１項に記載の方法で構築されたチャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子のエクソン２を含むターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８ＰｕｒｏおよびｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）を用いて、以下のようにしてｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを構築した。
ｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）を制限酵素ＡｓｃＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＳｐｉｎＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いてネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットを含む約１．６ＫｂのＡｓｃＩ断片を回収した。
次に、ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを制限酵素ＡｓｃＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、大腸菌Ｃ１５株由来ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）により、ＤＮＡ断片の末端を脱リン酸化させた。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿法を用いて、ＤＮＡ断片を精製した。
上記で得たｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ由来のＡｓｃＩ断片（約１．６Ｋｂ）０．１μｇとｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ由来のＡｓｃＩ断片（約１０．１Ｋｂ）０．１μｇに滅菌水を加えて５μＬとし、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社製）５μＬを加えて１６℃で３０分間反応させることにより、連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより各々プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により塩基配列を解析した。このようにして第１図に示したｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを得た。ｐＫＯＦＵＴ８ＮｅｏはＣＨＯ細胞のＦＵＴ８遺伝子ヘミノックアウト細胞株を作製するためのターゲティングベクターとして用いた。
２．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子の１コピーを破壊したヘミノックアウト細胞株の作製
（１）ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏ導入株の取得
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌｅｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］に、本実施例の第１項で構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８ゲノム領域ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを以下のようにして導入した。
ｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを制限酵素ＳａｌＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化して線状化し、線状化した４μｇのｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを１．６×１０^６個のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により導入した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［透析ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）［透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地］１０ｍＬに培地交換した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１５日間の培養を行い、Ｇ４１８耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断
本項（１）で取得したＧ４１８耐性クローンの相同組換えの診断を、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより、以下のように行った。
９６穴プレート上のＧ４１８耐性クローンに対してトリプシン処理を行った後、２倍容量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］を各ウェルに添加、懸濁した。各ウェル中の細胞懸濁液の半量を接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存した。
レプリカプレート上のネオマイシン耐性クローンは、Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）で５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した後、細胞を回収し、回収した細胞から公知の方法［ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々３０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍＬＲＮａｓｅＡ］に一晩溶解した。
ゲノムＰＣＲに用いるプライマーは以下のように設計した。まず、ＷＯ０３／３１１４０の実施例１２に記載の方法により取得したＦＵＴ８ゲノム領域の配列（配列番号５５）の中から、配列番号５６または配列番号５７でそれぞれ示されるプライマーをフォワードプライマーとした。また、ターゲティングベクターのｌｏｘＰ配列に特異的に結合するプライマー（配列番号５８または配列番号５９）をリバースプライマーとし、以下のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液を各々１０μＬ含む２５μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー（フォワードプライマーとリバースプライマーを組み合わせて使用する）］を調製し、９４℃にて３分間の加熱の後、９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて２分間からなる反応を１サイクルとしてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、該反応液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、相同組換えによって生じる約１．７Ｋｂの特異的増幅産物が認められた株を陽性クローンと判定した。
（３）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（２）で取得された陽性クローンの相同組換えの診断を、ゲノムＤＮＡを用いたサザンブロットにより、以下のように行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、本項（２）で見出された陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１０分間静置した後、陽性クローンに該当するウェル中の細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（グライナー社製）へ播種した。Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（グライナー社製）へ播種した。該プレートを５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて培養し、細胞を回収した。回収した細胞より公知の方法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，３，２３０３（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々１５０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）に一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化し、エタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、２０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ］に溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，３６８３（１９７９）］に従って、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。ＷＯ０３／３１１４０の実施例１２に記載の方法により取得したＦＵＴ８ゲノム領域の配列（配列番号５５）の中から、配列番号６０および配列番号６１でそれぞれ示されるプライマーを作製し、以下のＰＣＲに用いた。ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載のｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２４ｎｇをテンプレートとして含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー］を調製し、９４℃にて１分間の加熱の後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、該反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＳｐｉｎＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を回収した。得られたプローブＤＮＡ溶液のうち５μＬを、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のゲノムＤＮＡ消化物が転写されたナイロン膜をローラーボトルへ封入し、１５ｍＬのハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］を加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った後、^３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を５０ｍＬの一次洗浄液［２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ナイロン膜を５０ｍＬの二次洗浄液［０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
第２図には、親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、および本項（２）で取得した陽性クローンである５０−１０−１０４株のゲノムＤＮＡを本法により解析した結果を示した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片のみが検出された。一方、陽性クローン５０−１０−１０４株では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片に加え、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約２０Ｋｂの断片が検出された。両断片の量比は１：１であったことから、５０−１０−１０４株は、ＦＵＴ８対立遺伝子のうち１コピーが破壊されたヘミノックアウトクローンであることが確認された。
３．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製
（１）ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ導入株の作製
本実施例の第２項で得たＦＵＴ８遺伝子ヘミノックアウトクローンのもう一方のＦＵＴ８対立遺伝子を破壊するために、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１３の第１項に記載のチャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクターであるｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを以下のようにして導入した。
ｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを制限酵素ＳａｌＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化して線状化し、線状化した４μｇのｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを１．６×１０^６個のＦＵＴ８遺伝子ヘミノックアウトクローンへエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）１０ｍＬに培地交換した。この培地交換作業を７日毎に繰り返しながら５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１５日間の培養を行い、ピューロマイシン耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（１）で取得された薬剤耐性クローンの相同組換えの診断を、ゲノムＤＮＡを用いたサザンブロットにより以下のように行った。
ピューロマイシン耐性クローンを、公知の方法［ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，（１９９３）］に従って接着細胞用平底プレート（旭テクノグラス社製）へ採取し、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、接着細胞用平底２４穴プレート（グライナー社製）へ播種した。ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した後、同様にトリプシン処理を行い、接着細胞用平底６穴プレート（グライナー社製）へ播種した。該プレートを５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて培養し、回収した細胞より公知の方法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々１５０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８）に一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化し、エタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、２０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，３６８３，（１９７９）］に従って、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。
まず、ターゲティングベクターに含まれるＦＵＴ８ゲノム領域よりもさらに５’側の配列に特異的に結合するプライマー（配列番号６２および配列番号６３）を作製し、以下のＰＣＲに用いた。ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載のプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２４．０ｎｇをテンプレートとして含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー］を調製し、９４℃にて１分間の加熱の後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、該反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＳｐｉｎＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液のうち５μＬを、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のゲノムＤＮＡ消化物が転写されたナイロン膜をローラーボトルへ封入し、１５ｍＬのハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］を加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った後、^３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を５０ｍＬの一次洗浄液［２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ナイロン膜を５０ｍＬの二次洗浄液［０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
第３図には、５０−１０−１０４株から本項（１）に記載の方法により取得したピューロマイシン耐性クローンの１つであるＷＫ７０４株のゲノムＤＮＡを本法により解析した結果を示した。ＷＫ７０４株では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片が消失し、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約２０Ｋｂの断片（図中、矢印で示した）のみが検出された。この結果からＷＫ７０４株は、ＦＵＴ８両対立遺伝子が破壊されたクローンであることが確認された。
４．ＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトした細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
（１）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターの導入
本実施例の第３項で取得したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンの薬剤耐性遺伝子を除去することを目的として、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を以下のようにして導入した。
４μｇのｐＢＳ１８５を１．６×１０^６個のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンへエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）１０ｍＬに懸濁し、さらに同培地を用いて２万倍に希釈した。該希釈液を接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）７枚へ播種後、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１０日間の培養を行い、コロニーを形成させた。
（２）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
本項（１）で取得したコロニーのうち、任意のクローンを公知の方法［ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，（１９９３）］に従って接着細胞用平底プレート（旭テクノグラス社製）へ採取し、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対してトリプシン処理を行い、２倍容量の凍結培地［２０％ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％ＩＭＤＭ］を各ウェルに添加、懸濁した。各ウェル中の細胞顕濁液の半量を接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノガラス社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存した。
次にレプリカプレート上の細胞を、Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬ、ピューロマイシンを１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、一週間培養した。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によりｌｏｘＰ配列に挟まれた薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、Ｇ４１８およびピューロマイシン存在下で死滅する。本法により陽性クローンを選択した。
（３）ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項（２）で選択した陽性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、上記陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１０分間静置した。静置後、上記クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（グライナー社製）へ播種した。
ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて１週間培養した後、トリプシン処理を行い、接着細胞用平底６穴プレート（グライナー社製）へ播種して５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で培養し、増殖した細胞を回収した。回収した細胞より公知の方法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，３，２３０３（１９７６）］に従って各クローンのゲノ厶ＤＮＡを調製し、各々１５０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８）に一晩溶解した。
上記で調製したゲノ厶ＤＮＡ１２μｇを制限酵素ＮｈｅＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化し、エタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、２０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，３６８３（１９７９）］に従って、ナイロン膜へゲノ厶ＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。ターゲティングベクターに含まれるＦＵＴ８ゲノム領域よりもさらに５’側の配列に特異的に結合するプライマー（配列番号６２および配列番号６３）を用いて、以下のＰＣＲを行った。ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載のｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２４ｎｇをテンプレートとして含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー］を調製し、９４℃にて１分間の加熱の後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、該反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＳｐｉｎＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液のうち５μＬを、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のゲノムＤＮＡ消化物が転写されたナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーション後、^３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を５０ｍＬの一次洗浄液［２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、ナイロン膜を５０ｍＬの二次洗浄液［０．２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ］に浸漬し、６５℃で１５分間加温して洗浄した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィル厶へ−８０℃で暴露し現像した。
第４図には、親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、本実施例の第２項に記載の５０−１０−１０４株、本実施例の第３項に記載のＷＫ７０４株、およびＷＫ７０４株から本項（２）に記載の方法により取得した薬剤感受性クローンの１つである４−５−Ｃ３株のゲノムＤＮＡを、本法により解析した結果を示した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子に由来する約８．０ＫｂのＤＮＡ断片のみが検出された。また、５０−１０−１０４株やＷＫ７０４株では、相同組換えが起こった対立遺伝子に由来する約９．５ＫｂのＤＮＡ断片が認められた。一方、４−５−Ｃ３株では、相同組換えが起こった対立遺伝子からさらにネオマイシン耐性遺伝子（約１．６Ｋｂ）およびピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去されて生じる約８ＫｂのＤＮＡ断片のみが検出された。この結果から４−５−Ｃ３株は、Ｃｒｅリコンビナーゼにより薬剤耐性遺伝子が除去されたことが確認された。
薬剤耐性遺伝子の除去されたＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローン（以下、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞と表記する）は、４−５−Ｃ３株以外にも複数株取得された。
［実施例２］
ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞による抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃの発現
１．抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターの作製
（１）抗ＴＡＧ−７２マウスモノクローナル抗体のＶＨをコードするＤＮＡの構築
癌細胞表面抗原ＴＡＧ−７２を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体ＣＣ４９［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５１，６５５９（１９９３）、ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ／Ｌ１４５４９］のＶＨをコードするＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、配列番号１８に示される塩基配列を設計した。該配列は、ＣＣ４９のＶＨをコードする配列を、クローニングベクターおよび発現ベクターにクローニングするための制限酵素認識配列、コード領域の５’側にはｓｃＦｖ−Ｆｃの生産量を向上させるために１１塩基の非翻訳配列および３’側にはリンカーをコードする塩基配列を組み入れた。設計した配列番号１８に示される塩基配列はセンス鎖とアンチセンス鎖が交互になるように、５’端側から約１３０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し、隣り合う塩基配列はその末端の約２０塩基が重複し、対合できるようにし、配列番号１９、２０、２１および２２でそれぞれ示される４本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した。
４本の合成ＤＮＡのうち両端に位置する２本については終濃度が０．５μＭ、中間の２本については終濃度が０．１μＭとなるように、ＰＣＲ反応液［２．５ｕｎｉｔｓＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、１倍濃度のＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ＃２（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行なった後、７４℃にて５分間反応させた。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４５０ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４５０ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約２．９ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られた約４５０ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）由来の約２．９ｋｂｐの断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）により連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第５図に示したプラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＨが得られたことを確認した。
（２）抗ＴＡＧ−７２マウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの構築
癌細胞表面抗原ＴＡＧ−７２を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体ＣＣ４９［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５１，６５５９（１９９３）、ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ／Ｌ１４５５３］のＶＬをコードするＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、配列番号２３に示される塩基配列を設計した。該配列には、ＣＣ４９のＶＬをコードする配列を、クローニングベクターおよび発現ベクターにクローニングするための制限酵素認識配列、コード領域の３’側にヒンジ領域の塩基配列およびヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域の塩基配列、５’側にはＶＨとのリンカーをコードする塩基配列を組み入れた。設計した配列番号２３に示される塩基配列はセンス鎖とアンチセンス鎖が交互になるように、５’端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し、隣り合う塩基配列はその末端の約２０塩基が重複し、対合できるようにし、配列番号２４、２５、２６および２７でそれぞれ示される４本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した。
４本の合成ＤＮＡのうち両端に位置する２本については終濃度が０．５μＭ、中間の２本については終濃度が０．１μＭとなるように、ＰＣＲ反応液［２．５ｕｎｉｔｓＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、ＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ＃２（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行なった後、７４℃にて５分間反応させた。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約５４０ｂｐのＶＬのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４５０ｂｐのＰＣＲ産物由来の断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約２．９ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得た約４５０ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）由来の約２．９ｋｂｐの断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）により連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第６図に示したプラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＬが得られたことを確認した。
（３）抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３［Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１０３５（２０００）］、本項（１）および上記（２）で得られたプラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＨおよびｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＬから、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の発現ベクターを以下のようにして構築した。
上記（１）で得られたプラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＨを制限酵素ＡｃｃＩＩＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩＩＩ断片を回収した。
また、本項（２）で得られたプラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＬを制限酵素ＡｃｃＩＩＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢｍｇＢＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約５４０ｂｐのＡｃｃＩＩＩ−ＢｍｇＢＩ断片を回収した。
一方、ヒト化抗体発現用ベクタープラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢｍｇＢＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約９．８ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｍｇＢＩ断片を回収した。
上記で得られたプラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＨ由来のＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩＩＩ断片、プラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）／ＣＣ４９ＶＬ由来のＡｃｃＩＩＩ−ＢｍｇＢＩ断片およびプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来の断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）により連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入された塩基配列を解析し、第７図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃが得られたことを確認した。
２．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞での安定発現
実施例１の第４項に記載のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞であるＭｓ７０５細胞および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主細胞として用いて、本実施例の第１項で作製した抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃを導入して、抗体Ｆｃに付加する糖鎖の構造が異なる二種類の抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
８μｇのプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃを１．６×１０^６細胞のＭｓ７０５細胞あるいはＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により導入後、３０ｍＬのＩＭＤＭ−（１０）［Ｍｓ７０５細胞の場合には牛胎児血清（ＦＣＳ）を、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の場合には透析牛血清（ｄＦＢＳ）を１０％で含むＩＭＤＭ培地：ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製１培地に懸濁し、９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト社製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、６００μｇ／ｍＬの濃度でＧ４１８を含むＩＭＤＭ−（１０）培地において１〜２週間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を回収し、培養上清中の抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の産生量を後述する本実施例の第３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中にｓｃＦｖ−Ｆｃの発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する：ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−（１０）培地に懸濁し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、約１週間培養し、５０ｎＭのＭＴＸに耐性を示す形質転換株を取得した。次に、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的に６００μｇ／ｍＬのＧ４１８および２００ｎＭのＭＴＸを含むＩＭＤＭ−（１０）培地で増殖可能な形質転換株を取得した。取得した形質転換株について、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行った。
最終的に５００μｇ／ｍＬのＧ４１８および２００ｎＭのＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質を生産する形質転換株を取得した。親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株をＫＣ１２０１と、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞より得られた形質転換株をＫＣ１２００と名付けた。
３．培養上清中の抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ社製）をＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）で希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、室温で一時間静置して吸着させた。反応後、ＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する；ＰｒｏｌｉａｎｔＩｎｃ．社製）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを除去し、測定対象の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、ＰＢＳで５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体溶液（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
４．抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の精製
本実施例の第２項で得られた抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質を発現する形質転換株ＫＣ１２００およびＫＣ１２０１をそれぞれ２００ｎＭＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ＦＣＳ（１０）に１×１０^５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１８２ｃｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍＬ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を除去し、２５ｍＬのＰＢＳで洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３０ｍＬを注入した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清をそれぞれ回収した後、０．２２μｍ孔径ＰＥＳＭｅｍｂｒａｎｅ（イワキ社製）を用いて濾過滅菌した。上述の方法で回収した培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、異なる形質転換株で生産される二種類の抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質をそれぞれ精製した。以後、精製した抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質は、それぞれＫＣ１２００により生産される抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）およびＫＣ１２０１により生産される抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）と表記する。
５．精製抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の分析
本実施例の第４項で精製した抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製度および抗体に付加している全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を以下のようにして確認した。
（１）抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製度の評価
各精製抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の約３μｇを、公知の方法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］に従ってＳＤＳ変性ポリアクリルアミド電気永動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する）を行った。
結果を第８図に示した。二種類の精製蛋白質はそれぞれ、非還元条件下は約１１０キロダルトン（以下、ｋＤａと表記する）、還元条件下では約５５ＫＤａのバンドとして検出された。この結果は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の分子量が、非還元条件下では約１１０ＫＤａであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と表記する）が切断され、約５５ＫＤａの構成単位に分解されるという報告［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，３６，６１（１９９９）］と一致し、宿主の異なる抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）では泳動パターンが類似している。このことから、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は目的に合致したポリペプチド鎖として発現されていることが示唆された。
（２）精製抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の単糖組成分析
本実施例の第４項で得られた抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製標品を遠心濃縮機で減圧下乾固した後、２．０−４．０Ｍのトリフルオロ酢酸溶液を加えて１００℃、２〜４時間酸加水分解を行い、タンパク質から中性糖・アミノ糖を遊離した。トリフルオロ酢酸溶液を遠心濃縮機で除去し、脱イオン水に再溶解してＤｉｏｎｅｘ社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析を行った。ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１カラム、ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１ガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用い、溶離液として１０−２０ｍＭ水酸化ナトリウム−脱イオン水溶解液、洗浄液として５００ｍＭ水酸化ナトリウム−脱イオン水溶解液を使用して、第１表に示した溶出プログラムで分析した。

得られた溶出プロファイルの中性糖・アミノ糖成分のピーク面積から、Ｎ−アセチルグルコサミン比を４とした場合の各成分（フコース、ガラクトース、マンノース）の組成比を算出した。
第２表に各蛋白質の単糖組成比により計算される、全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を示した。抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）ではフコースが結合していない糖鎖の割合が９％であった。一方、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、フコースが結合していない糖鎖の割合はほぼ１００％と見積もられた。
以上の結果より、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンには、フコースが結合していないことが示された。

［実施例３］
抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の活性評価
１．抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質のＴＡＧ−７２発現細胞に対する結合活性（蛍光抗体法）
実施例２の第４項で得られた抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製標品の結合活性を、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ−ＸＬ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いた蛍光抗体法によって評価した。陰性対照として抗ＩＬ−５受容体ヒト化抗体ＫＭ８４０４［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，３４６６（２００３）］を用いた。
ＴＡＧ−７２陽性細胞であるヒトＴ細胞リンパ腫由来細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＲＣＢ０８０６）を１ウェル当たり２×１０^５個になるように９６ウェルＵ字プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に分注し、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）または陰性対照である抗ＩＬ−５受容体ヒト化抗体ＫＭ８４０４をＦＡＣＳ用緩衝液（０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ_３および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で終濃度が０．０１６〜５０μｇ／ｍＬとなるように希釈した抗体溶液を５０μＬ／ウェルで添加して、氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）をＦＡＣＳ用緩衝液で２０倍希釈して５０μＬ／ウェルで添加した。遮光下氷中で３０分間反応させた後、ＦＡＣＳ用緩衝液で３回洗浄し、５００μＬのＰＢＳに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。
結果を第９図に示した。抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）については濃度依存的に蛍光強度が増加しており、各濃度でのＪｕｒｋａｔ細胞への結合活性は同等であったが、陰性対照である抗ＩＬ−５受容体ヒト化抗体ＫＭ８４０４はＪｕｒｋａｔ細胞には結合しなかった。以上のことから、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のＴＡＧ−７２陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞への結合は、融合蛋白質のｓｃＦｖ部分に特異的な結合であり、この結合は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質に付加する糖鎖中のフコース含量とは無関係であることが示された。
２．抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−ＦｃのＴＡＧ−７２結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
ヒト体液由来のＴＡＧ−７２（シグマ社製）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注して室温で一時間静置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを除去し、０．００３２μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度で抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）または陰性対照である抗ＩＬ−５受容体ヒト化抗体ＫＭ８４０４を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体溶液（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
結果を第１０図に示した。抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的に抗原であるＴＡＧ−７２に結合することが確認され、その結合はほぼ同等であった。一方、陰性対照である抗ＩＬ−５受容体ヒト化抗体ＫＭ８４０４では、ＴＡＧ−７２に対する結合は認められなかった。以上のことから、作製した糖鎖構造の異なる二種類の抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の抗原であるＴＡＧ−７２への結合は、ｓｃＦｖ部分に特異的な結合であった。二種類の抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の抗原への結合活性はほぼ同等であったが、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）の抗原であるＴＡＧ−７２に対する結合活性は、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のＴＡＧ−７２に対する結合活性と比較して、若干であるが高いことが確認された。
３．抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−ＦｃのＦｃγ受容体ＩＩＩａ結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
Ｆｃγ受容体ＩＩＩａには、Ｎ末端のメチオニンから数えて１７６番目のアミノ酸残基の遺伝子多形によりバリン型（以下、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）と表記する）およびフェニルアラニン型（以下、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）と表記する）の二種が存在し、両者は抗体Ｆｃに対する結合活性が異なることが知られている。ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）およびＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対する抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の結合活性を測定した。測定に使用したヒスチジンタグ標識ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）およびヒスチジンタグ標識ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）は、後述する参考例に作製法を示した。
まず、マウス抗ヒスチジンタグ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）を吸着させたプレートに、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したヒスチジンタグ標識ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）またはヒスチジンタグ標識ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、０．００１７μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度で抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）あるいは抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５６μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
結果を第１１図に示した。抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的にＦｃγＲＩＩＩａに結合することが確認でき、ＦｃγＲＩＩＩａに対する抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）の結合活性は、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の結合活性と比較して有意に高いことが示された。この結果は、二種類のＦｃγＲＩＩＩａの多形において同様であった。また、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）およびｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）とＦｃγＲＩＩＩａとの間に結合が確認されたことより、ｓｃＦｖ−ＦｃのＦｃ領域は、ＦｃγＩＩＩａと結合活性を保持した形で発現していることが示された。
４．抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の抗原であるＴＡＧ−７２存在下でのＦｃγ受容体ＩＩＩａ結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
抗原であるＴＡＧ−７２の存在下で抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）およびＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）との結合活性を測定した。測定に使用したヒスチジンタグ標識ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）およびヒスチジンタグ標識ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）は、後述する参考例に作製法を示した。
まず、本実施例の第２項で作製したプレートに、０．００１７μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度で抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したヒスチジンタグ標識ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）またはヒスチジンタグ標識ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒスチジンタグ抗体溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
結果を第１２図に示した。抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）は濃度依存的にＦｃγＲＩＩＩａおよび抗原であるＴＡＧ−７２に対して結合活性が認められたが、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）では発色が認められなかった。これは、本実施例の第２項で確認された、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）と抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）との間で認められたＴＡＧ−７２に対する結合活性の差以上に大きく、このことは、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）が抗原ＴＡＧ−７２と結合している場合の抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性は、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）の方が抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）よりも高いことを示している。また、ＦｃγＲＩＩＩａの多形とは関係なしに、抗原であるＴＡＧ−７２の存在下でのＦｃγＲＩＩＩａに対する抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）の結合活性は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の結合活性よりも高いことが確認され、バリン型のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）においてはＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）と抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の差が顕著であった。
５．ＴＡＧ−７２発現細胞株に対する細胞傷害活性の評価（ＡＤＣＣ活性、^５１Ｃｒ解離法）
実施例２の第４項で得られた精製抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および精製抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するため、ＴＡＧ−７２陽性であるヒトＴ細胞リンパ腫由来細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＡＤＣＣ活性を、健常人ドナーから採取したエフェクター細胞を用いて、^５１Ｃｒ解離法によるＡＤＣＣ活性を以下のようにして測定した。また、陰性対照の細胞株として、ＴＡＧ−７２が発現していない細胞株であるＲａｊｉ細胞（ＲＣＢ０８０６）を用いた。
（１）標的細胞懸濁液の調製
Ｊｕｒｋａｔ細胞あるいはＲａｊｉ細胞を２×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるようにＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地［ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）］に懸濁し、放射性物質であるＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４を３．７ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地を用いて懸濁及び遠心分離操作を繰り返すことにより３回洗浄し、再度ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。洗浄後、ＲＰＭＩ１８４０−ＦＣＳ（１０）培地を１０ｍＬ加えて２×１０^５細胞／ｍＬに調整し、標的細胞懸濁液とした。
（２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（武田薬品社製）０．２ｍＬを加え穏やかに混合した。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（第一化学薬品社製）を用いて使用説明書に従って単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１回、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地で１回遠心分離して洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地を加えて２×１０^６細胞／ｍＬに調整し、ヒトエフェクター細胞懸濁液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０^４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（２）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（２×１０^５細胞／ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）を各最終濃度０．００００９４〜５０μｇ／ｍＬとなるように加えて全量を２００μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、遠心分離により該反応溶液を細胞群と上清とに分離し、上清中の^５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。同時に、は、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の^５１Ｃｒ量は、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。また、標的細胞全遊離^５１Ｃｒ量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１Ｎの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の^５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛（各サンプル濃度での^５１Ｃｒ量−エフェクター細胞自然遊離の^５１Ｃｒ量−標的細胞自然遊離の^５１Ｃｒ量）／（標的細胞全遊離の^５１Ｃｒ量−標的細胞自然遊離の^５１Ｃｒ量｝×１００
結果を第１３図に示した。図のＡに示されるように、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）において、ＴＡＧ−７２陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞に対して濃度依存的なＡＤＣＣ活性が認められた。いずれの抗体濃度においても、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）によるＡＤＣＣ活性は抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）によるＡＤＣＣ活性よりも高く、また、最大細胞傷害活性も抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）と比べて抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）の方が高く、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）が抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）と同等のＡＤＣＣ活性を示すためには、１０００倍の濃度が必要であり、本実施例の第２項で確認された抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）の抗原であるＴＡＧ−７２に対する結合活性の差以上の違いがあった。一方、図のＢに示されるように、ＴＡＧ−７２陰性であるＲａｊｉ細胞に対しては、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）およびｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）はともにＡＤＣＣ活性は認められなかった。
以上のことから、抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）と抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の間には、各Ｆｃ融合蛋白質組成物中の全Ｆｃ融合蛋白質に占める、Ｆｃ融合蛋白質に結合したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＦｃ融合蛋白質の割合には差があった。この割合の差が抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）と抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）との間のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の差であり、このＦｃγＩＩＩａに対する結合活性の差がＡＤＣＣ活性の差となっていることが確認できた。
［実施例４］
ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞による抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃの発現
１．抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターの作製
（１）ｓｃＦｖ−Ｆｃ汎用発現ベクターｐＮＵＴＳの構築
実施例２の第１項で作製したｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃをもとに、ｓｃＦｖ−ＦｃもしくはｓｃＦｖ_２−Ｆｃをコードする塩基配列を挿入するためのベクターを以下のようにして構築した。
まず、実施例２の第１項で作製したｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃを、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩ（宝酒造社製）を用いて切断した後、ＭｕｎｇＢｅａｎＮｕｃｒｅａｓｅ（宝酒造社製）を用いて末端の平滑化反応を行った。反応後、該反応液にＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を加えて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドの塩基配列を解析し、第１４図に示されるプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃ（Ｂ−Ｓ−）が得られたことを確認した。
次に、配列番号７７に示される塩基配列を以下の手順で設計した。該配列には、該配列をプラスミドに組み入れるための制限酵素認識配列（５’末端側がＥｃｏＲＩ、３’末端側がＡｃｃＩＩＩ）、Ｓｉｇｎａｌ配列をコードする塩基配列（制限酵素ＡｇｅＩ認識配列を含む）、および該配列中に最大２対のＶＨおよびＶＬを組み入れるための制限酵素認識配列（５’末端側よりＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩを含む）をそれぞれ含む配列番号７８および７９でそれぞれ示される合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した後、定法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）］に従って２本の合成ＤＮＡのアニーリング反応を行い、得られたＤＮＡカセットをアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約８０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
一方、上記のプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃ（Ｂ−Ｓ−）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１０．５ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られた約８０ｂｐのＤＮＡ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃ（Ｂ−Ｓ−）由来の断片とを、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第１４図に示したプラスミドｐＮＵＴＳが得られたことを確認した。
（２）抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体のＶＨをコードするＤＮＡのｐＮＵＴＳベクターへの挿入
癌細胞表面抗原ＭＵＣ１を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体Ｃ５９５［ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ７６，６１４（１９９７）］のＶＨをコードするＤＮＡを以下のようにしてｐＮＵＴＳベクターに挿入した。
配列番号８０に示される塩基配列を以下の手順で設計した。まず、データベース（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ／Ｓ７７０３４）の抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体Ｃ５９５のＶＨの塩基配列は、ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ，７６，６１４（１９９７）に記載の抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体Ｃ５９５のＶＨのアミノ酸配列のうち、Ｎ末端およびＣ末端の一部に相当する塩基配列が欠失していたため、同一のアミノ酸配列を持つ抗体クローンの塩基配列を参照し、補完した。また、同文献中に記載の、抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体Ｃ５９５のＶＨの数アミノ酸残基を改変し、ｓｃＦｖに適したＶＨのアミノ酸配列をコードするように塩基配列を一部改変した。このようにして得られたＶＨの塩基配列の５’側に、発現ベクターにクローニングするための制限酵素ＡｇｅＩ認識配列およびＳｉｇｎａｌ配列を、３’側にはリンカーをコードする塩基配列および制限酵素認ＢａｍＨＩ識配列を付加した。設計した配列を、センス鎖とアンチセンス鎖が交互になるように、５’端側から約１２０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し、隣り合う塩基配列はその末端の約２０塩基が重複し、対合できるようにし、配列番号８１、８２、８３および８４でそれぞれ示される４本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した。
４本の合成ＤＮＡのうち両端に位置する２本については終濃度が０．５μＭ、中間の２本については終濃度が０．１μＭとなるように、ＰＣＲ反応液［２．５ｕｎｉｔｓＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付の１０倍濃度ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）を１０分の１体積分含む］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて４分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行なった。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４００ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を制限酵素ＡｇｅＩ（ＮｉｐｐｏｎＧｅｎｅ社製）および制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４００ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
一方、本項（１）で作製したプラスミドｐＮＵＴＳを制限酵素ＡｇｅＩ（ＮｉｐｐｏｎＧｅｎｅ社製）および制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１０．５ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られた約４００ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドｐＮＵＴＳ由来の断片とを、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第１５図のＡに示したプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭが得られたことを確認した。
（３）抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターの構築
上記（２）で作製したｐＮＵＴＳ／ＨＭに抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体のＶＬをコードするＤＮＡを組み入れ、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の発現ベクターを以下のように構築した。
配列番号８５に示される塩基配列を以下の手順で設計した。まず、データベースの抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体Ｃ５９５のＶＬの塩基配列（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ／Ｓ７７０３２）は、文献中［ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ，７６，６１４（１９９７）］に記載の抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体Ｃ５９５ＶＬのアミノ酸配列のうち、Ｎ末端およびＣ末端の一部に相当する塩基配列が欠失していたため、同一のアミノ酸配列を持つ抗体クローンの塩基配列を参照し、補完した。また、同文献中に記載の抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体Ｃ５９５のＶＬの数アミノ酸残基を改変し、ｓｃＦｖに適したＶＬのアミノ酸配列をコードするように塩基配列を一部改変した。このような抗ＭＵＣ１マウスモノクローナル抗体Ｃ５９５のＶＬをコードする塩基配列の５’側に、発現ベクターにクローニングするための制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列およびリンカーをコードする塩基配列を、３’側にはヒンジをコードする塩基配列および制限酵素ＰｍａＣＩ認識配列を付加した。設計した配列番号８５に示される塩基配列を、センス鎖とアンチセンス鎖が交互になるように、５’端側から約１１０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し、隣り合う塩基配列はその末端の約２０塩基が重複し、対合できるようにし、配列番号８６、８７、８８および８９でそれぞれ示される４本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した。
４本の合成ＤＮＡのうち両端に位置する２本については終濃度が０．５μＭ、中間の２本については終濃度が０．１μＭとなるように、ＰＣＲ反応液［２．５ｕｎｉｔｓＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付の１０倍濃度ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）を１０分の１体積分含む］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて４分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行なった。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４００ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＰｍａＣＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４００ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
一方、本項（２）で作製したプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＰｍａＣＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１０．５ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られた約４００ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭ由来の断片とを、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第１５図に示したプラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃが得られたことを確認した。
２．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞での安定発現
実施例１の第４項に記載のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞であるＭｓ７０５細胞および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主細胞として用いて、本実施例の第１項で作製した抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃを導入して、抗体Ｆｃに付加する糖鎖の構造が異なる二種類の抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質を生産する形質転換株を実施例２の第２項に記載の方法に従って作製した。
実施例１の第４項に記載のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞であるＭｓ７０５細胞および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主細胞として用いて、本実施例の第１項で作製した抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃを導入して、抗体Ｆｃに付加する糖鎖の構造が異なる二種類の抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
８μｇのプラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃを１．６×１０^６細胞のＭｓ７０５細胞あるいはＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により導入後、２０ｍＬのＩＭＤＭ−（１０）［Ｍｓ７０５細胞の場合には牛胎児血清（ＦＣＳ）を、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の場合には透析牛血清（ｄＦＢＳ）を１０％で含むＩＭＤＭ培地：ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製］培地に懸濁し、９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト社製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−（１０）培地において１〜２週間培養した。各ウェルから培養上清を回収し、培養上清中に含まれる抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質量を実施例２の第３項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中にｓｃＦｖ−Ｆｃの発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤であるＭＴＸを５０ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−（１０）培地に懸濁し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、約１週間培養し、５０ｎＭのＭＴＸに耐性を示す形質転換株を取得した。次に、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的に２００ｎＭのＭＴＸを含むＩＭＤＭ−（１０）培地で増殖可能な形質転換株を取得した。
最終的に２００ｎＭの濃度でＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質を生産する形質転換株を取得した。親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株をＫＭ３４８７と、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞であるＭｓ７０５細胞より得られた形質転換株をＫＭ３４８６とそれぞれ名付けた。
３．抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の精製
本実施例の第２項で得られた抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質を発現する形質転換細胞株ＫＭ３４８６およびＫＭ３４８７をそれぞれ２００ｎＭＭＴＸを含むＩＭＤＭ−（１０）に１×１０^５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１８２ｃｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に３５ｍＬ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を除去し、２５ｍＬのＰＢＳで洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３０ｍＬを注入した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、５日間培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清をそれぞれ回収した後、０．２２μｍ孔径ＰＥＳＭｅｍｂｒａｎｅ（イワキ社製）を用いて濾過滅菌した。上述の方法で回収した培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、ＫＭ３４８６およびＫＭ３４８７で生産される二種類の抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質をそれぞれ精製した。以後、形質転換株ＫＭ３４８６により生産される精製した抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および形質転換株ＫＭ３４８７により生産される精製した抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）とそれぞれ表記する。
４．精製抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の分析
本実施例の第３項で精製した抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製度および抗体に付加している全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を以下のようにして確認した。
（１）抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製度の評価
各精製抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の約３μｇを用い、実施例２の第５項（１）に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を第１６図に示した。図のＡおよびＢ共に、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）はレーン３に、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）はレーン４にそれぞれ示した。これら二種類の精製蛋白質はそれぞれ、図のＡに示す非還元条件下では約１１０ｋＤａ、図のＢに示す還元条件下では約５５ＫＤａのバンドとして検出された。この結果は、実施例２の第５項（１）の結果と一致しており、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は目的に合致したポリペプチド鎖として発現されていることが示唆された。
（２）精製抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の単糖組成分析
本実施例の第３項で得られた抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製標品の単糖組成分析を実施例２の第５項（２）に記載の方法に従って行った。
第３表に各蛋白質の単糖組成比により計算される、全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を示した。

抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）ではフコースが結合していない糖鎖の割合が９％であった。一方、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、フコースが結合していない糖鎖の割合はほぼ１００％と見積もられた。
以上の結果より、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンには、フコースが結合していないことが示された。
［実施例５］
抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の活性評価
１．抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質のＭＵＣ１発現細胞に対する結合活性（蛍光抗体法）
実施例４の第３項で得られた抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製標品の結合活性を、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ−ＸＬ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いた蛍光抗体法によって評価した。
ＭＵＣ１陽性細胞であるヒト乳癌由来細胞株Ｔ−４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−１３３）を１ウェル当たり２×１０^５個になるように９６ウェルＵ字プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に分注し、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）あるいは抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）をＦＡＣＳ用緩衝液で終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように希釈した抗体溶液を５０μＬ／ウェルで添加して、氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）をＦＡＣＳ用緩衝液で２０倍希釈したものを５０μＬ／ウェルで添加した。遮光し氷中で３０分間反応させた後、ＦＡＣＳ用緩衝液で３回洗浄し、５００μＬのＰＢＳに懸濁して、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。また、陰性対照としてＭＵＣ１陰性細胞であるＲａｊｉ細胞についても同様の操作を行った。
結果を第１７図に示した。抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は、Ｔ−４７Ｄ細胞に対しては結合を示し、Ｒａｊｉ系細胞に対しては結合を示さなかった。また、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のＴ−４７Ｄ細胞への結合活性は同等であった。以上のことから、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のＭＵＣ１陽性細胞であるＴ−４７Ｄ細胞への結合は、Ｆｃ融合蛋白質のｓｃＦｖ部分に特異的な結合であり、この結合は抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質のＦｃに付加する糖鎖中のフコース含量とは無関係であることが示された。
２．抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−ＦｃのＭＵＣ１結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
ヒト体液由来のＭＵＣ１（ＢｒｅａｓｔＴｕｍｏｒＡｎｔｉｇｅｎ：シグマ社製）をＰＢＳで１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬに希釈した後、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に５０μＬ／ウェルで分注し、室温で一時間静置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを除去した後、Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（シグマ社製）を０．００５ｕｎｉｔｓ／ｍＬの濃度で、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｒｏｃｈｅ社製）をｌｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ含むＰＢＳを５０μＬ／ウェルで分注し、３７℃で２０分間静置してＭＵＣ１の脱シアル酸化を行った。反応後、ＰＢＳで洗浄し、０〜１０μｇ／ｍＬの濃度で抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体溶液（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ基質液（シグマ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４５０を測定した。また、陰性対照として、ヒト体液由来のＴＡＧ−７２（シグマ社製）を吸着させたプレートについても同様の操作を行った。
結果を第１８図に示した。図のＡに示されるように、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的に、抗原であるＭＵＣ１に結合できることが確認され、その結合は抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）間でほぼ同等であった。一方、図のＢに示されるように、陰性対照の抗原であるＴＡＧ−７２に対する、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）結合は認められなかった。以上のことから、作製した糖鎖構造の異なる二種類の抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の、抗原であるＭＵＣ１への結合は、ｓｃＦｖ部位に特異的な結合であった。
３．抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−ＦｃのＦｃγ受容体ＩＩＩａ結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）またはＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対する抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の結合活性を、実施例３の第３項に記載の方法に従って測定した。なお、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は、０〜１０μｇ／ｍＬの濃度で反応時に添加した。また、発色はＴＭＢ基質液を用いて発色させ、ＯＤ４５０を測定した。
結果を第１９図に示した。図のＡに示されるように、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的にＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に結合することが確認でき、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性と比較して有意に高いことが示された。これは、図のＢに示されるように、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）においても同様の結果であった。また、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）およびｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）とＦｃγＲＩＩＩａとの間に結合が確認されたことより、ｓｃＦｖ−ＦｃのＦｃ領域は、ＦｃγＩＩＩａと結合活性を保持した形で発現していることが示された。
４．抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の抗原であるＭＵＣ１存在下でのＦｃγ受容体ＩＩＩａ結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
抗原であるＭＵＣ１の存在下で抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）との結合活性を、実施例３の第４項に記載の方法に従って測定した。なお、反応時に抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）は、０〜１０μｇ／ｍＬの濃度で添加して行った。また、発色はＴＭＢ基質液を用いて発色させ、ＯＤ４５０を測定した。
結果を第２０図に示した。抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）は濃度依存的にＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）および抗原であるＭＵＣ１に対して結合活性が認められたが、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）では発色が認められなかった。このことから、抗原であるＭＵＣ１の存在下での抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性は、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性よりも高いことが確認された。
５．ＭＵＣ１発現細胞株に対する細胞傷害活性の評価（ＡＤＣＣ活性、^５１Ｃｒ解離法）
上記実施例４の第３項で得られた抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の精製標品のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するためＭＵＣ１陽性細胞であるヒト乳癌由来細胞株Ｔ−４７Ｄに対するＡＤＣＣ活性を、実施例３の第５項に記載の方法に従って、以下のようにして測定した。また、陰性対照の細胞株として、ＭＵＣ１が発現していない細胞株であるＲａｊｉ細胞を用いた。なお、反応時に抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＭＵＣ１ｓｃＦＶ−Ｆｃ（＋）は、０〜１０μｇ／ｍＬの濃度で添加して行った。
結果を第２１図に示した。図のＡに示されるように、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）または抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）において、ＭＵＣ１陽性細胞であるＴ−４７Ｄ細胞に対して濃度依存的なＡＤＣＣ活性が認められ、抗ＭＵＣ１ｓｃＦＶ−Ｆｃ（−）のＡＤＣＣ活性は抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）によるＡＤＣＣ活性よりも高かった。また、最大細胞傷害活性も抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）と比べて抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）の方が高く、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）が抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）と同等のＡＤＣＣ活性を示すためには、１００倍の濃度が必要であった。また、図のＢに示されるように、ＭＵＣ１陰性であるＲａｊｉ細胞に対しては、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）はともにＡＤＣＣ活性は認められなかった。
以上のことから、抗ＭＵＣ１ｓｃＦＶ−Ｆｃ（−）と抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の間には、全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合に差が認められており、この糖鎖の割合の差が、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（−）と抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ−Ｆｃ（＋）の間のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の差となり、さらにこのＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の差が、ＡＤＣＣ活性の差となっていることが確認できた。
［実施例６］
ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞による二種類のｓｃＦＶを有するｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質の発現
抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖおよび抗体Ｆｃ領域が、Ｎ末端から順に並んでいる二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ−Ｆｃ融合蛋白質（以下、Ｎ末端側から連結した順に、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃまたは抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃと称す。）発現ベクターを、以下のようにして構築した。
１．抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ発現プラスミドの構築
実施例４の第１項（２）で作製したプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭに、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖのＶＬ部分および抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖを以下のようにして挿入し、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ発現プラスミドを構築した。
（１）プラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭへの抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖのＶＬ部分の挿入
配列番号９０に示される塩基配列を以下の手順で設計した。実施例４の第１項（３）で設計したＶＬ配列の３’末端側に付加したヒンジをコードするＤＮＡの塩基配列および制限酵素ＰｍａＣＩ認識配列を除き、リンカーをコードするＤＮＡの塩基配列および制限酵素ＳｐｅＩ認識配列を追加した。設計した配列番号９０に示される塩基配列を、センス鎖とアンチセンス鎖が交互になるように、５’端側から約１１０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し、隣り合う塩基配列はその末端の約２０塩基が重複し、対合できるようにし、配列番号８６、８７、８８および９１でそれぞれ示される４本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した。
４本の合成ＤＮＡのうち両端に位置する２本については終濃度が０．５μＭ、中間の２本については終濃度が０．１μＭとなるように、ＰＣＲ反応液［２．５ｕｎｉｔｓＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付の１０倍濃度ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）を１０分の１体積分含む］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて４分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行なった。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４００ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４００ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
一方、実施例４の第１項（２）で作製したプラスミドｐＮＵＴｓ／ＨＭを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１０．５ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られた約４００ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭ由来の約１０．５ｋｂｐの断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第２２図に示したプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭＬＭが得られたことを確認した。
（２）プラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭＬＭへの抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖの挿入
配列番号９２に示される塩基配列を以下の手順で設計した。実施例２の第１項で設計した抗ＴＡＧ−７２抗体ＣＣ４９のＶＨ、ＶＬおよびリンカーを含むｓｃＦｖのＤＮＡ配列の５’末端側に、ベクターへのクローニングのための制限酵素ＳｐｅＩ認識配列およびリンカーをコードする塩基配列を、３’末端側にヒンジをコードする塩基配列およびベクターへのクローニングのための制限酵素ＰｍａＣＩ認識配列を付加した。ここで、実施例２の第１項で作製した発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃを鋳型としたＰＣＲによって設計した配列番号９２に示されるｃＤＮＡを得るための、配列番号９３および９４でそれぞれ示される２本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃについては終濃度が１０ｎｇ／μＬ、２本のプライマーについては終濃度がそれぞれ０．５μＭとなるように、ＰＣＲ反応液［２ｕｎｉｔｓＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付の１０倍濃度ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）を１０分の１体積分含む］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて４分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行なった。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４００ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＰｍａＣＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約８００ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
一方、本項（１）で作製したプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭＬＭを制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＰｍａＣＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１１ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られた約８００ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＭＬＭ由来の約１１ｋｂｐの断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）要形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第２２図に示したプラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃが得られたことを確認した。
２．抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ発現プラスミドの作製
実施例４の第１項（１）で作製したプラスミドｐＮＵＴＳに、抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖおよび抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖを以下のようにして挿入し、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ発現プラスミドを構築した。
（１）発現ベクターｐＮＵＴＳへの抗ＴＡＧ−７２ｓｅＦｖの挿入
配列番号９５に示される塩基配列を以下の手順で設計した。実施例２の第１項で設計した抗ＴＡＧ−７２抗体ＣＣ４９のＶＨ、ＶＬおよびリンカーを含むｓｃＦｖのＤＮＡ配列の５’末端側に、ベクターへのクローニングのための制限酵素ＡｇｅＩ認識配列およびＳｉｇｎａｌ配列を、３’末端側にリンカーをコードする塩基配列およびベクターへのクローニングのための制限酵素ＳｐｅＩ認識配列を付加した。ここで、実施例２の第１項で作製した発現ベクタープラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃを鋳型としたＰＣＲによって設計した配列番号９５に示されるｃＤＮＡを得るための、配列番号９６および９７でそれぞれ示される２本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した。
ベクタープラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣＣ４９ｓｃＦｖ−Ｆｃについては終濃度が１０ｎｇ／μＬ、２本のプライマーについては終濃度がそれぞれ０．５μＭとなるように、ＰＣＲ反応液［２ｕｎｉｔｓＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付の１０倍濃度ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）を１０分の１体積分含む］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて４分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行なった。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４００ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を制限酵素ＡｇｅＩ（ＮｉｐｐｏｎＧｅｎｅ社製）および制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約８００ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
一方、実施例４の第１項で作製したプラスミドｐＮＵＴＳを制限酵素ＡｇｅＩ（ＮｉｐｐｏｎＧｅｎｅ社製）および制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１０．５ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られた約８００ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドｐＮＵＴＳ由来の約１０．５ｋｂｐの断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第２３図に示したプラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＴＬＴが得られたことを確認した。
（２）プラスミドｐＮＵＴＳ／ＨＴＬＴへの抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖの挿入
抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃの発現ベクターを以下のようにして構築した。
配列番号９８に示される塩基配列を以下の手順で設計した。実施例４の第１項で設計した抗ＭＵＣ１抗体Ｃ５９５のＶＨ、ＶＬおよびリンカーを含むｓｃＦｖのＤＮＡ配列の、５’末端側にベクターへのクローニングのための制限酵素ＳｐｅＩ認識配列およびリンカーをコードする塩基配列を、３’末端側にヒンジをコードする塩基配列およびベクターへのクローニングのための制限酵素ＰｍａＣＩ認識配列を付加した。ここで、実施例４の第１項で作製した発現プラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃを鋳型としたＰＣＲによって設計した配列番号９８に示されるｃＤＮＡを得るための、配列番号９４および９９でそれぞれ示される２本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を作製した。
プラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃについては終濃度が１０ｎｇ／μＬ、２本のプライマーについては終濃度がそれぞれ０．５μＭとなるように、ＰＣＲ反応液［２ｕｎｉｔｓＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付の１０倍濃度ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）を１０分の１体積分含む］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて４分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行なった。ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約８００ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＰｍａＣＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約８００ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
一方、実施例４の第１項で作製したプラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃを制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＰｍａＣＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１１ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得たＰＣＲ産物由来の断片とプラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ由来の断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥＭＲＦ’株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、第２３図に示したプラスミドｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃが得られたことを確認した。
３．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞での安定発現
実施例１の第４項に記載のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞であるＭｓ７０５細胞および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主細胞として用いて、本実施例の第１項で作製した抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃおよび抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターｐＮＵＴＳ／ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃをそれぞれ導入して、抗体Ｆｃに付加する糖鎖の構造が異なる二種類の抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ融合蛋白質および抗体Ｆｃに付加する糖鎖の構造が異なる二種類の抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ融合蛋白質を生産する形質転換株を実施例２の第２項に記載の方法に従って作製した。
最終的に２００ｎＭの濃度でＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能な、抗体Ｆｃに付加する糖鎖の構造が異なる二種類の抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ融合蛋白質および抗体Ｆｃに付加する糖鎖の構造が異なる二種類の抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ融合蛋白質を生産する形質転換株を取得した。抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃについては、親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株をＫＭ３４８９と、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞より得られた形質転換株をＫＭ３４８８と、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃについては、親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株をＫＭ３４９１と、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞より得られた形質転換株をＫＭ３４９０とそれぞれ名付けた。
４．二種類のｓｅＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質の精製
上記第３項で得られた四種類の形質転換株ＫＭ３４８８、ＫＭ３４８９、ＫＭ３４９０およびＫＭ３４９１からそれぞれ、実施例２の第４項に記載の方法に従って二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質を精製した。以後、精製した二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質は、それぞれＫＭ３４８８により生産される抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、ＫＭ３４８９により生産される抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）、ＫＭ３４９０により生産される抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）、ＫＭ３４９１により生産される抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）と表記する。
５．精製した二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質の分析
上記第４項で精製した抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）の精製度および抗体に付加している全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を以下のようにして確認した。
（１）精製抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質の精製度の評価
各精製抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質の約３μｇを用い、実施例２の第５項（１）に記載の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を第１６図に示した。図中、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）をレーン５に、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）をレーン６に、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）をレーン７に、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）をレーン８にそれぞれ示した。４種類の精製蛋白質はそれぞれ、非還元条件下では約１６０ｋＤａ、還元条件下では約８０ＫＤａのバンドとして検出された。この結果は精製蛋白質のアミノ酸配列より予想される分子量と一致している。このことから、各精製抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質は目的に合致したポリペプチド鎖として発現されていることが示唆された。
（２）精製した二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質の単糖組成分析
上記第４項で得られた抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質の精製標品の、実施例４の第４項（２）に記載の方法に従って、単糖組成分析を行った。
結果を第４表に示した。抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）ではフコースが結合していない糖鎖の割合が９％であった。一方、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｅＦｖＭ−Ｆｃ（−）ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、フコースが結合していない糖鎖の割合はほぼ１００％と見積もられた。
以上の結果より、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンには、フコースが結合していないことが示された。

［実施例７］
二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質の活性評価
１．二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質のＴＡＧ−７２発現細胞およびＭＵＣ１発現細胞に対する結合活性（蛍光抗体法）
実施例６の第４項で得られた抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）の精製標品の結合活性を、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ−ＸＬ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、実施例３の第１項に記載の方法に従って蛍光抗体法によって評価した。なお、ＴＡＧ−７２陽性かつＭＵＣ１陰性細胞であるヒトＴ細胞リンパ腫由来細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞をＴＡＧ−７２発現細胞として、ＭＵＣ１陽性かつＴＡＧ−７２陰性細胞であるヒト乳癌由来細胞株Ｔ−４７Ｄ細胞をＭＵＣ１発現細胞としてそれぞれ用いた。また、陰性対照としてＴＡＧ−７２陰性かつＭＵＣ１陰性細胞であるＲａｊｉ細胞についても同様の操作を行った。なお、反応には抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ_２−Ｆｃを７５μｇ／ｍＬの濃度で用いた。
結果を第２４図に示した。抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＴ−４７Ｄ細胞に対しては結合を示し、Ｒａｊｉ細胞に対しては結合を示さなかった。また、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）のＪｕｒｋａｔ細胞およびＴ−４７Ｄ細胞に対する結合活性はそれぞれ同等であった。
同様に抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＴ−４７Ｄ細胞に対しては結合を示し、Ｒａｊｉ細胞に対しては結合を示さなかった。また、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）のＪｕｒｋａｔ細胞およびＴ−４７Ｄ細胞に対する結合活性は同等であった。
以上のことから、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）のＴＡＧ−７２陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞への結合またはＭＵＣ１陽性細胞であるＴ−４７Ｄ細胞への結合、および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）のＴＡＧ−７２陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞への結合またはＭＵＣ１陽性細胞であるＴ−４７Ｄ細胞への結合は、二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質のそれぞれのｓｃＦｖ部分に特異的な結合であり、この結合は二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ融合蛋白質のＦｃに付加する糖鎖中のフコース含量とは無関係であることが示された。
２．二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−ＦｃのＴＡＧ−７２またはＭＵＣ１結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
実施例６の第４項で得られた抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）の精製標品のＴＡＧ−７２またはＭＵＣ１に対する結合活性を、実施例３の第２項または第３項に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡ法によって評価した。なお、それぞれの二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃは、終濃度が０〜１５μｇ／ｍＬになるようにして行った。また、発色基質にはＴＭＢ基質液（シグマ社製）を用い、ＯＤ４５０を測定した。
二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−ＦｃのＴＡＧ−７２に対する結合活性の結果を第２５図に示した。図のＡに示されるように、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的に抗原であるＴＡＧ−７２に結合することが確認され、その結合はほぼ同等であった。同様に、図のＢに示されるように、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗１ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的に抗原であるＴＡＧ−７２に結合することが確認され、その結合はほぼ同等であった。
また、二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−ＦｃのＭＵＣ１に対する結合活性の結果を第２６図に示した。図のＡに示されるように、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的に抗原であるＭＵＣ１に結合することが確認され、その結合はほぼ同等であった。同様に、図のＢに示されるように、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的に抗原であるＭＵＣ１に結合することが確認され、その結合はほぼ同等であった。
以上のことから、実施例６の第４項で得られた、二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃの抗原であるＴＡＧ−７２またはＭＵＣ１への結合は、糖鎖構造の違いに関わらず、それぞれのｓｃＦｖ部位に特異的な結合であった。
３．二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−ＦｃのＦｃγ受容体ＩＩＩａ結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）またはＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）に対する、実施例６の第４項で得られた、二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃの結合活性を、実施例３の第３項に記載の方法に従って測定した。なお、各種の二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃは、０〜１５μｇ／ｍＬの濃度で反応時に添加した。また、発色はＴＭＢ基質液を用いて発色させ、ＯＤ４５０を測定した。
結果を第２７図および第２８図にそれぞれ示した。第２７図のＡに示されるように、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的にＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に結合することが確認でき、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性は、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性と比較して有意に高いことが示された。これは、第２７図のＢに示されるように、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）においても同様の結果であった。
また、第２８図のＡに示されるように、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）は濃度依存的にＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に結合することが確認でき、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性は、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対する結合活性と比較して有意に高いことが示された。これは、第２８図のＢに示されるように、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）においても同様の結果であった。
実施例６の第４項で得られた、それぞれの二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−ＦｃとＦｃγＲＩＩＩａとの間に結合が確認されたことより、これらののＦｃ領域は、ＦｃγＩＩＩａと結合活性を保持した形で発現していることが示された。また、Ｆｃ領域の糖鎖構造の違いによるＦｃγＩＩＩａへの結合活性は、実施例３の第３項または実施例５の第３項で述べた一種類のｓｃＦｖしか持たないｓｃＦｖ−ＦｃとのＦｃ領域の糖鎖構造の違いによるＦｃγＩＩＩａへの結合活性と同様の結果であり、二種類のｓｃＦｖを有するＦｃ融合蛋白質の形状にしても、Ｆｃ領域のＦｃγＩＩＩａへの結合活性は保持されており、該結合活性はフコースが付加されていない糖鎖が結合しているＦｃ領域の方が、フコースが付加されている糖鎖が結合しているＦｃ領域より高いことも同様であった。
４．二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−ＦｃのＴＡＧ−７２またはＭＵＣ１存在下でのＦｃγ受容体ＩＩＩａ結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
抗原であるＴＡＧ−７２またはＭＵＣ１の存在下で、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖ_２−Ｆｃ融合蛋白質のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）への結合活性を、実施例３の第４項に記載の方法に従って測定した。なお、発色基質にはＴＭＢ基質液（シグマ社製）を用いて、ＯＤ４５０を測定した。
結果を第２９図に示した。ＴＡＧ−７２存在下またはＭＵＣ１存在下のいずれの条件でも、フコースが付加されていない糖鎖が結合している抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）は濃度依存的にＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）および抗原であるＴＡＧ−７２に対して結合活性が認められたが、フコースが付加されている糖鎖が結合している抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）では結合活性は認められなかった。
また、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）と抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）では、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）の方がＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）に対して高い結合活性を有していた。これは、Ｆｃ領域と融合させるｓｃＦｖが２つ以上の場合には、ｓｃＦｖを融合させる順番により、Ｆｃ領域のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）への結合の強さが変わることを示唆している。
以上のことから、抗原の存在下での、Ｆｃ領域の糖鎖構造の違いによるＦｃγＩＩＩａへの結合活性は、実施例３の第４項または実施例５の第４項で述べた一種類のｓｃＦｖしか持たないｓｃＦｖ−ＦｃとのＦｃ領域の糖鎖構造の違いによるＦｃγＩＩＩａへの結合活性と同様の結果であり、二種類のｓｃＦｖを有するＦｃ融合蛋白質の形状にしても、Ｆｃ領域のＦｃγＩＩＩａへの結合活性は保持されており、該結合活性はフコースが付加されていない糖鎖が結合しているＦｃ領域の方が、フコースが付加されている糖鎖が結合しているＦｃ領域より高いことも同様であった。
上記第３項および第４項の結果から、抗原の有無に関わらず、また、Ｆｃ領域に融合させるｓｃＦｖの数に関わらず、Ｆｃ領域のＦｃγＩＩＩａへの結合活性はフコースが付加されていない糖鎖が結合しているＦｃ領域の方が、フコースが付加されている糖鎖が結合しているＦｃ領域より高いことが明らかとなった。
５．二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−ＦｃのＴＡＧ−７２発現細胞株またはＭＵＣ１発現細胞株に対する細胞傷害活性の評価（ＡＤＣＣ活性、^５１Ｃｒ解離法）
上記実施例６の第４項で得られた、二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃの精製標品のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するため、ＴＡＧ−７２陽性ＭＵＣ１陽性細胞であるヒト卵巣癌由来細胞株ＯＶＣＡＲ−３、ＴＡＧ−７２陽性細胞であるヒトＴ細胞由来リンパ腫細胞株ＪｕｒｋａｔおよびＭＵＣ１陽性細胞であるヒト乳癌由来細胞株Ｔ−４７Ｄに対するＡＤＣＣ活性を、健常人ドナーから採取したエフェクター細胞を用いて、実施例３の第５項に記載の方法に従って測定した。また、陰性対照の細胞株として、ＴＡＧ−７２陰性かつＭＵＣ１陰性の細胞株であるＲａｊｉ細胞を用いた。なお、各種の二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃは、０〜１５μｇ／ｍＬの濃度で反応時に添加した。
結果を第３０図、第３１図および第３２図にそれぞれ示した。
第３０図のＡに示されるように、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）または抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）において、ＴＡＧ−７２陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞に対して濃度依存的なＡＤＣＣ活性が認められた。また、最大細胞傷害活性も抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）と比べて抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）の方が高く、抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）が抗ＭＵＣ１抗ＴＡＧ−７２ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）と同等のＡＤＣＣ活性を示すためには、１０００倍の濃度が必要であった。
第３１図のＡに示されるように、標的細胞にＭＵＣ１陽性細胞であるＴ−４７Ｄ細胞を用いた場合にも、同様の結果であった。
また、第３０図のＢまたは第３１図のＢに示されるように、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）または抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）には、ＴＡＧ−７２陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞またはＭＵＣ１陽性細胞であるＴ−４７Ｄ細胞に対して、濃度依存的なＡＤＣＣ活性が認められた。また、いずれの標的細胞においても、最大細胞傷害活性も抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）と比べて抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）の方が高く、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）が抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）と同等のＡＤＣＣ活性を示すためには、１０００倍の濃度が必要であった。
一方、第３２図に示されるように、ＴＡＧ−７２陰性かつＭＵＣ１の陰性であるＲａｊｉ細胞に対しては、いずれの二種類のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ_２−Ｆｃにおいて、ＡＤＣＣ活性は認められなかった。
以上のことから、抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（−）と抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）の間、および抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）と抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）の間には、各Ｆｃ融合蛋白質組成物中の全Ｆｃ融合蛋白質に占める、Ｆｃ融合蛋白質に結合したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＦｃ融合蛋白質の割合に差が認められ、この割合の差が抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｅ（−）と抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＭ−ｓｃＦｖＴ−Ｆｃ（＋）との間または抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（−）と抗ＴＡＧ−７２抗ＭＵＣ１ｓｃＦｖＴ−ｓｃＦｖＭ−Ｆｃ（＋）との間のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の差となり、さらにこのＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の差がＡＤＣＣ活性の差となっていることが確認できた。また、このような二重特異性を有するＦｃ融合蛋白質が持つＡＤＣＣ活性は、ＴＡＧ−７２およびＭＵＣ１の２種類の抗原に対して、それぞれ独立して細胞傷害活性が誘導されることが確認できた。
［実施例８］
可溶型ＴＮＦ−α受容体ＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質（ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ）の作製
１．ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ発現ベクターの作製
（１）ｓＴＮＦＲＩＩをコードするＤＮＡの構築
ＵＳＰ５６０５６９０に記載のｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法により以下のように構築した。なお、該ｃＤＮＡは、ｓＴＮＦＲＩＩをコードするｃＤＮＡ配列中に存在する制限酵素ＢｌｐＩ部位で分割し、配列番号２８に示される前半部分と配列番号２９に示される後半部分の２つのｃＤＮＡ配列を作製した。
まず、配列番号２８に示される配列には、ｓＴＮＦＲＩＩをコードする配列の前半部分の５’末端に８７塩基の非翻訳領域とｓＴＮＦＲＩＩの分泌シグナル配列を挿入した。更に配列の５’末端と３’末端にクローニングベクターおよび発現ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む、ＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列を付加した。設計した配列番号２８に示される塩基配列を、センス鎖とアンチセンス鎖が交互になるように、５’末端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し、隣り合う塩基配列はその末端の約２０塩基が重複し、対合できるようにし、配列番号３０、３１、３２および３３の４本の合成オリゴヌクレオチドを合成した（ファスマック社製）。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなるように０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む反応液に加え、さらに０．４μＭＭ１３ｐｒｉｍｅｒＲＶ（宝酒造社製）、０．４μＭＭ１３ｐｒｉｍｅｒＭ３（配列番号４３、ＧＥＮＳＥＴ社製）および２．５単位のＫＯＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて６０秒間のサイクルを２５サイクル、その後７４℃にて５分間を１サイクルで行った。ＰＣＲ後、該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製し、制限酵素ＫｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４９ｋｂのＰＣＲ断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＫｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約２．９ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたｓＴＮＦＲＩＩ前半部分の約０．４９ｋｂのＰＣＲ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）由来のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５ａ株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．３（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたＰＣＲ断片の塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する第３３図に示したプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−１が得られたことを確認した。
次に、配列番号２９に示される塩基配列には、ｓＴＮＦＲＩＩをコードする配列の後半部分とその３’末端にヒトＦｃのヒンジとＣＨ２領域の一部を組み入れた。更に配列の５’末端と３’末端にクローニングベクターおよび発現ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む、ＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列を付加した。設計した配列番号２９に示される塩基配列を、センス鎖とアンチセンス鎖が交互になるように、５’末端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し、隣り合う塩基配列はその末端の約２０塩基が重複し、対合できるようにし、配列番号３４、３５、３６および３７の４本の合成オリゴヌクレオチドを合成した（ファスマック社製）。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなるように０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む反応液に加え、さらに０．４μＭＭ１３ｐｒｉｍｅｒＲＶ（宝酒造社製）、０．４μＭＭ１３ｐｒｉｍｅｒＭ３（ＧＥＮＳＥＴ社製）および２．５単位のＫＯＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて６０秒間のサイクルを２５サイクル、その後７４℃にて５分間を１サイクルで行った。ＰＣＲ後、該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製し、制限酵素ＫｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．５ｋｂのＰＣＲ断片を回収した。
次に、上記で得られたｓＴＮＦＲＩＩ後半部分の約０．５ｋｂのＰＣＲ断片と上記で得られたプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）由来のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）により連結し、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５ａ株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．３（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたＰＣＲ断片の塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する第３４図に示したプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−２が得られたことを確認した。
（２）ｓＴＮＦＲＩＩ−ＦｃをコードするＤＮＡの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画した。ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１．０ｋｂｐのヒトＩｇＧ１サブクラスＨ鎖定常領域（ｈＣγ１）を含むＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した。同様に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）も制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、約２．９ｋｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した。ｐＫＡＮＴＥＸ９３由来の約１．０ｋｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）由来の約２．９ｋｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片をＴＡＫＡＲＡＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎＩ（宝酒造社製）により連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換してプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｈＣγ１を構築した。
上記（１）で得られたプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−１を制限酵素ＫｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＢｌｐＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４８ｋｂのＫｐｎＩ−ＢｌｐＩ断片を回収した。
また、上記（１）で得られたプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−２を制限酵素ＢｌｐＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＳｔｙＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４９ｋｂのＢｌｐＩ−ＳｔｙＩ断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｈＣγ１を制限酵素ＫｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＳｔｙＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約３．５ｋｂｐのＫｐｎＩ−ＳｔｙＩ断片を回収した。
上記で得られたプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−１由来の約０．４８ｋｂのＫｐｎＩ−ＢｌｐＩ断片、プラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−２由来の約０．４９ｋｂのＢｌｐＩ−ＳｔｙＩ断片およびプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｈＣγ１由来の約３．５ｋｂｐのＳｔｙＩ−ＫｐｎＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）により連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５ａ株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．３（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入された断片の塩基配列を解析し、第３５図に示したプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃが得られたことを確認した。
（３）ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と本項（２）で得られたプラスミドｐＢｓＩＩｓＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを用いてｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを以下のようにして構築した。
本項（２）で得られたプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した。
一方、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）とＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約９．３ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ由来の約１．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来の約９．３ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）により連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５ａ株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．３（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入された断片の塩基配列を解析し、第３６図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃが得られたことを確認した。
２．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞での安定発現
実施例１の第４項に記載のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞であるＭｓ７０５細胞および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主細胞として用いて、本実施例の第１項で作製したｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを導入して、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の安定生産細胞を実施例２の第２項に記載の方法で作製した。
最終的に６００μｇ／ｍＬのＧ４１８および２００ｎＭのＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質を生産する形質転換株を取得した。ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞より得られた形質転換株をＫＣ１１９４と名付けた。
３．ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の精製
本実施例の第２項で作製したｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の生産細胞から実施例２の第４項に記載の方法でｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質を精製した。以後、精製したｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質はそれぞれＫＣ１１９４により生産されるｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）および親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞により生産されるｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）と表記する。
４．精製ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の分析
本実施例の第５３項で精製したｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）の精製度およびＦｃ領域中に付加している糖鎖中のフコース含量を以下のようにして確認した。
（１）ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）の精製度の評価
本実施例の第３項で精製した各精製ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の約３μｇを用いて、実施例２の第５項（１）に記載の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を第３７図に示した。二種類の精製蛋白質はそれぞれ、非還元条件下は約１４０ｋＤａ、還元条件下では約７０ＫＤａのバンドとして検出された。この結果は、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の分子量が、非還元条件下では約１４０ＫＤａであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約７０ＫＤａの構成単位に分解されるという報告［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，３６，６１（１９９９）］と一致し、宿主の異なる二種類のｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）で泳動パターンが類似していることから、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）が目的に合致したポリペプチド鎖として発現されていることが示唆された。
（２）精製ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の単糖組成分析
本実施例の第３項で得られたｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）の精製標品の単糖組成分析を、実施例２の第５項（２）に記載の方法に従って行った。但し、ｓＴＮＦＲＩＩには２箇所のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖結合部位が存在し、さらに複数のＯ−グリコシド結合型糖鎖結合部位も存在することが知られているため、各精製ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質からＦｃ領域の断片を精製し、該断片を用いて単糖組成分析を行った。
各精製ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質５００μｇとリシルエンドペプチダーゼ５μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液ｐＨ８．５に懸濁し、総量５ｍＬとして３７℃、１時間反応させた。反応直後にＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ファルマシア社製）カラ厶を使用説明書に従い、用いてＦｃ領域の断片を精製した。
結果を第５表に示した。ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）ではフコースが結合していない糖鎖の割合が７％であった。一方、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、フコースが結合していない糖鎖の割合はほぼ１００％と見積もられた。
以上の結果より、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンには、フコースが結合していないことが示された。

［実施例９］
ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の活性評価
１．ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の抗ＴＮＦＲＩＩ抗体に対する反応性（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＴＮＦＲＩＩ抗体（Ｒ＆Ｄ社製）をＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを除去し、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）またはｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで５００倍に希釈したペルオキシターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体溶液（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
結果を第３８図に示した。ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）は、濃度依存的に抗ＴＮＦＲＩＩ抗体に結合することが確認でき、その結合はほぼ同等であったことから、作製した糖鎖構造の異なる二種類のｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）のＴＮＦＲＩＩ部分に特異的な結合であり、この結合はｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質のＦｃに付加する糖鎖中のフコース含量とは無関係であることが示された。
２．ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質のＦｃγ受容体ＩＩＩａ結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
実施例３の第３項に記載の方法と同様に行った。但し、測定したｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の濃度範囲は１００ｎｍｏｌ／Ｌからとした。
結果を第３９図に示した。ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）について濃度依存的な結合が確認され、ＦｃγＲＩＩＩａに対するｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）の結合活性は、ＳＴＮＦＲＩＩ−ＦＣ（＋）の結合活性よりも高いものであり、二種類のＦｃγＲＩＩＩａの多形の違いにかかわらず同様であった。また、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）とＦｃγＲＩＩＩａとの間に結合が確認されたことより、ｓＴＮＦＲＩＩ−ＦｃのＦｃ領域は、ＦｃγＩＩＩａと結合しうる正常な立体構造をとっていることが示された。
３．ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質のＴＮＦ−α中和活性
ＴＮＦ−α感受性細胞であるＬ９２９細胞［Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，９，２２９（１９４８）］を用いて中和活性の測定を行った。ＨＥＭ−ＦＢＳ（１０）培地（１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍＬＧｅｎｔａｍｉｃｉｎを含むＭＥＭ培地）で培養したＬ９２９細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）で処理した後、回収し、ＭＥＭ−ＦＢＳ（１０）培地に３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ｗｅｌｌ平底プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃、２４時間培養後、細胞を吸わないように培地を除去した。各ウェルにＭＥＭ−ＦＢＳ（１０）培地を１００μＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬのマウスＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ社製）を５０μｌ、各最終濃度の５倍濃度のｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）あるいはｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）を５０μＬ、２．５μｇ／ｍＬのＡｃｔｉｎｏｍｙｓｉｎＤ（ＭＢＬ社製）を５０μＬ加え計２５０μＬ／ｗｅｌｌとし、さらに２４時間培養した。細胞を吸わないように培地を除去し、ＰＢＳ（−）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、再度細胞を吸わないようにＰＢＳ（−）を除去し、１０分以上風乾させた。０．０５％ＣｒｙｓｔａｌＶｉｏｌｅｔ溶液（和光純薬工業社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、１０分以上放置した。１５０μＬ／ｗｅｌｌのメタノール（ナカライテスク社製）を加え、プレートリーダーにて５９０ｎｍの吸光度を測定した。ＡｃｔｉｎｏｍｙｓｉｎＤ存在下でのＴＮＦ−α非添加時の細胞を１００％、添加時の細胞を０％として各濃度におけるＴＮＦ−α中和活性を求めた。
結果を第４０図に示した。ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）は、濃度依存的にマウスＴＮＦ−αの活性を阻害し、その中和活性はほぼ同等であったことから、作製した糖鎖構造の異なる二種類のｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）およびｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）の糖鎖に起因するＴＮＦ−α中和活性に違いが無いことが確認された。
４．ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質のＡＤＣＣ活性（乳酸デヒドロゲナーゼ法）
ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の膜型ヒトＴＮＦ−α発現マウスＴ細胞腫瘍株ＥＬ４（ＡＴＣＣＴＩＢ−３９）（以下、ＴＮＦ−α／ＥＬ４と記す）に対するＡＤＣＣ活性を、健常人ドナーから採取した末梢血単核球画分をエフェクター細胞として以下のようにして測定した。
（１）ＴＮＦ−α／ＥＬ４の作製
（１−１）ヒトリンパ節由来１本鎖ｃＤＮＡの作製
ヒトリンパ節由来ＰｏｌｙＡ^＋ＲＮＡ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）の１μｇより、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の説明書に従い、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成後、最終液量を１ｍＬとし、これを５倍希釈した溶液を以下の反応に用いた。
（１−２）膜型ヒトＴＮＦ−αをコードするｃＤＮＡの作製
ヒトＴＮＦ−αの全長配列において７７番目から８８番目までのプロテアーゼによる認識部位を含む１２残基を欠失させたＴＮＦ−αをＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現させると、ＴＮＦ−αはプロテアーゼにより切断されず、ヒトＴＮＦ−αが細胞膜上に発現する［Ｃｅｌｌ，６３，２５１（１９９０）］。そこで、７７番目から８８番目までの１２残基を欠失したヒトＴＮＦ−αをコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
上記（１−１）で作製したｃＤＮＡ溶液の５μＬを鋳型とし、終濃度０．４μＭの配列番号１００および配列番号１０１でそれぞれ示される合成ＤＮＡをプライマーとして添加し、ＰＣＲ反応液［１ｕｎｉｔＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１倍濃度のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ緩衝液（いずれも東洋紡績社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて４分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、６８℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、３０サイクル行なった。本反応により、ヒトＴＮＦ−αのＣ末端側約４４０ｂｐが増幅される。ＰＣＲ後、該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約４４０ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、修飾酵素ＭｕｎｇＢｅａｎＮｕｃｌｅａｓｅ（宝酒造社製）で平滑末端化後にＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて自己連結反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られた形質転換株のクローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＡｆｌＩＩＩ認識部位が欠失したプラスミドｐＢｓＡｆｌＩＩＩ（−）を取得した。
上記プラスミドｐＢＳＡｆｌＩＩＩ（−）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、上記と同様にして約２．９ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した。
上記で得られた約４４０ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドｐＢｓＡｆｌＩＩＩ（−）由来の約２．９ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７によりプラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析した結果、目的のプラスミドΔＴＮＦ−αｐＢＳＡｆｌＩＩＩ（−）が得られたことを確認した。
次に、ヒトＴＮＦ−αのＮ末端側約３００ｂｐをセンス鎖とアンチセンス鎖が交互になるように５’末端から４本の塩基配列に分割し、隣り合う配列はその末端の約２０ｂが重複し、対合可能なように設計した。さらに配列番号１０２と１０５の末端にはクローニング用の制限酵素認識配列を付加し、配列番号１０２、１０３、１０４および１０５の４本の合成ＤＮＡ（ファスマック社製）を合成した。
各オリゴヌクレオチドを終濃度が０．１μＭ、さらに終濃度０．５μＭの配列番号１０６および配列番号１０７の合成オリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして添加し、ＰＣＲ反応液［２ｕｎｉｔＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１倍濃度のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ緩衝液（いずれも東洋紡績社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル、その後７４℃にて５分間を１サイクル行った。ＰＣＲ後、該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約３００ｂｐのＰＣＲ断片を回収した。
上記で得られたプラスミドΔＴＮＦ−αｐＢＳＡｆｌＩＩＩ（−）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、上記と同様にして約３．２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片を回収した。
上記で得られた約３００ｂｐのＰＣＲ断片とプラスミドΔＴＮＦ−αｐＢＳＡｆｌＩＩＩ（−）由来の約３．２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖ３．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７によりプラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析した結果、目的の膜型ヒトＴＮＦ−αをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドΔ１−１２ＴＮＦ−αｐＢＳが得られたことを確認した。配列番号１０８に構築した膜型ヒトＴＮＦ−αのｃＤＮＡ配列を、配列番号１０９に膜型ヒトＴＮＦ−αの推定アミノ酸配列をそれぞれ示した。
（１−３）膜型ヒトＴＮＦ−α発現ベクターの構築
上記（１−２）で得られたプラスミドΔ１−１２ＴＮＦ−αｐＢＳを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、上記と同様にして約０．７２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した。
上記で得れらたプラスミドΔ１−１２ＴＮＦ−αｐＢＳ由来の約０．７２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と実施例８の１項（３）で調製したヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３由来の約９．３ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンよりプラスミドＤＮＡを調製した結果、第４１図に示した膜型ヒトＴＮＦ−α発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸΔ１−１２ＴＮＦ−αが得られたことを確認した。
（１−４）ＴＮＦ−α／ＥＬ４の作製
８μｇの上記（１−３）で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸΔ１−１２ＴＮＦ−αを３×１０^６細胞のＥＬ４細胞へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）により導入後、６０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（１０）培地［１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０（１０）培地において、１〜２週間培養した。培養後、増殖が確認された薬剤耐性株を用いて膜型ヒトＴＮＦ−αの発現を以下のようにして検討した。
薬剤耐性株あるいは親株であるＥＬ４細胞を５×１０^５細胞／５０μＬとなるように４０倍希釈のヒト免疫グロブリン溶液（ウェルファイド社製）および５倍希釈のＦＩＴｃ標識抗ヒトＴＮＦ−α抗体溶液（Ｒ＆Ｄ社製）を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳで懸濁し、９６ウェルＵ字底プレートに分注して４℃遮光下で３０分間反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄後、１ｍＬのＰＢＳで懸濁し、フローサイトメーターで解析した。
結果を第４２図に示した。第４２図に示したように、薬剤耐性株７で膜型ヒトＴＮＦ−αの発現が確認された。一方、親株であるＥＬ４細胞では膜型ヒトＴＮＦ−αの発現は確認されなかった。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．３ｍＬを加え穏やかに混合した。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｉｄ社製）を用いて使用説明書に従い、単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０Ｆ（−）−ＦＣＳ（５）培地［５％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］で２回遠心分離、洗浄操作を行い、ＲＰＭＩ１６４０Ｆ（−）−ＦＣＳ（５）培地を加えて５×１０^６細胞／ｍＬに調整し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）標的細胞溶液の調製
上記で作製したＴＮＦ−α／ＥＬ４（薬剤耐性株７）を２×１０^５細胞／ｍＬの濃度になるようにＲＰＭＩ１６４０Ｆ（−）−ＦＣＳ（５）培地に懸濁し、標的細胞溶液とした。
（４）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（２）で調製したエフェクター細胞溶液の５０μＬ（２．５×１０^５細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（３）で調製した標的細胞溶液を５０μＬ（１×１０^４細胞／ウェル）で分注し、エフェクター細胞と標的細胞の比が２５：１となるように添加した。更に、本実施例の第２項で作製した各種ｓＴＦＮＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質をそれぞれ最終濃度が０．００００１〜１μｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、遠心分離（７００ｒｐｍ、５分間）後、３７℃で４時間反応させた。反応後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して反応溶液を細胞群と上清とに分離し、上清の５０μＬを９６ウェル平底プレートに分注した。分注した上清にＣｙｔｏＴｏｘ９６−Ｎｏｎ−ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に付属の基質反応液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温、遮光下で３０分間反応させた。反応後、付属のＳｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬ／ウェルで添加し、ＯＤ４９０ｎｍの吸光度を測定し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨと記す）の量を測定した。ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合蛋白質の特異的なＬＤＨ放出活性は、各測定値から標的細胞とエフェクター細胞のみを含むウェルの値を差し引いて求めた。標的細胞の全ＬＤＨ量としては反応時に付属のＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを１／１０量添加したウェルの値を測定し、また、標的細胞の自然放出ＬＤＨ量としては培地のみで反応させたウェルの値を測定した。これらの値より下記式に従い、ＡＤＣＣ活性（％）を算出した。
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛各サンプル濃度での特異的ＬＤＨ測定値／（全ＬＤＨ測定値−自然放出ＬＤＨ測定値）｝×１００
結果を第４３図に示した。ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（−）はＴＮＦ−α／ＥＬ４に対して濃度依存的なＡＤＣＣ活性を示した。一方、ｓＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（＋）では、測定した濃度範囲では非常に低いＡＤＣＣ活性しか認められなかった。以上の結果は、抗体Ｆｃ領域のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンのフコースを除去することにより、Ｆｃ融合蛋白質のＡＤＣＣ活性を著しく高めることが可能であることを示している。
［実施例１０］
ＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメインＦｃ融合蛋白質（ＬＦＡ−３−Ｆｃ）の作製
１．ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの作製
（１）ＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメインをコードするＤＮＡの構築
ＵＳＰ５９１４１１１に記載のＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメインのＦｃ融合蛋白質をコードするｃＤＮＡを以下のように構築した。
配列番号３８に示される塩基配列には、ＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメインをコードする配列の５’末端に９塩基の非翻訳領域とＬＦＡ−３の分泌シグナル配列を組み入れた。３’末端にはヒトＦｃのヒンジ（Ｎ末から５残基欠損したもの）とＣＨ_２領域の一部を組み入れた。さらに配列の５’末端と３’末端に、クローニングベクターおよび発現ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む、ＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列を付加した。設計した配列番号３８に示される塩基配列を、センス鎖、アンチセンス鎖が交互になるように、５’末端側から約１２０〜１４０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し、隣り合う塩基配列はその末端に約２０塩基が重複し、対合できるようにし、配列番号３９、４０、４１および４２の４本の合成オリゴヌクレオチドを合成した（ファスマック社製）。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなるように０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む反応液に加え、さらに０．４μＭＭ１３ｐｒｉｍｅｒＲＶ（宝酒造社製）、０．４μＭＭ１３ｐｒｉｍｅｒＭ３（ＧＥＮＳＥＴ社製）および２．５単位のＫＯＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、合計５０μｌとし、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて６０秒間のサイクルを２５サイクル、その後７４℃にて５分間を１サイクルで行った。該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製し、制限酵素ＫｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＡｌｗＮＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４２ｋｂのＫｐｎＩ−ＡｌｗＮＩ断片を回収した。
次に、実施例８の第１項（２）で作製したプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｈＣγ１を制限酵素ＡｌｗＮＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１．１ｋｂのＡｌｗＮＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片を回収した。一方で、同プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＫｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約２．５ｋｂのＡｆｌＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を回収した。
上記で得らえたＰＣＲ由来の約０．４２ｋｂのＫｐｎＩ−ＡｌｗＮＩ断片、プラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｈＣγ１由来の約２．５ｋｂのＡｌｗＮＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片およびプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ｈＣγ１由来のＡｆｌＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５ａ株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．３（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたＰＣＲ断片の塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する第４４図に示したプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ＬＦＡ−３−Ｆｃが得られたことを確認した。
（２）ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と本項（１）で得られたプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ＬＦＡ−３−Ｆｃを用いてＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＬＦＡ−３−Ｆｃを以下のようにして構築した。
本項（１）で得られたプラスミドｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ＬＦＡ−３−Ｆｃを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）と制限酵素ＸｃｍＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｃｍＩ断片を回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＸｃｍＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）とＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約１ｋｂのＸｃｍＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した。同プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）とＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約９．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたｐＢｓＩＩＳＫ（−）／ＬＦＡ−３−Ｆｃ由来ＥｃｏＲＩ−ＸｃｍＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＸｃｍＩ−ＢａｍＨＩ断片とＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ溶液（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５ａ株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．３（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて同社のシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列の解析を行った。解析の結果、目的の塩基配列を有する第４５図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＬＦＡ−３−Ｆｃが得られたことを確認した。
２．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞での安定発現
実施例１の第４項に記載のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞およびその親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主細胞として用いて、本実施例の第１項で作製したＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＬＦＡ−３−Ｆｃを導入して、ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質の安定生産細胞を実施例２の第２項に記載の方法に従って作製した。ただし、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用した遺伝子増幅は行っていない。
最終的に６００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質を生産する形質転換株を取得した。ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞より得られた形質転換株をＫＣ１１９８と名付けた。
３．ＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメイン−Ｆｃ融合蛋白質の精製
上記実施例６の第２項で作製したＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質の生産細胞をＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を用いて１０００ｍＬのスケールで培養した。培養上清より実施例２の第４項に記載の方法に従ってＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質を精製した。以後、精製したＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質はそれぞれ親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞により生産されるＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）と、ＫＣ１１９８により生産されるＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）と表記する。
４．精製ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質の分析
本実施例の第３項で精製したＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）の精製度およびＦｃ領域中に付加している糖鎖中のフコース含量を以下のようにして確認した。
（１）ＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）の精製度の評価
各精製ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質の約２μｇを用いて、実施例２の第５項（１）に記載の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を第４６図に示した。二種類の精製蛋白質はそれぞれ、非還元条件下は約１１５ｋＤａ、還元条件下では約６０ＫＤａのバンドとして検出された。この結果は、ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質の分子量が、非還元条件下では約１１５ＫＤａであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約６０ＫＤａの構成単位に分解されるという報告［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，３６，６１（１９９９）］と一致し、宿主の異なる二種類のＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）で泳動パターンが類似していることから、ＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）が発現ベクターにコードされた通りのポリペプチド鎖として発現されていることが示唆された。
（２）精製ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質の単糖組成分析
本実施例の第３項で得られたＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）の精製標品の単糖組成分析を実施例２の第５項（２）に記載の方法で行った。但し、ＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメインには３箇所のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖結合部位が存在（ＵＳＰ５６１４１１１）することが知られているため、各精製ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質からＦｃ領域の断片を精製し、該断片を用いて単糖組成分析を行った。
本実施例の第３項で精製したＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質各５００μｇとリシルエンドペプチダーゼ５μｇを５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液ｐＨ８．５に懸濁し、総量５ｍＬとして３７℃、１時間反応させた。反応直後にＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ファルマシア社製）カラムを使用説明書に従い、用いてＦｃ断片を精製し方。
結果を第６表に示した。ＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）ではフコースが結合していない糖鎖の割合が７％であった。一方、ＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、フコースが結合していない糖鎖の割合はほぼ１００％と見積もられた。
以上の結果より、ＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンには、フコースが結合していないことが示された。

［実施例１１］
ＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメイン−Ｆｃ融合蛋白質の活性評価
１．膜表面上のＣＤ２分子への結合性（蛍光抗体法）
実施例６の第３項で作製したＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質であるＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）との結合活性を有するＣＤ２に対する反応性を、蛍光抗体法により以下のように検討した。ＣＤ２発現細胞株としては、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１１９）を用いた。
１ウェル当たり２×１０^５個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を９６ウェルＵ字プレートに分注し、公知の方法［酵素抗体法：学際企画刊（１９８５）］でＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）をＦＡＣＳ用緩衝液で４３５ｎｍｏｌ／Ｌから適宜希釈した溶液を１００μＬ／ウェルとして加え、氷中で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）抗体（ベックマン・コールター社製）をＦＡＣＳ用緩衝液にて５０倍に希釈した溶液を５０μｌ／ウェルで加えた。遮光し氷中で３０分間反応後、ＦＡＣＳ用緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。
第４７図に示したように、ＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）のＣＤ２への結合活性は同程度であった。ＣＤ２とＬＦＡ−３の結合には糖鎖修飾の影響が大きいと報告されているが［ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＧｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１（１９９９）］、フコースの結合していないＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）分子でもその結合活性には影響を及ぼさないことが示された。
２．ＦｃγＲＩＩＩａへの結合活性
実施例３の第３項に記載の方法と同様に行った。但し、測定したＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質の濃度範囲は３３ｎｍｏｌ／Ｌからとした。
結果を第４８図に示した。ＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびｓＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）は濃度依存的にＦｃγＲＩＩＩａに結合することが確認され、ＦｃγＲＩＩＩａに対するＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性は、ＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）のそれよりも高いものであった。この結果は、二種類のＦｃγＲＩＩＩａの多形で同様の結果であった。
ＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）とＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）の間には、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性およびＦｃ領域に結合する糖鎖中のフコース含量に差が認められており、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の差はＦｃ領域に結合する糖鎖中のフコース含量の差に起因していることを明確に示したものである。一方、ＬＦＡ−３領域のフコース含量はＣＤ２との結合には何ら影響を与えないことから、抗体Ｆｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンのフコースを除去することで、抗体Ｆｃ領域が介在するエフェクター活性を人為的に調節できることを明確に示している。
３．ＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメイン−Ｆｃ融合蛋白質のＡＤＣＣ活性
ＣＤ２結合性ＬＦＡ−３ドメイン−Ｆｃ融合蛋白質のＣＤ２陽性ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔに対するＡＤＣＣ活性を、健常人ドナーから採取した末梢血単核球画分をエフェクター細胞として以下のようにして測定した。
（１）エフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウ厶（清水製薬社製）０．３ｍＬを加え穏やかに混合した。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｉｄ社製）を用いて使用説明書に従い、単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０Ｆ（−）−ＦＣＳ（５）培地［５％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］で２回遠心分離、洗浄操作を行い、ＲＰＭＩ１６４０Ｆ（−）−ＦＣＳ（５）培地を加えて５×１０^６細胞／ｍＬに調整し、エフェクター細胞溶液とした。
（２）標的細胞溶液の調製
Ｊｕｒｋａｔ細胞を２×１０^５細胞／ｍＬの濃度になるようにＲＰＭＩ１６４０Ｆ（−）−ＦＣＳ（５）培地に懸濁し、標的細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに本項（１）で調製したエフェクター細胞溶液の５０μＬ（２．５×１０^５細胞／ウェル）を分注した。次いで本項（２）で調製した標的細胞溶液を５０μＬ（１×１０^４細胞／ウェル）で分注し、エフェクター細胞と標的細胞の比が２５：１となるように添加した。更に、本実施例の第２項で作製した各種ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質をそれぞれ最終濃度が０．００００１〜１０μｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、遠心分離（７００ｒｐｍ、５分間）後、３７℃で４時間反応させた。反応後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して反応溶液を細胞群と上清とに分離し、上清の５０μＬを９６ウェル平底プレートに分注した。分注した上清にＣｙｔｏＴｏｘ９６−Ｎｏｎ−ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に付属の基質反応液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温、遮光下で３０分間反応させた。反応後、付属のＳｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬ／ウェルで添加し、ＯＤ４９０ｎｍの吸光度を測定し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼの量を測定し、細胞傷害活性とした。ＬＦＡ−３−Ｆｃ融合蛋白質の特異的な細胞傷害活性は、各測定値から標的細胞とエフェクター細胞のみを含むウェルの値を差し引いて求めた。
結果を第４９図に示した。ＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）およびＬＦＡ−３−Ｆｃ（＋）はＪｕｒｋａｔ細胞に対して濃度依存的なＡＤＣＣ活性を示し、その活性はＬＦＡ−３−Ｆｃ（−）の方が約１００倍高かった。以上の結果は、抗体Ｆｃ領域のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンのフコースを除去することにより、Ｆｃ融合蛋白質のＡＤＣＣ活性を高めることが可能であることを示している。
参考例
可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質の作製
１．可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質の発現ベクターの構築
（１）ヒト末梢血単核球ｃＤＮＡの作製
健常人の静脈血３０ｍＬにヘパリンナトリウム（武田薬品社製）を加え穏やかに混合した。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（第一化学薬品社製）を用いて使用説明書に従って単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１回、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地で１回遠心分離して洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）中に懸濁した２×１０^６個／ｍＬの末梢血単核球懸濁液を調製した。該末梢血単核球懸濁液の５ｍＬを室温下８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、５ｍＬのＰＢＳに懸濁した。室温下８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、ＱＩＡａｍｐＲＮＡＢｌｏｏｄＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、全ＲＮＡを抽出した。
得られた全ＲＮＡ２μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^ＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（２）ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質をコードするｃＤＮＡの取得
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質（以下、ｈＦｃγＲＩＩＩａと表記する）のｃＤＮＡの取得は、以下のようにして行った。
まず、ｈＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡの塩基配列［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０，４８１（１９８９）］より、翻訳開始コドンを含む特異的なフォワードプライマー（配列番号４４に示す）および翻訳終止コドンを含む特異的なリバースプライマー（配列番号４５に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥＸＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項（１）で調製したヒト末梢血単核球由来のｃＤＮＡ溶液の２０倍希釈液５μＬを含む５０μＬの反応液［１倍濃度のＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１μＭ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号４４および４５）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間、７２℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＰＣＲ後、該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌水２０μＬに溶解した。制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ由来の約８００ｂｐの断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）２．５μｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約２．９ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られたヒト末梢血単核球ｃＤＮＡ由来の約８００ｂｐの断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）由来の約２．９ｋｂｐの断片を、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を決定した。本法により配列決定した全ての挿入ｃＤＮＡが、ｈＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡのＯＲＦ全長配列をコードすることを確認した。結果として２種類のｈＦｃγＲＩＩＩａをコードするｃＤＮＡを得た。一つは、配列番号４６に示した配列であり、該配列を含むプラスミドとしてｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３を得た。配列番号４６の塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号４７に示す。もう一つは、配列番号４８に示した配列であり、該配列を含むプラスミドとしてｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ３を得た。配列番号４８の塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号４９に示す。配列番号４６と配列番号４８に示される塩基配列の違いは、５３８番目の塩基がそれぞれＴとＧであり、その結果、対応するアミノ酸配列は、配列上、１７６番目がそれぞれＰｈｅとＶａｌであった。以下、配列番号４７に示されるアミノ酸配列のｈＦｃγＲＩＩＩａをｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、配列番号４９に示されるアミノ酸配列のｈＦｃγＲＩＩＩａをｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）と称す。
（３）可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）をコードするｃＤＮＡの取得
ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の細胞外領域（配列番号４７の１〜１９３番目）とＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ配列を持つ可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）［以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）と表記する］をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、配列番号４６に示されるｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）のｃＤＮＡの塩基配列より、細胞外領域に特異的なプライマーＦｃｇＲ３−１（配列番号５０に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項（２）で作製したプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３をテンプレートとして含む反応液［１倍濃度のＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１μＭプライマーＦｃｇＲ３−１、１μＭプライマーＭ１３Ｍ４（宝酒造社製）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間、７２℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、３５サイクル行った。ＰＣＲ後、反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌水２０μＬに溶解した。制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約１１０ｂｐの特異的増幅断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３を制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得たｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）ｃＤＮＡ由来の約１１０ｂｐの特異的増幅断片とプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３由来の約３．５ｋｂｐの断片を、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調整し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシークエンサー３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、ｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）＋Ｈｉｓ３が得られたことを確認した。
決定したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号５１、それに対応するシグナル配列を含むアミノ酸配列を配列番号５２に示す。配列番号５２において、Ｎ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基はフェニルアラニンであった。
（４）可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）をコードするｃＤＮＡの取得
ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の細胞外領域（配列番号４９の１〜１９３番目）とＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ配列を持つ可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）［以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）と記す］をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
本項（２）で得られたプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ３を制限酵素ＡｌｗＮＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の５’末端側を含む約２．７ｋｂｐの断片を回収した。
本項（３）で得られたプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）＋Ｈｉｓ３を制限酵素ＡｌｗＮＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、ｈＦｃγＲＩＩＩａの３’末端側とＨｉｓ−ｔａｇ配列を含む約９２０ｂｐの断片を回収した。
上記で得たプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ３由来の約２．７ｋｂｐの断片とプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）＋Ｈｉｓ３由来の約９２０ｂｐの断片を、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０（宝酒造社製）により連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調整し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシークエンサー３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、ｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ２が得られたことを確認した。
決定したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号５３、それに対応するシグナル配列を含むアミノ酸配列を配列番号５４に示す。配列番号５４において、Ｎ末端メチオニンから１７６番目のアミノ酸残基はバリンであった。
（５）ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の発現ベクターの構築
ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の発現ベクターは、以下のようにして構築した。
本項（３）および（４）で得られたプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ３およびｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ２のそれぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約６２０ｂｐの各断片を回収した。
一方、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約１０．７ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得たｓｈＦｃγＲＩＩａ（Ｆ）ｃＤＮＡおよびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）ｃＤＮＡを含む約６２０ｂｐの各断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来の約１０．７ｋｂｐの断片を、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調整し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシークエンサー３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、目的のｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）ｃＤＮＡを含む発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）−ＨｉｓおよびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）ｃＤＮＡを含む発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）−Ｈｉｓが得られたことを確認した。
２．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの安定生産細胞の作製
本参考例の第１項で構築したｓｈＦｃγＩＩＩａの発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）−ＨｉｓおよびｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）−ＨｉｓをラットミエローマＹＢ２／０細胞［ＡＴＣＣＣＲＬ−１６６２、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，５７６（１９８２）］に導入し、二種類のｓｈＦｃγＲＩＩＩａの安定生産細胞を以下のようにして作製した。
制限酵素ＡａｔＩＩで消化し、線状化したｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓの１０μｇを４×１０^６個のＹＢ２／０細胞へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］で導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（１０）［１０％ＦＢＳを含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中のｓｈＦｃγＲＩＩＩａの発現量を後述する本参考例の第５項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中にｓｈＦｃγＲＩＩＩａの発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用してｓｈＦｃγＲＩＩＩａ生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１〜２週間培養して、５０ｎＭＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中のｓｈＦｃγＲＩＩＩａの発現量を本参考例の第５項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中にｓｈＦｃγＲＩＩＩａの発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａを高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株に対して、２回の限界希釈法によるクローン化を行った。ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）を生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１０７およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１１１を得た。
４．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの精製
本参考例の第２項で得られたｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）を生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１０７およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１１１をＧ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌで含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＧＦ（５）［５％Ｄａｉｇｏ’ｓＧＦ２１（和光純薬社製）を含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＬＩＦＥＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）］に３×１０^５細胞／ｍＬとなるように濁し、１８２ｃｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍＬ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）を精製した。
５．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の検出（ＥＬＩＳＡ法）
培養上清中あるいは精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の検出、定量は、以下に示すＥＬＩＳＡ法により行った。
Ｈｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体Ｔｅｔｒａ−ＨｉｓＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をＰＢＳを用いて５μｇ／ｍＬに調製した溶液を９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃、１２時間以上反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）およびｓｈＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５０倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＣＤ１６抗体溶液（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ＡｖｉｄｉｎＤ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、５分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４１５を測定した。

配列番号１７−人工配列の説明：一本鎖抗体のアミノ酸配列
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７４−人工配列の説明：一本鎖抗体のアミノ酸配列
配列番号７５−人工配列の説明：二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列
配列番号７６−人工配列の説明：二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列
配列番号７７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１００−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims

結合性蛋白質とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体Ｆｃ領域との融合蛋白質分子からなる医薬融合蛋白質組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である融合蛋白質組成物。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である、請求の範囲１に記載の融合蛋白質組成物。
抗体Ｆｃ領域がヒト抗体のＩｇＧクラスである、請求の範囲１または２に記載の融合蛋白質組成物。
抗体Ｆｃ領域がヒト抗体のＩｇＧ１クラスである、請求の範囲３に記載の融合蛋白質組成物。
抗体融合蛋白質組成物が、ヒト抗体のＩｇＧ１クラス重鎖定常領域ドメイン２（ＣＨ_２）を含む請求の範囲４に記載の融合蛋白質組成物。
融合蛋白質組成物が、ヒト抗体ヒンジ領域、抗体のＩｇＧ１クラス重鎖定常領域ドメイン２（ＣＨ_２）および抗体重鎖定常領域ドメイン３（ＣＨ_３）を含む請求の範囲５に記載の融合蛋白質組成物。
結合性蛋白質が、抗体の結合性断片、可溶性受容体およびリガンド蛋白質からなる群から選ばれる蛋白質を少なくとも１つ含む請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物。
抗体の結合性断片が、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖を少なくとも１つ含む請求の範囲７に記載の融合蛋白質組成物。
抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖が、一本鎖抗体である請求の範囲８に記載の融合蛋白質組成物。
抗体の結合性断片が、一本鎖抗体である請求の範囲７に記載の融合蛋白質組成物。
抗体の結合性断片が、二種類の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖を含む請求の範囲７に記載の融合蛋白質組成物。
抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド鎖が、一本鎖抗体である請求の範囲１１に記載の融合蛋白質組成物。
抗体の結合性断片が、二重特異性一本鎖抗体である請求の範囲７に記載の融合蛋白質組成物。
可溶性受容体が、可溶型ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ）受容体ＩＩである請求の範囲７に記載の融合蛋白質組成物。
可溶性受容体が、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含む請求の範囲１５に記載の融合蛋白質組成物。
融合蛋白質が、ＦＥＲＭＢＰ−８４９９により生産される請求の範囲１４または１５に記載の融合蛋白質組成物。
リガンド蛋白質が、ＬＦＡ−３（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅＦｕｎｃｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎ−３）である請求の範囲７に記載の融合蛋白質組成物。
リガンド蛋白質が、配列番号６５で示されるアミノ酸配列を含む請求の範囲１６に記載の融合蛋白質組成物。
融合蛋白質が、ＦＥＲＭＢＰ−８５００により生産される請求の範囲１７または１８に記載の融合蛋白質組成物。
融合蛋白質組成物が、２量体である請求の範囲１〜１９のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物。
請求の範囲１〜２０のいずれか１項に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素を失活するようにゲノムが改変された細胞である、請求の範囲２１に記載の形質転換体。
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞である、請求の範囲２２に記載の形質転換体。
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）およびＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）からなる群から選ばれる酵素である、請求の範囲２２または２３に記載の形質転換体。
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求の範囲２４に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲２４に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求の範囲２４に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲２４に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである請求の範囲２２または２３に記載の形質転換体。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求の範囲２９に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲２９に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
宿主細胞が、下記の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれる細胞である請求の範囲２１〜３１のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハ厶スター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｇ）胚性幹細胞；
（ｈ）受精卵細胞。
形質転換体がＦＥＲＭＢＰ−８４９９である請求の範囲２１〜３２のいずれか１項に記載の形質転換体。
形質転換体がＦＥＲＭＢＰ−８５００である請求の範囲２１〜３２のいずれか１項に記載の形質転換体。
請求の範囲２１〜３４のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に融合蛋白質組成物を生成蓄積させ、該抗体組成物を採取し、精製する、請求の範囲１〜２０のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物の製造方法。
請求の範囲３５に記載の製造方法により得られる、請求の範囲１〜２０のいずれか１項に記載の抗体融合蛋白質組成物。
請求の範囲１〜２０および３６のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物を有効成分として含有する医薬。
請求の範囲１〜２０および３６のいずれか１項に記載の融合蛋白質組成物を有効成分として含有する医薬が、腫瘍、炎症性疾患または自己免疫疾患の予防薬または治療薬。
腫瘍が、血液腫瘍または癌である請求の範囲３８に記載の疾患の予防薬または治療薬。