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KR20150027829A - 항-cd22 항체를 포함하는 면역접합체 - Google Patents

항-cd22 항체를 포함하는 면역접합체 Download PDF

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KR20150027829A
KR20150027829A KR20157003046A KR20157003046A KR20150027829A KR 20150027829 A KR20150027829 A KR 20150027829A KR 20157003046 A KR20157003046 A KR 20157003046A KR 20157003046 A KR20157003046 A KR 20157003046A KR 20150027829 A KR20150027829 A KR 20150027829A
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KR
South Korea
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antibody
seq
amino acid
acid sequence
hvr
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Withdrawn
Application number
KR20157003046A
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English (en)
Inventor
폴 폴라키스
앤드류 폴슨
수잔 다이앤 스펜서
샹-판 유
존 에이. 플라이게어
자넷 엘. 건즈너-토스테
토마스 하덴 필로우
필립 윌슨 하워드
루크 매스터슨
Original Assignee
제넨테크, 인크.
스피로즌 살
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Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48803621&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20150027829(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 제넨테크, 인크., 스피로즌 살 filed Critical 제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 항-CD22 항체와 면역접합체 그리고 이를 이용하는 방법을 제시한다.

Description

항-CD22 항체를 포함하는 면역접합체{Immunoconjucates comprising anti-CD22 antibodies}
본 발명은 항-CD22 항체를 포함하는 면역접합체(immunoconjucates) 및 이를 이용하는 방법들에 관계된다.
B-세포항원, 이를 테면 CD19, CD22, 및 CD52는 임파종 치료를 위한 치료 가능성 표적을 나타낸다(Grillo-Lopez A.J. et al., Curr Pharm Biotechnol, 2:301-11, (2011). CD22는 분화의 성숙 단계에서만 오직 B-세포 표면상에서 발현되는 135-kDa B-세포-제한된 시알로당단백질이다(Dorken, B. et al., J. Immunol. 136:4470-4479(1986)). 인간에서 CD22의 주요 형태는 세포밖 도메인에 7개 면역글로블린 슈퍼패밀리 도메인이 포함된 CD22베타이다(Wilson, G.L. et al., J. Exp. Med. 173:137-146 (1991)). 변이 형태, CD22 알파는 면역글로블린 슈퍼패밀리 도메인 3 및 4가 부족하다(Stamenkovic, I. and Seed, B., Nature 345:74-77 (1990)). 인간 CD22에 리간드-결합은 면역글로블린 슈퍼패밀리 도메인 1과 2 (또한 에피토프 1과 2라고도 불림)와 연관된 것으로 나타났다(Engel, P. et al., J. Exp. Med. 181:1581-1586, 1995).
B 세포-관련된 장애는 악성 임파종 (비-호지킨(Hodgkin) 임파종, NHL), 다발성 골수종, 그리고 만성 림프모구 백혈병 (CLL, B 세포 백혈병 (CD5+ B 림프구)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. B 림프구로부터 주로 발생되는 이질성 암 집단인 비-호지킨 임파종(NHLs)은 새로 진단을 받은 모든 암의 대략적으로 4%를 나타낸다( Jemal, A. et al., CA-Cancer J Clin, 52: 23-47, (2002)). 공격적인 NHL은 성인 NHL의 대략적으로 30 - 40%를 포함하고(Harris, N.L. et al., Hematol. J. 1:53-66 (2001)) 미만성 거대 B-세포 임파종 (DLBCL), 맨틀 세포 임파종 (MCL), 말초 T-세포 임파종, 그리고 역형성 거대 세포 임파종을 포함한다. 프론트라인 복합 화학요법은 공격성 NHL 환자의 절반도 치료하지 못하고, 대부분 환자들은 결국 이들의 병에 굴복하게 된다(Fisher, R.I. Semin. Oncol. 27(suppl 12): 2-8 (2000)).
B-세포 NHL에서, CD22 발현은 공격적 집단과 무기력 집단에서 각각 91% 내지 99% 범위에 이른다(Cesano, A. et al., Blood 100:350a(2002)). CD22는 B-세포 활성화 복합체의 성분 (Sato, S. et al., Semin. Immunol. 10:287-296 (1998)) 그리고 흡착 분자(Engl, Pl t al., Immunol. 150:4719-4732(1993))로써 모두 기능을 할 수 있다. CD22-결함 마우스의 B 세포들은 더 짧아진 수명과 강화된 세포자가사멸을 가지며, 이는 B-세포 생존에서 이 항원의 역할을 제안한다 (Otipoby, K.L. et al., Nature (Lond) 384:634-637(1996)). 이의 천연 리간드(들) 또는 항체와 결합된 후, CD22는 신속하게 내화되며(internalized), 주요 B 세포와 신형성 B 세포에서 전-자가사멸성 신호에서 공동-자극 신호를 제공한다(Sato, S. et al., Immunity 5:551-562(1996)).
CD22-연합된 상태, 이를 테면 암의 진단 및 치료를 위하여 CD22를 표적으로 하는 물질이 당업계에서 요구된다. 본 발명은 이러한 수요를 충족시키고, 다른 장점들도 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 항-CD22 항체 및 면역접합체 그리고 이를 이용하는 방법들을 제시한다.
일부 구체예들에 있어서, 세포독성 물질에 공유적으로 부착된 CD22에 결합되는 항체를 포함하는 면역접합체가 제공되며, 이때 상기 항체는 서열 번호: 28의 아미노산 20 내지 240 안에 있는 에피토프에 결합된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 세포독성 물질은 피롤로벤조디아제핀이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (ii) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 그리고 (iii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 그리고 (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 다음을 포함한다: a) (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 그리고 (vi) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는 b) (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 (vi) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 다음을 포함한다: a) (i) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 (iii) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 b) (i) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 (iii) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열에 최소한 95% 서열 동일성을 보유하는 VH 서열; 또는 b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열에 최소한 95% 서열 동일성을 보유하는 VL 서열; 또는 c) (a)에서와 같은 VH 서열 그리고 (b)에서와 같은 VL 서열. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 보유하는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 보유하는 VL 서열 또는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 보유하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 항체다.
일부 구체예들에 있어서, 세포독성 물질에 공유적으로 부착된 CD22에 결합되는 항체를 포함하는 면역접합체가 제공되며, 이때 상기 항체는 (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 보유하는 VH 서열과 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 보유하는 VL 서열을 포함하며, 그리고 이때 상기 세포독성 물질은 피롤로벤조디아제핀이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 면역접합체는 식(formula) Ab-(L-D)p를 보유하며, 이때: (a) Ab는 항체이며; (b) L은 링커이며; (c) D는 세포독성 물질이며; 그리고 (d) p는 1-8이다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, D는 화학식 A의 피롤로벤조디아제핀이다:
Figure pct00001
이때 점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이에 이중 결합의 임의선택적 존재를 나타내며;
R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 그리고 COR로부터 독립적으로 선택되며, 그리고 할로 또는 디할로로부터 임의선택적으로 더 선택되며, 이때 RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R6과 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
Q는 O, S 그리고 NH로부터 독립적으로 선택되며;
R11은 H, 또는 R이거나 또는, Q가 O일 때, SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이고;
R 및 R'는 임의선택적으로 치환된 C1-8 알킬, C3-8 헤테로시클일 그리고 C5-20 아릴 기로부터 각각 독립적으로 선택되며, 그리고 NRR'기와 관련하여 임의선택적으로, R 및 R'는 이들에 부착된 질소 원자와 함께 임의선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원(membered) 헤테로사이클 고리를 형성하고;
R12, R16, R19 및 R17은 R2, R6, R9 및 R7에 대해 차례로 정의된 바와 같고;
R″는 C3-12 알킬렌 기이며, 이의 쇄는 하나 또는 그 이상의 이형원자 및/또는 임의선택적으로 치환된 방향족 고리에 의해 차단될 수 있으며; 그리고
X와 X'는 O, S 그리고 N(H)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, D는 하기 구조를 가진다:
Figure pct00002
이때 n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, D는 다음에서 선택된 구조를 가진다:
Figure pct00003
Figure pct00004
그리고
Figure pct00005
이때 RE 및 RE"는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택되며, 이때 RD 는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
이때 Ar1 및 Ar2는 각각 임의선택적으로 치환된 C5-20 아릴이며; 그리고
이때 n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, D는 구조식 B의 피롤로벤조디아제핀이다:
Figure pct00006
이때 수평 파동선은 링커에 공유적 부착 부위를 나타내고;
RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸, 페닐, 플루오로-치환된 페닐, 그리고 C5-6 헤테로시클일로부터 독립적으로 선택되며; 그리고
n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 면역접합체는 프로테아제에 의해 절단가능한 링커를 포함한다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 상기 링커는 val-cit 이펩티드 또는 Phe-homoLys 이펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 면역접합체는 다음 식을 가진다:
Figure pct00007
일부 구체예들에 있어서, p는 1-3이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 면역접합체는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00008
이때 CBA는 항체 (Ab)를 나타낸다. 일부 구체예들에 있어서, RL1 및 RL2는각각 H와 메틸로부터 독립적으로 선택되며, 또는 이들이 결합된 탄소원자와 함께 시클로프로필렌 기를 형성한다. 일부 구체예들에 있어서, Y는 단일 결합, (a1), 그리고 (a2)으로부터 선택된다:
이때 N은 상기 기(group)가 PBD 모이어티의 N10에 결합됨을 보여준다.
Figure pct00009
일부 구체예들에 있어서, 상기 면역접합체는 다음으로부터 선택된 구조를 포함한다:
Figure pct00010
Figure pct00011
그리고
Figure pct00012
일부 구체예들에 있어서, 상기 면역접합체는 다음의 구조를 포함한다:
Figure pct00013
이때 RE 및 RE"는 각각 H 및 RD로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 면역접합체는 다음 구조를 포함한다:
Figure pct00014
이때 Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의선택적으로 치환된 C5-20 아릴이다. 일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 임의선택적으로 치환된 페닐, 퓨라닐, 티오페닐 그리고 피리딜로부터 각각 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 면역접합체는 다음 구조를 포함한다:
Figure pct00015
이때 RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸, 임의선택적으로 치환된 페닐, 그리고 C5-6 헤테로시클일로부터 각각 독립적으로 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, RV1 및 RV2는 H, 페닐, 그리고 4-플루오로페닐로부터 각각 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 다음으로부터 선택된 화학식을 가지는 면역접합체가 제공된다:
Figure pct00016
그리고
Figure pct00017
이때 Ab는 (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 그리고 (vi) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체이며; 그리고 이때 p는 1 내지 3이다.
일부 구체예들에 있어서, 면역접합체가 제공되며, 이때 상기 면역접합체는 다음 화학식을 보유한다:
Figure pct00018
이때 Ab는 (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 (vi) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체이며; 그리고 이때 p는 1 내지 3이다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 보유하는 VH 서열 그리고 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 보유하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 26의 중쇄와 서열 번호: 23의 경쇄를 포함한다.
본 명세서에서 논의된 임의의 구체예들에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 인간, 인간화된, 또는 키메라 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 CD22에 결합하는 항체 단편이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 인간 CD22에 결합한다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 인간 CD22는 서열 번호: 28 또는 서열 번호: 29의 서열을 보유한다.
일부 구체예들에 있어서, 약학 제제(formulation)가 제공되며, 이때 제제는 본 명세서에서 설명된 면역접합체와 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 이 약학 제제는 추가 치료제를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 암에 걸린 개체를 치료하는 방법들이 제시된다. 일부 구체예들에 있어서, 이 방법은 본 명세서에서 설명된 면역접합체의 유효량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 암은 임파종, 비-호지킨 임파종 (NHL), 공격성 NHL, 재발된 공격성 NHL, 재발된 무기력한 NHL, 난치성 NHL, 난치성 무기력한 NHL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 소림프구성 임파종, 백혈병, 털모양 세포 백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 버킷(Burkitt) 임파종, 그리고 맨틀 세포 임파종으로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 이 방법은 상기 개체에게 추가 치료물질을 투여하는 것을 더 포함한다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 추가 치료물질은 CD79b에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 추가 치료물질은 세포독성 물질에 공유적으로 부착된 CD79b에 결합되는 항체가 포함된 면역접합체다.
일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 세포의 증식을 저해시키는 방법이 제시된다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 이 방법은 세포 표면 상에서 CD22에 상기 면역접합체의 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에서 설명된 면역접합체에 세포를 노출시키고, 이로 인하여 이 세포의 증식이 억제되는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 이 세포는 신생물 B 세포다. 일부 구체예들에 있어서, 이 세포는 임파종 세포다.
도 1a-1b: 도 1a는 인간 하위군 III 서열과 나란히 배열된, 뮤린 10F4 항-CD22 항체 (m10F4)의 중쇄 가변 영역, 인간화된 10F4 버젼 1 (hu10F4v1) 중쇄 가변 영역 그리고 인간화된 10F4 버젼 3 (hu10F4v3) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열들을 나타낸다. HVRs들은 네모상자로 표시된다(HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3). HVRs을 묶는 서열은 골격 서열 (FR-H1 내지 FR-H4)이다. Kabat 넘버링에 따라 서열에 번호가 부여된다. Kabat, Chothia, 그리고 접촉 CDRs은 상자로 표시된 HVRs 부근에 표시된다. 도 1b는 인간 카파 I 서열과 나란하게 배열된, 뮤린 10F4 항-CD22 항체 (m10F4)의 경쇄 가변 영역, 인간화된 10F4 버젼 1 (hu10F4v1) 경쇄 가변 영역 그리고 인간화된 10F4 버젼 3 (hu10F4v3) 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열들을 나타낸다. 상기 항체 hu10F4v3은 HVR-L1 (N28V)의 아미노산 28에서 hu10F4v1과 상이하다. HVRs들은 네모상자로 표시된다. FR-L1, FR-L2, FR-L3, 그리고 FR-L4 서열은 HVRs (HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3)를 묶는다. Kabat 넘버링에 따라 서열에 번호가 부여된다. Kabat, Chothia, 그리고 접촉 CDRs은 상자로 표시된 HVRs 부근에 표시된다.
도 2는 IgG1의 이소타입인 인간화된 항-CD22 항체 10F4v3의 경쇄 및 중쇄의 전장 아미노산 서열(가변 및 불변 영역)을 나타낸다. 밑줄 부분은 불변 도메인들이다.
도 3은 항-CD22 시스테인 조작된(engineered) 항체의 아미노산 서열을 나타내는데, 이때 경쇄 또는 중쇄 또는 Fc 영역은 선택된 아미노산 위치들에서 아미노산이 시스테인으로 대체되어 변경된다. 제시된 시스테인 조작된 이러한 항체는 Kabat 위치 205에서 발린(서열 위치 발린 210)은 시스테인으로 변경된 항-CD22 10F4 변이 경쇄("항-CD22 V205C h10Fv3 시스테인 조작된 경쇄"); EU 위치 118 (서열 위치 알라닌 121)에서 알라닌이 시스테인으로 변경된 항-CD22 10F4 변이 중쇄("항-CD22 A118C h10Fv3 시스테인 조작된 중쇄"); 그리고 EU 위치 400 (서열 위치 세린 403)에서 세린이 시스테인으로 변경된 항-CD22 10F4 변이 Fc 영역 ("항-CD22 S400C h10Fv3 시스테인 조작된 Fc 영역")을 포함한다. 각 도면에서, 변경된 아미노산은 두 줄 밑줄이 쳐진 굵은 글씨로 나타낸다. 한줄 밑줄은 불변 영역을 나타낸다. 가변 영역들은 밑줄이 없다.
도 4는 실시예 A에서 설명되는 (A) 10F4v3-PBD, (B) 10F4v3-SS-PBD, 그리고 (C) 10F4v3-SSMe-PBD의 링커 및 약물 구조를 나타낸다.
도 5는 실시예 B에서 설명된, WSU-DLCL2 마우스 이종이식편 모델에서 다양한 항체-약물 접합체의 효과를 나타낸다.
도 6은 실시예 C에서 설명된, Granta-519 마우스 이종이식편 모델에서 다양한 항체-약물 접합체의 효과를 나타낸다.
도 7은 실시예 D에서 설명된, SuDHL4-luc 마우스 이종이식편 모델에서 다양한 항체-약물 접합체의 효과를 나타낸다.
도 8은 실시예 E에서 설명된, SuDHL4-luc 마우스 이종이식편 모델에서 10F4v3-PBD에 의한 종양 성장의 약량-의존성 저해를 나타낸다.
도 9는 실시예 F에서 설명된, Bjab-luc 마우스 이종이식편 모델에서 10F4v3-PBD에 의한 종양 성장의 약량-의존성 저해를 나타낸다.
도 10은 실시예 G에서 설명된, WSU-DLCL2 마우스 이종이식편 모델에서 다양한 항체-약물 접합체의 효과를 보여준다.
I. 정의
본 명세서의 목적을 위한 "수용자 인간 골격(acceptor human framework)"이란 하기에서 정의된 바와 같이, 인간 면역글로블린 골격으로부터 유도된 경쇄 가변 도메인 (VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 골격의 아미노산 서열이 포함된 골격 또는 인간 공통(consensus) 골격이다. 인간 면역글로블린 골격 또는 인간 공통 골격"으로부터 유도된 "수용자 인간 골격은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 아미노산 변화 수는 10 또는 그 미만, 9 또는 그 미만, 8 또는 그 미만, 7 또는 그 미만, 6 또는 그 미만, 5 또는 그 미만, 4 또는 그 미만, 3 또는 그 미만, 또는 2 또는 그 미만이 된다. 일부 구체예들에 있어서, VL 수용자 인간 골격은 VL 인간 면역글로블린 골격 서열 또는 인간 공통 골격 서열에 대해 서열이 동일하다.
"친화력(Affinity)"은 한 분자(예컨데, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 짝 (예컨데, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 말한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "결합 친화력"은 결합 쌍(예컨데, 항체와 항원)의 구성요소 간 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화력을 말한다. 분자 X가 이의 짝 Y에 대한 친화력은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화력은 본 명세서에서 설명된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화력을 측정하는 특정한 설명된 예시적인 구체예들은 다음에서 기술된다.
"친화력 숙성된(matured)" 항체란 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 (HVRs)내 하나 또는 그 이상의 변경을 보유하여, 이러한 변경이 없는 부모 항체와 비교하였을 때, 이러한 변경이 항원에 대한 상기 항체의 친화력을 개선시키게 만드는, 항체를 지칭한다.
용어 "항-CD22 항체" 그리고 "CD22에 결합하는 항체"란 충분한 친화력으로 CD22에 결합할 수 있는 항체를 말하며, 이러한 항체는 CD22를 표적으로 하는 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 한 구체예에 있어서, 무관한, 비-CD22 단백질에 대한 항-CD22 항체의 결합 정도는 예컨데, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정되었을 때 CD22에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이 된다. 특정 구체예들에 있어서, CD22에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, , ≤ 5 Nm, , ≤ 4 nM, , ≤ 3 nM, , ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예컨데, 10-8 M 또는 그 미만, 예컨데 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨데, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 가진다. 특정 구체예들에 있어서, 항-CD22 항체는 상이한 종간에 CD22 가운데 보존된 CD22의 에피토프에 결합한다.
용어 "항체"는 광범위한 의미에서 본 명세서에서 이용되는데, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예컨데, 이중특이적 항체), 그리고 바람직한 항원-결합 활성을 나타내는 항체 단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 항체 구조들이 포괄된다.
"항체 단편"은 고유한 항체의 일부분이 포함된, 그리고 고유한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 고유한 항체가 아닌 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자(예컨데 scFv); 그리고 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
기준 항체로써, "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 기준 항체가 이의 항원에 결합하는 것을 50% 또는 그 이상으로 차단하는 항체를 지칭하고, 그리고 역으로, 기준 항체는 경쟁 분석에서 항체가 이의 항원에 결합하는 것을 50% 또는 그 이상으로 차단시킨다. 예시적인 경쟁 분석이 본 명세서에서 제시된다.
용어 "암" 및 "암의(cancerous)"란 통제안된 세포 성장/증식을 전형적으로 특징으로 하는 포유류의 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 설명한다. 암의 예로는 흑색종, 암종, 임파종 (예컨데, 호지킨 및 비-호지킨 임파종), 아세포종, 육종, 그리고 백혈병을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 좀더 구체적으로 암의 예로는 B-세포 연합된 암, 예로써, 고등급, 중등급 그리고 저등급의 임파종(B 세포 임파종 이를 테면, 예로써, 점막-연합된-림프 조직 B 세포 임파종 그리고 비-호지킨 임파종 (NHL), 맨틀 세포 임파종, 버킷 임파종, 소림프구성 임파종, 변연부 임파종, 미만성 거대 세포 임파종, 소포 임파종, 그리고 호지킨 임파종 그리고 T 세포 임파종을 포함) 그리고 백혈병(2차 백혈병, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 이를 테면 B 세포백혈병 (CD5+ B 림프구), 골수성 백혈병, 이를 테면 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프 백혈병, 이를 테면 급성 임파아구성 백혈병 (ALL) 그리고 골수이형성을 포함), 그리고 다른 조혈 및/또는 B 세포- 또는 T-세포-연합된 암을 포함한다. 다형핵 백혈구, 이를 테면 호염기성, 호산구, 호중구, 그리고 단세포, 수상돌기세포, 혈소판, 적혈구 그리고 천연 킬러 세포가 포함된 추가 조혈 세포의 암도 또한 포함된다. 다음에서 선택된 암성 B 세포 증식성 장애들이 또한 포함된다: 임파종, 비-호지킨 임파종 (NHL), 공격성 NHL, 재발된 공격성 NHL, 재발된 무기력한 NHL, 난치성 NHL, 난치성 무기력한 NHL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 소림프구성 임파종, 백혈병, 털모양 세포백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 그리고맨틀 세포 임파종. B-세포암의 기원은 다음을 포함한다: 변연부, 소포 임파종 그리고 미만성 거대 B-세포 임파종에서 기억 B-세포에서 변연부 B-세포 임파종의 기원은 배중심의 밝은 영역에 있는 중심세포(centrocytes)에서 유래되고, 만성 림프모구 백혈병과 소임파성 백혈병은 B1 세포 (CD5+)에서 유래되고, 맨틀 세포 임파종은 맨틀 영역내 고유 B-세포에서 유래되고, 그리고 버킷 임파종은 배중심의 어두운 영역내 중심아세포에서 유래된다. 본 명세서에서 "조혈 세포 조직"으로 언급된 조혈 세포를 포함하는 조직은 흉선과 골수 그리고 말초 림프 조직, 이를 테면 비장, 림프절, 점막과 연합된 림프 조직, 이를 테면 장-연합된 림프 조직, 편도선, Peyer의 패취(patches) 그리고 맹장 그리고 다른 점막 조직과 연합된 림프 조직, 예로써, 기관지 내벽을 포함한다. 이러한 암의 추가 특정 예로는 편평 세포 암, 소(small)-세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편명 암종, 복막의 암, 간세포 암, 위장 암, 췌장 암, 신경교종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 내막암 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간의 암종, 백혈병 그리고 다른 임파증식성 장애, 그리고 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본 명세서에서 "B-세포 악성"은 낮은 등급/소포 NHL, 소림프구성 (SL) NHL, 중간 등급/소포 NHL, 중간 등급 미만성 NHL, 높은 등급의 면역아세포 NHL, 높은 등급 임파아구성 NHL, 높은 등급 소(small) 비-절단된 세포 NHL, 거대 질환(bulky disease) NHL, 맨틀 세포 임파종, AIDS-관련된 임파종, 그리고 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 비-호지킨 임파종 (NHL), 림프구 현저 호지킨 질환(LPHD), 소림프구성 임파종 (SLL), 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 재발된 무기력한 NHL 그리고 리투시맙(rituximab)-난치성 무기력한 NHL이 포함된 무기력한 NHL을 포함하는 비-호지킨 임파종 (NHL); 급성 임파아구성 백혈병 (ALL), 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 털모양 세포 백혈병, 만성 골수아구성 백혈병을 포함하는 백혈병; 버킷 임파종; 맨틀 세포 임파종; 그리고 기타 혈액 악성을 포함한다. 이러한 악성은 B-세포 표면 지표, 이를 테면 CD22에 대하여 지향된 항체로 치료될 수 있다. 이러한 질환은 B 세포 표면 지표, 이를 테면 CD22에 대항하여 지향된 항체의 투여에 의해 치료되는 것으로 고려되며, 그리고 접합안된 ("네이키드(naked)") 항체 또는 본 명세서에서 공개된 세포독성 물질에 접합된 항체의 투여를 포함한다. 이러한 질환은 본 발명의 항-CD22 항체 또는 또다른 항체 또는 항체 약물 접합체, 또다른 세포 독성 물질, 방사능 또는 다른 치료와 병용하여 동시에 또는 연속적으로 본 발명의 항-CD22 항체 약물 접합체가 포함된 복합 요법에 의해 치료될 수 있는 것으로 고려된다. 예시적인 치료 방법에서, 항-CD22 면역접합체는 항-CD79b 항체, 면역글로블린, 또는 이의 CD79b 결합 단편과 복합되어 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 항- CD79b 항체는 네이키드 항체 또는 항체 약물 접합체일 수 있다. 또다른 예시적인 치료 방법에서, 항-CD22 면역접합체는 항-CD20 항체, 면역글로블린, 또는 이의 CD20 결합 단편과 복합되어, 함께 또는 순차적으로 투여된다. 항-CD20 항체는 네이키드 항체 또는 항체 약물 접합체일 수 있다. 복합 요법의 일부 구체예들에 있어서, 항-CD22 면역접합체는 Rituxan® (리투시맙)과 함께 투여된다.
본원 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "비-호지킨 임파종" 또는 "NHL"는 호지킨 임파종 이외의 임파계의 암을 지칭한다. 호지킨 임파종은 일반적으로 호지킨 임파종에서 Reed-Sternberg 세포의 존재와 비-호지킨 임파종에서 상기 세포들의 부재로 비-호지킨 임파종으로부터 구별될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 이 용어에 포괄되는 비-호지킨 임파종의 예로는 당업계에 공지된 분류 체계 이를 테면 Revised European-American Lymphoma (REAL) scheme as described in Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000)에 따라 당업자(예컨대, 종양학자 또는 병리학자)에 의해 확인되는 임의의 것들을 포함한다. 특히, 도. 11.57, 11.58 그리고 11.59에 있는 목록 참고. 좀더 구체적인 예들은 재발된 또는 난치성 NHL, 프론트 라인 낮은 등급 NHL, 단계 III/IV NHL, 화학요법 저항성 NHL, 전구물질 B 임파아구성 백혈병 및/또는 임파종, 소림프구성 임파종, B 세포만성 림프모구 백혈병 및/또는 전림프구 백혈병 및/또는 소림프구성 임파종, B-세포전림프구 임파종, 면역종 및/또는 림프구형질세포성 임파종, 림프구형질세포성 임파종, 변연부 B 세포 임파종, 비장의 변연부 임파종, 외부결절성 변연부 - MALT 임파종, 결절성 변연부 임파종, 털모양 세포백혈병, 형질구종 및/또는 혈장 세포 골수종, 낮은 등급/소포 임파종, 중간 등급/소포 NHL, 맨틀 세포 임파종, 여포 중심 임파종 (소포), 중간 등급 미만성 NHL, 미만성 거대 B-세포 임파종, 공격성 NHL (공격성 프론트-라인 NHL 및 공격성 재발된 NHL을 포함), 자가 줄기세포 이식 후 재발된 또는 자가줄기세포 이식에 대해 난치성 NHL, 원발성 종격동 거대 B-세포 임파종, 원발성 삼출액 임파종, 높은 등급 면역아세포 NHL, 높은 등급 임파아구성 NHL, 높은 등급 소(small) 비-절단된 세포NHL, 거대 질환(bulky disease) NHL, 버킷 임파종, 전구물질 (말초) 거대 과립 림프구 백혈병, 균상식육종 및/또는 세자리 증후군(Sezary syndrome), 피부(cutaneous) 임파종, 역형성 거대 세포 임파종, 혈관중심성 임파종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "키메라(chimeric)" 항체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 원료 또는 종으로부터 유도되며, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 원료 또는 종으로부터 유도된 항체를 지칭한다.
항체의 "분류(class)"는 불변 도메인의 유형 또는 이의 중쇄가 보유하는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 일부는 하위분류(이소타입)으로 더 세분될 수 있는데, 예컨데, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 그리고 IgA2. 면역글로블린의 상이한 분류에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 그리고 μ로 불린다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "세포독성 물질"은 세포 기능을 저해 또는 막거나 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성 물질은 방사능 동위원소(예컨데, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 그리고 Lu의 방사능활성 동위원소); 화학요법 물질 또는 약물 (예컨데, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 옥소루비신, 멜파란, 미토마이신 C, 클로람부칠, 다우노루비친 또는 다른 삽입(intercalating) 물질); 성장 저해 물질; 효소 및 이의 단편들 이를 테면 핵산분해 효소; 항생제; 톡신 이를 테면, 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 소(small) 분자 톡신 또는 효소적으로 활성 톡신, 이의 단편 및/또는 변이 포함; 그리고 하기에서 논의되는 다양한 항종양 또는 항암 물질들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"화학요법 물질"은 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법 물질의 예로는 알킬화 물질, 이를 테면 티오테파 및 사이클로포스파미드 (CYTOXAN®); 알킬 술포네이트 이를 테면 부술판, 임프로술판 그리고 피포술판; 아지리딘 이를 테면 벤조도파, 칼보쿠온, 메투레도파, 그리고 우레도파; 에틸렌이민 그리고 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜라민을 포함하는 메알아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파촌; 라파촐; 콜치시넨; 베툴리닌산; 캄포테신(합성 유사체 토포테칸 포함(HYCAMTIN®), CPT-11 (이리도테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄포테신, 스코포렉틴, 그리고 9-아미노캄포테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도켈레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필라톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1과 크립토피신 8); 도라스태틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체 포함, KW-2189 및 CB1-TM1); 에루테로빈; 판크라티스태틴; 사르코딕틴; 스폰기스태틴; 질소 무스타드, 이를 테면 클로람부칠, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥스드 히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비친, 페네스테린, 프레디니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 무스타드; 니트로소우레아 이를 테면 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 그리고 라님무스틴; 항생제 이를 테면 에네디네(enediyne) 항생제 (가령, 칼리케아미, 특히 칼리케아미신 감마 1I 그리고 칼리케아미신 오메가 I1 (예컨데, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참조); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스태틴 발색단 그리고 관련된 색소단백질 에네디네 항생제 발색단), 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 카티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모미신, 닥티노마이신, 다우노루비친, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 옥소루비신 (몰포리노-옥소루비신, 시아노몰포리노-옥소루비신, 2-피롤리노-옥소루비신 그리고 데옥시옥소루비신을 포함), 에피루비신, 에소르루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 이를 테면 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙조신, 부베르시딘, 우베니멕스, 지노스태틴, 조루비신; 항-대사물질 이를 테면 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 이를 테면 데노프테린, 메토트렉세이트, 테로프테린, 트렘트렉세이트; 퓨린 유사체 이를 테면 플루다라빈, 6-멀캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 이를 테면 안시타빈, 아자시티빈, 6-아자우리딘, 카르보푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록우리딘; 그리고로겐 이를 테면 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날 이를 테면 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충물 이를 테면 프로리닌산; 아세갈톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불리닌산; 에니루라실; 암사크린; 베스트라부칠; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜친; 디아지퀴논; 엘포르니틴; 엘리프티니움 아세테이트; 에포티론; 에토글루시드; 갈리늄 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다닌; 메이탄시노이드 이를 테면 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스태틴; 페나메트; 피라루비친; 로스옥산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리조신; 시조피란; 스피로게르마니움; 테나우아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리초테센(특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 아구니딘); 우레탄; 벤데신(ELDISINE®, FILDESIN®); 다크라바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예컨데, 파클리탁셀(TAXOL®; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM Cremophor-프리, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 그리고 도세탁셀 (TAXOTERE®; Rh
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ne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로라부칠; 겜시타빈(GEMZAR®); 6-티오구아닌; 멀캅토퓨린; 메토트렉세이트; 플라티늄 유사체 이를 테면 시스플라틴과 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 플라티늄; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소메라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드 이를 테면 레티논산; 카페시타빈(XELODA®); 상기중 임의의 것의 약학적으로 수용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기의 2개 또는 그 이상의 조합 이를 테면 CHOP, 사이클로포스파미드, 옥소루비신, 빈크리스틴, 그리고 프레디솔론의 복합 치료제의 약어; CVP, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 그리고 프레디솔론의 복합 치료제의 약어; 그리고 FOLFOX, 옥살리플라틴 (ELOXATINTM)과 5-FU 및루코보린이 복합된 치료 섭생의 약어를 포함한다.
"작용기 (Effector) 기능"이란 항체의 Fc 영역에 기여하는 생물학적 활성을 지칭하는데, 상기 항체 이소타입에 따라 변화된다. 항체 작용기 기능의 예로는 다음을 포함한다; C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-중개된 세포독성 (ADCC); 식작용; 세포표면 수용체 (예컨데 B 세포 수용체)의 하향 조절; 그리고 B 세포 활성화.
물질, 예컨데, 약학 제제의 "유효량"이란 바람직한 치료 또는 예방 결과를 획득하기 위하여 필요한 약량 및 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합되는 항원 분자상의 특정 부위를 말한다.
본원 명세서에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 최소한 일부분이 포함된 면역글로블린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 이용된다. 이 용어는 고유한 서열 Fc 영역과 변이 Fc 영역을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복시-말단까지 이어진다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 특별히 언급되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 번호 매김은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 것과 같이 EU 색인이라고도 불리는 EU 넘버링 체계에 따른다.
"골격(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 4개의 FR 도메인들: FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장(full length) 항체", "고유한 항체" 그리고 "전체 항체"는 본 명세서에서 서로 호환되며, 고유한 항체 구조에 실질적으로 유사한 구조를 가지는 항체 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 Fc 영역이 포함된 중쇄를 보유하는 항체를 지칭한다.
용어 "CD22의 당화된 형태(glycosylated forms)"는 탄수화물 잔기의 추가에 의해 해독후 변형된 CD22의 자연 발생 형태를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포 계통", 그리고 "숙주 세포 배양물"은 호환되며, 외생 핵산이 도입된 세포를 지칭하며, 이러한 세포의 자손도 포함된다. 숙주 세포는 "형질변환체(transformants)" 및 "형질변환 세포"를 포함하는데, 이들은 1차 형질변환 세포와 계대수에 무관하게 이로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량에서 완전하게 일치하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질변환 세포에서 선별 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 자손이 본 명세서에서 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체 또는 인간 항체 레퍼토리를 이용하는 비-인간 원료 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열로부터 유도된 항체의 것에 대응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기가 포함된 인간화된 항체는 특별히 배제된다.
"인간 공통 골격(human consensus framework)"은 인간 면역글로블린 VL 또는 VH 골격 서열의 선별에서 가장 흔하기 발생되는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로블린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열들의 하위군(subgroup)로부터 한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서 설명된 하위군이다. 한 구체예에 있어서, VL의 경우, 하위군은 Kabat et al., supra에서 설명된 것과 같은 카파 I 하위군이다. 한 구체예에 있어서, VH의 경우, 하위군은 Kabat et al., supra에서 설명된 것과 같은 하위군 III이다.
"인간화된(humanized)" 항체란 비-인간 HVRs의 아미노산 잔기와 인간 FRs의 아미노산 잔기가 포함된 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화된 항체는 최소한 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인들을 실질적으로 포함하는데, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVRs (예컨데, CDRs)은 비-인간 항체의 것들에 대응되며, 그리고 모든 또는 실질적으로 모든 FRs은 인간 항체의 것에 대응된다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부분을 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 예컨데, 비-인간 항체는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변적인 및/또는 구조적으로 특정된 루프("초가변 루프")를 만드는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 고유한 4개-쇄 항체는 6개의 HVRs를 포함하는데; VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에서 3개 (L1, L2, L3). HVRs는 일반적으로 초가변 루프의 아미노산을 포함하거나 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDRs)의 아미노산을 포함하는데, 후자의 경우 최대 서열 가변성이고 및/또는 항원 인식에 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생된다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) 예시적인 CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 그리고 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 그리고 H3의 95-102에서 발생된다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH에서 CDR1를 제외하고, CDRs는 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 일반적으로 포함한다. CDRs는 또한 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDRs"를 포함하는데, 이것은 항원과 접촉되는 잔기들이다. SDRs는 단축된(abbreviated)-CDRs, 또는 a-CDRs로 불리는 CDRs의 영역내에 포함된다. 예시적인 a-CDRs (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 그리고 a-CDR-H3)는 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 그리고 H3의 95-102에서 발생된다. (Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) 다른 언급이 없는 한, 가변 도메인에서 HVR 잔기 및 잔기들(예컨데, FR 잔기)는 Kabat et al., supra에 따라 번호매김된다.
"면역접합체"는 세포독성 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체다.
"개체" 또는 "대상"은 포유류다. 포유류는 길들여진 동물들(예컨데, 소, 양, 고양이, 개 그리고 말), 영장류(예컨데, 인간과 인간이 아닌 영장류 이를 테면 원숭이), 토끼 그리고 설치류(예컨데, 마우스 및 렛)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에 있어서, 개체 또는 대상는 인간이다.
"단리된(isolated) 항체"는 이 항체의 자연적 환경 성분으로부터 분리된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 항체는 예로써, 전기영동 (예컨데, SDS-PAGE, 등전성 포커싱(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예컨데, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 이상 또는 99% 순도로 정제된다. 항체 순도를 평가하는 방법들에 대한 검토는 예컨데, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)를 참고한다.
"단리된 핵산"은 이의 자연적 환경으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 이 핵산 분자가 보통 포함된 세포안에 내포된 핵산 분자를 포함하지만, 그러나 이 핵산 분자는 염색체외 또는 이의 자연적 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재된다.
"항-CD22 항체를 인코드하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 지칭하는데, 단일 벡터 또는 별도 벡터에 있는 이러한 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 안에 하나 또는 그 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)들도 포함된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "CD22"는 다른 언급이 없는 한, 포유류 이를 테면 영장류 (예컨데 인간, 시노몰구스 원숭이 (cyno)) 그리고 설치류 (예컨데, 마우스와 렛)이 포함된 임의의 척추동물 기원의 임의의 고유한 CD22를 지칭한다. 이 용어는 가공안된 "전장" CD22 뿐만 아니라 세포 안에서 가공되어 생성된 임의의 형태의 CD22를 포괄한다. 이 용어는 또한 자연적으로 생성된 CD22의 변이, 예컨데, 접합(splice) 변이, 대립형질 변이, 그리고 이소폼(isoforms) 또한 포괄한다. CD22의 주요 이소폼 (CD22베타)은 847개의 아미노산과 세포밖 도메인 안에 7개의 면역글로블린-유사 영역을 포함한다(Wilson, G.L. et al., J. Exp. Med. 173:137-146 (1991)). 소수의 이소폼인 CD22알파는 647개의 아미노산을 포함하고, 세포밖 도메인 안에 면역글로블린-유사 도메인 3 및 4가 부족하다(Stamenkovic, I. and Seed, B., Nature 345:74-77 (1990)) 그리고 Wilson et al. (1991), 상기를 참고). 예시적인 인간 CD22베타 전구물질의 아미노산 서열 (신호 서열과 함께)은 서열 번호: 28에 나타낸다. 예시적인 인간 성숙 CD22베타의 아미노산 서열(신호 서열 없이)은 서열 번호: 29에 나타낸다. 예시적인 인간 CD22알파 전구물질의 아미노산 서열 (신호 서열과 함께)은 서열 번호: 30에 나타낸다. 예시적인 인간 성숙 CD22알파의 아미노산 서열(신호 서열 없이)은 서열 번호: 31에 나타낸다.
용어 "CD22-양성 암"은 이들의 표면에 CD22를 발현시키는 세포들이 포함된 암을 지칭한다.
용어 "CD22-양성 세포"는 이의 표면에서 CD22를 발현시키는 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 상동성 항체, 가령, 동일한 집단 및/또는 동일한 에피토프에 결합되는 항체 집단에서 획득된 항체를 지칭하는데, 있을 수 있는 변이 항체, 예컨데, 자연적으로 발생되는 돌연변이 또는 단클론 항체 집단의 생산 동안 생성된 변이 항체는 제외되며, 이러한 변이는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부(에피토프)를 지향하는 상이한 항체가 일반적으로 포함된 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 집단의 각 단클론 항체는 항원 상에 단일 결정부위를 지향한다. 따라서, 변형자( modifier) "단클론"은 실질적으로 상동성 항체 집단으로부터 획득된 항체의 특징을 나타내고, 그리고 임의의 특정 방법으로 항체 생산이 필요한 것으로 간주되지는 않는다. 예로써, 본 발명에 따라 이용되는 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이, 그리고 인간 면역글로블린 좌(loci)의 전부 또는 일부가 포함된 유전자전이 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있고, 단클론 항체를 만드는 이러한 방법 및 다른 예시적인 방법들은 본 명세서에서 설명된다.
"네이키드(naked) 항체"는 이질성 모이어티 (예컨데, 세포독성 모이어티) 또는 방사능라벨에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약학 제제 안에 존재할 수 있다.
"고유한 항체"는 다양한 구조를 가진 자연 발생적 면역글로블린 분자들을 지칭한다. 예로써, 고유한 IgG 항체는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄가 이황화결합된 약 150,000 달톤의 이형사합체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고 불리는 가변 영역(VH), 이어서 3개의 불변 도메인들 (CH1, CH2, 그리고 CH3)을 보유한다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 불리는 가변 영역(VL), 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 보유한다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형중 하나에 해당될 수 있다.
용어 "포장 삽입물(package insert)"은 징후, 용도, 용량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 이러한 치료 산물의 사용과 관련된 경고에 관련된 정보가 포함된, 치료제의 시판 포장에 관례적으로 포함되는 지시사항을 이를 때 사용된다.
기준 폴리펩티드서열에 대하여 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 최대 서열 상동성 비율을 얻기 위하여 서열들을 배열하고, 필요에 따라 갭을 도입시킨 후, 기본 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 안에 있는 아미노산 잔기의 비율로 정의되는데, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적으로 하는 배열은 당업계 숙지된 범위내 다양한 방식으로 이루어질 수 있으며, 예를 들면, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 이를 테면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용한다. 당업계 숙련자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 배열을 획득하는데 요구되는 임의의 알고리즘이 포함된 서열을 배열하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 목적을 위하여, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 기획되었으며, 그리고 원천 코드는 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 사용자 서류와 함께 기록되어 있고, 이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California으로부터 공개적으로 이용가능하며, 또는 원천 코드로부터 적성될 수도 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운용 체계상에서 이용될 수 있도록 작성되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 변화되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위하여 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (이것은 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 %의 아미노산 서열 동일성을 보유 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 대체 표현될 수도 있음)은 다음과 같이 산출된다:
분수 X/Y 에 곱하기 100
여기에서 X는 A 및 B의 프로그램 배열에서 서열 배열 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 합치로 기록된 아미노산 잔기의 수를 나타내며, 그리고 Y는 B에 있는 전체 아미노산 잔기의 수를 나타낸다. 아미노산 서열 A의 길이가 B의 아미노산 서열 의 길이와 대등하지 않을 때, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %과는 대등하지 않을 것이라는 것을 인지할 수 있다. 구체적으로 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 단락에서 설명된 것과 같이 획득된다.
용어 "약학 제제"는 제제안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 허용하는 형태 그리고 제제가 대상에게 투여될 때 수용불가능한 독성이 있는 추가 성분들이 포함되지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 수용가능한 운반체"는 대상에게 비독성이면서, 활성 성분이 아닌 약학 제제 안에 있는 성분을 지칭한다. 약학적으로 수용가능한 운반체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "치료" (그리고 이의 문법적으로 변화된 형태 이를 테면 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 치료될 개체의 자연 과정을 변경시키는 시도와, 예방을 위한 또는 임상 병리 과정 동안에 실행될 수 있는 임상적 중재를 말한다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지, 증상의 완화, 질환의 병리학적 임의의 직접 또는 간접적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 그리고 차도 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 면역접합체는 질환의 발달을 지연 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 이용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 항체의 결합에 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유한 항체의 중쇄 및 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인들은 유사한 구조를 보유하는데, 각 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FRs)과 3개의 초가변 영역(HVRs)을 포함한다. (예컨데, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인들의 라이브러리를 각각 스크리닝하기 위하여 항원에 결합되는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예컨데, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또다른 핵산의 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 이 용어는 자체-복제가능한 핵산구조로써의 벡터 구조 뿐만 아니라 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈 안에 통합된 벡터도 포함한다. 특정 벡터는 기능적으로 연계된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원 명세서에서 "발현 벡터"라고 한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 구절 "임의선택적으로 치환된"이란 치환되거나 치환되지 않을 수 있을 수 있는 부모 기와 관계된다.
다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 용어 "치환된"이란 하나 또는 그 이상의 치환체를 보유하는 부모 기에 관련된 것이다. 용어 "치환체"는 통상적인 의미로 본 명세서에서 이용되며, 부모기에 적절하게 융합되거나 공유적으로 부착된 화학 모이어티를 지칭한다. 광범위한 치환체들이 공지되어 있으며, 그리고 이의 형성 및 다양한 부모기로의 도입 방법 또한 공지되어 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 치환체(임의선택적 치환체 포함)는 상기 항체에 비반응성인 기들에 한정된다. 일부 구체예들에 있어서, 링커 (L)을 통하여 PBD 화합물의 N10 위치에서 상기 항체에 연결이 형성된다. 일부 경우에서 PBD 구조의 다른 부분에 위치된 반응성 기능기는 상기 항체에 추가 결합을 형성할 수 있다(이를 교차연결(crosslinking)이라고 부를 수 있다). 일부 경우에서 이러한 추가 결합은 접합체의 운반 및 생물학적 활성을 변경시킬 수 있다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 추가 치환체는 반응 기능성이 부족한 것들에 제한된다.
일부 구체예들에 있어서, 치환체는 R, OR, SR, NRR', NO2, 할로, CO2R, COR, CONH2, CONHR, 그리고 CONRR'에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 치환체는 R, OR, SR, NRR', NO2, CO2R, COR, CONH2, CONHR, 그리고 CONRR'에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 치환체는 R, OR, SR, NRR', NO2, 그리고 할로에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 치환체는 R, OR, SR, NRR', 그리고 NO2로 구성된 그룹에서 선택된다.
상기에서 논의된 임의의 구체예들은 본 명세서에서 설명된 임의의 치환체에 적용될 수 있다. 대안으로, 치환체는 하기에서 논의되는 하나 또는 그 이상의 기로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "C1-12 알킬"은 1 내지 12개의 탄소원자를 가지는 탄화수소 화합물의 탄소원자로부터 수소를 제거함으로써 획득되는 단가(monovalent) 모이어티에 관계되며, 이때 탄화수소 화합물은 지방족이며, 고리 또는 비고리(acyclic)일 수 있으며, 포화 또는 불포화(예컨데 부분적으로 불포화, 완전하게 불포화)될 수 있다. 따라서, 용어 "알킬"은 하기에서 논의되는 바와 같이, 하위-부류 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 등을 포함한다.
포화 알킬 기의 예는 메틸 (C1), 에틸 (C2), 프로필 (C3), 부틸 (C4), 펜틸 (C5), 헥실 (C6) 그리고 헵틸 (C7)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포화 선형 알킬 기의 예는 메틸 (C1), 에틸 (C2), n-프로필 (C3), n-부틸 (C4), n-펜틸 (아밀) (C5), n-헥실 (C6) 그리고 n-헵틸 (C7)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포화 분기화된 알킬 기의 예로는 이소-프로필 (C3), 이소부틸 (C4), sec-부틸 (C4), tert-부틸 (C4), 이소-펜틸 (C5), 그리고 네오-펜틸 (C5)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
알킬 기는 O, N(H) 그리고 S로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 이형원자에 의해 임의선택적으로 중단될 수 있다. 이러한 기를 "헤테로알킬"이라고 할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "C2-12 헤테로알킬"은 2 내지 12개의 탄소원자를 가지는 탄화수소 화합물의 탄소원자로부터 수소를 제거함으로써 획득되는 단가(monovalent) 모이어티에 관계되며, 그리고 하나 또는 그 이상의 헤테로원자는 O, N(H) 그리고 S, 바람직하게는 O 및 S로부터 선택된다.
헤테로알킬 기의 예로는 하나 또는 그 이상의 에틸렌 글리콜 단위 -(OCH2CH2)-를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 헤테로알킬 가의 말단은 헤테로원자의 주요 형태, 예컨데 -OH, -SH 또는 -NH2일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 말단은 -CH3이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "C2-12 알케닐"은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 보유하는 알킬 기에 관계된다.
불포화 알케닐 기의 예로는 에테닐 (비닐, -CH=CH2), 1-프로페닐 (-CH=CH-CH3), 2-프로페닐 (아릴, CHCH=CH2), 이소프로페닐 (1-메틸비닐, -C(CH3)=CH2), 부테닐 (C4), 펜테닐 (C5), 그리고 헥세닐(C6)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "C2-12 알키닐"은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 보유하는 알킬 기에 관계된다.
불포화 알키닐 기의 예로는 에티닐 (-C≡CH) 그리고 2-프로피닐(프로파르길, -CH2C≡CH)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "C3-12 시클로알킬"은 시클일 기이기도 한 알킬 기에 관계되는데; 즉, 3개 내지 7개 탄소 원자를 보유하는 모이어티와 3 내지 7개 고리 원자가 포함된 고리 탄화수소(카르보사이클) 화합물의 지환식 고리로부터 수소 원자를 제거함으로써 획득된 단가 모이어티이다.
시클로알킬 기의 예로는 다음으로부터 유도된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다:
(i) 포화 모노사이클 탄화수소 화합물들:
시클로프로판 (C3), 시클로부탄 (C4), 시클로펜탄 (C5), 시클로헥산 (C6), 시클로헵탄 (C7), 메틸시클로프로판 (C4), 디메틸시클로프로판 (C5), 메틸시클로부탄 (C5), 디메틸시클로부탄 (C6), 메틸시클로펜탄 (C6), 디메틸시클로펜탄 (C7) 그리고메틸시클로헥산 (C7);
(ii) 불포화 모노사이클 탄화수소 화합물들:
시클로프로펜 (C3), 시클로부텐 (C4), 시클로펜텐 (C5), 시클로헥센 (C6), 메틸시클로프로펜 (C4), 디메틸시클로프로펜 (C5), 메틸시클로부텐 (C5), 디메틸시클로부텐 (C6), 메틸시클로펜텐 (C6), 디메틸시클로펜텐 (C7) 그리고메틸시클로헥센 (C7); 그리고
(iii) 포화 폴리사이클 탄화수소 화합물들:
노르카란(C7), 노르피난(C7), 노르보난(C7).
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "C3-20 헤테로시클일"은 헤테로사이클 화합물의 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 획득되는 단가 모이어티에 관계되는데, 이 모이어티는 3 내지 20개 고리 원자를 보유하며, 이들중 1 내지 10개는 고리 헤테로원자다. 일부 구체예들에 있어서, 각 고리는 3 내지 7개 고리 원자를 보유하며, 이들중 1 내지 4개는 고리 헤테로원자다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 접두부 (예컨데 C3-20, C3-7, C5-6, 등.)는 고리 원자의 수, 또는 고리 원자의 수의 범위, 탄소 원자 또는 헤테로 원자를 나타낸다. 예로써, 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "C5-6 헤테로시클일"은 5 또는 6개의 고리 원자를 보유한 헤테로시클일 기에 관계된다.
모노사이클 헤테로시클일 기의 예들은 다음으로부터 유도된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다:
(i) N1: 아지리딘 (C3), 아제티딘(C4), 피롤리딘(테트라히드로피롤) (C5), 피롤린(예컨데, 3-피롤린, 2,5-디히드로피롤) (C5), 2H-피롤 또는 3H-피롤 (이소피롤, 이소아졸) (C5), 피페리딘 (C6), 디히드로피리딘 (C6), 테트라히드로피리딘 (C6), 아제핀(C7);
(ii) O1: 옥시란 (C3), 옥세탄(C4), 옥소란(테트라히드로퓨란) (C5), 옥솔(디히드로퓨란) (C5), 옥산(테트라히드로피란) (C6), 디히드로피란 (C6), 피란 (C6), 옥세핀(C7);
(iii) S1: 티이란(C3), 티에탄(C4), 티오란(테트라히드로티오펜) (C5), 티안 (테트라히드로티오피란) (C6), 티에판(C7);
(iv) O2: 디옥소란 (C5), 디옥산 (C6), 그리고 디옥세판 (C7);
(v) O3: 트리옥산(C6);
(vi) N2: 이미다졸리딘 (C5), 피라졸리딘(디아졸리딘) (C5), 이미다졸린 (C5), 피라졸린(디히드로피라졸) (C5), 피페라진(C6);
(vii) N1O1: 테트라히드로옥사졸 (C5), 디히드로옥사졸 (C5), 테트라히드로이소옥사졸 (C5), 디히드로이소옥사졸 (C5), 몰포린 (C6), 테트라히드로옥사진 (C6), 디히드로옥사진 (C6), 옥사진 (C6);
(viii) N1S1: 티아졸린(C5), 티아졸리딘 (C5), 티오몰포린 (C6);
(ix) N2O1: 옥사디아진(C6);
(x) O1S1: 옥사티올(C5) 그리고 옥사티안(티옥산) (C6); 그리고,
(xi) N1O1S1: 옥사티아진(C6).
치환된 모노사이클 헤테로시클일 기의 예로는 고리형태의 사카라이드로부터 유도된 것들, 예로써, 퓨란노스(C5), 이를 테면 아라비노퓨라노스, 릭소퓨라노스, 리보퓨라노스, 그리고 크실로퓨란, 그리고 피라노스(C6), 이를 테면 알로피라노스, 알트로피라노스, 글루코피라노스, 만노피라노스, 굴로피라노스, 이도피라노스, 갈락토피라노스, 그리고 탈로피라노스를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "C5-20 아릴"은 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 획득된 단가 모이어티에 관계되는데, 이 모이어티는 3 내지 20개 고리 원자를 가진다. 일부 구체예들에 있어서, 각 고리는 5 내지 7개의 고리 원자를 가진다.
일부 구체예들에 있어서, 고리 원자들은 "카르보아릴 기"에서와 같이 모두 탄소 원자다. 카르보아릴 기의 예로는 벤젠 (가령, 페닐) (C6), 나프탈렌 (C10), 아줄렌 (C10), 안트라센(C14), 페난트렌(C14), 나프타센(C18), 그리고 피렌(C16)으로부터 유도된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
융합된 고리를 포함하고, 이 고리중 최소한 하나는 방향족 고리인 아릴 기의 예로는 인단(예컨데 2,3-디히드로-1H-인덴) (C9), 인덴 (C9), 이소인덴 (C9), 테트라린(1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌 (C10), 아세나프텐(C12), 플루오렌(C13), 페날렌(C13), 아세페난트렌(C15), 그리고 아세안트렌(C16)으로부터 유도된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구체예들에 있어서, 고리 원자들은 "헤테로아릴 기"에서와 같이 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 모노사이클 헤테로아릴 기의 예로는 다음으로부터 유도된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다:
(i) N1: 피롤 (아졸) (C5), 피리딘 (아진) (C6);
(ii) O1: 퓨란 (옥솔) (C5);
(iii) S1: 티오펜 (티올) (C5);
(iv) N1O1: 옥사졸 (C5), 이소옥사졸 (C5), 이소옥사진 (C6);
(v) N2O1: 옥사디아졸(퓨라잔) (C5);
(vi) N3O1: 옥사트리아졸(C5);
(vii) N1S1: 티아졸(C5), 이소티아졸(C5);
(viii) N2: 이미다졸(1,3-디아졸) (C5), 피라졸 (1,2-디아졸) (C5), 피리다진(1,2-디아진) (C6), 피리미딘 (1,3-디아진) (C6) (예컨데, 시토신, 티민, 우라실), 피라진(1,4-디아진) (C6);
(ix) N3: 트리아졸(C5), 트리아진(C6); 그리고,
(x) N4: 테트라졸(C5).
융합된 고리를 포함하는 헤테로아릴의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:
(i) 벤조퓨란 (O1), 이소벤조퓨란 (O1), 인돌 (N1), 이소인돌 (N1), 인돌리진(N1), 인돌린 (N1), 이소인돌린 (N1), 퓨린 (N4) (예컨데, 아데닌, 구아닌), 벤지이미다졸(N2), 인다졸 (N2), 벤즈옥사졸 (N1O1), 벤즈이소옥사졸 (N1O1), 벤조디옥솔(O2), 벤조퓨라잔(N2O1), 벤조트리아졸 (N3), 벤조티오퓨란 (S1), 벤조티아졸 (N1S1), 벤조티아디아졸 (N2S)로부터 유도된 C9 (2개의 융합된 고리와 함께);
(ii) 크로멘 (O1), 이소크로멘 (O1), 크로만 (O1), 이소크로만 (O1), 벤조디옥산(O2), 퀴놀린(N1), 이소퀴놀린(N1), 퀴놀리진(N1), 벤즈옥사진 (N1O1), 벤조디아진 (N2), 피리도피리딘 (N2), 퀴노옥살린(N2), 퀴나졸린(N2), 씨놀린(N2), 프탈라진(N2), 나프티리딘(N2), 프테리딘(N4)으로부터 유도된 C10 (2개의 융합된 고리와 함께);
(iii) 벤조디아제핀(N2)으로부터 유도된 C11 (2개의 융합된 고리와 함께);
(iv) 카르바졸(N1), 디벤조퓨란 (O1), 디벤조티오펜 (S1), 카르보린(N2), 페리미딘(N2), 피리도인돌 (N2)로부터 유도된 C13(3개의 융합된 고리와 함께); 그리고,
(v) 아크리딘(N1), 산텐(O1), 티오산텐(S1), 옥산트렌(O2), 페녹산틴(O1S1), 페나진(N2), 펜옥사진 (N1O1), 페노티아진(N1S1), 티안트렌(S2), 펜난트리딘(N1), 페난트롤린(N2), 페나진(N2)로부터 유도된 C14(3개의 융합된 고리와 함께).
상기 기들은 단독으로 또는 또다른 치환체와 함께, 상기 기들로부터 또는 하기에서 열거된 추가 치환체로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 기로 임의선택적으로 치환될 수 있다.
할로: -F, -Cl, -Br, 그리고 -I.
히드록시: -OH.
에테르: -OR, 이때 R은 에테르 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기 (하기에서 논의되는 바와 같이 C1-7 알콕시 기로 불리기도 함), C3-20 헤테로시클일 기 (C3-20 헤테로시클일옥시 기로 불리기도 함), 또는 C5-20 아릴 기 (C5-20 아릴옥시 기로 불리기도 함). 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다.
알콕시: -OR, 이때 R은 알킬 기, 예로써, C1-7 알킬 기다. C1-7알콕시 기의 예로는 -OMe (메톡시), -OEt (에톡시), -O(nPr) (n-프로폭시), -O(iPr) (이소프로폭시), -O(nBu) (n-부톡시), -O(sBu) (sec-부톡시), -O(iBu) (이소부톡시), 그리고-O(tBu) (tert-부톡시)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
아세탈: -CH(OR1)(OR2), 이때 R1 및 R2는 독립적으로 아세탈 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기. 일부 구체예들에 있어서, R1 및/또는 R2는 독립적으로 C1-7 알킬 기다. 일부 구체예들에 있어서, "사이클" 아세탈 기의 경우, R1와 R2는 이들에 부착된 2개의 산소 원자와 함께 4 내지 8개의 고리 원자를 보유하는 헤테로사이클 고리를 형성한다. 아세탈 기의 예는 -CH(OMe)2, -CH(OEt)2, 그리고 -CH(OMe)(OEt)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
헤미아세탈: -CH(OH)(OR1), 이때 R1은 헤미아세탈 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기. 일부 구체예들에 있어서, R1은 C1-7 알킬 기다. 헤미아세탈 기의 예로는 -CH(OH)(OMe) 그리고 -CH(OH)(OEt)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
케탈: -CR(OR1)(OR2), 이때 R1 및 R2는 아세탈의 경우에 대해 정의된 바와 같고, 그리고 R은 수소 이외의 케탈 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 케탈 기의 예로는 -C(Me)(OMe)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2, -C(Et)(OEt)2, 그리고 -C(Et)(OMe)(OEt)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
헤미케탈: -CR(OH)(OR1), 여기에서 R1은 헤미아세탈에 대해 정의된 바와 같고, 그리고 R은 수소 이외의 헤미케탈 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 헤미케탈 기의 예로는 -C(Me)(OH)(OMe), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt), 그리고 -C(Et)(OH)(OEt)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
옥소(케토, -온): =O.
티온(티오케톤): =S.
이미노 (이민): =NR, 이때 R은 이미노 치환체, 예로써, 수소, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 수소 또는 C1-7 알킬 기다. 이미노 기의 예로는 =NH, =NMe, =NEt, 그리고 =NPh을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포르밀 (카르브알데히드, 카르복시알데히드): -C(=O)H.
아실 (케토): -C(=O)R, 이때 R은 아실 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기 (C1-7 알킬아실 또는 C1-7 알카노일이라고도 부름), C3-20 헤테로시클일 기 (C3-20 헤테로시클일아실이라고도 부름), 또는 C5-20 아릴 기 (C5-20 아릴아실이라고도 부름)이다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 아실 기의 예로는 -C(=O)CH3 (아세틸), -C(=O)CH2CH3 (프로피오닐), -C(=O)C(CH3)3 (t-부티릴), 그리고 -C(=O)Ph (벤조일, 페논)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
카르복시(카르복실산): -C(=O)OH.
티오카르복시 (티오카르복실산): -C(=S)SH.
티올카르복시 (티올카르복실산): -C(=O)SH.
티오노카르복시 (티오노카르복실산): -C(=S)OH.
이미딘산: -C(=NH)OH.
히드록사민산: -C(=NOH)OH.
에스테르 (카르복실레이트, 카르복실산 에스테르, 옥시카르보닐): -C(=O)OR, 이때 R은 에스테르 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 에스테르 기의 예로는 -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3, 그리고 -C(=O)OPh을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
아실옥시(역 에스테르): -OC(=O)R, 이때 R은 아실옥시 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 아실옥시 기의 예로는 -OC(=O)CH3 (아세톡시), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)Ph, 그리고 -OC(=O)CH2Ph을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
옥시카르보닐옥시: -OC(=O)OR, 이때 R은 에스테르 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 옥시카르보닐옥시 기의 예로는 -OC(=O)OCH3, -OC(=O)OCH2CH3, -OC(=O)OC(CH3)3, 그리고 -OC(=O)OPh을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
아미노: -NR1R2, 이때 R1 및 R2는 독립적으로 아미노 치환체, 예로써, 수소, C1-7 알킬 기 (C1-7 알킬아미노 또는 디-C1-7 알킬아미노라고도 함), C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-7 알킬 기다. 일부 구체예들에 있어서, "사이클" 아미노 기의 경우, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께, 4 내지 8개의 고리 원자를 가진 헤테로사이클 고리를 형성한다. 아미노 기는 1차(-NH2), 2차(-NHR1), 또는 3차 (-NHR1R2)일 수 있으며, 그리고 양이온 형태에서 4차 (-+NR1R2R3)일 수 있다. 아미노 기의 예로는 -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2, 그리고 -NHPh을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 사이클 아미노 기의 예로는 아지리디노, 아제티디노, 피롤리디노, 피페리디노, 피페라지노, 몰포리노, 그리고 티오몰포리노를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
아미도 (카르바모일, 카르바밀, 아미노카르보닐, 카르복사미드): C(=O)NR1R2는, 이때 R1 및 R2는 아미노기의 경우에서 정의된 바와 같이 독립적으로 아미노 치환체다. 아미도 기의 예로는 -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3, 그리고 -C(=O)N(CH2CH3)2, 뿐만 아니라 아미도 기, 여기에서 R1 및 R2는 이들이 부착된 질소원자와 함께 헤테로사이클 구조를 형성하는 아미도기, 예로써, 피페리디노카르보닐, 몰포리노카르보닐, 티오몰포리노카르보닐, 그리고 피페라지노카르보닐을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
티오아미도 (티오카르바밀): -C(=S)NR1R2, 이때 R1 및 R2는 아미노기의 경우에서 정의된 바와 같이 독립적으로 아미노 치환체다. 티오아미도 기의 예로는 -C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2, 그리고 -C(=S)NHCH2CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
아실아미도 (아실아미노): -NR1C(=O)R2, 이때 R1은 아미드 치환체, 예로써, 수소, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기이며, 그리고 R2는 아실 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R1 및/또는 R2는 수소 또는 C1-7 알킬 기다. 아실아미드 기의 예로는 -NHC(=O)CH3, -NHC(=O)CH2CH3, 그리고 -NHC(=O)Ph을 포함하나 이에 한정되지 않는다. R1 및 R2는 함께 사이클 구조를 형성할 수 있는데, 예로써, 숙시니미딜, 말레이미딜 그리고 프탈리미딜을 형성할 수 있다:
Figure pct00020
아미노카르보닐옥시: -OC(=O)NR1R2, 이때 R1 및 R2는 아미노기의 경우에서 정의된 바와 같이, 독립적으로 아미노 치환체다. 아미노카르보닐옥시 기의 예로는 -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHMe, -OC(=O)NMe2, 그리고 -OC(=O)NEt2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
우레도: -N(R1)CONR2R3 이때 R2 및 R3은 아미노기에서 정의된 바와 같이 독립적으로 아미노 치환체이며, 그리고 R1은 우레도 치환체, 예로써, 수소, C1-7 알킬 기, C3-20헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R1은 수소 또는 C1-7 알킬 기다. 우레도 기의 예로는 -NHCONH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2, 그리고 -NMeCONEt2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
구아니디노: -NH-C(=NH)NH2.
테트라졸일: 4개의 질소 원자와 1개의 탄소 원자를 가지는 5원 방향족 고리,
Figure pct00021
아미딘(아미디노): -C(=NR)NR2, 이때 각 R은 아미딘 치환체, 예로써, 수소, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R은 H 또는 C1-7 알킬 기다. 아미딘 기의 예로는 -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2, 그리고 -C(=NMe)NMe2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
니트로: -NO2.
니트로소: -NO.
아지도: -N3.
시아노 (니트릴, 카르보니트릴): -CN.
이소시아노: -NC.
시아나토: -OCN.
이소시아나토: -NCO.
티오시아노 (티오시아나토): -SCN.
이소티오시아노 (이소티오시아나토): -NCS.
술퍼히드릴(티올, 멀캅토): -SH.
티오에테르 (술피드): -SR, 이때 R은 티오에테르 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기 (C1-7 알킬티오 기라고도 함), C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 티오에테르 기의 예로는 -SCH3 그리고 -SCH2CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
디설피드: -SS-R, 이때 R은 디설피드 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기 (C1-7 알킬 디설피드라고도 함)다. 디설피드 기의 예로는 -SSCH3 그리고 -SSCH2CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술핀(술피닐, 술폭시드): -S(=O)R, 이때 R은 술핀 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 술핀 기의 예로는 -S(=O)CH3 그리고 -S(=O)CH2CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술폰 (술포닐): -S(=O)2R, 이때 R은 술폰 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기, 예로써, 불소첨가된 또는 과불소첨가된 C1-7 알킬 기다. 술폰 기의 예로는 -S(=O)2CH3 (메탄술포닐, 메실), -S(=O)2CF3 (트리플일), -S(=O)2CH2CH3 (에실), -S(=O)2C4F9 (노나플일), -S(=O)2CH2CF3 (트레실), -S(=O)2CH2CH2NH2 (타우릴), -S(=O)2Ph (페닐술포닐, 베실), 4-메틸페닐술포닐 (토실), 4-클로로페닐술포닐 (클로실), 4-브로모페닐술포닐 (브로실), 4-니트로페닐 (노실), 2-나프탈렌술포네이트 (냅실), 그리고 5-디메틸아미노-나프탈렌-1-일술포네이트 (단실)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술핀산 (술피노): -S(=O)OH, -SO2H.
술폰산 (술포): -S(=O)2OH, -SO3H.
술피네이트(술피닌산 에스테르): -S(=O)OR; 이때 R은 술피네이트 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 술피네이트 기의 예로는 -S(=O)OCH3 (메톡시술피닐; 메틸 술피네이트) 그리고 -S(=O)OCH2CH3 (에톡시술피닐; 에틸 술피네이트)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술포네이트 (술포닌산 에스테르): -S(=O)2OR, 이때 R은 술포네이트 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 술포네이트 기의 예로는 -S(=O)2OCH3 (메톡시술포닐; 메틸 술포네이트) 그리고 -S(=O)2OCH2CH3 (에톡시술포닐; 에틸 술포네이트)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술피닐옥시: -OS(=O)R, 이때 R은 술피닐옥시 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 술피닐옥시기의 예로는 -OS(=O)CH3 그리고 -OS(=O)CH2CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술포닐옥시: -OS(=O)2R, 이때 R은 술포닐옥시 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 술포닐옥시 기의 예로는 -OS(=O)2CH3 (메실레이트) 그리고 -OS(=O)2CH2CH3 (에실레이트)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술페이트: -OS(=O)2OR; 이때 R은 술페이트 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 술페이트 기의 예로는 -OS(=O)2OCH3 그리고 -SO(=O)2OCH2CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술파밀(술파모일; 술핀산 아미드; 술핀아미드): -S(=O)NR1R2, 이때 R1 및 R2는 아미노기에 대해 정의된 바와 같이 독립적으로 아미노 치환체다. 술파밀 기의 예로는 -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2, 그리고 -S(=O)NHPh을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술폰아미도 (술피나모일; 술폰산 아미드; 술폰아미드): -S(=O)2NR1R2, 이때 R1 및 R2는 아미노기에 대해 정의된 바와 같이 독립적으로 아미노 치환체다. 술폰아미도 기의 예로는 -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2, 그리고 -S(=O)2NHPh을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술프아미노: -NR1S(=O)2OH, 이때 R1은 아미노기에 대해 정의된 바와 같이 아미노 치환체다. 술프아미노 기의 예로는 -NHS(=O)2OH 그리고 -N(CH3)S(=O)2OH을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술폰아미노: -NR1S(=O)2R, 이때 R1은 아미노기에 대해 정의된 바와 같이 아미노 치환체이며, 그리고 R은 술폰아미노 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 술폰아미노 기의 예로는 -NHS(=O)2CH3 그리고 -N(CH3)S(=O)2C6H5를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
술핀아미노: -NR1S(=O)R, 이때 R1은 아미노기에 대해 정의된 바와 같이 아미노 치환체이며, 그리고 R은 술핀아미노 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기다. 술핀아미노 기의 예로는 -NHS(=O)CH3 그리고 -N(CH3)S(=O)C6H5를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포스피노 (포스핀): -PR2, 이때 R은 포스피노 치환체, 예로써, -H, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 -H, C1-7 알킬 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 포스피노 기의 예로는 -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P(t-Bu)2, 그리고 -P(Ph)2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포스포: -P(=O)2.
포스피닐 (포스핀 옥시드): -P(=O)R2, 이때 R은 포스피닐 치환체, 예로써, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기. 일부 구체예들에 있어서, R은 C1-7 알킬 기 또는 C5-20 아릴 기다. 포스피닐 기의 예로는 -P(=O)(CH3)2, -P(=O)(CH2CH3)2, -P(=O)(tBu)2, 그리고 -P(=O)(Ph)2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포스핀산 (포스포노): -P(=O)(OH)2.
포스포네이트 (포스포노 에스테르): -P(=O)(OR)2, 여기에서 R은 포스포네이트 치환체, 예로써, -H, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 -H, C1-7 알킬 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 포스포네이트 기의 예로는 -P(=O)(OCH3)2, -P(=O)(OCH2CH3)2, -P(=O)(O-tBu)2, 그리고 -P(=O)(OPh)2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포스포린산(포스포노옥시): -OP(=O)(OH)2.
포스페이트 (포스포노옥시 에스테르): -OP(=O)(OR)2, 여기에서 R은 포스페이트 치환체, 예로써, -H, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 -H, C1-7 알킬 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 포스페이트 기의 예로는 -OP(=O)(OCH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)2, -OP(=O)(OtBu)2, 그리고 -OP(=O)(OPh)2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포스포러스산: -OP(OH)2
포스피트: -OP(OR)2, 여기에서 R은 포스피트 치환체, 예로써, -H, C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 -H, C1-7 알킬 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 포스피트 기의 예로는 -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -OP(OtBu)2, 그리고 -OP(OPh)2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포스포라미디트: -OP(OR1)-NR2 2, 여기에서 R1 및 R2는 포스포라미드트 치환체, 예로써, -H, (임의선택적으로 치환된) C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R은 -H, C1-7 알킬 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 포스포라미드트 기의 예로는 -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2, 그리고 -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포스포라미데이트: -OP(=O)(OR1)-NR2 2, 여기에서 R1 및 R2는 포스포라미데이트 치환체, 예로써, -H, (임의선택적으로 치환된) C1-7 알킬 기, C3-20 헤테로시클일 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 일부 구체예들에 있어서, R1 및 R2는 -H, C1-7 알킬 기, 또는 C5-20 아릴 기다. 포스포라미데이트 기의 예로는 -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2, 그리고 -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "C3-12 알킬렌"은 3 내지 12개의 탄소 원자(명시적으로 다른 언급이 없는 한)를 보유하는, 지방족이며, 사이클 또는 비사이클일 수 있는 탄화 수소 화합물의 동일한 탄소 원자, 또는 2개의 상이한 탄소 원자 각각으로부터 2개의 수소원자를 제거함으로써 획득되는 이좌배위자(bidentate) 모이어티에 관계한다. 따라서, 용어 "알킬렌"은 아래에서 논의되는 바와 같이 하위부류 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌, 등을 포함한다.
선형 포화 C3-12 알킬렌 기의 예로는 -(CH2)n- (여기에서 n은 3 내지 12의 정수), 예로써, -CH2CH2CH2- (프로필렌), -CH2CH2CH2CH2- (부틸렌), -CH2CH2CH2CH2CH2- (펜틸렌) 그리고 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- (헵틸렌)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
분기화된 포화 C3-12 알킬렌 기의 예로는 -CH(CH3)CH2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH2H3)-, -CH(CH2H3)CH2-, 그리고 -CH2CH(CH2H3)CH2-을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
선형 부분적으로 불포화 C3-12 알킬렌 기 (C3-12 알케닐렌, 그리고 알키닐렌 기)의 예로는 -CH=CHCH2-, -CH2-CH=CH2-, -CH=CHCH2CH2-, -CH=CHCH2CH2CH2-, -CH=CHCH=CH-, -CH=CHCH=CH-CH2-, -CH=CH-CH=CH-CH2CH2-, -CH=CH-CH2CH=CH-, -CH=CHCH2CH2CH=CH-, 그리고 -CH2-C≡C-CH2-을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
분기화된 부분적으로 불포화 C3-12 알킬렌 기 (C3-12 알케닐렌 그리고 알키닐렌 기)의 예로는 -C(CH3)=CH-, -C(CH3)=CHCH2-, -CH=CHCH(CH3)- 그리고 -C≡C-CH(CH3)-을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
알리사이클 포화 C3-12 알킬렌 기 (C3-12 시클로알킬렌)의 예로는 시클로펜틸렌(예컨데 시클로펜트-1,3-일렌), 그리고 시클로헥실렌 (예컨데 시클로헥스-1,4-일렌)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
알리사이클 부분적으로 불포화 C3-12 알킬렌 기 (C3-12 시클로알킬렌)의 예로는 시클로펜테닐렌(예컨데 4-시클로펜텐-1,3-일렌), 시클로헥센일렌(예컨데 2-시클로헥센-1,4-일렌; 3-시클로헥센-1,2-일렌; 2,5-시클로헥사디엔-1,4-일렌)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"링커"는 공유 결합 또는 약물 모이어티에 항체가 공유적으로 부탁되는 원자의 쇄를 포함하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 비제한적인 예시적인 링커들은 본 명세서에서 설명된다.
용어 "키랄(chiral)"은 거울상 짝의 겹쳐지지 않은 성질을 보유하는 분자를 지칭하고, 한편 용어 "아키랄(achiral)"은 이들의 거울상 짝에 겹쳐질 수 있는 분자를 지칭한다.
용어 "입체이성질체(stereoisomer)"는 동일한 화학적 구성을 보유하지만, 그러나 공간에서 원자 또는 기의 배열이 상이한 화합물들을 말한다.
"부분입체이성질체(diastereomer)"는 하나 또는 그 이상의 키랄성을 가지지만, 이들 분자는 서로 거울상이 아닌 입체이성질체를 말한다. 부분입체이성질체들은 상이한 물리적 성질, 예컨데 용융점, 끓는점, 스펙트럼 성질, 및 반응성을 보유한다. 부분입체이성질체 혼합물들은 고해상 분석 과정, 이를 테면 전기영동 및 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.
"거울상이성질체(enantiomers)"는 서로 겹쳐질 수 없는 거울 상인 화합물의 두 입체이성질체를 말한다.
본 명세서에서 이용된 입체적 정의 및 관례는 일반적으로 S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; 그리고 Eliel, E. and Wilen, S., Stereocchemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York에 따른다. 많은 유기 화합물들은 광학적으로 활성 형태로 존재하는데, 가령, 화합물들은 편광 면을 회전하는 능력을 보유한다. 광학적으로 활성 화합물이 설명될 때, 접두어 D 그리고 L, 또는 R 그리고 S는 이의 키랄 중심(들)에 대해 분자의 절대적인 배치를 나타내는데 이용된다. 접두어 d 그리고 l 또는 (+) 그리고 (-)은 화합물에 의해 편광의 회전 신호를 나타내는데 이용되는데, (-) 또는 l은 이 화합물이 좌회선성임을 의미한다. (+) 또는 d가 앞에 붙은 화합물은 우회전성이다. 주어진 화학 구조에서, 이러한 입체이성질체들은 서로 거울상인 것을 제외하고 동일하다. 특정 입체이성질체는 거울상체라고도 하는데, 이러한 이성질체의 혼합물은 거울상체 혼합물이라고도 한다. 거울상체의 50:50 혼합물은 라셈 혼합물 또는 라셈체라고도 하는데, 화학 반응 또는 공정에서 입체선택 또는 입체특이성이 없을 때 발생될 수 있다. 용어 "라셈(racemic) 혼합물" 그리고 "라셈체(racemate)"는 광학적 활성없이 2개의 거울상체의 등몰(equimolar) 혼합물을 말한다.
"이탈(Leaving) 기"는 또다른 기능기에 의해 치환될 수 있는 기능기를 말한다. 특정 이탈기는 당분야에 공지되어 있으며, 예로는 할로겐화물(예컨데, 염소화물, 브롬화물, 요오드화물), 메탄술포닐 (메실), p-톨루엔술포닐 (토실), 트리플루오로메틸술포닐 (트리플레이트), 그리고 트리플루오로메틸술포네이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "보호(protecting) 기"는 화합물상에 있는 다른 반응기가 반응하는 동안 특정 반응기를 차단 또는 보호하는 치환체를 말한다. 예로써, "아미노-보호 기"는 화합물에 있는 아미노 기능기를 차단 또는 보호하는 아미노 기에 부착된 치환체다. 적절한 아미노-보호 기는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ) 그리고 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 보호 기와 이들의 용도에 대한 전반적인 설명은 T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991, 또는 이후 편집물을 참고한다.
II. 조성물 및 방법
한 측면에서, 본 발명은 CD22에 결합하는 항체 및 이러한 항체가 포함된 면역접합체에 일부 기초된다. 본 발명의 항체 및 면역접합체는 예컨데, CD22-양성 암의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적인 항-CD22 항체
일부 구체예들에 있어서, CD22에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. CD22는 분화의 성숙 단계에서 B-세포 표면에서 발현되는 135-kDa의 B-세포-제한된 시알로당단백질이다. CD22는 다양한 B-세포 관련된 장애 및 다양한 임파종들, 이를 테면 비-호지킨 임파종이 포함된 암에서 발현된다.
신호 서열 (아미노산 1 내지 19)을 가진, 예시적인 자연 발생적 인간 CD22 전구물질 서열은 서열 번호: 28에 제공되며, 그리고 대응하는 성숙 CD22 서열은 서열 번호: 29 (서열 번호: 28의 아미노산 20 내지 847에 대응)에서 제공된다. 신호 서열 (아미노산 1 내지 19)을 가진, 추가적인 예시적인 자연 발생적 인간 CD22 전구물질 서열은 서열 번호: 30에 제공되며, 그리고 대응하는 성숙 CD22 서열은 서열 번호: 31 (서열 번호: 30의 아미노산 20 내지 670에 대응)에서 제공된다.
특정 구체예들에 있어서, 항-CD22 항체는 서열 번호: 28의 아미노산 20 내지 240 내에 있는 에피토프에 결합한다. 이러한 항체의 비-제한적 예시로는 10F4 및 이의 인간화된 버전이 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 항-CD22 항체는 인간 CD22에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 항-CD22 항체는 인간 CD22 및 시노몰구스 원숭이 CD22에 결합한다.
일부 구체예들에 있어서, 항-CD22 항체는 ≤ 10 nM, 또는 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM의 친화력 그리고 임의선택적으로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화력으로 인간 CD22에 결합한다. 이러한 항체의 비-제한적 예시로는 차례로 2.4 nM, 1.1-1.7 nM, 그리고 1.6 nM의 친화력으로 인간 CD22에 결합하는 mu10F4, hu10F4v1, 그리고 hu10F4v3이 포함되는데, 예컨데, US 2008/0050310 참고.
분석(Assays)
항-CD22 항체가 "서열 번호: 28의 아미노산 20 내지 240 내에 있는 에피토프에 결합하는 지"를 판단하기 위하여, N- 및 C-말단 결손을 가진 CD22 폴리펩티드는 CHO 세포에서 발현되며, 그리고 절두된 폴리펩티드에 상기 항체의 결합되는지는 이미 설명된 바와 같이 FACS에 의해 테스트된다. 예컨데, US 2008/0050310 참고. CHO 세포에서 발현된 전장의 CD22에 대한 결합과 비교하여 절두된 폴리펩티드에 대한 상기 항체의 결합의 실질적인 감소(≥ 70% 감소) 또는 배제는 상기 항체가 절두된 폴리펩티드에 결합하지 않음을 나타낸다.
항-CD22 항체가 ≤ 10 nM, 또는 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM의 "친화력으로 결합"하는지의 판단은 연속적으로 희석된, 라벨안된 항-CD22 항체를 이용한 경쟁 분석에서 표면상에 CD22를 발현시키는 CHO 세포를 이용하여 결정된다. 예컨데, US 2008/0050310 참고. 이 항체의 결합 친화력, KD는 비-선형 곡선 피팅 프로그램을 이용하여 실행되는 표준 Scatchard 분석에 따라 결정될 수 있다(예로써, Munson et al., Anal Biochem, 107: 220-239, 1980 참고).
항체 10F4 및 다른 구체예들
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 그리고 (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVRs가 포함된 항-CD22 항체 또는 면역접합체를 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 그리고 (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVRs가 포함된 항-CD22 항체 또는 면역접합체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 그리고 (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 최소한 1개, 최소한 2개 또는 3개 VH HVR 서열이 모두 포함된 항체 또는 면역접합체를 제공한다. 한 구체예에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3을 포함하고, 그리고 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3을 포함하고, 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함하고, 그리고 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2를 포함한다. 추가 구체예에 있어서, 상기 항체는 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2; 그리고 (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3에서 선택된 최소한 1개, 최소한 2개 또는 3개의 VL HVR 모두가 포함된 항체 또는 면역접합체를 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3에서 선택된 최소한 1개, 최소한 2개 또는 3개의 VL HVR 모두가 포함된 항체 또는 면역접합체를 제공한다. 한 구체예에 있어서, 상기 항체는 (a) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 항체는 (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 (a) (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2, 그리고 (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3에서 선택된 최소한 1개, 최소한 2개 또는 3개의 VH HVR 서열 모두가 포함된 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1, (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2, 그리고 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3에서 선택된 최소한 1개, 최소한 2개 또는 3개의 VL HVR 서열 모두가 포함된 VL 도메인을 포함한다. 또다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 (a) (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2, 그리고 (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3에서 선택된 최소한 1개, 최소한 2개 또는 3개의 VH HVR 서열 모두가 포함된 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1, (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2, 그리고(c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3에서 선택된 최소한 1개, 최소한 2개 또는 3개의 VL HVR 서열 모두가 포함된 VL 도메인을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2; (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3; (d) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함하는 항체 또는 면역접합체를 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2; (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3; (d) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함하는 항체 또는 면역접합체를 제공한다..
상기 구체예들중 임의의 것에 있어서, 항-CD22 항체는 인간화된다. 한 구체예에 있어서, 항-CD22 항체는 상기 구체예들중 임의의 것에서와 같이 HVRs을 포함하고, 인간 수용 골격, 예컨데 인간 면역글로블린 골격 또는 인간 공통 골격을 더 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간 수용체 골격은 인간 VL 카파 1 (VLKI) 골격 및/또는 VH 골격 VHIII이다. 일부 구체예들에 있어서, 인간화된 항-CD22 항체는 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2; (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3; (d) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 인간화된 항-CD22 항체는 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2; (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3; (d) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함한다.
또다른 측면에서, 항-CD22 항체는 서열 번호: 7의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 보유한 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 서열 번호: 7의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 보유한 VH 서열은 기준 서열과 비교하여 치환 (예컨데, 보존적 치환), 삽입, 또는 결손을 포함하지만, 항-CD22 항체는 CD22에 결합하는 능력을 유지하는 서열을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 서열 번호: 7에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되거나, 삽입되거나 및/또는 결손되었다. 특정 구체예들에 있어서, 서열 번호: 7에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환되거나, 삽입되거나 및/또는 결손되었다. 특정 구체예들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결손은 HVRs 밖의 영역(이를 테면, FRs)에서 일어난다.
임의선택적으로, 항-CD22 항체는 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 7의 해독후 변형이 포함된, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 7의 VH 서열을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, VH는 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1, (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2, 그리고 (c) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3로부터 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 HVRs을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 항-CD22 항체가 제공되는데, 이때 상기 항체는 서열 번호: 8의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 서열 번호: 8의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 보유한 VL 서열은 기준 서열과 비교하여 치환 (예컨데, 보존적 치환), 삽입, 또는 결손을 포함하지만, 항-CD22 항체는 CD22에 결합하는 능력을 유지하는 서열을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 서열 번호: 8에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되거나, 삽입되거나 및/또는 결손되었다. 특정 구체예들에 있어서, 서열 번호: 8에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환되거나, 삽입되거나 및/또는 결손되었다. 특정 구체예들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결손은 HVRs 밖의 영역(이를 테면, FRs)에서 일어난다. 임의선택적으로, 항-CD22 항체는 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 8의 해독후 변형이 포함된, 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 8의 VL 서열을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, VL은 (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3에서 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 HVRs을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, VL은 (a) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2; 그리고(c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3에서 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 HVRs을 포함한다.
또다른 측면에서, 항-CD22 항체가 제공되는데, 이때 상기 항체는 상기에서 제공된 임의의 구체예들에서와 같은 VH와 상기에서 제공된 임의의 구체예들에서와 같은 VL을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 7 및 서열 번호: 8의 차례로 VH 및 VL 서열을 포함하는데, 이때 이들의 전사 후 변형도 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6의 차례로 VH 및 VL 서열을 포함하는데, 이때 이들의 전사 후 변형도 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 24 및 서열 번호: 23의 차례로 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는데, 이때 이들의 전사 후 변형도 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 26 및 서열 번호: 23의 차례로 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는데, 이때 이들의 전사 후 변형도 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 25 및 서열 번호: 23의 차례로 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는데, 이때 이들의 전사 후 변형도 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 27 및 서열 번호: 23의 차례로 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는데, 이때 이들의 전사 후 변형도 포함된다.
추가 측면에 있어서, 본 발명은 본 명세서에서 제공되는 항-CD22 항체와 동일한 에피토프에 결합되는 항체 또는 면역접합체를 제공한다. 예로써, 특정 구체예들에 있어서, 서열 번호: 7의 VH 서열과 서열 번호: 8의 VL 서열이 포함된 항-CD22 항체와 동일한 에피토프에 결합되는 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 구체예들에 있어서, 서열 번호: 28의 아미노산 20 내지 240으로부터, 이내에 또는 이와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 있어서, 상기 구체예들중 임의의 것에 따른 항-CD22 항체는 키메라, 인간화된 또는 인간 항체가 포함된 단클론 항체다. 한 구체예에 있어서, 항-CD22 항체는 항체 단편, 예컨데, a Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디(diabody), 또는 F(ab')2 단편이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 항체는 실질적으로 전장 항체, 예컨대, IgG1 항체 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 다른 항체 분류 또는 이소타입이다.
상기에서 설명된 임의의 면역접합체에서, 상기 항체는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 세포독성 물질에 접합된다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 상기 세포독성 물질은 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 이를 테면 PBD 이합체다. 다양한 비제한적인 예시적인 PBD 이합체는 본 명세서에서 논의된다.
추가 측면에 있어서, 상기 구체예들중 임의의 것에 따른 항-CD22 항체 또는 면역접합체는 하기 섹션 1-7에서 설명된 바와 같이 특징들중 임의의 것을 단독, 또는 조합하여 포함할 수 있다.
1. 항체 친화력
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (Kd)를 보유하고 그리고 임의선택적으로 ≥ 10-13 M. (예컨데 10-8 M 또는 그 미만, 예컨데 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨데, 10-9 M 내지 10-13 M)이다.
한 구체예에 있어서, Kd는 다음의 분석에서 설명된 것과 같이 관심 항체의 Fab 버전과 이의 항원으로 실행된 방사능라벨된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fabs의 용액 결합 친화력은 라벨안된 항원의 적정(titration) 시리즈 존재하에 최소 농도의 (125I)-라벨된 항원과 평형화(equilibrating)되고, 그 다음 항-Fab 항체-피복된 플레이트에 결합된 항원을 포집함으로써 측정된다(예컨데, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) 참고). 분석 조건을 확립하기 위하여, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)내에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 동안 피복되며, 그리고 후속적으로 실온(대략적으로 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS에서 2% (w/v) 소의 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 관심 Fab(예컨데, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일관된, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997))의 일련의 희석물과 혼합된다. 그 다음 관심 Fab는 하룻밤동안 항온처리되며; 그러나, 항온처리는 평형에 확실히 도달되도록 더 오랜 기간(예컨데, 약 65 시간)동안 지속될 수 있다. 그 이후, 혼합물은 실온에서 항온처리를 위하여(예컨대, 한 시간) 포획 플레이트로 옮겨진다. 그 다음 용액이 제거되고, 플레이트는 PBS 안에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)로 8회 세척되었다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 μl/웰의 섬광물질 (MICROSCINT-20™; Packard)이 추가되며, 그리고 플레이트는 10분간 TOPCOUNT™ 감마 카운터(Packard) 상에서 카운트된다. 최대 결합의 20% 미만 또는 20%를 제공하는 각 Fab 농도는 경쟁 결합 분석에 사용하기 위하여 선택된다.
또다른 구체예에 따르면, Kd는 25℃에서 ~10 반응 단위(RU)에서 고정된 항원 CM5 칩(chips)과 함께 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하여 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정된다. 간략하게 설명하자면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센스 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업자의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 그리고 N-히드록시숙시니미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 10 mM 아세테이트 나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (~0.2 μM)으로 희석된 후 결합 단백질의 대략적으로 10 반응 단위(RU)를 획득하기 위하여 분당 5 μl의 유속으로 주사된다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민은 반응안된 기를 차단하기 위하여 주사된다. 역학 측정을 위하여, Fab의 2배 연속 희속물(0.78 nM 내지 500 nM)은 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™) 계면활성제 (PBST)와 함께 PBS로 대략적으로 분당 25 μl의 유속으로 주사된다. 결합율 (kon) 및 해리율(koff)은 결합 및 해리 센서그램(sensorgram)을 동시에 피팅함으로써 단순 1 대 1 Langmuir 결합 모델 (BIACORE® Evaluation Software 버젼 3.2)로 산출된다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로 산출된다. 예컨데, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 참고. 결합율이 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 따라 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 결합율은 25℃에서 분광계, 이를 테면 정지-유동(stop-flow) 구비된 분광광도계(Aviv Instruments) 또는 교반(stirred) 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정되었을 때 항원의 농도가 증가되는 조건하에서 PBS, pH 7.2에서 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 담금질 기술을 이용하여 측정될 수 있다(여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)
2. 항체 단편들
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제시되는 항체는 항체 단편이다. 항체 단편들은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 그리고 scFv 단편, 그리고 하기에서 설명되는 다른 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토는 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)을 참고한다. scFv 단편에 대한 검토는 예컨데, Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)을 참고하고; 또한 WO 93/16185; 그리고 U.S. 특허 5,571,894 그리고5,587,458를 또한 참고한다. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의는 U.S. 특허 5,869,046을 참고한다.
디아바디는 이가(bivalent) 또는 이중특이적인 2개의 항원-결합 부위를 가진 항체 단편이다. 예로써, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)을 참고한다. 트리아바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies) 또한 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부가 포함된 항체 단편이다. 특정 구체예들에 있어서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예컨데, U.S. 특허 6,248,516 B1 참고)다.
항체 단편은 하기에서 설명된 것과 같이, 고유한 항체의 단백질 절단 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예컨데 대장균(E. coli) 또는 파아지)에 의해 생산되는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
3. 키메라 및 인간화된 항체
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공된 항체는 키메라 항체다. 특정 키메라 항체는 예컨데, U.S. 특허 4,816,567; 그리고 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 설명된다. 한 실시예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예컨데, 마우스, 렛, 헴스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 이를 테면 원숭이로부터 유도된 가변 영역)과 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 실시예에서, 키메라 항체는 분류 또는 아류가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "분류 전환된(class switched)" 항체다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 키메라 항체는 인간화된 항체다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간에 대한 면역원성이 감소되도록 인간화되며, 한편, 부모의 비-인간 항체의 특이성 및 친화력은 유지된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVRs, 예컨데, CDRs(또는 이의 일부분)은 비-인간 항체로부터 유도되며, FRs (또는 이의 일부분)은 인간 항체 서열로부터 유도된 하나 또는 그 이상의 가변 도메인들을 포함한다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 불변 영역의 최소한 일부분을 또한 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 항체 특이성 또는 친화력을 복원 또는 개선시키기 위하여, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예컨데, HVR 잔기가 유도된 상기 항체)의 대응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이의 제법은 예컨데, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되며, 예컨데, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 그리고 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 접목을 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재표면화(resurfacing)" 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링(shuffling)"설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 그리고 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선별" 방식을 설명)에서 추가 설명된다.
인간화를 위하여 이용되는 인간 골격 영역들은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: "베스트-핏(best-fit)" 방법을 이용하여 선별된 골격 영역 (예컨데, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유도된 골격 영역 (예컨데, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 그리고 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 참고); 인간 성숙 (체세포적으로 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식계역 골격 영역 (예컨데, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참고); 그리고 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유도된 골격 영역(예컨데, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 그리고 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참고).
4. 인간 항체
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는 인간 항체다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 그리고 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다.
인간 항체는 항원 공격에 반응하여 고유한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 고유한 항체를 만들기 위하여 변형된 유전자전이 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내생적 면역글로블린 좌를 대체한, 또는 염색체 외적으로 존재하거나 동물의 염색체 안에 무작위로 통합된 인간 면역글로블린 좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 유전자전이 마우스에서, 내생적 면역글로블린 좌는 일반적으로 비활성화되어 있다. 유전자전이 동물로부터 인간 항체를 획득하는 방법에 대한 검토는 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)을 참고한다. 또한 예컨데, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 U.S. 특허 6,075,181 및 6,150,584; HUMAB® 기술을 설명하는 U.S. 특허 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 7,041,870, 그리고 VELOSCIMOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 출원 공개 US 2007/0061900을 참고한다). 이러한 동물에 의해 생성된 고유한 항체의 인간 가변 영역은 예컨데, 상이한 인간 불변 영역과 복합됨으로써 더 변형될 수 있다.
인간 항체는 하이브리도마-기반 방법에 의해 또한 만들어질 수 있다. 인간 단클론 항체 생산을 위하여 인간 골수종과 마우스-인간 헤테로골수종 세포 계통에 대해 설명되었다(예컨데, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 그리고 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) 인간 B-세포하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체는 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 또한 설명된다. 추가 방법은 예로써, U.S. 특허 7,189,826 (하이브리도마 세포 계통으로부터 단클론 인간 IgM 항체를 생산하는 것을 설명) 그리고 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 그리고 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 인간-유도된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 또한 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 복합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하는 기술은 하기에서 설명된다.
5. 라이브러리-유도된 항체
항체는 바람직한 활성 또는 활성을 가지는 항체에 대하여 복합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예로써, 파아지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 바람직한 결합 특징을 보유한 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예컨데, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되며, 그리고 예컨데, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 그리고 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에서 추가 설명된다.
특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자들의 레퍼토리는 폴리메라제 쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클론되고, 파아지 라이브러리에서 무작위로 조합되며, 그 다음 Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 것과 같이 항원-결합 파이지에 대하여 선별될 수 있다. 파아지는 전형적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로던 항체 단편을 드러낸다. Libraries from 면역화된 원료로부터 라이브러리는 하이브리도마의 구축 없이도 면역원에 대한 고-친화력 항체를 제공한다. 대안으로, Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에서 설명된 바와 같이 임의의 면역화 없지 광범위한 비-자체 및 자체 항원에 대하여 항체의 단일 원료를 제공하기 위하여 (예컨대, 인간으로부터) 고유 레퍼토리(naive repertoire)가 클론될 수 있다. 끝으로, 고유 라이브러리는 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에서 설명된 것과 같이 상당한 가변 CDR3 영역을 인코드하고, 시험관내에서 재배열을 이루기 위하여 무작위 서열이 포함된 PCR 프라이머를 이용하여, 줄기 세포로부터 재배열 안된 V-유전자 세그먼트를 클로닝함으로써 합성에 의해 만들어질 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 설명하는 특허 공개는 예로써 다음의 것들을 포함한다: US 특허 5,750,373, 그리고 US 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 그리고 2009/0002360.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이적 항체
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는 다중특이적 항체, 예컨데 이중특이적 항체다. 다중특이적 항체는 최소한 2가지 다른 부위에 대하여 결합 특이성을 보유하는 단클론 항체다. 특정 구체예들에 있어서, 결합 특이성중 하나는 CD22에 대한 특이성이며, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 특이성이다. 특정 구체예들에 있어서, 이중특이적 항체는 CD22의 상이한 2개의 에피토프에 결합될 수 있다. 이중특이적 항체는 CD22를 발현시키는 세포에게 세포독성 물질을 국소화시키는데 또한 이용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 준비될 수 있다.
다중특이적 항체를 만드는 기술은 상이한 특이성을 보유한 2개의 면역글로블린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 그리고 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 참고), 그리고 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예컨데, U.S. 특허 5,731,168 참고)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다중-특이성 항체는 항체 Fc-헤테로이합체 분자를 만들기 위한 정전기적 스티어링 효과를 만들거나(WO 2009/089004A1); 2개 또는 그 이상 항체 또는 단편의 가교 (예컨데, US 특허 4,676,980, 그리고 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중-특이성 항체를 만들기 위하여 류신 지퍼를 이용하거나(예컨데, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위하여 "디아바디" 기술을 이용하거나 (예컨데, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 그리고단일-쇄 Fv (sFv) 이합체를 이용하거나(예컨대, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 그리고 예컨데, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 설명된 것과 같이 삼중특이적 항체를 만들어서 또한 만들어질 수 있다.
"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 포함하는 3개 또는 그 이상의 기능적 항원 결합 부위를 가진 조작된 항체 또한 설명된다(예컨데 US 2006/0025576A1 참고).
본 명세서에서 상기 항체 또는 단편은 CD22 뿐만 아니라 또다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위가 포함된 "이중 작용(Dual Acting) FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예로써, US 2008/0069820 참고).
7. 항체 변이체(Variants)
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이가 고려된다. 예로써, 상기 항체의 결합 친화력 및/또는 기타 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이는 상기 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 안에 적절한 변형을 도입시키거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 상기 항체의 아미노산 서열로부터 잔기의 결손 및/또는 서열 안에 잔기의 삽입 또는 치환이 포함된다. 최종 구조물이 바람직한 성질, 예컨대, 항원-결합을 보유한다면, 이러한 최종 구조물에 도달되도록 결손, 삽입, 그리고 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.
a) 치환, 삽입, 그리고 결손 변이체
특정 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 보유하는 항체 변이체들이 제공된다. 치환에 의한 돌연변이생성에 관심 부위는 HVRs 및 FRs을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 제목으로 표 1에 나타낸다. 좀더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 제목으로 표 1에 제공되며, 그리고 아미노산 측쇄 분류에 대하여 하기에서 더 논의된다. 아미노산 치환은 관심 항체 안으로 도입될 수 있으며, 바람직한 활성, 예컨데, 유지된/개선된 항원 결합, 면역원성 감소, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대하여 생성물이 선별될 수 있다.
Figure pct00022
공통 측쇄 성질에 따라 아미노산들이 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류중 하나의 구성요소가 또다른 부류의 것으로 교환이 수반될 것이다.
치환성 변이중 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기의 치환 (예컨데 인간화된 또는 인간 항체)과 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선택된 생성된 변이(들)은 부무 항체와 비교하여 특정 생물학적 성질에서 변화(예컨데, 개선) (예컨데, 증가된 친화력, 감소된 면역원성)를 가질 수 있거나 및/또는 부모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환성 변이는 예컨데, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 것과 같은, 파아지 디스플레이-기반된 친화력 성숙 기술을 이용하여 통상적으로 생성되는, 친화력 숙성된 항체다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고, 그리고 변이 항체는 파아지 상에서 드러나게 되며, 특정 생물학적 활성(예컨데 결합 친화력)에 대하여 선별된다.
예컨데, 항체 친화력을 개선시키기 위하여 HVRs에 변경 (예컨데, 치환)이 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟(hotspots)" 이를 테면, 체세포 성숙과정 동안 높은 빈도로 돌연변이되는 코돈에 의해 인코드되는 잔기에서 만들어질 수 있고 (예컨데, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), 및/또는 SDRs (a-CDRs)에 만들어질 수 있으며, 생성된 변이 VH 또는 VL은 결합 친화력에 대하여 테스트된다. 2차 라이브러리로부터 구축 및 재선별에 의한 친화력 성숙은 예컨데, Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)에 설명되어 있다. 친화력 성숙의 일부 구체예들에 있어서, 다양성(diversity)은 임의의 다양한 방법 (예컨데, 에러-유발(error-prone) PCR, 쇄 셔플링(chain shuffling), 또는 올리고뉴클레오티드-지향된 돌연변이생성)에 의해 성숙에 대하여 선택된 가변 유전자 안으로 도입된다. 2차 라이브러리가 만들어진다. 이 라이브러리는 바람직한 친화력을 가진 임의의 항체 변이를 확인하기 위하여 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 HVR-지향된 방법과 관련되는데, 이때 몇 가지 HVR 잔기 (예컨데, 한 번에 4-6개의 잔기 )가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 예컨데, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 대개 표적화된다.
특정 구체예들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결손은 이러한 변경이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 HVRs에서 발생될 수 있다. 예로써, 실질적으로 결합 친화력을 감소시키지 않는 보존적 변경 (예컨데, 본 명세서에서 제시된 보존적 치환)이 HVRs 안에 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDRs 외부에서 일어날 수 있다. 상기에서 제공된 변이 VH와 VL 서열의 특정 구체예들에 있어서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 단지 하나, 둘 또는 세 개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
돌연변이생성을 표적으로 하는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에서 설명된 것과 같은 "알라닌 스캐닝(scanning) 돌연변이생성"이라고도 한다. 이 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 기(예컨데, 하전된 잔기 이를 테면 arg, asp, his, lys, 그리고 glu)가 확인되며, 그리고 중성 또는 음 하전된 아미노산 (예컨데, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 상기 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받았는지를 확인한다. 최초 치환에 대한 기능적 감응성을 설명하기 위하여 아미노산 위치들에 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 상기 항체 와 항원 사이에 접촉 점을 확인하는데 이용된다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로 표적이 될 수 있거나 또는 제거될 수 있다. 이들이 바람직한 성질을 보유하는지를 결정하기 위하여 변이체들이 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기에서부터 수백 또는 그 이상의 잔기가 포함된 폴리펩티드 범위의 아미노- 및/또는 카르복시-말단, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이는 상기 항체의 N- 또는 C-말단을 효소 (예컨데 ADEPT용 효소) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 융합을 포함한다.
b) 당화(glycosylation) 변이체
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는 이 항체의 당화된 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체에 당화 부위의 추가 또는 결손은 하나 또는 그 이상의 당화 부위가 만들어지거나 또는 제거되도록, 아미노산 서열을 변경시켜 통상적으로 이루어질 수 있다.
여기에서 상기 항체는 Fc 영역을 포함하는데, 여기에 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산되는 고유한 항체는 전형적으로 분기화된, 바이안테너리 올리고사카라이드를 포함하는데, 이는 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 부착된다. 예컨데, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예컨데, 만노즈, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토즈, 그리고 시알산, 뿐만 아니라 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기(stem)"에 있는 GlcNAc에 부착된 퓨코즈를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 특정 개량된 성질을 가지는 항체 변이체를 만들기 위하여 항체내 올리고사카라이드의 변형이 만들어질 수 있다.
한 구체예에 있어서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코즈가 없는 탄수화물 구조를 보유한 항체 변이체가 제공된다. 예로써, 이러한 항체에서 퓨코즈의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%가 될 수 있다. 퓨코즈의 양은 예로써 WO 2008/077546에서 설명된 것과 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정되었을 때, Asn 297에 부착된 모든 당구조(가령, 복합체, 하이브리드, 많은 만노즈 구조)의 합에 비교하여, Asn297에서 슈가 쇄 안에 있는 퓨코즈의 평균 양을 산출함으로써, 퓨코즈의 양이 결정된다. Asn297는 Fc 영역 안에 대략 위치 297에 위치한 아스파라진 잔기를 말한다 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링); 그러나, Asn297는 약간의 서열 변이로 인하여 위치 297의 대략 ± 3개 아미노산 위 또는 아래, 이를 테면, 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 퓨코실화(fucosylation) 변이는 ADCC 기능을 개선시킬 수 있다. 예컨데, US 특허 공개 번호US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) 참고. "탈-퓨코실화된" 또는 "퓨코즈-결핍" 항체 변이체에 관련된 공개의 예로는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈-퓨코실화 항체를 생산할 수 있는 세포 계통의 예로는 단백질 퓨코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 그리고 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 그리고 녹아웃 세포 계통, 이를 테면 알파-1,6-퓨코실전이효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예컨데, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 그리고 WO2003/085107)를 포함한다 .
이등분된 올리고사카라이드를 가진 항체 변이체가 더 제공되는데, 예컨데, 상기 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테너리 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예컨데, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US 특허 6,602,684 (Umana et al.); 그리고 US 2005/0123546 (Umana et al.)에서 설명된다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 안에 최소한 한 개의 갈락토즈 잔기를 가진 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예컨데, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 그리고 WO 1999/22764 (Raju, S.)에서 설명된다.
c) Fc 영역 변이체
특정 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형은 본 명세서에서 제공되는 항체의 Fc 영역 안에 도입되고, 이로 인하여 Fc 영역 변이를 만들 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예컨데 치환)이 포함된 인간 Fc 영역 서열 (예컨데, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 발명은 모든 작용기 기능은 아니지만 일부를 보유하는 항체 변이를 고려하는데, 이로써 생체내 항체의 반감기가 중요하지만, 특정 작용기 기능(이를 테면 보체 및 ADCC)은 불피요하거나 또는 유해한 용도를 위한 바람직한 후보물질을 만들 수 있다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위하여 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석이 실행될 수 있다. 예로써, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석은 항체가 FcγR 결합 (그런 이유로 ADCC 활성이 없을 것 같은)은 없지만, FcRn 결합 능력은 유지하는 지를 확인하기 위하여 실행될 수 있다. ADCC를 중개하는 주요 세포, NK 세포는 오직 FcγRIII 만을 발현시키지만, 반면 단세포는 FcγRI, FcγRII 그리고 FcγRIII을 발현시킨다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약된다. 관심 분자의 관심 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비-제한적 예는 U.S. 특허 5,500,362 (예컨데 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 그리고 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))에서 설명된다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법이 이용될 수 있다(예로써, 유동 세포분석을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 그리고 CytoTox 96® 비-방사능활성 세포독성 분석(Promega, Madison, WI). 분석에 유용한 작용기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 Natural Killer (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 이를 테면, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 공개된 것과 같은 동물 모델안에서 생체내 평가될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 부족하다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 실행될 수 있다. 예컨데, WO 2006/029879와 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다(예로써, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, M.S. 그리고 M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참고). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 결정은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 또한 실행될 수 있다(예컨데, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참고).
감소된 작용기 기능을 가진 항체는 하나 또는 그 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 그리고 329의 치환을 가진 것들을 포함한다 (U.S. 특허 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 "DANA" Fc 돌연변이체가 포함된, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 그리고 327중 2개 또는 그 이상에서 치환을 가진 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 특허 7,332,581).
FcRs에 개선된 또는 감소된 결합을 가진 특정 항체 변이체가 설명된다(See, 예컨데, U.S. 특허 6,737,056; WO 2004/056312, 그리고 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
특정 구체예들에 있어서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 예컨데, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기의 EU 번호매김)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 예컨데, US 특허 6,194,551, WO 99/51642, 그리고 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 것과 같이, Fc 영역 안에서 변경이 만들어지고, 이로써 C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 변경된다(이를 테면 개선 또는 감소).
태아에게 모체 IgGs의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 그리고 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))에 개선된 결합 및 증가된 반감기를 가진 항체는 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기중 하나 또는 그 이상에서 치환을 가진 것들을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예컨데, Fc 영역 잔기 434의 치환 (US 특허 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 실시예와 관련하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 5,648,260; U.S. 특허 5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참고.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구체예들에 있어서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기으로 치환된, 시스테인 조작된 항체, 예컨데, "티오MAbs(thioMAbs)"를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 치환된 잔기는 상기 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기가 시스테인으로 대체됨으로써, 이로 인하여 반응성 티올 기는 상기 항체의 접근가능한 부위에 위치되며, 그리고 다른 모이어티, 이를 테면 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 항체를 접합시켜, 본 명세서에서 더 설명되는 면역접합체가 탄생될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 다음 잔기들중 임의의 하나 또는 그 이상의 잔기는 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 번호매김); 중쇄의 A118 (EU 번호매김); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 번호매김). 항-CD22 항체의 비제한적인 예시적인 시스테인 조작된 중쇄 및 경쇄는 도 3 (서열 번호: 25 내지 27)에 나타낸다. 시스테인 조작된 항체는 예컨데, U.S. 특허 7,521,541에서 설명된 것과 같이 만들어질 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는 당분야에 공지되어 있고, 바로 이용가능한 추가적인 비단백질성 모이어티가 포함되도록 추가 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도화에 적절한 모이어티는 수용성 폴리머가 포함되나 이에 국한되지 않는다. 수용성 폴리머의 비-제한적인 실시예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌글리콜의 코폴리머, 카르복시메틸 셀룰로오즈, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 코폴리머, 폴리아미노산 (동종폴리머 또는 무작위 코폴리머), 그리고덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌글리콜 동종폴리머, 프롤리프로필렌옥시드/에틸렌 옥시드 코-폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예컨데, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 이의 안정성으로 인하여 제작에 유리할 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량을 가지며, 그리고 분기화된 또는 분기화안된 것일 수 있다. 상기 항체에 부착된 폴리머의 수는 가변적일 수 있으며, 그리고 하나 이상의 폴리머가 부착된 경우, 이들 폴리머는 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도화에 이용된 폴리머의 수 및/또는 유형은 개선되어야 하는 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 명시된 상태하에 치료제로 이용될 것인지의 여부를 포함하나 이에 한정되지 않는 고려사항에 근거하여 결정될 수 있다.
또다른 구체예에 있어서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비단백질 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 구체예에 있어서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브다(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 보통의 세포에게는 해가없지만, 상기 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포를 죽이는 온도로 비단백질 모이어티를 가열시키는 파장이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
예컨데, U.S. 특허 4,816,567에서 설명된 것과 같은 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 항체가 만들어질 수 있다. 한 구체예에 있어서, 본 명세서에서 설명된 항-CD22 항체를 인코드하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 상기 항체의 VL이 포함된 아미노산 서열 및/또는 상기 항체의 VH가 포함된 아미노산 서열(예컨데, 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 인코드할 수 있다. 추가 구체예에 있어서, 이러한 핵산이 포함된 하나 또는 그 이상의 벡터 (예컨데, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구체예에 있어서, 이러한 핵산이 포함된 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 가지 구체예에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL이 포함된 아미노산 서열 및/또는 상기 항체의 VH가 포함된 아미노산 서열을 인코드하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL이 포함된 아미노산 서열을 인코드하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터와 상기 항체의 VH가 포함된 아미노산 서열을 인코드하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다(예컨데, 이들 벡터로 형질변환되었다). 한 구체예에 있어서, 숙주 세포는 진핵세포, 예컨데 중국 헴스터 난소(Chinese Hamster Ovary (CHO)) 세포 또는 림프 세포(예컨데, Y0, NS0, Sp20 세포)다. 한 구체예에 있어서, 항-CD22 항체를 만드는 방법이 제공되는데, 이때 이 방법은 상기에서 제공된 바와 같은 항체가 인코드된 핵산이 포함된 숙주 세포를 항체의 발현에 적절한 조건하에서 배양하고, 그리고 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의선택적으로 회수하는 것을 포함한다.
항-CD22 항체의 재조합 생산을 위하여, 예컨데, 상기에서 설명된 바와 같이, 항체를 인코드하는 핵산이 단리되고, 그리고 추가 클로닝 및/또는 숙주 세포 안에서 발현을 위하여 하나 또는 그 이상의 벡터 안으로 삽입된다. 이러한 핵산은 용이하게 단리되고, 통상의 과정을 이용하여 서열화될 수 있다(예컨데, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써).
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 본 명세서에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예로써, 항체는 당화 및 Fc 작용기 기능이 필요없을 때 특히 세균 안에서 만들어질 수 있다. 세균 안에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위하여, 예컨데, U.S. 특허 5,648,237, 5,789,199, 그리고5,840,523를 참고한다. (Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, 대장균(E. coli)에서 항체 단편의 발현을 설명) 발현 후, 상기 항체는 가용성 분획물 안에 세균 세포 페스트로부터 단리될 수 있고, 그리고 추가 정제될 수 있다.
원핵세포에 추가하여, 진핵 미생물, 이를 테면 사상균 또는 효모는 당화 경로가 "인간화되고", 부분적으로 또는 완전하게 인간 당화 패턴을 가진 항체가 만들어지는 곰팡이 및 효모가 포함된 항체-인코딩 벡터를 위한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 그리고 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) 참고.
당화된 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다중 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 또한 유도될 수 있다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 베큘로바이러스 균주는 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 것으로 확인되었는데, 특히 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 확인되었다.
식물 세포 배양물 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예컨데, US 특허 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 그리고 6,417,429 (유전자전이 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 설명)를 참고.
척추동물 세포가 숙주로 또한 이용될 수 있다. 예로써, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유류 세포 계통이 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포 계통의 다른 예는 SV40 (COS-7)에 의하여 형질변환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통 (예컨데, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)에서 설명된 것과 같은 293 또는 293 세포들); 아기 헴스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예컨데, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에서 설명된 것과 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 경부 암종 세포(HELA); 개의 신장 세포(MDCK; 버팔로 렛 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); TRI 세포, 예컨데, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에서 설명된 것과 같은; MRC 5 세포; 그리고 FS4 세포들이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포 계통은 DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 그리고 골수종 세포 계통 이를 테면 Y0, NS0 그리고 Sp2/0을 포함하는 중국 헴스터 난소(CHO) 세포를 포함한다. 항체 생산을 위하여 적절한 포유류 숙주 세포 계통의 검토는 예컨데, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)를 참고한다.
C. 분석
본 명세서에서 제공되는 항-CD22 항체는 당분야에 공지된 다양한 분석에 의해 이들의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되고, 스크리닝되며, 또는 특징화될 수 있다.
한 측면에서, 항체는 예컨데, 공지의 방법 이를 테면 ELISA, BIACore®, FACS, 또는 Western blot에 의해 항체의 항원 결합 활성에 대하여 테스트된다.
또다른 측면에서, 경쟁 분석을 이용하여 CD22에 결합하는 본 명세서에서 설명된 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 경쟁 항체는 본 명세서에서 설명된 항체가 결합하는 동일한 에피토프(예컨대, 선형 또는 입체 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프 멥핑을 위한 상세한 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols,"in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 설명된다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정된 CD22는 CD22에 결합하는 라벨된 제 1 항체 (예컨데, 본원 명세서에서 설명되는 임의의 항체)와 CD22에 결합하기 위하여 제 1 항체와 경쟁하는 능력에 대하여 테스트되는 라벨안된 제 2 항체가 포함된 용액 안에서 항온처리된다. 제 2 항체는 하이브리도마 상청액 안에 존재할 수 있다. 대조으로, 고정된 CD22는 제 1 라벨된 제 1 항체가 포함된, 그러나 라벨안된 제 2 항체는 포함되지 않은 용액 안에서 항온처리된다. CD22에 제 1 항체의 결합이 허용되는 조건하에서 항온처리된 후, 과량의 결합안된 항체는 제거되고, 그리고 고정된 CD22와 연합된 라벨의 양이 측정된다. 고정된 CD22와 연합된 라벨의 양이 대조 시료와 비교하여 테스트 시료에서 실질적으로 감소된 경우, 이는 제 2 항체가 CD22에 결합하는 것에 대하여 제 1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
D. 면역접합체
본 발명은 하나 또는 그 이상의 세포독성 물질, 이를 테면 화학요법 물질 또는 약물, 성장 저해 물질, 톡신 (예컨데, 단백질 톡신, 세균, 곰팡이, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 톡신, 또는 이의 단편), 또는 방사능활성 동위원소 (이를 테면, 방사능접합체)에 접합된 본 명세서의 항-CD22 항체가 포함된 면역접찹체를 또한 제공한다.
면역접합체는 종양으로 약물 모이어티의 표적화 전달과 그리고 일부 구체예들에 있어서 세포내 축적을 허용하는데, 여기에서 접합안된 약물의 전신 투여는 정상 세포로 독성의 수용불가능한 수준을 초래할 수 있다(Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
항체-약물 접합체(ADC)는 잠재적 세포독성 약물을 항원-발현시키는 종양 세포에 표적화시키고(Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), 이로써 효과를 최대화시키고, 표적을 벗어난 독성을 최소화시킴으로써, 치료 지수가 강화되는, 항체 및 세포독성 약물 모두의 성질을 복합시킨 표적화된 화학요법 분자다(Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107.
본 발명의 ADC 화합물들은 항암 활성을 가진 것들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, ADC 화합물들은 약물 모이어티에 접합된, 가령, 공유적으로 부착된 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 링커를 통하여 약물 모이어티에 공유적으로 부착된다. 본 발명의 상기 항체-약물 접합체 (ADC)는 종양 조직에 약물의 유효량을 선택적으로 전달하고, 여기에서 치료 지수는 증가시키면서 ("치료 윈도우") 더 큰 선택성, 이를 테면, 더 낮은 유효한 투여 분량이 획득될 수 있다.
상기 항체-약물 접합체(ADC)의 약물 모이어티(D)는 세포독성 또는 세포억제성 효과를 보유하는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기를 포함한다. 예시적인 약물 모이어티는 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 및 세포독성 활성을 보유한 이의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 면역접합체의 비제한적 예들은 하기에 더 상세하게 논의된다.
1. 예시적인 항체-약물 접합체
항체-약물 접합체 (ADC) 화합물의 예시적인 구체예는 종양 세포를 표적으로 하는 항체(Ab), 약물 모이어티 (D), 그리고 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기, 이를 테면 리신 및/또는 시스테인을 통하여 링커 모이어티(L)에 부착된다.
예시적인 ADC는 공식 I을 가진다:
Figure pct00023
여기에서 p는 1 내지 약 20이다. 일부 구체예들에 있어서, 항체에 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 자유 시스테인 잔기 수에 의해 제한된다. 일부 구체예들에 있어서, 자유 시스테인 잔기는 본 명세서에서 설명된 방법에 의해 항체 아미노산 서열 안으로 도입된다. 공식 I의 예시적인 ADC는 1, 2, 3, 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 보유한 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다 (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). 일부 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 자유 시스테인 잔기가 조작하지 않아도 항체 안에 이미 존재할 수 있고, 이런 경우 기존의 자유 시스테인 잔기가 이용되어 상기 항체를 약물에 접합시킬 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 항체는 하나 또는 그 이상의 자유 시스테인 잔기를 만들기 위하여 항체 접합에 앞서 환원 조건에 노출된다.
a) 예시적인 링커
"링커" (L)는 공식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성하기 위하여 하나 또는 그 이상의 약물 모이어티(D)를 항체(Ab)에 연결시키는데 이용되는 이중기능 또는 다중기능 모이어티다. 일부 구체예들에 있어서, 항체-약물 접합체 (ADC)는 약물과 상기 항체에 공유적으로 부착되는 반응 기능을 보유한 링커를 이용하여 만들 수 있다. 예로써, 일부 구체예들에 있어서, 항체 (Ab)의 시스테인 티올은 링커 또는 약물-링커 중간생성물의 반응 기능기와 결합을 형성하여 ADC를 만들 수 있다.
한 측면에서, 링커는 공유 결합을 형성하기 위하여 항체 상에 존재하는 자유 시스테인과 반응할 수 있는 기능을 보유한다. 이러한 반응 기능기의 비제한적인 예시는 말레이미드, 할로아세타아미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르 이를 테면 숙시니미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 염화물, 술포닐 염화물, 이소시아네이트, 트기로 이소티오시아네이트를 포함한다. 예컨데, Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773의 페이지 766의 접합 방법 및 본 명세서에서 실시예들을 참고.
일부 구체예들에 있어서, 링커는 항체 상에 존재하는 친전자(electrophilic) 기와 반응할 수 있는 기능기를 가진다. 예시적인 이러한 친전자 기는 알데히드 그리고 케톤 카르보닐 기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 링커의 반응 기능기의 헤테로 원자는 항체 상에서 친전자 기와 반응하여 항체 단위에 공유 결합을 형성할 수 있다. 이러한 반응 기능기의 비제한적인 예로는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 그리고 아릴하이드라지드를 포함한다.
링커는 하나 또는 그 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시투룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙시니미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), 그리고 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("MCC")를 포함한다. 다양한 링커 성분은 당분야에 공지되어 있고, 이들중 일부는 하기에서 설명된다.
링커는 약물의 방출을 용이하게 하는 절단가능한 링커"일 수 있다. 비제한적인 예시적인 절단가능한 링커는 산-불안정한 링커 (예컨데, 하이드라존이 포함된), 프로테아제-민감성 (예컨데, 펩티다제-민감성) 링커, 광불안정한 링커, 또는 디설피드-함유 링커를 포함한다(Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); US 5208020).
특정 구체예들에 있어서, 링커는 식 II를 보유한다:
Figure pct00024
이때 A는 "스트레쳐(stretcher) 단위"이며, 그리고 a는 0 내지 1의 정수이고; W는 "아미노산 단위"이며, 그리고 w는 0 내지 12의 정수이며; Y는 "스페이스 단위"이고, 그리고 y는 0, 1, 또는 2이다. 식 II의 링커가 포함된 ADC는 공식 I(A): Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p를 보유하며, 이때 Ab, D, 그리고 p는 상기 공식 I에서 정의된 바와 같다. 이러한 링커의 예시적인 구체예들은 U.S. 특허 7,498,298에서 설명되며, 이들은 명시적으로 명세서의 참고자료에 편입된다.
일부 구체예들에 있어서, 링커 성분은 항체를 또다른 링커 성분 또는 약물 모이어티에 연계시키는 "스트레쳐 단위" (A)를 포함한다. 비제한적인 예시적인 스트레쳐 단위는 하기에서 나타낸다(이때 물결선은 항체, 약물, 또는 추가 링커 성분에 공유 부착 부위를 나타낸다):
Figure pct00025
일부 구체예들에 있어서, 링커 성분은 "아미노산 단위" (W)를 포함한다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 아미노산 단위는 프로테아제, 이를 테면 리소좀 효소에 의한 링커의 절단을 허용함으로써, 세포내 프로테아제에 노출될 때 상기 면역접합체로부터 약물의 방출이 용이하게 된다(Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). 예시적인 아미노산 단위는 이펩티드, 삼펩티드, 사펩티드, 그리고 오펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 이펩티드는 발린-시투룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-리신 (fk 또는 phe-lys); 페닐알라닌-호모리신 (phe-homolys); 그리고N-메틸-발린-시투룰린 (Me-val-cit)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 삼펩티드는 글리신-발린-시투룰린 (gly-val-cit) 그리고글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 아미노산 단위는 자연적으로 발생되는 아미노산 잔기 및/또는 소수 아미노산 및/또는 비-자연 발생적 아미노산 유사체, 이를 테면 시투룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 특정 효소, 예로써, 종양-연합된 프로테아제, 카텝신 B, C 그리고 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의해 효소 절단되고 최적화되도록 기획된다.
전형적으로, 펩티드-유형 링커는 2개 또는 그 이상 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합이 형성됨으로써 준비될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 액상 합성 방법 (예컨데, E. Schroeder 그리고 K. Luebke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press)에 따라 준비될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 링커 성분은 상기 항체를 약물 모이어티에 직접적으로 연계하거나 또는 스트레쳐 단위 및/또는 아미노산 단위를 통하여 연계하는 "스페이스" 단위를 포함한다. 스페이스 단위는 "자가-희생적(self-immolative)" 또는 "비-자가-희생적"일 수 있다. "비-자가-희생적" 스페이스 단위는 ADC가 절단될 때 약물 모이어티 상에 일부 또는 모든 스페이스 단위가 남아있다. 비-자가-희생적 스페이스 단위의 예로는 글리신 스페이스 단위 그리고 글리신-글리신 스페이스 단위를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 종양-세포 연합된 프로테아제에 의해 글리신-글리신 스페이스 단위가 포함된 ADC의 효소 절단으로 ADC의 나머지로부터 글리신-글리신-약물 모이어티거 방출된다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 글리신-글리신-약물 모이어티는 종양 세포 안에서 가수분해 단계를 거치게 되고, 따라서 약물 모이어티로부터 글리신-글리신 스페이스 단위가 절단된다.
"자가-희생적" 스페이스 단위는 약물 모이어티의 방출을 허용한다. 특정 구체예들에 있어서, 링커의 스페이스 단위는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, p-아미노벤질 알코올은 아미드 결합을 통하여 아미노산 단위에 부착되고, 그리고 카르바메이트, 메틸카르바메이트, 또는 카르보네이트가 벤질 알코올과 약물 사이에 만들어진다 (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). 일부 구체예들에 있어서, 스페이스 단위는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB)을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 자가-희생적 링커가 포함된 ADC는 다음 구조를 보유한다:
Figure pct00026
이때 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로, 또는 -시아노이며; m은 0 내지 4 범위의 정수이고; X는 하나 또는 그 이상의 추가 스페이스 단위이거나 또는 존재하지 않을 수 있고; 그리고 p는 1 내지 약 20 범위가 된다. 일부 구체예들에 있어서, p는 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지4의 범위가 된다. 비제한적인 예시적인 X 스페이스 단위는 다음을 포함한다:
Figure pct00027
그리고
Figure pct00028
이때 R1 및 R2는 독립적으로 H 그리고 C1-C6 알킬로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, R1 및 R2는 각각 -CH3이다.
자가-희생적 스페이스의 다른 예들은 PAB 기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물, 이를 테면 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (U.S. 특허 7,375,078; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) 그리고 오르소- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 스페이스는 아미드 결합 가수분해시 고리화를 겪는데 이용될 수 있는데, 이를 테면 치환된 그리고 치환안된 4-아미노부틸산 아미드 (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), 적절하게 치환된 비시클로[2.2.1] 그리고 비시클로[2.2.2] 고리계 (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) 그리고 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867)가 이용될 수 있다. 약물을 글리신 잔기의 α-탄소에 연계는 ADC에서 유용할 수 있는 자가-희생적 스페이스의 또다른 예가 된다 (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
일부 구체예들에 있어서, 링커 L은 분기된(branching), 다중기능성 링커 모이어티를 통하여 하나이상의 약물 모이어티를 항체에 공유적으로 부착시키기 위한 가지돌기(dendritic) 유형 링커일 수 있다 (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). 가지돌기 링커는 항체에 대한 약물의 몰 비율, 즉, 로딩(로딩)을 증가시키고, 이는 ADC의 효능과 관련된다. 따라서, 여기에서 항체는 오직 한 개의 반응 시스테인 티올 기를 가지면, 다수의 약물 모이어티는 가지돌기 링커를 통하여 부착될 수 있다.
비제한적인 예시적인 링커는 식 I의 ADC 내용에서 나타낸다:
Figure pct00029

Figure pct00030
; 이때 R1 및 R2는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, R1 및 R2는 각각 -CH3이다.
Figure pct00031
이때 n은 0 내지 12이다. 일부 구체예들에 있어서, n은 2 내지 10이다. 일부 구체예들에 있어서, n은 4 내지 8이다.
추가 비제한적인 예시적인 ADCs는 다음 구조들을 포함한다:
Figure pct00032
Figure pct00033
여기에서 X는 다음과 같다:
Figure pct00034
Y는
Figure pct00035
이고;
각 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며; 그리고 n은 1 내지 12다.
일부 구체예들에 있어서, 링커는 용해도 및/또는 반응성을 조정하는 기로 치환된다. 비제한적인 실시예로써, 하전된 치환체 이를 테면, 술포네이트 (-SO3 -) 또는 암모늄은 링커 시약의 물 용해도를 증가시킬 수 있고, 그리고 링커 시약과 상기 항체 및/또는 약물 모이어티의 결합 반응을 촉진시키고, 또는 ADC를 준비하는데 이용되는 합성 경로에 따라 Ab-L (항체-링커 중간생성물)과 D, 또는 D-L (약물-링커 중간생성물)과 Ab의 결합 반응을 촉진시킨다. 일부 구체예들에 있어서, 링커의 일부분은 상기 항체에 결합되고, 링커의 일부분은 약물에 결합되어, 그 다음 Ab-(링커 일부분)a는 약물-(링커 일부분)b에 결합되어, 식 I의 ADC가 형성된다.
본 발명의 화합물들은 다음의 링커 시약으로 준비된 ADC를 명백하게 고려하지만 이에 국한되지 않는다: 비스-말레이미도-트리옥시에틸렌 글리콜 (BMPEO), N-(β-말레이미도프로필옥시)-N-히드록시 숙시니미드 에스테르 (BMPS), N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 숙시니미드 에스테르 (EMCS), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙시니미드 에스테르 (GMBS), 1,6-헥산-비스-비닐술폰 (HBVS), 숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙시니미드 에스테르 (MBS), 4-(4-N-말레이미도페닐)부틸산 하이드라지드 (MPBH), 숙시니미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP), 숙시니미딜 요오드아세테이트(SIA), 숙시니미딜 (4-요오드아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), N-숙시니미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), 숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 숙시니미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(SMPB), 숙시니미딜 6-[(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트] (SMPH), 이미노티올란(IT), 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 그리고술포-SMPB, 그리고 숙시니미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트 (SVSB), 그리고 다음의 비스-말레이미드 시약를 포함하고: 디티오비스말레이미도에탄 (DTME), 1,4-비스말레이미도부탄 (BMB), 1,4 비스말레이미딜-2,3-디히드록시부탄 (BMDB), 비스말레이미도헥산 (BMH), 비스말레이미도에탄 (BMOE), BM(PEG)2 (하기에 나타냄), 그리고 BM(PEG)3 (하기에 나타냄); 이미도에스테르의 이중기능기 유도체 (이를 테면 디메틸 아디피이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (이를 테면 디숙시니미딜 수베레이트), 알데히드 (이를 테면 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물들 (이를 테면 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조니움 유도체 (이를 테면 비스-(p-디아조니움벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (이를 테면 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 그리고비스-활성 플루오린 화합물들 (이를 테면 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠). 일부 구체예들에 있어서, 비스-말레이미드 시약은티올-함유 약물 모이어티, 링커, 또는 링커-약물 중간생성물에게 항체내 시스테인의 티올기 부착을 허용한다. 티올 기와 반응성이 있는 다른 기능기는 요오드아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디설피드, 피리딜 디설피드, 이소시아네이트, 그리고 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
Figure pct00036
특정 유용한 링커 시약은 다양한 시판되는 원료, 이를 테면 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO)로부터 구입하거나, 또는 당분야에서 설명된 절차에 따라 합성되거나; 예로써, Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 그리고 WO 04/032828에서 설명된 절차에 따라 합성된다.
탄소-14-라벨된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사능뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅 물질이다. 예컨데, WO94/11026 참고.
b) 예시적인 약물 모이어티
일부 구체예들에 있어서, ADC는 피롤로벤조디아제핀 (PBD)을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, PBD 이합체는 특이적 DNA 서열을 인지하고 이에 결합된다. 천연 산물 안트라마이신, PBD는 1965년 처음으로 보고되었다(Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791-5793). 그 이후, 트리사이클 PBD 스캐폴드의 이합체를 포함하는 자연 생성 및 유사체 모두를 포함한 다수의 PBDs가 보고되었다(Thurston, et al., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465) (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099). 임의의 특정 이론에 국한되지 않고, 이합체 구조는 B-형태의 DNA의 작은 홈을 가진 등나선도(isohelicity)를 위한 적절한 3차원 모양을 부여함으로써, 결합 부위에 꼭 맞게 된다(Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, (1986) Acc. Chem. Res., 19:230-237). C2 아릴 치환체를 보유한 이합체 PBD 화합물은 세포독성 물질로써 유용한 것으로 나타났다(Hartley et al (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927-2941; Howard et al (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466).
PBD 이합체는 항체에 접합되며, 생성된 ADC는 항암 성질을 보유하는 것으로 드러났다. PBD 이합체 상에 비제한적인 예시적인 링키지 부위는 5-원(membered) 피롤로 고리, PBD 단위 사이에 묶음, 그리고 N10-C11 이민 기 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598)를 포함한다.
ADCs의 비제한적인 예시적인 PBD 이합체 성분은 식 A의 성분 및 이의 염과 용매화합물들이며, 여기에서:
Figure pct00037
파동선은 링커에 공유 부착 부위를 나타내고;
점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이에 이중 결합의 임의선택적 존재를 나타내며;
R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 그리고 COR로부터 독립적으로 선택되며, 그리고 임의선택적으로 할로 또는 디할로로부터 추가 선택되며, 이때 RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R6과 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
Q는 O, S 그리고 NH로부터 독립적으로 선택되며;
R11은 H, 또는 R이거나 또는, Q가 O일 때, SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이고;
R 및 R'는 임의선택적으로 치환된 C1-12 알킬, C3-20 헤테로시클일 그리고 C5-20 아릴 기로부터 각각 독립적으로 선택되며, 그리고 기 NRR'와 관련되어 임의선택적으로, R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클 고리를 형성하고;
R12, R16, R19 및 R17은 R2, R6, R9 및 R7에 대해 차례로 정의된 바와 같고;
R″는 C3-12알킬렌 기이며, 각 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자, 예컨데 O, S, N(H), NMe 및/또는 방향족 고리, 예컨데 벤젠 또는 피리딘에 의해 중단될 수 있으며, 이때 고리는 임의선택적으로 치환되며; 그리고
X와 X'는 O, S 그리고 N(H)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, R9 및 R19는 H다.
일부 구체예들에 있어서, R6 및 R16는 H다.
일부 구체예들에 있어서, R7 및 R17은 모두 OR7A이며, 여기에서 R7A는 임의선택적으로 치환된 C1-4 알킬이다. 일부 구체예들에 있어서, R7A는 Me다. 일부 구체예들에 있어서, R7A는 CH2Ph이며, 여기에서 Ph는 페닐 기다.
일부 구체예들에 있어서, X는 O이다.
일부 구체예들에 있어서, R11은 H다.
일부 구체예들에 있어서, 각 단량체 단위에서 C2와 C3 사이에 이중 결합이 있다.
일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 H 및 R로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 독립적으로 R이다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 독립적으로 임의선택적으로 치환된 C5-20 아릴 또는 C5-7 아릴 또는 C8-10 아릴이다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 독립적으로 임의선택적으로 치환된 페닐, 티에닐, 나프틸, 피리딜, 퀴놀리닐, 또는 이소퀴놀리닐이다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 =O, =CH2, =CH-RD, 그리고 =C(RD)2로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 각각 =CH2이다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 각각 H다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 각각 =O이다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및 R12는 각각 =CF2이다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및/또는 R12는 독립적으로 =C(RD)2이다. 일부 구체예들에 있어서, R2 및/또는 R12는 독립적으로 =CH-RD이다.
일부 구체예들에 있어서, R2 및/또는 R12가 각각 =CH-RD일 때, 각 기는 다음에 나타낸 배위를 독립적으로 보유할 수 있다:
Figure pct00038
일부 구체예들에 있어서, =CH-RD는 배위(I)에 있다.
일부 구체예들에 있어서, R″는 C3 알킬렌 기 또는 C5 알킬렌 기다.
일부 구체예들에 있어서, ADC의 예시적인 PBD 이합체 성분은 식 A(I)의 구조를 가진다:
Figure pct00039
이때 n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, ADC의 예시적인 PBD 이합체 성분은 식 A(II)의 구조를 가진다:
Figure pct00040
이때 n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, ADC의 예시적인 PBD 이합체 성분은 식 A(III)의 구조를 가진다:
Figure pct00041
이때 RE 및 RE"는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택되며, 이때 RD 는 상기에서 정의된 바와 같고; 그리고
이때 n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, n은 0이다. 일부 구체예들에 있어서, n은 1이다. 일부 구체예들에 있어서, RE 및/또는 RE"는 H이다. 일부 구체예들에 있어서, RE 및 RE"는 H이다. 일부 구체예들에 있어서, RE 및/또는 RE"는 RD이며, 이때 RD는 임의선택적으로 치환된 C1-12 알킬이다. 일부 구체예들에 있어서, RE 및/또는 RE"는 RD이며, 이때 RD는 메틸이다.
일부 구체예들에 있어서, ADC의 예시적인 PBD 이합체 성분은 식 A(IV)의 구조를 가진다:
Figure pct00042
이때 Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의선택적으로 치환된 C5-20 아릴이며; 이때 Ar1 및 Ar2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고; 그리고
이때 n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, ADC의 예시적인 PBD 이합체 성분은 식 A(V)의 구조를 가진다:
Figure pct00043
이때 Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의선택적으로 치환된 C5-20 아릴이며; 이때 Ar1 및 Ar2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고; 그리고
이때 n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 임의선택적으로 치환된 페닐, 퓨라닐, 티오페닐 그리고 피리딜으로부터 각각 독립적으로 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의선택적으로 치환된 페닐이다. 일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의선택적으로 치환된 티엔-2-일 또는 티엔-3-일이다. 일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의선택적으로 치환된 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다. 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 기는 임의의 이용가능한 고리 위치를 통하여 PBD 코어에 결합될 수 있다. 예로써, 퀴놀리닐은 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 및 퀴놀린-8-일일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 퀴놀리닐은 퀴놀린-3-일과 퀴놀린-6-일에서 선택된다. 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7-일 그리고 이소퀴놀린-8-일일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-3-일과 이소퀴놀린-6-일로부터 선택된다.
ADCs의 추가 비제한적인 예시적인 PBD 이합체 성분은 식 B의 성분 및 이의 염 및 용매화합물이며:
Figure pct00044
이때:
파동선은 링커에 공유 부착 부위를 나타내고;
OH에 연결된 파동선은 S 또는 R 배열을 나타내며;
RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸, 그리고 페닐 (이때 페닐은 특히 위치 4에서 임의선택적으로 플루오로로 치환되며) 그리고 C5-6 헤테로시클일로부터 독립적으로 선택되며; 이때 RV1 및 RV2는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며; 그리고
n은 0 또는 1이다.
일부 구체예들에 있어서, RV1 및 RV2는 H, 페닐, 그리고 4-플루오로페닐로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 링커는 B 고리의 N10 이민, C 고리의 C-2 엔도/엑소 위치, 또는 A 고리를 연결시키는 묶음 단위(아래 구조 C(I) 및 C(II) 참고)를 포함하는 PBD 이합체 약물 모이어티의 다양한 부위중 하나에 부착될 수 있다.
ADCs의 비제한적인 예시적인 PBD 이합체 성분은 식 C(I) 및 C(II)를 포함한다:
Figure pct00045
식 C(I) 및 C(II)는 이들의 N10-C11 이민 형에서 나타난다. 예시적인 PBD 약물 모이어티는 하기 표에 나타낸 것과 같은 또한 카르비놀아민 그리고 보호된 카르비놀아민 형태를 포함한다:
이때:
Figure pct00046
X는 CH2 (n = 1 내지 5), N, 또는 O이며;
Z 및 Z'는 OR 및 NR2로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서 R은 1 내지 5개 탄소원자를 포함하는 1차, 2차 또는 3차 알킬이다;
R1, R'1, R2 및 R'2는 각각 H, C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-20 아릴 (치환된 아릴을 포함), C5-20 헤테로아릴 기, -NH2, -NHMe, -OH, 그리고 -SH로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서, 일부 구체예들에 있어서, 알킬, 알케닐 그리고 알키닐 쇄는 최대 5개 탄소 원자를 포함하고;
R3 및 R'3은 H, OR, NHR, 그리고 NR2로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서 R은 1 내지 5개의 탄소 원자를 함유하는 1차, 2차 또는 3차 알킬이며;
R4 및 R'4는 H, Me, 그리고 OMe로부터 독립적으로 선택되며;
R5는 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-20 아릴 (할로, 니트로, 시아노, 알콕시, 알킬, 헤테로시클일에 의해 치환된 아릴 포함) 그리고 C5-20 헤테로아릴 기로부터 선택되며, 여기에서, 일부 구체예들에 있어서, 알킬, 알케닐 그리고알키닐 쇄는 최대 5개의 탄소 원자를 포함하고;
R11은 H, C1-C8 알킬, 또는 보호 기 (이를 테면 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ), 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc), 또는 자가-희생 단위 이를 테면, 발린-시투룰린-PAB을 포함하는 모이어티)이고;
R12는 H, C1-C8 알킬, 또는 보호 기이며;
이때 R1, R'1, R2, R'2, R5, 또는 R12 중 하나의 수소 또는 A 고리 사이에 있는 -OCH2CH2(X)nCH2CH2O- 스페이스의 수소는 ADC의 링커에 연결된 결합으로 대체된다.
ADC의 예시적인 PBD 이합체 일부분은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다(파동선은 링커에 공유 부착 부위를 나타낸다):
Figure pct00047
PBD 이합체;
일부 구체예들에 있어서, PBD 이합체를 포함하는 항체-약물 접합체는 식 (D) 그리고 이의 염 및 용매화합물의 구조를 가진다:
Figure pct00048
이때:
점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이에 이중 결합의 임의선택적 존재를 나타내며;;
R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 그리고 COR로부터 독립적으로 선택되며, 그리고 임의선택적으로 할로 또는 디할로로부터 추가 선택되며; 여기에서 RD 는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R6과 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
Y는 단일 결합, 그리고 식 a1 또는 a2의 기로부터 선택되며:
여기에서 N은 기들이 PBD 모이어티의 N10에 결합되는 것을 나타낸다;
Figure pct00049
RL1 및 RL2는 H 그리고 메틸로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 이들이 부착된 탄소와 함께 시클로프로필렌 기를 형성하고;
CBA는 항체를 나타내며;
Q는 O, S 그리고 NH로부터 독립적으로 선택되며;
R11은 H, 또는 R이거나 또는, Q가 O일 때, SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이고;
R 및 R'는 임의선택적으로 치환된 C1-12 알킬, C3-20 헤테로시클일 그리고 C5-20 아릴 기로부터 독립적으로 각각 선택되며, 그리고 임의선택적으로 기 NRR'와 관련된 경우, R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클 고리를 형성하며;
이때 R12, R16, R19 및 R17은 R2, R6, R9 및 R7에 대해 차례로 정의된 바와 같고;
이때 R″는 C3-12 알킬렌 기이며, 이의 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자, 예컨데 O, S, N(H), NMe 및/또는 방향족 고리, 예컨데 벤젠 또는 피리딘에 의해 중단될 수 있으며, 이들 고리는 임의선택적으로 치환되며;
X와 X'는 O, S 그리고 N(H)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 시스테인을 통하여 PBD 이합체에 연계되어 디설피드 링키지를 형성하는데, 이는 예컨데, 도 4b 및 4c에 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 식 D는 Y에 따라 식 D-I, D-II 및 D-III로부터 선택된다:
Figure pct00050
식 A의 화합물들에서:
Figure pct00051
는 황 연결기다.
일부 구체예들에 있어서, ADC는 다음 구조를 포함하고:
Figure pct00052

그리고 일부 구체예들에 있어서, ADC는 다음 구조를 포함한다:
Figure pct00053
이때 CBA는 항체이며, 그리고 n은 0 또는 1이다. Y, RL1 및 RL2는 기존에 정의된 바와 같고, 그리고 RE 및 RE"는 각각 H 또는 RD로부터 독립적으로 선택된다.
상기에서 설명된 임의의 구체예들에 있어서, 특정 치환체는 다음과 같이 정의되며, 여기에서 다음과 같다:
n은 0이며;
n은 1이며;
RE는 H이며;
RE는 RD이고, 여기에서 RD 는 임의선택적으로 치환된 알킬이며;
RE는 RD이고, 여기에서 RD 는 메틸이며;
RL1 및 RL2는 H이고;
RL1 및 RL2는 Me이다.
일부 구체예들에 있어서, ADC는 다음 구조를 포함하고:
Figure pct00054

그리고 일부 구체예들에 있어서, ADC는 다음 구조를 포함한다:
Figure pct00055
이때 CBA는 항체이며, 그리고 n은 0 또는 1이다. Y, RL1 및 RL2는 앞서 정의된 바와 같고, 그리고 Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의선택적으로 치환된 C5-20 아릴이며. Ar1 및 Ar2는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 각각 임의선택적으로 치환된 페닐, 퓨라닐, 티오페닐 그리고 피리딜로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 각각 임의선택적으로 치환된 페닐이다. 일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 각각 임의선택적으로 치환된 티엔-2-일 또는 티엔-3-일이다. 일부 구체예들에 있어서, Ar1 및 Ar2는 각각 임의선택적으로 치환된 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다.
다양한 구체예들에 있어서, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 기는 임의의 이용가능한 고리 위치를 통하여 PBD 코어에 결합될 수 있다. 예로써, 퀴놀리닐은 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 그리고퀴놀린-8-일일 수 있다. 이들 중 퀴놀린-3-일 그리고 퀴놀린-6-일이 바람직할 수 있다. 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7일 그리고 이소퀴놀린-8-일일 수 있다. 이들 중 이소퀴놀린-3-일 그리고 이소퀴놀린-6-일이 바람직할 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, ADC는 다음 구조를 포함하고:
Figure pct00056
그리고 일부 구체예들에 있어서, ADC는 다음 구조를 포함한다:
Figure pct00057
이때 CBA는 항체이며, 그리고 n은 0 또는 1이다. Y, RL1 및 RL2는 앞서 정의된 바와 같고, 그리고 RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 그리고 페닐 (페닐은 일부 구체예들에 있어서, 위치 4에서 플로오르로 임의선택적으로 치환될 수 있다) 그리고 C5-6 헤테로시클일로부터 독립적으로 선택된다. RV1 및 RV2는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며. 일부 구체예들에 있어서, RV1 및 RV2는 H, 페닐, 그리고 4-플루오로페닐로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
PBD 이합체를 포함하는 비제한적인 예시적인 ADCs의 구체예는 다음 구조를 가진다:
Figure pct00058
PBD 이합체-val-cit-PAB-Ab;
Figure pct00059
PBD 이합체-Phe-Lys-PAB-Ab, 이때:
n은 0 내지 12이다. 일부 구체예들에 있어서, n은 2 내지 10이다. 일부 구체예들에 있어서, n은 4 내지 8이다. 일부 구체예들에 있어서, n은 4, 5, 6, 7, 및 8로부터 선택된다.
PBD 이합체-val-cit-PAB-Ab 및 PBD 이합체-Phe-Lys-PAB-Ab의 링커는 프로테아제 절단가능하다.
PBD 이합체를 포함하는 ADCs의 비제한적인 예시적 구체예들은 다음 구조를 보유한다:
Figure pct00060
PBD 이합체-디설피드-Ab; 그리고
Figure pct00061
PBD 이합체-디설피드 메틸-Ab.
PBD 이합체 및 PBD 이합체가 포함된 ADC는 당분야에 공지된 방법에 따라 그리고 본 명세서에서 설명된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨데, WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598 참고.
c) 약물 로딩
약물 로딩은 식 I의 분자에서 항체 당 약물 모이어티의 평균 수, p로 나타낸다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개의 약물 모이어티(D) 범위가 될 수 있다. 식 I의 ADCs는 약 1 내지 20개의 약물 모이어티 범위로 접합된 항체 집합을 포함한다. 접합 반응에서 ADC의 준비물내 항체당 약물 모이어티의 평균 수는 통상적인 수단, 이를 테면 질량 분석, ELISA 분석, 그리고 HPLC에 의해 특징화될 수 있다. p 측면에서 ADC의 정량적 분포 또한 측정될 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 상동성 ADC의 분리, 정제 및 특징화는 이를 테면 역상 HPLC 또는 전기영동 수단에 의해 획득될 수 있으며, 여기에서 p는 또다른 약물이 로딩된 ADC의 특정 값이 된다.
일부 항체-약물 접합체의 경우, p는 항체 상에 있는 부착 부위의 수로 제한될 수 있다. 예로써, 여기에서 부착은 시스테인 티올이며, 상기의 특정 예시적인 구체예들에 있어서, 항체는 오직 한개 또는 몇 개의 시스테인 티올 기를 보유할 수 있거나, 또는 링커에 부착될 수 있는 오직 한 개 또는 몇 개의 충분한 반응성 티올기를 보유할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 약물 로딩이 높을 수록, 예컨데 p >5일 경우 특정 항체-약물 접합체의 응집(aggregation), 불용성, 독성 또는 세포 침투 능력의 상실을 야기할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, ADC의 경우 평균 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 또는 약 3 내지 약 5의 범위가 된다. 또한, 특정 ADCs의 경우, 항체당 약물 모이어티의 최적 비율은 8 미만일 수 있고, 그리고 약 2 내지 약 5 일 수 있는 것으로 나타났다 (US 7498298).
특정 구체예들에 있어서, 이론적인 최대치보다 적은 약물 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는 하기에서 논의되는 바와 같이, 약물-링커 중간생성물 또는 링커 시약과 반응하지 않는 예를 들면, 리신 잔기를 보유할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수도 있는 많은 자유 그리고 반응성 시스테인 티올 기를 포함하지 않고; 실제로 항체내 대부분 시스테인 티올 잔기는 디설피드 다리로 존재한다. 특정 구체예들에 있어서, 항체는 부분적 또는 전체 환원 조건하에서 반응성 시스테인 티올기를 만들기 위하여 환원 물질 이를 테면 디티오트레톨 (DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 환원될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 항체는 반응성 친핵 기 이를 테면 리신 또는 시스테인를 드러내기 위하여 변성 조건을 거친다.
ADC의 로딩 (약물/항체 비율)은 여러 방법으로 조절될 수 있으며 그리고 예로써, (i) 항체에 대한 약물-링커 중간생성물 또는 링커 시약의 몰 초과량을 제한하고, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한하고, 그리고 (iii) 시스테인 티올 변형에 대한 환원 상태를 부분적 또는 제한함으로써, 조절될 수 있다.
여기에서 하나 이상의 친핵 기는 약물-링커 중간생성물 또는 링커 시약과 반응하고, 그 다음 생성 산물은 항체에 부착된 하나 또는 그 이상의 약물 모이어티 분포를 가진 ADC 화합물의 혼합물이 된다는 것으로 이해된다. 항체당 평균 약물의 수는 항체에 특이적이며, 그리고 약물에 대해 특이적인 이중 ELISA 항체 분석에 의해 혼합물로부터 산출될 수 있다. 개체 ADC 분자는 질량 분석에 의해 혼합물에서 확인될 수 있고 HPLC, 예컨데 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다(예컨데, McDonagh et al (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugates," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004 참고). 특정 구체예들에 있어서, 단일 로딩 값을 가진 상동성 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
d) 면역접합체를 준비하는 특정 방법들
식 I의 ADC는 당분야에 공지된 유기 화학 반응, 조건 그리고 시약을 이용하는 몇 가지 경로에 의해 제조될 수 있는데, 다음이 포함된다: (1) 공유 결합을 통하여 Ab-L을 만들기 위하여 이가 링커 시약과 항체의 친핵 기의 반응, 이어서 약물 모이어티 D의 반응; 그리고 (2) 공유 결합을 통하여 D-L을 만들기 위하여 이가 링커 시약과 약물 모이어티의 친핵 기의 반응, 이어서 항체의 친핵기와의 반응. 후자 경로를 통하여 식 I의 ADC를 제조하는 예시적인 방법은 이의 전문이 명세서의 참고자료에 편입된 US 7498298에서 설명된다.
항체 상의 친핵 기는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예컨데 리신, (iii) 측쇄 티올 기, 예컨데 시스테인, 그리고 (iv) 슈가 히드록실 또는 아미노 기, 여기에서 상기 항체는 당화된다. 아민, 티올, 그리고히드록실 기는 친핵기이며, 링커 모이어티 상에 친전자기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있고, 그리고 링커 시약은 다음을 포함한다: (i) 활성 에스테르 이를 테면 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 그리고 산 할로겐화물; (ii) 알킬 그리고벤질 할로겐화물 이를 테면 할로아세트아미드; 그리고 (iii) 알데히드, 케톤, 카르복시, 그리고 말레이미드 기. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디설피드, 가령, 시스테인 다리를 가진다. 항체는 환원 물질 이를 테면 DTT (디티오트레톨) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)로 처리됨으로써 링커 시약과의 접합에 반응성이 될 수 있고, 따라서 상기 항체는 완전하게 또는 부분적으로 환원된다. 각 시스테인 다리는 따라서 이론적으로 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가 친핵 기는 예컨데, 리신 잔기과 2-이미노티올란 (Traut의 시약)이 반응하여, 아민이 티올로 전환됨으로써, 리신 잔기 변형을 통하여 항체 안으로 도입될 수 있다. 반응성 티올 기는 또한 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상 시스테인 잔기를 도입시킴으로써(예컨데, 하나 또는 그 이상의 비-고유한 시스테인 아미노산 잔기가 포함된 변이체 항체를 만듦으로써), 항체 안으로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 항체 상의 친전자 기 이를 테면 알데히드 또는 케톤 카르보닐 기와 링커 시약 또는 약물의 친핵 기와의 반응에 의해 또한 만들어질 수 있다. 링커 시약 상에 유용한 친핵 기는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 그리고 아릴하이드라지드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에 있어서, 항체는 링커 시약 또는 약물 상에 친핵 치환체와 반응할 수 있는 친전자 모이어티를 도입시키기 위하여 변형된다. 또다른 구체예에 있어서, 당화된 항체의 슈가는 예컨데 과옥소산염 산화 시약으로 산화되어, 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있고, 이는 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있다. 생성된 이민 Schiff 염기 기는 안정적인 링키지를 형성할 수 있거나, 또는 예컨데 수소화붕소시약에 의해 환원되어 안정적인 아민 링키지를 형성할 수 있다. 한 구체예에 있어서, 당화된 항체의 탄수화물 부분은 갈락토즈 산화효소 또는 메타-과옥소산 나트륨염과 반응으로 항체에서 카르보닐 (알데히드 그리고 케톤) 기를 만들 수 있고, 이는 약물에 있는 적절한 기와 반응할 수 있다(Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또다른 구체예에 있어서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 항체는 메타-과옥소산 나트륨염과 반응할 수 있고, 제 1 아미노산을 대신하여 알데히드를 생산하게 된다 (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). 이러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응될 수 있다.
약물 모이어티 상의 예시적인 친핵 기는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 링커 모이어티 상에 있는 친전자 기와 공유 결합을 형성하기 위하여 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 그리고 아릴하이드라지드 기, 그리고 링커 시약은 다음을 포함한다: (i) 활성 에스테르 이를 테면 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 그리고 산 할로겐화물; (ii) 알킬 그리고 벤질 할로겐화물 이를 테면 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복시, 그리고 말레이미드 기.
ADC를 만드는데 이용될 수 있는 비제한적인 예시적인 교차-링커 시약은 본 명세서 안에 "예시적인 링커"라는 제목의 부분에서 설명된다. 단백질성 모이어티와 화학 모이어티가 포함된 2개 모이어티를 연계시키기 위하여 교차-링커 시약을 사용하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 일부 구체예들에 있어서, 항체 및 세포독성 물질이 포함된 융합 단백질은 예컨대, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 재조합 DNA 분자는 항체를 인코드하는 영역과 접합체의 세포독성 부분을 인코드하는 영역을 포함할 수 있는데, 이들 영역은 서로 인접해있거나 또는 접합체의 바람직한 성질을 파괴하지 않은 링커 펩티드를 인코드하는 영역에 의해 분리되어 있을 수 있다.
여전히 또다른 구체예에 있어서, 항체는 종양 사전-표적화에서 이용을 위한 "수용체"(이를 테면 스트렙타아비딘)에 접합될 수 있으며, 이때 상기 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여되고, 이어서 제거 물질을 이용하여 순환계로부터 결합안된 접합체가 제거되고, 그리고 세포독성 물질에 접합된 "리간드" (예컨데, 약물 또는 방사능뉴클레오티드)가 투여된다.
E. 진단 및 탐지를 위한 방법 및 조성물
특정 구체예들에 있어서, 항-CD22 본 명세서에서 제공되는 임의의 항체는 생물학적 시료 안에 CD22의 존재를 탐지하는데 유용하다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "탐지"는 정량적 또는 정성적 탐지를 포괄한다. "생물학적 시료"는 예컨데, 세포 또는 조직 (예컨데, 임파종, 비-호지킨 임파종 (NHL), 공격성 NHL, 재발된 공격성 NHL, 재발된 무기력한 NHL, 난치성 NHL, 난치성 무기력한 NHL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 소림프구성 임파종, 백혈병, 털모양 세포백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 버킷 임파종, 그리고 맨틀 세포 임파종을 포함하나 이에 한정되지 않는 B 세포 장애 및/또는 B 세포 증식성 장애를 가진 또는 가진 것으로 의심이 되는 대상의 조직이 포함된 암 또는 암 가능성이 있는 임파 조직이 포함된 생검 물질을 포함한다.
한 구체예에 있어서, 진단 또는 탐지 방법에 이용되기 위한 항-CD22 항체가 제공된다. 추가 측면에 있어서, 생물학적 시료 안에 CD22의 존재에 대한 탐지 방법이 제공된다. 특정 구체예들에 있어서, 이 방법은 본 명세서에서 설명된 항-CD22 항체를 항-CD22 항체가 CD22에 결합이 허용되는 조건하에서 생물학적 시료에 접촉시키고, 그리고 생물학적 시료 안에서 항-CD22 항체와 CD22 사이에 복합체가 형성되었는지를 탐지하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 구체예에 있어서, 항-CD22 항체는 항-CD22 항체를 이용한 치료에 적격인 대상을 선택하는데 이용되며, 예컨데 여기에서 CD22는 환자 선별을 위한 생물지표다. 추가 구체예에 있어서, 생물학적 시료는 세포 또는 조직 (예컨데, 임파종, 비-호지킨 임파종 (NHL), 공격성 NHL, 재발된 공격성 NHL, 재발된 무기력한 NHL, 난치성 NHL, 난치성 무기력한 NHL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 소림프구성 임파종, 백혈병, 털모양 세포백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 버킷 임파종, 그리고 맨틀 세포 임파종을 포함하나 이에 한정되지 않는 B 세포 장애 및/또는 B 세포 증식성 장애를 가진 또는 가진 것으로 의심이 되는 대상의 조직이 포함된 암 또는 암 가능성이 있는 임파 조직이 포함된 생검 물질을 포함한다)이다.
추가 구체예에 있어서, 항-CD22 항체는 예컨데, 암의 진단, 예후, 단계를 결정하기 위한 목적, 적절한 치료 과정을 결정하기 위한 목적, 또는 치료에 대한 암의 반응을 모니터하기 위한 목적으로, 생체내 영상화(imaging)에 의해 대상에서 CD22-양성 암을 탐지하기 위하여 생체내에서 이용된다. 생체내 탐지를 위하여 당분야에 공지된 한 가지 방법은 예컨데, van Dongen et al., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) 그리고 Verel et al., J. Nucl. Med. 44:1271-1281 (2003)에서 설명된 것과 같은 면역-양전자 방출 단층촬영술 (면역-PET)이다. 이러한 구체들에 있어서, 대상에서 CD22-양성 암을 탐지하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 라벨된 항-CD22 항체를 CD22-양성 암을 가진 또는 가진 것으로 의심되는 대상에게 투여하고, 그리고 대상에서 라벨된 항-CD22 항체를 탐지하는 것을 포함하며, 이때 라벨된 항-CD22 항체의 탐지는 대상에 CD22-양성 암이 있음을 나타낸다. 이러한 구체예들에 있어서, 라벨된 항-CD22 항체는 양전자 방출자, 이를 테면 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 그리고 124I에 접합된 항-CD22 항체를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 양전자 방출자는 89Zr이다.
추가 구체예들에 있어서, 진단 또는 탐지 방법은 기질에 고정된 제 1 항-CD22 항체를 CD22의 존재에 대하여 테스트되는 생물학적 시료와 접촉시키고, 이 기질을 제 2 항-CD22 항체에 노출시키고, 그리고 제 2 항-CD22가 생물학적 시료 안에 제 1 항-CD22와 CD 22 사이의 복합체에 결합되어 있는 지를 탐지하는 것을 포함한다. 기질은 임의의 지지성 매체, 예컨대, 유리, 금속, 세라믹, 폴리머 비드, 슬라이드, 칩 또는 다른 기질이 될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 생물학적 시료는 세포 또는 조직 (예컨데, 임파종, 비-호지킨 임파종 (NHL), 공격성 NHL, 재발된 공격성 NHL, 재발된 무기력한 NHL, 난치성 NHL, 난치성 무기력한 NHL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 소림프구성 임파종, 백혈병, 털모양 세포백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 버킷 임파종, 그리고 맨틀 세포 임파종을 포함하나 이에 한정되지 않는 B 세포 장애 및/또는 B 세포 증식성 장애를 가진 또는 가진 것으로 의심이 되는 대상의 조직이 포함된 암 또는 암 가능성이 있는 임파 조직이 포함된 생검 물질을 포함한다)이다. 특정 구체예들에 있어서, 제 1 또는 제 2 항-CD22 항체는 본 명세서에서 설명된 임의의 항체다.
상기 구체예들중 임의의 것에 따라 진단 또는 탐지될 수 있는 예시적인 장애는 CD22-양성 암, 이를 테면 CD22-양성 임파종, CD22-양성 비-호지킨 임파종 (NHL; CD22-양성 공격성 NHL, CD22-양성 재발된 공격성 NHL, CD22-양성 재발된 무기력한 NHL, CD22-양성 난치성 NHL, 그리고 CD22-양성 난치성 무기력한 NHL을 포함하나 이에 한정되지 않는다), CD22-양성 만성 림프모구 백혈병 (CLL), CD22-양성 소림프구성 임파종, CD22-양성 백혈병, CD22-양성 털모양 세포백혈병 (HCL), CD22-양성 급성 림프구성 백혈병 (ALL), CD22-양성 버킷 임파종, 그리고 CD22-양성 맨틀 세포 임파종을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 암은 종양 세포 >90% 이상에서 매우 약하거나 또는 착색이 없는 것에 상응하는 "0"이상의 항-CD22 면역조직화학(IHC) 점수를 받은 암이다. 일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 암은 1+, 2+ 또는 3+ 수준에서 CD22를 발현시키고, 이때 1+은 신생물 세포 >50%에서 약한 착색에 상응하며, 2+는 >50% 신생물 세포에서 중간수준의 착색에 상응하며, 그리고 3+는 신생물 세포의 >50%에서 강력한 착색에 상응한다. 일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 암은 즉석(in situ) 혼성화(ISH) 분석에 따라 CD22를 발현시키는 암이다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, IHC에 이용되는 것과 유사한 득점 시스템이 이용된다. 일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 암은 CD22 mRNA를 탐지하는 역-전사효소 PCR (RT-PCR) 분석에 따라 CD22를 발현시키는 암이다. 일부 구체예들에 있어서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
특정 구체예들에 있어서, 라벨된 항-CD22 항체가 제공된다. 라벨은 직접적으로 탐지되는 라벨 또는 모이어티 (이를 테면 형광, 발색단, 전자-밀도, 화학적 발광, 그리고 방사능활성 라벨), 뿐만 아니라 예컨데, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통하여 간접적으로 탐지되는 이를 테면 효소 또는 리간드와 같은 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 염료 전구물질 이를 테면 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제, 바이오틴/아비딘, 스핀 라벨, 박테리오파아지 라벨, 안정적인 자유 라디칼 및 이와 유사한 것들을 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소와 결합된, 예시적인 라벨은 방사능동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 그리고 131I, 플루오르 이를 테면, 희토 킬레이트 또는 플루오레신 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예컨데, 반딧불이 발광효소 및 세균성 발광효소 (U.S. 특허 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로 프탈라진디온, 양소추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예컨데, 글루코즈 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제, 그리고 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소, 헤테로사이클 옥시다제 이를 테면 우리카제 및 산틴 옥시다제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또다른 구체예에 있어서, 라벨은양전자 방출자다. 양전자 방출자는 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 그리고 124I를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에 있어서, 양전자 방출자는 89Zr이다.
F. 약학 제제
본원 명세서에서 설명된 항-CD22 항체 또는 면역접합체의 약학 제제는 하나 또는 그 이상의 임의선택적 약학적으로 수용가능한 운반체에 바람직한 수준의 순도를 가진 이러한 항체 또는 면역접합체를 혼합하여 동결건조된 제제 또는 수성 용액 형태로 만들어진다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 약학적으로 수용가능한 운반체는 이용된 약량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 비독성이며, 그리고 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 완충액 이를 테면 포스페이트, 구연산염, 그리고 다른 유기 산; 아스크로브산 및 메티오닌이 포함된 항산화제; 보존제 (이를 테면 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 이를 테면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 이를 테면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 폴리머 이를 테면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 이를 테면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 포도당, 만노즈, 또는 덱스트린이 포함된 기타 탄수화물; 킬레이팅 물질 이를 테면 EDTA; 슈가 이를 테면 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 솔비톨; 염-형성 카운터-이온 이를 테면 나트륨; 금속 복합체 (예컨데 Zn-단백질 복합체); 그리고/또는 비-이온성 계면활성제 이를 테면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원 명세서에서 예시적인 약학적으로 수용가능한 운반체는 침입형(insterstitial) 약물 분산 물질 이를 테면 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예로써, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 이를 테면 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 포함한다. rHuPH20을 포함하는 특정 예시적인 sHASEGPs 및 이용 방법은 US 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에서 설명된다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 또는 그 이상의 추가 글리코사미노글리칸 이를 테면 콘드로이티나제와 복합된다.
예시적인 동결건조된 항체 또는 면역접합체 제제는 US 특허 6,267,958에서 설명된다. 수성 항체 또는 면역접합체 제제는 US 특허 6,171,586 그리고 WO2006/044908에서 설명된 것들을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본 명세서의 제제는 치료될 특정 질환에 필수적인, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 주지 않는 상보성 활성을 가진 하나 또는 그 이상의 활성 성분을 또한 포함할 수 있다.
활성 성분은 코아세르베이션 기술 또는 인터페이스(interfacial) 중합화에 의해 준비된 미소캡슐 안에 포집될 수 있는데, 예로써, 콜로이드성 약물 운반 시스템(예로써, 리포좀, 알부민 미소구체, 미세유액, 나노-입자 그리고 나노캡슐) 또는 거대유액 안에 각각 히드록시메틸셀룰로오즈 또는 젤라틴-미소캡슐 그리고 폴리-(메틸메타아실레이트) 미소캡슐로 준비될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 기술된다.
지속적-방출 조제물이 만들어질 수 있다. 지속적-방출 조제물의 적절한 예로는 고체의 소수성 폴리머 함유 상기 항체 또는 면역접합체의 반침투성 매트릭스를 포함하는데, 이 매트릭스는 모양을 갖춘 물품, 예컨데 필름, 또는 미소캡슐의 형태다.
생체내 투여에 이용되는 제제는 일반적으로 살균된다. 살균은 살균 여과 막을 통하여 여과에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에서 제공되는 임의의 항-CD22 항체 또는 면역접합체는 방법, 예컨데, 치료 방법에 이용될 수 있다.
한 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 항-CD22 항체 또는 면역접합체는 CD22-양성 세포의 증식을 억제하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 세포의 표면 상에 있는 CD22에 항-CD22 항체 또는 면역접합체의 결합을 허용하는 조건하에서 세포를 항-CD22 항체 또는 면역접합체에 노출시키는 것을 포함하고, 이로 인하여 세포의 증식이 억제된다. 특정 구체예들에 있어서, 이 방법은 시험관내 또는 생체내 방법이다. 일부 구체예들에 있어서, 이 세포는 B 세포다. 일부 구체예들에 있어서, 이 세포는 신생물 B 세포, 이를 테면 임파종 세포 또는 백혈병 세포다.
세포증식 시험관내의 억제는 Promega (Madison, WI)에서 시판하는 CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay를 이용하여 분석될 수 있다. 이 분석은 존재하는 ATP의 양에 근거하여 배양물에서 살아있는 세포의 수를 결정하는데, 이는 대사적으로 활성 세포를 나타낸다. Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, US Pat. No. 6602677 참고. 이 분석은 96- 또는 384-웰 포맷에서 실행되어, 자동화된 고-처리량 스크리닝(HTS)에 적합하게 된다. Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. 이 분석 과정은 배양된 세포에 직접단일 시약 (CellTiter-Glo® 시약)을 첨가하는 것과 관련된다. 이로써 세포가 용해되고, 루시페라제 반응에 의해 생성되는 발광 신호가 생성된다. 이 발광 신호는 존재하는 ATP의 양에 비례하며, 이는 배양물에 존재하는 살아있는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 발광계 또는 CCD 카메라 영상 장치에 의해 데이터가 기록될 수 있다. 발광 출력은 상대적인 광 단위(RLU)로 나타낸다.
또다른 측면에서, 약물로써 아용하기 위한 항-CD22 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 추가 측면에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-CD22 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 구체예들에 있어서, CD22-양성 암 치료에 사용하기 위한 항-CD22 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명은 CD22-양성 암을 가진 개체를 치료하는 방법에 이용하기 위한 항-CD22 항체 또는 면역접합체를 제공하는데, 이 방법은 이 개체에게 유효량의 항-CD22 항체 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 가지 구체예에서, 이 방법은 하기에서 설명되는 최소한 한 가지 추가 치료 물질의 유효량을 이 개체에게 투여하는 것을 더 포함한다.
추가 측면에 있어서, 약물의 제조 또는 준비에서 본 발명은 항-CD22 항체 또는 면역접합체의 용도를 제공한다. 한 구체예에 있어서, 이 약물은 CD22-양성 암의 치료용이다. 추가 구체예에 있어서, 이 약물은 CD22-양성 암을 치료하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 CD22-양성 암을 가진 개체에게 이 약물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 가지 구체예에서, 이 방법은 하기에서 설명되는 최소한 한 가지 추가 치료 물질의 유효량을 이 개체에게 투여하는 것을 더 포함한다.
추가 측면에 있어서, 본 발명은 CD22-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에 있어서, 이 방법은 이러한 CD22-양성 암을 가진 개체에게 유효량의 항-CD22 항체 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 가지 구체예에서, 이 방법은 하기에서 설명되는 최소한 한 가지 추가 치료 물질의 유효량을 이 개체에게 투여하는 것을 더 포함한다.
상기 구체예들중 임의의 한 구체예에 따른 CD22-양성 암은 예컨데, 임파종, 비-호지킨 임파종 (NHL), 공격성 NHL, 재발된 공격성 NHL, 재발된 무기력한 NHL, 난치성 NHL, 난치성 무기력한 NHL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 소림프구성 임파종, 백혈병, 털모양 세포백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 버킷 임파종, 그리고 맨틀 세포 임파종일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 암은 종양 세포 >90% 이상에서 매우 약하거나 또는 착색이 없는 것에 상응하는 "0"이상의 항-CD22 면역조직화학(IHC) 또는 즉석 혼성화(ISH) 점수를 받은 암이다. 또다른 구체예들에 있어서, CD22-양성 암은 1+, 2+ 또는 3+ 수준에서 CD22를 발현시키고, 이때 1+은 신생물 세포 >50%에서 약한 착색에 상응하며, 2+는 >50% 신생물 세포에서 중간수준의 착색에 상응하며, 그리고 3+는 신생물 세포의 >50%에서 강력한 착색에 상응한다. 일부 구체예들에 있어서, CD22-양성 암은 CD22 mRNA를 탐지하는 역-전사효소 PCR (RT-PCR) 분석에 따라 CD22를 발현시키는 암이다. 일부 구체예들에 있어서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
일부 구체예들에 있어서, 피롤로벤조디아제핀 세포독성 모이어티가 포함된 면역접합체는 예로써, 실시예 B 및 D에서 나타낸 것과 같은 이종이식편 모델에서 증명된 것과 같이, 미만성 거대 B-세포 임파종을 치료하는데 유용하다. 일부 구체예들에 있어서, 미만성 거대 B-세포 임파종을 치료하는데 사용하기 위한 면역접합체는 다음 구조를 보유한 PBD 이합체를 포함한다:
Figure pct00062
이때 n은 0 또는 1이다. 일부 구체예들에 있어서, PBD 이합체는프로테아제 절단가능한 링커를 통하여 항체에 공유적으로 부착되는데, 이를 테면, 예로써, 도 4a에 나타낸 상기 면역접합체다. 일부 구체예들에 있어서, PBD 이합체는 디설피드 링커를 통하여 항체에 공유적으로 부착되는데, 이를 테면, 예로써, 도 4b 및 4c에 나타낸 상기 면역접합체다. 일부 구체예들에 있어서, 피롤로벤조디아제핀 세포독성 모이어티가 포함된 면역접합체는 맨틀 세포 임파종 그리고 버킷 임파종을 치료하는데 유용하다.
상기 구체예들중 임의의 한 구체예에 따른"개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에 있어서, 본 발명은 상기 치료 방법들중 임의의 것에 사용하기 위하여 본 명세서에서 제공된 항-CD22 항체 또는 면역접합체가 포함된 약학 제제를 제공한다. 한 구체예에 있어서, 약학 제제는 본 명세서에서 제공된 항-CD22 항체 또는 면역접합체와 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 약학 제제는 본 명세서에서 제공된 임의의 항-CD22 항체 또는 면역접합체와 최소한 한 가지 추가 치료 물질, 예컨데, 하기에서 설명되는 것을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 단독으로 또는 치료법에서 다른 물질과 복합되어 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 최소한 한 가지 추가 치료 물질과 함께 공동-투여될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 항-CD22 면역접합체는 항-CD79b 항체 또는 면역접합체와 함께 투여된다. 비제한적인 예시적인 항-CD79b 항체 또는 면역접합체는 huMA79bv28의 초가변 영역을 포함하는데, 이러한 항-CD79b 항체 또는 면역접합체는 (i) 서열 번호: 32의 서열을 가진 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 33의 서열을 가진 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 34의 서열을 가진 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 35의 서열을 가진 HVR-L1, (v) 서열 번호: 36의 서열을 가진 HVR-L2, 그리고 (vi) 서열 번호: 37의 서열을 가진 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 항-CD79b 항체 또는 면역접합체는 huMA79bv28의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 일부 구체예들에 있어서, 항-CD79b 항체 또는 면역접합체는 서열 번호: 38의 서열을 보유한 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 39의 서열을 보유한 경쇄 가변 영역을 포함ㅎ나다. 일부 구체예들에 있어서, 항-CD79b 면역접합체는 아우리스태틴, 네모루비친 유도체, 그리고 피롤로벤조디아제핀으로부터 선택된 세포 독성 물질을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 항-CD79b 면역접합체는 MMAE, PNU-159682, 그리고 다음 구조를 보유한 PBD 이합체로부터 선택된 세포독성 물질을 포함한다:
Figure pct00063
이때 n은 0 또는 1이다. 일부 구체예들에 있어서, 항-CD79b 면역접합체는 예컨데, US 8,088,378 B2에서 설명된 티오 huMA79bv28 HC A118C-MC-val-cit-PAB-MMAE 면역접합체; 티오 huMA79bv28 HC S400C-MC-val-cit-PAB-MMAE 면역접합체, 티오 huMA79bv28 LC V205C-MC-val-cit-PAB-MMAE 면역접합체, 티오 huMA79bv28 HC A118C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682, 티오 huMA79bv28 HC A118C-MC-아세탈-PNU-159682, 티오 huMA79bv28 HC A118C-MC-val-cit-PAB-PBD, 티오 huMA79bv28 HC S400C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682, 티오 huMA79bv28 HC S400C-MC-아세탈-PNU-159682, 티오 huMA79bv28 HC S400C-MC-val-cit-PAB-PBD, 티오 huMA79bv28 LC V205C-MC-val-cit-PAB-PNU-159682, 티오 huMA79bv28 LC V205C-MC-아세탈-PNU-159682, 그리고 티오 huMA79bv28 LC V205C-MC-val-cit-PAB-PBD로부터 선택된다. 티오 huMA79bv28 HC A118C의 중쇄 및 경쇄 서열은 각각 서열 번호: 40과 41에 나타낸다. 티오 huMA79bv28 HC S400C의 중쇄 및 경쇄 서열은 각각 서열 번호: 43과 41에 나타낸다. 티오 huMA79bv28 LC V205C의 중쇄 및 경쇄 서열은 각각 서열 번호: 42와 44에 나타낸다. 특이적 항체 서열과는 별도로, 항-CD79b 면역접합체의 구조는 본 명세서와 US 2008/0050310에서 설명된 항-CD22 면역접합체의 구조와 유사하다. PNU-159682를 포함하는 비제한적인 예시적인 면역접합체는 다음 구조들을 보유한다:
Ab-MC-아세탈-PNU-159682
Figure pct00064
Ab-MC-val-cit-PAB-PNU-159682
Figure pct00065
일부 구체예들에 있어서, 항-CD22 면역접합체는 항-CD20 항체 (네이키드 항체 또는 ADC)와 복합 투여된다. 일부 구체예들에 있어서, 항-CD20 항체는 리투시맙 (Rituxan®) 또는 2H7 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA)이다. 일부 구체예들에 있어서, 항-CD22 면역접합체는 항-VEGF 항체 (가령 베비시주맙, 상표명 Avastin®)와 복합 투여된다.
다른 치료 섭생이 항-CD22 면역접합체의 투여와 복합될 수 있는데, 방사선 요법 및/또는 골수 및 말초 혈액 이식물, 및/또는 세포독성 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 세포독성 물질은 물질 또는 물질의 조합 이를 테면, 예로써, 사이클로포스파미드, 히드록시다우노루비친, 아드리아마이신, 독소루비신, 빈크리스틴 (Oncovin™), 프레디솔론, CHOP (사이클로포스파미드, 옥소루비신, 빈크리스틴, 그리고 프레디솔론의 조합), CVP (사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 그리고 프레디솔론의 조합), 또는 면역치료법 이를 테면 항-CD20 (예컨데, 리투시맙, 상표명 Rituxan®), 항-VEGF (예컨데, 베비시주맙, 상표명 Avastin®), 탁산 (이를 테면 파클리탁셀 그리고 도세탁셀) 그리고 안트라사이클린 항생제다.
상기에서 명시된 이러한 복합 요법은 복합 투여(여기에서 2개 또는 그 이상 치료 물질이 동일한 또는 별도 제제 안에 포함됨), 그리고 별도 투여가 포함된되며, 이 경우 본 발명의 상기 항체 또는 면역접합체의 투여는 추가 치료물질 및/또는 어쥬번트의 투여 전, 동시 또는 투여 이후가 될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 방사선 요법과 복합되어 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체(그리고 임의의 추가 치료 물질)는 장관외, 폐내, 그리고 비강내 및 국소 투여가 바람직한 경우, 병소내 투여가 포함된 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 장관외 주입은 근육, 정맥, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 복용은 투여가 잠시 또는 오래 지속되는지에 일부 의존적으로, 이를 테면 정맥 또는 파하 주사와 같은 주사에 의한 임의 경로에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 투약 일정은 1회 투여 또는 다양한 시간-시점에 걸쳐 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 펄스 주입이 본 명세서에서 고려된다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 우수한 의학적 관행에 일치되는 방식으로 제형화되고, 투약 및 투여될 수 있다. 본 발명의 내용에서 고려되는 인자들은 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유류, 개체 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 물질 운반 부위, 투여 방법, 투여 일정, 그리고 의료진에게 알려진 다른 인자들을 포함한다.
상기 항체 또는 면역접합체는 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 있이서 현재 이용되는 하나 또는 그 이상의 물질과 함께 제형화될 필요는 없지만, 임의선택적으로 조제될 수 있다. 이러한 다른 물질의 유효량은 제제에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, 장애 또는 치료 유형, 그리고 상기에서 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 동일한 투약형내에 그리고 본 명세서에서 설명된 투여 경로를 이용하여, 또는 본 명세서에서 설명된 투약량의 약 1 내지 99%, 또는 임상적으로 적절하다고 판단되는 임의의 투약량과 경로에 의해 투여될 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 적절한 투약량(단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 추가 치료 물질과 복합되어 이용될 때)은 치료될 질환의 유형, 항체 또는 면역접합체의 유형, 상기 항체 또는 면역접합체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 기존 요법, 환자의 병력 및 상기 항체 또는 면역접합체에 대한 반응, 그리고 주치의의 판단에 따라 달라진다. 상기 항체 또는 면역접합체는 1회 또는 일련의 치료 과정에 걸쳐 적절하게 환자에게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예컨데 0.1mg/kg - 10mg/kg)의 항체 또는 면역접합체가 1회 또는 그 이상의 별도 투여,또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여를 위한 최초 후보 투약량이 될 수 있다. 전형적으로 1일 1회 투약량은 상기에서 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상이 될 수 있다. 수일 또는 그 이상 동안 반복 투여를 위하여, 상태에 따라, 치료는 질환 증상의 바람작한 억제가 일어날 때까지 일반적으로 지속될 것이다. 상기 항체 또는 면역접합체의 한 가지 예시적인 투약량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위가 될 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합)의 1회 또는 그 이상의 투약분량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투약분량은 간헐적으로 예컨데 매주 또는 3주마다 한번씩(예컨대 환자는 항체의 약 2 내지 약 20의 투여 분량, 또는 예컨대 약 6회의 투여분량을 제공받는다) 투여될 수 있다. 처음 높은 로딩 투여 분량, 이어서 1회 또는 그 이상의 더 낮은 투여분량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 섭생들이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석을 통하여 용이하게 관찰된다.
일부 구체예들에 있어서, 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 이합체가 포함된 저투여용량의 10F4v3 ADC는 MMAE 모이어티가 포함된 고투여용량의 10F4v3 ADC와 동일한 효과를 획득하는데 이용될 수 있다.
상기 임의의 본 발명의 면역접합체와 항-CD22 항체 모두를 이용하여 실행될 수 있다.
H. 제조 물품
본 발명의 또다른 측면에서, 상기에서 설명된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들이 함유된 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 라벨 또는 용기 상에 또는 용기에 연합된 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기는 예로써, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 이를 테면 유리 또는 플라스틱으로부터 만들어진다. 용기는 자체에 조성물을 보유하거나 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또다른 조성물과 복합될 수 있고, 그리고 살균 접근 포트 (예로써 용기는 정맥 용액 주머니일 수 있거나 또는 피하 주사 바늘에 의해 찌를 수 있는 마개를 가진 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다. 조성물내 최소한 한 가지 활성 물질은 본 발명의 항체 또는 면역접합체다. 라벨 또는 포장 삽입물에는 이 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 이용된다라고 명시된다. 더욱이, 제조 물품은 (a) 여기에 포함된 조성물을 가진 제 1 용기; 그리고 (b) 추가 세포독성 또는 다른 치료 물질이 포함된 조성물을 가진 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에서 제조 물품은 이 조성물이 특정 상태를 치료하는데 이용될 수 있음을 표시한 포장 삽입물을 더 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로-수용가능한 완충액, 이를 테면 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, Ringer 용액 또는 덱스트로즈 용액이 포함된 제 2 (또는 제 3) 용기를 더 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는 상업적 그리고 사용자 입장에서 바람직한 다른 재료들이 더 포함될 수 있다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예다. 상기에서 제공된 전반적인 설명이 제공된다면 다양한 다른 구체예들이 실시될 수 있음을 이해해야 한다.
A. 항-CD22 항체 약물 접합체의 생산
인간화 변이체 hu10F4v1 및 hu10F4v3을 포함하는 항-CD22 항체 10F4 및 특정 변이체들은 예컨데, US 2008/0050310에서 설명된다. 항체 10F4, hu10F4v1, 그리고hu10F4v3은 서열 번호: 9, 10, 및 11 (각각 차례로 HVR H1, HVR H2, 및 HVR H3)의 중쇄 HVRs를 포함한다. 항체 10F4 및 hu10F4v1는 서열 번호: 12, 13, 그리고 14 (각각 차례로 HVR L1, HVF L2, 및 HVR L3)의 경쇄 HVRs를 포함한다. Hu10F4v3은 서열 번호: 15, 13, 그리고 14 (각각 차례로 HVR L1, HVF L2, 및 HVR L3)의 경쇄 HVRs를 포함하며, 이때 hu10F4v3의 HVR-L1은 10F4 그리고 10F4v1의 HVR L1과 비교하였을 때 단일 아미노산 변화(N28V)를 포함한다. 인간 CD22에 대한 3개 항체의 결합 친화력은 유사한 것으로 밝혀졌다(1.4 nM 내지 2.3 nM의 범위). hu10F4v1의 HVR L1에서 특정 추가 아미노산 치환이 있었고, 서열 번호: 16 내지 22에 나타낸다. 이들 각 HVR L1 서열이 포함된 항체는 인간 CD22에 대한 결합 친화력을 보유하는데, 이 친화력은 hu10F4v1의 결합 친화력보다 2-배 미만으로 변화된다. 예컨데, US 2008/0050310 참고.
더 큰 규모의 항체 생산을 위하여, 항체는 CHO 세포에서 만들어졌다. VL 및 VH를 코딩하는 벡터는 CHO 세포 안으로 형질감염되었으며, IgG는 단백질 A 친화력 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 정제되었다.
항-CD22 항체-약물 접합체 (ADCs)는 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C 항체를 특정 약물 모이어티 접합시켜 만들었다. 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C는 접합가능한 티올 기를 추가하는 중쇄의 A118C 돌연변이를 가진 인간화된 항-CD22 10F4v3 항체다. 예컨데, US 2008/0050310 참고. 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C의 중쇄 아미노산 서열은 서열 번호: 26 (도 3 참고)에 나타내며, 그리고 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C의 경쇄 아미노산 서열은 서열 번호: 23 (도 2 참고)에 나타낸다. 면역접합체는 다음과 같이 준비되었다.
티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-val-cit-PAB-PBD ("10F4v3-PBD")
접합에 앞서, 상기 항체는 디티오트레톨 (DTT)로 환원되어 티오-항체의 조작된 시스테인으로부터 차단 기(예컨대 시스테인)을 제거하였다. 이 과정은 항체의 쇄간(interchain) 디설피드 결합을 또한 환원시킨다. 환원된 항체는 방출된 차단기를 제거하기 위하여 정제되었고, 쇄간 디설피드는 데히드로-아스크로브산 (dhAA)을 이용하여 재산화되었다. 그 다음 고유한 항체는 약물-링커 모이어티 MC-val-cit-PAB-PBD ("val-cit"는 본 명세서에서 "vc"로 불릴 수 있다)와 복합되어 항체의 조작된 시스테인 잔기에 약물-링커 모이어티의 접합이 허용되었다. 접합 반응은 임의의 자유 링커-약물 모이어티와 반응되도록 과량의 N-아세틸-시스테인이 첨가됨으로써 진정되었고, 그리고 ADC는 정제되었다. ADC의 약물 로드 (항체당 평균 약물 모이어티의 수)는 하기 실시예에서 나타낸 것과 같이, 약 1.7 내지 약 1.9개 범위였다. 10F4v3-PBD는 도 4a (p = 약물 로드)에 나타낸 구조를 보유한다.
티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-val-cit-PAB-MMAE ("10F4v3-MMAE")
접합에 앞서, 상기 항체는 디티오트레톨 (DTT)로 환원되어 티오-항체의 조작된 시스테인으로부터 차단 기(예컨대 시스테인)을 제거하였다. 이 과정은 항체의 쇄간(interchain) 디설피드 결합을 또한 환원시킨다. 환원된 항체는 방출된 차단기를 제거하기 위하여 정제되었고, 쇄간 디설피드는 데히드로-아스크로브산 (dhAA)을 이용하여 재산화되었다. 그 다음 고유한 항체는 약물-링커 모이어티 MC-val-cit-PAB-MMAE ("val-cit"는 본 명세서에서 "vc"로 불릴 수 있다)와 복합되어 항체의 조작된 시스테인 잔기에 약물-링커 모이어티의 접합이 허용되었다. 접합 반응은 임의의 자유 링커-약물 모이어티와 반응되도록 과량의 N-아세틸-시스테인이 첨가됨으로써 진정되었고, 그리고 ADC는 정제되었다. ADC의 약물 로드 (항체당 평균 약물 모이어티의 수)는 하기 실시예에서 나타낸 것과 같이, 약 2로 측정되었다. 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-val-cit-PAB-MMAE는 예컨데, US 2008/0050310에서 설명된다.
티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-디설피드-PBD ("10F4v3-SS-PBD")와 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-디설피드 메틸-PBD ("10F4v3-SSMe-PBD")
접합에 앞서, 상기 항체는 디티오트레톨 (DTT)로 환원되어 티오-항체의 조작된 시스테인으로부터 차단 기(예컨대 시스테인)을 제거하였다. 이 과정은 항체의 쇄간(interchain) 디설피드 결합을 또한 환원시킨다. 환원된 항체는 방출된 차단기를 제거하기 위하여 정제되었고, 쇄간 디설피드는 데히드로-아스크로브산 (dhAA)을 이용하여 재산화되었다.
그 다음 고유한 항체는 50 mM Tris, pH 8에서 16 내지 24 시간 동안 6-8배 몰 과량의 약물-링커 모이어티 (실시예 H 또는 I에서 차례로 14 또는 22)과 복합되었다. 그 다음 ADC는 양이온 교환 컬럼에 의해 정제되었다. ADC의 약물 로드 (항체당 평균 약물 모이어티 수)는 하기 실시예에서 나타낸 것과 같이 약 1.7 내지 약 1.9 범위다. 10F4v3-SS-PBD는 도 4b (p = 약물 로드)에 나타낸 구조를 가진다. 10F4v3-SSMe-PBD는 도 4c (p = 약물 로드)에 나타낸 구조를 가진다.
B. WSU-DLCL2 이종이식편 모델에서 인간화된 항-CD22 항체 약물 접합체의 생체내 항-종양 활성
PBD와 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C 접합체 효과를 테스트하기 위하여 WSU-DLCL2 종양 (미만성 거대 B-세포 임파종 세포 계통)의 마우스 이종이식편 모델에서 접합된 항체의 효과가 검사되었다.
암컷 CB17 ICR SCID 마우스 (12-13 주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)에게 2 x 107 WSU-DLCL2 세포 (DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)로 측면 피하로 각각 접종되었다. 이종이식편 종양이 150-300 mm3의 평균 종양 크기에 도달될 때(0 일 시점으로 칭함), 처음의 그리고 유일한 치료 투여 분량이 투여되었다. 종양 체적은 칼리퍼를 이용하여 측정된 2차원에 근거하여 산출되었으며, 다음의 식에 따라 mm3로 표현된다: V= 0.5a x b2, 이때 a 및 b는 종양의 각각 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다. 시간을 두고 동일한 동물에서 종양 체적의 반복 측정을 분석하기 위하여, 혼합형 모델링 방식이 이용되었다(예컨데, Pinheiro J, et al. nlme: linear and nonlinear mixed effects models. 2009; R 패키지, 버젼 3.1-96 참고). 이 방식은 반복된 측정과 연구 종료 전에 동물에서 치료와 무관한 제거로 인한 보통의 탈락비율(modest dropout rates)을 모두 해결할 수 있다. 입방 회귀 키(cubic regression splines)를 이용하여 각 투여 분량 수준에서 log2 종양 용적의 시간 과정에 대해 비-선형 프로파일을 피팅하였다. 그 다음 이들 비-선형 프로파일은 혼합 모델 안에서 투여 분량과 관련있었다.
9마리의 마우스 집단은 단일 정맥(i.v.) 투여 분량인 0.5 또는 2 또는 8 mg ADC/kg의 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C 면역접합체 또는 대조 항체-약물 접합체 (대조 ADCs)로 처리되었다. 대조 ADCs는 WSU-DLCL2 세포의 표면 상에서 발현되지 않는 단백질에 결합된다. 마우스의 종양 및 체중은 실험 동안 주당 1-2회 측정되었다. 마우스는 3000 mm3에 도달되기 전 또는 종양이 임박한 궤양 신호를 보일 때 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 승인되었다.
실험 결과는 표 2 및 도 5에 나타낸다. 표 2는 각 치료 집단, 연구 종료시 관측가능한 종양을 가진 마우스의 수("TI"), 부분 반응을 보이는 마우스의 수("PR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적은 0일 시점에서 측정된 종양 체적의 50% 미만으로 떨어짐), 완전한 반응을 보이는 마우스의 수("CR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적이 0 mm3으로 떨어짐), 각 집단에 대한 약물 투여 분량, 그리고 투여된 각 ADC에 대한 약물 로드를 나타낸다.
Figure pct00066
표 2에서 나타낸 약물 접합체와 투여 분량으로 35 일 일정에서, 프로테아제 절단가능한 링커를 통하여 PBD에 접합된 10F4v3 ADCs ("10F4v3-PBD")는 운반체와 대조 ADC ("대조-PBD")과 비교하였을 때, WSU-DLCL2 종양을 가진 SCID 마우스에서 종양 성장이 저해되었음을 나타낸다. 도 5 참고.
더욱이, 2 mg/kg의 10F4v3-PBD는 아우리스태틴 약물 MMAE에 접합된 8 mg/kg의 인간화된 항-CD22 티오mab ("10F4v3-MMAE")와 필적가능한 항-종양 활성을 나타내었다. 도 5 참고. 표 2에서 나타낸 것과 같이, 2 mg/kg 10F4v3-PBD를 제공받은 마우스는 9가지 완전한 반응을 보였고, 반면 8 mg/kg 10F4v3-MMAE를 제공받은 마우스는 6가지 부분적인 반응과 3가지 완전한 반응을 보였다.
이 연구에서, 각 투약형 집단에서 체중 변화 비율을 측정하였다. 그 결과는 10F4v3 ADCs의 투여는 연구 동안 체중의 상당한 증가를 야기하지 않았음을 나타내었다.
C. Granta-519 이종이식편 모델에서 인간화된 항-CD22 항체 약물 접합체의 생체내 항-종양 활성
PBD와 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C 접합체("10F4v3-PBD") 효과를 테스트하기 위하여 Granta-519 종양 (인간 맨틀 세포 임파종 세포 계통)의 마우스 이종이식편 모델에서 접합된 항체의 효과가 검사되었다.
암컷 CB17 ICR SCID 마우스 (10-11 주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)에게 2 x 107 Granta-519 세포(DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)로 측면 피하로 각각 접종되었다. 이종이식편 종양이 150-300 mm3의 평균 종양 크기에 도달될 때(0 일 시점으로 칭함), 처음의 그리고 유일한 치료 투여 분량이 투여되었다. 종양 체적은 칼리퍼를 이용하여 측정된 2차원에 근거하여 산출되었으며, 다음의 식에 따라 mm3로 표현된다: V= 0.5a x b2, 이때 a 및 b는 종양의 각각 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다. 시간을 두고 동일한 동물에서 종양 체적의 반복 측정을 분석하기 위하여, 혼합형 모델링 방식이 이용되었다(예컨데, Pinheiro et al. 2009 참고). 이 방식은 반복된 측정과 연구 종료 전에 동물에서 치료와 무관한 제거로 인한 보통의 탈락비율을 모두 해결할 수 있다. 입방 회귀 키를 이용하여 각 투여 분량 수준에서 log2 종양 용적의 시간 과정에 대해 비-선형 프로파일을 피팅하였다. 그 다음 이들 비-선형 프로파일은 혼합 모델 안에서 투여 분량과 관련있었다.
9마리의 마우스 집단은 단일 정맥(i.v.) 투여 분량인 1 mg ADC/kg의 10F4v3 면역접합체 또는 대조 항체-약물 접합체 (대조 ADCs)로 처리되었다. 대조 ADCs는 Grant-519 세포의 표면 상에서 발현되지 않는 단백질에 결합된다. 마우스의 종양 및 체중은 실험 동안 주당 1-2회 측정되었다. 마우스는 3000 mm3에 도달되기 전 또는 종양이 임박한 궤양 신호를 보일 때 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 승인되었다.
실험 결과는 표 3 및 도 6에 나타낸다. 표 3은 각 치료 집단, 연구 종료시 관측가능한 종양을 가진 마우스의 수("TI"), 부분 반응을 보이는 마우스의 수("PR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적은 0일 시점에서 측정된 종양 체적의 50% 미만으로 떨어짐), 완전한 반응을 보이는 마우스의 수("CR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적이 0 mm3으로 떨어짐), 각 집단에 대한 약물 투여 분량, 그리고 투여된 각 ADC에 대한 약물 로드를 나타낸다.
Figure pct00067
표 3에서 나타낸 약물 접합체와 1 mg ADC/kg의 투여 분량으로 29 일 일정에서, 프로테아제 절단가능한 링커를 통하여 PBD에 접합된 티오 Hu 항-CD22 ADC("10F4v3-PBD")는 운반체와 비교하였을 때, Granta-519 종양을 가진 SCID 마우스에서 종양 성장이 저해되었음을 나타낸다. 그러나, PBD에 접합된 대조 ADC("대조-PBD") 또한 항-종양 활성을 보여주었고, 이는 이 종양 모델이 PBD에 매우 민감함을 나타낸다. 끝으로, 1 mg/kg으로 제공될 때, 10F4v3-PBD는 아우리스태틴 약물 MMAE ("10F4v3-MMAE")에 접합된 인간화된 항-CD22 티오mab보다 종양 성장을 더 억제하였다.
10F4v3-PBD를 제공받은 마우스는 종양 퇴행을 모두 나타내었지만, 10F4v3-MMAE로 처리된 대부분의 마우스는 그렇지 않았다. 단일 투여 분량의 10F4v3-PBD는 한 가지 부분적 반응과 8가지 완전한 반응을 결과하였다.
본 연구에서 각 투약량 집단에서 체중 변화 비율이 측정되었다. 결과에 따르면, 10F4v3 ADCs의 투여는 연구 동안 체중의 심각한 증가를 야기하지 않았다.
D. SuDHL4-luc 이종이식편 모델에서 인간화된 항-CD22 항체 약물 접합체의 생체내 항-종양 활성
PBD와 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C 접합체("10F4v3-PBD") 효과를 테스트하기 위하여 SuDHL4-luc 종양 (미만성 거대 B-세포 임파종 세포 계통)의 마우스 이종이식편 모델에서 접합된 항체의 효과가 검사되었다.
암컷 CB17 ICR SCID 마우스 (11-12 주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)에게 2 x 107 SuDHL4-luc 세포(DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany, 그리고 루시퍼라제 유전자를 안정적으로 발현하도록 Genentech에서 조작됨)로 측면 피하로 각각 접종되었다. 이종이식편 종양이 150-300 mm3의 평균 종양 크기에 도달될 때(0 일 시점으로 칭함), 처음의 그리고 유일한 치료 투여 분량이 투여되었다. 종양 체적은 칼리퍼를 이용하여 측정된 2차원에 근거하여 산출되었으며, 다음의 식에 따라 mm3로 표현된다: V= 0.5a x b2, 이때 a 및 b는 종양의 각각 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다. 시간을 두고 동일한 동물에서 종양 체적의 반복 측정을 분석하기 위하여, 혼합형 모델링 방식이 이용되었다(예컨데, Pinheiro et al. 2008 참고). 이 방식은 반복된 측정과 연구 종료 전에 동물에서 치료와 무관한 제거로 인한 보통의 탈락비율을 모두 해결할 수 있다. 입방 회귀 키를 이용하여 각 투여 분량 수준에서 log2 종양 용적의 시간 과정에 대해 비-선형 프로파일을 피팅하였다. 그 다음 이들 비-선형 프로파일은 혼합 모델 안에서 투여 분량과 관련있었다.
8마리의 마우스 집단은 단일 정맥(i.v.) 투여 분량인 2 또는 8 mg ADC/kg의 10F4v3 면역접합체 또는 대조 항체-약물 접합체 (대조 ADCs)로 처리되었다. 대조 ADCs는 SuDHL4-luc 세포의 표면 상에서 발현되지 않는 단백질에 결합된다. 마우스의 종양 및 체중은 실험 동안 주당 1-2회 측정되었다. 마우스는 3000 mm3에 도달되기 전 또는 종양이 임박한 궤양 신호를 보일 때 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 승인되었다.
실험 결과는 표 4 및 도 7에 나타낸다. 표 4는 각 치료 집단, 연구 종료시 관측가능한 종양을 가진 마우스의 수("TI"), 부분 반응을 보이는 마우스의 수("PR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적은 0일 시점에서 측정된 종양 체적의 50% 미만으로 떨어짐), 완전한 반응을 보이는 마우스의 수("CR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적이 0 mm3으로 떨어짐), 각 집단에 대한 약물 투여 분량, 그리고 투여된 각 ADC에 대한 약물 로드를 나타낸다.
Figure pct00068
표 4에서 나타낸 약물 접합체와 투여 분량으로 35 일 일정에서, 프로테아제 절단가능한 링커를 통하여 PBD에 접합된 티오 Hu 항-CD22 ADC("10F4v3-PBD")는 운반체와 대조 ADC("대조-PBD")과 비교하였을 때, SuDHL4-luc 종양을 가진 SCID 마우스에서 종양 성장이 저해되었음을 나타낸다. 도 7 참고.
더욱이, 2 mg/kg의 10F4v3-PBD는 아우리스태틴 약물 MMAE에 접합된 8 mg/kg의 인간화된 항-CD22 티오mab ("10F4v3-MMAE")와 필적가능한 항-종양 활성을 나타내었다; 처리된 모든 동물에서 완전한 반응을 보였다. 도 7 및 표 4 참고.
이 연구에서, 각 투약형 집단에서 체중 변화 비율을 측정하였다. 그 결과는 10F4v3 ADCs의 투여는 연구 동안 체중의 상당한 증가를 야기하지 않았음을 나타내었다.
E. SuDHL4-luc 이종이식편 모델에서 10F4v3-PBD의 투여 분량 단계적 증가 연구
SuDHL4-luc 종양 (미만성 거대 B-세포 임파종 세포 계통)의 마우스 이종이식편 모델에서 다양한 투여 분량 수준에서 10F4v3-PBD의 효과가 검사되었다.
암컷 CB17 ICR SCID 마우스 (9-10 주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)에게 2 x 107 SuDHL4-luc 세포(DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany, 그리고 루시퍼라제 유전자를 안정적으로 발현하도록 Genentech에서 조작됨)로 측면 피하로 각각 접종되었다. 이종이식편 종양이 150-300 mm3의 평균 종양 크기에 도달될 때(0 일 시점으로 칭함), 처음의 그리고 유일한 치료 투여 분량이 투여되었다. 종양 체적은 칼리퍼를 이용하여 측정된 2차원에 근거하여 산출되었으며, 다음의 식에 따라 mm3로 표현된다: V= 0.5a x b2, 이때 a 및 b는 종양의 각각 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다. 시간을 두고 동일한 동물에서 종양 체적의 반복 측정을 분석하기 위하여, 혼합형 모델링 방식이 이용되었다(예컨데, Pinheiro et al. 2008 참고). 이 방식은 반복된 측정과 연구 종료 전에 동물에서 치료와 무관한 제거로 인한 보통의 탈락비율을 모두 해결할 수 있다. 입방 회귀 키를 이용하여 각 투여 분량 수준에서 log2 종양 용적의 시간 과정에 대해 비-선형 프로파일을 피팅하였다. 그 다음 이들 비-선형 프로파일은 혼합 모델 안에서 투여 분량과 관련있었다.
8마리의 마우스 집단은 단일 정맥(i.v.) 투여 분량인 0.2, 0.5, 1, 또는 2 mg ADC/kg의 10F4v3-PBD 또는 SuDHL4-luc 세포의 표면 상에서 발현되지 않는 단백질에 결합되는 대조-PBD로 처리되었다. 마우스의 종양 및 체중은 실험 동안 주당 1-2회 측정되었다. 마우스는 3000 mm3에 도달되기 전 또는 종양이 임박한 궤양 신호를 보일 때 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 승인되었다.
실험 결과는 표 5 및 도 8에 나타낸다. 표 5는 각 치료 집단, 연구 종료시 관측가능한 종양을 가진 마우스의 수("TI"), 부분 반응을 보이는 마우스의 수("PR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적은 0일 시점에서 측정된 종양 체적의 50% 미만으로 떨어짐), 완전한 반응을 보이는 마우스의 수("CR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적이 0 mm3으로 떨어짐), 각 집단에 대한 약물 투여 분량, 그리고 투여된 각 ADC에 대한 약물 로드를 나타낸다.
Figure pct00069
표 5에서 나타낸 약물 접합체와 투여 분량으로 31일 일정에서, 10F4v3-PBD는 SuDHL4-luc 종양을 가진 SCID 마우스에서 투여 분량 의존적으로 종양 성장을 저해하였다. 0.5 mg/kg 또는 더 높은 약량에서 투여될 때, 10F4v3-PBD는 운반체 또는 대조 ADC와 비교하여 명백한 저해 활성을 나타내었다. 도 8 참고. 또한, 단일 투여 분량의 2 mg/kg 10F4v3-PBD는 모든 처리된 동물에서 완벽한 종양 감소를 초래하였다.
이 연구에서, 각 투약형 집단에서 체중 변화 비율을 측정하였다. 그 결과는 10F4v3-PBD의 투여는 연구 동안 체중의 상당한 증가를 야기하지 않았음을 나타내었다.
F. Bjab-luc 이종이식편 모델에서 10F4v3-PBD의 투여 분량 단계적 증가 연구
Bjab-luc 종양 (버킷 임파종 세포 계통)의 마우스 이종이식편 모델에서 다양한 투여 분량 수준에서 10F4v3-PBD의 효과가 검사되었다.
암컷 CB17 ICR SCID 마우스 (11-12 주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)에게 2 x 107 Bjab-luc 세포 (예컨데, Lonza, Basel, Switzerland로부터 이용가능하며, 그리고 루시퍼라제 유전자를 안정적으로 발현하도록 Genentech에서 조작됨)로 측면 피하로 각각 접종되었다. 이종이식편 종양이 150-300 mm3의 평균 종양 크기에 도달될 때(0 일 시점으로 칭함), 처음의 그리고 유일한 치료 투여 분량이 투여되었다. 종양 체적은 칼리퍼를 이용하여 측정된 2차원에 근거하여 산출되었으며, 다음의 식에 따라 mm3로 표현된다: V= 0.5a x b2, 이때 a 및 b는 종양의 각각 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다. 시간을 두고 동일한 동물에서 종양 체적의 반복 측정을 분석하기 위하여, 혼합형 모델링 방식이 이용되었다(예컨데, Pinheiro et al. 2008 참고). 이 방식은 반복된 측정과 연구 종료 전에 동물에서 치료와 무관한 제거로 인한 보통의 탈락비율을 모두 해결할 수 있다. 입방 회귀 키를 이용하여 각 투여 분량 수준에서 log2 종양 용적의 시간 과정에 대해 비-선형 프로파일을 피팅하였다. 그 다음 이들 비-선형 프로파일은 혼합 모델 안에서 투여 분량과 관련있었다.
9마리의 마우스 집단은 단일 정맥(i.v.) 투여 분량인 0.05, 0.2, 0.5, 또는 1mg ADC/kg의 10F4v3-PBD 또는 Bjab-luc 세포의 표면 상에서 발현되지 않는 단백질에 결합되는 대조-PBD로 처리되었다. 마우스의 종양 및 체중은 실험 동안 주당 1-2회 측정되었다. 마우스는 3000 mm3에 도달되기 전 또는 종양이 임박한 궤양 신호를 보일 때 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 승인되었다.
실험 결과는 표 6 및 도 9에 나타낸다. 표 6은 각 치료 집단, 연구 종료시 관측가능한 종양을 가진 마우스의 수("TI"), 부분 반응을 보이는 마우스의 수("PR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적은 0일 시점에서 측정된 종양 체적의 50% 미만으로 떨어짐), 완전한 반응을 보이는 마우스의 수("CR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적이 0 mm3으로 떨어짐), 각 집단에 대한 약물 투여 분량, 그리고 투여된 각 ADC에 대한 약물 로드를 나타낸다.
Figure pct00070
표 6에서 나타낸 약물 접합체와 투여 분량으로 35 일 일정에서, 10F4v3-PBD는 Bjab-luc 종양을 가진 SCID 마우스에서 투여 분량 의존적으로 종양 성장을 저해하였다. 0.2 mg/kg 또는 더 높은 약량에서 투여될 때, 10F4v3-PBD는 운반체 또는 대조 ADC와 비교하여 명백한 저해 활성을 나타내었다. 도 9 참고. 또한, 단일 투여 분량의 0.5 또는 1 mg/kg 10F4v3-PBD는 모든 처리된 동물에서 완벽한 종양 감소를 초래하였다. 1 mg/kg에서 대조-PBD 또한 실질적인 항-종양 활성을 나타나고, 이는 이 모델이 PBD에 매우 민감하다는 것을 나타낸다.
이 연구에서, 각 투약형 집단에서 체중 변화 비율을 측정하였다. 그 결과는 10F4v3-PBD의 투여는 연구 동안 체중의 상당한 증가를 야기하지 않았음을 나타내었다.
G. WSU-DLCL2 이종이식편 모델에서 생체내 항-종양 활성 of 인간화된 항-CD22 항체 약물 접합체의 생체내 항-종양 활성
PBD와 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C 접합체 효과를 테스트하기 위하여 WSU-DLCL2 종양 (미만성 거대 B-세포 임파종 세포 계통)의 마우스 이종이식편 모델에서 접합된 항체의 효과가 검사되었다.
암컷 CB17 ICR SCID 마우스 (9-10 주령, Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)에게 2 x 107 WSU-DLCL2 세포(DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)로 측면 피하로 각각 접종되었다. 이종이식편 종양이 150-300 mm3의 평균 종양 크기에 도달될 때(0 일 시점으로 칭함), 처음의 그리고 유일한 치료 투여 분량이 투여되었다. 종양 체적은 칼리퍼를 이용하여 측정된 2차원에 근거하여 산출되었으며, 다음의 식에 따라 mm3로 표현된다: V= 0.5a x b2, 이때 a 및 b는 종양의 각각 긴 직경과 짧은 직경을 나타낸다. 시간을 두고 동일한 동물에서 종양 체적의 반복 측정을 분석하기 위하여, 혼합형 모델링 방식이 이용되었다(예컨데, Pinheiro J, et al. nlme: linear and nonlinear mixed effects models. 2009; R 패키지, 버젼 3.1-96). 이 방식은 반복된 측정과 연구 종료 전에 동물에서 치료와 무관한 제거로 인한 보통의 탈락비율을 모두 해결할 수 있다. 입방 회귀 키를 이용하여 각 투여 분량 수준에서 log2 종양 용적의 시간 과정에 대해 비-선형 프로파일을 피팅하였다. 그 다음 이들 비-선형 프로파일은 혼합 모델 안에서 투여 분량과 관련있었다.
9마리의 마우스 집단은 단일 정맥(i.v.) 투여 분량인 0.5, 또는 2 또는 10mg ADC/kg의 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C 면역접합체 또는 대조 항체-약물 접합체 (대조 ADCs)로 처리되었다. 대조 ADCs는 WSU-DLCL2 세포의 표면 상에서 발현되지 않는 단백질에 결합된다. 마우스의 종양 및 체중은 실험 동안 주당 1-2회 측정되었다. 마우스는 3000 mm3에 도달되기 전 또는 종양이 임박한 궤양 신호를 보일 때 안락사시켰다. 모든 동물 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 승인되었다.
실험 결과는 표 7 및 도 10에 나타낸다. 표 2는 각 치료 집단, 연구 종료시 관측가능한 종양을 가진 마우스의 수("TI"), 부분 반응을 보이는 마우스의 수("PR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적은 0일 시점에서 측정된 종양 체적의 50% 미만으로 떨어짐), 완전한 반응을 보이는 마우스의 수("CR"; 여기에서 투여 후 임의의 시간에서 종양 체적이 0 mm3으로 떨어짐), 각 집단에 대한 약물 투여 분량, 그리고 투여된 각 ADC에 대한 약물 로드를 나타낸다.
Figure pct00071
표 7에서 나타낸 약물 접합체와 투여 분량으로 28 일 일정에서, 10F4v3-PBD 그리고 10F4v3-SSMe-PBD는 운반체와 대조 ADCs와 비교하였을 때, WSU-DLCL2 종양을 가진 SCID 마우스에서 0.5 mg/kg에서 종양 성장이 저해되었음을 나타낸다. 도 7 참고.
더욱이, 2 mg/kg 10F4v3-SSMe-PBD는 거의 완벽한 종양 성장 억제를 보여주었다. 도 7 참고. 표 2에 나타낸 바와 같이, 2 μg/kg 10F4v3-SSMe-PBD를 제공받은 2마리 마우스와 0.5 μg/kg 10F4v3-SSMe-PBD를 제공받은 한 마리 마우스는 이 요법에 부분적인 반응을 보였다.
이 연구에서, 각 투약형 집단에서 체중 변화 비율을 측정하였다. 그 결과는 10F4v3 ADCs의 투여는 연구 동안 체중의 상당한 증가를 야기하지 않았음을 나타내었다.
H. 디설피드 PBD 시약의 합성
(a) ( S )-2-(메톡시카르보닐)-4-메틸렌피롤리디니움 클로라이드 ( 3 )
Figure pct00072
(i) ( S )-1-tert-부틸 2-메틸 4-메틸렌피롤리딘-1,2-디카르복실레이트 ( 2 )
탄산칼륨 (19.92 g, 14 mmol, 3 eq.)은 DMF (270 mL)에서 교반된 카르복실산 (1) (10.92 g, 48 mmol, 1 eq.) 용액에 첨가되었다. 생성된 백색 현탁액은 30분간 실온에서 교반되었고, 이때 요오드메탄 (21.48 g, 9.5 mL, 151 mmol, 3.15 eq.)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 3일간 교반되도록 두었다. 감압 하에서 회전 증발에 의해 DMF가 제거되면 에틸아세테이트와 물 사이에서 분할되는 황색 잔류물이 획득되었다. 유기 층은 분리되었고, 수성 상은 에틸아세테이트로 추출되었다. 복합된 유기 층들은 물, 염수로 세척되었고, 그리고 황산 마그네슘 상에서 건조되었다. 에틸아세테이트는 감압하에서 회전 증발에 제거되면 황색 오일로 된 비정제 산물이 수득되었다. 비정제 산물은 섬광 크로마토그래피 [85% n-헥산/15% 에틸아세테이트]에 의해 정제되어, 무색 오일로 된 산물을 수득하였다. (공지 화합물 F
Figure pct00073
et al., J. Org. Chem. 1992, 57, 2060-2065)
(ii) ( S )-2-(메톡시카르보닐)-4-메틸렌피롤리디니움 클로라이드 ( 3 )
실온에서 디옥산 (63 mL, 254.4 mmol, 4.5 eq.)에서 4M 염화수소산 용액은 Boc 보호된 C-고리 단편 (2) (13.67 g, 56.6 mmol, 1 eq.)에 첨가되었다. 비등이 관찰되는데, 이는 CO2의 유리 및 Boc 기의 제거를 나타낸다. 산물은 백색 고체로 침전되었고, 추가 디옥산이 첨가되어 교반을 용이하게 하였다. 반응 혼합물은 한 시간 동안 교반되도록 두었고, 그 다음 에테르로 희석되었다. 침전된 산물은 진공 여과에 의해 수집되며, 추가 에테르로 세척되었다. 대기 건조에 의해 백색 분말의 바람직한 산물이 수득되었다(9.42 g, 94%) (P Herdwijn et al., Canadian Journal of Chemistry. 1982, 60, 2903-7)
(b) tert-부틸 (5-((5-(5-아미노-4-(( S )-2-(((tert-부틸디메틸실일)옥시)메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-카르보닐)-2-메톡시펜옥시)펜틸)옥시)-2-(( S )-2-(((tert-부틸디메틸실일)옥시)메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-카르보닐)-4-메톡시페닐)카르바메이트 ( 9 )
Figure pct00074
(i) ( S )-(4,4'-(펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(5-메톡시-2-니트로-4,1-페닐렌))비스((( S )-2-(메톡시카르보닐)-4-메틸렌피롤리딘-1-일)메타논) ( 5 )
촉매량의 무수 DMF (0.5 mL)는 실온에서 무수 DCM (180 mL) 안에 옥살일 클로라이드 (9.1 g, 6.25 mL, 71.7 mmol, 3 eq.)와 이합체 코어(4) (11.82 g, 23.9 mmol, 1 eq.)의 교반된 현탁액에 첨가되었다. DMF를 첨가한 후 활발한 비등이 관찰되었고, 반응 혼합물은 염화칼슘 건조 튜브가 고정된 밑둥근 플라스크 안에서 18 시간 동안 교반되도록 두었다. 생성된 맑은 용액은 감압하에서 증발되었으며, 고체는 에테르로 저작되었다(triturate). 고형 산물은 진공 여과에 의해 수거되었으며, 추가 에테르로 세척되었고, 40℃에서 1.5시간 동안 진공에서 건조되었다. 이 고체는 TEA (12.08 g, 119.6 mmol, 5 eq.)안에 C-고리 (3) (9.35 g, 52.6 mmol, 2.2 eq.)와 건조 DCM (110 mL)의 현탁액에 부분적으로 추가되었고, 온도는 드라이아이스/아세토니트릴 조의 도움으로 -40 내지 -50℃ 사이의 온도에서 유지된다. 반응 혼합물은 -40℃에서 교반되도록 허용된 후, 실온으로 데워지도록 두었으며, 이때 LCMS는 출발 물질의 완전한 소비를 나타내었다. 반응 혼합물은 추가 DCM로 희석되었고, 수성 염화수소산 (1M, 2 x 200 mL), 포화 수성 중탄산 나트륨 (2 x 250 mL), 물(250 mL), 염수 (250 mL)로 순차적으로 세척되었고, 건조되었다(MgSO4). DCM은 감압하에서 회전 증발에 의해 제거되어 황색 포말의 산물이 수득되었다(13.94 g, 79 %). 분석 데이터: RT 3.95 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 741 ([M + 1]+., 100).
(ii) ( S )-(4,4'-(펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(5-메톡시-2-니트로-4,1-페닐렌))비스((( S )-2-(히드록시메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-일)메타논) ( 6 )
고형 리튬 수소화붕소(0.093 g, 4.3 mmol, 3 eq.)는 0℃(얼음조)에서 질소 대기하에 건조 THF(10 mL)에서 에스테르 (5) (1.05 g, 142 mmol, 1 eq.)의 용액에 일부분으로 추가되었다. 반응 혼합물은 30분간 0℃에서 교반되도록 하였고, 그 다음 실온으로 데워지도록 두었으며, 이때 오랜지색 점성(gum) 침전물이 관찰되었다. 반응 혼합물은 추가 2시간 동안 실온에서 교반되도록 두었고, 그 다음 얼음조 안에서 냉각되었으며, 물(20 mL)로 처리되어 황색 현탁액이 제공되었다. 염화수소산 (1M)이 비등이 중단될 때까지 신중하게 추가되었다(격렬한 비등!). 반응 혼합물은 에틸아세테이트 (4 x 50 mL)로 추출되었고, 그리고 복합된 유기 층들은 물(100 mL), 염수 (100 mL)로 세척되었고, 건조되었다(MgSO4). 에틸아세테이트는 감압하에서 회전 증발에 의해 제거되고, 황색 포말의 산물이 획득되었다(0.96 g, 99%). 이 반응은 12.4 g 규모에서 반복되어 11.06 g의 산물이 생성되었다(96%). 분석 데이터: RT 3.37 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 685 ([M + H]+., 100).
(iii) ( S )-((펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(5-메톡시-2-니트로-4,1-페닐렌))비스((( S )-2-(((tert-부틸디메틸실일)옥시)메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-일)메타논) ( 7 )
아르곤 대기하에서 무수 DMF (100 mL) 안에 비스-니트로 알코올 (6) (7.94 g, 11.6 mmol, 1 eq), tert-부틸디메틸실일클로라이드 (4.54 g, 30.15 mmol, 2.6 eq) 그리고 이미다졸(4.1 g, 60.3 mmol, 5.2 eq)의 용액은 실온에서 3시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 물(250 mL)로 희석되었고, DCM (4 x 100 mL)으로 추출되었다. 복합된 추출물은 물(200 mL), 포화 염수 (200 mL)로 세척되었고, 건조되었고(MgSO4) 그리고 감압하에서 기화되었다. 잔기는 섬광 컬럼 크로마토그래피 [50% 에틸아세테이트/50% n-헥산 내지 100% 에틸아세테이트- 10%씩 증분]에서 정제되어 황색 포말로된 산물이 획득되었다(10.0 g, 94%). 분석 데이터: RT 4.57 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 913 [M + H]+., 100).
(iv) ( S )-((펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(2-아미노-5-메톡시-4,1-페닐렌))비스((( S )-2-(((tert-부틸디메틸실일)옥시)메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-일)메타논) ( 8 )
포름산 용액 (5% v/v, 15 mL)은 에틸아세테이트/에탄올 (80 mL/150 mL)에서 아연 분말(29.56 g, 0.45 mol, 40 eq.)과 화합물 (7) (10.34 g, 11.32 mmol, 1 eq.)의 혼합물에 한 부분으로 추가되었다. 12℃의 발열이 관찰되었다. 15분 후, 반응 혼합물은 에틸아세테이트 (과량)으로 세척되면서 셀라이트를 통하여 여과되었다. 여과물은 포화 중탄산 나트륨 (3 x 150 mL), 물(200 mL), 포화 염수 (200 mL)로 세척되었고, 건조되었고(MgSO4) 그리고 감압하에서 기화되었다. 섬광 컬럼 크로마토그래피 [에틸아세테이트]에 의해 정제되면 백색 포말로 된 산물이 수득되었다 (8.09 g, 84%). 분석 데이터: RT 4.43 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 853 ([M + H]+., 100).
(v) tert-부틸 (5-((5-(5-아미노-4-(( S )-2-(((tert-부틸디메틸실일)옥시)메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-카르보닐)-2-메톡시펜옥시)펜틸)옥시)-2-(( S )-2-(((tert-부틸디메틸실일)옥시)메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-카르보닐)-4-메톡시페닐)카르바메이트 ( 9 )
무수 THF (50 mL)에서 비스-아닐린 (8) (6.02 g, 7.1 mmol, 1 eq.)과 디-t-부틸-디카르보네이트 (1.54 g, 7.1 mmol, 1 eq.)의 용액은 16시간 동안 재환류에서 가열되었다. 용매는 감압하에서 기화되었고, 잔류물은 섬광 컬럼 크로마토그래피 [40% 에틸아세테이트/60% n-헥산 내지 60% 에틸아세테이트/40% n-헥산 내지 100% 에틸아세테이트]로 정제되어 백색 포말로 된 산물이 제공되었다(3.22 g, 48%). 분석 데이터: RT 4.27 min MS (ES+) m/z (상대적 강도) 953 ([M + H]+., 100), MS (ES-) m/z (상대적 강도) 951 ([M - H])-., 100).
(c) (11 S ,11a S )-2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 11-히드록시-7-메톡시-8-((5-((( S )-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 14 )
Figure pct00075
화합물 10은 Jones et al, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 6526-6527에 따라 준비되었다.
(i) tert-부틸 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸) (( S )-(펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(2-(( S )-2-(((tert-부틸디메틸실일)옥시)메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-카르보닐)-4-메톡시-5,1-페닐렌))디카르바메이트 ( 11 )
트리에틸아민 (0.25 g, 0.34 mL, 2.42 mmol, 2.2 eq.)은 실온에서 아르곤 대기하에 건조 THF (10 mL) 안에서 모노-Boc 보호된 비스-아닐린 (9) (1.05 g, 1.1 mmol, 1.0 eq.)과 트리포스포겐(0.117 g, 0.4 mmol, 0.36 eq.)의 교반된 용액에 추가되었다. 반응 혼합물은 40℃로 가열되었고, 5분 후 시료는 메탄올로 처리되었고, LCMS에 의해 메틸 카르바메이트로 분석되었다. 분석 데이터: RT 4.37 min MS (ES+) m/z (상대적 강도) 1011 ([M + H]+., 100).
건조 THF (10 mL)에서 2-(피리딘-2-일디술파닐)에탄올 (10) (0.31 g, 1.65 mmol, 1.5 eq.)와 트리에틸아민 (0.17 g, 0.23 mL, 1.65 mmol, 1.5 eq.)의 용액은 새로 준비된 이소시아네이트에 점적되었다. 반응 혼합물은 40℃에서 1.5시간 동안 가열되었고, 그 다음 추가 부분의 트리포스포겐 (0.058 g, 0.2 mmol, 0.18 eq.)이 첨가되었다. 추가 30분 후, 반응 혼합물은 냉각되도록 둔 다음, 여과시켜 트리에틸아민 히드로클로라이드를 제거하였고, 여과물은 건조되도록 기화되어 황색 오일로된 미정제 산물이 제공되었고, 이는 섬광 컬럼 크로마토그래피 [60% n-헥산/40% 에틸아세테이트에서 55% n-헥산/45% 에틸아세테이트로 변화]에 의해 정제되어 무색 오일로 된 원하는 산물이 제공되었다(0.63 g, 49%). 분석 데이터: RT 4.50 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 1166 ([M + H]+., 100), MS (ES-) m/z (상대적 강도) 1164 ([M - H])-., 70).
(ii) tert-부틸 (2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸) (( S )-(펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(2-(( S )-2-(히드록시메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-카르보닐)-4-메톡시-5,1-페닐렌))디카르바메이트 ( 12 )
AcOH/H2O (3/1/) (8 mL)은 THF(2 mL)에 화합물 (11) (0.37 g, 0.32 mmol, 1 eq) in THF (2 mL)의 용액에 첨가되었고, 생성된 용액은 18시간 동안 실온에서 교반되었다. 반응 혼합물의 pH는 포화 NaHCO3 용액을 이용하여 pH8로 조정되었다. 혼합물은 에틸아세테이트 (3 x 100 mL)로 추출되었고, 복합된 추출물은 포화 NaHCO3 용액 (100 mL), 물(100 mL), 포화 염수 (100 mL)로 세척되었고, 건조되었고(MgSO4) 그리고 감압하에서 기화되었다. 섬광 컬럼 크로마토그래피 [그라디언트 용리 클로로포름 /메탄올 0% 내지 5%, 1%씩 증분]에 의한 잔류물의 정제로 백색 포말로 된 산물이 제공되었다(0.24 g, 81%). 분석 데이터: RT 3.08 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 938 ([M + H]+., 100), MS (ES-) m/z (상대적 강도) 936 ([M - H])-., 100).
(iii) (11 S ,11a S )-tert-부틸 11-히드록시-8-((5-(((11 S ,11a S )-11-히드록시-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-10-((2-(피리딘-2-일디술파닐)에톡시)카르보닐)-2,3,5,10,11,11a-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 13 )
DCM (5 mL)내 DMSO (79 mg, 72 μL, 1.0 mmol, 4.4 eq) 용액은 -78℃(드라이아이스/아세톤)에서 아르곤 대기하에 DCM (5 mL)내 옥살일 클로라이드 (62 mg, 42 μL, 0.49 mmol, 2.15 eq.)의 용액에 점적되었다. 이 용액은 -78℃에서 15분간 교반되었다. DCM (6 mL)내 화합물 (12) (0.214 g, 0.23 mmol, 1.0 eq.)의 용액이 점적되었고, 혼합물은 -78℃에서 45분간 교반되었다. 트리에틸아민 (0.23 g, 0.32 mL, 2.28 mmol, 10 eq.)이 첨가되었고, 5분 후 반응 혼합물은 실온에 도달되도록 두었다. 반응 혼합물은 포화 NH4Cl 용액 (15 mL)으로 처리되었고, 유기 부분은 분리되었고, 1M 구연산 용액 (3 x 50 mL), 포화 NaHCO3 용액 (100 mL), 물(100mL), 포화 염수 (100 mL)으로 세척되었고, 건조되었고(MgSO4) 그리고 감압하에서 기화되어 옅은 황색 오일이 제공되었다. 섬광 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제로 백색 포말로 된 산물이 제공되었다(68 mg, 32%). 분석 데이터: RT 2.90 min; MS (ES+) m/z(상대적 강도) 933 ([M + H]+., 50), MS (ES-) m/z (상대적 강도) 935 ([M - H])-., 55).
(iv) (11 S ,11a S )-2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 11-히드록시-7-메톡시-8-((5-((( S )-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 14 )
95% 트리플루오로아세트산 (1 mL)의 차가운(얼음조) 용액은 얼음조에서 냉각된 화합물 13에 첨가되었다. 용액은 0℃에서 15분간 교반되었고, 이때 LCMS에 의해 완료된 것으로 나타났다. 이 반응 혼합물은 차가운 포화 NaHCO3 용액의 혼합물에 점적되어 트리플루오로아세트산 용액이 중화되었다. 혼합물은 DCM (4 x 50 mL)으로 추출되었고, 복합된 추출물은 포화 염수 (100 mL)로 세척되었고, 건조되었다(MgSO4) 그리고 감압하에서 기화되어 백색 포말로 된 산물이 제공되었다(26 mg, 96%). 분석 데이터: RT 2.72 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 816 ([M + H]+., 70), MS (ES-) m/z (상대적 강도) 814 ([M - H])-., 40).
1. 디설피드 메틸 PBD 시약의 합성
(a) ( R )-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올 ( 18 )
Figure pct00076
(i) ( R )-메틸 2-(아세틸티오)프로파노에이트 ( 16 )
티오아세트산 (1.99 g, 1.86 mL, 26.1 mmol, 1.1 eq.)은 건조 DMF (40 mL)에 탄산 세슘(7.73 g, 23.72 mmol, 1.0 eq.)의 현탁액에 추가되었다. 30 분 후 (S)-메틸 2-클로로프로파노에이트 (15)가 추가되었고, 혼합물은 실온에서 1시간 동안 교반되도록 두었다. 반응 혼합물은 디에틸 에테르 (150 mL)과 물(150 mL) 사이에서 분할되었다; 물이 분리되었고, 추가 디에틸 에테르 (150 mL) 부분에 의해 세척되었다. 복합된 유기 부분들은 물(6 x 100 mL), 염수 (200 mL)로 세척되었고, 건조되었고(MgSO4) 그리고 감압하에서 기화되었다. 섬광 컬럼 크로마토그래피 [10% 에틸아세테이트/90% n-헥산]에 의한 정제에 의해 무색 오일로 된 산물이 수득되었다(3.01 g, 82%). 분석 데이터: RT 2.25 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 163 ([M + H]+., 10), 185([M + Na]+., 65); [α]t d = [+141]17.8℃ d (c, 2.26 CHCl3).
(ii) ( R )-2-멀캅토프로판-1-올( 17 )
건조 THF (10 mL)에서 티오아세테이트 (16) (0.57 g, 3.54 mmol, 1.0 eq.)의 용액은 아르곤 대기하에 재환류에서 건조 THF(20mL)에서 수산화리튬 알루미늄(0.54 g, 14.15 mmol, 4.0 eq.) 현탁액에 점적되었다. 1시간 후, 반응 혼합물은 0℃도 냉각되었고, 2M HCl은 비등이 중단될 때까지 30℃ 미만으로 온도를 유지시키면서 점적되었다. 생성된 혼합물은 실온에서 1시간 동안 교반되도록 두었고, 그 다음 THF (40 mL)로 세척되면서 셀라이트를 통하여 여과되었다. 용매는 기화되었다; 잔류물은 DCM에 다시 용해되었고, 건조되었다(MgSO4). 감암하에 DCM의 기화와 이어서 잔류물의 컬럼 크로마토그래피[60% n-헥산/40% 에틸아세테이트]에 의해 옅은 황색 오일로 된 산물이 수득되었다(0.193 g, 58%). 분석 데이터: [α]t d = [-22]17.2℃(c, 0.972 CHCl3).
(iii) ( R )-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올 ( 18 )
술푸릴 클로라이드 (DCM내에서 1M, 2.0 mL, 2.0 mmol, 1.1 eq.)는 아르곤 대기하에 0℃에서 건조 DCM(5mL)내에 2-멀캅토피리딘 (0.2 g, 1.81 mmol, 1.0 eq.)의 용액에 점적되었다. 생성된 용액은 실온에서 2시간 교반되었고, DCM은 감압하에서 기화되어 황색 고체가 수득되었다. 고체는 건조 DCM (10 mL)에 현탁되었고, 건조 DCM (5 mL)내 (R)-2-멀캅토프로판-1-올 (17)(0.18 g, 1.95 mmol, 1.08 eq.)의 용액이 점적되었다. 혼합물은 아르곤 대기하에 실온에서 18시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 여과되었고, 여과물은 감압하에서 기화되어 황색 점성물이 수득되었다. 점성 물질은 물에 다시 용해되었고, 용액은 수산화 암모늄 용액으로 염기화되었고, DCM (3 x 50 mL)으로 추출되었고, 그리고 복합된 추출물은 물(100 mL), 염수 (100 mL)로 세척되었고, 건조되었다(MgSO4) 그리고 기화되어 황색 오일이 수득되었다. 섬광 컬럼 크로마토그래피 [80% n-헥산/20% 에틸아세테이트 내지 60 % n-헥산/40% 에틸아세테이트, 5%씩 증분]에 의해 무색 오일로 된 산물이 수득되었다 (0.213 g, 59%). 분석 데이터: RT 2.43 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 202 ([M + H]+., 50); [α]t d = [+273]26.2℃ d (c, 0.28 CHCl3).
(b) (11 S ,11a S )-( R )-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 11-히드록시-7-메톡시-8-((5-((( S )-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 22 )
Figure pct00077
(i) tert-부틸 (( R )-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필) (( S )-(펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(2-(( S )-2-(((tert-부틸디메틸실일)옥시)메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-카르보닐)-4-메톡시-5,1-페닐렌))디카르바메이트 ( 19 )
트리에틸아민 (0.28 g, 0.39 mL, 2.8 mmol, 2.2 eq.)은 아르곤 대기하 실온에서 건조 THF(15mL)내 모노-boc 보호된 비스-아닐린 (9) (1.21 g, 1.27 mmol, 1.0 eq.)와 트리포스포겐 (0.136 g, 0.46 mmol, 0.36 eq.)의 교반된 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 40℃로 가열되었고, 5분 후 시료는 메탄올로 처리되었고, 그리고 LCMS에 의해 메틸 카르바메이트로 분석되었다. 분석 데이터: RT 4.30 min MS (ES+) m/z (상대적 강도) 1011 ([M + H]+., 100).
건조 THF (10 mL)내에 (R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올(18) (0.38 g, 1.91 mmol, 1.5 eq.) 및 트리에틸아민 (0.19 g, 0.27 mL, 1.91 mmol, 1.5 eq.)의 용액은 새로 준비된 이소시아네이트에 점적되었다. 반응 혼합물은 40℃에서 4 시간동안 가열되었고, 실온에서 18시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 여과되어 트리에틸아민 히드로클로라이드가 제거되었고, 여과물은 건조되도록 기화되어 황색 오일의 미정제 산물이 획득되었고, 이는 섬광 컬럼 크로마토그래피 [60% n-헥산/40% 에틸아세테이트 내지 40% n-헥산/60% 에틸아세테이트, 5%씩 증분]에 의해 정제되어 백색 포말로 된 바람직한 산물이 수득되었다(0.75 g, 50%). 분석 데이터: RT 4.50 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 1180 ([M + H]+., 60); [α]t d = [-18]21℃ d (c, 0.28 CHCl3).
(ii) tert-부틸 (( R )-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필) (( S )-(펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(2-(( S )-2-(히드록시메틸)-4-메틸렌피롤리딘-1-카르보닐)-4-메톡시-5,1-페닐렌))디카르바메이트 ( 20 )
아세트산/H2O (3/1, 16 mL)는 THF(4mL)내 비스-실일 에테르 (19) (0.72 g, 0.61 mmol, 1 eq.)의 용액에 추가되었다. 생성된 용액은 실온에서 16 시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물의 pH는 포화 중탄산 나트륨 용액에 의해 pH8로 조정되었다. 혼합물은 에틸아세테이트 (4 x 150 mL)로 추출되었고, 복합된 추출물은 포화 중탄산 나트륨 용액 (2 x 150 mL), 물(150 mL), 염수 (150 mL)로 세척되었고, 건조되었고(MgSO4), 감압하에서 기화되었다. 섬광 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제에 의해 백색 포말로 된 산물이 수득되었다(0.56 g, 96%). 분석 데이터: RT 3.15 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 953 ([M + H]+., 100); [α]t d = [-13.5]26℃ d (c, 0.22 CHCl3).
(iii) (11 S ,11a S )-tert-부틸 11-히드록시-8-((5-(((11S,11a S )-11-히드록시-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-10-((( R )-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로폭시)카르보닐)-2,3,5,10,11,11a-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 21 )
무수 DCM (5 mL)내 DMSO (91 mg, 83 μL, 1.16 mmol, 4.4 eq.)의 용액은 아르곤 대기하에 -40℃에서 무수 DCM (5 mL)내 옥살일 클로라이드 (DCM내 2.0M, 318 μL, 0.635 mmol, 2.4 eq.)의 용액에 점적되었다. 용액은 -40℃에서 15분간 교반되었다. 무수 DCM (10 mL)내 비스-알코올 (20) (0.252 g, 0.26 mmol, 1 eq.)의 용액이 점적되었고, 생성된 혼합물은 -40℃에서 45분간 교반되었다. 이 시간 동안 온도는 -25℃에 도달되도록 두었다. 온도는 -35℃로 낮추고, 트리에틸아민 (0.27 g, 0.36 mL, 2.6 mmol, 10 eq.)이 점적되었다. 5분 후, 온도는 실온에 도달되도록 두었다. 반응 혼합물은 DCM (50 mL)으로 희석되었고, 1M 구연산 용액 (3 x 150 mL), 포화 중탄산 나트륨 용액 (150 mL), 물(200 mL), 염수 (200 mL)로 추출되었고, 건조되었고(MgSO4) 그리고 감압하에서 기화되어 황색 포말이 수득되었다. 섬광 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올 0% 내지 2%, 0.5%씩 증분]에 의한 정제로 백색 포말이 획득되었다 (0.137 g, 53%). 분석 데이터: RT 3.17 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 948 ([M + H]+., 100); [α]t d = [+170]26℃ d (c, 0.25 CHCl3).
(iv) (11S,11a S )-( R )-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 11-히드록시-7-메톡시-8-((5-((( S )-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 ( 22 )
95% 트리플루오로아세트산 (8.5 mL)의 차가운 용액(얼음조)은 얼음조 안에서 냉각된 화합물 (21) (0.221 g, 0.23 mmol, 1 eq.)에 추가되었다. 용액은 0℃에서 25분간 교반되었고, LCMS에 의해 완료되었음이 볼 수 있었다. 반응 혼합물은 차가운 그리고 포화 중탄산 나트륨 용액 (200 mL)의 혼합물에 점적되어, 트리플루오로아세트산 용액이 중화되었다. 혼합물은 DCM (4 x 75 mL)으로 추출되었고, 복합된 추출물은 물(100 mL) 포화 염수 (100 mL)로 세척되었고, 건조되었고(MgSO4) 그리고 감압하에서 기화되어 미정제 산물이 수득되었다. 섬광 컬럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올 0% 내지 3%, 1%씩 증분]에 의한 정제로 백색 포말로 된 산물이 획득되었다 (0.192 g, 99%). 분석 데이터: RT 3.00 min; MS (ES+) m/z (상대적 강도) 830 ([M + H]+., 75); [α]t d = [+444]22℃ d (c, 0.26 CHCl3).
전술한 발명은 명백한 이해를 위한 목적으로 설명 및 실시예에 의해 일부 상세하게 설명되었지만, 본 발명의 범위를 설명 및 실시예들로 제한되어서는 안된다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 과학 문헌은 이들의 전문이 명세서의 참고자료에 편입된다.
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> ANTI-CD22 ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES <130> GENE-32632/WO-1/ORD <150> US 61/669,272 <151> 2012-07-09 <150> US 61/777,113 <151> 2013-03-12 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 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musculus <400> 4 Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met 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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Cys 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 44 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 45 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210> 47 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 51 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

Claims (45)

  1. 세포독성 물질에 공유적으로 부착된 CD22에 결합되는 항체가 포함된 면역접합체에 있어서, 이때 상기 항체는 서열 번호: 28의 아미노산 20 내지 240내에 있는 에피토프에 결합되며, 그리고 이때 상기 세포독성 물질은 피롤로벤조디아제핀인, 면역접합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 항체는 (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3, (ii) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3, 그리고 (iii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2를 포함하는, 면역접합체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 상기 항체는 (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2, 그리고 (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3을 포함하는, 면역접합체.
  4. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 항체는 다음을 포함하는, 면역접합체:
    a) (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1, (v) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2, 그리고 (vi) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3; 또는
    b) (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1, (v) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2, 그리고 (vi) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3.
  5. 청구항 1 내지 3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체는 다음을 포함하는 면역접합체:
    a) (i) 서열 번호: 12 그리고 15 내지 22에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1, (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2, 그리고 (iii) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3; 또는
    b) (i) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1, (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2, 그리고 (iii) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3.
  6. 청구항 1 내지 5중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체는 다음을 포함하는 면역접합체:
    a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열에 최소한 95% 서열 동일성을 보유하는 VH 서열; 또는
    b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열에 최소한 95% 서열 동일성을 보유하는 VL 서열; 또는
    c) (a)에서와 같은 VH 서열과 (b)에서와 같은 VL 서열.
  7. 청구항 6에 있어서, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 보유한 VH 서열을 포함하는, 면역접합체.
  8. 청구항 6에 있어서, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 보유한 VL 서열 또는 서열 번호:8의 아미노산 서열을 보유한 VL 서열을 포함하는, 면역접합체.
  9. 세포독성 물질에 공유적으로 부착된 CD22에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체에 있어서, 이때 상기 항체는 (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 보유하는 VH 서열과 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 보유하는 VL 서열을 포함하고, 이때 상기 세포독성 물질은 피롤로벤조디아제핀인, 면역접합체.
  10. 청구항 1 내지 9중 임의의 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 항체인, 면역접합체.
  11. 청구항 1 내지 10중 임의의 한 항에 있어서, 상기 면역접합체는 식 Ab-(L-D)p을 보유하며, 이때:
    (a) Ab는 항체이며;
    (b) L은 링커이며;
    (c) D는 세포독성 물질이며; 그리고
    (d) p는 1-8의 범위인, 면역접합체
  12. 청구항 11에 있어서, 이때 D는 식 A의 피롤로벤조디아제핀인, 면역접합체:
    Figure pct00083

    이때 파동선은 링커에 공유 부착 부위를 나타내며;
    점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이에 이중 결합의 임의선택적 존재를 나타내며;;
    R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 그리고 COR로부터 독립적으로 선택되며, 그리고 할로 또는 디할로로부터 임의선택적으로 추가 선택되며, 이때 RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
    R6과 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
    R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
    Q는 O, S 그리고 NH로부터 독립적으로 선택되며;
    R11은 H, 또는 R이거나 또는, Q가 O일 때, SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이고;
    R 및 R'는 각각 임의선택적으로 치환된 C1-12 알킬, C3-20 헤테로시클일 그리고 C5-20 아릴 기로부터 독립적으로 선택되며, 그리고 임의선택적으로 기 NRR'와 관련하여, R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원(membered) 헤테로사이클 고리를 형성하고;
    R12, R16, R19 및 R17은 R2, R6, R9 및 R7에 대해 차례로 정의된 바와 같고;
    R″는 C3-12 알킬렌 기이며, 이의 쇄는 하나 또는 그 이상의 이형원자 및/또는 임의선택적으로 치환된 방향족 고리에 의해 차단될 수 있으며; 그리고
    X와 X'는 O, S 그리고 N(H)로부터 독립적으로 선택된다.
  13. 청구항 12에 있어서, 이때 D는 다음 구조를 가지는, 면역접합체:
    Figure pct00084

    이때 n은 0 또는 1이다.
  14. 청구항 12에 있어서, 이때 D는 다음 구조로부터 선택된, 면역접합체:
    Figure pct00085

    Figure pct00086
    그리고
    Figure pct00087

    이때 RE 및 RE"는 각각 H 또는 RD로부터 독립적으로 선택되며, 이때 RD 는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 그리고 할로로부터 독립적으로 선택되며;
    이때 Ar1 및 Ar2는 각각 임의선택적으로 치환된 C5-20 아릴로부터 독립적으로 선택되며; 그리고
    이때 n은 0 또는 1이다.
  15. 청구항 11에 있어서, 이때 D는 식 B의 피롤로벤조디아제핀인, 면역접합체:
    Figure pct00088

    이때 수평 파동선은 평으로 링커에 공유적 부착 부위를 나타내고;
    RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸, 페닐, 플루오로-치환된 페닐, 그리고 C5-6 헤테로시클일로부터 독립적으로 선택되며; 그리고
    n은 0 또는 1이다.
  16. 청구항 11 내지 15중 임의의 한 항에 있어서, 링커는 프로테아제에 절단가능한, 면역접합체.
  17. 청구항 16에 있어서, 링커는 val-cit 이펩티드 또는 Phe-Lys 이펩티드를 포함하는, 면역접합체.
  18. 청구항 11에 있어서, 다음 식을 포함하는, 면역접합체.
    Figure pct00089
  19. 청구항 11 내지 18중 임의의 한 항에 있어서, p는 1-3의 범위가 되는, 면역접합체.
  20. 청구항 12에 있어서, 다음 구조를 포함하는, 면역접합체:
    Figure pct00090

    이때 CBA는 항체 (Ab)를 나타내며; RL1 및 RL2은 각각 H와 메틸로부터 독립적으로 선택되며, 또는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 시클로프로필렌 기를 형성하고; 그리고 Y는 단일 결합, (a1), 그리고 (a2)로부터 독립적으로 선택되며:
    Figure pct00091

    이때 N은 기(group)가 PBD 모이어티의 N10에 결합된 것을 보여주는, 면역접합체.
  21. 청구항 20에 있어서, 다음 구조로부터 선택되는 면역접합체:
    Figure pct00092

    Figure pct00093
    그리고
    Figure pct00094
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 다음 구조를 포함하는 면역접합체:
    Figure pct00095

    이때 RE 및 RE"는 각각 H 및 RD로부터 독립적으로 선택된다.
  23. 청구항 20 또는 21에 있어서, 다음 구조를 포함하는 면역접합체:
    Figure pct00096

    이때 Ar1 및 Ar2는 각각 임의선택적으로 치환된 C5-20 아릴로부터 독립적으로 선택된다.
  24. 청구항 23에 있어서, Ar1 및 Ar2는 각각 임의선택적으로 치환된 페닐, 퓨라닐, 티오페닐 그리고 피리딜로부터 독립적으로 선택되는, 면역접합체.
  25. 청구항 20 또는 21에 있어서, 다음 구조를 포함하는, 면역접합체:
    Figure pct00097

    이때 RV1 및 RV2는 각각 H, 메틸, 에틸, 임의선택적으로 치환된 페닐, 그리고 C5-6 헤테로시클일로부터 독립적으로 선택된다.
  26. 청구항 25에 있어서, RV1 및 RV2는 각각 H, 페닐, 그리고 4-플루오로페닐로부터 독립적으로 선택되는, 면역접합체.
  27. 다음에서 선택된 식을 보유하는 면역접합체:
    Figure pct00098
    그리고
    Figure pct00099

    이때 Ab는 (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1, (v) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2, 그리고 (vi) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3를 포함하는 항체이며; 그리고 이때 p는 1 내지 3이다.
  28. 다음 식을 보유하는 면역접합체:
    Figure pct00100

    이때 Ab는 (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 10의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 11의 아미노산 서열이 포함된 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 15의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L1, (v) 서열 번호: 13의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L2, 그리고 (vi) 서열 번호: 14의 아미노산 서열이 포함된 HVR-L3을 포함하는 항체이며; 그리고 이때 p는 1 내지 3이다.
  29. 청구항 27 또는 28에 있어서, 이때 상기 항체는 서열 번호: 7의 VH 서열과 서열 번호: 8의 VL 서열을 포함하는, 면역접합체.
  30. 청구항 29에 있어서, 이때 상기 항체는 서열 번호: 26의 중쇄와 서열 번호: 23의 경쇄를 포함하는, 면역접합체.
  31. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체는 단클론 항체인, 면역접합체.
  32. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체는 인간, 인간화된, 또는 키메라 항체인, 면역접합체.
  33. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체는 CD22에 결합하는 항체 단편인, 면역접합체.
  34. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체는 인간 CD22에 결합하는, 면역접합체.
  35. 청구항 34에 있어서, 이때 인간 CD22는 서열 번호: 28 또는 서열 번호: 29의 서열을 보유하는, 면역접합체.
  36. 전술한 임의의 한 항에 따른 면역접합체와 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학 제제.
  37. 청구항 36에 있어서, 추가 치료 물질를 더 포함하는, 약학 제제.
  38. CD22-양성 암을 가진 개체를 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 1 내지 35중 임의의 한 항에 따른 상기 면역접합체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 이때 CD22-양성 암은 임파종, 비-호지킨 임파종 (NHL), 공격성 NHL, 재발된 공격성 NHL, 재발된 무기력한 NHL, 난치성 NHL, 난치성 무기력한 NHL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 소림프구성 임파종, 백혈병, 털모양 세포백혈병 (HCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 버킷 임파종, 그리고 맨틀 세포 임파종으로부터 선택되는, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 추가 치료 물질을 개체에게 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 이때 추가 치료물질은 CD79b에 결합하는 항체가 포함된, 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 이때 추가 치료물질은 세포독성 물질에 공유적으로 부착된 CD79b에 결합하는 항체가 포함된 면역접합체인, 방법.
  43. CD22-양성 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서, 이 방법은 세포 표면 상에 있는 CD22에게 면역접합체의 결합을 허용하는 조건하에서 청구항 1 내지 35중 임의의 한 항에 따른 면역접합체에 상기 세포를 노출시키는 것을 포함하며, 이로 인하여 상기 세포의 증식이 억제되는, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 이때 세포는 신생물 B 세포인, 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 이때 세포는 임파종 세포인, 방법.
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