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CN116723861A - 抗GARP/TGFβ抗体及使用方法 - Google Patents

抗GARP/TGFβ抗体及使用方法 Download PDF

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CN116723861A
CN116723861A CN202180078289.7A CN202180078289A CN116723861A CN 116723861 A CN116723861 A CN 116723861A CN 202180078289 A CN202180078289 A CN 202180078289A CN 116723861 A CN116723861 A CN 116723861A
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王锦堂
曾琪铃
姜伟东
陈斌
徐瑶
高洁
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Shanghai Henlius Biotech Inc
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Abstract

本公开提供了结合GARP(也称为LRRC32和CPPRDD)和/或GARP/TGFβ复合物的抗体和抗体衍生物及其使用方法。在某些实施例中，本文提供的抗GARP/TGFβ抗体或抗体衍生物可以抑制靶细胞中的TGFβ信号途径。

Description

抗GARP/TGFβ抗体及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月2日提交的国际专利申请号PCT/CN2020/133398的优先权，其内容通过引用以其整体并入，并要求其优先权。
技术领域
本公开涉及结合GARP/TGFβ复合物的抗体和抗体衍生物及其使用方法。
背景技术
糖蛋白A主导重复序列(GARP，也称为LRRC32和CPPRDD)是潜在转化生长因子β(TGFβ)的跨膜细胞表面对接蛋白。GARP包含三个结构域：占蛋白质约70％的大的N-末端胞外结构域、跨膜结构域和短的C-末端胞质尾区。GARP在TGFβ产生、积累和活化的多个严格调节步骤中起重要作用。此外，GARP/TGFβ复合物在调节性T淋巴细胞(Treg)、血小板和多种人癌细胞上表达，其中据报道其通过提供TGFβ的过量来源来支持癌细胞生长和迁移，TGFβ在肿瘤微环境中起作用并促进肿瘤免疫逃逸。鉴于GARP和TGFβ信号传导在免疫调节和癌症生物学中的重要作用，本领域需要开发靶向GARP/TGFβ信号传导的治疗性分子和方法，用于免疫疗法和癌症治疗。
发明内容
本公开提供了以高亲和力特异性结合GARP/TGFβ复合物的分离的单克隆抗体和抗体衍生物，包括单特异性抗GARP/TGFβ抗体和结合GARP/TGFβ复合物和一种或多种另外的靶标的多特异性抗体。在某些实施例中，本文公开的抗体或抗体衍生物包含与GARP/TGFβ复合物结合的全长抗体。在某些实施例中，本文公开的抗体或抗体衍生物包含结合GARP/TGFβ复合物的scFv。本公开还提供了制备和使用本文公开的抗体和抗体衍生物以及包含这些抗体和抗体衍生物的药物组合物的方法，例如用于治疗疾病和障碍，例如癌症。本发明部分地基于与GARP/TGFβ复合物结合的新型抗体的发现，其可以靶向肿瘤细胞和/或增加针对肿瘤细胞的免疫应答。
本公开提供一种结合GARP/TGFβ复合物的抗体，该抗体包含：a)重链可变区，其包含：(1)重链可变区CDR-H1，其包含SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51、61和105中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)重链可变区CDR-H2，其包含SEQ ID NO：2、12、22、32、42、52、62和106中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；和(3)重链可变区CDR-H3，其包含SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、63和107中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；和b)轻链可变区，其包含：(1)轻链可变区CDR-L1，其包含SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54、64和108中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)轻链可变区CDR-L2，其包含SEQ ID NO：5、15、25、35、45、55、65和109中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；和(3)轻链可变区CDR-L3，其包含SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56、66和110中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施例中，抗体以1x10-7M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以1x10-8M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-11M至约1x10-7M的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-10M至约5x10-8M的KD结合GARP/TGFβ复合物。
在某些实施例中，抗体与参考抗GARP/TGFβ抗体交叉竞争，该参考抗GARP/TGFβ抗体包含：a)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：6中所示氨基酸序列的CDR-L3；b)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ IDNO：11中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16中所示氨基酸序列的CDR-L3；c)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：26中所示氨基酸序列的CDR-L3；d)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：34中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQID NO：36中所示氨基酸序列的CDR-L3；e)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQID NO：41中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：42中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：44中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的CDR-L3；f)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：51中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：54中所示氨基酸序列的CDR-L 1，(2)包含SEQ ID NO：55中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56中所示氨基酸序列的CDR-L3；g)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：61中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：64中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66中所示氨基酸序列的CDR-L3；或h)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：105中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：106中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：107中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：108中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ IDNO：109中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施例中，抗体包含：a)包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域的重链可变区，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、85、89、93、97、101和111组成的组的氨基酸序列；和b)包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域的轻链可变区，其中该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、83、84、86、90、94、98、102和112组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ IDNO：1中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：26中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ IDNO：33中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ IDNO：34中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：41中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQID NO：42中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：44中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：51中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：54中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：61中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：64中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：105中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ IDNO：106中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：107中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：108中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：109中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO：7中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：17中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：27中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：28中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：38中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：83中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：48中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：84中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：57中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQID NO：58中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：67中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：68中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO：85中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：86中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：89中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：90中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：93中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：94中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：97中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：98中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：101中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：102中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：111中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：112中所示氨基酸序列。
在某些实施例中，抗体包含人框架。在某些实施例中，抗体是人抗体。在某些实施例中，抗体是人源化抗体。在某些实施例中，抗体包含全长免疫球蛋白、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双抗体、三抗体、四抗体或其任何组合。
在某些实施例中，抗体包含Fc区。在某些实施例中，Fc区包含人Fc区。在某些实施例中，Fc区包含选自下组的Fc区，该组由以下组成：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区。
在某些实施例中，Fc区包含选自下组的Fc区，该组由以下组成：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区。在某些实施例中，Fc区包含IgG1 Fc区。在某些实施例中，Fc区包含IgG4 Fc区。在某些实施例中，抗体结合人GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体结合食蟹猴GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体结合人GARP/TGFβ复合物、食蟹猴GARP/TGFβ复合物和小鼠GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，Fc区包含C-末端赖氨酸。在某些实施例中，Fc区包含C-末端赖氨酸的缺失。
在某些实施例中，抗体包含在多特异性抗体例如双特异性抗体中，其中该多特异性抗体包含特异性结合第二抗原的第二抗体部分。在某些实施例中，第二抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施例中，肿瘤相关抗原选自下组，该组由以下组成：Her-2，EGFR，PDL1，MSLN，c-Met，B细胞成熟抗原(BCMA)，碳酸酐酶IX(CA1X)，癌胚抗原(CEA)，CD5，CD7，CD10，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，CD38，CD41，CD44，CD47，CD49f，CD56，CD74，CD123，CD133，CD138，CD276(B7H3)，上皮糖蛋白(EGP2)，滋养层细胞表面抗原2(TROP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-a，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis A(CA 1.9.9)，Lewis Y(LeY)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，粘蛋白16(Muc-16)，粘蛋白1(Muc-1)，NG2D配体，肿瘤胚胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，密封蛋白18.2(CLDN18.2)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，肾母细胞瘤蛋白(WT-1)，1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)，PVR，PVRL2及其任何组合。在某些实施例中，第二抗原是免疫检查点调节剂。在某些实施例中，免疫检查点调节剂选自下组，该组由以下组成：TIGIT、PD1、CTLA4、LAG-3、2B4、BTLA及其任何组合。在某些实施例中，第二抗原是免疫共刺激分子或T细胞受体/CD3复合物的亚基。在某些实施例中，免疫共刺激分子选自下组，该组由以下组成：CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40及其任何组合。在某些实施例中，T细胞受体/CD3复合物的亚基选自下组，该组由以下组成：CD3γ、CD3δ、CD3ε及其任何组合。
本公开提供了包含与治疗剂或标记连接的本文公开的任何抗体的免疫缀合物。在某些实施例中，治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。在某些实施例中，标记选自下组，该组由以下组成：放射性同位素、荧光染料和酶。
本公开提供了抗原识别受体，其包含含有本文公开的抗体的胞外抗原结合结构域。在某些实施例中，抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体。在某些实施例中，抗原识别受体是CAR。在某些实施例中，抗体是scFv或Fab。
本公开提供了包含本文公开的抗原识别受体的免疫应答细胞。在某些实施例中，免疫应答细胞选自下组，该组由以下组成：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和髓样细胞。在某些实施例中，免疫应答细胞是T细胞。
本公开进一步提供了药物组合物。在某些实施例中，药物组合物包含a)本文公开的抗体、免疫缀合物或免疫应答细胞，和b)药学上可接受的载剂。
本公开还提供了编码本文公开的任何抗体的一种或多种核酸、包含本文公开的任何核酸的一种或多种载体、以及包含本文公开的任何核酸或任何载体的宿主细胞。
本公开提供了用于制备本文公开的抗体的方法。在某些实施例中，该方法包括在本文公开的宿主细胞中表达抗体，并从宿主细胞分离抗体。
本公开还提供了减轻受试者的肿瘤负荷的方法。在某些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体、免疫缀合物或药物组合物。
在某些实施例中，该方法减少肿瘤细胞的数量。在某些实施例中，该方法减小肿瘤大小。在某些实施例中，该方法根除受试者的肿瘤。在某些实施例中，肿瘤表现出高微卫星不稳定性(MSI)。在某些实施例中，肿瘤选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
本公开还提供了治疗和/或预防受试者的癌症的方法。在某些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体、免疫缀合物或药物组合物。
本公开还提供了延长患有癌症的受试者的存活期的方法。在某些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体、免疫缀合物或药物组合物。
在某些实施例中，癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI)。在某些实施例中，癌症选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
本公开提供了本文公开的用作药物的任何抗体。本公开还提供了本文公开的用于治疗癌症的任何抗体。本公开还提供了本文公开的用作药物的药物组合物。本公开还提供了本文公开的用于治疗癌症的药物组合物。在某些实施例中，癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI)。在某些实施例中，癌症选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
本公开提供了试剂盒，其包含本文公开的抗体、免疫缀合物、药物组合物、核酸、载体或免疫应答细胞。在某些实施例中，试剂盒包含用于治疗和/或预防赘生物的书面说明书。
本公开还提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的抗GARP/TGFβ抗体和抗PD1抗体。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体是本文公开的抗GARP/TGFβ抗体。在某些实施例中，癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI)。在某些实施例中，癌症选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体和抗PD1抗体同时或顺序施用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体和抗PD1抗体同时施用。在某些实施例中，在施用抗GARP/TGFβ抗体之前施用一剂或多剂的抗PD1抗体。在某些实施例中，受试者在施用抗GARP/TGFβ抗体之前接受完整疗程的抗PD1抗体疗法。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体在抗PD1抗体疗法的第二疗程期间施用。在某些实施例中，受试者在施用抗GARP/TGFβ抗体之前接受至少一剂、至少两剂、至少三剂或至少四剂的抗PD1抗体。在某些实施例中，至少一剂抗PD1抗体与抗GARP/TGFβ抑制剂同时施用。在某些实施例中，在施用抗PD1抗体之前施用一剂或多剂抗GARP/TGFβ抗体。在某些实施例中，受试者在施用抗PD1抗体之前接受至少两剂、至少三剂、至少三剂或至少四剂的抗GARP/TGFβ抗体。在某些实施例中，至少一剂抗GARP/TGFβ抗体与抗PD1抗体同时施用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体和抗PD1抗体每1、2、3、4或5周施用一次。在某些实施例中，癌症在选自由手术、化疗、放射疗法和其任何组合组成的组的疗法之后是复发性或进展性的。
附图说明
图1A-1E描绘了所选抗体克隆的GARP/潜在TGFβ1结合。抗体克隆GA1选自天然人Fab噬菌体文库，并通过流式细胞术测试其与人GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞(1A)、食蟹猴GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞(1B)、小鼠GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞(1C)、凝血酶活化的人血小板(1D)和抗CD3/CD28珠活化的人Treg(1E)的结合能力。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。同种型对照(贝伐单抗(bevacizumab))用作阴性对照。
图2描绘了GA1抑制成熟TGFβ1从活化血小板的释放。在存在或不存在指定抗体的情况下，用凝血酶刺激血小板1小时。刺激后，收获反应上清液用于成熟TGFβ1定量。使用TGFβ1ELISA试剂盒(R&D公司)检测成熟TGFβ1。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。
图3描绘了GA1减少血小板介导的T细胞抑制。用抗CD3/CD28 Dynabeads(吉布科公司(Gibco))以1∶40的珠与细胞比刺激CD4+T细胞，并与血小板和GA1孵育4天。对收获的上清液进行IFNγ定量。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。
图4A和4B描绘了GA1可以逆转Treg介导的T细胞抑制。在混合白细胞反应测定中，将分离的Treg细胞(2.5×103)加入含有或不含抗体的T细胞(1×105)和同种异体树突状细胞(DC)(1×104)的混合物中。孵育5天后，对培养上清液中的IFNγ(4A)和IL-2(4B)分泌进行定量。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。
图5描绘了GA1可单独和与抗PD1抗体组合抑制肿瘤生长。在MC38(小鼠结肠癌)同基因小鼠模型中，向C57BL/6小鼠(n＝6只小鼠/组)皮下植入MC38细胞。在肿瘤接种后4天施用各测试药剂的第一剂。用指定抗体每周两次腹膜内治疗小鼠，持续3周。RMP1-14是市售的抗小鼠PD1抗体。所有数据点代表平均值±SEM。
图6A-6E描绘了GA1靠前变体的GARP/潜在TGFβ1结合能力。通过流式细胞术测试了选自亲和力成熟的GA1顶部变体与人GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞(6A)、食蟹猴GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞(6B)、小鼠GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞(6C)、凝血酶活化的人血小板(6D)和抗CD3/CD28珠活化的人Treg细胞(6E)的结合能力。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。
图7描绘了GA1框架/恒定区变体与人GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞的全细胞结合能力。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。
图8描绘了GA1变体抑制成熟TGFβ1从活化血小板的释放。在存在或不存在指定抗体的情况下，用凝血酶刺激血小板1小时。刺激后，收获反应上清液用于成熟TGFβ1定量。使用TGFβ1ELISA试剂盒(R&D公司)检测成熟TGFβ1。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。
图9描绘了所选GA1变体减少血小板介导的T细胞抑制。在存在或不存在指定抗体的情况下，用抗CD3/CD28 Dynabeads(吉布科公司)以1∶40的珠与细胞比在有或没有血小板的情况下刺激CD4+T细胞4天。对从反应中收获的上清液进行IFNγ定量。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。
图10A和10B描绘了GA1变体可以逆转Treg介导的T细胞抑制。在混合白细胞反应测定中，将分离的Treg细胞(2.5×103)加入含有或不含GA1变体的T细胞(1×105)和同种异体树突状细胞(DC)(1×104)的混合物中。孵育5天后，对培养上清液中的IFNγ(10A)和IL-2(10B)分泌进行定量。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。
图11描绘了GA1#8抑制活化的人Treg细胞中TGFβ介导的Smad2磷酸化。在存在或不存在指定抗体的情况下，用抗CD3/CD28 Dynabeads(吉布科公司)以1∶1的珠与细胞比刺激分离的Treg，持续24小时。用针对P-Smad2(作为活性TGFβ1产生的读数)和GAPDH(作为负载对照)的抗体通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。抗TGFβ是来自Bio X Cell的市售抗TGFβ抗体(1D11)。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。
图12描绘了GA1变体可以在MC38(小鼠结肠癌)同基因小鼠模型中抑制肿瘤生长。向C57BL/6小鼠(n＝6只小鼠/组)皮下植入MC38细胞。在肿瘤接种后4天施用各测试药剂的第一剂。用指定抗体每周两次腹膜内治疗小鼠，持续3周。所有数据点均为平均值±SEM。
图13描绘了GA1#8可单独和与抗PD1抗体组合抑制肿瘤生长。在MC38(小鼠结肠癌)同基因小鼠模型中，向C57BL/6小鼠(n＝10只小鼠/组)皮下植入MC38细胞。在肿瘤接种后4天施用各测试药剂的第一剂。用指定抗体每周两次腹膜内治疗小鼠，持续3周。RMP1-14是市售的抗小鼠PD1抗体。所有数据点代表平均值+SEM。
图14描绘了GA1#8可单独和与抗PD1抗体组合抑制肿瘤生长。在CT26(小鼠结肠癌)同基因小鼠模型中，向C57BL/6小鼠(n＝10只小鼠/组)皮下植入CT26细胞。在肿瘤接种后3天施用各测试药剂的第一剂。用指定抗体每周两次腹膜内治疗小鼠，持续3周。RMP1-14是市售的抗小鼠PD1抗体。所有数据点代表平均值+SEM。
图15A和15B描绘了通过ELISA评估的抗GARP/TGFβ抗体与人GARP/TGFβ复合物(15A)和单独的人GARP(15B)的结合。
图16A-16D描绘了通过流式细胞术评估的抗GARP/TGFβ抗体与Hs 578T细胞(16A)、人GARP转染的CHO-S细胞(16B)、人血小板(16C)和人Treg细胞(16D)的全细胞结合。
图17描绘了抗GARP/TGFβ抗体抑制TGFβ1从凝血酶活化的血小板释放的能力。
图18描绘了抗GARP/TGFβ抗体降低Treg介导的CD3+T细胞抑制的能力。
图19A和19B描绘了在来自供体1(19A)和供体2(19B)的PBMC存在下，抗GARP/TGFβ抗体对Hs 578T细胞的ADCC效应。
图20描绘了抗GARP/TGFβ抗体耗竭来自四个供体的PBMC中的GARP+Treg细胞的能力。
图21A-21C描绘了抗GARP/TGFβ抗体在MC38小鼠结肠癌模型中抑制肿瘤生长的能力。图21A描绘了在指定抗GARP/TGFβ抗体和对照治疗下的肿瘤生长曲线。图21B描绘了每个治疗组中小鼠血液中的Treg细胞群。图21C描绘了每个治疗组中小鼠脾脏中的Treg细胞群。
具体实施方式
本公开提供了以高亲和力特异性结合GARP/TGFβ复合物的分离的单克隆抗体和抗体衍生物，包括单特异性抗GARP/TGFβ抗体和结合GARP/TGFβ复合物和一种或多种另外的靶标的多特异性抗体。在某些实施例中，本文公开的抗体或抗体衍生物包含与GARP/TGFβ复合物结合的全长抗体。在某些实施例中，本文公开的抗体或抗体衍生物包含结合GARP/TGFβ复合物的scFv。本公开还提供了制备和使用本文公开的抗体和抗体衍生物以及包含这些抗体和抗体衍生物的药物组合物的方法，例如用于治疗疾病和障碍，例如癌症。本发明部分地基于与GARP/TGFβ复合物结合的新型抗体的发现，其可以靶向肿瘤细胞和/或增加针对肿瘤细胞的免疫应答。
为了清楚起见而不是作为限制，本公开的主题的具体实施方式分为以下小节：
1.定义；
2.抗体和抗体衍生物：
3.使用方法；
4.药物配制品；以及
5.制品。
1.定义
本文提及的术语“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即抗体片段)。“抗体”可以是独立的分子或抗体衍生物的一部分。示例性抗体衍生物包括但不限于多功能抗体，例如多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原识别受体(例如嵌合抗原受体)、包含另外的蛋白质或非蛋白质部分的抗体缀合物(例如抗体-药物缀合物或聚合物包被的抗体)和包含抗体的其他多功能分子。
“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”是指与天然抗体结构相似或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。在某些实施例中，全长抗体包含两条重链和两条轻链。在某些实施例中，轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变区可以分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链(LC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链(HC)CDR)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过公知的惯例来定义或鉴定，例如，下文所述的Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT和AHo的惯例。重链或轻链的三个CDR被插入称为框架区(FR)的侧翼区段之间，它们比CDR更为保守，并形成了支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但是表现出多种效应子功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别以存在α、δ、ε、γ和μ重链为特征。几种主要抗体类别分为亚类，例如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。在某些实施例中，全长抗体是糖基化的。在某些实施例中，全长抗体包含与其Fc区连接的聚糖。在某些实施例中，全长抗体包含支链聚糖。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、“抗体片段”和“抗体部分”是指保留与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv和scFv-Fc)、单结构域抗体、VHH、VHH-Fc、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、或结合抗原的抗体的任何其他片段或其组合。“VHH”是指从骆驼科动物中分离的单结构域抗体。在某些实施例中，VHH包含骆驼科动物重链抗体的重链可变区。在某些实施例中，VHH的大小不超过约25kDa。在某些实施例中，VHH的大小不超过约20kDa。在某些实施例中，VHH的大小不超过约15kDa。
与参考抗体“交叉竞争结合的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％以上的抗体，相反，在竞争测定中参考抗体阻断抗体与其抗原的结合达50％以上。在Antibodies，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)中描述了示例性竞争测定法。
“Fv”是最小抗体片段，其含有完整抗原识别位点和抗原结合位点。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(重链和轻链各自中的3个环)，该高变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体与抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)可以识别并结合抗原，虽然有时以比完整结合位点更低的亲和力进行。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施例中，scFv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv形成所希望的用于抗原结合的结构。关于scFv的综述，参见Plückthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
出于本文的目的，“受体人框架”或“人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者可以包含氨基酸序列变化。在某些实施例中，氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在某些实施例中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列方面是相同的。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文所用，“结合亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1∶1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些)测量。下面描述了用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施例。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有这种改变的亲本抗体相比，在一个或多个CDR或高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，该改变提供了抗体对抗原的改善的亲和力。
如本文所用，“GARP”、“GARP蛋白”或“GARP多肽”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如人和食蟹猴))的任何GARP多肽、或其任何片段，并且可以任选地包含至多一个、至多两个、至多三个、至多四个、至多五个、至多六个、至多七个、至多八个、至多九个或至多十个氨基酸取代、添加和/或缺失。该术语包括全长、未加工的GARP以及在细胞中加工产生的任何形式的GARP。该术语还包括天然存在的GARP变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施例中，GARP多肽包含或具有与具有以下NCBI参考号的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列：NP_001122394.1、NP_001357116.1、NP_001357117.1、NP_001357118.1、NP_001357119.1、NP_001357120.1或NP_005503.1(本文的同源性可使用标准软件如BLAST或FASTA确定)。在某些实施例中，GARP多肽包含或具有作为SEQ ID NO：85的整体或连续部分的氨基酸序列。在某些实施例中，GARP蛋白在GARP/TGFβ复合物中。在某些实施例中，GARP蛋白不在GARP/TGFβ复合物中，例如分离的GARP蛋白。
术语“GARP的ECD”是指GARP的胞外结构域。在某些实施例中，GARP的胞外结构域是GARP的N-末端胞外结构域。在某些实施例中，示例性GARP多肽的N-末端ECD可包含SEQ IDNO：86中所示的氨基酸序列。
术语“抗GARP/TGFβ抗体”和“结合GARP/TGFβ复合物的抗体”是指能够以足够的亲和力结合GARP/TGFβ复合物的抗体，使得该抗体可用作靶向GARP/TGFβ复合物的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施例中，抗GARP/TGFβ抗体与无关的、非GARP/TGFβ蛋白的结合程度小于该抗体与GARP/TGFβ复合物结合的约10％，例如通过表面等离子体共振测定法所测量的。在某些实施例中，与GARP/TGFβ复合物结合的抗体具有以下解离常数(KD)：＜约1μM，＜约100nM，＜约10nM，＜约1nM，＜约0.1nM，＜约0.01nM或＜约0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-12M，例如10-9M至10-10M)。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体结合来自不同物种的GARP/TGFβ复合物中保守的GARP/TGFβ复合物表位。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体结合在蛋白质的ECD中的GARP蛋白上的表位。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体与GARP/TGFβ复合物中的GARP蛋白结合。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体与不在GARP/TGFβ复合物中的GARP蛋白(例如分离的GARP蛋白)结合。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体不结合不是GARP/TGFβ复合物的GARP蛋白。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种。在某些实施例中，本文公开的嵌合抗体包含骆驼科动物重链可变区和人Fc区。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指重链和/或轻链的可变区内的非连续抗原结合位点。这些特定区已经描述于：Kabat et al.，J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabat et al.，U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Al-Lazikani B.et al.，J.Mol.Biol.，273：927-948(1997)；MacCallum etal.，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)；Abhinandan and Martin，Mol.Immunol.，45：3832-3839(2008)；Lefranc M.P.et al.，Dev.Comp.Immunol.，27：55-77(2003)；以及Honeggerand Plückthun，J.Mol.Biol.，309：657-670(2001)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。涵盖如上述每篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中作为比较。CDR预测算法和接口是本领域已知的，包括例如Abhinandan andMartin，Mol.Immunol.，45：3832-3839(2008)；Ehrenmann F.et al.，Nucleic Acids Res.，38：D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.et al.，Nucleic Acids Res.，43：D432-D438(2015)。在本段中引用的参考文献的内容通过引用以其整体并入本文，以用于本申请中并且可能包含在本文的一项或多项权利要求中。
表1：CDR定义
Kabat1 Chothia2 MacCallum3 IMGT4 AHo5
VH CDR1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
VH CDR2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
VH CDR3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
VL CDR1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
VL CDR2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
VL CDR3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1残基编号遵循Kabat等人的命名法(同上)。
2残基编号遵循Chothia等人的命名法(同上)。
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法(同上)。
4残基编号遵循Lefranc等人的命名法(同上)。
5残基编号遵循Honegger和Plückthun的命名法(同上)。
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指用于上文Kabat等人的抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际直链氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
在某些实施例中，涵盖单结构域抗体的CDR的氨基酸残基是根据上文Lefrranc等人的IMGT命名法定义的。在某些实施例中，涵盖全长抗体或scFv的CDR的氨基酸残基是根据上文Kabat等人的Kabat命名法定义的。在某些实施例中，免疫球蛋白重链例如Fc区中的残基编号是如上文Kabat等人所述的EU索引的编号。“如Kabat所述的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”是指除了本文定义的CDR残基以外的那些可变结构域残基。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR/HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包括基本上至少一个、并且典型地两个可变结构域的全部，其中HVR/CDR的全部或基本上全部对应于非人类抗体的那些，并且FR的全部或基本上全部对应于人类抗体的那些。人源化抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经人源化的抗体。
“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或已经使用本文公开的任何用于制备人抗体的技术制备。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Markset al.，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boemer etal.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)中描述的方法。另请参见van Dijk and van deWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用至已被修饰以响应抗原攻击而产生这种抗体但其内源基因座已失效的转基因动物(例如已免疫的xenomice)来制备(参见例如关于XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。还参见，例如，关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体的Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。
将“关于本文鉴定的多肽和抗体序列的氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”定义为在比对序列(考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列中与所比较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE生成氨基酸序列同一性％值(Edgar，R.C.，Nucleic Acids Research 32(5)：1792-1797，2004；Edgar，R.C.，BMCBioinformatics 5(1)：113，2004)。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中两个的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个的一个位置被腺嘌呤占据，则该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数乘以100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，那么两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常，当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，其相对于免疫球蛋白的另一部分，即可变结构域，具有更保守的氨基酸序列，其包含抗原结合位点。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CL结构域。
任何哺乳动物物种的抗体(例如免疫球蛋白)的“轻链”都可以根据其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种明显不同的类型之一，分别称为kappa(“κ”)和lambda(“λ”)。
“CH1结构域”(也称为“H1”结构域的“C1”)通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
“铰链区”通常定义为IgG中对应于人IgG1的Glu216至Pro230的区域(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。其他IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列比对。
人IgG Fc区(也称为“C2”结构域)的“CH2结构域”通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域是独特的，因为其不与另一个结构域紧密配对。而是，两个N连接的支链碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物并有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec Immunol.22：161-206(1985)。
“CH3结构域”(也称为“C2”结构域)包含CH2结构域与Fc区的C末端之间的残基(即，从约氨基酸残基341到抗体序列的C末端)，通常在IgG的氨基酸残基446或447处)。
本文中的术语“Fc区”或“片段可结晶区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是通常将人IgG重链的Fc区定义为从Cys226位置处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。可以例如在抗体的生产或纯化期间或通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程化来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包括去除了所有K447残基的抗体群体，没有去除K447残基的抗体群体以及具有带有和不带有K447残基的抗体混合物的抗体群体。用于本文所述抗体的合适天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体的FcR，包括等位基因变体和这些受体的剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)。FcR综述于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；和deHaas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995).本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来鉴定的FcR。
如本文所用，术语“表位”是指抗体或抗体衍生物所结合的抗原上的特定原子或氨基酸基团。如果两个抗体或抗原结合部分对抗原具有竞争性结合，则它们可以结合抗原内的相同表位。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”和“对......有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，例如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其决定了在异质分子(包括生物分子)群体存在时靶标的存在。例如，特异性识别靶标(可以是表位)的抗体或抗体部分是与该靶标结合的抗体或抗体部分，其亲和力、亲合力、就绪性和/或持续时间长于与其他靶标的结合。在一些实施例中，抗体与不相关靶标的结合程度小于例如通过放射免疫测定(RIA)测量的抗体与靶标的结合程度的约10％。在一些实施例中，特异性结合靶标的抗体的解离常数(KD)≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M、或≤10-12M。在一些实施例中，抗体特异性结合在来自不同物种的蛋白中为保守的蛋白的表位。在一些实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。抗体或抗原结合结构域的结合特异性可以通过本领域已知的方法通过实验确定。这类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIACORETM-检验和肽扫描。
“分离的”抗体(或构建体)是已经从其生产环境的组分(例如天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的抗体。在某些实施例中，分离的多肽在其生产环境中没有或基本上没有与所有其他组分缔合。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是与在其生产环境中从通常与其相关联的至少一种污染物核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。在某些实施例中，分离的核酸没有或基本没有与生产环境有关的所有组分缔合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于天然存在的形式或背景。因此，分离的核酸分子不同于编码天然存在于细胞中的本文所述的多肽和抗体的核酸。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作地连接的(operablylinked或operatively linked)”。例如，如果将前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者如果核糖体结合位点被定位成使得有助于翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读框中。然而，增强子不必需是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果不存在此类住点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞，该细胞包括原代受试者细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的子代，而与传代次数无关。子代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，并且可能含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变子代包括在本文中。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，受试者是人。
药剂的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。该特定剂量可以根据以下各项中的一种或多种来改变：所选择的特定药剂、随后的给药方案(无论它是否与其他化合物组合)、施用时间、成像的组织、以及其中携带它的物理递送系统。
本申请的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据例如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发希望的应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是该物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用均被治疗有益作用所抵消的量。治疗有效量可以一次或多次施用来递送。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本申请的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如，转移)、预防或延迟疾病的重现、延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加或改善生活质量、增加体重增长和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少癌症的病理后果(像例如，肿瘤体积)。本申请的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。“治疗”并不一定意味着所治疗的疾病将得到治愈。
应当理解，本文所述的本申请的实施例包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。
如本文所用，术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受的误差范围之内，这将部分地取决于该值是怎样测定或确定的，即，受到测量系统的限制。在某些实施例中，“约”可以意指根据本领域的实践在3个或大于3个标准差之内。在某些实施例中，“约”可以表示给定值的至多20％(例如，至多10％、至多5％或至多1％)的范围。在某些实施例中，特别是对于生物学系统和方法，该术语可以意指在某一值的数量级内，例如在5倍内或在2倍内。
如本文所用，术语“调节”是指正向或负向变化。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约100％的变化。
如本文所用，术语“增加”是指正向地改变至少约5％。改变可以为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％或更多。
如本文所用，术语“减少”是指负向地变化至少约5％。改变可以为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或甚至约100％。
本文使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
当在本文和附带的权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a)”、“或(or)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。
“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型不同而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞活化。
“免疫缀合物”是指缀合至一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于允许包含其中的活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含对配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指药物配制品中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其参与抗体与抗原的结合。在某些实施例中，天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt etal.Kuby Immunology，61ed.，W.H.Freeman and Co.，page 91(2007).)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano et al.，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson et al.，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，术语“抗原识别受体”是指能够响应于其与抗原的结合而活化免疫应答细胞(例如T细胞)的受体。抗原识别受体的非限制性实例包括天然和修饰的T细胞受体(“TCR”)和嵌合抗原受体(“CAR”)。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的分子，该胞外抗原结合结构域与能够活化或刺激免疫应答细胞的胞内信号传导结构域融合。在某些实施例中，CAR的胞外抗原结合结构域包含抗体或抗体片段，例如VHH或scFv。在某些实施例中，抗体(例如VHH或scFv)与跨膜结构域融合，该跨膜结构域与胞内信号传导结构域融合。在某些实施例中，选择对抗原具有高结合亲和力或亲合力的CAR。
“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞或其祖先或子代。
2.抗体和抗体衍生物
本公开提供了抗体和抗体衍生物。在某些实施例中，本公开部分地基于与GARP/TGFβ复合物结合的单克隆抗体的发现，该单克隆抗体可用于抗肿瘤疗法，其中这些抗体选择性地靶向肿瘤细胞和/或抑制由GARP/TGFβ复合物介导的信号途径，从而诱导针对肿瘤细胞的有益抗肿瘤作用。在某些实施例中，本文公开的抗体是拮抗剂抗体，其抑制GARP/TGFβ复合物功能。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体抑制GARP与一种或多种TGFβ分子之间的相互作用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体阻断涉及GARP/TGFβ复合物的信号途径。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体阻断成熟TGFβ从GARP/TGFβ复合物的释放。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体抑制肿瘤细胞中的TGFβ信号途径。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体抑制免疫细胞例如Treg细胞中的TGFβ信号途径。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体降低由Treg细胞引起的免疫抑制作用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体增加免疫细胞(例如效应T细胞)中的抗肿瘤细胞因子分泌。在某些实施例中，与参考抗体(例如ABBV-151类似物)相比，抗GARP/TGFβ抗体表现出更优的增加免疫细胞(例如效应T细胞)中抗肿瘤细胞因子分泌的能力。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体在受试者中表现出抗肿瘤功效。在某些实施例中，与参考抗体(例如ABBV-151类似物或DS-1005a类似物)相比，抗GARP/TGFβ抗体表现出更优的抗肿瘤功效。ABBV-151，也称为LHG10.6，是临床阶段的抗GARP/TGFβ治疗性抗体，其序列公开于US 2016/0251438中。DS-1005a也称为H151D-H1L1，是临床阶段的抗GARP/TGFβIgG1抗体，其序列公开于US 2018/0258184中。
在某些实施例中，本公开的抗体可以是或包含单克隆抗体(包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体)。在某些实施例中，本文公开的抗体包含人源化抗体。在某些实施例中，抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施例中，本文公开的抗体包含人抗体。
在某些实施例中，本公开的抗体可以是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab′、scFv、双抗体或F(ab′)2片段。在某些实施例中，抗体是全长抗体，例如完整的IgG4抗体、或本文定义的其他抗体类型或同种型。在某些实施例中，本公开的抗体或抗体衍生物可以单独或组合地掺入任何(如本申请中所述的(例如，本文详述的第2.1-2.12节))特征。
本公开的抗体和抗体衍生物可用于例如诊断或治疗赘生物或癌症。在某些实施例中，使用本公开的抗体可以抑制其生长的瘤形成和癌症包括通常对免疫疗法有响应的瘤形成和癌症。在某些实施例中，瘤形成和癌症包括乳腺癌(例如，乳腺细胞癌)、卵巢癌(例如，卵巢细胞癌)和肾细胞癌(RCC)。可以使用本公开的方法治疗的其他癌症的实例包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)，前列腺癌，结肠癌，肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，脑瘤，慢性或急性白血病(包括急性髓细胞性白血病，慢性粒细胞性白血病，急性淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病)，淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，淋巴细胞性淋巴瘤，原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，T细胞淋巴瘤)，鼻咽癌，头或颈癌，皮肤癌或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，直肠癌，肛门区域癌，胃肿瘤，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，阴道癌，外阴，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，乳腺旁癌(cancerof the adbreast gland)，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，乳腺骨盆癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，肿瘤血管生成，脊柱肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西氏肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，环境诱导的癌症，包括由石棉(例如间皮瘤)诱导的癌症以及上述癌症的组合。
2.1.1示例性抗GARP/TGFβ抗体
本公开提供了结合GARP/TGFβ复合物的分离的抗体。在某些实施例中，本公开的抗GARP/TGFβ抗体结合GARP的ECD。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体结合包含SEQ ID NO：86中所示氨基酸序列的GARP的N-末端ECD。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体结合GARP/TGFβ复合物中的GARP蛋白。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体与不在GARP/TGFβ复合物中的GARP蛋白(例如分离的GARP蛋白)结合。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体不结合不在GARP/TGFβ复合物中的GARP蛋白。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体与本文所述的抗GARP/TGFβ抗体(例如克隆GA1、克隆hGA17或其变体，例如GA1#7、GA1#8或GA1#9)结合相同的表位。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体结合人GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体结合食蟹猴GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体结合小鼠GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体结合人GARP/TGFβ复合物、食蟹猴GARP/TGFβ复合物和小鼠GARP/TGFβ复合物。
在某些实施例中，本文公开的抗GARP/TGFβ抗体可作为基于GARP/TGFβ的信号途径的拮抗剂。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体可阻断或减少GARP与一种或多种TGFβ分子(例如TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3)之间的相互作用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体可将GARP与TGFβ分子之间的相互作用减少至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约99.9％。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体阻断GARP/TGFβ复合物的功能。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体阻断成熟TGFβ从GARP/TGFβ复合物的释放。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体抑制靶细胞中的TGFβ信号途径，例如抑制至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约99.9％。在某些实施例中，靶细胞是肿瘤细胞。在某些实施例中，靶细胞是免疫细胞，例如Treg细胞。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体降低由Treg细胞引起的免疫抑制作用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体增加免疫细胞(例如效应T细胞)中的抗肿瘤细胞因子分泌。在某些实施例中，与参考抗体(例如ABBV-151类似物)相比，抗GARP/TGFβ抗体表现出更优的增加免疫细胞(例如效应T细胞)中抗肿瘤细胞因子分泌的能力。
在某些实施例中，使用抗GARP/TGFβ抗体的治疗在受试者中表现出抗肿瘤功效，从而减少肿瘤生长和/或延长受试者的存活期。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体增加免疫细胞(例如效应T细胞和/或NK细胞)的免疫应答和/或抗肿瘤作用。在某些实施例中，与参考抗GARP/TGFβ抗体(例如ABBV-151类似物或DS-1055a类似物)相比，抗GARP/TGFβ抗体表现出更优的抗肿瘤功效。
在某些实施例中，抗体以约1x10-7M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-8M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约5x10-9M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-9M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-10M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-12M至约1x10-7M的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-11M至约1x10-8M的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-10M至约1x10-8M的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-10M至约5x10-8M的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约5x10-10M至约1x10-9M的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-9M至约5x10-8M的KD结合GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，抗体以约1x10-10M至约5x10-9M的KD结合GARP/TGFβ复合物。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：a)重链可变区，其包含：(1)重链可变区CDR-H1，其包含SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51、61和105中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)重链可变区CDR-H2，其包含SEQ ID NO：2、12、22、32、42、52、62和106中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；和(3)重链可变区CDR-H3，其包含SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、63和107中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；和b)轻链可变区，其包含：(1)轻链可变区CDR-L1，其包含SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54、64和108中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)轻链可变区CDR-L2，其包含SEQ ID NO：5、15、25、35、45、55、65和109中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；和(3)轻链可变区CDR-L3，其包含SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56、66和110中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体与参考抗GARP/TGFβ抗体交叉竞争，该参考抗GARP/TGFβ抗体包含：a)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ IDNO：3中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ IDNO：4中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的CDR-L3；b)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的CDR-L 1，(2)包含SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16中所示氨基酸序列的CDR-L3；c)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：26中所示氨基酸序列的CDR-L3；d)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQID NO：33中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQID NO：34中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36中所示氨基酸序列的CDR-L3；e)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：41中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：42中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：44中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的CDR-L3；f)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：51中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：54中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56中所示氨基酸序列的CDR-L3；g)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：61中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：64中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66中所示氨基酸序列的CDR-L3；或h)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：105中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：106中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：107中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：108中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：109中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域的重链可变区，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、85、89、93、97、101和111组成的组的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、83、84、86、90、94、98、102和112组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：83中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：47中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：48中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：47中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：84中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：57中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：58中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：67中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：68中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：111中所示的氨基酸序列，并且CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：112中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ IDNO：13中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ IDNO：14中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：26中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：34中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：41中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：42中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：44中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：51中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：54中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：61中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63中所示氨基酸序列的CDR-H3：和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：64中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66中所示氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：105中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：106中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：107中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：108中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：109中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、85、89、93、97、101和111组成的组的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，该轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、83、84、86、90、94、98、102和112组成的组的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、85、89、93、97、101和111组成的组的氨基酸序列，该轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、83、84、86、90、94、98、102和112组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQID NO：17中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：27中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：28中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：38中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：83中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：48中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：84中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：57中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：58中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：67中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：68中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：85中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：86中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：89中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：90中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：93中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：94中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：97中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：98中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：101中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQID NO：102中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：111中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：112中所示氨基酸序列。
在某些实施例中，重链可变区中包含的任何氨基酸序列可包含至多约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个氨基酸取代、缺失和/或添加。在某些实施例中，氨基酸取代是保守取代。
在某些实施例中，抗体包含人框架。在某些实施例中，抗体是人抗体。在某些实施例中，抗体分离自人衍生的噬菌体展示文库。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体不包含Fc区。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体还包含Fc区。在某些实施例中，Fc区包含人Fc区。在某些实施例中，Fc区包含选自下组的Fc区，该组由以下组成：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区。在某些实施例中，Fc区包含选自下组的Fc区，该组由以下组成：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区。在某些实施例中，Fc区包含IgG1 Fc区。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含一种或多种修饰抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含一种或多种降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含一种或多种增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中，Fc区包含IgG4 Fc区。在某些实施例中，IgG4 Fc区包含S228P的突变。在某些实施例中，Fc区包含C-末端赖氨酸。在某些实施例中，Fc区包含C-末端赖氨酸的缺失。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：71和72中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#7K)。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：73和74中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#7K(LC_FS/IT))。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：75和76中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#7(LC_FS/IT))。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：77和78中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#8K)。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：79和80中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#8K(LC_FS/IT))。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：81和82中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#8(LC_FS/IT))。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：87和88中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#8_14)。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：91和92中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#8_17)。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：95和96中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#8_18)。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：99和100中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#8_20)。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：103和104中所示的氨基酸序列的重链和轻链(GA1#8_21)。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含分别包含分别在SEQ ID NO：113和114中所示的氨基酸序列的重链和轻链(hGA17)。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体包含全长免疫球蛋白、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、VHH-Fv融合物、双抗体、三抗体、四抗体或其任何组合。
在某些实施例中，抗体包含在作为抗体衍生物的较大分子中。在某些实施例中，抗体衍生物是多特异性抗体，例如双特异性抗体，其中多特异性抗体包含特异性结合第二抗原的第二抗体部分。在某些实施例中，第二抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施例中，肿瘤相关抗原选自下组，该组由以下组成：Her-2，B7H3，EGFR，PD-L1，MSLN，c-Met，B细胞成熟抗原(BCMA)，碳酸酐酶IX(CA1X)，癌胚抗原(CEA)，CD5，CD7，CD10，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，CD38，CD41，CD44，CD47，CD49f，CD56，CD74，CD123，CD133，CD138，CD276(B7H3)，上皮糖蛋白(EGP2)，滋养层细胞表面抗原2(TROP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-a，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis A(CA 1.9.9)，Lewis Y(LeY)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，粘蛋白16(Muc-16)，粘蛋白1(Muc-1)，NG2D配体，肿瘤胚胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，密封蛋白18.2(CLDN18.2)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，肾母细胞瘤蛋白(WT-1)，1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)，PVR，PVRL2及其任何组合。在某些实施例中，第二抗原是免疫检查点调节剂。在某些实施例中，免疫检查点调节剂选自下组，该组由以下组成：TIGIT、PD1、CTLA4、LAG-3、2B4、BTLA及其任何组合。在某些实施例中，抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合抑制免疫检查点调节剂。在某些实施例中，第二抗原是免疫共刺激分子或T细胞受体/CD3复合物的亚基。在某些实施例中，免疫共刺激分子选自下组，该组由以下组成：CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40及其任何组合。在某些实施例中，抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合活化免疫共刺激分子。在某些实施例中，T细胞受体/CD3复合物的亚基选自下组，该组由以下组成：CD3γ、CD3δ、CD3ε及其任何组合。在某些实施例中，抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合活化T细胞受体/CD3复合物。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体经由接头与第二抗原结合部分连接。在某些实施例中，接头是肽接头。在某些实施例中，肽接头包含约4至约30个氨基酸。在某些实施例中，肽接头包含约4至约15个氨基酸。在某些实施例中，肽接头包含选自由SEQ ID NO：117-145组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体缀合至治疗剂或标记。在某些实施例中，标记选自下组，该组由以下组成：放射性同位素、荧光染料和酶。在某些实施例中，治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
2.2抗体亲和力
在某些实施例中，本文公开的抗体或抗体衍生物对其靶抗原具有高结合亲和力。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-7M或更小的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-8M或更小的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约5x10-9M或更小的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-9M或更小的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-10M或更小的KD结合靶标。
在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-12M至约1x10-7M的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-11M至约1x10-7M的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-10M至约5x10-8M的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-11M至约1x10-9M的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约2x10-10M至约5x10-9M的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-9M至约5x10-8M的KD结合靶标。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物以约1x10-10M至约1x10-9M的KD结合靶标。
抗体或抗体衍生物的KD可以通过本领域已知的方法确定。这类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、Octet--检验和肽扫描。
在某些实施例中，可以使用表面等离子体共振测定法测量KD。例如但不限于，在固定的抗原CMS芯片上以约10个响应单位(RU)在25℃下使用-2000或3000(Biacore公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(NJ))进行测定。在某些实施例中，根据供应商说明书，将羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CMS，Biacore公司)用N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化。将抗原用pH 4.8的10mM乙酸钠稀释至5μg/ml(大约0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注入，以实现偶联蛋白质的大约10个响应单位(RU)。在注入抗原之后，将1M乙醇胺注入以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃，将在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的Fab的双倍的连续稀释物(0.78nM至500nM)以大约25μl/min的流速注入。缔合速率(kon)和解离速率(koff)是使用简单的一对一朗缪尔结合模型(评估软件版本3.2)通过同时拟合缔合与解离传感图计算的。可以将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见例如，Chen et al.，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定法的缔合速率(on-rate)超过106M-1s-1，则缔合速率可以通过使用荧光淬灭技术来确定，该技术在增加的抗原浓度(如光谱仪例如截流配置的分光光度计(阿维夫仪器(Aviv Instruments))或具有搅拌吸收池的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic公司)测量的)的存在下，在25℃测量PBS(pH 7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
2.3抗体片段
在某些实施例中，本公开的抗体包含抗原结合片段或抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、VHH、Fv和scFv片段，以及文中描述的其他片段。有关某些抗体片段的综述，参见Hudson et al.Nat.Med.9：129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthtin，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，(Springer-Verlag，New York)，pp.269-315(1994)；还参见WO93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
在某些实施例中，本公开的抗体可以是双抗体。双抗体是具有两个可以是二价或双特异性的抗原结合位点的抗体片段。参见例如，EP 404，097；WO 1993/01 161；Hudson etal.，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还描述于Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
在某些实施例中，本公开的抗体可包含单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(马萨诸塞州沃尔瑟姆Domantis公司(Domantis，Inc.，Waltham，MA)；参见例如，美国专利号6,248,516 B1)。在某些实施例中，单结构域抗体是骆驼科动物单结构域抗体。在某些实施例中，单结构域抗体是VHH。在某些实施例中，单结构域抗体是嵌合抗体。在某些实施例中，单结构域抗体是人源化抗体。
抗体片段可以通过多种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生产，如本文所述。
2.4嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施例中，本公开的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于，例如，美国专利号4,816,567；和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。在某些实施例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠的可变区)和人恒定区。在某些实施例中，嵌合抗体是其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施例中，本公开的抗体可以是人源化抗体。通常，将非人抗体进行人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR，(或其部分)衍生自非人抗体，而一个或多个框架(FR)(或其任何部分)源自人抗体序列。人源化抗体还可以任选地包含人恒定区的至少一部分。在某些实施例中，人源化抗体中的某些FR残基被来自非人抗体(例如，源自HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法描述于例如Almagro and Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，并在例如以下中进一步描述：Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Queen et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri et al.，Methods 36：25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述“重修表面”)；Dall’Acqua et al.，Methods 36：43-60(2005)(描述了“FR改组”)；和Osbourn etal.，Methods 36：61-68(2005)和Klimka et al.，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述了FR改组的“指导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims et al.J.Immunol.151：2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta et al.J.Immunol.，151：2623(1993))；人类成熟的(体细胞突变的)构架区或人种系框架区(参见，例如Almagro and Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如，Baca et al.，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok et al.，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
2.5人抗体
在某些实施例中，本公开的抗体可以是人抗体(例如，人结构域抗体或人DAb)。人抗体可以使用本领域中已知的不同技术产生。人抗体一般在van Dijk and van deWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)，Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)和Chen，Mol.Immunol.47(4)：912-21(2010)中描述。能够产生完全人单结构域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如，US 20090307787 A1、美国专利号8,754,287、US 20150289489 A1、US 20100122358 A1和WO 2004049794。
可以通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体(例如人DAb)，该转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这样的动物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，它们取代了内源性免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。对于从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870，和描述技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。来自这类动物产生的完整抗体的人可变区可以(例如通过与不同的人恒定区结合)被进一步修饰。
人抗体(例如人DAb)也可以通过基于杂交瘤的方法来制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner et al.，J.Immunol.，147：86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers and Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)和Vollmers and Brandlein，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology，27(3)：185-91(2005)中。
人抗体(例如人DAb)也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
2.6文库衍生的抗体
可以通过在组合文库中筛选具有所需活性或多种活性的抗体来分离本公开的抗体。例如，本领域已知多种用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有所需结合特性的抗体的方法。这类方法在例如Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology178：1-37(O’Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2001)中描述，并且在以下文献中进一步描述：例如，McCafferty et al.，Nature 348：552-554；Clackson et al.，Nature352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks andBradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。已经描述了用于构建单结构域抗体文库的方法，例如，参见美国专利号7371849。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以按照Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中的描述筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常将抗体片段展示为scFv片段或Fab片段。来自免疫源的文库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。可替代地，可以如Griffiths et al.，EMBO J，12：725-734(1993)所述在无需任何免疫的情况下克隆天然文库(例如从人中获得)以提供针对广泛范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因片段，并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域并在体外完成重排，来合成天然文库，如Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
2.7抗体变体
本公开还提供了公开的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括但不限于抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的(即经过修饰的)抗体具有所需的特性(例如抗原结合)。
2.7.1取代、插入和缺失变体
在某些实施例中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目标位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代示于表2中“优选取代”标题之下。表2中在“示例性取代”的标题下提供了更实质的变化，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。氨基酸取代可以引入目的抗体中，并针对所希望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表2.氨基酸取代
氨基酸可以根据常见的侧链特性进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。在某些实施例中，非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
在某些实施例中，取代变体的一种类型涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，该抗体可以方便地生成，例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(例如本文公开的那些)。简而言之，对一个或多个HVR(或CDR)残基进行突变，并且将变体抗体在噬菌体上展示并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR(或CDR)中进行改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。这样的改变可以在HVR(或CDR)“热点”，即，由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)中进行，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库中重新选择而进行的亲和力成熟已经描述于例如，Hoogenboom et al.Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中。在亲和力成熟的某些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸定向诱变)中的任一种，将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后产生二级文库。然后筛选文库以鉴别具有所希望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR(或CDR)定向方法，其中使若干HVR(或CDR)残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化来特异性地鉴别抗原结合中涉及的HVR(或CDR)残基。特别是CDR-H3和CDR-L3经常成为靶标。
在某些实施例中，取代、插入或缺失可在一个或多个HVR(或CDR)内发生，只要这样的改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR(或CDR)中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可能在HVR(或CDR)“热点”或CDR之外。在以上提供的变体VHH序列的某些实施例中，每个HVR(或CDR)是未改变的，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham and Wells(1989)Science，244：1081-1085所述，用于鉴定可以靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在这种方法中，鉴定目标残基的残基或残基组(例如，带电荷的残基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入另外的取代，证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和邻近残基可以被靶向或消除作为取代候选。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的属性。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多残基的多肽的范围内，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括与抗体的N-或C-末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽融合。
2.7.2糖基化变体
在某些实施例中，改变抗体以增加或减少构建体糖基化的程度。向抗体中添加或缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区(例如，scFv-Fc)时，与其相连的碳水化合物可以发生改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过N-键连接至Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如，Wright et al.TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括多种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着于GlcNAc的岩藻糖。在某些实施例中，可以对抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在某些实施例中，抗体具有碳水化合物结构，该碳水化合物结构缺少(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖。例如，此类抗体中的岩藻糖含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量是通过计算Asn297糖链中岩藻糖的平均量来确定的，相对于通过MALDI-TOF质谱测量的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即在位置294和300之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd))。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004).能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化作用缺陷型的Lec13 CHO细胞(Ripkaet al.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams et al.)，以及敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8，敲除CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.et al.，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
在某些实施例中，抗体具有二等分的寡糖，例如其中附着于抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美国专利号6,602,684(Umana et al.)；和US 2005/0123546(Umana et al.)中。还提供了在寡糖上具有至少一个连接至Fc区的半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel et al.)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO 1999/22764(Raju，S.)中。
2.7.3Fc区变体
在某些实施例中，本公开的抗体或抗体衍生物的Fc区可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，该序列包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如，取代)。在某些实施例中，可将一个或多个氨基酸修饰引入抗体部分的Fc区(例如scFv-Fc或VHH-Fc)内，从而生成Fc区变体。
在某些实施例中，具有一些(但非全部)效应子功能的Fc区，此类功能使该区域成为适合应用的理想候选物，在这些应用中，抗体在体内的半衰期很重要，但某些效应子功能(例如，补体和ADCC)是非必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定确保抗体没有FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但可以保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464页的表2中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom，I.et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I etal.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5，821，337(参见Bruggemann，M.etal.，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。可替代地，可以采用非放射性测定方法(例如，参见用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(细胞技术公司(CellTechnology，Inc.)山景城(Mountain View)，加利福尼亚州；以及非放射性细胞毒性测定(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中公开的。还可以进行C1q结合测定确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。例如，参见在WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg，M.S.et al.，Blood 101：1045-1052(2003)；以及Cragg，M.S.and M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(例如，参见：Petkova，S.B.et al.，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括(美国专利号6,737,056)，具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的抗体。此类Fc突变体包括具有氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个的取代的Fc突变体，包括具有残基265和297被丙氨酸取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR结合提高或降低的某些抗体变体。(参见例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001).)
在某些实施例中，Fc区包含根据残基的EU编号的一个或多个突变。在某些实施例中，Fc区是IgG1 Fc区。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含L234A突变和/或L235A突变。在某些实施例中，Fc区是IgG2或IgG4 Fc区。在某些实施例中，Fc区是包含F234A和/或L235A突变的IgG4 Fc区。
在某些实施例中，Fc区是IgG1 Fc区。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含一种或多种修饰抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中，IgG1Fc区包含一种或多种降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含一种或多种增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施例中，IgG1Fc区包含L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L的突变。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含S239D、A330L和I332E的突变。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含L235V、F243L、R292P和Y300L的突变。在某些实施例中，IgG1 Fc区包含在Fc区的位置298、333和/或334处的取代。
在某些实施例中，Fc区包含IgG4 Fc区。在某些实施例中，IgG4 Fc区包含S228P突变。
在某些实施例中，Fc区包含C-末端赖氨酸。在某些实施例中，Fc区包含C-末端赖氨酸的缺失。
在某些实施例中，Fc区内发生改变，导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生改变(即，提高或降低)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie etal.J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
在某些实施例中，抗体(例如，scFv-Fc或VHH-Fc)变体包含变体Fc区，该区域包含一个或多个改变半衰期和/或改变与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的氨基酸取代。具有延长的半衰期和与新生儿Fc受体(FcRn)的改善的结合的抗体，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))，描述于US 2005/0014934A1(Hinton et al.)中。那些抗体包含具有一个或多个取代的Fc区，其中这些取代改变了Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基上具有取代(例如Fc区残基434的取代)的那些变体(美国专利号7,371，826)。
还参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及关于Fc区变体的其他实例的WO 94/29351。
2.7.4半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施例中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体部分，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在某些实施例中，取代的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点，并可用于将抗体与其他部分，例如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施例中，以下任何一个或多个残基可以被半胱氨酸取代；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体部分可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
2.8抗体衍生物
在某些实施例中，本文所述的抗体可以被进一步修饰为包含本领域已知且容易获得的其他蛋白质或非蛋白质部分的抗体衍生物。适用于抗体衍生的非蛋白质部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三氧杂环己烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。该聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。连接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接的聚合物多于一种，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑因素来确定，这些因素包括但不限于待改善抗体的特定性质或功能，是否将抗体衍生物用于确定的诊断条件等。
在某些实施例中，抗体可以被进一步修饰为包含一种或多种生物活性蛋白、多肽或其片段的抗体衍生物。如本文可互换使用的，“生物活性的”或“具有生物学活性的”是指在体内显示出执行特定功能的生物学活性。例如，它可能意味着与特定生物分子(例如蛋白质、DNA等)结合，然后促进或抑制这种生物分子的活性。在某些实施例中，生物活性蛋白或其片段包括：作为活性药物物质施用给患者的蛋白和多肽；用于预防或治疗疾病或病症、以及用于诊断目的的蛋白和多肽(例如诊断测试或体外测定中使用的酶)；以及为预防疾病而施用给患者的蛋白质和多肽(例如疫苗)。
2.9生产方法
可以使用本领域中任何可用的或已知的技术来产生本文公开的抗体和抗体衍生物。例如但不限于，可以使用重组方法和组合物产生抗体和抗体衍生物，例如，如美国专利号4,816,567中所述。产生抗体和抗体衍生物的详细程序在以下实例中描述。
本公开的主题还提供了编码本文公开的抗体或抗体衍生物的分离的核酸。例如，分离的核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列，例如抗体的轻链和/或重链。
在某些实施例中，核酸可以存在于一种或多种载体(例如表达载体)中。如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体表达载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体常常为质粒(载体)形式。但是，所公开的主题旨在包括具有等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中构建本文公开的抗体或抗体衍生物的不同部分。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于多种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES，例如，FGF-1IRES，FGF-2IRES，VEGF IRES，IGF-IIIRES，NF-kB IRES，RUNX1IRES，p53IRES，甲型肝炎IRES，丙型肝炎IRES，瘟病毒IRES，口蹄疫病毒IRES，小核糖核酸病毒IRES，脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可裂解的接头(例如2A肽，例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。逆转录病毒载体和合适的包装线的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知多种产生两亲性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller，et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5：431-437)；PA317(Miller，et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6：2895-2902)；和CRIP(Danos，et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464)。非两亲性颗粒也是合适的，例如用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域中任何其他已知的假型颗粒。
在某些实施例中，可以将编码本公开的抗体或抗体衍生物的核酸和/或包含核酸的一种或多种载体引入宿主细胞中。在某些实施例中，可以通过本领域已知的任何方法将核酸引入细胞中，这些方法包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。在某些实施例中，宿主细胞可以包括，例如，已经用以下载体转化的宿主细胞：该载体包含编码包含单结构域抗体和/或单结构域抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在某些实施例中，宿主细胞可以包括例如已经用以下转化的宿主细胞：(1)载体，其包含编码包含该抗体的VL的氨基酸序列和包含该抗体的VH的氨基酸序列的核酸，或(2)第一载体，其包含编码该抗体的VL的氨基酸序列的核酸，和第二载体，其包含编码包含该抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在某些实施例中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，YO、NSO、Sp20细胞)。
在某些实施例中，制备本文公开的抗体或抗体衍生物的方法可以包括在适合于抗体或抗体衍生物表达的条件下培养其中已经引入了编码抗体或抗体衍生物的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中回收抗体或抗体衍生物。在某些实施例中，通过色谱技术从宿主细胞回收抗体或抗体衍生物。
为了重组产生本公开的抗体或抗体衍生物，可以分离编码例如如上所述的抗体或抗体衍生物的核酸，并将其插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体或抗体衍生物的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这些核酸。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体或抗体衍生物，特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton，Methods inMolecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)在表达后，抗体或抗体衍生物可以以可溶性级分从细菌细胞糊中分离并可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母菌)也是适合抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体或抗体衍生物。参见Gemgross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)和Li et al.，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。在某些实施例中，植物细胞培养物可以用作宿主细胞。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
在某些实施例中，脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如但不限于，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的非限制性实例是由SY40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293或293细胞，如例如在Graham et al.，J GenViral.36：59(1977)中描述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中描述)；猴肾细胞(CV 1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep 02)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如在Matheret al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中描述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFK CHO细胞(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：42I6(1980))；和骨髓瘤细胞系(例如YO、NSO和Sp2/0)。对于某些适合抗体或抗体衍生物产生的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki andWu，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，pp.255-268(2003)。
在某些实施例中，用于制备双特异性和/或多特异性抗体的技术包括但不限于重组表达具有相同特异性的两个免疫球蛋白重链轻链对，其中一个或两个重链或轻链融合至具有不同特异性的抗原结合部分(例如，VHH或scFv)，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链轻链对的重组共表达(参见Milstei n and Cuello，Nature 305：537(1983))，PCT专利申请号WO 93/08829和Traunecker et al.，EMBO J 10：3655(1991))和“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利号5,731,168)。双特异性抗体也可以通过工程化静电转向效应来制备，以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如，美国专利号4,676,980和Brennan et al.，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny et al.，JImmunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如，Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994))；以及制备三特异性抗体，例如Tutt etal.J Immunol.147：60(1991)中所述。
本公开的双特异性和多特异性分子也可以使用化学技术(参见例如，Kranz(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807)、“polydoma”技术(参见例如美国专利4,474,893)或重组DNA技术制备。还可以使用本领域已知的和本文所述的方法，通过缀合组成型结合特异性，例如第一表位和第二表位结合特异性，来制备当前公开的主题的双特异性和多特异性分子。例如，但不限于，双特异性和多特异性分子的每种结合特异性可以通过重组融合蛋白技术一起产生，或者可以分开产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的非限制性实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括由Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，1 18-132；Brennan(1985)Science 229：81-83)，Glennie(1987)J Immunol.139：2367-2375)所述的那些。当结合特异性是抗体(例如，两种人源化抗体)时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键合来缀合。在某些实施例中，在缀合之前，铰链区可以被修饰为包含奇数个(例如一个)巯基残基。
在某些实施例中，双特异性抗体的两种结合特异性可在同一载体中编码并在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性和多特异性分子是MAb x Mab、MAb x Fab、Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白时，该方法特别有用。在某些实施例中，本公开的双特异性抗体可以是单链分子，例如单链双特异性抗体，包含一个单链抗体和结合决定簇的单链双特异性分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可以是单链分子或可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子和多特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；以及美国专利号5,482,858中。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点(例如，表位结合位点)的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
在某些实施例中，动物系统可以用于产生本公开的抗体或抗体衍生物。用于制备杂交瘤的一种动物系统是鼠系统。
在小鼠中杂交瘤的产生是非常完善建立的程序。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的(参见例如Harlow and Lane(1988)，Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor New York)。
2.10测定
本文提供的本公开的抗体和抗体衍生物可以通过本领域已知的和本文提供的多种测定法对其物理/化学性质和/或生物学活性进行鉴定、筛选或表征。
在某些实施例中，可以通过已知方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或蛋白质印迹测定)来测试本公开的抗体或抗体衍生物的抗原结合活性。这些测定中的每一种通常通过采用特异性针对感兴趣的复合物的经标记的试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并特异性结合抗体或抗体衍生物的酶联抗体或抗体片段来检测抗体或抗体衍生物。可替代地，可以使用多种其他免疫测定中的任何一种来检测抗体或抗体衍生物。例如，可以将该抗体或抗体衍生物进行放射性标记并且在放射免疫测定(RIA)中使用(参见例如，Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，1986年3月，其通过引用并入本文)。可以通过这样的手段，如使用盖革(Geiger)计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来对放射性同位素进行检测。
在某些实施例中，竞争测定法可用于鉴定与本公开的抗体竞争结合GARP/TGFβ复合物的抗体或抗体衍生物。在某些实施例中，这样的竞争性抗体结合与本文公开的抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols，”Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press，Totowa，NJ)中提供了定位抗体所结合的表位的详细示例性方法。
在竞争测定的非限制性实例中，可以在包含与GARP/TGFβ复合物结合的第一标记抗体或抗体衍生物和第二未标记抗体的溶液中孵育固定的GARP/TGFβ复合物，测试第二未标记抗体与第一抗体竞争结合GARP/TGFβ复合物的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的GARP/TGFβ复合物在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与GARP/TGFβ复合物结合的条件下孵育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定的GARP/TGFβ复合物相关的标记物的量。如果在测试样品中相比于对照样品的与固定的GARP/TGFβ复合物相关的标记的量大大减少，则表明第二抗体正在与第一抗体竞争结合GARP/TGFβ复合物。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies：ALaboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
本公开提供了用于鉴定具有生物学活性的抗GARP/TGFβ抗体或其抗体衍生物的测定法。生物学活性可以包括例如活化免疫细胞或免疫活化报告基因(例如NFAT报告基因或NF-κB报告基因)。还提供了在体内和/或体外具有这种生物学活性的抗体。
2.11免疫缀合物
本公开的主题还提供了免疫缀合物，其包含与一种或多种检测探针和/或细胞毒性剂(例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素、或其片段))或放射性同位素缀合的本文公开的抗体或抗体衍生物。例如，所公开的主题的抗体或抗原结合部分可以功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。
在某些实施例中，免疫缀合物是抗体药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登木素生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235)；奥瑞他汀(auristatin)，例如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588，以及7,498,298)；尾海兔素(dolastatin)；卡里奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman et al.，CancerRes.53：3336-3342(1993)；和Lode et al.，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽环霉素，如道诺霉素(daunomycin)或阿霉素(doxorubicin)(参见Kratz et al.，Current MedChem.13：477-523(2006)；Jeffrey et al.，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov et al.，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik et al.，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King et al.，J Med.Chem.45：4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，例如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替塞他赛和奥他赛；单端孢霉烯(trichothecenes)；和CC1065。
在某些实施例中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酿霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端抱菌素(tricothecenes)。
在某些实施例中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。非限制性实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当将放射性缀合物用于检测时，它可以包括用于闪烁显像研究的放射性原子，例如tc99m或1123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如碘123、碘131、铟11、氟19、碳13、氮15、氧17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂(例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二亚氨酸酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲代亚苯基2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯))制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)描述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳4-标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺-五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari et al.，Cancer Res.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(例如，来自美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A))。
2.12抗原识别受体
本公开的主题还提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的抗原识别受体。抗原识别受体是能够响应于其与抗原的结合而活化、刺激或抑制免疫应答细胞(例如T细胞)的受体。抗原识别受体的非限制性实例包括天然和重组T细胞受体(TCR)、嵌合共刺激受体(CCR)、嵌合抗原受体(CAR)和抑制性CAR(iCAR)。抗原识别受体设计和使用方法是本领域熟知的，并且描述于文献中，例如国际公开WO 2018/027155、WO 2019/099483、WO 2019/157454、WO 2019/133969、WO 2019/099993、WO 2015/142314、WO 2018/027197和WO2014055668。
在某些实施例中，本公开的主题提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的嵌合抗原受体(CAR)。CAR是工程化受体，其可以将感兴趣的特异性移植或赋予给免疫效应细胞。在某些实施例中，CAR可用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上；通过载体促进其编码序列的转移。在某些实施例中，CAR是“第一代”CAR，其通常由与跨膜结构域融合的胞外抗原结合结构域(例如scFv或VHH)组成，该跨膜结构域与胞质/胞内信号传导结构域融合。“第一代”CAR可以提供从头抗原识别并通过它们在单个融合分子中的CD3z链信号传导结构域引起免疫应答细胞(例如CD4+和CD8+T细胞)的活化，而与HLA介导的抗原呈递无关。在某些实施例中，CAR是“第二代”CAR，其进一步包含从各种共刺激分子(例如，CD28、4-1BB、ICOS、0X40、CD27、CD40/Mv88和NKGD2)到CAR的胞质尾区的胞内信号传导结构域以向免疫应答细胞提供额外信号，由此“第二代”CAR包含同时提供共刺激(例如，CD28或4-1BB)和活化(CD3z)的那些。在某些实施例中，CAR是“第三代”CAR，其包含多个共刺激结构域(例如，CD28和4-1BB)和活化(CD3z)。在某些实施例中，CAR是第二代CAR。在某些实施例中，CAR包含与抗原结合的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中该胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在某些实施例中，CAR还包含在胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链/间隔区。在某些实施例中，胞外抗原结合结构域包含本文公开的抗体或抗体片段。在某些实施例中，抗体或抗体片段包含VHH、Fab或scFv。
在某些实施例中，本公开的主题提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的重组TCR。天然TCR是包含二硫键连接的异二聚体蛋白的蛋白复合物，该异二聚体蛋白由表达为与CD3链分子的复合物的一部分的两条可变链组成。天然TCR存在于T细胞表面，并负责将抗原识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。在某些实施例中，天然TCR包含α链和β链(分别由TRA和TRB基因编码)。在某些实施例中，TCR包含γ链和δ链(分别由TRG和TRD基因编码)。α链、β链、γ链和δ链各自包含两个胞外结构域：可变(V)区和恒定(C)区。恒定区靠近细胞膜，随后是跨膜区和短的胞质尾区。可变区与肽/MHC复合物结合。每个可变区具有三个互补决定区(CDR)。在某些实施例中，TCR包含与CD3δ、CD3γ、CD3ε和CD3ζ的受体复合物。当TCR复合物与其抗原和MHC(肽/MHC)结合时，表达TCR复合物的T细胞被活化。
在某些实施例中，重组TCR是非天然存在的TCR。在某些实施例中，重组TCR包含重组α链和/或重组b链，其中重组α链和/或重组b链的部分或整个可变区被本文公开的抗体或抗体片段替代。在某些实施例中，抗体或抗体片段包含VHH、VH、VL或scFv。在某些实施例中，抗体或抗体片段包含VHH。在某些实施例中，重组TCR以MHC/HLA非依赖性方式结合感兴趣的抗原。在某些非限制性实施例中，抗原的结合能够活化包含重组TCR的免疫应答细胞。
本公开的主题提供了免疫应答细胞，其包含(a)本文公开的抗原识别受体(例如，CAR或TCR)。在某些实施例中，抗原识别受体能够活化免疫应答细胞。本公开主题的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。包含B、T和自然杀伤(NK)细胞的淋巴谱系提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来试剂的检测、宿主外来细胞的检测等。淋巴谱系的免疫应答细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可从中分化淋巴细胞的那些)。T细胞可以是在胸腺中成熟并主要负责细胞介导的免疫的淋巴细胞。T细胞参与适应性免疫系统。本公开主题的T细胞可以是任何类型的T细胞，包括但不限于辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(stem-cell-like memory T cell/stem-like memory T cell))和两种类型的效应记忆T细胞：例如，TEM细胞和TEMRA细胞、调节性T细胞(也称为抑制T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞和gd T细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞子集。患者自身的T细胞可通过引入抗原识别受体(例如CAR或TCR)进行遗传修饰以靶向特定抗原。在某些实施例中，免疫应答细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在某些实施例中，T细胞是CD4+T细胞。在某些实施例中，T细胞是CD8+T细胞。自然杀伤(NK)细胞可以是作为细胞介导的免疫的一部分并在先天免疫应答期间起作用的淋巴细胞。NK细胞不需要预先活化以对靶细胞进行细胞毒性作用。本公开主题的人淋巴细胞的类型包括但不限于外周供体淋巴细胞，例如以下公开的那些：Sadelain，M.，et al.2003 Nat Rev Cancer 3：35-45(公开了经遗传修饰以表达CAR的外周供体淋巴细胞)、Morgan，R.A.，et al.2006 Science 314：126-129(公开了经遗传修饰以表达包含a和b异二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞)、Panelli，M.C.，et al.2000 J Immunol 164：495-504；Panelli，M.C.，et al.2000 J Immunol164：4382-4392(公开了源自肿瘤活检中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物)、和Dupont，J.，et al.2005 Cancer Res 65：5417-5427；Papanicolaou，G.A.，et al.2003Blood 102：2498-2505(公开了使用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突状细胞选择性体外扩增抗原特异性外周血白细胞)。在某些实施例中，免疫应答细胞(例如，T细胞)可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)、或体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。
3.使用方法
本公开的主题进一步提供了使用公开的抗体和抗体衍生物的方法。在某些实施例中，这些方法涉及本公开的抗体或抗体衍生物的治疗用途。在某些实施例中，这些方法涉及本公开的抗体或抗体衍生物的诊断用途。
3.1治疗方法
本公开提供了本文公开的抗体或抗体衍生物用于治疗疾病和障碍或用于增强免疫应答的方法和用途。在某些实施例中，可以将本文公开的抗体，抗体衍生物或包含该抗体、抗体衍生物的药物组合物施用于受试者(例如哺乳动物(例如人))以治疗疾病和障碍或增强免疫应答。在某些实施例中，这些疾病和障碍涉及Treg介导的免疫抑制和/或异常的GARP/TGFβ活性。在某些实施例中，可以通过本文公开的抗体或抗体衍生物治疗的疾病和障碍包括但不限于瘤形成(例如癌症)。
在某些实施例中，本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段)，用于制造药物。在某些实施例中，本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段)，用于制造用于治疗癌症的药物。在某些实施例中，本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段)，用于治疗受试者的癌症。在某些实施例中，本公开提供了包含本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)的药物组合物，用于治疗受试者的癌症。在某些实施例中，癌症可以是血液癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃肿瘤、成胶质细胞瘤、喉癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和多种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌还包括肿瘤学领域中的任何已知癌，包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌、和其肝转移瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺瘤、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、睾丸瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、乳腺肿瘤(如导管腺癌和小叶腺癌)、子宫颈鳞状上皮和腺癌、子宫上皮癌和卵巢上皮性癌、前列腺腺癌、膀胱移行性鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴瘤(结节性和弥散性)、浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。
在某些实施例中，癌症可以是黑素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌、TNBC)、胃癌、胆管癌、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、非霍奇金淋巴瘤原发性纵隔B-细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食管癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、宫颈癌或甲状腺癌。在某些实施例中，癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI-高)。在某些实施例中，癌症表现出低微卫星不稳定性(MSI-低)。
在某些实施例中，待治疗的受试者是哺乳动物(例如，人，非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施例中，受试者是人。在某些实施例中，受试者疑似患有癌症或有患癌症的风险、或被诊断患有具有异常GARP/TGFβ复合物表达或活性的癌症或任何其他疾病。
表现出异常的GARP/TGFβ活性的许多癌症或任何其他疾病的诊断方法以及这些疾病的临床描述是本领域已知的。此类方法包括但不限于例如免疫组织化学、PCR、荧光原位杂交(FISH)。关于异常GARP/TGFβ活性或表达的诊断方法的其他细节描述于例如Gupta etal.(2009)Mod Pathol.22(1)：128-133；Lopez-Rios et al.(2013)J Clin Pathol.66(5)：381-385；Ellison et al.(2013)J Clin Pathol 66(2)：79-89；以及Guha et al.(2013)PLoS ONE 8(6)：e67782中。
可以通过任何合适的途径施用，包括例如静脉内、肌内或皮下。在一些实施例中，本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与第二、第三或第四药剂(包括例如抗肿瘤药、生长抑制剂，细胞毒性剂或化学治疗剂)组合施用，以治疗涉及异常GARP/TGFβ活性的疾病或障碍。这类药剂包括例如抗PD1抗体(例如，派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、斯鲁利单抗(serplulimab))、多西他赛、吉非替尼、FOLFIRI(伊立替康、5-氟尿嘧啶和亚叶酸)、伊立替康、顺铂、卡铂、紫杉醇、贝伐单抗(抗VEGF抗体)、FOLFOX-4、输注氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、阿法替尼、吉西他滨、卡培他滨、培美曲塞、替万替尼、依维莫司、CpG-ODN、雷帕霉素、来那度胺、维罗非尼、内皮抑素、拉帕替尼、PX-866、Imprime PGG和伊洛替尼。在一些实施例中，将抗体或抗体衍生物(或其片段)缀合至另外的药剂。
在某些实施例中，本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与一种或多种其他疗法(例如放射疗法、手术、化学疗法、和/或靶向疗法)组合施用。在某些实施例中，本文提供的抗体、抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与放射疗法组合施用。在某些实施例中，本文提供的抗体、抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与放射疗法的组合用于治疗本文公开的赘生物或癌症。
在某些实施例中，本文提供的抗GARP/TGFβ抗体、抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与抗PD1抗体(例如斯鲁利单抗)组合施用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体和抗PD1抗体同时或顺序施用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体和抗PD1抗体同时施用。在某些实施例中，在施用抗GARP/TGFβ抗体之前施用一剂或多剂的抗PD1抗体。在某些实施例中，受试者在施用抗GARP/TGFβ抗体之前接受完整疗程的抗PD1抗体疗法。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体在抗PD1抗体疗法的第二疗程期间施用。在某些实施例中，受试者在施用抗GARP/TGFβ抗体之前接受至少一剂、至少两剂、至少三剂或至少四剂的抗PD1抗体。在某些实施例中，至少一剂抗PD1抗体与抗GARP抑制剂同时施用。在某些实施例中，在施用抗PD1抗体之前施用一剂或多剂抗GARP/TGFβ抗体。在某些实施例中，受试者在施用抗PD1抗体之前接受至少两剂、至少三剂、至少三剂或至少四剂的抗GARP/TGFβ抗体。在某些实施例中，至少一剂抗GARP/TGFβ抗体与抗PD1抗体同时施用。在某些实施例中，抗GARP/TGFβ抗体和抗PD1抗体每1、2、3、4或5周施用一次。在某些实施例中，癌症在选自由手术、化疗、放射疗法和其任何组合组成的组的疗法之后是复发性或进展性的。
取决于待治疗的适应症和本领域技术人员熟悉的与给药相关的因素，本文提供的抗体或抗体衍生物将以在最小化毒性和副作用的同时有效治疗该适应症的剂量施用。对于癌症的治疗，典型的剂量可以是例如在0.001至1000μg的范围内；然而，低于或高于该示例性范围的剂量在本发明的范围内。日剂量可以是总体重的约0.1μg/kg至约100mg/kg，总体重的约0.1μg/kg至约100μg/kg或总体重的约1μg/kg至约100μg/kg。如上提到的，可以通过定期评估治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于经若干天或更长时间的重复施用，取决于病症，重复进行治疗直至发生所希望的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且在本发明的范围内。所希望的剂量可通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物、或通过连续输注施用组合物来递送。
包含本文公开的抗体或抗体衍生物的药物组合物可以每天一次、两次、三次或四次施用。组合物也可以以低于每日施用的频率进行施用，例如，每周六次、每周五次、每周四次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。组合物也可以例如在植入物中以缓释配制品施用，该植入物逐渐释放该组合物以在一段时间内使用，并且允许该组合物以较低频率施用，例如每月一次、每2-6个月一次、每年一次、或甚至单次施用。缓释装置(例如圆粒剂型(pellet)、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球等)可以通过注射或手术植入各种位置进行施用。
可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、进展时间、存活持续时间、无进展存活、总体反应率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估癌症治疗。可以采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射成像测量反应。
在某些实施例中，将治疗功效测量为肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，使用等式100-(T/C x 100)进行计算，其中T是治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积，并且C是未治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积。在某些实施例中，％TGI是约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％)、约94％)、约95％、或多于95％。
3.2诊断和成像方法
经标记的抗体或抗体衍生物可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与GARP/TGFβ复合物的表达、异常表达和/或活性相关的疾病和/或障碍。例如，本文提供的抗体和抗体衍生物可以用于原位、体内、离体和体外诊断测定或成像测定。用于检测GARP/TGFβ复合物表达的方法，包括(a)使用一种或多种抗体或抗体衍生物测定多肽在个体的细胞(例如组织)或体液中的表达，和(b)比较该基因表达水平和标准基因表达水平，其中与标准表达水平相比，测定的基因表达水平的增加或减少指示异常表达。
本文提供的另外的实施例包括在动物(例如哺乳动物，如人)中诊断与GARP/TGFβ复合物的表达或异常表达相关的疾病或障碍的方法。这些方法包含在哺乳动物中检测GARP/TGFβ复合物。在某些实施例中，诊断包括：(a)向哺乳动物施用有效量的经标记的抗体或抗体衍生物；(b)在施用后等待一段时间间隔，以允许经标记的抗体或抗体衍生物优先浓缩在受试者的表达GARP/TGFβ复合物的部位(并且将未结合的经标记的分子清除至背景水平)；(c)确定背景水平；和(d)检测受试者中经标记的分子，使得检测到高于背景水平的经标记的分子指示受试者患有与GARP/TGFβ复合物表达或异常表达相关的特定疾病或障碍。背景水平可以通过不同方法确定，这些方法包括将所检测到的标记的分子的量与先前针对一个具体系统确定的标准值进行对比。
本文提供的抗体和抗体衍生物可以用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法来测定生物样品中蛋白质水平(例如，参见Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。有用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域中已知的并且包括酶标记(例如葡萄糖氧化酶)；放射性同位素，例如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、和锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru；鲁米诺；以及荧光标记(例如荧光素及罗丹明及生物素)。
本领域已知的技术可以应用于本文提供的经标记的抗体(或其片段)。此类技术包括但不限于使用双功能缀合剂(参见例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003)。
可替代地，或另外地，可以测量细胞中编码GARP多肽的核酸或mRNA的水平，例如经由使用对应于编码GARP的核酸或其互补序列的基于核酸的探针的荧光原位杂交；(FISH；参见1998年10月公布的WO 98/45479)，DNA印迹法、RNA印迹法或聚合酶链反应(PCR)技术，例如实时定量PCR(RT-PCR)。还可以通过测量生物流体(例如血清)中的脱落抗原来研究GARP/TGFβ复合物过表达，例如使用基于抗体的测定(还参见，例如，1990年6月12日发布的美国专利号4,933,294；1991年4月18日发布的WO 91/05264；1995年3月28日发布的美国专利号5,401,638；和Sias et al.，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。除了上述测定之外，本领域技术人员可获得各种体内和离体测定。例如，可以将哺乳动物体内的细胞暴露于抗体，该抗体任选地用可检测标记(例如放射性同位素)进行标记，并且可以例如通过外部扫描放射性或者通过分析取自先前暴露于该抗体的哺乳动物的样品(例如，活体标本检查或其他生物样品)来评估抗体与细胞的结合。
4.药物配制品
本公开的主题还提供了包含本文公开的抗体或抗体衍生物以及药学上可接受的载剂的药物配制品。在某些实施例中，药物组合物可以包含本公开的主题的多种(例如，两种或更多种)抗体和/或抗体衍生物的组合。
在某些实施例中，所公开的药物配制品可以通过将具有所需纯度的抗体或抗体衍生物与一种或多种任选的药学上可接受的载剂组合来制备(Remington′s PharmaceuticalSciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))，呈冻干配制品或水溶液形式。例如但不限于，冻干抗体配制品在美国专利号6,267,958中描述。在某些实施例中，水性抗体配制品可以包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者的配制品包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。在某些实施例中，抗体或抗体衍生物可以具有大于约80％，大于约90％，大于约91％，大于约92％，大于约93％，大于约94％，大于95％，大于约96％，大于约97％，大于约98％，大于约99％，大于约99.1％，大于约99.2％，大于约99.3％，大于约99.4％，大于约99.5％，大于约99.6％，大于约99.7％，大于约99.8％或大于约99.9％的纯度。
药学上可接受的载剂通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液(例如磷酸盐、柠檬酸盐、以及其他有机酸)；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；氯化苄烷铵、氯化苯乙铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯(例如甲基或丙基对羟苯甲酸酯)；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螫合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的计数离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载剂还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International公司)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在某些实施例中，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(例如软骨素酶)组合。
载剂可以适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物(例如，抗GARP/TGFβ抗体)包被在一种材料中，以保护该化合物免受酸和其他可使化合物失活的自然条件的影响。
本公开的药物组合物也可以组合治疗，即与其他药剂组合施用。在某些实施例中，本文所公开的药物组合物还可以包含多于一种活性成分，这对于所治疗的特定适应症是必需的，例如，具有互补活性且不会产生互相不利影响的那些。在某些实施例中，药物配制品可包含用于治疗由第一治疗剂治疗的相同疾病的第二活性成分。此类活性成分合适地以对于预期目的有效的量组合存在。例如但不限于，本公开的配制品还可以包含多于一种活性成分，这对于所治疗的特定适应症是必要的，优选地是具有互补活性且不会产生互相不利影响的那些。例如，可能期望进一步提供可用于治疗相同疾病的第二治疗剂。此类活性成分合适地以对于预期目的有效的量组合存在。
本公开的组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。施用途径和/或方式取决于所需结果。这些活性化合物可以用保护该化合物以便避免快速释放的载剂来制备，例如受控释放配制品，包括植入物、经皮贴片以及微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。制备这类配制品的许多方法由例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker,Inc.，New York，1978描述。在某些实施例中，药物组合物是在美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)的优质生产规范(Good Manufacturing Practice(GMP))条件下生产的。
也可以制备含有本文公开的抗体或抗体衍生物的缓释制剂。缓释制剂的适合的实例包括含有抗体或抗体衍生物的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质处于成型制品的形式(例如薄膜或微胶囊)。在某些实施例中，可以将活性成分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980)。
为了通过某些施用途径施用本公开的抗体或抗体衍生物，可能有必要用防止其失活的材料包被该化合物或与该化合物共同施用。例如，可以在合适的载剂(例如脂质体)或稀释剂中将化合物施用给受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水型CGF乳液以及常规脂质体(Strejan et al.(1984)J Neuroimmunol.7：27)。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。使用此类介质和试剂用于药物活性的物质是本领域中已知的。
除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本公开的药物组合物中。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
治疗组合物通常必须是无菌的、基本等渗的，并且在生产和储存条件下是稳定的。该组合物可以配制为一种溶液、微乳液、脂质体，或适合于高药物浓度的其他有序结构。该载剂可以是含有以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)，以及其适合的混合物。恰当的流动性可以(例如)通过使用包衣(如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠将为优选的。可以通过在该组合物中包括例如单硬脂酸盐以及明胶的一种延迟吸收的药剂来实现这些可注射组合物的延长的吸收。
无菌注射溶液可通过将所需量的一种或多种本文公开的抗体或抗体衍生物根据需要与合适的溶剂与上面列举的一种或多种成分的组合掺入，然后进行灭菌微滤(例如通过无菌滤膜过滤)来制备。通常，分散液通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所希望的成分的粉末。
还可以用本领域已知的医学装置来施用治疗性组合物。例如，本发明的治疗组合物可以与无针皮下注射装置一起施用，例如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置。可用于本公开的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控的速率分配药物的植入式微输液泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率输送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物输送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开了一种渗透药物输送系统。已知许多其他此类植入物、递送系统和模块。
对于治疗组合物，本公开的配制品包括适于口服、经鼻、局部(包括经颊和经舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些配制品。这些配制品可以方便地以单位剂量形式存在并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的抗体或抗体衍生物的量根据所治疗的受试者和特定的施用方式而变化。可以与载剂材料结合以产生单一剂型的抗体或抗体衍生物的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以百分数计，这个量的范围是从约0.01％至约99％的活性成分，从约0.1％至约70％，或从约1％至约30％。
用于局部或经皮施用本公开的组合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。可以将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载剂和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”是指除了肠施用和局部施用之外的、通常通过注射的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。
这些药物组合物还可以含有辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、和分散剂。预防存在微生物可以通过上述灭菌程序，以及通过包含不同抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸等来确保。可能还希望将等渗剂，例如糖、氯化钠等包括于这些组合物中。此外，通过包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶可以引起可注射药物形式的延长吸收。
在某些实施例中，当将本公开的抗体或抗体衍生物作为药物施用给人和动物时，它们可以单独或与药学上可接受的载剂组合的作为药物组合物给予，该药物组合物包含例如约0.01％至约99.5％(或约0.1％至约90％)的抗体或抗体衍生物。
5.制品
本公开的主题还提供一种制品(例如试剂盒)，该制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述障碍的材料。
在某些实施例中，制品/试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插入物。合适的容器的非限制性实例包括瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。容器可以容纳(本身或与另一种组合物组合)有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。
在某些实施例中，组合物中的至少一种活性剂是本公开的抗体或抗体衍生物。标签或包装插入物可指示该组合物用于治疗所选病症。
在某些实施例中，该制品/试剂盒可以包括(a)第一容器，该第一容器中装有组合物，其中该组合物包含本公开的抗体或抗体衍生物；以及(b)第二容器，其中装有组合物，其中该组合物包含其他细胞毒性或治疗剂。在某些实施例中，该制品/试剂盒还可包含包装插入物，其指示组合物可以用于治疗特定病症。
可替代地或另外地，制品/试剂盒还可包括另外的容器，例如第二或第三容器，其包括药学上可接受的缓冲剂，例如但不限于注射用抑菌水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液和右旋糖溶液。该制品/试剂盒可以包括从商业和用户角度所希望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
序列表
以下实例仅是对本公开的主题的说明，不应以任何方式视为限制。
实例
实例1.抗GARP/TGFβ抗体GA1的筛选和测试
从内部合成的天然人Fab噬菌体文库中分离抗GARP/TGFβ抗体克隆，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光活化细胞分选(FACS)针对GARP N-末端ECD进行筛选。使用从8个健康供体分离的PBMC样品产生天然人Fab噬菌体文库。然后，通过使用标准组装PCR技术将所得克隆的VL和VH的核苷酸序列与人IgG1的恒定区融合，将所得克隆用于产生全长抗体。克隆GA1被鉴定为靠前克隆(top clone)。
使用表达人、食蟹猴和小鼠人GARP/TGFβ1复合物的转染的CHO-S细胞以及在细胞表面上表达人GARP/潜在TGFβ1的活化血小板和Treg细胞测试GA1的全细胞结合能力。通过与抗CD3/CD28 Dynabead(吉布科公司)以1∶1的细胞与珠比孵育24小时进行Treg细胞的活化。通过与1U/mL的凝血酶(西格玛公司(Sigma))孵育1小时进行血小板的活化。然后通过将细胞与在FACS缓冲液(含有2％FBS的1x PBS)中连续稀释的抗GARP/TGFβ单克隆抗体在4℃孵育半小时来测试各抗体的全细胞结合能力。用FACS缓冲液洗涤细胞，并在4℃下用山羊抗人IgG(H+L)FITC Ab再检测结合半小时。使用CytoFLEX平台(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))进行流式细胞术分析。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。GARP参考抗体(基于US 2016/0251438中公开的序列信息内部合成的ABBV-151类似物)用作阳性对照。ABBV-151也称为LHG10.6，是临床阶段的抗GARP/TGFβ1抗体。
如图1A-1E所示，GA1结合CHO-S细胞上表达的人GARP/TGFβ1复合物、食蟹猴GARP/TGFβ1复合物和小鼠GARP/TGFβ1复合物，以及凝血酶活化的人血小板和活化的人Treg细胞上的内源性人GARP/TGFβ1复合物。相反，ABBV-151类似物能够结合人和食蟹猴GARP/TGFβ1复合物，但不能结合小鼠GARP/TGFβ1复合物，如图1C所示。除了靶向人GARP/TGFβ1复合物以外，GA1靶向小鼠GARP/TGFβ1复合物的能力赋予其优势，因为其治疗功效可以在各种小鼠模型中测试，这可以在进入人临床试验之前提供更多的治疗信息和指导。此外，如图1D和1E所示，与ABBV-151类似物相比，GA1对活化的血小板和Treg细胞表现出更高的结合能力，表明GA1与人GARP/TGFβ1复合物结合的能力增强。
接下来，测试GA1抑制成熟TGFβ1从活化的血小板释放的能力。如下所述制备血小板。将血液抽到含有酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)的BD vacutainer玻璃血液收集管(BD生物科学公司)中，并以200x g离心20min，收集上层富含血小板的血浆。将收集的富含血小板的血浆与等体积的含有1μM前列腺素E1(西格玛公司)的HEP缓冲液(140mM NaCl、2.7mM KCl、3.8mM HEPES、5mM EGTA，pH 7.4)轻轻混合，并以100x g离心20min以除去RBC和白细胞。然后将上清液转移到新管中，通过以800x g离心20min使血小板沉淀。用洗涤缓冲液(10mM柠檬酸钠、150mM NaCl、1mM EDTA、1％(w/v)右旋糖，pH7.4)进一步冲洗沉淀，并将血小板沉淀重悬于Tyrode缓冲液(134mM NaCl、12mM NaHCO3、2.9mM KCl、0.34mM Na2HPO4、1mM MgCl2、10mM HEPES，pH 7.4)中。在存在或不存在指定的Ab的情况下，用1U/mL的凝血酶(西格玛公司)在1000rpm振荡下刺激血小板1小时。刺激后，收获反应上清液用于成熟TGFβ1定量。用TGFβ1ELISA试剂盒(R&D公司)根据制造商的说明在不进行酸化的情况下确定成熟TGFβ1定量。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。
如图2所示，与仅含血小板的样品相比，凝血酶刺激成熟TGFβ1从血小板释放，并且GA1以剂量依赖性方式抑制成熟TGFβ1从凝血酶活化的人血小板释放。
此外，测试了GA1降低血小板介导的T细胞抑制的能力。通过MagniSort人CD4T细胞富集试剂盒(伊生物科学公司(eBioscience))分离人CD4+T细胞。在存在或不存在指定抗体的情况下，用抗CD3/CD28 Dynabeads(吉布科公司)以1∶40的珠与细胞比在有或没有血小板(1 x 107)的情况下刺激CD4+T细胞(5 x 104)4天。孵育后，收集培养上清液用于IFNγ定量。通过人IFNγELISA MAX Deluxe试剂盒(百进生物科技公司(Biolegend))根据制造商的说明测量IFNγ的量。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。
如图3所示，与仅T细胞相比，抗CD3/CD28珠刺激CD4+T细胞的IFNγ分泌，而血小板的添加抑制了IFNγ分泌。GA1和ABBV-151类似物均降低血小板对IFNγ分泌的抑制，而同种型对照抗体不降低血小板抑制。与ABBV-151类似物相比，GA1表现出更高的血小板抑制降低，导致更高的来自CD4+T细胞的IFNγ分泌，尤其是在更高的剂量水平下。由于IFNγ是重要的抗肿瘤细胞因子，因此结果表明GA1具有更好的抗肿瘤功效。
还在混合白细胞反应测定中测试了GA1降低Treg介导的T细胞抑制的能力。通过MagniSort人T细胞富集试剂盒(伊生物科学公司)分离人T细胞。人CD4+CD25+CD127低Treg根据制造商提供的说明通过EasySep人CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Stemcell公司(Stemcell))分离，并在抗CD3/CD28Dynabeads存在下在含有IL-2(300U/ml，伊生物科学公司)、雷帕霉素(1nM，Selleckchem公司(Selleckchem))和5％人血清(西格玛公司)的X-VIVO 15培养基(龙沙基团(LONZA))中扩增13-15天。在37℃，5％CO2气氛下，将Treg细胞(2.5×103)加入到RPMI-1640完全培养基中含有或不含抗体剂量滴定的T细胞(1×105)和同种异体树突状细胞(DC)(1×104)的混合物中。孵育5天后，分别用人IFNγELISA MAXDeluxe试剂盒和人IL-2 ELISA MAX Deluxe试剂盒(百进生物科技公司)对培养上清液中的IFNγ和IL-2分泌进行定量。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。
如图4A和4B所示，树突状细胞(DC)刺激人T细胞的IFNγ和IL-2分泌，而Treg细胞的添加抑制IFNγ和IL-2分泌。与同种型对照抗体和无抗体组相比，GA1和ABBV-151类似物均降低了Treg抑制并提高了IFNγ和IL-2分泌水平。与ABBV-151类似物相比，GA1升高了T细胞的IFNγ分泌。由于IFNγ和IL-2是重要的抗肿瘤细胞因子，因此结果表明GA1具有更好的抗肿瘤功效。
此外，在同基因MC38小鼠模型(结肠癌)中测试了GA1单独时和与抗PD1抗体组合时的体内抗肿瘤功效。将100μL PBS中的总共3×105个MC38细胞(小鼠结肠癌细胞)与100μL的Matrigel(美国加利福尼亚州康宁公司(Corning，CA，USA))(以1∶1比率)混合，并皮下植入雄性C57BL/6小鼠(中国台湾台北乐斯科生物科技股份有限公司(Biolasco))的两侧胁腹。当肿瘤大小达到100-150mm3时，将每组中的指示抗体或对照试剂腹膜内施用，每周两次，持续3周。每周两次对肿瘤进行观察和测量。肿瘤体积定义为TV(肿瘤体积)＝(长度×宽度2)/2。所有数据点代表平均值±SEM。通过比较每个治疗组与媒介物对照组的肿瘤体积来计算肿瘤生长抑制(TGI)。
如图5所示，与对照组相比，单独的GA1显著降低肿瘤生长(TGI＝53％)。单独的抗PD1抗体(RMP1-14)也如预期的那样显著降低肿瘤生长(TGI＝75％)。此外，GA1和抗PD1抗体的组合进一步增强肿瘤生长抑制(TGI＝95.0％)。结果表明，GA1本身在体内具有抗肿瘤功效，并且与使用任一种抗体的单一治疗相比，GA1和抗PD1抗体的组合可提供显著增强的抗肿瘤功效。由于抗PD1抗体如派姆单抗和纳武单抗已被广泛用于治疗各种类型的癌症，因此结果表明，当组合使用时，GA1可进一步提高抗PD1抗体的治疗功效。
实例2.GA1变体的筛选和测试
为了进一步提高抗体克隆GA1的治疗功效，根据标准方案对其进行基于体外噬菌体展示的亲和力成熟以增强对GARP/TGFβ抗原的亲和力。简言之，使一个或多个CDR残基发生突变，并在噬菌体上展示变体抗体，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光活化细胞分选(FACS)根据对GARP/TGFβ1复合物的更好结合能力进行筛选。
使用表达人、食蟹猴和小鼠人GARP/TGFβ1复合物的转染的CHO-S细胞以及在细胞表面上表达人GARP/TGFβ1复合物的活化的血小板和Treg细胞测试GA1变体的全细胞结合能力。通过与抗CD3/CD28 Dynabead(吉布科公司)以1∶1的细胞与珠比孵育24小时进行Treg细胞的活化。通过与1U/mL的凝血酶(西格玛公司(Sigma))孵育1小时进行血小板的活化。然后通过将细胞与在FACS缓冲液(含有2％FBS的1x PBS)中连续稀释的抗GARP/TGFβ单克隆抗体在4℃孵育半小时来测试各抗体的全细胞结合能力。用FACS缓冲液洗涤细胞，并在4℃下用山羊抗人IgG(H+L)FITC Ab再检测结合半小时。使用CytoFLEX平台(贝克曼库尔特公司)进行流式细胞术分析。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。GARP参考抗体(基于US 2016/0251438中公开的序列信息内部合成的ABBV-151类似物)用作阳性对照。
如图6A-6E所示，GA1及其变体(GA1#4、GA1#6、GA1#7、GA1#8、GA1#9和GA1#12)结合CHO-S细胞上表达的人GARP/TGFβ1复合物、食蟹猴GARP/TGFβ1复合物和小鼠GARP/TGFβ1复合物，以及凝血酶活化的人血小板和活化的人Treg细胞上的人GARP/TGFβ1复合物。
此外，还测试了在框架/恒定区中具有修饰的GA1变体。例如，与GA1#8相比，GA1#8K含有重链C-末端赖氨酸的添加，并且GA1#8K(LC_FS/IT)在GA1#8K的轻链框架区(FR1和FR3)中含有两个氨基酸取代。使用上述方法测试这些恒定区变体针对人GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞的全细胞结合能力。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。如图7所示，框架/恒定区变体(GA1#8K和GA1#8K(LC_FS/IT))能够以与GA1#8相同的方式结合人GARP/潜在TGFβ1转染的CHO-S细胞。这些结果表明，框架/恒定区中的修饰不改变GA1变体结合抗原的能力。
接下来，测试GA1变体抑制成熟TGFβ1从活化的血小板释放的能力。如下所述制备血小板。将血液抽到含有酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)的BD vacutaiher玻璃血液收集管(BD生物科学公司)中，并以200x g离心20min，收集上层富含血小板的血浆。将收集的富含血小板的血浆与等体积的含有1μM前列腺素E1(西格玛公司)的HEP缓冲液(140mM NaCl、2.7mMKCl、3.8mM HEPES、5mM EGTA，pH 7.4)轻轻混合，并以100x g离心20min以除去RBC和白细胞。然后将上清液转移到新管中，通过以800x g离心20min使血小板沉淀。用洗涤缓冲液(10mM柠檬酸钠、150mM NaCl、1mM EDTA、1％(w/v)右旋糖，pH7.4)进一步冲洗沉淀，并将血小板沉淀重悬于Tyrode缓冲液(134mM NaCl、12mM NaHCO3、2.9mM KCl、0.34mM Na2HPO4、1mM MgCl2、10mM HEPES，pH 7.4)中。在存在或不存在指定的Ab的情况下，用1U/mL的凝血酶(西格玛公司)在1000rpm振荡下刺激血小板1小时。刺激后，收获反应上清液用于成熟TGFβ1定量。用TGFβ1ELISA试剂盒(R&D公司)根据制造商的说明在不进行酸化的情况下确定成熟TGFβ1定量。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。
如图8所示，与仅含血小板的样品相比，凝血酶刺激成熟TGFβ1从血小板释放，并且GA1变体以剂量依赖性方式抑制成熟TGFβ1从凝血酶活化的人血小板释放。
此外，测试了GA1变体降低血小板介导的T细胞抑制的能力。通过MagniSorr人CD4T细胞富集试剂盒(伊生物科学公司(eBioscience))分离人CD4+T细胞。在存在或不存在指定抗体的情况下，用抗CD3/CD28 Dynabeads(吉布科公司)以1∶40的珠与细胞比在有或没有血小板(1 x 107)的情况下刺激CD4+T细胞(5 x 104)4天。孵育后，收集培养上清液用于IFNγ定量。通过人IFNγELISA MAX Deluxe试剂盒(百进生物科技公司)根据制造商的说明测量IFNγ的量。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。
如图9所示，与仅T细胞相比，抗CD3/CD28珠刺激CD4+T细胞的IFNγ分泌，而血小板的添加抑制了IFNγ分泌。GA1变体和ABBV-151类似物均降低血小板对IFNγ分泌的抑制，而同种型对照抗体不降低血小板对IFNγ分泌的抑制。与ABBV-151类似物相比，GA1变体表现出更高的血小板抑制降低，导致更高的来自CD4+T细胞的IFNγ分泌。由于IFNγ是重要的抗肿瘤细胞因子，因此结果表明GA1变体具有更好的抗肿瘤功效。
还在混合白细胞反应测定中测试了GA1变体降低Treg介导的T细胞抑制的能力。通过MagniSort人T细胞富集试剂盒(伊生物科学公司)分离人T细胞。人CD4+CD25+CD127低Treg根据制造商提供的说明通过EasySep人CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Stemcell公司)分离，并在抗CD3/CD28 Dynabeads存在下在含有IL-2(300U/ml，伊生物科学公司)、雷帕霉素(1nM，Selleckchem公司)和5％人血清(西格玛公司)的X-VIVO 15培养基(龙沙基团)中扩增13-15天。在37℃，5％CO2气氛下，将Treg细胞(2.5×103)加入到RPMI-1640完全培养基中含有或不含抗体剂量滴定的T细胞(1×105)和同种异体树突状细胞(DC)(1×104)的混合物中。孵育5天后，分别用人IFNγELISA MAX Deluxe试剂盒和人IL-2ELISAMAX Deluxe试剂盒(百进生物科技公司)对培养上清液中的IFNγ和IL-2分泌进行定量。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。
如图10A和10B所示，树突状细胞(DC)刺激人T细胞的IFNγ和IL-2分泌，而Treg细胞的添加抑制IFNγ和IL-2分泌。与同种型对照抗体和无抗体组相比，GA1变体和ABBV-151类似物均降低Treg抑制并提高IFNγ和IL-2分泌水平。与ABBV-151类似物相比，GA1变体导致更高的来自T细胞的IFNγ分泌。由于IFNγ和IL-2是重要的抗肿瘤细胞因子，因此结果表明GA1变体具有更好的抗肿瘤功效。
在活化的人Treg细胞中测试GA1变体抑制TGFβ介导的Smad2磷酸化的能力。人CD4+CD25+CD127低Treg根据制造商提供的说明通过EasySep人CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Stemcell公司)分离，并在抗CD3/CD28 Dynabeads(赛默公司(Thermo))存在下在含有IL-2(300U/ml，伊生物科学公司)、雷帕霉素(1nM，Selleckchem公司)和5％人血清(西格玛公司)的X-VIVOTM 15培养基(龙沙基团)中扩增13-15天。在抗体存在或不存在的情况下，用抗CD3/CD28 Dynabeads在无血清X-VIVO 15培养基中刺激扩增的Treg(1×106个细胞/ml)24小时。通过与细胞孵育30分钟进行重组人TGFβ1(20ng/mL，派普泰克公司(PeproTech))刺激。刺激后，将细胞裂解并在还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。用Wet/Tank印迹系统(伯乐公司(Bio-Rad))在硝化纤维素膜上印迹凝胶。封闭后，将膜与针对P-Smad2(细胞信号传导技术公司)或GAPDH(细胞信号传导技术公司)的第一抗体一起孵育，然后与第二HRP偶联抗体一起孵育，并用ECL底物(赛默公司)显色。P-Smad2的存在表明受刺激的Treg产生活性TGFβ1。同种型对照(贝伐单抗)用作阴性对照。重组人TGFμ(rhTGFβ)和GARP参考抗体ABBV-151类似物用作阳性对照。抗TGFβ(来自Bio X Cell的市售抗TGFβ抗体(1D11))也用作阳性对照。
如图11所示，无抗体样品和阴性对照样品显示相似的基线P-Smad2水平；重组人TGFβ(rhTGFβ)的治疗如预期增加P-Smad2水平；并且代表性GA1变体(GA1#8)、ABBV-151类似物和抗TGFβ能够抑制Treg细胞中的Smad2磷酸化。由于TGFβ介导的Smad2信号传导对于Treg细胞活化是重要的，因此结果表明，GA1变体可以抑制Treg细胞活化，这进而可以增强效应T细胞功能并改善受试者针对疾病和肿瘤的免疫应答。
此外，在同基因MC38小鼠模型(结肠癌)中测试GA1变体的体内抗肿瘤功效。将100μL PBS中的总共3×105个MC38细胞(小鼠结肠癌细胞)与100μL的Matrigel(美国加利福尼亚州康宁公司)(以1∶1比率)混合，并皮下植入雄性C57BL/6小鼠(中国台湾台北乐斯科生物科技股份有限公司)的两侧胁腹。当肿瘤大小达到100-150mm3时，将每组中的指示抗体或对照试剂腹膜内施用，每周两次，持续3周。每周两次对肿瘤进行观察和测量。肿瘤体积定义为TV(肿瘤体积)＝(长度×宽度2)/2。所有数据点代表平均值±SEM。通过比较每个治疗组与媒介物对照组的肿瘤体积来计算肿瘤生长抑制(TGI)。
尽管先前在MC38小鼠模型中对GA1的研究证明了GA1的抗肿瘤功效，但是与对照组相比，GA1治疗在治疗后第12天之前没有显示出肿瘤抑制，如图5所示。类似地，在该研究中，GA1治疗对肿瘤的抑制在治疗后第13天最小(TGI＝9％)，如图12所示。然而，在治疗后第13天，从GA1变体GA1#7(TGI＝57％)、GA1#8(TGI＝54％)和GA1#9(TGI＝48％)的治疗中观察到更大的肿瘤抑制。结果表明GA1变体GA1#7、GA1#8和GA1#9的抗肿瘤功效优于GA1。
根据上述相同方案，在MC38小鼠模型中以较低剂量水平(10mg/kg)进一步测试GA1#8。如图13所示，与对照组相比，单独的GA1变体GA1#8显著降低肿瘤生长(TGI＝37.8％)，类似于抗PD1抗体(RMP1-14；TGI＝37.3％)。此外，GA1#8和抗PD1抗体的组合进一步增强肿瘤生长抑制(TGI＝98.0％)。结果表明，GA1#8本身和与抗PD1抗体组合时在较低剂量水平下具有体内抗肿瘤功效。
此外，在CT26小鼠模型(小鼠结肠癌)同基因小鼠模型中以较高剂量(25mg/kg)测试GA1#8。与MC38模型相比，报告CT26小鼠模型对PD1抑制剂治疗更具抗性并且与MC38模型相比，在肿瘤微环境中具有更高水平的Treg细胞，这可能影响抗GARP/TGFβ抗体治疗的抗肿瘤效果。将100μL PBS中的总共5x105个CT26细胞(小鼠结肠癌)与100μL的Matrigel(美国加利福尼亚州康宁公司)(以1∶1比率)混合，并皮下植入BALB/c小鼠(中国台湾台北乐斯科生物科技股份有限公司)的两侧胁腹。当肿瘤大小达到100-150mm3时，将每组中的指示抗体或对照腹膜内施用，每周两次，持续3周。每周两次对肿瘤进行观察和测量。肿瘤体积定义为TV(肿瘤体积)＝(长度×宽度2)/2。所有数据点代表平均值±SEM。通过比较每个治疗组与媒介物对照组的肿瘤体积来计算肿瘤生长抑制(TGI)。
如图14所示，与对照组相比，单独的GA1变体GA1#8显著降低肿瘤生长(TGI＝50％)，类似于抗PD1抗体(RMP1-14；TGI＝48％)。此外，GA1#8和抗PD1抗体的组合进一步增强肿瘤生长抑制(TGI＝73％)。结果与来自MC38模型的结果一致，并且它们一起表明，GA1变体GA1#8本身在体内具有抗肿瘤功效，并且与使用任一种抗体的单一治疗相比，GA1#8和抗PD1抗体的组合可以提供显著增强的抗肿瘤功效。由于抗PD1抗体如派姆单抗和纳武单抗已被广泛用于治疗各种类型的癌症，因此结果表明，当组合使用时，GA1变体如GA1#8可进一步提高抗PD1抗体的治疗功效。
实例3.抗GARP/TGFβ抗体hGA17的筛选和测试
通过筛选Fab噬菌体文库鉴定另外的抗GARP/TGFβ抗体克隆，该噬菌体文库由杂交瘤产生，这些杂交瘤构建自GARP/TGFβ1复合物或GARP ECD/TGFβ1复合物免疫的小鼠。选择一个代表性克隆GA17用于框架的人源化。简言之，使用克隆的序列进行Igblast以搜索人种系基因的数据库。选择理想的种系序列，并进行框架序列的突变以将框架序列从小鼠序列改变为人序列，产生人源化克隆hGA17。
使用人GARP/TGFβ1复合物和不在任何GARP/TGFβ1复合物中的人GARP蛋白测试hGA17的ELISA结合。将96孔板(科斯塔公司(Costar)，3690)在4℃下用30μl/孔的在PBS缓冲液中的4μg/ml GARP/TGFβ1复合物或2μg/ml GARP包被过夜。用PBST缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS，pH 7.4)洗涤包被的板5次，并用SuperBlockTM缓冲液(赛默公司，37516)封闭。产生hGA17、GA1#8和参考抗体的重复滴定(在1000ng/ml至0.32ng/ml的范围内)并加入到洗涤的板中并在室温下孵育2小时。GARP参考抗体1(基于US 2016/0251438中公开的序列信息内部合成的ABBV-151类似物)和GARP参考抗体2(基于US 2018/0258184中公开的序列信息内部合成的DS-1005a类似物)用作阳性对照。ABBV-151，也称为LHG10.6，是临床阶段的抗GARP/TGFβ1 IgG4抗体。DS-1005a也称为H151D-H1L1，是临床阶段的抗GARP/TGFβ IgG1抗体。如上所述对板进行洗涤，加入30μl/孔的1/8000稀释的山羊抗人IgG，猴ads-HRP(南方生物技术公司(SouthernBiotech))，并在室温下再孵育1小时。进一步洗涤后，用30μl/孔TMB底物(SurModics公司，TMBS-1000-01)检测结合的抗体，并用ELISA终止溶液(索莱宝科技有限公司(Solarbio)，C1058-100m1)终止。在450nm处测量吸光度，并将测试抗体的结合曲线与参考抗体进行比较。将吸光度对样品浓度作图。抗体对人GARP和人GARP/TGFβ1复合物的结合能力通过Octect进一步测试。
如图15A所示，GA1#8和hGA17均与人GARP/潜在TGFβ1复合物结合，并且与两种参考抗体相比显示出更好的结合。如图15B所示，hGA17和GARP参考抗体2都单独与人GARP结合，其中hGA17显示出比GARP参考抗体2强得多的结合。相比之下，GARP参考抗体1和GA1#8不结合GARP/TGFβ复合物之外的人GARP。
通过Octect进一步测试抗体对人GARP和人GARP/TGFβ1复合物的结合能力，结果示于表3中。与仅结合GARP/TGFβ1复合物的GA1#8和ABBV-151不同，hGA17以相当的亲和力结合GARP/TGFβ1复合物和GARP(表3)。DS-1005a类似物能够结合GARP/TGFβ1复合物和GARP，但与hGA17相比结合弱得多。
表3通过Octet的抗GARP/TGFβ抗体的结合亲和力
亲和力(KD) hGA17 GA1#8 GARP参考抗体1 GARP参考抗体2
hGARP 4.292E-10 N/A N/A 2.025E-09
hGARP/TGFβ1 6.956E-10 2.813E-10 4.282E-10 4.120E-09
使用表达GARP/TGFβ复合物的肿瘤细胞Hs 578T、表达人GARP蛋白的GARP转染的CHO-S细胞以及在细胞表面上表达人GARP/潜在TGFβ1的人血小板和Treg细胞测试hGA17和GA1#8的全细胞结合能力。血小板来自苗通生物科学和技术公司(Miao Tong BiologicalScience&Technology)。人CD4+CD25+CD127低Treg细胞根据制造商提供的说明通过EasySep人CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Stemcell公司)从人PBMC(苗通生物科学和技术公司)中分离，并在抗CD3/CD28 Dynabeads存在下在含有IL-2(300U/ml，伊生物科学公司)、雷帕霉素(1nM，Selleckchem公司)和5％人血清(西格玛公司)的X-VIVO 15培养基(龙沙基团)中扩增13-15天。通过与抗CD3/CD28 Dynabead(吉布科公司，111.32D)以1∶1的细胞与珠比孵育24小时进行Treg细胞的活化。然后通过将细胞与在FACS缓冲液(含有2％FBS的1x PBS)中连续稀释的抗GARP/TGFβ单克隆抗体在4℃孵育1小时来测试各抗体的全细胞结合能力。然后，用FACS缓冲液洗涤细胞，并在4℃下用山羊抗人IgG PE Ab(百进生物科技公司)再检测结合半小时。使用CytoFLEX平台(贝克曼库尔特公司)进行流式细胞术分析。IgG同种型对照(抗CLDN18.2抗体)用作阴性对照。GARP参考抗体1(ABBV-151类似物)和GARP参考抗体2(DS-1005a类似物)用作阳性对照。
如图16A-16D所示，hGA17结合Hs 578T肿瘤细胞上表达的人GARP/TGFβ复合物(图16A)、CHO-S细胞上表达的人GARP(图16B)以及人血小板(图16C)和活化的人Treg细胞(图16D)上的人GARP/潜在TGFβ1复合物。如图16A所示，hGA17对Hs 578T肿瘤细胞的结合活性比GA1#8、GARP参考抗体1和GARP参考抗体2强得多。此外，hGA17和GARP参考抗体2能够结合CHO-S细胞上的人GARP和人血小板和活化的人Treg细胞上的人GARP/潜在TGFβ1复合物，如图16B所示。相反，GA1#8和GARP参考抗体1不结合CHO细胞上的人GARP，如图16B所示。靶向GARP/TGFβ复合物之外的人GARP和人GARP/TGFβ1复合物的能力可赋予hGA17优势，因为其治疗功效可由两种形式的GARP诱导，从而介导更广泛的ADCC效应。此外，如图16C和16D所示，与GARP参考抗体2相比，hGA17对人血小板和Treg细胞表现出更高的结合能力，表明与GARP参考抗体2相比，hGA17与人GARP/潜在TGFβ1复合物的结合能力更好。
此外，测试了hGA17抑制成熟TGFβ1从活化的血小板释放的能力。血小板来自苗通生物科学和技术公司。将DMEM培养基预洗涤的血小板接种到96孔板中，并与指定的抗体在4℃下孵育1小时，然后在存在或不存在指定的Ab的情况下，用2U/mL的凝血酶(西格玛公司)在1000rpm振荡下刺激1小时。刺激后，收获反应上清液用于成熟TGFβ1定量。用TGFβ1ELISA试剂盒(R&D公司)根据制造商的说明在不进行酸化的情况下确定成熟TGFβ1定量。GARP参考抗体1(ABBV-151类似物)和GARP参考抗体2(DS-1055a类似物)用作阳性对照。
如图17所示，与仅含血小板的样品相比，GA1#8和hGA17在50μg/ml的剂量下抑制成熟TGFβ1从凝血酶活化的人血小板释放。GARP参考抗体1显示出类似的抑制TGFβ1从凝血酶活化的人血小板释放的模式，然而，在该测定中没有观察到GARP参考抗体2的抑制作用。
此外，测试了hGA17降低Treg介导的T细胞抑制的能力。人CD3+T细胞购自苗通生物科学和技术公司。Treg细胞根据制造商提供的说明通过EasySep人CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Stemcell公司)从人PBMC(苗通生物科学和技术公司)中分离。在存在或不存在指定抗体的情况下，用抗CD3/CD28Dynabeads(吉布科公司)以1∶10的珠与细胞比在有或没有Treg细胞(5x104)的情况下刺激CD3+T细胞(1x105)3天。孵育后，收集培养上清液用于IL-2定量。IL-2的量通过人IL-2 ELISA MAX Deluxe试剂盒(百进生物科技公司)根据制造商的说明来测量。人IgG1(Sino)用作阴性对照。GARP参考抗体1(ABBV-151类似物)用作阳性对照。
如图18所示，与无刺激样品相比，抗CD3/CD28珠刺激CD3+T细胞的IL-2分泌，而Treg的添加抑制了IL-2分泌。GA1#8、hGA17和GARP参考抗体1降低Treg对IL-2分泌的抑制，而同种型对照抗体不降低Treg对IL-2分泌的抑制。由于IL-2是免疫活化的重要细胞因子，因此结果表明，GA1#8和hGA17可提高患者的抗肿瘤免疫力。
如下进一步测试hGA17促进NK细胞介导的表达GARP/TGFβ复合物的肿瘤细胞裂解的能力。简言之，Hs 578T肿瘤细胞用作靶细胞。PBMC用作效应细胞。在系列稀释(10000ng/ml至0.1ng/ml)的抗体存在下，将PBMC与Hs 578T(10000个细胞/孔)以20∶1的效应细胞与靶细胞(E/T)比混合过夜。GARP参考抗体1(ABBV-151类似物)和GARP参考抗体2(DS-1055a类似物)用作对照。按照细胞毒性LDH测定试剂盒-WST(同仁化学研究所(Dojindi)，CK12)的说明测量细胞毒性。基于OD490读数，用下式计算抗体依赖性细胞裂解的百分比：[(测试-平均背景)/(平均最大值-平均背景)]×100。测试从两个健康供体分离的PBMC。
如图19A和19B所示，hGA17以剂量依赖性方式诱导强细胞毒性，而其他抗GARP/TGFβ抗体仅诱导针对Hs 578T细胞的弱细胞毒性或无细胞毒性。hGA17的优异ADCC效应表明，hGA17在高表达GARP/TGFβ复合物的肿瘤中可具有更好的抗肿瘤功效。
此外，测试了hGA17耗竭GARP+Treg细胞的能力。在存在抗人GARP/TGFβ抗体或人IgG1(Sino)的情况下，在含有CD3/CD28 dynabeads(吉布科公司)的RPMI 1640中培养来自四个健康供体(苗通生物科学和技术公司)的人PBMC。GARP参考抗体2(DS-1055a类似物)用作对照。培养2天后，洗涤细胞并用LIVE/DEAD(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))、Alexa Flour 700-CD3(百进生物科技公司)、PE/CY7-CD4(百进生物科技公司)、PE/CY5.5-CD25(百进生物科技公司)、Pacific Blue-FOXP3(百进生物科技公司)、PE-GARP(BD生物科学公司)染色。用CytoFLEX平台(贝克曼库尔特公司)评估染色的细胞，并测定CD3+CD25+CD4+FOXP3+T细胞群中GARP+Treg细胞群的减少。
如图20所示，与所有其他抗GARP/TGFβ抗体相比，hGA17更大程度地减少四个不同供体中的GARP+Treg群体。结果表明，与其他抗GARP/TGFβ抗体相比，hGA17具有优异的Treg耗竭活性，并且可以通过减少肿瘤微环境中的Treg群体来提高抗肿瘤功效。
GA1#8可与小鼠GARP/TGFβ复合物交叉反应，而hGA17、GARP参考抗体1和GARP参考抗体2不能与小鼠GARP结合。为了比较GA1#8、hGA17和参考抗体的体内抗肿瘤功效，将人GARP敲入(KI)c57/BL6小鼠用于MC38结肠癌模型。GARP参考抗体1(ABBV-151类似物)和GARP参考抗体2(DS-1055a类似物)用作对照。
将100μL的PBS中总共5×105个MC38细胞与100μL Matrigel(美国加利福尼亚州康宁公司)(以1∶1的比率)混合，并皮下植入小鼠前肢。当肿瘤大小达到80-100mm3时，将每组中的指定抗体或媒介物以25mg/kg的剂量腹膜内施用，每周两次，持续3周。每周两次对肿瘤进行观察和测量。肿瘤体积定义为TV(肿瘤体积)＝(长度×宽度2)/2。所有数据点代表平均值±SEM。通过比较每个治疗组与媒介物对照组的肿瘤体积来计算肿瘤生长抑制(TGI)。在第24天处死小鼠，收获脾脏和血液。通过在4℃下400g离心，用40μm细胞滤网研磨和过滤，将脾脏制备为单细胞悬浮液。每个脾脏用5ml 1xRBC裂解缓冲液(英杰公司(Invitrogen))来悬浮沉淀，并在室温下孵育4分钟。用30ml PBS缓冲液终止红细胞裂解。每1ml小鼠血液用1ml的1x RBC裂解缓冲液裂解小鼠血液4分钟，用30ml的PBS缓冲液终止红细胞裂解。收集脾和血细胞的沉淀并染色表面标记物(Live/dead-eflour 506、mCD45-BV605、mCD3-AF700、mCD4-APC-H7、mCD8-Percp-cy5.5、mCD25-PE-cy7、mPD1-APC、hGARP-BV421/mGARP-BV421)。用FACS缓冲液(含2％FBS的PBS)洗涤后，将细胞沉淀用Foxp3固定/透化悬浮，并在4℃孵育16小时。用1×透化缓冲液洗涤2次后，将细胞用mFOXP3-PE在4℃下在黑暗中染色30分钟。最后，将细胞用1×透化缓冲液洗涤2次并用FACS缓冲液悬浮用于流式细胞术分析。
如图21A所示，hGA17和GA1#8在人GARP KI MC38小鼠模型中都显示出抗肿瘤功效。在第24天，与媒介物对照组相比，hGA17和GA1#8的肿瘤生长抑制(TGI)分别为45.81％和38.55％。相反，在第24天，与媒介物对照组相比，GARP参考抗体1显示少得多的肿瘤生长抑制(TGI＝16.57％)，而GARP参考抗体2治疗未显示肿瘤抑制。此外，通过流式细胞术分析来自人GARP KI小鼠的血液和脾脏的Treg细胞。如图21B和21C所示，每个抗体治疗组都降低hGARP KI小鼠的血液(图21B)和脾脏(图21C)中的GARP+Treg细胞。这些结果表明，与参考抗体相比，GA1#8和hGA17在体内显示出优异的抗肿瘤功效和更好的耗竭GARP+Treg细胞的能力。
除了所描绘和要求保护的各种实施例之外，所公开的主题还针对具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。这样，本文所呈现的特定特征可以在所公开的主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。出于展示和说明的目的已经提出了所公开主题的特定实施例的以上说明。以上说明并不旨在是穷尽的或将所公开主题限制于所公开的那些实施例。
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本文引用了多种出版物、专利和专利申请，其内容通过引用以其整体特此并入。

Claims (102)

1.一种结合GARP/TGFβ复合物的抗体，该抗体包含：
a)重链可变区，其包含：
(1)重链可变区CDR-H1，其包含SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51、61和105中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(2)重链可变区CDR-H2，其包含SEQ ID NO：2、12、22、32、42、52、62和106中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；以及
(3)重链可变区CDR-H3，其包含SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、63和107中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；以及
b)轻链可变区，其包含：
(1)轻链可变区CDR-L1，其包含SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54、64和108中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(2)轻链可变区CDR-L2，其包含SEQ ID NO：5、15、25、35、45、55、65和109中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；以及
(3)轻链可变区CDR-L3，其包含SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56、66和110中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中该抗体以1x10-7M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中该抗体以1x10-8M或更小的KD结合GARP/TGFβ复合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中抗体以约1x10-11M至约1x10-7M的KD结合GARP/TGFβ复合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中该抗体以约1x10-10M至约5x10-8M的KD结合GARP/TGFβ复合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中该抗体与参考抗GARP/TGFβ抗体交叉竞争，该参考抗GARP/TGFβ抗体包含：
a)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的CDR-L3；
b)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：16中所示氨基酸序列的CDR-L3；
c)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：26中所示氨基酸序列的CDR-L3；
d)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：34中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：36中所示氨基酸序列的CDR-L3；
e)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：41中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：42中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：44中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：46中所示氨基酸序列的CDR-L3；
f)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：51中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：54中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：56中所示氨基酸序列的CDR-L3；
g)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：61中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：64中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：66中所示氨基酸序列的CDR-L3；或
h)重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：105中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：106中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：107中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：108中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：109中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列的CDR-L3。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：
a)包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域的重链可变区，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别包含参考重链可变区中包含的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、85、89、93、97、101和111组成的组的氨基酸序列；以及
b)包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域的轻链可变区，其中该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别包含参考轻链可变区中包含的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、83、84、86、90、94、98、102和112组成的组的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ IDNO：5中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的CDR-L3。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQID NO：15中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16中所示氨基酸序列的CDR-L3。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQID NO：25中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：26中所示氨基酸序列的CDR-L3。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：34中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQID NO：35中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36中所示氨基酸序列的CDR-L3。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：41中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：42中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：44中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQID NO：45中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的CDR-L3。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：51中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：54中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQID NO：55中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56中所示氨基酸序列的CDR-L3。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：61中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：64中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQID NO：65中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66中所示氨基酸序列的CDR-L3。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：105中所示氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：106中所示氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：107中所示氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，其包含：(1)包含SEQ ID NO：108中所示氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：109中所示氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列的CDR-L3。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：17中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：27中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：28中所示氨基酸序列。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：38中所示氨基酸序列。
20.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：83中所示氨基酸序列。
21.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：48中所示氨基酸序列。
22.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：47中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：84中所示氨基酸序列。
23.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：57中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：58中所示氨基酸序列。
24.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：67中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：68中所示氨基酸序列。
25.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：85中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：86中所示氨基酸序列。
26.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：89中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：90中所示氨基酸序列。
27.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：93中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：94中所示氨基酸序列。
28.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：97中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：98中所示氨基酸序列。
29.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：101中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：102中所示氨基酸序列。
30.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：111中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：112中所示氨基酸序列。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的抗体，其中该抗体包含人框架。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的抗体，其中该抗体是人抗体。
33.根据权利要求1-31中任一项所述的抗体，其中该抗体是人源化抗体。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体，其中该抗体包含全长免疫球蛋白、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双抗体、三抗体、四抗体或其任何组合。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的抗体，其中该抗体包含Fc区。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含人Fc区。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含选自下组的Fc区，该组由以下组成：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含选自下组的Fc区，该组由以下组成：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含IgG1Fc区。
40.根据权利要求1-38中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含IgG4Fc区。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的抗体，其中该抗体结合人GARP/TGFβ复合物。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的抗体，其中该抗体结合食蟹猴GARP/TGFβ复合物。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的抗体，其中该抗体结合人GARP/TGFβ复合物、食蟹猴GARP/TGFβ复合物和小鼠GARP/TGFβ复合物。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含C-末端赖氨酸。
45.根据权利要求1-43中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含C-末端赖氨酸的缺失。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的抗体，其中该抗体包含在多特异性抗体例如双特异性抗体中，其中该多特异性抗体包含特异性结合第二抗原的第二抗体部分。
47.根据权利要求46所述的抗体，其中该第二抗原是肿瘤相关抗原。
48.根据权利要求47所述的抗体，其中该肿瘤相关抗原选自下组，该组由以下组成：Her-2，EGFR，PDL1，MSLN，c-Met，B细胞成熟抗原(BCMA)，碳酸酐酶IX(CA1X)，癌胚抗原(CEA)，CD5，CD7，CD10，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，CD38，CD41，CD44，CD47，CD49f，CD56，CD74，CD123，CD133，CD138，CD276(B7H3)，上皮糖蛋白(EGP2)，滋养层细胞表面抗原2(TROP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-a，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis A(CA1.9.9)，Lewis Y(LeY)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，粘蛋白16(Muc-16)，粘蛋白1(Muc-1)，NG2D配体，肿瘤胚胎抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，密封蛋白18.2(CLDN18.2)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，肾母细胞瘤蛋白(WT-1)，1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)，PVR，PVRL2及其任何组合。
49.根据权利要求48所述的抗体，其中该第二抗原是免疫检查点调节剂。
50.根据权利要求49所述的抗体，其中该免疫检查点调节剂选自下组，该组由以下组成：TIGIT、PD1、CTLA4、LAG-3、2B4、BTLA及其任何组合。
51.根据权利要求48所述的抗体，其中该第二抗原是免疫共刺激分子或T细胞受体/CD3复合物的亚基。
52.根据权利要求51所述的抗体，其中该免疫共刺激分子选自下组，该组由以下组成：CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40及其任何组合。
53.根据权利要求51所述的抗体，其中该T细胞受体/CD3复合物的亚基选自下组，该组由以下组成：CD3γ、CD3δ、CD3ε及其任何组合。
54.一种免疫缀合物，其包含与治疗剂或标记连接的根据权利要求1-53中任一项所述的抗体。
55.根据权利要求54所述的免疫缀合物，其中该治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
56.根据权利要求54所述的免疫缀合物，其中该标记选自下组，该组由以下组成：放射性同位素、荧光染料和酶。
57.一种抗原识别受体，其包含含有根据权利要求1-53中任一项所述的抗体的胞外抗原结合结构域。
58.根据权利要求57所述的抗原识别受体，其是嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体。
59.根据权利要求57或58所述的抗原识别受体，其是CAR。
60.根据权利要求57-59中任一项所述的抗原识别受体，其中该抗体是scFv或Fab。
61.一种免疫应答细胞，其包含根据权利要求57-60中任一项所述的抗原识别受体。
62.根据权利要求61所述的免疫应答细胞，其中该免疫应答细胞选自下组，该组由以下组成：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和髓样细胞。
63.根据权利要求62所述的免疫应答细胞，其中该免疫应答细胞是T细胞。
64.一种药物组合物，其包含a)根据权利要求1-53中任一项所述的抗体、根据权利要求54-56中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求61-63中任一项所述的免疫应答细胞，和b)药学上可接受的载剂。
65.一种或多种核酸，其编码根据权利要求1-53中任一项所述的抗体。
66.一种或多种载体，其包含根据权利要求65所述的核酸。
67.一种宿主细胞，其包含根据权利要求65所述的核酸或根据权利要求66所述的载体。
68.一种用于制备根据权利要求1-53中任一项所述的抗体的方法，该方法包括在根据权利要求67所述的宿主细胞中表达该抗体，并从该宿主细胞中分离该抗体。
69.一种减轻受试者的肿瘤负荷的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的根据权利要求1-53中任一项所述的抗体、根据权利要求54-56中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求64所述的药物组合物。
70.根据权利要求69所述的方法，其中该方法减少肿瘤细胞的数量。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中该方法减小肿瘤大小。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中该方法根除受试者的肿瘤。
73.根据权利要求69-72中任一项所述的方法，其中该肿瘤表现出高微卫星不稳定性(MSI)。
74.根据权利要求69-73中任一项所述的方法，其中该肿瘤选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
75.一种治疗和/或预防癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1-53中任一项所述的抗体、根据权利要求53-56中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求64所述的药物组合物。
76.一种延长患有癌症的受试者的存活期的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的根据权利要求1-63中任一项所述的抗体、根据权利要求54-56中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求64所述的药物组合物。
77.根据权利要求75或76所述的方法，其中该癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI)。
78.根据权利要求75-77中任一项所述的方法，其中该癌症选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
79.根据权利要求1-53中任一项所述的抗体，其用作药物。
80.根据权利要求1-53中任一项所述的抗体，其用于治疗癌症。
81.根据权利要求64所述的药物组合物，其用作药物。
82.根据权利要求64所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
83.根据权利要求86所述的抗体或根据权利要求82所述的药物组合物，其中该癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI)。
84.根据权利要求80所述的抗体或根据权利要求82所述的药物组合物，其中该癌症选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
85.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-53中任一项所述的抗体、根据权利要求54-56中任一项所述的免疫缀合物、根据权利要求64所述的药物组合物、根据权利要求65所述的核酸、根据权利要求66所述的载体或根据权利要求61-63所述的免疫应答细胞。
86.根据权利要求85所述的试剂盒，其进一步包含用于治疗和/或预防赘生物的书面说明书。
87.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的抗GARP/TGFβ抗体和抗PD1抗体。
88.根据权利要求87所述的方法，其中该抗GARP/TGFβ抗体是根据权利要求1-53中任一项所述的抗GARP/TGFβ抗体。
89.根据权利要求87或88所述的方法，其中该癌症表现出高微卫星不稳定性(MSI)。
90.根据权利要求87-89中任一项所述的方法，其中该癌症选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。
91.根据权利要求87-90中任一项所述的方法，其中该抗GARP/TGFβ抗体和该抗PD1抗体同时或顺序施用。
92.根据权利要求87-91中任一项所述的方法，其中该抗GARP/TGFβ抗体和该抗PD1抗体同时施用。
93.根据权利要求87-92中任一项所述的方法，其中在施用该抗GARP/TGFβ抗体之前施用一剂或多剂的该抗PD1抗体。
94.根据权利要求87-93中任一项所述的方法，其中该受试者在施用该抗GARP/TGFβ抗体之前接受完整疗程的该抗PD1抗体疗法。
95.根据权利要求87-94中任一项所述的方法，其中该抗GARP/TGFβ抗体在该抗PD1抗体疗法的第二疗程期间施用。
96.根据权利要求87-95中任一项所述的方法，其中该受试者在施用该抗GARP/TGFβ抗体之前接受至少一剂、至少两剂、至少三剂或至少四剂的该抗PD1抗体。
97.根据权利要求87-96中任一项所述的方法，其中至少一剂的该抗PD1抗体与该抗GARP/TGFβ抗体同时施用。
98.根据权利要求87-97中任一项所述的方法，其中一剂或多剂的该抗GARP/TGFβ抗体在施用该抗PD1抗体之前施用。
99.根据权利要求87-98中任一项所述的方法，其中该受试者在施用该抗PD1抗体之前接受至少两剂、至少三剂、至少三剂或至少四剂的该抗GARP/TGFβ抗体。
100.根据权利要求87-99中任一项所述的方法，其中至少一剂的该抗GARP/TGFβ抗体与该抗PD1抗体同时施用。
101.根据权利要求87-100中任一项所述的方法，其中该抗GARP/TGFβ抗体和该抗PD1抗体每1、2、3、4或5周施用一次。
102.根据权利要求87-101中任一项所述的方法，其中该癌症在选自由手术、化疗、放射疗法和其任何组合组成的组的疗法之后是复发性或进展性的。
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