JP2003501043A

JP2003501043A - 腫瘍壊死因子（ｔｎｆ）関連障害において、ｔｎｆのレベルを低下させるための方法および組成物

Info

Publication number: JP2003501043A
Application number: JP2001500793A
Authority: JP
Inventors: ハイムバーステイン，; アンソニーエム．ステパン，
Original assignee: ターゲティッドジェネティクスコーポレイション
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2003-01-14
Also published as: US20030113295A1; PT1180159E; EP1180159B1; AU2005244527B2; WO2000073481A1; AU783037B2; DK1180159T3; DE60040147D1; AU2005244527A1; EP1180159A1; AU5295800A; US20070128177A1; US6537540B1; ATE407214T1; AU2005244527C1; ES2312344T3; US20030103942A1; CA2374597A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。および本発明は、哺乳動物におけるＴＮＦのレベルを減少させるために、これらのベクターを使用する方法を提供する。本発明はまた、ＴＮＦ関連障害を緩和させるにおいて、これらのｒＡＡＶベクターを使用する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）の細胞外ドメインおよびＩｇＧ１分子の定常ドメインを含む、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本願は、１９９９年５月２８日付けで出願された、米国仮特許出願番号６０／
１５０，６８８号（これは、その全体において参考として援用される）の優先権
の利益を主張する。

【０００２】（連邦政府による後援研究のもとでなされた発明に対する権利の陳述）（適用なし）（発明の分野）本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレベルを低下させるための、アデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用に関する。より詳細には、本発明は、ＴＮＦ
アンタゴニストをコードするＡＡＶベクターに関し、そして個体におけるＴＮＦ
のレベルを減少させるために、このＡＡＶベクターを使用する方法に関する。

【０００３】（背景）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）および腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）は、相同な多
機能性サイトカインであり；その構造的および機能的特徴における高い類似性に
よって、腫瘍壊死因子、すなわち「ＴＮＦ」としてのその集合的記載に帰着して
いる。一般的にＴＮＦに帰する活性としては、以下が挙げられる：他のサイトカ
イン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０を含む）の放出、
ケモカインの誘導、接着分子の増加、血管の増殖、組織崩壊酵素の放出、および
Ｔ細胞の活性化。例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎら，１９９７，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，６４：２８３−３５０，Ｎａｗｒｏｔｈら，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．，１６３：１３６３−１３７５；Ｍｏｓｅｒら，１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３：４４４−４５５；Ｓｈｉｎｇｕら，１９９３，Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４：１４５−１４９；ＭａｃＮａｕｌら，１９
９２，ＭａｔｒｉｘＳｕｐｐｌ．１：１９８−１９９；およびＡｈｍａｄｚａ
ｄｅｈら，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：３８７−３
９１を参照のこと。これらのすべての活性が、炎症応答を増強するように作用し
得る。

【０００４】ＴＮＦは、ＴＮＦ応答細胞における特異的な細胞表面レセプターとのその相互
作用を通して、その生物学的効果を開始する。ｐ７５（またはＩＩ型）およびｐ
５５（またはＩ型）と称される、細胞表面腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）
の２つの異なる形態が存在する（Ｓｍｉｔｈら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２
４８：１０１９−１０２３；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら，１９９０，Ｃｅｌｌ６１
：３５１−３５９）。ＴＮＦＲＩ型およびＴＮＦＲＩＩ型は、各々、ＴＮＦ
αおよびＴＮＦβの両方に結合する。リガンド結合ドメインを有するＴＮＦＲの
可溶性短縮化バージョンは、体液および関節中に存在する（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ
ら，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１１９７４−１１９８０；Ｒ
ｏｕｘ−Ｌｏｍｂａｒｄら，１９９３，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．３６
：４８５−４８９）。

【０００５】多くの障害が、ＴＮＦレベルの上昇と関連し、その多くが、医学的にかなり重
要なものである。このようなＴＮＦ関連障害の中には、うっ血性心不全、炎症性
腸疾患（クローン病を含む）、関節炎およびぜん息がある。

【０００６】ＴＮＦは、うっ血性心不全においては、心臓および内皮に影響するようであり
、そして心筋細胞におけるアポトーシスプロセスの開始に関与している。この疾
患におけるＴＮＦの役割はまた、ＴＮＦの活性化と、無症候性から症候性のうっ
血性心不全への移行との間の時間的関係によって支持される（Ｃｅｃｏｎｉら，
１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．４１：２５−３０）。

【０００７】炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）は、ＴＮＦの発現の
増加と関連する（Ｅｖａｎｓら，１９９７，Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．Ｔｈｅｒ．１１：１０３１−１０３５）。このような障害の処置は、免疫抑
制剤（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、および糖
質副腎皮質ステロイド）の広範な使用を含んだ（Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ，１９９８
，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ５９：４５３−４６９）。

【０００８】関節炎は、一般的な不自由な（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）状態であり、これに対し
て治癒はなく、そして有効な治療はわずかしか存在しない。米国において７人中
約１人が、１以上の形態の関節炎を患う。関節炎の大半の形態が、感染、機械的
損傷、または免疫学的障害から生じる関節の慢性炎症によって特徴付けられる。
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、腫脹、疼痛、硬直、および組織破壊によって、関
節において主に顕在化する慢性の炎症性疾患である（Ｈａｒｒｉｓ，１９９０，
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３：９９４−９９６）。全身的な症状発現と
しては、急性期タンパク質の血清レベルの上昇、熱、中程度の貧血、血小板増加
症、および顆粒球増加症が挙げられ得る。罹患した関節では、関節空間内への炎
症性滲出液を伴なう、滑膜の過形成および炎症によって特徴付けられる滑膜炎が
存在し、軟骨および骨の侵食へと導く。

【０００９】慢性関節リウマチは、直接的そして限りなく生命の危機を脅かすものではない
が、近年のデータによって、ＲＡは、寿命の有意な短縮化を生じ、そして健康系
、生産性の損失に起因する全体的な経済、ならびに移動および活動の制限から生
じる生活の質のどれもに対して、莫大な偽性を払うことが示唆されている（Ｓｃ
ｈｉｆｆ，１９９７，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１０２（１Ａ）：１１Ｓ−１５Ｓ）
。

【００１０】ＲＡの処置のために現在一般的に使用される治療は、主に、３つの分類に入る
：非ステロイド性の抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）、疾患調節性抗リウマチ性薬物
（ＤＭＡＲＤ）、および免疫抑制剤。ＮＳＡＩＤは、慢性関節リウマチの第一線
の治療として頻繁に使用される薬物の大きなグループである。この化合物は、主
に、プロスタグランジンおよびトロンボキサンへのアラキドン酸の変換を触媒す
るシクロオキシゲナーゼの遮断を通して作用する。１クラスとして、ＤＭＡＲＤ
（金、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、およびＤ−ペニシラミンのよ
うな薬剤を含む）は、緩慢に作用し、極めて毒性であり、そしてこれらの化合物
のいずれも、根底にある疾患に対して緩和効果を有するという証拠が、ほとんど
存在しない。ＮＳＡＩＤは、関節炎に付随する炎症および疼痛のいくつかの徴候
を緩和し得る；しかし、ＮＳＡＩＤは、免疫系に対して、および関節の破壊およ
び疾患の進行をブロックする際に、効果を有さないようである。免疫抑制剤（例
えば、コルチコステロイドおよびメトトレキサート）は、免疫系を抑制するため
、従って、抗炎症効果を有するために、ＲＡの処置において一般に使用される。
しかし、これらの薬剤は、重大な全身的毒性を引き起こし、この毒性によって、
その使用および有効性を制限している。

【００１１】ＲＡが、免疫に基づく炎症性疾患であることは広く認識されているが、この疾
患を誘発する抗原は、未だ知られていない。このことは、全体として免疫応答系
を調節する試みを含む、前臨床的研究または臨床的研究の下での治療に対する多
数のアプローチへと導いた。この方面にあるいくつかの一般的な試みの例を、以
下に強調する。

【００１２】ＮＳＡＩＤの作用機構は、誘導的形態および構成的形態の両方を有する酵素で
ある、シクロオキシゲナーゼをブロックすることに関連している。誘導的形態の
シクロオキシゲナーゼは、炎症性疾患において上昇するようであるので、この誘
導的形態に対して選択的な化合物に関する研究が進行中である。さらに、進行中
の関節炎を処置するためのワクチンを考案するための試みが、ＭＨＣクラスＩＩ
またはＴ細胞レセプタータンパク質に対するペプチドワクチンを使用して、なさ
れている。一般的に、進行中の疾患に対して投与されたワクチンの効力を実証す
ることは、困難であることが示されている。

【００１３】ＲＡにおける組織崩壊の大半は、種々のメタロプロテイナーゼに起因するよう
である。このグループのプロテアーゼは、関節炎において見られるコラーゲンＩ
Ｉおよびプロテオグリカンの崩壊の中枢であると考えられる。種々のこれらの酵
素の多くのインヒビターが、前臨床的研究または臨床的研究下にある。

【００１４】多くの広範な免疫抑制剤（シクロスポリンＡおよびミコフェノール酸モフェチ
ル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）を含む）が、慢性関節リウ
マチにおける使用について臨床試験されている。広範なサイトカインが、関節炎
の関節において見出されるので、抗関節炎治療は、サイトカイン経路（ＩＬ−１
、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＴＧＦβ、およびＴＮＦαの
経路を含む）、およびケモカイン経路（Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９７）を標的
とした。特に、ＩＬ−１の炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）経路
は、直接的なＩＬ−１の攻撃によって、および天然に存在するインターロイキン
−１レセプターアンタゴニスト分子を介して、の両方で標的とした。

【００１５】ＲＡについての薬物療法の投与方法には、治療用薬物の全身的または局所的送
達が挙げられ、そして提案される遺伝子治療の場合には、治療用遺伝子の全身的
または局所的送達が挙げられることが提案されている。現在までに、このような
処置は、以下を含む種々の理由のために、関節炎についての有効で安全な治療の
送達には達していない：多くの薬物の全身的な副作用、注射された関節および／
または循環からの治療用分子の急速なクリアランス、ＤＮＡの組み込みおよびゲ
ノムからの発現の非効率性、いくつかのウイルス送達ベクターに関連する標的細
胞集団の制限、容易には組み込まないウイルスベクターに関連した一過的な遺伝
子発現、ならびに、遺伝子送達ウイルスに関連した免疫応答の誘導。

【００１６】ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、可溶性ＴＮＦＲおよび抗ＴＮＦ抗体）の使用
によって、ＴＮＦの遮断が、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、接
着分子、および組織崩壊の減少を含む、ＴＮＦに起因する影響を逆転し得ること
が示された（Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９７）。ＴＮＦ単独の遮断に明らかに起
因するこのような多面的な効果は、ＴＮＦが、サイトカイン媒介性事象のカスケ
ードの最初の付近に存在し得ることを示唆する。ＴＮＦ−αレベルの上昇が、Ｒ
Ａ患者の滑液において見出される（ＣａｍｕｓｓｉおよびＬｕｐｉａ，１９９８
，Ｄｒｕｇｓ５５：６１３−６２０）。

【００１７】ハムスター抗マウスＴＮＦ抗体を利用するＴＮＦの遮断の効果を、ＤＢＡ／１
マウスにおけるコラーゲンＩＩ型関節炎のモデルにおいて試験した（Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：
９７８４−９７８８）。疾患の発症後に開始した処置は、フットパッド（ｆｏｏ
ｄｐａｄ）の腫脹、臨床的スコア、および関節破壊の組織病理学における改善を
生じた。他の研究により、抗体（Ｔｈｏｒｂｅｃｋｅら，１９９２，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７３７５−７３７９）またはＴＮ
ＦＲ構築物（Ｈｕｓｂｙら，１９８８，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１：３６３−
７１；Ｔｅｔｔａら，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．４９：６６５−
６６７；Ｗｏｏｌｅｙら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６６０２−
６６０７；Ｐｉｇｕｅｔら，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７７：５１０−
５１４）のいずれかを使用して、類似の結果が得られた。

【００１８】類似の結果はまた、進行中の関節炎の他の動物モデルにおいて得られた。ウサ
ギでは、抗ＴＮＦα抗体が、抗原に誘導された関節炎に対して、抗関節炎効果を
有することが示された（Ｌｅｗｔｈｗａｉｔｅら，１９９５，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕ
ｍ．Ｄｉｓ．５４：３６６−３７４）。ラットでは、抗ＴＮＦ治療が、アジュバ
ント（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）関節炎において（Ｉｓｓｅｋｕｔｚら，１
９９４，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９７：２６−３２）、連鎖球菌性
細胞壁に誘導された関節炎において（Ｓｃｈｉｍｍｅｒら，１９９７，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５９：４１０３−４１０８）、そしてコラーゲンに誘導された関
節炎において（Ｌｅら，１９９７，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．４０：１
６６２−１６６９）有効であると実証された。

【００１９】上記の研究において、ＴＮＦの遮断は、遮断薬の全身的送達によって達成され
た。ラットのコラーゲン関節炎モデルでは、アデノウイルスベクターを使用する
ＴＮＦＲ遺伝子の送達は、このアデノウイルスが活性な関節炎を経験している動
物に与えられた場合に、ＴＮＦＲの血清レベルの一過的な産生（８日間まで）、
および疾患の進行における有意な減少を生じた（Ｌｅら、１９９７）。関節に直
接的に遺伝子を送達する試みは成功したが、アデノウイルスに対する炎症反応を
生じた。

【００２０】メトトレキサートと共にまたは伴なわずに投与された、ＴＮＦαに対するモノ
クローナル抗体（インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ），ＲＥＭＩＣＡＤ
Ｅ，Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）は、ＲＡの処置において臨床的な効力を示した（Ｅｌｌ
ｉｏｔｔら，１９９３，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．３６：１６８１−１
６９０；Ｅｌｌｉｏｔｔら，１９９４，Ｌａｎｃｅｔ３４４：１１０５−１１
１０）。これらのデータは、４、１２、および２６週目に、Ｐａｕｌｕｓの２０
％および５０％の判断基準の有意な減少を示した。この処置は、静脈内に投与さ
れ、そして抗ＴＮＦモノクローナル抗体は、２ヶ月の期間にわたって、循環から
消滅する。この効力の持続期間は、反復用量では減少するようである。患者は、
抗ＴＮＦ抗体に対する抗体を産生し得、この抗体が、この治療の有効性および持
続期間を制限する（Ｋａｖａｎａｕｇｈら，１９９８，Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃ
ｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．２４：５９３−６１４）。インフリキシマブとの組
み合わせにおけるメトトレキサートの投与は、抗インフリキシマブ抗体の発生を
阻止するのに役立つ（Ｍａｉｎｉら，１９９８，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕ
ｍ．４１：１５５２−１５６３）。インフリキシマブはまた、炎症性腸疾患であ
るクローン病の処置において、臨床的な効力を示した（Ｂａｅｒｔら，１９９９
，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１１６：２２−２８）。

【００２１】ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結された、可溶性ヒトＴＮＦＲ（ｐ７５）の組換
えバージョン（ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃ、ＥＮＢＲＥＬ，Ｉｍｍｕｎｅｘ）
の臨床試験によって、その投与が、ＲＡ疾患の活性における有意かつ急速な減少
を生じさせることが示された（Ｍｏｒｅｌａｎｄら，１９９７，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ
．Ｍｅｄ．，３３７：１４１−１４７）。さらに、ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃ
について進行中の小児臨床試験からの予備的な安全性データによって、この薬物
が一般的に、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）を有する患者によって十分に耐容さ
れることが示されている（Ｇａｒｒｉｓｏｎら，１９９８，ＡｍＣｏｌｌｅｇ
ｅｏｆＲｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙｍｅｅｔｉｎｇ，１９９８年１１月９日
，要旨５８４）。

【００２２】上述のように、ＥＮＢＲＥＬは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７
５キロダルトン（ｐ７５）ＴＮＦＲの細胞外リガンド結合部分からなる、二量体
融合タンパク質である。このＥＮＢＲＥＬのＦｃ成分は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメ
イン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含むが、ＣＨ１ドメインは含まない。
ＥＮＢＲＥＬは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系に
おいて産生される。これは、９３４個のアミノ酸からなり、そして約１５０キロ
ダルトンの見かけの分子量を有する（Ｓｍｉｔｈら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：１０１９−１０２３；Ｍｏｈｌｅｒら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５１：１５４８−１５６１；米国特許第５，３９５，７６０号（Ｉｍｍｕ
ｎｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）；同第５，６０５，
６９０号（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）
。

【００２３】米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されたため（１９９８年１１月２日
）、ＥＮＢＲＥＬは現在、１以上の疾患調節性抗リウマチ性薬物（ＤＭＡＲＤ）
に対して不適切な応答を有していた患者において、中程度から重篤な活性慢性関
節リウマチの徴候および症状の減少のために指示されている。ＥＮＢＲＥＬは、
メトトレキサート単独に対しては十分に応答しない患者において、メトトレキサ
ートと組合せて使用され得る。ＥＮＢＲＥＬはまた、１以上のＤＭＡＲＤに対し
て不適切な応答を有していた患者において、中程度から重篤な活性多関節性若年
性関節リウマチの徴候および症状の減少のために指示されている（１９９８年５
月２８日）。ＥＮＢＲＥＬは、皮下注射として、１週間に２回、２５ｍｇでＲＡ
患者に与えられる。

【００２４】現在、ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃ（ＥＮＢＲＥＬ，Ｉｍｍｕｎｅｘ）調製物
を使用する処置（上記の処置を含む）は、１週間に２回、皮下的に投与される。
これは、患者には高価であり、不快であり、そして不便である。「Ｉｍｐｏｒｔ
ａｎｔＤｒｕｇＷａｒｎｉｎｇ」＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ
／ｍｅｄｗａｔｃｈ／ｓａｆｅｔｙ／１９９９／ｅｎｂｒｅｌ．ｈｔｍ＞にて；
「ＮｅｗＷａｒｎｉｎｇＦｏｒＡｒｔｈｒｉｔｉｓＤｒｕｇ，ＥＮＢＲ
ＥＬ」＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｂｂｓ／ｔｏｐｉｃｓ／ＡＮ
ＳＷＥＲＳ／ＡＮＳ００９５４．ｈｔｍｌ＞にて；「ＥＮＢＲＥＬＩｎｊｅｃ
ｔｉｏｎｓＤｉｆｆｉｃｕｌｔｆｏｒＳｏｍｅＰａｔｉｅｎｔｓ」＜ｈ
ｔｔｐ：／／ｄａｉｌｙｎｅｗｓ．ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ／ｈ／ｎｍ／２００００
５１６／ｈｌ／ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＿ｄｒｕｇｓ＿ｌ．ｈｔｍｌ＞にて。さらに
、この処置によってもたらされる緩和は、維持されない。関節炎の状態に付随す
る症状は、ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃでの処置の間は減少するが、この治療の
中断に際して（一般的に、１ヶ月以内に）戻る。合併症（注射の部位での局所的
反応を含む）が生じている。さらに、このＴＮＦαアンタゴニストに対する長期
間の全身曝露は、ウイルス感染および細菌感染、そしてあり得ることには癌の増
加の危険を課し得る。この生成物が、最初に導入されてから、重篤な感染（いく
つかは、死を伴う）が、ＥＮＢＲＥＬを使用する患者において報告されている。
「ＰｒｏｄｕｃｔＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｂ
ｒｅｌ．ｃｏｍ／ｐａｔｉｅｎｔ／ｈｔｍｌ／ｐａｔｐｉ．ｈｔｍ＞にて；「Ｐ
ｒｏｖｅｎＴｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ」＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｂｒｅ
ｌ．ｃｏｍ／ｐａｔｉｅｎｔ／ｈｔｍｌ／ｐａｔｓａｆｅｔｙ．ｈｔｍ＞にて。

【００２５】さらなる関連の参考文献としては、以下が挙げられる：米国特許第５，８５８
，７７５号；同第５，８５８，３５５号；同第５，８５８，３５１号；同第５，
８４６，５２８号；同第５，８４３，７４２号；同第５，７９２，７５１号；同
第５，７８６，２１１号；同第５，７８０，４４７号；同第５，７６６，５８５
号；同第５，６３３，１４５号；国際特許公開ＷＯ９５／１６３５３；ＷＯ
９４／２０５１７；ＷＯ９２／１１３５９；Ｓｃｈｗａｒｚ，１９９８，Ｋｅ
ｙｓｔｏｎｅＳｙｍｐ．，Ｊａｎ．２３−２９，要旨４１２；Ｓｏｎｇら（１
９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２６１５−２６２１；Ｇｈｉｖ
ｉｚｚａｎｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：４６１３−４６１８；Ｋａｎｇら，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ＳｏｃｉｅｔｙＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ２５：５３３−５３７；Ｒｏｂｂ
ｉｎｓら，１９９７，ＤｒｕｇＮｅｗｓ＆Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１０：２８３−
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１９５−１９７；ＭｕｌｌｅｒＬａｄｎｅｒら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５８：３４９２−３４９８；ならびにＰｅｌｌｅｔｉｅｒら，１９９７，
ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ４０：１０１２−１０１９。

【００２６】ＴＮＦ関連障害（例えば、ＲＡ）の処置、特に、維持して制御される治療を提
供し得る処置についての、新規の有効な形態について必要性が存在する。本発明
は、関節炎および他のＴＮＦ関連障害の炎症プロセスの有効かつ持続的な処置の
ための組成物および方法を提供する。

【００２７】本明細書中に引用されるすべての刊行物および参考文献が、それらの全体にお
いて、本明細書中で参考として援用される。

【００２８】（発明の要旨）本発明は、哺乳動物のＴＮＦのレベルを減少させるため、および／またはＴＮ
Ｆ関連障害の処置のための、組成物および方法に関する。この組成物は、一般的
に、ＴＮＦアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ
随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む。この方法は、一般的に、哺乳動物に
ＴＮＦアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを送達するために、ｒＡＡ
Ｖベクターを使用し、これが次いで、ＴＮＦのレベルを減少させ、そして多くの
ＴＮＦ関連障害（例えば、関節炎（ＲＡを含む）、クローン病、ぜん息、および
うっ血性心不全）の緩和を生じさせる。ＴＮＦを低下させることは、次いで、他
の疾患を引き起こすか、または他の疾患に寄与する因子（例えば、他の炎症性サ
イトカイン）のレベルを減少し得る。ＲＡを示す関節において、可溶性ＴＮＦの
レベルを低下させることは、次いで、ＴＮＦ関連状態（例えば、関節炎）を緩和
し得、そして、関節における炎症応答を減少し得る。

【００２９】本明細書中に記載されるｒＡＡＶベクターにおいて好ましい本発明のポリヌク
レオチドは、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）をコードするポリヌクレオチ
ドである。ＴＮＦＲは、可溶性ＴＮＦに結合し得るので、ＴＮＦＲの導入は、循
環および／または罹患した組織（例えば、関節）におけるＴＮＦのレベルを減少
させる傾向がある。いくつかの実施形態では、本発明は、ｐ７５ＴＮＦＲポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ｒＡＡＶベクターを提供する。
他の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、Ｆｃ（免疫グロブリン分子の
定常ドメイン）：ｐ７５融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
。他の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＴＮＦＲの細胞外ドメイン
がＦｃに融合されている、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
む。

【００３０】いくつかの実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターはさらに、ＩＬ−１アン
タゴニスト（例えば、ＩＬ−１レセプターＩＩ型ポリペプチド）をコードするポ
リヌクレオチドを含む。

【００３１】別の局面では、本発明は、哺乳動物におけるＴＮＦレベルを減少させる方法を
提供し、この方法は、ＴＮＦレベルを減少させるために十分な量の本明細書中に
記載される任意のｒＡＡＶベクターを、哺乳動物に投与する工程（すなわち、送
達する工程）を包含する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの送達は
、関節炎の関節内である。いくつかの実施形態では、これらの方法はさらに、Ｔ
ＮＦアンタゴニストを投与する工程を包含する。

【００３２】別の局面では、本発明は、哺乳動物における炎症応答を減少させる方法を提供
し、この方法は、炎症応答を減少させるために十分な量の本明細書中に記載され
る任意のｒＡＡＶベクターを、哺乳動物に投与する工程（すなわち、送達する工
程）を包含する。いくつかの実施形態では、これらの方法はさらに、ＴＮＦアン
タゴニストを投与する工程を包含する。

【００３３】別の局面では、本発明は、ＴＮＦ関連障害（例えば、哺乳動物において生じる
関節炎状態）を緩和する方法を提供し、この方法は、この障害（例えば、関節炎
状態）を緩和させるために十分な量の本明細書中に記載される任意のｒＡＡＶベ
クターを、哺乳動物に投与する工程（すなわち、送達する工程）を包含する。い
くつかの実施形態では、これらの方法はさらに、ＴＮＦアンタゴニストを投与す
る工程を包含する。

【００３４】（詳細な説明）本発明者らは、組織、特定の解剖学的部位および／または個体の循環における
ＴＮＦのレベルを減少させるための組成物および方法、ならびにＴＮＦレベルを
低下させるための方法およびＴＮＦ関連障害を緩和するための方法を発見した。
ＴＮＦ活性のレベルを減少させることによって被験体における炎症応答を減少さ
せるための方法が含まれる。

【００３５】本明細書中に記載される発明は、哺乳動物におけるＴＮＦアンタゴニストをコ
ードするポリヌクレオチドの送達、およびこのポリヌクレオチドの発現における
使用のための物質および方法を提供する。ＴＮＦアンタゴニストをコードするポ
リヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを介して哺
乳動物に送達され、このベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ｒＡＡ
ＶＤＮＡの細胞への導入は、一般的に、細胞の正常な代謝を乱すことなくＤＮ
Ａの長期にわたる持続および発現に導く。従って、本発明は、ＴＮＦアンタゴニ
ストの連続的な供給源およびＴＮＦアンタゴニストの哺乳動物への投与の継続を
提供する。このことは、以前に記載された、一過性の利点を与えるのみの処置様
式（すなわち、治療剤の外来投与）に対して異なり、そして顕著な利点である。

【００３６】（定義）明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、お
よび「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の参照を含む。例
えば、用語「細胞」は、複数の細胞を含み、それらの混合物を含む。

【００３７】本明細書中で使用される場合、「ＴＮＦアンタゴニスト」は、ＴＮＦに結合し
、以下のいずれかに挙げられるＴＮＦ−レセプターへのＴＮＦ結合の際に反映さ
れるようなＴＮＦ活性を阻害し、および／または妨害するポリペプチドをいう：
（ａ）ＴＮＦＲ、好ましくは内因性（すなわち、個体または宿主に対してネイテ
ィブ）の細胞膜結合ＴＮＦＲ；（ｂ）ＴＮＦＲの細胞外ドメイン；および／また
は（ｃ）ＴＮＦＲのＴＮＦ結合ドメイン（これは、細胞外ドメインの一部分であ
り得る）。ＴＮＦアンタゴニストには、ＴＮＦレセプター（または、本明細書に
記載されるようなその適切な部分）および抗ＴＮＦ抗体が挙げられるが、これら
に限定されない。本明細書中で使用される場合、ＴＮＦアンタゴニストの「生物
学的活性」は、ＴＮＦに結合し、そして以下のいずれかに結合することからＴＮ
Ｆを阻害し、および／または妨害することである：（ａ）ＴＮＦＲ、好ましくは
内因性の細胞膜結合ＴＮＦＲ；（ｂ）ＴＮＦＲの細胞外ドメイン；および（ｃ）
ＴＮＦＲのＴＮＦ結合ドメイン（これは、細胞外ドメインの一部分であり得る）
。ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ活性およびその阻害を測定するために当該分
野で公知のアッセイを使用して生物学的活性を示すことが示され得、この例は、
本明細書中に提供される。

【００３８】「ＴＮＦ関連障害」は、ＴＮＦの上昇したレベルと関連するか、その上昇した
レベルから生じるか、および／またはその上昇したレベルに応答して起こる障害
または疾患である。このような障害は、ＴＮＦ活性の偶発的もしくは慢性的なレ
ベル上昇および／またはＴＮＦ活性の局所的もしくは全身的増加と関連し得る。
このような障害には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炎症性疾患
（例えば、関節炎および炎症性腸疾患）、ならびにうっ血性心不全。

【００３９】本明細書中で使用される場合、用語「ＴＮＦレセプターポリペプチド」および
「ＴＮＦＲポリペプチド」は、ＴＮＦを結合し得るＴＮＦＲ（任意の種由来の）
由来のポリペプチドをいう。２つの異なる細胞表面ＴＮＦＲが記載されている：
ＩＩ型ＴＮＦＲ（またはｐ７５ＴＮＦＲもしくはＴＮＦＲＩＩ）およびＩ型
ＴＮＦＲ（またはｐ５５ＴＮＦＲもしくはＴＮＦＲＩ）。成熟した全長ヒ
トｐ７５ＴＮＦＲは、約７５〜８５キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有する糖
タンパク質である。成熟全長ヒトｐ５５ＴＮＦＲは、約５５〜６０ｋＤの分子
量を有する糖タンパク質である。本発明の好ましいＴＮＦＲポリペプチドは、Ｔ
ＮＦＲＩ型および／またはＴＮＦＲＩＩ型由来である。

【００４０】ＴＮＦＲポリペプチド（例えば、「ＴＮＦＲ」、「ＴＮＦＲ；Ｆｃ」など）は
、本発明の文脈およびそれについての組成物において議論される場合、それぞれ
のインタクトなポリペプチド（例えば、ＴＮＦＲインタクト）、あるいは所望さ
れる生物学的活性（すなわち、ＴＮＦへの結合）を示す、その任意のフラグメン
トまたは誘導体（例えば、アミノ酸配列誘導体）をいう。「ＴＮＦＲポリヌクレ
オチド」は、ＴＮＦＲポリペプチド（例えば、ＴＮＦＲ：Ｆｃポリペプチド）を
コードする任意のポリヌクレオチドである。

【００４１】本明細書中で使用される場合、ＴＮＦＲの「細胞外ドメイン」は、ＴＮＦＲの
アミノ末端とＴＮＦＲ膜貫通領域のアミノ末端との間に見出されるＴＮＦＲの部
分をいう。このＴＮＦＲの細胞外ドメインは、ＴＮＦに結合する。

【００４２】本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１アンタゴニスト」は、インターロイ
キン１（ＩＬ−１）に結合し、以下のいずれかに挙げられるＩＬ−１レセプター
へのＩＬ−１結合の際に反映されるようなＩＬ−１活性を阻害し、および／また
は妨害するポリペプチドをいう：（ａ）ＩＬ−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ）、好
ましくは内因性（すなわち、個体または宿主に対してネイティブ）の細胞膜結合
ＩＬ−１Ｒ；（ｂ）ＩＬ−１Ｒの細胞外ドメイン；および／または（ｃ）ＩＬ−
１ＲのＩｌ−１結合ドメイン（これは、細胞外ドメインの一部分であり得る）。
ＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１レセプター（または、本明細書に記載さ
れるようなその適切な部分）および抗ＩＬ−１抗体が挙げられるが、これらに限
定されない。本明細書中で使用される場合、ＩＬ−１アンタゴニストの「生物学
的活性」は、ＩＬ−１に結合し、そして以下のいずれかに結合することからＩＬ
−１を阻害し、および／または妨害することである：（ａ）ＩＬ−１Ｒ、好まし
くは内因性の細胞膜結合ＩＬ−１Ｒ；（ｂ）ＩＬ−１Ｒの細胞外ドメイン；およ
び／または（ｃ）ＩＬ−１ＲのＩＬ−１結合ドメイン（これは、細胞外ドメイン
の一部分であり得る）。ＩＬ−１アンタゴニストは、当該分野で公知のアッセイ
を使用して生物学的活性を示すことが示され得、これらのアッセイには、ＩＬ−
１阻害アッセイが含まれ、これらは、本明細書および当該分野において記載され
る。

【００４３】本明細書中で使用される場合、用語「ＩＬ−１レセプターポリペプチド」は、
ＩＬ−１に結合し得るＩＬ−１レセプター（任意の種からの）由来のポリペプチ
ドをいう。ＩＬ−１Ｒポリペプチドは、本発明の文脈およびそれについての組成
物において議論される場合、各々のインタクトなポリペプチド（例えば、インタ
クトなＩＬ−１Ｒ）あるいは、それらの任意のフラグメントまたは誘導体（例え
ば、アミノ酸配列誘導体）（所望される生物学的活性（すなわち、ＩＬ−１への
結合）を示す）をいう。「ＩＬ−１Ｒポリヌクレオチド」は、ＩＬ−１Ｒポリペ
プチドをコードする任意のポリヌクレオチドである。

【００４４】本明細書中で使用される場合、ＩＬ−１Ｒの「細胞外ドメイン」は、ＩＬ−１
Ｒのアミノ末端とＩＬ−１Ｒ膜貫通領域のアミノ末端との間に見出されるＩＬ−
１Ｒの部分をいう。ＩＬ−１Ｒの細胞外ドメインは、ＩＬ−１に結合する。

【００４５】用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で
互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。この用語はまた
、改変されたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グ
リコシル化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）または標識化成分との結合体化。

【００４６】「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、天然に存在する位置
とは異なる位置において領域を含むポリペプチドである。この領域は、個別のタ
ンパク質に通常存在し得、そしてキメラポリペプチドまたは融合ポリペプチド中
に一緒にもたらされるか、あるいはそれらは、同じタンパク質に通常存在し得る
が、キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチド中に新しい配置で配置される。
キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドはまた、直鎖または分枝であろうと
、ＴＮＦＲポリペプチドのポリマー形態から生じ得る。

【００４７】用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書中で互換可能に使用さ
れ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態（デオキシリボヌクレオチドまた
はリボヌクレオチド、あるいはそれらのアナログを含む）をいう。ポリヌクレオ
チドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド
アナログ）を含み得、そして非ヌクレオチド成分によって、中断（ｉｎｔｅｒｒ
ｕｐｔ）され得る。存在するならば、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーのア
センブルの前、またはその後に行われる。用語ポリヌクレオチドは、本明細書中
で使用される場合、二本鎖または一本鎖の分子を、互換可能にいう。他に特定ま
たは要求されない限り、ポリヌクレオチドである、本明細書中に記載の本発明の
任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を作り出すことが既知または
予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。

【００４８】「キメラポリヌクレオチド」または「融合ポリヌクレオチド」は、天然に生じ
る、異なる位置における領域を含むポリヌクレオチドである。この領域は、個別
の遺伝子に通常存在し得、そしてキメラポリヌクレオチドまたは融合ポリヌクレ
オチド中に一緒にもたらされるか、あるいはそれらは同じ遺伝子に通常存在し得
るが、キメラポリヌクレオチドまたは融合ポリヌクレオチド中に新しい配置で配
置される。

【００４９】「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスに対する略語であり、そしてウイルス自体
またはその誘導体をいうために使用され得る。この用語は、他を必要とされる場
合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態
の両方を包含する。

【００５０】本明細書中で使用される場合、「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＶＶ起源ではない
ポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種であるポリヌクレオチド
）、代表的に、細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクター
をいう。異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、好ましくは２つのＡＡＶ逆
方向末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される。本明細書中で使用される場合
、ｒＡＡＶベクターは、任意の多くの形態であり得、プラスミド、線状人工染色
体、脂質との複合体化、リポソーム内でのカプセル化、および最も好ましくは、
ウイルス粒子、特にＡＡＶ中でのキャプシド形成化が挙げられるが、これらに限
定されない。

【００５１】「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つの
ＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク
質の全てによる）とキャプシド化ｒＡＡＶとからなるウイルス粒子をいう。

【００５２】「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子のアセンブリおよびキ
ャプシド形成を生じる一連の細胞内事象をいう。

【００５３】ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およ
びキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をいう。それら
は、試験された全てのＡＡＶ血清型において見出され、そして本明細書中以下お
よび当該分野において記載される。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書中
において、ＡＡＶ「パッケージング遺伝子」といわれる。

【００５４】ＡＡＶについての「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶが哺乳動物細胞によって複
製されること、そしてパッケージングされることを可能にするウイルスをいう。
ＡＡＶについての種々のこのようなヘルパーウイルスは当該分野で公知であり、
これには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス（例え
ば、ワクシニア）が挙げられる。アデノウイルスは、多くの異なるサブグループ
を含むが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒ
ト、非ヒト哺乳動物および鳥類起源の多くのアデノウイルスが公知であり、ＡＴ
ＣＣのような寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば
、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ
）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲ
Ｖ）が挙げられ、これらもまたＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。

【００５５】「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、ウイルス種が栄養性である細胞に
送達され得るポリヌクレオチド成分を含むものである。この用語は、ウイルスの
任意の複製能力を必ずしも意味しない。感染性ウイルス粒子を計測するためのア
ッセイが当該分野で説明されている。

【００５６】「複製能力のある」ウイルス（例えば、複製能力のあるＡＡＶ、これは、とき
どき、「ＲＣＡ」と略される）は、感染性である、表現型的に野生型のウイルス
であり、そしてまた、感染細胞において複製され得る（すなわち、ヘルパーウイ
ルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）。ＡＡＶの場合において、複製能
力は、一般に、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。本明細
書中に記載される好ましいｒＡＡＶベクターは、１以上のＡＡＶパッケージング
遺伝子の欠失のために、哺乳動物細胞において（特に、ヒト細胞において）複製
不能である。好ましくは、このようなｒＡＡＶベクターは、ＲＣＡが、ＡＡＶパ
ッケージング遺伝子とｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって生成される可能
性を最小にするために、全てのＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠失する。

【００５７】「遺伝子」は、転写および翻訳の後に特定のタンパク質をコードし得る、少な
くとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。

【００５８】「組換え体」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、
クローニング、制限または連結工程の種々の組み合わせの、および他の手順（天
然に見出されるポリヌクレオチドから区別される構築物を生じる）の産物である
ことを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒
子である。この用語は、それぞれ、本来のポリヌクレオチド構築物の複製物およ
び本来のウイルス構築物の子孫を含む。

【００５９】「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの機能的調節（
ポリヌクレオチドの複製、重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写、スプライシ
ング、翻訳、または分解）に寄与する分子の相互作用に関係するヌクレオチド配
列である。この調節は、プロセスの頻度、速度または特異性に影響し得、そして
天然で、増強または阻害し得る。当該分野で公知の制御エレメントには、例えば
、転写制御配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）が挙げられる。プ
ロモーターは、特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてプロモ
ーターから下流（３’方向）に通常位置するコード領域の転写を開始し得る、Ｄ
ＮＡ領域である。

【００６０】「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」は、遺伝子エレメン
トの並置をいい、ここで、これらのエレメントは、それらが期待された様式で作
動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターは、プロモーターが
、コード配列の転写を開始することを補助する場合、コード領域に作動可能に連
結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域と
の間に介在性残基が存在し得る。

【００６１】「異種」は、それが比較される実体の残りの実体から遺伝子型的に区別される
実体由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって、異なる種由来
のプラスミドまたはベクターに導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレ
オチドである。そのネイティブのコード配列から取り出され、そして連結される
ことが天然には見出されていないコード配列に作動可能に連結されるプロモータ
ーは、異種プロモーターである。

【００６２】「遺伝子改変」は、遺伝子エレメントが、有糸分裂または減数分裂以外によっ
て、細胞に導入されるプロセスをいう。このエレメントは、細胞に対して異種で
あり得るか、またはそれは、細胞内に既に存在するエレメントのさらなるコピー
または改良されたバージョンであり得る。遺伝子改変は、例えば、当該分野で公
知の任意のプロセス（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱
、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触）を介して、細胞を組換
えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって
もたらされ得る。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスある
いはウイルスベクターでの形質導入または感染によってもたらされ得る。好まし
くは、この遺伝子エレメントは、細胞中の染色体またはミニ染色体（ｍｉｎｉ−
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）に導入され得る；しかし、細胞の表現型および／または
遺伝子型ならびにその子孫を変化させる任意の改変は、この用語に含まれる。

【００６３】細胞は、配列が、細胞のインビトロでの長期培養の間にその機能を実施するた
めに利用可能である場合、遺伝子配列で「安定に」改変されているか、形質導入
されているか、または形質転換されているといわれる。好ましい例において、遺
伝子改変が導入されているという点で、このような細胞は、「遺伝的に」改変さ
れ、この遺伝子改変はまた、改変された細胞の子孫によって、遺伝可能である。

【００６４】ポリヌクレオチドの細胞への「安定な組込み」は、ポリヌクレオチドが、細胞
中に安定に維持される傾向にあるレプリコンへ組み込まれていることを意味する
。プラスミドのようなエピソームは、時折、多くの世代で維持され得るが、エピ
ソームに保持される遺伝物質は、一般に、染色体組込み物質より欠失に対して感
受性である。しかし、ポリヌクレオチドの維持は、しばしば、選択マーカーをポ
リヌクレオチドへの組込むか、またはポリヌクレオチドに隣接させること、次い
で、選択圧下でポリヌクレオチドを保有する細胞を維持することによって、行わ
れ得る。いくつかの場合において、配列は、それらが染色体に組込まれた状態に
なるまで、有効に、安定に維持され得ない；そして、従って、選択マーカーを含
む配列の維持のための選択は、マーカーが染色体に安定に組込まれている細胞の
選択を生じ得る。抗生物質耐性遺伝子は、当該分野で周知のように、このような
選択マーカーとして、好都合に使用され得る。典型的に、安定に組込まれたポリ
ヌクレオチドは、平均して、少なくとも約２０世代、好ましくは少なくとも約１
００世代、なおさらに好ましくは、永久に維持されることが期待される。真核生
物染色体のクロマチン構造はまた、組込みポリヌクレオチドの発現のレベルに影
響し得る。安定に維持されたエピトーム上に保有される遺伝子を有することは、
特定の遺伝子の複数の安定に維持されたコピーを有することが所望される場合に
、特に有用であり得る。本発明の文脈において特に所望される特性を有する安定
な細胞株の選択は、以下に記載され、そして例示される。

【００６５】「単離された」プラスミド、ウイルス、または他の物質は、その物質または類
似の物質が、天然に生じるか、または調製がもともと由来した場所に同様に存在
し得る他の成分の少なくともいくつかを欠損する物質の調製物をいう。従って、
例えば、単離された物質は、供給源混合物からそれを富化するために、精製技術
を使用することによって調製され得る。富化は、溶液の容積当たりの重量のよう
な、絶対基準に対して測定され得るか、または供給源混合物に存在する、第二の
潜在的に妨害性の物質に関連して測定され得る。本発明の実施形態の富化を増加
させることは、ますますより好ましい。従って、例えば、２倍の富化が好ましく
、１０倍の富化がより好ましく、１００倍の富化がより好ましく、１０００倍の
富化がなおより好ましい。

【００６６】ｒＡＡＶの調製物は、感染性ヘルパーウイルス粒子に対する感染性ｒＡＡＶ粒
子の比が、少なくとも約１０²：１；好ましくは少なくとも約１０⁴：１、より好
ましくは少なくとも約１０⁶：１；なおより好ましくは少なくとも約１０⁸：１で
ある場合、ヘルパーウイルスを、「実質的に含まない」といわれる。調製物はま
た、好ましくは、等しい量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘ
ルパーウイルス粒子不純物が、崩壊形態で存在する場合、ヘルパーウイルスのこ
のようなレベルの結果として存在するようなタンパク質）を含まない。ウイルス
および／または細胞タンパク質夾雑物は、一般に、ＳＤＳゲル上のクマシー染色
バンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ
３に対応するもの以外のバンドの出現）として観測され得る。

【００６７】「宿主細胞」は、ベクターまたはポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質
の組む込みのためのレシピエントであり得るか、またはレシピエントであった個
々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が得げら
れるが、この子孫は、天然の変異、偶発的な変異、または意図的な変異に起因し
て、本来の親細胞と必ずしも完全に同一（形態において、または全ＤＮＡ相補体
のゲノムにおいて）である必要はない。宿主細胞は、インビボで、本発明のポリ
ヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞を含む。

【００６８】「形質転換」または「トランスフェクション」とは、宿主細胞への外因性ポリ
ヌクレオチドの挿入をいい、これは、この挿入に使用される方法（例えば、リポ
フェクション、形質導入、感染またはエレクトロポレーション）には関わらない
。その外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、プラスミド）
として維持され得るし、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。

【００６９】「個体」または「被験体」とは、脊椎動物（特に、哺乳動物種のメンバー）を
いい、家庭内動物、競技用動物（ｓｐｏｒｔｓａｎｉｍａｌ）、齧歯類および
霊長類（ヒトを含む）を含むがこれらに限定されない。

【００７０】「有効量」とは、有益な結果または所望の臨床結果をもたらすに十分な量であ
る。有効量は、１回以上の投与にて投与され得る。本発明の目的のために、「有
効量」とは、以下のうちのいずれかを達成する量である：ＴＮＦレベルの減少；
炎症応答の減少；および／または疾患状態の進行における緩和、改善、安定化、
逆転、緩化または遅延。

【００７１】本明細書中で使用される場合、「組み合わせて」とは、１つの処置様式を別の
処置様式に加えて投与することをいい、例えば、被験体へのｒＡＡＶの送達に加
えて、同じ被験体にＴＮＦアンタゴニストを投与すること、または同じ被験体に
２つの異なるｒＡＡＶベクターを投与することである。このように、「組み合わ
せて」とは、被験体に１つの処置様式を送達する前、間または後に、別の処置様
式を投与することをいう。

【００７２】「関節炎状態」とは、関節（単数または複数）の炎症により特徴付けられる状
態をいうことが、当該分野で十分に理解されている用語である。

【００７３】本明細書中で使用される場合、「処置」とは、有益な臨床結果または所望の臨
床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な臨床結果
または所望の臨床結果としては、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定し
た（すなわち、悪化しない）状態、疾患の伝播を防ぐこと、疾患進行の遅延また
は緩化、疾患状態の緩和または改善、および緩解（部分的であろうと全体的であ
ろうと）、（検出可能であろうかまたは検出不能であろうと）が挙げられるが、
これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合の予想生存と
比較した場合に延長する生存を意味し得る。例えば、個体の処置は、ＴＮＦレベ
ルの上昇と関連した病理を減少または限定するように行われ得、このような病理
としては、遺伝性遺伝子欠損または誘導性遺伝子欠損、ウイルス生物による感染
、細菌生物による感染または寄生生物による感染、新形成状態または形成不全状
態、あるいは自己免疫のような免疫系機能不全が挙げられるが、これらに限定さ
れない。処置は、予防的または治療的のいずれかに実施され得；すなわち、病理
事象の開始あるいは病因因子との接触の前または後のいずれかに実施され得る。

【００７４】「生物学的サンプル」は、個体から得られる種々のサンプル型を包含しかつ診
断アッセイまたはモニタリングアッセイにて使用され得る。この定義は、血液及
び生物学的起源の他の液体サンプル、生検標本もしくは組織培養物あるいはそれ
ら由来の細胞のような固体組織サンプル、およびこれらの子孫を包含する。この
定義はまた、入手した後に何らかの様式で操作された（例えば、特定の成分（例
えば、タンパク質またはポリヌクレオチド）について試薬での処理、可溶化、ま
たは濃縮によって）サンプルを含む。用語「生物学的サンプル」とは、臨床サン
プルを包含し、そしてまた培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、
生物学的流体、および組織サンプルを包含する。

【００７５】疾患を「緩和する」とは、本発明のｒＡＡＶベクターを投与しないことと比較
して、疾患状態の程度および／もしくは望ましくない臨床発現が弱められること
、そして／あるいは進行の時間経過が緩化または延長されることを意味する。

【００７６】（一般的技術）本発明の実施は、他のように示されない限り、当業者の範囲内にある分子生物
学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の従来技術を使用する。このような
技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」第２版（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｌ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９）；「Ａｎｉｍａｌ
ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｊ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｇ
ｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣ
ｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；
「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ
ｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒ
ｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ」（ＪｏｈｎＥＣ
ｏｌｉｇａｎら編、ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９５）；ならびに「Ｐｒｏ
ｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａ
ｃｔｉｃｅ」（ＲｏｂｅｒｔＫ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ、１９９４）を参照のこと。

【００７７】（ＴＮＦアンタゴニストの送達のためのｒＡＡＶベクター）本発明は、被験体においてＴＮＦのレベルを減少するための組換えＡＡＶ（ｒ
ＡＡＶ）ベクターを提供する。この減少は、身体中のどこででも（例えば、組織
、特定の解剖学的部位および／または循環において）生じ得る。一般的には、こ
れらのｒＡＡＶベクターは、ＴＮＦアンタゴニストをコードするポリヌクレオチ
ドを含む。好ましくは、このＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦＲまたはＴＮＦＲ
ポリペプチド（その生物学的に活性な誘導体を含む）である。本発明において、
好ましいＴＮＦＲは、ｐ７５ＴＮＦＲに由来する。

【００７８】本発明のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムの塊を通常構成するＡＡＶｒｅ
ｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の代わりに、目的の異種（すなわち、非Ａ
ＡＶ）ポリヌクレオチドを含む。しかし、野生型ＡＡＶゲノムにおける場合、こ
の異種ポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは２つの
ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する。ｒＡＡＶ構築物が１つだけの
（代表的には改変された）ＩＴＲに隣接する変異が、当該分野にて記載されてお
り、そして本発明と関係して使用され得る。

【００７９】（ＴＮＦアンタゴニスト）本発明において、ＴＮＦアンタゴニストは、個体、好ましくは哺乳動物、最も
好ましくはヒトに、ＴＮＦアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドの発現
産物として供給される。ＴＮＦアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドは
、ｒＡＡＶベクターの形態で哺乳動物に送達される。規定されるように、このよ
うなＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦに結合する任意のポリペプチドであり得、
これらとしては、ＴＮＦＲポリペプチドおよび抗ＴＮＦ抗体が挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【００８０】ＴＮＦアンタゴニストは、ｒＡＡＶベクターを受ける細胞により分泌され；好
ましくはそのＴＮＦアンタゴニストは可溶性である（すなわち、細胞に結合して
いない）。例えば、可溶性ＴＮＦアンタゴニストは、膜貫通領域を欠き、そして
細胞から分泌される。膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を同定
および除去するための技術は、当該分野で公知である。

【００８１】好ましくは、このＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦＲポリペプチドである。Ｔ
ＮＦＲポリペプチドは、インタクトなＴＮＦＲ（好ましくはｒＡＡＶを受けるの
と同じ種に由来する）であってもＴＮＦＲの適切なフラグメントであってもよい
。米国特許第５，６０５，６９０号は、本発明における使用に適切なＴＮＦＲポ
リペプチドの例（可溶性ＴＮＦＲポリペプチドを含む）を提供する。好ましくは
、このＴＮＦＲポリペプチドは、ＴＮＦＲの細胞外ドメインを含む。より好まし
くは、このＴＮＦＲポリペプチドは、免疫グロブリン分子の定常ドメインに連結
したＴＮＦＲの細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであり；なおより好まし
くは、このＴＮＦＲポリペプチドは、ＩｇＧ分子の定常ドメインに連結したｐ７
５ＴＮＦＲの細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドである。好ましくは、ヒ
トへの投与が意図される場合、融合タンパク質に使用されるＩｇはヒトＩｇであ
り、好ましくはヒトＩｇＧ１である。

【００８２】ＴＮＦＲポリペプチドの単価形態および多価形態が、本発明において使用され
得る。ＴＮＦＲポリペプチドの多価形態は、１つより多くのＴＮＦＲ結合部位を
保有する。ＴＮＦＲポリペプチドの多価形態は、ｒＡＡＶベクター中に、例えば
、ＴＮＦ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの反復連結（各反復がリン
カー領域により隔てられている）を介して、コードされ得る。好ましくは、本発
明のＴＮＦＲは、ＴＮＦＲの二価形態または二量体形態である。例えば、米国特
許第５６，０５，６９０号およびＭｏｈｌｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５１：１５４８〜１５６１に記載されるような、免疫グロブリン重鎖また
は軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインの代わりに置換されたＴＮＦＲ細胞
外ドメインを有する、キメラ抗体ポリペプチドが、本発明のためのＴＮＦＲポリ
ペプチドを提供する。一般的に、このようなキメラＴＮＦＲ：抗体ポリペプチド
が細胞により産生される場合、そのポリペプチドは、免疫グロブリンドメイン間
のジスルフィド結合を介して二価分子を形成する。このようなキメラＴＮＦＲ：
抗体ポリペプチドは、ＴＮＦＲ：Ｆｃと呼ばれる。

【００８３】ＴＮＦＲポリペプチド構築物であるｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃは、本発明の
ＴＮＦアンタゴニストの好ましい実施形態である。ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃ
のポリペプチド配列は、図１に示される。このＴＮＦアンタゴニストのコード配
列は、米国特許第５，６０５，６９０号に記載されるようなプラスミドｐＣＡＶ
ＤＨＦＲｈｕＴＮＦＲＦｃに見出される。このｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃポリ
ペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドが、本発明における使用に適切で
ある。ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃをコードするポリヌクレオチド配列は、図２
に示される。

【００８４】本発明において、さらなるＴＮＦＲポリペプチド配列としては、米国特許第５
，３９５，７６０号の図２および３に示される配列が挙げられるが、これらに限
定されない。

【００８５】ＴＮＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知のＴ
ＮＦＲポリヌクレオチド配列から、当該分野で公知の方法を使用して作製され得
る。本発明において、ＴＮＦＲポリペプチドをコードする好ましいポリヌクレオ
チド配列としては、米国特許第５，３９５，７６０号および同第５，６０５，６
９０号ならびにＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３２３１５（ヒトＴＮＦＲ）およびＭ
５９３７８（マウスＴＮＦＲＩ）に見出されるＴＮＦＲポリヌクレオチド配列が
挙げられるが、これらに限定されない。本発明における使用に適切なポリヌクレ
オチドは、標準的合成方法および組換え方法を使用して合成され得る。

【００８６】ＴＮＦアンタゴニスト活性を評価するための方法は、当該分野で公知であり、
そして本明細書中に例示されている。例えば、ＴＮＦアンタゴニスト活性は、細
胞に基づく競合結合アッセイを用いて評価され得る。このようなアッセイにおい
て、放射性標識したＴＮＦが、系列希釈したＴＮＦアンタゴニストと、および細
胞膜結合ＴＮＦＲを発現する細胞と、混合され得る。この懸濁物の一部が遠心分
離されて、遊離ＴＮＦおよび結合ＴＮＦが分離され、そして遊離画分および結合
画分中の放射能の量が決定される。ＴＮＦアンタゴニスト活性は、そのＴＮＦア
ンタゴニストの存在下での細胞へのＴＮＦ結合の阻害により評価される。

【００８７】別の例として、ＴＮＦアンタゴニストは、バイオアッセイにおいてインビトロ
でＴＮＦ活性を中和する能力について分析され得、このバイオアッセイは、標的
細胞として、ＴＮＦの細胞傷害活性に感受性の細胞（例えば、Ｌ９２９細胞（例
えば、実施例３を参照のこと））を使用する。このようなアッセイにおいて、Ｔ
ＮＦと共に培養された標的細胞が、種々の量のＴＮＦアンタゴニストで処理され
、その後、細胞溶解について試験される。ＴＮＦアンタゴニスト活性は、そのＴ
ＮＦアンタゴニストの存在下でのＴＮＦ誘導性標的細胞溶解における減少により
評価される。

【００８８】本発明はまた、インターロイキン１（ＩＬ−１）アンタゴニストをコードする
ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶベクターを提供する。サイトカインＩＬ−１は
、ＲＡの早期疾患段階および後期疾患段階の両方における中心的媒介因子として
見なされている（Ｊｏｏｓｔｅｎら、１９９６、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕ
ｍ．３９：７９７〜８０９）。ＲＡにおいて、ＩＬ−１は、罹患した関節におけ
る炎症細胞の浸潤および軟骨破壊に関与するようである。ＲＡに罹患した患者に
おけるＩＬ−１アンタゴニストを用いた臨床試験は、ＩＬ−１活性をブロックす
ることが、ＲＡ症状の緩和を生じ得ることを示した（Ｃａｍｐｉｏｎら、１９９
６、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．３９：１０９２〜１１０１；Ｂｒｅｓｎ
ｉｈａｎら、１９９６、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．３９：Ｓ７３）。マ
ウス関節炎モデルにおいて、抗ＴＮＦ−α／抗ＩＬ−１の併用処置は、炎症の減
少および関節軟骨損傷の減少の両方をもたらした（Ｋｕｉｐｅｒら、１９９８、
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１０：６９０〜７０２）。

【００８９】ＩＬ−１およびＴＮＦは、ＲＡの異なる局面を媒介するようであるので、本発
明は、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃ）およびＩ
Ｌ−１アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを提供する
（すなわち、このｒＡＡＶベクターは、ＴＮＦアンタゴニストおよびＩＬ−１ア
ンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む）。本発明はまた、ＩＬ−１
アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶベクターを提供す
る。好ましくは、このＩＬ−１アンタゴニストは、ＩＬ−１レセプター（ＩＬ−
１Ｒ）であるか、または所望の生物学的活性（すなわち、ＩＬ−１への結合）を
示すＩＬ−１Ｒポリペプチド（その生物学的に活性な誘導体を含む）である。好
ましくは、このＩＬ−１Ｒは、ＩＬ−１ＲＩＩ型に由来する。本発明において
、好ましいＩＬ−１Ｒポリペプチド配列としては、図３に示される配列、および
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７４６４９および米国特許第５，３５０，６８３号に
見出されるＩＬ−１Ｒの配列が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ−１
Ｒポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドが、本発明における使用に
適切である。好ましいＩＬ−１Ｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列は、図３に示される。本発明における使用に適切なポリヌクレオチドは、標準
的合成法および組換え法を使用して合成され得る。

【００９０】ＩＬ−１アンタゴニスト活性を評価するための方法は、当該分野で公知である
。例えば、ＩＬ−１アンタゴニスト活性は、ＴＮＦアンタゴニストについて本明
細書中に記載されるような、細胞に基づく競合結合アッセイを用いて評価され得
る。別の例として、ＩＬ−１アンタゴニスト活性は、ＩＬ−１についてのバイオ
アッセイにおいてインビトロでＩＬ−１活性を中和する能力について評価され得
る。このようなアッセイにおいて、ＩＬ−１での処理に応答してインターロイキ
ン２（ＩＬ−２）を産生する細胞株（例えば、ＥＬ−４ＮＯＢ−１）が、使用
される。このＩＬ−１応答性細胞株は、ＩＬ−２感受性細胞株（例えば、ＣＴＬ
Ｌ−２）と組み合わせて使用される。このＩＬ−２感受性細胞株の増殖は、ＩＬ
−２を産生するＩＬ−１応答性細胞株に依存し、従って、そのＩＬ−１応答性細
胞株のＩＬ−１刺激の指標として使用される。ＩＬ−１アンタゴニスト活性は、
このようなＩＬ−１バイオアッセイにおいてＩＬ−１活性を中和するその能力に
より評価される（Ｇｅａｒｉｎｇら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ９９：７〜１１；Ｋｕｉｐｅｒら、１９９８）。

【００９１】好ましい実施形態において、本発明のベクターは、ｒＡＡＶウイルス粒子にキ
ャプシド化される。従って、本発明は、本明細書中に記載されるベクターのいず
れかを含むｒＡＡＶウイルス粒子（組換えポリヌクレオチドを含むので組換え体
）を含む。このような粒子を産生する方法は、下記に記載される。

【００９２】本発明はまた、本明細書中に記載されるｒＡＡＶベクター（および／またはｒ
ＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶウイルス粒子）のいずれかを含む組成物を提供す
る。これらの組成物は、ＴＮＦのレベルの減少から利益を受け得る個体への投与
に特に有用である。

【００９３】一般的に、ＴＮＦレベルを減少させる際の使用のための本発明の組成物は、Ｔ
ＮＦアンタゴニストをコードするｒＡＡＶベクターの有効量を、好ましくは薬学
的に受容可能な賦形剤中に含む。当該分野で周知であるように、薬学的に受容可
能な賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性な物質であ
り、そして液体溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、あるいは使用
前に液体に溶解もしくは懸濁するに適切な固体形態として、供給され得る。例え
ば、賦形剤は、形態または粘稠度を提供し得、あるいは希釈剤として作用し得る
。適切な賦形剤としては、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、種々の浸透圧モル濃
度用の塩、カプセル化剤、および緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない
。非経口薬物送達および経口薬物送達のための賦形剤および処方物は、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版
、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）に示される。

【００９４】一般的に、これらのｒＡＡＶ組成物は、注射（例えば、関節内、静脈内、筋内
など）による投与のために処方される。従って、これらの組成物は、好ましくは
、生理食塩水、リンゲル平衡化食塩水溶液（ｐＨ７．４）、デキストロース溶液
などのような、薬学的に受容可能なビヒクルと混合される。必要とはされないけ
れども、薬学的組成物は、必要に応じて、正確な量の投与に適切な単位投薬形態
で供給され得る。

【００９５】本発明はまた、ＴＮＦ関連障害（例えば、炎症状態（関節炎を含む））の処置
における使用のために上記のベクター（またはそのベクターを含む組成物）のい
ずれかを含む。本発明はまた、個体におけるＴＮＦレベルを減少させる際の使用
のために上記のベクター（またはそのベクターを含む組成物）のいずれかを含む
。本発明はさらに、ＴＮＦ関連障害（例えば、炎症状態（関節炎を含む））の処
置のための医薬の製造における上記のベクター（またはそのベクターを含む組成
物）のいずれかの使用を提供する。本発明はまた、個体におけるＴＮＦ活性レベ
ルを減少させるための医薬の製造における上記のベクター（またはそのベクター
を含む組成物）のいずれかの使用を提供する。

【００９６】（本発明のｒＡＡＶを含む宿主細胞）本発明はまた、本明細書中に記載されるｒＡＡＶベクターを含む宿主細胞を提
供する。真核生物宿主細胞の中には、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、植物細胞
および哺乳動物細胞がある。好ましくは、その宿主細胞は、哺乳動物細胞である
。例えば、宿主細胞としては、ＨｅＬａ細胞および２９３細胞（両方ともヒト起
源であり、そして両方とも容易に利用可能である）が挙げられるが、これらに限
定されない。

【００９７】そのｒＡＡＶベクター配列を発現し得る宿主細胞の開発は、信頼できるレベル
で発現されるこの物質の確立した供給源を提供する。このｒＡＡＶベクターを宿
主細胞中に導入するため、次いで宿主細胞がそのｒＡＡＶベクターを含むか否か
を決定するための、方法および組成物は、後の節に記載され、すでに記載されて
いる技術であり、そして広範に利用可能である。

【００９８】これらの実施形態に含まれそして後の節に考察されるのは、パッケージングさ
れたｒＡＡＶベクターを産生するための基礎として使用される、いわゆる「プロ
デューサー細胞」である。

【００９９】（本発明のｒＡＡＶの調製）本発明のｒＡＡＶベクターは、当該分野における標準的方法を使用して調製さ
れ得る。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが適切である。なぜなら、その種々
の血清型は、遺伝子レベルでさえ機能的および構造的に関連があるからである（
例えば、「ＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅ」
Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編（１９８８）のＢｌａｃｋｌｏｗ、１６５〜１７４
頁；およびＲｏｓｅ、ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＶｉｒｏｌｏｇｙ３：１
、１９７４を参照のこと）。ＡＡＶ血清型すべてが、相同性ｒｅｐ遺伝子により
媒介される類似の複製特性を明らかに示し；そしてすべてが一般的に、ＡＡＶ２
にて発現されるような、３つの関連キャプシドタンパク質を有する。関連性の程
度は、ゲノムの長さに沿って血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーションを示
すヘテロ二重鎖分析；ならびにＩＴＲに対応する末端の類似する自己アニーリン
グセグメントの存在によりさらに示唆される。類似の感染性パターンもまた、各
血清型における複製機能が、類似の調節制御下にあることを示唆する。種々のｒ
ＡＡＶ血清型の間で、ＡＡＶ２が最も一般的に使用される。ＡＡＶの生物学およ
び遺伝学の概説について、例えば、Ｃａｒｔｅｒ「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰ
ａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」第Ｉ巻、第１６９〜２２８頁（１９８９）、ならびに
Ｂｅｒｎｓ「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」第１７４３〜１７６４頁、ＲａｖｅｎＰｒｅ
ｓｓ（１９９０）を参照のこと。ｒＡＡＶベクター構築の一般的原理は、当該分
野で公知である。例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ
ｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：５３３〜５３９；およびＭｕ
ｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏ
ｌ．１５８：９７〜１２９を参照のこと。

【０１００】上記のように、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＴＮＦアンタゴニストをコード
する異種ポリヌクレオチドを含む。このｒＡＡＶベクターは、さらなるポリペプ
チド（例えば、ＩＬ−１レセプターＩＩ型）もまたコードし得る。あるいは、こ
のｒＡＡＶベクターは、ＩＬ−１アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１Ｒ）をコー
ドする異種ポリヌクレオチドを含み得る。このような異種ポリヌクレオチドは、
一般的に、そのコード配列および所望の機能を提供するに十分な長さである。Ａ
ＡＶ２粒子内へのキャプシド化のために、その異種ポリヌクレオチドは、好まし
くは約５ｋｂ未満であるが、他の血清型および／または改変が、もっと長い配列
がそのＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングされるのを可能にするために使用
され得る。例えば、配列番号１に示されるようなＴＮＦＲ：Ｆｃをコードする好
ましいポリヌクレオチドは、約１．５ｋｂ長である。

【０１０１】その異種ポリヌクレオチドの転写が意図される標的細胞にて所望されるので、
その異種ポリヌクレオチドは、それ自身または異種プロモーターおよび／もしく
はエンハンサーに作動可能に連結され得、それは、当該分野で公知であるように
、例えば、標的細胞中での転写の所望のレベルおよび／もしくは特異性に依存す
る。種々の型のプロモーターおよびエンハンサーが、この状況における使用に適
切である。例えば、Ｆｅｌｄｈａｕｓ（１９９８年、１０月２０日出願の米国特
許出願第０９／１７１，７５９号）は、ｒＡＡＶからの発現を調節するためのプ
ロモーターを含む、改変型ＩＴＲを記載する。構成的プロモーターは、継続する
一定レベルの遺伝子転写を提供し、そして治療ポリペプチドが継続する基準にて
発現されることが望ましい場合に好ましい。誘導性プロモーターまたは調節可能
なプロモーターは、一般的に、誘導物質の非存在下で低活性を示し、そして誘導
物質の存在下でアップレギュレートされる。誘導性プロモーターまたは調節可能
なプロモーターは、特定の時間または特定の位置でのみ発現が望ましい場合、あ
るいは誘導剤を使用して発現のレベルを決定する（ｔｉｔｒａｔｅ）のが望まし
い場合に、好ましくあり得る。プロモーターおよびエンハンサーはまた、組織特
異的であり得る（すなわち、それらは、特定の細胞型に特有に見出される遺伝子
制御エレメントにおそらく起因して、その特定の細胞型においてのみその活性を
示す）。このような組織特異的プロモーターおよびエンハンサーは、当該分野で
公知である。例として、組織特異的プロモーターの例としては、筋肉における発
現のための種々のミオシンプロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーター
およびエンハンサーの別の例は、関節における細胞型および／または組織型につ
いての制御エレメントである。

【０１０２】好ましい誘導性または調節性のプロモーターおよび／もしくはエンハンサーと
しては、生理学的に応答性のもの（例えば、炎症性シグナルおよび／または状態
に応答性のもの）が挙げられる。例えば、炎症性発赤を駆動する媒介物質に応答
して活性化されるプロモーターおよび／またはエンハンサー（炎症誘発性サイト
カイン遺伝子（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＦＮγ）由来のものを
含むが、これらに限定されない）の使用は、炎症発赤の期間の間のＴＮＦアンタ
ゴニストの発現を生じる（Ｖａｒｌｅｙら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄ
ａｙ４；４４５〜４５１）。ＴＮＦαプロモーター領域は、約１．２ｋｂであ
り、そしてその配列は、Ｔａｋａｓｈｉｂａら、１９９３、Ｇｅｎｅ１３１：
３０７〜３０８により報告されている。

【０１０３】プロモーターのさらなる例示的例は、シミアンウイルス４０由来のＳＶ４０後
期プロモーター、バキュロウイルス多核体エンハンサー／プロモーターエレメン
ト、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、サイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）由来前初期プロモーター、および種々のレトロウイルスプロモ
ーター（ＩＴＲエレメントを含む）である。さらなる誘導性プロモーターとして
は、重金属イオン誘導性プロモーター（例えば、マウス乳癌ウイルス（ｍＭＴＶ
）プロモーターまたは種々の成長ホルモンプロモーター）、ならびにＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼの存在下で活性なＴ７ファージ由来のプロモーターが挙げられる
。他の種々の多数のプロモーターが、当該分野で公知でありそして一般的に利用
可能であり、そのような多くのプロモーターの配列が、ＧｅｎＢａｎｋデータベ
ースのような配列データベースにて利用可能である。

【０１０４】意図される標的細胞における翻訳もまた所望されるので、ＴＮＦアンタゴニス
トをコードする異種ポリヌクレオチドは、好ましくは、翻訳を促進する制御エレ
メント（例えば、リボソーム結合部位すなわち「ＲＢＳ」、およびポリアデニル
化シグナル）もまた含む。従って、その異種ポリヌクレオチドは、一般的には、
適切なプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのコード領域を含み
、そしてまた、例えば、作動可能に連結されたエンハンサー、リボソーム結合部
位およびポリＡシグナルを含み得る。その異種ポリヌクレオチドは、１つのコー
ド領域を含み得るし、または同じプロモーターもしくは異なるプロモーターの制
御下にある１つより多くのコード領域を含み得る。制御エレメントおよびコード
領域の組み合わせを含む単位全体が、しばしば、発現カセットと呼ばれる。

【０１０５】ＴＮＦアンタゴニストをコードする異種ポリヌクレオチドは、組換え技術によ
って、ＡＡＶゲノムコード領域中にかまたは好ましくはＡＡＶゲノムコード領域
の代わりに（すなわち、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の代わりに）組み込
まれるが、一般的には、ＡＡＶＩＴＲのいずれかの側面に隣接する。これは、
ＩＴＲが、コード配列から上流と下流の両方に、いずれも直接並置して、好まし
くは（必ずしもではないが）複製能力のあるＡＡＶ（「ＲＣＡ」）ゲノムを生成
し得る組換えの可能性を減少させるためにＡＡＶ起源のいかなる介在配列をも伴
わずに現れることを意味する。最近の証拠は、単一のＩＴＲが２つのＩＴＲを含
む構成と通常関連する機能を実行するのに十分であり得ることを示唆し（米国特
許第５，４７８，７４５号）、そして従って、１つのＩＴＲのみを有するベクタ
ー構築物が、本明細書中に記載されるパッケージングおよび産生の方法とともに
利用され得る。得られたｒＡＡＶベクターは、特定のＡＡＶコード配列がベクタ
ーから欠失している場合、ＡＡＶ機能が「欠損している」といわれる。

【０１０６】種々のＡＡＶゲノムの相対的なキャプシド形成サイズの制限を考慮すると、そ
のゲノムへの大きな異種ポリヌクレオチドの挿入は、そのＡＡＶゲノムの一部を
除去する必要があり、特に、１つ以上のパッケージング遺伝子が除去され得る。
１つ以上のＡＡＶ遺伝子の除去は、ＲＣＡを生成する可能性を減少するためにい
ずれの場合においても望ましい。従って、ｒｅｐ、ｃａｐ、またはその両方につ
いてのコード配列またはプロモーター配列が好ましくは除去される。なぜなら、
これらの遺伝子によって提供される機能は、トランスで提供され得るからである
。

【０１０７】ｒＡＡＶベクターは、細菌プラスミド、ＡＡＶ粒子、リポソームまたはこれら
の任意の組み合わせの形態のような種々の形態で提供される。他の実施形態にお
いて、ｒＡＡＶベクター配列は、そのｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされ
た真核生物細胞において提供される。

【０１０８】ｒＡＡＶがパッケージングされたｒＡＡＶ粒子の形態で使用される場合、遺伝
子移入における使用のためにｒＡＡＶウイルス調製物の少なくとも３つの望まし
い特徴がある。第１に、ｒＡＡＶウイルスが、標的組織において効率的な速度で
細胞を導入するのに十分高い力価で生成されるべきことが好ましい。多くのｒＡ
ＡＶウイルス粒子が典型的にはインビボでの遺伝子移入に必要とされる。例えば
、いくつかの処理は、１０⁸を超える粒子を必要とし得る。第２に、ｒＡＡＶウ
イルス調製物が複製能力のあるＡＡＶ（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘル
パーウイルス機能の存在下で複製され得る表現型的に野生型のＡＡＶ）を基本的
に含まないべきであることが好ましい。第３に、ｒＡＡＶウイルス調製物が全体
として、遺伝子移入の状況において免疫応答を産生するいかなる危険性も最小に
するかまたは除去するために、他のウイルス（例えば、ＡＡＶ産生に使用される
ヘルパーウイルス）、ならびにヘルパーウイルスおよび細胞性タンパク質ならび
に他の成分（脂質および炭水化物のような）を基本的に含まないことが好ましい
。この後者の点は、ＡＡＶの関係において特に重要である。なぜなら、ＡＡＶが
、ＡＡＶ産生のプロセスの間に効果的に複製されパッケージングされるようにヘ
ルパーウイルス（典型的には、アデノウイルス）との同時感染またはヘルパーウ
イルス機能の他の提供を必要とする「ヘルパー依存性」ウイルスであるからであ
り；そしてさらに、上記のように、アデノウイルスは、遺伝子移入適用の状況に
おいて宿主免疫応答を生成することが観測されているからである（例えば、Ｌｅ
ら、１９９７；Ｂｙｒｎｅｓら、１９９５、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、６６：
１０１５；ＭｃＣｏｙら、１９９５、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、
６：１５５３；およびＢａｒｒら、１９９５、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、２：
１５１を参照のこと）。

【０１０９】ｒＡＡＶベクターが、そのｒＡＡＶベクターを複製およびパッケージングする
ためにＡＡＶ粒子にパッケージングされる場合、欠損している機能は、１つのパ
ッケージング遺伝子または複数のパッケージング遺伝子（一緒に、種々の欠損し
ているｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子産物に必要な機能をコードする）によ
って、補充される。パッケージング遺伝子または遺伝子カセットは、好ましくは
、ＡＡＶＩＴＲに隣接せず、好ましくは、ｒＡＡＶゲノムといかなる実質的な
相同性も共有しない。従って、ベクター配列と別に提供されたパッケージング遺
伝子との間での複製の間の相同組換えを最小化するために、その２つのポリヌク
レオチド配列の重なりを避けることが望ましい。相同性のレベルおよび対応する
組換えの頻度は、相同な配列の長さの増加および共有する同一性のレベルととも
に増加する。所与の系において関係を提起する相同性のレベルは、当該分野で公
知なように理論的に決定され得、実験的に確認され得る。しかし、一般的に、重
複配列がその全体の長さにわたって少なくとも８０％同一であり、その重複配列
が約２５ヌクレオチド配列未満である場合、または重複配列がその全体の長さに
わたって少なくとも７０％同一であり、その重複配列が約５０ヌクレオチド配列
未満である場合、組換えは実質的に減少され得るかまたは排除され得る。もちろ
ん、相同性のさらに低いレベルが、好ましい。なぜなら、これらは、組換えの可
能性をさらに減少するからである。いかなる重複する相同性も含まない場合でさ
え、ＲＣＡを生成する説明のつかないいくらかの頻度が存在するようである。Ｒ
ＣＡを生成する頻度のよりさらなる減少（例えば、非相同組換えによる）が、１
９９６年１２月１８日に出願されたＡｌｌｅｎら、米国特許出願第０８／７６９
，７２８号によって記載されるように、ＡＡＶの複製およびキャプシド形成機能
を「分離」することによって得られえる。

【０１１０】ｒＡＡＶベクター構築物、および相補的なパッケージング遺伝子構築物は、多
くの異なる形態で本発明において実行され得る。ウイルス粒子、プラスミド、お
よび安定に形質転換される宿主細胞は、すべて、このような構築物をパッケージ
ング細胞に一過性でかまたは安定にかのいずれかで導入するために使用され得る
。

【０１１１】従って、種々の異なる遺伝的に改変された細胞が、本発明の状況において使用
され得る。例示として、哺乳動物宿主細胞は、安定に組み込まれたｒＡＡＶベク
ターの少なくとも１つのインタクトなコピーとともに使用され得る。プロモータ
ーに作動可能に連結された少なくとも１つのＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含むＡＡＶ
パッケージングプラスミドは、複製機能を供給するために使用され得る（米国特
許第５，６５８，７７６号に記載されるように）。あるいは、プロモーターに作
動可能に連結されたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳動物細胞株は、複
製機能を供給するために使用され得る（例えば、Ｔｒｅｍｐｅら、米国特許第５
，８３７，４８４号；Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、ＷＯ９８／２７２０７号；およびＪ
ｏｈｎｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７８５号を参照のこと）。ＡＡＶｃ
ａｐ遺伝子（上記のようにキャプシド形成タンパク質を提供する）は、ＡＡＶ
ｒｅｐ遺伝子とともにか、または別々に提供され得る（例えば、上に参照される
出願および特許ならびにＡｌｌｅｎら、（ＷＯ９６／１７９４７）を参照のこと
）。他の組み合わせも可能である。

【０１１２】当該分野において記載され、上で引用される参考文献および以下の実施例に示
されるように、遺伝物質は、細胞（例えば、ｒＡＡＶの産生のための哺乳動物「
プロデューサー」細胞）中に、このような細胞を形質転換するためまたは形質導
入するための任意の種々の手段を使用して導入され得る。例示として、このよう
な技術としては、細菌プラスミドでのトランスフェクション、ウイルスベクター
での感染、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、および任意の種々
の脂質ベースの組成物を使用する導入（しばしば、「リポフェクション」と呼ば
れるプロセス）が挙げられるが、これらには限定されない。これらの技術を実行
するための方法および組成物は、当該分野において記載され、幅広く利用可能で
ある。

【０１１３】適切に改変された細胞の選択は、当該分野における任意の技術によって行われ
得る。例えば、細胞を改変させるために使用されるポリヌクレオチド配列は、当
該分野において公知なように、１つ以上の検出可能なマーカーまたは選択マーカ
ーと同時に導入され得るか、またはこれらに作動可能に連結され得る。例示とし
て、選択マーカーとして薬物耐性遺伝子を利用し得る。次いで、薬剤耐性細胞を
採取し、増殖させ得、次いで、所望の配列の発現（すなわち、異種ポリヌクレオ
チドの産物）について試験し得る。導入されたポリヌクレオチドの獲得、位置決
定、および／または維持についての試験は、ＤＮＡハイブリダイゼーションベー
スの技術（例えば、サザンブロッティングおよび当該分野において公知の他の手
順）を使用して行われ得る。発現についての試験は、遺伝的に改変された細胞か
ら抽出されたＲＮＡのノーザン分析によってか、または対応する遺伝子産物につ
いての間接的な免疫蛍光検査によって、容易に実施され得る。パッケージング能
力および効率の試験および確認は、ＡＡＶ粒子の産生について試験するために、
ＡＡＶおよびヘルパーウイルスの残りの機能成分を細胞に導入することによって
得られ得る。細胞が複数のポリヌクレオチド構築物によって遺伝的に改変される
場合、それらを細胞に別々に導入し、そして各工程を逐次確認することが、一般
的に（必須ではないが）より便利である。このような技術を記載する参考文献に
は、本明細書中に引用される文献が挙げられる。

【０１１４】ＡＡＶ粒子中へｒＡＡＶベクターをパッケージングするための１つのアプロー
チにおいて、ｒＡＡＶベクター配列（すなわち、ＡＡＶＩＴＲに隣接する配列
）、およびトランスで提供されるＡＡＶパッケージング遺伝子は、別々の細菌プ
ラスミドで宿主細胞に導入される。このアプローチの例は、Ｒａｔｓｃｈｉｎら
、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：２０７２；Ｈｅｒｍｏｎａｔ
ら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６
６；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３
２５１；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら．，１９８８、Ｊ．Ｖｉｔｒｏｌ．，６２：１
９６３；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７
：３４９；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２
−３８２８；およびＦｌｏｔｔｅら、１９９２、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９に記載される。

【０１１５】第２のアプローチは、ＡＡＶ複製のために使用される哺乳動物細胞においてエ
ピソームプラスミドの形態で、ｒＡＡＶベクター配列またはＡＡＶパッケージン
グ遺伝子のいずれかを提供することである。例えば、米国特許第５，１７３，４
１４号を参照のこと。

【０１１６】第３のアプローチは、以下の実施例２に例示されるように、複製に使用される
哺乳動物細胞のゲノムに安定に組み込まれた、ｒＡＡＶベクター配列またはＡＡ
Ｖパッケージング遺伝子のいずれか、あるいはその両方を提供することである。

【０１１７】この第３のアプローチの１つの例示的な技術は、国際特許出願ＷＯ９５／１３
３６５（ＴａｒｇｅｔｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎａｎ
ｄＪｏｈｎＨｏｐｋｉｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）および対応する米国特
許第５，６５８，７７６号（Ｆｌｏｔｔｅらによる）に概略される。この例は、
安定に組み込まれたｒＡＡＶベクターの少なくとも１つのインタクトなコピーを
有する哺乳動物細胞を使用し、ここで、このベクターは、ＡＡＶＩＴＲ、およ
び標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結された転写プロモーターを含むが、ｒ
ｅｐの発現は、その細胞中に制限的である。好ましい実施形態において、異種プ
ロモーターに作動可能に連結されたｒｅｐ遺伝子を含むＡＡＶパッケージングプ
ラスミドが、細胞に導入され、次いで、その細胞が、ｒＡＡＶベクター配列の複
製および粒子へのパッケージングを可能にする条件下でインキュベートされる。

【０１１８】別のアプローチは、Ｔｒｅｍｐｅら、米国特許第５，８３７，４８４号に概略
される。この実施例は、機能性Ｒｅｐタンパク質を発現し得るように異種プロモ
ーターに作動可能に連結されたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳動物細
胞株を使用する。種々の好ましい実施形態において、ＡＡＶｃａｐ遺伝子もま
た、安定に提供され得るか、または一過性で（例えば、プラスミド上で）導入さ
れ得る。ｒＡＡＶベクターもまた、安定に導入されても一過性で導入されてもよ
い。

【０１１９】別のアプローチは、特許出願ＷＯ９６／１７９４７（ＴａｒｇｅｔｅｄＧｅ
ｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に概説される。この実施例は、安定に
組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス誘導性異種プロモ
ーターに作動可能に連結された安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む
、哺乳動物細胞を使用する。ｒＡＡＶベクター配列を含むプラスミドはまた、（
安定または一過性のいずれかで）その細胞に導入される。次いで、粒子へのｒＡ
ＡＶベクターのパッケージングは、ヘルパーウイルスの導入によって開始される
。

【０１２０】混入するウイルスならびに／あるいはウイルスタンパク質または細胞タンパク
質を実質的に含まない高い力価のｒＡＡＶウイルス調製物を達成する方法は、Ａ
ｔｋｉｎｓｏｎら、ＷＯ９９／１１７６４号に概略される。そこに記載される技
術は、ｒＡＡＶウイルス粒子調製物の大規模産生のために使用され得る。ｒＡＡ
Ｖを調製するための他の方法は、ＷＯ００／１４２０５号、ＷＯ９９／２０７７
３号、およびＷＯ９９／２０７７９号に記載される。

【０１２１】これらの種々の例は、十分に高い力価でのｒＡＡＶウイルス粒子の産生、ｒＡ
ＡＶベクターとパッケージング成分をコードする配列との間の組換えの最小化、
哺乳動物におけるＡＡＶｒｅｐ遺伝子の発現と関連した潜在的困難性の減少ま
たは回避（なぜなら、Ｒｅｐタンパク質は、それら自身の発現を制限し得るだけ
ではなく、細胞代謝に影響し得るため）ならびに混入するウイルスおよび／また
はウイルスタンパク質もしくは細胞タンパク質を実質的に含まないｒＡＡＶウイ
ルス調製物といった産生の問題に取り組む。

【０１２２】ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングは、ＡＡＶに対する適切
なヘルパーウイルスの存在、またはヘルパーウイルス機能の供給に依存する。Ａ
ＡＶ複製を支持し得るヘルパーウイルスは、アデノウイルスによって例示される
が、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、サイトメガロウイルスおよびＨＨＶ−６を含
むが、これらに限定されない）ならびにポックスウイルス（特に、ワクシニア）
のような他のウイルスが挙げられる。このようなウイルスが使用され得る。

【０１２３】しばしば、ヘルパーウイルスは、意図した宿主細胞に感染し得る型およびサブ
グループのアデノウイルスである。サブグループＣ、特に血清型１、２、４、６
および７のヒトアデノウイルスが通常使用される。血清型５が一般的に好ましい
。

【０１２４】アデノウイルスの特徴および増殖パターンは、当該分野において公知である。
例えば、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅａｎｄｔｈｅｉｒ
ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、７７１〜８１６頁、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｆｉｅｌｄｓら編を参照のこと。パッケージングされたア
デノウイルスゲノムは、末端タンパク質複合体を介して左手末端および右手末端
のアデノウイルスＩＴＲを介して連結されて環を形成する、線状ＤＮＡ分子であ
る。初期、中間および後期成分についてのコントロール領域およびコード領域は
、ゲノム内で重複する。初期領域遺伝子は、アデノウイルスゲノムの複製に関連
し、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４領域へのそれらの位置に依存して分類される
。

【０１２５】必須ではないが、原則として、ヘルパーウイルス株が、遺伝子療法を受けるた
めに最終的に被験体において複製欠損であることが望ましい。従って、ｒＡＡＶ
ウイルス調製物に存在する任意の残りのヘルパーウイルスは、複製能力を有さな
い。Ｅ１Ａ領域またはＥ１Ａ領域とＥ３領域の両方が除去されたアデノウイルス
は、ほとんどのヒト細胞に対して感染性ではない。これらは、その欠損した活性
を相補し得る許容細胞株（例えば、ヒト２９３細胞株）において複製され得る。
ヘルパー機能と関連するようであるアデノウイルスの領域ならびにそうではない
領域は、当該分野において同定され、記載されている（例えば、Ｐ．Ｃｏｌｏｓ
ｉら、ＷＯ９７／１７４５８、およびそこに引用される参考文献を参照のこと）
。

【０１２６】例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（ＷＯ９９／１１７６４号）に記載されるように
、「条件的に感受性の」ヘルパーウイルスはまた、ヘルパーウイルス活性を提供
するために利用され得る。このようなヘルパーウイルス株は、最小限、それ自身
が効果的なゲノム複製を受けない少なくとも一セットの条件下で、宿主細胞にお
いてＡＡＶ複製を支持し得る性質を有さなければならない。ヘルパーウイルス活
性がインタクトなウイルス粒子として供給される場合、このウイルスが第２のセ
ットの条件下で宿主細胞において複製し得ることが一般的に必要である。第１の
セットの条件は、必要とされる補因子（例えば、カチオン）の存在または非存在
、阻害性の薬剤の存在または非存在、または温度のような環境条件における移動
のような容易に制御可能な特徴によって第２のセットの条件とは異なる。最も便
利には、２つの条件の間の差は、温度であり、従ってこのような条件的に感受性
のウイルスは、温度感受性ヘルパーウイルスと呼ばれる。

【０１２７】ヘルパーウイルスは、ウイルス複製を許容する任意の細胞において調製され得
る。アデノウイルスについて、好ましい細胞には、２９３細胞およびＨｅＬａ細
胞が挙げられる。播種密度における増加を可能にする培養技術を利用することが
好ましい。懸濁培養物に適合されている２９３細胞およびＨｅＬａ細胞改変体が
利用可能である。ＨｅＬａは、懸濁物における細胞の増殖、生存能力および形態
の理由のために好ましい。これらの細胞は、温度感受性アデノウイルス株の低い
増殖速度を補うに十分な密度（１ｍｌ当たり２×１０⁶）で増殖され得る。一旦
確立されると、細胞をウイルスに感染させ、許容な温度で十分な期間（一般的に
、３〜７日、そして典型的には約５日）培養する。

【０１２８】ヘルパーウイルスの調製、単離および濃縮に有用な方法の例は、Ａｔｋｉｎｓ
ｏｎら（ＷＯ９９／１１７６４）に見出され得る。

【０１２９】いくつかの基準が、本明細書中に記載されるようなｒＡＡＶ粒子を産生する際
における使用のための細胞の選択に影響する。最初の問題として、細胞は、その
選択したヘルパーウイルスを使用する場合、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッ
ケージングに許容でなければならない。しかし、大部分の哺乳動物細胞がＡＡＶ
によって産生的に感染され得、多くがまたアデノウイルスのようなヘルパーウイ
ルスによって感染され得るので、多くの種々の哺乳動物細胞および細胞株がこれ
らの基準を効果的に満足することは明らかである。これらのうち、より好ましい
細胞および細胞株は、ｒＡＡＶウイルス調製物の大規模産生を容易にするために
、培養物中において容易に増殖し得る細胞および細胞株である。しかし、また、
多くのこのような細胞は、この基準を効果的に満足する。大規模産生が望ましい
場合、産生方法の選択はまた、宿主細胞の選択に影響する。例えば、Ａｔｋｉｎ
ｓｏｎら（ＷＯ９９／１１７６４号）および当該分野にさらに詳細に記載される
ように、いくつかの産生技術および培養容器またはチャンバは、接着細胞または
付着細胞の増殖のために設計され、一方、他の産生技術および培養容器またはチ
ャンバは、懸濁物での細胞の増殖のために設計される。後者の場合、従って、宿
主細胞は、好ましくは、懸濁物での増殖のために適合されるか、または適合可能
である。しかし、接着性または足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）依存性とみなされる
細胞および細胞株の場合でさえ、懸濁物で増殖し得る細胞を連続的に選択するこ
とによって、足場依存性親株の懸濁物適合改変体を誘導することが可能である。
例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（ＷＯ９９／１１７６４号）を参照のこと。

【０１３０】最後に、ヘルパーウイルス、ｒＡＡＶベクター配列、および複製およびパッケ
ージングに必要とされる全てのＡＡＶ配列は、同じ細胞に存在しなければならな
い。１以上のＡＡＶパッケージング遺伝子がそのベクターとは別々に提供される
場合、以下を含む宿主細胞が提供される：（ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージン
グ遺伝子であって、ここで、各ＡＡＶパッケージング遺伝子が、ＡＡＶ複製また
はキャプシド形成タンパク質をコードする、ＡＡＶパッケージング遺伝子；（ｉ
ｉ）ｒＡＡＶベクターを用いてこの宿主細胞に導入された異種ポリヌクレオチド
であって、ここで、このｒＡＡＶベクターが、少なくとも１つのＡＡＶＩＴＲ
に隣接されているこの異種ポリヌクレオチドを含み、かつこのＡＡＶパッケージ
ング遺伝子を欠いている、異種ポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）ヘルパーウイルス
または必要なヘルパーウイルス機能をコードする配列。しかし、１つ以上のこれ
らのエレメントが、単一のレプリコンで組み合わせられ得ることに注意すべきで
ある。

【０１３１】ヘルパーウイルスは、好ましくは、培養物における細胞の大部分を感染するの
に十分なレベルで細胞培養物に導入されるが、そうでなければ、得られる調製物
に存在するヘルパーウイルスの量を制限するために最小量で維持され得る。１〜
１００の感染多重度つまり「ＭＯＩ」が使用され得るが、５〜１０のＭＯＩが代
表的に適切である。

【０１３２】同様に、ｒＡＡＶベクターおよび／またはパッケージング遺伝子がパッケージ
ング細胞に一過性で導入される（安定に導入されるのとは対照的に）場合、これ
らは、好ましくは、培養物において大部分の細胞を遺伝的に変化させるのに十分
なレベルで導入される。一般的に必要とされる量は、細菌プラスミドとして供給
される場合、１０⁶細胞当たり１０μｇのオーダーであり；ＡＡＶ粒子として供
給される場合、１０⁵細胞当たり１０⁸粒子のオーダーである。最適量の決定は、
当業者の技術の範囲内である慣用的な力価測定の実行である。

【０１３３】これらのエレメントは、任意の順序で同時にまたは連続的にのいずれかで、細
胞に導入され得る。細胞をいずれかのエレメントによって遺伝的に変化する場合
、細胞は、次のエレメントを導入する前に選択され得、増殖され得る。

【０１３４】１つの好ましい例において、ヘルパーウイルスは、定在性のｒＡＡＶベクター
をレスキューし、そしてパッケージするために細胞に最後に導入される。細胞は
、一般的に、すでにＡＡＶパッケージング遺伝子に必要な程度に補充されている
。好ましくは、ｒＡＡＶベクターまたはパッケージング遺伝子のいずれか、そし
てより好ましくはその両方が、細胞に安定に組み込まれる。他の組み合わせが可
能であることは容易に理解される。このような組み合わせは、本発明の範囲内に
含まれる。

【０１３５】一旦、宿主細胞に必要なエレメントを提供すると、この細胞を、ｒＡＡＶベク
ターの複製およびパッケージングを可能にするために、ＡＡＶの複製に許容な条
件下で培養する。培養時間は、好ましくは、ピーク産生レベルに対応するように
調節され、代表的には、３〜６日である。次いで、ｒＡＡＶ粒子を、収集し、使
用した細胞から単離して、これらを調製する。

【０１３６】必要に応じて、ｒＡＡＶウイルス調製物は、ｒＡＡＶ粒子を富化するか、ヘル
パーウイルス粒子を枯渇させるか、またはそうでなければ、それらを被験体への
投与に適合させるためにさらにプロセスされ得る。例示的技術については、Ａｔ
ｋｉｎｓｏｎら（ＷＯ９９／１１７６４）を参照のこと。精製技術には、等密度
（ｉｓｏｐｙｎｉｃ）勾配遠心分離、およびクロマトグラフィー技術が挙げられ
る。感染ヘルパーウイルス活性の減少には、当該分野で公知なように熱処理また
はｐＨ処理による不活化が挙げられ得る。他のプロセスには、濃縮、濾過、ダイ
アフィルトレーション、あるいは適切な緩衝液または薬学的賦形剤との混合が挙
げられ得る。調製物は、分配のために単位用量および複数用量のアリコートに分
けられ得、これは、抗原性含有量および遺伝的含有量の均一性、ならびに混入ヘ
ルパーウイルスの相対的な比率のような、バッチの基本的な特徴を維持する。

【０１３７】ウイルス調製物の感染力価の決定のための種々の方法は、当該分野において公
知である。例えば、力価決定のための１つの方法は、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（ＷＯ
９９／１１７６４）によって提供されるような高スループット力価測定アッセイ
である。この迅速かつ定量的な方法によって決定されるウイルス力価は、より古
典的な技術によって決定される力価に密接に対応する。しかし、さらに、この高
スループット方法は、多くのウイルス複製反応の同時のプロセシングおよび分析
を可能にし、従って、例えば、ウイルス複製および感染性について許容性または
非許容性の細胞株のスクリーニングを含む多くの他の用途を有する。

【０１３８】（本発明のｒＡＡＶを使用する方法）本発明はまた、本明細書中に記載されるｒＡＡＶベクターの投与を使用して、
被験体におけるＴＮＦのレベルを減少する方法を提供する。このような方法は、
ＴＮＦ関連障害を有する個体に特に有利であり得る。これらの方法に適切な障害
は、ＴＮＦの上昇したレベルに関連する障害であり、これには、関節炎（ＲＡを
含む）、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）
、喘息およびうっ血性心不全が挙げられるがこれらには限定されない。

【０１３９】ＴＮＦのレベルは、ＴＮＦの循環レベルならびに／あるいは組織および／また
は解剖学的部位におけるＴＮＦのレベルであり得る。ＴＮＦレベルは、ＴＮＦア
ンタゴニストをコードするｒＡＡＶを受容する前の被験体のＴＮＦレベルと比べ
た場合、またはＴＮＦアンタゴニストをコードするｒＡＡＶを受容しない個体の
ＴＮＦレベルと比較した場合に減少されていることが理解される。ＴＮＦレベル
とは、遊離（複合体化されていないまたは結合されていない）ＴＮＦのレベルか
あるいは活性なＴＮＦのレベルをいうことが理解される。ＴＮＦレベルを検出す
るための方法は、以下に記載される。

【０１４０】１つの実施形態において、ＴＮＦのレベルを減少するための本明細書中に提供
される方法は、本明細書中に記載されるｒＡＡＶベクター（またはそのベクター
を含む組成物）の投与（送達）を包含する。別の実施形態において、ｒＡＡＶベ
クターは、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦＲまたは抗ＴＮＦ抗体）の投
与とともに投与される。ＴＮＦアンタゴニストは、好ましくは、生理学的に受容
可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤を含む組成物で、ボーラス注射、連続注
入または移植片からの持続放出による、動脈内、腹腔内または皮下経路を含むが
これらに限定されない適切な技術によって投与され得る。以下に議論されるよう
に、ＴＮＦアンタゴニストはまた、結合組織、特に関節に直接投与され得る。

【０１４１】本発明はまた、本明細書中に記載されるｒＡＡＶベクター（またはｒＡＡＶベ
クターを含む組成物）の投与を使用して、被験体において炎症応答を減少する方
法を提供する。好ましくは、炎症応答は、結合組織（滑膜、軟骨、靭帯および腱
を含むがこれらに限定されない）において減少する。炎症応答の減少に好ましい
解剖学的部位は、関節炎（例えば、ＲＡ）を罹患する被験体における冒された関
節である。炎症応答は、ＴＮＦアンタゴニストをコードするｒＡＡＶを受容する
前の被験体における炎症応答と比べた場合、またはＴＮＦアンタゴニストをコー
ドするｒＡＡＶを受容しない個体における炎症応答と比較した場合、減少されて
いることが理解される。

【０１４２】本発明はまた、本明細書中に記載されるｒＡＡＶベクター（またはｒＡＡＶベ
クターを含む組成物）の投与を使用して、被験体において起こるＴＮＦ関連障害
（関節炎（すなわち、関節炎状態）のような炎症性疾患が挙げられる）を緩和す
る方法を提供する。好ましくは、関節炎状態は、関節において、好ましくは、結
合組織（滑膜、軟骨、靭帯、および腱が挙げられるが、これらに限定されない）
において、緩和される。炎症状態は、ＴＮＦアンタゴニストをコードするｒＡＡ
Ｖを受容する前の被験体の関節炎状態と比較した場合に、またはＴＮＦアンタゴ
ニストをコードするｒＡＡＶを受容しない個体における関節炎状態と比較した場
合に緩和されることが、理解される。

【０１４３】好ましい実施形態において、ｒＡＡＶベクター（またはｒＡＡＶベクターを含
む組成物）が、哺乳動物の関節炎の関節に送達され、これによってＴＮＦアンタ
ゴニストの供給源を炎症の部位に提供する。なおより好ましくは、ｒＡＡＶベク
ターは、ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃをコードするポリヌクレオチドを含む。

【０１４４】別の好ましい実施形態において、ｒＡＡＶベクター（またはｒＡＡＶベクター
を含む組成物）は、哺乳動物の関節炎の関節に送達されて、ＴＮＦアンタゴニス
トの供給源およびＩＬ−１アンタゴニストの供給源を、炎症の部位に提供する。
好ましくは、ｒＡＡＶベクターは、ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃをコードするポ
リヌクレオチドおよびＩＬ−１Ｒをコードするポリヌクレオチドを含む。

【０１４５】別の好ましい実施形態において、ＴＮＦアンタゴニストの供給源およびＩＬ−
１アンタゴニストの供給源は、少なくとも２つの異なるｒＡＡＶベクター（また
は少なくとも２つの異なるｒＡＡＶベクターを含む組成物）の投与によって、炎
症の部位において、哺乳動物の関節炎の関節に送達される。好ましくは、ｒＡＡ
Ｖベクターの１つは、ＴＮＦＲをコードするポリヌクレオチドを含み、そしてｒ
ＡＡＶベクターの別のものは、ＩＬ−１Ｒをコードするポリヌクレオチドを含む
。これら２つの異なるｒＡＡＶベクターにおいて、異種ポリヌクレオチドが、類
似の条件下で活性な転写プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に
連結し得るか、あるいは異なる条件下で活性な（例えば、独立して調節される）
転写プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結し得る。投与の
種々の改善において、これら２つの異なるｒＡＡＶベクター（すなわち、１つが
ＴＮＦＲをコードするポリヌクレオチドを含み、そして１つがＩＬ−１Ｒをコー
ドするポリヌクレオチドを含む）は、同時にかまたは異なる時点で、同じ頻度で
かまたは異なる頻度で、そして／あるいは同じ量でかまたは異なる量で、哺乳動
物に投与され得る。

【０１４６】上記方法のいずれかに対して、１つ以上のｒＡＡＶベクターが投与され得るこ
とが、理解される。例えば、上記のように、ＴＮＦレセプターのようなＴＮＦア
ンタゴニスト（最も好ましくは、ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃ）をコードするベ
クターが投与され得る。あるいは、ＩＬ−１レセプターポリペプチドのようなＩ
Ｌ−１アンタゴニストをコードする、さらなるベクターが投与され得る。あるい
は、ＴＮＦアンタゴニストとＩＬ−１アンタゴニストとの両方をコードする単一
のベクターが、投与され得る。この単一のベクターは、同じかまたは異なる転写
制御エレメントの制御下で、コード配列を有し得る。１つより多いベクターが使
用される場合には、これらは同じかまたは異なる時点および／または頻度で、投
与され得る。

【０１４７】さらに、上記方法のいずれかに対して、好ましい実施形態において、ｒＡＡＶ
ベクターを受容する個体は、（投与後に）ｒＡＡＶベクターを含む細胞を有し、
そして最も好ましくは、ｒＡＡＶベクターが細胞ゲノムに取り込まれる細胞を有
することが、理解される。ｒＡＡＶの安定な取り込みは、別の利点である。なぜ
なら、これは、エピソームベクターより持続性の発現を可能にするからである。
従って、好ましい実施形態において、個体における細胞（すなわち、少なくとも
１つの細胞）は、安定に取り込まれたｒＡＡＶを含む。言い換えれば、上記方法
のいずれかに対して、ｒＡＡＶの投与は、細胞ゲノムへのｒＡＡＶの取り込みを
生じる（しかし、当業者により理解されるように、全てのｒＡＡＶベクターが取
り込まれる必要はない）。取り込まれた形態対取り込まれていない形態を決定お
よび／または区別する方法（例えば、サザン検出法）は、当該分野において周知
である。

【０１４８】ｒＡＡＶベクター（好ましくは、ＡＡＶ粒子としてパッケージされた）の投与
は、多数の経路のいずれかを通し得る。投与の好ましい様式は、筋内送達による
。ｒＡＡＶベクターの筋内送達は、注射の部位の近くおよびまた循環中の組織お
よび内部組織空間の両方において、ＴＮＦレベルを減少させ得る。ｒＡＡＶ組成
物の投与の別の好ましい様式は、静脈内送達による。本発明のｒＡＡＶ組成物の
投与の別の好ましい様式は、この組成物を組織または解剖学的部位に直接注射す
ることによる。このような投与の好ましい様式は、組成物の関節内注射による。
好ましくは、ｒＡＡＶ組成物は、罹患した関節の滑膜に；より好ましくは、関節
空間を内張りしている（ｌｉｎｉｎｇ）滑膜細胞に、送達される。関節への投与
は、単一の投与かまたは反復される投与であり得る。反復される投与は、約１ヶ
月に１回、約６週間ごとに１回、約２ヶ月ごとに１回、約３ヶ月ごとに１回、約
４ヶ月ごとに１回、約５ヶ月ごとに１回、約６ヶ月ごとに１回のうちのいずれか
のような、適切な間隔である。反復される投与はまた、変化する間隔で行われ得
る。

【０１４９】本発明のｒＡＡＶ組成物の投与の別の好ましい様式は、鼻咽頭および肺の投与
経路（吸入による経路、経気管支経路、および経肺胞経路が挙げられるが、これ
らに限定されない）による。本発明は、吸入による投与（種々の型の吸入用エア
ロゾル、ならびに送達系のための粉末形態が挙げられるが、これらに限定されな
い）に適したｒＡＡＶ組成物を含む。ｒＡＡＶ組成物の吸入による投与のために
適したデバイスとしては、噴霧器および気化器が挙げられるが、これらに限定さ
れない。

【０１５０】有効量のｒＡＡＶ（好ましくは、ＡＡＶ粒子の形態）が、処置の目的に依存し
て、投与される。有効量は、単回用量または分割用量で与えられ得る。低い百分
率の形質導入が、治療効果を達成し得る場合には、処置の目的は、一般に、この
形質導入のレベルに合致するか、または過剰である。いくつかの例において、こ
の形質導入のレベルは、ほんの約１〜５％の標的細胞の形質導入により達成され
得るが、より代表的には、約２０％の所望の組織型の細胞、通常は少なくとも約
５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％、
そしてなおより好ましくは少なくとも約９９％の、所望の組織型の細胞により、
達成され得る。

【０１５１】ガイドとして、１回の注射あたりに投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、一般に、
約１×１０⁶粒子と約１×１０¹⁴粒子との間、好ましくは、約１×１０⁷粒子と１
×１０¹³粒子との間、より好ましくは、約１×１０⁹粒子と１×１０¹²粒子との
間、そしてなおより好ましくは、約１×１０¹¹粒子である。

【０１５２】例えば関節内注射によって、１関節あたりに投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、
ＤＮＡｓｅ耐性粒子およびＤＮＡｓｅ感受性粒子の両方を含めて、一般に、少な
くとも約１×１０⁸粒子であり、そしてより代表的には、約５×１０⁸、約１×１
０¹⁰であり、そしていくつかの場合においては、約１×１０¹¹粒子である。ＤＮ
Ａｓｅ耐性粒子の観点から、用量は、一般に、約１×１０⁶粒子と約１×１０¹⁴
粒子との間であり、より一般的には、約１×１０⁸粒子と約１×１０¹²粒子との
間である。

【０１５３】１回の筋内注射あたり、および１回の静脈内投与あたりに投与されるｒＡＡＶ
粒子の数は、ＤＮＡｓｅ耐性粒子およびＤＮＡｓｅ感受性粒子の両方を含めて、
例えば、一般には少なくとも約１×１０¹⁰であり、そしてより代表的には、約５
×１０¹⁰、約１×１０¹¹、約５×１０¹¹、約１×１０¹²、約５×１０¹²のうちの
いずれかであり、そしていくつかの場合においては、約１×１０¹³の粒子である
。ＤＮＡｓｅ耐性粒子の観点から、用量は、一般に、約１×１０⁶粒子と１×１
０¹⁴粒子との間であり、より一般的には、約１×１０¹⁰粒子と１×１０¹³粒子と
の間である。

【０１５４】ｒＡＡＶ送達の有効性は、いくつかの基準によりモニタリングされ得る。例え
ば、生検または外科的切除により除去されたサンプルを、インサイチュハイブリ
ダイゼーション、ベクター特異的プローブを使用するＰＣＲ増幅、および／また
はＲＮＡｓｅ保護により分析して、ｒＡＡＶＤＮＡおよび／またはｒＡＡＶ
ｍＲＮＡを検出し得る。また、例えば、採取した組織、関節液および／または血
清のサンプルを、ｒＡＡＶによりコードされたＴＮＦアンタゴニストの存在につ
いて、イムノアッセイ（免疫ブロッティング、免疫沈降、免疫組織学および／ま
たは免疫蛍光細胞計数、あるいはＴＮＦ活性のＴＮＦアンタゴニスト媒介性阻害
に依存する、機能に基づくバイオアッセイが挙げられるがこれらに限定されない
）を用いてモニタリングし得る。例えば、ｒＡＡＶにコードされたＴＮＦアンタ
ゴニストがＴＮＦＲポリペプチドである場合には、採取したサンプル中のコード
されたＴＮＦＲの存在は、ＴＮＦＲイムノアッセイ、またはマウスＬ９２９細胞
のＴＮＦ殺傷のＴＮＦＲ媒介性阻害に依存する、機能に基づくバイオアッセイを
用いて、モニタリングされ得る。このようなアッセイの例は、当該分野において
公知であり、そして本明細書中に記載される。

【０１５５】本発明はまた、本明細書中に記載のｒＡＡＶベクターの投与が、哺乳動物への
ポリヌクレオチドの送達のためにエキソビボストラテジーを使用する方法を提供
する。このような方法および技術は、当該分野において公知である。例えば、米
国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。一般に、細胞は、ｒＡＡＶベクタ
ーによってインビトロで形質導入され、次いでこの形質導入された細胞が、哺乳
動物に（例えば、関節炎の関節に）導入される。適切な細胞は、当業者に公知で
あり、そして幹細胞のような自己由来の細胞が挙げられる。

【０１５６】本明細書中に提供される方法の有効性は、例えば、本明細書中に記載のｒＡＡ
Ｖベクターの送達に続いて、採取した組織、関節液および／または血清中で、相
対的ＴＮＦレベルを評価することによって、モニタリングされ得る。ＴＮＦレベ
ルを評価するためのアッセイは、当該分野において公知であり、そしてＴＮＦに
ついてのイムノアッセイ（免疫ブロットアッセイおよび／または免疫沈降アッセ
イが挙げられるが、これらに限定されない）、ならびにＴＮＦの細胞傷害性活性
に対して感受性の細胞を用いる細胞傷害性アッセイが挙げられるが、これらに限
定されない。例えば、Ｋｈａｂａｒら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．
４６：１０７−１１０を参照のこと。

【０１５７】処置される被験体はまた、ＴＮＦ関連障害を伴う臨床的特徴について、モニタ
リングされ得る。例えば、被験体は、炎症に関連する症状の減少について、モニ
タリングされ得る。例えば、本発明の方法を使用して、被験体のＲＡを処置した
後に、この被験体は、多数の臨床パラメータ（関節腫脹、関節圧痛、早朝の堅さ
（ｍｏｒｎｉｎｇｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）、疼痛、赤血球沈降速度、およびｃ反
応性タンパクが挙げられるが、これらに限定されない）の改善について、評価さ
れ得る。

【０１５８】特定の組成、投薬レジメン（すなわち、用量、タイミングおよび反復）ならび
に投与経路の選択は、多数の異なる要因（被験体の医学的履歴ならびに処置され
る状態および被験体の特徴が挙げられるが、これらに限定されない）に依存する
。このような特徴の評価および適切な治療レジメンの設計は、最終的には、処方
する医師の責任である。特定の投薬レジメンは、実験的に決定され得る。

【０１５９】先の記載は、とりわけ、哺乳動物においてＴＮＦのレベルを減少させるための
組成物および方法を提供する。変更が、当業者によって、本発明の意図から逸脱
することなく、これらの方法に対して適用され得ることが、理解される。

【０１６０】以下に提示する実施例は、当業者に対するさらなるガイドを提供し、そしてい
かなる様式においても、限定することを意味しない。

【０１６１】（実施例）（実施例１）（ラット（ｐ８０）ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合構築物およびその発現）（ラット（ｐ８０）ＴＮＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のクローニング）ラットｐ８０ＴＮＦＲ（ＩＩ型）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードする
ｃＤＮＡを、ＭＡＲＡＴＨＯＮ−ＲＥＡＤＹラット脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ）から、遺伝子特異的ＰＣＲプライマー（５’−ＣＴＡＡＣＧＡＣＧＴＴＡ
ＡＣＧＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣ−３’）を有する５’ＲＡＣＥＰＣＲ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ）を使用して、単離した（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８−９００２）。このプラ
イマーを、ラットＴＮＦＲ（ｐ８０）遺伝子の細胞質領域の２５９ｂｐの配列か
ら選択した（Ｂａｄｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３０８９
−３０９６）。５つの別個の５’ＲＡＣＥＰＣＲ反応を実施した。各ＰＣＲ反
応からの生成物を、ｐＣＲ２．１プラスミド（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）に連結し、続いてＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇ（登録商
標）Ｋｉｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、Ｔ
ＯＰ１０Ｆ’コンピテント細胞に形質転換した。クローンの代表的なパネルを完
全に配列決定し、そしてラットＴＮＦＲ（ｐ８０）ＥＣＤの完全なコンセンサス
配列を、生成した。ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図１に示す。ＤＮＡお
よびタンパク質配列アランメントを、マウスｐ８０ＴＮＦＲおよびヒトｐ７５
ＴＮＦＲを参照配列として使用して、実施した。図２は、ラットｐ８０ＴＮ
ＦＲＥＣＤ、マウスｐ８０ＴＮＦＲＥＣＤ、およびヒトｐ７５ＴＮＦＲ
ＥＣＤのタンパク質アライメントを示す。ラットＴＮＦＲ（ｐ８０）ＥＣＤプ
ラスミドを、ｐＣＲｒＴＮＦＲ．ＥＣＤと表示した。

【０１６２】（ラットＩｇＧ１Ｆｃ領域のクローニング）ラット脾臓ポリ（Ａ）ＲＮＡを、プライマーとしてＯｌｉｇｏｄ（Ｔ）₁₆を
用いて逆転写し、そして引き続いて、ＩｇＧ１ＦｃｃＤＮＡ（ヒンジドメイ
ン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む）を、

【０１６３】

【化１】を使用して増幅した（図３）。ＰＣＲプライマーを、ラットＩｇＧ１配列（Ｇｅ
ｎＢａｎｋＲＡＴＩＧＧ１Ｚ、登録番号Ｍ２８６７０）に基づいて設計した
（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ、１９８８、Ｇｅｎｅ７４：４７３−８２）。順方向
（ヒンジ領域）プライマー：５’−ｃｇｇａａｔｔｃＧＴＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣ
ＴＧＴＧＧＡＧ−３’）は、ＥｃｏＲＩ部位を含んだ（より低い場合）。逆方向
（ＣＨ３領域）プライマー：５’−ｇｃｔｃｔａｇａＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧ
ＡＧＡＧＴＧＧ−３’は、ＸｂａＩ部位を含んだ。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．
１プラスミドＤＮＡに連結し、続いてＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇ（登録商
標）Ｋｉｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、Ｔ
ＯＰ１０Ｆ’コンピテント細胞に形質転換した。クローンのパネルを、制限酵素
および配列分析により、分析した。ラットＩｇＧ１ＦｃのｃＤＮＡ配列および対
応するアミノ酸配列を、図４に示す。１つのクローンを、さらなる操作のために
使用し（以下を参照のこと）、そしてｐＣＲｒＩｇＧ１Ｆｃと表現した。

【０１６４】（ラット（ｐ８０）ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合構築物および発現ベクターの生成）ラットＴＮＦＲＥＣＤとＩｇＧ１Ｆｃ領域との（ヒンジ領域において）融合
を容易にするために、ＰＣＲを使用して、ＴＮＦＲＥＣＤの５’末端における
ＮｏｔＩ制限部位および３’末端におけるＫｐｎＩ制限部位を操作した。ＰＣＲ
反応のために、プラスミドｐＣＲｒＴＮＦＲ．ＥＣＤをテンプレートとして使用
し、順方向プライマー（ｐ８０−５ＮｏｔＩ）は、５’−ＣＡＴＡＡＧＧＧＣＣ
ＣＧＣＡＡＧＡＧＣＧＧＧＡＧＣＴＡＣＣＧＣＣＧ−３’であり、そして逆方
向プライマー（ｐ８０−３ＫｐｎＩ）は、５’−ＧＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＧＴ
ＧＡＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣＡＡＴＧ−３’であった。同様に、ＰＣＲを使用して
、ＩｇＧ１Ｆｃの５’末端におけるＫｐｎＩ制限部位を（ヒンジ領域において）
操作した。これに関しては、ｐＣＲｒＩｇＧ１Ｆｃをテンプレートとして使用し
、順方向プライマー（５ｒＩｇＧ１Ｆｃ）は、５’−ＧＧＧＴＡＣＣＣＡＧ
ＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＴＧＣ−３’であり、そして逆方向プライマ
ー（ＨＢＲＡＴＧ１／３’）は、５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣ
ＧＧＡＧＡＧＴＧＧ−３’であった。

【０１６５】配列融合の部位を、ヒト（ｐ７５）ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の後に、モ
デル化した（Ｍｏｈｌｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１５４
８−１５６１）。ＴＮＦＲＥＣＤおよびＩｇＧ１ＦｃＰＣＲ産物を、これら
のＫｐｎＩ制限部位を介して連結し、そしてｐＣＲ２．１にサブクローニングし
た。クローンのパネルを、制限酵素および配列分析により分析した。融合ポリヌ
クレオチドを有する１つのプラスミド（ｐＣＲｒＴＮＦＲ−Ｆｃ）を、さらなる
操作のために使用した。ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ融合ポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列およびコードされるアミノ酸配列を、図５に示す。

【０１６６】哺乳動物発現ベクターを構築するために、プラスミドｐＣＲｒＴＮＦＲ−Ｆｃ
を、ＮｏｔＩ制限酵素で消化し、そしてｒＴＮＦＲ−Ｆｃ融合遺伝子を含む１．
６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、単離および精製した。哺乳動物発現プラスミド
ｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＮｏｔＩで消化して、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を除去し、そして３．６ｋｂのプラスミドＤＮＡ骨格フラグメントを、
単離および精製した。１．６ｋｂのｒＴＮＦＲ−Ｆｃ遺伝子フラグメントを、３
．６ｋｂのプラスミド骨格に連結し、そして得られた発現プラスミドを、ｐＣＭ
ＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃと表現した（図６に図示する）。

【０１６７】（ｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃからの発現の分析）発現プラスミドｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃ（１０μｇ）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴ
ＡＭＩＮＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２９３Ａ細胞
にトランスフェクトした。偽トランスフェクションを、陰性コントロールとして
含んだ。トランスフェクション後４８時間において、細胞を採取し、そして全細
胞ＲＮＡを、ＲｎｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出
した。ＲＮＡサンプル（１０μｇ）を、ラットＴＮＦＲ特異的³²Ｐ標識プローブ
を使用して、ノーザンブロット分析に供した。ラットＴＮＦＲ−ＦｃＲＮＡに
対応する１．６ｋｂのバンドは、ｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃでトランスフェクト
した細胞由来のＲＮＡサンプルのみに存在した（図７）。

【０１６８】ラットＴＮＦＲ−Ｆｃ発現ベクターからのタンパク質発現を評価するために、
６６ｍｍディッシュ内の２９３細胞を、１０μｇのｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃま
たはコントロールプラスミド（ｐＣＭＶＧＦＰ）のいずれかで、ＬＩＰＯＦＥＣ
ＴＡＭＩＮＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、トランスフ
ェクトした。偽トランスフェクションもまた含んだ。トランスフェクション後４
８時間において、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして室温でメタノール／アセトン中
に１０分間固定した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩
衝液とともに室温で１時間インキュベートし、再度ＰＢＳで洗浄し、次いでアル
カリホスファターゼ結合体化抗ラットＩｇＧ１（ＰＢＳ中に１：５０００に希釈
）とともに、３７℃で１時間インキュベートした。これらの細胞をＰＢＳで洗浄
し、そしてアルカリホスファターゼ検出系１−ＳＴＥＰＮＢＴ／ＢＣＩＰプラ
スＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（ＰＩＥＲＣＥ）とともに、室温で２〜４時間インキュ
ベートした。

【０１６９】（実施例２）（ｒＡＡＶベクターおよびプロデューサー細胞株の生成）（ｒＡＡＶベクター）ｒＡＡＶベクター構築物の原理は、ウイルスの遺伝学に従う。一般に、ＡＡＶ
ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は欠失し、そしてシス作用性ＩＴＲ配列が、ｒＡＡ
Ｖベクターの構築物中に残る。ｒｅｐおよびｃａｐの機能は、ｒＡＡＶウイルス
の生成を可能にする、種々のアプローチ（一過性トランスフェクションに基づく
もの（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９５、Ｇ
ｅｎｅＴｈｅｒ．２：２９−３７を参照のこと）および安定な細胞株に基づく
もの（例えば、Ｃｌａｒｋら、１９９５、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：１
３２９−１３４１；Ｔａｍａｙｏｓｅら、１９９６、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅ
ｒ．７：５０７−５１３を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない
）により提供され得る。

【０１７０】（ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃの構築）発現プラスミドｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−ＦｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ制限酵素およ
びＸｂａＩ制限酵素で消化し、そしてラットＴＮＦＲ−Ｆｃ融合遺伝子を含む１
．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、単離および精製した。ｒＡＡＶベクタープラ
スミドである、ｐＡＡＶｆｌａｇＬＵＣを、ＮｏｔＩ制限酵素およびＸｂａＩ制
限酵素で消化して、ｆｌａｇＬＵＣＤＮＡフラグメントを除去し、そしてｒＡ
ＡＶベクター骨格を、単離および精製した。次いで、１．６ｋｂのラットＴＮＦ
Ｒ−Ｆｃ遺伝子フラグメントを、ｒＡＡＶベクタープラスミドのＮｏｔＩ制限部
位およびＸｂａＩ制限部位にサブクローニングした。図８の図は、得られたｒＡ
ＡＶベクターを示し、ここで、ラットＴＮＦＲ−Ｆｃ融合ポリヌクレオチドが、
ヒト即時型早期ＣＭＶエンハンサープロモーターと、合成ポリＡ付加シグナルと
の間に位置し、そしてこれらに作動可能に連結している。ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合遺
伝子を含む転写ユニットは、ＡＡＶ−２ＩＴＲの間に収容される。このｒＡＡＶ
ベクタープラスミドを、ｐＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃと表現した。

【０１７１】（ＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃのための安定なプロデューサー細胞株の生成
）一般に、ｒＡＡＶプロデューサー細胞株は、ベクタープラスミドでの細胞のト
ランスフェクション、続いて抗生物質での選択（代表的に、Ｇ４１８、ハイグロ
マイシン、またはヒスチジノール）および個々のコロニーのクローニングにより
、生成する。コロニーを、最初に、ベクター複製についてスクリーニングする。
次いで、アデノウイルス感染に続いてベクターの高レベルの複製を示すクローン
を、感染性ベクターの産生について試験する。

【０１７２】プラスミドｐＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃ（３０μｇ）を、ＨｅｌａＣ１
２パッケージング細胞株に、エレクトロポレーションによりトランスフェクトし
た（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７９：７１６１−７１６５）。Ｃ１２細胞株は、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子お
よびｃａｐ遺伝子を含み、これらは、アデノウイルスヘルパーでの感染の際の誘
導まで、転写的に静止している（Ｃｌａｒｋら、１９９５；Ｃｌａｒｋら、１９
９６、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：１１２４−１１３２）。トランスフェク
ションの２４時間後、これらの細胞をトリプシン処理し、そして１００ｍｍのプ
レートに、プレートあたり５×１０³〜５×１０⁴の細胞の範囲の密度で、再プレ
ートした。細胞を、１０％ウシ胎仔血清および３００μｇ／ｍｌのハイグロマイ
シンＢを含むＤＭＥＭ中での選択に供した。薬物耐性細胞クローンを単離し、増
殖し、そしてこれらが感染性ＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃベクターを産生する
能力を試験し、そしてＡｔｋｉｎｓｏｎら、１９９８、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄＲｅｓ．２６：２８２１−２８２３に記載されるような感染性アッセイにお
いて、比較した。１つのこのようなプロデューサー細胞クローン（Ｃ１２−５５
）を、ＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃベクターの産生のために、さらに使用した
。産生、精製および滴定を、本質的に本明細書中に記載されるように、そしてに
一般的にＡｔｋｉｎｓｏｎら（ＷＯ９９／１１７６４）に記載されるように、実
施した。

【０１７３】（実施例３）（ＴＮＦアンタゴニストとしてのラットＴＮＦＲ−Ｆｃ）（ｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃでのトランスフェクション後のラットＴＮＦＲ−
Ｆｃ活性の発現）細胞を、ラットＴＮＦＲ−Ｆｃ発現ベクターでトランスフェクトし、そして（
１）ラットＴＮＦＲ−Ｆｃが細胞から分泌されるか否か、および（２）ラットＴ
ＮＦＲ−ＦｃがＴＮＦ−α活性を中和する能力を有するか否かを決定した。

【０１７４】Ｔ−７５フラスコ内の２９３細胞（２×１０⁶）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩ
ＮＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、１０μｇ
のｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−ＦｃまたはｐＣＭＶＧＦＰのいずれかでトランスフェク
トした。４８時間後、培地を収集し、そして以下のように、ＴＮＦ−α阻害バイ
オアッセイにおいて、試験した。マウス線維肉腫ＷＥＨＩ−１３ｖａｒ細胞（Ａ
ＴＣＣ、ＣＲＬ−２１４８）を、９６ウェルミクロプレートに、１０％ウシ胎仔
血清を含む１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地中で、１ウェルあたり４×１０ ⁴ 細胞で、播種した。一晩のインキュベーションの後に、アクチノマイシンＤ（
１μｇ／ｍｌ）および組換えラットＴＮＦ−α（０．７５ｎｇ／ｍｌ；ＢｉｏＳ
ｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＰＲＣ３０１４）を、総容量１０
０μｌで、各ウェルに添加した。トランスフェクトした２９３細胞由来の培地の
サンプルを、ウェルの第一の列に添加し、そして２倍に３回、系列希釈した。こ
れらの細胞を、５％ＣＯ₂を補充して、３７℃で一晩インキュベートした。翌日
、５０μｌのＸＴＴ標識混合物（細胞増殖キット、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ、＃１−４６５−０１５）を各ウェルに添加し、そして細胞を、３
７℃で４時間インキュベートした。最後に、プレートをＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ
２５０プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）に置き、そ
して４９０ｎｍにおける吸光度を、ＤｅｌｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェアを使
用して、記録した。測定した吸光度は、細胞数に、従ってアッセイにおける細胞
増殖に、直接相関する。阻害されない場合には、ＴＮＦ−αは、このアッセイに
おいて、細胞死を誘導する。

【０１７５】このようなＴＮＦ阻害バイオアッセイの結果を図９に示し、そしてｐＣＭＶｒ
ＴＮＦＲ−Ｆｃ−トランスフェクトされた２９３細胞がラットＴＮＦＲ−Ｆｃ融
合タンパク質を培地中に発現および分泌し、そしてこのＴＮＦＲ−Ｆｃタンパク
質が、用量依存性様式におけるＴＮＦ−αによるＷＥＨＩ−１３ｖａｒ細胞の殺
傷を阻害したことを実証する。ｐＣＭＶＧＦＰ−トランスフェクトされた２９３
細胞からの培地は、ＴＮＦ−α活性に対する効果を有さないようであった。

【０１７６】（ＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃでの形質導入後のラットＴＮＦＲ−Ｆｃ活性
）細胞をｒＡＡＶウイルス粒子で感染し、形質導入された細胞がラットＴＮＦＲ
−Ｆｃを発現および分泌し得るか否かを決定した。形質導入細胞から産生される
ラットＴＮＦＲ−Ｆｃをまた、ＴＮＦアンタゴニストとして作用する能力につい
て試験した。

【０１７７】２４ウェルプレート中の２９３細胞を、細胞当たり１０⁴粒子のＬａｃＺ遺伝
子含有ＡＡＶベクター（Ｃｌａｒｋら、１９９５；Ｃｌａｒｋら、１９９６）ま
たはＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃで、偽感染（ｍｏｃｋ−ｉｎｆｅｃｔ）させ
た。この感染細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ウェル当たり１ｍｌ）を含むＤＭＥ
Ｍ中に維持した。感染の４８時間後、培地を集め、そして０．３１２５μｌ〜２
０μｌの範囲のサンプルを、上記のＴＮＦ−α阻害アッセイにおいて分析した。
ＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃで形質導入した２９３細胞は、ＴＮＦ−α中和活
性を有するＴＮＦＲ−Ｆｃポリペプチドを発現し、そして分泌したが、ＬａｃＺ
遺伝子含有ベクター（Ｄ６）で形質導入した細胞も偽感染細胞も、これを発現お
よび分泌しなかった（図１０）。

【０１７８】別の実験において、２９３細胞を、偽感染させるか、細胞当たり１０²、５×
１０²、１０³、５×１０³および１０⁴粒子で、ＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃベ
クターに感染させるかのいずれかを行った。感染の４８時間後、培地を集め、そ
して上記のＴＮＦ−α阻害アッセイに供した。このラットＴＮＦＲ−Ｆｃタンパ
ク質は、形質導入細胞から用量依存性様式で分泌された（図１１）。２９３細胞
を、細胞当たり１０³粒子のＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃで形質導入した後の
ＴＮＦＲ−Ｆｃタンパク質発現の時間経過分析は、１２０時間にわたって、ＴＮ
Ｆ−αアンタゴニスト活性を有するＴＮＦＲ−Ｆｃタンパク質の分泌における安
定した増加を示した。

【０１７９】（実施例４）（関節へのｒＡＡＶベクターの送達）ＡＡＶベクターは、種々の組織標的への、効率的かつ持続性のインビボ遺伝子
送達を媒介することが示されてきた。これらの標的としては、気道上皮、血管系
、筋肉、肝臓、および中枢神経系が挙げられる。例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、１９
９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０６１３−１
０６１７；Ｌｙｎｃｈら、１９９７，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８０：４９７−５０５
；Ｋｅｓｓｌｅｒら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ９３：１４０８２−１４０８７；Ｘｉａｏら、１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
７０：８０９８−８１０８；Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１４２６−１４３１；Ｓｎｙｄｅｒら、１
９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：２７０−２７６；およびＫａｐｌｉｔｔら
、１９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５４を参照のこと。いくつか
の場合において、ｒＡＡＶベクターで誘導されるレポーター導入遺伝子の発現は
、１年より長く考証されてきた。ＡＡＶベクター系を用いる動物研究は、一般に
、他のウイルス性ベクター系と対照的に、病原性または免疫原性を、ほとんどま
たは全く示さなかった。

【０１８０】予備実験において、５匹の正常なラット後ろ足関節に、１０¹¹のＬａｃＺ遺伝
子含有ｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ−ＬａｃＺ）のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）を注射
した。ゲノムへのｒＡＡＶベクターの取りこみの検出を、ＬａｃＺでコードされ
るポリペプチド（β−ガラクトシダーゼ）の産生によってモニターした。このラ
ットを、炎症（例えば、関節の赤み、腫大、および痛み）の徴候について３０日
間観察した。不完全フロイントアジュバントにおいてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓを注射したラット（これは、関節の腫大、赤み、圧痛によって示される明白
な炎症を発生した）とは対照的に、これらの動物において炎症の徴候は見られな
かった。

【０１８１】この動物を３０日目に屠殺し、その関節を検査し、そして関節組織を、β−ガ
ラクトシダーゼ活性の発光読み出しによる遺伝子の発現の評価のために解体した
。ひどい炎症は見られず、この関節は未注入の関節と同一のようであり、アジュ
バント注入ラット（これは、顕著な細胞充実性を示した）とは対照的であった。
発光測定は、ｒＡＡＶ注入関節において５２×１０⁴ＲＬＵを示し、バックグラ
ウンドレベルは３．５×１０⁴ＲＬＵであった。関節組織において見出される内
因性β−ガラクトシダーゼの高いバックグラウンドにもかかわらず、この実験の
結果は、ｒＡＡＶベクターが、関節で見出される首尾よく形質導入する細胞であ
り得ることを示す。

【０１８２】要約すると、正常なラットにおける予備実験は、ベクターの関節内注射に続い
て、ｒＡＡＶベクターが、関節空間の近傍において見出される細胞の、関節空間
への形質導入を媒介することを示唆する。

【０１８３】（実施例５）（関節炎の齧歯類モデルにおける、関節へのｒＡＡＶベクターの送達）関節炎の連鎖球菌細胞壁モデルにおけるｒＡＡＶベクター遺伝子転移を使用し
て、研究を行った。これらの研究において使用されるラットモデルは、当該分野
で受容され、そして関節炎の研究のためにＦＡＤに受容されたモデルであり、そ
してこれは抗サイトカイン治療を評価するために使用される。

【０１８４】この研究において、関節炎を誘導するためにＡ群連鎖球菌細胞壁の腹腔内注射
で処置されたラットにまた、８．６×１０⁹のｒＡＡＶ−ＬａｃＺベクターのＤ
ＲＰの関節内注射を同時投与した。動物を、ベクター投与の５日後に屠殺した。
連鎖球菌細胞壁調製物を受けたラットは、ｒＡＡＶ−ＬａｃＺベクターの投与に
無関係に、関節炎を発症した。

【０１８５】 β−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的染色は、β−ガラクトシダーゼ活性ｒ
ＡＡＶ−ＬａｃＺ処置関節（図１３および１４）においてβ−ガラクトシダーゼ
活性（青色の反応生成物）の存在下で生じたが、コントロール処置関節（図１５
）では生じなかった。非常に暗い青黒色細胞が、ｒＡＡＶ−ＬａｃＺ処置動物の
滑膜において見られ、そしてより淡い青色細胞が、この関節空間の下にある骨間
質に局在化した。この時点で、軟骨も海綿状骨も、このベクターによって形質導
入されないようであった。

【０１８６】要約すると、関節炎のラットモデルにおける予備実験は、ベクターの関節内注
射に続いて、ｒＡＡＶベクターが、関節空間の近傍において見出される細胞の形
質導入を媒介することを示唆する。

【０１８７】（実施例６）（関節炎の齧歯類モデルにおけるｒＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクター遺
伝子治療）ベクター。組換えＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ（上記の実施例を参照のこと
）およびＡＡＶ−ＥＧＦＰベクターを、それぞれその対応する安定なＨｅＬａ
Ｃ１２プロデューサー細胞株、Ｃ１２／ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：ＦｃおよびＣ
１２／ＡＡＶ−ＥＧＦＰから産生した。ＡＡＶ−ＥＧＦＰは、生物発光クラゲＡ
ｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ由来のレッドシフトした増大した緑色蛍光性
タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする（Ｈｅｉｍら、１９９５，Ｎａｔｕｒｅ
３７３：６６３−６６４；Ｃｏｒｍａｃｋら、１９９６，Ｇｅｎｅ１７３：３
３−３８）。この遺伝子カセットは、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）エンハンサー／プロ
モーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シ
グナルを含む。これを、ベクターコントロール（無関係な遺伝子）として、実験
に含んだ。細胞を細胞ファクトリーで増殖させ、そしてベクターを、ヘルパーＡ
ｄ５（ｍｏｉ１０）で感染させた３日後に調製した溶解物から産生した。細胞
溶解物を、１０，０００ＰＳＩで１８ゲージの開口部（ｏｒｆｉｃ）を通して微
小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅ）した。次いで、このベクターをＣｓＣ
ｌ勾配遠心分離によってバンドにし、透析し、そしてＰＩカラムを通してさらに
精製した。最後に、この精製したベクターバルクを、Ｒｉｎｇｅｒ緩衝生理食塩
水溶液（ＲＢＳＳ）および４％グリセロールに対して透析し、滅菌濾過し、アリ
コート化し、そして−８０℃で保存した。ＤＮａｓｅＩ耐性粒子（ＤＲＰ）の
力価を、スロットブロット分析によって決定し、そしてこれはＡＡＶ−ラットＴ
ＮＦＲ：ＦｃおよびＡＡＶ−ＥＧＦＰベクターについてそれぞれ７．６×１０¹¹ ＤＲＰ／ｍＬおよび２．８×１０¹²ＤＲＰ／ｍＬであった。Ｃｌａｒｋら、１９
９５，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６：１３２９−１３４１。感染
性力価を、感染中心アッセイによって決定し、そしてこれはＡＡＶ−ラットＴＮ
ＦＲ：ＦｃおよびＡＡＶ−ＥＧＦＰベクターについてそれぞれ１×１０¹⁰ｉ．ｕ
／ｍＬおよび５．２×１０⁹ｉ．ｕ．／ｍＬであった。Ｙａｋｏｂｓｏｎら、１
９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：９７２−９８１；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、１
９９９，Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ６：９７３−９８５。

【０１８８】ＳＣＷ誘導関節炎モデル。関節炎のこの実験モデルにおいて、この疾患を、４
週齢（１００ｇｒ）の遺伝的に感受性の雌性のＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅ
ｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＭＡ）へのＡ群ＳＣＷペプチドグリカン−多糖類（ＰＧ−ＡＰＳ）（
３０μｇ／ｇｒ体重）（ＬｅｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，Ｇｒａ
ｙｓｏｎ，ＧＡ）の単一腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって開始した。（Ｃｒｏｍ
ａｒｔｉｅら、１９７７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６：１５８５−１６０２）
。代表的に、このモデルは、悪化した再発および緩解のサイクルを有する末梢性
および対称性の二相性多発性関節炎を示し、そしてこれはＲＡに臨床的にも組織
学的にも類似である（Ｃｒｏｍａｒｔｉｅら、１９７７）。後部の足首の急性炎
症は、２４〜４８時間以内に発症し、これは４〜５日間持続し、次いで部分的に
回復した。次いで、この急性好中球優性な炎症応答に続いて、約１５日目に、自
発的に再活性化する慢性炎症が生じ、これは慢性の進行性の、侵食性滑膜炎に発
達した。多発性関節炎に加えて、このＰＧ−ＡＰＳモデルは、肝臓および脾臓の
慢性の肉芽腫炎症を誘導した。関節炎の重症度（関節指数、ＡＩ）を、０〜４の
段階の腫大、紅斑、および湾曲の程度に基づく各足首のスコアリングによって決
定し、そして全ての手足についてのスコアを要約した。

【０１８９】筋内および関節内注射。ラットを、イソフルラン（Ｏ₂とともに誘導のために
５％および維持のために３％）で麻酔した。ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲまたはＡＡ
Ｖ−ＥＧＦＰベクター（２×１０¹⁰ＤＲＰ）のいずれか２０マイクロリットル、
あるいは等量のＲＢＳＳおよび４％グリセロール（ビヒクル）を、Ｈａｍｉｌｔ
ｏｎシリンジに適合した３０ゲージ針を使用して、後部足首関節に注射した。ビ
ヒクルまたは組換えＡＡＶベクター（１５０μＬ中の１．２×１０¹¹ＤＲＰ）の
いずれかの筋内注射を、２５ゲージ針を使用して行った。

【０１９０】ＴＮＦＲ：Ｆｃバイオアッセイ。血液サンプル（３００μＬ）を、ＳＣＷ注射
の前（前出血）、５日後（急性段階）、１１日後（緩解）、および３３日後（慢
性段階）に尾の静脈から集めた。血清サンプル（５０μＬ）を、阻害研究に適合
した標準的ＴＮＦ−αバイオアッセイにおいて、生理活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ
融合タンパク質についてアッセイした（Ｋｈａｂａｒら、１９９５，Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｌｅｔｔ．４６：１０７−１１０）。このアッセイにおいて、感受性ＷＥ
ＨＩ−１３ＶＡＲ細胞の溶解性ラットＴＮＦＲ：ＦｃによるＴＮＦ−α（７５０
ｐｇ／ｍＬ）媒介殺傷の阻害は、ＯＤ４９０ｎｍでの増加した吸光度によって決
定する。

【０１９１】要約。本発明者らは、関節炎の実験的ラットモデルにおけるＡＡＶ−ラットＴ
ＮＦＲ：Ｆｃベクター遺伝子治療を評価した。Ｌｅｗｉｓラットにおける連鎖球
菌細胞壁（ＳＣＷ）誘導関節炎モデルを、同側性および対側の関節の両方の関節
炎の重症度への、ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクター投与の効果を評価する
ために使用した。

【０１９２】ＳＣＷの腹腔内注射に続く２×１０¹⁰のＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクタ
ーのＤＮａｓｅＩ耐性粒子（ＤＲＰ）の両足首関節への単一関節内投与は、関
節炎指数（ＡＩ）スコアによる測定されるように、後ろ足の腫大の有意な減少を
生じた。さらに、ＳＣＷの腹膜内注射に続く単一関節へのＡＡＶ−ラットＴＮＦ
Ｒ：Ｆｃベクターの投与はまた、対側性の関節における足の腫大の有意な減少を
生じた。１．２×１０¹¹のＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：ＦｃベクターのＤＲＰの単
一筋内投与は、同様の効果を生じた。予想通りに、ＳＣＷの腹膜内注射に続く、
無関係の遺伝子発現カセットをコードするＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＥＧＦＰ）
の関節内または筋内投与は、関節の炎症を悪化させず、いずれの治療効果もまた
生じなかった。生理活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質は、ＡＡＶ−ラットＴ
ＮＦＲ：Ｆｃベクターを筋内注射したラットの血清サンプルにおいて、３３日目
で容易に検出可能であった。対照的に、関節内注射ラットにおける血清生理活性
ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質レベルは、コントロールラット（ＲＢＳＳまた
はＡＡＶ−ＥＧＦＰ処置ラット）とは有意に異ならず、これはＡＡＶ−ラットＴ
ＮＦＲ：Ｆｃベクターの局所投与が、このＴＮＨ−αアンタゴニストの有意な全
身性暴露を導かないことを示唆する。

【０１９３】結果。以下に記載される実験は、ラットにおけるＡ群ＳＣＷ誘導関節炎モデル
を使用して行った。合計で６５匹の４週齢の雌性のＬｅｗｉｓラットを、３つの
グループに分け、そして以下のように処置した：グループ１Ｎ＝８、０日目：ＳＣＷ（ｉ．ｐ．）およびＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ（関
節内、両後部足首；２×１０¹⁰ＤＲＰ／関節）Ｎ＝８、０日目：ＳＣＷ（ｉ．ｐ．）およびＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ（関
節内、片方の後部足首関節；２×１０¹⁰ＤＲＰ／関節）Ｎ＝４、０日目：ＳＣＷ（ｉ．ｐ．）およびＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ（筋
内；１．２×１０¹¹ＤＲＰ／筋肉）Ｎ＝６、０日目：ＳＣＷ（ｉ．ｐ．）およびＡＡＶ−ＥＧＦＰ（関節内、両後部
足首；２×１０¹⁰ＤＲＰ／関節）Ｎ＝４、０日目：ＳＣＷ（ｉ．ｐ．）およびＡＡＶ−ＥＧＦＰ（筋内；１．２×
１０¹¹ＤＲＰ／筋肉）グループ２Ｎ＝４、０日目：ＳＣＷ（ｉ．ｐ．）およびＲＢＳＳ（関節内、両後部足首）Ｎ＝５、０日目：ＳＣＷ（ｉ．ｐ．）グループ３Ｎ＝４、０日目：ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ（関節内、両後部足首；２×１
０¹⁰ＤＲＰ／関節）Ｎ＝４、０日目：ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ（筋内；１．２×１０¹¹ＤＲＰ
／筋肉）Ｎ＝４、０日目：ＡＡＶ−ＥＧＦＰ（関節内、両後部足首；２×１０¹⁰ＤＲＰ／
関節）Ｎ＝４、０日目：ＡＡＶ−ＥＧＦＰ（筋内；１．２×１０¹¹ＤＲＰ／筋肉）Ｎ＝３、０日目：ＲＢＳＳ（関節内、両後部足首）。

【０１９４】ラットを、疾患の発症および進行について毎日検査し、そして関節炎の重症度
（ＡＩ）を、２〜３日毎に記録した。図１９は、０日目における両後部足首関節
への、ＳＣＷの関節炎原性（ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ）用量（３０μｇ／ｇ
ｒ体重）の、単独またはＲＢＳＳの関節内投与との組み合わせのいずれかでの腹
膜内投与が、代表的な急性炎症応答（これは、４日目にピークとなり（平均ＡＩ
＝６）、次いで１１日目に最小値まで減少する（平均ＡＩ＝２））を生じたこと
を示す。緩解に続いて、関節腫大の再発が生じ、これは２２日目に頭打ちになり
（平均ＡＩ＝７）、そしてこの動物が屠殺されるまで（３５日目）慢性的に残っ
た。予想されるように、ＳＣＷの腹膜内注射に続く、両後部足首関節への２×１
０¹⁰ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：ＦｃベクターのＤＲＰの単一関節内投与は、急性
段階の間の関節腫大に対して有意な影響を有さなかった。対照的に、後者の処置
の効果は、ＡＩスコアによって測定されるように（平均ＡＩ＝２）、慢性段階の
間の後ろ足腫大の有意な減少を生じた。興味深いことに、片方の関節へのＡＡＶ
−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクターの投与は、両側性ならびに対側性の関節の両方
について、有意な、そして同様の治療効果を生じた（図２０もまた参照のこと）
。図２０は、動物に、０日目にＳＣＷ（３０μｇ／ｇｒ体重）を腹膜内注射し、
続いてＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ（合計２×１０¹⁰ＤＲＰ）を左側後部足首
関節に単一投与したことを示す。各後部足首についてのＡＩスコアを、別々に記
録した。ＳＣＷの腹膜内注射に続く１．２×１０¹¹のＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：
ＦｃベクターのＤＲＰの単一筋内投与は、同様の効果を生じた。ＳＣＷの腹膜内
注射に続く、緑色蛍光性遺伝子をコードするＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＥＧＦＰ
）の関節内または筋内投与は、関節炎症を悪化させず、またいずれの治療効果も
生じなかった。最後に、ネイティブなラットの関節へのＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ
：ＦｃまたはＡＡＶ−ＥＧＦＰのいずれかの投与は、明白な関節腫大を誘導しな
かった。この実験から、本発明者らは、関節または筋肉のいずれかへのＡＡＶ−
ラットＴＮＦＲ：Ｆｃの投与は、溶解性生理活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク
質（これは、ＴＮＦ−αに結合し、そしてＴＮＦ−αの炎症活性を有意に阻害す
る）の治療レベルの産生を生じるが、ＡＡＶ−ＥＧＦＰベクターの投与はこれを
生じなかったことを結論付けた。ＡＡＶ−ＥＧＦＰベクターの投与はいずれの治
療効果も生じないが、これは、罹患した関節における炎症性プロセスを悪化せず
、そしてネイティブな動物の関節において炎症を誘導しなかった。このことは、
関節への組換えＡＡＶベクターの局所的送達が安全であることを示す。注目され
る対側性効果についての１つの可能な説明は、形質導入された関節組織における
ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ遺伝子の発現が、循環にこのタンパク質の分泌を導き、次
いで、未注射の炎症関節へのアクセスを得るということである。この仮説を試験
するために、ネイティブな動物およびＳＣＷ処置動物の両方由来の血清サンプル
を、関節または筋肉へのＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃの投与の後に、ＴＮＦ−
α阻害バイオアッセイにおいて生理活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質につい
てアッセイした（Ｋｈａｂａｒら、１９９５）。図２１および２２は、生理活性
ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質は、ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクターの
筋内注射の３３日後に、容易に検出可能であったことを示す。対照的に、関節内
注射された動物からの生理活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質の循環レベルは
低く、そしてコントロール動物（ＡＡＶ−ＥＧＦＰまたはＲＢＳＳで処置したラ
ット）の循環レベルと有意には異ならなかった。本発明者らは、対側性効果が、
ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質の分泌および全身性分布に起因しそうにないこ
とを結論付けた。

【０１９５】考察。本発明者らは、炎症関節疾患の処置のための組換えＡＡＶ媒介ＴＮＦＲ
：Ｆｃ遺伝子送達の評価を目的とした、関節炎の当該分野で受容されたモデルを
使用するインビボ研究を本明細書に記載した。本発明者らは、関節炎の重症度に
対するＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクターの局所的（関節内）投与および全
身的（筋内）投与の治療効果を評価するために、ラットにおけるＳＣＷ誘導関節
炎モデルを使用した。

【０１９６】本発明者らの結果は、ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクターの関節内投与が
、循環における検出可能な生理活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質の非存在下
で、ＳＣＷ誘導関節炎の重症度を有意に減少したことを示す。ＡＡＶ−ラットＴ
ＮＦＲ：Ｆｃベクターの筋内投与はまた、関節炎の症状の減少において効果的で
あり、そして予想されるように生理活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質は、血
清において容易に検出可能であった。

【０１９７】未処理ラットの関節へのＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：ＦｃまたはＡＡＶ−ＥＧＦ
Ｐの投与は、注射した足において検出可能な炎症応答を誘導せず、そしてＳＣＷ
処置ラットへのＡＡＶ−ＥＧＦＰベクターの関節内投与は、炎症関節部疾患を悪
化しなかった。このことは、組換えＡＡＶベクターの関節内の局所的投与が安全
であることを示す。

【０１９８】興味深いことに、このベクターの片方の関節への単一投与は、同側性および未
注射の対側性（ｃｏｎｔａｌａｔｅｒａｌ）の両方の関節に対して同様の治療効
果を生じた。治療的対側性効果の現象は、最初にＧｈｉｖｉｚｚａｎｉら、（１
９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９５：４６１３−４
６１８）によって報告され、この著者らは、両側性の抗原誘導関節炎を有するウ
サギの一方の膝関節への、溶解性インターロイキン１レセプター（ＩＬ−１ｓＲ
）のアデノウイルス送達が、同側性ならびに対側性の未注射の膝の両方において
疾患を抑制したことを記載した。同様の現象が、ウイルス性インターロイキン１
０（ｖＩＬ−１０）遺伝子を使用するこのモデルにおいて記載された（Ｌｅｃｈ
ｍａｎ，１９９９，ＭＳＴｈｅｓｉｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｉｔ
ｔｓｂｕｒｇｈ）。さらに、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を有するマウスの
足へのｖＩＬ−１０のアデノウイルス送達（Ｗｈａｌｅｎら、１９９９，ＪＩ
ｍｍｕｎｏｌ．１６２：３６２５−３２）およびＳＣＷ誘導関節炎を有するラッ
トの足首関節へのＩｋＢの送達（Ｍｉａｇｋｏｖら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１３８５９−１３８６４）はまた、同
じ動物の非注射関節における疾患を抑制した。この対側性効果の１つの可能な説
明は、形質導入された関節組織におけるラットＴＮＦＲ：Ｆｃ遺伝子の発現が、
循環へのこのタンパク質の分泌を導き、次いで未注射の炎症関節へのアクセスを
得るということである。本発明者らの結果は、対側性効果が、ラットＴＮＦＲ：
Ｆｃタンパク質の分泌および全身性分布に起因しそうにないことを示す。これら
の結果はまた、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉら（１９９８）の結果と一致し、その著者
らは、遺伝子産物またはアデノウイルスベクターでさえも、全身性循環またはリ
ンパ管を介して他の関節に移動するという可能性はありえないとした。従って、
本発明者らの結果は、モデルに最も一致しそうであり、これは関節炎関節への遺
伝子の直接導入が、他の関節に往来する能力を有する細胞の形質導入を導くこと
を示唆する（Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉら、１９９８）。

【０１９９】未処理の動物（ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクターを筋内注射された）に
おける生理活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質の循環レベルは、対応するＳＣ
Ｗ処置動物よりも有意に高かった。この差異の可能な説明は、ＳＣＷ処置動物に
おいて、進行中の全身性の炎症性プロセスの結果として、ＴＮＦ−αのレベルが
、ネイティブな動物よりも相当高いということである。これらの罹患した動物に
おいて、ＴＮＦ−α分子は、おそらく溶解性ＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質分子に結
合し、そして中和されており、そしてバイオアッセイにおいて検出不可能である
。

【０２００】（実施例７）（ＴＮＦアンタゴニストおよびＩＬ−１アンタゴニストの同時送達のためのｒ
ＡＡＶベクター）ＴＮＦＲ：Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書中に記
載されるような）を、ｒＡＡＶＴＮＦＲ：Ｆｃプラスミドを産生するために、実
施例２において記載されるようにｒＡＡＶベクタープラスミド中にクローニング
する。ＩＬ−１Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＵ７４６４９）をコードするポリ
ヌクレオチドを、ｒＡＡＶＴＮＦＲ：Ｆｃプラスミド中にクローニングする。Ｔ
ＮＦＲ：Ｆｃコード配列およびＩＬ−１Ｒコード配列の両方を、転写性制御配列
に作動可能に連結し、そして両方をＡＡＶＩＴＲの間に封入した。このｒＡＡ
Ｖベクタープラスミドを、ｐＡＡＶＴＮＦＲ：ＦｃＩＬ−１Ｒと示す。

【０２０１】ｒＡＡＶプロデューサー細胞株を、実施例２において記載されるように、ｐＡ
ＡＶＴＮＦＲ：ＦｃＩＬ−１Ｒプラスミドでの細胞のトランスフェクションによ
って作製した。ｒＡＡＶベクター粒子を、本明細書中で記載されるように調製し
た。ｒＡＡＶＴＮＦＲ：ＦｃＩＬ−１Ｒウイルス粒子での細胞の形質導入の後の
、ＴＮＦＲ：Ｆｃ活性の発現およびＩＬ−１Ｒ活性の発現を、本明細書中に記載
の方法を使用して評価した。ＩＬ−１バイオアッセイは、Ｋｕｉｐｅｒら、１９
９８に記載される。

【０２０２】ｒＡＡＶＴＮＦＲ：ＦｃＩＬ−１Ｒウイルス粒子の投与の効果を、動物の関節
炎モデルの状況において評価する。ｒＡＡＶウイルス粒子を、関節内、筋内およ
び静脈内注射を含む異なる経路によって投与する。処置の評価は、関節における
炎症および軟骨破壊の決定を含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、米国特許第５，６０５，６９０号からのＴＮＦＲ：Ｆｃ融合ポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。

【図２】図２は、米国特許第５，６０５，６９０号からのＴＮＦＲ：Ｆｃ融合ポリペプ
チドのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。

【図３】図３は、ＧｅｎＢａｎｋＵ７４６４９からのヒトＩＬ−１ＲＩＩ型のアミ
ノ酸およびポリヌクレオチド配列を示す。

【図４】図４は、ラットＴＮＦＲ（ｐ８０）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のヌクレオチド
およびアミノ酸配列を示す。

【図５】図５は、ラットＴＮＦＲ（ｐ８０）ＥＣＤ、マウスＴＮＦＲ（ｐ８０）ＥＣＤ
およびヒトＴＮＦＲ（ｐ７５）ＥＣＤのアミノ酸配列の整列を示す。

【図６】図６は、ラットＩｇＧ１重鎖ｃＤＮＡの図およびＩｇＧ１ｃＤＮＡのＦｃ部
分を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーの相対位置を示す。

【図７】図７は、ラットＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。

【図８】図８は、ラットＴＮＦＲ：Ｆｃ融合構築物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
を示す。

【図９】図９は、ｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃ発現プラスミドの図であり、ラットＴＮＦ
Ｒ（ｐ８０）ＥＣＤ−ＩｇＧ１Ｆｃ融合ポリヌクレオチドおよび作動可能に連結
された制御エレメント含む。

【図１０】図１０は、ｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃ発現プラスミドでトランスフェクトされ
た細胞からのＲＮＡのノーザン分析を示す。

【図１１】図１１は、ｒＡＡＶベクタープラスミド、ｐＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲＦｃの図
であり、ラットＴＮＦＲ（ｐ８０）ＥＣＤ−ＩｇＧ１Ｆｃ融合ポリヌクレオチド
、ＡＡＶＩＴＲを含む作動可能に連結された制御エレメント含む。

【図１２】図１２は、ｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃでトランスフェクトされた細胞（黒菱形
）、およびｐＣＭＶＧＦＰでトランスフェクトされた細胞（白菱形）から回収さ
れた培地を使用するＴＮＦ阻害バイオアッセイの結果を示すグラフである。

【図１３】図１３は、ＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲＦｃ粒子で形質導入された細胞（黒菱形）
、ＡＶＶ−ｌａｃＺ粒子で形質導入された細胞（黒丸）、擬似感染細胞（黒三角
）およびｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃでトランスフェクトされた細胞（黒四角）か
らの培地を使用するＴＮＦ阻害バイオアッセイの結果を示すグラフである。

【図１４】図１４は、細胞当たり１００（黒菱形）、５００（

【数１】）、１０００（白三角）、５０００（白丸）、または１０，０００（白菱形）個
の粒子で、ＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲＦｃ粒子で形質導入された細胞からの培地、
ならびに擬似感染細胞（

【数２】）およびｐＣＭＶｒＴＮＦＲ−Ｆｃでトランスフェクトされた細胞（白四角）か
らの培地を使用するＴＮＦ阻害バイオアッセイの結果を示すグラフである。

【図１５】図１５は、細胞をＡＡＶＣＭＶｒＴＮＦＲＦｃで、細胞当たり１０００粒子で
形質導入した後のＴＮＦＲ−Ｆｃポリペプチド発現の時間経過分析を示すグラフ
である。ＴＮＦＲ−Ｆｃの発現を、ＴＮＦ阻害バイオアッセイを用いて決定した
。

【図１６】図１６は、ｒＡＡＶ−ＬａｃＺで処理され、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性
について組織化学的に染色された関節組織の写真である。

【図１７】図１７は、ｒＡＡＶ−ＬａｃＺで処理され、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性
について組織化学的に染色された関節炎関節組織の写真である。

【図１８】図１８は、ＰＢＳで処理され、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について組織
化学的に染色された関節炎関節組織の写真である。

【図１９】図１９は、ｒＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクターによる、ＳＣＷ誘導関節
炎の抑制を示すグラフである。各点は、ラットの各群に対する平均＋／−平均か
らの標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

【図２０】図２０は、ＡＡＶ−ラットＴＮＦＲ：Ｆｃベクターによる、対側関節における
関節炎症状の抑制を示すグラフである。足の各背面足根関節についてのＡＩスコ
アを、個別に記録し、そしてプロットした。各点は、ラットの各群に対する平均
＋／−平均からの標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

【図２１】図２１は、ＳＣＷ処理ラットにおける生物活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク
質の血清発現を示すグラフである。各点は、ラットの各群に対する平均＋／−標
準偏差（ＳＤ）を表す。

【図２２】図２２は、未処理のラットにおける生物活性ラットＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質
の血清発現を示すグラフである。各点は、ラットの各群に対する平均＋／−標準
偏差（ＳＤ）を表す。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１月２９日（２００２．１．２９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図２】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図３】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図４】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図７】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 29/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/00 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ステパン，アンソニーエム．アメリカ合衆国ワシントン 98110，シアトル，エス．ダブリュー．， 41エスティーアベニュー 3211 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA28 BA63 CA01 CA07 DA02 EA02 FA02 GA11 HA17 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA13 AA19 BA01 BA08 BA22 BA23 BA35 BA44 CA01 CA17 CA62 DA25 DA39 MA02 MA17 MA66 NA01 NA14 ZA962 ZB112 4C087 AA01 AA02 BB63 BC83 CA12 MA02 MA05 MA17 MA66 NA01 NA14 ZA96 ZB11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）の細胞外ドメインおよ
びＩｇＧ１分子の定常ドメインを含む、融合ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
【請求項２】前記ＴＮＦＲの細胞外ドメインが、ｐ７５ＴＮＦＲ由来で
ある、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項３】前記ＴＮＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
、異種プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載のｒＡＡＶベ
クター。
【請求項４】前記ＴＮＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
、構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載のｒＡＡＶ
ベクター。
【請求項５】前記ＴＮＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載のｒＡＡＶ
ベクター。
【請求項６】前記誘導性プロモーターが、ＴＮＦα遺伝子由来である、請
求項５に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項７】前記ポリヌクレオチドがさらに、インターロイキン−１（Ｉ
Ｌ−１）アンタゴニストを含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のｒ
ＡＡＶベクター。
【請求項８】前記ＩＬ−１アンタゴニストが、ＩＬ−１レセプターポリペ
プチドであり、ここで該ＩＬ−１レセプターポリペプチドは、ＩＬ−１に結合す
る、請求項７に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項９】前記ＩＬ−１レセプターポリペプチドが、ＩＬ−１レセプタ
ーＩＩ型ポリペプチドである、請求項８に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項１０】請求項１に記載のｒＡＡＶベクターでトランスフェクトさ
れた、哺乳動物細胞。
【請求項１１】請求項７に記載のｒＡＡＶベクターでトランスフェクトさ
れた、哺乳動物細胞。
【請求項１２】請求項１に記載のｒＡＡＶを含む、組成物。
【請求項１３】薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１２に記
載の組成物。
【請求項１４】請求項１に記載のｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶウイ
ルス粒子。
【請求項１５】請求項７に記載のｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶウイ
ルス粒子。
【請求項１６】哺乳動物におけるＴＮＦレベルを減少させる方法であって
、該哺乳動物におけるＴＮＦレベルを減少させるために十分な量の請求項１に記
載のｒＡＡＶベクターを、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】ＴＮＦアンタゴニストを投与する工程をさらに包含する、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】前記ｒＡＡＶベクターが、関節内注射によって投与される
、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】前記ｒＡＡＶが、前記哺乳動物の滑膜、軟骨、靱帯および
腱からなる群から選択される結合組織への注射によって投与される、請求項１６
に記載の方法。
【請求項２０】前記ｒＡＡＶベクターが、前記哺乳動物の関節空間を内張
りしている滑膜細胞に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】前記ｒＡＡＶベクターが、筋内注射によって投与される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】前記ｒＡＡＶベクターが、静脈内注射によって投与される
、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】哺乳動物における炎症応答を減少させる方法であって、該
哺乳動物における炎症応答を減少させるために十分な量の請求項１に記載のｒＡ
ＡＶベクターを、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】ＴＮＦアンタゴニストを投与する工程をさらに包含する、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】前記炎症応答が、結合組織において生じる、請求項２３に
記載の方法。
【請求項２６】前記炎症応答が、関節において生じる、請求項２３に記載
の方法。
【請求項２７】前記ｒＡＡＶベクターが、関節内注射によって投与される
、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】前記ｒＡＡＶが、前記哺乳動物の滑膜、軟骨、靱帯および
腱からなる群から選択される結合組織への注射によって投与される、請求項２３
に記載の方法。
【請求項２９】前記ｒＡＡＶベクターが、前記哺乳動物の関節空間を内張
りしている滑膜細胞に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】前記ｒＡＡＶベクターが、筋内注射によって投与される、
請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】前記ｒＡＡＶベクターが、静脈内注射によって投与される
、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】哺乳動物におけるＴＮＦ関連障害を緩和する方法であって
、該ＴＮＦ関連障害の状態を緩和させるために十分な量の請求項１に記載のｒＡ
ＡＶベクターを、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３３】ＴＮＦアンタゴニストを投与する工程をさらに包含する、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記ｒＡＡＶベクターが、関節内注射によって投与される
、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】前記ｒＡＡＶが、前記哺乳動物の滑膜、軟骨、靱帯および
腱からなる群から選択される結合組織に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】前記ｒＡＡＶベクターが、前記哺乳動物の関節空間を内張
りしている滑膜細胞に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】前記ｒＡＡＶベクターが、筋内注射によって投与される、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】前記ＴＮＦ関連障害が炎症性障害である、請求項３０に記
載の方法。
【請求項３９】前記炎症性障害が、関節炎状態である、請求項３２に記載
の方法。