DE102007001370A1

DE102007001370A1 - RNA-kodierte Antikörper

Info

Publication number: DE102007001370A1
Application number: DE102007001370A
Authority: DE
Inventors: Ingmar Dr. Hoerr; Jochen Dr. Probst
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Curevac SE
Priority date: 2007-01-09
Filing date: 2007-01-09
Publication date: 2008-07-10
Also published as: US11421038B2; US20160185840A1; US20130195867A1; US20160145346A1; DK2101823T3; EP2101823B1; US20160166690A1; EP3115064A1; US20160168254A1; EP3636669A1; ES2614901T3; EP3329941A1; EP3115064B1; WO2008083949A3; EP2101823A2; ES2904550T3; WO2008083949A2; US20100189729A1; US20160166691A1; US20190284260A1

Abstract

Die vorliegende Anmeldung beschreibt eine einen Antikörper kodierende, unmodifizierte oder modifizierte RNA sowie deren Verwendung zur Expression dieses Antikörpers zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere einer passiven Vakzine, zur Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen, Herz- und Kreislauferkrankungen, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, Viruserkrankungen, monogenetischen Erkrankungen, z. B. auch in der Gentherapie. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein In-vitro-Transkriptionsverfahren, In-vitro-Verfahren zur Expression dieses Antikörpers unter Verwendung der erfindungsgemäßen RNA und ein In-vivo-Verfahren.

Description

Die vorliegende Anmeldung beschreibt eine, einen Antikörper kodierende, unmodifizierte oder modifizierte RNA, sowie deren Verwendung zur Expression dieses Antikörpers, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere einer passiven Vakzine, zur Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen, Herz- und Kreislauferkrankungen, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, Viruserkrankungen, monogenetischen Erkrankungen, z. B. auch in der Gentherapie. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein in vitro-Transkriptionsverfahren, in vitro-Verfahren zur Expression dieses Antikörpers unter Verwendung der erfindungsgemäßen RNA und ein in vivo-Verfahren.
Das Auftreten von Tumoren und Krebserkrankungen ist neben Herz-, Kreislauf- und Infektionskrankheiten eine der häufigsten Todesursachen in modernen Gesellschaften und mit zumeist erheblichen Kosten bei der Therapie und anschließenden Rehabilitationsmaßnahmen verbunden. Die Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen hängt bspw. stark von der Art des auftretenden Tumors ab und erfolgt heute üblicherweise neben invasiven Eingriffen durch Anwendung einer Strahlen- oder Chemotherapie. Diese Therapien stellen jedoch für das Immunsystem eine außerordentliche Belastung dar und können in manchen Fällen nur eingeschränkt eingesetzt werden. Zudem erfordern diese Therapieformen zumeist lange Pausen zwischen den einzelnen Behandlungen zur Regeneration des Immunsystems. In den letzten Jahren haben sich daher neben diesen „klassischen Maßnahmen" insbesondere molekularbiologische Ansätze zur Behandlung oder zur Unterstützung dieser Therapien als vielversprechend herausgestellt.
Ein Beispiel dieser molekularbiologischen Verfahren umfasst die Verwendung von Antikörpern oder Immunglobulinen als essentielle Effektoren des Immunsystems. Antikörper oder Immunglobuline können sowohl in vitro durch Anwendung bekannter molekularbiologischer Verfahren erzeugt werden als durch das Immunsystem des zu therapierenden Organismus selbst. So verfügt das Immunsystem von höheren Vertebraten über zwei getrennte Funktionen des Immunsystems: das angeborene Immunsystem, das unspezifisch auf Pathogene reagiert (z. B. durch Makrophagen-vermittelte Phagozytose) und das adaptive Immunsystem, das spezifisch auf Pathogene mittels spezialisierter Effektorzellen (z. B. B- und T-Zellen) reagiert. Teil dieses adaptiven Immunsystems sind die Antikörper oder Immunglobuline, die bei einer Immunantwort von Plasmazellen sezerniert werden. Sie bilden zusammen mit dem Komplementsystem den humoralen Zweig der Immunantwort.
Neben ihrer essentiellen Bedeutung für das Immunsystem bei höheren Vertebraten sind Antikörper, gerade aufgrund ihrer hohen Affinität und Spezifität für ein bestimmtes Antigen, ein hervorragendes Mittel sowohl bei der biochemischen und molekularbiologischen Forschung als auch in der Diagnostik und bei medizinischen Anwendungen. So sind Antikörper in der Lage, spezifisch an ihre Zielstrukturen (z. B. Antigene, die im Wesentlichen aus Proteinen, Peptiden, z. T. aus Lipiden, Kohlenhydraten, etc. bestehen) zu binden und diese dadurch zu blockieren (zu inhibieren) oder ggf. zu markieren. Darüber hinaus können sie das Immunsystem mittels ihres Fc-Teils aktivieren, so dass es zu einer Zerstörung der markierten Zellen kommt. Zur Zeit befinden sich über 100 therapeutische Antikörper in klinischen Studien. Die bei weitem größte Rolle spielen hierbei Antikörper, die in der Krebstherapie eingesetzt werden können. Die meisten dazu heute hergestellten Antikörper sind monoklonale Antikörper, die ursprünglich bspw. aus der Maus stammen. Um eine Immunreaktion gegen solche monoklonalen Antikörper zu verhindern, werden heute hauptsächlich humanisierte oder humane Antikörper zur Therapie eingesetzt (vgl. David Male; „Immunologie auf einen Blick", 1. deutsche Auflage, 2005, Elsevier-Urban & Fischer Verlag; Charles A. Janeway, Paul Travers, Mark Walport und Mark Shlomchik, Immunobiology, 5. Auflage, 2001, Garland Publishing; Dissertation von Christian Klein, Monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente gegen sekundäre Arzneipflanzenmetabolite, 2004; Andreas Schmiedl und Stefan Dübel, Rekombinante Antikörper & Phagen-Display, 2004, Molekulare Biotechnologie (Wiley-VCH)) Antikörper lassen sich allgemein der Gruppe der Immunglobuline zuordnen. Diese Immunglobuline können wiederum anhand ihrer schweren Kette in fünf Hauptklassen von Immunglobulinen unterschieden werden, den IgM-(μ), IgD-(δ), IgG(γ), IgA(α) und IgE(ε)-Antikörpern, wobei IgG-Antikörper den größten Anteil ausmachen. Anhand ihrer leichten Ketten lassen sich Immunglobuline zudem in die Isotypen κ und λ unterscheiden.
Trotz ihrer unterschiedlichen Spezifität sind Antikörper strukturell recht ähnlich aufgebaut. So sind IgG-Antikörper typischerweise aus jeweils 2 identischen leichten und 2 schweren Proteinketten aufgebaut, die miteinander über Disulfid-Brücken verbunden sind. Die leichte Kette besteht aus der N-terminalen variablen Domäne V_L und der C-terminalen konstanten Domäne C_L. Die schwere Kette eines IgG-Antikörpers lässt sich in eine N-terminale variable Domäne V_H und drei konstante Domänen C_H1, C_H2 und C_H3 einteilen (vgl. 1). Während die Aminosäuresequenz im Bereich der konstanten Domänen weitgehend gleich ist, zeigen sich innerhalb der variablen Domänen typischerweise große Sequenzunterschiede.
Das Antikörperrepertoire eines Menschen besteht aus etwa mindestens 10¹¹ verschiedenen Antikörperspezifitäten. Die Bildung von Antikörpern erfolgt bei höheren Vertebraten natürlicherweise im Immunsystem durch somatische Rekombination. Dabei ist ein Organismus theoretisch zwar in der Lage, gegen jedes Antigen einen Antikörper mit passender Spezifität zu generieren. Würde aber jeder dieser Antikörper durch ein eigenes Gen kodiert werden, würden sie das humane Genom sprengen. Antikörpergene werden beim Menschen stattdessen aus einer Vielzahl einzelner Gensegmente zusammengesetzt. Der Teil des Antikörpergens, der für die variable Region einer leichten Kette kodiert, wird aus einem V-Gensegment und einem J-Gensegment gebildet. Dabei stehen zahlreiche verschiedene V- und J-Segmente zur Verfügung, die nahezu beliebig miteinander kombiniert werden können. Die variable Region einer schweren Kette wird dabei aus drei unterschiedlichen Gensegmenten zusammengesetzt. Neben den V- und J-Segmenten findet man hier noch zusätzliche D-Segmente. Die V_H, D_H- und J_H-Segmente können zur Bildung der variablen Region der schweren Kette ebenso nahezu beliebig kombiniert werden (vgl. 2). Den Mechanismus, durch den die verschiedenen Gensegmente zu kompletten Antikörpergenen zusammengesetzt werden, bezeichnet man als Immunglobulin-Rearrangement oder somatische Rekombination. Sie findet ausschließlich in B-Lymphozyten zu bestimmten Zeiten der Zellentwicklung statt.
Neben der reinen Genumlagerung existieren noch weitere Mechanismen, um die Antikörpervielfalt zu erhöhen. Hierbei sind zunächst zwei Mechanismen zu nennen, die mit der somatischen Rekombination einhergehen: Die junktionale Vielfalt, beschreibt dabei die gesteuerte unpräzise Zusammenlagerung der umgelagerten Gensegmente, wodurch es an den Schnittstellen zum zufälligen Entfernen und Einfügen von Nukleotiden kommt. Eine weitere kombinatorische Vielfalt ergibt sich aus der Möglichkeit, eine bestimmte umgelagerte leichte Kette mit einer bestimmten umgelagerten schweren Kette zu kombinieren. Schließlich erhöht sich die Vielfalt von Antikörpern auch noch nach der erfolgreichen Umlagerung und späteren Aktivierung von B-Zellen, indem es durch eine erhöhte Mutationsrate im Bereich der variablen Regionen aktivierter B-Zellen (somatische Hypermutation) zu einer Affinitätsreifung von Antikörpern kommt.
Neben der natürlicherweise durch das Immunsystem des jeweiligen Organismus stattfindenden Bildung von Antikörpern kann auch eine Erzeugung von Antikörpern durch molekularbiologische Verfahren erfolgen. Um jedoch das ausgefeilte System der Spezifizierung der Antikörperbildung und deren Spezifizierung auf bestimmte Antigene oder Nukleinsäuren hin auszunutzen, wird heute typischerweise die Bildung von Antikörpern in ausgewählten Organismen durch Injektion eines bestimmten Antigens induziert und der Antikörper danach zur weiteren Verwendung aus dem Organismus isoliert. Dabei werden üblicherweise die B-Lymphozyten des Organismus selektiv aufgereinigt und mit einer immortalen Myelomzelle zu einer Hybridomzelle fusioniert. Durch Selektionsverfahren werden anschließend diejenigen Zellen ermittelt, die die entsprechenden Antigenspezifischen Antikörper sezernieren.
Neben der Verwendung von Hybridomzellen ist, nach Isolierung und Sequenzierung, auch die rekombinante Herstellung dieser Antikörper mit der gewünschten Spezifität möglich. Dazu werden typischerweise Zellen benutzt, die die benötigten posttranslationalen Modifikationen bereitstellen. Aufgrund der Immunreaktion unter Bildung von humanen Anti-Maus-Antikörpern im menschlichen Organismus bei nativen, in Maus (oder in anderen Wirten) generierten Antikörpern, werden dabei bevorzugt chimäre, humanisierte oder humane Antikörper hergestellt.
Nach Expression können diese, ggf. rekombinant hergestellten, Antikörper als Mittel sowohl bei der biochemischen und molekularbiologischen Forschung als auch in der Diagnostik und bei medizinischen Anwendungen eingesetzt werden.
Bei medizinischen Anwendungen können in vielen Fällen jedoch Antikörper nur schwer direkt eingesetzt werden, da diese zumeist nur eine sehr kurze Halbwertszeit in vivo aufweisen und damit ggf. ihr Ziel-Antigen oder ihre Ziel-Nukleinsäure gar nicht erst erreichen. Dies erfordert entweder hohe Wirkstoffkonzentrationen des gewünschten Antikörpers, oder alternative Verfahren, die geeignet sind, Antikörper in vivo in großen Mengen bereitzustellen.
Solche Verfahren umfassen z. B. molekularmedizinische Verfahren der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung, deren Anwendung allgemein in der Therapie und Prävention von Erkrankungen erhebliche Auswirkungen auf die medizinische Praxis haben. Beide Verfahren beruhen auf der Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen bzw. in Gewebe des Patienten sowie auf der anschließenden Verarbeitung der durch die eingebrachten Nukleinsäuren kodierten Information durch die Zellen bzw. das Gewebe, d. h. der Expression der erwünschten Polypeptide, z. B. Antikörper, in den Zellen bzw. dem Gewebe.
Die übliche Vorgehensweise bisheriger Verfahren der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung basiert auf der Verwendung von DNA, um die benötigte genetische Information in die Zelle einzuschleusen. In diesem Zusammenhang sind verschiedene Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, wie bspw. Calciumphosphat-Transfektion, Polypren-Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion und die Verwendung von Genkanonen entwickelt worden, wobei sich insbesondere die Lipofektion als geeignetes Verfahren herausgestellt hat.
Ein weiteres Verfahren, das insbesondere bei genetischen Vakzinierungsverfahren vorgeschlagen wurde, ist die Verwendung von DNA-Viren als DNA-Vehikel. Derartige Viren haben den Vorteil, dass aufgrund ihrer infektiösen Eigenschaften eine sehr hohe Transfektionsrate zu erzielen ist. Die verwendeten Viren werden genetisch verändert, so dass in der transfizierten Zelle keine funktionsfähigen infektiösen Partikel gebildet werden. Die Verwendung von DNA-Viren als DNA-Vehikel ist in den letzten Jahren aufgrund der Gefahr der Rekombination nicht aktiver Viren zu aktiven Viren jedoch unter Kritik geraten.
Die Verwendung von DNA als Mittel der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung oder zur passiven Immunisierung (durch passive Vakzine), z. B. durch Verwendung kodierender Sequenzen für Antikörper, kann jedoch auch unter anderen Gesichtspunkten weniger vorteilhaft sein. DNA wird in der Blutbahn nur relativ langsam abgebaut, so dass es bei der Verwendung von (Fremd-)DNA als kodierende Sequenz für ein gewünschtes Protein zu einer Bildung von Anti-DNA-Antikörpern kommen kann, was im Tiermodell bei der Maus bestätigt wurde (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 1398–1402). Die mögliche Persistenz von (Fremd-) DNA im Organismus kann so zu einer Überaktivierung des Immunsystems führen, welche bekanntermaßen bei Mäusen in einer Splenomegalie resultiert (Montheith et al., Anticancer Drug Res. 1997, 12(5): 421–432). Des weiteren kann (Fremd-)DNA mit dem Wirtsgenom wechselwirken, und insbesondere durch Integration in das Wirtsgenom Mutationen hervorrufen. So kann es bspw. zu einer Insertion der eingebrachten (Fremd-)DNA in ein intaktes Gen kommen, welche eine Mutation darstellt, die die Funktion des endogenen Gens behindern oder gar vollkommen ausschalten kann. Durch solche Integrationsereignisse können einerseits für die Zelle lebenswichtige Enzymsysteme zerstört werden, andererseits besteht auch die Gefahr einer Transformation der so veränderten Zelle in einen entarteten Zustand, falls durch die Integration der (Fremd-)DNA ein für die Regulation des Zellwachstums entscheidendes Gen verändert wird. Daher kann bei bisherigen Verfahren in der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung wie auch der passiven Immunisierung bei der Verwendung von (Fremd-)DNA ggf. ein Risiko der Krebsbildung nicht ausgeschlossen werden. Die passive Immunisierung (durch sogenannte „passive Vakzine") ist dabei streng von der sogenannten aktiven Immunisierung zu unterscheiden. Bei der aktiven Immunisierung wird typischerweise ein Antigen („aktive Vakzine") verabreicht, woraufhin der Organismus Antikörper gegen dieses Antigen bildet. Die aktive Immunisierung schafft damit eine dauerhafte Immunisierung des Organismus gegen das jeweilige Antigen, die mit den oben beschriebenen Nachteilen verbunden sein kann. Bei der passiven Immunisierung wird dem Organismus dagegen lediglich ein Antiserum bzw. der aufgereinigte Antikörper selbst („passive Vakzine") verabreicht. Ebenfalls kann die für den Antikörper kodierende Sequenz, wie oben beschrieben, als sogenannte passive Vakzine zur passiven Immunisierung verabreicht werden.
Zusammenfassend besteht im Stand der Technik ein erhöhter Bedarf sowie ein erhebliches Interesse an Mitteln, die geeignet sind, Antikörper wirksam in vivo einzusetzen, insbesondere erhöhte Wirkstoffmengen an Antikörpern in vivo bereitzustellen, ohne die Gefahren, die die Verwendung von DNA bisher mit sich bringen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Verwendung einer RNA(-Sequenz) zur intrazellulären Expression eines Antikörpers gelöst, wobei die RNA(-Sequenz) für einen Antikörper kodiert. Eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jede RNA, die einen Antikörper kodiert.
Die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig, linear oder zirkulär sein, oder insbesondere als mRNA vorliegen. Besonders bevorzugt liegt die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA als einzelsträngige RNA vor, noch stärker bevorzugt als mRNA.
Eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA weist bevorzugt eine Länge von 50 bis 15000 Nukleotiden auf, stärker bevorzugt eine Länge von 50 bis 10000 Nukleotiden auf, noch stärker bevorzugt eine Länge von eine Länge von 500 bis 10000 Nukleotiden auf und am stärksten bevorzugt eine Länge von 500 bis 7000, 500 bis 5000 oder 700 bis 3000 Nukleotiden auf.
Der durch die erfindungsgemäße RNA kodierte Antikörper kann im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung aus allen Antikörpern ausgewählt werden, z. B. aus allen rekombinant erzeugten oder natürlich auftretenden Antikörpern, die einem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind, insbesondere Antikörper, die für therapeutische Zwecke, für diagnostische oder für Forschungszwecke eingesetzt werden (können) oder bei bestimmten Erkrankungen, z. B. Krebserkrankungen, Infektionskrankheiten, etc. gefunden wurden.
Antikörper, die von einer erfindungsgemäßen RNA kodiert werden, umfassen im Sinne der vorliegenden Erfindung typischerweise alle einem Fachmann bekannten (oben beschriebenen) Antikörper, z. B. natürlich auftretende oder durch Immunisierung in einem Wirtsorganismus erzeugte Antikörper, rekombinant hergestellte Antikörper, die aus natürlich auftretenden bzw. durch (klassische) Immunisierung in einem Wirtsorganismus erzeugten Antikörpern isoliert und identifiziert wurden oder mit Hilfe von molekularbiologischen Verfahren generiert wurden, sowie chimäre Antikörper, humane Antikörper, humanisierte Antikörper, bispezifische Antikörper, Intrabodies (Intrakörper), d. h. in Zellen exprimierte und gegebenenfalls in bestimmten Zellkompartimenten lokalisierte Antikörper, und Fragmente der zuvor genannten Antikörper. Dabei bestehen Antikörper im Allgemeinen typischerweise aus einer leichten Kette und einer schweren Kette, die beide variable und kon stante Domänen aufweisen. Die leichte Kette besteht aus der N-terminalen variablen Domäne V_L und der C-terminalen konstanten Domäne C_L. Die schwere Kette eines IgG-Antikörpers lässt sich dagegen in eine N-terminale variable Domäne V_H und drei konstante Domänen C_H1, C_H2 und C_H3 einteilen (vgl. 1).
Erfindungsgemäße RNA-Moleküle können auch auf der Basis polyklonaler Antikörper hergestellt werden bzw. als Antikörper kodierender RNA-Cocktail polyklonalen Charakter haben. Im Sinne dieser Erfindung sind polyklonale Antikörper typischerweise Mischungen von Antikörpern gegen ein spezifisches Antigen bzw. Immunogen oder Epitop eines Proteins, die durch Immunisierung eines Wirtsorganismus erzeugt wurden, bspw. Säugetiere, d. h. Tiere, einschließlich Rind, Schwein, Hund, Katze, Esel, Affe, einschließlich Nagetiere, z. B. Maus, Hamster, Kaninchen, etc., sowie Menschen. Polyklonale Antikörper erkennen üblicherweise jeweils unterschiedliche Epitope oder Regionen des gleichen spezifischen Antigens, wobei jedes dieser Epitope wiederum in der Lage ist, einen Klon von B-Lymphozyten zu generieren, der einen Antikörper gegen dieses Epitop erzeugt. Aus solchen polyklonalen Antikörpern bzw. aus den aus dem Wirtsorganismus gewonnen Antikörperseren, können die einzelnen, gegen die jeweiligen Epitope spezifischen Antikörper durch Vereinzelung zu monoklonalen Antikörpern gewonnen werden. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch RNA, kodierend für einen durch Vereinzelung von polyklonalen Antikörpern gewonnenen monoklonalen Antikörper bereit.
Monoklonale Antikörper im Sinne dieser Erfindung sind daher typischerweise Antikörper, die für ein bestimmtes Antigen oder Epitop (eines Proteins) spezifisch sind, d. h. dieses Antigen oder Epitop (eines Proteins) mit hoher Affinität binden, und üblicherweise durch eine Hybridomzelle exprimiert werden. Zur Herstellung solcher monoklonaler Antikörper wird typischerweise einem wie hier beschriebenen Wirtsorganismus zumindest einmal, typischerweise aber mehrmals, das entsprechende Antigen bzw. Immunogen oder Epitop eines Proteins injiziert, wodurch das Immunsystem des Wirtsorganismus in Gegenwart geeigneter Adjuvantien über Aktivierung entsprechend spezifischer B-Zellen bevorzugt zur Antikörperproduktion stimuliert wird. Aus der Milz oder anderen dafür geeigneten Organen oder Flüssigkeiten eines derart immunisierten Tieres werden dann üblicherweise die B-Lymphozyten selektiv aufgereinigt und mit einer immortalen Myelomzelle zur sogenannten Hybridomzelle fusioniert. Nach Selektionsverfahren und Klonierung der entstehenden Hybridome bzw. Hybridomzellen können solche Klone ermittelt werden, die Antikörper der ge wünschten Spezifität sezernieren, d. h. exprimieren und ausscheiden. Diese Klone können mit bekannten molekularbiologischen Verfahren isoliert und sequenziert werden. Die aus einer solchen Sequenzierung gewonnen Daten können weiter in einer Nukleinsäuresynthese zur Generierung von synthetischen DNA-Sequenzen oder zum Screenen einer cDNA-Bibliothek und Isolieren der cDNA-Fragmente und der Generierung eines DNA- bzw. Nukleinsäuretemplates für die in vitro- oder in vivo-Synthese der erfindungsgemäßen RNA, kodierend für einen Antikörper, dienen. Ggf. kann die in den Hybridomen enthaltene RNA auch, bspw. durch Fraktionierung, isoliert und nachfolgend die für den Hybridom Antikörper kodierenden, erfindungsgemäßen RNA-Moleküle durch dem Fachmann bekannte Verfahren aufgereinigt werden.
Für den therapeutischen Einsatz im Menschen sind RNA-Moleküle, kodierend für nicht-humane monoklonale oder polyklonale Antikörper, z. B. murine monoklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper aus anderen, wie hier beschriebenen, nicht-humanen Wirtsorganismen oder Hybridomzellen allerdings nur bedingt geeignet, da sie im menschlichen Organismus selbst üblicherweise eine Immunreaktion unter Bildung von humanen, gegen diesen Antikörper gerichteten, Anti-Antikörpern hervorrufen. Dadurch können solchen nicht-humanen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper in der Regel nur ein einziges Mal am Menschen appliziert werden. Um dieses Problem zu umgehen können erfindungsgemäß auch RNA-Moleküle bereitgestellt werden, die für chimäre, humanisierte und humane Antikörper kodieren.
Chimäre Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt Antikörper, bei denen die konstanten Domänen eines wie hier beschriebenen Antikörpers durch humane Sequenzen ersetzt wurden. Bevorzugt werden chimäre Antikörper aus wie hier beschriebenen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gebildet.
Humanisierte Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Antikörper, bei denen die zuvor beschriebenen konstanten und variablen Domänen der nicht-humanen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper mit Ausnahme der hypervariablen Regionen durch humane Sequenzen ersetzt wurden.
Weiterhin können im Sinne der vorliegenden Erfindung auch RNA-Moleküle, kodierend für humane Antikörper verwendet werden, d. h. Antikörper, die vollständig humane Sequenzen, also in den konstanten und variablen Domänen einschließlich den hypervariablen Regionen, aufweisen. Solche RNA-Moleküle, die für humane Antikörper kodieren, können aus humanem Gewebe isoliert werden bzw. aus wie hier beschriebenen immunisierten Wirtsorganismen, z. B. Mäusen, stammen, die dann transgen für den menschlichen IgG-Genlokus sind. Ferner werden RNA-Moleküle, kodierend für humane Antikörper, bereitgestellt, die mittels Phagen-Displays isoliert wurden und mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden kloniert wurden (siehe unten).
Antikörper, die durch erfindungsgemäße RNAs kodiert werden, umfassen besonders bevorzugt sogenannte Volllängen-Antikörper, d. h. Antikörper, die sowohl die vollständigen schweren als auch die vollständigen leichten Ketten, wie oben beschrieben, umfassen.
Weiterhin können im Sinne der vorliegenden Erfindung auch RNAs bereitgestellt werden, die alternativ anstelle der entsprechenden Volllängen-Antikörper für ein oder mehrere Antikörperfragment(e) der zuvor beschriebenen Antikörper kodieren. Beispiele solcher Antikörperfragmente sind jegliche einem Fachmann bekannten Antikörperfragmente, z. B. Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fc-, Facb-, pFc'-, Fd-, und Fv-Fragmente der zuvor genannten Antikörper, etc.. Die schematische Struktur solcher Antikörperfragmente wird beispielhaft in 4 gezeigt.
Beispielsweise besteht ein Fab-Fragment (fragment antigen binding) typischerweise aus der variablen und einer konstanten Domäne jeweils einer leichten und einer schweren Kette, d. h. aus der C_H1 und der V_H-Domäne der schweren Kette sowie der vollständigen leichten Kette. Die beiden Ketten sind über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Ein Fab-Fragment enthält somit üblicherweise die vollständige antigenbindende Region des ursprünglichen Antikörpers und weist im Regelfall die gleiche Affinität gegenüber dem Antigen, dem Immunogen oder einem Epitop eines Proteins auf. Antikörperfragmente können wie auch für Antikörper zuvor beschrieben mit Hilfe molekularbiologischer Methoden hergestellt werden. Dabei werden die DNA-Sequenzen, die für die verschiedenen Domänen des Antikörperfragments kodieren, in einen speziellen Expressionsvektor kloniert. Die RNA, kodierend für diese Antikörperfragmente, kann dann z. B. in geeigneten Wirtszellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen u. a. E. coli, Hefen, transgene Pflanzen oder Säugerzellen, etc. (s. u.). Ein scFv-Fragment (single chain variable fragment) besteht dagegen typischerweise aus der variablen Domäne der leichten und der schweren Kette, die über einen artifiziellen Polypeptidlinker miteinan der verbunden sind. Bei der Klonierung von solchen scFv-Fragmenten werden bevorzugt RNAs bereitgestellt, die für eine V_H und V_L kodieren, wobei diese durch einen Polypeptidlinker miteinander verknüpft sind. In der Regel verwendet man ein aus 15–25 Glycin, Prolin- und/oder Serin-Resten aufgebautes Polypeptid (vgl. 5) bzw. die dazugehörige Nucleotidsequenz auf RNA-Ebene.
Ferner können im Sinne der vorliegenden Erfindung auch RNA-Moleküle bereitgestellt werden, die für bispezifische Antikörper, kodieren. Bispezifische Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt Antikörper, die als Adaptoren zwischen einem Effektor und einem entsprechenden Target wirken können, z. B. zur Rekrutierung von Effektormolekülen (z. B. Toxinen, Wirkstoffen („drugs"), Cytokinen, etc.), dem Targeting von Effektorzellen (z. B. CTL, NK-Zellen, Makrophagen, Granulozyten, etc.) (siehe bspw. Review von Kontermann R. E., Acta Pharmacol. Sin, 2005, 26(1): 1–9). Bispezifische Antikörper sind dabei grundsätzlich so aufgebaut, wie für Antikörper im Allgemeinen hier beschrieben, wobei diese bispezifischen Antikörper z. B. zwei unterschiedliche Antigene, Immunogene oder Epitope, oder Wirkstoffe, Zellen, oder andere, wie zuvor genannte Moleküle (oder Strukturen) erkennen, d. h. die antigenbindende Regionen des Antikörpers sind spezifisch für zwei unterschiedliche Moleküle (oder Strukturen). Damit können bspw. die verschiedenen Antigene, Immunogene oder Epitope, etc. in räumliche Nähe gebracht werden. Ferner kann durch die Bindung z. B. einer Bindungsdomäne oder anderer Spezifitäten die Funktion des Antikörpers spezifisch erweitert werden, z. B. eines Bindungsproteins, eines Immunotoxins, etc.. Solche bispezifischen Antikörper können auch einzelkettige Antikörper („single-chain anibodies") sein (z. B. scFv-Fragmente, etc.). Bispezifische Antikörper können bspw. dazu verwendet werden, um zwei Reaktionspartner, z. B. zwei Zellen, zwei Proteine, ein Protein und dessen Substrat, etc., in räumliche Nähe zu bringen, um eine Interaktion zwischen diesen zu fördern (z. B. Protein-Protein-Interaktionen, Substratumsetzungen, Modifikationen, etc.). Bispezifische Antikörper werden v. a. benutzt, um Effektorzellen (wie bspw. T-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen, etc.) und Targetzellen (z. B. Tumorzellen, infizierte Zellen, etc.) in räumliche Nähe zu bringen. Beispiele bispezifischer Antikörper können, ohne darauf beschränkt zu sein, z. B. solche Antikörper oder Antikörperfragmente umfassen, die auf einer Seite einen wie hier beschriebenen Oberflächenfaktor und auf der anderen Seite ein wie hier beschriebenes Antigen, bevorzugt ein wie hier beschriebenes Tumorantigen binden. Dies schließt z. B. CD28 und ein Tumorantigen (Grosse-Hovest L. et al., 2003, Eur. Immunol. 33(5); 1334–40, (A recombinant bispecific single-chain antibody induces tar geted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing)), CD19 und CD3 (CD19 Tumorantigen von B-Zell-Lymphom), etc., ein.
Ohne darauf beschränkt zu sein, können RNAs, kodierend für Antikörper, gemäß der vorliegenden Erfindung u. a. für solche Antikörper kodieren, die Antigene oder spezifische Nukleinsäuren binden. Antigene im Sinne der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Moleküle, die vom Immunsystem als körperfremd erkannt und üblicherweise eine Immunreaktion oder Immunantwort unter Bildung von spezifisch gegen sie gerichteten Antikörpern hervorrufen. Antigene können jedoch, insbesondere bei Autoimmunerkrankungen, auch körpereigene Moleküle oder Strukturen umfassen, die fälschlicherweise vom Immunsystem als körperfremd erkannt werden und dadurch eine Immunreaktion auslösen. Alternativ formuliert sind Antigene daher alle Moleküle, die durch einen Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung erkannt werden. Antigene bestehen im Wesentlichen aus Proteinen, Peptiden oder Epitopen dieser Proteine oder Peptide. Epitope (auch "antigene Determinanten" genannt) sind dabei typischerweise an der Oberfläche von solchen Protein- oder Peptidstrukturen liegende kleine Bereiche (Molekülabschnitte) mit einer Länge von 5 bis 15, bevorzugt 6 bis 9, Aminosäuren. Antigene können weiterhin auch Lipide, Kohlenhydrate, etc. umfassen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen Antigene bspw. auch sogenannte Immunogene, d. h. Antigene, die zu einer Immunität des damit transfizierten Organismus führen. Beispielhafte Antigene umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Oberflächen-Antigene von Zellen, Tumorantigene, etc.. Bspw. können Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung folgende (typischerweise in Vertebraten auftretende) Antigene binden, z. B. tumorspezifische Oberflächenantigene (TSSA), z. B. 5T4, α5β1-Integrin, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β-Catenin/m, Bcr-abl, MN/C IX-Antigen, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, β-Catenin/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (oder hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MACE, MART-1/Melan-A, MART-2/Ski, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO1, PAP, Proteinase-3, p190 minor bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, Survivin, TEL/AML1, TGFβ, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF und WT1, oder Sequenzen, wie z. B. NY-Eso-1 oder NY-Eso-B. Tumorantigene können bspw. typisch für die Metastasierung, also das Herauslösen von Tumorzellen aus ihrem nativen Gewebe, Übertritt in das Gefäßsystem (Lymph- oder Blutgefäßsystem), Austritt aus dem Gefäßsystem und Ansiedlung in einem neuen Gewebe verantwortlich sein. Hierbei sind insbesondere solche Tumorantigene von Interesse, die gegenüber dem nativen Zustand veränderte Zell-Zell-Interaktionen bewirken.
Antikörper (und damit auch die diesen Antikörpern zugrundeliegenden erfindungsgemäßen RNAs), die die hier beschriebenen Antigene sowie ggf. andere Antigene oder Nukleinsäuren binden, können z. B. mittels der von George P. Smith entwickelten Methode des Phagen-Displays identifiziert werden. Dabei werden typischerweise Antikörper oder Antikörperfragmente auf der Oberfläche von filamentösen Phagen exprimiert (Smith, G. P., 1985, „Filamentous fusion Phage: novel expression vectors that display cloned antigens an the virion surface", Science 228; 1315–1317). Am proximalen Ende des Phagen befinden sich dafür üblicherweise 3 bis 5 Kopien des Oberflächenproteins gpIII, mit dessen Hilfe der Phage Bakterienzellen über deren F-Pilus infiziert. Beim Phagen-Display wird dann bspw. die DNA, die für ein Antikörper-Fragment, das die Antigen-bindende variable Domäne kodiert, in-frame vor das gpIII-Gen kloniert. Bei der Proteinbiosynthese entsteht daraus ein Fusionsprotein, das auf der Virusoberfläche exprimiert wird, ohne dass der Phage seine Infektiösität verliert. Mit Hilfe der Phagen-Display-Technik können große Antikörperbibliotheken generiert werden, wobei jeder Phage ein anderes Antikörperfragment auf der Oberfläche exprimiert. Insoweit ist damit auch die zugrundeliegende RNA verfügbar. Mit einem als „Phagen-Panning" bezeichneten Verfahren kann aus einer solchen Bibliothek ein bestimmtes Antikörperfragment isoliert werden. Dazu wird das entsprechende Antigen an eine Matrix gebunden und mit der Phagen-Suspension inkubiert. Die Phagen, die ein passendes Antikörperfragment präsentieren, interagieren mit dem fixierten Antigen, während die anderen Phagen durch einen Waschschritt entfernt werden. Die isolierten Phagen werden bspw. in E. coli vermehrt. Die DNA wird entsprechend isoliert und die Gensequenz bestimmt. Mit Hilfe von gentechnischen Methoden können anschließend Expressionskonstrukte entwickelt werden, die die cDNA, kodierend für den ganzen Antikörper oder Antikörperfragmente, aufweisen. Von dieser cDNA kann eine RNA (mRNA) kodierend für den Antikörper mittels in-vitro-Transkription (s. u.) generiert werden. Auf diese Weise erhält man Nukleinsäuren bzw. mRNA, kodierend für monoklonale Antikörper, die vollständig menschlichen Ursprungs sind.
Erfindungsgemäße RNA, kodierend für wie oben beschriebene Antikörper, ist im Sinne der vorliegenden Erfindung auch geeignet, um sogenannte Intrabodies (Intrakörper) zu kodieren bzw. eine Expression von Intrabodies zu ermöglichen. Intrabodies im Sinne der vorliegenden Erfindung können jeden der hier beschriebenen Antikörper oder Antikörperfragmente umfassen. Intrabodies sind intrazellulär exprimierte Antikörper, d. h. Antikörper, die durch in der Zelle lokalisierte Nukleinsäuren kodiert und dort exprimiert werden. Dazu wird eine erfindungsgemäße RNA, die wie zuvor beschriebene Antikörper oder Antikörperfragmente kodiert, zuvor bspw. mit Hilfe von erfindungsgemäßen oder anderen geeigneten Transfektionsverfahren (s. u.) in Zellen gebracht und ggf. danach in einen Organismus bzw. Lebewesen transplantiert oder als Nukleinsäuren in einen Organismus bzw. Lebewesen direkt eingebracht. Die erfindungsgemäße RNA (oder eine entsprechende Nukleinsäure) kann dabei nackt oder komplexiert mit geeigneten Trägern (z. B. Liposomen) in den Organismus bzw. das Lebewesen direkt eingebracht werden bzw. solche Modifikationen (der RNA) aufweisen, die ggf. zusammen mit einer der genannten Transfektionsmethoden zu einer besseren Zellaufnahme führen, z. B. jede der hier genannten RNA-Modifikationen, wie bspw. Lipidmodifikationen der erfindungsgemäßen RNA. Ein Organismus bzw. ein Lebewesen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Säugetiere, d. h. Tiere, einschließlich Rind, Schwein, Hund, Katze, Esel, Affe, einschließlich Nagetiere, z. B. Maus, Hamster, Kaninchen, etc., sowie Menschen. Intrabodies können an bestimmten Orten in der Zelle lokalisiert sein und exprimiert werden. Bspw. können Intrabodies cytoplasmatisch exprimiert werden, wobei üblicherweise die Ausbildung von Disulfidbrücken unter den reduzierenden Bedingungen des Cytoplasmas vermindert ist. Es konnte aber gezeigt werden, dass auch cytoplasmatische Intrabodies und inbsesondere scFv-Fragmente funktionell sein können. Die cytoplasmatische Expression durch die erfindungsgemäße RNA eröffnet die Möglichkeit, auch cytoplasmatische Proteine zu hemmen. Dies ist bei der Behandlung mit monoklonalen Antikörpern aus dem Stand der Technik nicht möglich, da diese Antikörper nur sekretierte und membranständige (extrazelluläre) Proteine erreichen können. Durch Expression eines Signalpeptids können Intrabodies ins endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert werden und anschließend sekretiert werden. In diesem Fall sind typischerweise nur sekretierte oder membranständige Proteine ein Ziel für diese Antikörper. Durch zusätzliche Kodierung eines C-terminalen ER-Retentions-Signals (bspw. KDEL) durch die erfindungsgemäße RNA kann der Intrabody (Intrakörper) im ER verbleiben und die Sekretion seines Antigens bzw. den Transports seines Antigens oder seines Zielmoleküls zur Plasmamembran verhindern. Je nach Erfordernis können Intrabodies wie oben beschriebene Volllängen-Antikörper oder Antikörperfragmente umfassen. Bevorzugt umfassen Intrabodies im Rahmen der vorliegenden Erfindung zunächst Volllängen-Antikörper. Falls z. B. jedoch die Expression von Volllängen-Antikörpern intrazellulär technisch nicht möglich oder nicht sinnvoll ist, können auch wie zuvor beschriebene Antikörperfragmente eingesetzt werden.
Antikörper, die durch die erfindungsgemäße RNA kodiert werden, umfassen weiterhin auch solche Antikörper oder Antikörperfragmente, die zu einem der hier beschriebenen Antikörper oder Antikörperfragmente eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80% oder 85%, bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% und am stärksten bevorzugt mindestens 99% über die gesamte Länge der kodierenden Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz eines wie hier beschriebenen Antikörpers oder Antikörperfragments aufweisen. Bevorzugt weisen solche Antikörper oder Antikörperfragmente die gleiche biologische Funktion bzw. die spezifische Aktivität des entsprechenden Volllängen-Antikörpers auf, z. B. die spezifische Bindung bestimmter Antigene oder Nukleinsäuren.
Die biologische Funktion von hier beschriebenen Antikörpern, die durch die erfindungsgemäße RNA kodiert wird, umfasst z. B. die Neutralisation von Antigenen, die Komplementaktivierung, oder die Opsonisierung. Bei der Neutralisation von Antigenen kann der Antikörper an ein Antigen binden und dieses dadurch neutralisieren. Durch die Bindung des Antigens wird der Antikörper üblicherweise blockiert und kann seine Wirkung daher nur gegenüber einem Antigen bzw. zwei Antigenen bei bispezifischen Antikörpern, entfalten. Für diese (Neutralisierungs-)Funktion eines Antikörpers eignen sich vor allem scFv-Antikörperfragmente, da sie die Funktionen der konstanten Domäne eines Antikörpers nicht beinhalten. Bei der Komplementaktivierung kann das komplexe System von Komplementproteinen über die Bindung von Antikörpern aktiviert werden, welche abhängig vom Fc-Teil des Antikörpers sind. Endprodukte der Komplementkaskade führen typischerweise zur Lyse von Zellen und zur Schaffung eines entzündlichen (inflammatorischen) Milieus. Bei der Opsonisierung werden Krankheitserreger oder Fremdpartikel durch die Bindung durch einen Antikörper über die konstanten Domänen des Antikörpers für Phagozyten zugänglich gemacht. Alternativ können die opsonisierten, als fremd erkannten Zellen, über eine Antikörperabhängige, Zell-vermittelte Zytotoxizität (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) lysiert werden. Dabei können insbesondere NK-Zellen über Aktivierung ihrer Fc-Rezeptoren über diese Art und Weise lytische Funktionen ausüben.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Begriff "Identität", dass die Sequenzen, wie folgt, miteinander verglichen werden. Um die prozentuale Identität zweier Nukleinsäuresequenzen zu bestimmen, können die Sequenzen zunächst zueinander angeordnet werden („alignment"), um nachfolgend einen Vergleich dieser Sequenzen zu ermöglichen. Hierfür können z. B. Lücken in die Sequenz der ersten Nukleinsäuresequenz eingeführt werden und die Nukleotide mit der entsprechenden Position der zweiten Nukleinsäuresequenz verglichen werden. Wenn eine Position in der ersten Nukleinsäuresequenz mit dem gleichen Nukleotid besetzt ist, wie es an einer Position in der zweiten Sequenz der Fall ist, dann sind beide Sequenzen an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Anzahl aller verglichenen Positionen der untersuchten Sequenzen. Wird z. B. für eine bestimmte Nukleinsäure (z. B. eine Nukleinsäure, die für ein Protein, wie zuvor beschrieben, kodiert) im Vergleich zu einer Referenznukleinsäure (z. B. eine Nukleinsäure aus dem Stand der Technik) einer definierten Länge eine spezifische Sequenzidentität angenommen, so wird diese prozentuale Identität relativ in Bezug auf diese Referenznukleinsäure angegeben. Geht man daher bspw. von einer Nukleinsäure aus, die eine Sequenzidentität von 50% zu einer 100-Nukleotide-langen Referenznukleinsäure aufweist, so kann diese Nukleinsäure eine 50-Nukleotide-lange Nukleinsäure darstellen, die vollkommen identisch zu einem 50-Nukleotide-langen Abschnitt der Referenznukleinsäure ist. Sie kann allerdings auch eine 100-Nukleotide-lange Nukleinsäure darstellen, die 50% Identität, d. h. in diesem Fall 50% identische Nukleinsäuren, mit der Referenznukleinsäure über deren gesamte Länge aufweist. Alternativ kann diese Nukleinsäure eine 200-Nukleotide-lange Nukleinsäure sein, die in einem 100-Nukleotide-langen Abschnitt der Nukleinsäure vollkommen identisch zu der 100-Nukleotide-langen Referenznukleinsäure ist. Andere Nukleinsäuren erfüllen selbstverständlich gleichermaßen diese Kriterien. Die für Nukleinsäuren beschriebenen Ausführungen zur Identität gelten gleichermaßen für die durch die erfindungsgemäße RNA kodierten Antikörper und Antikörperfragmente.
Die Bestimmung der prozentualen Identität zweier Sequenzen kann anhand eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, jedoch nicht beschränkendes, Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen herangezogen werden kann, ist der Algorithmus von Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90: 5873–5877. Ein solcher Algorithmus ist in dem NBLAST-Programm integriert, mit dem Sequenzen identifiziert werden können, die eine gewünschte Identität zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung aufweisen. Um einen Lücken-Abgleich (auch "gapped alignment"), wie hier beschrieben, zu erhalten, kann das Gapped BLAST"-Programm verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25: 3389–3402 beschrieben. Bei der Verwendung von BLAST-und Gapped BLAST-Programmen können die Vorgabe-Parameter des jeweiligen Programms (z. B. NBLAST) verwendet werden. Die Sequenzen können weiter unter Verwendung der Version 9 von GAP (global alignment program) der "Genetic Computing Group", unter Verwendung der Vorgabe-(BLOSUM62) Matrix (values-4 to +11) mit einem Strafwert für die Öffnung einer Lücke von –12 („gap open penalty” für die erste Null einer Lücke) und einem Strafwert für die Erweiterung einer Lücke von –4 (für jede zusätzliche aufeinanderfolgende Null in der Lücke) abgeglichen werden. Nach dem Abgleich (alignment) wird die prozentuale Identität dadurch berechnet, dass die Anzahl an Übereinstimmungen als Prozentanteil der Nukleinsäuren in der beanspruchten Sequenz ausgedrückt wird. Die beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der prozentualen Identität zweier Nukleinsäuresequenzen kann entsprechend, falls erforderlich, auch auf die kodierten Aminosäuresequenzen, d. h. die hier beschriebenen Antikörper, angewendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA eine Sequenz auf, die für die schweren Ketten gemäß der SEQ ID NO: 2 und die leichten Ketten gemäß der SEQ ID NO: 4 kodiert. Gemäß einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA eine kodierende Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 5 auf.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA eine Sequenz auf, die für die schweren Ketten gemäß der SEQ ID NO: 7 und die leichten Ketten gemäß der SEQ ID NO: 9 kodiert. Gemäß einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA eine kodierende Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 10 auf.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA eine Sequenz auf, die für die schweren Ketten gemäß der SEQ ID NO: 12 und die leichten Ketten gemäß der SEQ ID NO: 14 kodiert. Gemäß einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA eine kodierende Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 15 auf.
Antikörper, die durch die erfindungsgemäße RNA kodiert werden, können weiterhin auch solche Antikörper kodieren, die zu einer der kodierenden Sequenzen der hier beschriebenen Antikörper der SEQ ID NO: 5, 10 oder 15, eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80% oder 85%, bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% und am stärksten bevorzugt mindestens 99% über die gesamte Länge der Nukleinsäuresequenz eines wie hier beschriebenen Antikörpers der SEQ ID NO: 5, 10 oder 15 aufweisen.
Solche Antikörper, die durch die erfindungsgemäße RNA kodiert werden, umfassen ebenfalls Antikörper gemäß den SEQ ID NO: 5, 10 oder 15, die in einer der hier beschriebenen schweren Ketten gemäß der SEQ ID NO: 2, 7 oder 12 und/oder in einer der hier beschriebenen leichten Ketten gemäß der SEQ ID NO: 4, 9 oder 14 eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80% oder 85%, bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% und am stärksten bevorzugt mindestens 99% über die gesamte Länge der kodierenden Sequenz für die jeweilige leichte und/oder schwere Kette aufweisen bei ansonsten unveränderter kodierender Antikörpersequenz der SEQ ID NO: 5, 10 oder 15.
Insgesamt also wird mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ein neuer Weg bereitgestellt, Antikörper-Therapien auf der Basis von RNA, insbesondere mRNA durchzuführen. Dergestalt können klinisch erprobte Antikörper, bspw. Angiogenese-Hemmer auf Antikörper-Basis, bspw. Bevacizumab (monoklonaler Immunglobulin G, Antikörper, der an den Gefäßwachstumsfaktor VEGF (vascular endothelial growth factor) bindet; oder Trastuzumab (Herceptin), ein indirekter Hemmstoff, der die Wirkung von Tumorproteinen an Rezeptoren hemmt, oder bspw. Rituximab oder Cetuximab (gegen den Epidermal Growth Factor Receptor (EGRF) gerichtet) auf RNA-Basis zur Verfügung gestellt werden, so dass die RNA für diese Antikörper kodiert.
Die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA weist in einer bevorzugten Ausführungsform typischerweise zusätzlich mindestens eine der folgenden Modifikationen auf, die bevorzugt geeignet sind, die Stabilität der kodierenden RNA zu steigern, die Expression des dadurch kodierten Antikörpers zu verbessern, die Zellpermeabilität zu steigern, eine Lokalisierung des Antikörpers an oder in bestimmte Zellkompartimente zu ermöglichen, etc.. Jede dieser im folgenden genannten Modifikationen der hier beschriebenen erfindungsgemäßen RNA (modifizierte RNA) kann mit einander in geeigneter Weise kombiniert werden, wobei bevorzugt solche Modifikationen miteinander kombiniert werden, die nicht miteinander interferieren oder die Stabilität bzw. Zellpermeabilität der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, modifizierten RNA oder die Expression des dadurch kodierten Antikörpers nicht negativ beeinflusst. Die Nomenklatur „(modifiziert)" wird für die gesamte vorliegende Erfindung mit dem Inhalt von „ggf. modifiziert" gleichgesetzt.
Modifikationen der hier beschriebenen erfindungsgemäßen RNA (modifizierte RNA) können bspw. Modifikationen der Nukleotide der RNA umfassen. Eine erfindungsgemäße RNA (modifizierte RNA) kann so bspw. Backbone-Modifikationen, Zucker-Modifikationen oder Basen-Modifikationen umfassen. Die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA weist dabei typischerweise zunächst Nukleotide auf, die aus allen natürlich auftretenden Nukleotiden sowie deren Analoga (modifizierte Nukleotide) ausgewählt werden können, wie z. B. Ribonukleotide und/oder Desoxyribonukleotide. Nukleotide im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen daher, ohne darauf beschränkt zu sein, bspw. Purine (Adenin (A), Guanin (G)) oder Pyrimidine (Thymin (T), Cytosin (C), Uracil (U)), sowie als modifizierte Nukleotide Analoge oder Derivate von Purinen und Pyrimidinen wie z. B. 1-Methyl-Adenin, 2-Methyl-Adenin, 2-Methylthio-N6-isopentenyl-Adenin, N6-Methyl-Adenin, N6-Isopentenyl-Adenin, 2-Thio-Cytosin, 3-Methyl-Cytosin, 4-Acetyl-Cytosin, 5-Methyl-Cytosin, 2,6-Diaminopurin, 1-Methyl-Guanin, 2-Methyl-Guanin, 2,2-Dimethyl-Guanin, 7-Methyl-Guanin, Inosin, 1-Methyl-Inosin, Pseudouracil (5-Uracil), Dihydro-Uracil, 2-Thio-Uracil, 4-Thio-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thio-Uracil, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)-Uracil, 5-Fluoro-Uracil, 5-Bromo-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-Uracil, 5-Methyl-2-Thio-Uracil, 5-Methyl-Uracil, N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, 5-Methylaminomethyl-Uracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thio-Uracil, 5'-Methoxycarbonylmethyl-Uracil, 5-Methoxy-Uracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 1-Methyl-Pseudouracil, Queosin, β-D-Mannosyl-Queosin, Wybutoxosin, sowie Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide, Methylphosphonate, 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin. Die Herstellung derartiger Analoga sind einem Fachmann bspw. aus den US-Patenten 4,373,071 , US 4,401,796 , US 4,415,732 , US 4,458,066 , US 4,500,707 , US 4,668,777 , US 4,973,679 , US 5,047,524 , US 5,132,418 , US 5,153,319 , US 5,262,530 und 5,700,642 bekannt, deren Offenbarung durch Verweis hier vollumfänglich mit aufgenommen ist.
Insbesondere kann eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA Backbone-Modifikationen aufweisen. Eine Backbone-Modifikation ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Modifikation, bei der Phosphate des Rückgrates („Backbone") der in der RNA enthaltenen Nukleotide chemisch modifiziert sind. Solche Backbone-Modifikationen umfassen dabei typischerweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Modifikationen aus der Gruppe, bestehend aus Methylphosphonaten, Phosphoramidaten, Phosphorthioaten (z. B. Cytidin-5'-O-(1-thiophosphat)), etc..
Eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA kann ebenfalls auch Zucker-Modifikationen aufweisen. Eine Zucker-Modifikation im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine chemische Modifikation des Zuckers der enthaltenen Nukleotide und umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, typischerweise Zucker-Modifikationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2'-Deoxy-2'-fluoro-oligoribonucleotid (2'-Fluoro-2'-deoxycytidin-5'-triphosphat, 2'-Fluoro-2'-deoxyuridin-5'-triphosphat), 2'-Deoxy-2'-deamin-oligoribonucleotid (2'-Amino-2'-deoxycytidin-5'-triphosphat, 2'-Amino-2'-deoxyuridin-5'-triphosphat), 2'-O-Alkyloligoribonucleotid, 2'-Deoxy-2'-C-alkyloligoribonucleotid (2'-O-Methylcytidin-5'-triphosphat, 2'-Methyluridin-5'-triphosphat), 2'-C-alkyloligoribonucleotid, und Isomere davon (2'-Aracytidin-5'-triphosphat, 2'-Arauridin-5'-triphosphat), oder Azidotriphosphate (2'-Azido-2'-deoxycytidin-5'-triphosphat, 2'-Azido-2'-deoxyuridin-5'-triphosphat).
Bevorzugt weist die erfindungsgemäße modifizierte RNA-Sequenz jedoch keine Zucker-Modifikationen oder Backbone-Modifikationen auf, falls z. B. eine in vitro-Transkription erforderlich ist. Dieser bevorzugte Ausschluss liegt in der Problematik begründet, dass bestimmte Backbone-Modifikationen und Zucker-Modifikationen von RNA Sequenzen einerseits deren in vitro-Transkription verhindern oder zumindest stark vermindern können. So funktioniert eine beispielhaft durchgeführte in vitro Transkription von eGFP bspw. nur mit den Zucker-Modifikationen 2'-Amino-2'-deoxyuridin-5'-phosphat, 2'-Fluoro-2'-deoxyuridin-5'-phosphat und 2'-Azido-2'-deoxyuridin-5'-phosphat. Zusätzlich kann durch Backbone-Modifikationen, und, unabhängig davon, durch Zucker-Modifikationen von RNA-Sequenzen, die Translation des Proteins, d. h. die Proteinexpression in vitro bzw. in vivo typischerweise erheblich vermindert werden. Dies konnte bspw. für eGFP im Zusammenhang mit den oben ausgewählten Backbone-Modifikationen und Zucker-Modifikationen gezeigt werden.
Eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA kann ebenfalls auch Modifikationen der Basen der enthaltenen Nukleotide (Basen-Modifikationen) aufweisen. So kann bspw. die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA kann derart modifiziert werden, dass lediglich ein oder mehrere Nukleotide der modifizierten RNA gegen Nukleotide mit Basen-Modifikationen ausgetauscht werden, die bevorzugt geeignet sind, die Expression des durch die RNA kodierten Antikörpers signifikant gegenüber der nicht-veränderten, d. h. nativen, RNA-Sequenz zu steigern. Signifikant bedeutet in diesem Fall eine Steigerung der Expression des Antikörpers aufgrund der modifizierten RNA-Sequenz gegenüber der nativen RNA-Sequenz um mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, 40%, 50% oder 60%, noch stärker bevorzugt um mindestens 70%, 80%, 90% oder gar 100% und am stärksten bevorzugt um mindestens 150%, 200% oder gar 300%. Ein modifiziertes Nukleotid, das eine Basen-Modifikation aufweist, wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Basen-modifiziertes Nukleotid genannt und wird, ohne darauf beschränkt zu sein, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 2-Amino-6-Chloropurinribosid-5'-triphosphat, 2-Aminoadenosin-5'-triphosphat, 2-Thiocytidin-5'-triphosphat, 2-Thiouridin-5'-triphosphat, 4-Thiouridin-5'-triphosphat, 5-Aminoallylcytidin-5'-triphosphat, 5-Aminoallyluridin-5'-triphosphat, 5-Bromocytidin-5'-triphosphat, 5-Bromouridin-5'-triphosphat, 5-Iodocytidin-5'-triphosphat, 5-Iodouridin-5'-triphosphat, 5-Methylcytidin-5'-triphosphat, 5-Methyluridin-5'-triphosphat, 6-Azacytidin-5'-triphosphat, 6-Azauridin-5'-triphosphat, 6-Chloropurinribosid-5'-triphosphat, 7-Deazaadenosin-5'-triphosphat, 7-Deazaguanosin-5'-triphosphat, 8-Azaadenosin-5'-triphosphat, 8-Azidoadenosin-5'-triphosphat, Benzimidazol-ribosid-5'-triphosphat, N1-Methyladenosin-5'-triphosphat, N1-Methylguanosin-5'-triphosphat, N6-Methyladenosin-5'-triphosphat, O6-Methylguanosin-5'-triphosphat, Pseudouridin-5'-triphosphat, Puromycin-5'-triphosphat, oder Xanthosine-5'-triphosphat. Besonders bevorzugt werden Nukleotide für Basen-Modifikationen ausgewählt aus der Gruppe von Basen-modifizierten Nukleotiden, bestehend aus 5-Methylcytidin-5'-triphosphat und Pseudouridin-5'-triphosphat.
Ohne darauf festgelegt zu sein, führen die Erfinder in diesem Zusammenhang eine Steigerung der Expression des durch die erfindungsgemäße (Basen-)modifizierte RNA kodierten Antikörpers u. a. auf die Verbesserung der Stabilisierung von Sekundärstrukturen und ggf. auf die gebildete „starrere" Struktur der RNA und das verstärkte „base stacking" zurück. So ist bspw. für Pseudouridin-5'-triphosphat bekannt, dass dieses natürlich in strukturellen RNAs (tRNA, rRNA und snRNA) in Euka ryonten als auch in Prokaryonten auftritt. Es wird in diesem Zusammenhang angenommen, dass Pseudouridin in rRNA für die Stabilisierung von Sekundärstrukturen notwendig ist. Im Laufe der Evolution hat der Anteil an Pseudouridin in der RNA zugenommen und es konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass die Translation von dem Vorhandensein von Pseudouridin in der tRNA und rRNA abhängt, wobei vermutlich dabei die Interaktion zwischen tRNA und mRNA verstärkt wird. Die Umwandlung von Uridin zu Pseudouridin erfolgt posttranskriptionell durch Pseudouridin-Synthase. Bei 5-Methylcytidin-5'-triphosphat erfolgt ebenfalls eine posttranskriptionelle Modifikation von RNA, die durch Methyltransferasen katalysiert wird. Eine weitere Steigerung des Anteils von Pseudouridin sowie die Basen-Modifikation von anderen Nukleotiden führt angenommenerweise zu ähnlichen Effekten, die allerdings im Unterschied zu den natürlich auftretenden gesteigerten Anteilen von Pseudouridin in der Sequenz gezielt und mit wesentlich größerer Variabilität durchgeführt werden können. Für 5-Methylcytidin-5'-triphosphat und die weiteren hier genannten Basen-Modifikationen wird daher ein ähnlicher Mechanismus angenommen wie für Pseudouridin-5'-triphosphat, d. h. eine verbesserte Stabilisierung von Sekundärstrukturen, und darauf basierend eine verbesserte Translationseffizienz. Neben dieser strukturell begründeten Expressionssteigerung wird jedoch auch ein positiver Effekt auf die Translation unabhängig von der Stabilisierung von Sekundärstrukturen und einer „starreren" Struktur der RNA vermutet. Weitere Ursachen der Expressionssteigerung liegen ggf. auch in der geringeren Abbaurate der RNA-Sequenzen durch RNAsen in vitro oder in vivo begründet.
Die zuvor beschriebenen Modifikationen der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA kann/können mit Hilfe von Verfahren in die RNA eingebracht werden, die einem Fachmann bekannt sind. In Frage kommen dazu bspw. Syntheseverfahren unter Verwendung von (automatischen oder halbautomatischen) Oligonukleotidsynthesegeräten, biochemische Verfahren, wie z. B. in vitro-Transkriptionsverfahren, etc.. Bevorzugt können in diesem Zusammenhang bei (kürzeren) Sequenzen, die im Allgemeinen eine Länge von 50–100 Nukleotiden nicht überschreiten, Syntheseverfahren unter Verwendung von (automatischen oder halbautomatischen) Oligonukleotidsynthesegeräten als auch in vitro-Transkriptionsverfahren eingesetzt werden. Bei (längeren) Sequenzen, z. B. Sequenzen, die eine Länge von mehr als 50 bis 100 Nukleotiden aufweisen, kommen bevorzugt biochemische Verfahren in Frage, wie bspw. in vitro-Transkriptionsverfahren, bevorzugt ein wie hier beschriebenes in vitro-Transkriptionsverfahren, ggf. unter Verwendung der erfindungsgemäßen modifizierten RNA.
Modifikationen mit wie hier beschriebenen Nukleotiden bei einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA können an mindestens einem (modifizierbaren) Nukleotid der erfindungsgemäßen RNA-Sequenz auftreten, bevorzugt an mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 (modifizierbaren) Nukleotiden, stärker bevorzugt an mindestens 10–20 (modifizierbaren) Nukleotiden, noch stärker bevorzugt an mindestens 10–100 (modifizierbaren) Nukleotiden und am stärksten bevorzugt an mindestens 10–200, 10 bis 1000 oder 10 bis 10.000 oder mehr (modifizierbaren), z. B. allen, Nukleotiden. Alternativ formuliert können Modifikationen bei einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA an mindestens einem (modifizierbaren) Nukleotid der erfindungsgemäßen RNA-Sequenz auftreten, bevorzugt an mindestens 10% aller (modifizierbaren) Nukleotide, stärker bevorzugt an mindestens 25% aller (modifizierbaren) Nukleotide, noch stärker bevorzugt an mindestens 50% aller (modifizierbaren) Nukleotide, sogar noch stärker bevorzugt an mindestens 75% aller (modifizierbaren) Nukleotide und am stärksten bevorzugt an 100% der in der erfindungsgemäßen RNA-Sequenz enthaltenen (modifizierbaren) Nukleotide. Ein „modifizierbares Nukleotid" ist in diesem Zusammenhang jedes (bevorzugt natürlich vorkommende (native) und damit nicht-modifizierte) Nukleotid, das gegen ein, wie hier beschriebenes, modifiziertes Nukleotid ausgetauscht werden soll. Dabei können alle Nukleotide der RNA-Sequenz modifiziert werden oder nur bestimmte ausgewählte Nukleotide der RNA-Sequenz. Sollen alle Nukleotide der RNA-Sequenz modifiziert werden, so sind 100% der „modifizierbaren Nukleotide" der RNA-Sequenz alle Nukleotide der verwendeten RNA-Sequenz. Sollen dagegen nur bestimmte ausgewählte Nukleotide der RNA-Sequenz modifiziert werden, so sind die ausgewählten Nukleotide bspw. Adenosin, Cytidin, Guanosin oder Uridin. So kann bspw. ein Adenosin der nativen Sequenz gegen ein modifiziertes Adenosin ausgetauscht werden, ein Cytidin gegen ein modifiziertes Cytidin, ein Uridin gegen ein modifiziertes Uridin und ein Guanosin gegen ein modifiziertes Guanosin. In diesem Fall sind 100% der „modifizierbaren Nukleotide" der RNA-Sequenz 100% der in der verwendeten RNA-Sequenz enthaltenen Adenosine, Cytidine, Guanosine oder Uridine.
Gemäß einer anderen ganz bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA bspw. einen GC-Gehalt aufweisen, der gegenüber der nativen, d. h. nicht-modifizierten (Vorläufer)RNA-Sequenz verändert wurde. Gemäß einer ersten Alternative der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA ist der G/C-Gehalt für den kodierenden Bereich der erfindungsgemäßen RNA größer als der G/C-Gehalt für den kodierenden Bereich der nativen RNA-Sequenz, wobei die kodierte Aminosäuresequenz des Antikörpers oder Antikörperfragments gegenüber dem Wildtyp, d. h. der durch die native RNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz des Antikörpers oder Antikörperfragments, unverändert ist. Dabei spielt die Zusammensetzung und die Abfolge der verschiedenen Nukleotide eine große Rolle. Insbesondere sind Sequenzen mit erhöhtem G(Guanin)/C(Cytosin)-Gehalt stabiler als Sequenzen mit einem erhöhten A(Adenin)/U(Uracil)-Gehalt. Daher werden erfindungsgemäß unter Beibehaltung der translatierten Aminosäureabfolge die Codons gegenüber der Wildtyp-RNA derart variiert, dass sie vermehrt G/C-Nukleotide beinhalten. Da mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure kodieren (Degeneration des genetischen Codes), können die für die Stabilität günstigsten Codons ermittelt werden (alternative Codonverwendung, engl. "codon usage").
In Abhängigkeit von der durch die erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA zu kodierenden Aminosäure sind unterschiedliche Möglichkeiten zur Modifikation der nativen Sequenz der erfindungsgemäßen RNA möglich. Im Fall von Aminosäuren, die durch Codons kodiert werden, die ausschließlich G- oder C-Nukleotide enthalten, ist keine Modifikation des Codons erforderlich. So erfordern die Codons für Pro (CCC oder CCG), Arg (CGC oder CGG), Ala (GCC oder GCG) und Gly (GGC oder GGG) keine Veränderung, da kein A oder U vorhanden ist.
In folgenden Fällen werden die Codons, welche A- und/oder U-Nukleotide enthalten durch Substituieren anderer Codons, welche für die gleichen Aminosäuren kodieren, jedoch kein A und/oder U enthalten, verändert. Beispiele sind:

• Die Codons für Pro können von CCU oder CCA zu CCC oder CCG verändert werden;
• die Codons für Arg können von CGU oder CGA oder AGA oder AGG zu CGC oder CGG verändert werden;
• die Codons für Ala können von GCU oder GCA zu GCC oder GCG verändert werden;
• die Codons für Gly können von GGU oder GGA zu GGC oder GGG verändert werden.

In anderen Fällen können A- bzw. U-Nukleotide zwar nicht aus den Codons eliminiert werden, es ist jedoch möglich, den A- und U-Gehalt durch Verwendung von Codons zu vermindern, die weniger A- und/oder U-Nukleotide enthalten. Zum Beispiel:

• Die Codons für Phe können von UUU zu UUC verändert werden;
• die Codons für Leu können von UUA, CUU oder CUA zu CUC oder CUG verändert werden;
• die Codons für Ser können von UCU oder UCA oder AGU zu UCC, UCG oder AGC verändert werden;
• das Codon für Tyr kann von UAU zu UAC verändert werden;
• das Stop-Codon UAA kann zu UAG oder UGA verändert werden;
• das Codon für Cys kann von UGU zu UGC verändert werden;
• das Codon His kann von CAU zu CAC verändert werden;
• das Codon für Gin kann von CAA zu CAG verändert werden;
• die Codons für Ile können von AUU oder AUA zu AUC verändert werden;
• die Codons für Thr können von ACU oder ACA zu ACC oder ACG verändert werden;
• das Codon für Asn kann von AAU zu AAC verändert werden;
• das Codon für Lys kann von AAA zu AAG verändert werden;
• die Codons für Val können von GUU oder GUA zu GUC oder GUG verändert werden;
• das Codon für Asp kann von GAU zu GAC verändert werden;
• das Codon für Glu kann von GAA zu GAG verändert werden.

Im Falle der Codons für Met (AUG) und Trp (UGG) besteht hingegen keine Möglichkeit der Sequenz-Modifikation.
Die vorstehend aufgeführten Substitutionen können selbstverständlich einzeln aber auch in allen möglichen Kombinationen zur Erhöhung des G/C-Gehalts der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA gegenüber der nativen RNA-Sequenz (bzw. Nukleinsäuresequenz) verwendet werden. So können beispielsweise alle in der nativen RNA-Sequenz auftretenden Codons für Thr zu ACC (oder ACG) verändert werden. Vorzugsweise werden jedoch Kombinationen der vorstehenden Substitutionsmöglichkeiten genutzt, z. B.:

• Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Thr kodierenden Codons zu ACC (oder ACG) und Substitution aller ursprünglich für Ser kodierenden Codons zu UCC (oder UCG oder AGC);
• Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Ile kodierenden Codons zu AUC- und Substitution aller ursprünglich für Lys kodierenden Codons zu AAG und Substitution aller ursprünglich für Tyr kodierenden Codons zu UAC;
• Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Arg kodierenden Codons zu CGC (oder CGG);
• Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Gly kodierenden Codons zu GGC (oder GGG) und Substituion aller ursprünglich für Asn kodierenden Codons zu AAC;
• Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller usprünglich für Phe kodierenden Codons zu UUC und Substitution aller ursprünglich für Cys kodierenden Codons zu UGC und Substitution aller ursprünglich für Leu kodierenden Codons zu CUG (oder CUC) und Substitution aller ursprünglich für Gin kodierenden Codons zu CAG und Substitution aller ursprünglich für Pro kodierenden Codons zu CCC (oder CCG); usw..

Bevorzugt wird der G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA gegenüber dem G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der nativen RNA derart erhöht dass mindestens 5%, mindestens 10%, mindestens 15%, mindestens 20%, mindestens 25% oder stärker bevorzugt mindestens 30%, mindestens 35%, mindestens 40%, mindestens 45%, mindestens 50% oder mindestens 55%, noch stärker bevorzugt mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70% oder mindestens 75% und am stärksten bevorzugt mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 100% der möglichen modifizierbaren Codons des kodierenden Bereichs der nativen RNA (bzw. Nukleinsäure) modifiziert sind.
Besonders bevorzugt ist es in diesem Zusammenhang, den G/C-Gehalt der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA, insbesondere im kodierenden Bereich, im Vergleich zur nativen RNA-Sequenz maximal zu erhöhen.
Eine zweite Alternative der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden RNA mit Modifikationen beruht auf der Erkenntnis, dass die Translationseffizienz der RNA auch durch eine unter schiedliche Häufigkeit im Vorkommen von tRNAs in Zellen bestimmt wird. Sind daher in einer RNA-Sequenz vermehrt sogenannte "seltene" Codons vorhanden, so wird die entsprechende RNA deutlich schlechter translatiert als in dem Fall, wenn für relativ "häufige" tRNAs kodierende Codons vorhanden sind.
Gemäß dieser zweiten Alternative der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA ist daher der kodierende Bereich der erfindungsgemäßen RNA gegenüber dem kodierenden Bereich der nativen RNA derart verändert, dass mindestens ein Codon der nativen RNA, das für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodiert, gegen ein Codon ausgetauscht ist, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA.
Durch diese Modifikation wird die Sequenz der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA derart modifiziert, dass Codons eingefügt werden, für die häufig vorkommende tRNAs zur Verfügung stehen. Welche tRNAs relativ häufig in der Zelle vorkommen und welche demgegenüber relativ selten sind, ist einem Fachmann bekannt; vgl. bspw. Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660–666.
Durch diese Modifikation können erfindungsgemäß alle Codons der Sequenz der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA, die für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodieren, jeweils gegen ein Codon ausgetauscht werden, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche jeweils die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA.
Besonders bevorzugt ist es, den in der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA erhöhten, insbesondere maximalen, sequenziellen G/C-Anteil mit den "häufigen" Codons zu verknüpfen, ohne die durch die erfindungsgemäße RNA kodierte Antikörpersequenz zu verändern. Diese bevorzugte Ausführungsform stellt eine besonders effizient translatierte und stabilisierte erfindungsgemäße RNA-Sequenz bereit, die einen Antikörper kodiert (bspw. für eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung).
In den Sequenzen eukaryotischer RNAs gibt es typischerweise destabilisierende Sequenzelemente (DSE), an welche Signalproteine binden und den enzymatischen Abbau der RNA in vivo regulieren. Daher werden zur weiteren Stabilisierung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodieren den, RNA gegebenenfalls in dem für das Protein kodierenden Bereich eine oder mehr Veränderungen gegenüber dem entsprechenden Bereich der nativen RNA vorgenommen, so dass keine destabilisierenden Sequenzelemente enthalten sind. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt, gegebenenfalls in den nicht-translatierten Bereichen (3'- und/oder 5'-UTR) vorhandene DSE aus der RNA zu eliminieren.
Derartige destabilisierende Sequenzen sind bspw. AU-reiche Sequenzen ("AURES"), die in 3'-UTR-Abschnitten zahlreicher instabiler RNA vorkommen (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 bis 1674). Die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA ist daher vorzugsweise derart gegenüber der nativen RNA verändert, dass diese keine derartigen destabilisierenden Sequenzen mehr aufweist. Dies gilt auch für solche Sequenzmotive, die von möglichen Endonukleasen erkannt werden, bspw. die Sequenz GAACAAG, die im 3' UTR-Segment des für den Transferrin-Rezeptor kodierenden Gens enthalten ist (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 bis 1980). Auch diese Sequenzmotive werden bevorzugt in der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA eliminiert.
Einem Fachmann sind verschiedene Verfahren geläufig, die vorliegend zur Substitution von Codons in RNAs geeignet sind, d. h. zur Substitution von Codons in der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA. Im Falle kürzerer kodierender Bereiche (die für wie hier beschriebene Antikörper oder Antikörperfragmente kodieren) kann bspw. die gesamte erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA chemisch unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert werden, wie sie einem Fachmann geläufig sind.
Bevorzugt werden allerdings Basensubstitutionen unter Verwendung einer DNA-Matrize zur Herstellung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA mit Hilfe von Techniken der gängigen zielgerichteten Mutagenese eingeführt (siehe bspw. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl., Cold Spring Harbor, NY, 2001). Bei diesem Verfahren wird zur Herstellung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA daher ein entsprechendes DNA-Molekül in vitro transkribiert (s. u.). Diese DNA-Matrize besitzt ggf. einen geeigneten Promotor, bspw. einen T3, T7 -oder SP6-Promotor, für die in vitro-Transkription, dem die gewünschte Nukleotidsequenz für die herzustellende erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA und ein Termisationssignal für die in in vitro-Transkription fol gen. Das DNA-Molekül, das die Matrize des herzustellenden, einen Antikörper kodierenden, RNA-Konstrukts bildet, kann dann durch fermentative Vermehrung und anschließende Isolierung als Teil eines in Bakterien replizierbaren Plasmids hergestellt werden. Als dafür geeignete Plasmide können bspw. die Plasmide pT7Ts (GenBank-Zugriffsnummer U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 bis 2360), pGEM^®-Reihe, bspw. pGEM^®-1 (GenBank-Zugriffsnummer X65300; von Promega) und pSP64 (GenBank-Zugriffsnummer X65327) genannt werden; vgl. auch Mezei und Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin und Griffin (Hrsg.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
Es kann so unter Verwendung kurzer synthetischer RNA- oder DNA-Oligonukleotide, die an den entstehenden Schnittstellen kurze einzelsträngige Übergänge aufweisen, oder durch chemische Synthese hergestellte Gene, die gewünschte Nukleotidsequenz nach einem Fachmann geläufigen molekularbiologischen Methoden in ein geeignetes Plasmid kloniert werden (vgl. Maniatis et al., (2001) supra). Das RNA- oder DNA-Molekül wird dann aus dem Plasmid, in welchem es in einfacher oder mehrfacher Kopie vorliegen kann, durch Verdauung mit Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die oben beschriebene erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende (modifizierte) RNA, insbesondere falls die RNA als mRNA vorliegt, darüber hinaus eine 5'-Cap-Struktur (ein modifiziertes Guanosin-Nukleotid) aufweisen. Als Beispiele von Cap-Strukturen können, ohne darauf festgelegt zu sein, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G genannt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA, insbesondere falls die RNA als mRNA vorliegt, einen Poly-A-Schwanz am 3'-Terminus von typischerweise etwa 10 bis 200 Adenosin-Nukleotiden, bevorzugt etwa 10 bis 100 Adenosin-Nukleotiden, stärker bevorzugt etwa 20 bis 70 Adenosin-Nukleotiden oder noch stärker bevorzugt etwa 20 bis 60 Adenosin-Nukleotiden.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA, insbesondere falls die RNA als mRNA vorliegt, einen Poly-C-Schwanz am 3'-Terminus von typischerweise etwa 10 bis 200 Cyto sin-Nukleotiden, bevorzugt etwa 10 bis 100 Cytosin-Nukleotiden, stärker bevorzugt etwa 20 bis 70 Cytosin-Nukleotiden oder noch stärker bevorzugt etwa 20 bis 60 oder gar 10 bis 40 Cytosin-Nukleotiden.
Die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA, kann gemäß einer weiteren Ausführungsform zusätzlich einen Nukleinsäureabschnitt enthalten, der einen Tag zur Aufreinigung kodiert. Solche Tags umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, z. B. einen Hexahistidin-Tag (His-Tag, Polyhistidin-Tag), einen Streptavidin-Tag (Strep-Tag), einen SBP-Tag (Streptavidin-Bindungs-Tag), einen GST (Glutathion-S-Transferase)-Tag, etc.. Weiterhin kann die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA einen Tag für die Aufreinigung über ein Antikörper-Epitop kodieren (Antikörper-Bindungs-Tag), z. B. einen Myc-Tag, ein Swa11-Epitop, einen FLAG-Tag, einen HA-Tag, etc., d. h. über Erkennung des Epitops über den (immobilisierten) Antikörper.
Für eine effiziente Translation von RNA, insbesondere mRNA, ist weiterhin eine wirksame Bindung der Ribosomen an die Ribosomen-Bindungsstelle (Kozak-Sequenz: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO: 16), das AUG bildet das Startcodon) erforderlich. Diesbezüglich ist festgestellt worden, dass ein erhöhter A/U-Gehalt um diese Stelle herum eine effizientere Ribosomen-Bindung an die RNA ermöglicht. Daher kann, gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA einen um die Ribosomen-Bindungsstelle erhöhten A/U-Gehalt aufweisen, bevorzugt einen um 5 bis 50%, stärker bevorzugt einen um 25 bis 50% oder mehr erhöhten A/U-Gehalt, gegenüber der nativen RNA.
Des weiteren ist es gemäß einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA möglich, in die RNA eine oder mehr sog. IRES (engl. "internal ribosomal entry side") einzufügen. Eine IRES kann so als alleinige Ribosomen-Bindungsstelle fungieren, sie kann jedoch auch zur Bereitstellung einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA dienen, die für mehrere Antikörper oder Antikörperfragmente kodiert, die unabhängig voneinander durch die Ribosomen translatiert werden sollen ("multicistronische RNA"). Eine solche RNA kann bspw. eine vollständige Sequenz eines Antikörpers kodieren, wobei die entsprechenden kodierenden Bereiche der schweren und leichten Kette durch eine IRES-Sequenz miteinander (funktionell) verknüpft sind. Erfindungsgemäß werden die beschriebenen IRES-Sequenzen insbesondere zur (nahezu) gleichzeitigen und gleichmäßigen Expression der leichten und der schweren Ketten des durch die erfindungsgemäße RNA kodierten Antikörpers eingesetzt. Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer IRES-Sequenzen sind diejenigen aus Picornaviren (z. B. FMDV), Pestviren (CFFV), Polioviren (PV), Enzephalo-Myocarditis-Viren (ECMV), Maul-und-Klauenseuche-Viren (FMDV), Hepatitis-C-Viren (HCV), Klassisches-Schweinefieber-Viren (CSFV), Murines-Leukoma-Virus (MLV), Simean-Immundefizienz-Viren (SIV), Cricket-Paralysis-Viren (CrPV), oder eine SIRES-Sequenz.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA in den 5'- und/oder 3'-nicht translatierten Bereichen Stabilisierungssequenzen auf, die befähigt sind, die Halbwertszeit der RNA im Cytosol zu erhöhen. Diese Stabilisierungssequenzen können eine 100%ige Sequenzhomologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen aufweisen, die in Viren, Bakterien und Eukaryoten auftreten, können aber auch teilweise oder vollständig synthetischer Natur sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können die nicht-translatierten Sequenzen (UTR) des β-Globingens, bspw. von Homo sapiens oder Xenopus laevis, genannt werden. Ein anderes Beispiel einer Stabilisierungssequenz weist die allgemeine Formel (C/U)CCAN_xCCC(U/A)Py_xUC(C/U)CC (SEQ ID NO: 17) auf, die im 3'UTR der sehr stabilen RNA enthalten ist, die für α-Globin, α-(I)-Collagen, 15-Lipoxygenase oder für Tyrosin-Hydroxylase kodiert (vgl. Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 bis 2414). Selbstverständlich können derartige Stabilisierungssequenzen einzeln oder in Kombination miteinander als auch in Kombination mit anderen, einem Fachmann bekannten Stabilisierungssequenzen verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA zusätzlich zu dem wie hier beschriebenen Antikörper ein sekretorisches Signalpeptid kodieren. Solche Signalpeptide sind (Signal-)Sequenzen, die üblicherweise eine Länge von 15 bis 30 Aminosäuren umfassen und bevorzugt am N-Terminus des kodierten Antikörpers lokalisiert sind. Signalpeptide ermöglichen typischerweise den Transport eines damit fusionierten Antikörpers (hier z. B. eines Antikörpers), zu einem oder in ein definiertes zelluläres Kompartiment, bevorzugt die Zelloberfläche, das endoplasmatische Reticulim oder das endosomal-lysosomale Kompartiment. Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Signalsequenzen sind z. B.
Signalsequenzen von klassischen und nicht klassischen MHC-Molekülen, Cytokinen, Immunglobulinen, der invarianten Kette, Lamp1, Tapasin, Erp57, Calretikulin und Calnexin, sowie aller weiteren membranständigen, endosomal-lysosomal- oder endoplasmatisches Restikulum-assozierten Proteine. Bevorzugt wird das Signalpepid des humanen MHC-Klasse-I-Moleküls HLA-A*0201 verwendet.
Sequenzen, die einen Transport eines damit fusionierten Antikörpers (hier z. B. eines Antikörpers), zu einem oder in ein definiertes zelluläres Kompartiment, bevorzugt die Zelloberfläche, den Kern, den Kernbereich, der Plasmamembran, dem Zytosol, dem endoplasmatischen Reticulim, den Organellen, den Mitochondrien, dem Golgi-Apparat oder dem endosomalen-lysosomalen Kompartiment ermöglichen, umfassen auch, ohne darauf beschränkt zu sein, sogenannte „routing signals", „sorting signals", „retention signals" oder „salvage signals" und „membrane topology-stop transfer signals" (vgl. Pugsley, A. P., Protein Targeting, Academic Press, Inc. (1989)) auf der Ebene der erfindungsgemäßen RNA. Lokalisierungssequenzen umfassen in diesem Zusammenhang Nukleinsäuresequenzen, die z. B. Signale, d. h. Aminosäuresequenzen kodieren wie bspw. KDEL (SEQ ID NO: 18) (Munro, et al., Cell 48: 899-907 (1987)) DDEL (SEQ ID NO: 19), DEEL (SEQ ID NO: 20), QEDL (SEQ ID NO: 21) und RDEL (SEQ ID NO: 22) (Hangejorden, et al., J. Biol. Chem. 266: 6015 (1991)) für das Endoplasmatische Reticulum; PKKKRKV (SEQ ID NO: 23) (Lanford, et al. Cell 46: 575 (1986)) PQKKIKS (SEQ ID NO: 24) (Stanton, L. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 1772 (1986); QPKKP (SEQ ID NO: 25) (Harlow, et al., Mol. Cell Biol. 5: 1605 1985), und RKKR (SEQ ID NO: 26), für den Kern; und RKKRRQRRRAHQ (SEQ ID NO: 27), (Seomi, et al., J. Virology 64: 1803 (1990)), RQARRNRRRRWRERQR (SEQ ID NO: 28) (Kubota, et al., Biochem. and Biophy, Res. Comm. 162: 963 (1989)), und MPLTRRRPAASQALAPPTP (SEQ ID NO: 29) (Siomi, et al., Cell 55: 197 (1988)) für den Kernbereich; MDDQRDLISNNEQLP (SEQ ID NO: 30), (Bakke, et al., Cell 63: 707–716 (1990)) für das endosomale Kompartiment (siehe bspw. Letourneur, et al., Cell 69: 1183 (1992) zum Targeting von Liposomen). Weiterhin können Myristoylierungssequenzen verwendet werden, um die exprimierten Antikörper zur Plasmamembran zu leiten oder zu bestimmten verschiedenen subzellulären Kompartimenten, wie dem Kernbereich, den Organellen, den Mitochondrien und dem Golgi-Apparat. Nachfolgend sind entsprechende Aminosäure-Sequenzen angegeben, die durch eine entsprechende Codon-Abfolge von der erfindungsgemäßen RNA kodiert werden. Die Sequenz MLFNLRXXLNNAAFRHGHNFMVRNFRCGQPLX (SEQ ID NO: 31) kann verwendet werden, um den Antikörper zur mitochondrialen Matrix zu leiten (Pugsley, supra). Siehe, Tang, et al., J. Bio. Chem. 207: 10122, bzgl. der Lokalisierung von Proteinen (Antikörpern) zum Golgi-Apparat; zur Lokalisierung von Proteinen zur Plasmamembran: GCVCSSNP (SEQ ID NO: 32), GQTVTTPL (SEQ ID NO: 33), GQELSQHE (SEQ ID NO: 34), GNSPSYNP (SEQ ID NO: 35), GVSGSKGQ (SEQ ID NO: 36), GQTITTPL (SEQ ID NO: 37), GQTLTTPL (SEQ ID NO: 38), GQIFSRSA (SEQ ID NO: 39), GQIHGLSP (SEQ ID NO: 40), GARASVLS (SEQ ID NO: 41), und GCTLSAEE (SEQ ID NO: 42); zum Endoplasmatischen Retikulum GQNLSTSN (SEQ ID NO: 43); zum Kern GAALTILV (SEQ ID NO: 44) und GAALTLLG (SEQ ID NO: 45); zum Endoplasmatischen Retikulum und zum Cytoplasma GAQVSSQK (SEQ ID NO: 46) und GAQLSRNT (SEQ ID NO: 47); zum Golgi-Apparat, zum Kern, zum Cytoplasma und zum Cytoskelett: GNAAAAKK (SEQ ID NO: 48); zum Cytoplasma und zum Cytoskelett GNEASYPL (SEQ ID NO: 49); und zur Plasmamembran und zum Cytoskelett GSSKSKPK (SEQ ID NO: 50). Solche, wie zuvor beschriebenen, Sequenzen werden bevorzugt für RNAs, kodierend für Intrabodies, verwendet.
Die hier beschriebenen Modifikationen können in geeigneter Weise durch einen Fachmann in die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, RNA-Sequenz eingeführt werden. Bspw. kann die Ermittlung der optimalen erfindungsgemäßen modifizierten RNA durch dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden, z. B. kann die Anpassung des G/C-Gehalts manuell und/oder mittels eines automatisierten Verfahrens durchgeführt werden, wie gemäß WO 02/098443 offenbart. Dabei kann die Adaptierung der RNA-Sequenzen mit den hier beschriebenen zusätzlichen unterschiedlichen Optimierungszielen erfolgen: Zum einen kann die Anpassung mit größtmöglichen G/C-Gehalt, zum anderen unter bestmöglicher Berücksichtigung der Häufigkeit der tRNAs gemäß Codon Usage durchgeführt werden. Im ersten Schritt des Verfahrens wird dabei eine virtuelle Translation einer beliebigen RNA (oder DNA)-Sequenz durchgeführt, um die entsprechende Aminosäuresequenz zu generieren. Ausgehend von der Aminosäuresequenz wird eine virtuelle reverse Translation durchgeführt, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes Wahlmöglichkeiten für die entsprechenden Codons liefert. Je nach geforderter Optimierung bzw. Modifizierung werden zur Auswahl der geeigneten Codons entsprechende Selektionslisten und Optimierungsalgorithmen verwendet. Die Ausführung der Algorithmen erfolgt typischerweise mit Hilfe einer geeigneten Software auf einem Computer. So wird die optimierte RNA-Sequenz erstellt und kann bspw. mit Hilfe einer entsprechenden Anzeigevorrichtung ausgegeben und mit der ursprünglichen (Wildtyp-)Sequenz verglichen werden. Das gleiche gilt auch für die Häufigkeit der einzelnen Nukleotide. Die Änderungen gegenüber der ursprünglichen Nukleotidsequenz werden dabei vorzugsweise hervorgehoben. Weiter werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform in der Natur bekannte stabile Sequenzen eingelesen, welche die Grundlage für eine gemäß natürlichen Sequenzmotiven stabilisierte RNA bieten können. Es kann ebenfalls eine Sekundärstrukturanalyse vorgesehen werden, die anhand von Strukturberechnungen stabilisierende und destabilisierende Eigenschaften bzw. Bereiche der RNA analysieren kann.
Des weiteren kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der wirksame Transfer der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA in die zu behandelnden Zellen bzw. den zu behandelnden Organismus dadurch verbessert werden, dass die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA mit einem kationischen Peptid oder Protein komplexiert oder daran gebunden ist. Eine solche Komplexierung/Kondensierung der RNA, insbesondere mRNA, umfasst bspw. die Komplexierung (oder Bindung) der erfindungsgemäßen RNA mit einem (poly)kationischen Polymer, Polyplexen, Protein(en), insbesondere polykationischen Protein(en), oder Peptid(en) assoziiert oder daran gebunden wird. Vorzugsweise wird eine erfindungsgemäße RNA (mRNA) mit mindestens einem kationischen oder polykationischen Agens komplexiert oder kondensiert. Bevorzugt handelt es sich bei einem solchen kationischen oder poykationischen Agens um ein Agens, das aus der Gruppe bestehend aus Protamin, Poly-L-Lysin, Poly-L-Arginin, Nucleolin, Spermin und Histonen, Nukleolin oder Derivaten davon ausgewählt wird. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung von Protamin als polykationisches, Nukleinsäurebindendes Protein. Diese Vorgehensweise zur Stabilisierung der RNA wird beispielsweise in EP-A-1083232 beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlossen wird.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA eine Lipid-Modifizierung aufweisen. Eine solche, mit einem Lipid modifizierte RNA besteht typischerweise aus einer, wie hier definierten, erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, RNA, mindestens einem mit dieser RNA kovalent verknüpften Linker und mindestens einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid. Alternativ besteht die mit einem Lipid modifizierte erfindungsgemäße (modifizierte) RNA aus (mindestens) einer, wie hier definierten, erfindungsgemäßen (modifizierten) RNA und mindestens einem mit dieser RNA kovalent verknüpften (bifunktionellen) Lipid. Gemäß einer dritten Alternative besteht die mit einem Lipid modifizierte erfindungsgemäße (modifizierte) RNA aus einer, wie hier definierten, erfin dungsgemäßen (modifizierte) RNA, mindestens einem mit dieser RNA verknüpften Linker und mindestens einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid sowie mindestens einem mit dieser erfindungsgemäßen (modifizierte) RNA (ohne Linker) kovalent verknüpften (bifunktionellen) Lipid.
Das zur Lipid-Modifikation der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA eingesetzte Lipid ist typischerweise ein Lipid oder ein lipophiler Rest, der bevorzugt an sich biologisch aktiv ist. Solche Lipide umfassen bevorzugt Naturstoffe oder Verbindungen, wie z. B. Vitamine, z. B. α-Tocopherol (Vitamin E), einschließlich RRR-α-Tocopherol (früher D-α-Tocopherol), L-α-Tocopherol, dem Racemat D,L-α-Tocopherol, Vitamin E-Succinat (VES), oder Vitamin A und dessen Derivate, z. B. Retinsäure, Retinol, Vitamin D und dessen Derivate, z. B. Vitamin D sowie dessen Ergosterol-Vorstufen, Vitamin E und dessen Derivate, Vitamin K und dessen Derivate, z. B. Vitamin K und verwandte Chinon- bzw. Phytolverbindungen, oder Steroide, wie Gallensäuren, bspw. Cholinsäure, Desoxycholinsäure, Dehydrocholinsäure, Cortison, Digoxygenin, Testosteron, Cholesterin oder Thiocholesterin. Weitere Lipide oder lipophile Reste im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyalkylenglykole, (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), aliphatische Gruppen, wie z. B. C₁-C₂₀-Alkane, C₁-C₂₀-Alkene, oder C₁-C₂₀-Alkanolverbindungen, etc., wie bspw. Dodecandiol, Hexadecanol oder Undecyl-Reste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), Phospholipide, wie z. B. Phosphatidylglycerin, Diacylphosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Dihexadecyl-rac-glycerin, Sphingolipide, Cerebroside, Ganglioside, oder Triethylammonium 1,2-Di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777), Polyamine oder Polyalkylenglykole, wie z. B. Polyethylenglykol (PEG) (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), Hexaethylenglykol (HEG), Palmitin oder Palmityl-Reste (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229), Octadecylamine oder Hexylaminocarbonyloxycholesterin-Reste (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), sowie Wachse, Terpene, alicyklische Kohlenwasserstoffe, gesättigte bzw. einfach- oder mehrfach ungesättigte Fettsäurereste, etc..
Die Verknüpfung zwischen dem Lipid und der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA kann grundsätzlich an jedem Nukleotid, an der Base oder dem Zuckerrest jedes Nukleotids, am 3'- und/oder 5'-Ende, und/oder am Phosphatrückgrat der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA stattfinden. Erfindungsgemäß wird eine terminale Lipid-Modifizierung der erfindungsgemäßen (modifizierten) RNA an deren 3'- und/oder 5'-Ende besonders bevorzugt. Eine terminale Modifizierung weist gegenüber sequenzinternen Modifikationen mehrere Vorteile auf. Zum einen können sequenzinterne Modifikationen das Hybridisierungsverhalten beeinflussen, was sich ggf. bei sterisch anspruchsvollen Resten negativ auswirkt. Sequenzinterne (sterisch anspruchsvolle) Modifikationen stören sehr oft auch bei der Translation, was häufig zu einem Abbruch der Proteinsynthese führen kann. Andererseits kann bei einer synthetischen Herstellung einer mit einem Lipid modifizierten erfindungsgemäßen (modifizierten) RNA, die ausschließlich terminal modifiziert ist, die Synthese dieser erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA mit handelsüblichen, in großer Menge verfügbaren, Monomeren durchgeführt und im Stand der Technik bekannte Syntheseprotokolle verwendet werden.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verknüpfung zwischen der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA und mindestens einem verwendeten Lipid über einen (kovalent mit der (modifizierten) RNA verknüpften) „Linker". Linker im Sinne der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise mindestens zwei und optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10–20, 20–30 oder mehr reaktive Gruppen auf, jeweils ausgewählt aus z. B. einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe, einer Alkoxygruppe, etc.. Bevorzugt dient eine reaktive Gruppe zur Bindung der hier beschriebenen erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA. Diese reaktive Gruppe kann in einer geschützten Form vorliegen, z. B. als DMT (Dimethoxytritylchlorid)-Gruppe, als Fmoc-Gruppe, als MMT (Monomethoxytrityl-)-Gruppe, als TFA (Trifluoressigsäure)-Gruppe, etc. Weiterhin können Schwefelgruppen durch Disulfide, z. B. Alkylthiole, wie bspw. 3-Thiopropanol, oder mit aktivierten Komponenten, wie 2-Thiopyridin, geschützt werden. Eine oder mehr weitere reaktive Gruppen dienen erfindungsgemäß zur kovalenten Bindung von einem oder mehr Lipiden. Eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA kann daher gemäß der ersten Ausführungsform über den kovalent gebundenen Linker bevorzugt mindestens ein Lipid binden, z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 5–10, 10–20, 20–30 oder mehr Lipid(e), besonders bevorzugt mindestens 3–8 oder mehr Lipide pro (modifizierter) RNA. Die gebundenen Lipide können dabei getrennt voneinander an verschiedene Positionen der erfindungs gemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA gebunden werden, aber auch als Komplex an einer oder mehr Positionen der (modifizierten) RNA vorliegen. Eine zusätzliche reaktive Gruppe des Linkers kann zur direkten oder indirekten (spaltbaren) Bindung an ein Trägermaterial, z. B. eine Festphase, verwendet werden. Bevorzugte Linker gemäß der vorliegenden Erfindung sind z. B. Glykol, Glycerin sowie Glycerin-Derivate, 2-Aminobutyl-1,3-propandiol sowie 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivate/Gerüst, Pyrrolidin-Linker bzw. Pyrrolidin enthaltende organische Moleküle (insbesondere für eine Modifikation am 3'-Ende), etc.. Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß als Linker Glycerin oder Glycerinderivate (C₃-Anker) oder ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivat/Gerüst (C₇-Anker) verwendet. Ein Glycerinderivat (C₃-Anker) als Linker wird insbesondere dann bevorzugt, wenn die Lipid-Modifikation über eine Etherbindung eingeführt werden kann. Soll die Lipid-Modifikation z. B. über eine Amid- oder eine Urethanbindung eingeführt werden, wird z. B. ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Gerüst (C₇-Anker) bevorzugt. In diesem Zusammenhang ist die zwischen dem Linker und der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA entstehende Bindung bevorzugt so beschaffen, dass sie mit den Bedingungen und Chemikalien der Amiditchemie kompatibel ist, das heißt, sie ist bevorzugt weder säure- noch basenlabil. Insbesondere werden solche Bindungen bevorzugt, die synthetisch leicht zugänglich sind, und nicht durch die ammoniakalische Abspaltprozedur eines Nukleinsäuresyntheseverfahrens hydrolysiert werden. Als Bindungen kommen grundsätzlich alle entsprechend geeigneten Bindungen in Frage, bevorzugt Esterbindungen, Amidbindungen, Urethan- sowie Etherbindungen. Neben der guten Zugänglichkeit der Edukte (wenige Synthesestufen) ist dabei die Etherbindung aufgrund ihrer relativ hohen biologischen Stabilität gegenüber enzymatischer Hydrolyse besonders bevorzugt.
Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform erfolgt für die Lipid-Modifizierung der erfindungsgemäßen (modifizierten) RNA die Verknüpfung (mindestens einer) erfindungsgemäßen (modifizierten) RNA direkt mit mindestens einem, wie hier beschriebenen, (bifunktionellen) Lipid, d. h. ohne Verwendung eines, wie hier beschriebenen, Linkers. In diesem Fall weist das erfindungsgemäße (bifunktionelle) Lipid bevorzugt mindestens zwei reaktive Gruppen, oder optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, oder mehr reaktive Gruppen, auf, wobei eine erste reaktive Gruppe zur direkten oder indirekten Bindung des Lipids an ein hier beschriebenes Trägermaterial und mindestens eine weitere reaktive Gruppe zur Bindung der (modifizierten) RNA dient. Gemäß der zweiten Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA daher bevor zugt mindestens ein Lipid (direkt ohne Linker) binden, z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 5–10, 10–20, 20–30 oder mehr Lipid(e), besonders bevorzugt mindestens 3–8 oder mehr Lipide pro (modifizierter) RNA. Die gebundenen Lipide können dabei getrennt voneinander an verschiedene Positionen der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA gebunden werden, aber auch als Komplex an einer oder mehr Positionen der (modifizierten) RNA vorliegen. Alternativ kann gemäß der zweiten Ausführungsform an ein, wie zuvor beschriebenes, Lipid über dessen reaktive Gruppen mindestens eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA gebunden werden, z. B. optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10–20, 20–30 oder mehr (modifizierte) RNAs. Besonders bevorzugt umfassen für diese zweite Ausführungsform verwendbare Lipide solche (bifunktionellen) Lipide, die (bevorzugt an ihren Termini oder optional intramolekular) eine Kopplung ermöglichen, wie z. B. Polyethylenglykol (PEG) sowie Derivate davon, Hexaethylenglykol (HEG) sowie Derivate davon, Alkandiole, Aminoalkan, Thioalkanole, etc.. Die Bindung zwischen einem (bifunktionellen) Lipid und einer, wie zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen und einen Antikörper kodierenden (modifizierten) RNA ist bevorzugt so beschaffen, wie für die erste bevorzugte Ausführungsform beschrieben.
Gemäß einer dritten Ausführungsform kann für die Lipid-Modifizierung der erfindungsgemäßen (modifizierten) RNA die Verknüpfung zwischen der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA und mindestens einem, wie hier beschriebenen, Lipid über beide der zuvor genannten Ausführungsformen gleichzeitig erfolgen. So kann z. B. die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA an einer Position der RNA mit mindestens einem Lipid über einen Linker verknüpft sein (analog 1. Ausführungsform) und an einer anderen Position der (modifizierten) RNA direkt mit mindestens einem Lipid ohne Verwendung eines Linkers (analog 2. Ausführungsform). Beispielsweise kann am 3'-Ende der (modifizierten) RNA mindestens ein, wie hier beschriebenes, Lipid über einen Linker mit der RNA kovalent verknüpft werden und am 5'-Ende der (modifizierten) RNA ein, wie hier beschriebenes, Lipid ohne einen Linker mit der RNA kovalent verknüpft werden. Alternativ kann am 5'-Ende einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA mindestens ein, wie hier beschriebenes, Lipid über einen Linker mit der (modifizierten) RNA kovalent verknüpft werden und am 3'-Ende der (modifizierten) RNA ein, wie hier beschriebenes, Lipid ohne einen Linker mit der (modifizierten) RNA kovalent verknüpft werden. Ebenso können kovalente Verknüpfungen nicht nur an den Termini der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA sondern auch intramolekular stattfinden, wie zuvor beschrieben, z. B. am 3'-Ende und intramolekular, am 5'-Ende und intramolekular, am 3'- und 5'-Ende und intramolekular, ausschließlich intramolekular, etc..
Die hier beschriebene erfindungsgemäße (modifizierte) RNA kann nach im Stand der Technik bekannten Herstellungsverfahren hergestellt werden, z. B. automatisch oder manuell über bekannte synthetische Nukleinsäuresynthesen (siehe bspw. Maniatis et al. (2001) supra) oder auch über molekularbiologische Verfahren, bspw. mit anschließender Aufreinigung, etwa über chromatographische Verfahren.
Die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA kann gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung Tumoren und Krebserkrankungen, Herz- und Kreislauferkrankungen, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten oder ggf. monogenetischen Erkrankungen, z. B. in der Gentherapie, verwendet werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung im Sinne der vorliegenden Erfindung enthält eine, wie hier beschriebene, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA sowie optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder weitere Hilfs- und Zusatzstoffe. Die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzte pharmazeutische Zusammensetzung umfasst typischerweise eine sichere und effektive Menge einer, wie hier beschriebenen, (modifizierten) RNA. Wie hier verwendet, bedeutet "sichere und effektive Menge" eine solche Menge der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierende, (modifizierte RNA), die ausreichend ist, um signifikant eine positive Änderung eines zu behandelnden Zustands durch Expression des kodierten Antikörpers zu induzieren, z. B. einer Tumor- oder Krebserkrankung, einer Herz- und Kreislauferkrankung oder einer Infektionskrankheit, wie im folgenden beschrieben. Gleichzeitig ist eine "sichere und effektive Menge" jedoch gering genug, um schwerwiegende Nebeneffekte bei der Therapie dieser Erkrankungen zu vermeiden, also ein vernünftiges Verhältnis von Vorteil und Risiko zu ermöglichen. Die Festlegung dieser Grenzen liegen typischerweise innerhalb des Bereichs vernünftiger medizinischer Urteilskraft. Die Konzentration der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA in derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann daher bspw., ohne darauf eingeschränkt zu werden, innerhalb eines weiten Bereichs von z. B. 0,1 ng bis 1000 mg/ml variieren. Eine solche „sichere und effektive Menge" einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA kann im Zusammenhang mit dem besonderen zu behandelnden Zustand variieren, sowie dem Alter und dem physischen Zustand des zu behandelnden Patienten, der Schwere des Zustandes, der Dauer der Behandlung, der Natur der begleitenden Therapie, des verwendeten besonderen pharmazeutisch geeigneten Trägers und ähnlichen Faktoren innerhalb des Wissens und der Erfahrung des begleitenden Arztes. Die hier beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung kann für humane wie auch für veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt werden.
Optional kann die hier beschriebene erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch geeigneter Träger" umfasst bevorzugt einen oder mehr kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, bzw. Verdünnungsmittel oder einkapselnde Verbindungen, welche für die Verabreichung an eine Person geeignet sind. Der Begriff "kompatibel", wie hier verwendet, bedeutet, dass die Bestandteile der Zusammensetzung in der Lage sind, mit der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA, dem optional enthaltenen Hilfsstoff als solchem und miteinander in einer solchen Art zusammengemischt zu werden, dass keine Interaktion auftritt, welche wesentlich die pharmazeutische Effektivität der Zusammensetzung unter gewöhnlichen Verwendungsbedingungen reduzieren würde, wie z. B. die pharmazeutische Aktivität des kodierten Antikörpers vermindern oder gar die Expression des kodierten Antikörpers unterbinden oder verschlechtern würde. Pharmazeutisch geeignete Träger müssen selbstverständlich eine ausreichend hohe Reinheit und eine ausreichend geringe Toxizität aufweisen, um sie für die Verabreichung an eine zu behandelnde Person geeignet zu machen. Einige Beispiele von Verbindungen, welche als pharmazeutisch geeignete Träger oder Bestandteile davon dienen können, sind Zucker, wie beispielsweise Lactose, Glucose und Sukrose; Stärken, wie beispielsweise Kornstärke oder Kartoffelstärke; Cellulose und ihre Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose, Celluloseacetat; pulverisiertes Tragacanth; Malz; Gelatine; Talg; feste Gleitmittel, wie beispielsweise Stearinsäure, Magnesiumstearat; Calciumsulfat; Pflanzenöle, wie beispielsweise Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Kornöl und Öl aus Theobroma; Polyole, wie beispielsweise Polypropylenglycol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; Algininsäure; Emulgatoren, wie beispielsweise Tween^®; Benetzungsmittel, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat; färbende Agenzien; geschmacksvermittelnde Agenzien, Arzneistoffträger; tablettenbildende Agenzien; Stabilisatoren; Antioxidantien; Konservierungsmittel; Pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung und phosphatgepufferte Lösungen.
Die Wahl eines wie oben beschriebenen pharmazeutisch geeigneten Trägers wird grundsätzlich durch die Art bestimmt, durch die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann bspw. systemisch verabreicht werden. Routen zur Verabreichung schließen z. B. transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen ein. Die geeignete Menge der zu verwendenden erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann durch Routineexperimente mit Tiermodellen bestimmt werden. Solche Modelle schließen, ohne jedoch darauf begrenzt zu sein, Modelle von Kaninchen, Schaf, Maus, Ratte, Hund und nicht-humane Primatenmodelle mit ein. Bevorzugte Einheitsdosisformen zur Injektion schließen sterile Lösungen von Wasser, physiologischer Salzlösung oder Mischungen davon mit ein. Der pH solcher Lösungen sollte auf etwa 7,4 eingestellt werden. Geeignete Träger zur Injektion schließen Hydrogele, Vorrichtungen zur kontrollierten oder verzögerten Freigabe, polylaktische Säure und Collagenmatrizen ein. Hier verwendbare pharmazeutisch-geeignete Träger zur topischen Anwendung schließen solche ein, die zur Verwendung in Lotionen, Cremes, Gels u. ä. geeignet sind. Falls die Verbindung peroral verabreicht werden soll, sind Tabletten, Kapseln u. ä. die bevorzugte Einheitsdosisform. Die pharmazeutisch geeigneten Träger zur Herstellung von Einheitsdosisformen, die für die orale Verabreichung verwendbar sind, sind im Stand der Technik gut bekannt. Ihre Auswahl wird von sekundären Überlegungen wie Geschmack, Kosten und Lagerfähigkeit abhängen, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht kritisch sind und ohne Schwierigkeiten durch einen Fachmann durchgeführt werden können.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner einen Injektionspuffer enthalten, der bevorzugt die Transfektion als auch die Translation der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden RNA, in Zellen oder einen Organismus verbessert. In der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann bspw. ein wässriger Injektionspuffer enthalten sein, der in Bezug auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung, falls diese in flüssiger Form vorliegt, ein Natriumsalz, bevorzugt mindestens 50 mM eines Natriumsalzes, ein Calciumsalz, bevorzugt mindestens 0,01 mM eines Calciumsalzes und ggf. ein Kaliumsalz, bevorzugt mindestens 3 mM eines Kaliumsalzes enthält. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegen die in einem solchen Injektionspuffer enthaltenen Natriumsalze, Calciumsalze und ggf. Kaliumsalze in Form von Halogeniden, z. B. Chloriden, Iodiden oder Bromiden, in Form ihrer Hydroxide, Carbonate, Hydro gencarbonate oder Sulfate vor. Beispielhaft sollen hier für das Natriumsalz NaCl, NaI, NaBr, Na₂CO₃, NaHCO₃, Na₂SO₄, für das ggf. enthaltene Kaliumsalz KCl, KI, KBr, K₂CO₃, KHCO₃, K₂SO₄, und für das Calciumsalz CaCl₂, CaI₂, CaBr₂, CaCO₃, CaSO₄, Ca(OH)₂ genannt werden. Auch können organische Anionen der vorgenannten Kationen im Injektionspuffer enthalten sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält ein solcher Injektionspuffer als Salze Natriumchlorid (NaCl), Calciumchlorid (CaCl₂) und ggf. Kaliumchlorid (KCl), wobei neben den Chloriden auch andere Anionen enthalten sein können.
Typischerweise liegen diese Salze in dem optional in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendeten Injektionspuffer in Bezug auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung (falls diese in flüssiger Form vorliegt) in einer Konzentration von mindestens 50 mM Natriumchlorid (NaCl), mindestens 3 mM Kaliumchlorid (KCl) und mindestens 0,01 mM Calciumchlorid (CaCl₂) vor. Der Injektionspuffer kann sowohl als hypertonischer als auch isotonischer oder hypotonischer Injektionspuffer vorliegen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist dabei der Injektionspuffer jeweils in Bezug auf das jeweilige Referenzmedium hypertonisch, isotonisch oder hypotonisch, d. h. der Injektionspuffer weist entweder einen im Vergleich mit dem jeweiligen Referenzmedium höheren, gleichen oder niedrigeren Salzgehalt auf, wobei bevorzugt solche Konzentrationen der zuvor genannten Salze eingesetzt werden, die nicht zu einer durch Osmose oder anderen Konzentrationseffekten bedingten Schädigung der Zellen führen. Referenzmedien sind hier beispielsweise in „in vivo"-Verfahren auftretende Flüssigkeiten wie beispielsweise Blut, Lymphflüssigkeit, cytosolische Flüssigkeiten, oder sonstige im Körper vorkommende Flüssigkeiten, oder bei in „in vitro"-Verfahren üblicherweise eingesetzte Flüssigkeiten oder Puffer. Solche Flüssigkeiten und Puffer sind einem Fachmann bekannt.
Der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung optional enthaltene Injektionspuffer kann auch weitere Komponenten enthalten, bspw. Zucker (Mono-Di-Tri- oder Polysaccharide), insbesondere Glucose oder Mannitol. In einer bevorzugten Ausführungsform werden in dem verwendeten Injektionspuffer jedoch keine Zucker vorliegen. Auch ist es bevorzugt, dass der Injektionspuffer gerade keine ungeladenen Komponenten, wie beispielsweise Zucker enthält. Typischerweise enthält der Injektionspuffer ausschließlich Metall-Kationen, insbesondere aus der Gruppe der Alkali- oder Erdalkalimetalle, und Anionen, insbesondere die vorbezeichneten Anionen. Der pH-Wert des verwendeten Injektionspuffers in Bezug auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung, falls diese in flüssiger Form vorliegt, liegt vorzugsweise zwischen 1 und 8,5, vorzugsweise zwischen 3 und 5, stärker bevorzugt zwischen 5,5 und 7,5, insbesondere zwischen 5,5 und 6,5. Ggf. kann der Injektionspuffer auch ein Puffersystem enthalten, das den Injektionspuffer auf einen gepufferten pH-Wert festlegt. Bspw. kann es sich um ein Phosphatpuffer-System, HEPES oder Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ handeln. Ganz besonders bevorzugt ist jedoch der verwendete Injektionspuffer dann, wenn er keines der vorgenannten Puffersysteme enthält oder überhaupt kein Puffersystem aufweist.
Der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung optional enthaltene Injektionspuffer kann zusätzlich zu den oder alternativ zu den beschriebenen monovalenten und divalenten Kationen divalente Kationen, insbesondere aus der Gruppe der Erdalkalimetalle, wie beispielsweise Magnesium (Mg²⁺), oder auch Eisen (Fe²⁺), und monovalente Kationen, insbesondere aus der Gruppe der Alkalimetalle, wie beispielsweise Lithium (Li⁺), enthalten. Diese monovalenten Kationen liegen bevorzugt in Form ihrer Salze vor, z. B. in Form von Halogeniden, z. B. Chloriden, Iodiden oder Bromiden, in Form ihrer Hydroxide, Carbonate, Hydrogencarbonate oder Sulfate vor. Beispielhaft sollen hier für das Lithiumsalz LiCl, LiI, LiBr, Li₂CO₃, LiHCO₃, Li₂SO₄, für das Magnesiumsalz MgCl₂, MgI₂, MgBr₂, MgCO₃, MgSO₄, und Mg(OH)₂ und für das Eisensalz FeCl₂, FeBr₂, FeI₂, FeF₂, Fe₂O₃, FeCO₃, FeSO₄, Fe(OH)₂. Umfasst sind ebenfalls sämtliche Kombinationen von di- und/oder monovalenten Kationen, wie zuvor beschrieben. So können solche Injektionspuffer in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, die nur divalente, nur monovalente oder di- und monovalente Kationen enthalten. Ebenfalls können solche Injektionspuffer verwendet werden, die lediglich eine Sorte di- oder monovalente Kationen enthalten, insbesondere bevorzugt z. B. lediglich Ca²⁺-Kationen bzw. ein Salz davon, z. B. CaCl₂. Die voranstehend für Ca²⁺ (als divalentes Kation) und Na¹⁺ (als monovalentes Kation) vorgegebenen Molaritäten (also typischerweise Konzentrationen von mindestens 50 mM Na⁺, mindestens 0,01 mM Ca²⁺ und ggf. mindestens 3 mM K⁺) im Injektionspuffer können auch dann berücksichtigt werden, wenn teilweise oder vollständig anstelle von Ca²⁺ bzw. Na¹⁺ ein anderes di- bzw. monovalentes Kation, insbesondere andere Kationen aus der Gruppe der Erdalkalimetalle bzw. Alkalimetalle, im erfindungsgemäß zur Herstellung der Injektionslösung verwendeten Injektionspuffer zum Einsatz kommen. Zwar können Ca²⁺ bzw. Na¹⁺, wie vorstehend erwähnt, vollständig durch jeweils andere di- bzw. monovalente Kationen im verwendeten Injektionspuffer ersetzt sein, bspw. auch durch eine Kombination von anderen divalenten Kationen (anstelle von Ca²⁺) und/oder eine Kombination von anderen monovalenten Kationen (anstelle von Na¹⁺) (insbesondere eine Kombination von anderen divalenten Kationen aus der Gruppe der Erdalkalimetalle bzw. von anderen monovalenten Kationen aus der Gruppe der Alkalimetalle), jedoch ist es bevorzugt, Ca²⁺ bzw. Na¹⁺ allenfalls tw. zu ersetzen, d. h. mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, noch stärker mindestens 60% und noch stärker bevorzugt mindestens 80% der jeweiligen Gesamtmolaritäten der mono- bzw. divalenten Kationen im Injektionspuffer durch Ca²⁺ bzw. Na¹⁺ zu besetzen. Ganz besonders bevorzugt aber ist es, wenn in dem in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung optional enthaltenen Injektionspuffer ausschließlich Ca²⁺ als divalentes Kation und Na¹⁺ als monovalentes Kation enthalten ist, also in Bezug auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung Ca²⁺ 100% der Gesamtmolarität von divalenten Kationen darstellt ebenso wie Na¹⁺ 100% der Gesamtmolarität an monovalenten Kationen darstellt. Die wässrige Lösung des Injektionspuffers kann in Bezug auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung bis zu 30 Mol% der in der Lösung enthaltenen Salze, vorzugsweise bis zu 25 Mol%, bevorzugt bis zu 20 Mol%, weiterhin bevorzugt bis zu 15 Mol%, stärker bevorzugt bis zu 10 Mol%, noch stärker bevorzugt bis zu 5 Mol%, ebenfalls stärker bevorzugt bis zu 2 Mol% nicht bzw. schwer lösliche Salze enthalten. Als schwer löslich im Sinne der vorliegenden Erfindung gelten solche Salze, deren Löslichkeitsprodukt < 10 ist. Als leicht löslich gelten solche Salze, deren Löslichkeitsprodukt > 10^–4 ist. Bevorzugt ist der enthält der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung optional enthaltene Injektionspuffer von 50 mM bis 800 mM, bevorzugt von 60 mM bis 500 mM, stärker bevorzugt von 70 mM bis 250 mM, insbesondere bevorzugt 60 mM bis 110 mM Natriumchlorid (NaCl), von 0,01 mM bis 100 mM, bevorzugt von 0,5 mM bis 80 mM, stärker bevorzugt von 1,5 mM bis 40 mM Calciumchlorid (CaCl₂) und ggf. von 3 mM bis 500 mM, bevorzugt von 4 mM bis 300 mM, stärker bevorzugt von 5 mM bis 200 mM Kaliumchlorid (KCl). Als weitere Anionen können neben den vorgenannten anorganischen Anionen, bspw. Halogeniden, Sulfaten oder Carbonaten, auch organische Anionen auftreten. Hierunter sind zu nennen Succinat, Lactobionat, Laktat, Malat, Maleonat etc., die auch kombiniert enthalten sein können.
Vorzugsweise enthält ein in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung optional enthaltene Injektionspuffer Laktat. Insbesondere bevorzugt weist ein solcher Injektionspuffer, sofern ein organisches Anion enthalten ist, ausschließlich Laktat als organisches Anion auf. Laktat im Sinne der Erfindung kann jedes beliebige Laktat sein, beispielsweise L-Laktat und D-Laktat. Als Laktatsalze treten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung typischerweise Natriumlaktat und/oder Calciumlaktat auf, insbesondere dann, wenn der Injektionspuffer lediglich Na⁺ als monovalentes Kation aufweist und Ca²⁺ als divalentes Kation. Ein in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung optional verwendeter und wie oben beschriebener Injektionspuffer enthält in Bezug auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung bevorzugt von 15 mM bis 500 mM, stärker bevorzugt von 15 mM bis 200 mM, und noch stärker stärksten bevorzugt von 15 mM bis 100 mM Laktat. Dabei wurde festgestellt, dass die Verwendung eines Injektionspuffers mit den vorstehend beschriebenen Komponenten, optional mit oder ohne Laktat (nachfolgend: „RL-Injektionspuffer", wenn die Komponente Laktat nicht enthalten ist, bzw. „RL-Injektionspuffer mit Laktat", wenn die Komponente Laktat enthalten ist) für RNA-Injektionslösungen (d. h. Injektionslösungen, die RNA enthalten und für die Injektion dieser RNA geeignet sind) sowohl den Transfer als auch die Translation der RNA in die/den Zellen/Gewebe eines Wirtsorganismus (Säugetier) signifikant erhöht im Vergleich zu sonstigen, im Stand der Technik herkömmlich verwendeten, Injektionspuffern.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die hier verwendete pharmazeutische Zusammensetzung auch als passive Vakzine (zur passiven Immunisierung) vorliegen. Die passive Immunisierung beruht in der vorliegenden Erfindung, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, auf der Einbringung einer wie hier beschriebenen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA in einen Organismus, insbesondere in eine Zelle, wobei der kodierte Antikörper daraufhin exprimiert, d. h. translatiert, wird. Dadurch kann eine Bindung von solchen Molekülen, z. B. Nukleinsäuren oder Antigene, erfolgen, für die der kodierte Antikörper spezifisch ist. Passive Vakzine im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine Zusammensetzung, wie zuvor für eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, wobei die Zusammensetzung solcher verwendeten passiven Vakzine insbesondere durch die Art bestimmt wird, durch die sie verabreicht werden. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen passiven Vakzine systemisch verabreicht. Routen zur Verabreichung von solchen erfindungsgemäßen passiven Vakzinen schließen typischerweise transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen mit ein. Erfindungsgemäße passive Vakzine werden daher bevorzugt in flüssiger oder fester Form formuliert.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA oder eine erfindungsgemäße pharma zeutische Zusammensetzung zur Behandlung von im folgenden genannten beispielhaften Indikationen verwendet. Ohne darauf beschränkt zu werden, können mit der beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung beispielsweise Erkrankungen oder Zustände behandelt werden, wie z. B. Krebs bzw. Tumorerkrankungen, ausgewählt aus Melanomen, malignen Melanomen, Kolon-Karzinomen, Lymphomen, Sarkomen, Blastomen, Nierenkarzinomen, Gastrointestinalen Tumoren, Gliomen, Prostatatumoren, Blasenkrebs, Rektaltumoren, Magenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Mammakarzinomen (= Brustkrebs), Gebärmutterkrebs, Gebärmuttehalskrebs, Akuter myeloider Leukämie (AML), Akuter Lymphoider Leukämie (ALL), chronischer myeloider Leukämie (CML), chronischer lymphozytischre Leukämie (CLL), Hepatomen, diversen Virus-induzierten Tumoren, wie z. B. Papillomvirus-induzierten Karzinomen (z. B. Cervixkarzinom = Gebärmutterhalskrebs), Adenokarzinomen, Herpesviren-induzierten Tumoren (z. B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertem B Zelllymphom), Hepatitis B-induzierten Tumoren (Hepatozellkarzinomen), HTLV-1- und HTLV-2-induzierten Lymphomen, Akustikusneurinom, Lungenkarzinomen (= Lungenkrebs = Bronchialkarzinom), kleinzelligen Lungenkarzinomen, Rachenkrebs, Analkarzinom, Glioblastom, Rektumkarzinom, Astrozytom, Hirntumoren, Retinoblastom, Basaliom, Hirnmetastasen, Medulloblastomen, Scheidenkrebs, Hodenkrebs, Schilddrüsenkarzinom, Hodgkin-Syndrom, Meningeomen, Schneeberger Krankheit, Hypophysentumor, Mycosis fungoides, Karzinoiden, Neurinom, Spinaliom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinor, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphomen, Urethrakrebs, CUP-Syndrom, Kopf-Hals-Tumoren, Oligodendrogliom, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Ösphaguskarzinom (= Speiseröhrenkrebs), Warzenbeteiligung, Dünndarmtumoren, Kraniopharyngeomen, Ovarial-Karzinom, Weichteiltumoren, Eierstockkrebs (= Ovarialkarzinom), Pankreaskarzinom (= Bauchspeicheldrüsenkrebs), Endometriumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Lidtumor, Prostatakrebs (= Prostatatumoren), etc., oder Infektionskrankheiten, ausgewählt aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis,
Ebenfalls kann die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA oder eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von beispielsweise viralen Infektionskrankheiten verwendet werden, ausgewählt aus, ohne darauf beschränkt zu sein, AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes- Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanischer Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-Infektion, Pfeifersches Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten, wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis (Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischem Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, Lungenentzündung, Meningitis, Bakterieller Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weichem Schanker und durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufener Infektionskrankheiten, wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas-Krankheit, Echinococcus, Fischbandwurm, Fischvergiftung (Ciguatera), Fuchsbandwurm, Fußpilz, Hundebandwurm, Kandiose, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Kutaner Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), Läuse, Malaria, Mikroskopie, Onchozerkose (Flussblindheit), Pilzerkrankungen, Rinderbandwurm, Schistosomiasis, Schlafkrankheit, Schweinebandwurm, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszeraler Leishmaniose, Windeldermatitis oder Zwergbandwurm.
Die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA oder eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch zur Behandlung von Herz- und Kreislauferkrankungen werden, ausgewählt aus, ohne darauf beschränkt zu sein, Koronare Herzkrankheit, Arteriosklerose, Apoplexie, Hypertonie, und neuronale Erkrankungen ausgewählt aus Alzheimerscher Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Dystonie, Epilepsie, Multiple Sklerose und Parkinsonscher Krankheit, etc..
Weiterhin kann die erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA oder eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten verwendet werden, ausgewählt aus, ohne darauf beschränkt zu sein, Autoimmun-Typ-I-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-II-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-III-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-IV-Erkrankungen, wie bspw. Multipler Sklerose (MS), Rheumatoider Arthritis, Dia betes, Diabetes-Typ-I (Diabetes mellitus), Systemischem Lupus Erythematosus (SLE), Chronischer Polyarthritis, Basedowscher Krankheit, Autoimmunen Formen der chronischen Hepatitis, Colitis Ulcerosa, Allergie-Typ-I-Erkrankungen, Allergie-Typ-II-Erkrankungen, Allergie-Typ-III-Erkrankungen, Allergie-Typ-IV-Erkrankungen, Fibromyalgie, Haarausfall, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Myasthenia gravis, Neurodermitis, Polymyalgia rheumatica, Progressiver Systemischer Sklerose (PSS), Psiorasis, Reiter-Syndrom, Rheumatischer Arthritis, Schuppenflechte, Vaskulitis, etc., oder Diabetes-Typ-II.
Erkrankungen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls, ohne darauf beschränkt zu sein, Viruserkrankungen verursacht durch Viren, ausgewählt aus, ohne darauf beschränkt zu sein, HIV, Orthopox-Variola-Virus, Orthopox-Alastrim-Virus, Parapox-Ovis-Virus, Molluscum-Contagiosum-Virus, Herpes-simplex-Virus 1, Herpes-simplex-Virus 2, Herpes-B-Virus, Varizella-Zoster-Virus, Pseudowut-Virus, Humanes-Zytomegalie-Virus, Humanes-Herpes-Virus 6, Humanes-Herpes-Virus 7, Epstein-Barr-Virus, Humanes-Herpes-Virus 8, Hepatitis-B-Virus, Chikungunya-Virus, O'nyong'nyong-Virus, Rubivirus, Hepatitis-C-Virus, GB-Virus-C, West-Nil-Virus, Dengue-Virus, Gelbfieber-Virus, Louping-ill-Virus, St.-Louis-Enzephalitis-Virus, Japan-B-Enzephalitis-Virus, Powassan-Virus, FSME-Virus, SARS-assoziiertes-Corona-Virus, Humanes-Corona-Virus 229E, Humanes-Corona-Virus OC43, Torovirus, Humanes-T-Zell-lymphotropes-Virus Typ I, Humanes_T-Zell-lymphotropes_Virus Typ II, Humanes-Immundefizienz-Virus Typ 1, Humanes-Immundefizienz-Virus Typ 2, Lassa-Virus, Lymphozytäre-Chorio-Meningitis-Virus, Tacaribe-Virus, Junin-Virus, Machupo-Virus, Virus der Borna'schen Krankheit, Bunyamwera-Virus, California-Encephalitis-Virus, Rift-Valley-Fieber Virus, Sandmückenfieber-Virus, Toscana-Virus, Krim-Kongohämorrhagisches-Fieber Virus, Hazara-Virus, Khasan-Virus, Hantaan-Virus, Seoul-Virus, Prospect-Hill-Virus, Puumala-Virus, Dobrava-Belgrad-Virus, Tula-Virus, Sin-Nombre-Virus, Lake-Victoria-Marburgvirus, Zaire-Ebolavirus, Sudan-Ebolavirus, Côte d'lvoire-Ebolavirus, Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenza viren C, Parainfluenzavirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Respiratory-Syncytical- Virus, Humanes Metapneumovirus, Vesicular-Stomatitis-Indiana-Virus, Rabiesvirus, Mokola-Virus, Duvenhage-Virus, Europäisches-Fledermaus-Lyssa-Virus 1 + 2, Australisches-Fledermaus-Lyssa-Virus, Adenviren A–F, Humane Papillomviren, Kondyloma-Virus 6, Kondyloma-Virus 11, Polyoma viren, Adenassoziiertes-Virus 2, Rotaviren, oder Orbiviren, etc..
Erkrankungen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls monogenetische Erkrankungen, d. h. (Erb-)Erkrankungen, die durch einen Einzelgendefekt bedingt sind und nach den Mendel'schen Regeln vererbt werden. Monegenetische Erkrankungen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus autosomal-rezessiven Erbkrankheiten, wie bspw. Adenosin-Deaminase-Mangel, Familiäre Hypercholesterinanämie, Canavan-Syndrom, Morbus Gaucher, Fanconi-Anämie, neuronale Ceroid-Lipofuszinosen, Mukoviscidose (Zystische Fibrose), Sichelzellanämie, Phenylketonurie, Alkaptonurie, Albinismus, Hypothyreose, Galactosämie, Alpha-1-Anti-Trypsin-Mangel, Xeroderma pigmentosum, Ribbing-Syndrom, Mukopolysaccharidosen, Lippen-, Kiefer-, Gaumenspalte, Laurence-Moon-Biedl-Bardet-Syndrom, Kurzripp-Polydaktylie-Syndrom, Kretinismus, Joubert-Syndrom, Progerie Typ II, Brachydaktylie, Adrenogenitalem Syndrom, und X-chromosomalen Erbkrankheiten, wie bspw. Farbenblindheit, z. B. Rot-Grün-Blindheit, Fragilem X-Syndrom, Muskeldystrophie (Duchenne- und Becker-Kiener-Typ), Hämophilie A und B, G6PD-Mangel, Morbus Fabry, Mukopolysaccharidose, Norrie-Syndrom, Retinitis pigmentosa, Septischer Granulomatose, X-SCID, Ornitihin-Transcarbamylase-Mangel, Lesch-Nyhan-Syndrom, oder aus autosomal-dominanten Erbkrankheiten, wie bspw. heriditäres Angioödem, Marfan-Syndrom, Neurofibromatose, Progerie Typ I, Osteogenesis imperfecta, Klippel-Trenaurnay-Syndrom, Sturge-Weber-Syndrom, Hippel-Lindau-Syndrom und Tuberöse Sklerose. Erfindungsgemäße RNA, kodierend einen wie hier beschriebenen Antikörper, können bei monegenetischen Erkrankungen im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei der kodierte Antikörper bspw. durch die Regulierung von unerwünschten Stoffwechselprodukten, Abfangen spezifischer Genprodukte, etc., regulierend und auch therapierend eingreifen kann.
Zur Behandlung der oben genannten Indikationen kann eine erfindungsgemäße (modifizierte) RNA, kodierend einen Antikörper, auf unterschiedliche Weise eingesetzt werden. So können Krebserkrankungen bspw. zusätzlich oder alternativ zu bekannten Therapien immuntherapeutisch behandelt werden. Dazu kann bspw. eine erfindungsgemäße RNA, kodierend für einen bispezifischen Antikörper, eingesetzt werden, wobei der Antikörper der einerseits ein Oberflächen-Antigen, wie z. B. CD3, auf T-Zellen und andererseits ein Tumorantigen, wie z. B. Her2/neu, CD20, EGFR oder CA-125, erkennt. Dadurch werden bzgl. bestimmter Oberflächen-Antigene positive T-Zellen und Tumorzellen, die das Tumorantigen exprimieren, in räumliche Nähe gebracht, was die Erkennung der Tumorzellen durch das Immunsystem verbessert und damit die Zerstörung der Tumorzellen erhöht wird.
Weiterhin kann z. B. bei Herzinfarkten bspw. eine erfindungsgemäße RNA, kodierend für einen bispezifischen Antikörper, eingesetzt werden, der einerseits ein Antigen der Stammzelle, wie z. B. CD45, erkennt und andererseits ein Antigen des Zielgewebes, wie z. B. Myosin light chain, um die Anreicherung der Stammzellen im Herzmuskel zu erhöhen (siehe auch Reusch et al. Anti-CD3 x anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) bispecific antibody redirects T-cell cytolytic activity to EGFR-positive cancers in vitro and in an animal model. Clin Cancer Res. 2006).
Ferner können durch Verwendung erfindungsgemäßer RNA, kodierend bispezifische Antikörper, durch die kodierten Antikörper z. B. 2 verschiedene Zell-Typen in Kontakt bzw. in räumliche Nähe gebracht werden. Dies ist bspw. vorteilhaft, um eine Zelle in einem Gewebe anzureichern oder zwei Proteine, z. B. Antigene, in Kontakt bzw. in räumliche Nähe zueinander zu bringen z. B. Ligand und Rezeptor oder Proteine, die dimerisieren/oligomerisieren müssen, um aktiviert zu werden.
Zur Anwendung bei den oben genannten Erkrankungen, insbesondere Infektionserkrankungen, Autoimmunkrankheiten und neuronalen Erkrankungen und auch bei monogenetischen Erkrankungen, können auch wie hier beschriebene erfindungsgemäße RNAs, kodierend für Intrabodies, eingesetzt werden. So können Intrabodies verwendet werden, um als bispezifische intrazellulär exprimierte Antikörper cytoplasmatische Proteine zu hemmen, wie oben beschrieben. Bspw. können erfindungsgemäße RNAs, kodierend für Intrabodies, eingesetzt werden, um durch die kodierten Antikörper IL-2R (Rezeptor von IL-2) oder ErbB2 (Her2/neu) zu hemmen. Auch für die Anwendung bei Viruserkrankungen wie z. B. HIV-1 sind erfindungsgemäße RNAs, kodierend für Intrabodies, geeignet. Des weiteren konnte z. B. gezeigt werden, dass die Infektion von Mäusen mit Scrapie, einer Prionerkrankung, durch die Expression eines scFv-Fragments gegen das Prionprotein verhindert werden kann (Vertrugno et al., KDEL-tagged anti-prion intrabodies impair PrP lysosomal degradation and inhibit scrapie infectivity., Biochem Biophys Res Commun. 2005; Marasco WA, Intrabodies: turning the humoral immune system outside in for intracellular immunization, Gene Therapy (1997) 4: 11–15). Ferner können erfindungsgemäße RNAs, kodierend für Intrabodies, eingesetzt werden, um durch die kodierten Antikörper wie hier beschriebene intrazellulär exprimierte Faktoren, wie z. B. Antigene, Nukleinsäuren, etc. zu binden und bevorzugt zu neutralisieren (siehe oben).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft in diesem Zusammenhang daher auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA oder einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung, z. B. einer erfindungsgemäßen passiven Vakzine, zur Behandlung von hier beschriebenen Indikationen bzw. Erkrankungen. Damit umfasst ist insbesondere auch die Verwendung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA zur passiven Immunisierung bzw. die Verwendung der beschriebenen erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung als passive Vakzine. Ebenfalls umfasst ist die Verwendung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer passiven Vakzine, wie hier beschrieben, zur Behandlung der hier beschriebenen Indikationen. Umfasst ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA zur Herstellung einer passiven Vakzine, wie hier beschrieben, zur passiven Immunisierung gegen die oben genannten Indikationen.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung umfasst in diesem Zusammenhang daher ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA, des dadurch kodierten Antikörpers, der hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung oder der erfindungsgemäßen passiven Vakzine für die therapeutische Anwendung zur Hemmung/Neutralisierung einer Proteinfunktion bei einer der hier beschriebenen Indikationen: Dabei wird bevorzugt eine Proteinfunktion unterbunden (neutralisierender Antikörper). Grundsätzlich weist dabei jeder der durch die erfindungsgemäße RNA kodierte und hier beschriebene Antikörper durch Bindung seines spezifischen Substrats gleichzeitig auch eine neutralisierende Wirkung auf. Beispiele umfassen z. B. Anti-CD4-Antikörper zur Verhinderung der Abstoßung bei Transplantationen, Avastin (s. o.), Herceptin (s. o.), etc..
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst in diesem Zusammenhang daher auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA, des dadurch kodierten Antikörpers oder der hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung für die therapeutische Anwendung zur passiven Immunisierung durch Auslösung einer immunologischen Effektorfunktion im Sinne eines monoklonalen Antikörpers. Dabei wird durch die Expression und Sekretion des Antikörpers oder Antikörperfragmentes z. B. eine Therapierung von Tumorzellen oder pathogenen Erreger wie Viren oder Bakterien bei wie hier beschriebenen Indikationen ermöglicht.
Ferner kann in diesem Zusammenhang eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA oder die hier beschriebene erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung oder die erfindungsgemäße passive Vakzine bei den zuvor beschriebenen Indikationen auch als Immunsuppressivum verwendet werden. Bspw. konnte gezeigt werden, dass Antikörper gegen den CD40-Liganden (CD154) oder gegen CD3 die Abstoßung von Transplantaten verhindern bzw. vermindern konnten. Bevorzugt werden daher zur Verwendung als Immunsuppressiva solche erfindungsgemäßen (modifizierten) RNAs, kodierend einen Antikörper, eingesetzt, deren kodierte Antikörper an Oberflächen-Antigene bzw. allgemein an Oberflächenfaktoren von Zellen binden können, wie z. B. MHC Klasse-I Moleküle, MHC Klasse-II Moleküle, T-Zell-Rezeptoren, LMP2-Moleküle, LMP7-Moleküle, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11, CD28, CD30, CD31, CD40, CD50, CD54, CD56, CD58, CD80, CD86, CD95, CD153, CD154, CD178, CD3 = TCR (T-Zell-Rezeptor), etc..
Ein anderer Gegenstand der Erfindung umfasst in diesem Zusammenhang auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA oder der hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung für die therapeutische Anwendung zur Expansion von (bestimmten) Zellen in vitro oder in vivo. Z. B. können durch Expression des Superantagonisten-CD28-Antikörpers CD4- und CD25-positive Zellen und regulatorische T-Zellen zur Expansion angeregt werden. Regulatorische T-Zellen spielen vor allem bei Autoimmunerkrankungen eine Rolle, die durch die Expression des Superantagonisten-CD28-Antikörpers vermehrt werden können (Beyersdorf N, Hanke T, Kerkau T, Hunig T. Superagonistic anti-CD28 antibodies: potent activators of regulatory T cells for the therapy of autoimmune diseases. Ann Rheum Dis. 2005 Nov; 64).
Ebenfalls kann eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende, (modifizierte) RNA oder die hier beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung, zur Verhinderung von Entzündungsreaktionen durch Antikörper gegen TNFα bei rheumatoider Arthritis verwendet werden.
Zur Verminderung von Entzündungen durch Hemmung von Leukozyten, z. B. bei den oben genannten Indikationen, kann ferner auch eine erfindungsgemäße, einen Anti-CD18-Antikörper ko dierende, (modifizierte) RNA oder die hier beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung oder die erfindungsgemäße passive Vakzine, verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention der vorstehend genannten Krankheiten bzw. zur (präventativen) passiven Immunisierung gegen die vorstehend genannten Erkrankungen bereitgestellt, welches das Verabreichen der beschriebenen erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung, der erfindungsgemäßen passiven Vakzine bzw. der erfindungsgemäßen RNA an einen Patienten, insbesondere einen Menschen, umfasst. Solche Verfahren betreffen auch die Behandlung von Indikationen, die mit den zuvor beschriebenen intra- und extrazellulären Vorgängen, mit Neutralisierungsfunktionen von Antikörpern, der o. g. Hemmung bestimmter (Zell-)Funktionen durch Antikörper, etc. zusammenhängen.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein in vitro-Transkriptionsverfahren zur Herstellung einer, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA, umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, insbesondere einer cDNA, kodierend für einen wie zuvor beschriebenen Antikörper;
b) Zugabe der Nukleinsäure, insbesondere einer RNA, kodierend für einen Antikörper, zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, enthaltend ein oder mehrere wie zuvor beschriebene, ggf. modifizierte Nukleotide, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor;
c) Inkubation der Nukleinsäure, insbesondere einer cDNA, kodierend für einen Antikörper, im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure zu einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, ggf. modifizierten, RNA;
d) gegebenenfalls Aufreinigung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium.

Eine wie in Schritt a) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens beschriebene Nukleinsäure kann jede wie hier beschriebene Nukleinsäure sein (bspw. einzel- oder doppelsträngige DNA, cDNA, etc.), die einen wie hier beschriebenen Antikörper kodiert. Typischerweise werden dazu DNA-Sequenzen eingesetzt, z. B. genomische DNA oder Fragmente davon, oder Plasmide, kodierend einen wie hier beschriebenen Antikörper, bevorzugt in linearisierter Form. Die in vitro-Transkription kann üblicherweise durch Verwendung eines Vektors erfolgen, der eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle aufweist. Dazu können jegliche im Stand der Technik bekannte (Expressions-)Vektoren verwendet werden, z. B. kommerziell erhältliche (Expressions-)Vektoren (s. o.). Bevorzugt sind bspw. solche (Expressions-)Vektoren, die stromaufwärts und/oder stromabwärts der Klonierungsstelle eine SP6 bzw. eine T7- oder T3-Bindungsstelle aufweisen. So können die verwendeten Nukleinsäuresequenzen später nach Belieben in Abhängigkeit der gewählten RNA-Polymerase transkribiert werden. Eine zur in vitro-Transkription verwendete und für einen wie hier beschriebenen Antikörper kodierende, Nukleinsäuresequenz wird typischerweise in den (Expressions-)Vektor einkloniert, z. B. über eine „multiple cloning site" des verwendeten Vektors. Vor der Transkription wird typischerweise der (Expressions-)Vektor mit Restriktionsenzymen an der Stelle, an der sich das zukünftige 3'-Ende der RNA befinden soll, mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und das Fragment aufgereinigt. Dadurch wird ausgeschlossen, dass die transkribierte RNA Vektorsequenzen enthält, und es wird ein RNA-Transkript mit definierter Länge erhalten. Bevorzugt werden dabei keine Restriktionsenzyme verwendet, die überhängende 3'-Enden erzeugen (wie z. B. Aat II, Apa I, Ban II, Bgl I, Bsp 1286, BstX I, Cfo I, Hae II, HgiA I, Hha I, Kpn I, Pst I, Pvu I, Sac I, Sac II, Sfi I, Sph I, etc.). Sollten dennoch solche Restriktionsenzyme verwendet werden, wird bevorzugt das überhängende 3'-Ende aufgefüllt, z. B. mit Klenow- oder T4-DNA-Polymerase.
Alternativ dazu kann für Schritt a) die Nukleinsäure als Transkriptionstemplate auch per Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden. Dazu enthält typischerweise einer der verwendeten Primer die Sequenz einer RNA-Polymerase-Bindungsstelle. Weiterhin bevorzugt enthält das 5'-Ende des verwendeten Primers eine Verlängerung von etwa 10–50 weiteren Nukleotiden, stärker bevorzugt von 15 bis 30 weiteren Nukleotiden und am stärksten bevorzugt von etwa 20 Nukleotiden.
Vor der in vitro-Transkription wird die Nukleinsäure, bspw. die Nukleinsäure, z. B. das DNA- oder cDNA-Template, typischerweise aufgereinigt und von RNase befreit, um eine hohe Ausbeute zu gewährleisten. Eine Aufreinigung kann dabei mit Hilfe jedes im Stand der Technik bekannten Verfahrens durchgeführt werden, bspw. mit einem Cäsiumchloridgradienten, Ionenaustauschverfahren, oder durch Aufreinigung über Agarosegelelektrophorese.
Gemäß Verfahrenschritt b) wird die (als Transkriptionstemplate verwendete) Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium gegeben. Ein geeignetes in vitro-Transkriptionsmedium enthält zunächst eine wie unter Schritt a) bereitgestellte Nukleinsäure, bspw. etwa 0,1–10 μg, bevorzugt etwa 1–5 μg, stärker bevorzugt 2,5 μg und am stärksten bevorzugt etwa 1 μg einer solchen Nukleinsäure. Ein geeignetes in vitro-Transkriptionsmedium enthält weiterhin gegebenenfalls ein Reduktionsmittel, z. B. DTT, stärker bevorzugt etwa 1–20 μl 50 mM DTT, noch stärker bevorzugt etwa 5 μl 50 mM DTT. Das in vitro-Transkriptionsmedium enthält weiterhin Nukleotide, z. B. einen Nukleotid-Mix, im Falle der vorliegenden Erfindung bestehend aus einer Mischung von wie hier definierten (modifizierten) Nukleotiden (typischerweise etwa 0,1–10 mM je Nukleotid, bevorzugt 0,1 bis 1 mM je Nukleotid (bevorzugt etwa 4 mM gesamt) und gegebenenfalls nicht-modifizierten Nukleotiden. Werden wie hier definierte modifizierte Nukleotide (etwa 1 mM je Nukleotid, bevorzugt etwa 4 mM gesamt), z. B. Pseudouridin-5'-triphosphat, 5-Methylcytidin-5'-triphosphat, etc. eingesetzt, werden sie typischerweise in einer Menge zugegeben, dass das modifizierte oder basenmodifizierte Nukleotid komplett durch das natürliche Nukleotid ersetzt wird. Es können jedoch auch Mischungen eines oder mehrerer modifizierter oder basenmodifizierter Nukleotide und eines oder mehrerer natürlich auftretender Nukleotide anstelle eines bestimmten Nukleotids eingesetzt werden, d. h. es können also ein oder mehrere wie zuvor beschriebene modifizierte Nukleotide im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U und gegebenenfalls zusätzlich ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen. Umgekehrt können auch nur natürliche Nukleotide verwendet werden. Durch selektive Zugabe des gewünschten Nukleotids zu dem in vitro-Transkriptionsmedium kann daher der Gehalt, d. h. das Auftreten und die Menge, der gewünschten Modifikation von Nukleotiden in der transkribierten, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA-Sequenz gesteuert werden. Ein geeignetes in vitro-Transkriptionsmedium enthält ebenfalls eine RNA Polymerase, z. B. z. B. T7-RNA-Polymerase (bspw. T7-Opti mRNA Kit, CureVac, Tübingen, Deutschland), T3-RNA-Polymerase oder SP6, typischerweise etwa 10 bis 500 U, bevorzugt etwa 25 bis 250 U, stärker bevorzugt etwa 50 bis 150 U, und am stärksten bevorzugt etwa 100 U RNA-Polymerase. Das in vitro-Transkriptionsmedium wird weiterhin bevorzugt frei von RNase gehalten, um einen Abbau der transkribierten RNA zu vermeiden. Ein geeignetes in vitro-Transkriptionsmedium enthält daher gegebenenfalls zusätzlich einen RNase-Inhibitor.
Die Nukleinsäure wird in einem Schritt c) im in vitro-Transkriptionsmedium inkubiert und zu einer, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA transkribiert. Die Inkubationszeiten betragen typischerweise etwa 30 bis 240 Minuten, bevorzugt etwa 40 bis 120 Minuten und am stärksten bevorzugt etwa 90 Minuten. Die Inkubationstemperaturen liegen typischerweise bei etwa 30–45°C, bevorzugt bei 37–42°C. Die Inkubationstemperatur richtet sich nach der verwendeten RNA-Polymerase, z. B. bei T7-RNA-Polymerase etwa 37°C. Die durch die Transkription erhaltene RNA ist bevorzugt eine mRNA. Die bei der in vitro-Transkription erhaltenen Ausbeuten liegen für die in Schritt b) angegebenen eingesetzten Ausgangsmengen typischerweise in einem Bereich von etwa 30 μg RNA pro μg verwendeter Template-DNA. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können die erhaltenen Ausbeuten der in vitro-Transkription durch lineares Upscaling gesteigert werden. Dazu werden bevorzugt die in Schritt b) angegebenen eingesetzten Ausgangsmengen entsprechend der benötigten Ausbeuten gesteigert, z. B. um einen Multiplikationsfaktor von 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, etc..
Nach der Inkubation kann gegebenenfalls in Schritt d) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens eine Aufreinigung der transkribierten, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten RNA) stattfinden. Dazu kann jedes im Stand der Technik bekannte geeignete Verfahren verwendet werden, z. B. chromatographische Aufreinigungsverfahren, z. B. Affinitätschromatographie, Gelfitration, etc.. Durch die Aufreinigung können nicht-eingebaute, d. h. überschüssige Nukleotide bzw. Template-DNA aus dem in vitro-Transkriptionsmedium entfernt und eine saubere (modifizierte) RNA erhalten werden. Bspw. kann nach der Transkription das Reaktionsgemisch typischerweise mit der transkribierten RNA DNAse-verdaut werden, um im Reaktionsgemisch noch enthaltenes DNA-Template zu entfernen. Anschließend oder alternativ kann die transkribierte RNA mit LiCl gefällt werden. Eine Aufreinigung der transkribierten RNA kann danach über IP RP-HPLC stattfinden. Dies ermöglicht es insbesondere, längere und kürzere Fragmente effektiv voneinander zu trennen.
Bevorzugt findet dabei die Aufreinigung über ein Verfahren zur Reinigung von RNA in präparativem Maßstab statt, das sich dadurch auszeichnet, dass die RNA mittels HPLC unter Verwendung einer porösen Umkehrphase als stationäre Phase gereinigt wird (PURE Messenger). Beispielsweise kann für die Aufreinigung in Schritt d) des erfindungsgemäßen in-vitro-Verfahrens eine Umkehrphase als stationäre Phase für die HPLC-Reinigung eingesetzt werden. Für die Chromatographie mit Umkehrphasen dient typischerweise als stationäre Phasen eine unpolare Verbindung und zur Elution als mobile Phase ein polares Lösungsmittel, wie Gemische von Wasser, das meistens in Form von Puffern eingesetzt wird, mit Acetonitril und/oder Methanol. Bevorzugt weist die poröse Umkehrphase eine Partikelgröße von 8,0 ± 2 μm, bevorzugt ± 1 μm, stärker bevorzugt +/– 0,5 μm auf. Das Umkehrphasenmaterial kann in Form von Kügelchen vorliegen. Mit einer porösen Umkehrphase mit dieser Partikelgröße, ggf. in Form von Kügelchen, kann die Aufreinigung in besonders günstiger Weise durchgeführt werden, wobei besonders gute Trennergebnisse erhalten werden. Die eingesetzte Umkehrphase ist bevorzugt deshalb porös, da mit stationären Umkehrphasen, die nicht porös sind, wie sie z. B. bei Azarani A. und Hecker K. H. beschrieben sind, zu hohe Drücke aufgebaut werden, so dass eine präparative Reinigung der RNA, falls überhaupt nur sehr schwer möglich ist. Bevorzugt weist die Umkehrphase eine Porengröße von 200 Å bis 5 000 Å, insbesondere eine Porengröße von 300 Å bis 4 000 Å, auf. Besonders bevorzugte Porengrößen für die Umkehrphasen sind 200–400 Å, 800–1200 Å und 3500–4500 Å. Mit einer Umkehrphase mit diesen Porengrößen werden hinsichtlich der Reinigung der RNA in Verfahrensschritt d) besonders gute Ergebnisse erzielt. Das Material für die Umkehrphase ist bevorzugt ein Polystyroldivinylbenzol, wobei insbesondere nicht alkylierte Polystyroldivinylbenzole eingesetzt werden können. Stationäre Phasen mit Polystyroldivinylbenzol sind an sich bekannt. Für die Aufreinigung in Verfahrensschritt d) können die an sich bekannten und bereits für HPLC-Verfahren eingesetzten Polystyroldivinylbenzole verwendet werden, die kommerziell erhältlich sind. Ganz besonders bevorzugt wird zur Aufreinigung in Verfahrensschritt d) ein nicht alkyliertes poröses Polystyroldivinylbenzol verwendet, das insbesondere eine Partikelgröße von 8,0 ± 0,5 μm sowie eine Porengröße von 250–300 Å, 900–1100 Å oder 3500–4500 Å aufweist. Mit diesem Material für die Umkehrphasen können die vorstehend geschilderten Vorteile in besonders günstiger Weise erreicht werden. Die HPLC-Aufreinigung kann mit der Ionenpaarmethode durchgeführt werden, wobei der mobilen Phase ein Ion mit positiver Ladung als Gegenion zur negativ geladenen RNA zugegeben wird. Auf diese Weise entsteht ein Ionenpaar mit lipohilem Charakter, das durch die unpolare stationäre Phase des Umkehrphasen-Systems verlangsamt wird. In der Praxis müssen die genauen Bedingungen für die Ionenpaarmethode für jedes konkrete Trennproblem empirisch erarbeitet werden. Die Größe des Gegenions, seine Konzentration und der pH-Wert der Lösung tragen stark zum Ergebnis der Trennung bei. In günstiger Weise werden der mobilen Phase Alkylammonium-Salze, wie Triethylammoniumacetat, und/oder Tetraalkylammonium-Verbindungen, wie Tetrabutylammonium, zugegeben. Vorzugsweise wird 0,1 M Triethylammoniumacetat zugesetzt und der pH-Wert auf etwa 7 eingestellt. Die Wahl der mobilen Phase hängt von der Art der gewünschten Trennung ab. Dies bedeutet, dass die für eine spezielle Trennung gefundene mobile Phase, wie sie beispielsweise aus dem Stand der Technik bekannt sein kann, nicht auf ein anderes Trennproblem ohne weiteres mit hinreichender Aussicht auf Erfolg übertragen werden kann. Für jedes Trennproblem müssen mit empirischen Versuchen die idealen Elutionsbedingungen, insbesondere die verwendete mobile Phase, bestimmt werden. Als mobile Phase zur Elution der RNA kann für das HPLC-Verfahren ein Gemisch aus einem wässrigen Lösungsmittel und einem organischen Lösungsmittel eingesetzt werden. Dabei ist es günstig, wenn als wässriges Lösungsmittel ein Puffer benutzt wird, der insbesondere einen pH von etwa 7, bspw. 6,5–7,5, aufweist, z. B. 7,0; vorzugsweise wird der Puffer Triethylammoniumacetat, besonders bevorzugt ein 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer verendet, der, wie vorstehend beschrieben, auch als Gegenion zur RNA in der Ionenpaarmethode wirkt. Das organische Lösungsmittel, das in der mobilen Phase eingesetzt wird, kann Acetonitril, Methanol oder ein Gemisch von diesen beiden sein, ganz besonders bevorzugt Acetonitril. Mit diesen organischen Lösungsmitteln, insbesondere Acetonitril, erfolgt die Aufreinigung der RNA in Verfahrensschritt d) mit einem wie beschriebenen HPLC-Verfahren in besonders günstiger Weise. Besonders bevorzugt ist die mobile Phase ein Gemisch von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7, und Acetonitril. Als ebenfalls besonders günstig hat es sich herausgestellt, wenn die mobile Phase 5,0 Vol.-% bis 20,0 Vol.-% organisches Lösungmittel, bezogen auf die mobile Phase, enthält und der Rest auf 100 Vol.-% das wässrige Lösungsmittel ist. Ganz besonders günstige für das erfindungsgemäße Verfahren ist es, wenn die mobile Phase 9,5 Vol.-% bis 14,5 Vol.-% organisches Lösungmittel, bezogen auf die mobile Phase, enthält und der Rest auf 100 Vol.-% das wässrige Lösungsmittel ist. Die Elution der RNA kann anschließend isokratisch oder mittels einer Gradiententrennung erfolgen. Bei einer isokratischen Trennung erfolgt die Elution der RNA mit einem einzigen Elutionsmittel oder einem gleich bleibenden Gemisch mehrerer Elutionsmittel, wobei als Elutionsmittel die vorstehend detailliert beschriebenen Lösungsmittel eingesetzt werden können.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahren zur Expression eines Antikörpers, umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, insbesondere einer cDNA, kodierend einen wie zuvor beschriebenen Antikörper;
b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere wie zuvor beschriebene (modifizierte) Nukleotide, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor;
c) Inkubation der Nukleinsäure, insbesondere einer cDNA, im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure zu einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA;
d) gegebenenfalls Aufreinigung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium;
e) Zugabe der in Schritt c) (und ggf. in Schritt d) erhaltenen (modifizierten) RNA zu einem in vitro-Translationsmedium;
f) Inkubation der (modifizierten) RNA im in vitro-Translationsmedium und in vitro Translation des durch die (modifizierte) RNA kodierten Antikörpers;
g) ggf. Aufreinigung des in Schritt f) translatierten Antikörpers.

Die Schritte a), b) c) und d) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahren zur Expression eines Antikörpers sind identisch zu den Schritten a), b) c) und d) des hier beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens.
In Schritt e) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers wird die in Schritt c) (und ggf. in Schritt d) transkribierte (modifizierte) RNA zu einem geeigneten in vitro-Translationsmedium zugegeben. Ein geeignetes in vitro-Translationsmedium umfasst bspw. Reticulozyten-Lysat, Weizenkeim-Extrakt, etc.. Ein solches Medium umfasst üblicherweise weiterhin einen Aminosäure-Mix. Der Aminosäure-Mix umfasst typischerweise (alle) natürlich vorkommenden Aminosäuren und gegebenenfalls modifizierte Aminosäuren, z. B. ^3SS-Methionin (bspw. zur Kontrolle der Translationseffizienz über Autoradiographie). Ein geeignetes in vitro-Translationsmedium umfasst weiterhin einen Reaktionspuffer. In vitro-Translationsmedien sind bspw. in Krieg und Melton (1987) (P. A. Krieg and D. A. Melton (1987) In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase Methods Enzymol 155: 397–415) beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlossen ist, beschrieben.
In einem Schritt f) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers wird die (modifizierte) Nukleinsäure in dem in vitro-Translationsmedium inkubiert und der durch die (modifizierte) Nukleinsäure kodierte Antikörper in vitro translatiert. Die Inkubation dauert typischerweise etwa 30 bis 240 Minuten, bevorzugt etwa 40 bis 120 Minuten und am stärksten bevorzugt etwa 90 Minuten. Die Inkubationstemperatur liegt typischerweise in einem Bereich von etwa 20–40°C, bevorzugt bei etwa 25 bis etwa 35°C und am stärksten bevorzugt bei etwa 30°C.
Die Schritte b) bis f) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers oder einzelne Schritte der Schritte b) bis f) können miteinander kombiniert werden, d. h. gemeinsam durchgeführt werden. Dabei werden bevorzugt alle notwendigen Komponenten zu Beginn gemeinsam oder während der Reaktion nacheinander entsprechend der Abfolge der beschriebenen Schritte b) bis f) dem Reaktionsmedium zugegeben.
In einem optionalen Schritt g) kann der in Schritt f) erhaltene translatierte Antikörper aufgereinigt werden. Eine Aufreinigung kann mit Verfahren erfolgen, die einem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind, z. B. Chromatographie, wie bspw. Affinitätschromatographie (HPLC, FPLC, etc.), Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie, Größenausschlusschromatographie, Gaschromatographie, oder Antikörper-Detektion, oder biophysikalische Verfahren, wie z. B. NMR-Analysen, etc. (siehe z. B. Maniatis et al. (2001) supra). Chromatographische Verfahren, einschließlich affinitätschromatographische Verfahren, können in geeigneter Weise zur Aufreinigung Tags einsetzen, wie zuvor beschrieben, z. B. ein Hexahistidin-Tag (His-Tag, Polyhistidin-Tag), ein Streptavidin-Tag (Strep-Tag), ein SBP-Tag (Streptavidin-Bindungs-Tag), ein GST(Glutathion-S- Transferase)-Tag, etc.). Weiterhin kann die Aufreinigung über ein Antikörper-Epitop erfolgen (Antikörper-Bindungs-Tag), z. B. ein Myc-Tag, ein Swa11-Epitop, ein FLAG-Tag, ein HA-Tag, etc., d. h. über Erkennung des Epitops über einen entsprechenden (immobilisierten) Antikörper. Ebenfalls kann die Aufreinigung über das immobilisierte Substrat des spezifischen Antikörpers erfolgen, d. h. durch Bindung des Antikörpers an ein immobilisiertes Antigen, das durch den translatierten Antikörper spezifisch erkannt wird bzw. gebunden wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers in einer Wirtszelle, umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, insbesondere einer cDNA, kodierend einen wie zuvor beschriebenen Antikörper;
b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, ein oder mehrere wie zuvor beschriebene (modifizierte) Nukleotide im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen;
c) Inkubation der Nukleinsäure, insbesondere einer cDNA, im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure zu einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA;
d) gegebenenfalls Aufreinigung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium;
e') Transfektion der in Schritt c) (und ggf. d)) erhaltenen (modifizierten) RNA in eine Wirtsszelle;
f') Inkubation der (modifizierten) Nukleinsäure in der Wirtszelle und Translation des durch die (modifizierte) RNA kodierten Antikörpers in der Wirtszelle;
g') Optional Isolation und/oder Aufreinigung des in Schritt f') translatierten Antikörpers.

Die Schritte a), b) c) und d) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers in einer Wirtszelle sind identisch zu den Schritten a), b) c) und d) des hier beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens und des hier beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers.
Gemäß Schritt e') des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens erfolgt die Transfektion der in Schritt c) (und ggf. d)) erhaltenen (modifizierten) RNA in eine Wirtszelle. Die Transfektion erfolgt im Allgemeinen über im Stand der Technik bekannte Transfektionsverfahren (siehe bspw. Maniatis et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY). Geeignete Transfektionsverfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, z. B. Elektroporations-Verfahren einschließlich modifizierter Elektroporations-Verfahren (z. B. Nukleofektion), Calciumphosphat-Verfahren, z. B. das Calcium-Copräzipitations-Verfahren, das DEAE-Dextran-Verfahren, das Lipofektions-Verfahren, z. B. das Transferrin-vermittelte Lipofektions-Verfahren, Polypren-Transfektion, Partikelbeschuss, Nanoplexe, z. B. PLGA, Polyplexe, z. B. PEI, Protoplasten-Fusion und das Mikroinjektions-Verfahren, wobei sich insbesondere das Lipofektion-Verfahren als geeignetes Verfahren herausgestellt hat. Dabei kann die erfindungsgemäße (modifizierte) RNA nackt oder komplexiert vorliegen wie zuvor für die erfindungsgemäße (modifizierte) RNA beschrieben.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung und mit Schritt e') des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers in einer Wirtszelle umfasst eine (geeignete) Wirtszelle jede Zelle, die eine Expression des durch die erfindungsgemäße (modifizierte) RNA kodierten Antikörpers erlaubt, bevorzugt jede kultivierte eukaryotische Zelle (z. B. Hefezellen, Pflanzenzellen, tierische Zellen und humane Zellen) oder prokaryotische Zelle (z. B. bakterielle Zellen, etc.). Bevorzugt werden zur Expression des durch die erfindungsgemäße (modifizierte) RNA kodierten Antikörpers Zellen von multizellulären Organismen ausgewählt, falls posttranslationale Modifikationen, z. B. Glykosylierung des kodierten Proteins, erforderlich sind (N und/oder O-gekoppelt). Im Unterschied zu prokaryotischen Zellen, ermöglichen solche (höheren) eukaryotischen Zellen die posttranslationale Modifikation des synthetisierten Proteins. Der Fachmann kennt eine Vielzahl von solchen höheren eukaryotischen Zellen oder Zelllinien, z. B. 293T (embryonische Nierenzelllinie), HeLa (humane Cervixcarcinomzellen), CHO (Zellen aus den Ovarien chinesischer Hamster) und weitere Zelllinien, einschließlich solcher für Laborzwecke entwickelten Zellen und Zellinien, wie bspw. hTERT-MSC-, HEK293-, Sf9- oder COS- Zellen. Geeignete eukaryotische Zellen umfassen weiterhin Zellen oder Zellinien, die durch Erkrankungen oder Infektionen beeinträchtigt sind, z. B. Krebszellen, insbesondere Krebszellen jeder der hier in der Beschreibung genannten Krebsarten, durch HIV beeinträchtigte Zellen, und/oder Zellen des Immunsystems oder des Zentralen Nervensystems (CNS). Besonders bevorzugt sind als eukaryotische Zellen humane Zellen oder tierische Zellen, z. B. von wie hier genannten Tieren. Geeignete Wirtszellen können ebenfalls aus eukaryotischen Mikroorganismen wie Hefe, z. B. Saccharomyces cerevisiae (Stinchcomb et al., Nature, 282:39, (1997)), Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia, und filamentöse Pilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium, etc. abgeleitet sein. Geeignete Wirtszellen umfassen ebenfalls prokaryotische Zellen, wie z. B. Bakterienzellen z. B. aus Escherichia coli oder aus Bakterien der Gattungen Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, etc..
In Schritt f') des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers in einer Wirtszelle erfolgt die Inkubation der (modifizierten) RNA in der Wirtszelle und die Translation des durch die (modifizierte) RNA kodierten Antikörpers in der Wirtszelle. Dazu werden bevorzugt wirtszelleigene Expressionsmechanismen genutzt, z. B. durch Translation der RNA in der Wirtzelle über Ribosomen und tRNAs. Die dabei verwendeten Inkubationstemperaturen richten sich nach den jeweils verwendeten Wirtszellsystemen.
In einem optionalen Schritt g') kann der in Schritt f') erhaltene translatierte Antikörper isoliert und/oder aufgereinigt werden. Eine Isolation des translatierten (exprimierten) Antikörpers umfasst dabei typischerweise eine Abtrennung des Antikörpers von Reaktionsbestandteilen und kann mit Verfahren erfolgen, die einem Fachmann bekannt sind, bspw. durch Zelllyse, Ultraschallaufschluss, oder ähnliche Verfahren, einschließlich der oben genannten Verfahren. Eine Aufreinigung kann daher auch mit Verfahren durchgeführt werden, wie für Schritt e) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers beschrieben.
Bei der Aufreinigung von (rekombinanten) Antikörpern aus einer Wirtszelle in Schritt g') des zuvor beschriebenen Verfahrens ist je nach Anwendung eine unterschiedliche Auswahl der zuvor beschriebenen Wirtszellen erforderlich. So ist die Produktion von rekombinanten Antikörpern in E. coli typischerweise nur begrenzt möglich, da die durch eine erfindungsgemäße (modifizierte) RNA kodierten Antikörper sehr komplex sind, komplizierte Faltungsmechanismen erfordern und für die Anwendung in mehrzelleigen Organismen bzw. Lebewesen üblicherweise posttranslational modifiziert werden. Im Cytoplasma von E. coli sind diese Mechanismen üblicherweise nicht durchführbar. Verwendet werden kann daher die periplasamatische Produktion in E. coli, bei der eine korrekte Faltung und Modifikation der Antikörperfragmente möglich ist. Dabei erfordert die Aufreinigung zumeist einen aufwendigen Aufschluss der Bakterien und eine schwierige Abtrennung aller bakteriellen Bestandteile, die als Endotoxine bei einer therapeutischen Anwendung wirken können. Um diese Probleme der Aufreinigung zu umgehen, können erfindungsgemäß in solchen Fällen Expressionsysteme für Hefen, Insektenzellen, Säugerzellen und Pflanzen eingesetzt worden, wobei die Produktion bevorzugt in geeigneten Säugerzellen wie z. B. Hamsterzellen (CHO) durchgeführt wird, wie hier beschrieben.
Unabhängig von den Schritten (a) bis (d) kann der durch die erfindungsgemäße (modifizierte) RNA kodierte Antikörper auch durch ein in vitro Translationsverfahren der Schritte (e') bis (g') exprimiert werden, welches auch als solches Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein in vitro-Transkriptions- und in vivo-Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers in einem Organismus, umfassend folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, insbesondere einer cDNA, kodierend einen wie zuvor beschriebenen Antikörper;
b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere wie zuvor beschriebene (modifizierte) Nukleotide, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor;
c) Inkubation der Nukleinsäure, insbesondere einer cDNA, im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure zu einer erfindungsgemäßen, wie hier beschriebenen, (modifizierten) RNA;
d) gegebenenfalls Aufreinigung und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium;
e'') Transfektion der in Schritt c) (und ggf. d)) erhaltenen (modifizierten) RNA in eine Wirtsszelle und Transplantation der transfizierten Wirtszelle in einen Organismus;
f'') Translation des durch die (modifizierte) RNA kodierten Antikörpers im Organismus.

Die Schritte a), b), c) und d) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und in vivo-Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einem Organismus sind identisch zu den Schritten a), b), c) und d) des hier beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro Transkriptionsverfahrens, des hier beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins und des hier beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einer Wirtszelle.
Wirtszellen im Sinne der vorliegenden Erfindung und insbesondere in Schritt e'') können auch autologe Zellen umfassen, d. h. Zellen, die einem Patienten entnommen und wieder zurückgeführt werden (körpereigene Zellen). Solche autologen Zellen verringern die Gefahr der Abstoßung durch das Immunsystem bei in vivo-Anwendungen. Bevorzugt werden bei autologen Zellen (gesunde oder erkrankte) Zellen aus den betroffenen Körperbereichen/Organen des Patienten eingesetzt. Transfektionsverfahren sind bevorzugt solche wie zuvor für Schritt e) beschrieben. In Schritt e'') erfolgt zusätzlich zu Schritt e) die Transplantation der Wirtszelle in einen Organismus. Ein Organismus bzw. ein Lebewesen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Säugetiere, d. h. Tiere, einschließlich Rind, Schwein, Hund, Katze, Esel, Affe, einschließlich Nagetiere, z. B. Maus, Hamster, Kaninchen, etc., sowie Menschen.. Alternativ zu Schritt e'') und f'') kann die Isolation und/oder Aufreinigung gemäß den Schritten f)/f') und/oder g)/g') und eine anschließende Verabreichung des translatierten (therapeutisch wirksamen) Proteins an das Lebewesen erfolgen. Die Verabreichung kann, wie für pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, durchgeführt werden.
In Schritt f'') erfolgt die Translation des durch die (modifizierte) RNA kodierten Antikörpers im Organismus. Die Translation erfolgt dabei bevorzugt durch wirtszellspezifische Systeme in Abhängigkeit der verwendeten Wirtszelle.
Unabhängig von den Schritten (a) bis (d) kann die transkribierte erfindungsgemäße (modifizierte) RNA auch durch ein in vitro Translationsverfahren der Schritte (e'') bis (g'') exprimiert werden, welches auch als solches Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
Alternativ zu den oben beschriebenen Verfahren kann gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine gemäß den Schritten a) bis d) transkribierte erfindungsgemäße (modifizierte) RNA in einem weiteren Schritt e''') direkt in den Organismus, z. B. Mensch, verabreicht werden, z. B. durch Verabreichung der nackten oder komplexierten erfindungsgemäßen RNA, bspw. unter Verwendung der oben beschriebenen Transfektionsverfahren, ggf. unter Verwendung bestimmter hier beschriebener Stabilisierungsfaktoren. Dabei wird die RNA nach Aufnahme bevorzugt in die Zellen transportiert, z. B. mit wie hier beschriebenen Lokalisierungs- oder Signalsequenzen, und in den Zellen bevorzugt in den kodierten Antikörper translatiert.
Vorteile der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt insbesondere eine erfindungsgemäße, einen Antikörper kodierende RNA. Diese kann modifiziert oder unmodifiziert sein, wobei die Definition von „Modifikation" im weitesten Sinne zu verstehen ist. Eine native RNA, kovalent gebunden an eine andere Gruppe, bspw. ein Lipid oder einen Zuckerrest, ist im Sinne dieser Erfindung modifiziert. Modifiziert im Sinne der vorliegenden Erfindung ist auch eine RNA, die nicht-nativ auftretende Bestandteile enthält, bspw. nicht native Nukleotide, oder eine RNA, die gegenüber ihrem Vorläufer durch Austausch von Nukleotiden, unabhängig davon, ob diese nativ oder nicht nativ sind, verändert ist. Der große Vorteil von solchen RNAs ist, dass diese nicht die negativen Wirkungen von DNA-Transfektionen (mit stabilem Einbau in das Genom) aufweisen. Im Falle von modifizierten, Antikörper kodierenden RNAs ist die begrenzte Stabilität der RNA kodierend für die Antikörper bzw. Antikörperfragmente, darüber hinaus verbessert. Damit also werden erfindungsgemäß die Antikörper nach Verabreichung an Patienten, insbesondere Säugetiere, v. a. den Menschen, nur über eine überschaubare Zeit über die Behandlung hinaus, in vivo exprimiert und führen damit nicht zu schädlichen Effekten. Im Gegensatz dazu können die klassischen Intrabody-DNAs stabil ins Genom integriert oder zumindest langanhaltend exprimiert werden, was zu unkontrollierbaren Ereignissen führen kann. Der große Vorteil gegenüber der Applikation von monoklonalen Antikörpern in vivo ist ferner, dass bei Verwendung einer wie hier beschriebenen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA, keine Antikörper aufwendig hergestellt und aufgereinigt werden müssen und damit wesentlich kostengünstiger herzustellen sind. Der wesentlichste Vorteil der vorliegenden Erfindung ist jedoch, dass mit den durch erfindungsgemäße (modifizierte) RNAs kodierten Antikörpern auch intrazellulär exprimierte Proteine erreicht werden können, was mit bisher aus dem Stand der Technik bekannten monoklonalen Antikörpern nicht möglich ist.
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die vorhergehende Beschreibung, ohne darauf eingeschränkt zu werden, näher erläutern und illustrieren.
Figuren:
1 zeigt veranschaulichend die Struktur eines IgG-Antikörpers. IgG-Antikörper sind aus jeweils 2 identischen leichten und 2 schweren Proteinketten aufgebaut, die miteinander über Disulfid-Brücken verbunden sind. Die leichte Kette besteht aus der N-terminalen variablen Domäne V_L und der C-terminalen konstanten Domäne C_L. Die schwere Kette eines IgG-Antikörpers lässt sich in eine N-terminale variable Domäne V_H und drei konstante Domänen C_H1, C_H2 und C_H3 einteilen.
2 zeigt die Gencluster für die leichten und die schweren Ketten eines Antikörpers:

(A): Gencluster für die leichte Kette ĸ.
(B): Gencluster für die leichte Kette λ.
(C): und (D): Gencluster für die schwere Kette.

Die variable Region einer schweren Kette wird dabei aus drei unterschiedlichen Gensegmenten zusammengesetzt. Neben den V- und J-Segmenten findet man hier noch zusätzliche D-Segmente. Die V_H, D_H- und J_H-Segmente können zur Bildung der variablen Region der schweren Kette ebenso nahezu beliebig kombiniert werden.
3 veranschaulicht schematisch die Unterschiede in den leichten und schweren Ketten von murinen (d. h. in dem Wirtsorganismus Maus gewonnen), chimären, humanisierten und humanen Antikörpern.
4 zeigt in einer Übersicht die Struktur unterschiedlicher Antikörperfragmente. Die Bestandteile der Antikörperfragmente sind dunkelgrau unterlegt.
5 zeigt in 5A, 5B und 5C verschiedene Varianten von Antikörpern und Antikörperfragmenten:

(A) zeigt eine schematische Darstellung eines IgG-Antikörpers aus zwei leichten und zwei schweren Ketten.
(B) zeigt ein Fab-Fragment aus der variablen und einer konstanten Domäne jeweils einer leichten und einer schweren Kette. Die beiden Ketten sind über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden.
(C) zeigt ein scFv-Fragment aus der variablen Domäne der leichten und der schweren Kette, die über einen artifiziellen Polypeptidlinker miteinander verbunden sind.

6 zeigt die Darstellung einer erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, (modifizierten) RNA als Expressionskonstrukt. Es bedeuten:

V_H: = variable Domäne der schweren (heavy) Kette;
C_H: = konstante Domäne der schweren (heavy) Kette;
V_L: = variable Domäne der leichten (light) Kette;
C_L: = konstante Domäne der leichten (light) Kette;
SIRES: = internal ribosomal entry side (IRES, superIRES)
muag: = mutierte Form des 3'-UTR des Alpha-Globin-Gens; und
A70C30: = PolyA-PolyC-Schwanz.

7 zeigt die schematische Darstellung des Nachweises eines durch eine erfindungsgemäße RNA kodierten Antikörpers mittels ELISA am Beispiel des Antigens Her2.
8 zeigt die Wildtyp-DNA-Sequenz der schweren Kette des Antikörpers Rituximab (= Rituxan, MabThera) (Wildtyp: GC-Gehalt: 56,5%, Länge: 1344) (SEQ ID NO: 1).
9 zeigt die GC-optimierte DNA-Sequenz der schweren Kette des Antikörpers Rituximab (= Rituxan, MabThera) (GC-Gehalt: 65,9%, Länge: 1344) (SEQ ID NO: 2).
10 zeigt die Wildtyp-DNA-Sequenz der leichten Kette des Antikörpers Rituximab (= Rituxan, MabThera) (Wildtyp: GC-Gehalt: 58,5%, Länge: 633) (SEQ ID NO: 3).
11 zeigt die GC-optimierte DNA-Sequenz der leichten Kette des Antikörpers Rituximab (= Rituxan, MabThera) (GC-Gehalt: 67,2%, Länge: 633) (SEQ ID NO: 4).
12 zeigt das Gesamtkonstrukt der GC-optimierten DNA-Sequenz des Antikörpers Rituximab (= Rituxan, MabThera) mit den leichten und schweren Ketten (SEQ ID NO: 5). Das Gesamtkonstrukt enthält folgende Sequenzen und Schnittstellen: ACC-linker für eine optimale Kozak-Sequenz
13 zeigt die Wildtyp-DNA-Sequenz der schweren Kette des Antikörpers Cetuximab (= Erbitux) (Wildtyp: GC-Gehalt: 56,8%, Länge: 1359) (SEQ ID NO: 6).
14 zeigt die GC-optimierte DNA-Sequenz der schweren Kette des Antikörpers Cetuximab (= Erbitux) (GC-Gehalt: 65,9%, Länge: 1359) (SEQ ID NO: 7).
15 zeigt die Wildtyp-DNA-Sequenz der leichten Kette des Antikörpers Cetuximab (= Erbitux) (Wildtyp: GC-Gehalt: 58,2%, Länge: 642) (SEQ ID NO: 8).
16 zeigt die GC-optimierte DNA-Sequenz der leichten Kette des Antikörpers Cetuximab (= Erbitux) (GC-Gehalt: 65,7%, Länge: 642) (SEQ ID NO: 9).
17 zeigt das Gesamtkonstrukt der GC-optimierten DNA-Sequenz des Antikörpers Cetuximab (= Erbitux) mit den leichten und schweren Ketten (SEQ ID NO: 10). Das Gesamtkonstrukt enthält folgende Sequenzen und Schnittstellen: ACC-linker für eine optimale Kozak-Sequenz
18 zeigt die Wildtyp-DNA-Sequenz der schweren Kette des Antikörpers Trastuzumab (= Herceptin) (Wildtyp: GC-Gehalt: 57,8%, Länge: 1356) (SEQ ID NO: 11).
19 zeigt die GC-optimierte DNA-Sequenz der schweren Kette des Antikörpers Trastuzumab (= Herceptin) (GC-Gehalt: 67,0%, Länge: 1356) (SEQ ID NO: 12).
20 zeigt die Wildtyp-DNA-Sequenz der leichten Kette des Antikörpers Trastuzumab (= Herceptin) (Wildtyp: GC-Gehalt: 56,9%, Länge: 645) (SEQ ID NO: 13).
21 zeigt die GC-optimierte DNA-Sequenz der leichten Kette des Antikörpers Trastuzumab (= Herceptin) (GC-Gehalt: 66,4%, Länge: 645) (SEQ ID NO: 14).
22 zeigt das Gesamtkonstrukt der GC-optimierten DNA-Sequenz des Antikörpers Trastuzumab (= Herceptin) mit den leichten und schweren Ketten (SEQ ID NO: 15). Das Gesamtkonstrukt enthält folgende Sequenzen und Schnittstellen: ACC-linker für eine optimale Kozak-Sequenz
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher, ohne sie einzuschränken.
Beispiele
1.1 Verwendete Zell-Linien und Zellkultur-Bedingungen:
Die Zell-Linien HeLa (humane Zervixkarzinom-Zell-Linie; Her2-positiv), HEK293 (human embryonal kidney; Her2-negativ) und BHK21 (Syrian hamster kidney; Her2-negativ) wurden vom DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) in Braunschweig bezogen und in RPMI-Medium angereichert mit 2 mM L-Glutamine (Bio Whittaker) und 10 μg/ml streptamycin und 10 U/ml of Penicillin bei 37°C und unter 5% CO₂ kultiviert.
1.2 Herstellung von Expressionsvektoren für erfindungsgemäße modifizierte RNA-Sequenzen:
Für die Produktion von erfindungsgemäßen modifizierten RNA-Sequenzen wurden die GC-angereicherten und translationsoptimierten DNA-Sequenzen, kodierend für eine schwere Kette und eine leichte Kette eines Antikörpers (z. B. Cetuximab (Erbitux), Trastuzumab (Herceptin) und Rituximab (Rituxan) vgl. SEQ ID NO: 1–15, wobei die SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 11 und 13 die jeweiligen kodierenden nicht-GC-optimierten Sequenzen der schweren und der leichten Ketten dieser Antikörper und die SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 14 und 15 die kodierenden GC-angereicherten Sequenzen darstellen (s. o.)) mit molekularbiologischen Standardmethoden in den pCV19-Vektor (CureVac GmbH) kloniert. Um eine äquimolare Expression der beiden Ketten zu gewährleisten, wurde eine IRES (internal ribosomal entry side) eingeführt. Zur zusätzlichen Stabilisierung der mRNA dient der mutierte 3'-UTR (untranslated region) des alpha-Globin-Gens und ein PolyA-polyC-Schwanz am 3'-Ende. Zur Sekretion des exprimierten Antikörpers ist das Signalpeptid des HLA-A*0201-Gens kodiert. Zur Detektion des Antikörpers wurde zusätzlich ein His-Tag eingeführt. 6 zeigt die verwendeten Expressionskonstrukte.
1.3 Herstellung der G/C-angereicherten und translationsoptimierten mRNA kodierend für einen Antikörper:
Es wurde eine in vitro-Transkription mittels der T7-Polymerase (T7-Opti mRNA Kit, CureVac, Tübingen, Deutschland) durchgeführt und anschließend mit Pure Messenger^TM (CureVac, Tübingen, Deutschland) aufgereinigt. Dazu wurde zunächst ein DNAse Verdau, anschließend eine LiCl- Fällung und danach eine HPLC unter Verwendung einer porösen Umkehrphase als stationäre Phase durchgeführt (PURE Messenger).
1.4 Nachweis von RNAntibody mittels Durchflusszytometrie:
1 Mio Zellen wurden mit der mRNA gemäß einer des SEQ ID NO: 5, 10 oder 15 (s. o.), kodierend für einen wie zuvor beschriebenen Antikörper, mittels Elektroporation transfiziert und anschließend für 16 h in Medium kultiviert. Mittels eines FITC-gekoppelten His-Tag-Antikörpers wurde der exprimierte Antikörper nachgewiesen. Alternativ wurde der sekretierte Antikörper aus dem Überstand transfizierter Zellen zu nicht transfizierten, Antigen-exprimierenden Zellen gegeben und nach Inkubation nach der gleichen Methode nachgewiesen.
1.5 Nachweis eines durch eine erfindungsgemäße RNA kodierten Antikörpers in vitro mittels ELISA:
Eine Mikrotiter-Platte wurde mit einem murinen Antikörper (1) gegen ein erstes Antigen (HER-2) beladen. Anschließend wurde zu der Platte Zell-Lysat von Antigen-exprimierenden Zellen gegeben. Das Antigen wurde dabei von dem murinen Antigen-spezifischen Antikörper (1) gebunden. Anschließend wurde der Überstand von Zellen zu der Mikrotiter-Platte zugegeben, die mit einer erfindungsgemäßen modifizierten mRNA, kodierend für einen HER-2-spezifischen Antikörper, transfiziert wurden. Der im Überstand enthaltene HER-2-spezifische Antikörper (2) bindet ebenfalls an das Antikörper-gebundene Antigen, wobei die beiden Antikörper unterschiedliche Domänen des Antigens erkennen. Zum Nachweis des gebunden Antikörpers (2) wird Meerrettich-Peroxidasegekoppeltes Anti-human-IgG (3-HRP) zugegeben, welches das Substrat TMB umsetzt und photometrisch bestimmt wurde.
1.6 Nachweis eines durch eine erfindungsgemäße RNA kodierten Antikörpers in vivo:
Eine wie zuvor beschriebene erfindungsgemäße (m)RNA, kodierend für einen Antikörper, wurde in BALB/c-Mäuse intradermal oder intramuskulär injiziert. 24 h danach wurden die entsprechenden Gewebe entnommen und Proteinextrakte hergestellt. Die Expression des Antikörpers wurde, wie hier beschrieben, mittels ELISA nachgewiesen.
1.7 Nachweis eines durch eine erfindungsgemäße RNA kodierten Antikörpers mittels Western Blot:
Die exprimierten Antikörper aus den Überständen von Zellen, die mit einer modifizierten mRNA, kodierend für einen wie zuvor beschriebenen Antikörper, transfiziert wurden, wurden mittels einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf eine Membran übertragen. Nach Inkubation mit Anti-His-Tag-Antikörper und eines Meerrettich-Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörpers wurde der exprimierte Antikörper mittels Chemolumineszenz nachgewiesen.
1.8 Tumor-Modell:
Es wurden SKOV-3-Zellen subcutan in BALB/c-Mäuse injiziert. Innerhalb der folgenden 28 Tage wurden achtmal 10 μg einer modifizierten mRNA, kodierend für einen wie zuvor beschriebenen Antikörper, in die Schwanzvene der Mäuse injiziert. Das Tumorwachstum wurde über den Zeitraum von 5 Wochen verfolgt.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

RNA zur intrazellulären Expression eines Antikörpers, wobei die RNA für einen Antikörper kodiert.
RNA gemäß Anspruch 1, wobei die RNA einzelsträngig oder doppelsträngig, linear oder zirkulär, als rRNA, tRNA oder mRNA vorliegt.
RNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die RNA als mRNA vorliegt.
RNA gemäß Anspruch 1 bis 3, wobei der kodierte Antikörper ausgewählt wird aus monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, chimären Antikörpern, humanen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, bispezifischen Antikörpern, Intrabodies (Intrakörper) und Fragmenten dieser Antikörper.
RNA gemäß Anspruch 1 bis 4, wobei die kodierten Antikörperfragmente ausgewählt werden aus Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fc-, Facb-, pFc'-, Fd-, und Fv-Fragmenten dieser Antikörper.
RNA gemäß Anspruch 1 bis 5, wobei die kodierten Antikörper oder Antikörperfragmente tumorspezifische Oberflächenantigene spezifisch erkennen und binden, ausgewählt aus (TSSA), 5T4, α5β1-Integrin, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β-Catenin/m, Bcr-abl, MN/C IX-Antigen, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, β-Catenin/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (oder hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MART-2/Ski, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, PAP, Proteinase-3, p190 minor bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, Survivin, TEL/AML1, TGFβ, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF und WT1, NY-Eso-1 und NY-Eso-B.
RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die RNA modifiziert ist.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Modifikation ausgewählt ist aus Modifikationen der Nukleotidabfolge gegenüber einer Vorläufer-RNA-Sequenz, durch Einführung nicht-nativer Nukleotide und/oder durch kovalente Kopplung der RNA mit einer anderen Gruppe.
RNA gemäß Anspruch 8, wobei die RNA einen G/C-Gehalt im kodierenden Bereich der Basen-modifizierten RNA aufweist, der größer ist als der G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der nativen RNA-Sequenz, wobei die kodierte Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp bzw. der Vorläufer–RNA unverändert ist.
RNA gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei der kodierende Bereich der modifizierten RNA gegenüber dem kodierenden Bereich der nativen RNA derart verändert ist, dass mindestens ein Codon der nativen RNA, das für eine in der Zelle relativ seltene, tRNA kodiert, gegen ein Codon ausgetauscht ist, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA.
RNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die RNA eine Lipid-Modifizierung aufweist.
RNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die RNA an mindestens einem Nukleotid der RNA eine Modifikation eines Nukleotids aufweist, wobei die Nukleotide ausgewählt werden aus 1-Methyl-Adenin, 2-Methyl-Adenin, 2-Methylthio-N6-isopentenyl-Adenin, N6-Methyl-Adenin, N6-Isopentenyl-Adenin, 2-Thio-Cytosin, 3-Methyl-Cytosin, 4-Acetyl-Cytosin, 5-Methyl-Cytosin, 2,6-Diaminopurin, 1-Methyl-Guanin, 2-Methyl-Guanin, 2,2-Dimethyl-Guanin, 7-Methyl-Guanin, Inosin, 1-Methyl-Inosin, Dihydro-Uracil, 2-Thio-Uracil, 4-Thio-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thio-Uracil, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)-Uracil, 5-Fluoro-Uracil, 5-Bromo-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-Uracil, 5- Methyl-2-Thio-Uracil, 5-Methyl-Uracil, N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, 5-Methylaminomethyl-Uracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thio-Uracil, 5'-Methoxycarbonylmethyl-Uracil, 5-Methoxy-Uracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Pseudouracil, 1-Methyl-Pseudouracil, Queosin, b-D-Mannosyl-Queosin, Wybutoxosin, sowie Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide, Methylphosphonate, 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin.
RNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die RNA an mindestens einem Nukleotid der RNA eine Modifikation eines Nukleotids aufweist, wobei die Nukleotide ausgewählt werden Basen-modifizierten Nukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-Amino-6-Chloropurineribosid-5'-triphosphat, 2-Aminoadenosin-5'-triphosphat, 2-Thiocytidin-5'-triphosphat, 2-Thiouridin-5'-triphosphat, 4-Thiouridin-5'-triphosphat, 5-Aminoallylcytidin-5'-triphosphat, 5-Aminoallyluridin-5'-triphosphat, 5-Bromocytidin-5'-triphosphat, 5-Bromouridin-5'-triphosphat, 5-Iodocytidin-5'-triphosphat, 5-Iodouridin-5'-triphosphat, 5-Methylcytidin-5'-triphosphat, 5-Methyluridin-5'-triphosphat, 6-Azacytidin-5'-triphosphat, 6-Azauridin-5'-triphosphat, 6-Chloropurinribosid-5'-triphosphat, 7-Deazaadenosin-5'-triphosphat, 7-Deazaguanosin-5'-triphosphat, 8-Azaadenosin-5'-triphosphat, 8-Azidoadenosin-5'-triphosphat, Benzimidazolribosid-5'-triphosphat, N1-Methyladenosin-5'-triphosphat, N1-Methylguanosin-5'-triphosphat, N6-Methyladenosin-5'-triphosphat, O6-Methylguanosin-5'-triphosphat, Pseudouridin-5'-triphosphat, Puromycin-5'-triphosphat, oder Xanthosine-5'-triphosphat.
RNA gemäß Anspruch 13, wobei die Basen-modifizierten Nukleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus 5-Methylcytidin-5'-triphosphat und Pseudouridin-5'-triphosphat.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA zusätzlich eine 5'-Cap-Struktur aufweist, ausgewählt aus der Gruppe betsehend aus m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA zusätzlich einen Poly-A-Schwanz von etwa 10 bis 200 Adenosin-Nukleotiden aufweist.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA zusätzlich einen Poly-C-Schwanz von etwa 10 bis 200 Cytosin-Nukleotiden aufweist.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA zusätzlich einen Tag zur Aufreinigung kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Hexahistidin-Tag (HIS-Tag, Polyhistidin-Tag), einem Streptavidin-Tag (Strep-Tag), einem SBP-Tag (Streptavidin-Bindungs-Tag) oder einem GST (Glutathion-S-Transferase)-Tag, oder für einen Tag für die Aufreinigung über ein Antikörper-Epitop kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antikörper-Bindungs-Tags, einem Myc-Tag, einem Swa11-Epitop, einem FLAG-Tag oder einem HA-Tag.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA zusätzlich ein Signalpeptid und/oder eine Lokalisationssequenz kodiert.
RNA gemäß Anspruch 19, wobei die Lokalisationssequenz ausgewählt wird aus einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 18 bis 50.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA eine für einen Antikörper kodierende Sequenz aufweist, die für die schweren Ketten gemäß der SEQ ID NO: 2 und die leichten Ketten gemäß der SEQ ID NO: 4 kodiert.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 20, wobei die RNA eine für einen Antikörper kodierende Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 5 aufweist.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 20, wobei die RNA eine für einen Antikörper kodierende Sequenz aufweist, die für die schweren Ketten gemäß der SEQ ID NO: 7 und die leichten Ketten gemäß der SEQ ID NO: 9 kodiert.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 20, wobei die RNA eine für einen Antikörper kodierende Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 10 aufweist.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 20, wobei die modifizierte RNA eine für einen Antikörper kodierende Sequenz aufweist, die für die schweren Ketten gemäß der SEQ ID NO: 12 und die leichten Ketten gemäß der SEQ ID NO: 14 kodiert.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 20, wobei die RNA eine für einen Antikörper kodierende Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 15 aufweist.
RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 20, wobei die modifizierte RNA eine für einen Antikörper kodierende Sequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu der Sequenz SEQ ID NO: 5, 10 oder 15 über die gesamte Länge der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 5, 10 oder 15 aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27.
Verwendung einer modifizierten RNA-Sequenz, wie in den Ansprüchen 1 bis 27 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen, Herz- und Kreislauferkrankungen, Infektionskrankheiten oder Autoimmunkrankheiten.
Verwendung gemäß Anspruch 29, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als passive Vakzine zur Behandlung von Tumor- oder Infektionserkrankungen vorliegt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 29 oder 30, wobei die Krebs- bzw. Tumorerkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Melanomen, malignen Melanomen, Kolon-Karzinomen, Lymphomen, Sarkomen, Blastomen, Nierenkarzinomen, Gastrointestinalen Tumoren, Gliomen, Prostatatumoren, Blasenkrebs, Rektaltumoren, Magenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Mammakarzinomen (= Brustkrebs), Gebärmutterkrebs, Gebärmuttehalskrebs, Akuter myeloider Leukämie (AML), Akuter Lymphoider Leukämie (ALL), chronischer myeloider Leukämie (CML), chronischer lymphozytischre Leukämie (CLL), Hepatomen, diversen Virus-induzierten Tumoren, wie z. B. Papillomvirus-induzierten Karzinomen (z. B. Cervixkarzinom = Gebärmutterhalskrebs), Adenokarzinomen, Herpesviren-induzierten Tumoren (z. B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertem B Zelllymphom), Hepatitis B-induzierten Tumoren (Hepatozellkarzinomen), HTLV-1- und HTLV-2-induzierten Lymphomen, Akustikusneurinom, Lungenkarzinomen (= Lungenkrebs = Bronchialkarzinom), kleinzelligen Lungenkarzinomen, Rachenkrebs, Analkarzinom, Glioblastom, Rektumkarzinom, Astrozytom, Hirntumoren, Retinoblastom, Basaliom, Hirnmetastasen, Medulloblastomen, Scheidenkrebs, Hodenkrebs, Schilddrüsenkarzinom, Hodgkin-Syndrom, Meningeomen, Schneeberger Krankheit, Hypophysentumor, Mycosis fungoides, Karzinoien, Neurinom, Spinaliom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinom, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphomen, Urethrakrebs, CUP-Syndrom, Kopf-Hals-Tumoren, Oligodendrogliom, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Ösphaguskarzinom (= Speiseröhrenkrebs), Warzenbeteiligung, Dünndarmtumoren, Kraniopharyngeomen, Ovarial-Karzinom, Weichteiltumoren, Eierstockkrebs (= Ovarialkarzinom), Pankreaskarzinom (= Bauchspeicheldrüsenkrebs), Endometriumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Lidtumor und Prostatakrebs (= Prostatatumoren).
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 29 bis 30, wobei die Infektionskrankheiten ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten, wie AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanischer Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-Infektion, Pfeiferschem Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten, wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis (Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischem Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, Lungenentzündung, Meningitis, Bakterieller Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weichem Schanker und durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufenen Inkektionskrankheiten, wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas-Krankheit, Echinococcus, Fischbandwurm, Fischvergiftung (Ciguatera), Fuchsbandwurm, Fußpilz, Hundebandwurm, Kandiose, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), Läuse, Malaria, Mikroskopie, Onchozerkose (Flussblindheit), Pilzerkrankungen, Rinderbandwurm, Schistosomiasis, Schlafkrankheit, Schweinebandwurm, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale Leishmaniose, Windeldermatitis, oder Infektionen, verursacht durch den Zwergbandwurm.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 29 oder 30, wobei die Herz- und Kreislauferkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Koronarer Herzkrankheit, Arteriosklerose, Apoplexie, Hypertonie, und neuronalen Erkrankungen, ausgewählt aus Alzheimerscher Krankheit, Amyotropher Lateralsklerose, Dystonie, Epilepsie, Multipler Sklerose und Parkinsonscher Krankheit.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 29 oder 30, wobei die Autoimmunkrankheiten ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Autoimmun-Typ-I-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-II-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-III-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-IV-Erkrankungen, wie bspw. Multipler Sklerose (MS), Rheumatoider Arthritis, Diabetes, Diabetes-Typ-I (Diabetes mellitus), Systemischem Lupus Erythematosus (SLE), Chronischer Polyarthritis, Basedowscher Krankheit, Autoimmunen Formen der chronischen Hepatitis, Colitis Ulcerosa, Allergie-Typ-I-Erkrankungen, Allergie-Typ-II-Erkrankungen, Allergie-Typ-III-Erkrankungen, Allergie-Typ-IV-Erkrankungen, Fibromyalgie, Haarausfall, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Myasthenia gravis, Neurodermitis, Polymyalgia rheumatica, Progressiver Systemischer Sklerose (PSS), Psiorasis, Reiter-Syndrom, Rheumatischer Arthritis, Schuppenflechte oder Vaskulitis.
In vitro-Transkriptionsverfahren zur Herstellung einer, einen Antikörper kodierenden, ggf. modifizierten RNA, umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Nukleinsäure kodierend für einen Antikörper, wie in den Ansprüchen 4 bis 6 definiert; b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere modifizierte Nukleotide, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, oder ggf. nur natürlich vorkommende Nukleotide und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor; c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure zu einer, einen Antikörper kodierenden, ggf. modifizierten RNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 27; d) gegebenenfalls Aufreinigung der, einen Antikörper kodierenden, ggf. modifizierten RNA und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium.
In vitro-Transkriptions- und Translationsverfahren zur Expression eines Antikörpers, umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend einen Antikörper wie in den Ansprüchen 4 bis 6 definiert; b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere modifizierte Nukleotide, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, oder ggf. nur natürlich vorkommende Nukleotide und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor; c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure zu einer, einen Antikörper kodierenden, ggf. modifizierten RNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 27; d) gegebenenfalls Aufreinigung der, einen Antikörper kodierenden, ggf. modifizierten RNA und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium; e) Zugabe der in Schritt c) (und ggf. in Schritt d) erhaltenen ggf. modifizierten RNA zu einem in vitro-Translationsmedium; f) Inkubation der ggf. modifizierten RNA im in vitro-Translationsmedium und in vitro Translation des durch die ggf. modifizierte RNA kodierten Antikörpers; g) ggf. Aufreinigung des in Schritt f) translatierten Antikörpers.
In vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Expression eines Antikörpers in einer Wirtszelle, umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend einen Antikörper wie in den Ansprüchen 4 bis 6 definiert; b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, ein oder mehrere modifizierte Nukleotide im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen oder nur natürlich vorkommende Nukleotide und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor; c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure zu einer, einen Antikörper kodierenden, ggf. modifizierten RNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 27; d) gegebenenfalls Aufreinigung der erfindungsgemäßen, einen Antikörper kodierenden, ggf. modifizierten RNA und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium; e') Transfektion der in Schritt c) (und ggf. d)) erhaltenen ggf. modifizierten RNA in eine Wirtszelle; f') Inkubation der ggf. modifizierten Nukleinsäure in der Wirtszelle und Translation des durch die ggf. modifizierte RNA kodierten Antikörpers in der Wirtszelle; g') Optional Isolation und/oder Aufreinigung des in Schritt f') translatierten Antikörpers.