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KR20240122448A - 안정화된 il-18 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

안정화된 il-18 폴리펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240122448A
KR20240122448A KR1020247019240A KR20247019240A KR20240122448A KR 20240122448 A KR20240122448 A KR 20240122448A KR 1020247019240 A KR1020247019240 A KR 1020247019240A KR 20247019240 A KR20247019240 A KR 20247019240A KR 20240122448 A KR20240122448 A KR 20240122448A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polypeptide
lymphoma
cell
cancer
amino acid
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247019240A
Other languages
English (en)
Inventor
트래비스 윌리엄 바인브릿지
베이자 불루토글루 베이카라
조나단 토마스 소콜로스키
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 안정화된 IL-18 폴리펩티드 및 이를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.

Description

안정화된 IL-18 폴리펩티드 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참고
본 출원은 2021년 12월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 63/289,948의 우선권을 주장하며, 이 출원은 어떤 목적으로든 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 안정화된 IL-18 폴리펩티드 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
배경
인터루킨 18(IL-18)은 전염증성 IL-1 계열 사이토카인이다. 다른 IL-1 계열 구성원과 마찬가지로 IL-18은 신호 펩티드를 포함하지 않으므로 대부분의 가용성 단백질의 전형적인 방식으로 분비되지 않고 오히려 전통적이지 않은 단백질 분비 경로를 사용한다[Zhang 외, Cell, 2020]. 신호 펩티드 대신 IL-18의 아미노 말단에는 억제성 프로펩티드 서열이 포함되어 있으며, 이는 카스파제 1에 의해 단백질 분해에 의해 성숙한 형태로 절단될 때까지 사이토카인을 비활성 상태로 유지한다[Tsutsumi 외, Sci Rep, 2019]. IL-18에는 두 개의 동족 신호 전달 보조 수용체인 IL-18Rα 및 IL-18Rβ와 가용성 "미끼" 수용체인 IL-18BP가 있다. IL-18 신호 전달 경로는 먼저 IL-18Rα에 대한 성숙 IL-18 결합에 의해 시작된 다음, IL-18/IL-18Rα 복합체는 IL-18Rβ를 고친화도 이종삼량체 복합체 내부로 동원시키며, 이러한 복합체가 상기 수용체들의 세포내 톨/인터루킨 1 수용체(T1R) 도메인을 통해 신호 전달한다. 대조적으로, IL-18Rα와 상동성을 갖는 IL-18BP는 성숙한 사이토카인에 대해 매우 강한 친화도를 가져서 IL-18Rα/IL-18Rβ를 통한 신호 전달로부터 IL-18을 입체적으로 차단할 수 있어, 천연 길항제로 역할할 수 있다.
IL-18 신호전달은 효과기 T 세포 성숙 및 기능을 촉진할 수 있고 NK 세포를 자극할 수 있다. IL-18 신호 전달이 단일 제제 요법으로서 뿐만 아니라 체크포인트 차단제와 병용하여서도 항종양 면역을 유도할 수 있다는 새로운 관점이 제시되고 있다. 야생형 사이토카인을 사용한 임상적 효능은 제한적이었는데[Tarhini 외, Cancer, 2009], 이는 아마도 상대적으로 풍부한 IL-18 길항제인 IL-18BP에 의해 억제되기 때문일 것이다. 그러나 최근 연구에서는 IL-18BP에 대해 내성이 되도록 조작된 IL-18 변이체가 WT 사이토카인과 비교하여 마우스 모델에서 우수한 항종양 반응을 제공하는 것으로 나타났다[Zhou 외, Nature, 2020]. 치료제로서 IL-18의 일부 특징은 짧은 반감기 및 불안정성과 같은 문제를 제기할 수 있다.
재조합 IL-18은 가장 일반적으로 그 전구 형태[Kirkpatrick 외, Protein Expression & Purification, 2003] 또는 SUMO와 같은 안정화 파트너와 유전적으로 융합되어 대장균에서 낮은 수율로 생산되는데[Kato 외, Nat Struct Biol, 2003; Krumm 외, Structural Biology Communications, 2015], 이는 기능적 활성을 위해, 정제 후 프로테아제로 추가 처리되어야 한다. GSK[Tarhini 외, Cancer, 2009; Robertson 외, J Immunother, 2013] 및 Simcha 테라퓨틱스(Clinicaltrials.gov 식별자: NCT04787042)에 의에 의한 실험을 포함하여 IL-18에 대한 여러 임상 실험이 있었으며, 이들 실험 모두 대장균에서 생산된 재조합 사이토카인을 사용했다. 포유동물 숙주 세포에서의 재조합 단백질 생산은 대장균에 비해 매력적인 이점을 제공하는데, 이러한 이점에는 낮은 수준의 내독소 및 보다 복잡한 형식들, 예를 들어, 생체 내 반감기 연장을 위한 알부민 또는 IgG의 Fc 도메인과의 융합을 생산할 수 있는 능력이 포함되며, 이러한 이점들은 이황화 결합 형성 및 글리코실화를 위한 포유동물 단백질 접힘 기작의 이점을 활용한다. 재조합 IL-18은 특히 포유동물 숙주 세포에서 생산하기 어려운 분자인데, 이는 부분적으로는 신호 펩티드를 사용하지 않는 전형적이지 않은 분비 메커니즘 및 활성 사이토카인을 생산하기 위해 제거되어야 하는 N 말단 억제 프로펩티드의 존재로 인한 것이다[Dinarello 외, Front. Immunol., 2013]. 추가적으로, 인간 및 뮤린 IL-18 둘 모두는 유리 시스테인을 함유하고 있으며, 이들 중 어느 것도 기능성인 분자내 이황화물을 형성하지 않으므로, 이들은 비환원 조건 하에서 비천연 이황화물-연결된 분자간 응집체 형성에 여전히 이용 가능하다. 시스테인 잔기의 산화로 인해 분자의 신속한 비활성화 또한 나타났다[Cohen 외, Nat Comm., 2015]. 더욱이, IL-18은 특히 프로펩티드 제거 후 상대적으로 낮은 열안정성을 갖는 것으로 보고되어 있다[Tsutsumi 외, Sci Rep, 2019]. 따라서 IL-18의 고유한 분자 불안정성은 이 분자를 연구 시약으로 사용하는 데 상당한 장애를 유발하며 IL-18 기반 치료제에 대한 상당한 CMC 책임을 초래할 수 있다.
안정화된 IL-18에 대한 필요성이 여전히 남아 있다. 본원에 기재된 발명은 이러한 요구를 충족시키고 다른 이점을 제공한다.
요약
본 발명은 안정화된 IL-18 단백질 및 이를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
실시형태 1. 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 또는 적어도 97% 동일하며, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 한 쌍의 시스테인을 포함하는 폴리펩티드.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 유리 시스테인을 포함하지 않는 폴리펩티드.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 한 쌍 또는 두 쌍의 시스테인을 포함하고, 각 시스테인 쌍은 이황화 결합을 형성하는 폴리펩티드.
실시형태 4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개 모두의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드.
실시형태 5. 실시형태 4에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개 모두의 시스테인이 세린으로 치환된 폴리펩티드.
실시형태 6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 치환 C74S, C104S, C112S 및/또는 C163S 중 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 포함하고, 아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
실시형태 7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
a) L45C 및 E192C;
b) Y37C 및 S91C;
c) S43C 및 S86C;
d) S46C 및 V189C;
e) S46C 및 I85C;
f) V47C 및 Q190C;
g) N50C;
h) N50C 및 L174C;
i) F57C 및 T81C;
j) D90C 및 A97C;
k) V98C 및 Q139C;
l) T99C 및 P124C;
m) S101C 및 T109C;
n) I107C 및 N123C;
o) R140C 및 Q150C; 및
p) A162C 및 I185C;
아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는, 폴리펩티드.
실시형태 8. 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 또는 적어도 97% 동일하며, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
a) L45C 및 E192C;
b) Y37C 및 S91C;
c) S43C 및 S86C;
d) S46C 및 V189C;
e) S46C 및 I85C;
f) V47C 및 Q190C;
g) N50C;
h) N50C 및 L174C;
i) F57C 및 T81C;
j) D90C 및 A97C;
k) V98C 및 Q139C;
l) T99C 및 P124C;
m) S101C 및 T109C;
n) I107C 및 N123C;
o) R140C 및 Q150C; 및
p) A162C 및 I185C;
아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
실시형태 9. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
a) L45C 및 E192C;
b) Y37C 및 S91C;
c) S43C 및 S86C;
d) S46C 및 V189C;
e) S46C 및 I85C;
f) V47C 및 Q190C;
g) F57C 및 T81C;
h) D90C 및 A97C;
i) V98C 및 Q139C;
j) T99C 및 P124C;
k) S101C 및 T109C;
l) I107C 및 N123C;
m) R140C 및 Q150C; 및
n) A162C 및 I185C;
아미노산 치환 C74S, C104S, C112S 및 C163S를 포함하며, 아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
실시형태 10. 실시형태 7 또는 실시형태 8에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
a) N50C, C74S, C104S, 및 C112S; 및
b) N50C, C74S, C104S, 및 L174C;
아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 5, 6, 8, 9, 12, 13, 15, 18, 19-24 및 27로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 것인 폴리펩티드.
실시형태 12. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 5, 6, 8, 9, 12, 13, 15, 18, 19-24, 및 27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
실시형태 13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, IL-18Rα에 결합하는 폴리펩티드.
실시형태 14. 실시형태 11에 있어서, 표면 플라즈몬 공명으로 측정 시 100 nM 미만, 또는 50 nM 미만, 또는 30 nM 미만, 또는 20 nM 미만, 10 nM 미만, 0.1 nM에서 100 nM 사이 또는 1 nM에서 100 nM 사이의 친화도로 IL-18Rα에 결합하는 폴리펩티드.
실시형태 15. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 야생형 IL-18에 비해 IL-18Rα에 유의하게 감소된 친화도로 결합하거나, IL-18Rα에 검출가능하게 결합하지 않는 폴리펩티드.
실시형태 16. 실시형태 15에 있어서, 50 nM 초과, 60 nM 초과, 70 nM 초과, 80 nM 초과, 90 nM 초과, 100 nM 초과, 50 nM에서 1 mM 사이, 60 nM에서 1 mM 사이, 70 nM에서 1 mM 사이, 80 nM에서 1 mM 사이의 친화도로 IL-18Rα에 결합하는 폴리펩티드.
실시형태 17. 실시형태 15에 있어서, 표면 플라즈몬 공명으로 측정 시 최대 81 nM까지 IL-18Rα에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는 폴리펩티드.
실시형태 18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, IL-18BP에 결합하는 폴리펩티드.
실시형태 19. 실시형태 18에 있어서, 표면 플라즈몬 공명으로 측정 시 1 nM 미만, 100 pM 미만, 또는 50 pM 미만, 또는 30 pM 미만, 또는 20 pM 미만, 10 pM 미만, 1 fM에서 1 nM 사이, 10 fM에서 1 nM 사이, 1 fM에서 100 pM 사이, 10 fM에서 100 pM 사이, 1 fM에서 50 pM 사이, 10 fM에서 50 pM 사이, 1 fM에서 30 pM 사이, 또는 10 fM에서 30 pM 사이의 친화도로 IL-18BP에 결합하는 폴리펩티드.
실시형태 20. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 리포터 검정에서 1 nM 미만, 800 pM 미만, 700 pM 미만, 600 pM 미만, 500 pM 미만, 400 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 1 pM에서 1 nM 사이, 1 pM에서 800 pM 사이, 1 pM에서 500 pM 사이, 또는 1 pM에서 300 pM 사이의 EC50으로 IL-18 수용체를 통해 신호전달을 유도하는 폴리펩티드.
실시형태 21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 시험관 내 인간 림프구에서 IFNγ 발현을 유도하는 폴리펩티드.
실시형태 22. 실시형태 21에 있어서, 림프구는 T 세포 또는 NK 세포인, 폴리펩티드.
실시형태 23. 실시형태 21 또는 실시형태 22에 있어서, 시험관 내 인간 T 세포에서 1 nM 미만, 800 pM 미만, 700 pM 미만, 600 pM 미만, 500 pM 미만, 400 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 1 pM에서 1 nM 사이, 1 pM에서 800 pM 사이, 1 pM에서 500 pM 사이, 또는 1 pM에서 300 pM 사이의 EC50으로 IFNγ 발현을 유도하는 폴리펩티드.
실시형태 24. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 시험관내 인간 림프구에서 IFNγ 발현을 야생형 인간 IL-18보다 실질적으로 감소된 정도로 유도하는 폴리펩티드.
실시형태 25. 실시형태 24에 있어서, 림프구는 T 세포 또는 NK 세포인 폴리펩티드.
실시형태 26. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 Y37, L41, K44, M87, K89, S91, Q92, P93, G95, M96, E113, Q139, S141, D146, N147, M149, V189, 및 N191로부터 선택된 위치에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하고, 아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 Y37H, Y37R, L41H, L41I, L41Y, K44Q, K44R, M87T, M87K, M87D, M87N, M87E, M87R, K89R, K89G, K89S, K89T, S91K, S91R, Q92E, Q92A, Q92R, Q92V, Q92G, Q92K, Q92L, P93L, P93G, P93A, P93K, G95T, G95A, M96K, M96Q, M96R, M96L, E113D, Q139E, Q139K, Q139P, Q139A, Q139R, S141R, S141D, S141K, S141N, S141A, D146H, D146K, D146N, D146Q, D146E, D146S, D146G, N147H, N147Y, N147D, N147R, N147S, N147G, M149V, M149R, M149T, M149K, V189I, V189T, V189A, N191K, 및 N191H로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
실시형태 28. 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 위치 M87, M96, S141, D146 및 N147에; 또는 위치 M87, K89, Q92, S141 및 N147에 치환을 추가로 포함하고, 아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
실시형태 29. 실시형태 28에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 치환 (i) M87T 또는 M87K; (ii) M96K 또는 M96L; (iii) S141D, S141N, 또는 S141A; (iv) D146K, D146N, D146S, 또는 D146G; 및 (v) N147Y, N147Y, N147R, 또는 N147G를 추가로 포함하거나; 또는 치환 (i) M87K; (ii) K89G 또는 K89S; (iii) Q92G, Q92R, 또는 Q92L; (iv) D146N, D146S, 또는 D146G; 및 (v) N147R 또는 N147G를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
실시형태 30. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 Y37, L41, D53, E67, T70, D71, S72, D73, D76, N77, M87, Q91, M96, Q139, H145, M149, 및 R167로부터 선택된 위치에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하고, 아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
실시형태 31. 실시형태 30에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 Y37D, Y37F, Y37H, Y37L, L41F, L41H, D53A, D53G, D53R, D53H, E67A, E67T, E67G, E67K, E67R, T70A, T70K, T70E, D71S, D71A, D71Y, S72N, S72K, S72R, D73P, D73A, D73R, D73H, D73L, D73V, D76Y, D76S, D76A, N77K, N77S, N77R, M87F, M87L, M87I, Q91H, M96L, M96F, M96I, Q139L, Q139I, H145A, H145P, H145D, M149L, M149I, M149F, 및 R167S로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
실시형태 32. 실시형태 1 내지 29, 30 및 31 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 치환 D53G, E66A, 및 Q139L이나 Q139I 중 하나를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
실시형태 33. 실시형태 32에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 치환 D71S 및 M87F를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
실시형태 34. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 융합 파트너를 포함하는 폴리펩티드.
실시형태 35. 실시형태 34에 있어서, 융합 파트너가 없는 변형된 IL-18 폴리펩티드보다 더 긴 반감기를 갖는 폴리펩티드.
실시형태 36. 실시형태 34 또는 실시형태 35에 있어서, 융합 파트너는 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민, 또는 항원 결합 도메인인 폴리펩티드.
실시형태 37. 실시형태 36에 있어서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 도메인인 폴리펩티드.
실시형태 38. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 융합 파트너를 포함하지 않는 폴리펩티드.
실시형태 39. 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나의 폴리펩티드 및 접합체 모이어티를 포함하는 접합체.
실시형태 40. 실시형태 39에 있어서, 접합체 모이어티는 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 접합체.
실시형태 41. 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
실시형태 42. 실시형태 41의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
실시형태 43. 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나의 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포.
실시형태 44. 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법이며, 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 실시형태 42 또는 실시형태 43의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 45. 실시형태 44에 있어서, 숙주 세포로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시형태 46. 실시형태 44 또는 실시형태 45에 있어서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포인 방법.
실시형태 47. 실시형태 46에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포인 방법.
실시형태 48. 실시형태 47에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포 또는 293 세포인 방법.
실시형태 49. 실시형태 44 내지 48 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 폴리펩티드.
실시형태 50. 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드, 또는 실시형태 39 또는 실시형태 40의 접합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
실시형태 51. 실시형태 50에 있어서, 추가 치료제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
실시형태 52. 실시형태 51에 있어서, 추가 치료제는 면역종양제인 약학 조성물.
실시형태 53. 실시형태 51 또는 실시형태 52에 있어서, 면역종양제는 면역 체크포인트 억제제 또는 면역 보조자극 분자의 효능제인 약학 조성물.
실시형태 54. 실시형태 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제는 종양 관련 항원; CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40, ICOS, HVEM, NKG2D, MICA, 2B4, IL-2, IL-12, IL-27, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-1, CDN, HMGB1 또는 TLR 효능제; 또는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD47, SIRPα, B7H4, CD96, TIGIT, CD226, 프로스타글란딘, VEGF, 엔도텔린 B, IDO, 아르기나제, MICA/MICB, TIM-3, IL-10, IL-4 또는 IL-13 길항제에 결합하는 항체인 약학 조성물.
실시형태 55. 실시형태 51 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제는 PD-1 축 결합 길항제인 약학 조성물.
실시형태 56. 실시형태 55에 있어서, PD-1 축 길항제는 PD-1 결합 길항제 또는 PDL1 결합 길항제인 약학 조성물.
실시형태 57. 실시형태 51 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제는 항체인 약학 조성물.
실시형태 58. 실시형태 51 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 우토밀루맙, 우렐루맙, INBRX-105, GSK3359609, JTX-2011, TRX 518-001, MK-4166, BMS-986156, INCAGN01876, 쿠사투주맙, 바릴루맙, PF-0451860, MEDI0562/6469/6383, GSK3174998, BMS-986178, CP870893, APX005M, CA-170, 모가물리주맙, MGD009, 8H9, TSR-022, MBG453, Sym023, 올레클루맙, 렐라틀리맙, IMP321(에프틸라지모드 알파), LAG525, 리릴루맙, 인독시모드, 에파카도스타트, 티스렐리주맙, 티라골루맙, BMS-986207, MTIG7192A, AB154, 시포라데난트, M7824, 갈루니세르팁, TTI-621, 에보르파셉트, 마그롤리맙, 올레클루맙, 폴리-ICIC, 레피톨리모드, SD-101, DSP-0509, 린타톨리모드, CMP-001, NKTR-214, RO6874281, THOR-707, CB-1158, LTX-315 또는 페길로데카킨으로부터 선택되는 약학 조성물.
실시형태 59. 약제로서 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드, 실시형태 39 또는 실시형태 40의 접합체, 또는 실시형태 50 내지 58 중 어느 하나의 약학 조성물.
실시형태 60. 암 치료에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드, 실시형태 39 또는 실시형태 40의 접합체, 또는 실시형태 50 내지 58 중 어느 하나의 약학 조성물.
실시형태 61. 실시형태 60에 있어서, 암은 암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병인 폴리펩티드 또는 약학 조성물.
실시형태 62. 실시형태 60 또는 실시형태 61에 있어서, 암은 전이성 선암종(예를 들어, 전이성 결장직장 선암종, 전이성 위장 선암종, 또는 전이성 췌장 선암종) 일 수 있는 선암종(예를 들어, 결장직장 선암종, 위장 선암종, 또는 췌장 선암종), 식도암, 위장암 또는 위암, 소장암, 대장암, 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위장암, 결장직장암(CRC), 간세포 암종, 유방암, 직장암, 비소세포폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신장세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종은 제외하지만 배중심 B 세포 유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포 유사(ABC) DLBCL은 포함하는 성숙 B 세포암, 소포 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프모구 백혈병(CLL), 변연부 림프종(MZL), 소림프구성 백혈병(SLL), 림프형질세포 림프종(LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM), 중추신경계 림프종(CNSL), 버킷 림프종(BL), B세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 분류불가, 비장 미만성 적색속질 소 B세포 림프종, 변종 털세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B세포 림프종, CNS의 원발성 DLBCL, 원발성 피부 DLBCL, 다리 유형, 노인의 EBV 양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK 양성 거대 B세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8 관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종: 미만성 거대 B세포 림프종과 버킷 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종 또는 미만성 거대 B세포 림프종과 고전적 호지킨 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종인 폴리펩티드 또는 약학 조성물.
실시형태 63. 암 치료를 위한 약제의 제조에서, 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드, 실시형태 39 또는 실시형태 40의 접합체, 또는 실시형태 50 내지 58 중 어느 하나의 약학 조성물의 용도.
실시형태 64. 실시형태 63에 있어서, 암은 암종, 선암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병인 용도.
실시형태 65. 실시형태 63 또는 실시형태 64에 있어서, 암은 전이성 선암종(예를 들어, 전이성 결장직장 선암종, 전이성 위장 선암종, 또는 전이성 췌장 선암종) 일 수 있는 선암종(예를 들어, 결장직장 선암종, 위장 선암종, 또는 췌장 선암종), 식도암, 위장암 또는 위암, 소장암, 대장암, 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위장암, 결장직장암(CRC), 간세포 암종, 유방암, 직장암, 비소세포폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신장세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종을 제외하지만 배중심 B 세포 유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포 유사(ABC) DLBCL을 포함하는 성숙 B 세포암, 소포 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프모구 백혈병(CLL), 변연부 림프종(MZL), 소림프구성 백혈병(SLL), 림프형질세포 림프종(LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM), 중추신경계 림프종(CNSL), 버킷 림프종(BL), B세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 분류불가, 비장 미만성 적색속질 소 B세포 림프종, 변종 털세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B세포 림프종, CNS의 원발성 DLBCL, 원발성 피부 DLBCL, 다리 유형, 노인의 EBV 양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK 양성 거대 B세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8 관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종: 미만성 거대 B세포 림프종과 버킷 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종 또는 미만성 거대 B세포 림프종과 고전적 호지킨 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종인 용도.
실시형태 66. 암을 가진 대상체를 치료하는 방법이며, 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 실시형태 39 또는 실시형태 40의 접합체, 또는 실시형태 50의 약학 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 67. 실시형태 66에 있어서, 암은 암종, 선암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병인 방법.
실시형태 68. 실시형태 66 또는 실시형태 67에 있어서, 암은 전이성 선암종(예를 들어, 전이성 결장직장 선암종, 전이성 위장 선암종, 또는 전이성 췌장 선암종) 일 수 있는 선암종(예를 들어, 결장직장 선암종, 위장 선암종, 또는 췌장 선암종), 식도암, 위장암 또는 위암, 소장암, 대장암, 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위장암, 결장직장암(CRC), 간세포 암종, 유방암, 직장암, 비소세포폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신장세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종은 제외하지만 배중심 B 세포 유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포 유사(ABC) DLBCL은 포함하는 성숙 B 세포암, 소포 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프모구 백혈병(CLL), 변연부 림프종(MZL), 소림프구성 백혈병(SLL), 림프형질세포 림프종(LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM), 중추신경계 림프종(CNSL), 버킷 림프종(BL), B세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 분류불가, 비장 미만성 적색속질 소 B세포 림프종, 변종 털세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B세포 림프종, CNS의 원발성 DLBCL, 원발성 피부 DLBCL, 다리 유형, 노인의 EBV 양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK 양성 거대 B세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8 관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종: 미만성 거대 B세포 림프종과 버킷 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종 또는 미만성 거대 B세포 림프종과 고전적 호지킨 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종인 방법.
실시형태 69. 실시형태 66 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 대상체에게 추가 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 70. 실시형태 69에 있어서, 추가 치료제는 면역종양제 또는 화학요법제인 방법.
실시형태 71. 실시형태 70에 있어서, 면역종양제는 면역 체크포인트 억제제 또는 면역 보조자극 분자의 효능제인 방법.
실시형태 72. 실시형태 69 내지 실시형태 71 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제는 종양 관련 항원; CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40, ICOS, HVEM, NKG2D, MICA, 2B4, IL-2, IL-12, IL-27, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-1, CDN, HMGB1 또는 TLR 효능제; 또는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD47, SIRPα, B7H4, CD96, TIGIT, CD226, 프로스타글란딘, VEGF, 엔도텔린 B, IDO, 아르기나제, MICA/MICB, TIM-3, IL-10, IL-4 또는 IL-13 길항제에 결합하는 항체인 방법.
실시형태 73. 실시형태 69 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제는 PD-1 축 결합 길항제인 방법.
실시형태 74. 실시형태 73에 있어서, PD-1 축 길항제는 PD-1 결합 길항제 또는 PDL1 결합 길항제인 방법.
실시형태 75. 실시형태 69 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제는 항체인 방법.
실시형태 76. 실시형태 69 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 우토밀루맙, 우렐루맙, INBRX-105, GSK3359609, JTX-2011, TRX 518-001, MK-4166, BMS-986156, INCAGN01876, 쿠사투주맙, 바릴루맙, PF-0451860, MEDI0562/6469/6383, GSK3174998, BMS-986178, CP870893, APX005M, CA-170, 모가물리주맙, MGD009, 8H9, TSR-022, MBG453, Sym023, 올레클루맙, 렐라틀리맙, IMP321(에프틸라지모드 알파), LAG525, 리릴루맙, 인독시모드, 에파카도스타트, 티스렐리주맙, BMS-986207, MTIG7192A, AB154, 시포라데난트, M7824, 갈루니세르팁, TTI-621, 에보르파셉트, 마그롤리맙, 올레클루맙, 폴리-ICIC, 레피톨리모드, SD-101, DSP-0509, 린타톨리모드, CMP-001, NKTR-214, RO6874281, THOR-707, CB-1158, LTX-315, 페길로데카킨으로부터 선택되는 것인 방법.
실시형태 77. 세포 상의 IL-18 수용체를 활성화시키는 방법이며, 세포를 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 실시형태 39 또는 실시형태 40의 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 78. 림프구에서 IFNγ 발현을 유도하는 방법이며, 림프구를 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 실시형태 39 또는 실시형태 40의 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 79. 림프구를 활성화시키는 방법이며, 림프구를 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 실시형태 39 또는 실시형태 40의 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 80. 실시형태 78 또는 실시형태 79에 있어서, 림프구는 T 세포 또는 NK 세포인 방법.
실시형태 81. 실시형태 77 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 세포 또는 림프구는 시험관 내 존재하는 것인 방법.
실시형태 82. 실시형태 77 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 세포 또는 림프구는 생체 내 존재하는 것인 방법.
실시형태 83. 인간 IL-18 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 안정성을 개선하는 방법이며, 이황화 결합을 형성하는 적어도 한 쌍의 시스테인을 IL-18 아미노산 서열에 도입하여, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 84. 실시형태 83에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 유리 시스테인을 포함하지 않는 것인 방법.
실시형태 85. 실시형태 83 또는 실시형태 84에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 한 쌍 또는 두 쌍의 시스테인을 포함하고, 각 시스테인 쌍은 이황화 결합을 형성하는 것인 방법.
실시형태 86. 실시형태 83 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개 모두의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환된 것인 방법.
실시형태 87. 실시형태 86에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개 모두의 시스테인이 세린으로 치환된 것인 방법.
실시형태 88. 실시형태 83 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 치환 C74S, C104S, C112S 및/또는 C163S 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하고, 아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 방법.
실시형태 89. 샘플에서 IL-18BP를 검출하는 방법이며, 샘플을 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 IL-18BP에 대한 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 90. 샘플에서 IL-18Rα를 검출하는 방법이며, 샘플을 실시형태 1 내지 38 및 49 중 어느 하나의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 IL-18Rα에 대한 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 91. 실시형태 89 또는 실시형태 90에 있어서, 폴리펩티드는 검출 가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
도 1A-1B는 포유동물 생산을 위한 IL-18 구조체를 보여준다. 도 1A는 인간 및 마우스 IL-18 구조체를 보여준다. 인간 IL-18 구조체는 성숙 인간 IL-18, 이어서 순차적으로 TEV 프로테아제 부위, 폴리-히스티딘 태그 및 단량체 인간 Fc를 함유한다. 마우스 IL-18 구조체는 유사한 설계를 가지고 있지만, C-말단에 Fc 대신 마우스 혈청 알부민(MSA)이 있다. 도 1B는 대장균 생산을 위한 야생형 성숙 IL-18 구조체를 보여준다. 폴리히스티딘 태그가 붙은 소형 유비퀴틴 관련 변형자(SUMO)를 성숙한 인간 또는 마우스 IL-18의 N 말단에 융합시켰다. SUMO 프로테아제에 의한 절단으로 인해 태그가 없고 N 말단이 깨끗한 성숙한 IL-18이 생성된다.
도 2A-2Z는 IL-18의 여러 신규 이황화물 변이체의 WT IL-18 대비 증가된 수율 및 감소된 응집을 분석적 크기 배제 크로마토그램 및 SDS-PAGE를 통해 보여준다. 인간 IL-18 변이체는 단량체 인간 Fc 융합체로서 발현되었고, 마우스 IL-18 변이체는 마우스 알부민 융합체로서 발현되었다.
도 3A-3B는 일차 T 세포 효능 분석에서 IL-18 변이체의 용량-반응 곡선을 보여준다. 도 3A는 일차 인간 T 세포 효능 분석에서 인간 IL-18 변이체의 용량-반응 곡선을 보여준다. 도 3B는 일차 마우스 T 세포 효능 분석에서 마우스 IL-18 변이체의 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 4A-4B는 성숙 인간 IL-18(4A; 서열 번호 1) 및 성숙 마우스 IL-18(4B; 서열 번호 2)의 서열을 나타내며, 본원에서 사용된 아미노산 넘버링도 포함되어 있다.
도 5A-5B는 MC38 결장암 모델에서 마우스 IL-18 T44C/L189C Fc("dsIL-18Fc")의 효능을 보여준다. 도 5A는 5회 투여 동안 0.1 mg/kg, 1 mg/kg 및 5 mg/kg으로 주 2회 단독으로(상단 줄: 두 번째, 세 번째, 네 번째 그래프), 및 10mg/kg의 항-PD-L1 항체와 병용하여(하단 줄: 두 번째, 세 번째, 네 번째 그래프) 투여된 dsIL-18Fc의 효능을 보여준다. 10mg/kg의 대조 항체의 단독(상단 줄: 첫 번째 그래프) 및 PD-L1과의 병용(하단 줄: 첫 번째 그래프) 투여의 효능도 도시된다. 각 그래프의 굵은 점선은 비교 대조군(대조 항체 단독)을 나타내고, 각 그래프의 굵은 실선은 그룹 핏(group fit)을 나타낸다. 더 얇은 선은 각 동물의 데이터를 표시한다. 도 5B는 동일한 모델에서 WT IL-18의 효능을 보여준다(오른쪽 그래프). 각 그래프의 굵은 점선은 비교 대조군(대조 항체 단독)을 나타내고, 각 그래프의 굵은 실선은 그룹 핏(group fit)을 나타낸다. 더 얇은 선은 각 동물의 데이터를 표시한다.
도 6A-6B는 인간 L45C/E192C 변이체(6A) 및 인간 A162C/I185C 변이체(6B)의 결정 구조로부터 얻은 백본 추적을 보여준다. 각 구조체에서 새로운 이황화물을 나타내고 표지하였다.
상세한 설명
IL-18은 강력한 면역 자극 사이토카인이며 임상 시험에서 초기에 항종양 효능을 입증하는 데 실패했음에도 불구하고 더 최근의 연구는 천연 IL-18 길항제인 IL-18BP를 우회하면 사이토카인에 대한 치료 반응을 획기적으로 개선할 수 있는 가능성이 있음을 시사한다. IL-18BP의 급속한 움직임(hurtle) 외에도, 성숙한 재조합 IL-18은 연구 규모에서도 다소 불안정하고 생산하기 어렵다. 추가적으로, 통상적인 IgG 기반 치료제에 비해, 재조합 IL-18은 2일 미만의 매우 짧은 반감기를 갖는다[Robertson 외, Clin Cancer Res, 2006]. IL-18 기반 치료법의 성공은 이러한 단점을 해결함으로써 크게 향상될 수 있다.
임상 시험에 사용되는 IL-18 기반 치료제는 일반적으로 대장균에서 생산되어 왔다. 포유동물 숙주에서 대량의 단백질 치료제를 생성할 수 있는 능력은 생산 및 정제 과정을 크게 단순화하는 동시에 포유동물 특유의 번역 후 변형 및 단백질 접힘 메커니즘을 필요로 하는 기능들을 통합시킨 보다 복잡한 설계를 가능하게 한다. 예를 들어, 알부민 또는 IgG의 Fc 도메인에 대한 IL-18 치료제의 융합은 분자의 약동학 및/또는 약력학 특성을 크게 향상시킬 수 있다. 점점 일반화되고 있는 또 다른 접근 방식은 반감기 연장 모듈 외에 Fab 또는 VHH와 같은 표적화 모듈을 추가하는 것이다. 이러한 접근법은 모두 포유동물 숙주 생산으로부터 이점을 얻는다. 우리는 조작된 이황화물을 통한 IL-18의 안정화가 실제로 Fc 및 알부민 융합 모두를 포함하는 안정한 분자의 높은 수율을 가능하게 한다는 것을 본원에서 입증했다. 또한 우리가 평가한 두 가지 변이체(N50C 및 N50C/L174C)는 세포 기반 분석에서 IL-18Rα에 대한 결합이 크게 약화되고 효능이 크게 감소하는 예상치 못한 특성을 보여 주었지만 IL-18BP에 대한 강한 친화도를 유지했다. 이러한 독특한 특성을 활용하여 순환하는 IL-18BP 길항제에 대한 분자 트랩을 생산하여 IL-18 신호 전달을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 우리는 인간과 뮤린 IL-18에 새로운 비천연 이황화 결합을 설계했다. 우리의 IL-18 이황화물-안정화된 IL-18 변이체는 포유동물 숙주 세포에서 성공적으로 발현되었으며 대장균에서 생산된 WT IL-18에 비해 훨씬 더 높은 수율과 더 낮은 응집 수준으로 분비되었다.
또한 여러 변이체들은 비환원 조건하에서 WT에 비해 개선된 열 안정성을 보여준다. 우리는 IL-18Rα에 대한 이러한 변이체들 두 가지의 결합을 검출할 수 없었지만, IL-18 변이체는 일반적으로 SPR에 의해 결정된 바와 같이 IL-18Rα 및 IL-18BP 모두에 대해 유사한 친화도를 가지고 있다. 마지막으로, SPR 결과와 유사하게, 대부분의 변이체는 세포 기반 리포터 검정에서 WT와 유사한 효능을 나타낸다. 종합하면, 이러한 결과는 IL-18에 특정 이황화 결합을 도입하면 치료제로서의 약물 유사 특성을 개선할 수 있고 융합 단백질 생산을 비롯한 재조합 사이토카인 생산을 용이하게 할 수 있음을 시사한다.
I. 정의
“친화도”는 분자(예를 들어, 단백질)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 수용체) 사이의 비공유 상호작용의 총합 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않은 한, 본원에 설명된 “결합 친화도”는 결합쌍(예를 들면, 단백질 및 수용체)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 그 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 설명된 것을 포함하여 해당 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정 될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 설명적 및 예시적 방법은 아래에 기재되어 있다.
용어 “암”은 통상적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 병태를 지칭한다. 암의 예는, 비제한적으로, 선암종(예를 들어, 결장직장 선암종, 위장 선암종, 또는 췌장 선암종)(이는 전이성 선암종(예를 들어, 전이성 결장직장 선암종, 전이성 위장 선암종, 또는 전이성 췌장 선암종) 일 수 있음), 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함한다. 이러한 암의 보다 구체적인 예에는, 제한 없이, 식도암, 소장암, 대장암, 편평 세포암(예를 들어, 상피 편평 세포암), 소세포 폐암을 포함한 폐암, 비소세포 폐암, 폐선암종 및 폐 편평상피암종, 복막암, 간세포암, 위장관암 및 위장관 간질암을 포함한 위장암 및 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암 요로암, 간암, 유방암, 대장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁암종, 타액선암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문암종, 음경 암종, 흑색종, 표재 확산 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종, 다발성 골수종 및 B 세포 림프종(저 등급/소포성 비호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고 등급 면역아세포성 NHL; 고 등급 림프구성 NHL; 고 등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 및 이식후 림프증식성 장애(PTLD) 포함), 뿐만 아니라 식립종증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예를 들어, 뇌종양과 관련된 부종), 메이그스 증후군, 뇌, 및 두경부암 및 관련 전이를 포함한다.
“화학요법제”는 암 치료에 유용한 화학적 화합물을 의미한다. 화학요법제의 예에는 다음이 포함된다: 알킬화제, 예를 들어, 티오테파, 사이클로포스파미드(CYTOXAN®), 테모졸로마이드(Methazolastone®, Temodar®), 트레오술탄, 및 벤다무스틴 하이드로클로라이드(Treanda®); 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에티일렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®을 포함), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®), 이리노테칸 리포솜 주사(Onivyde®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체를 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로르암부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네다인 항생제(예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1(예를 들어, Nicolaou 외, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); 경구 알파-4 인테그린 억제제인 CDP323;다이네마이신 A를 포함한 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사(DOXIL®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99(MYOCET®), 페길화된 리포솜 독소루비신(CAELYX®), 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트, 젬시타빈(GEMZAR®), 테가푸르(UFTORAL®), 카페시타빈(XELODA®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌, 클라드리빈(Leustat®) 및 넬라라빈(Arranon®)과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항부신제; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드(“Ara-C”); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(TAXOL®), 파클리탁셀(ABRAXANETM), 카바지탁셀(Jevtana®) 및 도세탁셀(TAXOTERE®)의 알부민 조작 나노입자 제제; 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴, 옥살리플라틴(예를 들어, ELOXATIN®) 및 카보플라틴과 같은 백금 제제; 빈블라스틴(VELBAN®), 빈크리스틴(ONCOVIN®), 빈크리스틴 설페이트 리포솜(Marqibo®), 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®), 빈플루닌(Javlor®) 및 비노렐빈(NAVELBINE®)을 포함하여 튜불린 중합이 미세소관을 형성하는 것을 방지하는 빈카스; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 벡사로텐(TARGRETIN®)을 비롯하여 레티노산과 같은 레티노이드; 클로드로네이트(예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트(DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(ZOMETA®), 알렌드로네이트(FOSAMAX®), 파미드로네이트(AREDIA®), 틸루드로네이트(SKELID®) 또는 리세드로네이트(ACTONEL®)와 같은 비스포스포네이트; 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식과 관련된 신호 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체(EGF-R); THERATOPE® 백신 및 유전자 치료 백신, 예를 들어 ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신과 같은 백신; 토포이소머라제 1 억제제(예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH(예를 들어, ABARELIX®); 소라페닙(예를 들어, Nexavar®); SU-11248(수니티닙, SUTENT®, Pfizer); 페리포신, COX-2 억제제(예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제(예를 들어, PS341), 예를 들어 카르필조밉(Kyprolis®) 및 익사조밉 시트레이트(Ninlaro®); 보르테조밉(VELCADE®); CCI-779; 티피파르닙(R11577); 오라페닙, ABT510; 오블리메르센 소듐(GENASENSE®) 및 베네토클락스(Venclexta®)와 같은 Bcl-2 억제제; 픽산트론; 게피티닙(Iressa®)과 같은 EGFR 억제제(아래 정의 참고); 보수티닙(Bosulif®), 카보잔티닙-s-말레이트(Cabometyx®, Cometriq®), 아파티닙 디말레에이트(Gilotrif®), 이마티닙 메실레이트(Gleevec®), 포나티닙 하이드로클로라이드(Iclusig®)와 같은 티로신 키나제 억제제(아래 정의 참고); 악시티닙(Inlyta®), 이브루티닙(Imbruvica®), 소라페닙 토실레이트(Nexavar®), 다사티닙(Sprycel®), 오시머티닙(Tagrisso®), 에를로티닙 하이드로클로라이드(Tarceva®), 닐로티닙(Tasigna®), 라파티닙 디토실레이트(Tykerb®) , 크리조티닙(Xalkori®) 및 파조파닙 하이드로클로라이드(Votrient®); 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE®), 에베롤리무스(Afinitor®) 및 템시롤리무스(Torisel®)와 같은 세린-트레오닌 키나제 억제제; 로나파르닙(SCH 6636, SARASARTM)과 같은 파르네실트랜스퍼라제 억제제; 네투피탄트(netupitant) 및 롤라피탄트 하이드로클로라이드(Varubi®)와 같은 NK1 수용체 길항제; 이미퀴모드(Aldara®); 알렉티닙(Alecensa®) 및 세리티닙(Zykadia®)과 같은 역형성 림프종 키나제(ALK) 억제제; 벨리노스타트(Beleodaq®) 및 보리노스타트(Zolinza®)와 같은 히스톤 데아세틸라제 억제제; 클로파라빈과 같은 퓨린 뉴클레오시드 항대사물질; 코비메티닙(Cotellic®) 및 트라메티닙(Mekinist®)과 같은 미토겐 활성화 단백질 키나제 키나제(MEK) 억제제; 데시타빈(Dacogen®)과 같은 핵산 합성 억제제; 비스모데깁(Erivedge®) 및 소니데깁(Odomzo®)과 같은 헤지호그 신호전달 경로 억제제; 파노비노스타트(Farydak®)와 같은 히스톤 데아세틸라제 억제제; 프랄라트렉세이트(Folotyn®), 랄티트렉시드 및 페메트렉시드 디소듐(Alimta®)과 같은 항엽산제; 에리불린 메실레이트(Halaven®)와 같은 유사분열 억제제; 팔보시클립(Ibrance®)과 같은 사이클린 의존성 키나제 억제제; 로미뎁신(Istodax®)과 같은 뎁시펩티드; 익사베필론(Ixempra®)과 같은 에포틸론 B 유사체; 룩소리티닙 포스페이트(Jakafi®)와 같은 야누스 키나제 억제제; 렌바티닙 메실레이트(Lenvima®), 반데타닙(Caprelsa®), 레고라페닙(Stivarga®), 닌테다닙(Vargatef®)과 같은 다중 키나제 억제제; 트리플루리딘과 같은 뉴클레오시드 유사체; 티피라실 하이드로클로라이드와 같은 티미딘 포스포릴라제 억제제; 올라파립(Lynparza®)과 같은 PARP 억제제; 탈리도마이드(Stivarga®, Thalomid®) 및 이의 유도체, 예를 들어, 포말리도마이드(Pomalyst®) 및 레날리도마이드(Revlimid®); 프레드니손과 같은 합성 코르티코스테로이드; 란레오티드 아세테이트(Somatuline®)와 같은 소마토스타틴 유사체; 오마세탁신 메페숙시네이트(Synribo®)와 같은 단백질 번역 억제제; 다브라페닙(Tafinlar®) 및 베무라페닙(Zelboraf®)과 같은 관련 효소 B-Raf의 억제제; 삼산화비소(Trisenox®); 우리딘 트리아세테이트(Vistogard®); 라듐 223 디클로라이드(Xofigo®); 트라벡테딘(Yondelis), 포스포이노시티드 3-키나제 억제제, 예를 들어 이델랄리십(Zydelig®); 미파무르타이드(Mepact®); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 복합 요법의 약어인 CHOP와 같은 상기 중 2개 이상의 조합; 및 옥살리플라틴(ELOXATINTM)을 5-FU 및 류코보린과 복합하여 사용하는 치료 요법의 약어인 FOLFOX.
본원에서 정의된 바와 같이, 화학요법제는 암의 성장을 증진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 “항호르몬 효능제” 또는 “내분비 치료제”를 포함한다. 이들은: 타목시펜(NOLVADEX®), 4-하이드록시타목시펜, 토레미펜(FARESTON®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜(EVISTA®), 트리옥시펜, 케옥시펜 및 SERM3과 같은 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)을 포함하는 혼합 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐; 데가렐릭스, 류프로프렐린, 트립토렐린과 같은 성선자극호르몬 방출 호르몬(GnRH) 길항제; 효능제 특성이 없는 순수한 항에스트로겐, 예를 들어, 풀베스트란트(FASLODEX®) 및 EM800(이러한 제제는 에스트로겐 수용체(ER) 이량체화를 차단하고, DNA 결합을 억제하고, ER 회전율을 증가시키고/시키거나 ER 수준을 억제할 수 있음); 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예를 들어, 포르메스탄 및 엑세메스탄(AROMASIN®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예를 들어, 아나스트라졸(ARIMIDEX®), 레트로졸(FEMARA®) 및 아미노글루테티미드를 포함한 아로마타제 억제제, 및 보로졸(RIVISOR®), 메게스트롤 아세테이트(MEGASE®), 파드로졸, 및 4(5)-이미다졸을 포함한 기타 아로마타제 억제제; 류프롤라이드(LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린, 부세렐린, 히스트렐린 및 트립테렐린을 포함한 황체형성 호르몬 방출 호르몬 효능제; 프로게스틴, 예를 들어, 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트, 에스트로겐, 예를 들어, 디에틸스틸베스트롤 및 프리마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예를 들어, 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티나이드를 포함한 성 스테로이드; 덱사메타손; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제(ERD); 항안드로겐, 예를 들어, 플루타미드, 닐루타미드(예를 들어, Nilandron®), 아비라테론 아세테이트(Zytiga®), 사이프로테론 아세테이트(Cyprostat®), 엔잘루타마이드(Xtandi®) 및 비칼루타미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 호르몬 자체; 및 전술한 것 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 둘 이상의 조합일 수 있다.
제제, 예를 들어, 약학 조성물의 “유효량”은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
용어 “숙주 세포”, “숙주 세포주”, 및 “숙주 세포 배양물”은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 “형질전환체” 및 “형질전환된 세포”를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 “IL-18”는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 IL-18를 나타낸다. 이 용어는 “전장”의, 가공되지 않은 IL-18, 뿐만 아니라 세포에서 가공된 임의의 형태의 IL-18을 포함한다. 이 용어는 또한 IL-18의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 성숙 인간 IL-18의 아미노산 서열은 UniProtKB/Swiss-Prot: Q14116의 아미노산 37-193로 표시되며 본원에서 서열 번호 1에 제시된다. 예시적인 성숙 마우스 IL-18의 아미노산은 UniProt: P70380의 아미노산 36-192로 표시되며 및 본원에서 서열 번호 2에 제시된다.
용어 “안정화된 IL-18 폴리펩티드”는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 한 쌍의 시스테인을 함유하도록 변형되어 있는, 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 변형된 IL-18 폴리펩티드 외에 추가적인 아미노산 서열, 예를 들어, 융합 파트너를 포함할 수 있다.
“개체” 또는 “대상체”는 포유동물이다. 포유동물에는 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 양상에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
“단리된” 폴리펩티드는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 예를 들어, 전기영동의(예를 들어, SDS-PAGE, 등전초점조절(IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다.
용어 “핵산 분자” 또는 “폴리뉴클레오티드”는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특히 퓨린- 또는 피리미딘 염기 (즉, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (즉, 데옥시리보스 또는 리보스) 및 포스페이트 기로 이루어진다. 종종, 핵산 분자는 염기 서열로 기재되며, 이 염기는 핵산 분자의 1차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'에서 3'로 나타낸다. 본원에서, 용어 핵산 분자는, 예를 들어, 상보적 DNA (cDNA) 및 게놈 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히, 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태들, 및 둘 이상의 이러한 분자들을 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 또한, 핵산 분자라는 용어는 센스 및 안티센스 가닥 모두, 뿐만 아니라 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 더욱이, 본원에 기재된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 예에는 유도된 당 또는 포스페이트 백본 링키지 또는 화학적으로 변형된 잔기가 있는 변형된 뉴클레오티드 염기가 포함된다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본 발명의 폴리펩티드의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이러한 DNA(예를 들어, cDNA) 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 벡터는 비변형 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 RNA 벡터의 안정성 및/또는 코딩된 분자의 발현을 행상시키기 위하여 화학적으로 변형될 수 있으며, 이러한 mRNA는 대상체에 주사되어 생체내에서 폴리펩티드를 생성할 수 있다(예를 들어, 2017년 6월 12일 온라인으로 공개된 Stadler 등, Nature Medicine 2017, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1 참고).
“단리된” 핵산은 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
“약품 설명서(package insert)”라는 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상용 패키지에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하는 데 사용된다.　
참조 폴리펩티드 서열에 대한 “아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)”는, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 정렬 목적에 있어서 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 대안적으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에서 제작되었으며 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었으며, WO 2001/007611에 기재되어 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 목적을 위해 아미노산 서열 동일성 퍼센트 값은 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 이상의 ggsearch 프로그램을 사용하여 또한 이후 BLOSUM50 비교 매트릭스를 사용하여 생성된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson 및 D. J. Lipman(1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson 외 공저 (1997) Genomics 46:24-36에 의해 개발되었으며 www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 또는 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta로부터 공중이 이용가능하다. 또는 http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 액세스할 수 있는 공용 서버를 사용하여 ggsearch(전신 단백질:단백질) 프로그램 및 기본 옵션(BLOSUM50; 오픈: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 사용하여 서열들을 비교하여, 국소가 아닌 전신 정렬이 수행되도록 할 수 있다. 아미노산 동일성 퍼센트는 정렬 결과의 헤더에 제공된다.　
용어 “약학 조성물” 또는 “약학 제형(pharmaceutical formulation)”이란 이 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 약학 조성물이 투여되는 대상체에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
“약학적으로 허용되는 담체”는 활성 성분 이외에 약학 조성물 또는 제형 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체에는 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함되지만 이들에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 “치료”(및 “치료하다” 또는 “치료하는 것”과 같은 이의 문법적 변형)는 치료를 받는 개체의 질환의 자연적 과정을 변경하려는 시도에 있어서의 임상적 개입을 의미하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 양상들에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 질환 또는 질환의 발달을 지연 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 이용된다.
본원에서 사용되는 용어 “벡터”는 이것에 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어에는 자가-복제 핵산 구조체로서의 벡터 및 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결되는 핵산들의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 “발현 벡터”로 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
일부 양상에서, 본 발명은, 부분적으로, 안정화된 IL-18 폴리펩티드에 기초한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 적어도 하나의 이황화 결합을 포함한다. 안정화된 IL-18 폴리펩티드는, 예를 들어, 암, 감염성 질환 및 염증의 치료에 유용하다.
A. 안정화된 IL-18 폴리펩티드 예시
일부 측면에서, 본 발명은 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 100 nM 미만, 또는 50 nM 미만, 또는 30 nM 미만, 또는 20 nM 미만, 또는 10 nM 미만, 또는 0.1 nM에서 100 nM 사이 또는 1 nM에서 100 nM 사이의 친화도로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 야생형 IL-18에 비해 IL-18Rα에 대해 유의하게 감소된 친화도로 IL-18Rα에 결합하거나, IL-18Rα에 검출가능하게 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 50 nM 초과, 60 nM 초과, 70 nM 초과, 80 nM 초과, 90 nM 초과, 100 nM 초과, 50 nM에서 1 mM 사이, 60 nM에서 1 mM 사이, 70 nM에서 1 mM 사이, 80 nM에서 1 mM 사이의 친화도로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시형태에서, 친화도는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정 시 IL-18Rα에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는다, 예를 들어, 최대 81 nM까지 검출 가능한 결합을 나타내지 않는다.
일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18BP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 1 nM 미만, 100 pM 미만, 또는 50 pM 미만, 또는 30 pM 미만, 또는 20 pM 미만, 10 pM 미만, 1 fM에서 1 nM 사이, 10 fM에서 1 nM 사이, 1 fM에서 100 pM 사이, 10 fM에서 100 pM 사이, 1 fM에서 50 pM 사이, 10 fM에서 50 pM 사이, 1 fM에서 30 pM 사이, 또는 10 fM에서 30 pM 사이의 친화도로 IL-18BP에 결합한다. 일부 실시형태에서, 친화도는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18 수용체를 통해 신호전달을 유도한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 예를 들어, 시험관내 리포터 검정에서 1 nM 미만, 800 pM 미만, 700 pM 미만, 600 pM 미만, 500 pM 미만, 400 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 1 pM에서 1 nM 사이, 1 pM에서 800 pM 사이, 1 pM에서 500 pM 사이, 또는 1 pM에서 300 pM 사이의 EC50으로 IL-18 수용체를 통해 신호전달을 유도한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 인간 림프구, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포에서 IFNγ 발현을 유도한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 시험관 내 인간 T 세포에서 1 nM 미만, 800 pM 미만, 700 pM 미만, 600 pM 미만, 500 pM 미만, 400 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 1 pM에서 1 nM 사이, 1 pM에서 800 pM 사이, 1 pM에서 500 pM 사이, 또는 1 pM에서 300 pM 사이의 EC50으로 IFNγ 발현을 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 시험관 내에서 인간 림프구, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포에서 IFNγ 발현을 야생형 인간 IL-18보다 실질적으로 감소된 정도로 유도한다.
다양한 실시형태에서, 본원에 제공된 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 한 쌍의 시스테인을 포함하도록 조작되어 있는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 한 쌍 또는 두 쌍의 시스테인을 갖는다. 일부 이러한 실시형태에서, 각 시스테인 쌍은 이황화 결합을 형성할 수 있다. “이황화 결합을 형성할 수 있다”는 것은 시스테인이 생리적 조건과 같은 적절한 조건 하에서 이황화 결합을 형성하고/하거나 유지하기에 충분히 근접하고 배향되어 있음을 의미한다. 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 임의의 유리 시스테인을 함유하지 않는다. 다양한 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 야생형 성숙 IL-18의 아미노산 서열(서열 번호 1)에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 또는 적어도 97% 동일하다. 일부 실시형태에서, 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 쌍들의 일부가 아닌 야생형 성숙 IL-18 아미노산 서열의 임의의 시스테인은 세린으로 치환된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 치환 C74S, C104S, C112S, 및 C163S 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 도 4A에 따른다.
일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
a)L45C 및 E192C;
b)Y37C 및 S91C;
c)S43C 및 S86C;
d)S46C 및 V189C;
e)S46C 및 I85C;
f)V47C 및 Q190C;
g)N50C;
h)N50C 및 L174C;
i)F57C 및 T81C;
j)D90C 및 A97C;
k)V98C 및 Q139C;
l)T99C 및 P124C;
m)S101C 및 T109C;
n)I107C 및 N123C;
o)R140C 및 Q150C; 및
p)A162C 및 I185C;
아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 치환 C74S, C104S, C112S, 및 C163S 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 도 4A에 따른다.
일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
a)L45C 및 E192C;
b)Y37C 및 S91C;
c)S43C 및 S86C;
d)S46C 및 V189C;
e)S46C 및 I85C;
f)V47C 및 Q190C;
g)F57C 및 T81C;
h)D90C 및 A97C;
i)V98C 및 Q139C;
j)T99C 및 P124C;
k)S101C 및 T109C;
l)I107C 및 N123C;
m)R140C 및 Q150C; 및
n)A162C 및 I185C;
아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 치환 C74S, C104S, C112S, 및 C163S를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 도 4A에 따른다.
일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 5, 9, 12, 13, 15, 18, 19-24 및 27로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 5, 9, 12, 13, 15, 18, 19-24, 및 27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 치환 N50C를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 도 4A에 따른다. 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 치환 L174C를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 도 4A에 따른다. 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 치환 N50C, C74S, C104S, 및 C112S; 또는 치환 N50C, C74S, C104S, 및 L174C를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 도 4A에 따른다. 일부 실시형태에서, N50C는 천연 시스테인인 C163과 이황화 결합을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, L174C는 천연 시스테인인 C112와 이황화 결합을 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 6 및 8로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 6 및 8로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 추가 치환을 포함할 수 있다. 변형된 IL-18 폴리펩티드에 포함될 수 있는 비제한적인 예시적 추가 치환에는 US2019/0070262에 설명된 것들이 포함된다. 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y37, L41, K44, M87, K89, S91, Q92, P93, G95, M96, E113, Q139, S141, D146, N147, M149, V189, 및 N191로부터 선택된 위치에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 도 4A에 따른다. 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y37H, Y37R, L41H, L41I, L41Y, K44Q, K44R, M87T, M87K, M87D, M87N, M87E, M87R, K89R, K89G, K89S, K89T, S91K, S91R, Q92E, Q92A, Q92R, Q92V, Q92G, Q92K, Q92L, P93L, P93G, P93A, P93K, G95T, G95A, M96K, M96Q, M96R, M96L, E113D, Q139E, Q139K, Q139P, Q139A, Q139R, S141R, S141D, S141K, S141N, S141A, D146H, D146K, D146N, D146Q, D146E, D146S, D146G, N147H, N147Y, N147D, N147R, N147S, N147G, M149V, M149R, M149T, M149K, V189I, V189T, V189A, N191K, 및 N191H로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 위치 M87, M96, S141, D146 및 N147에; 또는 위치 M87, K89, Q92, S141 및 N147에 치환을 추가로 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 치환 (i) M87T 또는 M87K; (ii) M96K 또는 M96L; (iii) S141D, S141N, 또는 S141A; (iv) D146K, D146N, D146S, 또는 D146G; 및 (v) N147Y, N147Y, N147R, 또는 N147G를 추가로 포함하거나; 또는 치환 (i) M87K; (ii) K89G 또는 K89S; (iii) Q92G, Q92R, 또는 Q92L; (iv) D146N, D146S, 또는 D146G; 및 (v) N147R 또는 N147G를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y37, L41, D53, E67, T70, D71, S72, D73, D76, N77, M87, Q91, M96, Q139, H145, M149, 및 R167로부터 선택된 위치에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 도 4A에 따른다. 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y37D, Y37F, Y37H, Y37L, L41F, L41H, D53A, D53G, D53R, D53H, E67A, E67T, E67G, E67K, E67R, T70A, T70K, T70E, D71S, D71A, D71Y, S72N, S72K, S72R, D73P, D73A, D73R, D73H, D73L, D73V, D76Y, D76S, D76A, N77K, N77S, N77R, M87F, M87L, M87I, Q91H, M96L, M96F, M96I, Q139L, Q139I, H145A, H145P, H145D, M149L, M149I, M149F, 및 R167S로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 치환 D53G, E66A, 및 Q139L 또는 Q139I 중 하나, 및 선택적으로 치환 D71S 및 M87F를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 변형된 IL-18 폴리펩티드 및 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하고 융합 파트너를 포함하지 않는다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 중합체에 접합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, PEG와 같은 중합체에 접합된 본원에 제공된 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 접합체가 제공된다.
단백질 변이체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 폴리펩티드의 상기 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성들을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들어 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 상기 서열 내로의 삽입 및/또는 상기 서열 내에 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특징, 예를 들어, 결합을 가지고 있다면, 최종 구조체에 도달하기 위한 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 양상들에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드 변이체들이 제공된다. 보존적 치환들을 표 1에서 “바람직한 치환”이라는 제목으로 나타낸다. 더 많은 실질적인 변화가 표 1의 “예시적 치환”이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 분류를 참고하여 이하에서 추가로 설명된다. 아미노산 치환이 관심 폴리펩티드에 도입될 수 있으며 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 수용체 결합의 증가 또는 감소, 효능의 증가 또는 감소, 면역원성 감소, 생산 수율 개선 및/또는 반감기 개선에 대해 스크리닝될 수 있다.
표 1
아미노산은 공통적인 측쇄 성질들에 따라 다음과 같이 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기들: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환들은 이들 분류 중 하나의 구성원을 또 다른 분류의 구성원으로 교환하게 할 것이다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 폴리펩티드의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 “알라닌 주사 돌연변이유발”로 불린다. 이 방법에서, 표적 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹(예를 들어, 하전된 잔기, 예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu)이 식별되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어, 폴리펩티드와, 예를 들어, 이의 수용체의 상호작용이 영향을 받았는지를 판단한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 폴리펩티드-수용체 복합체의 결정 구조를 사용하여 폴리펩티드와 그 수용체 사이의 접촉점을 식별할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 이들을 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 다른 삽입 변이체에는, 예를 들어, 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위한 N- 또는 C-말단에의 융합이 포함된다.
융합 파트너 예시
일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 융합 파트너를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 파트너는 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 반감기를 연장하고/하거나 폴리펩티드의 정제를 도울 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 파트너는 항원 결합 도메인이다. Fc 영역, 알부민, 항체, Fab, scFv 및 VHH 도메인을 비롯한(그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 융합 파트너가 해당 분야에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 융합 파트너는 인간 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 융합 파트너는, 이것이 유래된 인간 단백질과 비교하여 예를 들어, 바람직한 특성을 부여하기 위한 치환을 포함한다.
Fc 영역
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 Fc 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역이다.
특정 양상에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 융합 파트너에 도입되어 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 상기 폴리펩티드는, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 양상들에서, 본 발명은 전체 효과기 기능이 아닌 일부만을 보유하는 Fc 영역을 고려하는데, 이들 변이체는, 생체내 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 반감기는 중요하지만 특정 효과기 기능(예를 들어, 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC))은 불필요하거나 또는 유해한 응용분야에서 바람직한 후보물질이 될 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행하여, Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 FcγR 결합이 결여되어 있지만(따라서 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음) FcRn 결합 능력은 유지하는지 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인, NK 세포는 오로지 FcγRIII만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적 실시예는 미국 특허 제 5,500,362 (예를 들어, Hellstrom, I. 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참고) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참고)에 설명되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유동 세포 분석을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 검정(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사능활성 세포독성 검정(Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어, Clynes 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 상기 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 C1q에 결합할 수 없고, 이로 인하여 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 실행될 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879와 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참고. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다(예를 들면, Gazzano-Santoro 외. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외. Blood. 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. 및 M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004) 참고). 또한 FcRn 결합과 생체내 제거율/반감기 결정은 해당 분야에 공지된 방법들을 이용하여 또한 실시될 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B. 외. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) WO 2013/120929 Al 참고).
감소된 효과기 기능을 가진 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 또는 그 이상의 치환을 가진 것들을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 “DANA” Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 특허 번호 7,332,581).
FcRs에 대한 결합이 개선된 또는 감소된 특정 Fc 영역들이 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참고.)
특정 양상들에 있어서, 폴리펩티드는 ADCC를 개선시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기는 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.
특정 양상들에서, 폴리펩티드는 FcγR 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예컨대 Fc 영역의 위치 234 및 235(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 특정 양상들에서, Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 D265A 및/또는 P329G를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 L234A, L235A 및 P329G (LALA-PG)이다. (예를 들어, WO 2012/130831 참고). 일부 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 L234A, L235A 및 D265A (LALA-DA)이다.
일부 양상들에서, Fc 영역 안에 예를 들어, 미국 특허 제 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 외 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (예를 들어, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 변경시키는 변경이 이루어진다.
태아로 모계 IgGs의 전달을 담당하는, 증가된 반감기와 신생아의 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선된 폴리펩티드들(Guyer 외, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994))은 US2005/0014934(Hinton 외)에서 설명된다. 이들 폴리펩티드는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 치환들을 가진 융합 파트너 Fc 영역을 내부에 포함한다. 이러한 Fc 변이체들에는 다음 중 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 치환을 갖는 것들이 포함된다: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예컨대 Fc 영역 잔기 434의 치환(예를 들어, 미국 특허 제 7,371,826; Dall'Acqua, W.F., 외, J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524를 참고).
마우스 Fc-마우스 FcRn 상호작용에 중요한 Fc 영역 잔기는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 확인되었다(예를 들어, Dall'Acqua, W.F., 외, J. Immunol 169 (2002) 5171-5180을 참고). 잔기 I253, H310, H433, N434, 및 H435 (EU 색인 넘버링)는 상호작용에 관여한다(Medesan, C., 외, Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., 외, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). 잔기 I253, H310 및 H435는 인간 Fc와 뮤린 FcRn의 상호작용에 중요한 것임이 밝혀졌다(Kim, J.K., 외, Eur.J.Immunol.29 (1999) 2819). 인간 Fc-인간 FcRn 복합체에 관한 연구는 잔기 I253, S254, H435, 및 Y436이 이러한 상호작용에 중요함을 보여주었다(Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., 외, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Yeung, Y. A. 외(J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)에서, 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437의 다양한 돌연변이체가 보고 및 조사되었다.
특정 양상들에 있어서, 폴리펩티드는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예를 들어, Fc-영역의 위치 253, 및/또는 310, 및/또는 435 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 이러한 폴리펩티드는 위치 253, 310 및 435에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 I253A, H310A 및 H435A이다. 예를 들어, Grevys, A., 외, J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508를 참고하라.
특정 양상들에서, 폴리펩티드는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예를 들어, Fc-영역의 위치 310, 및/또는 433, 및/또는 436(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 이러한 폴리펩티드는 위치 310, 433 및 436에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 H310A, H433A 및 Y436A이다. (예를 들어, WO 2014/177460 Al 참고).
특정 양상들에서, 폴리펩티드는 FcRn 결합을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예를 들어, Fc-영역의 위치 252, 및/또는 254, 및/또는 256(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 이러한 폴리펩티드는 위치 252, 254, 및 256에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 M252Y, S254T 및 T256E이다. Fc 영역 변이체들의 다른 예들에 관하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260; 미국 특허 제5,624,821; 및 WO 94/29351 참고.
B. 재조합 방법 및 조성물
일부 양상에서, 본원에서 보고된 바와 같은 방법에서 이용된 바와 같은 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
일부 양상에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 제조 방법이 제공되는데, 이 방법은 상기 제시된 바와 같이 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로, 상기 폴리펩티드를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
IL-18 폴리펩티드의 재조합 생산의 경우에, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 핵산은 쉽게 단리될 수 있고, 통상적인 절차를 사용하여 시퀀싱되거나 또는 재조합 방법에 의해 생산되거나 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.
폴리펩티드-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포에는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다.
일부 실시형태에서, 척추동물 세포가 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 개조시킨 포유동물 세포주들이 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, Graham, F.L. 외, J. Gen Virol. 36, (1977) 59-74에 설명된 293 또는 293T 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에 설명된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562); (예를 들면, Mather, J.P. 외, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에 설명된) TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 (Urlaub, G. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(1980) 4216-4220); 및 Y0, NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다.
일부 양상에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)다.
C. 분석
본원에 제공된 안정화된 IL-18 폴리펩티드들은 해당 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 그 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
1. 결합 분석 및 기타 분석
일부 양상에서, 본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 예를 들면, 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 결합 활성에 대해 테스트된다.
일부 양상에서, 본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα 또는 IL-18BP에 대한 결합 친화도, 즉 KD에 대해 테스트된다. 일부 양상에서, KD는 BIACORE® 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE®-2000, BIACORE®-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 또는 BIACORE® 8K를 사용하는 분석은, 예를 들어, ≤50 반응 단위(RU)의 스트렙타비딘 칩에서 고정된 표적(예를 들어, 비오티닐화된 IL-18Rα 또는 IL-18BP)을 사용하여 25°C 또는 37°C에서 수행된다. 또 다른 양상에서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화된다. ≤50 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해, 표적은 5 μl/분의 유속으로 주입하기 전 pH 4.8의 10 mM 아세트산나트륨으로 5 μg/ml(~0.2 μM)까지 희석된다. 표적의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 동역학 측정을 위해, 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 2배 또는 3배 연속 희석액을 HBS-P+ 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20)에 주입한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 예를 들어, 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 일대일(1:1) Langmuir 결합 모델(BIACORE ® 평가 소프트웨어 버전 3.2 또는 BIACORE® 8K 평가 소프트웨어)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(KD)는 비율 koff/kon로 계산된다. 예를 들어, Chen 등, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 참고.
BIAcore™ T200 기계를 이용한 다른 예시적인 분석에서, 예를 들면, 대략 300 RU를 달성하기 위해, 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 안정화된 IL-18 폴리펩티드가 단백질 A 칩 상에 포획된다. 일부 이런 실시형태에서, 정제된 표적의 연속 희석액이 37 ℃에서 100 μL/분의 유속으로 추가의 3 mM CaCl2를 포함하는 HBS-P 완충액에 주입된다. 결합 속도 (ka) 및 해리 속도 (kd)가 1:1 Langmuir 결합 모델(예를 들면, BIAcore™ T200 평가 소프트웨어 버전 2.0)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수(KD)는 kd/ka 비율로서 계산될 수 있다.
결합 속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106M-1 s-1을 초과하는 경우, 분광기, 예를 들어 정지-유동이 구비된 분광광도계(Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정시 증가하는 표적 농도의 존재 하에서 PBS(pH 7.2) 중의 20nM 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기법을 이용함으로써 결합 속도를 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 효능을 결정하기 위해 리포터 분석이 사용된다. 예시적인 분석은 다음과 같다. HEK293 세포는 IL-18 수용체를 발현하도록 안정적으로 형질감염된다. IL-18 수용체 신호전달은 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 발현을 유도하며, 이는 비색 시약을 사용하여 측정된다.
추가의 예시적인 분석에서, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 IFNγ 생산을 측정함으로써 천연 T 세포 분석을 사용하여 IL-18 폴리펩티드의 효능을 테스트할 수 있다. 예시적인 분석은 다음과 같다. 말초 혈액 단핵 세포는, 예를 들어, SepMate 단리 튜브(STEMCELL Technologies, 15460)를 사용하여 전혈로부터 단리된다. 인간 T 세포는, 예를 들어, 면역자기 음성 선택 키트(STEMCELL Technologies, 17951)를 사용하여 PBMC로부터 단리된다. 세포들을 CD3 및 CD28로 미리 코팅된 384 웰 플레이트에 1x104개 세포/웰로 시딩한다. 세포는 예를 들어, 0.5 내지 10,000 pM, 또는 5 내지 100,000 pM 농도 범위의 안정화된 IL-18 폴리펩티드로 자극된다. 세포를 NEAA, 피루브산 나트륨, β-머캅토에탄올 및 인간 IL-12가 보충된 10% FBS RPMI 배지에서 37℃및 5% CO2에서 인큐베이션한다. 24시간 후, 상청액 중의 IFN-γ 생산을 예를 들어, 인간 IFN-γ HTRF 키트(Cisbio, 62HIFNGPEG)를 사용하여 측정한다.
특정 실시형태에서, 안정화된 IL-18 단백질은 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 대해 테스트되고 SepMate 단리 튜브(STEMCELL Technologies, 15460)를 통해 전혈로부터 단리된다. 인간 T 세포는 면역자기 음성 선택 키트(STEMCELL Technologies, 17951)에 의해 PBMC로부터 단리된다. 세포들을 CD3(5ug/mL, Thermofisher, 16-0037-85) 및 CD28(5ug/mL, Biosciences 555725)로 미리 코팅된 384 웰 플레이트에 1x104개 세포/웰로 시딩한다. 인간 IL-18 자극 분석의 경우 세포의 농도는 0.5 내지 10,000pM 범위이다. 더욱 약화된 IL-18 분자의 경우, 농도는 5 내지 100,000pM 범위로 증가된다. 모든 처리제는 NEAA(희석 1:100, Gibco 11140-050), 피루브산나트륨(희석 1:100, Gibco 11360-070), b-머캅토에탄올(희석 1:1000, Gibco 21985-023) 및 인간 IL-12(10ng/mL, R&D, 219-IL-025/CF)이 보충된 10% FBS RPMI 배지에서 37℃및 5% CO2에서 인큐베이션된다. 24시간 후, 상청액 중의 IFN-γ 생산을 인간 IFN-γ HTRF 키트(Cisbio, 62HIFNGPEG)를 사용하여 측정한다.
D. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 양상에서, 본원에 제공된 안정화된 IL-18 폴리펩티드 중 어느 하나는 생물학적 샘플 내 IL-18BP 또는 IL-18Rα의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본원에서 사용된 용어 “검출하는”은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 일정한 양상에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 세포 또는 조직, 예컨대 객담, 분비 세포, 기도 상피 세포, 면역 세포, 폐 세포 또는 조직, 또는 기관지 세포 또는 조직을 포함한다.
일부 양상에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드가 제공된다. 추가 양상에서, 생물학적 샘플 중의 IL-18BP 또는 IL-18Rα의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 양상들에서, 상기 방법은 IL-18BP 또는 IL-18Rα에 대한 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 결합을 허용하는 조건하에서 생물학적 샘플을 본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 안정화된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18BP 또는 IL-18Rα 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 양상에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 예를 들면, IL-18BP 또는 IL-18Rα가 환자의 선별을 위한 바이오마커인 경우에, IL-18BP 또는 IL-18Rα를 이용한 요법에 적격인 대상체를 선별하는 데 이용된다.
특정 양상에서, 표지된 안정화된 IL-18 폴리펩티드가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예를 들어, 형광, 발색, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들어, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는, 이에 제한되지 않지만, 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 움벨리페론, 예를 들어, 반딧불 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제(미국 특허 4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온(dihydrophthalazinediones), 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 알카리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제와 같은 사카라이드 옥시다제, 우리카제 및 크산틴 옥시다제와 같은 헤테로고리 옥시다제를 포함하고, 그들은 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등과 같은 염색 전구체를 산화하기 위해 과산화수소를 채택하는 효소와 결합된다.
E. 약학 조성물
추가 양상에서, 예를 들어, 하기의 치료 방법들 중 임의의 것에 사용하기 위한 본원에 제공된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, 약학 조성물은 본원에서 제공된 임의의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 양상에서, 약학 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같이, 본원에서 제공된 임의의 폴리펩티드 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같은 안정화된 IL-18 단백질의 약학 조성물은 동결 건조된 조성물 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 폴리펩티드를 한 가지 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 약학적으로 허용되는 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이며, 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 히스티딘, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 낮은 분자량의(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 세포간(insterstitial) 약물 분산 물질, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(HYLENEX®, Halozyme, Inc.)을 포함한다. rHuPH20를 포함하는 특정 예시적인 sHASEGP 및 이를 이용하는 방법은 미국 공개 특허 출원 제2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 일부 양상에서, sHASEGP는 한 가지 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 병용된다.
본원의 약학 조성물은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 둘 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 화학요법제 및/또는 면역종양제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 면역종양제이다. 이러한 활성 성분은 의도한 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼(macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
지속 방출을 위한 약학 조성물이 제조될 수 있다. 지속 방출 제재의 적합한 예들에는 상기 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 약학 조성물은 일반적으로 멸균이다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다.
F. 치료 방법 및 투여 경로
본원에서 제공된 임의의 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 치료 방법에서 사용될 수 있다.
한 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드가 제공된다. 추가의 양상들에서, 암 치료에 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드가 제공된다. 암의 예에는, 제한없이, 암종, 선암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 치료할 수 있는 암에는 선암종(예를 들어, 결장직장 선암종, 위장 선암종, 또는 췌장 선암종)(이는 전이성 선암종(예를 들어, 전이성 결장직장 선암종, 전이성 위장 선암종, 또는 전이성 췌장 선암종) 일 수 있음), 식도암, 위장암 또는 위암, 소장암, 대장암, 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위장암, 결장직장암(CRC), 간세포 암종, 유방암, 직장암, 비소세포폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신장세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 및 다발성 골수종이 포함된다. 다른 실시형태에서, 암은, 호지킨 림프종을 제외하지만 배중심 B 세포 유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포 유사(ABC) DLBCL을 포함하는 하나의 분류의 성숙 B 세포암, 소포 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프모구 백혈병(CLL), 변연부 림프종(MZL), 소림프구성 백혈병(SLL), 림프형질세포 림프종(LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM), 중추신경계 림프종(CNSL), 버킷 림프종(BL), B세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 분류불가, 비장 미만성 적색속질 소 B세포 림프종, 변종 털세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B세포 림프종, CNS의 원발성 DLBCL, 원발성 피부 DLBCL, 다리 유형, 노인의 EBV 양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK 양성 거대 B세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8 관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종: 미만성 거대 B세포 림프종과 버킷 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종 또는 미만성 거대 B세포 림프종과 고전적 호지킨 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
특정 양상에서, 치료 방법에 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드가 제공된다. 특정 양상에서, 본 발명은 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 가진 개체의 치료 방법에서 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 한 양상에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기와 같은 적어도 하나의 추가 치료제(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 추가 치료제)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 양상에서, 본 발명은 세포 상의 IL-18 수용체를 활성화하는 데 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공한다. 특정 양상에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하여 세포 상의 IL-18 수용체를 활성화시키는 것을 포함하는, 개체의 세포 상의 안정화된 IL-18 수용체를 활성화하는 방법에 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 림프구에서 IFNγ 발현을 유도하는 데 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공한다. 특정 양상에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하여 림프구에서 IFNγ 발현을 유도하는 것을 포함하는, 개체의 림프구에서 IFNγ 발현을 유도하는 방법에 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 림프구를 활성화시키는 데 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공한다. 특정 양상에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하여 림프구를 활성화시키는 것을 포함하는, 개체의 림프구를 활성화시키는 방법에 사용하기 위한 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 준비에서 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 한 양상에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 암의 예에는, 제한없이, 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함된다. 이러한 암의 보다 구체적인 예에는 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 암종, 복막 암, 간세포 암, 위장암, 췌장암, 신경 교종, 자궁 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간 세포종, 유방암, 결장암, 결장 직장암, 자궁 내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 전립선 암, 외음부 암, 갑상선암, 간암종, 백혈병 및 기타 림프구 증식 장애, 및 다양한 종류의 두경부암이 포함된다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 한 추가 양상에서, 약제는 암을 가진 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 이러한 한 양상에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 양상에서, 상기 방법은 상기 암을 갖는 개체에게 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 양상에서, 상기 방법은 하기와 같은 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 제공된 임의의 양상들에 따른 “개체”는 바람직하게는 인간이다.
추가 양상에서, 본 발명은 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에서 제공된 임의의 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 양상에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 안정화된 IL-18 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 양상에서, 약학 조성물은, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이, 본원에서 제공된 임의의 안정화된 IL-18 폴리펩티드 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
본원 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 단독으로 투여되거나 또는 병용 요법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하는 것과 적어도 하나의 추가 치료제(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 추가 치료제)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 면역종양제 및/또는 화학요법제와 병용 투여된다.
특정 양상에서, 상기 병용 요법은 본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하는 단계 및 적어도 하나의 추가 치료제, 예를 들어, 종양 관련 항원; CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40, ICOS, HVEM, NKG2D, MICA, 2B4, IL-2, IL-12, IL-15, IL-27, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-1, CDN, HMGB1 또는 TLR 효능제; 또는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD47, SIRPα, B7H4, CD96, TIGIT, CD226, 프로스타글란딘, VEGF, 엔도텔린 B, IDO, 아르기나제, MICA/MICB, TIM-3, IL-10, IL-4 또는 IL-13 길항제에 결합하는 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 적어도 하나의 면역종양제와 병용 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역종양제는 활성화 동시자극 분자에 대해 지시되는 효능제이다. 일부 실시형태에서, 면역종양제는 면역 체크포인트 억제제이다. 다양한 실시형태에서, 면역종양제는 항체이다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 활성화 보조자극 분자를 촉진하거나 음성 보조자극 분자를 억제함으로써 T 세포 자극을 향상시키면 종양 세포 사멸을 촉진하여 암의 진행을 치료하거나 지연시킬 수 있다고 생각된다. 따라서 일부 예에서는 안정화된 IL-18 폴리펩티드가 활성화 보조자극 분자에 대해 지시되는 효능제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 활성화 보조자극 분자에는 CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40, ICOS, HVEM, NKG2D, MICA, 2B4, IL-2, IL-12, IL-15, IL-27, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-1, CDN, HMGB1 또는 TLR이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 활성화 보조자극 분자에 대해 지시되는 효능제는 CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40, ICOS, HVEM, NKG2D, MICA, 2B4, IL-2, IL-12, IL-15, IL-27, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-1, CDN, HMGB1, 또는 TLR에 결합하는 효능제 항체이다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 억제성 보조자극 분자에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 억제성 보조자극 분자에는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD47, SIRPα, B7H4, CD96, TIGIT, CD226, 프로스타글란딘, VEGF, 엔도텔린 B, IDO, 아르기나제, MICA/MICB, TIM-3, IL-10, IL-4, 또는 IL-13이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 억제성 보조자극 분자에 대해 지시되는 길항제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD47, SIRPα, B7H4, CD96, TIGIT, CD226, 프로스타글란딘, VEGF, 엔도텔린 B, IDO, 아르기나제, MICA/MICB, TIM-3, IL-10, IL-4, 또는 IL-13에 결합하는 길항제 항체이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CTLA-4(CD152로도 알려짐)에 대한 길항제, 예를 들어, 차단 항체와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 이필리무맙과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 트레멜리무맙(티실리무맙으로도 알려짐)과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 B7-H3(CD276으로도 알려짐)에 대한 길항제, 예를 들어, 차단 항체와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 MGA271과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 TGF-베타에 대한 길항제, 예를 들어, 메텔리무맙, 프레솔리무맙 또는 LY2157299와 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포 또는 세포독성 림프구(CTL))의 입양 전달을 포함하는 치료제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 우성-음성 TGF-베타 수용체, 예를 들어, 우성-음성 TGF-베타 유형 II 수용체를 포함하는 T 세포의 입양 전달을 포함하는 치료제와 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CD137(TNFRSF9, 4-1BB 또는 ILA로도 알려짐)에 대한 효능제, 예를 들어, 활성화 항체와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 우렐루맙과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 우토밀루맙과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 INBRX-105와 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CD40에 대한 효능제, 예를 들어, 활성화 항체와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CP-870893과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 APX005M과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 OX40(CD134로도 알려짐)에 대한 효능제, 예를 들어, 활성화 항체와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 항-OX40 항체(예를 들어, AgonOX)와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 PF-04518600(PF-8600)과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 MEDI0562, MEDI6469, 및/또는 MEDI6383과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 GSK3174998과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 BMS986178과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CD27에 대한 효능제, 예를 들어, 활성화 항체와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 바릴루맙과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 ICOS에 대해 지시되는 효능제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 보프라텔리맙과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 GSK3359609와 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 IL-15 효능제와 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 IL-27 효능제와 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 GITR에 대해 지시되는 효능제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 TRX 518-001과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 MK-4166과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 BMS-986156과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 INCAGN01876과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CD70에 대해 지시되는 효능제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 쿠사투주맙과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 VISTA에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, VISTA 길항제는 CA-170이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CCR4에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, CCR4 길항제는 모가물리주맙이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 B7-H3에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, B7-H3 길항제는 MGD009이다. 일부 예에서, B7-H3 길항제는 8H9이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 TIM-3에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, TIM-3 길항제는 TSR-022이다. 일부 예에서, TIM-3 길항제는 MBG453이다. 일부 예에서, TIM-3 길항제는 Sym023이다. 일부 예에서, TIM-3 길항제는 올레클루맙이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 LAG-3에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, LAG-3 길항제는 렐라틀리맙이다. 일부 예에서, LAG-3 길항제는 IMP321(에프틸라지모드 알파)이다. 일부 예에서, LAG-3 길항제는 LAG525이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 KIR(2DL1-3)에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, KIR 길항제는 리릴루맙이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 IDO-1,2에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, IDO-1,2 길항제는 인독시모드이다. 일부 예에서, IDO-1,2 길항제는 에파카도스타트이다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 인돌아민-2,3-디옥시게나제(IDO)에 대해 지시된 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, IDO 길항제는 1-메틸-D-트립토판(1-D-MT로도 공지됨)이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 TIGIT에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, TIGIT 길항제는 티스렐리주맙이다. 일부 예에서, TIGIT 길항제는 티라골루맙이다. 일부 예에서, TIGIT 길항제는 BMS-986207이다. 일부 예에서, TIGIT 길항제는 MTIG7192A이다. 일부 예에서, TIGIT 길항제는 AB154이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 A2aR에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, A2aR 길항제는 시포라데난트이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 형질전환 성장 인자 β에 대해 지시되는 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 형질전환 성장 인자 β 길항제는 M7824이다. 일부 예에서, 형질전환 성장 인자 β 길항제는 칼루니세르팁이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CD47에 대한 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, CD47 길항제는 TTI-621이다. 일부 예에서, CD47 길항제는 ALX148(에보르파셉트)이다. 일부 예에서, CD47 길항제는 마그롤리맙이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CD73에 대해 지시된 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, CD73은 올레클루맙이다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 톨 유사 수용체에 대한 제제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 PolyICIC와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 레프티톨리모드와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 SD101과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 DSP-0509와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 린타톨리모드와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CMP-001과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 인터루킨 2 수용체에 대해 지시되는 제제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 NKTR-214와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 RO6874281과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 THOR-707과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 아르기나제 억제제와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 CB-1158과 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 종양용해성 펩티드와 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 LTX-315와 병용 투여될 수 있다.
일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 인터루킨 10과 병용 투여될 수 있다. 일부 예에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 페길로데카킨과 병용 투여될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 암을 치료 및/또는 진행을 지연시키기 위해 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 PD-1 축 결합 길항제와 함께 사용하는 방법이 제공된다. 암을 가진 개체에게 유효량의 안정화된 IL-18 폴리펩티드 및 유효량의 PD-1 축 결합 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 가진 개체에서 면역 기능을 향상시키는 방법이 본원에 추가로 제공된다. PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다.
용어 “PD-1 축 결합 길항제”는, T-세포 기능(예를 들어, 증식, 사이토카인 생산, 표적 세포 사멸)을 복구하거나 증진하는 결과를 갖는, PD-1 신호전달 축 상의 신호전달로부터 유발된, T-세포 기능이상을 제거하기 위하여, PD-1 축 결합 파트너와 이의 결합 파트너 중 하나 또는 그 이상의 상호작용을 억제하는 분자이다. 본원에서 사용되는, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다.
용어 “PD-1 결합 길항제”는 PD-1 및 이의 결합 파트너 중 하나 이상, 예를 들어, PDL1, PDL2의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 간섭하는 분자이다. 일부 실시형태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 그 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, 상기 PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PDL1 및/또는 PDL2에 결합하는 것을 억제한다. 예를 들면, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 PDL1 및/또는 PDL2와의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 제거하거나 또는 간섭하는 항-PD-1 항체, 이들의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 기타 분자를 포함한다. 한 실시형태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1을 통하여 T 림프구 매개된 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통하여 매개된 음성 보조자극 신호를 감소시켜, 이상기능 T-세포의 기능이상을 더 적게 한다(예를 들어, 항원 인지에 대한 효과기 반응을 향상시킴). 일부 실시형태들에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 구체적인 양상에서, PD-1 결합 길항제는 니볼루맙이다. 또 다른 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 펨브롤리주맙이다. 또 다른 구체적인 양상에서, PD-1 결합 길항제는 CT-011(hBAT 또는 hBAT-1로도 알려짐)이다. 또 다른 구체적인 양상에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224(B7-DCIg로도 알려짐)이다.
용어 “PDL1 결합 길항제”는, PDL1 의, 이의 결합 파트너, 예를 들어, PD-1, B7-1 중 하나 이상과의 상호작용으로부터 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 제거 또는 저해하는 분자이다. 일부 실시형태에서, PDL1 결합 길항제는 결합 파트너에 대한 PDL1의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, 상기 PDL1 결합 길항제는 PDL1이 PD-1 및/또는 B7-1에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시형태에서, PDL1 결합 길항제는 PDL1의 이의 결합 파트너 중 하나 또는 그 이상, 예를 들어, PD-1, B7-1과의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 저해하거나, 제거하거나 또는 간섭하는 항-PDL1 항체, 이들의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 기타 분자를 포함한다. 한 실시형태에서, PDL1 결합 길항제는 기능장애성 T 세포를 더 적게 기능장애성이 되도록 만들기 위해 (예를 들면, 항원 인식에 대한 효과 반응을 향상시키기 위해), PDL1을 통한 T 림프구 매개된 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 이것을 통해 매개되는 음성 동시자극성 신호를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, PDL1 결합 길항제는 항-PDL1 항체이다. 구체적인 양상에서, 항-PDL1 항체는 아테졸리주맙이다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 항체는 아벨루맙이다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 항체는 더발루맙이다.
일부 양상에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 암 치료를 위한 병용 요법에 사용하기 위한 것이다. 한 실시형태에서, 이러한 병용 요법은 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하는 단계 및 적어도 하나의 체크포인트 억제제, 예를 들어, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙을 포함하는 항-PD-1 항체, 또는 이필리무맙을 포함하는 항-CTLA-4 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 병용 요법은 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하는 단계 및 항-CTLA-4 항체 및 항-PD-1 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 병용 요법은 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하는 단계 및 이필리무맙 및 니볼루맙을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 BRAF V600 돌연변이가 있는 흑색종 치료를 위한 병용 요법에 사용하기 위한 것이다. 한 실시형태에서, 병용 요법은 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하는 단계 및 적어도 하나의 MAPK 경로 억제제, 예를 들어, 무라페닙, 코비메티닙; 다브라페닙 또는 트라메티닙을 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 병용 요법은 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 투여하는 단계 및 적어도 하나의 BRAF 억제제, 예를 들어, 베무라페닙, 코비메티닙 또는 다브라페닙, 및 적어도 하나의 MEK 억제제, 예를 들어, 트라메티닙을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 요법은 안정화된 IL-18 폴리펩티드 및 베무라페닙 + 코비메티닙; 또는 다브라페닙 + 트라메티닙을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 병용 요법은 안정화된 IL-18 폴리펩티드, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙, 및 BRAF 억제제, 예를 들어, 베무라페닙, 코비메티닙 또는 다브라페닙을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 이러한 병용 요법은 병용 투여 (여기서 두 가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 약학 조성물 내에 포함된다), 및 별개 투여를 포괄하고, 이러한 예에서, 본원 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 투여는 추가 치료제 또는 치료제들의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다.한 양상에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내에 발생한다. 한 양상에서, 안정화된 IL-18 폴리펩티드 및 추가 치료제는 치료 1일차에 환자에게 투여된다. 본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 또한 수술, 화학 요법(즉, 화학요법제와 병용) 및/또는 방사선 요법과 병용될 수 있다.
본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드(및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료의 경우 필요에 따라 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는 부분적으로는 투여가 단기인지 만성인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다. 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 비롯한(그러나 이에 제한되지 않는) 다양한 투여 일정이 본원에서 고려된다.
본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려해야 할 요소에는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 공지된 기타 요소가 포함된다. 안정화된 IL-18 폴리펩티드는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 문제의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 선택적으로 제형화된다. 이러한 다른 물질들의 유효량은 약학 조성물에 존재하는 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기에서 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 설명된 투여 경로로 동일한 투여량으로 이용되거나, 또는 본원에서 논의된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 이용된다.
질환의 예방 또는 치료에 있어서, 본 발명의 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 적절한 용량(단독으로 사용될 때 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료 제제와 병용될 때)은 치료대상 질환의 유형, 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 상기 안정화된 IL-18 폴리펩티드의 투여가 예방 목적인지 아니면 치료 목적인지 여부, 이전 치료, 상기 환자의 임상 병력 및 상기 안정화된 IL-18 폴리펩티드에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 이러한 안정화된 IL-18 폴리펩티드는 환자에게 한 번에 또는 일련의 치료일정에 걸쳐 적절하게 투여된다. 수일 또는 보다 장기에 걸친 반복된 투여를 위하여, 병태에 따라, 일반적으로 질환 증세가 바람직하게 억제될 때까지 치료는 지속될 것이다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들면 상기 환자는 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 안정화된 IL-18 폴리펩티드를 제공받는다). 초기에는 보다 높은 부하 용량을, 후속하여 보다 낮은 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술과 분석법에 의해 모니터링될 수 있다.
G. 제조 물품
본 발명의 일부 양상에서, 상기 설명된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 상기 제조 물품은 용기 및 용기 위에 또는 용기에 결합된 라벨 또는 약품 설명서를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니, 등등을 포함한다. 용기는 다양한 재료들, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 및 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물에서 적어도 한 가지 활성제는 본원 발명의 폴리펩티드이다. 라벨 또는 약품 설명서에는 이 조성물이 선택된 병태 치료에 사용된다는 것이 명시되어 있다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 포함된 제1 용기, 여기서 상기 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하고; 및 (b) 조성물이 포함된 제2 용기, 여기서 상기 조성물은 또 다른 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에서 제조 물품은, 조성물이 선택한 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 라벨 또는 약품 설명서를 더 포함할 수 있다. 한편, 또는 추가적으로, 상기 제조 물품은 약학적으로-허용되는 완충액, 예를 들어, 주사(BWFI)용 정균수, 포스페이트-완충된 염수, Ringer 용액 및 덱스트로즈 용액이 포함된 제2(또는 제 3) 용기를 더 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기가 포함된 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 더 포함할 수 있다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 감안하여, 다양한 다른 실시예가 실시될 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1: 재료 및 방법
재조합 단백질
성숙한 인간 IL-18 변이체는 포유동물 세포(HEK293 또는 CHO)에서 분비를 위한 N-말단의 이소성 신호 펩티드, 이어서 성숙한 IL18(Y37-D193), TEV 프로테아제 절단 서열, His 태그 및 단량체 인간 Fc와의 재조합 융합체로서 생산되었다(도 1A). 성숙한 마우스 IL-18 변이체는 포유동물 세포(HEK293 또는 CHO)에서 분비를 위한 N-말단의 이소성 신호 펩티드, 이어서 성숙한 IL18(N36-S192), TEV 프로테아제 절단 서열, His 태그 및 마우스 혈청 알부민(MSA)과의 재조합 융합체로서 발현되었다(도 1A). 이러한 단백질은 컨디셔닝된 배지로부터 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제되었다. C-말단 태그는 TEV 프로테아제 소화에 의해 제거되었고, 및 이러한 프로테아제 및 소화된 C-말단 태그는 감산 친화성 크로마토그래피(subtractive affinity chromatography)에 의해 IL-18로부터 분리되었다.
성숙한 인간 및 마우스 야생형 IL-18은 대장균에서 N-말단 His/SUMO 태그가 있는 재조합 융합체로 생산되었다. 세포 용해 및 정화 후, 친화성 크로마토그래피에 이어 SEC를 통해 단백질을 정제했다. N-말단 His/SUMO 태그는 SUMO 프로테아제 ULP1로 절단하여 제거되었으며 소화 생성물은 IL-18로부터 감산 친화성 크로마토그래피에 의해 분리되었다.
결합 동역학 상수를 측정하기 위해, 재조합 인간 및 마우스 IL-18Rα, 인간 IL-18BP(이소형 A) 및 마우스 IL-18BP(이소형 D) 세포외 도메인을 포유동물 세포에서 생산하고 비오티닐화하고 친화성 크로마토그래피, 이후 SEC로 정제하였다.
IL-18의 열안정성
WT IL-18 및 IL-18 변이체의 열안정성 측정을 위해, 단백질들을 20mM HEPES pH 7.2, 150mM NaCl(비환원) 또는 20mM HEPES pH 7.2, 150mM NaCl, 10mM TCEP(환원) 중 0.5 mg/ml로 제형화했다. 아미노산 변화가 WT와 비교하여 단백질의 열안정성에 미치는 영향을 이해하기 위해 시차 주사 형광측정법(DSF)을 수행했다. DSF는 형광 염료의 존재에서 단백질의 열적 풀림을 모니터링하고, 및 전형적으로, 실시간 PCR 기기를 이용함으로써 수행된다. SYPRO 오렌지 염료(Invitrogen, 카탈로그 # S6650)를 20mM HEPES pH 7.2, 150mM NaCl에 1:20으로 희석한다. 희석된 염료 1μl를 웰의 IL-18 단백질 24μl에 첨가한다. 온도가 실시간 PCR 기기 (Bio-Rad CFX 96 RT)에서 20℃에서 100℃로 증가함에 따라서, 형광 강도가 플롯되고 전이 곡선 (Tm)의 변곡점이 예를 들면, 볼츠만 방정식을 이용하여 계산된다. Nature Protocols, 2007, 2:2212-2221 참고.
표면 플라즈몬 공명
SPR 실험은 Biacore 8K(Cytiva)를 사용하여 37°C의 온도에서 수행되었다. 비오티닐화된 인간 또는 마우스 IL-18Rα 및 IL-18BP를 Biacore 스트렙타비딘 센서 칩(시리즈 S 센서 칩 SA, Cytiva)에 고정하여 Rmax ≤ 50 RU를 산출했다. HBS-P+ 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20)으로 3배 희석을 5회하여 측정을 수행했다. 단일 주기 동역학 방법을 사용하여 상호작용을 평가하고 Biacore 8K 평가 소프트웨어로 분석하여 1:1 결합 모델에 적합시켰다.
효능 분석(T-세포 분석)
말초 혈액 단핵 세포는, SepMate 단리 튜브(STEMCELL Technologies, 15460)를 사용하여 전혈로부터 단리된다. 인간 T 세포는 면역자기 음성 선별 키트(STEMCELL Technologies, 17951)에 의해 PBMC로부터 단리되었다. 세포들을 CD3(5ug/mL, Thermofisher, 16-0037-85) 및 CD28(5ug/mL, Biosciences 555725)로 미리 코팅된 384 웰 플레이트에 1x104개 세포/웰로 시딩하였다. 인간 IL-18 자극 분석의 경우 세포는 0.5 내지 10,000 pM 범위의 농도로 자극되었다. 더욱 약화된 IL-18 분자의 경우, 농도는 5 내지 100,000pM 범위로 증가되었다. 모든 처리제는 NEAA(희석 1:100, Gibco 11140-050), 피루브산나트륨(희석 1:100, Gibco 11360-070), b-머캅토에탄올(희석 1:1000, Gibco 21985-023) 및 인간 IL-12(10ng/mL, R&D, 219-IL-025/CF)이 보충된 10% FBS RPMI 배지에서 37℃및 5% CO2에서 인큐베이션된다. 24시간 후, 상청액 중의 IFN-γ 생산을 인간 IFN-γ HTRF 키트(Cisbio, 62HIFNGPEG)를 사용하여 측정하였다.
실시예 2: 야생형 IL-18은 불안정하고 포유동물 세포에서 재조합적으로 생산하기가 어렵다.
포유동물 숙주 세포에서 IL-18을 생산하기 위해, 이소성 신호 펩티드를 성숙한 형태의 IL-18에 재조합적으로 융합시키고, 안정한 융합 파트너를 C-말단에 융합시켰다-인간 IL-18의 경우 단량체 Fc [Ying 외, mAbs, 2014], 또는 마우스 오쏠로그의 경우 알부민(도 1). 친화도 정제 후, 야생형 인간 IL-18은 Fc 태그의 대략적인 질량에 상응하는, 높은 수준의 응집 및 더 낮은 분자량 분해 산물을 가졌고(도 2A), 기능성 IL-18 융합 단백질은 검출되지 않았다. 반응성이 높은 유리 천연 시스테인의 잠재적인 책임을 줄이기 위해, 이들 시스테인이 세린(“hCS” 및 “mCS”)으로 대체된 구조체들을 생성했다. 이로 인해 응집은 제거되었지만, 생산 수율은 보통 수준이었고 분자의 열안정성은 낮았다(도 2C).
실시예 3: 이황화물 안정화 IL-18 변이체 조작
생산 수율과 열안정성은 단백질 치료제의 중요한 품질 속성이다. IL-18 안정성을 향상시키기 위해, IL-18 결정 구조를 기반으로 서로 5Å 이내의 -탄소 거리를 갖는 잠재적 치환 및 이황화 결합의 형성을 위한 잔기 쌍을 식별하였다. 의도한 이황화 결합에 관여하지 않는 경우, 천연 시스테인은 세린으로 대체되었다. 인간 IL-18 변이체에서의 잔기 치환은, 그 변이체 명칭 및 각각의 WT 인간 IL-18에 대한 치환을 포함하여 표 2에 제시되어 있다. 마우스 IL-18 변이체에서의 잔기 치환은, 그 변이체 명칭 및 각각의 WT 마우스 IL-18에 대한 치환을 포함하여 표 3에 제시되어 있다.
표 2
* “DR”은 “미끼 저항성”을 의미하며 IL-18BP 결합을 유의하게 감소시키는 돌연변이가 포함되어 있음을 나타낸다.
표 3
실시예 4: 이황화물-안정화 IL-18 변이체의 특성 분석
CHO 또는 HEK293 포유동물 숙주 세포에서 생산된 IL-18 변이체를 발현 수율 및 응집 수준에 대해 평가하였다. 인간 IL-18에 대한 결과를 도 2 및 표 4에 나타내었다. 마우스 IL-18에 대한 결과를 도 2 및 표 5에 나타내었다.
표 4
표 5
이황화물-안정화 인간 및 마우스 IL-18 변이체는 수율이 유의하게 증가한 것으로 나타났으며, 이황화물-안정화 인간 IL-18 변이체는 WT IL-18에 비해 응집체 수준이 감소한 것으로 나타났다. 특히, L45C/E192C는 단일 단계 정제 후 검출가능한 응집이 없었으며 인간 야생형 IL-18 또는 hCS IL-18(여기서 천연 시스테인이 세린으로 대체되어 있음) 중 하나 보다 수십배 더 높은 수율을 보였다. 균등한 마우스 변이체인 T44C/L189C를 mCS와 비교할 때 수율 증가도 관찰되었다.
또한, 시차 주사 형광법(DSF)에 의한 열안정성 평가를 위해 선택된 이황화물-안정화 IL-18 변이체들은 모두 비환원 조건하에서 각각의 WT IL-18 대비 향상된 겉보기 용융 온도를 나타냈으며, L45C/E192C는 인간 야생형 IL-18 대비 섭씨 15도 이상의 용융 온도 증가를 나타냈다(표 6).
표 6
또한, 이황화물-안정화 IL-18 변이체에는 유리 티올이 존재하지 않는다. 30mM 메틸 메탄티오술포네이트(MMTS)를 첨가한 후 LC/MS로 측정한 달톤(Da) 단위의 IL-18 변이체들의 실험적 질량이 아래 표 7에 나와 있다. MMTS의 접합으로 인해 유리 티올당 45.99 Da의 질량 추가 증가가 발생한다. 이론적 질량에는, 안정화된 변이체들의 경우 유리 시스테인 티올이 없다는 가정이 포함되지만, 인간 WT의 경우에는 그렇지 않다.
표 7
인간 L45C/E192C 및 A162C/I185C 변이체들의 결정 구조가 규명되었으며 기존에 보고된 WT IL-18의 구조와 유사한 것으로 밝혀졌다. 두 구조 모두 표 7의 질량 분석 데이터와 일치하는 예상했던 새로운 이황화물 형성을 확인시켜 준다. 도 6A-6B 참고.
실시예 5: 이황화물-안정화 IL-18 변이체의 결합 동역학
IL-18 수용체인 IL-18Rα 및 미끼 수용체인 IL-18BP에 대한 결합 동역학을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 분석하기 위한 변이체들의 서브세트를 선택했다(표 8). 두 가지를 제외하고 모든 동역학 상수는 야생형 IL-18의 크기 범위 내에 있다. 놀랍게도 N50C 및 N50C/L174C 변이체는 IL-18Rα에 대해 최대 81 nM까지 검출 가능한 결합이 없었으나 IL-18BP에 대해서는 강한 결합을 유지한다.
표 8
실시예 6: 이황화물-안정화 IL-18 변이체의 효능
변이체가 WT에 비해 효능 차이가 있는지 확인하기 위해, IFNγ 생산을 측정하는 천연 T 세포 분석에서 EC50을 평가했다. IFNγ 생산은 IL-18 변이체를 이용한 치료에 대한 반응으로 측정된다.
분석 결과를 도 3A-3B 및 표 9에 나타낸다. SPR에 의한 관찰결과과 유사하게, 대부분의 변이체는 N50C 및 N50C/L174C를 제외하고 천연 T 세포 분석에서 인간 야생형 IL-18과 비등한 EC50을 가졌다. Y37C/S91C는 또한 인간 야생형 IL-18에 비해 효능이 유의하게 감소하였고, S46C/I85C 및 F57C/T81C는 효능이 다소 감소하였다(도 3A). N50C 함유 변이체는 효능이 수십 배 이상 감소했다(표 9). IL-18 변이체에 대해 IFNγ 발현의 최대 유도값인 Emax 또한 결정되었다. 도 3A 및 표 9에서 보는 바와 같이, S101C/T109C 변이체는 인간 야생형 IL-18과 유사한 EC50을 가졌으나, Emax는 대략 30% 더 낮았다. 나머지 변이체는 Emax 값이 인간 야생형 IL-18의 20% 이내였다. 마우스 변이체 T44C/L189C, T44C/L189C MSA 및 T44C/L189C Fc 모두는 EC50 및 Emax가 마우스 야생형 IL-18과 비등하였다(표 9 및 도 3B).
표 9
실시예 7: MC38 결장암 모델에서 마우스 IL-18 T44C/L189C Fc의 효능
첫 번째 실험에서는 C57BL-6 마우스에 100만 개의 MC38 세포를 피하 접종했다. 종양이 약 130-230 mm3의 평균 종양 부피에 도달했을 때(접종 후 대략 7-9일이었음) 치료가 시작되었다. 모든 그룹들은 총 5회 투여 동안 매주 2회 투여되었다. 마우스 IL-18 T44C/L189C Fc(“dsIL-18Fc”) 그룹에 0.1, 1 또는 5 mg/kg을 복강내(IP) 투여했다. 항-PD-L1 항체와 대조 항체는 각각 10 mg/kg으로 제1 용량은 정맥 내로, 후속 용량은 IP로 투여했다.
두 번째 실험에서는 C57BL-6 마우스에 10만 개의 MC38 세포를 피하 접종했다. 종양이 약 130-230 mm3의 평균 종양 부피에 도달했을 때(접종 후 대략 14-18일이었음) 치료가 시작되었다. IL-18 WT 및 PBS 대조 그룹 모두 총 5회 투여 동안 매주 2회 투여되었다. IL-18 WT 그룹에는 3 mg/kg(7.4 mg/kg의 dsIL-18Fc에 해당하는 몰당량)를 IP 투여했다.
결과를 도 5A 및 5B에 나타낸다. 놀랍게도, 3 mg/kg의 WT IL-18을 사용한 치료는 단일 제제로서 의미 있는 종양 성장 억제를 나타내지 않았지만(도 5A), 마우스 IL-18 T44C/L189C Fc(“dsIL-18Fc”)(IL-18BP에 대해 WT IL-18과 유사한 효능 및 친화도를 가짐(예를 들어, 표 8 참고))를 사용한 치료는 1 mg/kg 및 5 mg/kg에서 단일 제제 종양 성장을 중간 내지 강하게 억제하였으며, 이는 항-PD-L1 항체 치료와 병용한 경우 더욱 향상되었다(도 5B). 이러한 결과는 IL-18BP 결합을 제거하는 것이 IL-18 변이체의 효능에 필요하지 않음을 시사한다.
IV. 특정 서열들의 표
서열목록 전자파일 첨부

Claims (91)

  1. 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드이며,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 또는 적어도 97% 동일하며,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 한 쌍의 시스테인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 유리 시스테인을 포함하지 않는 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 한 쌍 또는 두 쌍의 시스테인을 포함하고,
    각 시스테인 쌍은 이황화 결합을 형성하는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개 모두의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환된 것인 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개 모두의 시스테인이 세린으로 치환된 것인 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 치환 C74S, C104S, C112S 및/또는 C163S 중 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 포함하고,
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
    a) L45C 및 E192C;
    b) Y37C 및 S91C;
    c) S43C 및 S86C;
    d) S46C 및 V189C;
    e) S46C 및 I85C;
    f) V47C 및 Q190C;
    g) N50C;
    h) N50C 및 L174C;
    i) F57C 및 T81C;
    j) D90C 및 A97C;
    k) V98C 및 Q139C;
    l) T99C 및 P124C;
    m) S101C 및 T109C;
    n) I107C 및 N123C;
    o) R140C 및 Q150C; 및
    p) A162C 및 I185C;
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
  8. 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드이며,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 또는 적어도 97% 동일하며,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
    a) L45C 및 E192C;
    b) Y37C 및 S91C;
    c) S43C 및 S86C;
    d) S46C 및 V189C;
    e) S46C 및 I85C;
    f) V47C 및 Q190C;
    g) N50C;
    h) N50C 및 L174C;
    i) F57C 및 T81C;
    j) D90C 및 A97C;
    k) V98C 및 Q139C;
    l) T99C 및 P124C;
    m) S101C 및 T109C;
    n) I107C 및 N123C;
    o) R140C 및 Q150C; 및
    p) A162C 및 I185C;
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
    a) L45C 및 E192C;
    b) Y37C 및 S91C;
    c) S43C 및 S86C;
    d) S46C 및 V189C;
    e) S46C 및 I85C;
    f) V47C 및 Q190C;
    g) F57C 및 T81C;
    h) D90C 및 A97C;
    i) V98C 및 Q139C;
    j) T99C 및 P124C;
    k) S101C 및 T109C;
    l) I107C 및 N123C;
    m) R140C 및 Q150C; 및
    n) A162C 및 I185C;
    아미노산 치환 C74S, C104S, C112S 및 C163S를 포함하며,
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
  10. 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 다음으로부터 선택된 아미노산 치환 세트를 포함하고:
    a) N50C, C74S, C104S, 및 C112S; 및
    b) N50C, C74S, C104S, 및 L174C;
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 5, 6, 8, 9, 12, 13, 15, 18, 19-24, 및 27로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 것인 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 5, 6, 8, 9, 12, 13, 15, 18, 19-24, 및 27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18Rα에 결합하는 폴리펩티드.
  14. 제11항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명으로 측정 시 100 nM 미만, 또는 50 nM 미만, 또는 30 nM 미만, 또는 20 nM 미만, 10 nM 미만, 0.1 nM에서 100 nM 사이 또는 1 nM에서 100 nM 사이의 친화도로 IL-18Rα에 결합하는 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    야생형 IL-18에 비해 IL-18Rα에 유의하게 감소된 친화도로 결합하거나,
    IL-18Rα에 검출가능하게 결합하지 않는 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 50 nM 초과, 60 nM 초과, 70 nM 초과, 80 nM 초과, 90 nM 초과, 100 nM 초과, 50 nM에서 1 mM 사이, 60 nM에서 1 mM 사이, 70 nM에서 1 mM 사이, 80 nM에서 1 mM 사이의 친화도로 IL-18Rα에 결합하는 폴리펩티드.
  17. 제15항에 있어서, 표면 플라스몬 공명으로 측정 시 최대 81 nM까지 IL-18Rα에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18BP에 결합하는 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명으로 측정 시 1 nM 미만, 100 pM 미만, 또는 50 pM 미만, 또는 30 pM 미만, 또는 20 pM 미만, 10 pM 미만, 1 fM에서 1 nM 사이, 10 fM에서 1 nM 사이, 1 fM에서 100 pM 사이, 10 fM에서 100 pM 사이, 1 fM에서 50 pM 사이, 10 fM에서 50 pM 사이, 1 fM에서 30 pM 사이, 또는 10 fM에서 30 pM 사이의 친화도로 IL-18BP에 결합하는 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 검정에서 1 nM 미만, 800 pM 미만, 700 pM 미만, 600 pM 미만, 500 pM 미만, 400 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 1 pM에서 1 nM 사이, 1 pM에서 800 pM 사이, 1 pM에서 500 pM 사이, 또는 1 pM에서 300 pM 사이의 EC50으로 IL-18 수용체를 통해 신호전달을 유도하는 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관 내 인간 림프구에서 IFNγ 발현을 유도하는 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, 림프구는 T 세포 또는 NK 세포인 폴리펩티드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 시험관 내 인간 T 세포에서 1 nM 미만, 800 pM 미만, 700 pM 미만, 600 pM 미만, 500 pM 미만, 400 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 1 pM에서 1 nM 사이, 1 pM에서 800 pM 사이, 1 pM에서 500 pM 사이, 또는 1 pM에서 300 pM 사이의 EC50으로 IFNγ 발현을 유도하는 폴리펩티드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 인간 림프구에서 IFNγ 발현을 야생형 인간 IL-18보다 실질적으로 감소된 정도로 유도하는 폴리펩티드.
  25. 제24항에 있어서, 림프구는 T 세포 또는 NK 세포인 폴리펩티드.
  26. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 Y37, L41, K44, M87, K89, S91, Q92, P93, G95, M96, E113, Q139, S141, D146, N147, M149, V189, 및 N191로부터 선택된 위치에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하고,
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 Y37H, Y37R, L41H, L41I, L41Y, K44Q, K44R, M87T, M87K, M87D, M87N, M87E, M87R, K89R, K89G, K89S, K89T, S91K, S91R, Q92E, Q92A, Q92R, Q92V, Q92G, Q92K, Q92L, P93L, P93G, P93A, P93K, G95T, G95A, M96K, M96Q, M96R, M96L, E113D, Q139E, Q139K, Q139P, Q139A, Q139R, S141R, S141D, S141K, S141N, S141A, D146H, D146K, D146N, D146Q, D146E, D146S, D146G, N147H, N147Y, N147D, N147R, N147S, N147G, M149V, M149R, M149T, M149K, V189I, V189T, V189A, N191K, 및 N191H로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 위치 M87, M96, S141, D146 및 N147에; 또는 위치 M87, K89, Q92, S141 및 N147에 치환을 추가로 포함하고,
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는
    치환 (i) M87T 또는 M87K; (ii) M96K 또는 M96L; (iii) S141D, S141N, 또는 S141A; (iv) D146K, D146N, D146S, 또는 D146G; 및 (v) N147Y, N147Y, N147R, 또는 N147G를 추가로 포함하거나; 또는
    치환 (i) M87K; (ii) K89G 또는 K89S; (iii) Q92G, Q92R, 또는 Q92L; (iv) D146N, D146S, 또는 D146G; 및 (v) N147R 또는 N147G를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 Y37, L41, D53, E67, T70, D71, S72, D73, D76, N77, M87, Q91, M96, Q139, H145, M149, 및 R167로부터 선택된 위치에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하고,
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 폴리펩티드.
  31. 제30항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 Y37D, Y37F, Y37H, Y37L, L41F, L41H, D53A, D53G, D53R, D53H, E67A, E67T, E67G, E67K, E67R, T70A, T70K, T70E, D71S, D71A, D71Y, S72N, S72K, S72R, D73P, D73A, D73R, D73H, D73L, D73V, D76Y, D76S, D76A, N77K, N77S, N77R, M87F, M87L, M87I, Q91H, M96L, M96F, M96I, Q139L, Q139I, H145A, H145P, H145D, M149L, M149I, M149F, 및 R167S로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 치환을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  32. 제1항 내지 제29항, 제30항 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 치환 D53G, E66A, 및 Q139L이나 Q139I 중 하나를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  33. 제32항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 치환 D71S 및 M87F를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 파트너를 포함하는 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서, 융합 파트너가 없는 변형된 IL-18 폴리펩티드보다 더 긴 반감기를 갖는 폴리펩티드.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 융합 파트너는 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민, 또는 항원 결합 도메인인 폴리펩티드.
  37. 제36항에 있어서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 도메인인 폴리펩티드.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 파트너를 포함하지 않는 폴리펩티드.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및
    접합체 모이어티
    를 포함하는 접합체.
  40. 제39항에 있어서, 접합체 모이어티는 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 접합체.
  41. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  42. 제41항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포.
  44. 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법이며,
    폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 제42항 또는 제43항의 숙주 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    숙주 세포로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포 또는 293 세포인 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 폴리펩티드.
  50. 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 또는
    제39항 또는 제40항의 접합체, 및
    약학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 약학 조성물.
  51. 제50항에 있어서,
    추가 치료제
    를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 추가 치료제는 면역종양제인 약학 조성물.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 면역종양제는 면역 체크포인트 억제제 또는 면역 보조자극 분자의 효능제인 약학 조성물.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 종양 관련 항원; CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40, ICOS, HVEM, NKG2D, MICA, 2B4, IL-2, IL-12, IL-27, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-1, CDN, HMGB1 또는 TLR 효능제; 또는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD47, SIRPα, B7H4, CD96, TIGIT, CD226, 프로스타글란딘, VEGF, 엔도텔린 B, IDO, 아르기나제, MICA/MICB, TIM-3, IL-10, IL-4 또는 IL-13 길항제에 결합하는 항체인 약학 조성물.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 PD-1 축 결합 길항제인 약학 조성물.
  56. 제55항에 있어서, PD-1 축 길항제는 PD-1 결합 길항제 또는 PDL1 결합 길항제인 약학 조성물.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 항체인 약학 조성물.
  58. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 유토밀루맙, 우렐루맙, INBRX-105, GSK3359609, JTX-2011, TRX 518-001, MK-4166, BMS-986156, INCAGN01876, 쿠사투주맙, 바릴루맙, PF-0451860, MEDI0562/6469/6383, GSK3174998, BMS-986178, CP870893, APX005M, CA-170, 모가물리주맙, MGD009, 8H9, TSR-022, MBG453, Sym023, 올레클루맙, 렐라틀리맙, IMP321(에프틸라지모드 알파), LAG525, 리릴루맙, 인독시모드, 에파카도스타트, 티스렐리주맙, 티라골루맙, BMS-986207, MTIG7192A, AB154, 시포라데난트, M7824, 갈루니세르팁, TTI-621, 에보르파셉트, 마그롤리맙, 올레클루맙, 폴리-ICIC, 레피톨리모드, SD-101, DSP-0509, 린타톨리모드, CMP-001, NKTR-214, RO6874281, THOR-707, CB-1158, LTX-315 또는 페길로데카킨으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  59. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제39항 또는 제40항의 접합체, 또는 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항의 약학 조성물.
  60. 암 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제39항 또는 제40항의 접합체, 또는 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항의 약학 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 암은 암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병인 폴리펩티드 또는 약학 조성물.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 암은 전이성 선암종(예를 들어, 전이성 결장직장 선암종, 전이성 위장(gastric) 선암종, 또는 전이성 췌장 선암종)일 수 있는 선암종(예를 들어, 결장직장 선암종, 위장 선암종, 또는 췌장 선암종), 식도암, 위장암 또는 위암, 소장암, 대장암, 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위장암, 결장직장암(CRC), 간세포 암종, 유방암, 직장암, 비소세포폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신장세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종은 제외하지만 배중심 B 세포 유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포 유사(ABC) DLBCL은 포함하는 성숙 B 세포암, 소포 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프모구 백혈병(CLL), 변연부 림프종(MZL), 소림프구성 백혈병(SLL), 림프형질세포 림프종(LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM), 중추신경계 림프종(CNSL), 버킷 림프종(BL), B세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 분류불가, 비장 미만성 적색속질 소 B세포 림프종, 변종 털세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B세포 림프종, CNS의 원발성 DLBCL, 원발성 피부 DLBCL, 다리 유형, 노인의 EBV 양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK 양성 거대 B세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8 관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종: 미만성 거대 B세포 림프종과 버킷 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종 또는 미만성 거대 B세포 림프종과 고전적 호지킨 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종인 폴리펩티드 또는 약학 조성물.
  63. 암 치료를 위한 약제의 제조에서, 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제39항 또는 제40항의 접합체, 또는 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 용도.
  64. 제63항에 있어서, 암은 암종, 선암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병인 용도.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 암은 전이성 선암종(예를 들어, 전이성 결장직장 선암종, 전이성 위장 선암종, 또는 전이성 췌장 선암종)일 수 있는 선암종(예를 들어, 결장직장 선암종, 위장 선암종, 또는 췌장 선암종), 식도암, 위장암 또는 위암, 소장암, 대장암, 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위장암, 결장직장암(CRC), 간세포 암종, 유방암, 직장암, 비소세포폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신장세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종은 제외하지만 배중심 B 세포 유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포 유사(ABC) DLBCL은 포함하는 성숙 B 세포암, 소포 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프모구 백혈병(CLL), 변연부 림프종(MZL), 소림프구성 백혈병(SLL), 림프형질세포 림프종(LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM), 중추신경계 림프종(CNSL), 버킷 림프종(BL), B세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 분류불가, 비장 미만성 적색속질 소 B세포 림프종, 변종 털세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B세포 림프종, CNS의 원발성 DLBCL, 원발성 피부 DLBCL, 다리 유형, 노인의 EBV 양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK 양성 거대 B세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8 관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종: 미만성 거대 B세포 림프종과 버킷 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종 또는 미만성 거대 B세포 림프종과 고전적 호지킨 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종인 용도.
  66. 암을 가진 대상체를 치료하는 방법이며,
    제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제39항 또는 제40항의 접합체, 또는 제50항의 약학 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 암은 암종, 선암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병인 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 암은 전이성 선암종(예를 들어, 전이성 결장직장 선암종, 전이성 위장 선암종, 또는 전이성 췌장 선암종)일 수 있는 선암종(예를 들어, 결장직장 선암종, 위장 선암종, 또는 췌장 선암종), 식도암, 위장암 또는 위암, 소장암, 대장암, 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위장암, 결장직장암(CRC), 간세포 암종, 유방암, 직장암, 비소세포폐암, 비호지킨 림프종(NHL), 신장세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종은 제외하지만 배중심 B 세포 유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포 유사(ABC) DLBCL은 포함하는 성숙 B 세포암, 소포 림프종(FL), 외투세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프모구 백혈병(CLL), 변연부 림프종(MZL), 소림프구성 백혈병(SLL), 림프형질세포 림프종(LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM), 중추신경계 림프종(CNSL), 버킷 림프종(BL), B세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 분류불가, 비장 미만성 적색속질 소 B세포 림프종, 변종 털세포 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 원발성 피부 소포 중심 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B세포 림프종, CNS의 원발성 DLBCL, 원발성 피부 DLBCL, 다리 유형, 노인의 EBV 양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK 양성 거대 B세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8 관련 다심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종: 미만성 거대 B세포 림프종과 버킷 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종 또는 미만성 거대 B세포 림프종과 고전적 호지킨 림프종의 중간 특징을 갖는 분류 불가능한 B세포 림프종인 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 추가 치료제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 추가 치료제는 면역종양제 또는 화학요법제인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 면역종양제는 면역 체크포인트 억제제 또는 면역 보조자극 분자의 효능제인 방법.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 종양 관련 항원; CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40, ICOS, HVEM, NKG2D, MICA, 2B4, IL-2, IL-12, IL-27, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-1, CDN, HMGB1 또는 TLR 효능제; 또는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD47, SIRPα, B7H4, CD96, TIGIT, CD226, 프로스타글란딘, VEGF, 엔도텔린 B, IDO, 아르기나제, MICA/MICB, TIM-3, IL-10, IL-4 또는 IL-13 길항제에 결합하는 항체인 방법.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 PD-1 축 결합 길항제인 방법.
  74. 제73항에 있어서, PD-1 축 길항제는 PD-1 결합 길항제 또는 PD-L1 결합 길항제인 방법.
  75. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 항체인 방법.
  76. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 유토밀루맙, 우렐루맙, INBRX-105, GSK3359609, JTX-2011, TRX 518-001, MK-4166, BMS-986156, INCAGN01876, 쿠사투주맙, 바릴루맙, PF-0451860, MEDI0562/6469/6383, GSK3174998, BMS-986178, CP870893, APX005M, CA-170, 모가물리주맙, MGD009, 8H9, TSR-022, MBG453, Sym023, 올레클루맙, 렐라틀리맙, IMP321(에프틸라지모드 알파), LAG525, 리릴루맙, 인독시모드, 에파카도스타트, 티스렐리주맙, BMS-986207, MTIG7192A, AB154, 시포라데난트, M7824, 갈루니세르팁, TTI-621, 에보르파셉트, 마그롤리맙, 올레클루맙, 폴리-ICIC, 레피톨리모드, SD-101, DSP-0509, 린타톨리모드, CMP-001, NKTR-214, RO6874281, THOR-707, CB-1158, LTX-315, 페길로데카킨으로부터 선택되는 것인 방법.
  77. 세포상의 IL-18 수용체를 활성화시키는 방법이며,
    세포를 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제39항 또는 제40항의 접합체와 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  78. 림프구에서 IFNγ 발현을 유도하는 방법이며,
    림프구를 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제39항 또는 제40항의 접합체와 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  79. 림프구를 활성화시키는 방법이며,
    림프구를 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제39항 또는 제40항의 접합체와 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 림프구는 T 세포 또는 NK 세포인 방법.
  81. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 림프구는 시험관 내 존재하는 것인 방법.
  82. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 림프구는 생체 내 존재하는 것인 방법.
  83. 인간 IL-18 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 안정성을 개선하는 방법이며,
    이황화 결합을 형성하는 적어도 한 쌍의 시스테인을 IL-18 아미노산 서열에 도입하여, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 유리 시스테인을 포함하지 않는 것인 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 한 쌍 또는 두 쌍의 시스테인을 포함하고,
    각 시스테인 쌍은 이황화 결합을 형성하는 것인 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개 모두의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환된 것인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개 모두의 시스테인이 세린으로 치환된 것인 방법.
  88. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 인간 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 치환 C74S, C104S, C112S 및/또는 C163S 중 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 포함하고,
    아미노산 넘버링은 도 4A에 따르는 것인 방법.
  89. 샘플에서 IL-18BP를 검출하는 방법이며,
    샘플을 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및
    IL-18BP에 대한 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  90. 샘플에서 IL-18Rα를 검출하는 방법이며,
    샘플을 제1항 내지 제38항 및 제49항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및
    IL-18Rα에 대한 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 폴리펩티드는 검출 가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
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