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TW202542177A - 可活化融合蛋白及使用方法 - Google Patents

可活化融合蛋白及使用方法

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TW202542177A
TW202542177A TW113149891A TW113149891A TW202542177A TW 202542177 A TW202542177 A TW 202542177A TW 113149891 A TW113149891 A TW 113149891A TW 113149891 A TW113149891 A TW 113149891A TW 202542177 A TW202542177 A TW 202542177A
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amino acid
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antigen
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TW113149891A
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傑克 安東尼 貝茲
大衛 貝爾托爾多
菲力克斯 波爾曼
奧里奇 彼克曼儂
迪克 蘿拉 柯達瑞
莫里茲 熱那亞
馬龍 雅各 辛納
勞福 荷斯
克里斯俊 克萊
史蒂芬 杰拉德 艾倫 勒克萊爾
黛安娜 安琪拉 皮皮格
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瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
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Abstract

本發明提供可活化融合蛋白及其使用方法。本發明進一步提供抗 huIL-2 抗體及其使用方法。

Description

可活化融合蛋白及使用方法
本發明涉及可活化融合蛋白及其使用方法。
治療性抗體徹底改變了現代醫學。憑藉它們的高特異性，該等治療性抗體使得以前所未有的精度靶向個體中之特異性分子成為可能。雖然最初的單株抗體治療劑主要局限於阻斷靶分子與天然配位體之相互作用，且從而中斷某些疾病機制潛在的傳訊路徑，但技術迅速自此等更簡單的作用模式進展至更複雜的形式，諸如可靶向兩種不同抗原決定基 (epitope) 之雙特異性抗體或旨在將細胞激素活性定位於靶組織，以便在局部觸發免疫反應而不同時影響健康組織之靶向的細胞激素。
然而，對於許多治療活性物質，諸如細胞激素或激動性抗體，在靶向抗體之幫助下將它們靶向所欲組織不足以防止活性物質在外周中的非特異性及非所欲的活性。特別是對於強效細胞激素諸如干擾素α，可能會引發非所要的副作用。
已經提出了不同的分子形式來解決此問題。舉例而言，已進行了各種嘗試來掩蔽治療活性劑，諸如細胞激素或 CD3 結合 (即 T 細胞活化) 抗原結合域，用與此等劑結合之分子掩蔽物 (通常為抗體或抗體衍生之分子，諸如 scFv，但肽掩蔽物亦為常見的)。此等掩蔽通常經由易於由靶組織特異性蛋白酶 (例如腫瘤蛋白酶) 切割之肽連接子接附至治療活性劑。因此，一旦分子達至靶組織，掩蔽物即被切割，且在所關注部位處釋放治療活性劑。亦提議了雙重結合掩蔽，其能夠以相互排斥的方式特異性結合靶組織中之治療活性劑以及抗原。此等分子已被描述為在不存在標靶抗原之情況下掩蔽治療活性劑，但在靶組織中此等分子將與標靶抗原結合，從而釋放治療活性劑之活性。
蛋白酶可活化分子取決於高度組織特異性蛋白酶之存在。若蛋白酶不僅在靶組織中表現，且亦在健康組織中表現，此可能會導致在外周中產生非所要副作用。相互排斥的雙重結合抗體克服了此問題，但它們需要大量的努力來開發，且並非每個靶組合均適合雙重結合。
因此，持續需要允許治療活性劑高度特異性地靶向定義的細胞群體或組織，同時防止治療活性劑在健康組織中產生不期望的副作用之通用分子形式。
本發明提供可活化融合蛋白及其使用方法。已發現，藉由將配位體 (諸如細胞激素) 及能夠與配位體結合且防止其發揮其生物活性 (藉由阻斷配位體與配位體集合部分之間的相互作用) 之掩蔽部分 (例如抗體或抗體片段)融合至與標靶抗原結合之抗原結合部分之兩條鏈，配位體之生物活性可取決於標靶抗原之存在。當抗原結合部分與其標靶抗原結合時，實現了此種未掩蔽，使得配位體 (例如細胞激素) 與掩蔽部分之間的抑制性相互作用在空間上被中斷，而無需蛋白酶可切割連接子。
因此，本發明的可活化融合蛋白平台並不依賴於組織特異性蛋白酶或對某些組織具有特異性之其他切割機制之存在。雖然後者導致生物活性分子之不可逆變化，但一旦環境中不存在標靶抗原，根據本發明之可活化融合蛋白所依賴的機制係可逆的。因此，與依賴更具破壞性原理 (諸如切割或消化) 之機制所依賴的分子相比，若可活化融合蛋白在循環中保留延長的時間段，則脫靶活性之風險降低。本發明之融合蛋白亦獨立於其他活化機制，諸如依賴環境中某些化學物質或物理化學條件之存在的 ATP 活化或 pH 依賴性活化。
根據本發明之可活化融合蛋白透過容易獲得的多肽域之簡單排列來實現標靶抗原依賴性活性，從而允許容易地實施及最佳化它們的預期目的。藉由改變不同組分之親和力，可訂製分子以區分標靶抗原之特定表面表現水準。可活化融合蛋白展現出優異的訊噪比及敏感性，例如與依賴配位體 (諸如細胞激素) 衰減之其他靶向的分子形式相比。因此，本文所描述之可活化融合蛋白亦具有極好的副作用概況，顯示出外周中極小的靶活化。在某些實施例中，本文所示之可活化融合蛋白不僅可作用於表面分子，且亦可作用於溶液中之靶分子。它們還允許使活化依賴於靶組織/細胞處兩種不同受體之存在，從而潛在地增加對靶組織之特異性。
本文所描述之發明提供了可活化融合蛋白，其包含(a) 能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽之第一抗原結合部分，(b) 能夠特異性結合至配位體結合部分之配位體，以及(c) 能夠特異性結合至配位體之掩蔽部分，其特徵在於，配位體係經由第一肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之一者的 N 端，掩蔽部分係經由第二肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之另一者的 N 端，且第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本文所描述之可活化融合蛋白中所包含的配位體與配位體結合部分之標靶依賴性結合特別不依賴於可活化融合蛋白之任何蛋白水解活性，特定而言不依賴於任何蛋白水解切割。在一個態樣中，可活化融合蛋白係功能性的且以其完整形式及/或在不存在蛋白酶之情況下顯示出標靶抗原依賴性活性。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第一抗原結合部分為抗體或抗體片段。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中抗原結合部分為選自由以下所組成之群組的抗體片段：Fab、DutaFab、DAF、Fv、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙功能抗體 (diabody)、線性抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中配位體係選自由以下所組成之群組：生長因子、細胞激素、趨化激素、抗體、抗體片段、酶、受體配位體、親和力肽配位體、肽激素、受體激動劑、受體拮抗劑、酶、可溶性受體、蛋白質毒素、可溶性配位體、細胞表面受體之胞外區、細胞表面配位體之胞外區、小分子或其任何組合。在特定實施例中，可活化融合蛋白中所包含之配位體為細胞激素。
本質上，在本文中之可活化融合蛋白中，配位體可為能夠特異性結合至充當配位體結合部分之另一分子的任何分子，而期望該結合為標靶抗原依賴性的。本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中配位體結合部分係選自由以下所組成之群組：生長因子受體、細胞激素受體、抗原、配位體受體、酶受質、螢光標記、放射性標記或激素受體。在特定實施例中，可活化融合蛋白中所包含之配位體為細胞激素受體。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：干擾素、介白素、趨化激素、淋巴激素、單核激素 (monokines)、群落刺激因子及腫瘤壞死因子。在特定實施例中，可活化融合蛋白為選自由干擾素及介白素所組成之群組的細胞激素。在一個實施例中，細胞激素為 IL-1 家族、IL-2 亞家族、干擾素 (IFN) 亞家族或 IL-10 亞家族之成員。在一個此類實施例中，配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：BMP、CSF-1、胰島素、GLP-1、HGH、IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、GM-CSF、FGF、EGF、G-CSF、IFNα、IFNβ、IFNγ、PDGF、TGFβ、TNFα、TNFβ、VEGF 或 EPO。在另一實施例中，配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IFNα、IFNβ 及 IFNγ。在特定實施例中，細胞激素係選自由以下所組成之群組：IL-2、IL-7、IL-21 及 IFNα。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中掩蔽部分係選自由以下所組成之群組：抗體、抗體片段、單鏈抗原結合部分、肽掩蔽物、抗獨特型抗體或抗-獨特型抗體片段、能夠特異性結合至配位體之受體、蛋白質抑制劑或結合蛋白。在本發明之特定實施例中，當配位體為抗體或抗體片段時，掩蔽部分為抗獨特型抗體或抗獨特型抗體片段 (例如 scFv、VHH) 或用為配位體之抗體或抗體片段之抗原。在本發明之另一實施例中，可活化融合蛋白之特徵在於掩蔽部分為選自由 scFv、VHH 及單域抗體 (sdAb) 組成之群組的抗原結合部分。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中掩蔽部分可逆地結合至配位體 (例如細胞激素)。本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中掩蔽部分與配位體 (例如細胞激素) 之結合在空間上阻擋配位體與配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之結合。本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中掩蔽部分與配位體 (例如細胞激素) 之結合在空間上阻擋第一抗原結合部分與抗原之結合。換言之，第一抗原結合部分與標靶抗原之結合與掩蔽部分與配位體之結合在空間上競爭。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中當與單獨的第一抗原結合部分之親和力相比時，可活化融合蛋白中之第一抗原結合部分對標靶抗原之親和力降低。本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第一抗原結合部分與標靶抗原之結合自與配位體結合之掩蔽部分釋放配位體 (例如細胞激素)。本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第一抗原結合部分與標靶抗原之結合防止掩蔽部分 (重新) 結合配位體 (例如細胞激素)。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其進一步包含第二抗原結合部分。在一個實施例中，第二抗原結合域為抗體、抗體片段 (諸如 Fab、DutaFab、DAF、Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、雙功能抗體、線性抗體、由抗體片段形成之多特異性抗體、scFv、奈米抗體、VHH 或新抗原受體之可變域 (VNAR))、抗體模擬物 (諸如 DARPIN、親和體、單功能抗體 (monobody) 或抗運載蛋白)、與標靶相互作用之內源蛋白質域、工程化 TCR 或能夠與抗原特異性結合之肽。在一個特定實施例中，第二抗原結合部分包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽。在一個實施例中，可活化融合蛋白之特徵在於第二抗原結合部分為 Fab、Dutafab、DAF 或 DBA。在另一實施例中，本文所描述之可活化融合蛋白中所包含的第二抗原結合部分為單鏈抗原結合部分，較佳選自由以下所組成之群組的單鏈抗原結合部分：scFv、scFab、VHH、VNAR、域抗體 (dAb)、DARPin、親和體、單功能抗體、抗運載蛋白及單域抗體 (sdAb)。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其進一步包含 Fc 域，該 Fc 域包含第一 Fc 域重鏈多肽及第二 Fc 域重鏈多肽。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第一抗原結合部分係共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端或 C 端。在一個實施例中，掩蔽部分在其 N 端接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端或 C 端。第一抗原結合域與 Fc 域之間的融合可經由肽連接子進行，該等肽連接子亦可包含免疫球蛋白鉸鏈區 (的一部分) 或由其組成。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第一抗原結合部分之第一重鏈多肽或第一輕鏈多肽係經由其 C 端 a) 共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或 b) 共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽之 C 端。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第二抗原結合部分係共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端或 C 端。在一個實施例中，可活化融合蛋白之特徵在於第二抗原結合部分為 Fab、Dutafab、DAF 或 DBA，且第二抗原結合部分之第二重鏈多肽或第二輕鏈多肽在其 C 端係 a) 共價接附至第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或 b) 共價接附至第一或第二 Fc 域重鏈多肽之 C 端。在另一實施例中，可活化融合蛋白之特徵在於第二抗原結合部分為選自由以下所組成之群組的單鏈抗原結合部分：scFv、scFab、VNAR、域抗體 (dAb)、DARPin、親合體、單功能抗體、抗運載蛋白及單域抗體 (sdAb)、奈米抗體及 VHH。第二抗原結合域與 Fc 域之間的融合可經由肽連接子進行，該肽連接子亦可包含免疫球蛋白鉸鏈區 (的一部分) 或由其組成。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中a) 第一抗原結合部分係共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端且第二抗原結合部分係共價接附至第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或b) 第一抗原結合部分係共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽或第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端且第二抗原結合部分係共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽或第二 Fc 域重鏈多肽之 C 端。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第二抗原結合部分係經由第三肽連接子共價接附至配位體 (例如細胞激素) 之 N 端，且第三肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端或 C 端係經由第三肽連接子共價接附至配位體 (例如細胞激素) 之 N 端，第二抗原結合部分在其重鏈多肽或輕鏈多肽之 N 端處係經由第四肽連接子共價接附至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端或 C 端，且第三及第四肽連接子並不包含蛋白酶切割位點。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體 (例如細胞激素)，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體 (例如細胞激素)，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分且第二抗原結合部分包含單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體 (例如細胞激素)，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，以及c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分且第二抗原結合部分包含單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體 (例如細胞激素)，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，以及c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第二抗原結合部分能夠特異性結合至與標靶抗原相同的抗原或不同的抗原。選擇能夠特異性結合至與第一抗原結合部分相同的抗原之第二抗原結合部分在其中標靶抗原雖然在所欲靶組織中顯示特異性表現但預計不會以極高數量表現之情況下係特別有用的。選擇結合至作為第一抗原結合部分之不同抗原之第二抗原結合部分可例如在標靶抗原亦在靶組織之外的組織中表現直情況下係有用的。如果僅所欲靶組織顯示兩種抗原之表現，則組合兩種不同的標靶抗原可增加本發明之可活化融合蛋白之特異性。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第二抗原結合部分 (a) 結合至標靶抗原且 (b) 結合至標靶抗原上之抗原決定基，該抗原決定基不同於由第一抗原結合部分所結合之抗原決定基。選擇第二抗原結合部分可能係有用的，因為第二抗原結合部分不會使第一抗原結合部分結合之標靶抗原上之抗原決定基飽和，且因此第一抗原結合部分仍可接近該抗原決定基以實現配位體 (例如細胞激素) 之未掩蔽。藉由選擇與第一抗原結合部分結合相同標靶抗原上之不同抗原決定基的第二抗原結合部分，可活化融合蛋白之活化機制可在分子內而非分子間進行，條件係連接子及可活化融合蛋白中之取向允許同時結合同一抗原分子中之兩個抗原決定基。由此，本發明之可活化融合蛋白不僅可由膜結合之標靶抗原活化，且亦可由可溶性標靶抗原活化，並且可進一步展示出增強的未掩蔽。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第二抗原結合部分與第一抗原結合部分結合至標靶抗原上的相同抗原決定基。藉由選擇結合至相同抗原決定基之兩個抗原結合部分，可使可活化融合蛋白更加依賴於靶組織中標靶抗原分子之表現水準，因為若在與由第二抗原結合部分結合之標靶抗原分子足夠近的附近存在可用的另一標靶抗原分子，則配位體 (例如細胞激素) 僅能夠由第一抗原結合部分釋放。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中第一抗原結合部分為IgG類型之抗體。在本發明之特定實施例中，可活化融合蛋白之特徵在於第一抗原結合部分、第二抗原結合部分及 Fc 區一起形成 IgG 類型之抗體。在一些實施例中，可活化融合蛋白之特徵在於 Fc 域為 IgG Fc 域。在特定實施例中，可活化融合蛋白之 Fc 域為 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中其包含至少兩條全長 IgG 抗體重鏈，且其中抗原結合部分之重鏈具有 γ 型 (IgG)，特定而言具有 γ1 型。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中可活化融合蛋白包含至少兩條輕鏈且其中抗原結合部分之輕鏈係選自卡帕 (κ) 及/或拉目達 (λ) 亞型。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中標靶抗原係選自由以下所組成之群組：α-突觸核蛋白、類澱粉蛋白 β、BCMA、BTLA、CD3e、CD4、CD8、CD14、CD16 (FcgRIIIa)、CD19、CD20、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD44、CD47、CD52、CD70、CD109、CD123、CD137、CEACAM5、c-MET、CTLA4、DLL3、CXCR4、EDB-FN、EpCAM、表皮生長因子受體 (EGFR)、EPO 受體、FAPα、FGFR2、FGFR3、GD-2、GP100、GITR、GLP-1 受體、GM-CSF、GPC3、Grp78、刺蝟蛋白、HER2、HER3、HLA-G、ICAM (ICAM-1、-2、-3、-4、-5)、IGF-1R、IL-1R1、IL-4Rα、整聯蛋白 αv、b7 整聯蛋白次單元、a4b7 整聯蛋白、a4 整聯蛋白、LAG3、LIGHT、LRP1、MAdCAM、MHC、MUC1、MICA、MICB、NKG2D、NKp30、nKp46、Notch1、Notch3、NRP1、NRP2、OX40、PAR-2、PD-1、PD-L1、PDGFR、PSA、PSMA、SLAMF6、SR-A1、SR-A3、SR-A4、SR-A5、SR-A6、SR-B、dSR-C1、SR-D1、SR-E1、SR-F1、SR-F2、SR-G、SR-H1、SR-H2、SR-11、SR-J1、多配體蛋白聚醣 (Syndecan) 1、TGFβ、TGF-γ、TCR、gdTCR、TGFBR1、TGFBR2、TIM-3、TLR2、TLR3、Trap、Trop2、VAP‑1、VCAM、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 或 5T4。在本發明之特定實施例中，標靶抗原係選自由以下所組成之群組：PD1、PD‑L1、CD8 及 CD19。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中配位體為抗原結合部分。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中抗原結合部分為能夠特異性結合至選自由以下所組成之群組的抗原之抗體或抗體片段：α-突觸核蛋白、類澱粉蛋白 β、BCMA、BTLA、CD3e、CD4、CD8、CD14、CD16 (FcgRIIIa)、CD19、CD20、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD44、CD47、CD52、CD70、CD109、CD123、CD137、CEACAM5、c-MET、CTLA4、DLL3、CXCR4、EDB-FN、EpCAM、表皮生長因子受體 (EGFR)、EPO 受體、FAPα、FGFR2、FGFR3、GD-2、GP100、GITR、GLP-1 受體、GM-CSF、GPC3、Grp78、刺蝟蛋白、HER2、HER3、HLA-G、ICAM (ICAM-1、-2、-3、-4、-5)、IGF-1R、IL-1R1、IL-4Rα、整聯蛋白 αv、b7 整聯蛋白次單元、a4b7 整聯蛋白、a4 整聯蛋白、LAG3、LIGHT、LRP1、MAdCAM、MHC、MUC1、MICA、MICB、NKG2D、NKp30、nKp46、Notch1、Notch3、NRP1、NRP2、OX40、PAR-2、PD-1、PD-L1、PDGFR、PSA、PSMA、SLAMF6、SR-A1、SR-A3、SR-A4、SR-A5、SR-A6、SR-B、dSR-C1、SR-D1、SR-E1、SR-F1、SR-F2、SR-G、SR-H1、SR-H2、SR-11、SR-J1、多配體蛋白聚醣 1、TGFβ、TGF-γ、TCR、gdTCR、TGFBR1、TGFBR2、TIM-3、TLR2、TLR3、Trap、Trop2、VAP‑1、VCAM、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 或 5T4。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中抗原結合部分為能夠特異性結合至選自由以下所組成之群組的抗原之抗體或抗體片段：BCMA、CD3、CD20、CD19、CD27、CD28、CD40、CD47、CD123、CD137、CEA、CTLA4、DLL3、EpCAM、GP100、GITR、HER2、HLA-G、IL-7、犬尿胺酸酶 (kynureninase)、MICA、MICB、OX40、PD-L1、PD-1、TGFBR2 之胞外域、TNF 或 VEGF-C。在本發明之特定實施例中，標靶抗原選自由 PD1、PD-L1、CD8 及 CD19 所組成之群組。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其中配位體為選自由以下所組成之群組的非細胞激素配位體：生長因子、趨化激素、抗體、抗體片段、酶、受體配位體、親和力肽配位體、肽激素、受體激動劑、受體拮抗劑、酶、可溶性受體、蛋白質毒素、可溶性配位體、細胞表面受體之胞外區、細胞表面配位體之胞外區、小分子或其任何組合。
本發明提供了一種經分離的核酸，其編碼如本文所描述之可活化融合蛋白。
本發明提供一種包含該等核酸的宿主細胞。
本發明提供了一種產生本文所描述之可活化融合蛋白之活體外方法，其包含在適合於表現如本文所描述之可活化融合蛋白之條件下培養宿主細胞。在特定實施例中，該方法進一步包含自宿主細胞回收抗體。
本發明提供了一種藉由此方法產生的可活化融合蛋白。
本發明提供了一種醫藥組成物，其包含如本文所描述之可活化融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
本發明提供了一種如本文所描述之可活化融合蛋白或醫藥組成物，其用為藥物。
本發明提供了一種如本文所描述之可活化融合蛋白或如本文所描述之醫藥組成物，其使用於治療癌症、病毒感染或自體免疫疾病。
本發明提供了一種如本文所描述之可活化融合蛋白或如本文所描述之醫藥組成物在製備藥物中之用途。在一個實施例中，藥物係用於治療癌症、病毒感染或自體免疫疾病。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其包含 (A) 能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽之第一抗原結合部分，(B) 包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽之第二抗原結合部分，(C) 能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之配位體 (例如細胞激素)，以及 (D) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至配位體之單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽，其中第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其包含 (A) 能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽之第一抗原結合部分，(B) 包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽之第二抗原結合部分，(C) 能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之配位體 (例如細胞激素)，以及 (D) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至配位體之單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽，其中第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其包含 (A) 能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽之第一抗原結合部分，(B) 第二抗原結合部分，(C) 能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之配位體 (例如細胞激素)，以及 (D) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至配位體之單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，以及c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，其中第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其包含 (A) 能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽之第一抗原結合部分，(B) 第二抗原結合部分，(C) 能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之配位體 (例如細胞激素)，以及 (D) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至配位體之單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，以及c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，其中第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本發明進一步提供了結合至 IL-2 或其變異體之抗體。已發現本發明之抗體不僅結合至人類 IL-2 且亦結合至 IL-2v，其為具有消除的 CD25 (IL-2Rα) 結合之人類IL-2之減弱的變異體。本文所揭示之抗 IL-2 抗體至少與 IL-2Rβ 競爭 IL-2/IL-2v 結合。藉由中斷與高親和力受體 IL-2Rβ (而非低親和力受體 IL-2Rγ) 之相互作用來掩蔽 IL-2，因此它們能夠藉由不允許與細胞表面之顯著結合來減少標靶介導之藥物處置 (TMDD)—由於它們不會透過 IL-2Rβ 聚集，因此不會增加局部濃度—亦增加了 IL-2 掩蔽效率。在本發明之一些實施例中，本文所揭示之抗 IL-2 抗體不僅藉由與 IL-2Rβγ 競爭 IL-2 結合來阻斷 IL-2 與 IL-2Rβγ 之結合，且亦令人驚訝地同時阻止 IL-2 與 IL-2Rα (CD25) 之結合。此類抗 IL-2 抗體展現出有效的 IL-2Rα 競爭性結合，作為 IL-2 分子之掩蔽係極有用的，因為它們完全消除了IL-2活性，使得野生型 IL-2 可用於治療而非減弱的變異體，諸如 IL-2v。此為一個優點，因為引入胺基酸取代來減弱細胞激素具有增加患者之免疫原性的風險。在本文所描述之可活化融合蛋白之上下文中，本文所揭示之抗 IL-2 抗體當用為 IL-2 之掩蔽部分時，一旦 IL-2 被釋放，即具有與細胞表面上之 IL-2Rα 結合之能力，從而有助於可活化融合蛋白之整體腫瘤靶向。在腫瘤治療之上下文中，與 IL-2Rα 結合之抗 IL2 抗體可能會有所幫助，因為它可阻止 IL-2Rα 與 Tregs 及 Bregs 結合。此外，由於 IL-2Rα 為一種高親和力受體，掩蔽它可能會藉由減少 TMDD 而產生積極影響，該 TMDD 為藥物與其藥理學標靶結合至影響其藥物動力學特徵之機制。
本發明之一個實施例為一種結合至 IL-2 或其變異體之抗體，其中該抗體結合至在 SEQ ID NO:81 之胺基酸殘基 8 至 17、胺基酸殘基 30 及/或胺基酸殘基 77 至 81 內的 IL-2 之抗原決定基；且因此抑制 IL-2 與 IL-2Rβγ 及與 IL-2Rα 之結合。在一個實施例中，抗原決定基包含對應於 SEQ ID NO:81 之 K8、Q13、E15、H16、N30、N77、H79 及 R81 之胺基酸殘基；且因此抗 IL2 抗體與 IL-2 之結合抑制 IL-2 與 IL-2Rβγ 及 IL-2Rα 之結合。
本發明之一個實施例為一種結合至 IL-2 或其變異體之抗體，其中該抗體包含(A) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(B) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(C) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(D) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(E) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(F) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(G) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(H) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(I) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；或(J) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3。
本發明之一個實施例為一種抗體，其包含(A) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(B) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(C) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(D) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(E) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(F) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(G) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(H) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(I) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；或(J) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3。
在本發明之一個特定實施例中，該抗體包含(A) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(B) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(C) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(D) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(E) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(F) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(G) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；或(F) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3。
在本發明之另一特定實施例中，抗體包含重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的CDR-H1，(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的CDR-H2，及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1，(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2，及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3。
在本發明之一個實施例中，抗體為單株抗體。在一個實施例中，抗體為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。在特定實施例中，抗體為結合 IL-2 或其變異體之抗體片段。
本發明之一個實施例為一種抗體，其包含(A) SEQ ID NO:7 之 VH 序列及 SEQ ID NO:8 之 VL 序列；(B) SEQ ID NO:12 之 VH 序列及 SEQ ID NO:13 之 VL 序列；(C) SEQ ID NO:18 之 VH 序列及 SEQ ID NO:19 之 VL 序列；(D) SEQ ID NO:24 之 VH 序列及 SEQ ID NO:25 之 VL 序列；(E) SEQ ID NO:30 之 VH 序列及 SEQ ID NO:31 之 VL 序列；(F) SEQ ID NO:35 之 VH 序列及 SEQ ID NO:36 之 VL 序列；(G) SEQ ID NO:38 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 39 之 VL 序列；(H) SEQ ID NO:41 之 VH 序列及 SEQ ID NO:42 之 VL 序列；(I) SEQ ID NO:44 之 VH 序列及 SEQ ID NO:45 之 VL 序列；或(J) SEQ ID NO:47 之 VH 序列及 SEQ ID NO:48 之 VL 序列。
在本發明之一個實施例中，特異性結合至 IL-2 或其變異體之抗體包含(A) SEQ ID NO:7 之 VH 序列及 SEQ ID NO:8 之 VL 序列；(B) SEQ ID NO:12 之 VH 序列及 SEQ ID NO:13 之 VL 序列；(C) SEQ ID NO:18 之 VH 序列及 SEQ ID NO:19 之 VL 序列；(D) SEQ ID NO:24 之 VH 序列及 SEQ ID NO:25 之 VL 序列；(E) SEQ ID NO:30 之 VH 序列及 SEQ ID NO:31 之 VL 序列；(F) SEQ ID NO:35 之 VH 序列及 SEQ ID NO:36 之 VL 序列；(G) SEQ ID NO:38 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 39 之 VL 序列；(H) SEQ ID NO:41 之 VH 序列及 SEQ ID NO:42 之 VL 序列；(I) SEQ ID NO:44 之 VH 序列及 SEQ ID NO:45 之 VL 序列；或(J) SEQ ID NO:47 之 VH 序列及 SEQ ID NO:48 之 VL 序列。
在本發明之特定實施例中，抗體包含(A) SEQ ID NO:18 之 VH 序列及 SEQ ID NO:19 之 VL 序列；(B) SEQ ID NO:24 之 VH 序列及 SEQ ID NO:25 之 VL 序列；(C) SEQ ID NO:30 之 VH 序列及 SEQ ID NO:31 之 VL 序列；(D) SEQ ID NO:35 之 VH 序列及 SEQ ID NO:36 之 VL 序列；(E) SEQ ID NO:38 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 39 之 VL 序列；(F) SEQ ID NO:41 之 VH 序列及 SEQ ID NO:42 之 VL 序列；(G) SEQ ID NO:44 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 45 之 VL 序列；或(H) SEQ ID NO:47 之 VH 序列及 SEQ ID NO:48 之 VL 序列。
在本發明之另一特定實施例中，抗體包含 SEQ ID NO:47 之 VH 序列及 SEQ ID NO:48 之 VL 序列。
在本發明之一個實施例中，抗體為全長 IgG1 抗體或 Fab。
在一個實施例中，如藉由 SPR 測定法量測的，抗體以 ≤ 125 nM 之親和力結合 IL-2，或以 ≤ 15,4 nM 之親和力結合 IL-2v。
在一個實施例中，如藉由 SPR 測定法量測的，抗體以 ≤ 1,5 nM 之親和力結合 IL-2，或以 ≤ 0,9 nM 之親和力結合 IL-2v。
在一個實施例中，抗體為多特異性抗體。
在一個實施例中，抗體為 Fab 且包含(A) 含有 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:50 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(B) 含有 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(C) 含有 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(D) 含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(E) 含有 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(F) 含有 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(G) 含有 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(H) 含有 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(I) 含有 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列的輕鏈多肽；或(J) 含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽。
在一個特定實施例中，抗體為 Fab 且包含(A) 含有 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(B) 含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(C) 含有 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(D) 含有 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(E) 含有 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(F) 含有 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(G) 含有 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列的輕鏈多肽；或(H) 含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽。
在另一特定實施例中，抗體為 Fab 且包含含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽。
在一個實施例中，抗體為全長抗體且包含(A) 含有 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:50 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(B) 含有 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(C) 含有 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(D) 含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(E) 含有 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(F) 含有 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(G) 含有 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(H) 含有 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(I) 含有 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列的輕鏈多肽；或(J) 含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽，且其中抗體進一步包含人類 Fc 區，該人類 Fc 區包含選自由以下所組成之群組的兩種人類 Fc 區多肽：SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72.SEQ ID NO:73、SEQ ID NO74: 及 SEQ ID NO:75。
在一個特定實施例中，作為全長抗體之抗體包含(A) 含有 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(B) 含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(C) 含有 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(D) 含有 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(E) 含有 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(F) 含有 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(G) 含有 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列的輕鏈多肽；或(H) 含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽，且進一步包含人類 Fc 區，該人類 Fc 區包含選自由以下所組成之群組的兩種人類 Fc 區多肽：SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72.SEQ ID NO:73、SEQ ID NO74: 及 SEQ ID NO:75。
在另一特定實施例中，作為全長抗體之抗體包含含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽，且進一步包含人類 Fc 區，該人類 Fc 區包含選自由以下所組成之群組的兩種人類 Fc 區多肽：SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72.SEQ ID NO:73、SEQ ID NO74: 及 SEQ ID NO:75。
本發明之一個實施例為一種抗體，其與如實施例 58 至 72 中任一項之抗體競爭結合 IL-2 或其變異體。
本發明之一個實施例為一種經分離的核酸，其編碼本文所描述之抗體。本發明之一個實施例為一種宿主細胞，其包含編碼本文所描述之抗體之核酸。本發明之一個實施例為一種產生與 IL‑2 或其變異體結合之抗體的方法，其包含在適合於表現該抗體之條件下培養該宿主細胞。在一個實施例中，該方法進一步包含自宿主細胞回收抗體。本發明之一個實施例為一種藉由該方法產生之抗體。
本發明之一個實施例為一種醫藥組成物，其包含如本文所描述之抗體及醫藥上可接受之載劑。
本發明之一個實施例為一種如本文所描述之抗 IL-2 抗體或如本文所描述之醫藥組成物，其用為藥物。
本發明之一個實施例為一種如本文所描述之抗 IL-2 抗體或如本文所描述之醫藥組成物，其使用於治療癌症、病毒感染或自體免疫疾病。
本發明之一個實施例為一種如本文所描述之抗體或如本文所描述之醫藥組成物在製造用於癌症、病毒感染或自體免疫疾病之藥物中之用途。
本發明之一個實施例為一種治療患有癌症、病毒感染或自體免疫疾病之個體的方法，其包含向個體投予有效量的如本文所描述之抗體或如本文所描述之醫藥組成物。在一個實施例中，該方法進一步包含向個體投予另外的治療劑。在一個實施例中，另外的治療劑係選自由以下所組成之群組：抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑或抗血管發生劑。
本發明之一個實施例為一種本文所描述之抗 IL-2 抗體作為 IL-2、IL-2v 或其變異體之掩蔽抗體的用途。本發明之一個實施例為一種本文所描述之抗 IL-2 抗體作為本文所描述之可活化融合蛋白中之掩蔽部分的用途。
I. 定義
除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。本揭露之方法及技術通常按照本領域所熟知之習用方法來進行。通常，除非本文另有定義，否則與本文所描述之生物化學、酶學、分子與細胞生物學、微生物學、遺傳學以及蛋白質與核酸化學及雜交相關之命名法及技術為此項技術中熟知且慣常使用之彼等。
除非本文另外定義，否則術語「包含」應包括術語「由...組成」。
如本文所用之與具體值 (例如，溫度、濃度、時間等) 關聯使用的術語「約」應指代該術語「約」所指代之具體值的 +/- 1% 之變更。
如本文所用，術語「可活化」係指配位體 (例如細胞激素) (其為本文所描述之融合蛋白之一部分) 在存在以下條件時結合配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之能力：與融合蛋白緊密接近之標靶抗原，特定而言以第一抗原結合部分結合至標靶抗原結合為條件。
「親和力」係指分子 (例如抗體、配位體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原、配位體結合部分) 之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (KD) 來表示。可以藉由本領域已知的習知方法量測親和力，包括彼等本文所述之方法。下面描述了用於測量結合親和力的具體說明性和例示性方法。
如本文所用，術語「抗原」係指多肽大分子上之位點，抗原結合部分與該位點結合，形成抗原結合部分-抗原複合物。例如，有用的抗原可存在於例如腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、免疫細胞之表面上，不存在於血清中，及/或存在於細胞外基質 (ECM) 中。除非另有指示，否則本文稱為抗原之蛋白質 (例如 α-突觸核蛋白、類澱粉蛋白 β、BCMA、BTLA、CD3e、CD4、CD8、CD14、CD16 (FcgRIIIa)、CD19、CD20、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD44、CD47、CD52、CD70、CD109、CD123、CD137、CEACAM5、c-MET、CTLA4、DLL3、CXCR4、EDB-FN、EpCAM、表皮生長因子受體 (EGFR)、EPO 受體、FAPα、FGFR2、FGFR3、GD-2、GP100、GITR、GLP-1 受體、GM-CSF、GPC3、Grp78、刺蝟蛋白、HER2、HER3、HLA-G、ICAM (ICAM-1、-2、-3、-4、-5)、IGF-1R、IL-1R1、IL-4Rα、整聯蛋白 αv、b7 整聯蛋白次單元、a4b7 整聯蛋白、a4 整聯蛋白、LAG3、LIGHT、LRP1、MAdCAM、MHC、MUC1、MICA、MICB、NKG2D、NKp30、nKp46、Notch1、Notch3、NRP1、NRP2、OX40、PAR-2、PD-1、PD-L1、PDGFR、PSA、PSMA、SLAMF6、SR-A1、SR-A3、SR-A4、SR-A5、SR-A6、SR-B、dSR-C1、SR-D1、SR-E1、SR-F1、SR-F2、SR-G、SR-H1、SR-H2、SR-11、SR-J1、多配體蛋白聚醣 1、TGFβ、TGF-γ、TCR、gdTCR、TGFBR1、TGFBR2、TIM-3、TLR2、TLR3、Trap、Trop2、VAP‑1、VCAM、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 或 5T4) 可為來自任何脊椎動物來源 (包括哺乳動物諸如靈長類動物 (例如人類) 及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠))之蛋白質之任何天然形式。抗原亦可為帶有一或多個胺基酸取代之天然存在之多肽的變異體。在特定實施例中，該抗原為人蛋白質。
如本文所用，術語「抗原結合部分」或「抗原結合域」係指特異性結合至抗原決定位之多肽分子。抗原結合部分包括如本文進一步定義的抗體及其片段。在一個實施例中，抗原結合部分包含重鏈及輕鏈。在某些實施例中，重鏈及輕鏈經由肽連接子融合。在一些實施例中，抗原結合部分包含兩條多肽鏈。本文所描述之可活化融合蛋白之特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包含如本文進一步定義及此項技術中已知之至少一個抗體恆定區中之全部或一部分。可用之重鏈恆定區包括五種同型 (isotype) 中之任一者：α、δ、ε、γ 或 μ。可用之輕鏈恆定區包括二種同型中之任一者：κ 及 λ。在一些實施例中，抗原結合部分為單鏈抗原結合部分，諸如scFv、scFab、VHH、VNAR、域抗體 (dAb) 或單域抗體 (sdAb)。在一些實施例中，單鏈抗原結合部分為抗體模擬物，諸如DARPin、單功能抗體、親和體或抗運載蛋白。
如本文所用，關於抗原結合部分、肽連接子、Fab片段等等之術語「第一」及「第二」為當各類型之部分 (例如在單一融合蛋白內) 存在多於一個時用於方便區分。除非明確說明，否則使用此等術語並非旨在賦予雙特異性抗原結合分子特定之順序或方向。
術語「抗標靶抗原 (TA) 抗原結合部分」及「結合至標靶抗原 (TA) 之抗原結合部分」係指能夠以足夠的親和力特異性結合標靶抗原 (TA) 之抗原結合部分，使得抗原結合部分可用為靶向 TA 之診斷劑及/或治療劑。在一個態樣中，抗 TA 抗原結合部分與無關的非 TA 蛋白之結合程度小於抗原結合部分與 TA 結合的約 10%，如例如藉由表面電漿子共振 (SPR) 量測的。在某些態樣中，與 TA 結合之抗原結合部分具有 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如，10-8M或更小，例如 10-8M 至 10-13M，例如 10-9M 至 10-13M) 之解離常數 (KD)。當抗原結合部分具有 1 μM 或更小之 KD時，稱該抗原結合部分與 TA「特異性結合」。在某些態樣中，抗 TA 抗原結合部分結合至標靶抗原之抗原決定基，該抗原決定基在不同物種之標靶抗原中係保守的。
本文中之術語「抗體」係以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要它們展現出所欲抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括 (但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；從抗體片段所形成之雙功能抗體、線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 scFv 及 scFab)；單域抗體 (dAb)；及多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Holliger 及 Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
術語「抗原決定基」表示與抗原結合部分或任何其他抗原結合部分結合之蛋白質或非蛋白質抗原上之位點。抗原決定基可由連續的胺基酸延伸段形成 (線性抗原決定基) 或包含非連續的胺基酸 (構形抗原決定基)，例如，由於抗原的折疊、亦即藉由蛋白抗原的三級折疊而在空間上接近。線性抗原決定基通常在蛋白抗原暴露於變性劑後仍與抗原結合部分結合，而構形抗原決定基通常在用變性劑處理後被破壞。在獨特空間構象中，抗原決定基包含至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個或 8 個至 10 個胺基酸。
競爭性結合可用於容易地確定抗原結合部分是否與參考抗 TA 抗原結合部分結合至標靶抗原 (TA) 之相同抗原決定基，或與參考抗 TA 抗原結合部分競爭結合。舉例而言，作為參考抗 TA 抗原結合部分之「結合至相同抗原決定基之抗原結合部分」係指抗原結合部分在競爭測定中阻斷參考抗 TA 抗原結合部分與其抗原之結合 50% 或更多，且相反地，參考抗原結合部分在競爭測定中阻斷抗原結合部分與其抗原之結合 50% 或更多。亦舉例而言，為了確定抗原結合分子是否與參考抗 TA 抗原結合部分結合至相同的抗原決定基，使參考抗原結合部分在飽和條件下結合至 TA。在移除過量的參考抗 TA 抗原結合部分後，評定所討論的抗 TA 抗原結合部分結合至 TA 之能力。若抗 TA 抗原結合部分在參考抗 TA 抗原結合部分之飽和結合後能夠結合至 TA，則可得出結論，所討論的抗 TA 抗原結合部分結合至與參考抗 TA 抗原結合部分不同的抗原決定基。但是，若所討論的抗 TA 抗原結合部分在參考抗 TA 抗原結合部分之飽和結合後不能結合至 TA，則所討論的抗 TA 抗原結合部分可結合至與由參考抗 TA 抗原結合部分結合之抗原決定基相同的抗原決定基。為了確認所討論之抗原結合部分是否結合至相同的抗原決定基，或者僅由於立體原因而阻礙了結合，可使用常規實驗 (例如，使用 ELISA、RIA、表面電漿共振、流式細胞分析技術或此項技術中可獲得的任何其他定量或定性的抗體結合測定進行肽突變及結合分析)。此測定應分兩次設置進行，即以兩種抗體為飽和抗體。若在兩種設定中，僅第一 (飽和) 抗體能夠特異性結合至 TA，則可斷定所討論之抗 TA 抗體與參考抗 TA 抗體競爭結合至 TA。
在一些態樣中，如果一個抗體的 1 倍、5 倍、10 倍、20 倍或 100 倍的過量抑制另一抗體的結合至少 50%、至少 75%、至少 90% 或甚至 99% 或更多 (藉由競爭性結合測定量測)，則認為兩個抗體與相同或重疊的抗原決定基結合 (參見例如 Junghans 等人，Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502)。
在一些態樣中，如果抗原中之降低或消除一種抗體之結合的基本上全部胺基酸突變亦降低或消除另一種抗體之結合，則認為兩種抗體與相同抗原決定基結合。如果只有減少或消除一個抗體結合的胺基酸突變的次集合 (subset) 減少或消除另一抗體的結合，則認為兩種抗體具有「重疊抗原決定基 (overlapping epitope)」。
如本文所用，術語「CISS」意謂「競爭性相互作用空間轉換」，本文所描述之條件性可活化分子之作用模式，其依賴於多肽複合物內至少配位體 (例如細胞激素)、掩蔽部分及抗原結合部分之特定排列，使得配位體之狀態取決於標靶抗原之存在而被遮蔽或未掩蔽。術語「CISS 分子」在本文中用為術語「可活化融合蛋白」之簡寫且可與術語「可活化融合蛋白」互換。其係指包含本文所描述之至少配位體、掩蔽部分及抗原結合部分之排列的任何分子，使得配位體之遮蔽及去掩蔽取決於標靶抗原之存在。「CISS Fab」或「CISS Fab 分子」係指基本上由作為抗原結合部分之 Fab 組成的 CISS 分子，配位體及掩蔽部分均係經由肽連接子共價接附至 Fab。連接子及掩蔽部分較佳係共價接附至此類 CISS 分子中 Fab 重鏈及輕鏈之 N 端。如本文所用，術語「CISS 分子」係指包含將 CISS 功能傳遞至整個分子之 CISS Fab 之任何分子。CISS 分子可包含其他多肽域，諸如 Fc 域、其他 Fab 域、抗體片段或其他多肽，諸如細胞激素。
「靶向的 CISS 分子」係指包含配位體 (例如細胞激素)、掩蔽部分及抗原結合部分之 CISS 型排列以及至少一個另外的抗原結合部分之 CISS 分子，該至少一個另外的抗原結合部分結合至與 CISS 模組之抗原結合部分相同的抗原或不同的抗原，從而有助於將 CISS 分子靶向所欲靶組織/分子。靶向的 CISS 分子可包含另外的多肽域，諸如 Fc 域。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且該等種類中之若干種可進一步分為亞類 (同型)，例如 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及 IgA2。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG1同型。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG1同型，具有 P329G、L234A 及 L235A 突變以減少 Fc 區效應子功能。在其他態樣中，該抗體是屬 IgG2同型。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG4同型，在鉸鏈區中具有 S228P 突變以改善 IgG4抗體之穩定性。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
術語「共價接附」或「融合」在本文中可互換使用。如本文所用，「(共價) 接附至多肽之 N 端」意謂部分經由在該多肽之 N 端處或附近的共價鍵連接至多肽。在一個特定態樣中，該等部分 (例如 Fab 及 Fc 域) 藉由一個部分之 C 端 (亦即，多肽鏈之 C 端端部處的遊離羧基基團) 與 另一部分之 N 端 (亦即，多肽鏈之 N 端端部處的遊離胺基基團) 之間的肽鍵連接，要麼藉由羧基基團與胺基基團之間的醯胺連接或經由一或多個肽連接子連接。在另一態樣中，一個部分經由多肽之胺基酸側鏈連接至該多肽。可活化融合分子之各個域之間的融合可經由肽連接子進行，肽連接子亦可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)或由其組成，特定而言當 Fab 作為 (第一及/或第二) 抗原結合域融合至 Fc 域時。
如本文所用，術語「細胞激素」係指在約 5 kDa 至 20 kDa 範圍內的較小分泌的調控蛋白，其對於細胞傳訊至關重要，特別是在免疫系統內。細胞激素特別包括分子諸如趨化激素、干擾素、介白素、淋巴激素、腫瘤壞死因子、單核激素及群落刺激因子，且由一系列細胞類型包括 (但不限於) 免疫細胞 (巨噬細胞、B 及 T 淋巴球、肥大細胞、單核球)，以及非免疫細胞 (內皮細胞、纖維母細胞、間質細胞) 產生。細胞激素調控對發炎及感染之免疫反應且調節各種細胞功能，諸如存活、生長及基因表現，並且可分類為促發炎細胞激素及抗發炎細胞激素。一些細胞激素亦能夠動員免疫系統對抗癌症。細胞激素透過特異性受體發揮作用，在平衡體液及細胞免疫反應以及調控細胞群體之成熟、生長及反應性方面發揮關鍵作用。本文中之細胞激素可為天然存在的 (例如具有野生型序列) 或攜帶特定突變以改變它們的功能、活性或特異性。與細胞激素匹配之細胞表面受體在本文中亦稱為「細胞激素受體」。細胞激素與細胞激素受體之結合可能觸發細胞內傳訊之級聯，從而可改變細胞功能，包括基因或轉錄因子之上調及/或下調，導致其他細胞激素之產生或其他分子之表面受體數目的增加。細胞激素家族之實例包括骨形態演發蛋白 (BMP)、趨化激素配位體 (CCL)、C-X-C 模體配位體 (CXCL)、生長/分化因子 (GDF)、生長激素、干擾素 (IFN)、介白素 (IL) 及腫瘤壞死因子 (TNF)。特定而言，介白素係由 CD4 輔助 T 細胞、單核球、巨噬細胞及內皮細胞合成，且它們促進 T 及 B 淋巴球以及血胚細胞之發育及分化。在本文所揭示的本發明之特定態樣中，細胞激素可為介白素或干擾素。在一個態樣中，細胞激素可為 IL‑1 家族或 IL-2 亞家族、干擾素 (IFN) 亞家族或 IL-10 亞家族之成員。
「效應功能 (effector function)」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合和補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體 (例如 B 細胞受體) 的下調；以及 B 細胞活化。
藥劑例如醫藥組成物的「治療有效量」係指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
術語「Fc 區」、「Fc」、「Fc 片段」及「Fc 域」在本文中可互換使用且涉及含有恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈之 C 端區。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異體 Fc 區域。在一個態樣中，人 IgG 重鏈 Fc 區從 Cys226 或從 Pro230 延伸至重鏈的羧基端。但是，由宿主細胞產生的抗體可能經歷重鏈 C 端的一種或多種，特別是一種或兩種胺基酸之轉譯後切割。因此，由宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈的特異性核酸分子所產生之抗體可包括該全長重鏈，或者可包括該全長重鏈的經切割之變異體。重鏈的最後兩個 C 端胺基酸為甘胺酸 (G446) 及離胺酸 (K447，EU 編號系統)。因此，可以存在或可以不存在 Fc 區域之 C 端離胺酸 (Lys447) 或 C 端甘胺酸 (Gly446) 及離胺酸 (Lys447)。通常，Fc 區包含兩種重鏈多肽。除非另有說明，否則包括 Fc 區域之重鏈之胺基酸序列在本文中表示不含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽。在一個態樣中，包含在根據本發明之抗體中的包括如本文所指明之 Fc 區的重鏈包含另外的 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，EU 編號系統)。在一個態樣中，包含在根據本發明之抗體中的包括如本文所指明之 Fc 區的重鏈包含另外的 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 EU 索引編號)。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (另見上文)。具有及不具有胺基酸修飾之 Fc 區之例示性序列顯示於表 D 中 (SEQ ID NO:69 – 75)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有包含本文所定義之 Fc 區域的重鏈之抗體。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指包含兩個或更多個，特定而言三個或更多部分之融合多肽分子，其中融合蛋白之組分直接或透過肽連接子彼此連接。本文所揭示之融合蛋白之一或多個部分可為包含兩條或更多條多肽鏈之抗體或抗體片段。為清楚起見，如本文所描述之「融合蛋白」亦包含含有多於一條多肽鏈之融合蛋白複合物，其中至少一條多肽鏈為包含直接或透過肽連接子彼此連接之兩個或更多個部分的融合多肽。舉例而言，如本文所描述之「融合蛋白」亦可為 IgG 類型抗體，其中配位體 (例如細胞激素) 及掩蔽部分係經由肽連接子分別共價接附至該 IgG 類型抗體之兩個 Fab 臂中之一者的重鏈及輕鏈之 N 端。在如本文所用之融合蛋白之此實例中，四條多肽鏈中僅兩條包含融合的部分。為清楚起見，融合蛋白之抗體或抗體片段部分的個別肽鏈可非共價地，例如藉由二硫鍵彼此連接。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」和「宿主細胞培養物」可互換使用，係指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 CDR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些態樣中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變並決定抗原結合特異性的各個區域，例如「互補決定區」(「CDR」)。
通常，抗體包括六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，及三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括：(a) 高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk，J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))；(b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及 95-102 (H3)處 (Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；及(c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996))。
除非另有說明，否則 CDR 根據 Kabat 等人在上述文獻中描述之方法來判定。本領域之技術人員將理解，也可以根據 Chothia在上述文獻、McCallum在上述文獻中描述之方法或任何其他科學上接受之命名系統來判定 CDR 名稱。
除非另有指示，否則如本文所用，術語「介白素-2」或「IL-2」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然 IL-2，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒動物 (例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未處理之 IL-2 以及在細胞處理中得到的任何形式的 IL-2。該術語亦涵蓋天然存在之 IL-2 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人 IL-2 之胺基酸序列如 SEQ ID NO: 81 中所示。未經處理之人 IL-2 還包含 N 端 20 胺基酸訊號肽，其具有 SEQ ID NO: 83 之序列，該序列不存在於成熟 IL-2 分子中。當提及「全長」IL-2 時，是指成熟的自然長度的 IL-2 分子。例如，全長度人 IL-2 係指具有 133 個胺基酸的分子 (參見例如 SEQ ID NO: 81)。
如本文所用，「野生型」形式的 IL-2 係與突變型 IL-2 多肽相同的 IL-2 形式，區別僅在於野生型形式在突變型 IL-2 多肽的每個胺基酸位置處均具有野生型胺基酸。例如，如果 IL-2 突變體是全長 IL-2 (即未與任何其他分子融合或共軛的 IL-2)，則該突變體的野生型形式是全長的天然 IL-2。如果 IL-2 突變體是 IL-2 和 IL-2 下游編碼的另一種多肽 (例如，抗體鏈) 之間的融合體，則該 IL-2 突變體的野生型形式是具有野生型胺基酸序列，與相同的下游多肽融合的 IL-2。此外，如果 IL-2 突變為截短形式的 IL-2 (IL-2 的非截短部分內的突變或修飾序列)，則野生型形式的該 IL-2 突變為具有野生型序列的類似的截短 IL-2。為比較各種形式之 IL-2 突變型與對應的野生型形式之 IL-2 的 IL-2 受體結合親和力或生物活性之目的，術語野生型涵蓋包含相較於自然發生的天然 IL-2 並不影響 IL-2 受體結合的一個或多個胺基酸突變的 IL-2 形式，例如在對應於人類 IL-2 的殘基 125 位置處之半胱胺酸取代為丙胺酸。
如本文所用之術語「IL-2 突變」或「突變型 IL-2 多肽」旨在涵蓋任意突變形式之 IL-2 分子，包括全長 IL-2、截短形式之 IL-2 及其中 IL-2 藉由融合或化學結合連接至另一個分子的形式。各種形式之 IL-2 突變的特徵在於具有至少一個影響 IL-2 與 CD25 之交互作用的胺基酸突變。該突變可涉及通常位於該位置的野生型胺基酸殘基的取代、缺失、截短或修飾。藉由胺基酸取代獲得之突變係較佳的。除非另有指示，否則 IL-2 突變在本文中可稱為突變型 IL-2 肽序列、突變型 IL-2 多肽、突變型 IL-2 蛋白質或突變型 IL‑2 類似物。本文中所指的各種形式的 IL-2 係關於 SEQ ID NO: 81 所示的序列。本文可使用各種名稱指示同一突變。例如，位置 42 處之苯丙胺酸突變為丙胺酸可表示為 42A、A42、A42、L42A 或 Phe42Ala。
在一些實施例中，用於本發明之目的的野生型 IL-2 包含胺基酸取代 C125A。
如本文所用，術語「IL-2 變異體」、「IL-2v」或「介白素-2v」係指具有廢除的 CD25 結合之介白素-2 變異體。雖然存在具有廢除的 CD25 結合之不同 IL‑2 變異體，但本文指定之 IL-2v 變異體具有SEQ ID NO: 82，其中胺基酸交換為 T3A、F42A、Y45A、L72G、C125A，且在本文中之實例中係常用的。
除非另有指示，否則術語「CD25」、「IL-2 受體之 α-次單元」、「IL-2 受體之 α-次單元」、「IL-2Rα」或「IL-2Ra」在本文中可互換使用且係指來自任何脊椎動物來源之任何天然 CD25，該脊椎動物來源包括哺乳動物諸如靈長類動物 (例如人類) 及囓齒動物 (例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 CD25 以及在細胞處理中得到之任何形式的 CD25。該術語亦涵蓋天然存在之 CD25 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。在某些實施例中，CD25 係人 CD25。例示性人類 CD25 (具有訊號序列，Avi-tag 及 His-tag) 之胺基酸序列示於 SEQ ID NO: 85 中且例如在 UniProt 條目編號P01589 (版本 185) 中發現。
如本文所用，術語「IL-2Rβγ」或「IL-2Rbg」係指 IL-2 受體之異二聚體形式，由受體 γ-次單元 (亦稱為常見細胞激素受體 γ-次單元、γc 或 CD132，且在本文中亦稱為「IL-2Rγ」) 及受體 β-次單元 (亦稱為 CD122 或 p70，且在本文中亦稱為「IL-2Rβ」) 組成 (有關評論，參見例如Olejniczak 及 Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008))。IL-2 可作為淋巴球生長及刺激因子，經由活化異二聚體 IL-2 受體複合物或進一步包括 IL-2Rα (CD25) 之異三聚體 IL-2 受體複合物進行傳訊來起作用。
「受試者」或「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物 (例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物 (例如，人類及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如，小鼠及大鼠)。在某些態樣中，個體或個體為人類。
「分離的」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在一些態樣中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 方法測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人，J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。
術語「掩蔽的」係指經空間阻擋而無法結合至靶序列之多肽域，例如抗體之抗原結合域，或經空間阻擋而無法結合至配位體結合部分 (例如其各別的細胞激素受體) 之配位體。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。各核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (亦即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (亦即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子係藉由鹼基之序列來描述，其中該等鹼基表示核酸分子之一級結構 (線性結構)。鹼基之序列通常由 5' 至 3' 表示。在本文中，術語核酸分子包括：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 及基因組 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。此外，術語核酸分子包括正義股及反義股，以及單股形式及雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸之實例包括帶有經衍生之糖或磷酸主鏈鍵聯或經化學修飾之殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋DNA 及RNA 分子，該等分子適於作為在活體外及/或活體內、例如在宿主或患者內直接表現本發明之抗體的載體。此類 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可為未修飾的或經修飾的。例如，mRNA 可經化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或所編碼之分子的表現，使得 mRNA可被注射入個體體內以在活體內生成抗體 (參見，例如，Stadler 等人，Nature Medicine 2017，於 2017 年 6 月 12 日在線上發表，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。經分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗 TA 抗體之經分離的核酸」係指編碼抗 TA 抗體重鏈及輕鏈 (或其片段) 之一或多種核酸分子，包括在單一載體或單獨載體中之此類核酸分子，並且此類核酸分子存在於宿主細胞中之一或多個位置處。
如本文所用，如本文所用之術語「配位體」係指能夠特異性結合至另一多肽分子 (例如細胞激素受體) 之一或多個特異性位點之分子 (例如細胞激素)，其在本文中稱為「配位體結合部分」。在一個態樣中，配位體可為生長因子、細胞激素、趨化激素、抗體、抗體片段、酶、受體配位體、親和力肽配位體、肽激素、受體激動劑、受體拮抗劑、酶、可溶性受體、蛋白質毒素、可溶性配位體、細胞表面受體之胞外區、細胞表面配位體之胞外區、小分子或其任何組合，較佳地細胞激素。
例如，在配位體結合中，配位體通常為訊號觸發分子，其結合至靶蛋白上之位點。此種結合可能導致蛋白質構象 (或形狀) 及/或功能之變化，從而影響生物過程。
如本文所用，術語「配位體結合部分」係指包含能夠由配位體結合之一或多個特異性位點之分子，特定而言多肽分子。在一個態樣中，配位體結合部分為膜結合分子。在特定態樣中，配位體結合部分係選自由以下所組成之群組：生長因子受體、細胞激素受體、抗原、配位體受體、酶受質、螢光標記、放射性標記或激素受體，較佳地細胞激素受體。
如本文所用，「掩蔽部分」有時亦簡稱為「掩蔽物」、「蛋白質掩蔽」或「抗體掩蔽」，係指能夠結合至另一多肽 (例如配位體) 且降低或完全消除配位體 (例如細胞激素) 特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之能力的多肽。在一些態樣中，掩蔽部分包含抗體或抗體片段之互補位。在其他態樣中，掩蔽部分為作為配位體之天然結合配偶體 (例如配位體之受體) 的多肽。在一個態樣中，掩蔽部分包含抗體、抗體片段、單鏈抗原結合部分、肽掩蔽物 (抗獨特型抗體、抗獨特型抗體片段 (例如 scFv、VHH) 或能夠特異性結合至配位體之受體、蛋白質抑制劑或結合蛋白。
「天然抗體」係指具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體醣蛋白。從 N 端 至 C 端，每條重鏈具有可變域 (VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變區，接著係三個重鏈恆定域 (CH1、CH2及CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變域 (VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區，接著為輕鏈恆定 (CL) 域。
術語「肽連接子」係指包含一或多個胺基酸，通常約 2 至 20 個，但有時至多 40 個胺基酸之肽。肽連接子為此項技術中已知或描述於本文中。合適的非免疫原性肽連接子為例如 (GG)n、(G3S)n(SEQ ID NO: 91) 或 (G4S)n(SEQ ID NO: 92) 肽連接子，其中「n」一般為 1 與 10 之間、通常 2 與 4 之間的數字，特定而言為 2。特別關注的肽連接子為 GG、GGGG (SEQ ID NO:86)、SGSGSG (SEQ ID NO:87)、(GSGGS)n(SEQ ID NO: 93)、(GGGS)n(SEQ ID NO: 91)、(GSGGG)n(SEQ ID NO: 94)、(GGGSG)n(SEQ ID NO: 95)、(GSSSG)n(SEQ ID NO: 96)、(GGGGS)n(SEQ ID NO: 92) 及 (GGSGG)n(SEQ ID NO: 97)，其中 n 表示至少 1 ，較佳 2 至 6 之整數。表 A 顯示了可用於共價接附 CISS 分子內不同部分之不同肽連接子。表 A – 使用於肽連接子中之 CISS 分子
連接子長度 SEQ ID NO: 序列
2x - GG
4x 86 GGGG
6x 87 GGGGGG
6x 529 GGSGGG
10x 88 GGSGGGGSGG
14x 89 GGSGGGGSGGGGGG
18x 90 GGSGGGGGSGGGGGSGGG
在本發明之一個態樣中，將配位體 (例如細胞激素) 連結至第一抗原結合部分的第一肽連接子具有足夠的長度以使得能夠與掩蔽部分相互作用並且不引起導致相互作用較差且出現多聚體之此張力。第一肽連接子之長度進一步使得配位體與掩蔽部分之間能夠相互作用，其足夠接近第一抗原結合部分之互補位，以證明配位體與配位體結合部分之結合接近或完全相互排他性部分。在另一態樣中，當第一抗原結合部分同時結合至標靶抗原時，第一肽連接子具有足夠的長度以達至配位體結合部分 (例如，在靶細胞表面上)。
相對於參照多肽序列所述之「胺基酸序列同一性百分比 (%)」，是指候選序列中胺基酸殘基與參照多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟件或 FASTA 程式套件實現。熟習此項技術者可判定用於比對序列之適當參數，包括在所比較之序列的全長上達成最大比對所需之任何演算法。可替代地，可使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 生成同一性百分比值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區 20559 的美國著作權局，其已經注冊 (美國版權註冊號 TXU510087) 並在 WO 2001/007611 中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用 FASTA 套件 36.3.8c 版或更高版本的 ggsearch 程式及 BLOSUM50 比較矩陣來生成胺基酸序列同一性百分比值。FASTA 程式包由以下作者開發：W. R. W. R. Pearson 及 D. J. Lipman、(1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258；及 Pearson 等人(1997) (Genomics 46:24-36)，並可從以下網址公開存取：www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 或 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta。可替代地，可使用透過 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
術語「醫藥組成物」或「醫藥調配物」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不含對組成物將投予之個體具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」是指醫藥組成物或調配物中除對個體無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，術語「多肽」，有時亦稱為「多肽鏈」係指
如所用，術語「標靶抗原」，為了便於閱讀，在本文中有時亦稱為 TA (特別是在抗標靶抗原抗原結合部分之上下文中)，係指存在於靶細胞或組織中或之上的抗原或其部分。可根據標靶抗原在將配位體 (諸如細胞激素或受體結合配位體) 靶向所欲靶細胞或組織中之有用性來選擇標靶抗原，例如出於標靶依賴性活化或阻斷配位體結合部分 (例如細胞激素受體或細胞表面受體) 之目的。標靶抗原可由抗原結合部分 (諸如抗體或抗體片段) 之抗原結合域結合。術語「標靶抗原」涵蓋例如存在於效應細胞諸如 T 細胞或 NK 細胞上之細胞表面分子。在一些實施例中，標靶抗原為 CD3。術語「標靶抗原」亦涵蓋腫瘤抗原，如上文所描述。在某些實施例中，標靶抗原可位於可被引入患病組織或器官中 (例如藉由注射) 之功能化表面上，以便活化在該區域有活性的系統投與之可活化融合蛋白。
如本文中所使用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些態樣中，本發明之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個互補決定區 (CDR)。(參見，例如，Kindt 等人Kuby Immunology, 第 6 版, W.H. Freeman and Co.,第 91 頁 (2007)。)單一 VH 或 VL 域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見，例如，Portolano 等人，J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson 等人，Nature352:624-628 (1991)。
如本文所用，術語「載體」是指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。II. 組成物及方法
在一個態樣中，本發明部分基於這樣的發現：藉由以本文所揭示之方式排列抗原結合部分、配位體 (例如細胞激素) 及結合該配位體之掩蔽部分，可獲得條件活性融合蛋白，其證明與標靶抗原及配位體之相互排斥的結合，並且此外顯示配位體與配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之條件性結合，亦即配位體與配位體結合部分之結合取決於標靶抗原之存在在配位體結合部分附近，而不必求助於使用相互排斥的雙特異性結合劑 (「開關結合劑」或「翻轉結合劑」)，此種雙特異性結合劑難以產生且可能無法為每個標靶抗原/配位體組合以所欲品質進行製備。
本文中之可活化融合蛋白係基於允許極大的多功能性及廣泛適用性之形式，因為製備此類可活化融合蛋白所需之唯一構建嵌段為 a) 對所欲標靶抗原具有特異性的抗原結合部分及 b) 能夠防止配位體與配位體結合部分結合且發揮其生物學功能之所欲配位體之掩蔽部分，可使用現有技術方法容易獲得之分子。藉由本文所報導之可活化融合蛋白實現的效應依賴於第一抗原結合部分以掩蔽部分與配位體之間的距離顯著增加的方式與標靶抗原之結合。因而，均經由肽連接子與第一抗原結合部分融合之掩蔽部分及配位體不再能夠彼此到達，從而有效地阻斷掩蔽部分與配位體之結合。配位體因此被釋放以結合至配位體結合部分。如本文所描述之可活化融合蛋白並不依賴於關於靶組織之特定要求，諸如組織特異性蛋白酶之存在。因此，用於活化本文所描述之可活化融合蛋白之機制係可逆的且非破壞性的。在不存在標靶抗原之情況下，掩蔽部分重新接附至配位體且恢復掩蔽效應。因此，若融合蛋白在循環中保留較長時間，脫靶活性就會顯著降低。
因此，本融合蛋白與已知分子平台的不同之處在於，融合至第一抗原結合部分之配位體 (例如細胞激素) 為本文所描述之可活化融合蛋白的 (主要) 生物活性實體，並且在於第一抗原結合部分與標靶抗原之結合釋放配位體，以藉由空間阻擋配位體與掩蔽部分之間的相互作用來發揮其生物學功能，而不必依賴切割或消化掩蔽部分 (諸如蛋白酶) 之機制。
使用本發明之可活化融合蛋白可以現表現配位體結合部分之靶細胞的優異的標靶依賴性結合及活化，特別是若本發明之該等可活化融合蛋白包含充當靶向臂之第二抗原結合部分，則將分子定位至靶細胞之表面。由第二抗原結合部分結合之抗原可為與由第一抗原結合部分結合之抗原相同的抗原或不同的抗原。
在一個態樣中，可活化融合蛋白之配位體結合活性被減弱，例如，若配位體為細胞激素，則其具有減弱的細胞激素受體結合活性。在一個實施例中，若配位體為細胞激素，則可活化融合蛋白之細胞激素-受體活化活性比含有細胞激素多肽但不含掩蔽部分之融合蛋白的細胞激素-受體活化活性低至少約 10 倍。
本發明之可活化融合蛋白例如可用於診斷或治療疾病，諸如癌症、病毒感染或自體免疫疾病。
在某些態樣中，如本文所描述之可活化融合蛋白● 顯示了配位體與配位體結合部分之標靶依賴性結合，特定而言- 若配位體為細胞激素 – 細胞激素受體之標靶依賴性活化或 – 若配位體為酶 – 標靶依賴性酶活性 (例如蛋白酶活性、磷酸化等)，● 顯示了若標靶抗原之水準低於某一閾值或若根本不存在標靶抗原，則配位體與配位體結合部分之結合減少或被抑制，及/或● 並不依賴於 (標靶特異性) 蛋白酶之存在來自掩蔽部分釋放配位體以使配位體結合配位體結合部分。
在本發明之一個態樣中，可活化融合蛋白包含能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽之第一抗原結合部分、能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之配位體 (例如細胞激素)，以及能夠特異性結合至配位體之掩蔽部分。可活化融合蛋白之特徵在於配位體係經由第一肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之一者的 N 端，掩蔽部分係經由第二肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之另一者的 N 端且第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。本文所描述之可活化融合蛋白中所包含的配位體與配位體結合部分之標靶依賴性結合特別不依賴於可活化融合蛋白 (例如在靶組織中) 之任何蛋白水解活性，特定而言不依賴於任何蛋白水解切割。在一個態樣中，可活化融合蛋白係功能性的且以其完整形式及/或在不存在蛋白酶之情況下顯示出標靶抗原依賴性活性。A. 例示性 CISS 分子形式
在可活化融合蛋白之一些態樣中，第一抗原結合部分為抗體或抗體片段。
為了製備功能性 CISS 分子，抗原結合部分、配位體及掩蔽部分需要以本文所描述之方式排列，亦即配位體係經由第一肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之一者的 N 端，且掩蔽部分係經由第二肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之另一者的 N 端。第一肽連接子及第二肽連接子均不易受到蛋白酶切割，即它們不包含蛋白酶切割位點。為了實現配位體 (例如細胞激素) 與配位體結合部分 (例如細胞激素受體) 之可活化結合，選擇抗原結合部分作為第一抗原結合部分，其中重鏈及輕鏈之 N 端極接近，例如就像在 Fab 中一樣。因此，在本文所描述之可活化融合蛋白之另一態樣中，第一抗原結合部分為選自由以下所組成之群組的抗體片段：Fab、DutaFab、DAF、Fv、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙功能抗體、線性抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。在另一態樣中，第一抗原結合部分為工程化 T 細胞受體 (TCR)，諸如可溶性 TCR (其缺乏跨膜域)或單鏈 TCR，其中 TCR 可變 α 區及 TCR 可變 β 區藉由肽連接子連接。
應瞭解，CISS 分子亦可基於僅包含一條多肽鏈之第一抗原結合部分 (例如DARPin) 產生。在此類實施例中，配位體及掩蔽部分將經由肽連接子接附至第一抗原結合部分之 N 端及 C 端。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，配位體係選自由以下所組成之群組：生長因子、細胞激素、趨化激素、抗體、抗體片段、酶、受體配位體、親和力肽配位體、肽激素、受體激動劑、受體拮抗劑、酶、可溶性受體、蛋白質毒素、可溶性配位體、細胞表面受體之胞外區、細胞表面配位體之胞外區、小分子或其任何組合，較佳地細胞激素。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，能夠與配位體特異性結合之配位體結合部分係選自由以下所組成之群組：生長因子受體、細胞激素受體、抗原、配位體受體、酶受質、螢光標記、放射性劑、放射性標記或激素受體，較佳地細胞激素受體。
在一個態樣中，本文所描述之可活化融合蛋白中所包含的掩蔽部分係選自由以下所組成之群組：抗體、抗體片段、單鏈抗原結合部分 (單鏈抗原結合部分亦可為抗體模擬物，諸如 DARPin、單功能抗體、親和體或抗運載蛋白)、肽掩蔽物、抗獨特型抗體、抗獨特型抗體片段 (例如 scFv、VHH、dAb、VNAR) (僅若配位體為抗體/抗體片段) 或特異性結合至配位體之受體。
在可活化融合蛋白之一些態樣中，掩蔽部分為選自由以下所組成之群組的單鏈抗原結合部分：scFv、scFab、VHH、VNAR、域抗體 (dAb)、DARPin、親和體、單功能抗體、抗運載蛋白及單域抗體 (sdAb)。
在本文所提供之可活化融合蛋白之一個態樣中，掩蔽部分可逆地結合至配位體。在一些態樣中，掩蔽部分與配位體之結合在空間上阻擋第一抗原結合部分與抗原之結合。在另一態樣中，當與第一抗原結合部分本身之親和力相比時，可活化融合蛋白中第一抗原結合部分之親和力降低。在又另一態樣中，當掩蔽部分與配位體結合時，會阻擋可活化融合蛋白之第一抗原結合部分與抗原結合。在另一態樣中，當第一抗原結合部分與標靶抗原結合時，配位體與掩蔽部分之間的相互作用被中斷且防止掩蔽部分與配位體結合。在又另一態樣中，當抗原結合部分與標靶抗原結合時，配位體自配位體結合部分釋放以與配位體結合部分結合。
配位體及掩蔽部分較佳地在它們的 C 端係經由肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之重鏈及輕鏈多肽之 N 端。肽連接子通常為短肽，其包含一或多個胺基酸，通常約 2 至 20 個，但有時至多 40 個或更多個胺基酸。本文所描述之可活化融合蛋白至肽連接子不含有蛋白酶切割位點，亦即當可活化融合蛋白在靶組織中發揮其治療效應時，配位體或掩蔽部分均不會脫落。本文所描述之分子即使在達成它們的生理目標後仍將保留它們的條件性治療活性。此允許使用具有長半衰期之分子。即使彼等分子在達至它們的靶組織後繼續在體內循環，它們亦會在外周展現出極低的非所欲活性，因為在標靶抗原不再存在時，掩蔽部分將再次與配位體結合。
在另一態樣中，可活化融合蛋白進一步包含第二抗原結合部分。在特定實施例中，第二抗原結合部分包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽。在一些態樣中，第二抗原結合域係選自由以下所組成之群組：Fab、DutaFab、scFab、DAF、Fv、Fab’、Fab’-SH 或 F(ab’)2片段，特定而言 Fab 片段。在另一實施例中，第二抗原結合部分為單鏈抗原結合部分，例如 scFv、scFab、VHH、VNAR、域抗體 (dAb)、DARPin、親和體、單功能抗體、抗運載蛋白及單域抗體 (sdAb)。在一些態樣中，第二抗原結合部分係直接或經由肽連接子共價接附至第一抗原結合部分。第一及第二抗原結合部分亦可形成 F(ab')2片段。
在又另一態樣中，可活化融合蛋白進一步包含 Fc 域，該 Fc 域包含第一 Fc 域重鏈多肽及第二 Fc 域重鏈多肽。應瞭解，在本文所描述之可活化融合蛋白中包括 Fc 域可在許多態樣中有用，例如用於提供額外域 (例如抗原結合部分) 之接附位點，且亦用於向分子傳遞所欲特性，諸如定制半衰期或 Fcγ 依賴性细胞毒性。
在一個態樣中，本文所描述之可活化融合蛋白中所包含的第一抗原結合部分係共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端或 C 端。在特定態樣中，第一抗原結合部分係共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端或 C 端。在特定態樣中，第一抗原結合部分係共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端。在一些態樣中，可活化融合蛋白之第一抗原結合部分為 Fab、Dutafab、DAF 或 DBA，且第一抗原結合部分之第一重鏈多肽或第一輕鏈多肽係經由其 C 端 (a) 共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或 (b) 共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽之 C 端。在另一態樣中，可活化融合蛋白之第一抗原結合部分為 Fab、Dutafab、DAF 或 DBA，且第一抗原結合部分之第一重鏈多肽或第一輕鏈多肽係經由其 N 端 (a) 共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或 (b) 共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽之 C 端，特定而言第一 Fc 域重鏈多肽之 C 端。
在一些態樣中，可活化融合蛋白中所包含的第二抗原結合部分係共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端或 C 端。在一些態樣中，第二抗原結合部分為 Fab、Dutafab、DAF 或 DBA，且第二抗原結合部分之第二重鏈多肽或第二輕鏈多肽係經由其 C 端 (a) 共價接附至第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或 (b) 共價接附至第一或第二 Fc 域重鏈多肽之 C 端。在另一實施例中，第二抗原結合部分為單鏈抗原結合部分，例如 scFv、scFab、VHH 或 單域抗體。
在一個態樣中，本文所描述之可活化融合蛋白中所包含的第一抗原結合部分係共價接附 (a) 至第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端且第二抗原結合部分共價接附至第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或 (b) 第一抗原結合部分係共價接附至第一或第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端且第二抗原結合部分係共價接附至第一或第二 Fc 域重鏈多肽之 C 端。
藉助於說明，圖 1顯示了本文所描述之可活化融合蛋白之兩個實例，例示性CISS Fab( 圖 1A)及例示性靶向的 CISS 分子( 圖 1B) 。圖 1A 中所示之分子係基於抗 TA Fab，其中配位體 (此處：細胞激素) 及掩蔽部分 (此處：能夠特異性結合至細胞激素之 scFv) 分別融合至 Fab 之重鏈及輕鏈之 N 端。圖 1B中所示之分子具有與 IgG 類似的結構。IgG 分子之一個 Fab 臂為 CISS 模組之基礎，其中配位體及掩蔽部分分別共價接附至該 Fab 之重鏈及輕鏈之 N 端。另一 Fab 臂充當第二抗原結合部分，為分子提供對靶組織之額外靶向 (藉由與 TA 或位於靶組織中之另一抗原結合)。
圖 13中顯示了可經由分子內機制活化之可活化融合蛋白之例示性形式，包含第一抗原結合部分、第二抗原結合部分、配位體 (例如細胞激素) 及掩蔽部分。在此實例中，第二抗原結合部分及掩蔽部分均為單鏈抗原結合部分。在靶向的 CISS 分子之上下文中，術語「分子內」意謂第一及第二抗原結合部分以這樣的方式結合至相同的標靶抗原上之不同抗原決定基，使得兩個抗原結合部分結合至一個且相同的標靶抗原分子導致配位體 (例如細胞激素) 之釋放以結合配位體結合部分 (例如細胞激素受體)。(若選擇第一及第二抗原結合部分使得它們不能同時特異性結合至一個且相同的標靶抗原分子，則它們依賴於同時結合兩種不同的標靶抗原分子，此為在本文中稱為「分子間」的機制)。配位體在其 C 端處係經由肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之重鏈或輕鏈多肽之 N 端。掩蔽部分在其 C 端處係經由肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之另一多肽鏈之 N 端。第二抗原結合部分在其 C 端或其 N 端經由肽連接子結合至掩蔽部分。
圖 14顯示了根據本發明之可活化融合蛋白之進一步例示性形式。圖 14 A 及圖 14 B顯示了替代靶向的 CISS 分子。除了 CISS 模組之外，此等分子具有替代形式，含有 Fc 域及第二抗原結合部分。在圖 14 A中所示之形式中，CISS 模組之第一抗原結合部分並不直接連接至 Fc 域，而係經由肽連接子在其肽鏈中之一者的 N 端處共價接附至掩蔽部分之 C 端，此本身係經由另一肽連接子在其 N 端處共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 C 端，而第二抗原結合部分則係經由其 N 端共價接附至具有又另一肽連接子之兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 C 端。在圖 14 B中所示之形式中，CISS 模組之第一抗原結合部分在其重鏈多肽之 C 端處係經由肽連接子共價接附至 Fc 域之 N 端，而第二抗原結合部分在其 N 端處係經由另一肽連接子共價接附至 Fc 域重鏈多肽中之一者的 C 端。應理解，肽連接子之接附位點可在用於組裝 CISS 分子之 Fab 及 Fc 域之不同多肽鏈之間變化。
圖 14 C例示性地說明了圖 14A中所示的分子之作用模式。分子經由第二抗原結合部分 (「靶向臂」) 結合至细胞表面上之標靶抗原。當掩蔽暫時釋放與第一抗原結合部分融合之細胞激素時，後者可結合至細胞表面上同一標靶抗原分子之另一抗原決定基，從而中斷掩蔽-細胞激素相互作用且釋放細胞激素以與細胞表面上之細胞激素受體 (此處未顯示) 結合。
在另一態樣中，本文所描述之可活化融合蛋白中所包含的第二抗原結合部分係經由不包含蛋白酶切割位點之第三肽連接子共價接附至配位體 (例如細胞激素) 之 N 端。在特定態樣中，第一及第二抗原結合部分能夠同時特異性結合至同一標靶抗原分子上之兩個不同抗原決定基。第二抗原結合部分與配位體、掩蔽部分及第一抗原結合部分之接近允許配位體之分子內活化，此可導致配位體之釋放，即使標靶抗原為可溶性的。在一些態樣中，共價接附至掩蔽部分之 N 端之第二抗原結合部分為選自由以下所組成之群組的單鏈抗原結合部分：scFv、scFab、VHH、VNAR、域抗體 (dAb)、DARPin、親和體、單功能抗體、抗運載蛋白及單域抗體 (sdAb)。
當第二抗原結合部分與標靶抗原結合時，可活化融合蛋白附近的標靶抗原之有效濃度增加，促進第一抗原結合部分與標靶抗原之結合，從而保持掩蔽部分打開，使得配位體 (例如細胞激素) 自由地結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體)。分子內未掩蔽通常會提高未掩蔽效率，因為其與受體之細胞表面濃度無關，而是應使用藉由分子內結合達成的更高的有效濃度。在欲靶向具有給定受體之整個群體或需要溶液內或固定標靶之情況下，此可能係有利的。
在上文所描述之可活化融合蛋白之一些例示性形式中，Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端或 C 端係經由第三肽連接子共價接附至掩蔽部分之 N 端 (圖 14 A)，且在一些中，第二抗原結合部分在其重鏈多肽或輕鏈多肽之 N 端處係經由第四肽連接子共價接附至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端或 C 端 (圖 14 A 及圖 14 B)。需要清楚的是，該第三及第四肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本文所描述的含有抗體衍生域 (諸如 Fc 域或 Fab) 之可活化融合蛋白通常包含多於一條多肽鏈。本文所描述之一些形式包含三條或四條多肽鏈。在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分，且可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體 (例如細胞激素)，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分，且可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體 (例如細胞激素)，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分，且可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體 (例如細胞激素)，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，以及c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分 (其為單鏈抗原結合部分)，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分，且可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體 (例如細胞激素)，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，以及c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分 (其為單鏈抗原結合部分)，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽。
在另一態樣中，可活化融合蛋白包含能夠特異性結合至抗原 (其為與標靶抗原相同的抗原或不同的抗原) 之第二抗原結合部分。在一些態樣中，第二抗原結合部分 (a) 特異性結合至標靶抗原，並且 (b) 特異性結合至標靶抗原上與第一抗原結合部分所結合之抗原決定基不同的抗原決定基。在一些態樣中，第二抗原結合部分特異性結合至標靶抗原上與第一抗原結合部分相同的抗原決定基。
很多時候，選擇第二抗原結合部分以能夠特異性結合至標靶抗原上與第一抗原結合部分相同的標靶抗原，或甚至相同的抗原決定基。已發現，若標靶抗原對所欲靶組織 (例如腫瘤組織或某種器官組織) 顯示出高特異性，則此等實施例係特別有用的。使用特異性結合至標靶抗原上與第一及第二抗原結合部分相同的抗原決定基之第一及第二抗原結合部分或甚至使用相同的抗原結合部分可導致可活化融合蛋白對其表面上標靶抗原之濃度特別高的靶細胞之更高特異性，因為僅當細胞表面上有至少兩種標靶抗原足夠接近使得第一及第二抗原結合部分可同時結合至它們時，融合蛋白才會被活化 (因為它們不能同時結合相同的標靶抗原，因為一者會阻斷另一者之結合)。
對於可活化融合蛋白來說，包含能夠特異性結合不同於標靶抗原之抗原的第二抗原結合部分可能係特別有用的，特別是當所欲標靶抗原之濃度不夠高時，或若標靶抗原之表現對於靶組織或靶細胞來說不夠特異性，則無法達成所欲作用模式。在此類情況下，可在第二抗原結合部分之幫助下靶向第二抗原，以便增加對特定靶細胞/組織之特異性。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，第一抗原結合部分為 IgG 類型之抗體或其一部分。在一些態樣中，IgG 類型抗體之一個臂包含第一抗原結合部分且 IgG 類型抗體之另一臂包含第二抗原結合部分。在一個態樣中，第一抗原結合部分、第二抗原結合部分及可活化融合蛋白之 Fc 區一起形成 IgG 類型的抗體。在一些態樣中，Fc 域為 IgG Fc 域，特定而言 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域。在一些態樣中，可活化融合蛋白包含至少兩條全長 IgG 抗體重鏈且抗原結合部分之重鏈具有 γ 類型 (IgG)，特定而言 γ1 類型。在另一態樣中，可活化融合蛋白包含至少兩條輕鏈且抗原結合部分之輕鏈係選自卡帕 (κ) 及/或拉目達 (λ) 亞型。
在一個態樣中，本文所描述之可活化融合蛋白包含Fc 域，該 Fc 域包含一或多個胺基酸取代，該一或多個胺基酸取代降低與 Fc 受體之結合，特定而言與 Fcγ 受體之結合。在另一態樣中，Fc 域具有人類 IgG1 亞類，其具有胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個態樣中，本文所描述之可活化融合蛋白包含 Fc 域，該 Fc 域包含促進第一及第二 Fc 域重鏈多肽締合之修飾。在某些態樣中，根據杵入臼 (knobs into holes) 方法，第一 Fc 域重鏈多肽包含杵且第二 Fc 域重鏈多肽包含臼。在一些態樣中，第一 Fc 域重鏈多肽包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (根據 Kabat EU 索引編號)，且第二 Fc 域重鏈多肽包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
包含多於一種不同的重鏈/輕鏈配對之分子複合物在製造期間存在形成非所欲重鏈/輕鏈配對之風險。為了防止此類錯誤配對，CrossMab 技術可用於本文中之 可活化融合蛋白中。因此，在一個態樣中，本文所描述之可活化融合蛋白之第一及第二抗原結合部分為 Fab，且在 Fab 中之一者中，可變域 VL 及 VH 被彼此替換，使得 VH 域為輕鏈之一部分且 VL 域為重鏈之一部分，亦即 Fab 中之一者為「交叉 Fab 片段」。在一些態樣中，在該兩個 Fab 片段中之一者之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且在恆定域 CH1 中，位置 147 及 213 處之胺基酸獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。在特定態樣中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且在恆定域 CH1 中，位置 147 及 213 處之胺基酸獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，與第一抗原結合部分特異性結合之標靶抗原係選自由以下所組成之群組：α-突觸核蛋白、類澱粉蛋白 β、BCMA、BTLA、CD3e、CD4、CD8、CD14、CD16 (FcgRIIIa)、CD19、CD20、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD44、CD47、CD52、CD70、CD109、CD123、CD137、CEACAM5、c-MET、CTLA4、DLL3、CXCR4、EDB-FN、EpCAM、表皮生長因子受體 (EGFR)、EPO 受體、FAPα、FGFR2、FGFR3、GD-2、GP100、GITR、GLP-1 受體、GM-CSF、GPC3、Grp78、刺蝟蛋白、HER2、HER3、HLA-G、ICAM (ICAM-1、-2、-3、-4、-5)、IGF-1R、IL-1R1、IL-4Rα、整聯蛋白 αv、b7 整聯蛋白次單元、a4b7 整聯蛋白、a4 整聯蛋白、LAG3、LIGHT、LRP1、MAdCAM、MHC、MUC1、MICA、MICB、NKG2D、NKp30、nKp46、Notch1、Notch3、NRP1、NRP2、OX40、PAR-2、PD-1、PD-L1、PDGFR、PSA、PSMA、SLAMF6、SR-A1、SR-A3、SR-A4、SR-A5、SR-A6、SR-B、dSR-C1、SR-D1、SR-E1、SR-F1、SR-F2、SR-G、SR-H1、SR-H2、SR-11、SR-J1、多配體蛋白聚醣 1、TGFβ、TGF-γ、TCR、gdTCR、TGFBR1、TGFBR2、TIM-3、TLR2、TLR3、Trap、Trop2、VAP-1、VCAM、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 或 5T4。在特定態樣中，標靶抗原係選自由以下所組成之群組：PD1、PD-L1、CD8 及 CD19。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，可活化融合蛋白中所包含的配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：干擾素、介白素、趨化激素、淋巴激素、單核激素、群落刺激因子及腫瘤壞死因子。在一個態樣中，細胞激素為 IL-1 家族、IL-2 亞家族、干擾素 (IFN) 亞家族或 IL-10 亞家族之成員。在特定態樣中，配位體為選自由干擾素及介白素所組成之群組的細胞激素。在一些態樣中，配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：BMP、CSF-1、胰島素、GLP-1、HGH、IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、GM-CSF、FGF、EGF、G-CSF、IFNα、IFNβ、IFNγ、PDGF、TGFβ、TNFα、TNFβ、VEGF 或 EPO。在一個此類態樣中，配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IFNα、IFNβ 及 IFNγ。在一些態樣中，配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：IL-2、IL-7、IL-21 及 IFNα。在一個態樣中，細胞激素可為天然存在的細胞激素之突變蛋白 (mutein)、變異體、活性次單元、活性片段及/或減弱的變異體。
在一個特定態樣中，可活化融合蛋白包含(a) 第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至標靶抗原之 Fab，(b) 能夠特異性結合至細胞激素受體之細胞激素，及(c) 掩蔽部分，其為能夠特異性結合至細胞激素之 VHH 或 scFv，其中細胞激素係經由第一肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之一者的 N 端，掩蔽部分係經由第二肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之另一者的 N 端且第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
在另一態樣中，可活化融合蛋白包含(a) 第一抗原結合部分，其為能夠特異性結合至第一標靶抗原之 Fab，(b) 能夠特異性結合至第一或第二標靶抗原之第二抗原結合部分，較佳地 Fab，(c) 包含第一及第二 Fc 域重鏈多肽之 Fc 域。(d) 能夠特異性結合至細胞激素受體之細胞激素，以及(e) 掩蔽部分，其為能夠特異性結合至細胞激素之 VHH 或 scFv，其中細胞激素係經由第一肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之一者的 N 端，掩蔽部分係經由第二肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之另一者的 N 端，第一抗原結合部分之重鏈多肽係共價接附至第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端且第二抗原結合部分係共價接附至第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，並且第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。在第二抗原結合部分為 Fab 之情況下，其在其重鏈或其輕鏈，特定而言其重鏈之 C 端處連接至 Fc 域。可活化融合分子之各個域之間的融合可經由肽連接子進行，肽連接子亦可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)或由其組成，特定而言當 Fab 作為 (第一及/或第二) 抗原結合域融合至 Fc 域時。
在本文所揭示之可活化融合蛋白之一些態樣中，不僅配位體，第一抗原結合部分亦具有治療活性且/或活化患者體內之反應，從而觸發預期的作用模式。
在本文所描述之可活化融合蛋白之一個態樣中，配位體為抗原結合部分。在一些態樣中，抗原結合部分可為能夠特異性結合至選自由以下所組成之群組的抗原的抗體或抗體片段：BCMA、GPRC5D、FcRH5、CD38、CS-1/SlamF7、CD20、CD19、CD22、CD27、CD28、CD40、CD47、CD123、CD137、CEACAM5、DLL3、EpCAM、HLA-G、GITR、HER2、HER3、MICA、MICB,、PD-L1、 PSMA、STEAP-1、TROP‑2、EpCAM、HER3 及 cMet。應瞭解，若抗原結合部分用為包含在本文所描述之可活化融合蛋白中的配位體，則掩蔽部分通常為能夠特異性結合至抗原結合部分 (其用為配位體) 的抗獨特型抗原結合部分。
本文所描述之CISS分子形式可用於實現不同類型的作用模式。在一個態樣中，揭示了可活化 T 細胞或 NK 細胞接合物。可活化 T 細胞或 NK 細胞接合物包含能夠特異性結合標靶抗原之第一抗原結合部分、作為能夠特異性結合至 T 細胞或 NK 細胞抗原 (諸如 CD3、TCR 或 CD28) 之抗原結合部分的配位體，以及能夠特異性結合至作為配位體之抗原結合部分的掩蔽部分，亦即能夠特異性結合抗 T 細胞或抗 NK 細胞抗原結合部分之抗獨特型抗體或抗體片段。此種形式之一個優點為可使用不同的標靶抗原，而不必為抗原結合部分與標靶抗原之結合產生新的抗獨特型掩蔽。圖 11A顯示了基本上由能夠特異性結合至標靶抗原之 IgG 類型抗體組成之此種例示性可活化 T 細胞接合物之示意性描繪，其中配位體、抗 CD3ε scFv 及掩蔽部分抗 CD3 VHH 與 IgG 抗體之兩個 Fab 臂中之一者結合。在此實例中，另一臂充當第二抗原結合部分。在不存在標靶表現細胞之情況下，抗 CD3ε sc Fv 由抗 CD3 VHH 掩蔽部分結合 (圖 12)。在可活化 T 細胞接合物結合至具有兩個抗原結合部分之標靶抗原上後，抗 CD3ε scFv 就會自掩蔽中釋放出來且自由地結合至 T 細胞上的其抗原 CD3ε，從而向腫瘤募集 T 細胞且誘導 T 細胞活化及腫瘤細胞消除。
在另一態樣中，如本文所揭示之可活化 T 細胞或 NK 細胞接合物亦可包含能夠特異性結合至 T 細胞或 NK 細胞抗原 (諸如 CD3、TCR、CD28、CD16a 或 NKG2D) 之第一抗原結合部分，而配位體能夠特異性結合至第二標靶抗原且掩蔽為能夠特異性結合至充當此處的配位體的抗原結合部分之抗獨特性抗體或抗體片段 (例如 VHH)。在特定態樣中，配位體為結合至標靶抗原結合之抗原結合部分。圖 11 B顯示了基本上由包含兩個 Fab 臂之雙特異性 IgG 類型抗體之此種例示性可活化 T 細胞接合物之示意性描繪，兩個臂中之一者能夠特異性結合至 CD3ε，而另一臂能夠特異性結合至標靶抗原。本實例中之配位體 (抗 TA scFv) 及掩蔽部分 (抗抗 TA 獨特型 VHH) 係共價接附至能夠特異性結合至 CD3ε 之 IgG 抗體之一個 Fab 臂。在不存在標靶表現細胞之情況下，抗靶 scFv 由抗抗 TA VHH 掩蔽部分結合。在可活化 T 細胞接合物結合至具有抗 TA scFv 及抗 TA Fab 臂之標靶抗原上後，抗 CD3ε scFv 就不再經空間阻擋而無法與 T 細胞上之其抗原 CD3ε 結合，從而募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球以及誘導 T 細胞活化及腫瘤細胞消除。
本文所描述之可活化 T 細胞接合物特別能夠微調親和力及親合力以在低密度及高密度表現標靶之細胞之間進行選擇，特定而言若與結合至兩種不同的標靶抗原之兩個抗原結合部分組合。它們藉由「掩蔽」CD3 而進一步強烈地降低與循環中 T 細胞之 CD3ε 的結合，且藉由「掩蔽」抗 CD3 抗原結合域而減少潛在作用模式驅動的細胞激素釋放症候群。與本文所描述之其他可活化融合蛋白一樣，第二抗原結合部分可結合至與第一抗原結合部分或配位體相同的抗原或不同的抗原。在可活化 T 細胞或 NK 細胞接合物包含結合至與第一抗原結合部分不同的抗原的第二抗原結合部分之情況下，此可能導致對表現該兩種抗原之靶細胞之子集的特異性增加。在一些實施例中，本文所描述之可活化 T 細胞接合物為 CD3 雙特異性或 CD3 三特異性 T 細胞接合物。
在另一態樣中，本揭露提供了一種作為可活化拮抗劑之可活化融合蛋白，其中第一抗原結合部分為能夠特異性結合至例如必需的膜轉運蛋白或通道之拮抗性結合劑。
在另一態樣中，配位體可為非細胞激素配位體，亦即除了細胞激素之外的多肽，選自由以下所組成之群組：生長因子、趨化激素、抗體、抗體片段、酶、受體配位體、親和力肽配位體、肽激素、受體激動劑、受體拮抗劑、酶、可溶性受體、蛋白質毒素、可溶性配位體、細胞表面受體之胞外區、細胞表面配位體之胞外區、小分子或其任何組合。
在一個態樣中，提供了一種可活化融合蛋白，其包含(A) 第一抗原結合部分，其能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽(B) 第二抗原結合部分，其包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽，(C) 配位體 (例如細胞激素)，其能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體)，以及(D) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至配位體之單鏈抗原結合部分，且其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽，其中第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
在一個態樣中，提供了一種可活化融合蛋白，其包含(A) 第一抗原結合部分，其能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽，(B) 第二抗原結合部分，其包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽，(C) 配位體 (例如細胞激素)，其能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體)，以及(D) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至配位體之單鏈抗原結合部分，且其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽，其中第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其包含(A) 第一抗原結合部分，其能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽，(B) 第二抗原結合部分，(C) 配位體 (例如細胞激素)，其能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體)，以及(D) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至配位體之單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，以及c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，其中第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
本發明之一個實施例為一種可活化融合蛋白，其包含(A) 第一抗原結合部分，其能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽，(B) 第二抗原結合部分，其包含單鏈抗原結合部分 (或由其組成)，(C) 配位體 (例如細胞激素)，其能夠特異性結合至配位體結合部分 (例如細胞激素受體)，以及(D) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至配位體之單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，以及c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，其中第一肽連接子及第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
在另一態樣中，如以下部分 1-8 中所描述，根據上述態樣中之任一者的可活化融合蛋白可單獨或組合地併入任何特徵。 1. 抗體片段
在某些態樣中，本文所提供之可活化融合蛋白包含抗體片段。抗體片段尤其可包含在抗原結合部分或配位體中。
在一個態樣中，抗體片段為 Fab、DutaFab、scFab、DAF、Fv、Fab’、Fab’-SH 或 F(ab’)2片段，特定而言 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈可變域 (分別為 VH 和 VL) 及輕鏈之恆定域 (CL) 和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，術語「Fab」或「Fab 片段」係指包含輕鏈多肽 (包含 VL 域及 CL 域) 及重鏈多肽 (包含 VH 域及 CH1 域) 之抗體片段。「Fab’ 片段」與 Fab 片段的區別在於在 CH1 域的羧基末端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH 是 Fab' 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab')2 片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國專利號 5,869,046。
在另一態樣中，抗體片段為雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體。「雙功能抗體」為具有兩個抗原結合位點 (其可為二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。
在又一態樣中，抗體片段為單鏈 Fab 片段。「單鏈 Fab 片段」或「scFab」是由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體重鏈恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成的多肽，其中該抗體域及該連接子在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL、b) VL-CL-連接子-VH-CH1、c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL。特定而言，該連接子為至少 30 個胺基酸且較佳地 32 至 50 個胺基酸組成之多肽。該單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然雙硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 片段可藉由插入半胱胺酸殘基產生鏈間二硫鍵而得到進一步穩定 (例如，根據 Kabat 編號，在變異重鏈之位置 44 及變異輕鏈之位置 100 處插入)。
在另一態樣中，抗體片段為單鏈變異片段 (scFv)。「單鏈變異片段」 或 「scFv」 為抗體之重鏈 (VH) 及輕鏈 (VL) 的可變域之融合蛋白，其藉由連接子連接。特定而言，連接子為 10 個至 25 個胺基酸組成之短多肽，並且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解性，並且可將 VH 之 N 端與 VL 之 C 端連接，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接子，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269 頁至第 315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。
在另一態樣中，抗體片段為單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些態樣中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌) 之重組產生。 2. 多特異性抗體
在某些態樣中，本文所提供之可活化融合蛋白包含多特異性抗體，例如雙特異性抗體。「多特異性抗體」為對至少兩個不同位點 (亦即不同抗原上之不同抗原決定基或同一抗原上之不同抗原決定基) 具有結合特異性的單株抗體。在某些態樣中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些態樣中，結合特異性中之一者係針對標靶抗原，且其他特異性係針對任何其他抗原。在某些態樣中，雙特異性抗體可結合至同一標靶抗原之兩個 (或更多個) 不同的抗原決定基。多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現 (參見 Milstein 及 Cuello, Nature 305: 537 (1983)) 以及「杵-臼」工程化 (參見例如美國專利第 5,731,168 號及 Atwell 等人，J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體亦可藉由以下方法來製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子之工程化靜電轉向效應 (參見例如 WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如美國專利第 4,676,980 號，及 Brennan 等人，Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體 (參見例如，Kostelny 等人，J. Immunol.，148(5):1547-1553 (1992)；及 WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術規避輕鏈錯配問題 (參見例如 WO 98/50431)；使用「雙功能抗體」技術製備雙特異性抗體片段 (參見例如，Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參見例如 Gruber 等人，J. Immunol.，152:5368 (1994))；以及製備三特異性抗體，如闡述於例如 Tutt 等人 J. Immunol. 147: 60 (1991)。
本文亦包括具有三個或更多個抗原結合位點的工程化之抗體，包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies) 或 DVD-Ig (參見，例如，WO 2001/77342 及 WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點的多特異性抗體之其他實例可見於 WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792 及 WO 2013/026831 中。雙特異性抗體或其抗原結合片段亦包括「雙重作用 FAb」或「DAF」，其包含結合至標靶抗原以及另一不同的抗原或標靶抗原之兩個不同的抗原決定基之抗原結合位點 (參見例如，US 2008/0069820 及 WO 2015/095539)。
多特異性抗體也可提供為不對稱形式，其包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，即透過交換 VH/VL 域 (參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (參見例如 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 實現。在一個態樣中，多特異性抗體包含 cross-Fab 片段。術語「cross-Fab 片段」或「xFab 片段」或「交叉 Fab 片段」 是指其中重鏈和輕鏈之可變區或恆定區發生交換的 Fab 片段。cross-Fab 片段包含由輕鏈可變區 (VL) 和重鏈恆定區 1 (CH1) 構成之多肽鏈以及由重鏈可變區 (VH) 和輕鏈恆定區 (CL) 構成之多肽鏈。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確 Fab 配對，從而設計不對稱之 Fab 臂。參見例如 WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中 (參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
亦包括於本文中的特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體經設計為同時結合至靶細胞 (例如，腫瘤細胞) 上之表面抗原以及 T 細胞受體 (TCR) 複合物之活化、不變組分 (諸如 CD3)，用於重靶向 T 細胞或 NK 細胞以殺傷靶細胞。因此，在某些態樣中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，特定而言雙特異性抗體，其中結合特異性中之一者係針對標靶抗原，而另一者係針對 CD3。
可用於此目的之雙特異性抗體形式之實例包括但不限於所謂「BiTE」(雙特異性 T 細胞接合物) 分子，其中，兩個 scFv 分子透過柔性連接子融合 (參見例如 WO 2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261 及 WO 2008/119567；Nagorsen 及 Bäuerle，Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011))；雙功能抗體 (Holliger 等人，Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 及其衍生物，諸如串聯雙功能抗體 (「TandAb」；Kipriyanov 等人，J Mol Biol 293, 41-56 (1999))；「DART」(雙親和性重定位) 分子，其基於雙功能抗體形式，但具有 C 端二硫鍵以供進一步穩定 (Johnson 等人，J Mol Biol 399, 436-449 (2010))，以及所謂三功能抗體 (triomab)，它們為完整的小鼠/大鼠 IgG 雜合分子 (參見 Seimetz 等人的綜述：Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010))。本文所包括之特定 T 細胞雙特異性抗體形式描述於：WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；及 Bacac 等人 Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498。 3. 分子變異體
在某些態樣中，考慮了本文所提供之可活化融合蛋白之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改變抗原結合部分之結合親和力及/或其他生物特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗原結合部分之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任意組合以得到最終構築體，前提條件是最終構築體具有所期望之特徵，例如抗原結合特徵。 4. Fc 區域變異體
在某些態樣中，可將一或多種胺基酸修飾引入本文所提供之可活化融合蛋白之 Fc 區中，從而產生 Fc 區變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮一種具有一部分但非全部效應物功能之可活化融合蛋白，使其成為合需的候選抗體以用於以下應用：其中可活化融合蛋白之活體內半衰期係重要的，但某些效應物功能 (諸如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)) 係不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。舉例而言，可進行 Fc 受體 (FcR) 結合測定以確保可活化融合蛋白缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留了 FcRn 結合能力。用於媒介 ADCC 之初代細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核球則表現 FcγRI、FcγRII 及 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 (Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之ADCC 活性的活體外分析方法的非限制性實例描述於美國專利號 5,500,362 中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA83: 7059-7063 (1986)) 和 Hellstrom, I 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA82: 1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人，J. Exp. Med.166: 1351-1361 (1987))。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞分析技術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及 CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI)。用於此等測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或此外，可活體內評估所關注分子之 ADCC 活性，例如在動物模型中，諸如 Clynes 等人Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998) 中所揭示之動物模型。亦可實施 C1q 結合測定以確認可活化融合蛋白無法結合 C1q 且因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等人，Blood101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 和 M.J. Glennie，Blood103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合和活體內清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B.等人，Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929 Al)。
效應物功能降低的 Fc 區包括 Fc 區殘基 238、265、269、270、297、327 及 329 中之一或多者被取代之 Fc 區 (美國專利第 6,737,056 號)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的 Fc 區。(參見例如美國專利第 6,737,056 號；WO 2004/056312 及 Shields 等人, J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些態樣中，可活化融合蛋白包含具有一或多個胺基酸取代之 Fc 區，該等取代改良了 ADCC，例如 Fc 區之位置 298、333 及/或 334 (殘基之 EU 編號) 處之取代。
在某些態樣中，可活化融合蛋白包含具有一或多個胺基酸取代之 Fc 區，該等取代減弱了 FcγR 結合，例如 Fc 區之位置 234 及 235 (殘基之 EU 編號) 處之取代。在一個態樣中，取代為 L234A 及 L235A (LALA)。在某些態樣中，可活化融合蛋白進一步包含 Fc 區中之 D265A 及/或 P329G，其來源於人類 IgG1Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 及 P329G (LALA-PG)，其來源於人 IgG1Fc 區域。參見例如 WO 2012/130831。在另一態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 及 D265A (LALA-DA)，其來源於人 IgG1Fc 區域。
在一些態樣中，在 Fc 區中進行改變，得到改變的 (亦即改良的或減少的) C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如，如描述於美國專利第 6,194,551 號、WO 99/51642 及 Idusogie 等人J. Immunol.164: 4178-4184 (2000)。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer 等人J. Immunol.117:587 (1976) 和 Kim 等人J. Immunol.24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 或 434，例如 Fc 區殘基 434 之取代 (參見例如美國專利第 7,371,826 號；Dall'Acqua, W.F., 等人 J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524) 且可用於本文所描述之可活化融合蛋白中。
通過定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 相互作用至關重要之 Fc 區域殘基 (參見例如，Dall’Acqua, W.F. 等人 J. Immunol 169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 和 H435 (殘基的 EU 編號) 參與交互作用 (Medesan, C. 等人，Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人 Fc 與小鼠 FcRn 之相互作用至關重要 (Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於相互作用至關重要 (Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A. 等人 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 中，已經報導並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變體。
在某些態樣中，可活化融合蛋白包含具有一或多個胺基酸取代之 Fc 區，該等取代降低 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 253、及/或 310、及/或 435 (殘基之 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，可活化融合蛋白包含具有位置 253、310 及 435 處之胺基酸取代的 Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 I253A、H310A 及 H435A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。參見例如 Grevys, A 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在某些態樣中，可活化融合蛋白包含具有一或多個胺基酸取代之 Fc 區，該等取代降低 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 310、及/或 433、及/或 436 (殘基之 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，可活化融合蛋白包含具有位置 310、433 及 436 處之胺基酸取代的 Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 H310A、H433A 及 Y436A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。(參見例如 WO 2014/177460 Al)。
在某些態樣中，可活化融合蛋白包含具有一或多個胺基酸取代之 Fc 區，該等取代增加 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 252、及/或 254、及/或 256 (殘基之 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，可活化融合蛋白包含具有位置 252、254 及 256 處之胺基酸取代的 Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 M252Y、S254T 及 T256E，其來源於人 IgG1Fc 區域。另參見 Duncan & Winter,Nature322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
在如本文所報導之可活化融合蛋白包含 Fc 區之情況下，Fc 區之重鏈之 C 端可為以胺基酸殘基 PGK 結尾之完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。於一個優選態樣中，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 PG。在如本文所報導之所有態樣中之一個態樣中，包含包括如本文所指定之 C 端 CH3 域之 Fc 域重鏈多肽之可活化融合蛋白包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，胺基酸位置之 EU 索引編號)。在如本文所報導之所有態樣中之一個態樣中，包含包括如本文所指定之 C 端 CH3 域之重鏈之可活化融合蛋白包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置之 EU 索引編號)。 5. 例示性抗 IL-2 抗體
在一個態樣中，本發明提供了結合至人類 IL-2 (huIL-2) 之抗體。在一個態樣中，提供了結合至 SEQ ID NO:81 之人類 IL-2 之經分離的抗體。在一個態樣中，提供了結合至減弱的變異體 IL‑2v (SEQ ID NO:82) 之經分離的抗體。在一個態樣中，提供了結合至 SEQ ID NO:81 之人類 IL-2 及減弱的變異體 IL-2v (SEQ ID NO:82) 兩者的經分離的抗體。在一個態樣中，本發明提供了與人 IL-2 特異性結合的抗體。在一個態樣中，本發明提供了特異性結合至人類 IL-2 及人類 IL-2v 之抗體。在某些態樣中，抗 huIL-2 抗體結合至包含螺旋狀 A 及 C 之表面，且結合至人類 IL-2 及/或 IL-2v 之螺旋 B` 與 C (Stauber D. J., 等人, PNAS 2005) 之間的環。在某些態樣中，抗 huIL-2 抗體阻斷 IL-2 及/或 IL-2v 與 IL-2Rβγ 之相互作用。在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體另外阻斷 IL-2 及/或 IL-2v 與 IL-2Rα 之結合。在另一態樣中，抗 huIL-2 抗體以 ≤ 1.1 nM，特定而言 ≤ 0.8 nM 之親和力結合至人類 IL-2 及/或 IL-2v。
在一個態樣中，本發明提供了一種抗 huIL-2 抗體，其包含(A) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(B) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(C) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(D) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(E) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(F) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(G) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(H) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(I) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；或(J) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3。
在本文所提供之態樣中之任一者中，抗 huIL-2 抗體為人類化的。在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體進一步包含人類接受者框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。
在另一態樣中，抗 huIL-2 抗體包含以下之 CDR-H1、CDR-H2 及 CDR-H3 胺基酸序列：(A) SEQ ID NO:7 之 VH 域及 SEQ ID NO:8 之 VL 域；(B) SEQ ID NO:12 之 VH 域及 SEQ ID NO:13 之 VL 域；(C) SEQ ID NO:18 之 VH 域及 SEQ ID NO:19 之 VL 域；(D) SEQ ID NO:24 之 VH 域及 SEQ ID NO:25 之 VL 域；(E) SEQ ID NO:30 之 VH 域及 SEQ ID NO:31 之 VL 域；(F) SEQ ID NO:35 之 VH 域及 SEQ ID NO:36 之 VL 域；(G) SEQ ID NO:38 之 VH 域及 SEQ ID NO: 39 之 VL 域；(H) SEQ ID NO:41 之 VH 域及 SEQ ID NO:42 之 VL 域；(I) SEQ ID NO:44 之 VH 域及 SEQ ID NO:45 之 VL 域；或(J) SEQ ID NO:47 之 VH 域及 SEQ ID NO:48 之 VL 域。
在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體包含(A)(a) 含有 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(B)(a) 含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(C)(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(D)(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(E)(a) 重鏈可變域 (VH)，其包含 (a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:30 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(F)(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:35 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(G)(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(H)(a) 含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:42 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(I)(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:45 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；或(J)(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1；(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的 CDR-H2；(c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含 (d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1；(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2；及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；及 VH 域，其與 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體包含(A) 與 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；(B) 與 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；(C) 與 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；(D) 與 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；(E) 與 SEQ ID NO:30 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；(F) 與 SEQ ID NO:35 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；(G) 與 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；(H) 與 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:42 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；(I) 與 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:45 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域；或(J) 與 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VH 域及與 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性的 VL 域。
在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體包含(A) 含有 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列的 VL 域；(B) 含有 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 VL 域；(C) 含有 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列的 VL 域；(D) 含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的 VL 域；(E) 含有 SEQ ID NO:30 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列的 VL 域；(F) 含有 SEQ ID NO:35 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 VL 域；(G) 含有 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 VL 域；(H) 含有 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:42 之胺基酸序列的 VL 域；(I) 含有 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:45 之胺基酸序列的 VL 域；或(J) 含有 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列的 VH 域及含有 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列的 VL 域。
在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體包含(A) 含有 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:50 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(B) 含有 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(C) 含有 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(D) 含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(E) 含有 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(F) 含有 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(G) 含有 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(H) 含有 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(I) 含有 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列的輕鏈多肽；或(J) 含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽。
在一個態樣中，提供了一種抗 huIL-2 抗體，其中該抗體為 Fab 且包含如上文所提供之態樣中之任一者中的 VH 序列及如上文所提供之態樣中之任一者中的 VL 序列。在一個態樣中，抗體包含分別以下中之 VH 及 VL 序列：SEQ ID NO:7 及 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12 及 SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18 及 SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24 及 SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30 及 SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35 及 SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38 及 SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41 及 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44 及 SEQ ID NO:45 或 SEQ ID NO:47 及 SEQ ID NO:48，包含彼等序列之轉譯後修飾。在一個態樣中，抗體包含分別以下中之重鏈及輕鏈序列：SEQ ID NO:49 及 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51 及 SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53 及 SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55 及 SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57 及 SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59 及 SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61 及 SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63 及 SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65 及 SEQ ID NO:66 或 SEQ ID NO:67 及 SEQ ID NO:68，包含彼等序列之轉譯後修飾。
在本發明之另一態樣中，根據上述態樣中之任一者的抗 huIL-2 抗體為單株抗體，其包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體為抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或 F(ab’)2片段。在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體為 Fab。
在一個態樣中，根據上述態樣中之任一者之抗 huIL-2 抗體為 DutaFab。在一個態樣中，抗 huIL-2 抗體包含在可變輕鏈域 (VL 域) 及可變重鏈域 (VH 域) 之一個同源對內的人類 IL-2 互補位及非結合互補位 (亦即不與抗原決定基結合之互補位)，其中該非結合互補位包含來自抗原結合部分之 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，且其中該 IL-2 互補位包含來自抗原結合部分之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基。
在另一態樣中，抗體為全長抗體，例如本文所定義之完整 IgG1 抗體或其他抗體類別或同種型。
在另一態樣中，如本文所描述之抗體包含 SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74 或 SEQ ID NO:75 之 Fc 區多肽，或 SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79 或 SEQ ID NO:80 之人類重鏈恆定區。在另一態樣中，如本文所描述之抗體具有 IgG1 同型/亞類且包含 SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72 或 SEQ ID NO:73 之 Fc 區多肽，或 SEQ ID NO:78 或 SEQ ID NO:79 之人類重鏈恆定區。在一個態樣中，另外存在 C 端甘胺酸 (Gly446)。一方面，另外存在 C 端甘胺酸 (Gly446) 及 C 端離胺酸 (Lys447)。
在一個態樣中，如本文所描述之抗體包含至少一個在其重鏈多肽之 C 端處直接或經由肽連接子融合至 Fc 區多肽之 N 端的 Fab，其中 Fab 具有如上文所揭示之胺基酸序列，且其中 Fc 區多肽具有如上文所揭示之胺基酸序列。在特定態樣中，如本文所描述之抗體包含兩個 Fab，每個 Fab 在其重鏈多肽之 C 端處係直接或經由肽連接子共價接附至兩個 Fc 區多肽之兩個 N 端中之一者，其中 Fab 具有如上文所揭示之胺基酸序列，且其中 Fc 區多肽具有如上文所揭示之胺基酸序列。
在一個態樣中，提供了一種抗 huIL-2 抗體，其包含具有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈及具有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈。表 B ：抗 IL-2 Fab CDR 之 SEQ ID NO:
分子 ID 替代名稱 SEQ ID NO:
CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 VH VL
P1AG2505 P017.093 1 2 3 4 5 6 7 8
P1AG2535 P017.333 9 2 10 4 11 6 12 13
P1AG2542 P029.221 14 2 15 4 16 17 18 19
P1AH3716 P029.221.AM2 20 21 22 4 23 17 24 25
P1AH3717 P029.221.AM3 26 27 28 4 29 17 30 31
P1AH3718 P029.221.AM4 14 32 33 4 34 17 35 36
P1AH4136 P029.221.AM1.1 26 37 22 4 23 17 38 39
P1AH4137 P029.221.AM5.1 40 37 22 4 23 17 41 42
P1AH4138 P029.221.AM6.1 26 37 43 4 29 17 44 45
P1AI2583 P029.221.AM2 20 46 22 4 23 17 47 48
表 C ：抗 IL-2 抗體之胺基酸序列之描述
SEQ ID NO: 多肽之名稱及胺基酸序列
1 P1AG2505 (P017.093) 之 CDR-H1 WDMS
2 P1AG2505 (P017.093)、P1AG2535 (P017.333) 及 P1AG2542 (P029.221) 之 CDR-H2 AISGSGGSTYYADSVKG
3 P1AG2505 (P017.093) 之 CDR-H3 DSDFLDF
4 P1AG2505 (P017.093)、P1AG2535 (P017.333)、P1AG2542 (P029.221)、P1AH3716 (P029.221.AM2)、P1AH3717 (P029.221.AM3)、P1AH3718 (P029.221.AM4)、P1AH4136 (P029.221.AM1.1)、P1AH4137 (P029.221.AM5.1)、P1AH4138 (P029.221.AM6.1) 及 P1AI2583 (P029.221.AM2) 之 CDR-L1 RASQGISNYLA
5 P1AG2505 (P017.093) 之 CDR-L2 DNDVTLY
6 P1AG2505 (P017.093) 及 P1AG2535 (P017.333) 之 CDR-L3 QQYDNLPYT
7 P1AG2505 (P017.093) 之 VH 域 DSFLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAEKWMGLWDMSWVRQAPGKGL EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSDFLDFWGQGTLVTVSS
8 P1AG2505 (P017.093) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIFDNDVTLYSVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYDNLPYTFGQGTKLEIK
9 P1AG2535 (P017.333) 之 CDR-H1 DPMS
10 P1AG2535 (P017.333) 之 CDR-H3 DHDFIYK
11 P1AG2535 (P017.333) 之 CDR-L2 DSDRKYF
12 P1AG2535 (P017.333) 之 VH 域 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAQWLMPFDPMSWVRQAPGKGL EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKDHDFIYKWGQGTLVTVSS
13 P1AG2535 (P017.333) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDSDRKYFNVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYDNLPYTFGQGTKLEIK
14 P1AG2542 (P029.221) 及 P1AH3718 (P029.221.AM4) 之 CDR-H1 WQAMS
15 P1AG2542 (P029.221) 之 CDR-H3 DDDFFDI
16 P1AG2542 (P029.221) 之 CDR-L2 DVDWRDE
17 P1AG2542 (P029.221)、P1AH3716 (P029.221.AM2)、P1AH3717 (P029.221.AM3)、P1AH3718 (P029.221.AM4)、P1AH4136 (P029.221.AM1.1)、P1AH4137 (P029.221.AM5.1)、P1AH4138 (P029.221.AM6.1) 及 P1AI2583 (P029.221.AM2) 之 CDR-L3 QQYYSTPYT
18 P1AG2542 (P029.221) 之 VH 域 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWQAMSWVRQAPGKG LEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDIWGQGTLVTVSS
19 P1AG2542 (P029.221) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDVDWRDENVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIK
20 P1AH3716 (P029.221.AM2) 及 P1AI2583 (P029.221.AM2) 之 CDR-H1 WARMS
21 P1AH3716 (P029.221.AM2) 之 CDR-H2 AISGRGGSTYYADSVKG
22 P1AH3716 (P029.221.AM2)、P1AH4136 (P029.221.AM1.1)、P1AH4137 (P029.221.AM5.1) 及 P1AI2583 (P029.221.AM2) 之 CDR-H3 DDDFFDF
23 P1AH3716 (P029.221.AM2)、P1AH4136 (P029.221.AM1.1)、P1AH4137 (P029.221.AM5.1) 及 P1AI2583 (P029.221.AM2) 之 CDR-L2 DIDWRDS
24 P1AH3716 (P029.221.AM2) 之 VH 域 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWARMSWVRQAPGKG LEWVSAISGRGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSS
25 P1AH3716 (P029.221.AM2) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIK
26 P1AH3717 (P029.221.AM3)、P1AH4136 (P029.221.AM1.1) 及 P1AH4138 (P029.221.AM6.1) 之 CDR-H1 WSRMS
27 P1AH3717 (P029.221.AM3) 之 CDR-H2 AISGQGGSTYYADSVKG
28 P1AH3717 (P029.221.AM3) 之 CDR-H3 DDDFFDY
29 P1AH3717 (P029.221.AM3) 及 P1AH4138 (P029.221.AM6.1) 之 CDR-L2 DIDWQDS
30 P1AH3717 (P029.221.AM3) 之 VH 域 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWSRMSWVRQAPGKG LEWVSAISGQGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDYWGQGTLVTVSS
31 P1AH3717 (P029.221.AM3) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWQDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIK
32 P1AH3718 (P029.221.AM4) 之 CDR-H2 AISGRGGSTYYADSVKG
33 P1AH3718 (P029.221.AM4) 之 CDR-H3 DDDFVDI
34 P1AH3718 (P029.221.AM4) 之 CDR-L2 DVDWQDE
35 P1AH3718 (P029.221.AM4) 之 VH 域 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMPWQAMSWVRQAPGKG LEWVSAISGRGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFVDIWGQGTLVTVSS
36 P1AH3718 (P029.221.AM4) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDVDWQDEPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIK
37 P1AH4136 (P029.221.AM1.1)、P1AH4137 (P029.221.AM5.1) 及 P1AH4138 (P029.221.AM6.1) 之 CDR-H2 AISGTGGSTYYADSVKG
38 P1AH4136 (P029.221.AM1.1) 之 VH 域 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWSRMSWVRQAPGKG LEWVSAISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSS
39 P1AH4136 (P029.221.AM1.1) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIK
40 P1AH4137 (P029.221.AM5.1) 之 CDR-H1 WQRMS
41 P1AH4137 (P029.221.AM5.1) 之 VH 域 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWLGWQRMSWVRQAPGKG LEWVSAISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSS
42 P1AH4137 (P029.221.AM5.1) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIK
43 P1AH4138 (P029.221.AM6.1) 之 CDR-H3 DDDFVDF
44 P1AH4138 (P029.221.AM6.1) 之 VH 域 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWLPWSRMSWVRQAPGKG LEWVSAISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFVDFWGQGTLVTVSS
45 P1AH4138 (P029.221.AM6.1) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWQDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIK
46 P1AI2583 (P029.221.AM2) 之 CDR-H2 AISGRGGSTYYADSVKG
47 P1AI2583 (P029.221.AM2) 之 VH 域 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWARMSWVRQAPGKG LEWVSAISGRGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSS
48 P1AI2583 (P029.221.AM2) 之 VL 域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIK
49 P1AG2505 (P017.093) Fab 之重鏈 DSFLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAEKWMGLWDMSWVRQAPGKGL EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSDFLDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTSPPGSGMASMTGGQQMG
50 P1AG2505 (P017.093) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIFDNDVTLYSVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYDNLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
51 P1AG2535 (P017.333) Fab 之重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAQWLMPFDPMSWVRQAPGKGL EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKDHDFIYKWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTSPPGSGMASMTGGQQMG
52 P1AG2535 (P017.333) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDSDRKYFNVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYDNLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
53 P1AG2542 (P029.221) Fab 之重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWQAMSWVRQAPGKG LEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTSPPGSGMASMTGGQQMG
54 P1AG2542 (P029.221) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDVDWRDENVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
55 P1AH3716 (P029.221.AM2) Fab 之重鏈 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWARMSWVRQAPGKG LEWVSAISGRGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTSPPGSGMASMTGGQQMG
56 P1AH3716 (P029.221.AM2) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
57 P1AH3717 (P029.221.AM3) Fab 之重鏈 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWSRMSWVRQAPGKG LEWVSAISGQGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTSPPGSGMASMTGGQQMG
58 P1AH3717 (P029.221.AM3) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWQDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
59 P1AH3718 (P029.221.AM4) Fab 之重鏈 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMPWQAMSWVRQAPGKG LEWVSAISGRGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFVDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTSPPGSGMASMTGGQQMG
60 P1AH3718 (P029.221.AM4) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDVDWQDEPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
61 P1AH4136 (P029.221.AM1.1) Fab 之重鏈   IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWSRMSWVRQAPGKG LEWVSAISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTSPPGSGMASMTGGQQMG
62 P1AH4136 (P029.221.AM1.1) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
63 P1AH4137 (P029.221.AM5.1) Fab 之重鏈 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWLGWQRMSWVRQAPGKG LEWVSAISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTSPPGSGMASMTGGQQMG
64 P1AH4137 (P029.221.AM5.1) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
65 P1AH4138 (P029.221.AM6.1) Fab 之重鏈 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWLPWSRMSWVRQAPGKG LEWVSAISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFVDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTSPPGSGMASMTGGQQMG
66 P1AH4138 (P029.221.AM6.1) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWQDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
67 P1AI2583 (P029.221.AM2) Fab 之重鏈 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWARMSWVRQAPGKG LEWVSAISGRGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD K
68 P1AI2583 (P029.221.AM2) Fab 之輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAP KLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
69 人 IgG1 Fc 區多肽 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSP
70 人 IgG4 Fc 區多肽 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSL
71 具有 L234A、L235A 及 P329G 突變的人 IgG1 Fc 區 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSP
72 具有 L234A、L235A 及 P329G 突變以及 S354C、T366W (杵鏈) 的人 IgG1 Fc 區 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLP PSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSP
73 具有 L234A、L235A 及 P329G 突變以及 Y349C、T366S、L368A、Y407V (臼鏈) 的人 IgG1 Fc 區 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLP PSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSP
74 具有 S228P、L235E 及 P329G 突變以及 S354C 及 T366W 突變 (杵鏈) 的人 IgG4 Fc 區 ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSL
75 具有 S228P、L235E 及 P329G 突變以及 Y349C、T366S、L368A 及 Y407 突變 (臼鏈) 的人 IgG4 Fc 區 ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSL
76 人類 κ 輕鏈恆定區 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
77 人類 λ 輕鏈恆定區 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKAD SSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQV THEGSTVEKTVAPTECS
78 來源於 IgG1 的人類重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSP
79 來源於 IgG1 的人類重鏈恆定區，其包含突變 L234A、L235A 及 P329G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSP
80 來源於 IgG4 的人類重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHK PSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSL
81 人類 IL-2 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKF YMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISN INVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
82 人類 IL-2 (T3A、F42A、Y45Y、L72G、C125A) (= IL-2v) APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKF AMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISN INVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
83 hIL-2 訊號肽 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
84 未加工的人類 IL-2 (IL-2 前驅物) MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMI LNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEE VLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA TIVEFLNRWITFCQSIISTLT
85 人類 IL-2 受體次單元 α (IL2RA_人類) MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMA YKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQC QCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQAS LPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALH RGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQ ASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQ VAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI
在另一態樣中，如以下第 3 至 8 部分所描述，根據上述態樣中之任一者之抗 huIL-2 抗體可單獨或組合地併入任何特徵： 6. 抗體親和力
在某些態樣中，本文所提供之抗體具有 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM 或 ≤ 0.1 nM (例如 10-8M 或更小，例如，10‑8M 至 10-10M，例如，10-9M 至 10-10M) 之解離常數 (KD)。
在一個態樣中，KD係使用 Biacore®表面電漿子共振測定來量測。舉例而言，使用 Biacore®8K 或 8K+ 儀器 (Cytiva) 之測定係使用抗 Fab 捕獲裝置在 25℃ 下進行。在一個態樣中，根據供應商的說明，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 及N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 活化 CM5 羧甲基化葡聚醣生物感測器晶片 (Cytiva；目錄號 29149604)。用 10 mM 乙酸鈉 (pH 5) 將抗人類 Fab 抗體 (Cytiva；目錄號 28958325) 稀釋至 10 μg/ml，之後以 10 μl/分鐘的流速注入持續 500 s，以達成大約 5000 反應單位 (RU) 的偶合的蛋白質。注入抗人類 Fab 抗體後，注入 1 M 乙醇胺以阻斷未反應的基團。對於動力學量測，在 25℃ 下將 100 nM Fab 以 10 μl/min 之流速注入 HBS-EP+ 緩衝液 1x (Cytiva，目錄號 BR100669) 中持續 60 秒。將在 HBS-EP+ 緩衝液 1x 中稀釋之 0 nM、10 nM、50 nM 及 150 nM 之抗原 (IL-2、IL-2v 或 CD79B) 以 30 µl/min 的速率流動 120 sec，接著以 30 µl/min 流過 240 秒的解離窗口。藉由持續 60s 以 30 µl/min 之流速注入 10 mM 甘胺酸 pH 2 來再生表面。藉由同時擬合締合及解離感測圖，使用簡單的一對一 Langmuir 結合模型 (Biacore 8K 控制軟體版本 4.0.8.20368) 計算締合速率 (kon) 及解離速率 (koff)。平衡解離常數 (KD) 藉由 koff/kon比率計算得出。參閱，例如，Chen 等人，J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)。 7. 抗體片段
在某些態樣中，本文所提供之融合蛋白包含一個或多個抗體片段。在某些態樣中，本文提供之抗體為抗體片段。
在一個態樣中，抗體片段為 Fab、Fab'、Fab'-SH 或 F(ab')2片段，特定而言 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈可變域 (分別為 VH 和 VL) 及輕鏈之恆定域 (CL) 和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，術語「Fab 片段」係指包含輕鏈 (包含 VL 域和 CL 域) 及重鏈片段 (包含 VH 域和 CH1 域) 之抗體片段。「Fab’ 片段」與 Fab 片段的區別在於在 CH1 域的羧基末端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH 是 Fab' 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab')2片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2片段的論述，參見美國專利號 5,869,046。
在某些態樣中，抗體片段為 DutaFab。DutaFab 為 Fab，其中單一對 VH 域及 VL 域能夠特異性結合至兩個不同的抗原決定基，其中一個互補位包含來自 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 之胺基酸殘基，且另一互補位包含來自 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 之胺基酸殘基。在一個態樣中，DutaFab 包含在同源 VH/VL 對內的兩個不重疊互補位，並且以互斥之方式與兩個不同抗原決定基結合 (「Dutaflip」)。
在另一態樣中，抗體片段為雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體。「雙功能抗體」為具有兩個抗原結合位點 (其可為二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。
在又一態樣中，抗體片段為單鏈 Fab 片段。「單鏈 Fab 片段」或「scFab」是由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體重鏈恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成的多肽，其中該抗體域及該連接子在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL、b) VL-CL-連接子-VH-CH1、c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL。特定而言，該連接子為至少 30 個胺基酸且較佳地 32 至 50 個胺基酸組成之多肽。該單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然雙硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 片段可藉由插入半胱胺酸殘基產生鏈間二硫鍵而得到進一步穩定 (例如，根據 Kabat 編號，在變異重鏈之位置 44 及變異輕鏈之位置 100 處插入)。
在另一態樣中，抗體片段為單鏈變異片段 (scFv)。「單鏈變異片段」 或 「scFv」 為抗體之重鏈 (VH) 及輕鏈 (VL) 的可變域之融合蛋白，其藉由連接子連接。特定而言，連接子為 10 個至 25 個胺基酸組成之短多肽，並且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解性，並且可將VH 之 N 端與 VL 之 C 端連接，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接子，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269 頁至第 315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。
在另一態樣中，抗體片段為單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些態樣中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌) 之重組產生。 8. 嵌合和人源化抗體
在某些態樣中，本文提供之抗體為嵌合抗體。在某些態樣中，本文所提供之融合蛋白包含嵌合抗體或嵌合抗體之片段。某些嵌合抗體描述於例如美國專利號4,816,567；及 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)。在一個實例中，嵌合抗體包含非人可變區 (例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物如猴的可變區) 及人恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些態樣中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體為人源化抗體以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體之特異性及親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR (或其部分) 來源於非人抗體，並且 FR (或其部分) 來源於人抗體序列。人源化抗體視情況將包含人恆定區之至少一部分。在一些態樣中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人抗體 (例如衍生 CDR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci.13:1619-1633 (2008) 中，並且進一步描述於例如：Riechmann 等人， Nature332:323-329 (1988)；Queen 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA86:10029-10033 (1989)；US 專利號5,821,337、7,527,791、6,982,321 和 7,087,409；Kashmiri 等人，Methods36:25-34 (2005) (具體描述了決定區 (SDR) 接枝)；Padlan，Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (描述了「表面重塑」)；Dall’Acqua 等人，Methods36:43-60 (2005) (描述了「FR 改組」)；Osbourn 等人，Methods36:61-68 (2005)；及 Klimka 等人，Br. J. Cancer，83:252-260 (2000) (描述了 FR 改組的「導向選擇」法)。
可以用於人源化的人框架區域包括但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的框架區域 (參見例如 Sims 等人，J. Immunol.151:2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區域 (參見例如：Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:4285 (1992)；及 Presta 等人，J. Immunol.，151:2623 (1993))；人成熟的 (體細胞突變) 框架區域或人種系框架區域 (參見例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci.13:1619-1633 (2008))；以及來源於篩選 FR 文庫的框架區域 (參見例如：Baca 等人，J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997)；及 Rosok 等人，J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996))。 9. 人抗體
在某些態樣中，本文提供之抗體為人抗體。在其他態樣中，本文所提供之融合蛋白包含人抗體或人抗體之片段。可使用此領域中所公知的各種技術生產人抗體。人類抗體一般描述於 van Dijk 及 van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001) 以及 Lonberg,Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008) 中。
可透過對轉基因動物投予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以回應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。有關從轉基因動物中獲得人抗體的方法的綜述，參見 Lonberg，Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005)。另見例如：美國專利號 6,075,181 和 6,150,584 (描述了 XENOMOUSETM技術)；美國專利號 5,770,429 (描述了 HuMab® 技術)；美國專利號 7,041,870 (描述了 K-M MOUSE® 技術)；及美國專利申請公開號 US 2007/0061900 (描述了 VelociMouse® 技術)。由此等動物產生的來源於完整抗體的人可變區可被進一步修飾，例如透過與不同的人恆定區結合來修飾。
人抗體也可透過基於融合瘤的方法進行製備。用於生產人單株抗體的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤細胞株已有描述。(參見，例如，KozborJ.Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁 (Marcel Dekker，Inc., New York., 1987)；及 Boerner 等人，J. Immunol., 147: 86 (1991).)透過人 B 細胞融合瘤技術產生的人抗體也描述於 Li 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103:3557-3562 (2006)。其他方法包括描述於例如以下文獻中的那些：美國專利號 7,189,826 (描述了由融合瘤細胞株生產單株人 IgM 抗體)，及 Ni，Xiandai Mianyixue，26(4):265-268 (2006) (描述了人-人融合瘤)。人融合瘤技術 (Trioma 技術) 也描述於以下文獻中：Vollmers 及 Brandlein，Histology and Histopathology，20(3):927-937 (2005)；及 Vollmers 和 Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3):185-91 (2005)。
人抗體也可以藉由分離選自人源性噬菌體展示文庫的可變域序列來產生。然後可以將此等可變域序列與所需的人恆定域結合。下文描述了從抗體文庫中選擇人類抗體的技術。 10. 源自文庫之抗體
在某些態樣中，如本文所描述之抗體或抗原結合部分係來源於文庫。在其他態樣中，本文所提供之融合蛋白包含抗體，特定而言抗體片段，諸如來源於文庫之 Fab 或 DutaFab。用於本發明之抗體可藉由篩選組合文庫中具有所期望的一種或多種活性之抗體來分離。例如，用於篩選組合文庫的方法綜述於例如 Lerner 等人的Nature Reviews16:498-508 (2016)。例如，此領域中所知之多種方法用於產生噬菌體展示庫並篩選此等庫中具有所欲之結合特性的抗體。此等方法綜述於以下文獻中：Frenzel 等人的mAbs8:1177-1194 (2016)；Bazan 等人的Human Vaccines and Immunotherapeutics8:1817-1828 (2012)；及 Zhao 等人的Critical Reviews in Biotechnology36:276-289 (2016)；以及 Hoogenboom 等人的Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien 等人主編，Human Press，Totowa，NJ，2001)；及 Marks 和 Bradbury 的Methods in Molecular Biology248:161-175 (Lo 主編，Human Press，Totowa，NJ，2003)。
在某些噬菌體展示方法中，透過聚合酶鏈反應 (PCR) 分別選殖 VH 及 VL 基因庫，並在噬菌體文庫中隨機重組，然後可按照以下文獻所述之方法篩選抗原結合噬菌體：Winter 等人，Annual Review of Immunology12: 433-455 (1994)。噬菌體通常以單鏈 Fv (scFv) 片段或 Fab 片段展示抗體片段。來自免疫源的文庫無需構建融合瘤即可向免疫原提供高親和性抗體。替代地，可以在不進行任何免疫的情況下選殖天然譜系 (例如，來自人) 以向各種非自身以及自身抗原提供抗體之單一來源，如 Griffiths 等人在EMBO Journal12: 725-734 (1993)。此外，亦可以藉由自幹細胞選殖未重排的 V 基因片段，並使用含有隨機序列的 PCR 引子來編碼高度可變區 CDR3 並在活體外完成重排，由此合成天然文庫，如 Hoogenboom 及 Winter 在Journal of Molecular Biology227: 381-388 (1992)。描述人抗體噬菌體庫的專利公開包括例如：美國專利號 5,750,373、7,985,840、7,785,903 及 8,679,490；以及美國專利公開號 2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764 及 2007/0292936。
用於篩選組合文庫中具有所需活性之抗體的此領域中所公知方法的其他實例包括核醣體和 mRNA 展示以及用於細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞上的抗體展示和選擇的方法。酵母表面展示方法綜述於例如 Scholler 等人的Methods in Molecular Biology503:135-56 (2012)、及 Cherf 等人的Methods in Molecular biology1319:155-175 (2015) 以及 Zhao 等人的Methods in Molecular Biology889:73-84 (2012) 中。於核醣體展示方法描述於例如 He 等人的Nucleic Acids Research25:5132-5134 (1997) 及 Hanes 等人的PNAS94:4937-4942 (1997) 中。
從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視作人抗體或人抗體片段。 11. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。「多特異性抗體」為對至少兩個不同位點 (亦即不同抗原上之不同抗原決定基或同一抗原上之不同抗原決定基) 具有結合特異性的單株抗體。在某些態樣中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些態樣中，結合特異性中之一者係針對 IL-2 的，而其他特異性則係針對任何其他抗原。在某些態樣中，雙特異性抗體可以與人 IL-2 之兩個 (或更多個) 不同抗原決定基結合。多特異性 (例如，雙特異性) 抗體亦可以用於將細胞毒性劑或細胞定位於表現人 IL-2 之細胞。多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現 (參見 Milstein 及 Cuello,Nature305: 537 (1983)) 以及「杵-臼」工程化 (參見例如美國專利第 5,731,168 號及 Atwell 等人，J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體亦可藉由以下方法來製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子之工程化靜電轉向效應 (參見例如 WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如美國專利第 4,676,980 號，及 Brennan 等人，Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參見例如，Kostelny等人,J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 及 WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術來規避輕鏈錯配對問題 (參見例如 WO 98/50431)；使用「雙功能抗體」技術製備雙特異性抗體片段 (參見例如，Hollinger 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (scFv) 二聚體 (參見例如 Gruber等人, J. Immunol.,152:5368 (1994))；以及製備三特異性抗體，如闡述於例如 Tutt 等人J. Immunol.147: 60 (1991)。
本文亦包括具有三個或更多個抗原結合位點的工程化之抗體，包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies) 或 DVD-Ig (參見，例如，WO 2001/77342 及 WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點的多特異性抗體之其他實例可見於 WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792 及 WO 2013/026831 中。雙特異性抗體或其抗原結合片段亦包括「雙重作用 Fab」或「DAF」，其包含與人 IL-2 以及另一不同抗原或人 IL-2 的兩個不同抗原決定基結合之抗原結合位點 (參見，例如，US 2008/0069820 及 WO 2015/095539)。
多特異性抗體也可提供為不對稱形式，其包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，即透過交換 VH/VL 域 (參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (參見例如 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 實現。在一個態樣中，多特異性抗體包含 CrossFab。術語「CrossFab」或「xFab」或「交換型 Fab」係指其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區經互換的 Fab。CrossFab 包含由輕鏈可變區 (VL) 及重鏈恆定區 1 (CH1) 所構成的多肽鏈以及由重鏈可變區 (VH) 及輕鏈恆定區 (CL) 所構成的多肽鏈。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確 Fab 配對，從而設計不對稱之 Fab 臂。參見例如 WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中 (參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
亦包括於本文中的特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體經設計為與標靶細胞 (例如，腫瘤微環境中的腫瘤細胞/免疫細胞) 上之表面抗原及與 T 細胞受體 (TCR) 復合物之活化不變組分 (諸如 CD3) 同時結合，用於重靶向 T 細胞以殺死標靶細胞。因此，在某些態樣中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，特定而言雙特異性抗體，其中結合特異性中之一者係針對人 IL-2，而另一者係針對 CD3。
可用於此目的之雙特異性抗體形式之實例包括但不限於所謂「BiTE」(雙特異性 T 細胞接合物) 分子，其中，兩個 scFv 分子透過柔性連接子融合 (參見例如 WO 2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261 及 WO 2008/119567；Nagorsen 及 Bäuerle，Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011))；雙功能抗體 (Holliger 等人，Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 及其衍生物，諸如串聯雙功能抗體 (「TandAb」；Kipriyanov 等人，J Mol Biol 293, 41-56 (1999))；「DART」(雙親和性重定位) 分子，其基於雙功能抗體形式，但具有 C 端二硫鍵以供進一步穩定 (Johnson 等人，J Mol Biol 399, 436-449 (2010))，以及所謂三功能抗體 (triomab)，它們為完整的小鼠/大鼠 IgG 雜合分子 (參見 Seimetz 等人的綜述：Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010))。本文所包括之特定 T 細胞雙特異性抗體形式描述於：WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；及 Bacac 等人 Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498。 12. 抗體及可活化融合蛋白變異體
在某些態樣中，考慮到本文所提供之可活化融合蛋白及抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改變抗體或可活化融合蛋白中所包含的抗原結合部分之結合親和力及/或其他生物特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體或可活化融合蛋白之核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體或可活化融合蛋白之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或插入及/或取代。可以實施缺失、插入及取代之任意組合以得到最終構築體，前提條件為最終構築體具有期望之特性，例如，抗原結合。a) 取代、插入及刪除變異體
在某些態樣中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體 (或抗原結合域) 變異體。取代誘變的目標位點包括 CDR 和 FR。保守取代顯示於表 D 之「較佳取代」標題下。表 D 中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變化，並且如下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入所關注抗體中，並篩選具有所期望的活性之產物，例如，保留/改善的抗原結合特徵、降低的免疫原性或改善的 ADCC 或 CDC。
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組：(1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2) 中性親水性：Cys，Ser、，Thr，Asn，Gln；(3) 酸性：Asp，Glu；(4) 鹼性：His，Lys，Arg;(5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro；(6) 芳族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型的取代變異體涉及取代一個或多個親代抗體 (例如，人源化或人抗體) 之高度可變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體將相對於親代抗體在某些生物學特性 (例如提高親和性、降低免疫原性) 上具有修飾 (例如，改善) 及/或基本上保留親代抗體之某些生物學特性。例示性取代變異體是親和力成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和性成熟技術，例如本文所述的那些。簡而言之，取代一個或多個。CDR 殘基發生突變，並且變異體抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物學活性 (例如，結合親和性)。
可以在 CDR 中進行更改 (例如，取代)，以改善抗體親和性。此等修改可以在 CDR 「熱點」中進行，即由密碼子編碼的殘基在體細胞成熟過程中經歷發生突變 (參見例如 Chowdhury，Methods Mol. Biol.207: 179-196 (2008)) 及/或與抗原接觸的殘基，並測試所得變異體 VH 或 VL 之結合親和性。藉由構築二級文庫且自其中重新選擇以實現親和力成熟已描述於例如 Hoogenboom 等人Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien 等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001)) 中。在親和性成熟之某些態樣中，通過多種方法 (例如，易錯 PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變) 將多樣性引入選擇用於成熟的變異基因中。然後創建第二文庫。然後篩選該文庫，以識別具有所需之親和性的任何抗體變異體。引入多樣性的另一種方法是 CDR 定向方法，其中將若干 CDR 殘基 (例如，每次 4-6 個殘基) 隨機化。可通過例如丙胺酸掃描誘變或建模以特異性識別參與抗原結合的 CDR 殘基。特定而言，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為靶點。表 D
原始 殘基 例示性 取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
在某些態樣中，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中實施基本上不降低結合親和力的保留式修改 (例如，本文所提供之保留取代)。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之某些 VH 和 VL 序列變異體中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
鑑別可靶向誘變之抗體或抗原結合部分的殘基或區域之有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由 Cunningham 及 Wells (1989)Science, 244:1081-1085 所描述。在該方法中，識別殘基或目標殘基組 (例如，帶電荷的殘基，如 Arg、Asp、His、Lys 及 Glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸 (例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以確定抗體與抗原之交互作用是否受到影響。可在胺基酸位置處引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為用於取代的候選物而經靶向或消除。可篩選變異體以判定它們是否含有所期望之特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基到含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 (例如，對於 ADEPT (針對抗體之酶前藥治療)) 或提高抗體血清半衰期之多肽。b) 醣基化變異體
在某些態樣中，改變本文所提供之可活化融合蛋白或抗體以增加或減少抗體發生醣基化之程度，特定而言若可活化融合蛋白包含 Fc 域。抗體中的醣基化位點之添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當可活化融合蛋白或抗體包含 Fc 區時，可改變與其附接之寡糖。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵結接附至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。例如參見 Wright 等人，TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露醣、N-乙醯基葡醣胺 (GlcNAc)、半乳醣及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中接附至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些態樣中，可對本發明之抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個態樣中，提供了具有非岩藻醣基化寡醣之抗體及可活化融合蛋白變異體，亦即缺乏 (直接或間接地) 接附至 Fc 區之岩藻醣的寡醣結構。此等非岩藻醣基化寡醣 (也稱為「去岩藻醣基化」寡醣) 特定而言在雙天線型寡醣結構的莖中缺少接附至第一 GlcNAc 之岩藻醣殘基的 N-連接寡醣。在一個態樣中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區域中具有增加比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡醣的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻醣基化寡醣)。非岩藻醣基化寡糖之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡糖相對於接附至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡糖的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域位置 297 附近之天冬醯胺酸殘基 (Fc 區域殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡糖的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應功能，特定而言改善的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體或可活化融合蛋白之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；及敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人Biotech. Bioeng.87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一態樣中，抗體變異體或可活化融合蛋白之變異體被提供有二等分之寡醣，例如，其中接附至抗體之 Fc 區的雙天線型寡醣被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
亦提供了在寡醣上具有至少一個接附至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。c) Fc 區域變異體
在某些態樣中，可以在本文所提供之融合蛋白或抗體之 Fc 區中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮了一种具有一些但非全部效應功能的融合蛋白或抗體變異體，使其成為以下應用中期望之候選者：其中抗體活體內半衰期很重要，但某些效應功能 (諸如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 及抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)) 是不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。例如，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定，以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。媒介 ADCC 之初代細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核細胞則表現 FcγRI、FcγRII 及 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 (Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之ADCC 活性的活體外分析方法的非限制性實例描述於美國專利號 5,500,362 中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA83: 7059-7063 (1986)) 和 Hellstrom, I 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA82: 1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人，J. Exp. Med.166: 1351-1361 (1987))。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞分析技術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及 CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI)。用於此等測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。另選地或此外，可活體內評估所關注分子之 ADCC 活性，例如在動物模型中，諸如 Clynes 等人Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998) 中所揭示之動物模型。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等人，Blood101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 和 M.J. Glennie，Blood103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合和活體內清除率/半衰期測定亦可使用此項技術中所已知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B. 等人,Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929 Al)。
效應子功能下降的抗體或融合蛋白包括 Fc 區殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 中之一者或多者被取代之抗體 (美國專利第 6,737,056 號)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的抗體變異體。(參見例如美國專利第 6,737,056 號；WO 2004/056312 及 Shields 等人, J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些態樣中，融合蛋白或抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該一個或多個胺基酸取代改善 ADCC，例如，Fc 區之位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。
在某些態樣中，融合蛋白或抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該一個或多個胺基酸取代減弱 FcγR 結合，例如，Fc 區之位置 234 及 235 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在一個態樣中，取代為 L234A 及 L235A (LALA)。在某些態樣中，抗體變異體進一步包含 Fc 區中之 D265A 及/或 P329G，其來源於人 IgG1Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 及 P329G (LALA-PG)，其來源於人 IgG1Fc 區域。參見例如 WO 2012/130831。在另一態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 及 D265A (LALA-DA)，其來源於人 IgG1Fc 區域。
在一些態樣中，在 Fc 區中進行改變，得到改變的 (亦即改良的或減少的) C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如，如描述於美國專利第 6,194,551 號、WO 99/51642 及 Idusogie 等人J. Immunol.164: 4178-4184 (2000)。
具有增加的半衰期且改進了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer 等人,J. Immunol.117:587 (1976) 及 Kim 等人,J. Immunol.24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如 Fc 區域殘基 434 之取代 (參見例如美國專利號 7,371,826；Dall'Acqua, W.F. 等人，J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。
通過定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 相互作用至關重要之 Fc 區域殘基 (參見例如，Dall’Acqua, W.F. 等人 J. Immunol 169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 和 H435 (殘基的 EU 編號) 參與交互作用 (Medesan, C. 等人，Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人 Fc 與小鼠 FcRn 之相互作用至關重要 (Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於相互作用至關重要 (Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A. 等人 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 中，已經報導並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變體。
在某些態樣中，融合蛋白或抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該一個或多個胺基酸取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 253、及/或 310、及/或 435 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，融合蛋白或抗體變異體包含 Fc 區，該 Fc 區具有在位置 253、310 及 435 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 I253A、H310A 及 H435A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。參見例如 Grevys, A 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在某些態樣中，融合蛋白或抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該一個或多個胺基酸取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 310、及/或 433、及/或 436 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 310、433 及 436 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 H310A、H433A 及 Y436A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。(參見例如 WO 2014/177460 Al)。
在某些態樣中，融合蛋白或抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該一個或多個胺基酸取代增加 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 252、及/或 254、及/或 256 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，融合蛋白或抗體變異體包含 Fc 區，該 Fc 區具有在位置 252、254 及 256 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 M252Y、S254T 及 T256E，其來源於人 IgG1Fc 區域。另參見 Duncan & Winter,Nature322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
如本文所報告之抗體的重鏈之 C 末端可為以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 末端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。於一個優選態樣中，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 PG。在本文所報告的所有態樣中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 指數編號)。在本文所報告的所有態樣中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置的 EU 指數編號)。d) 半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些態樣中，可能期望產生半胱胺酸工程化抗體或可活化融合蛋白，例如，THIOMABTM抗體，其中抗體或可活化融合蛋白之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體或可活化融合蛋白之可進入的位點，且可用於使抗體或可活化融合蛋白與其他部分 (諸如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所描述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所屬的方法產生。e) 抗體衍生物
在某些態樣中，可以進一步修飾本文所提供之融合蛋白或抗體，以使含有此項技術中已知且容易獲得的附加非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三㗁𠮿、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚醣或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可係分支的或不分支的。接附至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果接附的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來判定，此等考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。B. 重組方法及組成物
可使用重組方法及組成物來產生如本文所描述之可活化融合蛋白或抗體，例如如 US 4,816,567 中所描述。對於此等方法，提供了編碼可活化融合蛋白之一或多個經分離的核酸。
在僅僅基於包含重鏈及輕鏈多肽之第一抗原結合部分之可活化融合蛋白的情況下，其中一者共價接附至配位體且另一者共價接附至掩蔽部分，需要兩個核酸，一個用於輕鏈多肽且另一個用於重鏈多肽。類似地，在天然抗體或天然抗體片段之情況下，則需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段且另一個用於重鏈或其片段。此類核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含可活化融合蛋白之 VH 的胺基酸序列 (例如，可活化融合蛋白之輕鏈及/或重鏈)。這些核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上。
在進一步包含第二抗原結合部分及具有異二聚體重鏈之 Fc 域之可活化融合蛋白之情況下，可能需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於第一重鏈 (其包含第一異源單體 Fc 區多肽)，一個用於第二輕鏈，且一個用於第二重鏈 (其包含第二異源單體 Fc 區多肽)。類似地，在具有異二聚體重鏈之雙特異性抗體之情況下，需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於第一重鏈 (其包含第一異源單體 Fc 區多肽)，一個用於第二輕鏈，且一個用於第二重鏈 (其包含第二異源單體 Fc 區多肽)。這四個核酸可包含在一個或多個核酸分子或表現載體中。此類核酸編碼包含第一 VL 之胺基酸序列、及/或包含第一 VH (包括第一異源單體 Fc 區) 之胺基酸序列、及/或包含第二 VL 之胺基酸序列、及/或包含第二 VH (包括可活化融合蛋白之第二異源單體 Fc 區) 之胺基酸序列 (例如，可活化融合蛋白之第一及/或第二輕鏈以及/或第一及/或第二重鏈)。這些核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上，通常這些核酸位於兩個或三個表現載體上，即一個載體可包含一個以上的這些核酸。這些雙特異性抗體的實例是 CrossMabs (參見例如 Schaefer, W. 等人，PNAS，108 (2011) 11187-1191)。例如，異源單體重鏈之一包含所謂「杵突變」 (T366W，視情況地為 S354C 或 Y349C 之一)，且另一個包含所謂「臼突變」 (T366S、L368A 及 Y407V，以及視情況的 Y349C 或 S354C) (參見例如 Carter, P. 等人，Immunotechnol.2 (1996) 73) (根據 EU 索引編號)。
在本發明之一個態樣中，根據本發明之可活化融合蛋白或抗體包含 Fc 域，該 Fc 域包含促進第一及第二 Fc 域重鏈多肽之締合的修飾。在一個態樣中，根據杵入臼方法，第一 Fc 域重鏈多肽包含杵且第二 Fc 域重鏈多肽包含臼。在本發明之特定態樣中，可活化融合蛋白之特徵在於第一 Fc 域重鏈多肽包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (根據 Kabat EU 索引編號)，且第二 Fc 域重鏈多肽包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
在本發明之一個態樣中，本文所描述之可活化融合蛋白或抗體包含兩個 Fab 作為抗原結合部分，其中該兩個 Fab 中之一者為交叉 Fab，亦即可活化融合蛋白之特徵在於第一及第二抗原結合部分為 Fab，且在該等 Fab 中之一者中，可變域 VL 及 VH 被彼此替換，使得 VH 域為輕鏈之一部分且 VL 域為重鏈之一部分。在一個態樣中，在兩個 Fab 片段中之一者之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸係獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，且在恆定域 CH1 中，位置 147 及 213 處之胺基酸係獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。在本發明之特定態樣中，在第一抗原結合部分之恆定區 CL 中，位置 124 處之胺基酸係獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，且在恆定域 CH1 中，位置 147 及 213 處之胺基酸係獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個態樣中，提供了編碼如本文報導之可活化融合蛋白或抗體之經分離的核酸。在一個態樣中，提供了編碼如使用於如本文所報導之方法中之可活化融合蛋白的經分離的核酸。在一個態樣中，提供了一種宿主細胞，其包含編碼如本文所報導之可活化融合蛋白之核酸。
在一個態樣中，提供了一種製備可活化融合蛋白或抗體之方法，其中該方法包含在適合於可活化融合蛋白或抗體之表現的條件下活體外培養包含編碼如上文所提供之可活化融合蛋白或抗體之核酸的宿主細胞，以及視情況自該宿主細胞 (及/或自宿主細胞培養基) 回收可活化融合蛋白或抗體。在一個態樣中，提供了一種藉由本文所報導之方法產生的可活化融合蛋白或抗體。
對於可活化融合蛋白或抗體之重組產生，將編碼例如如上文所描述之可活化融合蛋白或抗體之核酸分離且插入一或多個載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類核酸可使用習用程序 (例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼可活化融合蛋白之重鏈及輕鏈的基因的寡核苷酸探針) 輕易地分離且定序，或藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。
用於選殖或表現編碼可活化融合蛋白或抗體之多肽的載體之合適的宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言，可活化融合蛋白或抗體可能在細菌中產生，特定而言在無需醣基化及 Fc 效應物功能的情況下。有關抗體片段和多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另請參見 Charlton, K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. (編輯)，Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，可活化融合蛋白或抗體可與可溶性部分中之細菌細胞糊分離，且可進一步經純化。
除原核生物外，真核微生物 (諸如絲狀真菌或酵母) 亦為用於編碼可活化融合蛋白或抗體之多肽之載體的合適的選殖或表現宿主，包括其醣基化路徑已被「人類化」，從而產生具有部分或完全人類醣基化模式之可活化融合蛋白的真菌及酵母菌株。參見 Gerngross, T.U.，Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及 Li, H. 等人，Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。
用於表現 (醣基化的) 可活化融合蛋白或抗體之合適的宿主細胞亦衍生自多細胞生物 (無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特定而言用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 細胞。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見，例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978 及 US 6,417,429 (描述在基因轉殖植物中產生抗體的 PLANTIBODIESTM 技術)。
脊椎動物細胞亦可用為宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham, F.L. 等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 中所述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather, J.P.，Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather, J.P. 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關適用於抗體及其他蛋白質之產生的某些哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki, P. 及 Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 第 248 卷, Lo, B.K.C. (主編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 第 255-268 頁。
在一個態樣中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。C. 測定
可藉由此項技術中已知之各種測定法對本文所提供之可活化融合蛋白及抗體之物理/化學特性及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。 1. 結合測定及其他測定
在一個態樣中，例如藉由已知方法諸如 ELISA、西方墨點法等，檢測本發明之可活化融合蛋白之抗原結合活性。標靶及配位體結合親和力。
在某些態樣中，本文所提供之可活化融合蛋白之抗原結合域具有 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如 10-8M 或更小，例如 10-8M 至 10-13M，例如 10-9M 至 10-13M) 之解離常數 (KD)。
在一個態樣中，KD係使用 BIACORE®表面電漿子共振測定來量測。例如，使用 BIACORE®-2000 或 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway，NJ) 於 25℃ 用固定化抗原 CM5 晶片以 ~10 反應單位 (RU) 進行測定。在一個態樣中，根據供應商的說明，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 及N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 活化羧甲基化葡聚醣生物感測器晶片 (CM5，BIACORE, Inc.)。用 10 mM 醋酸鈉 (pH 4.8) 將抗原稀釋至 5 μg/ml (約 0.2 μM)，然後以 5 μl/分鐘的流速注入，以獲得大約 10 反應單位 (RU) 的偶合蛋白。注入抗原後，注入 1 M 乙醇胺以封閉未反應的基團。在動力學量測中，將 Fab 之兩倍連續稀釋液 (0.78 nM 至 500 nM) 在 25°C 下以約 25 μl/min 的流速注入含 0.05% 聚山梨醇酯 20 (TWEEN-20TM) 界面活性劑 (PBST) 的 PBS 中。藉由同時擬合締合及解離感測圖，使用簡單的一對一 Langmuir 結合模型（BIACORE®評估軟體版本 3.2）計算締合速率 (kon) 和解離速率 (koff)。平衡解離常數 (KD) 藉由 koff/kon比率計算得出。參閱，例如，Chen 等人，J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)。如果藉由上述表面電漿子共振測定法測得的締合速率 (on-rate) 超過 106M-1s-1，則可以使用螢光淬滅技術確定締合速率，該技術可量測 25°C 下 PBS (pH 7.2) 中的 20 nM 抗原抗體 (Fab 形式) 在濃度遞增之抗原存在下螢光發射強度的增加或減少 (激發波長 = 295 nm；發射波長 = 340 nm，帶通 16 nm)，該螢光發射強度可藉由分光光度計諸如停流分光光度計 (Aviv Instruments) 或帶有攪拌比色皿的 8000 系列 SLM-AMINCOTM分光光度計 (ThermoSpectronic) 測得。
在替代性方法中，KD係藉由經放射性標記之抗原結合測定 (RIA) 來量測。在一個態樣中，使用目標抗體及其抗原之 Fab 版進行 RIA。例如，藉由在連續系列未標記的抗原存在下用最小濃度的 (125I) 標記的抗原平衡 Fab，然後用抗 Fab 抗體塗覆的板捕獲結合的抗原，來量測 Fab 對抗原的溶液結合親和力 (參見例如 Chen 等人，J. Mol. Biol.293:865-881(1999))。為建立測定的條件，用 50 mM 碳酸鈉 (pH 9.6) 中的 5 μg/ml 捕獲抗 Fab 抗體 (Cappel Labs) 將 MICROTITER®多孔板 (Thermo Scientific) 包被越夜，且隨後用 PBS 中的 2% (w/v) 牛血清白蛋白在室溫 (約 23℃) 阻斷達兩至五小時。在非吸附板 (Nunc #269620) 中，將 100 pM 或 26 pM [125I]-抗原與所關注 Fab 的系列稀釋液混合 (例如，與 Presta 等人在Cancer Res.57: 4593-4599 (1997) 中所述之抗 VEGF 抗體 Fab-12 的評估結果一致)。然後將所關注 Fab 孵育越夜；但是，可繼續孵育更長時間 (例如，約 65 小時)，以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕獲板，用於在室溫進行孵育 (例如，孵育 1 小時)。然後除去溶液，用溶於 PBS 中的 0.1% 聚山梨醇酯 20 (TWEEN-20®) 將板洗滌八次。當板乾燥後，以 150 μl/孔的量添加閃爍劑 (MICROSCINT-20TM；Packard)，並在 TOPCOUNTTM伽瑪計數器 (Packard) 上計數十分鐘。選擇提供小於或等於最大結合濃度之 20% 的各 Fab 的濃度以使用於競爭性結合測定中。 2. 活性測定
在一個態樣中，提供了用於鑑別具有生物活性之可活化融合蛋白之測定法。生物活性可包括細胞激素活性或酵素活性。還提供了在活體內及/或活體外具有此等生物學活性之抗體。
在某些態樣中，測試本發明之可活化融合蛋白之此類生物活性，例如，在基於細胞之測定中，諸如 HEK-Blue™ 報導細胞測定 (Invivogen)。可產生報導細胞株以用於以標靶依賴性或獨立性方式測試可活化融合蛋白。HEK-Blue™ IL-2 細胞經由表現 IL-2R 鏈 (IL-2Rα、β 及 γ 次單元) 及下游傳訊級聯之效應物 (JAK3 及 STAT5) 以及 STAT5 誘導型分泌性鹼性磷酸酶 (SEAP) 報導基因系統來重現人類 IL-2R 傳訊路徑。添加 Quanti-BlueTM 受質 (Invivogen rep-qbs) 後，量測 650 nm 處之吸光度，與 SEAP 水準及 IL-2R 活性相關。藉由對 HEK-Blue™ IL 2 報導細胞株 (Invivogen hkb-il2) 進行基因工程化以表現所欲標靶抗原，例如 PD1，可對 HEK-Blue™ IL-2 報導細胞株進行修飾，以標靶依賴性方式評定 IL-2 路徑之活化。為了進行修飾，使用了轉座子載體系統，該系統由兩種質體組成：轉座子載體，其中所關註標靶抗原基因由兩個反向/同向重複序列 IR/DR 側接，以及編碼睡美人轉座酶 (Sleeping Beauty transposase) SB100x 之載體。編碼標靶抗原之全長 cDNA 被亞選殖至轉座子載體中，且帶有新黴素抗性。在最終質體中，標靶抗原表現在 UBC 啟動子之控制下。根據製造商的方案，使用 Lipofectamine 2000 試劑 (Invitrogen，#11668019) 將轉座子及轉座酶載體共轉染至 HEK-Blue IL-2 報導細胞 (Invivogen，#hkb-IL2) 中。將 HEK-Blue IL-2 細胞維持在補充有10% FCS (Gibco，#10500)、2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，#P04-80100)、含有殺稻瘟菌素 (blasticidin)、潮黴素 (hygromycin)、吉歐黴素 (zeocin) 之 1x HEK Blue CLR 選擇溶液 (Invivogen，#hb-csm) 及 1 µg/mL 嘌呤黴素 (Gibco，#A11138-03) 之 DMEM 培養基 (PAN，#P04-03609) 中。
使用 BD FACSAria III 細胞分選儀 (BD Biosciences) 藉由單一細胞分選來分離穩定表現標靶抗原之 HEK-Blue IL-2 細胞，且培養以建立穩定細胞殖株。篩選穩定細胞殖株之標靶抗原表現且進行擴增。表現水準及穩定性可藉由使用抗人類 TA 抗體在3週時段內進行流式細胞分析技術分析來確認。
另外，可根據製造商的方案進行具有人類 IL-2 刺激 (Miltenyi Biotec，#130-097-748) 之 QUANTI-Blue 測定 (Invivogen，#rep-qbs2)，以便確認經由 IL-2 路徑活化報導基因不受轉殖基因標靶抗原之穩定轉染的影響。
在某些態樣中，例如，在基於細胞之測定 (諸如 p-Stat5 測定) 中測試本發明之可活化融合蛋白之此類生物活性。在細胞激素 (例如 IL-2) 傳訊路徑之誘導下，一種稱為 STAT5 之蛋白質在活化的供體 T 細胞中被磷酸化。可使用抗體對磷酸-STAT5 (p-STAT5) 進行螢光染色，且從而可評定細胞之群體的細胞激素 (例如 IL-2) 活化。D. 醫藥組成物
在另一態樣中，提供了包含本文所提供之可活化融合蛋白或抗體中之任一者之醫藥組成物，例如其使用於以下治療方法中之任一者中。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之可活化融合蛋白或抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之可活化融合蛋白或抗體中之任一者及至少一種另外的治療劑，例如，如下文所描述。
藉由將具有所欲程度之純度的此類可活化融合蛋白或抗體與一或多種視情況選用之醫藥上可接受之載劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences第 16 版, Osol, A. 主編 (1980)) 混合，來製備如本文所描述之可活化融合蛋白或抗體的呈凍乾組成物或水溶液形式的醫藥組成物。醫藥上可接受之載劑在採用的劑量及濃度下通常對受體無毒，其包括但不限於：緩衝劑，例如組胺酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及蛋氨酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文中例示性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白 (sHASEGP)，例如，人類可溶性 PH-20 透明質酸酶醣蛋白，諸如 rHuPH20 (HYLENEX®，Halozyme, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及使用方法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 及 2006/0104968 中。在一個態樣中，sHASEGP 與一種或多種額外的糖胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
例示性凍乾組成物如美國專利第 6,267,958 號中所描述。水性組成物包括美國專利第 6,171,586 號及 WO 2006/044908 中所描述之彼等，後者之組成物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文所述之醫藥組成物還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分可以包載在例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒及奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。該等技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences(第 16 版，Osol, A. 主編，1980 年)。
可製備用於緩釋之醫藥組成物。緩釋製劑之合適的實例包括含有可活化融合蛋白或抗體之固體疏水聚合物的半透性基質，該等基質呈成形製品之形式，例如膜或微膠囊。
用於活體內投予之醫藥組成物通常為無菌的。無菌性可易於例如透過無菌濾膜過濾來實現。E. 治療方法及投予途徑
本文所提供之可活化融合蛋白或抗體中之任一者均可使用於治療方法中。
在一個態樣中，提供了一種用為藥物之可活化融合蛋白或抗體。在其他態樣中，提供了一種使用於治療疾病中之可活化融合蛋白或抗體。在某些態樣中，提供了一種使用於治療方法中之可活化融合蛋白或抗體。在某些態樣中，本發明提供了一種使用於治療患有疾病之個體的方法中之可活化融合蛋白或抗體，該方法包含向個體投予有效量之可活化融合蛋白或抗體。疾病可選自由以下所組成之群組：癌症、過度增生性疾病、自體免疫疾病、神經退化性疾病、肝病、腎病、肺病及心臟病。在一個此等態樣中，該方法進一步包含向個體投予有效量之至少一種另外治療劑 (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外治療劑)，例如，如下文所描述。在其他態樣中，本發明提供了一種可活化融合蛋白或抗體，其使用於活化細胞激素或趨化激素反應、抑制 (腫瘤) 細胞增生、募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如用於殺死腫瘤細胞之 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球、誘導細胞死亡以及活化各種細胞功能，諸如促進 B 細胞分泌抗體、活化 T 細胞、修飾 APC 之抗原呈現、促進免疫細胞子集之增生及分化、促進免疫調控功能、刺激進一步的細胞激素及趨化激素分泌、促進細胞存活或細胞凋亡、促進細胞趨化、促進或調控發炎反應、促進血管生成或促進造血。在某些態樣中，本發明提供了一種使用於方法中之可活化融合蛋白或抗體，該方法活化細胞激素或趨化激素反應、抑制 (腫瘤) 細胞增生、募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如用於殺死腫瘤細胞之 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球、誘導細胞死亡以及活化各種細胞功能，諸如促進 B 細胞分泌抗體、活化 T 細胞、修飾 APC 之抗原呈現、促進免疫細胞子集之增生及分化、促進免疫調控功能、刺激進一步的細胞激素及趨化激素分泌、促進細胞存活或細胞凋亡、促進細胞趨化、促進或調控發炎反應、促進個體中之血管生成或促進造血，該方法包含向個體投予有效量的可活化融合蛋白或抗體以活化細胞激素或趨化激素反應、抑制 (腫瘤) 細胞增生、募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如針對腫瘤細胞之 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球、誘導細胞死亡以及活化各種細胞功能，諸如促進 B 細胞分泌抗體、活化 T 細胞、修飾 APC 之抗原呈現、促進免疫細胞子集之增生及分化、促進免疫調控功能、刺激進一步的細胞激素及趨化激素分泌、促進細胞存活或細胞凋亡、促進細胞趨化、促進或調控發炎反應、促進血管生成或促進造血。根據上述態樣中任一者之「個體」較佳地為人類。
在另一態樣中，本發明提供了一種可活化融合蛋白或抗體在製造或製備藥物中之用途。在一個態樣中，藥物係用於治療疾病，特定而言選自由以下所組成之群組的疾病：癌症、過度增生性疾病、自體免疫疾病、神經退化性疾病、肝病、腎病、肺病及心臟病。在另一態樣中，藥物係使用於治療疾病之方法中，該疾病特定而言選自由以下所組成之群組的疾病：癌症、過度增生性疾病、自體免疫疾病、神經退化性疾病、肝病、腎病、肺病及心臟病，該方法包含向患有該疾病之個體投予有效量之藥物。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (例如，如下文所述) 投予個體。在另一態樣中，藥物係用於活化細胞激素或趨化激素反應、抑制 (腫瘤) 細胞增生、募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如針對腫瘤細胞之 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球、誘導細胞死亡以及活化各種細胞功能，諸如促進 B 細胞分泌抗體、活化 T 細胞、修飾 APC 之抗原呈現、促進免疫細胞子集之增生及分化、促進免疫調控功能、刺激進一步的細胞激素及趨化激素分泌、促進細胞存活或細胞凋亡、促進細胞趨化、促進或調控發炎反應、促進血管生成或促進造血。在另一態樣中，藥物係使用於方法中，該方法活化細胞激素或趨化激素反應、抑制 (腫瘤) 細胞增生、募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如針對腫瘤細胞之 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球、誘導細胞死亡以及活化各種細胞功能，諸如促進 B 細胞分泌抗體、活化 T 細胞、修飾 APC 之抗原呈現、促進免疫細胞子集之增生及分化、促進免疫調控功能、刺激進一步的細胞激素及趨化激素分泌、促進細胞存活或細胞凋亡、促進細胞趨化、促進或調控發炎反應、促進個體中之血管生成或促進造血，該方法包含向個體投予有效量的藥物以活化細胞激素或趨化激素反應、抑制 (腫瘤) 細胞增生、募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如針對腫瘤細胞之 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球、誘導細胞死亡以及活化各種細胞功能，諸如促進 B 細胞分泌抗體、活化 T 細胞、修飾 APC 之抗原呈現、促進免疫細胞子集之增生及分化、促進免疫調控功能、刺激進一步的細胞激素及趨化激素分泌、促進細胞存活或細胞凋亡、促進細胞趨化、促進或調控發炎反應、促進血管生成或促進造血。根據上述任一態樣中的「個體」可以是人。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療疾病之方法，該疾病特定而言選自由以下所組成之群組的疾病：癌症、過度增生性疾病、自體免疫疾病、神經退化性疾病、肝病、腎病、肺病及心臟病。在一個態樣中，方法包含向患有此疾病之個體投予有效量之可活化融合蛋白或抗體，該疾病特定而言選自由以下所組成之群組的疾病：癌症、過度增生性疾病、自體免疫疾病、神經退化性疾病、肝病、腎病、肺病及心臟病。在一個此類樣態中，如下所述，該方法進一步包含向個體投予有效量之至少一種另外的治療劑。
根據上述任一態樣中的「個體」可以是人。
在另一態樣中，本發明提供一種方法，其使用於活化細胞激素或趨化激素反應、抑制 (腫瘤) 細胞增生、募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如針對腫瘤細胞之 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球、誘導細胞死亡以及活化各種細胞功能，諸如促進 B 細胞分泌抗體、活化 T 細胞、修飾 APC 之抗原呈現、促進免疫細胞子集之增生及分化、促進免疫調控功能、刺激進一步的細胞激素及趨化激素分泌、促進細胞存活或細胞凋亡、促進細胞趨化、促進或調控發炎反應、促進個體中之血管生成或促進造血。在一個態樣中，方法包含向個體投予有效量之可活化融合蛋白或抗體以活化細胞激素或趨化激素反應、抑制 (腫瘤) 細胞增生、募集 T 細胞、γδ T 細胞或其他先天免疫細胞，例如針對腫瘤細胞之 NK 細胞、巨噬細胞/單核球、嗜中性球、誘導細胞死亡以及活化各種細胞功能，諸如促進 B 細胞分泌抗體、活化 T 細胞、修飾 APC 之抗原呈現、促進免疫細胞子集之增生及分化、促進免疫調控功能、刺激進一步的細胞激素及趨化激素分泌、促進細胞存活或細胞凋亡、促進細胞趨化、促進或調控發炎反應、促進血管生成或促進造血。在一個態樣中，「個體」為人。
在另一態樣中，本發明提供了包含本文所提供之可活化融合蛋白或抗體中之任一者之醫藥組成物，例如其使用於上述任何治療方法中。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之可活化融合蛋白或抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之可活化融合蛋白或抗體中之任一者及至少一種另外的治療劑，例如，如下文所描述。
本發明之可活化融合蛋白或抗體可單獨投予或使用於組合療法中。例如，組合療法包括投予本發明之可活化融合蛋白或抗體且投予至少一種另外的治療劑 (例如，一、二、三、四、五或六種另外的治療劑)。在某些態樣中，組合療法包含投予本發明之可活化融合蛋白或抗體且投予至少一種另外的治療劑。
可活化融合蛋白或抗體 (及任何另外的治療劑) 可藉由任何合適的方式投予，包括腸胃外、肺內及鼻內投予，且若需要局部治療，則可採用病灶內投予。本發明之可活化融合蛋白或抗體亦可作為 mRNA 經由基因療法載體藉由注射的細胞株來遞送。腸胃道外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。投予可藉由任何合適的途徑進行，例如藉由注射，諸如靜脈內、皮下或腫瘤內注射，部分取決於短暫投予或長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予及脈衝輸注。
本發明之可活化融合蛋白或抗體將按照與良好醫學實踐一致的方式進行調配、給藥及投予。在這種情況下，所慮及之因素包括待治療之特定病症、待治療之特定哺乳動物、個別患者的臨床病症、病症之原因、遞送藥劑的部位、投予方法、投予日程及醫療從業者已知的其他因素。可活化融合蛋白或抗體並非必須，但視情況與一或多種目前用於預防或治療所討論之病症的藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量取決於醫藥組成物中所存在之可活化融合蛋白或抗體之量、病症或治療之類型以及上文所論述之其他因素。此等藥劑通常以與本文中所述者相同的劑量及投予途徑、或本文中所述劑量的約 1% 至 99%、或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量及藉由任意途徑使用。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體的適當劑量 (單獨使用或與一種或多種其他其他治療劑組合使用) 將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重度和病程、為了預防或是治療的目的施用該抗體、之前的治療、患者的臨床病史和對該抗體的反應及主治醫師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者投予抗體。根據疾病的類型和嚴重程度不同，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.1mg/kg – 10mg/kg) 的抗體可為例如透過一次或多次分開的施用或透過連續輸注來對患者施用的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體的一種例示性劑量將在從 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可以對患者施用約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三週施用 (例如，使得患者接受約兩種至約二十種或例如約六種劑量的抗體)。可投予初始較高的負載劑量，隨後投予一個或多個較低劑量。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。本發明之實施例
下文中列出本發明之具體實施例：1. 一種可活化融合蛋白，其包含(a) 能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽之第一抗原結合部分，(b) 能夠特異性結合至配位體結合部分之配位體，以及(c) 能夠特異性結合至配位體之掩蔽部分，其特徵在於，配位體係經由第一肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之一者的 N 端，掩蔽部分係經由第二肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之兩種多肽中之另一者的 N 端，且該第一肽連接子及該第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。2. 如實施例 1 之可活化融合蛋白，其中該第一抗原結合部分為抗體或抗體片段。3. 如實施例 2 之可活化融合蛋白，其中該抗體片段係選自由以下所組成之群組：Fab、DutaFab、scFab、DAF、Fv、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙功能抗體、線性抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。4. 如實施例 1 至 3 中任一項之可活化融合蛋白，其中該配位體係選自由以下所組成之群組：生長因子、細胞激素、趨化激素、抗體、抗體片段、酶、受體配位體、親和力肽配位體、肽激素、受體激動劑、受體拮抗劑、酶、可溶性受體、蛋白質毒素、可溶性配位體、細胞表面受體之胞外區、細胞表面配位體之胞外區、小分子或其任何組合，較佳地細胞激素。5. 如實施例 1 至 4 中任一項之可活化融合蛋白，其中該配位體結合部分係選自由以下所組成之群組：生長因子受體、細胞激素受體、抗原、配位體受體、酶受質、螢光標記、放射性標記或激素受體，較佳地細胞激素受體。6. 如實施例 1 至 5 中任一項之可活化融合蛋白，其中該掩蔽部分係選自由以下所組成之群組：抗體、抗體片段、抗體模擬物、單鏈抗原結合部分、肽掩蔽物、抗獨特型抗體或抗獨特型抗體片段 (僅若配位體為抗體/抗體片段時) 或能夠特異性結合至配位體之受體、蛋白質抑制劑或結合蛋白。7. 如實施例 6 之可活化融合蛋白，其中該掩蔽部分為選自由以下所組成之群組的單鏈抗原結合部分：scFv、scFab、VHH、VNAR、域抗體 (dAb)、DARPin、親和體、單功能抗體、抗運載蛋白及單域抗體 (sdAb)。8. 如實施例 1 至 7 中任一項之可活化融合蛋白，其中該掩蔽部分可逆地結合至該配位體。9. 如實施例 1 至 8 中任一項之可活化融合蛋白，其中該掩蔽部分與該配位體之結合在空間上阻擋該第一抗原結合部分與該抗原之結合。10. 如實施例 1 至 9 中任一項之可活化融合蛋白，其中當與單獨的第一抗原結合部分之親和力相比時，該可活化融合蛋白中之該第一抗原結合部分之親和力降低。11. 如實施例 1 至 10 中任一項之可活化融合蛋白，其中當該掩蔽部分結合至該配位體時，會阻擋該第一抗原結合部分與該抗原結合。12. 如實施例 1 至 11 中任一項之的可活化融合蛋白，其進一步包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分包含a) 至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽，或b) 單鏈抗原結合部分，較佳地選自由以下所組成之群組的單鏈抗原結合部分：scFv、scFab、VHH、VNAR、域抗體 (dAb)、DARPin、親和體、單功能抗體、抗運載蛋白及單域抗體 (sdAb)。13. 如實施例 1 至 12 中任一項之可活化融合蛋白，其進一步包含 Fc 域，該 Fc 域包含第一 Fc 域重鏈多肽及第二 Fc 域重鏈多肽。14. 如實施例 13 之可活化融合蛋白，其中該第一抗原結合部分在該第一重鏈多肽之 C 端處係共價接附至兩個 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端或 C 端。15. 如實施例 14 之可活化融合蛋白，其中該第一抗原結合部分之該第一重鏈多肽或該第一輕鏈多肽在其 C 端處係共價接附a) 至該第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或b) 至該第一 Fc 域重鏈多肽之 C 端。16. 如實施例 13 至 15 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第二抗原結合部分係共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 N 端或 C 端。17. 如實施例 16 之可活化融合蛋白，其中該第二抗原結合部分為 Fab、Dutafab、DAF 或 DBA，且該第二抗原結合部分之第二重鏈多肽或第二輕鏈多肽在其 C 端處係共價接附a) 至該第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或b) 至該第一 Fc 域重鏈多肽或該第二 Fc 域重鏈多肽之 C 端。18. 如實施例 13 之可活化融合蛋白，其中a) 該第一抗原結合部分之該第一重鏈多肽在其 C 端處係共價接附至該第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端且該第二抗原結合部分在其 C 端處係共價接附至該第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或b) 該第一抗原結合部分之該第一重鏈多肽係共價接附至第一或第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，且該第二抗原結合部分，較佳地在其 C 端 (特定而言若該第二抗原結合部分具有重鏈多肽及輕鏈多肽，則為該第二重鏈多肽之 C 端) 處係共價接附至第一或第二 Fc 域重鏈多肽之 C 端。19. 如實施例 12 至 15 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第二抗原結合部分在其 C 端 (特定而言若該第二抗原結合部分具有重鏈多肽及輕鏈多肽，則為該第二重鏈多肽之 C 端) 處係經由第三肽連接子共價接附至配位體且該第三肽連接子不包含蛋白酶切割位點。20. 如實施例 13 之可活化融合蛋白，其中a) 該第二抗原結合域在其重鏈多肽或輕鏈多肽之 N 端處係經由第三肽連接子共價接附至該 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端或 C 端，且/或b) 該 Fc 域之第一重鏈多肽在 N 端或 C 端處係經由第四肽連接子共價接附至配位體之 N 端，且該第三及 (若存在) 第四肽連接子不包含蛋白酶切割位點。21. 如實施例 13 之可活化融合蛋白，其中該掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體，其在其 C 端處經由肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽。22. 如實施例 13 之可活化融合蛋白，其中該掩蔽部分包含單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽。23. 如實施例 12 至 22 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第二抗原結合部分能夠特異性結合至與該標靶抗原相同的抗原或不同的抗原。24. 如實施例 23 之可活化融合蛋白，其中該第二抗原結合部分 (a) 能夠特異性結合至標靶抗原，且 (b) 能夠特異性結合至該標靶抗原上與該抗原決定基不同的抗原決定基，該抗原決定基由該第一抗原結合部分結合。25. 如實施例 23 之可活化融合蛋白，其中該第二抗原結合部分能夠特異性結合至標靶抗原上與該第一抗原結合部分相同的抗原決定基。26. 如實施例 1 至 23 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第一抗原結合部分為 IgG 類型之抗體。27. 如實施例 13 至 26 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第一抗原結合部分、該第二抗原結合部分及 Fc 區一起形成 IgG 類型之抗體。28. 如實施例 13 至 27 中任一項之可活化融合蛋白，其中該 Fc 域為 IgG Fc 域，特定而言 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域。29. 如實施例 26 至 28 中任一項之可活化融合蛋白，其中該可活化融合蛋白包含至少兩條全長 IgG 抗體重鏈，且其中該抗原結合部分之重鏈具有 γ 類型 (IgG)，特定而言 γ1 類型。30. 如實施例 1 至 29 中任一項之可活化融合蛋白，其中該可活化融合蛋白包含至少兩條輕鏈，且其中該輕鏈係選自卡帕 (κ) 及/或拉目達 (λ) 亞型。31. 如實施例 13 或 30 中任一項之可活化融合蛋白，其中該 Fc 域包含一或多個胺基酸取代，該一或多個胺基酸取代降低與 Fc 受體之結合，特定而言與 Fcγ 受體之結合。32. 如實施例 13 至 31 中任一項之可活化融合蛋白，其中該 Fc 域具有人類 IgG1 亞類，其具有胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。33. 如實施例 13 至 32 中任一項之可活化融合蛋白，其中 該Fc 域包含促進第一及第二 Fc 域重鏈多肽之締合的修飾。34. 如實施例 13 至 33 中任一項之可活化融合蛋白，其中根據杵入臼方法，該第一 Fc 域重鏈多肽包含杵且該第二 Fc 域重鏈多肽包含臼。35. 如實施例 13 至 34 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第一 Fc 域重鏈多肽包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (根據 Kabat EU 索引編號)，且該第二 Fc 域重鏈多肽包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。36. 如實施例 1 至 35 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第一及第二抗原結合部分為 Fab，且在該等 Fab 中之一者中，可變域 VL 及 VH 被彼此替換，使得 VH 域為輕鏈之一部分且 VL 域為重鏈之一部分。37. 如實施例 36 之可活化融合蛋白，其中在該兩個 Fab 片段中之一者之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且在恆定域 CH1 中，位置 147 及 213 處之胺基酸獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。38. 如實施例 36 或 37 之可活化融合蛋白，其中在該第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且在恆定域 CH1 中，位置 147 及 213 處之胺基酸獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。39. 如實施例 1 至 38 中任一項之可活化融合蛋白，其中該標靶抗原係選自由以下所組成之群組：α-突觸核蛋白、類澱粉蛋白 β、BCMA、BTLA、CD3e、CD4、CD8、CD14、CD16 (FcgRIIIa)、CD19、CD20、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD44、CD47、CD52、CD70、CD109、CD123、CD137、CEACAM5、c-MET、CTLA4、DLL3、CXCR4、EDB-FN、EpCAM、表皮生長因子受體 (EGFR)、EPO 受體、FAPα、FGFR2、FGFR3、GD-2、GP100、GITR、GLP-1 受體、GM-CSF、GPC3、Grp78、刺蝟蛋白、HER2、HER3、HLA-G、ICAM (ICAM-1、-2、-3、-4、-5)、IGF-1R、IL-1R1、IL-4Rα、整聯蛋白 αv、b7 整聯蛋白次單元、a4b7 整聯蛋白、a4 整聯蛋白、LAG3、LIGHT、LRP1、MAdCAM、MHC、MUC1、MICA、MICB、NKG2D、NKp30、nKp46、Notch1、Notch3、NRP1、NRP2、OX40、PAR-2、PD-1、PD-L1、PDGFR、PSA、PSMA、SLAMF6、SR-A1、SR-A3、SR-A4、SR-A5、SR-A6、SR-B、dSR-C1、SR-D1、SR-E1、SR-F1、SR-F2、SR-G、SR-H1、SR-H2、SR-11、SR-J1、多配體蛋白聚醣 1、TGFβ、TGF-γ、TCR、gdTCR、TGFBR1、TGFBR2、TIM-3、TLR2、TLR3、Trap、Trop2、VAP‑1、VCAM、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 或 5T4。40. 如實施例 39 之可活化融合蛋白，其中該標靶抗原係選自由 PD1、IL-2、CD8 及 CD19 所組成之群組。41. 如實施例 1 至 40 中任一項之可活化融合蛋白，其中該配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：干擾素、介白素、趨化激素、淋巴激素、單核激素、群落刺激因子及腫瘤壞死因子，特定而言選自由干擾素及介白素所組成之群組。42. 如實施例 41 之可活化融合蛋白，其中該配位體為選自由以下所組成之群組的細胞激素：BMP、CSF-1、胰島素、GLP-1、HGH、IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、GM-CSF、FGF、EGF、G-CSF、IFNα、IFNβ、IFNγ、PDGF、TGFβ、TNFα、TNFβ、VEGF 或 EPO。43. 如實施例 41 或 42 之可活化融合蛋白，其中該細胞激素係選自由 IL-2、IL-7、IL-21 及 IFNα 所組成之群組。44. 如實施例 1 至 40 中任一項之可活化融合蛋白，其中該配位體為抗原結合部分。45. 如實施例 39 之可活化融合蛋白，其中該抗原結合部分為能夠特異性結合至選自由以下所組成之群組的抗原的抗體或抗體片段：BCMA、CD3、CD20、CD19、CD27、CD28、CD40、CD47、CD123、CD137、CEA、CTLA4、DLL3、EpCAM、HLA-G、GP100、GITR、HER2、IL-7、犬尿胺酸酶、MICA、MICB、OX40、IL-2、PD-1、TGFBR2 之胞外域、TNF 或 VEGF-C。46. 如實施例 1 至 45 中任一項之可活化融合蛋白，其中該配位體為選自由以下所組成之群組的非細胞激素配位體：生長因子、趨化激素、抗體、抗體片段、酶、受體配位體、親和力肽配位體、肽激素、受體激動劑、受體拮抗劑、酶、可溶性受體、蛋白質毒素、可溶性配位體、細胞表面受體之胞外區、細胞表面配位體之胞外區、小分子或其任何組合。47. 一種經分離的核酸，其編碼如實施例 1 至 46 中任一項之可活化融合蛋白。48. 一種經分離之宿主細胞，其包含如實施例 47 之核酸。49. 一種產生如實施例 1 至 46 中任一項之可活化融合蛋白之活體外方法，其包含在適合於該可活化融合蛋白之表現的條件下培養如實施例 48 之宿主細胞。50. 如實施例 49 之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該可活化融合蛋白。51. 一種可活化融合蛋白，其係藉由如實施例 49 或實施例 50 之方法來產生。52. 一種醫藥組成物，其包含如實施例 1 至 46 或 51 中任一項之可活化融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。53. 如實施例 1 至 46 或 51 中任一項之可活化融合蛋白或如實施例 52 之醫藥組成物，其用為藥物。54. 如實施例 1 至 46 或 51 中任一項之可活化融合蛋白或如實施例 52 之醫藥組成物，其使用於治療癌症、病毒感染或自體免疫疾病。55. 一種如實施例 1 至 46 或 51 中任一項之可活化融合蛋白或如實施例 52 之醫藥組成物在製造用於治療癌症、病毒感染或自體免疫疾病之藥物中之用途。56. 一種可活化融合蛋白，其包含(a) 第一抗原結合部分，其能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽，(b) 第二抗原結合部分，其包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽，(c) 能夠特異性結合至配位體結合部分之配位體，以及(d) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至該配位體之單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽，其中該第一肽連接子及該第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。57. 一種可活化融合蛋白，其包含(a) 第一抗原結合部分，其能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽，(b) 第二抗原結合部分，其包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽，(c) 能夠特異性結合至配位體結合部分之配位體，以及(d) 掩蔽部分，其包含能夠特異性結合至該配位體之單鏈抗原結合部分，其中可活化融合蛋白包含a) 第一多肽，其包含 (a1) 掩蔽部分，其在其 C 端處經由第二肽連接子融合至第一抗原結合部分之重鏈多肽之 N 端，(a2) 第一抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第一重鏈多肽之 N 端，及 (a3) Fc 域之第一重鏈多肽，b) 第二多肽，其包含 (b1) 配位體，其在其 C 端處經由第一肽連接子融合至第一抗原結合部分之輕鏈多肽之 N 端，及 (b2) 第一抗原結合部分之輕鏈多肽，c) 第三多肽，其包含 (c1) 第二抗原結合部分之重鏈多肽，其在其 C 端處融合至 Fc 域之第二重鏈多肽之 N 端，及 (c2) Fc 域之第二重鏈多肽，以及d) 第四多肽，其包含第二抗原結合部分之輕鏈多肽，其中該第一肽連接子及該第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。58. 一種抗體，其結合至 huIL-2 或其變異體，其中該抗體結合至在 SEQ ID NO:81 之胺基酸殘基 8 至 17、胺基酸殘基 30 及/或胺基酸殘基 77 至 81 內的 huIL-2 之抗原決定基；且從而抑制 huIL-2 與人類 IL-2Rβγ 及與人類 IL-2Rα 之結合。59. 如實施例 58 之抗體，其中該抗原決定基包含對應於 SEQ ID NO:81 之 K8、Q13、E15、H16、N30、N77、H79 及 R81 之胺基酸殘基；且從而抑制 huIL-2 與人類 IL-2Rβγ 及與人類 IL-2Rα 之結合。60.    一種抗體，其結合至 huIL-2 或其變異體，其中該抗體包含(A) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(B) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(C) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(D) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(E) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(F) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(G) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(H) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(I) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；或(J) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3。61.    如實施例 58 或 59 之抗體，其包含(A) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(B) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(C) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(D) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(E) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(F) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(G) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(H) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(I) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；或(J) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3。62.    如實施例第 58 項至第 61 項中任一項所述之抗體，其為單株抗體。63.   如實施例 58 至 62 中任一項之抗體，其為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。64.   如實施例 60 至 63 中任一項之抗體，其為結合 huIL-2 或其變異體之抗體片段。65.   如實施例 58 至 64 中任一項之抗體，其包含(A) SEQ ID NO:7 之 VH 序列及 SEQ ID NO:8 之 VL 序列；(B) SEQ ID NO:12 之 VH 序列及 SEQ ID NO:13 之 VL 序列；(C) SEQ ID NO:18 之 VH 序列及 SEQ ID NO:19 之 VL 序列；(D) SEQ ID NO:24 之 VH 序列及 SEQ ID NO:25 之 VL 序列；(E) SEQ ID NO:30 之 VH 序列及 SEQ ID NO:31 之 VL 序列；(F) SEQ ID NO:35 之 VH 序列及 SEQ ID NO:36 之 VL 序列；(G) SEQ ID NO:38 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 39 之 VL 序列；(H) SEQ ID NO:41 之 VH 序列及 SEQ ID NO:42 之 VL 序列；(I) SEQ ID NO:44 之 VH 序列及 SEQ ID NO:45 之 VL 序列；或(J) SEQ ID NO:47 之 VH 序列及 SEQ ID NO:48 之 VL 序列。66.   一種抗體，其特異性結合至 huIL-2 或其變異體，該抗體包含(A) SEQ ID NO:7 之 VH 序列及 SEQ ID NO:8 之 VL 序列；(B) SEQ ID NO:12 之 VH 序列及 SEQ ID NO:13 之 VL 序列；(C) SEQ ID NO:18 之 VH 序列及 SEQ ID NO:19 之 VL 序列；(D) SEQ ID NO:24 之 VH 序列及 SEQ ID NO:25 之 VL 序列；(E) SEQ ID NO:30 之 VH 序列及 SEQ ID NO:31 之 VL 序列；(F) SEQ ID NO:35 之 VH 序列及 SEQ ID NO:36 之 VL 序列；(G) SEQ ID NO:38 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 39 之 VL 序列；(H) SEQ ID NO:41 之 VH 序列及 SEQ ID NO:42 之 VL 序列；(I) SEQ ID NO:44 之 VH 序列及 SEQ ID NO:45 之 VL 序列；或(J) SEQ ID NO:47 之 VH 序列及 SEQ ID NO:48 之 VL 序列。67.   如實施例 58 至 66 中任一項之抗體，其中該抗體為全長IgG1 抗體或 Fab。68.   如實施例 58 至 67 中任一項之抗體，其中該抗體以如藉由 SPR 測定量測的 ≤ 125 nM 之親和力結合 huIL-2，或以 ≤ 15,4 nM 之親和力結合 huIL-2v。69.   如實施例 68 之抗體，其中該抗體以如藉由 SPR 測定量測的 ≤ 1,5 nM 之親和力結合 huIL-2，或以 ≤ 0,9 nM 之親和力結合 huIL-2v。70.   如實施例第 58 項至第 69 項中任一項所述之抗體，其中該抗體是多特異性抗體。71.   如實施例 58 至 70 中任一項之抗體，其中該抗體為 Fab 且包含(A) 含有 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:50 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(B) 含有 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(C) 含有 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(D) 含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(E) 含有 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(F) 含有 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(G) 含有 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(H) 含有 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(I) 含有 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列的輕鏈多肽；或(J) 含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽。72.   如實施例 58 至 70 中任一項之抗體，其中該抗體為全長抗體且包含(A) 含有 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:50 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(B) 含有 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(C) 含有 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(D) 含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(E) 含有 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(F) 含有 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(G) 含有 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(H) 含有 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(I) 含有 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列的輕鏈多肽；或(J) 含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽，且其中抗體進一步包含人類 Fc 區，該人類 Fc 區包含選自由以下所組成之群組的兩種人類 Fc 區多肽：SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72.SEQ ID NO:73、SEQ ID NO74: 及 SEQ ID NO:75。73.   一種抗體，其與如實施例 58 至 72 中任一項之抗體競爭結合至 huIL-2 或其變異體。74.   一種經分離的核酸，其編碼如實施例第 58 項至第 73 項中任一項所述之抗體。75.   一種經分離之宿主細胞，其包含如實施例 74 之核酸。76.   一種產生結合至 huIL-2 或其變異體之抗體之方法，其包含在適合於表現該抗體之條件下培養如實施例 75 之宿主細胞。77.   如實施例第 76 項所述之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。78.   一種抗體，其藉由如實施例 76 或 77 之方法來生產。79.   一種醫藥組成物，其包含如實施例第 76 項至第 77 項中任一項所述之抗體以及醫藥上可接受之載劑。80.   如實施例 58 至 73中任一項之抗體或如實施例 79 之醫藥組成物，其用為藥物。81.   如實施例 58 至 73 中任一項之抗體或如實施例 79 之醫藥組成物，其使用於治療癌症、病毒感染或自體免疫疾病。82.   一種如實施例 58 至 73 中任一項之抗體或如實施例 79 之醫藥組成物在製造用於治療癌症、病毒感染或自體免疫疾病之藥物中之用途。83.   一種治療患有癌症、病毒感染或自體免疫疾病之個體之方法，其包含向該個體投予有效量之如實施例 58 至 73 中任一項之抗體或如實施例 79 之醫藥組成物。84.   如實施例 83 之方法，其進一步包含向該個體投予另外的治療劑。85.   如實施例 84 之方法，其中該另外的治療劑係選自由以下所組成之群組：抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑或抗血管發生劑。86. 如實施例 58 至 73 中任一項之抗體，其用為 huIL-2、huIL-2v 或其變異體之掩蔽抗體。87. 如實施例 58 至 73 中任一項之抗體，其用為如實施例 1 至 46 、51、56 或 57 中任一項之可活化融合蛋白中之掩蔽部分。III. 實例
以下為本發明之方法及組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。
實例 1 ：使用於以下實例中之 CISS 分子、前驅分子及對照分子之產生
使用標準方法來操縱 DNA，如以下文獻中所述：Sambrook, J. 等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商之說明使用分子生物試劑。為了產生靶向的 CISS 分子，使用了 WO2016/016299 中所描述之 CrossMab 技術，其中在一個抗體臂中交換了 VH/VL，且藉由電荷修飾對另一抗體臂之 CH1/CL 介面進行了修飾，結合在 CH3/CH3 介面中使用杵入臼技術來促進異二聚化，如 Regula 等人 (2018) Protein Engineering, Design and Selection, 31(7-8):289-299 中所描述。
在一些情況下，用於產生 CISS 分子及測定中使用的對照分子之質體係由外部供應商 (Twist Bioscience，USA) 合成且提供的。在其他情況下，合成 DNA 片段 (Twist Bioscience，USA) 且使用 Gibson assembly (Gibson 等人, (2009).Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods, 6(5): 343-348 及美國專利第 8,968,999 號) (NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix E2621X (New England BioLabs)) 或 Golden Gate Assembly (PaqCI R0745L 及 NEBridge® Ligase Master Mix M1100L (New England BioLabs)) 選殖至載體中。使用處於 CMV 啟動子控制下之標準化羅氏內部載體 (standardized Roche in-house vector)。a) 小規模表現
為了瞬時表現吾人的 CISS 蛋白及對照，根據標準方案將分子質體轉染至 4 ml 培養基中之 Expi293 細胞 (Thermo Fisher Scientific，USA) 中。表現間隔後，經由離心收穫細胞且使用 0.22 μm 真空過濾系統 (Millipore) 過濾含有蛋白質之上清液。使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 之親和力層析純化上清液，使用 PBS 緩衝液 (10 mM 磷酸鈉、1 mM 磷酸鉀、137 mM 氯化鈉及 2.7 mM 氯化鉀，pH 7.4) 作為平衡及洗滌緩衝液以及使用 25 mM 檸檬酸 (pH 3.0，用 NaOH 調整 pH) 作為溶離緩衝液。Tris 1.5 M (pH 7.5) 用於調整樣品 pH 值，遞送大約 23 mM 檸檬酸鹽、151 mM TRIS，pH 6.0-6.5 之最終調配物。b) 中等規模表現
根據標準方案，透過瞬時轉染在 30 ml 培養基中生長之 Expi293 細胞 (Thermo Fisher Scientific，USA) 來實現分子之中等規模表現。表現間隔後，經由離心收穫細胞且使用 0.22 μm 真空過濾系統 (Millipore) 過濾含有蛋白質之上清液。使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質或 MabSelect SuRe-蛋白 A 樹脂 (Cytiva Life Sciences，USA) 之親和力層析純化上清液，使用 PBS 緩衝液 (10 mM 磷酸鈉、1 mM 磷酸鉀、137 mM 氯化鈉及 2.7 mM 氯化鉀，pH 7.4) 作為平衡及洗滌緩衝液。使用 25 mM 檸檬酸 (pH 3.0，用 NaOH 調整 pH 值) 進行溶離且使用 Tris 1.5 M (ph 7.5) 來調整樣品 pH 值。若表現水準足夠高，則使用粒徑排阻層析 (Superdex® 200，Cytiva Life Sciences，USA) 在 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0) 中進一步分離蛋白質。c) 使用於實例中之工具及對照分子之概述
在實例中，使用了不同類型之工具分子 (例如，在用於測定 CISS 分子之捕獲的 SPR 測定期間固定或流動之工具分子；用於在細胞測定中阻斷受體分子之標靶結合抗體) 及對照分子。該等分子在相應實例中進行了更詳細的描述。為了方便參考，此等分子之序列列於表 E 中。表 E ：使用於實例中之工具及對照分子之序列及簡短描述
分子 ID 分子之描述 SEQ ID NO:
P1AA5355 FAP-IL-2v 98、99、100
P1AD6412 huIL-2v 101、102
P1AD6963 huCD8-Fc 103、104
P1AD6988 huCD19-Fc_OA 105、106
P1AD8636 IFNa 107
P1AD9386 IFNAR-2 108
P1AD9419 huPD1-Fc 109、110
P1AE0282 用於阻斷之阿特珠單抗 (atezolizumab) 111、112
P1AE2657 huIL-2rbg-Fc-bio 113、114
P1AE4422 PD1-IL-2v 115、116、117
P1AF4823 用於阻斷細胞之另一 OKT8 變異體 118、119
P1AF4984 IL7Ra-IL-2Rg-Fc 120、121
P1AF6937 huPD-L1-Fc 122、123
P1AF6940 單臂_Fc_LALAPG_3G4S_ N端_huIFNa2a 124、125
P1AF7243 C 端單臂 IL7-Fc 126、127
P1AF7450 huIL-21_FC_單臂 128、129
P1AF7757 huIL-21R_Fc_biot 130、131
P1AG3741 抗 PD1 抗體 1040 132、133
P1AH4157 用於阻斷之抗 PD1 抗體 376 134、135
P1AJ1025 IL7 融合物 (在 120 kDa 之抗體組分構築體之 N 端融合之 IL7，對捕獲的分子無特異性)
實例 2 ： SPR 測定
在隨後的實例中，使用基於表面電漿子共振 (SPR) 之測定來確定 CISS Fab 單元及它們的「前驅」分子 (包括僅 Fab、掩蔽物-Fab 融合物及細胞激素-Fab 融合物) 之結合特徵。在一些情況下，除了一些 Fc 融合之雙特異性分子之外，亦評定了 Fc 融合分子。
SPR 測定用於檢查以下實例中所使用之分子的許多態樣，包括：掩蔽物與細胞激素之結合、Fab 對 N 端融合物相對於它們的標靶結合之耐受性、細胞激素在融合時與它們的受體結合的能力、CISS Fab 分子內細胞激素之掩蔽是否具有功能性，以及 CISS Fab 分子是否展現出所欲結合相互排他性 (掩蔽物與配位體相互作用是否在空間上阻斷 Fab 與標靶抗原相互作用)。
可透過細胞激素或細胞激素受體分別在捕獲的 Fab-掩蔽物或 Fab-細胞激素融合分子上簡單流動且分析結合來評定掩蔽物及細胞激素功能。標靶抗原流經此等捕獲的 Fab-掩蔽物及 Fab-細胞激素融合物可揭露 Fab 是否耐受與任一 N 端之融合。在各情況下，在結合被保留之情況下，融合被認為係正確形成的且具有功能性。隨後，當細胞激素、細胞激素受體及標靶抗原作為分析物流經捕獲的 CISS 分子時，結合之強烈減少或不存在可能指示掩蔽相互作用具有功能性 (其應防止細胞激素與細胞激素受體結合) 且靶向 Fab 之空間阻止係由於此相互作用而發生的。
各測定均使用 S 系列 CM4 (Cytiva 29104989) 或 S 系列 CM5 (Cytiva 29104988) 感測器晶片進行，使用「人類 Fab 捕獲套組」(Cytiva 28958325) 經由胺偶合將抗人類 Fab 固定在該晶片上。抗人類 Fab (10 µg/ml) (Cytiva 28958325) 與感測器晶片之表面偶合通常會在感測器晶片之 8 個通道之各流動池上產生約 1500-3000 個反應單位 (RU)。使用Biacore 8k 及 8k+ (GE Healthcare) 機器。所流動的分析物及所使用的濃度在相應實例中進行了描述。
在運行期間，樣品被捕獲至晶片，且分析物以多種濃度流動以進行評定。各分析循環後，使用 10 mM 甘胺酸 pH 2.0 再生感測器晶片表面。在所有實驗中，樣品及運行緩衝液均為 HBS-EP+ (0.01 M HEPES，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.05 % v/v 界面活性劑 P20，pH 7.4)。流動池溫度設定為 25℃，且樣品隔室溫度設定為 10℃。系統用運行緩衝液啟動。樣品以 50-100 nM 之濃度注入 180 秒，且與第二流動池結合。將分析物以一組濃度 (225 nM、75 nM、25 nM 及 0 nM；或 250 nM、100 nM、20nM 及 0 nM) 注入各樣品 持續 120 秒，接著解離時間為 240 s、300 s 或 480 s 以及使用10 mM 甘胺酸 pH 2 進行 60 s 再生步驟。
藉由將資料擬合至 1:1 Langmuir 相互作用模型來確定平衡常數及動力學速率常數。包括捕獲總結以用於捕獲評估。透過使用實例1中所概述之小規模方法使用經表現且純化之蛋白質的許多感測圖之比較及評定，應用標準化捕獲水準評定來輔助解釋 SPR 結果，此在一定程度上導致所欲產品之捕獲較低，從而可能降低易於解釋感測圖之可能性，且亦導致除所研究產品之外的其他物質之實際或表觀捕獲。為了總結，選擇了以下捕獲值截止值：捕獲高於 30 表徵為「正常」，捕獲在 20 與 30 之間表徵為「低」，且低於 20 視為「VL/N」(極低或無捕獲)。
透過比較捕捉 RU 與在存在最高濃度之流動的分析物 (縮寫為「Capxxxnm」，濃度為 xx nm)之情況下的 RU來進一步評定結合。具體地，此反應率 (RR) 係藉由將「分析物後期結合」值 (分析物注入完成前 5 秒之 RU) 與理論 Rmax(捕獲RU/所捕獲分子之分子量 x 分析物之分子量 x 所捕獲分子之化合價) 進行比較來獲得。反應率 (%) = 100 / Rmax理論 x 分析物後期結合
出於篩選分子之目的，使用感測圖中之每一者進行了額外主觀結合評定 (「SumBdg」)，相比於類似分子及對照分子，除了手動評定曲線及擬合之外，亦考慮了動力學值、反應率。「結合」(B) 分配給似乎顯示大量與分析物結合之感測圖，「無/最小結合」(N/MB) 分配給似乎未明顯顯示與分析物明顯結合之感測圖，「低結合」(LB) 用於認為相對於對照，結合受到顯著干擾，但可能並未完全消除。
實例 3 ： HEK-Blue™ 細胞株產生
產生了報導細胞株用於以標靶依賴性或獨立性方式測試 CISS 分子及前體。該等細胞株係基於 HEK-Blue™ 報導細胞 (Invivogen)。a) 經修飾之 HEK-Blue™ IL-2 報導細胞株
HEK-Blue™ IL-2 細胞 (Invivogen hkb-il2) 使用於測定。HEK 報導細胞經由表現 IL-2R 鏈 (IL-2Rα、β 及 γ 次單元) 及下游傳訊級聯之效應物 (JAK3 及 STAT5) 以及 STAT5 誘導型分泌性鹼性磷酸酶 (SEAP) 報導基因系統來重現人類 IL-2R 傳訊路徑。添加 Quanti-BlueTM受質 (Invivogen rep-qbs) 後，量測 650 nm 處之吸光度，與 SEAP 水準及 IL-2R 活性相關。b) PD1 陽性 HEK-Blue™ IL-2 報導細胞株 ( 低 / 中 / 高 PD1 表現 )
為了以 PD1 依賴性方式評定 IL-2 路徑之活化，對 HEK-Blue™ IL‑2 報導細胞株 (Invivogen hkb-il2) 進行了基因工程化以表現 PD1。為了進行修飾，使用了轉座子載體系統，該系統由兩種質體組成：轉座子載體，其中所關注基因由兩個反向/同向重複序列 IR/DR 側接，以及編碼睡美人轉座酶 SB100x 之載體。編碼人類 PD1 之全長 cDNA 被亞選殖至轉座子載體中，且帶有新黴素抗性。在最終質體中，PD1 表現在 UBC 啟動子之控制下。根據製造商的方案，使用 Lipofectamine 2000 試劑 (Invitrogen，#11668019) 將轉座子及轉座酶載體共轉染至 HEK-Blue IL-2 報導細胞 (Invivogen，#hkb-IL2) 中。將 HEK-Blue IL-2 細胞維持在補充有10% FCS (Gibco，#10500)、2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，#P04-80100)、含有殺稻瘟菌素、潮黴素、吉歐黴素之 1x HEK Blue CLR 選擇溶液 (Invivogen，#hb-csm) 及 1 µg/mL 嘌呤黴素 (Gibco，#A11138-03) 之 DMEM 培養基 (PAN，#P04-03609) 中。
使用 BD FACSAria III 細胞分選儀 (BD Biosciences) 藉由單一細胞分選來分離穩定表現人類 PD1 之 HEK-Blue IL-2 細胞，且培養以建立穩定細胞殖株。篩選穩定細胞殖株之 PD1 表現且進行擴增。使用 PE 小鼠抗人類 PD1 (殖株 EH12.2H7) (BioLegend，#329906) 在 3 週之時段內藉由流式細胞分析技術分析確認表現水準及穩定性。
另外，根據製造商的方案進行具有人類 IL-2 刺激 (Miltenyi Biotec，#130-097-748) 之 QUANTI-Blue 測定 (Invivogen，#rep-qbs2)，以便確認經由 IL-2 路徑活化報導基因不受 PD1 之穩定轉染的影響。具有低人類 PD1 表現之所選殖株 4 (CL023813)、具有中等人類 PD1 表現之殖株 26 (CL023814) 及具有高人類 PD1 表現之殖株 42 (CL023814) 顯示出與 HEK-Blue IL-2 親代細胞株相當的 IL-2 刺激。c) CD8 / PD1 陽性 HEK-Blue™ IL-2 報導細胞株
為了以 CD8 及 PD1 依賴性方式評定 IL-2 路徑之活化，對 HEK Blue IL-2 報導細胞株進行了基因工程化以表現人類 CD8 及 PD1。為了進行修飾，使用了轉座子載體系統，該系統由兩種質體組成：轉座子載體，其中所關注基因由兩個反向/同向重複序列 IR/DR 側接，以及編碼睡美人轉座酶 SB100x 之載體。編碼人類 PD1 或 CD8 之全長 cDNA 被亞選殖至轉座子載體中，且帶有新黴素抗性。在最終質體中，PD1 表現在人類 PGK 啟動子及 CMV 啟動子上游之 CD8 的控制下，以驅動轉殖基因之不同表現水準。根據製造商的方案，使用 Lipofectamine 2000 試劑 (Invitrogen，#11668019) 將所有三種質體 (兩種轉座子載體及轉座酶載體) 共轉染至 HEK-Blue IL-2 報導細胞 (Invivogen，#hkb-IL2) 中。將 HEK-Blue IL-2 細胞維持在補充有10% FCS (Gibco，#10500)、2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，#P04-80100)、含有殺稻瘟菌素、潮黴素、吉歐黴素之 1x HEK Blue CLR 選擇溶液 (Invivogen，#hb-csm) 及 1 µg/mL 嘌呤黴素 (Gibco，#A11138-03) 之 DMEM 培養基 (PAN，#P04-03609) 中。
使用遺傳黴素 (geneticin) (Gibco，#44890) 進行抗生素選擇階段以富集穩定轉染的細胞群體後，使用 BD FACSAria III 細胞分選儀 (BD Biosciences) 藉由單一細胞分選分離穩定表現人類 PD1 及 CD8 之 HEK Blue IL-2 細胞。篩選穩定細胞殖株之 PD1 及 CD8 共表現且進行擴增。使用 PE 小鼠抗人類 PD1 (殖株 EH12.2H7，BioLegend，#329906) 及 APC 抗人類 CD8a (殖株 RPA-T8，BioLegend，#301014) 藉由流式細胞分析技術在 3 週之時段內確認表現水準及穩定性。
另外，根據製造商的方案進行具有人類 IL-2 刺激 (Miltenyi Biotec，#130-097-748) 之 QUANTI-Blue 測定 (Invivogen，#-qbs2)，以便確保經由 IL-2 路徑活化報導基因不受 PD1 及 CD8 之穩定轉染的影響。與 HEK Blue IL-2 親代細胞株相比，具有低人類 PD1 表現及高 CD8 表現水準之所選殖株 11 (DBR Concept ID CL023901) 顯示了有效但略低的 IL-2 刺激。d) 經修飾之 HEK-Blue™ IFNα/β 報導細胞株
使用 HEK-Blue™ IFNα/β 細胞 (Invivogen hkb-ifnab) 以評定包含干擾素 α 分子之 CISS 分子對 IFNΑR1/2 路徑之活化。HEK 報導細胞可用於檢測生物活性 1 型人類干擾素。當 IFN-α2a 與 IFNAR1/2 受體結合時，JAK/STAT/ISGF3 途徑經觸發，最終導致報告基因之表現，該報告基因係在含有 IFN 刺激之反應元件 (ISRE) 的 ISG54 啟動子的控制下。報告基因 SEAP (分泌型鹼性磷酸酶) 係由細胞產生並分泌至培養基中。其量與 IFNAR1/2 受體活化之程度相關。培養基中的 SEAP 含量可以藉由使用 SEAP 檢測試劑 (如 QUANTI-BlueTM) 來量測，且可以用分光光度計量測由 SEAP 活性引起的檢測試劑之色彩變化。e) PD-L1 陽性 HEK-Blue™ IFNα/β 報導細胞株
為了評定 IFNAR 之 PD-L1 依賴性活化，修飾 HEK-Blue™ IFNα/β 報導細胞以表現大量 PD-L1。將編碼人類 PD-L1 之全長 cDNA 亞選殖至哺乳動物表現載體中。根據製造商的方案，使用 Lipofectamine 3000 試劑 (Invitrogen，#L3000015) 將質體轉染至 HEK-Blue IFNα/β (Invivogen，#hkb-IFNab) 細胞中。將 HEK-Blue IFNα/β 細胞維持在補充有 10% FCS (Gibco，#10500)、2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，#P04-80100)、30 µg/mL 殺稻瘟菌素 (Gibco，#A1113903) 及 100 µg/mL 吉歐黴素 (Gibco，#R25001) 之 DMEM 培養基 (PAN，#P04-03596) 中。轉染兩天後，添加潮黴素 (PAN，#P06-08020) 至 200 µg/mL。
初步選擇後，藉由 BD FACSAria III 細胞分選儀 (BD Biosciences) 對 PD‑L1 之細胞表面表現最高之細胞進行分選且培養以建立穩定的細胞殖株。使用 PE 小鼠抗人類 CD274 (殖株 MIH1) (BD Biosciences，#557924) 在 4 週之時段內藉由流式細胞分析技術分析確認表面表現及穩定性。
另外，根據製造商的方案進行 QUANTI-Blue 測定 (Invivogen，#rep-qbs2)，以便確認經由 IFNα 路徑活化報導基因不受 PD-L1 之穩定轉染的影響。所選殖株 45 (DBR Concept ID CL022702) 顯示出與 HEK-Blue IFNα/β 親代細胞相當的 IFNα 刺激。使用基於珠之定量套組 (BD，#340495) 對細胞表面 PD-L1 進行定量揭露了 HEK-Blue IFNα/β 親代細胞 (在細胞表面上約 300 個 PD-L1 分子/細胞；在本文中亦稱為「親代細胞」) 之 PD-L1 表面表現水準較低，而殖株 45 (在細胞表面上約 25000 個 PD-L1 分子/細胞) 之 PD-L1 表面表現水準較高。
實例 4 ：用以鑑別合適的細胞激素連接子長度之分子之產生及測試
為了評定 CISS 分子內之 Fab 及細胞激素次單元是否可在預期背景下同時結合至標靶抗原及細胞激素受體，產生了具有減弱的 IL-2v 分子之產生的 Fab-細胞激素融合物，以用於在 PD1 陽性及陰性 IL-2 報導細胞測定中進行測試。用於此等測定之細胞株如實例 3 中所描述來製備。
表 1中顯示了為此實例產生的分子之概述。藉由將配位體 IL-2v 經由連接子融合至包含三種抗 PD1 抗體 1040int、oncL 及帕博利珠單抗 (Pembrolizumab) 之結合區的不同 Fab 之 N 端，產生各種 Fab 融合蛋白。由於 IL-2v 導致相當強效的受體活化，IL-2v 之減弱的變異體 IL-2v Q126T (具有降低的 IL-2Rβ 親和力) 被用為該測定之 Fab-融合物中之配位體，以便更好地自 IL-2v 直接與其受體結合而不與 PD1 結合區分 PD1 依賴性受體活化。
為了研究 IL-2v 融合之 N 端之選擇是否對 Fab 之標靶結合產生影響，產生了兩組對應的分子，其中一組將 IL-2v_Q126T 融合至 Fab 分子之輕鏈 (κ) 之 N 端且另一組將其融合至 Fab 分子之重鏈 (HC) 之 N 端。
此外，產生了接附至抗 PD1 Fab 1040 的具有三種不同連接子長度 (6x、10x 及 14x) 之不同分子，以評定連接子是否足夠長以到達細胞表面細胞上標靶與細胞激素受體之間。對於 IL-2v_Q126T 與帕博利珠單抗衍生之 N 端融合，僅使用長度為 10x 及 6x 之連接子，產生總共 17 個分子。表 1 ：產生以測試抗 PD1 Fab IL‑2 融合物之標靶結合之分子
分子 ID 分子名稱 SEQ ID NO: ( 重鏈 / 輕鏈 ) 類型 抗 PD1 結合劑 連接子長度 配位體 配位體 配位體融合至
P1AI4346 1040_L_x_IL2v_Q126T _14x_1040_H 141、140 CISS 前體 (Fab 細胞激素融合物 ) 1040int 14 IL2v Q126T HC
P1AI4345 1040_L_x_IL2v_Q126T _10x_1040_H 139、138 10
P1AI4347 1040_L_x_IL2v_Q126T _6x_1040_H 143、142 6
P1AI4348 IL2v_Q126T_14x_1040 _L_x_ 1040_H 144、145 14 LC
P1AI4349 IL2v_Q126T_10x_1040 _L_x_ 1040_H 146、147 10
P1AI4350 IL2v_Q126T_6x_1040_ L_x_ 1040_H 148、149 6
P1AI4351 oncL_L_x_IL2v_Q126T_ 14x_oncL_H 151、150 oncL 14 HC
P1AI4352 oncL_L_x_IL2v_Q126T_ 10x_oncL_H 153、152 10
P1AI4353 oncL_L_x_IL2v_Q126T_ 6x_oncL_H 155、154 6
P1AI4354 IL2v_Q126T_14x_oncL_ L_x_ oncL_H 156、157 14 LC
P1AI4355 IL2v_Q126T_10x_oncL_ L_x_ oncL_H 158、159 10
P1AI4356 IL2v_Q126T_6x_oncL_ L_x_oncL_H 160、161 6
P1AI4357 Pemb_L_x_IL2v_Q126T _14x_ Pemb _H 162、163 帕博利珠單抗 14 HC
P1AI4358 Pemb_L_x_IL2v_Q126T _10x_ Pemb _H 164、165 10
P1AI4359 Pemb_L_x_IL2v_Q126T _6x_ Pemb _H 166、167 6
P1AI4360 IL2v_Q126T_10x_Pemb _L_x_ Pemb_H 168、169 10 LC
P1AI4361 IL2v_Q126T_6x_Pemb_ L_x_ Pemb_H 170、171 6
P1AH4157 抗 PD1 抗體 376 (IgG) 134、135 對照 376 - - -
P1AG3741 抗 PD1 抗體 1040int (IgG) 132、133 1040int
為了進行測定，吾人的融合分子及對照 (一式兩份製備之對照) 被製備為滴定系列且應用於 HEK-Blue IL-2 報導細胞。使用 PD1 陰性 (親代) IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2」) 及 PD1 陽性 (CL1AA1486) IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2 PD1」)。使用額外條件，其中 PD1 陽性報導細胞用已知與被測定分子之彼等抗體具有競爭性的抗體 (在 37℃ 下 P1AH4157 及 P1AG3741 各自 250 nM 持續 1 h) 預先阻斷 (「HEK-Blue IL-2 PD1 阻斷」)。首先，以 1x104個報導細胞/孔接種於 25 µL 培養基 (DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/L 葡萄糖) (PAN，目錄號 P04-03609) + 10 % 熱不活化的 FBS (Anprotec，#AC-SM-0014Hi) + 2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，目錄號 P04-80100) + 100µg/ml 新黴素 (Normocin) (InvivoGen，目錄號 ant-nr-1) 中之 384 孔板中，接著在 37℃ 下與 25 µl 之阻斷抗體或培養基一起孵育 1 h。隨後，製備不同測試分子及對照之 3 倍滴定系列 (12 個步驟)，自 15 nM 開始 (測定孔中之最終濃度介於 5 nM 與 0.00003 nM 之間)。將每個濃度的每個測試分子 25 µL 轉移到 384 孔平底板中。作為陽性對照，使用相同濃度範圍之重組 IL‑2v (P1AD6412)。在 37℃ 下進行孵育過夜。製備 QUANTI-Blue 溶液 (Invivogen，#rep-qbs) 且以 20 µL/孔分配至新的 384 孔平底板 (#781098) 之孔中，接著添加 20 µL 經處理細胞之上清液。在 620 nm 處量測光學密度 (OD) 之前，藉由所表現之 SEAP 進行受質週轉 2 至 6 h (Tecan Safire 2)。
HEK-Blue 測定之結果顯示於圖 4 A 至圖 4 D中。對三種條件下僅 IL-2v 對照 P1AF6412 之反應的比較證實，所有條件均具有相似的 IL-2 報導基因反應，而兩個僅抗 PD1 對照 P1AH4157 及 P1AG3741 根本不會引發任何 IL-2 報導基因反應 (圖 4 D)。當細胞激素與 Fab 之間的連接子足夠長以覆蓋細胞表面處標靶與細胞激素受體之間的距離時，在存在標靶之情況下觀測到的訊號應增強。在觀測到之訊號未增強之情況下，此可能表明與細胞表面之結合未有效發生，細胞激素不允許融合至所選末端，存在蛋白質質量問題或分子定位至細胞表面但細胞激素以不適合細胞激素受體結合之構像被隔離在標靶處。結果證實，對於測試的所有靶向抗 PD1 Fab，可鑑別出細胞激素及 PD1 Fab 能夠耐受融合之至少一個融合位點及連接子長度。相對於「HEK-Blue IL-2」及「HEK-Blue IL-2 PD1 阻斷」條件，自「HEK-Blue IL-2 PD1」 (= PD1 陽性) 條件下 IL-2 路徑之活化增強可清楚地看出這一點。使用抗 PD1 Fab 1040int 產生的 Fab 細胞激素融合物 (圖 4 A)通常顯示出良好的融合物耐受性。除了與 Fab 輕鏈之最短融合物 (6x) 之外，所有變異體均顯示出差異化的受體活化，潛在地此連接子在該取向上可能太短，而無法實現良好的功能。對於抗 PD1-Fab 帕博利珠單抗 (圖 4 B) 及376( 圖 4 C)，一些變異體亦具有明顯的功能，因為藉由分子 P1AI4351、P1AI4360、P1AI4359 及 P1AI4361 可見 PD1 依賴性 IL-2 活化。
實例 5 ： CISS Fab 分子之產生及測試 a) 分子之產生
為了鑑別 CISS 作用模式之最佳參數，設計了 37 種不同的 PD1 IL-2v CISS 分子之池，該等分子係基於抗 PD1 抗體 1040int 之 Fab 變異體，該變異體在此處充當第一抗原結合部分。IL-2v (配位體) 接附至抗 PD1 Fab 之重鏈 (HC)，而抗 IL-2v 掩蔽物 (掩蔽部分) 接附至輕鏈 (LC)。產生的分子之形式對應於圖 1 A及圖 2 C中所示的示意性描繪。
抗 IL-2v 掩蔽物之序列列於表 2中。使用不同的連接子長度將細胞激素 (6x 及 14x) 及抗 IL-2v 掩蔽物 (2x 及 6x) 接附至第一抗原結合部分。對於 scFv 掩蔽物 P029.221.AM2、P017.333、P017.093 及 MT204，測試了兩種不同的取向，VH-VL (亦即經由肽連接子 C 端連接至 VL 之 N 端的 VH) 及 VL-VH (亦即經由肽連接子 C 端連接至 VH 之 N 端的 VL)。在掩蔽物來源於標準抗體 (221.AM2、093 及 333) 之情況下，使用兩個取向 (VH-VL 及 VL-VH) 之 21 個胺基酸 Gly-Ser 連接子產生對應 scFv。為此測定產生之分子的概述顯示於表 3中。表 2 – IL-2v 結合掩蔽物 (KH ( 重鏈 - 輕鏈 ) 取向之 scFv) 及序列
掩蔽物標識符 類型 SEQ ID NO:
VH-VK 取向 VK-VH 取向
P029.221.AM2 (「221.AM2」) scFv 171 IVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWARMSWVRQAPGKGLEWVSAISGRGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPYTFGQGTKLEIK 530 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDIDWRDSPVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPYTFGQGTKLEIKSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGIVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFWMGWARMSWVRQAPGKGLEWVSAISGRGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDDDFFDFWGQGTLVTV
P017.093 (「093」) scFv 172 DSFLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAEKWMGLWDMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSDFLDFWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIFDNDVTLYSVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDNLPYTFGQGTKLEIK 531 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIFDNDVTLYSVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDNLPYTFGQGTKLEIKSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGDSFLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAEKWMGLWDMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSDFLDFWGQGTLVTV
MT204 scFv 173 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIK 532 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKALIYSASFRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIKSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTV
P017.333 (「333」) scFv 174 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAQWLMPFDPMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDHDFIYKWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDSDRKYFNVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDNLPYTFGQGTKLEIK 533 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDSDRKYFNVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDNLPYTFGQGTKLEIKSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAQWLMPFDPMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDHDFIYKWGQGTLVTV
IL-2Rb IL-2 受體 β 175 AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRW NQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGV RWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQAS HYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDT QYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTGGDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI YTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSY STPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC n.a.
表 3之 CISS Fab 分子之質體係使用如實例 1 中所描述之基因片段合成 (Twist Bioscience，USA) 及 Gibson assembly® 產生。根據實例 1 中所概述之小規模表現方法進行表現及純化。表 3中所示之一些分子亦另外地根據如實例 1 中所描述之中等規模方案使用 CH1-XL 樹脂產生。
由此產生 37 個分子。此等分子呈現出潛在的完整 CISS Fab 分子，且經由 SPR 篩選標靶抗原 PD1 之間的相互排斥的 (或改變的) 結合以及掩蔽物與細胞激素 IL-2v 之間的掩蔽相互作用，並且對於所選分子亦可在 HEK-Blue 測定中。對於各掩蔽物，僅進行 Fab 掩蔽物融合作為對照分子。減弱的 IL-2v 分子、IL-2_Q126T 及僅抗 PD1 Fab (1040int) 用為額外對照。表 3 – 為概念驗證而產生之 PD1 IL-2 CISS Fab 分子
分子 ID 號 SEQ ID NO: (HC) SEQ ID NO: (LC) 分子類型 IL-2 掩蔽物 掩蔽物取向 連接子長度掩蔽物 連接子長度細胞激素 細胞激素
P1AI4346 141 140 對照 - - 14x IL-2_ Q126T
P1AI4373 180 179 僅 Fab (對照) - - -
P1AI4405 199 200 CISS 221.AM2 HK 2x 6x IL-2v
P1AI4423 213 214 CISS HK 6x 14x
P1AI4444 229 230 CISS HK 6x 6x
P1AI4385 187 188 CISS HK 2x 14x
P1AI4464 243 244 對照 HK 2x - -
P1AI4440 225 226 CISS P017.093 KH 6x 6x IL-2v
P1AI4402 197 198 CISS KH 2x 6x
P1AI4382 185 186 CISS KH 2x 14x
P1AI4419 209 210 CISS KH 6x 14x
P1AI4461 241 242 對照 KH 2x - -
P1AI4446 233 234 CISS HK 6x 6x IL-2v
P1AI4386 189 190 CISS HK 2x 14x
P1AI4425 217 218 CISS HK 6x 14x
P1AI4406 201 202 CISS HK 2x 6x
P1AI4465 245 246 對照 HK 2x -
P1AI4379 181 182 CISS MT204 KH 2x 14x IL-2v
P1AI4416 205 206 CISS KH 6x 14x
P1AI4399 193 194 CISS KH 2x 6x
P1AI4437 221 222 CISS KH 6x 6x
P1AI4422 211 212 CISS HK 6x 14x
P1AI4443 227 228 CISS HK 6x 6x
P1AI4458 237 238 對照 KH 2x - -
P1AI4445 231 232 CISS 333 HK 6x 6x IL-2v
P1AI4424 215 216 CISS HK 6x 14x
P1AI4439 223 224 CISS KH 6x 6x
P1AI4418 207 208 CISS KH 6x 14x
P1AI4381 183 184 CISS KH 2x 14x
P1AI4401 195 196 CISS KH 2x 6x
P1AI4460 239 240 對照 KH 2x - -
P1AI4398 191 192 CISS IL-2Rb n.a. 2x 14x IL-2v
P1AI4415 203 204 CISS n.a. 2x 6x
P1AI4436 219 220 CISS n.a. 6x 14x
P1AI4457 235 236 CISS n.a. 6x 6x
P1AI4474 247 248 對照 n.a. 2x - -
P1AI3653 178 177 PD1 (376) Fab 對照 - - - -
b) CISS Fab PD1-IL-2 分子之 SPR 測試
首先，使用表面電漿子共振 (SPR) 篩選 CISS Fab 分子，以鑑別具有適合於潛在 CISS 功能之特性的分子。使用實例 2 中所描述之 Fab 捕獲裝置進行 SPR 測定。分析物係以 20 nM、100 nM 及 250 nM 流動。捕獲了 50 nM – 100 nM 之 CISS 分子或前體。解離時間為 240 至 480 秒。
使三種分析物流動以評定 PD1-IL-2v 分子之功能：a) 使人類 PD1-Fc 蛋白流動，以評定完整 CISS Fab 分子之抗 PD1-Fab 與 PD1 或掩蔽物與細胞激素之相互排他性，由此結合之減少可能表明掩蔽物-細胞激素相互作用在空間上抑制抗 PD1 Fab 與 PD1 的相互作用。使用 PD1 作為分析物對於掩蔽物 (圖 2 A) 或 IL-2v (圖 2 B) 與抗 PD1 Fab 之 N 端的個別融合物亦為所關注的。融合物 PD1 動力學可與單獨 Fab 之彼等動力學進行比較，以評定 PD1 結合之改變。b) 使 IL-2Rbg-Fc 作為分析物流動，以評定掩蔽物之功能或確認遊離 IL-2v 組分之正確折疊。當涉及掩蔽物時，若 IL-2Rbg 不結合或結合大大減弱，則假定至少 IL-2v 之 IL-2Rb 結合表面被掩蔽或以其他方式改變。根據動力學，IL-2Rbg 之結合可能表明與 IL-2rbg 結合或與單獨的 IL-2rb 結合，前者表明不存在有效的掩蔽，且後者表明掩蔽可能單獨掩蓋 IL-2Rg 介面。c) 最後，使 IL-2v 流動，以評定掩蔽物與 Fab 融合物之掩蔽部分之功能 (圖 2 B)，且亦可為完整的 CISS Fab 遞送正確折疊之指示。
在表 4中，總結了證明標靶結合之 SPR 測定之結果。該表顯示了隨後流動 250 nM 分析物之循環中分子之捕獲水準、反應率 (以 [%] 為單位) 以及觀測到的各流動的分析物與標靶結合之總結。「B」指示「結合」，「LB」指示「低結合」且「N/MB」指示「無結合/最小結合」。由於用於產生用於測定之分子的高通量方法，並非所有蛋白質均能以令人滿意的品質產生，從而導致在一些情況下 SPR 感測圖不確定。捕獲之品質在表中指示為「好」表示令人滿意的捕獲，「低」表示低捕獲且 VL/N 表示「極低/無捕獲」。
由於蛋白質品質問題，許多感測圖並不完美，但是，對於許多產生的分子，可證明所欲 CISS Fab 相互排他性 (掩蔽相互作用發生時無標靶結合)。舉例而言，掩蔽物 093 處於 VL-VH 取向，在 1040 VL N 端具有 2 個胺基酸連接子，而 IL-2v 在 VH N 端具有 14 個胺基酸連接子 CISS，相互排他性似乎存在 (分子 P1AI4382)。此分子之前體，包括掩蔽物-Fab 融合物 (P1AI4461) 及 IL‑2v Q126T-Fab 融合物 (P1AI4346) 保留了與 PD1 之結合，且亦已分別與 IL-2v 及 IL‑2Rbg 結合。類似地，掩蔽物 333 亦展現出與類似取向的 CISS Fab (分子 P1AI4381、前體 P1AI4460 及 P1AI4346) 之顯著較低的 PD1 結合且掩蔽物 221.AM2 亦如此，儘管其具有 scFv 取向的 VH-VL (P1AI4385，前體 P1AI4464 及 P1AI4346)。表 4 ： CISS Fab PD1 IL-2 分子之 SPR 測定之結果
hPD1-Fc IL-2rbg-Fc-bio IL-2v 配位體 _ 捕獲 _ 總結
分子 ID 號 Cap250nM (RU) RR (%) SumBdg Cap250nM (RU) RR (%) SumBdg Cap250nM (RU) RR (%) SumBdg hPD1-Fc IL-2 rbg-Fc IL-2v
P1AI4346 338.7 37.4 B 367.6 42.1 B 340.7 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4373 67.0 44.0 B 60.9 1.4 N/MB 57.3 11.1 N/MB 好 好 好
P1AI4405 197.1 2.5 LB 153.2 1.1 N/MB 113.6 8.4 N/MB 好 好 好
P1AI4423 341.2 1.7 LB 243.3 2.2 LB 225.6 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4444 24.7 5.1 N/MB 19.9 3.4 N/MB 17.8 28.4 N/MB 低 VL/N VL/N
P1AI4385 332.6 0.0 N/MB 292.8 0.0 N/MB 272.9 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4464 688.7 12.3 B 646.5 0.0 N/MB 622.2 73.9 結合 好 好 好
P1AI4440 72.4 3.2 N/MB 57.5 2.2 N/MB 51.1 6.8 N/MB 好 好 好
P1AI4402 268.6 0.9 N/MB 235.3 0.1 N/MB 217.9 1.5 N/MB 好 好 好
P1AI4382 337.1 0.3 N/MB 316.4 0.0 N/MB 301.5 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4419 302.8 2.0 LB 274.2 0.0 N/MB 256.5 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4461 357.6 20.9 B 379.7 0.0 N/MB 362.4 82.0 結合 好 好 好
P1AI4446 5.7 50.3 N/MB 5.9 40.3 N/MB 5.8 193.2 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AI4386 17.1 17.5 N/MB 14.1 23.6 N/MB 13.6 107.4 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AI4425 7.8 40.1 N/MB 7.1 26.5 N/MB 7.0 152.9 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AI4406 27.6 12.6 N/MB 21.8 14.0 N/MB 18.8 65.4 N/MB 低 低 VL/N
P1AI4465 12.2 34.6 B 11.5 12.2 N/MB 11.3 90.1 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AI4379 386.9 1.9 LB 348.9 13.5 LB 327.0 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4416 374.8 1.3 LB 343.2 11.9 B 325.9 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4399 271.9 2.9 LB 237.2 8.8 LB 220.4 1.0 N/MB 好 好 好
P1AI4437 260.8 3.6 LB 229.5 11.0 B 216.1 1.3 N/MB 好 好 好
P1AI4422 269.2 9.5 LB 197.1 22.3 B 157.8 0.4 N/MB 好 好 好
P1AI4443 167.0 10.5 B 121.1 12.1 B 114.6 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4458 259.6 21.9 B 236.3 0.3 N/MB 222.9 82.3 結合 好 好 好
P1AI4445 8.2 36.5 N/MB 7.9 31.2 N/MB 7.8 158.3 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AI4424 126.1 2.8 LB 93.3 4.3 LB 77.6 5.3 N/MB 好 好 好
P1AI4439 11.2 27.8 N/MB 10.3 22.3 N/MB 9.8 114.5 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AI4418 226.6 3.5 LB 168.0 0.8 N/MB 154.6 4.4 N/MB 好 好 好
P1AI4381 258.6 0.3 N/MB 206.4 0.3 N/MB 196.8 0.0 N/MB 好 好 好
P1AI4401 46.8 6.9 N/MB 42.2 4.0 N/MB 40.4 24.9 N/MB 好 好 好
P1AI4460 456.2 16.2 B 419.4 0.0 N/MB 398.0 69.0 B 好 好 好
P1AI4396 83.3 13.7 B 63.3 5.0 LB 60.4 16.8 N/MB 好 好 好
P1AI4414 14.4 40.8 B 13.0 15.7 N/MB 12.8 75.1 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AI4435 78.8 16.5 B 60.9 0.7 N/MB 57.8 10.1 N/MB 好 好 好
P1AI4456 33.4 31.4 B 25.6 20.4 B 23.7 29.5 N/MB 好 低 低
P1AI4473 427.1 20.5 B 403.3 0.0 N/MB 388.8 20.9 結合 好 好 好
P1AI4398 72.7 8.3 LB 57.6 13.6 B 50.7 19.7 N/MB 好 好 好
P1AI4415 7.5 36.1 N/MB 7.7 27.2 N/MB 8.0 117.6 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AI4436 81.2 2.1 N/MB 67.5 1.3 N/MB 63.5 16.7 N/MB 好 好 好
P1AI4457 44.6 9.1 LB 31.9 15.6 B 29.0 28.7 N/MB 好 好 低
P1AI4474 58.4 16.9 B 52.5 4.0 N/MB 50.1 27.4 N/MB 好 好 好
P1AI3653 135.0 90.5 B 101.2 0.8 N/MB 96.0 4.8 N/MB 好 好 好
用 MT204 掩蔽物製成的 CISS 分子似乎保留了一些 IL-2v 結合，此可能係因為 MT204 阻止 IL-2v 與 IL-2R γ 結合，但不阻止 IL-2R β 結合，且因此與 IL-2Rbg 之結合雖已減少。由於蛋白質品質問題，IL-2Rb 掩蔽分子可能難以解釋。c) 使用 HEK blue 測定對 CISS Fab 分子之功能表徵
為了評估 CISS Fab 分子之掩蔽能力，選擇表 3之分子用於 HEK-blue IL-2 報道細胞測定，其如實例 4 中所描述使用「HEK-Blue IL-2」、「HEK-Blue IL-2 PD1」及「HEK-Blue IL-2 PD1 阻斷」條件進行。實驗之結果如圖 5 A 至圖 5 E中所示。相比之下，圖 4 D顯示了單獨的 IL-2v 分子對細胞之效應。所測試分子具有圖 1 A 中所示之形式，亦即它們係基於 Fab 且不包含額外的靶向臂或 Fc 域。本研究之主要目的係確定 CISS 分子是否有效掩蔽 IL-2v 分子。對於大多數測試的 CISS 分子，在所有條件下均觀測到 IL-2R 活性相對於僅 IL-2v 而言顯著降低。訊號之大幅降低可能指示存在功能性掩蔽相互作用，但在一些情況下亦可能指示蛋白質功能失調。在一些情況下，IL-2R 活性在「HEK-Blue IL-2 PD1」條件下似乎要高得多，此可能指示 PD1 依賴性活化係由於掩蔽振盪打開時 PD1 結合或當掩蔽關閉時 PD1 結合且定位至細胞表面。若不存在相互排他性，或者由於多聚體形成 (掩蔽物及細胞激素與其他分子之掩蔽物及細胞激素相互作用)，在一些情況下可能允許抗原結合，則 PD1 結合可在掩蔽關閉的情況下發生。
實例 6 ：基於 SPR 及細胞測定資料對合適的 CISS Fab 分子之選擇
可基於在實例 4 及 5 中所概述之細胞測定及 SPR 實驗中獲得的資料來選擇具有潛在功能的 CISS Fab。圖 6展示了 PD1-IL-2v CISS Fab 及具有 CISS 分子之所欲特性之前體的實例資料集。可選擇這樣的分子來添加靶向臂且進行進一步測試。表 5 總結了所論述之分子。表 5 – 展示 CISS Fab 選擇之例示性資料集
分子 ID 號 SEQ ID NO: (HC) SEQ ID NO: (LC) 分子類型 IL-2 掩蔽物 掩蔽物取向 連接子長度掩蔽物 連接子長度細胞激素 細胞激素
P1AI4346 141 140 對照 - - - 14x IL‑2_Q162T
P1AI4373 180 179 僅 Fab (對照) - - - -
P1AI4382 185 186 CISS P017.093 KH 2x 14x IL-2v
P1AI4461 241 242 對照 P017.093 KH 2x - -
圖 6 B顯示了 SPR 測定之結果，基本上如實例 2 中所進行 (分析物濃度為 20 nM、100 nM 及 250 nM，其中感測圖 a、b、c 及 d 之解離時間為 240 s，分析物濃度為 25 nM、75 nM 及 225 nM，其中感測圖 e、f、g 及 h 之解離時間為 480 s) 顯示了 PD1 結合劑單獨發揮作用以結合 PD1 (圖 6 B ，感測圖 a)，且在各 N 端與掩蔽物或細胞激素融合時繼續結合 (圖 6 、感測圖 e 及 g)。掩蔽物用以結合 IL-2v (圖 6 B ，感測圖 f)，且當 IL-2v Q126T 與 Fab 單獨融合時，其會與其受體結合 (圖 6 B，感測圖 h)。完整的CISS 分子 (P1AI4382，圖 6 B ，感測圖 b、c 及 d) 展示出明顯的相互排他性，並且不與 PD1 結合，因為掩蔽物及 IL-2v 可能相互作用且空間上阻斷互補位，此外，外部 IL-2v 及 IL-2Rbg 不能與分子結合，因為分子內發生的掩蔽相互作用佔據了必需的相互作用表面。使用表 5 中之相關分子進行的 HEK-Blue 測定，基本上如實例 4 及 5 中進行，確認了細胞激素連接子在結合至 PD1 時具有足夠的長度以到達細胞激素受體 (圖 6 A，P1AI4346) 且亦確認 CISS Fab 有效掩蔽 IL-2v 細胞激素 (P1AI4382)。
若由於可能不存在一些對照或 CISS 分子或實驗組分 (諸如 SPR 分析物或測定細胞株) 而無法獲得所有此等選擇資料，則仍然可基於可用資料之發現進行選擇以進行進一步研究。
實例 7 ：靶向的 PD1 IL-2 CISS 抗體分子之產生
使用兩個所關注的 CISS Fab 分子以產生 PD1 靶向的 IL-2v CISS 分子，該等分子包含一個額外的 Fab 臂，以用於將 CISS 分子靶向細胞表面 (有關分子形式之示意圖，參見圖 1 B)。此種靶向的 CISS 分子之建議作用機制顯示在圖 3 B中。第二抗原結合部分結合至細胞表面上之標靶分子，此通常增加標靶分子相對於 CISS 分子之局部濃度，且促進 CISS 靶向結合劑之結合，其釋放配位體以與配位體結合部分結合。因此，第二抗原結合部分之存在不僅提高了效率，且亦提高了與配位體結合部分之標靶依賴性結合之特異性。
使用先前使用的 221.AM2 掩蔽物之較低親和力變異體製備了兩個 CISS 分子。此等分子中使用了 IL-2 變異體 IL-2v (消除了 CD25 結合)，因為不需要靶向 CD25 陽性細胞。抗 PD1 (376) 抗體之 Fab 部分始終用為靶向臂。抗 PD1 (1040int) 抗體之 Fab 部分用於產生 CISS 臂。掩蔽物之連接子之長度為 2 個 AA，細胞激素連接子之長度為 14 或 18 個 AA。所測試靶向的 CISS 分子顯示於表 6 中。所產生分子之 SEQ ID NO 顯示於表 7中。
質體係使用根據實例 1 之基因合成 (Twist Bioscience，USA) 及 Gibson Assembly (NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix E2621X (New England BioLabs)) 之組合產生。根據實例 1 中之中規模表現程序，使用 MabSelect SuRe-蛋白 A 樹脂 (Cytiva Life Sciences，USA) 進行親和力純化來進行表現及純化。使用質譜以及還原性及非還原性 CE-SDS 來確認分子是否完整且具有預期大小。表 6：靶向的 CISS 分子
分子 ID 號 αPD1 靶向臂 CISS 臂之 αPD1 αIL-2v 掩蔽物 掩蔽物連接子長度 (AA 之數目 ) 細胞激素連接子長度 (AA 之數目 )
P1AJ4205 376 1040int 221_V2 2 14
P1AJ4207 2 18
表 7 ：靶向的 CISS 分子及對照之序列
SEQ ID NO:
分子名稱 VK-HC (PGLALA- 杵 XMab) VH-CL (Xmab) VH_HC IL-2v 融合物 (PGLALA_ 臼 ) VK-CL ( 掩蔽部分融合物 )
P1AJ4205 250 249 251 252
P1AJ4207 254 253 255 256
使用 HEK-Blue IL-2 報導細胞測定以評定靶向的 CISS 分子在 PD1 依賴性及非依賴性背景下的 IL-2 活性。為了進行測定，吾人的融合分子及對照被製備為滴定系列且應用於 HEK-Blue IL-2 報導細胞。使用 PD1 陰性 (親代) HEK-Blue IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2」條件) 及 PD1 陽性 (CL1AA1486) IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2 PD1」)。另外，PD1 陽性報導細胞 (CL1AA1486) 用已知與被測定分子之彼等抗體具有競爭性的抗體 (在 37℃ 下 P1AH4157 及 P1AG3741 各自 500 nM 持續 1h) 預先阻斷 (「HEK-Blue IL-2 PD1 阻斷」)。首先，以 1x104個報導細胞/孔接種於 25 µL 培養基 (DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/L 葡萄糖) (PAN，目錄號 P04-03609) + 10 % 熱不活化的 FBS (Anprotec，#AC-SM-0014Hi) + 2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，目錄號 P04-80100) + 100µg/ml 新黴素 (InvivoGen，目錄號 ant-nr-1) 中之 384 孔板中，接著在 37℃ 下與 25µl 之阻斷抗體混合物或培養基一起孵育 1h。隨後，製備不同測試分子及對照之 3 倍滴定系列 (12 個步驟)，自 15 nM 開始 (測定孔中之最終濃度介於 5 nM 與 0.00003 nM 之間)。將 25 µL 各濃度之每種融合蛋白轉移至 384 孔平底板。作為陽性對照，使用相同濃度範圍之重組 IL-2v (P1AD6412)。在 37℃ 下進行測試分子及細胞之孵育過夜。製備 QUANTI-Blue 溶液 (Invivogen，#rep-qbs) 且以 20 µL/孔分配至新的 384 孔平底板 (#781098) 之孔中，接著添加 20 µL 經處理細胞之上清液。在 620 nm 處量測光學密度 (OD) 之前，藉由所表現之 SEAP 進行受質週轉 2 至 6 小時 (Tecan Safire 2)。
結果顯示於圖 7 A 、 7 B 及 7 C中。如所預期，單獨的 huIL-2v (圖 7 C，對照) 在所有三種條件下均導致高度 IL-2 受體活化，與細胞表面上是否存在遊離 PD1 無關。如可透過在「HEK-Blue IL-2」及「HEK-Blue IL-2 PD1 阻斷」條件下比較此等分子 (圖 7 A 及 7 B)與 huIL-2v 對照 (圖 7 C) 觀測到，靶向的 CISS 分子 P1AJ4205 及 P1AJ4207 均顯示出良好的掩蔽效率。透過將「HEK-Blue IL-2 PD1」與「HEK-Blue IL-2」及「HEK-Blue IL-2 PD1 阻斷」條件進行比較，可清楚地看出，此等分子展現出強 PD1 依賴性 IL-2 活性 (圖 7A 及 7B)。
實例 8 ：靶向單元增加 CISS 功能
靶向域可用為將 CISS 分子定位至標靶抗原決定基之濃度相對較高的區域的手段，使得 CISS 結合劑在進入開放構象後更有可能與其標靶結合，且從而使細胞激素未掩蔽且能夠活化其受體。為了測試靶向域對 CISS 功能之影響且直接比較靶向分子及非靶向分子，產生了表 8中所示之分子。此等分子之示意性描繪顯示在圖 1 C中。所有分子均含有抗 PD1 Fab 1040int 作為第一抗原結合部分及細胞激素變異體 IL-2v 作為配位體。在此實例中，使用抗 PD1 VHH (G05) 作為額外抗 PD1 靶向臂，而非第二 Fab。093 掩蔽物藉由 2x 連接子以 VK_VH 取向接附至抗原結合部分。產生其中 CISS Fab 融合至 Fc 域之 N 端但不具有靶向臂之對應分子，且針對具有靶向臂之對應分子進行測試。表 8：具有第二靶向臂之 PD1 靶向的 IL-2v CISS 分子
分子 ID 號 SEQ ID NO: ( 鏈 1) SEQ ID NO: ( 鏈 2) SEQ ID NO: ( 鏈 3) 抗 PD1 靶向臂 連接子長度細胞激素
P1AJ7869 257 258 259 G05 14
P1AJ7871 260 261 262 18
P1AJ7873 263 264 265 22
P1AJ7915 266 267 268 無 (對照) 14
P1AJ7917 269 270 271 18
P1AJ7919 272 273 274 22
質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之中等規模純化方案，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 表現且純化分子。
圖 8顯示了使用 HEK-Blue IL-2 報導基因測定比較具有及不具有與 PD1 結合之靶向次單元的 PD1-IL-2v CISS 之代表性資料，使用分子 P1AJ7869 及 P1AJ7915。
為了進行測定，測試分子及對照被製備為 PD1 陰性 (親代) IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2」) 或 PD1 陽性 (CL1AA1486) IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2 PD1」) 上之滴定系列。首先，準備各種融合蛋白及對照的 3 倍滴定系列 (12 個步驟)，以至多 460 nM 之濃度開始，各蛋白質之範圍不同 (測定孔中之最終濃度介於 230 nM 與 0.0039 nM 之間)。將 25 µL 各濃度之各測試分子轉移至 384 孔平底板中。隨後，以 1x104個報導細胞/孔接種於 25 µL 培養基 (DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/L 葡萄糖) (PAN，目錄號 P04-03609) + 10 % 熱不活化的 FBS (Anprotec，#AC-SM-0014Hi) + 2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，目錄號 P04-80100) + 100µg/ml 新黴素 (InvivoGen，目錄號 ant-nr-1) 中之 384 孔板中。作為陽性對照，使用相同濃度範圍之重組 IL-2v (P1AD6412)。在 37℃ 下進行細胞及測試分子之孵育過夜。製備 QUANTI-Blue 溶液 (Invivogen，#rep-qbs) 且以 20 µL/孔分配至新的 384 孔平底板 (#781098) 之孔中，接著添加 20 µL 經處理細胞之上清液。在 620 nm 處量測光學密度 (OD) 之前，藉由所表現之 SEAP 進行受質週轉 2 至 6 小時 (Tecan Safire 2)。
如圖 8中可見，靶向臂顯著增加了 CISS 分子之 PD1 比活性，如可藉由比較分子 P1AJ7869 (靶向的) 及 P1AJ7915 (非靶向的) 可見。結果證實，靶向臂在一些情況下可大大增強功能。此等結果亦證明，額外靶向臂可由標準抗體域 (例如 Fab 或 scFv) 組成，或亦可為任何數目之其他類型的蛋白質結合劑，諸如 VHH、內源性蛋白質域或抗體模擬物 (例如DARPin、抗運載蛋白、親和體等)。潛在的其他靶向部分亦可結合使用。
實例 9 ：相對於簡單的細胞激素掩蔽相互排斥的 CISS 切換增強了功能
當 CISS 分子經由第二抗原結合域作為靶向臂定位至細胞表面時，其依賴於掩蔽在藉由 CISS 與標靶抗原結合及/或細胞激素與受體結合進入「關閉」狀態時保持打開狀態。由於細胞激素可在掩蔽處於「關閉」狀態時藉由直接與其受體結合來活化受體，因此並非所有活性均依賴於首先藉由額外靶向臂與 CISS Fab 之標靶結合。為了測試這一點，製備了具有相同第二靶向臂但不同第一抗原結合部分之靶向的 IL-2v CISS 分子。
表 9之 CISS Fab 分子之質體係使用外部基因合成及載體選殖 (Twist Bioscience，USA) 或如實例 1 中所描述之基因片段合成 (Twist Bioscience，USA) 及 Golden Gate Assembly (PaqCI R0745L 及 NEBridge® Ligase Master Mix M1100L (New England BioLabs)) 產生。根據實例 1 中所概述之中等規模表現方法，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 進行表現及純化。
如實例 8中所描述進行 HEK Blue IL-2 報導細胞測定，資料顯示於圖 9中。測試了圖 1 C中所示結構之兩個 CISS 分子，除了它們的第一個抗原結合部分之外，它們是相同的 (表 9)。兩種分子均含有細胞激素變異體 IL-2v 作為配位體，其經由 14x 連接子接附至第一個抗原結合部分之輕鏈 (LC) 的 N 端。如實例 8 中那樣，使用抗 PD1 VHH (G05) 作為第二抗 PD1 靶向臂。093 掩蔽物藉由 2x 連接子以 VK_VH 取向接附至抗原結合部分之重鏈 (HC) N 端。抗原結合部分要么與 PD1 (1040int Fab) 結合，要么不具有已知的特異性 (DP47 Fab)。
由於 DP47 殖株被認為基本上無結合活性，因此假定自該 CISS 變異體觀測到之任何受體活性主要係由於當掩蔽物處於「關閉」狀態時 IL-2v 與 IL-2R 之直接結合。似乎存在一些 PD1 依賴性活化，但效應相對較低 (圖 9 ，左上圖)。相較之下，在包括 PD1 依賴性相互排斥開關時，觀測到效力大大增加 (圖 9，右上圖)。顯示未靶向的 (圖 9 ，左下圖) 或不具有掩蔽或 CISS 功能性之 PD-1 靶向的 huIL-2v (圖 9 ，右下圖) 以用於比較，且未顯示出表現標靶與不表現標靶之報導細胞之間的顯著差異。表 9 ：具有第二靶向臂之 PD1 及 DP47 靶向的 IL-2v CISS 分子
分子 ID 號 SEQ ID NO: ( 鏈 1) SEQ ID NO: ( 鏈 2) SEQ ID NO: ( 鏈 3) 額外抗 PD1 靶向臂 抗原結合部分 細胞激素
P1AJ7980 278 279 280 G05 VHH DP47 IL-2v
P1AJ7869 275 276 277 G05 VHH 1040int IL-2v
實例 10 ：以分子內方式而非分子間方式未掩蔽
產生表 10 中所示之分子來顯示以分子內方式而非分子間方式未掩蔽之分子。此種分子內未掩蔽之建議機制顯示於圖 13中。在不存在標靶抗原之情況下，掩蔽部分與配位體結合，此處為受體結合劑 (例如細胞激素)。在存在標靶抗原之情況下，第二抗原結合部分將首先與標靶抗原結合。當掩蔽部分打開時，第一抗原結合部分 (此處為針對標靶抗原之 Fab) 亦將在單獨的抗原決定基處與標靶結合。第一及第二抗原結合部分與標靶抗原之雙倍結合導致配位體 (亦即受體結合劑) 之有效釋放，該配位體現在自由地與配位體結合部分 (亦即配位體的受體) 結合且觸發受體活化。a) 分子之 SPR 篩選及產生
以便找到能夠在所欲構象背景中與單一 PD1 結合兩次之分子，吾人製備了前驅分子來測試與排除 IL-2v 細胞激素之 PD1 的結合。構築此等前體之最終目的係基於實例 2-4 之細胞測定及 SPR 結果，以獲得具有已知良好篩選特性之彼等 CISS Fab 候選物中之一些，且將第二個 PD1 結合劑 (VHH G05) 添加至掩蔽物之 N 端 (VHH G05 與 PD1 之 1040int 結合劑非競爭性結合)。舉例而言，IL-2v 與 N 端之融合以及 1040int Fab 之重鏈與 14x 連接子之融合，以及 221.AM2 掩蔽物 (VH-VL) 藉由 2 個胺基酸連接子與輕鏈 N 端融合，看起來在篩選 SPR 及細胞測定中很有前景 (實例 2-4)。
因此，吾人基於此取向構築了前驅分子內分子，該取向排除了 IL-2v，但在輕鏈 之 N 端包括 221.AM2 掩蔽物 (經由 2x 連接子)，吾人進一步經由 20x Gly-Ser 連接子將靶向 VHH 之 G05 進一步添加至其 N 端。在該分子 (分子 P1AJ7955) 中亦添加了 Fc，以便於進行潛在的進一步測試。最後，吾人亦製作了具有 N 端 G05 VHH 融合物之 CISS Fab 的完整分子。一個實例 (P1AJ6652) 在構築上與分子 P1AJ7955 相似，但在 14x 連接子上具有 VH N 端 IL-2v，其為 221 掩蔽物之較低親和力變異體 (V3，其為未成熟的親代掩蔽物 P029.221 且具有最低親和力，或 V2，其與 V3 之不同之處在於胺基酸取代 Ih102F 且具有介於 V3 與 221.AM2 掩蔽物之間的親和力) 且無 Fc。分子內未掩蔽可能比許多分子間情況更有效，部分原因係當掩蔽物打開時，1040int 抗 PD1 之 PD1 抗原決定基理論上相對於 1040int 互補位而言處於相當高的有效濃度，而與細胞表面濃度無關。
表 10之 CISS Fab 分子之質體係使用外部基因合成及載體選殖 (Twist Bioscience，USA) 或如實例 1 中所描述之基因片段合成 (Twist Bioscience，USA) 及 Golden Gate Assembly (PaqCI R0745L 及 NEBridge® Ligase Master Mix M1100L (New England BioLabs)) 產生。根據實例 1 中所概述之中等規模表現方法，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 進行表現及純化。P1AJ6652 表現兩次，一次使用實例 1 中之小規模純化及表現方案，且一次使用前述中等規模方案。表 10 ：用於分子內未掩蔽之 PD1 靶向的 IL-2v CISS 分子
分子 ID 號 SEQ ID NO: ( 鏈 1) SEQ ID NO: ( 鏈 2) SEQ ID NO: ( 鏈 3) 第二抗原結合部分 掩蔽部分 第一抗原結合部分 連接子長度 MM 連接子長度細胞激素 細胞激素
P1AJ6652 281 282 - G05 VHH 221_V3 1040int 2 14 IL-2v
P1AJ7955 286 287 288 G05 VHH 221_V2 2 - -
P1AI4373 (對照) 179 180 - - - - - -
P1AJ7982 289 290 291 G05 VHH - DP47 - - -
然後，吾人使用 SPR 將潛在的串聯結合前驅分子與單獨具有 PD1 結合劑 (1040 或 G05) 特徵的分子進行比較。如實例 2 中所描述，使用 50 nM 捕獲物及 25 nM、75 nM 及 225 nM 之分析物濃度進行 SPR。解離時間為 480 s。圖 15顯示了使用分子 P1AJ7955、P1AI4373 (1040int Fab) 及 P1AJ7982 (含有 Fc 之雙特異性分子，其特徵在於與一種 Fc 多肽融合之非功能性 Fab (DP47) 及與另一 Fc 多肽融合之 G05 VHH) 之感測圖。當 P1AJ7955 與兩種個別 PD1 結合劑之 PD1 分析物感測圖進行比較時，可清楚地看出，P1AJ7955 之親和力顯著高於單獨的任一種 PD1 結合劑。此指示 P1AJ7955 與 PD1 結合兩次，從而改良結合之能力。當使用 IL-2v 作為分析物時，吾人亦可見分子 P1AJ7955 中所含的 221.AM2 scFv 保留了良好的結合，指示沒有由 G05 VHH 誘導之融合物不耐受。P1AJ6652 (小規模純化材料) 亦在相同的 SPR 設定中進行了檢查，但解離時間更短，為 30 s。P1AJ6652 之 SPR 結果證實，掩蔽相互作用似乎具有功能性 (如自不存在 IL-2v 或 IL-2Rbg 結合即可看出)。PD1 對分子 P1AJ6652 之結合的動力學似乎亦與分子 P1AJ7982 (G05 VHH 雙特異性分子) 相當接近，此可藉由 G05 VHH 在兩種情況下均為 PD1 結合之主要驅動力來解釋。b) HEK-Blue 測定
HEK-Blue IL-2 報導細胞測定用於檢查具有潛在分子內未掩蔽之 P1AJ6652 分子 (CISS Fab 及靶向 VHH 結合同一 PD1 之兩個不同的抗原決定基)。
為了進行測定，吾人的測試分子及對照 (P1AD6412) 被製備為滴定系列且應用於報導細胞。使用三種 HEK-blue 細胞株；PD1 陰性 (親代) IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2」)；高 PD1 表現 IL-2 報導細胞株 (CL023814：「HEK-Blue IL-2 PD1 高」)；及低 PD1 表現 IL-2 報導細胞株 (CL023813：「HEK-Blue IL-2 PD1 低」)。另外，此等細胞株中之每一者均在額外的預封閉條件下使用 PD1 抗體 (P1AH4157 及 P1AG3741 之各自 500 nM，且 37℃下 1h)，該等抗體已知與經測定分子之 PD1 結合劑具有競爭性 (「HEK-Blue IL-2 阻斷」、「HEK-Blue IL-2 PD1 高阻斷」、「HEK-Blue IL-2 PD1 低阻斷」)。
首先，以 1x104個報導細胞/孔接種於 25 µL 培養基 (DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/L 葡萄糖) (PAN，目錄號 P04-03609) + 10 % 熱不活化的 FBS (Anprotec，#AC-SM-0014Hi) + 2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，目錄號 P04-80100) + 100µg/ml 新黴素 (InvivoGen，目錄號 ant-nr-1) 中之 384 孔板中。此後，將 25µl 之阻斷抗體混合物或僅細胞培養基分配至各孔中，然後將細胞在 37℃ 下孵育 1 h。隨後，一式三份地製備不同融合蛋白及對照之 3 倍滴定系列 (12 個步驟)，濃度因蛋白質而異，自 100 nM 開始 (測定孔中之最終濃度介於 50 nM 與0.0003 nM 之間)。作為陽性對照，使用相同濃度範圍之重組 IL-2v (P1AD6412)。將 25 µL 各濃度之測試分子轉移至 384 孔平底板中。將細胞及測試分子在 37℃ 下孵育 16-20 hr。製備 QUANTI-Blue 溶液 (Invivogen，#rep-qbs) 且以 20 µL/孔分配至新的 384 孔平底板 (#781098) 之孔中，接著添加 20 µL 經處理細胞之上清液。在 620 nm 處量測光學密度 (OD) 之前，藉由產生的 SEAP 進行受質週轉 2.5 小時 (Tecan Safire 2)。
實例 11 ：靶向的 PD1-IL-2v CISS p-Stat5 測定
在誘導 IL-2 傳訊路徑後，一種稱為 STAT5 之蛋白質被磷酸化，可使用抗體對磷酸-STAT5 (p-STAT5) 進行螢光染色，且從而可評定細胞之群體的 IL-2 活化。當將 CISS 分子應用於活化的供體 T 細胞時，此 p-STAT5 測定用於分析 PD1 依賴性 IL-2 活性。測試了表 11中所示之分子。表 11 - 用於 p-Stat5 測定之 PD1 靶向的 IL-2v CISS 分子
分子 ID 號 SEQ ID NO: ( 鏈 1) SEQ ID NO: ( 鏈 2) SEQ ID NO: ( 鏈 3) 第二抗原結合部分 掩蔽部分 第一抗原結合部分 連接子長度 MM 連接子長度細胞激素 細胞激素
P1AJ7881 292 293 294 PD1-G05 221 1040int 2 18 IL-2v
P1AJ7893 295 296 297 221_V3
P1AJ7935 304 305 306 - 221_V3
P1AJ7946 (對照) 307 308 309 PD1-G05 - - -
P1AA5355 (對照) 98 99 100 FAP-Fab
P1AJ6652 534 535 - PD-G05 221_V3 1040int 2 4 IL2v
P1AJ7907 536 537 538 PD-G05 221 1040int 2 18 IL2
P1AJ7910 539 540 541 PD-G05 221_V2 1040int 2 18 IL2
P1AJ7913 542 543 544 PD-G05 221_V3 1040int 2 18 IL2
P1AJ7925 545 546 547 PD-G05 093_V3 1040int 2 14 IL2v
P1AJ7926 548 549 550 PD-G05 093_V4 1040int 4 14 IL2v
表 11之 CISS Fab 分子之質體係使用外部基因合成及載體選殖 (Twist Bioscience，USA) 或如實例 1 中所描述之基因片段合成 (Twist Bioscience，USA) 及 Golden Gate Assembly (PaqCI R0745L 及 NEBridge® Ligase Master Mix M1100L (New England BioLabs)) 產生。根據實例 1 中所概述之中等規模表現方法，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 進行表現及純化。IL-2R 訊號傳導測定
進行了以下測定以確定 PD-1-IL-2v 免疫結合物 (例如，包括至少一個與具有額外突變之 IL-2 多肽共軛的 PD-1 結合的結合域) 之效力及順式/反式傳訊。
出於此目的，自健康的供體 PBMC 中分選具有 CD4 珠之 CD4 T 細胞 (Miltenyi，#130-045-101)，且在存在 1 μg/ml 板結合之抗 CD3 (過夜預包覆，殖株 OKT3，#317315，BioLegend) 及 1 μg/ml 之可溶性抗 CD28 (殖株 CD28.2，#302923，BioLegend) 抗體的情況下活化 3 天 以誘導 PD-1 表現。三天後，收集細胞並洗滌幾次以去除內源性細胞激素，一半的細胞用細胞微量紫 (CTV) 標記 (5 µM、在室溫 (RT) 5 分鐘；C34557、Thermo Scientific)，及另一半未標記。
然後，將未標記的細胞與飽和濃度之競爭性抗 PD-1 抗體 (內部分子，10 µg/ml) 在 RT 下孵育 30 分鐘，接著進行幾個洗滌步驟以移除過量的未結合之抗 PD-1 抗體 (「PD-1 阻斷」)。此後，將經 PD-1 預阻斷之細胞 (25 μl，6*106個細胞/ml) 與 PD-1+ 經 CTV 標記之細胞 (25 μl，6x106個細胞/ml) 在 V-型底板中 1:1 共培養，之後在 37℃ 下用濃度增加之處理免疫結合物 (50 µl，1:10 稀釋步驟) 處理 12 分鐘。為了保持磷酸化狀態，在與各種構築體一起孵育 12 分鐘後，添加等量的 Phosphoflow Fix Buffer I (100 µl，557870，BD Bioscience)。然後將細胞在 37℃ 下孵育 30 分鐘，之後用 Phosphoflow PermBuffer III (558050，BD Bioscience) 在 -80℃ 下滲透過夜。第二天，透過使用抗 STAT-5P 抗體(47/Stat5(pY694) 殖株, 562076, BD Bioscience) 在 4℃ 下將磷酸化的 STAT-5 染色 30 分鐘。
細胞係在螢光活化細胞分選 (FACS) BD-Symphony A3/A5 (BD Bioscience) 儀器上獲取。STAT-5P 的頻率使用 FlowJo (V10) 測定，並使用 GraphPad Prism (v8) 繪製。
PD-1+ T 細胞上之劑量反應曲線提供了有關所評定之分子透過 IL-2R 進行傳訊之效力的資訊。另外，為防止 PD-1 介導之遞送，因此用競爭性抗 PD-1 抗體預處理之 T 細胞的劑量反應曲線顯示了分子獨立於 PD-1 表現提供 IL-2R 傳訊之效力。表 E ： 15 min 後 IL-2R 傳訊測定之結果
15 min EC50 PD1- 細胞 EC50 PD1+ 細胞 CIS (EC50PD1-/EC50PD1+) 與 PD1-IL2v 相比效力降低 CMAX δ AUC
P1AJ6652 84688 737.1 114.9 63.6 62.0 84.4
P1AJ7893 N.A 3986 N.A 343.9 41.6 32.2
P1AJ7907 5507 520.1 10.6 44.9 57.8 31.1
P1AJ7910 461.8 52.5 8.8 4.5 57.8 39.6
P1AJ7913 67.05 15.64 4.3 1.3 58.6 32.2
P1AJ7935 N.A N.A N.A N.A 29.4 5.3
P1AL7925 79809 1360 58.7 117.3 46.7 70.5
P1AL7926 N.A 2427 N.A 209.4 38.8 40.4
P1AA5355 512.3 455.6 1.1 39.3 62.4 6.0
表 F ：1h 後 IL-2R 傳訊測定之結果
60 min EC50 PD1- 細胞 EC50 PD1+ 細胞 CIS (EC50PD1-/EC50PD1+) 與 PD1-IL2v 相比效力降低 CMAX δ AUC
P1AJ6652 15727 109.8 143.23 47.3 49.3 90.2
P1AJ7893 N.A 856.1 N.A 369.0 40.0 55.1
P1AJ7907 1882 60.48 31.12 26.1 53.0 71.3
P1AJ7910 373.6 37.41 9.99 16.1 59.1 79.5
P1AJ7913 121 9.703 12.47 4.2 57.0 87.0
P1AJ7935 N.A N.A N.A N.A 28.9 7.4
P1AL7925 N.A 406.1 N.A 175.0 40.1 67.2
P1AL7926 N.A 530.7 N.A 228.8 29.0 44.1
P1AA5355 331.9 258.5 1.28 111.4 57.6 20.3
當使用此 STAT5-p 測定進行檢查時，「093」變異體掩蔽之 IL2v CISS 分子 (P1AL7925，頂列，及 P1AL7926，底列) 產生了 PD1 依賴性功能之清晰窗口 (表 E 及 F；圖 31A)。此可透過 PD1 阻斷及非阻斷條件之比較而觀測到。FAP-IL2v (P1AA5355 FAP-IL2v) 作為對照存在，且代表非靶向 IL2v，因為 FAP 不在存在的細胞上表現 (參見表 E 及 F)。
透過比較分子 P1AJ7935 (無靶向臂，中間列) 及 P1AL7893 (靶向 PD1 之 VHH，頂部列)，吾人可見此設定中 PD1 靶向臂之明顯添加的益處 (表 E 及 F；圖 31 B)。
在圖 31B底列中，吾人進一步觀測了「分子內」分子 P1AJ6652 之效力，其能夠與單一 PD1 分子結合兩次。PD1 陽性情況下之效力相對於 PD1 阻斷的增加了 143 倍 (EC50 值之比較，表 F)。
在圖 31 C中，除了 IL2Rb 之外，亦利用「221」掩蔽物以抑制 IL2Ra 之能力來製備三種使用 IL2wt 之 CISS 分子。再次，吾人在 PD1 未阻斷的情況下可見，IL2R 傳訊相對於阻斷的情況大幅增加，指示此等 CISS 分子遞送了靶向的細胞激素功能。
實例 12 ：細胞激素之修飾可增強 CISS 特異性
CISS 分子之標靶特異性在某種程度上取決於細胞激素與其受體之親和力。當對受體之親和力較高時，當掩蔽物相互作用關閉而未先與標靶結合時，細胞激素與細胞激素受體直接結合之風險更大。因此，減少細胞激素受體結合但不消除傳訊之細胞激素的突變可能有助於提高特異性，因為 CISS Fab 在打開時應該更優先地與標靶結合，其亦可用為調整分子之細胞激素效力之手段，而不改變與標靶之結合，且從而分子之潛在親和力及劑量依賴性次要功能 (諸如例如受體拮抗作用) 可能不受影響。
表 12顯示了具有 IL-2 細胞激素之變異的靶向的 CISS 實例分子。表 12之 CISS 分子之質體係使用外部基因合成及載體選殖 (Twist Bioscience，USA) 或如實例 1 中所描述之基因片段合成 (Twist Bioscience，USA) 及 Golden Gate Assembly (PaqCI R0745L 及 NEBridge® Ligase Master Mix M1100L (New England BioLabs)) 產生。根據實例 1 中所概述之中等規模表現方法，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 進行表現及純化表 12 - 具有不同的細胞激素變異體之 PD1 靶向的 IL-2v CISS 分子
分子 ID 號 SEQ ID NO: ( 鏈 1) SEQ ID NO: ( 鏈 2) SEQ ID NO: ( 鏈 3) 第二抗原結合部分 掩蔽部分 第一抗原結合部分 連接子長度 MM 連接子長度細胞激素 細胞激素
P1AJ7893 295 296 297 PD1 - G05 221_V3 VH-VL 2 1040int 18 IL-2v
P1AJ7904 298 299 300 IL-2v Q126T
為了評定此等分子，如實例 8中所描述進行 HEK-Blue™ IL-2 報導細胞測定。圖 16顯示了使用相同的靶向的 CISS 分子但在 IL-2v、Q126T 中進行單一胺基酸取代之 HEK-blue™ IL-2 測定資料。當細胞激素定位於細胞表面時，Q126T 突變會降低對 IL-2Rb 之親和力，但不會完全消除 IL-2R 傳訊。當與類似的 IL-2v 分子 (P1AJ7893；圖 16 ，左圖) 相比時，PD1- IL-2v Q126T 靶向的 CISS 變異體 (P1AJ7904；圖 16 ，右圖) 顯示了對 PD1 陽性細胞「HEK-Blue IL-2 PD1」之較低活性，Q126T 變異體亦顯示了在 PD1 陰性「HEK-Blue IL-2」條件下 IL-2R 活性降低，從而證明 CISS 分子可藉由細胞激素之突變進一步微調。
實例 13 ： CD8 IL-2v CISS Fab 分子
為了證明 CISS 作用模式亦適用於 PD1 之外的標靶抗原，表 13中所示之一組 CD8 靶向的 IL-2v CISS 分子係基於抗 CD8 抗體 OKT8v11 之 Fab 變異體設計的，其充當此等分子中之第一抗原結合部分。質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之小規模純化方案表現且純化分子。IL-2v (配位體) 接附至抗 CD8 Fab 之重鏈或輕鏈，而抗 IL-2v 掩蔽物 (掩蔽部分) 則接附至另一條鏈之 N 端。所產生分子之形式對應於圖 1 A及2 C中所示之示意性描繪。使用不同的連接子長度將細胞激素 (14x 及 18x) 及抗 IL-2v 掩蔽物 (2x 及 4x) 接附至第一抗原結合部分。對於 scFv 掩蔽物 P017.093，使用取向 VL-VH (接附至 Fab 輕鏈 C 端之 VH)。分子之 SEQ ID NO 列於表 14中。
在可用的情況下，將不具有掩蔽部分或 IL-2v 部分之分子用為對照。使用 IL-2 CD8 融合蛋白及 IL-2v 作為額外對照。使用表面電漿子共振 (SPR) 篩選 CD8 IL-2v CISS Fab 分子，以鑑別具有令人滿意的掩蔽特性及相互排斥結合能力之殖株。基於 SPR 之測定進一步用於確定 CISS Fab 單元之結合動力學。它們相應的「前驅」分子 (單獨的 Fab，不具有 IL-2v 之掩蔽物-Fab 融合物及不具有掩蔽物之 IL-2v-Fab 融合物) 用為對照。使用具有單一 OKT8v11 靶向臂之 Fc 融合的雙特異性 mAb 分子來評定 OKT8v11 結合 (P1AJ7944)。表 13 ：已測試的 CD8 IL-2 CISS Fab 分子
分子 ID 分子 分子類型 連接子長度掩蔽物 連接子長度細胞激素 細胞激素 細胞激素連接至 掩蔽物連接至
P1AJ7944 tgt_OKT8v11_VK_HC_X_OKT8v11_VH_CK_X_1040_VK_X_1040_VH_HC 對照 - - - - -
P1AJ6281 093_VK-VH_2x_OKT8v11_VH_ x_OKT8v11_VK 對照 2 重鏈
P1AJ6282 093_VK-VH_4x_OKT8v11_VH_ x_OKT8v11_VK 4 重鏈
P1AJ6283 OKT8v11_VH_x_093_VK-VH_4x_OKT8v11_VK 4 輕鏈
P1AJ6285 093_VK-VH_2x_OKT8v11_VH_ x_14_IL-2v_OKT8v11_VK CISS 2 14 IL-2v 輕鏈 重鏈
P1AJ6286 093_VK-VH_2x_OKT8v11_VH_ x_18_IL2v_OKT8v11_VK 2 18
P1AJ6287 093_VK-VH_4x_OKT8v11_VH_ x_14_IL2v_OKT8v11_VK 4 14
P1AJ6288 093_VK-VH_4x_OKT8v11_VH_ x_18_IL2v_OKT8v11_VK 4 18
P1AJ6289 14_IL2v_OKT8v11_VH_ x_093_VK-VH_2x_OKT8v11_VK 2 14 重鏈 輕鏈
P1AJ6290 18_IL2v_OKT8v11_VH_ x_093_VK-VH_2x_OKT8v11_VK 2 18
P1AJ6291 14_IL2v_OKT8v11_VH_ x_093_VK-VH_4x_OKT8v11_VK 4 14
P1AJ6292 18_IL2v_OKT8v11_VH_ x_093_VK-VH_4x_OKT8v11_VK 4 18
P1AJ6293 14_IL2v_Q126T_OKT8v11_VH_ x_OKT8v11_VK 對照 - 14 IL2v Q126T 重鏈 -
P1AJ6294 18_IL2v_Q126T_OKT8v11_VH_ x_OKT8v11_VK 18
P1AJ6295 OKT8v11_VH_x_14_IL2v_Q126T_OKT8v11_VK 14 輕鏈
P1AJ6296 OKT8v11_VH_x_18_IL2v_Q126T_OKT8v11_VK 18
各測定基本上如實例 4 中所描述進行。使三種分析物流動以評定 CD8 IL-2v 分子之功能：a) 使人類 hCD8a-Fc 蛋白流動，以評定完整 CISS Fab 分子之抗 CD8a-Fab 與 CD8a 或掩蔽物與細胞激素之相互排他性，由此結合之減少可能表明掩蔽物-細胞激素相互作用在空間上抑制抗 PD1 Fab 與 PD1 的相互作用。使用 PD1 作為分析物對於掩蔽物或 IL-2v 與抗‑PD1 之 N 端的個別融合物亦為所關注的表 14 – 所測試分子之序列
分子 ID 分子名稱 SEQ ID NO:
鏈 1 鏈 2 鏈 3 鏈 4
P1AJ7944 tgt_OKT8v11_VK_HC_X_OKT8v11_VH_CK_X_1040_VK_X_1040_VH_HC 346 347 348 349
P1AJ6281 093_VK-VH_2x_OKT8v11_VH_ x_OKT8v11_VK 316 317 - -
P1AJ6282 093_VK-VH_4x_OKT8v11_VH_ x_OKT8v11_VK 318 319 - -
P1AJ6283 OKT8v11_VH_x_093_VK-VH_4x_OKT8v11_VK 320 321 - -
P1AJ6285 093_VK-VH_2x_OKT8v11_VH_ x_14_IL2v_OKT8v11_VK 322 323 - -
P1AJ6286 093_VK-VH_2x_OKT8v11_VH_ x_18_IL2v_OKT8v11_VK 324 325 - -
P1AJ6287 093_VK-VH_4x_OKT8v11_VH_ x_14_IL2v_OKT8v11_VK 326 327 - -
P1AJ6288 093_VK-VH_4x_OKT8v11_VH_ x_18_IL2v_OKT8v11_VK 328 329 - -
P1AJ6289 14_IL2v_OKT8v11_VH_ x_093_VK-VH_2x_OKT8v11_VK 330 331 - -
P1AJ6290 18_IL2v_OKT8v11_VH_ x_093_VK-VH_2x_OKT8v11_VK 332 333 - -
P1AJ6291 14_IL2v_OKT8v11_VH_ x_093_VK-VH_4x_OKT8v11_VK 334 335 - -
P1AJ6292 18_IL2v_OKT8v11_VH_ x_093_VK-VH_4x_OKT8v11_VK 336 337 - -
P1AJ6293 14_IL2v_Q126T_OKT8v11_VH_ x_OKT8v11_VK 338 339 - -
P1AJ6294 18_IL2v_Q126T_OKT8v11_VH_ x_OKT8v11_VK 340 341 - -
P1AJ6295 OKT8v11_VH_x_14_IL2v_Q126T_OKT8v11_VK 342 343 - -
P1AJ6296 OKT8v11_VH_x_18_IL2v_Q126T_OKT8v11_VK 344 345 - -
Fab.融合物 PD1 動力學可與單獨 Fab 之彼等動力學進行比較，以評定 PD1 結合之改變。b) 使 IL-2Rbg-Fc 作為分析物流動，以評定掩蔽物之功能或確認遊離 IL-2v 組分之正確折疊。當涉及掩蔽物時，若 IL-2Rbg 不結合或結合大大減弱，則假定至少 IL-2v 之 IL-2Rb 結合表面被掩蔽或以其他方式改變。根據動力學，IL-2Rbg 之結合可能表明與 IL-2rbg 結合或與單獨的 IL-2rb 結合，前者表明不存在有效的掩蔽，且後者表明掩蔽可能單獨掩蓋 IL-2Rg 介面。c) 最後，使 IL-2v 流動，以評定掩蔽物與 Fab 融合物之掩蔽部分之功能，且亦可為完整的 CISS Fab 遞送正確折疊之指示。
在表 15中，總結了證明標靶結合之 SPR 測定之結果。該表顯示了隨後流動 225 nM 分析物之循環中分子之捕獲水準、反應率 (以 [%] 為單位) 以及觀測到的與標靶結合之總結。「B」指示「結合」，「LB」指示「低結合」且「N/MB」指示「無結合/最小結合」。
SPR 結果顯示了前驅分子之行為如所欲，OKT8v11 Fab 與 hCD8a 結合且所有掩蔽物-Fab 及 IL-2v Q126T-Fab 融合物亦與 hCD8a 結合，且亦分別與 IL-2v 及 IL-2Rbg 結合。對於許多 CISS Fab 產生之分子，可證明明顯的相互排他性。P1AJ6285 為所關注的實例。P1AJ6285 具有融合至 OKT8v11 Fab VH 之 OKT8v11 N 端之 093 掩蔽物 (VL-VH)，其中 IL-2v 經由 14 個胺基酸連接子融合至 VL。如所論述的，P1AJ6285 之前體在 SPR 中表現如所預期 (P1AJ7944、P1AJ6281、P1AJ6295)，而 P1AJ6285 已消除了對所有 3 種分析物 (hCD8a、IL-2v、IL-2rbg) 之結合，指示掩蔽相互作用可能正在發生且在空間上抑制 hCD8a 之結合。因而，吾人經由 SPR 評定的所有機械標準均滿足，P1AJ6285 在被靶向後，即成為潛在的功能性 CISS 分子。表 15 – SPR 測定之結果
hCD8a-Fc IL-2rbg-Fc-bio IL-2v 配位體 _ 捕獲 _ 總結
分子 ID 號 Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg hPD1-Fc IL-2rbg-Fc-bio IL-2v
P1AJ7944 186.2 71.3 B 184 2.0 N/MB 185.6 13.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6281 160.9 77.5 B 160.2 0.5 N/MB 160.7 86.3 B 好 好 好
P1AJ6282 152.3 80.8 B 154.3 1.2 N/MB 154.2 92.2 B 好 好 好
P1AJ6283 84.3 21.0 B 84.0 0.1 N/MB 84.5 20.3 B 好 好 好
P1AJ6285 122.6 2.7 N/MB 122.3 1.2 N/MB 122.7 9.6 N/MB 好 好 好
P1AJ6286 107.6 4.3 LB 107.5 1.3 N/MB 107.9 8.3 N/MB 好 好 好
P1AJ6287 120.1 3.3 N/MB 119.2 1.8 N/MB 120.0 12.2 N/MB 好 好 好
P1AJ6288 119.4 4.9 LB 118.9 1.6 N/MB 119.6 9.9 N/MB 好 好 好
P1AJ6289 116.0 2.0 N/MB 115.1 0.7 N/MB 115.5 5.3 N/MB 好 好 好
P1AJ6290 121.8 2.9 N/MB 121.0 1.2 N/MB 121.5 8.8 N/MB 好 好 好
P1AJ6291 12.3 53.1 N/MB 12.6 31.1 N/MB 12.4 217.4 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AJ6292 46.7 2.9 N/MB 46.4 1.7 N/MB 46.4 10.9 N/MB 好 好 好
P1AJ6293 89.9 76.8 B 89.2 35.3 B 89.1 5.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6294 93.2 81.9 B 92.2 35.3 B 92.5 7.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6295 67.3 74.3 B 66.8 24.7 B 67.2 17.3 N/MB 好 好 好
P1AJ6296 19.7 67.4 B 19.9 24.0 B 20.0 56.5 N/MB VL/N VL/N 低
使用 CD8 陽性及陰性細胞之HEK-blue IL-2 測定，以評定 CD8 IL-2 CISS 分子內之 Fab 及細胞激素次單元是否可在預期背景下同時結合至標靶及細胞激素受體，吾人產生了具有減弱的 IL-2v 分子之 Fab-細胞激素融合物，以用於在 IL-2 報導細胞測定中進行測試。吾人亦試圖評定完整的 CD8a CISS 分子是否成功掩蔽 IL-2v。
為了進行測定，吾人的測試分子及對照被製備為滴定系列且應用於 IL-2 報導細胞。PD1 陰性 (親代) IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2」)或 PD1 及 CD8A 陽性報導細胞 (CL023901：「HEK-Blue IL-2 CD8」)。首先，一式三份地製備不同測試分子及對照之 3 倍滴定系列 (12 個步驟)。所有分子均稀釋至起始濃度 100 nM (孔中之最終濃度介於 50 nM 與 0.0003 nM 之間)，對照 P1AD6412 及 P1AE4422 除外，其起始濃度稀釋至 10 nM (孔中之最終濃度介於 5 nM 與0.00003 nM 之間)。將 25 µL 各濃度之各測試分子轉移至 384 孔平底板中。隨後，以 1x104個報導細胞/孔接種於 25 µL 培養基 (DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/L 葡萄糖) (PAN，目錄號 P04-03609) + 10 % 熱不活化的 FBS (Anprotec，#AC-SM-0014Hi) + 2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，目錄號 P04-80100) + 100µg/ml 新黴素 (InvivoGen，目錄號 ant-nr-1) 中之 384 孔板中。將測試分子及細胞在 37℃ 下孵育 16-20 hr。製備 QUANTI-Blue 溶液 (Invivogen，#rep-qbs) 且以 20 µL/孔分配至新的 384 孔平底板 (781098) 之孔中，接著添加 20 µL 經處理細胞之上清液。在 620 nm 處量測光學密度 (OD) 之前，藉由所表現之 SEAP 進行受質週轉 2 至 6 小時 (Tecan Safire 2)。
在圖 10中，HEK-blue 資料係使用 CISS Fab P1AJ6285 及其前體作為實例來顯示。結果表明，儘管當與「HEK-Blue IL-2 CD8a」細胞株相比時，「HEK-Blue IL-2」細胞株對 IL-2v 之敏感性更高 (圖 10 B)，細胞激素 Fab 融合分子 P1AJ6295 中之 IL-2v Q126T 的CD8a 靶向導致「HEK-Blue IL-2 CD8」細胞株比「HEK-Blue IL-2」細胞株具有更高的 IL-2 傳訊活性 (圖 10 A)。此表明 IL-2R 可有效地達成且由 IL-2v 結合，同時 CD8a 亦被結合。當 IL-2v 與 CISS Fab P1AJ6285 進行比較時，可清楚地看出，在該兩種情況下，IL-2v 均更有效，且此表明 CISS 分子有效地掩蔽其內部的 IL-2v。因此，P1AJ6285 似乎滿足吾人的關於潛在靶向的 CISS 分子之所有篩選標準。
實例 14 ： CD8 IL-2 CISS 分子 (CD8 靶向的 )
向 CISS Fab 中添加靶向臂可增強與分子之特異性及效力。為了製備靶向的 CISS CD8 IL-2v 分子，將 Fc 及 VHH 靶向臂 (靶向 CD8a 之 VHH5v2) 接附至 OKT8v11 Fab。使用篩選的 P1AJ6285 候選物之取向及連接子長度，將 OKT8v11 進一步融合至 093 掩蔽物及 IL-2v。
表 16之 CISS Fab 分子之質體係使用外部基因合成及載體選殖 (Twist Bioscience，USA) 或如實例 1 中所描述之基因片段合成 (Twist Bioscience，USA) 及 Golden Gate Assembly (PaqCI R0745L 及 NEBridge® Ligase Master Mix M1100L (New England BioLabs)) 產生。根據實例 1 中所概述之中等規模表現方法，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 進行表現及純化。使用質譜來確認蛋白質之正確形成。表 16 – 產生的 CD8 靶向的 CD8 IL-2 CISS 分子
分子 ID 號 第二抗原結合部分 第一抗原結合部分 掩蔽部分 掩蔽物連接子長度 (AA 之數目 ) 細胞激素連接子長度 (AA 之數目 ) 細胞激素
P1AL7927 VHH5v2 OKT8v11 093 V3 2 14 IL2v
P1AL7886 - OKT8v11 2 14 IL2v
表 17 – 靶向 CD8 的 CD8 IL-2 CISS 分子之序列
分子 ID 號 SEQ ID NO:
鏈 1 鏈 2 鏈 3
P1AL7927 356 357 358
P1AL7886 350 352 353
HEK-Blue IL-2 報導基因測定
該實驗詳述了表 16 中所示之分子在 HEK-Blue IL-2 報導基因測定中之效力及它們對 CD8a 之依賴性。為了進行測定，吾人的融合分子及對照作為 IL-2 受體細胞上之滴定系列應用。使用 CD8a 陰性 (親代) HEK-Blue IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2」) 以及 PD1 及 CD8A 陽性 IL-2 報導細胞株 (CL023901：「HEK-Blue IL-2 CD8a」)。另外，使用了用 OKT8 變異體 (P1AF4823) 預阻斷 PD1 及 CD8A 陽性 IL-2 報導細胞 (CL023901) 上之 CD8a 分子的條件 (「HEK-Blue IL-2 CD8a 阻斷」)。重要的是，雖然該抗體能夠阻斷 OKT8，但其不與 VHH5v2 結合劑競爭。
將報導細胞在 15ml falcon 中與阻斷抗體 (OKT8 變異單株抗體 (P1AF4823，1 µM) 加培養基 (DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/L 葡萄糖) (PAN，目錄號 P04-03609) + 10 % 熱不活化的 FBS (Anprotec，#AC-SM-0014Hi) + 2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，目錄號 P04-80100) + 100µg/ml 新黴素 (InvivoGen，目錄號 ant-nr-1) 或培養基加單獨的新黴素一起孵育 1 小時。然後將 25 µL 之此等細胞 (含有 1x104個報導細胞/孔) 分配至 384 孔板之孔中。此後，將 25µl 之阻斷抗體混合物或僅細胞培養基分配至各孔中，然後將細胞在 37℃ 下孵育 1 h。隨後，首先，一式三份地製備不同測試分子及對照之 3 倍滴定系列 (12 個步驟)。將 25 µL 各濃度之測試分子轉移至 384 孔平底板中。將細胞及測試分子在 37℃ 下孵育 16-20 hr。製備 QUANTI-Blue 溶液 (Invivogen，#rep-qbs) 且以 20 µL/孔分配至新的 384 孔平底板 (#781098) 之孔中，接著添加 20 µL 經處理細胞之上清液。在 620 nm 處量測光學密度 (OD) 之前，藉由產生的 SEAP 進行受質週轉 2.5 小時 (Tecan Safire 2)。
測定之結果顯示於圖 29中。圖 29顯示了使用 IL2 親代細胞株由 CD8a-IL2v CISS Fab (P1AL7886，中間圖)、靶向的 CISS fab (P1AL7927，底部圖) 及 IL2v 對照 (P1AD6412，頂部圖) 分子刺激的劑量依賴性 IL2 活性。透過比較圖 29之三張圖，可清楚地看出，兩個 CISS 分子內所含的掩蔽物能夠強烈抑制 IL2 活性。由於靶向及非靶向 CISS Fab 中的 CISS Fab 單元相同，因此吾人毫不奇怪地發現 IL2 抑制之水準亦極相似。透過比較頂部圖中細胞株之間的 IL2v 功能，可清楚地看出，IL2 報導細胞株之 CD8 陽性變異體對 IL2 活性 (帶三角形之虛線) 之敏感性要低得多。透過比較頂部 (IL2v 對照) 及中間之圖，再次清楚了抗 IL2 掩蔽物之 IL2 阻斷功能。對於 P1AL7927 及 P1AL7886，不表現 CD8 之 HEKblue 細胞中 IL2 之活化大大降低。可清楚地看出，經由單獨的 CISS Fab 即可能實現大量的 CD8 選擇性，如當 CD8 被阻斷時 IL2 活性降低所指示的那樣 (虛線及方塊)。此外，當比較該兩張圖時，可清楚地看出，第二抗原結合部分顯著增強了此種 CD8 依賴性 CISS 功能。由於無具有 VHH5v2 靶向臂之競爭者，因此不可能阻斷靶向的構築體。然而，由於 CISS Fab 及靶向的 CISS Fab 在 IL2 報導細胞上之作用高度相似 (實線及圓圈)，成功阻斷靶向的 CISS Fab 很可能與圖 29之中間圖中所示的 CISS Fab 之阻斷有些相似。
實例 15 ： IL18R IL-2v CISS 分子
為了測試 CISS 型相互排他性是否亦可轉移至其中抗原結合部分為抗 IL18R 抗體之 CISS 結合劑的組合，進行篩選以尋找功能性抗 IL18R IL-2v CISS 分子 (參見表 18)。將抗 IL18R Fab 1G12_AB11.6 與 IL-2v 組合。所有分子均使用抗 IL-2v 掩蔽物 093。測試了 IL-2v 分子 (14x、18x) 及掩蔽物 (2x、4x) 之兩種不同的連接子長度以及 IL-2v 及掩蔽物與抗 IL18R 結合劑之重鏈及輕鏈的交替融合物。分子具有圖 2 C中所示之形式且不含有 Fc 域或靶向臂。質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之小規模純化方案表現且純化分子。表 18 ： IL18R1 IL-2v CISS 分子
分子 ID 號 類型 IL-2 IL-2 掩蔽物 掩蔽物接附至 細胞激素接附至 抗 IL18R ( 結合劑 ) 連接子長度掩蔽物 連接子長度細胞激素
P1AJ6484 對照 - 093 重鏈 輕鏈 1G12_AB11.6 2 -
P1AJ6485 4
P1AJ6487 輕鏈 重鏈 2
P1AJ6486 4
P1AJ6488 CISS IL-2v 重鏈 輕鏈 2 14
P1AJ6489 2 18
P1AJ6490 4 14
P1AJ6491 4 18
P1AJ6492 輕鏈 重鏈 2 14
P1AJ6493 2 18
P1AJ6494 4 14
P1AJ6495 4 18
P1AJ6496 對照 IL2v Q126T - - 重鏈 - 14
P1AJ6497 18
P1AJ6498 輕鏈 14
P1AJ6500 18
表 19 – 表 18 之分子之 SEQ ID NO:
分子名稱 分子 ID 號 SEQ ID NO: SEQ ID NO:
093_VK-VH_2x_1G12_AB11.6_VH_x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6484 359 360
093_VK-VH_4x_1G12_AB11.6_VH_x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6485 361 362
1G12_AB11.6_VH_x_093_VK-VH_2x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6487 365 366
1G12_AB11.6_VH_x_093_VK-VH_4x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6486 363 364
093_VK-VH_2x_1G12_AB11.6_VH_x_14_IL2v_1G12_AB11.6_VK P1AJ6488 367 368
093_VK-VH_2x_1G12_AB11.6_VH_x_18_IL2v_1G12_AB11.6_VK P1AJ6489 369 370
093_VK-VH_4x_1G12_AB11.6_VH_x_14_IL2v_1G12_AB11.6_VK P1AJ6490 371 372
093_VK-VH_4x_1G12_AB11.6_VH_x_18_IL2v_1G12_AB11.6_VK P1AJ6491 373 374
14_IL2v_1G12_AB11.6_VH_x_093_VK-VH_2x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6492 375 376
18_IL2v_1G12_AB11.6_VH_x_093_VK-VH_2x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6493 377 378
14_IL2v_1G12_AB11.6_VH_x_093_VK-VH_4x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6494 379 380
18_IL2v_1G12_AB11.6_VH_x_093_VK-VH_4x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6495 381 382
14_IL2v_Q126T_1G12_AB11.6_VH_x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6496 383 384
18_IL2v_Q126T_1G12_AB11.6_VH_x_1G12_AB11.6_VK P1AJ6497 385 386
1G12_AB11.6_VH_x_14_IL2v_Q126T_1G12_AB11.6_VK P1AJ6498 387 388
1G12_AB11.6_VH_x_18_IL2v_Q126T_1G12_AB11.6_VK P1AJ6500 389 390
使用表面電漿子共振 (SPR) 篩選 IL18R1 IL-2v CISS Fab 分子，以鑑別具有令人滿意的掩蔽特性及相互排斥結合能力之殖株。基於 SPR 之測定進一步用於確定 CISS Fab 單元之結合動力學。它們相應的「前驅」分子 (不具有 IL-2v 之掩蔽物-Fab 融合物及不具有掩蔽物之 IL-2v-Fab 融合物) 用為對照。
各測定基本上如實例 4 中所描述進行。使三種分析物流動以評定 IL18R1-IL-2v 分子之功能：a) 使人類 IL18R1-Fc 二聚體蛋白流動，以評定完整 CISS Fab 分子之抗 IL18R1-Fab 與 IL18R1 或掩蔽物與細胞激素之相互排他性，由此結合之減少可能表明掩蔽物-細胞激素相互作用在空間上抑制抗 IL18R1 Fab 與 IL18R1 的相互作用。使用 IL18R1 作為分析物對於掩蔽物 (圖 2 A) 或 IL-2v (圖 2 B) 與抗 IL18R1 Fab 之 N 端的個別融合物亦為所關注的。b) 使 IL-2Rbg-Fc 作為分析物流動，以評定掩蔽物之功能或確認遊離 IL-2v 組分之正確折疊。當涉及掩蔽物時，若 IL-2Rbg 不結合或結合大大減弱，則假定至少 IL-2v 之 IL-2Rb 結合表面被掩蔽或以其他方式改變。根據動力學，IL-2Rbg 之結合可能表明與 IL-2rbg 結合或與單獨的 IL-2rb 結合，前者表明不存在有效的掩蔽，且後者表明掩蔽可能單獨掩蓋 IL-2Rg 介面。c) 最後，使 IL-2v 流動，以評定掩蔽物與 Fab 融合物之掩蔽部分之功能 (圖 2 B)，且亦可為完整的 CISS Fab 遞送正確折疊之指示。
在表 20中，總結了證明標靶結合之 SPR 測定之結果。該表顯示了 225 nM 處之捕獲、反應率 (以 [%] 為單位) 以及觀測到的與標靶結合之總結。「B」指示「結合」，「LB」指示「低結合」且「N/MB」指示「無結合/最小結合」。
當捕獲水準足夠時，SPR 結果表明，當任一 N 端上存在融合物 (P1AJ6484、P1AJ6485、P1AJ6487、P1AJ6486 及 P1AJ6500) 時，IL18R1 結合劑保留了結合能力。另外，所有前驅掩蔽物-Fab 融合物均與 IL-2v 結合，且捕獲良好的單一 IL-2v Q126T-Fab 融合物亦與 IL-2Rbg 結合。對於許多 CISS Fab 產生的分子，可證明明顯的相互排他性 (掩蔽物-細胞激素相互作用與 Fab-標靶相互作用之間，如完整的 CISS 分子無法結合至 IL18R1 所指示)。掩蔽物-細胞激素融合物取向似乎係相互排他性之關鍵。舉例而言，雖然分子 P1AJ6488 似乎與融合至 VH 之 093 掩蔽物及融合至 VL 之細胞激素展示出不完全的相互排他性，但 P1AJ6492 似乎與相同的連接子長度但融合取向切換相互排他性。表 20 ： SPR- 結果
huIL18-R1-Fc_ 二聚體 IL-2v IL-2rbg-Fc-biot 配位體 _ 捕獲 _ 總結
分子 ID 號 Cap225nM (RU) RR (%) SumBdg Cap225nM (RU) RR (%) SumBdg Cap225nM (RU) RR (%) SumBdg hPD1- Fc IL-2rbg-Fc-bio IL-2v
P1AJ6484 61.9 38.3 B 62 79.4 B 61.9 0.8 N/MB 好 好 好
P1AJ6485 59.3 43.5 B 59.3 98.2 B 59.3 3.6 N/MB 好 好 好
P1AJ6487 65.5 42.1 B 65.6 108.7 B 65.5 6.9 N/MB 好 好 好
P1AJ6486 70.9 28.9 B 71 86.7 B 71 1.8 N/MB 好 好 好
P1AJ6488 75.2 5.9 LB 75.2 31.7 N/MB 75.2 3.8 N/MB 好 好 好
P1AJ6489 85.8 7.8 LB 85.8 22.6 N/MB 85.7 2.8 N/MB 好 好 好
P1AJ6490 45.6 6.6 N/MB 45.8 39.7 N/MB 45.6 5.9 N/MB 好 好 好
P1AJ6491 69.9 9.6 LB 69.5 43.5 N/MB 69.1 5.9 N/MB 好 好 好
P1AJ6492 65.4 2.3 N/MB 65.3 20.0 N/MB 65.1 1.9 N/MB 好 好 好
P1AJ6493 61.7 4.9 N/MB 61.6 37.9 N/MB 61.4 5.2 N/MB 好 好 好
P1AJ6494 62.8 5.6 N/MB 62.8 44.4 N/MB 62.7 5.5 N/MB 好 好 好
P1AJ6495 23 0.0 N/MB 23.1 0.0 N/MB 22.9 0.0 N/MB 低 低 低
P1AJ6496 19.7 4.1 N/MB 19.6 39.6 N/MB 19.5 4.8 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AJ6497 14.7 6.6 N/MB 14.6 53.4 N/MB 14.5 8.2 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AJ6498 17.1 10.7 N/MB 17 84.2 N/MB 16.9 13.2 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AJ6500 48.6 45.6 B 48 38.5 N/MB 47.8 26.0 B 好 好 好
實例 16 ： CD19 IFNα 構築體
為了測試 CISS 型相互排他性是否亦可轉移至抗原結合部分、掩蔽部分及細胞激素之其他組合，進行篩選以尋找功能性 CD19 IFNα CISS分子 (參見表 21)。CD19 Fab (基於抗 CD19 抗體布林莫單抗 (Blinatumumab)，「Blina」) 與野生型 IFNα 或 IFNα_L30A (減弱的) 組合。所有分子均使用抗 IFNα 掩蔽物 P7。IFNα 分子 (14x、18x) 及掩蔽物 (2x、4x) 使用兩種不同的連接子長度。分子具有如圖 2中所示之形式且不含有 Fc 域或靶向臂。質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之小規模純化方案表現且純化分子。表 21 ：使用布林莫單抗抗 CD19 測試的 CD19 IFNα 構築體
分子 ID 號 類型 IFNa IFNa 掩蔽物 IFNa 接附至 掩蔽物接附至 CD19- 結合劑 連接子長度掩蔽物 連接子長度細胞激素
P1AJ6695 (對照) 掩蔽物 Fab 融合物 - P7 - 輕鏈 Blina 2 -
P1AJ6697 (對照) - - 4 -
P1AJ6706 (對照) 細胞激素 Fab 融合物 IFNa_L30A - 重鏈 - - 14
P1AJ6707 (對照) - - 18
P1AJ6702 CISS IFNa P7 重鏈 輕 鏈 2 14
P1AJ6703 2 18
P1AJ6704 4 14
P1AJ6705 4 18
表 22 ：表 21 中所示之分子的 SEQ ID NO:
分子 ID 號 SEQ ID NO: SEQ ID NO:
P1AJ6695 (對照) 391 392
P1AJ6697 (對照) 393 394
P1AJ6706 (對照) 403 404
P1AJ6707 (對照) 405 406
P1AJ6702 395 396
P1AJ6703 397 398
P1AJ6704 399 400
P1AJ6705 401 402
使用表面電漿子共振 (SPR) 篩選 CISS Fab 分子，以鑑別具有令人滿意的掩蔽特性及相互排斥結合能力之殖株。基於 SPR 之測定進一步用於確定 CISS Fab 單元之結合動力學。它們相應的「前驅」分子 (不具有 IFNa 之掩蔽物-Fab 融合物及不具有掩蔽物之 IFNa-Fab 融合物) 用為對照。
各測定基本上如實例 4 中所描述進行。使三種分析物流動以評定 CD19 IFNα分子之功能：a) 使人類 CD19-Fc 蛋白流動，以評定完整 CISS Fab 分子之抗 CD19-Fab 與 CD19 或掩蔽物與細胞激素之相互排他性，由此結合之減少可能表明掩蔽物-細胞激素相互作用在空間上抑制抗 CD19 Fab 與 CD19 的相互作用。使用 CD19 作為分析物對於掩蔽物 (圖 2 A) 或 IFNa (圖 2 B) 與抗 CD19 Fab 之 N 端的個別融合物亦為所關注的。融合物 CD19 動力學可與單獨 Fab 之彼等動力學進行比較，以評定 CD19 結合之改變。b) 使 IFNAR2-his 作為分析物流動，以評定掩蔽物之功能或確認遊離 IFNa 組分之正確折疊。當涉及掩蔽物時，若 IFNAR2 不結合或結合大大減弱，則假定 IFNa 被掩蔽或以其他方式改變。由於 IFNa 之此種減弱的變異體存在低親和力，IFNAR-2 可能會或可能不會與 IFNa L30A 清楚地結合。c) 最後，使 IFNa 流動，以評定掩蔽物與 Fab 融合物之掩蔽部分之功能 (圖 2 B)，且亦可為完整的 CISS Fab 遞送正確折疊之指示。
在表 23中，總結了證明標靶結合之 SPR 測定之結果。該表顯示了隨後流動 225 nM 分析物之循環中分子之捕獲水準、反應率 (以 [%] 為單位) 以及觀測到的與標靶結合之總結。「B」指示「結合」，「LB」指示「低結合」且「N/MB」指示「無結合/最小結合」。
SPR 結果表明，前驅分子之行為很大程度上如所欲。掩蔽物-Fab 及 IFNa L30A-Fab 融合物存在 CD19 結合。當單獨與 Fab 融合時，P7 掩蔽物與 IFNa 結合。對於 IFNa L30A-Fab 融合物，無法清楚地觀測到 IFNAR-2 受體 ECD (胞外域) 之結合，可能係因為引入 L30A 突變時捕獲相對較低且親和力亦相當低。選擇的 CISS Fab CD19-IFNa 分子顯示出明顯的相互排他性，在掩蔽相互作用正在進行時不可能實現標靶結合。CISS Fab P1AJ6705 係基於此 SPR 篩選之潛在所關注的 CISS 分子之實例。表 23 ：使用布林莫單抗之 CD19 IFNα 構築體之 SPR 結果
huCD19-Fc_OA IFNAR-2 IFNa 配位體 _ 捕獲 _ 總結
分子 ID 號 Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg hPD1- Fc IL-2rbg- Fc-bio IL-2v
P1AJ6695 30.4 12.1 B 30.6 10.5 N/MB 30.4 42.7 B 好 好 好
P1AJ6697 27.3 5.9 B 27.3 1.1 N/MB 27.2 36.2 B 低 低 低
P1AJ6706 52 40.5 B 51.5 29.5 N/MB 51.2 37.8 N/MB 好 好 好
P1AJ6707 43.9 40.0 B 43.5 26.9 N/MB 43.4 39.6 N/MB 好 好 好
P1AJ6702 55.2 4.7 N/MB 54.9 15.5 N/MB 54.8 26.4 N/MB 好 好 好
P1AJ6703 45.3 11.8 N/MB 45.2 37.8 N/MB 45.2 59.7 N/MB 好 好 好
P1AJ6704 39.9 8.0 N/MB 39.8 41.0 N/MB 39.7 60.3 N/MB 好 好 好
P1AJ6705 52.5 7.2 N/MB 52 22.9 N/MB 51.2 40.0 N/MB 好 好 好
實例 17 ： PD-L1 IFNa 構築體
為了測試 CISS 功能性是否亦可轉移至 CISS 結合劑、掩蔽物及細胞激素之其他組合，進行篩選以尋找功能性 PD-L1 IFNα CISS 分子 (參見表 24)。PD-L1 結合劑 (阿特珠單抗 Fab) 與野生型 IFNα 或 IFNα_L30A (減弱的) 組合。所有分子均使用抗 IFNα 掩蔽物 P7 (VL-VH)。IFNα 分子 (14x、18x) 及掩蔽物 (2x、4x) 使用兩種不同的連接子長度。分子具有如圖 2中所示之形式且不含有 Fc 域或靶向臂。質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之小規模純化方案表現且純化表 24 中所示之分子。分子之 SEQ ID NO: 列於表 25 中。
使用表面電漿子共振 (SPR) 篩選 CISS Fab 分子，以鑑別具有令人滿意的掩蔽特性及相互排斥結合能力之殖株。基於 SPR 之測定進一步用於確定 CISS Fab 單元之結合動力學。它們相應的「前驅」分子 (不具有 IFNa 之掩蔽物-Fab 融合物及不具有掩蔽物之 IFNa-Fab 融合物) 用為對照。表 24 ：使用抗 PD-L1 測試的 PD-L1 IFNα 構築體
分子 ID 號 類型 IFNa 掩蔽物 掩蔽物取向 掩蔽物接附至 PDL1 結合物 連接子長度掩蔽物 細胞激素 連接子長度細胞激素 細胞激素接附至
P1AJ6804 對照 P7 VL-VH HC 阿特珠單抗 2 - - -
P1AJ6805 4
P1AJ6808 CISS 2 IFNa 14 LC
P1AJ6809 18
P1AJ6810 4 14
P1AJ6811 18
P1AJ6813 LC 2 14 HC
P1AJ6812 18
P1AJ7259 4 14
P1AJ6814 18
P1AJ6815 對照 - - - IFNa_L30A 14
P1AJ6816 18
P1AJ6817 14 LC
表 25 – 表 24 中所示之分子的 SEQ ID NO:
分子 ID 號 SEQ ID NO: ( 鏈 1) SEQ ID NO: ( 鏈 2)
P1AJ6804 407 408
P1AJ6805 409 410
P1AJ6808 411 412
P1AJ6809 413 414
P1AJ6810 415 416
P1AJ6811 417 418
P1AJ6813 419 420
P1AJ6812 421 422
P1AJ7259 431 432
P1AJ6814 423 424
P1AJ6815 425 426
P1AJ6816 427 428
P1AJ6817 429 430
各測定基本上如實例 4 中所描述進行。使三種分析物流動以評定 PD-L1 IFNα分子之功能：a) 使人類 PD-L1-Fc 蛋白流動，以評定完整 CISS Fab 分子之抗 PD-L1-Fab 與 PD-L1 或掩蔽物與細胞激素之相互排他性，由此結合之減少可能表明掩蔽物-細胞激素相互作用在空間上抑制抗 PD-L1 Fab 與 PD-L1 的相互作用。使用 PD-L1 作為分析物對於掩蔽物 (圖 2 A) 或 IFNa (圖 2 B) 與抗 PD-L1 Fab 之 N 端的個別融合物亦為所關注的。融合物 PD-L1 動力學可與單獨 Fab 之彼等動力學進行比較，以評定 PD-L1 結合之改變。b) 使 IFNAR2-his 作為分析物流動，以評定掩蔽物之功能或確認遊離 IFNa 組分之正確折疊。當涉及掩蔽物時，若 IFNAR2 不結合或結合大大減弱，則假定 IFNa 被掩蔽或以其他方式改變。由於 IFNa 之此種減弱的變異體存在低親和力，IFNAR-2 可能會或可能不會與 IFNa L30A 清楚地結合。c) 最後，使 IFNa 流動，以評定掩蔽物與 Fab 融合物之掩蔽部分之功能 (圖 2 B)，且亦可為完整的 CISS Fab 遞送正確折疊之指示。
在表 26中，總結了證明標靶結合之 SPR 測定之結果。該表顯示了隨後流動 225 nM 分析物之循環中分子之捕獲水準、反應率 (以 [%] 為單位) 以及觀測到的與標靶結合之總結。「B」指示「結合」，「LB」指示「低結合」且「N/MB」指示「無結合/最小結合」。
SPR 結果表明，前驅分子之行為很大程度上如所欲。掩蔽物-Fab 及 IFNa L30A-Fab 融合物存在 PD-L1 結合。當單獨與 Fab 融合時，P7 掩蔽物與 IFNa 結合。對於 IFNa L30A-Fab 融合物，無法清楚地觀測到 IFNAR-2 受體 ECD (胞外域) 之結合，可能係因為引入 L30A 突變時捕獲相對較低且親和力亦相當低。所有測試的 P7 掩蔽物融合至 VH N 端且 IFNa 融合至 VL N 端之 CISS Fab 並未顯示出完全的相互排他性 (如在掩蔽相互作用發生時 CISS Fab 結合 PD-L1 之能力所示)。另外，相反取向之 CISS Fab 確實顯示出明顯的相互排他性，其中掩蔽連接子為 2 個胺基酸 (P1AJ6812 及 P1AJ6813)，但當使用 4 個胺基酸連接子 (P1AJ7259、P1AJ6814) 時，PD-L1 結合被不完全阻斷。表 26 ：使用阿特珠單抗之 PD-L1 IFNα 構築體之 SPR 結果
huPD-L1-Fc IFNAR-2 IFNa 配位體 _ 捕獲 _ 總結
分子 ID 號 Cap 225 nM RR % SumBdg Cap 225 nM RR % SumBdg Cap 225 nM RR % SumBdg hPD-L1_Fc IFNAR-2 IFNa
P1AJ6804 58.4 24.9 B 50.2 0 N/MB 47 0.0 B 好 好 好
P1AJ6805 52.3 40.9 B 47 0 N/MB 46 0.0 B 好 好 好
P1AJ6808 47.7 0.5 B 43.7 0 N/MB 42.8 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6809 44.3 18.5 B 39.9 0 N/MB 38.8 24.2 N/MB 好 好 好
P1AJ6810 42.6 0.0 B 39.3 0 N/MB 38.6 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6811 57.5 20.5 B 54.5 0 N/MB 53.9 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6813 36 0.0 N/MB 33.8 0 N/MB 33.1 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6812 54.5 0.0 N/MB 52.9 0 N/MB 52.3 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ7259 31.3 0.0 LB 30.5 0 N/MB 30 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6814 34.7 0.0 LB 34.5 0 N/MB 34.4 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6815 40.5 60.5 B 40.1 0 N/MB 40 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6816 37.6 77.3 B 36.1 0 N/MB 35.7 23.2 N/MB 好 好 好
P1AJ6817 45.1 36.7 B 42.6 0 N/MB 41.5 0.0 N/MB 好 好 好
P1AJ6818 59.8 76.7 B 57.6 0 N/MB 56.5 0.0 N/MB 好 好 好
實例 18 ： PD-L1 IFNa 靶向的構築體
為了產生靶向的 PD-L1 IFNa CISS 分子，吾人使用了分子 P1AJ6812 之連接子長度及組成取向，此似乎在吾人的篩選測定中證明了相互排他性。吾人基本上將該 CISS Fab 融合至 Fc 域，且添加 VHH (KN035) 作為第二抗原結合部分 (「靶向臂」) (分子 P1AL7929)。圖 1 C顯示了此分子形式之示意圖。測試的分子展示於表 27 中。在所有測試的分子中，IFNa 經由 18x 肽連接子連接至第一抗原結合部分。掩蔽部分經由 2x 連接子連接至第一抗原結合部分。質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之中等規模純化方案，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 表現且純化分子 P1AL7929。根據實例 1 中所描述之小規模純化方案表現且純化所有其他分子。表 27 ：靶向的 PD-L1 IFNa CISS 構築體之測試分子
分子 ID 號 類型 第二抗原結合部分 掩蔽部分 掩蔽物取向 掩蔽物接附至 第一抗原結合部分 細胞激素 細胞激素接附至
P1AL7929 CISS Targ KN035 P7 VL-VH LC 阿特珠單抗 IFNa HC
P1AJ6812 CISS Fab -
P1AJ6816 對照 - - - - IFNa L30A
表 28 ：表 27 中所示之分子的 SEQ ID No
分子 ID 號 SEQ ID NO: ( 鏈 1) SEQ ID NO: ( 鏈 2) SEQ ID NO: ( 鏈 3)
P1AL7929 453 454 455
P1AJ6812 419 420 -
P1AJ6816 427 428 -
表 27 中所示之分子在 HEK-Blue 測定系統中進行測試。為此，將融合分子及對照作為滴定系列施加至 IFNα 報導細胞，即親代 HEK-Blue™ IFNα/β 報導細胞株，其 PD-L1 表現相對較低 (「HEK-Blue IFNα PD-L1 低」)，或高表現 PD-L1 陽性 IFNα 報導細胞 (殖株 45，CL022702，「HEK-Blue IFNa PD-L1 高」)，其已如實例 3 d) 及 3 e) 中所描述產生。具有阿特珠單抗 (P1AE0282) 之兩種細胞株均包括預封閉條件，該阿特珠單抗與 CISS Fab 之 Atezo Fab 以及 KN035 (「HEK-Blue IFNa PD-L1 低阻斷」、「HEK-Blue IFNa PD-L1 高阻斷」) 具有競爭性。
首先，以 1x104個報導細胞/孔接種於 25 µL 培養基 (DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/L 葡萄糖) (PAN，目錄號 P04-03609) + 10 % 熱不活化的 FBS (Anprotec，#AC-SM-0014Hi) + 2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，目錄號 P04-80100) + 100µg/ml 新黴素 (InvivoGen，目錄號 ant-nr-1) 中之 384 孔板中。此後，將 25 µl 阻斷抗體混合物 (阿特珠單抗單株抗體 P1AE0282，750 nM) 或僅細胞培養基分配至各孔中，然後將細胞在 37℃ 下孵育 1 h。隨後，一式三份地製備各種測試分子之 3x 滴定系列 (12 個步驟) (300 nM 起始濃度，測定孔中之最終濃度在 100 nM 與 0.0006 nM 之間)。將 25 µL 各濃度之測試分子轉移至 384 孔平底板中。將細胞及測試分子在 37℃ 下孵育 16-20 hr。製備 QUANTI-Blue 溶液 (Invivogen，#rep-qbs) 且以 20 µL/孔分配至新的 384 孔平底板 (#781098) 之孔中，接著添加 20 µL 經處理細胞之上清液。在 620 nm 處量測光學密度 (OD) 之前，藉由產生的 SEAP 進行受質週轉 2.5 小時 (Tecan Safire 2)。
具有及不具有 PD-L1 阻斷之親代 IFNα 報導細胞株之 HEK-Blue 細胞測定結果顯示於圖 28 A中。重要的是，雖然此等細胞尚未經修飾以表現 PD-L1，但 PD-L1 係以相對較低的水準表現 (參見實例 3)。當與 IFNa N‑ 端 Fc 融合物對照 (P1AF6940，圖 28 A 右下角) 相比時，可見CISS Fab 分子 P1AJ6812 (圖 28 A ，左上角) 有效抑制 IFNa。透過檢查減弱的 IFNa 分子 P1AJ6816 (圖 28 A ，左下角)，可清楚地看出，當 N 端融合至 Atezo Fab 之重鏈上時，IFNa 能夠在分子與 PD-L1 結合時到達其受體。此可透過 PD-L1 被阻斷時分子之功能的下降觀測到，其表明在非阻斷情況下高水準之 IFNAR 活化依賴於 PD-L1 結合。KN035 VHH 靶向的 CISS Fab (P1AL7929，圖 28A 右上角) 顯示出強烈的 PD-L1 依賴性活化。
高表現 PD-L1 細胞株 (參見實例3) 之 HEK-Blue IFNa 細胞測定結果顯示於圖 28 B中。可見 CISS Fab 分子 P1AJ6812 (圖 28 B 左上角) 在此種高表現情況下具有 PD-L1 依賴性活性，此可藉由比較阻斷及非阻斷情況來觀測到。靶向的 CISS Fab (P1AL7929，圖 28 B 右上角)在被阻斷之情況下與其非靶向對應物 (P1AJ6812，圖 28 B 左上角) 具有相當的活性，但可以看出，靶向臂大大增強了 PD-L1 可自由結合之活化作用。
實例 19 ： PD1 IL-21 構築體
為了測試 CISS 功能性是否亦可轉移至 CISS 結合劑、掩蔽物及細胞激素之其他組合，進行篩選以尋找功能性 PD1 IL-21 CISS 分子 (參見表 29)。抗 PD1 Fab 1040 與 IL-21 及抗 IL-21 掩蔽物「Aviza」(基於抗體艾維奇單抗 (avizakimab) 之Fab) 組合。IL-21 分子 (14x，18x) 及掩蔽物 (2x，4x) 均有兩種不同的連接子長度。IL-21 與 1040 抗 PD1 Fab 之重鏈融合，且掩蔽物與輕鏈融合。分子具有圖 2 C中所示之形式且不含有 Fc 域或靶向臂。質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之小規模純化方案來表現且純化分子，但質體 P1AJ7944 除外，該質體係使用來自實例 1 之中等規模表現及純化方案利用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 產生。表 29 ： PD1 IL-21 CISS 分子
分子 ID 類型 IL-21 掩蔽物 scFv 取向 IL-21 掩蔽物 IL-21 接附至 掩蔽物接附至 PD1- 結合劑 連接子長度掩蔽物 連接子長度細胞激素
P1AJ7192 IL-21 Fab 融合物 IL-21 - 重鏈 - 1040int - 14
P1AJ7193 18
P1AJ7194 CISS VL-VH Aviza 輕鏈 2 14
P1AJ7195 4 14
P1AJ7197 18
P1AJ7198 VH-VL 2 18
P1AJ7199 VL-VH 18
P1AJ7200 掩蔽物 Fab 融合物 - VH-VL - -
P1AJ7201 VL-VH 2 -
P1AJ7202 4 -
P1AJ7944 對照 (雙特異性 mAb) - - - - - - -
表 30 ：表 29 及 31 中所示之分子的 SEQ ID No
分子 ID 號 SEQ ID NO:
鏈 1 鏈 2 鏈 3 鏈 4
P1AJ7192 433 434 - -
P1AJ7193 435 436 - -
P1AJ7194 437 438 - -
P1AJ7195 439 440 - -
P1AJ7197 441 442 - -
P1AJ7198 443 444 - -
P1AJ7199 445 446 - -
P1AJ7200 447 448 - -
P1AJ7201 449 450 - -
P1AJ7202 451 452 - -
P1AJ7944 346 347 348 349
使用表面電漿子共振 (SPR) 篩選 CISS Fab 分子，以鑑別具有適合於潛在 CISS 功能之特性的分子。使用實例 2 中所描述之 Fab 捕獲裝置進行 SPR 測定。捕獲了 50nM 之分子，分析物濃度為 25 nM、75 nM、225 nM，且解離時間為 240 s。
使三種分析物流動以評定 PD1-IL-21 分子之功能：a) 使人類 PD1-Fc 蛋白流動，以評定完整 CISS Fab 分子之抗 PD1-Fab 與 PD1 或掩蔽物與細胞激素之相互排他性，由此結合之減少可能表明掩蔽物-細胞激素相互作用在空間上抑制抗 PD1 Fab 與 PD1 的相互作用。使用 PD1 作為分析物對於掩蔽物 (圖 2 A) 或 IL-21 (圖 2 B) 與抗 PD1 Fab 之 N 端的個別融合物亦為所關注的。融合物 PD1 動力學可與單獨 Fab 之彼等動力學進行比較，以評定 PD1 結合之改變。b) 使 IL-21R-Fc 作為分析物流動，以評定掩蔽物之功能或確認遊離 IL-21 組分之正確折疊。當涉及掩蔽物時，若 IL-21R-Fc 不結合或結合大大減弱，則假定 IL-21 被掩蔽或以其他方式改變。c) 最後，使 IL-21-Fc 流動，以評定掩蔽物與 Fab 融合物之掩蔽部分之功能 (圖 2 B)，且當在僅掩蔽物-Fab 融合物中融合時，亦可為掩蔽物遞送正確折疊及功能之指示。
結果顯示於表 31中。由於用於產生用於測定之分子的高通量方法，並非所有蛋白質均能以令人滿意的品質產生，從而導致在一些情況下 SPR 感測圖不確定。
SPR 結果表明，艾維奇單抗在兩個取向 (P1AJ7200 及 P1AJ7201) 均充當 scFv。另外，如先前所見，與 1040 之 N 端之融合不會阻止與 PD1 (例如，P1AJ7192、P1AJ7201) 之結合。所有 CISS Fab 分子似乎均能阻止 PD1 與 1040 結合，且因此認為會發生相互排他性。對於完整的 CISS 分子，可能存在極低量的 IL-21R-Fc 結合，此可能指示蛋白質品質問題，產生一些可用於 IL-21R 結合之遊離 IL-21。表 31 ： PD1 IL-21 CISS 分子之 SPR 結果
hPD1-Fc IL-21R-Fc IL-21-Fc 配位體 _ 捕獲 _ 總結
分子 ID 號 Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg Cap225 nM (RU) RR (%) SumBdg hPD1- Fc IL-2rbg- Fc-bio IL-2v
P1AJ7192 40.2 7.2 B 40 0 無感測圖 39.6 44.4 B 好 好 好
P1AJ7193 77.9 14.3 B 74.6 0 N/MB 72.3 66.4 B 好 好 好
P1AJ7194 88.1 3.4 N/MB 87.4 0.0 N/MB 85.3 5.8 LB 好 好 好
P1AJ7195 117.4 0.0 N/MB 115.9 0.0 無感測圖 114 0.0 LB 好 好 好
P1AJ7197 159.2 0.0 N/MB 156.8 0.0 N/MB 155.2 0.9 LB 好 好 好
P1AJ7198 117.2 3.8 N/MB 114.4 0.0 N/MB 113.2 5.2 LB 好 好 好
P1AJ7199 156 5.7 N/MB 153 2.7 N/MB 152.9 6.3 LB 好 好 好
P1AJ7200 101.3 7.1 B 102.5 97.1 B 101.5 3.3 N/MB 好 好 好
P1AJ7201 97.2 6.0 B 97.4 87.6 B 96.9 1.0 N/MB 好 好 好
P1AJ7202 93.9 8.7 B 93.9 88.0 B 93.3 3.1 N/MB 好 好 好
P1AJ7944 124.2 26.1 B 122.6 8.2 N/MB 121.8 7.6 N/MB 好 好 好
實例 20 ： PD1 IL7 分子
為了測試 CISS 功能性是否亦可轉移至 CISS 結合劑、掩蔽物及細胞激素之其他組合，進行篩選以尋找功能性 PD1 IL7 CISS 分子 (參見表 33)。抗 PD1 Fab 1040 與 IL7 及抗 IL7 掩蔽物 DRSPAI_L7B (基於抗體 DRSPAI_L7B 之Fab) 組合。兩個不同的連接子長度用於掩蔽物 (2x，4x)，且單一連接子長度用於 IL7 (18x)。IL7 與 1040 抗 PD1 Fab 之重鏈融合，且掩蔽物與輕鏈融合。分子具有圖 2 C中所示之形式且不含有 Fc 域或靶向臂。質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之小規模純化方案來表現且純化表 32 之分子，但質體 P1AJ7944 除外，該質體係使用來自實例 1 之中等規模表現及純化方案利用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 產生。表 32 ： PD1 IL7 CISS 分子
分子 ID 分子名稱 類型 IL7 掩蔽物 掩蔽物取向 PD1 結合物 連接子長度掩蔽物 細胞激素 連接子長度細胞激素
P1AJ7944 tgt_OKT8v11_VK_HC_X_ OKT8v11_VH_CK_X_1040_ VK_X_1040_VH_HC 僅 Mab - - 1040int - - -
P1AJ7159 18_IL7_1040_VH_x_1040_VK 對照 - - - IL7 18
P1AJ7168 18_IL7_1040_VH_x_DRSPAI- L7B_VK-VH_2x_1040_VK CISS DRSPAI- L7B KH 2
P1AJ7169 18_IL7_1040_VH_x_DRSPAI- L7B_VK-VH_4x_1040_VK KH 4
P1AJ7170 18_IL7_1040_VH_x_DRSPAI- L7B_VH-VK_2x_1040_VK HK 2
P1AJ7171 18_IL7_1040_VH_x_DRSPAI- L7B_VH-VK_4x_1040_VK HK 4
P1AJ7174 1040_VH_x_DRSPAI-L7B_VK-VH_2x_1040_VK 對照 KH 2 - -
P1AJ7175 1040_VH_x_DRSPAI-L7B_VK-VH_4x_1040_VK KH 4
P1AJ7176 1040_VH_x_DRSPAI-L7B_VH-VK_2x_1040_VK HK 2
P1AJ7177 1040_VH_x_DRSPAI-L7B_VH-VK_4x_1040_VK HK 4
表 33 ：表 32 中所示之分子的 SEQ ID No
分子 ID 號 SEQ ID NO:
鏈 1 鏈 2 鏈 3 鏈 4
P1AJ7944 346 347 348 349
P1AJ7159 458 459 - -
P1AJ7168 460 461 - -
P1AJ7169 462 463 - -
P1AJ7170 464 465 - -
P1AJ7171 466 467 - -
P1AJ7174 468 469 - -
P1AJ7175 470 471 - -
P1AJ7176 472 473 - -
P1AJ7177 474 475 - -
使用表面電漿子共振 (SPR) 篩選 CISS Fab 分子，以鑑別具有適合於潛在 CISS 功能之特性的分子。使用實例 2 中所描述之 Fab 捕獲裝置進行 SPR 測定。捕獲了 50 nM 之分子，分析物濃度為 25 nM、75 nM、225 nM，且解離時間為 240 s。
使三種分析物流動以評定 PD1-IL-7 分子之功能：a) 使人類 PD1-Fc 蛋白流動，以評定完整 CISS Fab 分子之抗 PD1-Fab 與 PD1 或掩蔽物與細胞激素之相互排他性，由此結合之減少可能表明掩蔽物-細胞激素相互作用在空間上抑制抗 PD1 Fab 與 PD1 的相互作用。使用 PD1 作為分析物對於掩蔽物 (圖 2 A) 或 IL7 (圖 2 B) 與抗 PD1 Fab 之 N 端的個別融合物亦為所關注的。融合物 PD1 動力學可與單獨 Fab 之彼等動力學進行比較，以評定 PD1 結合之改變。b) 使 IL7Ra-IL-2Rg-Fc 作為分析物流動，以評定掩蔽物之功能或確認遊離 IL7 組分之正確折疊。當涉及掩蔽物時，若 IL7Ra-IL-2Rg-Fc 不結合或結合大大減弱，則假定 IL7 被掩蔽或以其他方式改變。c) 最後，使 IL7-融合物流動，以評定掩蔽物與 Fab 融合物之掩蔽部分之功能 (圖 2 B)，且當在僅掩蔽物-Fab 融合物中融合時，亦可為掩蔽物遞送正確折疊及功能之指示。
結果顯示於表 34中。由於用於產生用於測定之分子的高通量方法，並非所有蛋白質均能以令人滿意的品質產生，從而導致在一些情況下 SPR 感測圖不確定。表 34 ： PD1 IL7 CISS 分子之 SPR 結果
hPD1-Fc IL7- 融合物 IL7Ra-IL-2Rg-Fc 配位體 _ 捕獲 _ 總結
分子 ID Cap225nM (RU) RR (%) 總結 Cap225nM (RU) RR (%) 總結 Cap225nM (RU) RR (%) 總結 hPD1- Fc IL7- 融合物 IL7Ra-IL2Rg-Fc
P1AJ7944 195 26.0 B 189.1 3.2 N/MB 188.2 3.6 N/MB 好 好 好
P1AJ7159 61.3 16.1 B 61.1 2.0 N/MB 59.6 48.3 B 好 好 好
P1AJ7168 45 9.2 N/MB 45.4 0.0 N/MB 44.6 8.4 LB 好 好 好
P1AJ7169 32.2 8.4 N/MB 32.5 7.7 LB 32.2 7.1 N/MB 好 好 好
P1AJ7170 46.2 10.9 N/MB 46.1 6.8 N/MB 46.3 11.5 LB 好 好 好
P1AJ7171 44.7 17.6 N/MB 44.9 10.3 N/MB 44.9 15.4 LB 好 好 好
P1AJ7174 47.2 16.4 B 47.3 89.2 B 47.5 6.1 N/MB 好 好 好
P1AJ7175 17.7 26.3 LB 17.7 38.2 B 17.7 15.1 N/MB VL/N VL/N VL/N
P1AJ7176 33.5 15.7 LB 33.5 52.7 B 33.8 4.4 N/MB 好 好 好
P1AJ7177 29.6 23.1 LB 29.7 93.1 B 30.1 11.4 N/MB 低 低 好
SPR 結果顯示 DRSPAI-L7B 在兩個取向上均充當 scFv。另外，如先前所見，與 1040 之 N 端之融合不會阻止與 PD1 之結合。所有 CISS Fab 分子似乎均能阻止 PD1 與 1040 結合，且因此認為會發生相互排他性。至少一些完整的 CISS 分子似乎存在少量的 IL7Ra-IL-2Rg-Fc 結合，儘管 IL7-Fab 與 IL7Ra-IL-2Rg-Fc 結合之動力學相當不同。此可能指示 DRSPAI-L7B 並未阻斷 IL7 受體複合物與 IL7 結合相互作用之所有元件，且保留了一些最小的修飾結合。
實例 21 ： PD1-IL7 靶向的 CISS
為了產生靶向的 PD1 IL7 CISS 分子，吾人使用了分子 P1AJ7168 之連接子長度及組成取向，此似乎在吾人的篩選測定中證明了相互排他性。對於各靶向的分子，吾人基本上將該 CISS Fab 至變異體融合至 Fc 域，且添加 VHH 作為靶向臂 (G05)。自 DRSPAI-L7B 親代掩蔽物中為此等分子產生了較低親和力掩蔽物。掩蔽物之變異體 3 及 4 (DRSPAI-L7B V3 及 V4) 交替用於靶向的 CISS 分子。兩種掩蔽物均具有比親代低得多的親和力，DRSPAI-L7B V3 具有比 DRSPAI-L7B V4 更高的親和力。另外，在一些分子中亦使用了 IL7 之減弱來調節 CISS 分子之效力。測試的分子展示於表 35 中。質體係藉由如實例 1 中所描述之基因合成及 Golden gate assembly 產生。根據實例 1 中所描述之中等規模純化方案，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 表現且純化分子。表 35 ：為此實驗產生之 PD1-IL7 靶向的 CISS
分子 ID 號 類型 第二抗原結合部分 DRSPAI-L7B IL7 掩蔽物 掩蔽物取向 掩蔽物接附 第一抗原結合部分 連接子長度掩蔽物 細胞激素 連接子長度細胞激素 細胞激素接附至
P1AL7931 CISS Targ G05 V3 VL-VH LC 1040int 2 IL7 18 HC
P1AL7932 V4
P1AL7933 V3 IL7_k81E
P1AL7934 V4
P1AJ7159 對照 - - - - - IL7 -
P1AL7935 IL7_k81E
PD1-IL7wt 用為 pStat5 測定之對照。表 36 ：表 35 中所示之分子的 SEQ ID No
分子 ID 號 SEQ ID NO: ( 鏈 1) SEQ ID NO: ( 鏈 2) SEQ ID NO: ( 鏈 3)
P1AL7931 485 486 487
P1AL7932 488 489 490
P1AL7933 491 492 493
P1AL7934 494 495 496
P1AJ7159 458 459 -
P1AL7935 497 498 -
表 35 中所示之分子在 p-Stat5 測定中測試了 CISS 功能性 (測定原理參見圖 33)。
IL-7R 訊號傳導測定
進行了以下測定以確定 PD-1-IL-7 CISS 分子或免疫結合物 (例如，包括至少一個與 PD-1 結合之結合域，該 PD-1 與被掩蔽或含有額外突變之 IL-7 多肽結合) 之效力及順式/反式傳訊。
出於此目的，自健康的供體 PBMC 中分選具有 CD4 珠之 CD4 T 細胞 (Miltenyi，#130-045-101)，且在存在 1 μg/ml 板結合之抗 CD3 (過夜預包覆，殖株 OKT3，#317315，BioLegend) 及 1 μg/ml 之可溶性抗 CD28 (殖株 CD28.2，#302923，BioLegend) 抗體的情況下活化 3 天 以誘導 PD-1 表現。三天後，收集細胞並洗滌幾次以去除內源性細胞激素，一半的細胞用細胞微量紫 (CTV) 標記 (5 µM、在室溫 (RT) 5 分鐘；C34557、Thermo Scientific)，及另一半未標記。
然後，將未標記的細胞與飽和濃度之競爭性抗 PD-1 抗體 (內部分子，10 µg/ml) 在 RT 下孵育 30 分鐘，接著進行幾個洗滌步驟以移除過量的未結合之抗 PD-1 抗體。此後，將經 PD-1 預阻斷之細胞 (25 μl，6*106個細胞/ml) 與 PD-1+經 CTV 標記之細胞 (25 μl，6x106個細胞/ml) 在 V-型底板中 1:1 共培養，之後在 37℃ 下用濃度增加之處理免疫結合物 (50 µl，1:10 稀釋步驟) 處理 12 分鐘。為了保持磷酸化狀態，在與各種構築體一起孵育 12 分鐘後，添加等量的 Phosphoflow Fix Buffer I (100 µl，557870，BD Bioscience)。然後將細胞在 37℃ 下孵育 30 分鐘，之後用 Phosphoflow PermBuffer III (558050，BD Bioscience) 在 -80℃ 下滲透過夜。第二天，透過使用抗 STAT-5P 抗體(47/Stat5(pY694) 殖株, 562076, BD Bioscience) 在 4℃ 下將磷酸化的 STAT-5 染色 30 分鐘。
細胞係在螢光活化細胞分選 (FACS) BD-Symphony A3/A5 (BD Bioscience) 儀器上獲取。STAT-5P 的頻率使用 FlowJo (V10) 測定，並使用 GraphPad Prism (v8) 繪製。
PD-1+T 細胞上的劑量反應曲線提供有關所評定之分子透過 IL-7R 進行傳訊的效力之資訊。另外，為防止 PD-1 介導之遞送，因此用競爭性抗 PD-1 抗體預處理之 T 細胞的劑量反應曲線顯示了分子獨立於 PD-1 表現提供 IL-7R 傳訊之效力。表 G ： 15 分鐘後 IL-7R 傳訊測定之結果
EC50 PD1+ EC50 PD1 阻斷 順式效應 AUC PD1+ AUC PD1 阻斷 δ AUC
PD1-IL7wt 31.0 69.5 2.2 199.3 148.4 50.9
P1AL7934 59197.0 0.0 0.0 6.0 4.3 1.6
P1AL7935 1815.0 6336.0 3.5 67.2 43.7 23.5
P1AL7931 4274.0 12445.0 2.9 53.5 34.7 18.8
P1AL7932 2256.0 67191.0 29.8 68.1 23.0 45.1
P1AL7933 21025581.0 3388586390.0 161.2 3.7 7.7 -4.0
P1AJ7159 67.0 53.7 0.8 171.4 146.9 24.5
FAP-IL7wt 46.8 47.8 1.0 158.3 151.1 7.2
表 H ： 1 小時後 IL-7R 傳訊測定之結果
EC50 PD1+ EC50 PD1bl. 順式效應 AUC PD1+ AUC PD1bl. δ AUC
PD1-IL7wt 5.4 116.0 21.6 252.8 191.6 61.2
P1AL7934-006 1206.0 38667.0 32.1 34.8 9.8 25.0
P1AL7935-005 184.6 424.4 2.3 122.9 84.6 38.3
P1AL7931-006 416.1 3496.0 8.4 101.9 56.2 45.7
P1AL7932-006 248.0 5711.0 23.0 112.0 43.0 69.0
P1AL7933-006 4713.0 99160.0 21.0 16.1 7.2 8.9
P1AJ7159-008 13.3 11.6 0.9 206.9 178.4 28.5
FAP-IL7wt 8.8 6.6 0.7 187.3 191.9 -4.6
使用野生型 IL7 分子之兩種完整的 CISS 分子均展現出良好的標靶依賴性 IL7R 傳訊。當與較高親和力 (P1AL7931) 變異體相比時，較低親和力 IL7 掩蔽物與較大的 PD1 特異性窗口 (P1AL7932) 相關。該兩種分子比與單獨的 IL7wt 融合的 Fab (P1AJ7159) 以及在此種情況下未靶向的 FAP-IL7wt 分子更具選擇性。類似地，當在完整的 CISS 分子中使用 IL7 之減弱的變異體 (K81E，對 IL7R 複合物之親和力降低)時，觀測到 PD1 增強了 IL7R 傳訊 (P1AL7933、P1AL7934)。當使用較低親和力掩蔽物時，CISS 分子更有效且更具選擇性 (P1AL7934 與 P1AL7933 相比)。此等 CISS 分子之選擇性優於單獨的 PD1 靶向的 IL7_K81E (P1AL7935)，且 STAT5-P 陽性細胞之頻率較低。
實例 22 ：具有野生型 IL-2 之 CISS 分子
野生型 IL-2 含有三個受體相互作用表面，其以高親和力 (KD ~10-8) 結合至 CD25 (IL-2Ra)，以較低親和力 (KD ~10-6-7) 結合至 CD122 (IL-2Rb) 且結合至 CD132 (IL-2Rg) (當 IL-2 已與 CD25 及 CD122 或單獨的 CD122 形成複合物時)。使用直接掩蓋 IL-2Rb 相互作用表面且以變構方式抑制與 CD25 之相互作用的掩蔽物 221 (參見實例 25)，吾人產生了含有野生型 IL-2 之靶向的 PD1 CISS 分子。表 37 顯示了 PD1-IL-2 CISS 變異體之實例分子表 37 ： IL-2 野生型靶向的 PD1 CISS 變異體
分子 ID 號 抗 PD1 靶向臂 掩蔽部分 連接子長度掩蔽物 抗原結合部分 連接子長度細胞激素 細胞激素
P1AJ7907 G05 221.AM2_VH-VL 2x 1040int 18 IL-2
P1AJ7910 221_V2_VH-VL
P1AJ7913 221_V3_VH-VL
P1AD6412 - - - - - IL-2v
表 37之 CISS Fab 分子之質體係使用外部基因合成及載體選殖 (Twist Bioscience，USA) 或如實例 1 中所描述之基因片段合成 (Twist Bioscience，USA) 及 Golden Gate Assembly (PaqCI R0745L 及 NEBridge® Ligase Master Mix M1100L (New England BioLabs)) 產生。根據實例 1 中所概述之中等規模表現方法，使用 CaptureSelect™ CH1-XL 親和力基質 (Thermo Fisher Scientific，USA) 進行表現及純化。表 38 ：表 37 中所示之分子的 SEQ ID No
分子 ID 號 SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
P1AJ7907 476 477 478
P1AJ7910 479 480 481
P1AJ7913 482 483 484
P1AD6412 101 - -
HEK-Blue IL-2 報導基因測定用於評定 PD1-IL-2 CISS 分子之效力及它們的 PD1 依賴性。為了進行測定，吾人的測試分子及對照被製備為滴定系列且應用於報導細胞。使用 PD1 陰性 (親代) IL-2 報導細胞株 (「HEK-Blue IL-2」) 及 PD1 陽性 (CL1AA1486：「HEK-Blue IL-2 PD1」) IL-2 報導細胞株。
首先，一式三份地製備測試分子之 3 倍滴定系列 (12 個步驟)，自 100 nM 開始 (測定孔中之最終濃度介於 50 nM 與 0.0003 nM 之間)。將 25 µL 各濃度之每種融合蛋白轉移至 384 孔平底板。作為陽性對照，使用相同濃度範圍之重組 IL-2v (P1AD6412)。隨後，以 1x104個報導細胞/孔接種於 25 µL 培養基 (DMEM 高葡萄糖 (4.5 g/L 葡萄糖) (PAN，目錄號 P04-03609) + 10 % 熱不活化的 FBS (Anprotec，#AC-SM-0014Hi) + 2 mM L-麩醯胺酸 (PAN，目錄號 P04-80100) + 100µg/ml 新黴素 (InvivoGen，目錄號 ant-nr-1) 中之 384 孔板中。在 37℃ 下進行測試分子及細胞之孵育過夜。製備 QUANTI-Blue 溶液 (Invivogen，#rep-qbs) 且以 20 µL/孔分配至新的 384 孔平底板 (#781098) 之孔中，接著添加 20 µL 經處理細胞之上清液。在 620 nm 處量測光學密度 (OD) 之前，藉由所表現之 SEAP 進行受質週轉 2 至 6 小時 (Tecan Safire 2)。
結果顯示於圖 17 A 至圖 17 D 。使用此測定設置，較低親和力掩蔽物 221_V2 (圖 17，中間圖) 及 221_V3 (圖 17，右圖) 似乎在掩蔽野生型 IL-2 方面無效。使用此等掩蔽物 (P1AJ7910 及 P1AJ7913) 之靶向的 CISS 分子在「HEK-Blue IL-2」及「HEK-Blue IL-2 PD1」細胞株中具有相似的效力。相較之下，在圖 17 ，左圖中，可見較高親和力「221」已成功掩蔽 IL-2，且亦在靶向的 CISS 分子之背景下遞送 PD1 依賴性 IL-2 活性 (分子 P1AJ7907)。該資料集證明了使用正確的親和力掩蔽物以避免標靶獨立性活化的必要性，且亦證明了 221 掩蔽物在抑制野生型 IL-2 方面之效用。
實例 23 ：用於選擇及表徵 huIL‑2 / huIL-2v 掩蔽部分之結合劑的構築體
表 39 列出了用於產生且表徵抗 IL-2/IL-2v 抗原結合域之構築體，該等抗原結合域被製成用為本文所描述之 CISS 分子中的 huIL‑2/huIL‑2v 掩蔽部分。表 39 ：用於產生且表徵 IL-2/IL-2v 抗原結合部分之構築體列表
分子名稱 Tapir ID SEQ ID NO: SEQ ID NO:
huIL-2v His-標籤 P1AD6412 101 -
huIL-2 (C125A，具有 N 端 Met) P1AG0692 499 -
biot-IL-2v P1AF7910 500 -
biot-IL-2 P1AG0693 501 -
cd79b 二聚體 (SPR 對照) P1AE1979 502 -
IL-2Rbg 異二聚體 –Fc bio P1AE2657 503 504
IL-2Ra (CD25) P1AE7552 505 -
P029.221 T7 標籤 P1AG2542 510 511
P017.093 T7 標籤 P1AG2505 506 507
P017.333 T7 標籤 P1AG2535 508 509
P029.221.AM1.1 T7 標籤 P1AH4136 518 519
P029.221.AM2 T7 標籤 P1AH3716 512 513
P029.221.AM3 T7 標籤 P1AH3717 514 515
P029.221.AM4 T7 標籤 P1AH3718 516 517
P029.221.AM5.1 T7 標籤 P1AH4137 520 521
P029.221.AM6.1 T7 標籤 P1AH4138 522 523
P029.221.AM2_無標籤 (x 射線) P1AI2583 527 528
P029.221.AM2 PG LALA AAA P1AH9927 524 525
實例 24 ：用於結合測定之重組人類 IL-2 / IL-2v 蛋白之產生 a) huIL-2 /huIL-2v 表現及純化
人類 IL-2v 細胞激素 (內部批號 P1AD6412-013) 已在 CHO 中瞬時表現，且經由 WuXi Biologics 之 C 端 his-標籤純化。藉由將表現的分子應用於以下層析步驟來進行純化：1.用於 C 端 his-標籤之親和力層析的 Ni Excel 管柱 (用於柱平衡及洗滌的緩衝液：20 mM PB、150 mM NaCl、20 mM 咪唑，pH 7.4；溶離緩衝液：20 mM PB、150 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 7.4)。2.Superdex 200 粒徑排阻層析 (平衡緩衝液、運行緩衝液及調配緩衝液：20 mM 組胺酸-HCl、140 mM NaCl，pH 6.0)。
藉由 SEC-HPLC (單體峰 100%)、非還原性 CE-SDS (主峰 98.7%)、還原性 CE-SDS (主峰 98.5%) 測定蛋白質純度，且藉由 LC-MS 確認蛋白質身份。內毒素濃度測定為 ＜0.05 EU/mg，並且最終濃度為 3.4 mg/mL。重組人類 IL-2 係購自 Peprotech，目錄號 200-02。b) 工具蛋白之生物素化
使用 4 及 3 莫耳過量之 EZ-Link™ Sulfo-NHS-SS-生物素 (ThermoFischer Scientific，#A39258) 對重組 huIL-2 /huIL-2v 蛋白進行化學生物素化。於室溫進行反應 1 小時，並藉由兩步驟之透析至 PBS 1X (pH 7.4) 來去除過量之生物素。以拉下測定 (pull-down assay) 評定生物素化，顯示在此兩種情況下，大於 90% 之蛋白質經生物素化。藉由 SEC 及 SPR 評定生物素化蛋白質之品質。
實例 25 ： huIL-2 /huIL-2v 結合劑之選擇及表徵 a) 特異性結合至 huIL-2 / huIL-2v 之 Fab 之產生
藉由噬菌體展示產生特異性結合至 huIL-2 / huIL-2v 之 Fab。為此，使用重組生物素化的 huIL-2 / huIL-2v (生物素化係如上文實例 24 b 中所描述進行)。
利用多種合成人類 Fab 片段之羅氏內部噬菌體展示文庫。在所有文庫中，Fab 片段之 CH1 域經由連接子與截短的基因-III 蛋白融合，以促進噬菌體展示。
噬菌體文庫淘選分四輪進行，其中第一輪係用預固定在 DynabeadsTMM-280 鏈黴親和素磁珠 (Thermo Fisher 目錄號 11206D) 上之 1000nM 的生物素化 huIL-2 / huIL-2v 來進行，且第 2 至 4 輪係用 500 nM 生物素化 huIL-2 以及 500 nM、250 nM、250 nM 生物素化 huIL-2v 來進行，接著捕獲珠上之噬菌體上 Fab/標靶複合物。在第 2 輪及第 4 輪中，使用中性親和素偶合磁珠 (Sera-Mag SpeedBeads 中性親和素包覆之磁性顆粒，Cytiva：78152104010350)。在第 1 輪中，攜帶標靶特異性 Fab 與珠之組合的所捕獲之噬菌體殖株係直接感染至對數期 TG1 大腸桿菌細胞中，且根據標準方案使用 M13KO7 輔助噬菌體來救援。在第 2 至 4 輪中，在用於進行感染之前，使用 100 mM DTT 自磁珠中溶離 Fab 攜帶型噬菌體。
為了篩選噬菌體展示輸出，自感染的 TG1 大腸桿菌細胞製備了相應選擇輪次之多株質體小量製備物。使用 BamHI 限制內切酶來消化質體，該限制內切酶切割噬菌體 Fd 基因 3 域上游及下游的噬菌粒 pDuta4。藉由連接使質體重新環化，在 DutaFab CH1 域的 C 端處產生 T7 標籤之同框融合物。將編碼有 T7 標籤的 DutaFab 的連接之多株質體轉化至 TG1 大腸桿菌細胞中，並將單一菌落挑到微量滴定盤中。可溶性 Fab 在微量滴定盤中表現，並且藉由離心來澄清上清液。
篩選 Fab 培養物上清液且藉由 ELISA 如下鑑別特異性結合劑：20 µL 生物素化抗原 huIL-2 / huIL-2v (0.1 µg/mL 最終濃度於測定中) 及檢測抗體抗人類 Ig κ 鏈特異性 POD (Millipore AP502P，1:2000 最終於測定中) 及抗 T7-標籤 POD (Bethyl A190-116P，1:10000 最終於測定中) 之混合物與 5 µL 含有 Fab 之細菌上清液混合且添加至鏈黴親和素包覆之微量滴定板 (MicroCoat 384 SA，11974998001)。在室溫下孵育 60 min 後，用 PBST (PBS，0.1% Tween20) 將板洗滌 6 次。藉由向孔中添加 30 µL TMB (Sera Care，#5120-0087) 受質來檢測 Fab 分別與 huIL-2 及 huIL-2v 之結合。在 RT 下孵育 5 min 後，藉由添加 30 µl 1M HCl 來終止反應。然後用酶標儀 (Biotek Powerwave) 在 OD 450 nm 處量測吸光度。鑑別表現 huIL-2 / huIL-2v 特異性 Fab 之殖株，且對對應的噬菌粒 (phagemid) 進行定序。
發現 365 個獨特序列，並隨後將其分組為家族。根據 ELISA 結果、序列頻率及序列相似性選擇 121 個殖株且在大腸桿菌中表現。經由在 CaptureSelectTMIgG-CH1 樹脂 (Thermo Fisher；目錄號：19432001L) 上的一步親和力層析純化自大腸桿菌上清液中純化 Fab。經由粒徑排阻層析分析經純化之 Fab 之品質。b) 特異性結合至 huIL-2 / huIL-2v 之 Fab 的 SPR 表徵
使用 Biacore 8K 或 8K+ 儀器 (Cytiva) 藉由 SPR 分析來評定 Fab 之結合親和力。分析了結合至人類 huIL-2v、人類 huIL-2 及 CD79B 二聚體 (對照) 之結合動力學 (結果顯示於表 40中)。表 40 ：所選 huIL-2 / huIL-2v 接合殖株之結合親和力
huIL-2 (P1AG0692) huIL-2v (P1AD6412) CD79B (P1AE1979)
殖株 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) KD (M)
093 5.83E+05 4.55E-04 7.80E-10 1.14E+06 1.92E-04 1.68E-10 無結合
333 8.15E+05 1.40E-02 1.72E-08 1.29E+06 1.12E-03 8.64E-10 無結合
221 2.21E+05 2.77E-02 1.25E-07 5.40E+05 8.29E-03 1.54E-08 無結合
簡言之，根據製造商的說明，將抗人類 Fab 抗體 (Cytiva；目錄號 28958325) 固定至 S 系列 CM5 感測器晶片 (Cytiva，目錄號 29149603)。捕獲 100 nM Fab (10 µl/min，60 sec)，且將 0 nM、10 nM、50 nM 及 150 nM 之抗原以 30 µl/min 流動 120 sec，接著為 30 µl/min 之流速下的 240 秒解離窗口。藉由持續 60s 以 30 µl/min 之流速注入 10 mM 甘胺酸 pH 2 來再生表面。感測圖顯示於圖 21中。
如下研究 huIL-2 / huIL-2v 特異性 Fab 與 huIL-2Rbg 異二聚體之競爭性結合。所用實驗設定之示意性描繪顯示於圖 18中。使用人類抗體捕獲套組 (Cytiva，目錄號 BR100839) 以使用標準胺偶合化學將 10µg/ml 的 IgG 捕獲抗體 (「抗 Fc」) (以 10 µl/min 之流速施加 500 秒) 固定至 S 系列 CM5 感測器晶片 (Cytiva，目錄號 29149603)。為了評定競爭性結合，藉由以 10 ul/min 流動 120 秒將 100 nM IL-2Rbg-Fc 異二聚體捕獲至晶片之表面。然後以 10 µl/min 之速率注入 100 nM huIL-2 / huIL-2v 持續 120 秒。隨後以 30 µl/min 之速率使 100 nM Fab 流動 120 秒，接著為 10 秒解離窗口。最後，藉由持續 60 秒以 30 µl/min 之流速注入 3 M MgCl2來再生表面。藉由對感測圖之個別評估來評定競爭性結合 (參見圖 22 A 至圖 22 B)。IL-2Rbg 非競爭性 Fab 預計會結合 IL-2Rbg 結合之 huIL-2 / huIL-2v，導致 SPR 訊號增加。IL-2Rbg 競爭性 Fab 預計不會結合 IL-2Rbg 結合之 huIL-2 / huIL-2v，導致 SPR 訊號增加。
如下進一步證實 huIL-2 / huIL-2v 特異性 Fab 與 IL-2Rbg 異二聚體之競爭性結合 (實驗設定之示意性描繪顯示於圖 19中)。使用人類抗體捕獲套組 (Cytiva，目錄號 BR100839) 以使用標準胺偶合化學將 10µg/ml 之 IgG 捕獲抗體 (以 10 µl/min 之流速施加 500 秒) 固定至 S 系列 CM5 感測器晶片(Cytiva，目錄號 29149603)。為了評定競爭性結合，藉由以 10 ul/min 流動 60 秒將 100 nM IL-2Rbg 異二聚體 (P1AE2657) 捕獲至晶片之表面。將 50 nM huIL-2 / huIL-2v 與 0 nM (圖 19 A)、100 nM (圖 19 B) 及 500 nM (圖 19 C) Fab 預混合，且隨後以 30 µl/min 流動 120 秒，接著為 240 秒解離窗口。最後，藉由持續 60 秒以 30 µl/min 之流速注射 3 M MgCl2來再生表面。藉由對感測圖之個別評估來評定競爭性結合 (參見圖 22)。與對照 (huIL-2 / huIL-2v + 0 nM Fab) 相比，IL-2Rbg 競爭性結合劑預計具有降低的 SPR 訊號。此種降低之程度取決於 Fab 結合親和力及所用莫耳過量之 Fab。如圖 22 所示，所有三種測試的結合劑均顯示與 IL2Rbg 競爭性結合 huIL-2/huIL-2v。
如下研究 huIL-2 / huIL-2v 特異性 Fab 與 IL-2Rα (CD25) 之競爭性結合 (實驗設定之示意性描繪顯示於圖 20中)。使用 S 系列感測器晶片 NTA (Cytiva，BR10053) 固定 100 nM 之 IL-2Rα-His (P1AE7552，以 10 µl/min 之流速施加 120 秒)。為了評定競爭性結合，以 30 ul/min 注入 100 nM huIL-2 持續 120 秒。隨後將運行緩衝液 (圖 20 A) 或 150 nM Fab (圖 20 B) 以30 µl/min 流動 120 秒，接著為 120 秒解離窗口。藉由以 30 µl/min 之流速注入 350 mM EDTA 持續 60s 來再生表面。感測圖顯示於圖 23中。藉由比較「Fab」感測圖 (圖 23 A ，虛線) 與「緩衝液」感測圖 (陰性對照；圖 23 A ，實線) 來評定競爭性結合。與緩衝液對照相比，IL-2Ra 非競爭性結合劑預計具有增加的 SPR 訊號。IL-2Ra 競爭性結合劑預計具有與緩衝液對照相當的 SPR 跡線。競爭實驗顯示 093 及 333 不具有 IL-2Rα 競爭性 (SPR 訊號在 t0 時增加，亦即注入 100 nM Fab 後，此指示 Fab 能夠結合至 huIL-2，該 huIL-2 結合至 IL-2Rα)，而 221 具有 IL-2Rα 競爭性 (注入 100 nM Fab 後，無SPR 訊號增加)。
如下進一步研究與 IL-2Ra (CD25) 之競爭性結合。使用標準胺偶合化學將 10µg/ml 之 THETMHis 標籤抗體、mAb、小鼠 (Genescript，目錄 A00186S，以 10 µl/min 之流速施加 500 秒) 固定至 S 系列 CM5 感測器晶片 (Cytiva，目錄號 29149603)。為了評定競爭性結合，藉由以 10 ul/min 流動 60 秒將 100 nM IL-2Ra-His (P1AE7552) 捕獲至晶片之表面。將50 nM huIL-2 與 0 nM、100 nM 及 500 nM Fab (圖 24 B) 預混合，且隨後以 30 µl/min 流動 120 秒，接著為 240 秒解離窗口。藉由在 60 秒內以 30 µl/min 的流速注入 10 mM 甘胺酸 pH 2 再生表面。藉由對感測圖之單獨評估來評定競爭性結合。與對照 (huIL-2 + 0 nM Fab) 相比，IL-2Ra 競爭性結合劑預計具有降低的 SPR 訊號。此種降低之程度取決於 Fab 結合親和力及所用過量之 Fab 兩者。IL-2Ra 非競爭性結合劑預計具有比對照更高的 SPR 訊號 (RU)。此種效應係由於與單獨的 huIL-2 之質量相比，複合物 huIL-2-Fab 之質量更高。此實驗證實 093 及 333 不具有 IL-2Rα 競爭性，而 221 具有 IL-2Rα 競爭性。
總之，鑑別出約 20 種經由 SPR 測定顯示 nM/pM 結合親和力之 huIL-2 / huIL-2v 結合劑。大多數結合劑對 huIL-2 及 huIL-2v 兩者具有相當的結合親和力，並且發現具有 IL-2Rbg 競爭性。僅一種結合劑 P029.221 亦被發現具有 IL-2Ra 競爭性。選擇結合劑 P029.221 (「221」)、P017.093 (「093」) 及 P017.333 (「333」) 作為 huIL-2v CISS 構築體之構建嵌段。鑑別出具有較低結合親和力 (高 nM 或 µM) 之額外結合劑，但未進一步表徵。
實例 26 ：殖株 221 之親和力成熟
結合劑 221 因其阻斷 IL-2Rbg 相互作用及 IL-2Ra (CD25) 相互作用之能力而受到特別關注，如 SPR 所示 (參見實例 25，圖 22及圖 23)。發現 huIL-2v 之結合親和力為 15.4 nM，且 huIL-2 之結合親和力為 125 nM。吾人推測，考慮到 IL‑2 / IL-2Rαβγ 複合物之高結合親和力，為了具有功能性 huIL-2 掩蔽物，需要提高結合親和力。為此，吾人如下文所描述使結合劑親和力成熟。a) 位點飽和誘變 (SSM)
為了鑑別在結合親和力方面帶有積極效應之點突變，使用了位點飽和誘變 (SSM) 方法。根據 Fab 文庫設計，選擇已知與結合有關的 22 個位置(h1、h2、h28、h29、h30、h31、h32、h33、h53、h96、h100、h102、k29、k31、k32、k51、k53、k54、k55、k56、k57、k92，根據 Kabat 編號；字母「h」及「k」指示該位置是否位於重鏈「h」或 κ 輕鏈「k」) 以進行隨機化。為各位置設計 NNK 簡併重疊引子，且使用 QuickChange 定點誘變套組 (Agilent，目錄 200519) 產生突變體。將突變的質體轉殖至 TG1 大腸桿菌細胞中且鋪種至瓊脂板中。b) 點突變命中之上清液篩選、表現及 SPR 表徵
將單一群落 (每個突變位置 170-180 個，以便覆蓋使用 NNK 引子引入之胺基酸多樣性) 挑選至微量滴定板，在微量滴定板中表現可溶性 Fab，且藉由離心澄清上清液。
針對相比於親代版本改善之親和力，藉由 ELISA 來如下篩選 Fab 培養物上清液：將500 ng/ml a-F(ab’)2 (108 µl/孔，JIR #109-006-006) 在室溫下包覆於 384w Maxisorp 板 (Nunc，464718) 上持續 1h。用 90 µl PBST (1x PBS，0.1% Tween20) 洗滌三次後，然後藉由添加 90 µl 阻斷緩衝液 (1x PBS，羅氏編號 11666789001；2% BSA，羅氏編號 10735086001；0,05% Tween-20，usb #20605) 在 4℃ 下孵育過夜來阻斷表面。其次，用 90 µl PBST 洗滌表面三次。隨後添加 25 µl 含有 Fab 之上清液且在室溫下孵育 1 小時。藉由用 90 µl PBST 洗滌三次來洗掉未結合之樣品。其次，添加不同濃度 (20 ng/ml、200 ng/ml、2000 ng/ml) 之 25 µl 生物素化 huIL-2 (內部生產) 且在室溫下孵育 1h。然後用 90 µl 洗滌板六次，接著用鏈黴親和素-POD (羅氏編號 11089143001，1:4000) 在室溫下孵育 1h。用 90 µl PBST 洗滌三次後，添加 25 µl TMB (Sera Care，#5120-0087)。孵育 10 min 後，使用酶標儀 (Biotek Powerwave) 在 OD 370 nm 處量測吸光度。
藉由 Sanger 定序揭露了表現 Fab 之所選殖株的身份，該等 Fab 顯示出相對於親代分子而言 ELISA 訊號增加的情況。所鑑別之命中物在大腸桿菌中表現，且如實例 25 中所描述藉由 SPR 評定與 huIL-2 / huIL-2v 之結合。c) 突變體設計、表現及表徵
有益的點突變以多種方式電腦模擬組合，且藉由化學合成製備所欲基因區段。Twist Bioscience (San Francisco，US) 將合成的基因片段選殖至合適的載體中，用於在大腸桿菌中表現。d) 經改進選殖之表現及 SPR 表徵
如實例 24 中所描述，在大腸桿菌中表現 Fab。如實例 25 中所描述評定與 huIL-2 / huIL-2v 之結合、IL-2Rbg 競爭及 IL-2Ra 競爭。
總之，表現且表徵了 71 個獨特的命中 (點突變體)。與親代分子相比，發現 15 個突變體具有改進的 kon、koff或兩者 (選擇 huIL-2 作為參考之抗原)。因此，以下突變以不同的方式組合成 6 個變異體 (根據 Kabat 編號)：VH: E1I；M29L；Q32S；Q32A；A33R；S53T；S53R；S53Q；F100V；I102F、I102Y；Vk：V51I；R54Q；E56S；N57P (關於結果，參見圖 24 A 至圖 24 F及表 41)。表 41 ： 221 衍生之點突變體的結合親和力。
突變 huIL-2 (P1AG0692) huIL-2v (P1AD6412) CD79B (P1AE1979)
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) KD (M)
221 3.36E+05 3.13E-02 9.31E-08 3.41E+05 9.05E-03 2.65E-08 無結合
Eh1I 3.86E+05 2.40E-02 6.22E-08 3.44E+05 6.66E-03 1.94E-08 無結合
Mh29L 2.91E+05 2.67E-02 9.20E-08 3.02E+05 7.68E-03 2.54E-08 無結合
Gh30P 6.64E+05 4.38E-02 6.60E-08 6.32E+05 1.28E-02 2.03E-08 無結合
Qh32S 2.23E+05 1.22E-02 5.44E-08 2.29E+05 3.65E-03 1.59E-08 無結合
Qh32A 3.29E+05 1.60E-02 4.87E-08 3.05E+05 4.43E-03 1.45E-08 無結合
Ah33R 7.21E+05 3.33E-02 4.62E-08 6.13E+05 9.25E-03 1.51E-08 無結合
Sh53T 4.09E+05 2.94E-02 7.18E-08 3.73E+05 8.15E-03 2.18E-08 無結合
Sh53Q 5.01E+05 3.32E-02 6.63E-08 4.32E+05 9.13E-03 2.11E-08 無結合
Sh53R 7.61E+05 3.83E-02 5.03E-08 4.22E+05 1.06E-02 2.51E-08 無結合
Fh100V 5.32E+05 5.48E-02 1.03E-07 7.16E+05 1.25E-02 1.75E-08 無結合
Ih102F 6.38E+05 1.62E-02 2.53E-08 9.40E+05 3.52E-03 3.74E-09 無結合
Ih102Y 9.44E+05 3.41E-02 3.61E-08 1.12E+06 6.53E-03 5.81E-09 無結合
Vk51I 3.65E+05 1.72E-02 4.71E-08 5.85E+05 4.80E-03 8.21E-09 無結合
Rk54Q 6.74E+05 4.64E-02 6.88E-08 8.50E+05 1.04E-02 1.22E-08 無結合
Ek56S 3.75E+05 1.76E-02 4.68E-08 6.10E+05 4.67E-03 7.66E-09 無結合
Nk57P 4.74E+05 4.63E-03 9.76E-09 8.15E+05 1.33E-03 1.64E-09 無結合
221.AM2 4.59E+05 6.79E-04 1.48E-09 5.02E+05 4.16E-04 8.29E-10 無結合
改進的變異體 P029.221.AM2 (「221.AM2」) 顯示了 huIL-2 之解離常數提高了 70 倍 (在 SPR 中並排量測時為 1.5 nM 與 103 nM，參見圖 25 A及圖 25 B ，及表 41) 且所有其他變異體與親代結合劑相比顯示出至少 10 倍的改進。亦測試了 IL-2Rbg 及 IL-2Ra 競爭 (圖 25)，且親和力成熟的殖株在與受體競爭時顯示出顯著提高的效力，表明提高的結合親和力轉化為提高的活體外效力。另外，此等競爭實驗證實了親和力成熟不會改變靶向的 huIL-2 抗原決定基。考慮到 221.AM2 之特殊結合模式，無法假設這樣的結果 (參見實例 27)。
實例 27 ：經由 X 射線晶體學對 221.AM2 huIL-2 結合模式之闡明 a) 用於 X 射線晶體學之 221.AM2_ 無標簽 之表現及純化
抗體 221.AM2 (內部概念編號 P1AI2583) 之片段抗原結合區 (Fab 區域) 係藉由胞漿素消化由單臂人類 IgG OA P029.221.AM2 PG LALA AAA (內部概念編號 P1AH9927) 產生的。單臂人類 IgG OA P029.221.AM2 PG LALA AAA 係在 Evitria 生產。使用懸浮適應的 CHO K1 細胞 (最初自 ATCC 接收且適應在 evitria 懸浮培養中的無血清生長)。種細胞在 eviGrow 培養基中生長，此為一種化學成分明確、不含動物成分、無血清的培養基。用 eviFect 轉染細胞，其為 Evitria 客製化的專有轉染試劑，且轉染後在 eviMake2 (一種不含動物組分之無血清培養基) 中生長。透過離心和隨後的過濾 (0.2 μm 過濾器) 收集上清液。
隨後在 Roche 處藉由 Protein A MabSelectSure 親和力層析 (平衡及洗滌緩衝液：20 mM 檸檬酸鈉、20 mM 磷酸鈉，pH 7.5；溶離緩衝液：20 mM 檸檬酸鈉，pH 3.0；中和緩衝液：0.5 M Na2HPO4，pH 8.0) 及 隨後製備型粒徑排阻層析來純化上清液。將單臂人類 IgG OA P029.221.AM2 PG LALA AAA 調配成 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl，pH 6.0，其中單體含量為 97.2% (分析粒徑排阻層析)，CE-SDS 主峰為 100% 且內毒素濃度 ＜ 0.061 EU/mg。
在下一步驟中，使用 1.05U 胞漿素/mg IgG 消化 20 mg 單臂人類 IgG OA P029.221.AM2 PG LALA AAA。抗體 P029.221.AM2 之 Fab 區藉由 CaptureSelect 預填裝 IgG-CH1 管柱 (Thermo Scientific，Ref 494320005) 及粒徑排阻層析 (HiLoad Superdex PG) 純化。將最終產物調配成 20mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.4，其中單體含量為 95.2% (分析粒徑排阻層析) 且 CE-SDS 主峰為 100%。b) 221.AM2-huIL-2 結晶及結構測定
將 IL-2 凍乾物 (Peprotech，#200-02，批號：071412) 溶解於 100 mM 乙酸 (pH 5.0) 中。為了形成複合物，將 huIL-2 以 2.2 莫耳過量與 Fab 221.AM2 混合。在冰上孵育1小時後，濃縮複合物且將緩衝液更換為 20 mM MES、150 mM NaCl，pH 5.5。在 13.2 mg/ml 之濃度下進行複雜晶體之結晶篩選。在坐滴蒸氣擴散實驗 (vapor diffusion sitting drop experiment) 中，藉由將蛋白質溶液與儲存溶液以 0.7/0.3 及 0.5/0.5 之不同比例混合，在 21℃ 下設定體積為 0.2 µl 之結晶液滴。用於確定結構之晶體在 100 mM Tris、20 % (v/v) PEG Smear Broad (分子尺寸，#MD2-100-26)、200 mM (NH4)2SO4，pH8.0 中以 0.5/0.5 之蛋白質/沉澱物比例在一天之內出現。兩天後安裝晶體且用石蠟油作為冷凍保護劑在液態 N2 中快速冷卻。
資料係在 Swiss Light Source beamline PX-II 上使用 EIGER2-16M 檢測器在 1 Å 波長下在 100 K 下自單一晶體收集的。強度與 XDS 整合 [Kabsch, Wolfgang.「ds.」Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography66.2 (2010): 125-132.]，以 AIMLESS 縮放且使用 STARANISO 處理各向異性 (Tickle, I. J., 等人 「Staraniso.」Global Phasing Ltd., Cambridge, UK(2018))。
來自一個晶體之資料被合併以產生空間群組 C121 中之 1.50 Å 解析度資料集 (參見表 42)。表 42 ： P029.221.AM2 之資料收集及精修統計學
波長 1.0 Å
解析度範圍* 21.68 - 1.50 (1.56 - 1.50)
空間群 C 1 2 1
晶胞 177.56 69.47 119.30 90 123.81 90
總體反射* 646801 (61298)
特有反射* 190358 (1027)
多重性* 3.4 (3.2)
完整度 (%)* 75.48 (5.38)
平均 I/sigma(I) * 9.60 (0.52)
Wilson B 因子 24.1
R-合併* 0.0491 (2.226)
R-meas* 0.0585 (2.678)
CC1/2* 0.999 (0.146)
精化中使用的反射* 144930 (1027)
R-free 所用的反射* 7244 (55)
R-work* 0.1806 (0.2725)
R-free* 0.2112 (0.3018)
非氫原子之數目 9514
大分子 8675
配位體 18
溶劑 821
蛋白質殘基 1103
RMS(鍵) 0.014
RMS(角度) 1.66
Ramachandran 偏好 (%) 98.15
允許的 Ramachandran (%) 1.66
Ramachandran 異常值 (%) 0.18
Rotamer 異常值 (%) 2.33
衝突得分 2.43
平均 B 因子 31.16
大分子 30.44
配位體 52.64
溶劑 38.23
* 圓括號中之值為針對具有最高解析度之外殼。
藉由使用 PHASER 進行分子替換 (McCoy, Airlie J., 等人 「Phaser crystallographic software.」Journal of applied crystallography40.4 (2007): 658-674.) 使用 AlphaFold2 (Jumper, John, 等人 「Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold.」Nature596.7873 (2021): 583-589.) 搜索模型產生各相。
模型係在 Coot 中重建 (Casañal, Ana、Bernhard Lohkamp 及 Paul Emsley.「Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo‐microscopy and Crystallographic Data.」Protein Science29.4 (2020): 1055-1064.) 且使用 CCP4 程式 REFMAC 精修 (Winn, Martyn D., 等人 「Overview of the CCP4 suite and current developments.」Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography67.4 (2011): 235-242.)。最後的精修步驟係使用程式 BUSTER 執行的 (Bricogne, G., 等人 「BUSTER, version 2.11.2; Global Phasing Ltd.」Cambridge, United Kingdom(2011))，對 B 值使用 TLS 方案。最終結構每個不對稱單元含有兩個分子 (參見表 42)。表 43 ： huIL-2 與 221.AM2 之間的主要相互作用之列表
221.AM2 HC 221.AM2 LC huIL-2
Gly26 - Glu15
Trp28 - His16
Trp28 - Gln13
Ser75 - Lys8
Asp101 - His79
Asp104 - Arg81
- Ser30 Asn77
- Asn31 His79
- Tyr32 His79
- Tyr49 Arg81
- Arg54 Asn30
c) 221.AM2 競爭 huIL-2 上 IL-2Rb 之相同抗原決定基
藉由 X 射線衍射闡明了 221.AM2 之結合模式(圖 26 A)。結構分析揭露，221.AM2 與包含螺旋 A 及 C 之 huIL-2 表面以及與螺旋 B` 與 C 之間的環結合 (Stauber D. J., 等人, PNAS 2005)。發現 huIL-2 與 221.AM2 之間的主要相互作用如表 43中所示。
在軟體 PyMol 之幫助下，使用 huIL-2 作為參考，將 221.AM2 - huIL-2 之共晶體結構與 huIL-2 - IL-2Rabg 複合物 (PDB 2erj) 進行比對 (圖 26 B 及 圖 26 C)。結構比對揭露 221.AM2 與 IL-2Rb 具有空間競爭性，IL-2Rb 亦與 huIL-2 螺旋 A 及 C 結合。結構分析結果與 SPR 競爭實驗結果一致 (實例 25 及實例 26)。出乎意料地，221.AM2 不為 IL-2Ra 之空間競爭者 (圖 26 C)。d) P029.221.AM2 之 IL-2Ra 競爭係由於結合誘導之 IL-2 構形變化所致
huIL-2 與 221.AM2 結合及 huIL-2 與三聚體受體複合物 (PDB 2erj) 結合之結構比對揭露，除螺旋 A 與 A' 之間的環及螺旋 A' (胺基酸 29 - 43) 以及跨螺旋 B´ 之 C 端與螺旋 C (胺基酸 67 - 84) 之 N 端之間的區之外，兩個結構之間無顯著差異 (圖 27 A 及圖 27 B)。與受體結合之細胞激素相比，Fab 結合之 huIL-2 的兩個區結果扭結且對稱移動，保持它們的相對距離 (圖 27 C 及圖 27 D)。此種效應可藉由 IL-2Rb 與 221.AM2 之不同結合模式來解釋。IL-2Rb 不會與前述 huIL-2 區形成任何相互作用，而 Fab 則經由 CDR L1 及 CDR L2 進行結合接觸。此種結合誘導之 huIL-2 構形變化係造成 221.AM2 之 IL-2Ra 競爭的原因。詳細而言，結構比對顯示，在螺旋 A´ 內，Fab 結合之 huIL-2 的 Lys36、Arg39 及 Phe43 將與 IL-2Ra 之 Leu42、Tyr43 及 Leu45 發生空間衝突。對於螺旋 B´，此種轉變可能會導致相互作用缺失，例如 huIL-2 Leu72 與 IL-2Ra Tyr43 之相互作用 (圖 27 E 及圖 27 F)。總之，此等組合的效應決定了 221.AM2 之結合誘導的 IL-2Ra 競爭，進一步證實了 SPR 競爭結果。
圖 1A ：基於Fab (「CISS Fab分子」) 之例示性可活化融合蛋白之示意圖。此圖說明了配位體 (此處：細胞激素) 與掩蔽部分 (此處：抗細胞激素掩蔽「α 細胞激素」) 之間的可逆結合，以及它如何在空間上阻斷抗原結合部分 (「α 標靶」) 與標靶抗原 (未描繪) 之接觸。圖 1 B ：例示性可活化融合蛋白之示意圖，其包含「CISS Fab 分子」及作為與 Fc 域融合之另外的靶向臂之第二抗原結合部分，從而產生基於 IgG 之分子。此處所示之分子由四條多肽鏈組成。圖 1 C ：例示性可活化融合蛋白之示意圖，其包含「CISS Fab 分子」及作為與 Fc 域融合之另外的靶向臂之第二抗原結合部分，其中第二抗原結合部分為單鏈抗原結合部分 (具體地，VHH)。此處所示之分子由三條多肽鏈組成。圖 2A ：實例中用為 CISS Fab 前驅分子之配位體 Fab 融合物之示意圖。圖 2 B ：實例中用為 CISS Fab 前驅分子之掩蔽 Fab 融合物之示意圖。圖 2 C ：例示性完整 CISS Fab 分子之示意圖。圖 3A ：CISS Fab 分子之作用模式的示意圖。在溶液中，在不存在標靶抗原之情況下，CISS Fab 分子之掩蔽部分與配位體結合，從而阻止配位體與配位體結合部分之結合。在存在標靶抗原之情況下，Fab 與其結合，同時阻止掩蔽部分與配位體之結合，該配位體現在自由地與配位體結合部分結合。圖 3 B ：「靶向的 CISS 分子」類型之可活化融合蛋白之示意圖。(I) 當在溶液中時，配位體 (虛線橢圓形) 被掩蔽部分 (深色虛線矩形) 掩蔽且不能與細胞表面上表現之配位體結合部分結合。當配位體與掩蔽部分之間的相互作用振盪打開時，與掩蔽部分相比，配位體結合部分相對於配位體通常處於極低的濃度，因此掩蔽相互作用通常重新建立。(II) 在存在標靶抗原之情況下，可活化融合蛋白經由第二抗原結合部分結合至細胞表面。(III) 在第二抗原結合部分結合至細胞表面上之標靶抗原後，第一抗原結合部分之有效抗原濃度升高。當配位體與掩蔽部分之間的相互作用現在在打開與關閉之間振盪時，其使第一抗原結合部分之結合表面打開以結合至標靶抗原。(IV) 第一抗原結合部分結合至第二細胞表面標靶抗原，保持配位體掩蔽打開。(V) 配位體與細胞表面上之配位體結合部分相互作用。圖 4 A 至圖 4 D ：CISS 前驅分子 (Fab 細胞激素融合物)之 HEK-Blue 測定之結果，以鑑別合適的細胞激素連接子長度。x 軸以對數標度顯示測定期間與細胞接觸之分子之濃度 (以 [nM] 為單位)。y 軸顯示了訊號之強度 (OD620nm)。圖 5 A 至圖 5 E ：CISS Fab 分子之 HEK-Blue 測定之結果，以評估 CISS Fab 分子之掩蔽能力。x 軸以對數標度顯示測定期間與細胞接觸之分子之濃度 (以 [nM] 為單位)。y 軸顯示了訊號之強度 (OD620nm)。圖 6 A 至圖 6 B ：PD1-IL-2v CISS Fab 及具有 CISS 分子之所欲特性之前體的實例資料集。圖 6A ：HEK-Blue 測定證實細胞激素連接子具有足夠的長度以達至細胞激素受體。圖 6 B ：用於選擇潛在功能性 CISS Fab 分子之 SPR 測定之結果。圖 7 ：HEK-Blue IL-2 報導細胞測定之結果評定了兩種靶向的 CISS 分子在 PD1 依賴性及非依賴性背景下的 IL-2 活性。圖 8 ：HEK-Blue IL-2 報導基因測定之結果比較了具有或不具有與 PD1 結合之靶向次單元的 PD1-IL-2v CISS。圖 9 ：HEK-Blue IL-2 報導基因測定之結果證明，相對於簡單的細胞激素掩蔽，相互排斥的 CISS 轉換增強了功能。圖 10A 至圖 10B：HEK-Blue IL-2 報導基因測定之結果顯示，與細胞的表面不表現 CD8 之 HEK-Blue IL-2 報導細胞相比，使用CD8 IL-2v CISS Fab 分子 (及前驅分子) 對表現 CD8 之 HEK-Blue IL-2 報導細胞之活化。圖 11A 至圖 11 B ：利用 CISS Fab 單元之不同例示性 T 細胞接合物分子形式之示意圖。圖 11A ：此種 CISS T 細胞接合物形式之抗原結合部分 (「CD3 外部」) 針對標靶抗原。此配位體為抗 CD3 單鏈 Fv，其被抗獨特型 VHH 掩蔽。第二抗原結合部分 (「靶向臂」) 亦針對標靶抗原。圖 11B ：此種 CISS T 細胞接合物形式之抗原結合部分 (「CD3 外部」) 為抗 CD3 Fab 臂。配位體為抗標靶抗原 scFv，其被獨特型 VHH 掩蔽。第二抗原結合部分 (「靶向臂」) 結合至標靶抗原。圖 12 ：「CD3 外部」CISS T 細胞接合物分子之作用模式之示意圖。圖 13 ：經由分子內機制及其作用模式活化的例示性 CISS 分子形式之示意圖。此形式包含第一抗原結合部分、第二抗原結合部分、配位體及掩蔽部分。在此實例中，第二抗原結合部分及掩蔽部分兩者均為單鏈抗原結合部分。配位體係經由肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之重鏈或輕鏈多肽之 N 端。掩蔽部分在其 C 端係經由肽連接子共價接附至第一抗原結合部分之另一多肽之 N 端。第二抗原結合部分在其 C 端或其 N 端經由肽連接子結合至掩蔽部分。圖 14A 至圖 14C ：例示性替代靶向的 CISS 分子形式之示意圖。除了 CISS 模組之外，此等形式亦含有 Fc 域及第二抗原結合部分。圖 14A：CISS 模組之第一抗原結合域並不直接連接至 Fc 域，而係經由肽連接子在其重鏈多肽中之一者的 N 端處共價接附至掩蔽部分之 C 端，此本身係經由另一肽連接子在其 N 端處共價接附至兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 C 端，而第二抗原結合域則係經由其 N 端中之一者共價接附至具有另一肽連接子之兩種 Fc 域重鏈多肽中之一者的 C 端。本實例中之第二抗原結合部分為 CrossFab (由可變域之不同顏色指示)，以在製造期間促進正確的重鏈/輕鏈配對。圖 14 B ：CISS 模組之第一抗原結合部分係經由肽連接子在其重鏈多肽之 C 端處共價接附至 Fc 域之 N 端，而第二抗原結合部分係經由另一肽連接子在其 N 端處共價接附至 Fc 域重鏈多肽中之一者的 C 端。圖 14 C ：圖 14A 中所示的分子之作用模式之示意圖。此分子經由第二抗原結合部分 (「靶向臂」) 結合至細胞表面上之標靶抗原。當掩蔽暫時釋放與第一抗原結合部分融合之細胞激素時，後者可結合至細胞表面上同一標靶抗原分子上之第二抗原決定基，從而中斷掩蔽-細胞激素相互作用且釋放細胞激素以與細胞表面上之細胞激素受體 (未顯示) 結合。圖 15 ：分子 P1AJ7955、P1AI4373 (1040int Fab)、P1AJ7982 (含有 Fc 之雙特異性分子，其特徵在於與一種 Fc 多肽融合之非功能性 Fab (DP47) 及與另一 Fc 多肽融合之 G05 VHH) 及 P1AJ6652 之 SPR 感測圖。P1AJ7955 之親和力顯著高於單獨的任一種 PD1 結合劑。此指示 P1AJ7955 與 PD1 結合兩次，從而改良結合之能力。分子 P1AJ7955 內所含之 221 個 scFv 保留了與 IL-2v 之良好結合，指示不具有由 G05 VHH 誘導之融合不耐受。P1AJ6652 之 SPR 結果證實，掩蔽相互作用似乎係功能性的 (如不存在 IL-2v 或 IL-2Rbg 結合即可看出)。圖 16 ：HEK-Blue IL-2 報導細胞測定之結果比較了在靶向的 PD1 IL-2 CISS 分子中使用減弱的 IL-2 變異體 Q126T 與使用具有完整的 IL-2R 傳訊之 IL-2v 作為細胞激素。圖 17 ：HEK-Blue IL-2 報導細胞測定之結果比較了 PD1 IL-2 CISS 分子中對細胞激素具有不同親和力之掩蔽部分的用途。圖 18 ：用於確定用 IL-2Rβγ 產生的抗 IL-2 Fab 與 IL-2 結合之競爭的 SPR 測定設置之示意圖。圖 19A 至圖 19C ：基於 SPR 之競爭性結合測定之示意圖，該測定用於確定產生的抗 IL-2 Fab 與 IL-2 之結合是否與 IL-2 與 IL-2Rbg 之結合競爭。圖 20A 至圖 20B ：基於 SPR 之競爭性結合測定之示意圖，該測定用於確定產生的抗 IL-2 / IL-2v 特異性 Fab 之結合是否與 IL-2 與 IL-2Ra (CD25) 之結合競爭。圖 21 ：使用 Biacore 8K 或 8K+ 儀器 (Cytiva) 進行 SPR 分析以確定產生的抗 IL-2/IL-2v Fab 之結合親和力的結果。在此測定中分析了與人類IL-2v (右行)、人類IL-2 (中間行) 及 CD79B 二聚體 (對照，左行) 之結合的結合動力學。圖 22 ：基於 SPR 之競爭性結合測定之結果，該測定用於確定產生的抗 IL-2 Fab 與 IL-2 之結合是否與 IL-2 與 IL-2Rbg 之結合競爭。圖 23A 至圖 23B ：基於 SPR 之競爭性結合測定之結果，該測定用於確定產生的抗 IL-2 Fab 與 IL-2 之結合是否與 IL-2 與 IL-2Ra (CD25) 之結合競爭。圖 24A 至圖 24F ：SPR 分析之結果，該分析用於確定親和力成熟的抗 IL-2 Fab 之親和力。圖 25A 至圖 25B ：SPR 分析之結果，該分析用於評定 221 個衍生的點突變抗 IL-2 Fab 之 IL-2Rbg 及 IL-2Ra 競爭。圖 26A 至圖 26C ：IL-2 與親和力成熟的抗 IL-2 Fab P029-221.AM2 之結合的 X 射線衍射分析以及對與 IL-2Rαβγ 結合之影響之結果。圖 26A ：P029.221.AM2 IL-2 複合物之結構。圖 26B ：與 P029-221.AM2 結合之 IL-2，與 IL-2 / IL-2Rαβγ 複合物 (PDB 2erj) 重疊。圖 26 C ：與 IL-2 / IL-2αβγ 複合物重疊之 P029-221.AM2。圖 27A 至圖 27F ：與 221.AM2 結合之 IL-2 以及與三聚體受體複合物 (PDB 2erj) 結合之 IL-2 的結構比對，以闡明 P029.221.AM2 與 IL-2Rα 之 IL-2 結合競爭。圖 27A ：與未結合之 IL-2 重疊之 IL-2 / P029.221.AM2 複合物 (PDB 2erj，正面)。圖 27 B ：與未結合之 IL-2 重疊之 IL-2 / P029.221.AM2 複合物 (PDB erj，背面)。圖 27 C ：與 P021.221.AM2 結合之 IL-2 及未結合的 IL-2 之重疊 (PDB 2erj，正面)。圖 27 D ：與 P021.221.AM2 結合之 IL-2 及未結合的 IL-2 之重疊 (PDB 2erj，細節)。圖 27 E ：與結合至 P021.221.AM2 之 IL-2 重疊之 IL-2 (PDB 2erj) / IL-2Rα 複合物。圖 27 F ：與結合至 P021.221.AM2 之 Il-2 重疊之 IL-2 (PDB 2erj) / IL-2Rα 複合物，細節。圖 28 A 至圖 28 B：HEK-Blue IFNα 報導基因測定之結果比較了 PD-L1-IFNα CISS 分子在具有及不具有第二抗原結合部分 (將該分子靶向細胞表面上之 PD-L1) 之情況下的活化。圖 28A ：此圖顯示了親代 HEK-Blue™ IFNα/β 報導細胞株中 IFNα 活化，該細胞株具有相對較低的 PD-L1 表現 (「HEK-Blue IFNα PD-L1 低」)。圖 28 B ：此圖顯示了高表現 PD‑L1 陽性 IFNα 報導細胞 (純系 45，CL022702，「HEK-Blue IFNa PD-L1 高」) 中之 IFNα 活化。圖 29 ：HEK-Blue IL-2 報導基因測定之結果比較了 CD8a 陰性 (親代) HEK-Blue IL-2 報導細胞 (標記為「HEK-Blue IL-2」，實線及圓圈) 以及 PD1 及 CD8a 陽性 IL-2 報導細胞株 (CL023901；標記為「HEK-Blue IL-2 CD8a」，虛線及三角形) 中 CD8 IL-2v CISS 分子 (CISS Fab 及靶向的 CISS 分子) 之 IL-2 活化。另外，使用了用 OKT8 變異體 (P1AF4823) 預阻斷 PD1 及 CD8a 陽性 IL-2 報導細胞 (CL023901) 上之 CD8a 分子的條件 (標記為「HEK-Blue IL-2 CD8a 阻斷」，虛線直線及正方形)。圖 30 ：STAT-5P 測定之示意圖，該測定用於確定順式 (同一細胞上 IL-2 受體之活化) 及反式 (另一細胞上 IL-2 受體之活化) 之 IL-2R 傳訊。在該測定中，對來自健康供體 PBMC 之 CD4 T 細胞進行分選，且使用抗 CD3 及抗 CD28 抗體活化 3 天，以誘導 PD-1 表現。3 天後，細胞用 Cell Trace Violet (CTV) 標記或不標記，然後用抗 PD-1 抗體阻斷未標記的細胞。將此等 PD-1 預阻斷細胞與 PD-1+ CTV 標記之細胞共培養且用不同濃度之免疫綴合物處理。使用流式細胞分析技術評定 STAT-5 之磷酸化，且資料分析提供了對分子透過 IL-2R 傳訊之效力的深入了解，無論是依賴於或獨立於 PD-1 表現。圖 31 A 至圖 31 C ：IL-2R 傳訊測定之結果。圖 32 ：用於確定 IL-7R 活化之 STAT-5-P 測定之示意圖。對來自健康供體 PBMC 之 CD4 T 細胞進行分選，且使用抗 CD3 及抗 CD28 抗體活化 3 天，以誘導 PD-1 表現。3 天後，細胞用 Cell Trace Violet (CTV) 標記或不標記，然後用抗 PD-1 抗體阻斷未標記的細胞。將此等 PD-1 預阻斷細胞與 PD-1+ CTV 標記之細胞共培養且用不同濃度之免疫綴合物處理。使用流式細胞分析技術評定 STAT-5 之磷酸化，且資料分析提供了對分子透過 IL-7R 傳訊之效力的深入了解，無論是依賴於或獨立於 PD-1 表現。
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Claims (25)

  1. 一種可活化融合蛋白，其包含(a) 能夠特異性結合至標靶抗原且包含至少第一重鏈多肽及至少第一輕鏈多肽之第一抗原結合部分，(b) 能夠特異性結合至細胞激素受體之細胞激素，及(c) 能夠特異性結合至該細胞激素之掩蔽部分，其特徵在於該細胞激素係經由第一肽連接子共價接附至該第一抗原結合部分之兩種多肽中之一者的 N 端，該掩蔽部分係經由第二肽連接子共價接附至該第一抗原結合部分之該兩種多肽中之另一者的 N 端，且該第一肽連接子及該第二肽連接子不包含蛋白酶切割位點。
  2. 如請求項 1 之可活化融合蛋白，其中該第一抗原結合部分為抗體或抗體片段。
  3. 如請求項 2 之可活化融合蛋白，其中該抗體片段係選自由以下所組成之群組：Fab、DutaFab、DAF、Fv、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙功能抗體 (diabody)、線性抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之可活化融合蛋白，其中該細胞激素係選自由以下所組成之群組：干擾素、介白素、趨化激素、淋巴激素、單核激素 (monokines)、群落刺激因子及腫瘤壞死因子。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之可活化融合蛋白，其中該細胞激素係選自由以下所組成之群組：BMP、CSF-1、胰島素、GLP-1、HGH、IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、GM-CSF、FGF、EGF、G-CSF、IFNα、IFNβ、IFNγ、PDGF、TGFβ、TNFα、TNFβ、VEGF 及 EPO。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之可活化融合蛋白，其中該掩蔽部分係選自由以下所組成之群組：抗體、抗體片段、單鏈抗原結合部分、肽掩蔽物 (peptide mask) (抗獨特型抗體、抗獨特型抗體片段 (例如 scFv、VHH)) 及能夠特異性結合至該細胞激素之受體、蛋白質抑制劑或結合蛋白。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之可活化融合蛋白，其中該掩蔽部分可逆地結合至該細胞激素。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之可活化融合蛋白，其中當該掩蔽部分結合至該細胞激素時，會阻擋該細胞激素與該細胞激素受體結合。
  9. 如請求項 1 至 8 中任一項之可活化融合蛋白，其中當該掩蔽部分結合至該細胞激素時，會阻擋該第一抗原結合部分與該抗原結合。
  10. 如請求項 1 至 9 中任一項之可活化融合蛋白，其進一步包含第二抗原結合部分，該第二抗原結合部分包含至少第二重鏈多肽及至少第二輕鏈多肽。
  11. 如請求項 1 至 10 中任一項之可活化融合蛋白，其進一步包含 Fc 域，該 Fc 域包含第一 Fc 域重鏈多肽及第二 Fc 域重鏈多肽。
  12. 如請求項 11 之可活化融合蛋白，其中a) 該第一抗原結合部分係共價接附至該第一 Fc 域重鏈多肽之 N 端且該第二抗原結合部分係共價接附至該第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端，或b) 該第一抗原結合部分係共價接附至該第一 Fc 域重鏈多肽或該第二 Fc 域重鏈多肽之 N 端且該第二抗原結合部分係共價接附至該第一 Fc 域重鏈多肽或該第二 Fc 域重鏈多肽之 C 端。
  13. 如請求項 10 至 12 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第二抗原結合部分能夠特異性結合至與該標靶抗原相同的抗原或不同的抗原。
  14. 如請求項 11 至 13 中任一項之可活化融合蛋白，其中該第一抗原結合部分、該第二抗原結合部分及 Fc 區一起形成 IgG 類型之抗體。
  15. 一種抗體，其特異性結合至 huIL-2 或其變異體，其中該抗體結合至在 SEQ ID NO:81 之胺基酸殘基 8 至 17、胺基酸殘基 30 及/或胺基酸殘基 77 至 81 內的 huIL-2 之抗原決定基 (epitope)；且抑制 huIL-2 與人類 IL-2Rβγ 及與人類 IL-2Rα 之結合。
  16. 如請求項 15 之抗體，其中該抗原決定基包含對應於 SEQ ID NO:81 之 K8、Q13、E15、H16、N30、N77、H79 及 R81 之胺基酸殘基；且抑制 huIL-2 與人類 IL-2Rβγ 及與人類 IL-2Rα 之結合。
  17. 一種抗體，其特異性結合至 huIL-2 或其變異體，其中該抗體包含(A) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(B) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列的 CDR-L3；(C) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(D) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(E) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(F) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:34 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(G) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(H) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；(I) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:29 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3；或(J) 重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) 含有 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列的 CDR-H1、(b) 含有 SEQ ID NO:46 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (c) 含有 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) 含有 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列的 CDR-L1、(e) 含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (f) 含有 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的 CDR-L3。
  18. 如請求項 15 至 17 中任一項之抗體，其包含(A) SEQ ID NO:7 之 VH 序列及 SEQ ID NO:8 之 VL 序列；(B) SEQ ID NO:12 之 VH 序列及 SEQ ID NO:13 之 VL 序列；(C) SEQ ID NO:18 之 VH 序列及 SEQ ID NO:19 之 VL 序列；(D) SEQ ID NO:24 之 VH 序列及 SEQ ID NO:25 之 VL 序列；(E) SEQ ID NO:30 之 VH 序列及 SEQ ID NO:31 之 VL 序列；(F) SEQ ID NO:35 之 VH 序列及 SEQ ID NO:36 之 VL 序列；(G) SEQ ID NO:38 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 39 之 VL 序列；(H) SEQ ID NO:41 之 VH 序列及 SEQ ID NO:42 之 VL 序列；(I) SEQ ID NO:44 之 VH 序列及 SEQ ID NO:45 之 VL 序列；或(J) SEQ ID NO:47 之 VH 序列及 SEQ ID NO:48 之 VL 序列。
  19. 如請求項 15 至 18 中任一項之抗體，其中該抗體為 Fab 且包含(A) 含有 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:50 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(B) 含有 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(C) 含有 SEQ ID NO:53 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(D) 含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(E) 含有 SEQ ID NO:57 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(F) 含有 SEQ ID NO:59 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(G) 含有 SEQ ID NO:61 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(H) 含有 SEQ ID NO:63 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:64 之胺基酸序列的輕鏈多肽；(I) 含有 SEQ ID NO:65 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:66 之胺基酸序列的輕鏈多肽；或(J) 含有 SEQ ID NO:67 之胺基酸序列的重鏈多肽及含有 SEQ ID NO:68 之胺基酸序列的輕鏈多肽。
  20. 一種經分離的核酸，其編碼如請求項 1 至 14 中任一項之可活化融合蛋白或如請求項 15 至 19 中任一項之抗體。
  21. 一種宿主細胞，其包含如請求項 20 之核酸。
  22. 一種產生如請求項 1 至 14 中任一項之可活化融合蛋白或如請求項 15 至 19 中任一項之抗體之方法，其包含在適合於表現該可活化融合蛋白或該抗體之條件下培養如請求項 20 之宿主細胞，視情況進一步包含自該宿主細胞回收該可活化融合蛋白或該抗體之步驟。
  23. 一種可活化融合蛋白或抗體，其藉由如請求項 22 之方法產生。
  24. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 14 或 23 中任一項之可活化融合蛋白或如請求項 15 至 19 或 23 中任一項之抗體以及醫藥上可接受之載劑。
  25. 如請求項 1 至 14 或 23 中任一項之可活化融合蛋白、如請求項 15 至 19 或 23 中任一項之抗體或如請求項 24 之醫藥組成物，其用為藥物。
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