CN104125852B9

CN104125852B9 - 基于Fc‑受体的亲和色谱

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Publication number: CN104125852B9
Application number: CN201380009724.6A
Authority: CN
Inventors: R·法尔肯施泰因; H·赫尔腾伯格; P·鲁格尔; T·施洛特豪尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-02-15
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2033-02-14
Also published as: BR112014018005A2; JP6360232B2; KR20140127251A; JP2017207494A; CA2860600C; JP2018188442A; CN104125852B; HRP20180966T1; CA3159061A1; MX2014009622A; US20150018241A1; US20190276492A1; BR112014018005B1; CA2860600A1; ES2676031T3; EP2814587B1; RU2624128C2; US11814409B2; MX360352B; HK1203435A1

Abstract

本文报道了新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的固定化非共价复合物的用途，一般用作亲和色谱配体，和例如用于通过确定抗体和参照抗体的保留时间的比例，确定抗体的体内半衰期。

Description

基于Fc-受体的亲和色谱

本文报道了包含固定的人新生儿Fc受体作为亲和配体的亲和色谱的用途及其用途。

背景

免疫球蛋白一般包括两条所谓的轻链多肽(轻链)和两条所谓的重链多肽(重链)。每条重链多肽和轻链多肽都含有可变结构域(可变区)(一般是多肽链的氨基末端部分)，其包括能够与抗原相互作用的结合区。每条重链多肽和轻链多肽都包括恒定区(一般羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体与i)具有Fcγ受体(FcγR)的细胞，如吞噬细胞，或　ii)具有新生儿Fc受体 (FcRn)，也被称为Brambell受体的细胞的结合。还介导与一些因子的结合，包括经典补体系统的因子，如成分(C1q)。

新生儿Fc受体(FcRn)也被称为I类MHC相关受体(综述参见Ward, E.S.和Ober,R.J.,Advances in Immunology 103(2009)77-115)。研究不仅显示该受体在整个成年生活史中发挥调控IgG水平和分布的作用(Ghetie, V.等人，Nat.Biotechnol.15(1997)637–640；Israel,E.J.,Immunology 89 (1996)573–578；Junghans,R.P.和Anderson,C.L.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93(1996)5512–5516)，而且还在多种细胞类型和组织中具有多种其他作用(参见例如，Akilesh,S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(2008) 967–972；Dickinson,B.L.等人，J.Clin.Invest.104(1999)903–911；Kim,H. 等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.49(2008)2025–2029；Spiekermann, G.M.等人，J.Exp.Med.196(2002)303–310；Zhu,X.等人，J.Immunol.166 (2001)3266–3276)。已从许多物种中分离出FcRn直系同源物，包括小鼠、大鼠、人、绵羊、牛、负鼠、猪和骆驼(Adamski,F.M.等人，Mol.Immunol. 37(2000)435–444；Ahouse,J.J.等人，J.Immunol.151(1993)6076–6088； Kacskovics,I.等人，J.Immunol.164(2000)1889–1897；Kacskovics,I.等人， Dev.Comp.Immunol.30(2006)1203–1215；Kandil,E.等人，J.Immunol. 154(1995)5907–5918；Mayer,B.等人，Immunology 107(2002)288–296； Schnulle,P.M.和Hurley,W.L.,Vet.Immunol.Immunopathol.91(2003) 227–231；Simister,N.E.和Mostov,K.E.,Nature 337(1989)184–187；Story, C.M.等人，J.Exp.Med.180(1994)2377–2381)，提示该受体存在于基本上所有的哺乳动物物种中。FcRn的多种功能取决于它将IgG从细胞内的溶酶体降解中分选出来，并在质膜释放胞吐事件(exocytic envent)中结合的物质的能力(Ober,R.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004) 11076–11081；Ober,R.J.等人，J.Immunol.172(2004)2021–2029；Prabhat, P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(2007)5889–5894)。此外，考虑到在体内调节IgG运输通路和行为的潜力，关于改造抗体以增加其在小鼠中的半衰期的早期报道(Ghetie等人，见上文)已经拓展至生物制药行业中的深入兴趣领域(Dall'Acqua,W.F.等人，J.Biol.Chem.281(2006) 23514–23524；Hinton,P.R.等人，J.Biol.Chem.279(2004)6213–6216； Hinton,P.R.等人，J.Immunol.176(2006)346–356；Shields,R.L.等人，J. Biol.Chem.276(2001)6591–6604)。

WO 2005/047327中报道了新生儿Fc受体(FcRn)-结合肽变体、二聚体化Fc结合蛋白及其相关方法。WO 2006/031370中报道了具有改变的效应子功能的多肽变体。WO 2009/041643中报道了通过CDR中的氨基酸取代，修饰抗体的等电点的方法。WO 2010/048313中报道了用于纯化含Fc的融合蛋白的重组FcRn及其变体。Magistrelli,G.等人报道了在哺乳动物细胞中大量生产重组FcRn，能够进行用于IgG结合研究的定向固定(J. Immunol.Meth.印刷中，可于12.09.2011在线获得)。

概述

本文报道的一个方面是固定化的新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物作为亲和色谱配体的用途。

已发现使用本文报道的方法/用途，目前能够分开、分离和表征ZAI 体内特性密切相关的抗体种类(antibody species)，即，单个或有限数量的氨基酸残基中有差异。

因此，用本文报道的方法分离的不同抗体种类，即，一个氨基酸残基差异，可用于表征/鉴别与FcRn相关的影响半衰期的氨基酸位置。

因此，用本文报道的方法能够分开一种亲本抗体的不同变体，并确定这些变体之间的具体比例，这是使用目前已知的方法所不能够的，因为后者仅提供修饰的总数，而不提供单个变体种类的数量(即，对于亲本抗体和变体1、变体2、变体1/2的混合物，质谱提供了包含变体1的分子的总数，即，包括单个变异(1)以及也含有第二变异(1/2)的那些的变体)。

这可以通过组合i)在色谱支持物上固定重组生产的人FcRn与重组生产的人β2微球蛋白的组合和ii)线性pH梯度来实现。

已发现对于给定的条件，野生型IgG1抗体具有约42至49分钟的保留时间。在一个实施方案中，包含IgG1亚型的野生型Fc区的抗体或Fc- 融合蛋白具有约45分钟的保留时间。

具有降低的FcRn结合的修饰型Fc区的抗体具有更短的保留时间，而具有增强的FcRn结合的修饰型Fc区的抗体具有更长的保留时间。在一个实施方案中，新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是与固相结合的。在一个实施方案中，固相是色谱材料。在一个实施方案中，新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是生物素化的，固相是用链霉亲和素衍生化的。

在一个实施方案中，用途是在具有pH梯度的亲和色谱中。在一个实施方案中，pH梯度是从第一pH值至第二pH值，第一pH值是从约pH3.5 至约pH7.5，第二pH值是从约pH6.0至约pH9.5。在一个实施方案中， pH梯度是具有递增的pH值的梯度或递减的pH值的梯度。在一个实施方案中，第一pH值是约pH5.5，第二pH值是约pH8.8，或第一pH值是约pH7.4，第二pH值是约pH6.0。

在一个实施方案中，β-2-微球蛋白来自与FcRn相同的物种。

在一个实施方案中，用途是用于通过确定抗体和参照抗体的保留时间的比例，确定抗体的体内半衰期。

在一个实施方案中，用途是用于分开至少包含Fc区的抗体或融合多肽。

在一个实施方案中，用途是用于确定抗体的甲硫氨酸氧化作用。

在一个实施方案中，用途是用于确定抗体的寡聚化水平。

在一个实施方案中，用途是用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的修饰的抗体或修饰的融合多肽的文库，对于那些与亲本抗体或亲本融合多肽相比针对FcRn具有改变的结合亲和力的修饰的抗体或修饰的融合多肽而言，其至少包含Fc区的FcRn结合部分。

在一个实施方案中，用途是用于鉴别至少包括Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽，所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体改变的结合。

在一个实施方案中，抗体是单特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或双特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或三特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或四特异性抗体或融合多肽的抗体片段。

在一个实施方案中，用途是用于从IgG制品中去除半抗体。

在一个实施方案中，用途是用于从IgG制品中去除抗体聚集体和抗体寡聚物。

本文报道的一个方面是人IgG1同种型的Fc区变体，其中第252位的氨基酸从甲硫氨酸变为组氨酸，第428位的氨基酸从甲硫氨酸变为谷氨酸。

本文报道的一个方面是用于选择具有预定的体内半衰期的抗体的方法，其中实施色谱，并选择相对于野生型IgG1具有给定保留时间窗口内的保留时间的抗体。

附图简介

图1使用本文报道的FcRn柱的应用抗体的线性和色谱曲线下方的面积。

图2位于本文报道的FcRn柱上的抗IGF-1R抗体野生型和YTE-突变体的色谱图。

图3在CE-SDS分析(A/B/C底栏)中可见，含有不同的半抗体量的不同抗体制品的FcRn色谱(A/B/C顶栏)

图4含有不同的抗体单体和聚集体的量的不同抗体制品的FcRn色谱。

图5进行色谱的分子中的Fc区数量对FcRn色谱的保留时间的影响。

图6抗体氧化对FcRn色谱保留时间的影响。

图7抗Aβ抗体野生型和HE-突变体在本文报道的FcRn柱上的色谱图。

图8 Met252和Met428氧化对FcRn相互作用的影响。将在40℃储藏了2个月的IgG1抗体的样品(曲线2)应用于FcRn柱，导致具有双峰的较早洗脱种类，提示了氧化的IgG1抗体，而在FcRn柱上应用在25℃(曲线1)和-80℃(曲线3)储藏了2个月的IgG1抗体的样品，导致较晚洗脱，实质上重叠的峰。色谱条件：缓冲液A(20mM MES，150mM NaCl，pH 5.5)，缓冲液B(20mM HEPES，150mM NaCl，pH8.2)，流速0.5ml/min，缓冲液A至缓冲液B的梯度：60min(标准)。

图9受胁迫(stressed)的IgG1抗体的表面等离振子共振(SPR)分析。向BIAcore应用在40℃储藏了2个月的IgG1抗体的样品进行SPR分析，显示了野生型，以及Met252和Met428氧化的IgG1抗体种类的不同的传感图。

图10抗体聚集体对FcRn相互作用的影响。FcRn色谱分析原始样品中的抗IL13Rα抗体、其分离的单体和分离的聚集体。色谱条件：缓冲液A(20mM MES，150mM NaCl，pH5.5)，缓冲液B(20mM Tris/HCl， 150mM NaCl，pH8.8)，流速0.5mL/min，缓冲液A至缓冲液B的梯度： 50min(标准)。

图11抗IL13Rα抗体聚集体的SPR分析。在原始样品(3)中，作为参照标准的抗IL13Rα抗体(曲线1)，分离的抗IL13Rα抗体单体(曲线2) 和分离的抗IL13Rα抗体聚集体(曲线4)的传感图。

图12 Fc突变对FcRn转基因小鼠的药代动力学的影响。向每组8 只动物，以单次静脉内推注10mg/kg给予野生型抗体或其三突变体YTE。结果表示为平均值±标准差(SD)，与野生型抗体比较的显著性ANOVA 分析(+++,p<0.001)。A：从0至672h，血清浓缩时间曲线下方的面积 (AUC(0-672))。B：最终半衰期。

本发明实施方案的详述

新生儿Fc受体(FcRn)对体内的IgG抗体代谢命运是重要的。

FcRn亲和色谱可以通过其峰面积和保留时间曲线区分IgG样品。其能够在体外分析FcRn和IgG之间的相互作用，并能够深入的审视治疗性 IgG涉及体内药代动力学的结构和功能完整性。

因此，可以使用突变体和野生型IgG的FcRn亲和色谱为体内药代动力学的半定量预测。进一步的，可以使用FcRn亲和色谱监控FcRn-IgG 的相互作用，例如，用于IgG批次表征或比较性研究。

已发现了这样的标准化pH梯度的FcRn亲和液相色谱方法，所述方法具有密切的模拟IgG和FcRn在体内的相互作用机制的条件。将人FcRn 固定在柱上作为亲和配体，并应用线性pH梯度，例如pH5.5至8.8。

例如，分析性FcRn亲和色谱允许通过峰模式和保留时间曲线鉴别和表征IgG样品和变体。方法可以区别1)具有不同的Fab片段的相同IgG， 2)氧化的IgG形式和非氧化的IgG形式，3)聚集体和单体，以及4)Fc区中具有变异的抗体。

已发现变体IgG(Fc区变体)相对于野生型IgG的FcRn亲和色谱曲线的改变是体内药代动力学曲线的预测。这些结果证实FcRn亲和色谱是用于表征FcRn-IgG相互作用、IgG完整性和同样的大多数IgG的有效的新方法。

I.定义

术语“约”表示后接数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语约表示后接数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语约表示后接数值的+/-5％的范围。

术语“改变”表示至少包括Fc区的FcRn结合部分的亲本抗体或融合多肽中的一个或多个氨基酸残基的取代、添加或缺失，从而获得修饰的抗体或融合多肽。

术语“氨基酸取代”表示用另一种不同的氨基酸残基(替换的氨基酸残基)替换至少一个现有的氨基酸残基。替换的氨基酸残基可以是“天然存在的氨基酸残基”，选自丙氨酸(三字母码：ala，单字母码：A)、精氨酸(arg， R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺 (gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸 (ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸 (phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp， W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。

术语“氨基酸插入”表示在氨基酸序列中的预定位置掺入至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中，插入是插入一个或两个氨基酸残基。插入的氨基酸残基可以是任何天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。

术语“氨基酸缺失”表示在氨基酸序列中的预定位置去除至少一个氨基酸残基。

本文中术语“抗体”是以最广的含义使用的，涵盖了各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其表现出FcRn结合特性。

术语“缓冲物质”表示当处于溶液中时，可以平衡溶液的pH值改变的物质，例如由于添加或释放酸性或碱性物质造成的。

术语“CH2结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其大致从EU第231 位延伸至EU第340位(根据Kabat的EU编号系统)。在一个实施方案中， CH2结构域具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列：APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK。

术语“CH3结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其大致从EU第341 位延伸至EU第446位。在一个实施方案中，CH3结构域具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列：GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG。

术语抗体的“类别”表示其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类人抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可被进一步分为亚类(同种型),例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、β、ε、γ和μ。

术语“人来源的Fc区”表示至少含有一部分铰链区、CH2结构域和 CH3结构域的人来源的免疫球蛋白重链的C端区域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区延伸自Cys226，或自Pro230，至重链的羧基端。在一个实施方案中，Fc区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。然而，Fc区C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另外说明，则Fc区或恒定区的氨基酸残基编号是根据EU编号系统的，也称为EU代码，如Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)，NIH Publication No.91-3242所述。

术语“FcRn”表示人新生儿Fc-受体。FcRn的功能是从溶酶体降解通路拯救IgG，导致降低的清除率和延长的半衰期。FcRn是异二聚体蛋白，由两条多肽组成：50kDa的I类主要组织相容性复合物-样蛋白(α-FcRn) 和15kDa的β2-微球蛋白(β2m)。FcRn以高亲和力与IgG的Fc结构域的 CH2-CH3部分结合。IgG和FcRn之间的相互作用是严格的pH依赖性的，以1:2化学计量发生，1个IgG通过其2条重链结合2个FcRn分子(Huber, A.H.等人，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。FcRn结合发生在酸性 pH(pH<6.5)的内体(endosome)中，将IgG释放在中性细胞表面(pH约7.4)。相互作用的pH-敏感性质通过与内体的酸性环境中的受体结合，促进了由 FcRn-介导的对胞饮到细胞内的IgG免受细胞内降解的保护作用。然后， FcRn促进了IgG再循环至细胞表面，和之后在FcRn-IgG复合物暴露于细胞外的中性pH环境后，释放到血流中。

术语“Fc区的FcRn结合部分”表示抗体重链多肽的一部分，其大致从EU第243位延伸至EU第261位，大致从EU第275位延伸至EU第 293位，大致从EU第302位延伸至EU第319位，大致从EU第336位延伸至EU第348位，大致从EU第367位延伸至EU第393位和EU第408 位，和大致从EU第424位延伸至EU第440位。在一个实施方案中，根据Kabat的EU编号的一个或多个下列氨基酸残基是改变的：F243、P244、 P245 P、K246、P247、K248、D249、T250、L251、M252、I253、S254、 R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、 Y278、V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、 T289、K290、P291、R292、E293、V302、V303、S304、V305、L306、 T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、 K317、E318、Y319、I336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、 P343、R344、E345、P346、Q347、V348、C367、V369、F372、Y373、 P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、 N384、G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、 C425、S426、V427、M428、H429、E430、A431、L432、H433、N434、 H435、Y436、T437、Q438、K439和S440(EU编号)。

术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本相似的结构，或具有含有本文定义的Fc区的重链的抗体。

术语“铰链区”表示抗体重链多肽中连接CH1结构域和CH2结构域的一部分，例如，从根据Kabat的EU编号系统的约第216位至约第230 位。铰链区通常是由两条具有相同氨基酸序列的多肽组成的二聚体分子。铰链区一般包括约25个氨基酸残基，是柔性的，允许抗原结合区独立的移动。铰链区可以细分为3个结构域：上、中、下铰链结构域(Roux等人， J.Immunol.161(1998)4083)。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换的使用，指导入了外来核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，包括原代转化的细胞和源自此类细胞的后代，而不涉及传代数量。后代可以不与亲代细胞的核酸含量完全相同，而可以含有突变。筛选或选择原始转化的细胞中具有相同功能或生物学活性的突变后代也包括在此。

“人源化”抗体指包含来自非人高变区(HVR)的氨基酸残基，和来自人框架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含几乎所有的至少1个，通常2个可变结构域中，其中所有的或几乎所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有的或几乎所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选的可以包括至少一部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”指经过人源化的抗体。

如本文中使用的术语“高变区”或“HVR”指在序列中超变的和/或形成结构定义的环(“超变环”)的抗体可变结构域的每个区。一般而言，天然的四链抗体包含6个HVR，其中3个在VH(H1、H2、H3)中，3个在 VL(L1、L2、L3)中。HVR一般包括来自超变环和/或来自“互补决定区” (CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性的超变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)，和 26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol. 196(1987)901-917)。示例性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、 CDR-H2和CDR-H3)存在于氨基酸残基L1的24-34、L2的50-56、L3的 89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)，NIH，Publication 91-3242)。除VH中的CDR1外，CDR一般包括形成超变环的氨基酸残基。 CDR还包括“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR 包含在CDR的区域中，被称为缩略的CDR，或a-CDR。示例性的 a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和 a-CDR-H3)存在于氨基酸残基L1的31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1 的31-35B、H2的50-58和H3的95-102(参见Almagro,J.C.和Fransson,J., Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另外指出，可变结构域中的HVR 残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中是根据Kabat等人，见上文编号的。

“个体”或“对象”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类，例如猴子)、兔和啮齿类(例如，小鼠、仓鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或对象是人。

术语“单克隆抗体”表示自基本均质的抗体群体中获得的抗体，即，除可能的变体抗体外，包含在群体中的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，所述可能的变体抗体例如，含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制品的过程中产生的，此类变体一般以微量存在。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同的抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体都针对抗原上的单个决定子。因此，修饰语“单克隆”表示自基本均质的抗体群体获得的抗体的特征，而不被理解为需要通过任何特定的方法生产抗体。例如，可以通过多种技术制备根据本发明待使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性的方法。

“天然抗体”指具有变化结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然的IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-至C-端，每条重链都具有可变区(VH)，也被称为可变重链结构域或重链可变结构域，之后是3 个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。相似的，从N-至C-端，每条轻链具有可变区(VL)，也被称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，之后是恒定轻链(CL)结构域。基于抗体恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以归属于称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型中的一种。

术语“非天然存在的氨基酸残基”表示除上述列举的天然存在的氨基酸残基以外的氨基酸残基，其可以与多肽链中邻近的氨基酸残基共价结合。非天然存在的氨基酸残基的例子是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸。其他例子列举在Ellman等人，Meth.Enzym.202(1991)301-336中。用于合成非天然存在的氨基酸残基的示例性方法报道在例如Noren等人， Science 244(1989)182和Ellman等人，见上文中。

相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性的百分比(％)"定义为在比对候选序列和参照多肽序列和引入空位(根据需要)且不认为任何保守取代是序列同一性的一部分后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比，所述引入空位是为了实现最大百分比序列同一性。以本领域技术中的多种方式，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，可以实现为确定氨基酸序列同一性百分比的目的而进行的比对。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现在所比较的全长序列上的最大比对所需的任何算法。然而，对于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创造，并且源代码已经作为用户文件提交给美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)，注册为U.S.版权注册号TXU510087。ALIGN-2程序是可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得的，或可以从源代码编译。ALIGN-2程序应该被编译用于UNIX操作系统，包括数据化UNIX V4.0D。通过ALIGN-2 程序设定所有序列比较参数且不改变。

在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定的氨基酸序列A对、与或针对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性 (备选地可以表达为给定的氨基酸序列A对、与或针对给定的氨基酸序列 B具有或包括某一％氨基酸序列同一性)：

100倍的分数X/Y

其中，X是在A和B的程序比对中，由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中的氨基酸残基的总数。将理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B 的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别指出，则本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都如前文段落中使用ALIGN-2计算机程序所述获得。

术语“药物制剂”指为这样的形式的制品，所述形式允许其中所含的活性成分的生物学活性是有效的，且所述制品中不含对待被施用该制剂的对象有不可接受的毒性的额外组分。

“可药用载体”指在药物制剂中，除活性成分外的对对象无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“正线性pH梯度”表示在低(即，更酸性)的pH值开始，在更高 (即，较不酸性、中性或碱性)的pH值结束的pH梯度。在一个实施方案中，正线性pH梯度自约5.5的pH值开始，在约8.8的pH值结束。

术语“负线性pH梯度”表示在高(即，中性或碱性)的pH值开始，在更低(即，中性或酸性)的pH值结束的pH梯度。在一个实施方案中，负线性pH梯度自约7.4的pH值开始，在约6.0的pH值结束。

如本文使用的，“治疗”(及其语法变化的各种形式)指临床尝试干预，以改变正在被治疗个体的天然病程，可以为预防或在临床病理的病程中进行。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、阻止转移、降低疾病发展速率、改善或减缓疾病状态，和减轻或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然的抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL) 一般具有相似的结构，每个结构域包含4个保守构架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H. Freeman and Co.，N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域足以赋予抗原结合特异性。此外，使用结合抗原的抗体的VH或VL结构域，分别筛选互补的VL或VH结构域文库，可以分离结合特定抗原的抗体(参见例如，Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T. 等人，Nature 352(1991)624-628)。

术语“变体”、“修饰的抗体”和“修饰的融合多肽”表示具有不同于亲本分子的氨基酸序列的氨基酸序列的分子。通常，这类分子具有一个或多个改变、插入或缺失。在一个实施方案中，修饰的抗体或修饰的融合多肽包括包含至少一部分非天然存在的Fc区的氨基酸序列。这类分子与亲本抗体或亲本融合多肽具有低于100％序列同一性。在一个实施方案中，变体抗体或变体融合多肽具有这样的氨基酸序列，所述序列与亲本抗体或亲本融合多肽的氨基酸序列具有从约75％至低于100％，尤其是从约 80％至低于100％，尤其是从约85％至低于100％，尤其是从约90％至低于100％，尤其是从约95％至低于100％氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本融合多肽与变体抗体或变体融合多肽的一个(单个)、两个或三个氨基酸残基不同。

II.组合物和方法

人新生儿Fc受体(FcRn)在IgG分解代谢中发挥重要的作用。IgG的体外FcRn结合特性/特征是它的体内药代动力学特性的指标。这类体外方法在抗体研发的过程中具有重大价值，因为可以避免重复的体内研究(减少动物实验、时间和成本)。迄今为止，一般用表面等离振子共振(SPR)实施这类测定(Wang,W.等人，Drug Metab.Disp.39(2011)1469-1477； Datta-Mannan,A.等人，Drug Metab.Disp.40(2012)1545-1555；Vaughn, D.E.和Bjorkman,P.J.,Biochemistry 36(1997)9374-9380；Raghavan,M. 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)11200-11204；Martin,W.L.和 Bjorkman,P.J.,Biochemistry 38(1999)12639-12647)。还描述了用于评估 IgG与FcRn的结合亲和力的量热和非对称流场流分级分离的方法(Huber, A.H.等人，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083；Pollastrini,J.等人，Anal. Biochem.414(2011)88-98)。除了复杂的测定外，一些研究探讨了通过SPR 确定的体外FcRn结合参数和抗体的体内血清半衰期之间的相关性，尽管这样研究改善了结合反应条件和进行恰当的建模，但目前仍不能证实存在这样的相关性(Gurbaxani,B.等人，Mol.Immunol.43(2006)1462-1473； Gurbaxani,B.M.和Morrison,S.L.,Mol.Immunol.43(2006)1379-1389； Gurbaxani,B.,Clin.Immunol.122(2007)121-124)。改造IgG1的Fc区，来改善SPR技术测量到的IgG1与FcRn在pH6和中性pH下的亲和力，并未在食蟹猴中获得改善的药代动力学(Yeung,Y.A.等人，J.Immunol.182 (2009)7663-7671)。然而，N434A IgG1变体在pH6下与FcRn亲和力仅中等程度的增加，同时不伴随在pH7.4下与FcRn的显著结合，在灵长类中获得了改善的药代动力学，证实了在pH7.4下的FcRn释放的重要性(参见Yeung,Y.A.，上文)。

已知方法的组合可以实现与FcRn亲和色谱的结果可比较的分析结果，但需要投入增加的复杂程度和努力。

目前的标准方法没有恰当的的反映出FcRn结合特征的生理学pH依赖性，这需要酸性pH用于内体结合，而需要中性pH用于在细胞表面释放IgG。pH环境对FcRn分子的自我关联特性有影响。目前的方法在一个给定pH的标准条件下工作，因此，仅检测到复杂的FcRn-IgG相互作用中的快照，不能有效的动态评估IgG-FcRn相互作用。这也可能是在一些研究中发现的缺乏体外FcRn分析和体内药代动力学之间的FcRn亲和力缺乏相关性的原因之一(参见上文)。

IgG-FcRn相互作用的SPR分析提供了定性的结果，提示样品的预期的或异常的结合特性，但既没有给出导致异常结合的线索，也没有定量的估算具有异常结合的抗体的量。质谱也仅给出了完整性被破坏的IgG分子的定性信息。相反，FcRn亲和色谱允许在恰当的生理学条件下分析样品，所述条件具有在包括1:2、1:1和2:2化学计量的化学计量混合物中以2:1 化学计量为主，和可以经调节以精细的适合分离可见于样品中的不同峰的 pH梯度。可以通过曲线下的它们的各个面积定量不同的峰，并且与各峰对应的洗脱物易于进行二次分析，例如确定功能性、再次色谱或质谱分析。

此外，为了提供用于治疗多种目前已知和未来将揭示的疾病的治疗方案，需要定制抗体以及含Fc部分的多肽。

为了定制抗体或含Fc部分的融合多肽的FcRn结合特征，修饰参与 Fc-部分介导的效应子功能的残基，并测试所获得的修饰的抗体和融合多肽。如果没有满足所需特征，则再次实施相同的步骤。

在一个实施方案中，Fc部分是介导与FcRn结合的Fc区部分。

因此，有利的是提供基于简单的色谱方法，且不需要体内研究来分析修饰的抗体的特征改变，预测修饰的抗体的特征性性质改变的方法。

在一些情况下，具有延长的半衰期的抗体是理想的。例如，在需要治疗的患者的循环系统中具有延长的半衰期的药物需要减少的给药或增加的给药间隔。这类抗体还具有增加的对疾病部位，例如肿瘤的暴露的优势。

本文报道的一个方面是新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的固定化非共价复合物作为亲和色谱配体的用途。

已发现包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的固定化非共价复合物作为亲和色谱配体的亲和色谱柱具有预料不到的稳定性。可用于至少 100次以上的色谱循环和多达约200次的色谱循环(平衡–分离–再生)，而不丢失性能(选择性和/或结合能力)。

还报道了包含基质和与基质结合的色谱官能团的亲和色谱柱，其特征是与色谱官能团结合的基质包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于通过确定抗体和参照抗体的保留时间比例，确定抗体的体内半衰期。在一个实施方案中，参照抗体是全长人IgG1抗体。

本文还报道了通过确定抗体和参照抗体在本文报道的FcRn亲和柱上确定的保留时间比例，来确定抗体相对于参照抗体的体内半衰期的方法。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于分离至少包含Fc部分的抗体或融合多肽。

本文还报道了用于分离至少包含Fc部分的抗体或融合多肽的方法。

在一个实施方案中，分离选自纯化、生产和分析。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于分离IgG1亚类的抗体和 IgG3亚类的抗体。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于确定抗体的甲硫氨酸氧化作用。

本文报道了使用本文报道的亲和色谱方法，确定对抗体的Fc部分中结合氧化的甲硫氨酸残基的FcRn的影响。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于确定抗体的寡聚化水平。

本文报道了使用本文报道的亲和色谱方法，确定抗体的寡聚化水平的方法。

一般而言，本文报道的方法的起点是以结合FcRn为特征的亲本抗体或亲本融合多肽。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的修饰抗体或修饰的融合多肽的文库，对于那些与亲本抗体或亲本融合多肽相比针对FcRn具有改变的结合亲和力的修饰的抗体或修饰的融合多肽而言，其至少包含Fc区的FcRn结合部分。

本文报道了下述方法，所述方法用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的修饰抗体或修饰的融合多肽的文库，对于那些与亲本抗体或亲本融合多肽相比针对FcRn具有改变的结合亲和力的修饰的抗体或修饰的融合多肽而言，其至少包含Fc区的FcRn结合部分，方法包括下列步骤：

(a)将文库的各个成员和亲本抗体或亲本融合多肽应用于本文报道的 FcRn亲和色谱柱；

(b)用pH梯度回收文库的各个成员，并确定每个的保留时间；和

(c)选择与FcRn具有比亲本抗体或亲本融合多肽改变的结合亲和力的那些抗体或融合多肽。

本文报道了用于从多肽混合物中纯化至少包括Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽的方法，方法包括将混合物应用于本文报道的FcRn亲和柱，和用pH梯度洗脱至少包括Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽，从而纯化抗体或融合多肽。在一个实施方案中，Fc区的FcRn部分是人Fc区，或小鼠Fc区，或食蟹猴Fc区，或兔Fc区，或仓鼠Fc区的FcRn 部分。

术语单数形式表示一、或二、或三、或四、或五、或六，最多达10⁹。

在一个实施方案中，在第一pH值下，将反应/生产混合物、或粗制的或部分纯化的培养上清液应用于FcRn亲和柱，在第二pH值下从FcRn亲和柱上回收抗体或融合多肽。

在一个实施方案中，第一pH值是约pH3.5至约pH7.5。在一个实施方案中，第一pH值是约pH4至约pH7。在一个实施方案中，第一pH值是约pH4.5至约pH6.5。在一个实施方案中，第一pH值是约pH5至约 pH6。在一个实施方案中，第一pH值是约pH5或约pH5.5或约pH6。

在一个实施方案中，第一pH值选自约pH3.5、约pH3.6、约pH3.7、约pH3.8、约pH3.9、约pH4.0、约pH4.1、约pH4.2、约pH4.3、约 pH4.4、约pH4.5、约pH4.6、约pH4.7、约pH4.8、约pH4.9、约pH5.0、约pH5.1、约pH5.2、约pH5.3、约pH5.4、约pH5.5、约pH5.6、约 pH5.7、约pH5.8、约pH5.9、约pH6.0、约pH6.1、约pH6.2、约pH6.3、约pH6.4、约pH6.5、约pH6.6、约pH6.7、约pH6.8、约pH6.9、约 pH7.0、约pH7.1、约pH7.2、约pH7.3、约pH7.4和约pH7.5。

在一个实施方案中，第二pH值是约pH8至约pH9.5。在一个实施方案中，第二pH值是约pH8.5至约pH9。在一个实施方案中，第二pH值是约pH8.8。

在一个实施方案中，第二pH值选自约pH8.0、约pH8.1、约pH8.2、约pH8.3、约pH8.4、约pH8.5、约pH8.6、约pH8.7、约pH8.8、约 pH8.9、约pH9.0、约pH9.1、约pH9.2、约pH9.3、约pH9.4和约pH9.5。

在一个实施方案中，将约pH3.5、约pH3.6、约pH3.7、约pH3.8、约pH3.9、约pH4.0、约pH4.1、约pH4.2、约pH4.3、约pH4.4、约 pH4.5、约pH4.6、约pH4.7、约pH4.8、约pH4.9、约pH5.0、约pH5.1、约pH5.2、约pH5.3、约pH5.4、约pH5.5、约pH5.6、约pH5.7、约 pH5.8、约pH5.9、约pH6.0、约pH6.1、约pH6.2、约pH6.3、约pH6.4、约pH6.5、约pH6.6、约pH6.7、约pH6.8、约pH6.9、约pH7.0、约 pH7.1、约pH7.2、约pH7.3、约pH7.4和约pH7.5中的每种给定的第一pH值与约pH8.0、约pH8.1、约pH8.2、约pH8.3、约pH8.4、约pH 8.5、约pH8.6、约pH8.7、约pH8.8、约pH8.9、约pH9.0、约pH9.1、约pH9.2、约pH9.3、约pH9.4和约pH9.5中每种给定的第二pH值组合。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于鉴别至少包括Fc区的 FcRn结合部分(例如，免疫球蛋白，如IgG1的恒定结构域)的抗体或融合多肽，所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体(FcRn)改变的结合。

本文提供了用于鉴别至少包括Fc区的FcRn结合部分(例如，免疫球蛋白，如IgG1的恒定结构域)的抗体或融合多肽的方法，所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体(FcRn)改变的结合。

相比亲本抗体或融合多肽，或相比参照抗体或参照融合蛋白，这类修饰的抗体或融合多肽表现出与FcRn增加的或减少的结合，因此，分别具有增加的或减少的血清半衰期。

相比与FcRn具有减少的亲和力的那些，与FcRn具有增加的亲和力的Fc区变体(即，在FcRn柱上增加的保留时间，但相比亲本抗体或参照抗体，仍如本文报道的在pH7.4的pH值之前洗脱)据预测具有更长的血清半衰期。与FcRn具有增加的亲和力的Fc区变体可用于治疗哺乳动物，尤其是人的方法，其中所施用抗体或融合多肽的长的半衰期是理想的，如在慢性疾病或病症的治疗中。与FcRn具有减少的亲和力的Fc区变体可用于治疗哺乳动物，尤其是人的方法，其中所施用抗体或融合多肽的短的半衰期是理想的，如体内诊断成像。

具有减少的FcRn结合亲和力的Fc区变体很可能能够穿过胎盘，因此可用于治疗孕妇，尤其是未出生胎儿的疾病或病症。此外，降低的FcRn 结合亲和力对于预期用于/运输至脑、肾和/或肝脏的那些药物而言是理想的。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于鉴别表现出降低的从脉管系统穿过肾脏肾小球上皮的运输的抗体或融合多肽。

在一个实施方案中，包含本文报道的修饰的Fc区的抗体或融合多肽表现出降低的从脉管系统穿过肾脏肾小球上皮的运输。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于鉴别表现出降低的穿过血脑屏障，从脑进入血管空间中的运输的抗体或融合多肽。

在一个实施方案中，包含本文报道的人来源的修饰的Fc区的抗体或融合多肽表现出降低的穿过血脑屏障(BBB)，从脑进入血管空间中的运输。

本文报道了制备至少包含Fc区的FcRn结合部分的这类修饰的抗体和融合多肽的方法，和使用这类修饰的抗体和融合多肽的方法。

在一个实施方案中，本文报道的抗体或融合多肽包括至少一个结合位点(例如，至少一个抗原结合位点，或至少一个受体结合位点，或至少一个配体结合位点)。在一个实施方案中，本文报道的抗体或融合多肽包括至少 2个结合位点(例如，至少2个抗原结合位点，或至少2个受体结合位点，或至少2个配体结合位点，或至少一个抗原结合位点和至少一个受体结合位点，或至少一个抗原结合位点和至少一个配体结合位点，或至少一个受体结合位点和至少一个配体结合位点)。在一个实施方案中，本文报道的抗体或融合多肽包括3个结合位点(例如，至少3个抗原结合位点，或至少3 个受体结合位点，或至少3个配体结合位点，或前述至少3个结合位点的任意的混合物)。在一个实施方案中，本文报道的抗体或融合多肽包括4个结合位点。

本文报道的所有方面的一个实施方案是至少一部分Fc区是人来源的至少一部分Fc区。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，是选自人 FcRn、食蟹猴FcRn、小鼠FcRn、大鼠FcRn、绵羊FcRn、狗FcRn和兔 FcRn的FcRn。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，β-2-微球蛋白来自与FcRn 相同的物种。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，β-2-微球蛋白来自与FcRn 不同的物种。

在一个实施方案中，Fc区或Fc区的FcRn结合部分源自任何同种型的重链。

在一个实施方案中，至少一部分Fc区至少包括人来源的CH2结构域的第282-340位的氨基酸残基(SEQ ID NO:01，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，至少一部分Fc区包括完整的CH2结构域(根据Kabat的EU 编号的人来源的抗体重链多肽Fc区的大致第231-340位的氨基酸残基)。在一个实施方案中，至少一部分Fc区至少包括CH2结构域，和至少一个铰链区(根据EU编号的人来源的抗体重链多肽Fc区的大致第216-230位的氨基酸残基)或CH3结构域(根据EU编号的人来源的抗体重链多肽Fc 区的大致第341-446位的氨基酸残基)。在一个实施方案中，至少一部分Fc 区包括人来源的抗体重链的CH2和CH3结构域。在一个实施方案中，至少一部分Fc区包括人来源的抗体重链多肽Fc区的铰链、CH2结构域和 CH3结构域。人来源的Fc区或人来源部分的Fc区的FcRn结合部分可源自任何同种型重链，所述同种型如IgG1(SEQ ID NO:03)、IgG2(SEQ ID NO:04)、IgG3(SEQ ID NO:05)和IgG4(SEQ ID NO:06)。在一个实施方案中，人同种型是IgG1。

亲本抗体的或包含在亲本融合多肽中的Fc区可源自不同的免疫球蛋白分子和/或不同的免疫球蛋白同种型。例如，亲本抗体或亲本融合多肽可包含源自IgG1同种型免疫球蛋白的CH2结构域和源自IgG3同种型免疫球蛋白的铰链区。此外例如，亲本抗体或亲本融合多肽可包括部分源自 IgG1免疫球蛋白亚型和部分源自IgG3免疫球蛋白亚型的铰链区，只要其是人起源的。例如，亲本抗体或亲本融合多肽可包括部分源自IgG1免疫球蛋白亚型和部分源自IgG4免疫球蛋白亚型的嵌合铰链区。

本文报道的亲本抗体或亲本融合多肽包含至少一个Fc区或其一个 FcRn-结合部分。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本多肽还包括至少一个结合结构域(在一个实施方案中，选自抗原结合结构域、受体结合结构域，或配体结合结构域)。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本融合多肽包括至少一个结合结构域和至少一个Fc区或其一个FcRn-结合部分。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本融合多肽包括2个结合结构域及2个Fc区或其2 个FcRn-结合部分。

在一个实施方案中，本文报道的亲本抗体或亲本融合多肽包括至少一个特异性结合这样的靶的结合结构域，和至少一个Fc区或其FcRn结合部分，所述靶介导生物学效应(在一个实施方案中，是能够结合细胞表面受体的配体或能够结合配体的细胞表面受体)，和介导负信号或正信号向细胞的传递。在一个实施方案中，生物学效应的介导是在约pH7.4的pH值下。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本融合多肽包括至少一个特异性针对定向降低或消除的抗原的结合结构域(在一个实施方案中，是细胞表面抗原或可溶性抗原)，和至少一个Fc区或其一个FcRn结合部分。

可以通过多次皮下或腹腔内注射相关抗原(例如，包含这类抗原的纯化的抗原、细胞或细胞提取物，或编码这类抗原的DNA)和任选的佐剂，在哺乳动物中产生特异性结合靶的抗体。

在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，本文报道的融合多肽包括与FcRn结合部分有效连接的抗体片段(例如，scFv分子、minibody、四价minibody，或双抗体)。在一个实施方案中，FcRn结合部分是完整的抗体重链Fc区。

在一个实施方案中，亲本抗体是双特异性抗体，或亲本融合多肽包括双特异性抗体或双特异性抗体片段。

在一个实施方案中，亲本抗体是嵌合抗体。

在一个实施方案中，亲本融合多肽至少包括Fc区的FcRn结合部分。在一个实施方案中，本文报道的亲本融合多肽包括一个或多个结合结构域，每个都包括一个结合位点。亲本融合多肽可以是双特异性的(具有一个与第一靶特异性结合的结合位点和与第二靶特异性结合的第二结合位)或多价的(具有2个与相同的靶特异性结合的结合位点)。

在所有上述方面的一个实施方案中，pH是从约pH5.5至约pH8.8的梯度。

在一个实施方案中，pH是从约pH5至pH6，或从约pH6至约pH7，或从约pH7至约pH8梯度。

一般而言，结合结构域与至少Fc区的FcRn结合部分的C-末端或N- 末端融合。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于针对体内(共-)靶向选择在 pH7.4的pH值下与FcRn结合的抗体。在一个实施方案中，共靶向是内化作用。

因此，在一个实施方案中，第一pH是约pH7.4。在一个实施方案中，第二pH是约pH6.0。

一般而言，在哺乳动物细胞中共表达C-末端含His-Avi标签(SEQ ID NO:08)的FcRn可溶性胞外结构域(人FcRn的SEQ ID NO:07)和β₂-微球蛋白(人β-2-微球蛋白的SEQ ID NO:09)。非共价FcRn-微球蛋白复合物是生物素化的，并上样到链霉亲和素衍生化的琼脂糖上。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，新生儿Fc受体(FcRn)和 β-2-微球蛋白的非共价复合物是与固相结合的。

“固相”表示非流体的物质，包括由例如聚合物、金属(顺磁、铁磁颗粒)、玻璃和陶瓷制成的颗粒(包括微粒和珠子)；凝胶物质，如硅石、矾土和聚合凝胶；毛细管，可由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微滴度板；固体的条(stripe)；和比色杯、试管或其他分光光度计的样品容器。测定的固相组分与惰性固体表面不同，在于“固相支持物”的表面上含有至少一个部分，其预期与分子在化学上相互作用。固相可以是固定组分，如芯片、管、条、比色杯或微滴度板，或者可以是不固定的组分，如珠子和微粒。还可以使用微粒作为均质化测定模式的固体支持物。可以使用多种允许蛋白质和其他物质非共价或共价连接的微粒。这类颗粒包括聚合物颗粒，如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒，如金纳米颗粒和金胶体；和陶瓷颗粒，如硅石、玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如，Martin,C.R.等，Analytical Chemistry-News&Features,May 1 (1998)322A-327A，其通过引用整合到本文中。在一个实施方案中，固体支持物是琼脂糖。

在一个实施方案中，非共价复合物与固相的缀合是通过经由N-末端和 /或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、抗体的氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚基官能团，和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基的化学结合来实施的。

在一个实施方案中，非共价复合物是通过特定的结合对与固相缀合的。在一个实施方案中，非共价复合物是与生物素缀合的，通过固定在固相支持物上的抗生物素蛋白或链霉亲和素实施与固相支持物的固定。

在一个实施方案中，特定的结合对(第一组分/第二组分)选自链霉亲和素或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原(参见例如Hermanson,G.T.等， Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996))、植物凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。

通过线性梯度洗脱回收与本文报道的用途和方法中的本文报道的 FcRn亲和柱结合的抗体。在一个实施方案中，线性梯度是pH梯度或电导率梯度。

原则上，任何缓冲物质都可用于本文报道的方法中。

通过定点诱变，鉴别了对小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用关键性的Fc残基(参见例如，Dall’Acqua,W.F.等人J.Immunol 169(2002)5171-5180)。残基I253、H310、H433、N434和H435(根据Kabat的EU编号)参与了相互作用(Medesan,C.等人，Eur.J.Immunol.26(1996)2533；Firan,M.等人， Int.Immunol.13(2001)993；Kim,J.K.等人，Eur.J.Immunol.24(1994) 542)。发现残基I253、H310和H435对人Fc与鼠FcRn的相互作用是关键性的(Kim,J.K.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。Dall’Acqua等人已描述了通过蛋白质-蛋白质相互作用研究，残基M252Y、S254T、T256E 用于改善FcRn结合(Dall'Acqua,W.F.等人J.Biol.Chem.281(2006) 23514-23524)。人Fc-人FcRn复合物的研究显示了残基I253、S254、H435 和Y436对相互作用是关键性的(Firan,M.等人，Int.Immunol.13(2001) 993；Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung, Y.A.等人中(J.Immunol.182(2009)7667-7671)，已经报道和检验了第248 至259、301至317、376至382，和424至437位残基的多种突变体。

下表显示了用不同的洗脱缓冲液获得的不同抗体的保留时间。

表

术语YTE-突变体表示三突变体M252Y/S254T/T256E。

在一个实施方案中，使用可药用的缓冲物质，例如磷酸或其盐，醋酸或其盐，柠檬酸或其盐，吗啉、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)或其盐，组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐，三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐，(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)或其盐。

在一个实施方案中，缓冲物质选自磷酸或其盐，或醋酸或其盐，或柠檬酸或其盐，或组氨酸或其盐。

在一个实施方案中，缓冲物质具有10mM至500mM的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有10mM至300mM的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有10mM至250mM的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有10mM至100mM的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有15mM 至50mM的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有约20mM的浓度。

在一个实施方案中，第一溶液中的缓冲物质和第二溶液中的缓冲物质是相同的缓冲物质。

在一个实施方案中，第一溶液中的缓冲物质和第二溶液中的缓冲物质是不同的缓冲物质。

在一个实施方案中，第一溶液具有约pH3.5至约pH7.5的pH值。在一个实施方案中，第一溶液具有约pH5至约pH6的pH值。在一个实施方案中，第一溶液具有约pH5.5的pH值。

在一个实施方案中，第二溶液具有约pH7.0至约pH9.5的pH值。在一个实施方案中，第二溶液具有约pH8至约pH9的pH值。在一个实施方案中，第二溶液具有约pH8.2至约pH8.8的pH值。

示例性的第一溶液包括20mM MES和150mM NaCl，调节至pH5.5。

示例性的第二溶液包括20mM TRIS和150mM NaCl，调节至pH8.8。

示例性的第二溶液包括20mM HEPES，调节至pH8.6。

示例性的第二溶液包括20mM TRIS，调节至pH8.2。

在一个实施方案中，缓冲的溶液包括额外的盐。在一个实施方案中，额外的盐选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。在一个实施方案中，包括50mM至1000mM额外的盐的缓冲溶液。在一个实施方案中，包括50mM至750mM额外的盐的缓冲溶液。在一个实施方案中，包括50mM至500mM额外的盐的缓冲溶液。在一个实施方案中，包括50mM至750mM额外的盐的缓冲溶液。在一个实施方案中，包括大约50mM至大约300mM额外的盐的缓冲溶液。

在一个实施方案中，第一和/或第二溶液包括氯化钠。在一个实施方案中，第一和/或第二溶液包括约50mM至约300mM氯化钠。

已发现盐和缓冲物质的种类影响保留时间和解析度。可以确定用于抗体与FcRn结合的最佳盐浓度(150mM NaCl)。如果盐浓度更高(300mM)，则降低与FcRn的结合/获得更短的保留时间。较低的盐浓度(50mM)也是如此。20mM HEPES pH8.6延长所有测试抗体的保留时间。

如图1可见，施加的抗体的量显示出与洗脱峰的曲线下面积的线性相关性。

分析了8种抗体的完整抗体和用酶IDES切割后的抗体。通过SDS page 和分析性SEC控制切割。通过预制的SEC分开抗体的Fc部分和Fab部分。在下表中，给出了完整抗体、Fab部分和Fc部分的保留时间。

表

术语YTE-突变体表示三突变体M252Y/S254T/T256E。

一般而言，具有野生型Fc部分(IgG1或IgG2或IgG4)的抗体的保留时间在45至49 min之间改变(用针对36种抗原的35种治疗性抗体测试，数据未显示)。

在下表中，显示了相对于每克柱材料的固定化的FcRn受体的量的保留时间。

表

术语YTE-突变体表示三突变体M252Y/S254T/T256E。

抗Aβ抗体FAB-片段包括糖基化位点。

因此，本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于检测FAB修饰。在一个实施方案中，修饰是糖基化，或电荷分布。

一般而言，本文报道的方法和用途中的保留时间取决于pH梯度的斜率和所应用的盐浓度。使用野生型抗体作为参照，由较短的保留时间(＝较早洗脱)表示较弱的结合，而较长的保留时间(＝较晚洗脱)表示较强的结合，但仍在pH7.4的pH值之前。

已发现IgG的Fc部分的不同突变体在FcRn柱上的行为不同，展示为修饰的保留时间。

例如，抗Aβ抗体突变体YTE表现出增加的保留时间。抗Aβ抗体YTE- 突变体的第二峰是由于在Fab部分中导入了额外的糖基化位点造成的。

例如，抗IGF-1R抗体突变体YTE表现出增加的保留时间(参见图2)。

表

术语YTE-突变体表示三突变体M252Y/S254T/T256E。

已发现使用本文报道的FcRn柱，可以鉴别与FcRn结合相关的氨基酸，和与未修饰的野生型抗体相比，给突变体排序。

本文报道的方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于鉴别与FcRn结合相关的氨基酸，和与未修饰的野生型抗体相比，给突变体排序。

下表展示了用抗Her2抗体获得的结果(参见例如，WO 2006/031370 作为示例性参考文献)。

表

已发现表现出从FcRn柱上洗脱较晚的抗体，即，在FcRn柱上具有更长保留时间的抗体，具有更长的体内半衰期。体内数据显示在下表中。

表

术语YTE-突变体表示三突变体M252Y/S254T/T256E。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于确定抗体的体内半衰期。

用野生型IgG和Fc部分具有YTE-突变的IgG变体进行的一系列体外和体内实验能够显示出在FcRn亲和色谱的发现与人FcRn转基因小鼠的体内药代动力学研究的发现之间的半定量相关性(Spiekerman,G.M.等人J. Exp.Med.196(2002)303-310；Dall’Acqua,W.F.等人，J.Biol.Chem.281 (2006)23514-23524)。YTE-突变导致显著延长的半衰期和较慢的血浆清除率。更长的体内半衰期对应于FcRn色谱中更长的保留时间。半衰期延长的改造了Fc的曲妥珠单抗变体最近表现出具有用流式细胞仪测量的、与 FcRn增强的体外结合(Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006) 1759-1769)。具有FcRn亲和力改善11倍的抗VEGF IgG1抗体贝伐珠单抗的变体表现出在人FcRn转基因小鼠中延长5倍的半衰期，和在食蟹猴中延长3倍的半衰期(Zalevsky,J.等人，Nat.Biotechnol.28(2010)157-159)。

已发现可以通过使用本文报道的FcRn柱，实现分析和去除IgG制品中的半抗体。图3显示了示例性的FcRn柱色谱。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于从IgG制品中去除半抗体。

已发现可以通过本文报道的FcRn色谱分离寡聚物和聚集体(参见图 4)。

本文报道的一个方面是包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料的用途，用于从IgG制品中去除抗体聚集体和抗体寡聚物。

已发现保留时间受被分析物分子中包括的Fc部分的数量的影响。通过使用含有一个或两个Fc部分的构建体显示(参见图5)。

已发现氧化作用对FcRn结合有影响，可以显示在FcRn柱上(参见图 6)。

已显示了抗体模式对FcRn柱的结合没有影响。杵-进-臼 (knob-into-hole)模式和一些双特异性抗体模式都显示出这一点。因此，可以使用FcRn柱评估新的抗体模式。

在一个实施方案中，复合物是单生物素化的。

在一个实施方案中，包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料具有在本文报道的方法和用途中进行至少 100个循环的稳定性。循环是从相应方法或用途的第一pH值至第二pH值的pH梯度，从而再生材料，除方法或用途的最终条件外，不再需要其他的条件改变。因此，在一个实施方案中，循环是从约pH值pH5.5至约pH 值pH8.8的pH梯度。

已发现在第252位的M变为H的氨基酸变换，和第428位由M变为 E的氨基酸变换导致缩短的保留时间(参见图7)。

具有氧化产物Met252和Met428的抗体样品示例了在SPR技术和 FcRn亲和色谱之间的差异。当样品的SPR分析检测到样品与参照标准相比约20％的相对结合差异时，并没有提供对该样品异质性的深入审视。相反，同一样品的FcRn亲和色谱展示出2个不同的峰，一个位于参照标准的保留时间处，第二个峰显著偏移到左侧，表示在较低pH下，受胁迫样品中的抗体与FcRn柱材料的较弱的相互作用。

本文报道的包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料可用于分离/分开抗体片段，因此，提供了常规蛋白 A亲和色谱的备选方案。除了使用本文报道的色谱材料外，分开可以在比常规蛋白A亲和色谱更生理学的条件，如pH值，下实现。

包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料可用于确定/分开/富集包含修饰的抗体种类，例如氧化作用、电荷变体、糖基化和脱酰胺化。可以根据选定的pH梯度(起始/终止pH值)，使用包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料富集某些抗体种类。

包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料可用于通过分子量变化/差异，分离/富集抗体种类。

包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料可用于通过分子中的FcRn结合位点数量，分离/富集抗体。

包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料可用于分离氨基酸修饰。包含新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白的非共价复合物作为配体的色谱材料可用于分离/分开双特异性抗体错配，如臼-臼二聚体和半抗体。

具体实施方案

1、新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的固定化非共价复合物的用途，用作在具有正线性pH梯度的亲和色谱中的亲和色谱配体。

2、根据项目1的用途，其特征是其在用于分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽的具有正线性pH梯度亲和色谱中。

3、根据项目1至2的任一项的用途，其特征是新生儿Fc受体和β-2- 微球蛋白彼此独立的是人来源、或小鼠来源、或食蟹猴来源、或大鼠来源、或兔来源的。

4、根据项目1至3的任一项的用途，其特征是β-2-微球蛋白来自与新生儿Fc受体相同的物种。

5、根据项目1至4的任一项的用途，其特征是新生儿Fc受体和β-2- 微球蛋白是人野生型新生儿Fc受体和人野生型β-2-微球蛋白，彼此独立的具有0至10个氨基酸残基修饰。

6、根据项目1至5的任一项的用途，其特征是新生儿Fc受体(FcRn) 和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是与固相结合的。

7、根据项目6的用途，其特征是固相是色谱材料。

8、根据项目6至7的任一项的用途，其特征是新生儿Fc受体(FcRn) 和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是生物素化的，而固相是用链霉亲和素衍生化的。

9、根据项目1至8的任一项的用途，其特征是pH梯度是从第一pH 值至第二pH值，其中第一pH值是从约pH3.5至约pH7.5，第二pH值是从约pH6.0至约pH9.5。

10、根据项目1至9的任一项的用途，其特征是第一pH值是约pH5.5，第二pH值是约pH8.8。

11、根据项目1至10的任一项的用途，其特征是所述用途是用于通过确定抗体和参照抗体的保留时间的比例，确定抗体的体内半衰期。

12、根据项目1至10的任一项的用途，其特征是所述用途是用于确定抗体的甲硫氨酸氧化作用。

13、根据项目1至10的任一项的用途，其特征是所述用途是用于确定抗体的寡聚化水平。

14、根据项目1至10的任一项的用途，其特征是所述用途是用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的修饰的抗体或修饰的融合多肽的文库，对于那些与亲本抗体或亲本融合多肽相比针对FcRn具有改变的结合亲和力的修饰的抗体或修饰的融合多肽而言，其至少包含Fc区的FcRn结合部分。

15、根据项目1至10的任一项的用途，其特征是所述用途是用于鉴别至少包括Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽，所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体改变的结合。

16、根据项目1至10的任一项的用途，其特征是所述用途是用于从 IgG制品中去除半抗体。

17、根据项目1至10的任一项的用途，其特征是所述用途是用于从 IgG制品中去除抗体聚集体和抗体寡聚物。

18、根据项目1至17的任一项的用途，其特征是所述抗体是单特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或双特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或三特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或四特异性抗体或融合多肽的抗体片段。

19、新生儿Fc受体(FcRn)和β-2-微球蛋白(b2m)的固定化的非共价复合物的用途，用于在具有负线性pH梯度的亲和色谱中作为亲和色谱配体。

20、根据项目19的用途，其特征是它是在具有负线性pH梯度的亲和色谱中用于分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽。

21、根据项目19至20的任一项的用途，其特征是新生儿Fc受体和β-2- 微球蛋白彼此独立的是人来源、或小鼠来源、或食蟹猴来源、或大鼠来源、或兔来源的。

22、根据项目19至21的任一项的用途，其特征是β-2-微球蛋白来自与新生儿Fc受体相同的物种。

23、根据项目19至22的任一项的用途，其特征是新生儿Fc受体和β-2- 微球蛋白是人野生型新生儿Fc受体和人野生型β-2-微球蛋白，彼此独立的具有0至10个氨基酸残基修饰。

24、根据项目19至23的任一项的用途，其特征是新生儿Fc受体(FcRn) 和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是与固相结合的。

25、根据项目24的用途，其特征是固相是色谱材料。

26、根据项目24至25的任一项的用途，其特征是新生儿Fc受体(FcRn) 和β-2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物是生物素化的，固相则是用链霉亲和素衍生的。

27、根据项目19至26的任一项的用途，其特征是pH梯度是从第一 pH值至第二pH值，其中第一pH值是从约pH7.0至约pH8.5，第二pH 值是从约pH5.5至约pH6.9。

28、根据项目19至27的任一项的用途，其特征是第一pH值是约pH 7.4，第二pH值是约pH6.0。

29、根据项目19至28的任一项的用途，其特征是用途是用于通过确定抗体和参照抗体的保留时间的比例，确定抗体的体内半衰期。

30、根据项目19至28的任一项的用途，其特征是所述用途是用于确定抗体的甲硫氨酸氧化作用。

31、根据项目19至28的任一项的用途，其特征是所述用途是用于确定抗体的寡聚化水平。

32、根据项目19至28的任一项的用途，其特征是所述用途是用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的修饰的抗体或修饰的融合多肽的文库，对于那些与亲本抗体或亲本融合多肽相比针对FcRn具有改变的结合亲和力的修饰的抗体或修饰的融合多肽而言，其至少包含Fc区的FcRn结合部分。

33、根据项目19至28的任一项的用途，其特征是所述用途是用于鉴别至少包括Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽，所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体改变的结合。

34、根据项目19至28的任一项的用途，其特征是所述用途是用于从 IgG制品中去除半抗体。

35、根据项目19至28的任一项的用途，其特征是所述用途是用于从 IgG制品中去除抗体聚集体和抗体寡聚物。

36、根据项目19至35的任一项的用途，其特征是所述抗体是单特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或双特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或三特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或四特异性抗体或融合多肽的抗体片段。

37、根据项目1至10、18、19至28和35的任一项的用途，其特征是所述用途是用于分离IgG1亚类的抗体和IgG3亚类的抗体。

38、人IgG1同种型的Fc区变体，其中第252位的氨基酸从甲硫氨酸变为组氨酸，第428位的氨基酸从甲硫氨酸变为谷氨酸。

1.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的融合多肽包含抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv和scFv片段，和下文所述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人，Nat.Med. 9(2003)129-134。对于scFv片段的综述，参见例如，Plueckthun,A.,In： The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg and Moore(编著),Springer-Verlag,New York(1994)，第269-315页；还参见WO 93/16185；和US 5,571,894和US5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论，参见 US 5,869,046。

双抗体是具有2个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人， Nat.Med.9(2003)129-134；和Hollinger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90(1993)6444-6448。Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134 中还描述了三抗体和四抗体。

单一结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人的单一结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如，US专利号6,248,516B1)。

可以通过各种技术制备抗体片段，所述技术包括但不限于通过如本文所述的完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)进行的生产。

2.嵌合的和人源化的抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合的抗体描述在例如US 4,816,567；和Morrison,S.L.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855中。在一个实例中，嵌合抗体包括非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类例如猴子的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，它的类或亚类已经从亲本抗体改变。嵌合的抗体包括它的抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包括一个或多个可变结构域，在所述可变结构域中的 HVR(例如，CDR)(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被用来自非人抗体(例如， HVR残基来源的抗体)的相应残基取代，以例如重建或改善抗体的特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法在例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front. Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并进一步描述在例如Riechmann,I. 等人，Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337；US 7,527,791；US 6,982,321 和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人，Methods 36(2005)25-34(描述了 SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498 (描述了“重修表面”)；Dall’Acqua,W.F.等人，Methods 36(2005)43-60 (描述了“FR改组”)；和Osbourn,J.等人，Methods 36(2005)61-68与 Klimka,A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述了FR改组的“指导选择”方法)。

可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用"最佳拟合"方法选择的构架区(参见例如Sims,M.J.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；源自人抗体特定亚类的轻链或重链可变区的共有序列的构架区(参见例如 Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta, L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变) 的构架区或人种系构架区(参见例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front. Biosci.13(2008)1619-1633)；和源自筛选FR文库的构架区(参见例如 Baca,M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人， J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。

3.人抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体一般描述在van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374；和Lonberg,N., Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。

可以通过对转基因动物施用免疫原，制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰以对抗原攻击应答来产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部的或部分的人免疫球蛋白基因座，其替换了内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座一般是已经失活的。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23 (2005)1117-1125。还参见例如US 6,075,181和US 6,150,584，描述了 XENOMOUSETM技术；US 5,770,429，描述了技术；US 7,041,870，描述了K-M技术；和US 2007/0061900，描述了技术。例如，通过不同的人恒定区组合，可以进一步修饰由此类动物产生的完整抗体的人可变区。

还可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(参见例如，Kozbor,D.,J. Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.,等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc., New York(1987)，pp.51-63；和Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991) 86-95)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述在Li,J.等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中。额外的方法包括描述在例如US 7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,J., Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(描述了人-人杂交瘤)中的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)还描述在Vollmers,H.P.和Brandlein,S., Histology and Histopathology 20(2005)927-937；和Vollmers,H.P.和 Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191中。

还可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列，产生人抗体。然后，可以组合此类可变结构域序列与所希望的人恒定结构域。下文描述了从抗体文库选择人抗体的技术。

4.文库衍生的抗体

本发明的抗体可以通过筛选组合文库中具有所希望活性的抗体而分离。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库和筛选此类文库中具有所希望的结合特征的抗体的多种方法。此类方法在例如Hoogenboom,H.R. 等人，Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中进行了综述，并进一步描述在例如McCafferty,J.，等人，Nature 348(1990)552-554； Clackson,T.，等人，Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.，等人，J. Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.，Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.，等人，J.Mol.Biol.338 (2004)299-310；Lee,C.V.等人，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093； Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；和Lee, C.V.，等人，J.Immunol.Methods 284(2004)119-132。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH 和VL基因的所有组成成分，并在噬菌体文库中随机重组，然后可如Winter, G.，等人，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455所述筛选在所述文库中结合抗原的噬菌体。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段展示抗体片段。来自免疫源的文库提供了对免疫原的高亲和力的抗体，而不需要构建杂交瘤。备选地，如Griffiths,A.D.，等人，EMBO J.12(1993)725-734 所述，可以克隆初生的所有组成成分(例如，从人)，以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原而不用任何免疫的单一来源抗体。最后，如 Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388中描述的，还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因片段，和使用含有随机序列的PCR引物以编码高可变CDR3区且在体外实现重排，来合成地制备初生文库。描述了人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如US 5,750,373； US 2005/0079574；US 2005/0119455；US 2005/0266000；US 2007/0117126； US 2007/0160598；US 2007/0237764；US 2007/0292936和US 2009/0002360。

分离自人抗体文库的抗体或抗体片段被认为是本文中的人抗体或人抗体片段。

5.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合同一抗原上的两个不同的表位。双特异性抗体还可以用于定位细胞毒性剂至表达抗原的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。

制备多特异性抗体的技术包括但不限于两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540，WO 93/08829，和Traunecker,A.等人，EMBO J.10 (1991)3655-3659)和“knob-in-hole”改造(参见例如，US 5,731,168)。还可以如下制备多特异性抗体，通过改造静电指向效应(electrostatic steering effect)来制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如，US 4,676,980，和Brennan,M.等人， Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny,S.A.，等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用 "双抗体"技术来制备双特异性抗体片段(参见例如，Holliger,P.等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如，Gruber,M.等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；如例如Tutt,A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。

具有三个或四个功能性抗原结合位点的改造抗体，包括“Octopus抗体”(参见例如，US 2006/0025576)也包括在本文中。

本文的抗体或片段还包括“双作用的Fab(Dual Acting Fab)”或 “DAF”，其包含结合不同抗原的抗原结合位点(例如参见US 2008/0069820)。

本文的抗体或片段还包括描述在WO 2009/080251；WO 2009/080252； WO 2009/080253；WO 2009/080254；WO 2010/112193；WO 2010/115589； WO 2010/136172；WO 2010/145792和WO 2010/145793中的多特异性抗体。

6.抗体变体

在某些实施方案中，考虑了在本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，所希望的是改进抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入恰当的修饰，或通过肽合成，来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如在抗体的氨基酸序列中的残基缺失和/ 或插入和/或取代。可以产生缺失、插入和取代的任意组合，以获得最终的构建体，只要最终的构建体具有所希望的特征，例如结合抗原。

a)取代、插入和缺失变体

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目标位点包括HVR和FR。示例性的改变显示在表1的小标题 “示例性取代”下，并在下文中参照氨基酸侧链类别进一步描述。保守性取代显示在表1的小标题“优选的取代”下。可以向目标抗体中导入氨基酸取代，并筛选产物的理想活性，例如，保持的/改善的抗原结合、减少的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

表

氨基酸可以根据共有的侧链特性分类：

(1)疏水性：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；

(2)中性亲水性：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；

(3)酸性：Asp,Glu；

(4)碱性：His,Lys,Arg；

(5)影响链定位的残基：Gly,Pro；

(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe.

非保守取代将需要将这些种类之一的成员调换为另一种类的成员。

一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区(HVR)残基。一般而言，选择用于进一步研究的而得到的变体相对于亲本抗体具有某些生物学特性的修饰(例如，改进)(例如，增加的亲和力,降低的免疫原性)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学性质。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以是例如使用如本文所述的基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简而言之，突变一个或多个HVR残基，在噬菌体上展示变体抗体，并筛选特定的生物学活性(例如，结合亲和力)。

可以产生HVR中的改变(例如，取代)，来例如提高抗体亲和力。可以产生HVR的“热点”和/或SDR(a-CDR)中的这类改变，所述热点即：由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如， Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，并测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。例如在Hoogenboom,H.R.等人，在 Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中，已经描述了通过构建和再选择次级文库进行亲和力成熟。

在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法的任一种向所选择的成熟的可变基因中引入多样性(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸指导的诱变)。然后产生次级文库。之后，筛选该文库，以鉴定具有所希望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，在所述方法中随机化若干HVR残基(例如，每次4-6个残基)。例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模，可以特异地鉴定抗原结合所涉及的HVR残基。特别是经常靶定CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以存在一个或多个HVR中的取代、插入或缺失，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以产生HVR 中的基本不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守取代)。此类改变可以位于HVR的“热点”或SDR以外。在某些实施方案中，在上文提供的变体VH和VL序列中，每个HVR都是未改变的，或含有不超过1、2或3个氨基酸的取代。

用于鉴定可以靶向诱变的抗体残基或区域的有用的方法被称为"丙氨酸扫描诱变"，其如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science 244(1989) 1081-1085所述。在这种方法中，鉴定并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多聚丙氨酸)替换残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，如arg、 asp、his、lys和glu)，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。还可以在对起始取代显示功能性敏感的氨基酸位置引入其他取代。备选地或额外地，抗原-抗体复合体的晶体结构用于鉴别抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基，作为取代的候选者。可以筛选变体，以确定其是否具有所希望的性质。

氨基酸序列的插入物包括长度范围从1个残基至含有上百个残基或以上的多肽的氨基端和/或羧基端的融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶(例如，用于ADEPT) 或增加抗体的血清半衰期的多肽。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，本文提供的抗体被改变以增加或降低抗体糖基化程度。通过改变氨基酸序列，使得产生或去除了一个或多个糖基化位点，可以方便地实现在抗体中添加或缺失糖基化位点。

当抗体包括Fc区时，可以改变与其连接的糖。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、双触角的寡糖，所述寡糖一般通过N-连接连接到Fc区的CH2结构域的Asn297上。参见例如Wright,A.和Morrison, S.L.TIBTECH 15(1997)26-32。寡糖可以包括多种糖，例如甘露糖、N- 乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双触角的寡糖结构的“茎” 中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明抗体中的寡糖的修饰，以产生具有某些改良性质的抗体变体。

在一个实施方案中，提供的抗体变体具有缺少与Fc区(直接或间接) 连接的岩藻糖的糖结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以从1％至 80％，从1％至65％，从5％至65％，或从20％至40％。相对于例如如WO 2008/077546中描述的，通过MALDI-TOF质谱测量的与Asn 297 连接的全部糖结构(例如，复杂的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，通过计算在Asn297处的糖链内的岩藻糖平均量，来确定岩藻糖的量。 Asn297指位于Fc区的约第297位(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的较小的序列变化，Asn297还可以位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即，在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改良的ADCC功能(参见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体的出版物实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140； US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119； WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742； WO 2002/031140；Okazaki,A.等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249； Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系实例包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO 细胞(Ripka,J.等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312,，尤其是实施例11)，和敲除细胞系，例如敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如 Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y. 等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。

还提供了具有二分寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如，在所述二分寡糖中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc二分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改良的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述在例如WO 2003/011878；US 6,602,684和US 2005/0123546 中。还提供了具有寡糖中的至少1个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。此类抗体变体可具有改良的CDC功能。此类抗体变体描述在例如WO 1997/30087；WO 1998/58964和WO 1999/22764中。

c)Fc区变体

在某些实施方案中，可以在本文提供的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4 Fc区)。

在某些实施方案中，本发明考虑了具有一些但并非全部效应子功能的抗体变体，使其成为这样的应用的所希望的候选者，在所述应用中，抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必需或有害的。可以进行体外和/或体内的细胞毒性测定，以证实CDC和/或 ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留了FcRn 结合能力。介导ADCC的主要细胞——NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.， Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的464页的表3中概括了在造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述在US 5,500,362(参见例如，Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp. Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以使用非放射性的测定方法 (参见例如，用于流式细胞仪的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定 (CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有效的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，例如，如Clynes,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656 中公开的，可以评估体内，例如在动物模型中的目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定，以证实抗体不能结合C1q，因而缺少CDC活性。参见例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体的激活，可以进行CDC测定(参见例如， Gazzano-Santoro,H.等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg, M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie, Blood 103(2004)2738-2743)。还可以使用本领域已知的方法，确定FcRn 的结合和体内清除率/半衰期(参见例如，Petkova,S.B.等人，Int.Immunol. 18(2006)1759-1769)。

具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、 297、327和329中的一个或多个取代的那些抗体(US 6,737,056)。此类 Fc突变体包括具有在两个或多个氨基酸位置265、269、270、297和327 处取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的、所称作“DANA” 的Fc变体(US 7,332,581)。

描述了对FcR具有改进的或降低的结合的某些抗体变体。参见例如， US 6,737,056；WO 2004/056312；和Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276 (2001)6591-6604。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改进了ADCC的氨基酸取代的Fc区，所述取代例如，在Fc区的位置第298位、第333位和 /或第334位的取代(残基的EU编号)。

在一些实施方案中，例如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E. 等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中描述的，在Fc区产生的改变导致改变的(即，增强的或减弱的)C1q结合和/或补体依赖细胞毒性 (CDC)。

在US 2005/0014934中描述了这样的抗体，所述抗体具有增加的半衰期，和对新生儿Fc受体(FcRn)增强的结合，所述FcRn负责将母体IgG 转移到胎儿中(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593和Kim, J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含具有在其中一个或多个取代的Fc区，所述取代增强了Fc区对FcRn的结合。此类 Fc变体包括具有在以下的一个或多个Fc区残基上取代的那些变体：238、 252、253、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、 340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc区残基434(US 7,371,826)。

还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821和WO 94/29351关于Fc区变体的其他实例。

d)半胱氨酸改造的抗体变体

在某些实施方案中，理想的是生成半胱氨酸改造的抗体，例如 “thioMAb”，所述抗体中的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定的实施方案中，取代的残基出现在抗体的可及位点上。通过用半胱氨酸取代这些残基，从而将反应性巯基定位在抗体的可及位点上，并可用于缀合抗体与其他部分，如药物部分或接头-药物部分，生成本文另外描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸取代一个或多个下列残基：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(Kabat编号)；和重链Fc区的 S400(EU编号)。可以如US 7,521,541所述，生成半胱氨酸改造的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体，使其含有本领域已知的和易于获得的额外的非蛋白性部分。适用于衍生抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、多聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)、以及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮) 聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。由于在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可具有生产优势。聚合物可以是任何分子量，可以是分支的或不分支的。与抗体连接的聚合物数量可以改变，如果连接了一个以上的聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以基于以下考虑，确定用于衍生的聚合物的数量和/或类型，包括但不限于待改善的抗体的特定特性或功能，不论在定义条件的治疗中是否使用抗体衍生物，等等。

在另一个实施方案中，提供了通过暴露于照射下，选择性加热抗体与非蛋白性部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白性部分是碳纳米管 (Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。照射可以是任何波长，包括但不限于这样的波长，所述波长对普通细胞无害但将非蛋白性部分加热至杀死与抗体-非蛋白性部分相邻的细胞的温度。

III.重组方法和组合物

Kohler和Milstein(Nature 256(1975)495-497)首次报道了用于生产单克隆抗体的方法。之后，已报道了通过稳定的导入编码抗体的核酸(DNA)，用杂交瘤细胞生产重组抗体(参见Oi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80 (1983)6351-6355)。

可以分离抗体的编码核酸(编码完整抗体或可变结构域)，使用常规方法从抗体生产细胞测序。在分离后，可以将编码核酸置入一个或多个表达载体中。如果仅分离可变结构域的编码核酸，则表达载体还包括分别编码重链和/或轻链恒定区的核酸(参见例如US 5,658,570)。可以将表达载体转染到不另外分泌抗体的原核宿主细胞(大肠杆菌(E.coli))或真核宿主细胞 (CHO、HEK、BHK、SP2/0)中。

如果编码核酸源自展示文库，如噬菌体展示文库、酵母展示文库，或一般的细胞表面展示文库，则可以将其直接克隆到表达载体中。

例如如US专利号4,816,567中描述的，可以使用重组方法和组合物产生抗体。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含 (例如，已经被转化了):(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的 VL的氨基酸序列的核酸的第一个载体，和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二个载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20 细胞)。在一个实施方案中，提供了制备本文报道的抗体的方法，其中所述方法包括在适合表达抗体的条件下，培养包含编码上文提供的抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。

为了重组产生本文报道的抗体，分离例如上文所述的、编码抗体的核酸，并将其插入到用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达的一个或多个载体中。使用常规方法可以容易地分离此类核酸并进行测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。

用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237；US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,在 Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编著),Humana Press, Totowa,NJ,(2003)，第245-254页中，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。)在表达后，抗体可以以可溶的级分从细菌细胞浆中被分离，并可以被进一步纯化。

除原核细胞外，真核微生物如丝状真菌或酵母，包括糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，导致产生的抗体具有部分或完全的人糖基化模式。参见Gerngross,T.U., Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006) 210-215。

用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了多种杆状病毒株，其可用于与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如US 5,959,177； US 6,040,498；US 6,420,548；US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

还可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，可使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(描述在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中的293或293细胞)；幼地鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述在例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252 中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人子宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；描述在例如Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68 中的TRI细胞；MRC 5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G. 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合抗体的产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.,(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。

III.免疫缀合物

本发明还提供了包含与一个或多个细胞毒性剂缀合的本文报道的抗体免疫缀合物，如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于类美登醇(maytansinoid)(参见 US 5,208,020、US 5,416,064和EP 0 425 235 B1)；auristatin，如单甲基 auristatin药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483、 US 5,780,588和US 7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素 (calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、 US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001和US 5,877,296； Hinman,L.M.等人，Cancer Res.53(1993)3336-3342；和Lode,H.N.等人， Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽环霉素(anthracycline)，如道诺霉素 (daunomycin)或阿霉素(doxorubicin)(参见Kratz,F.等人，Curr.Med. Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.16 (2006)358-362；Torgov,M.Y.等人，Bioconjug.Chem.16(2005)717-721； Nagy,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik, G.M.等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D. 等人，J.Med.Chem.45(2002)4336-4343；和U.S.专利号6,630,579)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯(trichothecene)；和CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包括与酶促活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，包括但不限于白喉毒素A链(diphtheria A chain)、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α- 八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草(Saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯毒素 (tricothecenes)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包括与放射性原子缀合的本文所述的抗体，形成了放射性缀合物。可获得多种放射性同位素用于生产放射性缀合物。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、 Pb²¹²和Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，可包括用于闪烁法研究的放射性原子，例如TC^99m或I¹²³，或用于核磁共振(NMR) 成像(也被称为磁共振成像，MRI)的自旋标志物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以使用多种多种双功能蛋白质偶联剂，制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、琥珀酰亚胺 -4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯HCl)、活化酯(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯 (如甲苯2,6-二异氰酸酯(toluene 2,6-diisocyanate))，和双活性氟化合物(如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta,E.S.等人，Science 238(1987) 1098-1104所述，制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于缀合放射性核素与抗体的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞内的细胞毒性药物释放的“可切割的接头”。例如，可使用酸-不稳定型接头、肽酶敏感型接头、光不稳定型接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari,R.V.等人， Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。

本文中的免疫缀合物或ADC明确的考虑但不限于用交联剂制备的这类缀合物，所述交联剂包括但不限于可商购的BMPS、EMCS、GMBS、 HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、 SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯砜)苯甲酸)(例如来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。

IV.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，任何本文提供的抗体都可用于检测其抗原在生物学样品中的存在。本文中使用的术语“检测”涵盖了定量或定性的检测。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织。

在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的本文报道的抗体。在另一方面，提供了检测生物学样品中的抗原存在的方法。在某些实施方案中，方法包括在允许抗体与其抗原结合的条件下，将生物学样品与本文所述的抗体接触，和检测在抗体与抗原之间是否形成了复合物。这类方法可以是体外或体内的方法。

在某些实施方案中，提供了本文报道的标记的抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光、生色、电子密度、化学发光和放射性的标记)，以及间接检测的部分，如酶或配体，例如通过酶促反应或分子的相互作用。示例性的标记包括但不限于放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I；荧光团如稀土螯合物或荧光素(fluorescein)及其衍生物；罗丹明及其衍生物；丹磺酰；伞形酮；荧光素酶例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶 (US 4,737,456)；荧光素(luciferin)、2,3-二氢酞嗪二酮 (2,3-dihydrophthalazinedione)；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β- 半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；蔗糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶；与使用过氧化氢氧化染料前体的酶偶联，所述酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基等。

V.药物制剂

通过混合具有所希望纯度的抗体与一个或多个任选的可药用载体 (Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(编著)(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式，制备本文描述的抗体的药物制剂。可药用的载体在所使用的剂量和浓度下一般对接受者是无毒的，并且可药用的载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化己烷双胺、苯扎氯胺、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他的糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇 (PEG)。本文中的示例性的可药用载体还包括间质性药物分散剂，如可溶性中性活性的透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如，人可溶性PH-20 透明质酸酶糖蛋白，例如rhuPH20(Baxter International, Inc.)。某些示例性的sHASEGP(包括rhuPH20)和使用方法描述在US 专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。

在一个方面，sHASEGP与一个或多个额外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

US 6,267,958中描述了示例性的冻干的抗体制剂。水性抗体制剂包括 US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的，后者的制剂包括组氨酸醋酸盐缓冲液。

对于所治疗的特定适应症，本文中的制剂还可以根据需要含有一种以上的活性成分，优选地是具有互补的活性且彼此无不利的影响的那些活性成分。此类活性成分以对于预期目的有效的量合适地组合存在。

在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米囊)或粗滴乳状液中，活性成分可以被捕获在通过例如凝聚技术或界面聚合法制备的微胶囊中，分别例如为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基异丁烯酸微胶囊。此类技术公开在Remington's Pharmaceutical Sciences,，第16版，Osol,A.(编著)(1980)中。

可以制备缓释制品，缓释制品的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半渗透基质，所述基质是成型物体的形式，例如膜或微胶囊。

用于体内施用的制剂一般是无菌的。可以通过例如无菌过滤膜过滤，容易地实现灭菌。

VI.物品

在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的物品。物品包含容器，和位于容器上，或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料，如玻璃或塑料制成。该容器内有组合物，并具有无菌入口 (例如，容器可以是具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)，其中所述组合物自身或与另一种组合物组合后，可有效治疗、预防和/或诊断病症。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示了组合物用于治疗的病症选项。此外，物品可以包含(a)其中含有组合物的第一个容器，其中所述组合物包括本发明的抗体，和(b)其中含有组合物的第二个容器，其中所述组合物包含其他的细胞毒性剂或另外的治疗剂。在本发明的这一实施方案中的物品可以进一步地包含这样的包装插页，其指示组合物可用于治疗特定的病症。备选地或额外地，物品可以进一步地包含含有可药用的缓冲液的第二个(或第三个)容器，所述缓冲液例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、任氏液和葡萄糖溶液。还可以包括从商业和用户的观点所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。

可理解，任何上述物品可包括本发明的免疫缀合物替代本文报道的抗体，或除本文报道的抗体外还包括本发明的免疫缀合物。

提供下列实施例、附图和序列帮助理解本发明，发明的实际范围提出在所附权利要求中。应理解，可以在不脱离发明精神的条件下，对所述方法进行修饰。

实施例

方法

电子喷雾离子化质谱(ESI-MS)

通过加入0.5μL N-Glycanase plus(Roche)和磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.1)，将蛋白质等分试样(50μg)去糖基化，获得体积为115μL的终样品。在37℃下孵育混合物18h。之后，为了还原和变性，加入60μL在4M胍 *HCl(Pierce)中的0.5M TCEP(Pierce)和50μL 8M胍*HCl。在37℃下孵育混合物30min。通过离子排阻色谱(Sepharose G-25，等度，含2％甲酸的40％乙腈)将样品脱盐。在配备了纳米ESI源(TriVersa NanoMate, Advion)的Q-TOF仪器(maXis,Bruker)上，记录ESI质谱(+ve)。MS参数设置如下：Transfer：Funnel RF,400 Vpp；ISCID Energy,0eV；Multipole RF,400 Vpp；Quadrupole：Ion Energy,4.0eV；Low Mass,600m/z； Source：Dry Gas,8L/min；干燥气体温度，160℃；Collision Cell：Collision Energy,10eV；Collision RF：2000Vpp；Ion Cooler：Ion Cooler RF,300 Vpp；Transfer Time：120μs；Pre Puls Storage,10μs；扫描范围m/z 600 至2000。使用内部研发的软件(MassAnalyzer)进行数据评估。

FcRn表面等离振子共振(SPR)分析

使用BIAcore T100仪器(BIAcore AB,Uppsala,Sweden)，通过表面等离振子共振(SPR)技术，分析野生型抗体和突变体与FcRn的结合特性。该系统是良好建立用于研究分子的相互作用的。其允许连续的实时监控配体/ 被分析物的结合，从而在多种测定条件下确定动力学参数。SPR-技术是基于测量靠近金包被的生物传感器芯片表面的折射率的。折射率的改变表示由于固定化的配体与注射到溶液中的被分析物之间的相互作用导致的表面上质量的改变。如果分子与固定在表面上的配体结合，则质量增加，如果解离，则质量减少。在本测定中，通过胺将FcRn受体固定在BIAcore CM5- 生物传感芯片(GE Healthcare Bioscience,Uppsala,Sweden)上，偶联水平为 400响应单位(RU)。测定在室温下进行，以PBS，0.05％Tween20 pH 6.0(GE Healthcare Bioscience)作为走样和稀释缓冲液。在室温下，以50 μL/min的流速注射200nM天然的或氧化的抗体样品。解离时间是180s，解离相需要360s。通过短时间注射HBS-P，pH8.0，实现芯片表面再生。通过比较注射180s后的生物学响应信号高度与注射300s后的生物学响应信号高度，评估SPR-数据。相应的参数是RU最大水平(注射180s后)和末期稳定性(注射结束后300s)。

实施例1

制备FcRn亲和柱

FcRn在HEK293细胞中的表达

用含有FcRn的编码序列和β-2-微球蛋白的编码序列的两种质粒转染 HEK293细胞，瞬时表达FcRn。在振荡烧瓶中培养转染的细胞，36.5℃， 120rpm(振幅5cm)，80％湿度和7％CO₂。每2-3天稀释一次细胞，至密度为3至4*10⁵细胞/ml。

为了瞬时表达，用8l培养体积在36.5℃，pH7.0±0.2，pO₂ 35％(用 N₂和空气通气，总气流200ml min^-1)和搅拌速度100-400rpm下开始14l 不锈钢生物反应器。当细胞密度达到20*10⁵细胞/ml时，将10mg质粒 DNA(等摩尔量的两种质粒)稀释在400ml Opti-MEM(Invitrogen)中。向该混合物中加入20ml的293fectin(Invitrogen)，然后室温孵育15分钟，再转移到发酵罐中。从第二天开始，以连续模式向细胞供应营养物：添加喂养溶液的速度为每天500ml，保持所需的葡萄糖在高于2g/l的水平。在转染后第7天，使用具有1l容器的回旋头式离心机(swing head centrifuge) 收获上清液：4000rpm，90分钟。通过Sartobran P滤纸(0.45μm+0.2μm, Sartorius)澄清上清液(13L)，并从中纯化FcRnβ-2-微球蛋白复合物。

生物素化新生儿Fc受体

在如下纯化后，将HEK293细胞中与β₂-微球蛋白共表达的含His-Avi 标签的FcRn的可溶性胞外结构域生物素化：

根据生产商的说明(Bulk BIRA)，使用Avidity的生物素化试剂盒，将 1.2mg至12mg FcRn/β₂-微球蛋白在5ml 20 mM柠檬酸钠缓冲液，pH5.5 中生物素化，所述缓冲液含有150mM KCl，250μl PBS和1全蛋白质抑制剂片剂(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)。在室温下进行生物素化反应过夜。在4℃下，用包含150mM NaCl，pH7.5的20mM 磷酸钠缓冲液透析修饰的蛋白质过夜，去除多余的生物素。

与链霉亲和素琼脂糖偶联

向生物素化和透析过的受体(1.2mg至12mg FcRn/β₂-微球蛋白，标准分析用途选择3mg)中加入1克链霉亲和素琼脂糖(GE Healthcare)，振荡孵育2小时。将受体衍生化的琼脂糖填充到1ml XK柱(GE Healthcare) 中。

实施例2

使用FcRn亲和柱色谱

将受体衍生化的琼脂糖填充到1ml XK柱(GE Healthcare)中，然后用含有150mM NaCl，pH5.5的20mM 2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)缓冲液平衡FcRn柱。

条件:

柱尺寸：50mm x 5mm

柱床高度：5cm

上样：50μg样品

平衡缓冲液：20mM MES，含150mM NaCl，调节至pH5.5

洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl，含150mM NaCl，调节至pH8.8

洗脱：7.5CV平衡缓冲液，在30CV中至100％洗脱缓冲液，10CV 洗脱缓冲液

将含有50至100μg蛋白质的抗体或融合蛋白样品调节至pH5.5，并使用explorer 10 XT或Dionex Summit(Dionex,Idstein,Germany) 施加到FcRn柱上。然后，用5-10倍柱体积的平衡缓冲液20mM MES， 150mM NaCl，pH5.5洗涤具有5cm柱床高度的柱子。在30倍柱体积内，用pH梯度至20mM Tris/HCl，150mM NaCl，pH8.8，洗脱亲和结合的含Fc的蛋白质。为了完整的洗脱修饰的抗体，梯度中pH增加至pH8.8。实验在室温下进行。通过连续测量280nm的吸光度，获得洗脱曲线。在注射样品后，被分析物的峰X到达检测器所花费的时间被称为保留时间。

实施例3

FcRn柱上的保留时间与体内半衰期的关联

在单次i.v.施用10mg/kg(n＝8)后，在人FcRn转基因C57BL/6J小鼠中测量体内半衰期，并与FcRn柱上的保留时间比较(参见表格)。发现表现出从FcRn柱上洗脱较晚的抗体在FcRn转基因小鼠中具有更长的半衰期。

表

实施例4

纯化人FcRn、小鼠FcRn和食蟹猴FcRn

在4℃下，将含有六组氨酸标记的蛋白质的澄清上清液上样到Ni-NTA 亲和色谱树脂(Qiagen,Hanbrechtikon,Switzerland)上。在用20mM磷酸钠缓冲液洗涤步骤后，所述缓冲液包含500mM NaCl，pH7.4，还分别包含20mM和100mM咪唑，使用含300mM咪唑的相同缓冲液分批洗脱，以2ml/min的流速在Prime色谱系统(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)上洗脱蛋白质。混合级分，在尺寸排阻色谱 (SuperdexTM 200,GE Healthcare,Zurich,Switzerland)上在含有500mM NaCl的磷酸钠缓冲液中进一步纯化。使用Nanodrop分光光度计(Nanodrop Technologies,Wilmington,DE)定量纯化的蛋白质，并在变性和还原条件下，在MES缓冲液中在NuPAGE 4–12％Bis–Tris凝胶上，通过SDS PAGE分析。

实施例5

小鼠和食蟹猴FcRn亲和柱色谱

在下表中，给出了示例性的人抗体在包含食蟹猴FcRn的亲和柱上的保留时间。使用下列条件获得数据：洗脱缓冲液：20mM TRIS/HCl，150 mM NaCl，pH8.5。其他描述：参见实施例2。术语YTE-突变体表示三突变体M252Y/S254T/T256E。

抗体	保留时间[min]
		抗Aβ抗体(野生型)	48.8
抗Aβ抗体(YTE-突变体)	57.4
		抗IGF-1R抗体(野生型)	51.2
抗IGF-1R抗体(YTE-突变体)	63.0

在下表中，给出了示例性的人抗体在鼠FcRn上的保留时间。使用下列条件获得数据：1.2mg偶联在1ml Sepharose上的受体。洗脱缓冲液： 20mM TRIS/HCl，150mM NaCl，pH8.5。其他描述：参见实施例2。表中不包括YTE-突变体，因为除非将洗脱缓冲液调节至9.5，否则其不能被洗脱。

抗体	保留时间[min]
		抗Aβ抗体(野生型)	54.7
抗IGF-1R抗体(野生型)	48.8

食蟹猴FcRn亲和柱的行为与涉及结合人源化抗体的人FcRn亲和柱相似。另一方面，由较晚的保留可见，人源化抗体与鼠FcRn柱的结合强于与人FcRn亲和柱的结合。

实施例6

生成抗体片段

按每50μg抗体加入1μg IdeS半胱氨酸蛋白酶，并在37℃孵育2h，切割用100mM Tris，pH8.0 1:1稀释的全长抗体，制备F(ab’)₂片段和Fc 区片段。使用Explorer色谱系统(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)，在尺寸排阻色谱(SEC)柱(Superdex 200,GE Healthcare,Zurich, Switzerland)上分离获得的切割产物F(ab’)₂和Fc，混合峰级分。基于保留时间，用同一柱子上的分子量标准鉴别2种切割产物。

全长抗体的保留时间变化显著。相反，所有测试抗体的相应Fc部分的保留时间彼此之间实质上没有区别(<1％)。

当使用纤溶酶切割全长抗体时，得到了相同的结果(数据未显示)。

实施例7

FcRn柱上的保留时间与氧化状态的关联

研究抗体的氧化作用对FcRn亲和色谱的保留时间的影响。通过将抗体在40℃下储藏2个月，观察到了IgG1抗体(1mg/ml)的氧化作用。通过 FcRn亲和色谱和FcRn表面等离振子共振(SPR)技术，分析未修饰的和氧化的抗体样品。通过肽图谱-电子喷雾离子化质谱(ESI-MS)表征抗体的氧化作用。

ESI-MS数据揭示了在40℃的加速条件下在缓冲液(20mM His/His*HCl，240mM海藻糖，0.02％聚山梨酯20)中储藏2个月后，约 50％的IgG1抗体重链的溶剂暴露的Met252和Met428残基被氧化。当将在40℃下受胁迫的含有氧化的抗体的样品和储藏在-80℃和25℃下的样品应用于在其上提前固定了FcRn的亲和柱时，可以分开2个主峰(图8)。图8的第二峰由2个实质上重叠的曲线组成，其中较长的保留时间对应于储藏在25℃和-80℃下的样品中的未修饰抗体的洗脱时间，而较早的洗脱峰代表Met252和Met428氧化的抗体。在受胁迫样品中用ESI-MS检测到的16Da质量迁移，支持了氧化的Met252和Met428的存在。在BIAcore 中通过SPR分析受胁迫(40℃)的抗体样品，显示用两种不同的抗体种类在 FcRn色谱中的传感图中的相同的应答模式，所述两种不同的抗体种类即，野生型抗体和Met252-与Met428-氧化的抗体(图9)。

实施例8

FcRn柱上的保留时间与聚集体形成的关联

针对抗IL13Rα抗体评估了抗体聚集体形成对亲和色谱中FcRn相互作用的影响。通过尺寸排阻色谱(SEC)分离抗体单体和聚集体级分，混合相应的峰。通过亲和色谱和SPR技术分析级分的FcRn相互作用。

使用尺寸排阻色谱(SEC)分离FcRn柱色谱的3种抗IL13Rα抗体级分，所述级分含有抗IL13Rα抗体单体和多聚的聚集体。基于色谱图的峰面积，用于FcRn亲和色谱的抗IL13Rα抗体样品含有57％的单体和43％的抗 IL13Rα抗体聚集体。对FcRn亲和色谱中未分级样品的分析揭示了2个具有不同保留时间的主峰(图10)。具有较长保留时间的较小的峰对应于聚集体级分的峰，而较快洗脱的峰的主要部分对应于单体级分。

在表面等离振子共振(SPR)分析中，比较抗IL13Rα抗体参照标准与2 种富集了聚集体(混合物1)和单体(混合物2)的不同的混合级分，和天然混合物。天然批次和混合级分的实际组成描述在下表中。

表：抗IL13Rα抗体的天然和富集的混合级分的组成

富集了单体的混合物2样品的传感图与在聚集体-混合物样品的传感图之后的抗IL13Rα抗体参照标准的传感图最接近。相反，富集了聚集体的混合物1的特征是SPR分析中与FcRn结合的几乎2倍高(图11)。

实施例9

人FcRn小鼠中的药代动力学研究

所有步骤都按Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(www.aaalac.org)的指导条例进行。研究由 Regional Council of Oberbayern,Germany授权。

在整个药代动力学研究中，使用雄性和雌性C57BL/6J小鼠(背景)；小鼠FcRn缺陷型，但其对人FcRn是半合子转基因(huFcRn(276)-/tg(30, 31))。

在施用时，动物体重在17至25g之间。通过尾静脉，以单次静脉推注给予各个抗体。由于小鼠的血液体积有限，需要3组、每组4只雄鼠和 4只雌鼠，来覆盖9个采样时间点，即，每只动物3个采样时间点。在施用后在下组中采集血样：组1，5min、24小时和336小时；组2，2小时、 168小时和504小时；组3，8小时、48小时和672小时。通过眼球后穿刺获得约100μL血样，在室温储藏60min进行凝血。在4℃下9,300xg离心3min，获得至少40μL血清样品，立即冷冻，并储藏在-20℃直到测定。

通过特异性针对施用抗体的抗原结合区(Fab)及其变体的抗原捕获的酶联免疫吸附测定(ELISA)，确定鼠血清中的人治疗性抗体的血清浓度。所有的试剂或样品都在室温下孵育，并在400rpm振荡。每个洗涤步骤包括3个循环。简而言之，用稀释在测定缓冲液中的生物素化的抗体，包被用链霉亲和素包被的微滴度板。在用磷酸缓冲的盐溶液-聚山梨酯 20(Tween20)洗涤后，加入各种稀释度的血清样品，孵育1h。在洗涤后，通过与缀合了地高辛配基的人Fcγ-特异性单克隆抗体Fab片段随后孵育，检测结合的人治疗性抗体，所述Fab片段不与小鼠IgG交叉反应。在洗涤后，加入缀合了辣根过氧化物酶(HRP)的抗地高辛配基的抗体，孵育1h。在洗涤后，加入ABTS(2,2-连氮基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸酯；Roche Diagnostics,Germany)作为HRP底物，形成显色的反应产物。用490nm的参照波长，读取得到的反应产物在405nm下的吸光度。重复分析所有的血清样品和阳性或阴性对照样品，并针对参照标准校准。

使用药代动力学评估程序WinNonlin^TM(Pharsight,St.Louis,MO, USA)，5.2.1版，通过非室分析，计算药代动力学参数。简而言之，通过从 0时至无限的线性梯形规则(具有线性插值)，计算浓度/时间曲线AUC(0-672) 下方的面积。表观的最终半衰期(T_1/2)源自等式：T_1/2＝ln2/λz。总的体清除率(CL)计算为剂量/AUC。通过ANOVA分析确定野生型抗体及其变体之间的药代动力学参数的统计学显著的差异。

小鼠FcRn缺陷的、但对人FcRn是半合子转基因的C57BL/6J小鼠 (huFcRn(276)-/tg)中的药代动力学研究显示，YTE突变增强了抗体的药代动力学(图12)。在统计学显著的水平，YTE突变体具有比野生型抗体高 1.74倍的AUC(0-672)、慢1.95倍的清除率和长2.2倍的末端半衰期(表)。

表在单次i.v.推注10 mg/kg至人FcRn转基因小鼠之后，通过ELISA 测量的血清浓度的非室分析，获得的野生型抗体及其三突变体YTE的药代动力学参数。平均值±SD，每组n＝8，与野生型抗体相比，显著性的 ANOVA分析(+++,p<0.001)。AUC(0-672)，0至672h的血清浓度-时间曲线下方面积。

Claims

1.与色谱材料结合的固定化的由新生儿Fc受体和β-2-微球蛋白组成的非共价复合物的用途，用于在具有正线性pH梯度的亲和色谱中作为亲和色谱配体，其中非共价复合物是单生物素化的，而色谱材料是用链霉亲和素衍生化的，其中所述非共价复合物通过链霉亲和素固定到固相。

2.根据权利要求1的用途，其特征是其在用于分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽的具有正线性pH梯度的亲和色谱中。

3.根据权利要求1或2的用途，其特征是新生儿Fc受体和 β-2-微球蛋白彼此独立的是人来源、或小鼠来源、或食蟹猴来源、或大鼠来源、或兔来源的。

4.根据权利要求1或2的用途，其特征是β-2-微球蛋白来自与新生儿Fc受体相同的物种。

5.根据权利要求1或2的用途，其特征是新生儿Fc受体和 β-2-微球蛋白是人野生型新生儿Fc受体和人野生型β-2-微球蛋白，各自彼此独立的具有0至10个氨基酸残基修饰。

6.根据权利要求1或2的用途，其特征是pH梯度是从第一pH值至第二pH值，其中第一pH值是从pH 3.5至pH 7.5，第二pH值是从pH 6.0至pH 9.5。

7.根据权利要求1或2的用途，其特征是第一pH值是pH 5.5，第二pH值是pH 8.8。

8.根据权利要求1或2的用途，其特征是所述用途是用于通过确定抗体和参照抗体的保留时间的比例，确定抗体的体内半衰期。

9.根据权利要求1或2的用途，其特征是所述用途是用于确定抗体的甲硫氨酸氧化作用。

10.根据权利要求1或2的用途，其特征是所述用途是用于确定抗体的寡聚化水平。

11.根据权利要求1或2的用途，其特征是所述用途是用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的修饰的抗体或修饰的融合多肽的文库，对于那些与亲本抗体或亲本融合多肽相比针对新生儿 Fc受体具有改变的结合亲和力的修饰的抗体或修饰的融合多肽而言，其至少包含Fc区的新生儿Fc受体结合部分。

12.根据权利要求1或2的用途，其特征是所述用途是用于鉴别至少包括Fc区的新生儿Fc受体结合部分的抗体或融合多肽，所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体改变的结合。

13.根据权利要求1或2的用途，其特征是所述用途是用于从IgG制品中去除半抗体。

14.根据权利要求1或2的用途，其特征是所述用途是用于从IgG制品中去除抗体聚集体和抗体寡聚物。

15.根据权利要求1或2的用途，其特征是所述抗体是单特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或双特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或三特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或四特异性抗体或融合多肽的抗体片段。

16.与色谱材料结合的固定化的新生儿Fc受体和β-2-微球蛋白的非共价复合物的用途，用于在具有负线性pH梯度的亲和色谱中作为亲和色谱配体，其中非共价复合物是单生物素化的，而色谱材料是用链霉亲和素衍生化的，其中所述非共价复合物通过链霉亲和素固定到固相。

17.根据权利要求16的用途，其特征是它是在具有负线性 pH梯度的亲和色谱中用于分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽。

18.根据权利要求16或17的用途，其特征是新生儿Fc受体和β-2-微球蛋白彼此独立的是人来源、或小鼠来源、或食蟹猴来源、或大鼠来源、或兔来源的。

19.根据权利要求16或17的用途，其特征是β-2-微球蛋白来自与新生儿Fc受体相同的物种。

20.根据权利要求16或17的用途，其特征是新生儿Fc受体和β-2-微球蛋白是人野生型新生儿Fc受体和人野生型β-2-微球蛋白，各自彼此独立的具有0至10个氨基酸残基修饰。

21.根据权利要求16或17的用途，其特征是新生儿Fc受体和β-2-微球蛋白的非共价复合物是与固相结合的。

22.根据权利要求21的用途，其特征是固相是色谱材料。

23.根据权利要求21的用途，其特征是新生儿Fc受体和β-2- 微球蛋白的非共价复合物是生物素化的，固相则是用链霉亲和素衍生的。

24.根据权利要求16或17的用途，其特征是pH梯度是从第一pH值至第二pH值，其中第一pH值是从pH 7.0至pH 8.5，第二pH值是从pH 5.5至pH 6.9。

25.根据权利要求16或17的用途，其特征是第一pH值是 pH 7.4，第二pH值是pH 6.0。

26.根据权利要求16或17的用途，其特征是用途是用于通过确定抗体和参照抗体的保留时间的比例，确定抗体的体内半衰期。

27.根据权利要求16或17的用途，其特征是所述用途是用于确定抗体的甲硫氨酸氧化作用。

28.根据权利要求16或17的用途，其特征是所述用途是用于确定抗体的寡聚化水平。

29.根据权利要求16或17的用途，其特征是所述用途是用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的修饰的抗体或修饰的融合多肽的文库，对于那些与亲本抗体或亲本融合多肽相比针对新生儿 Fc受体具有改变的结合亲和力的修饰的抗体或修饰的融合多肽而言，其至少包含Fc区的新生儿Fc受体结合部分。

30.根据权利要求16或17的用途，其特征是所述用途是用于鉴别至少包括Fc区的新生儿Fc受体结合部分的抗体或融合多肽，所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体改变的结合。

31.根据权利要求16或17的用途，其特征是所述用途是用于从IgG制品中去除半抗体。

32.根据权利要求16或17的用途，其特征是所述用途是用于从IgG制品中去除抗体聚集体和抗体寡聚物。

33.根据权利要求16或17的用途，其特征是所述抗体是单特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或双特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或三特异性抗体或融合多肽的抗体片段，或四特异性抗体或融合多肽的抗体片段。