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HK1213578A1 - 结合人fcrn的修饰的抗体和使用方法 - Google Patents

结合人fcrn的修饰的抗体和使用方法 Download PDF

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HK1213578A1
HK1213578A1 HK16101497.8A HK16101497A HK1213578A1 HK 1213578 A1 HK1213578 A1 HK 1213578A1 HK 16101497 A HK16101497 A HK 16101497A HK 1213578 A1 HK1213578 A1 HK 1213578A1
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古伊多．哈特曼
約爾格．托馬斯．雷古拉
约尔格．托马斯．雷古拉
馬蒂亞斯．吕特
马蒂亚斯．吕特
沃爾夫岡．舍費爾
沃尔夫冈．舍费尔
蒂爾曼．施洛特豪爾
蒂尔曼．施洛特豪尔
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豪夫迈‧罗氏有限公司
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Description

结合人FCRN的修饰的抗体和使用方法
发明领域
本发明涉及就人新生儿Fc-受体而言具有修饰的结合亲和力的特异结合可溶性受体-配体的抗体和Fc-区融合多肽、它们的制备方法、包含这些抗体的药物制剂及其用途。
背景
血管发生参与各种病症的发病机理，所述疾病包括实体瘤、眼内新血管综合征(intraocularneovascularsyndromes)如增生性视网膜病(proliferativeretinopathies)或年龄相关的黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，AMD)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)和银屑病(psoriasis)(Folkman，J.，等，J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934；Klagsbrun，M.，等，Annu.Rev.Physiol.53(1991)217-239；和Garner，A.，Vasculardiseases，在：Pathobiologyofoculardisease，Adynamicapproach，Garner，A.，和Klintworth，G.K，(编辑)，第二版，MarcelDekker，纽约，(1994)，第1625-1710页)。
雷珠单抗(ranibizumab)(商品名称为)是一种与贝伐珠单抗(bevacizumab)(Avastin)来源于相同的亲本鼠源抗体的单克隆抗体片段。然而，其已被亲和力成熟从而提供更强的与VEGF-A的结合(WO98/45331)。已知VEGF-A阻断可能与一些系统毒性相关，因此，雷珠单抗缺失Fc区，从而减少血清半衰期并且因此降低系统毒性。其是一种已被核准用于治疗“湿”型年龄相关的黄斑变性(AMD)(一种常见的年龄相关的视觉丧失)的抗血管生成剂。
眼血管疾病，如年龄相关的黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)，分别是由于异常的脉络膜或视网膜新血管形成所导致。它们是工业化国家中视觉丧失的主要原因。由于视网膜由界限明确的神经元、神经胶质和血管元件层组成，相对小的干扰，如在血管增生或水肿中观察到的那些，可以导致显著的视功能丧失。遗传性视网膜变性，诸如色素性视网膜炎(RetinitisPigmentosa，RP)也与血管遗传相关，诸如小动脉狭窄和血管萎缩。它们多至在每3,500名个体中影响1人，并且特征在于进行性的夜盲(progressive)、视野丧失(visualfieldloss)、视神经萎缩(opticnerveatrophy)、小动脉变细(arteriolarattenuation)和通常进展为完全的失明的中央视觉丧失(centrallossofvision)。
缺血性视网膜病变(Ischemicretinopathies)特征在于视网膜血管的丧失或功能障碍，其引起血流减少和缺氧。视网膜通过产生生长新血管的信号来响应缺氧，但是这些新血管通常是脆弱的和无组织性的。由于它们可能渗漏、导致出血或导致可能引起视网膜脱离的瘢痕，因此，正是这些异常新血管的生长产生大部分的视觉威胁。目前对于缺血性视网膜病变的治疗寻找终止病理性血管生长，但是没有解决推动其生长的潜在的缺血。此外，对糖尿病性视网膜病变(一种影响数百万人的缺血性视网膜神经病变)的标准治疗包括用激光破坏一部分视网膜，以尝试终止新血管生长并且保持中央视觉。已经应用一些策略来阻断血管内皮生长因子(VEGF)的功能，血管内皮生长因子是血管生长的主要促进剂。短期内，抗-VEGF治疗可以改善视觉，但是其没有解决潜在的缺血，并且事实上，由于其抑制所有的血管生长，包括有益的侧支的生长，可能加重这种病症。在老年人和/或糖尿病患者(在缺血性的脑、心脏或肢体中可能需要新血管生长)中，还存在对于系统性暴露于这些药物的严重的关注。
典型地，对于眼部疾病，通常使用通过玻璃体内应用的较小的抗体片段，如Fab或Fab2，原因在于其具有低血清半衰期，并且系统性毒性的危险较低。然而，这种较小的片段典型地具有较低的玻璃体内半衰期(例如，由于较快地扩散到血清中)并且必须典型地更频繁地给药。
几乎所有Fc-受体不对称地结合于抗体的对称的Fc-区。
例如，人Fcγ-受体IIIA在两个Fc-区多肽上与不同的氨基酸残基相互作用。因此，必须使用不对称引入的突变(例如在下部铰链区中残基233至238处)以增加或减少抗体与人Fcγ受体IIIA的相互作用。
但是，人新生儿Fc-受体FcRn之间的相互作用上对称的：两种FcRn分子可以以2∶1化学计量结合于单个IgG(参见.例如Huber，A.W.，等人，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。因此，不对称引入的突变减少对/由一种FcRn的结合，而不减少对/由二者的结合。
不对称IgG-样分子的实例包括但不限于以以下技术或以以下方式使用获得的那些：Triomab/Quadroma、凸起-进-孔洞(Knobs-into-Holes)、CrossMabs、静电匹配的抗体、LUZ-Y、链交换改造的结构域体(StrandExchangeEngineeredDomainbody)、Biclonic和DuoBody。
在WO2012/125850中报道了在其Fc-区包含不对称置换并且具有增加的对人Fcγ-受体IIIA的结合和增强的ADCC活性的含Fc蛋白。
在WO2012/58768中分离了包含异二聚体Fc-区的异多聚体，其中所述异二聚体Fc-区包含含有氨基酸突变的变体CH3结构域，以促进具有增加的稳定性的异二聚体形成，其中所述异二聚体Fc-区还包含含有不对称氨基酸修饰的变体CH2结构域，以促进Fcγ受体的选择性结合。
在WO2011/131746中报道了，通过在两种单特异起始蛋白的CH3区中引入对称的突变，可以促使Fab-臂交换反应成为定向的并且从而获得高度稳定的异二聚蛋白。
Kim等人(Kim，H.，等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.49(2008)2025-2029)报道了，除了视网膜色素上皮和脉络膜组织，眼组织，包括睫状体和虹膜、视网膜、结膜、角膜、晶状体和视神经束，显示预期的大小的FcRn转录本的存在。血眼屏障显示FcRn受体表达，表明IgG从眼组织向血液系统转运可能使用这种受体。因为内眼组织如视网膜与血液系统被血眼屏障隔开，不可能预期仅在玻璃体内注射后短时间内在血液系统中检测到全长抗体。然而，近期来自猴和人的药代动力学数据均表明，玻璃体内贝伐珠单抗在玻璃体内注射后数小时内出现在血液中。因此，可能是，FcRn受体在结膜淋巴管中的功能是充当用于从结膜空间有效去除抗原-抗体IgG复合物的外排(efflux)受体。尽管有类似的分子量，在房水中检测到IgG(150kDa)；然而，未检测到IgA(160kDa)。IgG和IgA从血清穿透入房水之间的差异可以由FcRn受体的存在来解释，所述FcRn受体对IgG具有选择性。
Kim等人还报道了(Kim，H.，等人，Mol.Vis.15(2009)2803-2812)，直接的玻璃体内注射已经成为将治疗性抗体递送到眼的后段以用于视网膜疾病的普通方式。玻璃体内施用的贝伐珠单抗(lgG)和鸡IgY二者均克服了内部限制性膜屏障并且扩散入深层视网膜结构。扩散通过视网膜之后，贝伐珠单抗跨过血液-视网膜屏障并且渗入体循环。视网膜内的鸡IgY仅沿血液-视网膜屏障的管腔侧定位。此外，脉络膜血管对于鸡IgY的存在是阴性的。发现在玻璃体内施用后，呈现注射剂量的至多30％的贝伐珠单抗的生理学相关血清水平。这提示比之前认为的更大的系统性副作用的风险。血眼屏障表明转运和清除全长IgG进入体循环的特定机制。目前关于它们的研究证实了该机制是新生儿Fc-受体的假设。
但是对FcRn的结合延长其在循环中的半衰期，可能导致系统性副作用。
本领域中存在对更好的治疗和预防各种眼血管疾病如缺血性视网膜病变(ischemicretinopathies)的方法的需求。
Magdelaine-Beuzelin，C.，等人报道了眼科学中旧的再次成为新的的治疗性抗体(MABS2(2010)176-180)。
Steinbrook，R.，报道了即期价格(thepriceofsight)-雷珠单抗，贝伐珠单抗，和黄斑变性的治疗(NewEng.J.Med.355(2006)1409-1412).
在US2011/236388中报道了双特异的、双价抗-VEGF/抗-ANG-2抗体。
Kuo，T.T.，等人报道了关于新生儿Fc受体：从免疫到治疗(J.Clin.Immunol.30(2010)777-789).
Medesan，C.，等人报道了小鼠IgG1的胞转作用和异化作用中涉及的氨基酸残基的阐述(J.Immunol.158(1997)2211-2217)。
Qiao，S.-W，等人报道了抗体-介导的抗原呈递对FcRn的依赖性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA105(2008)9337-9342)。
Kim，J.K.，等人报道了对人IgG对I类MHC相关受体，FcRn的结合位点的制图(mapping)(Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2825)。
Kuo，T.T，等人报道了关于新生儿Fc受体和基于IgG的治疗(MABS3(2011)422-438)。
概述
对于使用靶向/结合不仅存在于眼中而且还存在于其余身体的抗原的抗体，通过血眼屏障后从眼进入血液的短的系统性半衰期对避免副作用而言是有益的。
此外，对于特异结合受体的配体并且在眼疾病的治疗中有效的抗体，抗体-抗原复合物(＝抗体-受体配体-复合物)，在从眼移除后并且之后所述抗体(或者解离后或者作为复合物)，必须从体循环中移除，以避免副作用，即所述抗体用作从眼移除受体配体的载体，从而抑制受体信号转导，并且快速从血液循环中清除，以避免系统性副作用。
已经发现，包含不结合人新生儿Fc-受体的Fc-区的抗体可以通过血眼屏障。尽管结合FcRn被认为是跨血眼屏障转运所需的，所述抗体不结合人FcRn，这是令人惊讶的。
本文所报道的一个方面是包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体用于将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环的用途。
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用作药物。
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用于治疗眼血管疾病。
本文所报道的一个方面是包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除的用途。
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除。
本文所报道的一个方面是包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体用于治疗眼疾病，特别是眼血管疾病的用途。
本文所报道的一个方面是包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环的用途。
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体使用表面等离子共振不具有可检测的FcRn结合。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体在pH6以大于1.7μM的Kd值，即以低亲和力结合人FcRn。
在所有方面的一个实施方案中，作为包含具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)的Fc-区的抗体，所述抗体在FcRn亲和层析柱上具有相同或更短的保留时间。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体在FcRn亲和层析柱上具有三分钟以下的保留时间。
在一个实施方案中，FcRn亲和柱具有50mmx5mm的柱尺寸，床高是5cm并且上样为50μg抗体。在一个实施方案中，平衡缓冲液是20mMMES，具有150mMNaCl，调节至pH5.5，洗脱缓冲液是20mMTris/HCl，具有150mMNaCl，调节至pH8.8并且通过应用7.5CV平衡缓冲液，30CV中0％至100％的洗脱缓冲液，和随后10CV洗脱缓冲液来洗脱。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体以与包含具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)的Fc-区的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体以与具有SEQIDNO：01或SEQIDNO：02或SEQIDNO：112的重链氨基酸序列和SEQIDNO：03的轻链氨基酸序列的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在一个实施方案中，所述抗体以与包含具有突变L251D，L251S，M252T，I253A，S254W，S254R，H310A，H433A，N434L，H435A，Y436A中至少一种(根据KabatEU索引编号系统编号)的Fc-区的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在一个实施方案中，所述抗体以与包含具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)的Fc-区的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在一个实施方案中，所述抗体以与具有SEQIDNO：01或SEQIDNO：112的重链氨基酸序列和SEQIDNO：03的轻链氨基酸序列的抗体相比，或与具有SEQIDNO：02或SEQIDNO：112的重链氨基酸序列和SEQIDNO：04的轻链氨基酸序列的抗体相比，大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在一个实施方案中，所述抗体具有突变L251D，L251S，M252T，I253A，S254W，S254R，H310A，H433A，N434L，H435A，Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)或其组合中的至少一种。
在一个实施方案中，所述抗体在第一Fc-区多肽中具有突变L251D，L251S，M252T，I253A，S254W，S254R，H310A，H433A，N434L，H435A，Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)中的至少一种并且在第二Fc-区多肽具有突变L251D，L251S，M252T，I253A，S254W，S254R，H310A，H433A，N434L，H435A，Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)中的至少一种。
在一个实施方案中，所述抗体在两种Fc-区多肽中至少具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体具有异二聚的Fc-区。
在一个实施方案中，所述抗体是全长抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是人、人源化或嵌合抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是单特异抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用于治疗眼疾病。
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用于将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环.
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除。
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用于治疗眼疾病，特别是眼血管疾病。
本文所报道的一个方面是一种包含消除对FcRn的结合的Fc-区的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
在所有方面的一个实施方案中，抗体的治疗或应用通过玻璃体内应用来进行。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体具有使用表面等离子共振检测不到的FcRn结合。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体以在pH6以大于1.7μM的Kd值，即以低亲和力结合人FcRn。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体与包含具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)的Fc-区的抗体在FcRn亲和层析柱上具有相同或更短的保留时间。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体在FcRn亲和层析柱上具有三分钟以下的保留时间。
在一个实施方案中，FcRn亲和柱具有50mmx5mm的柱尺寸，床高是5cm并且上样为50μg抗体。在一个实施方案中，平衡缓冲液是20mMMES，具有150mMNaCl，调节至pH5.5，洗脱缓冲液是20mMTris/HCl，具有150mMNaCl，调节至pH8.8并且通过应用7.5CV平衡缓冲液，30CV中0％至100％的洗脱缓冲液，和之后10CV洗脱缓冲液来洗脱。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体以与包含具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)的Fc-区的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体以与具有SEQIDNO：01或SEQIDNO：02或SEQIDNO：112的重链氨基酸序列和SEQIDNO：03的轻链氨基酸序列的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在一个实施方案中，所述抗体以与包含具有突变L251D，L251S，M252T，I253A，S254W，S254R，H310A，H433A，N434L，H435A，Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)中至少一种的Fc-区的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在一个实施方案中，所述抗体以与包含具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)的Fc-区的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在一个实施方案中，所述抗体以与具有SEQIDNO：01或SEQIDNO：112的重链氨基酸序列和SEQIDNO：03的轻链氨基酸序列的抗体相比，或与具有SEQIDNO：02或SEQIDNO：112的重链氨基酸序列和SEQIDNO：04的轻链氨基酸序列的抗体相比大约相同或更小的亲和力结合人FcRn。
在一个实施方案中，所述抗体具有突变L251D，L251S，M252T，I253A，S254W，S254R，H310A，H433A，N434L，H435A，Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)或其组合中的至少一种。
在一个实施方案中，所述抗体在第一Fc-区多肽中具有突变L251D，L251S，M252T，I253A，S254W，S254R，H310A，H433A，N434L，H435A，Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)的至少一种并且在第二Fc-区多肽具有突变L251D，L251S，M252T，1253A，S254W，S254R，H310A，H433A，N434L，H435A，Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)的至少一种。
在一个实施方案中，所述抗体在两种Fc-区多肽中至少具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体具有异二聚的Fc-区。
在一个实施方案中，所述抗体是全长抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是人、人源化或嵌合抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是单特异性抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。
本文所报道的一个方面是一种治疗患有眼血管疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所报道的抗体，
本文所报道的一个方面是一种用于在个体中将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所报道的抗体，以将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环。
本文所报道的一个方面是一种在个体中将一种以上可溶性受体配体从眼移除的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所报道的抗体，以从眼移除一种以上可溶性受体配体。
本文所报道的一个方面是一种在个体中将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运入血液循环的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所报道的抗体，以将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
本文所报道的一个方面是在个体中将可溶性受体配体从玻璃体内空间或眼跨血眼屏障转运入血液循环的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所报道的抗体，以将可溶性受体配体从玻璃体内空间或眼跨血眼屏障转运入血液循环。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，其中
i)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变Y436A，或
ii)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变I253A，H310A和H435A，或
iii)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变H310A，H433A和Y436A，或
iv)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变L251D，L314D和L432D，或
v)所述第一Fc-区多肽包含突变Y436A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变I253A，H310A和H435A，或
b)突变H310A，H433A和Y436A，或
c)突变L251D，L314D和L432D，
或
vi)所述第一Fc-区多肽包含突变I253A，H310A和H435A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变H310A，H433A和Y436A，或
b)突变L251D，L314D和L432D，
或
vii)所述第一Fc-区多肽包含突变H310A，H433A和Y436A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变L251D，L314D和L432D。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不特异结合人FcRn。在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不特异结合葡萄球菌蛋白A。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不特异结合人FcRn。在所有方面的一个实施方案中，所述抗体特异结合葡萄球菌蛋白A。
在所有方面的一个实施方案中，所述第一Fc-区多肽还包含突变Y349C，T366S，L368A和Y407V(“孔洞”)并且所述第二Fc-区多肽包含突变S354C和T366W(“凸起”)。
在所有方面的一个实施方案中，所述Fc-区多肽是人IgG1亚类的。在一个实施方案中，所述第一Fc-区多肽和所述第二Fc-区多肽还包含突变L234A和L235A。在一个实施方案中，所述第一Fc-区多肽和所述第二Fc-区多肽还包含突变P329G。
在所有方面的一个实施方案中，所述Fc-区多肽是人IgG4亚类的。在一个实施方案中，所述第一Fc-区多肽和所述第二Fc-区多肽还包含突变S228P和L235E。在一个实施方案中，所述第一Fc-区多肽和所述第二Fc-区多肽还包含突变P329G。
在一个实施方案中，人IgG型Fc-区是变体人IgG型异二聚的Fc-区。
在一个实施方案中，第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的配对，形成Fc-区，导致异二聚体的形成。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：14的CDR3H区，SEQIDNO：15的CDR2H区，和SEQIDNO：16的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：17的CDR3L区，SEQIDNO：18的CDR2L区，和SEQIDNO：19的CDR1L区，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：22的CDR3H区，SEQIDNO：23的CDR2H区，和SEQIDNO：24的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：25的CDR3L区，SEQIDNO：26的CDR2L区，和SEQIDNO：27的CDR1L区，并且
iii)所述双特异性抗体包含具有突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的恒定重链区。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：14的CDR3H区，SEQIDNO：15的CDR2H区，和SEQIDNO：16的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：17的CDR3L区，SEQIDNO：18的CDR2L区，和SEQIDNO：19的CDR1L区，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：22的CDR3H区，SEQIDNO：23的CDR2H区，和SEQIDNO：24的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：25的CDR3L区，SEQIDNO：26的CDR2L区，和SEQIDNO：27的CDR1L区，并且
iii)所述双特异性抗体包含具有突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的恒定重链区，
并且其中就SEQIDNO：20、21、28和29而言，可变结构域包含不多于3种突变。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其中所述双特异性抗体包含在两种Fc-区多肽中均具有突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的恒定重链区。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体。
附图简述
图1：具有IHH-AAA突变(＝突变I253A，H310A和H435A的组合(根据Kabat的EU索引编号))的<VEGF-ANG-2>IgG1或IgG4抗体的概念方案和优势。
图2：小规模基于DLS的粘度测量：在200mM精氨酸/琥珀酸酯，pH5.5中150mg/mL的推算粘度(<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)与参考抗体VEGFang2-0015(没有这种IHH-AAA突变)的比较)。
图3：在20mM组氨酸缓冲液，140mMNaCl，pH6.0中随温度(包括DLS聚集开始温度)的DLS聚集(本文报道的<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)与参考抗体VEGFang2-0015(没有这种IHH-AAA突变)的比较)。
图4：在40℃100mg/mL的七天储存(主峰减少并且高分子量(HMW)增加)(显示较低聚集的本文报道的<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)与参考抗体VEGFang2-0015(没有这种IHH-AAA突变)的比较)。
图5A和B：A的FcRn稳定状态亲和力：VEGFang2-0015(没有IHH-AAA突变)和B：VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)。
图6：没有IHH-AAA突变的VEGFang2-0015和具有IHH-AAA突变的VEGFang2-0016(二者均是具有P329GLALA突变的IgG1亚类，作为对照，使用IgG1亚类的抗-地高辛(digoxigenin)抗体(抗-Dig)和IgG4系抗体)的FcγRIIIa相互作用测量。
图7A：图示的用于确定血清和全眼裂解物中<VEGF-ANG-2>双特异的抗体的浓度的药代动力学(PK)-ELISA测定原理。
图7B：静脉内(i.v.)施用后的血清浓度：没有IHH-AAA突变的VEGFang2-0015和具有IHH-AAA突变的VEGFang2-0016的比较。
图7C：玻璃体内施用后的血清浓度：没有IHH-AAA突变的VEGFang2-0015和具有IHH-AAA突变的VEGFang2-0016的比较。
图7D：右和左眼中VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)的眼裂解物浓度(与静脉内使用相比，仅玻璃体内施用于右眼后)：在玻璃体内施用后仅可在右眼检测到显著浓度；由于VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)的低血清半衰期，在静脉施用后，在眼裂解物中检测不到浓度。
图7E：右眼和左眼中VEGFang2-0015(没有IHH-AAA突变)的眼裂解物浓度(与静脉内施用相比，仅玻璃体内施用于右眼后)：在右眼中(并且在一定程度上在左眼中)，玻璃体内施用后可检测到VEGFang2-0015浓度；这表明从右眼扩散入血清并且从那里进入左眼，这可以由VEGFang2-0015(没有IHH-AAA突变)的长半衰期解释；在静脉内施用后，可以在双眼的眼裂解物中都检测到显著的浓度，由于血清稳定的VEGFang2-0015(没有IHH-AAA突变)扩散入眼中。
图8：与参考野生型(wt)抗体相比，就其结合FcRn的能力改造的抗体在SPR分析中展示出延长的(YTE突变)或缩短的(IHH-AAA突变)体内半衰期，增强的(YTE突变)或减小的结合(IHH-AAA突变)以及在FcRn柱层析中增强或减少的保留时间；a)将10mg/kg单次静脉推注施用于huFcRn转基因雄性C57BL/6J小鼠+/-276中后的PK数据：野生型IgG以及YTE和IHH-AAAFc-修饰的IgG的AUC数据；b)BIAcore传感图；c)FcRn亲和柱洗脱；野生型抗-IGF-1R抗体(参考)，抗-IGF-1R抗体的YTE-突变体，抗-IGF-1R抗体的IHH-AAA-突变体。
图9：在FcRn亲和层析中，保留时间随引入Fc-区的突变数量的改变。
图10：FcRn-结合随引入Fc-区的突变的不对称分布的改变。
图11：在两条重链中都具有突变H310A，H433A和Y436A的双特异的<VEGF-ANG-2>抗体(VEGF/ANG2-0121)从两个连续的蛋白A亲和层析柱洗脱的层析图。
图12：在两条重链中都具有突变H310A，H433A和Y436A的抗-IGF-1R抗体(IGF-1R-0045)从蛋白A亲和层析柱洗脱的层析图。
图13：IgGFc-区修饰的<VEGF-ANG-2>抗体对在CM5芯片上固定的蛋白A的结合。
图14：不同的<VEGF-ANG-2>抗体在FcRn亲和柱上的洗脱层析图。
图15：不同的融合多肽对葡萄球菌蛋白A(SPR)的结合。
图16：不同的<VEGF-ANG-2>抗体和抗-IGF-1R抗体突变体对固定的蛋白A(SPR)的结合。
图17：静脉内施用抗体IGF-1R0033，0035和0045后血清浓度的比较。
图18：玻璃体内和静脉内施用抗体IGF-1R0033后眼裂解物浓度的比较。
图19：玻璃体内和静脉内施用抗体IGF-1R0035后眼裂解物浓度的比较。
图20：玻璃体内和静脉内施用抗体IGF-1R0045后眼裂解物浓度的比较。
发明实施方案详述
I.定义
术语“约”表示之后接着的数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中术语约表示之后接着的数值的+/-10％。在一个实施方案中，术语约表示之后接着的数值的+/-5％。
为了本文的目的的“接纳体人框架区”是包含如下文定义的源自人免疫球蛋白框架区或人共有框架区的轻链可变结构域(VL)框架区或重链可变结构域(VH)框架区的氨基酸序列的框架区。“源自”人免疫球蛋白框架区或人工有框架区的接纳体人框架区可以包含其相同氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数量为10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL接纳体人框架区与VL人免疫球蛋白框架区序列或人工有框架区序列在序列上相同。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有这种改变的母体抗体相比，在一个以上高变区(HVRs)中具有一种以上改变的抗体，这种改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。
术语“改变”表示突变(置换)、插入(添加)、或缺失母体抗体或融合多肽，例如包含至少Fc-区的FcRn结合部分的融合多肽中一个以上氨基酸残基，以获得修饰的抗体或融合多肽。术语“突变”表示，指定的氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。例如突变L234A表示。抗体Fc-区(多肽)位置234的氨基酸残基赖氨酸被氨基酸残基丙氨酸置换(用丙氨酸置换赖氨酸)(根据EU索引编号)。
术语“氨基酸突变”表示至少一种已有氨基酸残基被另一种不同的氨基酸残基(＝替代氨基酸残基)置换。所述替代氨基酸残基可以是“天然存在的氨基酸残基”，并且选自由以下各项组成的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。替代氨基酸残基可以是“非天然存在的氨基酸残基”。参见例如US6,586,207，WO98/48032，WO03/073238，US2004/0214988，WO2005/35727，WO2005/74524，Chin，J.W.，等人，J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin，J.W.和Schultz，P.G.，ChemBioChem11(2002)1135-1137；Chin，J.W.，等人，PICASUnitedStatesofAmerica99(2002)11020-11024；以及，Wang，L.和Schultz，P.G.，Chem.(2002)1-10(全部通过引用整体并入本文)。
术语“氨基酸插入”表示在氨基酸序列中预定的位置(额外)并入至少一种氨基酸残基。在一个实施方案中，所述插入将是插入一种或两种氨基酸残基。插入的一个或多个氨基酸残基可以是任何天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。
术语“氨基酸缺失”表示在氨基酸序列中预定位置移除至少一种氨基酸残基。
本文使用的术语“ANG-2”是指人血管生成素-2(ANG-2)(备选地缩写为ANGPT2或ANG2)(SEQIDNO：31)，其例如在Maisonpierre，P.C.，等人，Science277(1997)55-60和Cheung，A.H.，等人，Genomics48(1998)389-91中描述。发现血管生成素-1(SEQIDNO：32)和-2作为Ties的配体，所述Ties是在血管内皮内选择性表达的酪氨酸激酶家族(Yancopoulos，G.D.，等人，Nature407(2000)242-248)。现在存在四个确定的血管生成素家族成员。血管生成素-3和-4(ANG-3和ANG-4)可能在小鼠和人的相同基因座的对应物广泛分开(Kim，I.，等人，FEBSLet，443(1999)353-356；Kim，I.，等人，J.Biol.Chem.274(1999)26523-26528)。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别被鉴定为激动剂和拮抗剂(对于ANG-1参见：Davis，S.，等人，Cell87(1996)1161-1169；并且对于ANG-2参见：Maisonpierre，P.C.，等人，Science277(1997)55-60)。所有已知血管生成素主要结合Tie2(SEQIDNO：33)，并且ANG-1和-2二者都以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2(Maisonpierre，P.C.，等人，Science277(1997)55-60)。
本文中的术语“抗体”用于最广泛的意义并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)，和抗体片段，只要它们呈现所需抗原-和/或蛋白A和/或FcRn-结合活性。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中以50％或更多阻断参考抗体对其抗原的结合的抗体，并且相反，在竞争测定中参考抗体以50％或更多阻断抗体对其抗原的结合。示例性的竞争测定在本文中提供。
术语“不对称Fc-区”表示在根据KabatEU索引编号系统的相应位置具有不同的氨基酸残基的Fc-区多肽对。
术语“就FcRn结合而言不对称的Fc-区”表示在相应位置具有不同的氨基酸残基的两条多肽链组成的Fc-区，所述位置根据KabatEU索引编号系统确定，所述不同的位置影响Fc-区对人新生儿Fc-受体(FcRn)的结合。为了本文的目的，“就FcRn结合而言不对称的Fc-区”中两条Fc-区多肽链之间的差异不包括包括引入以促进异二聚Fc-区的形成(例如用于制备双特异的抗体)的差异。这些差异也可以是不对称的，即所述两条链在根据KabatEU索引编号系统的非对应氨基酸残基础具有差异。这些差异有利于异二聚化并减少同源二聚。这种差异的实例是所谓的“凸起-进-孔洞(knobsintoholes)”置换(参见，例如，US7,695,936和US2003/0078385)。已经发现，亚类IgG1的IgG抗体的Fc-区的个体多肽链中的以下凸起-进-孔洞置换增加异二聚体形成：1)一条链中的Y407T和另一条链中的T366Y；2)一条链中的Y407A和另一条链中的T366W；3)一条链中的F405A和另一条链中的T394W；4)一条链中的F405W和另一条链中的T394S；5)一条链中的Y407T和另一条链中的T366Y；6)一条链中的T366Y和F405A以及另一条链中的T394W和Y407T；7)一条链中的T366W和F405W以及另一条链中的T394S和Y407A；8)一条链中的F405W和Y407A以及另一条链中的T366W和T394S；和9)一条链中的T366W以及另一条链中的T366S、L368A和Y407V，其中最后列出的是特别适合的。此外，在两条Fc-区多肽链之间形成新的二硫桥的改变有利于异二聚体形成(参见，例如，US2003/0078385)。已经发现，以下导致适当间隔开的半胱氨酸残基以用于亚类IgG1的IgG抗体的Fc-区的个体多肽链中新的链内二硫键的形成的置换增加异二聚体形成：一条链中的Y349C和另一条链中的S354C；一条链中的Y349C和另一条链中的E356C；一条链中的Y349C和另一条链中的E357C；一条链中的L351C和另一条链中的S354C；一条链中的T394C和另一条链中的E397C；或一条链中的D399C和另一条链中的K392C。促进氨基酸改变的异二聚化的进一步实例是所谓的“电荷对置换”(参见，例如，WO2009/089004)。已经发现，亚类IgG1的IgG抗体的Fc-区的个体多肽链中的以下电荷对置换增加异二聚体形成：1)一条链中的K409D或K409E和另一条链中的D399K或D399R；2)一条链中的K392D或K392E和另一条链中的D399K或D399R；3)一条链中的K439D或K439E和另一条链中的E356K或E356R；4)一条链中的K370D或K370E和另一条链中的E357K或E357R；5)一条链中的K409D和K360D加上另一条链中的D399K和E356K；6)一条链中的K409D和K370D加上另一条链中的D399K和E357K；7)一条链中的K409D和K392D加上另一条链中的D399K、E356K和E357K；8)一条链中的K409D和K392D以及另一条链中的D399K；9)一条链中的K409D和K392D以及另一条链中的D399K和E356K；10)一条链中的K409D和K392D以及另一条链中的D399K和D357K；11)一条链中的K409D和K370D以及另一条链中的D399K和D357K；12)一条链中的D399K以及另一条链中的K409D和K360D；和13)一条链中的K409D和K439D以及另一条链上的D399K和E356K。
术语“结合(抗原)”表示在体内测定中抗体结合其抗原，在一个实施方案中，在结合测定中，抗体结合于表面并且抗原对抗体的结合由表面等离子共振(SPR)测量。结合意味着结合10-8M或更少的亲和力(KD)，在一些实施方案中10-13至10-8M，在一些实施方案中10-13至10-9M。
结合可以通过BIAcore测定(GEHealthcareBiosensorAB，Uppsala，Sweden)研究。结合亲和力由术语ka(抗体从抗体/抗原复合物关联的速率常数)、kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。
术语“嵌合”抗体是指其中重和/或轻链部分源自特定来源或物种，同时重和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种的抗体。
术语“CH2-结构域”表示大约从EU位置231延伸至EU位置340(根据Kabat的EU编号系统)的抗体重链多肽部分。在一个实施方案中，CH2结构域具有SEQIDNO：09的氨基酸序列：APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK。
术语“CH3-结构域”表示从EU位置341延伸至EU位置446的抗体重链多肽部分。在一个实施方案中，CH3结构域具有SEQIDNO：10的氨基酸序列：
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG。
抗体的“类型”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(亚型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“可比长度”表示，两条多肽包含相等数量的氨基酸残基或可以在长度有一个以上并且至多多至10个氨基酸残基的不同。在一个实施方案中，Fc-区多肽包含相等数量氨基酸残基或相差1至10个氨基酸残基的数量。在一个实施方案中，Fc-区多肽包含相等数量的氨基酸残基或相差1至5个氨基酸残基数量。在一个实施方案中，Fc-区多肽包含相等数量的氨基酸残基或相差1至3个氨基酸残基数量。
“效应器功能”是指可归因于抗体的Fc-区的那些生物活性，其随抗体类型改变。抗体效应器功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体-依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B-细胞受体)的下调；和B-细胞激活。
“有效量”的化学剂，例如，药物制剂，是指实现所需治疗或预防结果所需的在剂量上的并且对于特定时期有效的量。
术语“Fc-融合多肽”表示呈现所需靶向-和/或蛋白A和/或FcRn-结合活性的，结合结构域(例如抗原结合结构域如单链抗体，或多肽如受体的配体)与抗体Fc-区的融合。
术语“人源的Fc-区”表示人源免疫球蛋白重链的C-末端区，其包含至少部分铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc-区从Cys226，或从Pro230，延伸至重链的羧基-末端。在一个实施方案中，所述Fc-区具有SEQIDNO：60的氨基酸序列。然而，Fc-区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非另有说明，Fc-区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如在Kabat，E.A.，等人，SequencesofproteinofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication913242中所述。Fc-区包含两条重链Fc-区多肽，其可以通过铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接，形成多肽间二硫键。
术语“FcRn”表示人新生儿Fc-受体。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救IgG，导致清除减少和半衰期增加。FcRn是异二聚蛋白，由两条多肽组成：50kDa的I型主要组织相容性复合物-样蛋白(α-FcRn)和15kDa的β2-微球蛋白(β2m)。FcRn以高亲和力结合IgGFc-区的CH2-CH3部分。IgG和FcRn之间的相互作用是严格pH依赖的并且在1∶2化学计量发生，一个IgG通过其两条重链结合两个FcRn分子(Huber，A.H.，等人，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。FcRn结合在核内体中在酸性pH(pH＜6.5)发生并且IgG在中性细胞表面(pH大约为7.4)释放。所述相互作用的pH-敏感的性质有利于在核内体的酸性环境内通过结合受体来进行从细胞内降解摄取(pinocytose)入细胞的IgGs的FcRn介导的保护。FcRn随后促进IgG再循环到细胞表面并随后在将FcRn-IgG复合物暴露于细胞外的中性pH环境时释放到血流中。
术语“Fc-区的FcRn结合部分”表示从大约从EU位置243延伸至EU位置261和大约从EU位置275延伸至EU位置293和大约从EU位置302延伸至EU位置319和大约从EU位置336延伸至EU位置348和大约从EU位置367延伸至EU位置393和EU位置408以及大约从EU位置424延伸至EU位置440的抗体重链多肽的部分。在一个实施方案中，一种以上根据Kabat的EU编号的以下氨基酸残基被改变F243、P244、P245P、K246、P247、K248、D249、T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、E318、Y319、I336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439和S440(EU编号)。
“框架区”或“FR”是指除了高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四种FR结构域构成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中的以下序列中出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”表示具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有本文所定义的Fc-区的重链的抗体。全长抗体可以包含进一步的结构域，如例如与全长抗体的一个以上链缀合的scFv或scFab。这些缀合物也包括在术语全长抗体中。
术语“异二聚体”或“异二聚的”表示包含两条多肽链(例如长度可比的)的分子，其中所述两条多肽链具有在相应位置具有至少一种不同的氨基酸残基的氨基酸序列，所述相应位置根据Kabat的EU索引确定。
术语“同源二聚体”和“同源二聚的”表示包含两条长度可比的多肽链的分子，其中所述两条多肽链具有在相应位置相同的氨基酸序列，所述相应位置根据Kabat的EU索引确定。
本文报道的抗体或Fc-区融合多肽就其Fc-区而言可以是同源二聚的或异二聚的，其根据关注的突变或性质而确定。例如，就FcRn和/或蛋白A结合(即关注性质)而言，Fc-区(抗体)就突变H310A，H433A和Y436A(就Fc-区融合多肽或抗体的FcRn和/或蛋白A结合性质而言，这些突变得到关注)而言是同源二聚的(即两条重链Fc-区多肽都包含这些突变)，而同时，分别就突变Y349C，T366S，L368A和Y407V(因为这些突变针对重链的异二聚化并且不针对FcRn/蛋白A结合性质，这些突变不受关注)以及突变S354C和T366W(第一组仅包含在第一Fc-区多肽中，而第二组仅包含在第二Fc-区多肽中)而言，是异二聚的。此外，例如，本文所报道的Fc-区融合多肽或抗体就突变I253A，H310A，H433A，H435A和Y436A(即这些突变全部针对二聚多肽的FcRn和/或蛋白A结合性质)而言可以是异二聚的，即一个Fc-区多肽包含突变I253A，H310A和H435A，而另一Fc-区多肽包含突变H310A，H433A和Y436A。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养”可交替使用并且是指其用已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其衍生的子代(不考虑传代数)。子代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体子代包括在本文中。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生的或源自使用人抗体组库的非人来源或其它编码人抗体的序列的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。该人抗体的定义具体排除了包含非人抗原-结合残基的人源化抗体。
“人共有框架区”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架区序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架区。通常，从可变结构域序列的亚组选择人免疫球蛋白VL或VH序列。通常，序列亚组是如Kabat，E.A.等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，BethesdaMD(1991)，NIHPublication91-3242，Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如在Kabat等人(见上文)中的亚组кI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如在Kabat等人(见上文)中的亚组III。
术语“源自”表示通过在至少一个位置引入改变源自母体氨基酸序列的氨基酸序列。因此，衍生的氨基酸序列在至少一个相应位置(抗体Fc-区，根据KabatEU索引编号系统编号)不同于相应母体氨基酸序列。在一个实施方案中，源自母体氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相差一至十五个氨基酸残基。在一个实施方案中，源自母体氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相差一至十个氨基酸残基。在一个实施方案中，源自母体氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相差一至六个氨基酸残基。同样，衍生的氨基酸序列与其母体氨基酸序列具有高的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，源自母体氨基酸序列的氨基酸序列具有80％以上的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，源自母体氨基酸序列的氨基酸序列具有90％以上的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，源自母体氨基酸序列的氨基酸序列具有95％以上的氨基酸序列同一性。
术语“人Fc-区多肽”表示与“天然的”或“野生型”人Fc-区多肽相同的氨基酸序列。术语“变体(人)Fc-区多肽”表示由于至少一种“氨基酸改变”导致的源自“天然的”或“野生型”人Fc-区多肽的氨基酸序列。“人Fc-区”由两条人Fc-区多肽组成。“变体(人)Fc-区”由两条Fc-区多肽组成，可以二者均是变体(人)Fc-区多肽或一个是人Fc-区多肽并且另一个是变体(人)Fc-区多肽。
在一个实施方案中，人Fc-区多肽具有SEQIDNO：60的人IgG1Fc-区多肽，或SEQIDNO：61的人IgG2Fc-区多肽，或SEQIDNO：62的人IgG3Fc-区多肽，或SEQIDNO：63的人IgG4Fc-区多肽的氨基酸序列。在一个实施方案中，Fc-区多肽源自SEQIDNO：60，或61，或62，或63的Fc-区多肽并且与SEQIDNO：60，或61，或62，或63的Fc-区多肽相比具有至少一种氨基酸突变。在一个实施方案中，Fc-区多肽包含/具有约一至约十个氨基酸突变，并且在一个实施方案中，包含/具有约一至约五个氨基酸突变。在一个实施方案中，Fc-区多肽与SEQIDNO：60，或61，或62，或63的人Fc-区多肽具有至少约80％同源性。在一个实施方案中，Fc-区多肽与SEQIDNO：60，或61，或62，或63的人Fc-区多肽具有至少约90％同源性。在一个实施方案中，Fc-区多肽具有与SEQIDNO：60，或61，或62，或63的人Fc-区多肽具有至少约95％的同源性。
源自SEQIDNO：60，或61，或62，或63的人Fc-区多肽的Fc-区多肽由含有的氨基酸改变限定。因此，例如，术语P329G表示相对于SEQIDNO：60，或61，或62，或63的在氨基酸位置329具有脯氨酸到甘氨酸的突变的Fc-区多肽衍生的人Fc-区多肽。
如本文使用的，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat，等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号并且在本文中也称为“根据Kabat编号”。具体地，Kabat，等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于к和λ亚型的轻链恒定结构域CL并且KabatEU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1，铰链，CH2和CH3)。
人IgG1Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：60)。
具有突变L234A，L235A的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：64)。
具有Y349C，T366S，L368A和Y407V突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：65)。
具有S354C，T366W突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：66).
具有L234A，L235A突变和Y349C，T366S，L368A，Y407V突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：67).
具有L234A，L235A和S354C，T366W突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：68).
具有P329G突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：69).
具有L234A，L235A突变和P329G突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：70).
具有P329G突变和Y349C，T366S，L368A，Y407V突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：71).
具有P329G突变和S354C，T366W突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：72).
具有L234A，L235A，P329G和Y349C，T366S，L368A，Y407V突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：73).
具有L234A，L235A，P329G突变和S354C，T366W突变的人IgG1Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：74).
人IgG4Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：63).
具有S228P和L235E突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：75).
具有S228P，L235E突变和P329G突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：76).
具有S354C，T366W突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：77).
具有Y349C，T366S，L368A，Y407V突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：78).
具有S228P，L235E和S354C，T366W突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：79).
具有S228P，L235E和Y349C，T366S，L368A，Y407V突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：80).
具有P329G突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：81).
具有P329G和Y349C，T366S，L368A，Y407V突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：82).
具有P329G和S354C，T366W突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：83).
具有S228P，L235E，P329G和Y349C，T366S，L368A，Y407V突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：84).
具有S228P，L235E，P329G和S354C，T366W突变的人IgG4Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO：85).
不同的人Fc-区的比对在下文显示(EU编号)：
“人源化”抗体是指包含来自非人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个，和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVRs(例如，CDRs)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有FRs对应于人抗体的那些。人源化抗体可以任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少部分。抗体，例如，非人抗体的“人源化形式”是指经历人源化的抗体。
如本文使用的术语“高变区”或“HVR”，是指抗体可变结构域中序列高变的各个区(“互补决定区”或“CDRs”)并且形成结构限定的环(“高变环”)，和/或含有与抗原接触的残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVRs；三个在VH中(H1，H2，H3)，并且三个在VL(L1，L2，L3)中。本文指示的的HVR包括
(a)在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)处存在的高变环(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)处存在的CDRs(Kabat，E.A.等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication91-3242.)；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)处存在的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，其包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
在一个实施方案中，HVR残基包含在说明书其它地方鉴定的那些。
除非另有记载，HVR残基和可变结构域中的其它残基(例如，FR残基)在本文中根据KabatEU索引编号系统(Kabat等人，见上文)编号。
除非另有记载，如本文使用的术语“IGF-1R”，是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)的任意天然的IGF-1R。术语包括“全长”，未加工的IGF-1R以及由细胞中加工产生的IGF-1R的任意形式。术语还包括IGF-1R的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。人IGF-1R的氨基酸序列显示在SEQIDNO：11中。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)，兔，和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
“分离的”抗体从其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过，例如，电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，尺寸排阻层析或离子交换或反相HPLC)确定。对于评价抗体纯度的方法的总数，参见，例如，Flatman，S.等人，J.Chrom.B848(2007)79-87。
“分离的”核酸是指从其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位点的染色体位点。
“编码抗-IGF-1R抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种以上核酸分子，包括在单个质粒或分开的质粒中一个或多个核酸分子，和存在于宿主细胞中一个以上位置的核酸分子。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，包含个体抗体的群体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体，例如，包含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的制备期间产生，这种变体通常以小量存在。与通常包括针对不同的决定簇(表位)的不同的抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的各个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明所述抗体的特征为获自基本上同源的抗体群体，并且不被认为需要通过任何特定的方法制备抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和使用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这种方法和其它制备单克隆抗体的示例性方法在本文描述。
“天然的抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然的IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚的糖蛋白，由二硫键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-至C-末端，各个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，接着三个恒定结构域(CH1，CH2，和CH3)。类似的，从N-至C-末端，各个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，接着恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以分为两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。
使用术语“包装说明书”，是指治疗性产品的商业包装中通常包括的使用说明，其包含关于有关使用这种治疗性产品的适应症、使用、剂量、施用、联合治疗、禁忌和/或告诫。
就参考多肽序列而言的“百分数(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列和引入缺口后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数，如果需要，用以获得最大百分数序列同一性，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的部分。为了确定百分数氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括获得跨比对的序列全长的最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创造，并且源代码已经在美国版权局，WashingtonD.C.，20559以用户文档归档，其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可以从Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California公开获得，或可以从源代码编辑。应该编辑ALIGN-2程序以在UNIX操作系统，包括数字UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对，与，或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地叙述为相对，与，或针对氨基酸序列B具有或包含某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
100乘以分数X/Y
其中X是通过序列比对程序ALIGN-2，在该程序的A和B的比对中得分为完全匹配的氨基酸残基数量，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值使用ALIGN-2计算机程序，如上一段描述的获得。
术语″药物制剂″是指使得包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式的制剂，并且所述制剂不含有对于制剂要施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。
“药用载体”是指药物制剂中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药用载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文使用的术语“肽接头”表示具有氨基酸序列的肽，在一个实施方案中，其是合成来源的。在一个实施方案中，肽接头是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，在一个实施方案中，是具有32至50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是具有32至40个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n，G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8，9或10)或(x＝4并且n＝6，7或8)，在一个实施方案中，x＝4，n＝6或7，在一个实施方案中，x＝4，n＝7。在一个实施方案中，肽接头是(G4S)6G2。
如本文使用的术语“重组抗体”，表示通过重组方式制备、表达、形成或分离的所有抗体(嵌合，人源化和人)。这包括分离自宿主细胞如NS0或CHO细胞或分离自对于人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)的抗体或转染入宿主细胞中的重组表达质粒表达的抗体。这种重组抗体具有重组形式的可变结构域和恒定区。本文报道的重组抗体可以进行体内体细胞超变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是在源自和与人生殖系VH和VL序列相关时，可以不天然存在在体内人抗体生殖系组库内的序列。
如本文使用的，“治疗(treatment)”(及其语法的变化形式如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变治疗的个体的天然过程的临床干预，并且可以进行，以用于预防或在临床病例过程中使用。治疗的所需效果包括，但不限于，防止疾病的发生或复发，缓解症状，减少疾病的直接或间接的病例结果，防止转移，减小疾病进程速率，改善或减轻疾病状态，和缓和或改善的预后。在一些实施方案中，本文报道的抗体或Fc-区融合多肽用于延迟疾病的发展或减缓疾病进展。
本申请中使用的术语“化合价的”表示(抗体)分子中存在结合位点的指定数量。这样，术语“双价”，“四价”，和“六价”表示在(抗体)分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。本文报道的双特异的抗体为一个优选的实施方案“双价”。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中涉及抗体对其抗原的结合的结构域。抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有类似的结构，各个结构域包含四个框架区(FRs)和三个高变区(HVRs)(参见，例如，Kindt，T.J.等人KubyImmunology，第6版，W.H.FreemanandCo.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原-结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体分离，以分别筛选互补VL或VH结构域文库。参见，例如，Portolano，S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等人，Nature352(1991)624-628)。
术语“眼血管疾病”包括，但不限于眼内新生血管综合征(intraocularneovascularsyndromes)如糖尿病视网膜病(diabeticretinopathy)，糖尿病黄斑水肿(diabeticmacularedema)，早产儿视网膜病(retinopathyofprematurity)，新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)，视网膜静脉闭塞(retinalveinocclusions)，视网膜中央静脉闭塞(centralretinalveinocclusions)，黄斑变性(maculardegeneration)，年龄相关黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration)，色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)，视网膜血管瘤样增生(retinalangiomatousproliferation)，黄斑毛细血管扩张症(maculartelangectasia)，缺血性视网膜病(ischemicretinopathy)，虹膜新生血管形成(irisneovascularization)，眼内新生血管形成(intraocularneovascularization)，角膜新生血管形成(cornealneovascularization)，视网膜新生血管形成(retinalneovascularization)，脉络膜新生血管形成(choroidalneovascularization)，和视网膜变性(retinaldegeneration)(参见例如Garner，A.，Vasculardiseases，In：Pathobiologyofoculardisease，Adynamicapproach，Garner，A.，和Klintworth，G.K.，(编辑)，第2版，MarcelDekker，NewYork(1994)，pp.1625-1710)。
如本文使用的术语“质粒”，是指能够扩增其连接的另一核酸的核酸分子。术语包括作为自我复制的核酸结构的质粒以及并入将其引入其中的宿主细胞的基因组中的质粒。某些质粒能够引导可操作连接于其的核酸的表达。这种质粒在本文被称为“表达质粒”。
术语“VEGF”如本文使用的是指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)，165-氨基酸人血管内皮细胞生长因子(人VEGF165：SEQIDNO：30的前体序列的氨基酸27-191；氨基酸1-26代表信号肽)，和相关的121，189，和206血管内皮细胞生长因子同种型，如由Leung，D.W.，等人，Science246(1989)1306-1309；Houck等人，Mol.Endocrin.5(1991)1806-1814；Keck，P.J.，等人，Science246(1989)1309-1312和Connolly，D.T.，等人，J.Biol.Chem.264(1989)20017-20024描述的；连同这些生长因子的天然存在的等位基因和加工的形式。VEGF参与与肿瘤和眼内疾病相关的正常和异常血管发生和新生血管形成的调节(Ferrara，N.，等人，Endocrin.Rev.18(1997)4-25；Berkman，R.A.，等人，J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown，L.F.，等人，HumanPathol.26(1995)86-91；Brown，L.F.，等人，CancerRes.53(1993)4727-4735；Mattern，J.，等人，Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；以及Dvorak，H.F.，等人，Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是同源二聚的糖蛋白，其已经从多种来源分离并且包括多种同种型。VEGF显示高度特异的针对内皮细胞的促有丝分裂活性。
如本文使用的术语“具有(所述)突变IHH-AAA”是指突变I253A(Ile253Ala)，H310A(His310Ala)，和H435A(His435Ala)的组合并且如本文使用的术语“具有(所述)突变HHY-AAA”是指突变H310A(His310Ala)，H433A(His433Ala)，和Y436A(Tyr436Ala)的组合并且如本文使用的术语“具有(所述)突变YTE”是指IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中突变M252Y(Met252Tyr)，S254T(Ser254Thr)，和T256E(Thr256Glu)的组合，其中编号根据Kabat的EU索引。
如本文使用的术语“具有(所述)突变P329GLALA”是指IgG1亚类的恒定重链区中突变L234A(Leu234Ala)，L235A(Leu235Ala)和P329G(Pro329Gly)的组合，其中编号根据Kabat的EU索引。如本文使用的术语“具有(所述)突变SPLE”是指IgG4亚类的恒定重链区中突变S228P(Ser228Pro)和L235E(Leu235Glu)的组合，其中编号根据Kabat的EU索引。如本文使用的术语“具有(所述)突变SPLE和P329G”是指IgG4亚类的恒定重链区中突变S228P(Ser228Pro)，L235E(Leu235Glu)和P329G(Pro329Gly)的组合，其中编号根据Kabat的EU索引。
II.组合物和方法
本发明至少部分基于这样的研究结果，用于玻璃体内施用的不具有FcRn-结合的抗体是有益的，因为，与具有FcRn-结合的抗体相比，这些抗体在眼中不具有基本上改变的半衰期，但从全身血液循环中快速清除，不产生或产生非常有限的眼外系统性副作用。本文报道的抗体可用于，例如，诊断或治疗眼血管疾病。
本发明至少部分基于这样的研究结果，影响免疫球蛋白Fc-区与新生儿Fc-受体(FcRn)的结合，即减少或甚至消除Fc-区对FcRn的结合的特定突变或突变的组合，不同时消除Fc-区对葡萄球菌蛋白A的结合。这对可以用作例如非特异的纯化过程具有严重影响，并且需要物种限制的亲和层析材料，如例如仅结合包含κ轻链的抗体KappaSelectTM。因此，利用本文报道的突变，可能同时减少或甚至消除对FcRn的结合，同时维持对蛋白A的结合。
本发明至少部分基于这样的研究结果，通过使用Fc-区的各个Fc-区多肽中的不同的突变，可以提供具有定制的FcRn-结合的异二聚的分子，如例如双特异性抗体并且可以随其提供具有定制的半衰期的抗体。
本发明至少部分基于这样的研究结果，通过使用Fc-区的各个Fc-区多肽中的不同的突变，可以提供一方面具有减小的或甚至消除的对FcRn的结合，另一方面维持对葡萄球菌蛋白A的结合能力的异二聚的分子，如例如双特异性抗体。该对蛋白A的结合可以用于从同源二聚的副产物中分离所述异二聚的抗体。例如通过使用凸起-进-孔洞方法将一条Fc-区多肽中的突变I253A，H310A和H435A与另一Fc-区多肽中的突变H310A，H433A和Y436A组合，可以获得一方面不结合FcRn(就人FcRn而言，两组突变是沉默的)，但维持对葡萄球菌蛋白A的结合的异二聚的Fc-区(具有突变I253A，H310A和H435A的Fc-区多肽不结合FcRn并且不结合蛋白A，然而，具有突变H310A，H433A和Y436A的Fc-区多肽不结合FcRn但仍然结合蛋白A)。因此，标准蛋白A亲和层析可以用于移除同源二聚的孔洞-孔洞副产物，因为这不再结合蛋白A。因此，通过将凸起-进-孔洞方法与孔洞链中的突变I253A，H310A和H435A和凸起链中的突变H310A，H433A和Y436A组合，可以促进来自同源二聚的孔洞-孔洞副产物的异二聚的凸起-进-孔洞产物的纯化/分离。
突变I253A，H310A，H435A，或L251D，L314D，L432D，或L251S，L314S，L432S的组合导致对蛋白A的结合的丧失，然而突变I253A，H310A，H435A，或H310A，H433A，Y436A，或L251D，L314D，L432D的组合导致对人新生儿Fc受体的结合的丧失。
以下表提供了Fc-区中参与相互作用或被改变以改变相互作用的氨基酸残基的示例性概览。
本文报道的修饰/突变改变一种以上Fc受体如人FcRn的结合特异性。同时一些改变对人FcRn的结合的突变不改变对蛋白A的结合。
在具体的实施方案中，与缺少这些突变的相应抗体相比，所述突变改变或基本上改变抗体的血清半衰期。
在进一步的具体的实施方案中，与缺少这些突变的相应抗体相比，突变还不改变或基本上不改变抗体对蛋白A的结合。
A.新生儿Fc-受体(FcRn)
新生儿Fc-受体(FcRn)对于IgG类型的抗体的体内代谢归宿而言是重要的。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救野生型IgG，导致清除减少和半衰期增加。其是异二聚蛋白，由两条多肽组成：50kDa的I型主要组织相容性复合物-样蛋白(α-FcRn)和15kDa的β2-微球蛋白(β2m)。FcRn以高亲和力结合IgG类的抗体的Fc-区的CH2-CH3部分。IgG型抗体和FcRn之间的相互作用是pH依赖性的并且以1∶2化学计量发生，即一个IgG可以通过其两条重链Fc-区多肽与两个FcRn分子相互作用(参见例如Huber，A.H.，等人，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。
因此，IgGs体内FcRn结合性质/特性指征血液循环中的体内药代动力学性质。
在FcRn和IgG型抗体的Fc-区之间的相互作用中，重链CH2-和CH3-结构域的不同的氨基酸残基参与。与FcRn相互作用的氨基酸残基位于大约EU位置243和EU位置261之间，大约EU位置275和EU位置293之间，大约EU位置302和EU位置319之间，大约EU位置336和EU位置348之间，大约EU位置367和EU位置393之间，在EU位置408处，和大约EU位置424和EU位置440之间。更具体地，以下根据Kabat的EU编号的氨基酸残基参与Fc-区和FcRn之间的相互作用：F243、P244、P245P、K246、P247、K248、D249、T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、E318、Y319、I336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439和S440。
针对位点的诱变研究已经表明，IgGs的Fc-区对于FcRn的关键结合位点是组氨酸310，组氨酸435，和异亮氨酸253并且在较小程度上是组氨酸433和酪氨酸436(参见例如Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2825；Raghavan，M.，等人，Biochem.34(1995)14649-146579；Medesan，C.，等人，JImmunol.158(1997)2211-2217)。
增加IgG对FcRn的结合的方法已经通过在多种氨基酸残基处突变IgG来进行：苏氨酸250、蛋氨酸252、丝氨酸254、苏氨酸256、苏氨酸307、谷氨酸380、蛋氨酸428、组氨酸433和天冬酰胺434(参见Kuo，T.T.，等人，J.Clin.Immunol.30(2010)777-789)。
在一些情况下，需要在血液循环中具有减小的半衰期的抗体。例如，玻璃体内施用的药物在患者的眼中应该具有长的半衰期并且在患者的循环中应该具有短的半衰期。这种抗体还具有例如在眼中增加的对疾病位点的暴露的优点。
已知影响FcRn结合和随之的在血液循环中的半衰期的不同的突变。已经通过针对位点的诱变鉴定了对于小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc-区残基(参见例如Dall’Acqua，W.F.，等人J.Immunol169(2002)5171-5180)。残基I253，H310，H433，N434，和H435(根据KabatEU编号)参与所述相互作用(Medesan，C.，等人，Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan，M.，等人，Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.24(1994)542-548)。发现，残基I253，H310，和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用是关键的(Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2825)。Dall’Acqua等人通过蛋白-蛋白相互作用研究描述了，残基M252Y，S254T，T256E改善FcRn结合(Dall′Acqua，W.F.，等人J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。人Fc-人FcRn复合物的研究表明，残基I253，S254，H435，和Y436对于相互作用是关键的(Firan，M.，等人，Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields，R.L.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung，Y.A.，等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中，报道和检测了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。示例性突变及其对FcRn结合的效果列在下表中。
表.
已经发现，一个Fc-区多肽中一侧的突变足以显著弱化对FcRn的结合。引入Fc-区的突变越多，对FcRn的结合变得越弱。但是一侧的不对称突变不足以完全抑制FcRn结合。两侧的突变是完全抑制FcRn结合所必需的。
对称改造IgG1Fc-区以影响FcRn结合的结果显示在下表中(列出突变和在FcRn-亲和层析柱上的保留时间)。
表.
低于3分钟的保留时间对应于无结合，因为物质在流过液中(空隙峰(voidpeak))。
单个突变H310A是缺失任何FcRn-结合的最沉默的对称突变。
对称单突变I253A和H435A导致0.3-0.4min的保留时间的相对变换。这通常可以被认为是不可检测的结合。
单突变Y436A导致可检测的对FcRn亲和柱的相互作用强度。不受该理论限制，该突变可以具有可以与零相互作用如突变I253A，H310A和H435A的组合(IHH-AAA突变)相区分的FcRn介导的半衰期。
获自对称修饰的抗-HER2抗体的结果提供在下表中(参见用于参考的WO2006/031370)。
表.
在Fc-区中引入不对称的影响FcRn-结合的突变的效果以使用凸起-进-孔洞技术组装的双特异性抗-VEGF/ANG-2抗体为例证(参见例如US7,695,936，US2003/0078385；“孔洞链”突变：S354C/T366W，“凸起链”突变：Y349C/T366S/L368A/Y407V)。使用FcRn亲和层析方法可以容易地确定引入的突变对FcRn-结合的影响(参见图9和下表)。从FcRn亲和柱上较晚洗脱的，即在FcRn亲和柱上具有较长保留时间的抗体，具有更长的体内半衰期，并且反之亦然。
表.
在Fc-区中引入不对称的影响FcRn-结合的突变的效果进一步以使用凸起-进-孔洞技术组装以引入不对称突变的单特异性抗-IGF-1R抗体为例证，(参见例如US7,695,936，US2003/0078385；“孔洞链”突变：S354C/T366W，“凸起链”突变：Y349C/T366S/L368A/Y407V)。可以使用FcRn亲和层析方法容易地确定引入的突变对FcRn-结合的影响(参见下表)。从FcRn亲和柱上较晚洗脱的，即在FcRn亲和柱上具有较长保留时间的抗体，具有更长的体内半衰期，并且反之亦然。
表.
不对称IHH-AAA-和LLL-DDD-突变(LLL-DDD-突变＝L251D，L314D和L432D)显示比相应母体或野生型抗体更弱的结合。
对称的HHY-AAA突变(＝突变H310A，H433A和Y436A的组合)导致Fc-区不再结合人FcRn，然而维持对蛋白A的结合(参见图11，12，13和14)。
在Fc-区中引入不对称的影响FcRn-结合的突变的效果进一步以使用凸起-进-孔洞技术以允许引入不对称突变来组装的单特异性抗-IGF-1R抗体(IGF-1R)，双特异性抗-VEGF/ANG-2抗体(VEGF/ANG2)，和在两条重链的C-末端具有融合的全长抗体(融合)为例证(参见例如US7,695,936，US2003/0078385；“孔洞链”突变：S354C/T366W，“凸起链”突变：Y349C/T366S/L368A/Y407V)。可以使用FcRn亲和层析方法、蛋白A亲和层析方法和基于SPR的方法容易地确定引入的突变对FcRn-结合和蛋白A结合的影响(参见下表)。
本文所报道的一个方面是包含本文报道的变体人IgG型Fc-区的抗体。
所述Fc-区多肽赋予所述抗体或其融合配偶体上述特性。
所述融合配偶体可以是任何具有生物活性的，体内半衰期可以减少或增加的，即体内半衰期可以为其预定应用明确限定并且定制的分子。
Fc-区融合多肽可以包含例如本文报道的变体(人)IgG型Fc-区和结合靶包括配体，如，例如，TNFR-Fc-区融合多肽(TNFR＝人肿瘤坏死因子受体)，或IL-1R-Fc-区融合多肽(IL-1R＝人白细胞介素-1受体)，或VEGFR-Fc-区融合多肽(VEGFR＝人血管内皮生长因子受体)，或ANG2R-Fc-区融合多肽(ANG2R＝人血管生成素2受体)的受体蛋白。
Fc-区融合多肽可以包含例如本文报道的变体(人)IgG型Fc-区和结合靶包括，如，例如，抗体Fab片段，scFvs(参见例如Nat.Biotechnol.23(2005)1126-1136)，或结构域抗体(dAbs)(参见例如WO2004/058821，和WO2003/002609)的抗体片段。
Fc-区融合多肽可以包含例如本文报道的变体(人)IgG型Fc-区和受体配体(天然存在的或人工的)。
B.眼血管疾病
眼血管病症是指任意这样的病理性病况，其特征在于改变的或失控的新血管增生和侵入到眼组织(如视网膜或角膜)的结构中。
在一个实施方案中，所述眼血管疾病选自由下述组成的组：湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)，干性年龄相关的黄斑变性(干性AMD)，糖尿病性黄斑水肿(DME)，囊样黄斑水肿(cystoidmacularedema，CME)，非增生性糖尿病性视网膜病变(non-proliferativediabeticretinopathy，NPDR)，增生性糖尿病性视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy，PDR)，囊样黄斑水肿，血管炎(vasculitis)(例如，视网膜中央静脉闭塞)，视盘水肿(papilloedema)，视网膜炎(retinitis)，结膜炎(conjunctivitis)，葡萄膜炎(uveitis)，脉络膜炎(choroiditis)，多病灶性脉络膜炎(multifocalchoroiditis)，眼组织胞浆菌病(ocularhistoplasmosis)，眼睑炎(blepharitis)，干眼症(dryeye)(舍格伦病(Sjogren′sdisease))和其他眼科疾病，其中所述眼病或病症与眼部新生血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿相关。
本文报道的抗体用于预防和治疗湿性AMD、干性AMD、CME、DME、NPDR、PDR、眼睑炎、干眼症和葡萄膜炎，还在一个优选的实施方案中是湿性AMD、干性AMD、眼睑炎和干眼症，还在一个优选的实施方案中是CME、DME、NPDR和PDR，还在一个优选的实施方案中是眼睑炎和干眼症，特别是湿性AMD和干性AMD，并且还特别是湿性AMD。
在一些实施方案中，所述眼血管疾病选自由湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病和糖尿病性视网膜病变组成的组。
与角膜新生血管化相关的其他疾病包括，但不限于，流行性角结膜炎(epidemickeratoconjunctivitis)，维生素A缺乏病(VitaminAdeficiency)，隐形眼镜佩带过度(contactlensoverwear)，变应性角膜炎(atopickeratitis)，高级边缘性角膜炎(superiorlimbickeratitis)，翼状胬肉干燥性角膜炎(pterygiumkeratitissicca)，舍格伦病(Sjogren’s)，红斑痤疮(acnerosacea)，phylectenulosis，梅毒(syphilis)，分枝杆菌感染(Mycobacteriainfections)，脂质变性(lipiddegeneration)，化学灼伤(chemicalburns)，细菌性溃疡(bacterialulcers)，真菌性溃疡(fungalulcers)，单纯疱疹感染(Herpessimplexinfections)，带状疱疹感染(Herpeszosterinfections)，原虫感染(protozoaninfections)，卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)，莫伦溃疡(Moorenulcer)，Terrien′s边缘变性(Terrien′smarginaldegeneration)，边缘性角质层分离(mariginalkeratolysis)，类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)，全身性红斑狼疮(systemiclupus)，多动脉炎(polyarteritis)，外伤(trauma)，韦格纳结节病(Wegener’ssarcoidosis)，巩膜炎(Scleritis)，史蒂文斯约翰逊病(Steven′sJohnsondisease)，periphigoid放射状角膜切开(periphigoidradialkeratotomy)和角膜移植排斥(cornealgraphrejection)。
与视网膜/脉络膜新血管生成相关的疾病包括，但不限于，糖尿病性视网膜病变，黄斑变性，镰状细胞性贫血(sicklecellanemia)，结节病(sarcoid)，梅毒(syphilis)，弹性假黄色瘤(pseudoxanthomaelasticum)，佩吉特病(Paget’sdisease)，静脉闭塞(veinocclusion)，动脉闭塞(arteryocclusion)，颈动脉闭塞病(carotidobstructivedisease)，慢性葡萄膜炎/玻璃体炎(chronicuveitis/vitritis)，分枝杆菌感染(mycobacterialinfections)，莱姆病(Lyme′sdisease)，全身性红斑性狼疮(systemiclupuserythematosis)，早产儿视网膜病，色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)，视网膜水肿(retinaedema)(包括黄斑水肿)，伊尔斯病(Eale’sdisease)，Bechet病(Bechet’sdisease)，引起视网膜炎或脉络膜炎的感染(infectionscausingaretinitisorchoroiditis)，假定的眼组织胞浆菌病(presumedocularhistoplasmosis)，贝斯特病(Best’sdisease)，近视(myopia)，视窝(opticpits)，斯达加特病(Stargart’sdisease)，睫状体扁平部炎(parsplanitis)，慢性视网膜脱离(chronicretinaldetachment)，高粘稠度综合征(hyperviscositysyndromes)弓形体病(toxoplasmosis)，外伤和激光后综合症(post-lasercomplications)。
其他疾病包括，但不限于，与潮红(角的新生血管形成)相关的疾病和由纤维血管或纤维组织的异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。
早产儿视网膜病(ROP)是一种影响早产儿的眼部疾病。认为其由视网膜血管的无组织性生长引起，其可能导致瘢痕和视网膜脱落。ROP可以是轻度的，并且可以自然治愈，但是在严重的病例可能导致失明。因此，所有早产儿都有ROP的危险，并且非常低的出生体重是另外的危险因素。氧中毒和相关的缺氧都可能促进ROP的发展。
黄斑变性是一种主要在老年人中发现的医学病症，其中被称为视网膜黄斑区域的眼睛的内衬中心变薄、萎缩，并且在一些情形中，出血。这可能导致中央视觉的丧失，这使得不能看到更详细的东西，不能阅读，或者不能辨识面部。依据美国眼科学会，其是当代美国年龄大于五十岁的人们中的中央视觉丧失(失明)的主要原因。尽管一些影响年轻人的黄斑营养不良(maculardystrophies)有时也称为黄斑变性，但是该术语通常是指年龄相关的黄斑变性(AMD或ARMD)。
年龄相关的黄斑变性从在视网膜色素上皮与其下的脉络膜之间的黄斑(提供详细的中央视觉的视网膜中央区域，称为小窝)中的特征性的黄色沉积(称为玻璃疣)开始。大部分具有这些早期改变(称为年龄相关的黄斑病变(maculopathy))的人们具有良好的视力。具有玻璃疣的人们可以继续发展晚期AMD。当玻璃疣变大并且变多，并且与在斑下的色素细胞层中的紊乱相关时，危险是相当高的。大且软的玻璃疣与升高的胆固醇沉积相关，并且可能响应降胆固醇剂或RheoProcedure。
导致深入的视觉丧失的晚期AMD具有两种形式：干性的和湿性的。中央萎缩，即，干性形式的晚期AMD，由在视网膜下的视网膜色素上皮层的萎缩导致，其通过丧失在眼睛中央部分的光感受器(杆状和锥体)而引起视觉丧失。尽管对于这种病况没有可用的治疗，但是国家眼科研究所(NationalEyeInstitute)和其他机构已经证明使用高剂量的抗氧化剂、叶黄素和玉米黄素的维生素补充减缓干性黄斑变性的进展，并且在一些患者中，改善视敏度。
色素性视网膜炎(RP)是一组遗传性眼病。在RP症状的进展过程中，夜盲症(nightblindness)通常在视野收缩(tunnelvision)之前数年或甚至几十年发生。许多患有RP的人直到他们四十多岁或五十多岁时才变成法定意义上的失明，并且终生保留些许视力。其他人由RP发展至完全失明，在一些情形中，早在儿童期就发展至完全的失明。RP的进展在每个病例中都是不同的。RP是一种类型的遗传性视网膜营养不良，一组遗传性病症，其中光感受器(杆状和锥体)或视网膜的视网膜色素上皮(RPE)的异常导致进展性的视觉丧失。患病的个体首先经历缺陷性的暗适应(defectivedarkadaptation)或夜盲(nyctalopia)(夜盲症)，之后是周边视野减少(称为管状视(tunnelvision))，并且有时在该疾病的过程晚期丧失中央视觉。
当流体和蛋白沉积集中在眼睛的黄斑上或之下使其变厚和肿胀时发生黄斑水肿，黄斑是视网膜的黄色中央区域。肿胀可以使人的中央视觉扭曲，原因在于黄斑位于眼球后部视网膜的中心附近。该区域容纳紧密包装的视网膜椎体，其提供灵敏清楚的中央视觉允许人们看清直接在视线上的形式、颜色和详情。囊样黄斑水肿是一种类型的包括包囊形成的黄斑水肿。
C.示例性抗体
在一个方面，本发明提供分离的消除对FcRn-结合的抗体，即这些抗体以与在Fc-区，即在两条Fc-区多肽中具有突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)的抗体相比，相当或更少的亲和力结合人FcRn。
本文报道的一种示例性的抗体是消除对FcRn的结合并且包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，其中
i)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变I253A，H310A和H435A，或
ii)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变H310A，H433A和Y436A，或
iii)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变L251D，L314D和L432D，或
iv)所述第一Fc-区多肽包含突变I253A，H310A和H435A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变H310A，H433A和Y436A，或
b)突变L251D，L314D和L432D，
或
vi)所述第一Fc-区多肽包含突变H310A，H433A和Y436A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变L251D，L314D和L432D。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不特异结合人FcRn。在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不特异结合葡萄球菌蛋白A。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体不特异结合人FcRn。在所有方面的一个实施方案中，所述抗体特异结合葡萄球菌蛋白A。
在所有方面的一个实施方案中，所述第二Fc-区多肽还包含突变Y349C，T366S，L368A和Y407V(“孔洞”)并且第一Fc-区多肽还包含突变S354C和T366W(“凸起”)。
在所有方面的一个实施方案中，所述Fc-区多肽是人IgG1亚类的。在一个实施方案中，所述第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽还包含突变L234A和L235A。在一个实施方案中，所述第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽还包含突变P329G。
在所有方面的一个实施方案中，Fc-区多肽是人IgG4亚类的。在一个实施方案中，第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽还包含突变S228P和L235E。在一个实施方案中，第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽还包含突变P329G。
在一个实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有一个特异结合人ANG-2的结合特异性和一个特异结合人VEGF的结合特异性。
本文报道的一种示例性的抗体和本发明的另一个方面是消除对FcRn的结合的双特异性双价抗体，其包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：14的CDR3H区，SEQIDNO：15的CDR2H区，和SEQIDNO：16的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：17的CDR3L区，SEQIDNO：18的CDR2L区，和SEQIDNO：19的CDR1L区，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：22的CDR3H区，SEQIDNO：23的CDR2H区，和SEQIDNO：24的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：25的CDR3L区，SEQIDNO：26的CDR2L区，和SEQIDNO：27的CDR1L区，
并且其中
iii)所述双特异性抗体包含具有二者都是人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的IgG型Fc-区，其在第一Fc-区多肽中包含一种或两种选自以下各组的突变：i)组I253A，H310A和H435A，或ii)组H310A，H433A和Y436A，或iii)组L251D，L314D和L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)并且在第二Fc-区多肽中包含一种或两种选自包含突变L251D，I253A，H310A，L314D，L432D，H433A，H435A和Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)的组的突变，使得所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变当一起时导致突变i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D包含在IgG型Fc-区中。
在所有方面的一个实施方案中，IgG型Fc-区是变体(人)IgG型Fc-区。在一个实施方案中，变体(人)IgG型Fc-区是IgG型异二聚的Fc-区。
在所有方面的一个实施方案中第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽配对形成(功能的)IgG型Fc-区，导致异二聚体的形成。
在一个实施方案中，人Fc-区多肽是IgG1亚类或IgG4亚类的人Fc-区多肽。
在一个实施方案中，人Fc-区多肽是具有突变L234A，L235A和P329G的IgG1亚类的人Fc-区多肽。
在一个实施方案中，人Fc-区多肽是具有突变S228P和L235E的IgG4亚类的人Fc-区多肽。
在一个实施方案中，第一Fc-区多肽还包含突变S354C和T366W并且第二Fc-区多肽还包含突变Y349C，T366S，L368A和Y407V。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQIDNO：20的氨基酸序列作为重链可变结构域VH和SEQIDNO：21的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQIDNO：28的氨基酸序列作为重链可变结构域VH和SEQIDNO：29的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于，iii)的Fc-区是人IgG1亚类的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于，人IgG1亚类的Fc-区还包含突变L234A，L235A和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，第一Fc-区多肽还包含突变S354C和T366W并且第二Fc-区多肽还包含突变Y349C，T366S，L368A和Y407V。在一个实施方案中，第一Fc-区多肽还包含突变Y349C和T366W并且第二Fc-区多肽还包含突变S354C，T366S，L368A和Y407V。
在一个实施方案中，双特异性抗体特征在于iii)的Fc-区是人IgG4亚类的。在一个实施方案中，双特异性抗体特征在于人IgG4亚类的Fc-区还包含突变S228P和L235E(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，双特异性抗体特征在于人IgG4亚类的Fc-区还包含突变S228P，L235E和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，第一Fc-区多肽还包含突变S354C和T366W并且第二Fc-区多肽还包含突变Y349C，T366S，L368A和Y407V。在一个实施方案中，第一Fc-区多肽还包含突变Y349C和T366W并且第二Fc-区多肽还包含突变S354C，T366S，L368A和Y407V。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含具有二者都是人IgG1或人IgG4亚类(即源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的Fc-区，其在第一Fc-区多肽中包含一种或两种选自以下各组的突变：i)组I253A，H310A和H435A，或ii)组H310A，H433A和Y436A，或iii)组L251D，L314D和L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)并且在第二Fc-区多肽中包含一种或两种选自包含突变L251D，I253A，H310A，L314D，L432D，H433A，H435A和Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)的组的突变，使得所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在一起时导致突变i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D包含在Fc-区中。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含具有二者都是人IgG1或人IgG4亚类(即源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的Fc-区，其在Fc-区中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)，从而所有突变都在第一或第二Fc-区多肽中，或一种或两种突变在第一Fc-区多肽中并且一种或两种突变在第二Fc-区多肽中，使得所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在一起时导致突变i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D包含在Fc-区中。
本文报道的另一个方面是包含所述双特异性抗体的药物制剂，用于治疗眼血管疾病的药物制剂，所述双特异性抗体用于制备治疗眼血管疾病的药物的用途，通过向需要这种治疗的患者施用所述双特异性抗体治疗患有眼血管疾病的患者的方法。在一个实施方案中，所述双特异性抗体或包含双特异性抗体的药物制剂通过玻璃体内施用给药。
根据本发明的进一步方面是编码本文报道的双特异性抗体的重和/或轻链的核酸分子。
本发明还提供包含本文报道的核酸的表达质粒，所述表达质粒能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸，并且提供包含这种质粒的宿主细胞，所述宿主细胞用于重组生产本文报道的双特异性抗体。
本发明还包括包含本文报道的质粒的原核或真核宿主细胞。
本发明还包含用于生产本文报道的双特异性抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达本文报道的核酸，并且从所述细胞或细胞培养物上清中回收所述双特异性抗体。一个实施方案是用于制备本文报道的双特异性抗体的方法，所述方法包括下述步骤：
a)用包含编码所述抗体的核酸分子的质粒转化宿主细胞；
b)在允许合成所述抗体的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从所述培养物回收所述抗体。
本发明还包括通过这种用于生产双特异性抗体的方法获得的抗体。
本文报道的抗体由于其在Fc中的特异性修饰而具有高度有价值的特性，所述特异性修饰引起对患有眼血管疾病的患者的益处。其在玻璃体内环境中显示高度的稳定性和从眼睛的缓慢扩散(与不具有恒定重链区的较小的抗体片段相比)，其中实际的疾病位于此并且在此处治疗(因此，与非全长IgG样抗体，如例如，Fab和(Fab)2片段相比，治疗时间安排可能得到改善)。另一方面，本文报道的抗体非常快速地从血清中清除(对于减少由系统性暴露引起的潜在的副作用这是高度合乎需要的)。令人吃惊地，它们还表现出较低的粘性(参见图2)(与在恒定区不具有突变I253A、H310A和H435A的版本相比)，并且因此在眼部疾病的治疗过程中特别有效的用于通过细针进行玻璃体内应用(对于此类应用，典型地使用细针进行，并且高粘性使得适当的应用变得相当困难)。所述较低的粘性还允许更高浓度的制剂。还令人吃惊地，本文报道的抗体在储存过程中表现出较低的聚集倾向性(参见图4)(与在Fc区不具有突变I253A、H310A和H435A的版本相比)，这对于在眼中玻璃体内的应用是至关重要的(由于在所述治疗过程中，在眼中的聚集可能导致并发症)。本文报道的双特异性抗体表现出抑制眼部疾病的良好功效。在某些实施方案中，本文报道的双特异性抗体由于其在恒定区中的特异性修饰(例如P329GLALA)表现出有价值的特性，如不结合Fcγ受体/与Fcγ受体无结合，这减少如血栓形成和/或不需要的细胞死亡(例如，由于ADCC引起)的副作用的危险性。
在本文报道的一个实施方案中，本文报道的双特异性抗体是双价的。
在根据本发明的一个方面，本文报道的这种双特异性双价抗体特征在于包含
a)特异结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)特异结合ANG-2的第二全长抗体的修饰的重链和修饰的轻链，其中恒定结构域CL和CH1彼此替代。
用于特异结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体的该双特异性双价抗体形式在WO2009/080253中描述(包括凸起-进-孔洞修饰的CH3结构域)。基于该双特异性双价抗体形式的抗体命名为CrossMabs。
在一个实施方案中，这种双特异性双价抗体特征在于包含
a)SEQIDNO：102的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：36的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和
b)SEQIDNO：103的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链和SEQIDNO：37的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
在一个实施方案中，这种双特异性双价抗体特征在于包含
a)SEQIDNO：104的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链并且SEQIDNO：40的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和
b)SEQIDNO：105的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链并且SEQIDNO：41的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
在一个实施方案中，这种双特异性双价抗体特征在于包含
a)SEQIDNO：106的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链并且SEQIDNO：44的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和
b)SEQIDNO：107的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链并且SEQIDNO：45的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
因此，本文所报道的一个方面是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：102，SEQIDNO：103，SEQIDNO：36，和SEQIDNO：37的氨基酸序列。
因此，本文所报道的一个方面是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：104，SEQIDNO：105，SEQIDNO：40，和SEQIDNO：41的氨基酸序列。
因此，本文所报道的一个方面是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：106，SEQIDNO：107，SEQIDNO：44，和SEQIDNO：45的氨基酸序列。
在本文报道的另一个方面，本文报道的双特异性抗体特征在于包含
a)特异结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)特异结合ANG-2的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N-末端通过肽接头与轻链的C-末端连接。
用于该特异结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体的该双特异性双价抗体形式在WO2011/117330中描述(包括凸起-进-孔洞修饰的CH3结构域)。基于这种双特异性双价抗体形式的抗体命名为单臂单链Fabs(OAscFabs)。
在一个实施方案中，这种双特异性双价抗体特征在于包含
a)SEQIDNO：108的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链并且SEQIDNO：48的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和
b)与第二全长抗体的轻链通过SEQIDNO：109的氨基酸序列的肽接头连接的第二全长抗体的重链。
在一个实施方案中，这种双特异性双价抗体特征在于包含
a)SEQIDNO：110的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链并且SEQIDNO：51的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，和
b)与第二全长抗体的轻链通过SEQIDNO：111的氨基酸序列的肽接头连接的第二全长抗体的重链。
在一个实施方案中，第二全长抗体的重和轻链的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)进一步通过在以下位置引入二硫键来稳定：重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100(根据Kabat的EU索引编号(Kabat，E.A.，等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991))。引入二硫桥用于稳定的技术在例如WO94/029350，Rajagopal，V.，等人，Prot.Eng.10(1997)1453-1459，Kobayashi等人，NuclearMedicine&Biology25(1998)387-393，和Schmidt，M.，等人，Oncogene18(1999)1711-1721中描述。
因此，本文所报道的一个方面是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：108、SEQIDNO：109和SEQIDNO：48的氨基酸序列。
因此，本文所报道的一个方面是包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：110、SEQIDNO：111和SEQIDNO：51的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本文报道的双特异性双价抗体的CH3结构域通过“凸起-入-孔洞”技术改变，所述“凸起-入-孔洞”技术例如在WO96/027011，RidgwayJ.B.，等，ProteinEng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等，NatBiotechnol.16(1998)677-681中以一些实例详细描述。在这种方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变，以增加包含这两个CH3结构域的两个重链的异源二聚化。(这两个重链的)这两个CH3结构域中的每一个都可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。引入二硫键进一步稳定该异二聚体(Merchant，A.M，等，NatureBiotech.16(1998)677-681；Atwell，S.，等J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并且增加产量。
在本文报道的所有方面的一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体特征在于
一条重链的CH3结构域与另一条重链的CH3结构域分别在包含所述抗体CH3结构域之间的原始界面的界面处相接，
其中所述界面被改变以促使形成双特异性抗体，其中所述改变特征在于：
a)一条重链的CH3结构域被改变，
以致在一条重链的CH3结构域与所述双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的原始界面相接的原始界面内，
氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起，该凸起可放置在另一条重链的CH3结构域的界面内的空穴内；
并且
b)另一条重链的CH3结构域被改变，
以致在第二CH3结构域与所述双特异性抗体内的第一CH3结构域的原始界面相接的原始界面中，
氨基酸残基被具有更小侧链体积的氨基酸残基置换，由此在第二CH3结构域内产生空穴，第一CH3结构域的界面内的凸起可放置在该空穴内。
因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的抗体特征在于
a)的全长抗体的重链的CH3结构域和b)的全长抗体的重链的CH3结构域分别在这样的界面处相接，所述界面包含在抗体CH3结构域之间的原始界面中的改变，
其中
i)在一条重链的CH3结构域中，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基置换，由此在一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起，所述凸起可放置在另一条重链的CH3结构域的界面内的空穴中；
并且其中
ii)在另一条重链的CH3结构域中，
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基置换，由此在第二CH3结构域的界面内产生空穴，第一CH3结构域的界面内的凸起可放置在所述空穴中。
在一个优选的实施方案中，具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。
在一个优选的实施方案中，具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。
在一个实施方案中，两个CH3结构域通过将半胱氨酸残基(C)引入每个CH3结构域的相应位置而进一步被改变，以致可以在两个CH3结构域之间形成二硫键。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体在“凸起链”的CH3结构域中包含T366W突变并且在“孔洞链”的CH3结构域中包含T366S、L368A和Y407V突变。也可以使用CH3结构域之间的另外的链间二硫键(Merchant，A.M，等，NatureBiotech16(1998)677-681)，例如，通过向“凸起链”的CH3结构域中引入Y349C或S354C突变，和向“孔洞链”的CH3结构域中引入Y349C或E356C或S354C突变。
在一个实施方案中，本文报道的双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含突变Y349C或S354C和突变T366W并且在两个CH3结构域的另一个中包含突变S354C或E356C或Y349C和突变T366S，L368A和Y407V。在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个包含Y349C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C，T366S，L368A，Y407V突变(一个CH3结构域中的额外Y349C突变和另一个CH3结构域中的额外S354C突变形成链间二硫键)(根据Kabat的EU索引编号(Kabat，E.A.，等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991))。在一个优选的实施方案中，双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含S354C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含Y349C，T366S，L368A，Y407V突变(一个CH3结构域中的额外Y349C突变和另一个CH3结构域中的额外S354C突变形成链间二硫键)(根据Kabat的EU索引编号(Kabat，E.A.，等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991))。
但是，还可以备选地或另外应用EP1870459A1所述的其他凸起-入-孔洞技术。因此，关于双特异性抗体的另一个实例是在“凸起链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(按照Kabat的EU索引编号(Kabat，E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991))。
在另一个实施方案中，所述双特异性抗体在“凸起链”的CH3结构域中包含T366W突变，并且在“孔洞链”的CH3结构域中包含T366S、L368A和Y407V突变，和另外的在“凸起链”的CH3结构域中的R409D、K370E突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K、E357K突变。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C，T366S，L368A和Y407V突变，或所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C，T366S，L368A和Y407V突变和另外的在“凸起链”的CH3结构域中的R409D，K370E突变和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K，E357K突变。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含S354C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含Y349C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含S354C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中Y349C，T366S，L368A和Y407V突变，以及另外的在“凸起链”的CH3结构域中的R409D，K370E突变和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K，E357K突变。
在本文报道的一个实施方案中，本文报道的双特异性抗体特征在于具有一种以上的以下性质：
-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，表现出较低的血清浓度(在小鼠中玻璃体内应用后96小时，所述小鼠缺失小鼠FcRn，但是关于人FcRn是半合子转基因的)(在如实施例6所述的测定法中确定)，和/或
-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，在全右眼裂解物中表现出相似的浓度(因子0.8-1.2)(在缺失小鼠FcRn但关于人FcRn是半合子转基因的小鼠中，在右眼中玻璃体内应用后96小时)(在如实施例6所述的测定法中确定)，和
-消除对人FcRn的结合，和/或
-对葡萄球菌蛋白A无结合(通过SPR确定)，和/或
-维持葡萄球菌蛋白A的结合(通过SPR确定)。
在一个实施方案中，所述双特异性双价抗体特征在于包含：
特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于
i)所述第一抗原结合位点包含SEQIDNO：20作为重链可变结构域(VH)和SEQIDNO：21作为轻链可变结构域(VL)；和
ii)所述第二抗原结合位点包含SEQIDNO：28作为重链可变结构域(VH)和SEQIDNO：29作为轻链可变结构域(VL)，和
iii)所述双特异性抗体包含
α)包含二者都是人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的IgG型Fc-区，其在第一Fc-区多肽中包含一种或两种选自以下组的突变i)组I253A，H310A和H435A，或ii)组H310A，H433A和Y436A，或iii)组L251D，L314D和L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)并且在第二Fc-区多肽中包含一种或两种选自包含突变L251D，I253A，H310A，L314D，L432D，H433A，H435A和Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)的组的突变，使得所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在一起时导致突变i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D包含在变体(人)IgG型Fc-区中，或
β)包含二者都是人IgG1或人IgG4亚类(即源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的IgG型Fc-区，其二者在Fc-区中都包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)，从而所有突变都在第一或第二Fc-区多肽中，或一种或两种突变在第一Fc-区多肽中并且一种或两种突变在第二Fc-区多肽中，从而所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在一起时导致突变i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D包含在Fc-区中，或
γ)包含二者都是人IgG1或人IgG4亚类(即源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的IgG型Fc-区，其在第一以及第二Fc-区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)，或在第一Fc-区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A的组合并且在第二Fc-区多肽中包含突变H310A/H433A/Y436A的组合(根据KabatEU索引编号系统编号)，
并且具有一种以上的以下性质：
-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，表现出较低的血清浓度(在小鼠中玻璃体内应用后96小时，所述小鼠缺失小鼠FcRn，但是关于人FcRn是半合子转基因的)(在如实施例6所述的测定法中确定)，和/或
-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，在全右眼裂解物中表现出相似的浓度(因子0.8-1.2)(在缺失小鼠FcRn但关于人FcRn是半合子转基因的小鼠中，在右眼中玻璃体内应用后96小时)(在如实施例6所述的测定法中确定)，和/或
-消除对人FcRn的结合，和/或
-对葡萄球菌蛋白A无结合(通过SPR确定)，和/或
-维持葡萄球菌蛋白A的结合(通过SPR确定)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于
i)第一抗原结合位点包含具有1，2或3个氨基酸残基置换的SEQIDNO：20作为重链可变结构域(VH)，和具有1，2或3个氨基酸残基置换的SEQIDNO：21作为轻链可变结构域(VL)；和
ii)第二抗原结合位点包含具有1，2或3个氨基酸残基置换的SEQIDNO：28作为重链可变结构域(VH)，和具有1，2或3个氨基酸残基置换的SEQIDNO：作为轻链可变结构域(VL)；和
iii)所述双特异性抗体包含
α)包含二者都是人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的IgG型Fc-区，其在第一Fc-区多肽中包含一种或两种选自以下各组的突变：i)组I253A，H310A和H435A，或ii)组H310A，H433A和Y436A，或iii)组L251D，L314D和L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)并且在第二Fc-区多肽中包含一种或两种选自包含突变L251D，I253A，H310A，L314D，L432D，H433A，H435A和Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)的组的突变，从而所述第一和第二Fc-区多肽中所有突变在一起时，导致突变i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D包含在变体(人)IgG型Fc-区中，或
β)包含二者都是人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的IgG型Fc-区，其二者在Fc-区中都包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)，从而所有突变都在第一或第二Fc-区多肽中，或一种或两种突变在第一Fc-区多肽中并且一种或两种突变在第二Fc-区多肽中，从而所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在一起时导致突变i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D包含在Fc-区中，或
γ)包含二者都是人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的第一和第二Fc-区多肽的IgG型Fc-区，其在第一以及在第二Fc-区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)，或在第一Fc-区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A的组合并且在第二Fc-区多肽中包含突变H310A/H433A/Y436A的组合(根据KabatEU索引编号系统编号)，
并且具有一种以上的以下性质：
-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，表现出较低的血清浓度(在小鼠中玻璃体内应用后96小时，所述小鼠缺失小鼠FcRn，但是关于人FcRn是半合子转基因的)(在如实施例6所述的测定法中确定)，和/或
-与不具有iii)中所述的突变的相对应的双特异性抗体相比，在全右眼裂解物中表现出相似的浓度(因子0.8-1.2)(在缺失小鼠FcRn但关于人FcRn是半合子转基因的小鼠中，在右眼中玻璃体内应用后96小时)(在如实施例6所述的测定法中确定)，和/或
-消除对人FcRn的结合，和/或
-对葡萄球菌蛋白A无结合(通过SPR确定)，和/或
-维持葡萄球菌蛋白A的结合(通过SPR确定)。
本文报道的双特异性抗体的抗原结合位点可包含六个互补性决定区(CDRs)，其在不同程度上有助于结合位点对于抗原的亲和力。存在三个重链可变结构域CDRs(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDRs(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。CDR和构架区(FRs)的程度通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，所述氨基酸序列中那些区域根据序列之间的可变性来确定。
本文报道的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码本文报道的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码本文所报道的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的，并且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个(修饰的)轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达质粒中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(培养上清液或裂解后的细胞)中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202，Geisse，S.，等，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282，Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-160，和Werner，R.G.，DrugRes.48(1998)870-880的综述文章中描述。
因此，本文所报道的一个方面是制备本文报道的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用包含编码所述抗体的核酸分子的质粒转化宿主细胞，
b)在允许合成所述抗体的条件下培养所述宿主细胞，和
c)从培养物回收所述抗体。
在一个实施方案中，c所述的回收步骤包括使用轻链恒定结构域特异性的捕获剂(例如，其对κ或λ恒定轻链特异，这取决于双特异性抗体中是否使用κ或λ轻链)。在一个实施方案中，这种轻链特异性捕获剂以结合-和-洗脱模式使用。这样的轻链恒定结构域特异性捕获剂的实例是，例如KappaSelectTM和LambdaFabSelectTM(可获自GEHealthcare/BAC)，其是基于高度刚性的琼脂糖系基质，该基质允许大规模下的高流速和低回压。这些材料分别含有与κ或λ轻链的恒定区结合的配体(即，缺少轻链恒定区的片段不结合；图1)。因此，二者都能结合其他含有轻链恒定区的靶分子，例如，IgG，IgA和IgM。配体通过长的亲水间隔臂连接到基质上，以使其容易地用于结合所述靶分子。它们是基于针对人Igκ或λ筛选的单链抗体片段。
在一个实施方案中，c)所述的回收步骤包括使用Fc-区特异的捕获剂。在一个实施方案中，所述Fc-区特异的捕获剂以结合-和-洗脱模式使用。这种Fc-区特异的捕获剂的实例是例如基于葡萄球菌属蛋白A的亲和层析材料。
双特异性抗体适当地通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基中分离，所述纯化方法如，例如亲和层析(蛋白A-琼脂糖，KappaSelectTM，LambdaFabSelectTM)，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳或透析。
编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。B-细胞或杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达质粒中，所述表达质粒接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
本文报道的一些(双特异的)抗体通过区别修饰Fc-区使得容易分离/纯化，其中至少一种所述修饰导致：i)(双特异的)抗体对蛋白A的有差别的亲和力，和ii)(双特异的)抗体对人FcRn的有差别的亲和力，并且(双特异的)抗体可以从破坏的细胞、从培养基、或从抗体混合物基于其对蛋白A的亲和力来分离。
通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsClbanding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白(见例如Ausubel，F.，等，编，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987))。不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和力材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech(应用生物化学生物技术).75(1998)93-102)。
本文报道的针对人VEGF和人ANG-2的双价双特异性抗体可以具有有价值的功效/安全性模式，并且可以为需要抗-VEGF和抗-ANG-2治疗的患者提供益处。
本文所报道的一个方面是一种药物制剂，所述药物制剂包含本文所报道的抗体。本文报道的另一方面是本文所报道的抗体用于制备药物制剂的用途。本文报道的进一步方面是制备包含本文所报道的抗体的药物制剂的方法。在另一方面，提供含有本文所报道的抗体的制剂，例如药物制剂，所述抗体与药用载体一起配制。
本文报道的制剂可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员应该理解的，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本文报道的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体中施用于受试者，所述载体例如是脂质体或稀释剂。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域中已知的。
可以使用多种可能的递送方式，包括，但不限于，眼内应用或局部应用。在一个实施方案中，所述应用是眼内的，并且包括，但其不限于，结膜下注射，前房内注射(intracanieralinjection)，通过颞侧缘(temporailimbus)注射到前房中，基质内注射，角膜内注射，视网膜下注射，眼房水注射，眼筋膜下(subtenon)注射或持续递送装置，玻璃体内注射(例如，玻璃体前、中或后注射)。在一个实施方案中，所述应用是局部的，并且包括，但其不限于，到角膜的滴眼液。
在一个实施方案中，本文报道的双特异性抗体或药物制剂经玻璃体内施用，例如通过玻璃体内注射给药。这可以根据本领域已知的标准步骤进行(参见，例如，Ritter等人，J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276，Russelakis-Carneiro等人，Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206，和Wray等人，Arch.Neurol.33(1976)183-185)。
在一些实施方案中，本文报道的治疗试剂盒可以包含一个或多个剂量的存在于本文所述的药物制剂中的(双特异性)抗体、用于玻璃体内注射所述药物制剂的适当的装置和详细说明适当的受试者和进行注射的流程的使用说明。在这些实施方案中，所述制剂典型地通过玻璃体内注射施用给需要治疗的受试者。这可以按照本领域已知的标准方法进行(参见，例如，Ritter等人，J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276，Russelakis-Carneiro等人，Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206，和Wray等人，Arch.Neurol.33(1976)183-185)。
所述制剂还可以包含辅剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法(见上文)和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保。可能还需要在制剂中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸收。
不管所选择的施用路径为何，可以将以适合的水合形式使用的本文报道的化合物，和/或本文报道的药物制剂通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。
在本文报道的药物制剂中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、制剂和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素包括所用的在本文报道的特定制剂的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、与所用的特定制剂联合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域公知的类似因素。
所述制剂必需是无菌和可流动的，到所述制剂可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。
适当的流动性可以例如通过使用涂层如磷脂酰胆碱，在分散体的情形中通过维持需要的粒度和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述制剂中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。
所述制剂可以包括用于结膜下施用的含有活性剂的眼科长效制剂。所述眼科长效制剂包含基本上纯的活性剂(例如，本文报道的双特异性抗体)的微粒。所述包含本文报道的双特异性抗体的微粒可以包埋在生物相容性药用聚合物或脂质包封剂中。所述长效制剂可以适于在延长的时间阶段中释放所有或基本上所有的活性物质。聚合物或脂质基质，如果存在，可以适于充分降解，从而在释放所有或基本上所有的活性剂后从施用位点转移。所述长效制剂可以是脂质制剂，包含药用聚合物和溶解的或分散的活性剂。注射时，聚合物在注射位点形成储库，例如，通过胶凝或沉淀形成。
本文报道的另一方面是本文报道的双特异性抗体，所述抗体用于治疗眼血管疾病。
本文报道的一个实施方案是本文报道的双特异性抗体，所述抗体用于治疗眼血管疾病。
本文报道的另一方面是本文报道的药物制剂，所述药物制剂用于治疗眼血管疾病。
本文报道的另一方面是本文所报道的抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗眼血管疾病。
本文报道的另一方面是治疗患有眼血管疾病的患的者方法，所述方法通过向需要这种治疗的患者施用本文所报道的抗体来进行。
在此明确表示，如本文使用的术语“包含(comprising)”包括术语“由...组成(consistingof)”。因此，含有术语“包含(comprising)”的所有方面和实施方案同样用术语“由...组成(consistingof)”公开。
D.修饰
在进一步的方面，根据任一上述实施方案的抗可以单独或组合并入以下部分1-6中所述的任意特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤100nM，≤10nM(例如10-7M或更少，例如10-7M至10-13M，例如，10-8M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，使用表面等离子共振测定测量Kd。例如，使用-2000或-3000(GEHealthcareInc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃以～10响应单位(RU)固定抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，根据供应商的使用说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，GEHealthcareInc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH4.8，稀释为5μg/mL(～0.2μM)，之后以5μL/分钟的速率注射，获得大约10响应单位(RU)的偶联的蛋白。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。为了动力学测量，在25℃，以大约25μL/min的流速将两倍系列稀释的(例如Fab)(0.78nM至500nM)注射入具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。使用简单的一对一Langmuir结合模型(评价软件版本3.2)，通过同时匹配结合和解离传感图，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比例koff/kon(参见，例如，Chen，Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。通过上述表面等离子共振测定，如果结合速率(on-rate)超过106M-1s-1，那么结合速率可以通过使用荧光淬灭技术确定，所述荧光淬灭技术在以光谱仪，如装有停流(stop-flow)的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌的比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)测量的增加的抗原浓度的存在下，在25℃测量PBS，pH7.2中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
2.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的的抗体是嵌合抗体。例如，在US4,816,567；和Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855)中描述了某些嵌合抗体。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、苍鼠、兔或非人灵长类，如猴的可变区)和人恒定区。在进一步实例中，嵌合抗体是“类型转换的(classswitched)”抗体，其中，类型或亚类从母体抗体的类型或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原-结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留母体非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个以上可变结构域，其中HVRs，例如，CDRs，(或其部分)源自非人抗体，并且FRs(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基源自的抗体)的相应残基置换，例如，以修复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法，例如，在Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且进一步，例如，在Riechmann，I.，等人，Nature332(1988)323-329；Queen，C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033；US5,821,337，US7,527,791，US6,982,321，和US7,087,409；Kashmiri，S.V.，等人，Methods36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重建(resurfacing)”)；Dall’Acqua，W.F.，等人，Methods36(2005)43-60(描述“FR位置变换(shuffling)”)；Osbourn，J.，等人，Methods36(2005)61-68；和Klimka，A.，等人，Br.J.Cancer83(2000)252-260(描述接近FR位置变换的“导向选择”)中描述。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配(best-fit)”方法选择的框架区(参见，例如，Sims，M.J.，等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308；源自轻链或重链可变区的特定亚群的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；和Presta，L.G.，等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞成熟的)框架区或人生殖系框架区(参见，例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca，M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok，M.J.等人，J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。
3.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域中已知的各种技术制备。人抗体通常在vanDijk，M.A.和vandeWinkel，J.G.，Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374以及Lonberg，N.，Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中描述。
人抗体可以通过将免疫原施用于修饰以响应抗原刺激(challenge)而生产完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备。这种动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其代替内源性免疫球蛋白基因座，或者其存在于染色体外或随机整合入动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常失活。为了回顾从转基因动物获得人抗体的方法，参见Lonberg，N.，Nat.Biotech.23(2005)1117-1125(还参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的US6,075,181和US6,150,584；描述技术的US5,770,429；描述K-M技术的US7,041,870，和描述技术)的US2007/0061900。通过这种动物产生的来自完整抗体的人可变区可以例如，通过与不同的人恒定区组合被进一步修饰。
人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor，D.，J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur，B.R.，等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications，MarcelDekker，Inc.，NewYork(1987)，pp.51-63；和Boerner，P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。还在Li，J.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)3557-3562中描述了通过人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。另外的方法包括例如，在US7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系制备单克隆人IgM抗体)和Ni，J.，XiandaiMianyixue26(2006)265-268(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)还在Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Histology和Histopathology20(2005)927-937以及Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology27(2005)185-191中描述。
人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后，这种可变结构域序列可以与所需人恒定结构域组合。从抗体文库选择人抗体的技术在下文描述。
4.源自文库的抗体
本文报道的抗体可以通过筛选具有所需一种活性或多种活性的抗体的组合文库来分离。例如，在本领域中已知多种方法用于产生噬菌体展示文库和筛选这种文库获得具有所需结合特性的抗体。这种方法例如，在Hoogenboom，H.R.等人，MethodsinMolecularBiology178(2001)1-37中综述，并且进一步，例如，在McCafferty，J.等人，Nature348(1990)552-554；Clackson，T.等人，Nature352(1991)624-628；Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks，J.D.和Bradbury，A.，MethodsinMolecularBiology248(2003)161-175；Sidhu，S.S.等人，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee，C.V.等人，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse，F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467-12472；以及Lee，C.V.等人，J.Immunol.Methods284(2004)119-132中描述。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的组库(repertoires)通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组在噬菌体文库中，随后将其对结合抗原的噬菌体进行筛选，如Winter，G.，等人，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自免疫来源的文库，不需要构建杂交瘤即提供对免疫原高亲和力的抗体。备选地，可以克隆(例如，从人)幼稚组库，以在没有任何免疫的情况下，提供针对宽泛的非自身和此外的自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths，A.D.，等人，EMBOJ.12(1993)725-734所述。最后，幼稚文库还可以通过将通过从干细胞克隆非重排的V-基因片段，和使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并实现体内重排，来合成制备，如Hoogenboom，H.R.和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：US5,750,373，和US2005/0079574，US2005/0119455，US2005/0266000，US2007/0117126，US2007/0160598，US2007/0237764，US2007/0292936，和US2009/0002360。
分离自人抗体文库的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
5.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一个所述结合特异性针对第一抗原并且另一个针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合相同抗原的两个不同的表位。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定位到表达至少一种所述抗原的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature305(1983)537-540，WO93/08829，和Traunecker，A.，等人，EMBOJ.10(1991)3655-3659)，和“凸起-入-孔洞”改造(参见，例如，US5,731,168)。多特异性抗体还可以通过改造静电转向效果来制备抗体Fc-异二聚的分子(WO2009/089004)；交联两种以上抗体或片段(参见，例如，US4,676,980，和Brennan，M.等人，Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链制备双特异性抗体(参见，例如，Kostelny，S.A.，等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用“双抗体(diabody)”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber，M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；和制备三特异性抗体，如，例如，在Tutt，A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69)中所述。
具有三个以上抗原结合位点的改造的抗体，包括“章鱼抗体，”也包括在本文中(参见，例如US2006/0025576)。
本文中的抗体或片段还包括“双重作用Fab(DualActingFab)”或“DAF”(参见，例如US2008/0069820)。
本文中的抗体或片段还包括在WO2009/080251，WO2009/080252，WO2009/080253，WO2009/080254，WO2010/112193，WO2010/115589，WO2010/136172，WO2010/145792，和WO2010/145793中描述的多特异性抗体。
6.抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列，或通过肽合成来制备。这种修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列中缺失残基，和/或将残基插入抗体的氨基酸序列中和/或置换抗体的氨基酸序列内的残基。假如最终构建体具有所需特性，例如，结合抗原，可以进行缺失、插入和置换的任意组合以实现最终构建体。
a)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个以上氨基酸置换的抗体变体。研究的置换诱变的位点包括HVRs和FRs。保守置换显示在下表中标题“优选的置换”下。更多的置换改变提供在下表中标题“示例性的置换”下，并且如以下参考氨基酸侧链类型进一步描述的。氨基酸置换可以引入研究的抗体和对于所需活性，例如，保留的/改善的抗原结合，减少的免疫原性，或改善的ADCC或CDC进行筛选的产物中。
表.
氨基酸可以根据普通侧链性质分组：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守置换将需要将这些类型中一种的成员交换为另一类型。
一种类型的置换的变体包括置换母体抗体(例如人源化或人抗体)的一个以上高变区残基。通常，选择用于进一步研究的得到的一种或多种变体将相对于母体抗体具有某些生物性质(例如，增加的亲和力，减少的免疫原性)的修饰(例如，改进)和/或将具有基本上具有保留的母体抗体的某些生物性质。示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以常规例如，使用如本文描述的基于噬菌体的亲和力成熟技术产生。简言之，一种以上HVR残基是被突变的并且变体抗体展示在噬菌体上并且对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
改变(例如，置换)可以在HVRs中进行，以例如，改善抗体亲和力。这种改变可以在HVR“热点，”即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury，P.S.，MethodsMol.Biol.207(2008)179-196)，和/或接触抗原的残基中进行，对得到的变体VH或VL测试结合亲和力。通过从次级文库构建和筛选的亲和力成熟已经在，例如，Hoogenboom，H.R.等人，MethodsinMolecularBiology178(2002)1-37中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链位置变换，或针对寡核苷酸的诱变)中的一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后建立次级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法包括针对HVR-的方法，其中多个HVR残基(例如，每次4-6残基)随机化。包括在抗原结合中的HVR残基可以例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模(modeling)被具体鉴定。尤其常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入、或缺失可以发生在一个以上HVRs内，只要这种改变基本上不减小抗体结合抗原的能力。例如，基本上不减小结合亲和力的保守的改变(例如，本文提供的的保守置换)可以在HVRs中进行。这种改变可以，例如，在HVRs中接触抗原的残基外进行。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各个HVR或者未改变，或包含不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
鉴定抗体中诱变靶向的残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science244(1989)1081-1085所描述的。在该方法中，鉴定靶残基(例如，带电残基如arg，asp，his，lys，和glu)的残基或基团并用中性或带负电氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在氨基酸位置引入的进一步置换，表明对于初始置换的功能敏感度。备选地，或另外，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴定抗体和抗原之间的接触点。这种接触残基和相邻残基可以作为用于置换的候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至含有一百或更多残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入的变体包括将抗体的N-或C-末端融合于增加抗体血清半衰期的酶(例如对于ADEPT)或多肽。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体的糖基化程度。向抗体添加或缺失糖基化位点可以常规通过改变氨基酸序列从而形成或去除一个以上糖基化位点来完成。
在所述抗体包含Fc-区的情况下，连接于其的碳水化合物可以改变。由哺乳动物细胞产生的天然的抗体通常包含分支的，通常通过N-连接固定于Fc-区的CH2结构域的Asn297的二支链(biantennary)寡糖(参见，例如，Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH15(1997)26-32)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及与二支链寡糖结构的“干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本文所报道的抗体中寡糖的修饰以形成具有某些改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了缺少(直接或间接)与Fc-区连接的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以从1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过测量糖链内Asn297处的岩藻糖的平均量(相对于通过MALDI-TOF质谱测量的与Asn297连接的所有糖结构(例如复合物，杂合物和高甘露糖结构)的总和)，确定岩藻糖的量，如例如在WO2008/077546中描述的。Asn297是指位于Fc-区(Fc-区残基的编号)大约位置297处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中小的序列变化，Asn297还可以位于位置297的上游或下游约±3氨基酸处，即，在位置294和300之间。这种岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，US2003/0157108；US2004/0093621。与“脱岩藻糖化”或“岩藻糖-缺乏”的抗体变体相关的公开的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki，A.等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki，N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生脱岩藻糖化的抗体的细胞系的实例包括蛋白岩藻糖化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka，J.，等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；和WO2004/056312，特别是在实例11中)，和敲除的细胞系，如敲除α-1，6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki，N.，等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda，Y.，等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO2003/085107)。
进一步提供具有一分为二的寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体的Fc-区连接的二支链寡糖由GlcNAc一分为二。这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这种抗体变体的实例，例如，在WO2003/011878；US6,602,684；和US2005/0123546中描述。还提供在连接于Fc-区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这种抗体变体可以具有改善的CDC功能。这种抗体变体，例如，在WO1997/30087；WO1998/58964；和WO1999/22764中描述。
c)Fc-区变体
在某些实施方案中，一个以上进一步氨基酸修饰可以引入本文提供的抗体的Fc-区中，从而产生Fc-区变体。Fc-区变体可以包括在一个以上氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如置换/突变)的人Fc-区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc-区)。
在某些实施方案中，本发明考虑拥有一些但不是全部效应器功能的抗体变体，这使得它成为用于应用的所希望的候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应器功能(如CDC和ADCC)是不必需的或有害的。可以进行体内和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC，NK细胞的原代细胞，仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页的表3中总结。体内测定以评价研究的分子的ADCC活性的非限制性实例在US5,500,362中描述(参见，例如Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)1499-1502)；US5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。备选地，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.MountainView，CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。用于这种测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，可以，例如，以动物模型如Clynes，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656中公开的，在体内评估研究的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以证实所述抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性(参见，例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评价补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro，H.等人，J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg，M.S.等人，Blood101(2003)1045-1052；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定(参见，例如，Petkova，S.B.等人，Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有减少的效应器功能的抗体包括Fc-区残基238，265，269，270，297，327和329(US6,737,056)中的一个以上置换的那些。这种Fc-区变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两个以上具有置换的Fc-区，包括残基265和297为丙氨酸的置换的所谓的“DANA”Fc-区突变体(US7,332,581)。
描述的了某些具有改善的或减少的对FcRs的结合的抗体变体(参见，例如，US6,737,056；WO2004/056312，和Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个以上改善ADCC的氨基酸置换的Fc-区，例如，在Fc-区的位置298，333，和/或334(EU编号残基)处的置换。
在一些实施方案中，在Fc-区进行改变，导致改变的(即，改善的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，在US6,194,551，WO99/51642，和Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述的。
具有增加的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgGs转移至胎儿(Guyer，R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593，和Kim，J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)的结合的抗体，在US2005/0014934中描述。那些抗体在其中包含具有一个以上置换的Fc-区，所述置换改善Fc-区对FcRn的结合。这种Fc-区变体包括在Fc-区残基：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434的一个以上处具有置换的那些，例如，Fc-区残基434的置换(US7,371,826)。
关于Fc-区变体的其它实例，还参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature322(1988)738-740；US5,648,260；US5,624,821；和WO94/29351。
d)半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能希望产生半胱氨酸改造的抗体，例如，“硫代MAbs，”其中抗体的一个以上残基被半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性巯基由此位于抗体的可接近位点处并且可以用于将抗体缀合于其它部分，如药物部分或接头-药物部分，形成免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施方案中，任意一个以上的以下残基可以被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc-区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以，如例如，在US7,521,541中所述产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文提供的抗体可以进一步被修饰以包含另外的本领域已知的和容易获得的非蛋白部分。适于抗体衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊烷，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛因为其在水中的稳定性可以在制造方面有优势。聚合物可以是任意分子量，并且可以是分支的或非分支的。连接于抗体的聚合物数量可以不同，并且如果多于一种聚合物连接，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑来确定，包括但不限于，要改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗，等。
在另一个实施方案中，提供抗体和可以通过暴露于辐射来选择性加热的非蛋白部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋部分是碳纳米管(Kam，N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)11600-11605)。所述辐射可以是任意波长，并且包括，但不限于，不伤害普通细胞，但加热非蛋白部分至这样的温度的波长，在所述温度，接近抗体-非蛋白部分的细胞被杀死。
f)异二聚化
存在多种CH3-修饰的方法以促使异二聚化，其例如在WO96/27011，WO98/050431，EP1870459，WO2007/110205，WO2007/147901，WO2009/089004，WO2010/129304，WO2011/90754，WO2011/143545，WO2012058768，WO2013157954，WO2013096291中详尽描述。通常在所有这种方法中，将第一CH3结构域和第二CH3结构域都以互补的方式改造，从而各个CH3结构域(或包含它的重链)不再能自身同源二聚化，但促使与互补改造的另一CH3结构域异二聚化(使得第一和第二CH3结构域异二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于改善的重链异二聚化的不同方式被考虑为与减少轻链错配Bence-Jones型副产物的根据本发明的多特异性抗体中重-轻链修饰(在一个结合臂中的VH和VL交换/替代和在CH1/CL界面引入具有相反电荷的带电氨基酸的置换)组合的不同备选方案。
在本发明的一个优选的实施方案中(如果多特异性抗体在重链中包含CH3结构域)，根据本发明的所述多特异性抗体的CH3结构域通过“凸起-进-孔洞”技术改变，所述记述以多个实例详述，例如WO96/027011，Ridgway，J.B.，等人，ProteinEng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO98/050431。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加包含这两个CH3结构域的重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域中的每一个可以是“凸起”，同时另一个是“孔洞”。二硫键的引入进一步稳定所述异二聚体s(Merchant，A.M.，等人，NatureBiotech.16(1998)677-681；Atwell，S.，等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产量。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述多特异性抗体(在各个重链中包含CH3结构域并且)进一步特征在于：
a)下的抗体第一重链的第一CH3结构域和b)下的抗体第二重链的第二CH3结构域各自在抗体CH3结构域之间包含原始界面的界面相接。
其中改变所述界面以促进多特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于：
i)一条重链的CH3结构域被改变，
从而在与多特异性抗体内的另一重链的CH3结构域的原始界面相接的一条重链的CH3结构域的原始界面内，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在可定位在另一重链的CH3结构域的界面内的空腔中的一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起
并且
ii)另一重链的CH3结构域被改变，
从而在与多特异性抗体内的第一CH3结构域的原始界面相接的第二CH3结构域的原始界面内
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在其中第一CH3结构域的界面内的凸起可定位的第二CH3结构域的界面内产生空腔。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。
在本发明的一个方面，两个CH3结构域进一步通过将半胱氨酸(C)作为氨基酸引入各个CH3结构域的相应位置来改变，从而两个CH3结构域之间的二硫键可以形成。
在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体在“凸起链”的第一CH3结构域中包含氨基酸T366W突变并且在“孔洞链”的第二CH3结构域中氨基酸T366S，L368A，Y407V突变。还可以例如通过将氨基酸Y349C突变引入“孔洞链”的CH3结构域和将氨基酸E356C突变或氨基酸S354C突变引入“凸起链”的CH3结构域，使用CH3结构域之间额外的链间二硫键(Merchant，A.M.，等人，NatureBiotech.16(1998)677-681)。
在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体(其在各个重链中包含CH3结构域)在两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸S354C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含氨基酸Y349C，T366S，L368A，Y407V突变(一个CH3结构域中的额外氨基酸S354C突变和另一个CH3结构域中的额外氨基酸Y349C突变形成链间二硫键)(根据Kabat编号)。
其他用于CH3-修饰以促进异二聚化的技术考虑为本发明的备选方案，并且例如在WO96/27011，WO98/050431，EP1870459，WO2007/110205，WO2007/147901，WO2009/089004，WO2010/129304，WO2011/90754，WO2011/143545，WO2012/058768，WO2013/157954，WO2013/096291中描述。
在一个实施方案中，可以备选地使用EP1870459A1中所述的异二聚化方法。该方法基于通过在两条重链之间的CH3/CH3结构域界面之间的特定氨基酸位置引入带电氨基酸的置换/突变。对于所述多特异性抗体的一个优选的实施方案是(多特异性抗体的)第一CH3结构域的氨基酸R409D；K370E突变和氨基酸D399K；多特异性抗体的第二CH3结构域中的E357K突变(根据Kabat编号)。
在另一个实施方案中，所述多特异性抗体在“凸起链”的CH3结构域中包含氨基酸T366W突变并且在“孔洞链”的CH3结构域中包含氨基酸T366S，L368A，Y407V突变，以及额外地，“凸起链”的CH3结构域中的氨基酸R409D；K370E突变和“孔洞链”的CH3结构域中的氨基酸D399K；E357K突变。
在另一个实施方案中，所述多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸S354C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含氨基酸Y349C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸Y349C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含氨基酸S354C，T366S，L368A，Y407V突变，以及额外地，“凸起链”的CH3结构域中的氨基酸R409D；K370E突变和“孔洞链”的CH3结构域中的氨基酸D399K；E357K突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用在WO2013/157953中描述的异二聚化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366K突变并且第二CH3结构域多肽包含氨基酸L351D突变。在进一步实施方案中，第一CH3结构域进一步包含氨基酸L351K突变。在进一步实施方案中，第二CH3结构域进一步包含选自Y349E，Y349D和L368E的氨基酸突变(优选地L368E)。
在一个实施方案中，可以备选地使用在WO2012/058768中描述的异二聚化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y，Y407A突变并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A，K409F突变。在进一步实施方案中，第二CH3结构域还在位置T411，D399，S400，F405，N390，或K392处包含氨基酸突变，所述突变例如选自a)T411N，T411R，T411Q，T411K，T411D，T411E或T411W，b)D399R，D399W，D399Y或D399K，cS400E，S400D，S400R，或S400KF405I，F405M，F405T，F405S，F405V或F405WN390R，N390K或N390DK392V，K392M，K392R，K392L，K392F或K392E。在进一步实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y，Y407A突变并且第二CH3结构域包含氨基酸T366V，K409F突变。在进一步实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸Y407A突变并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A，K409F突变。在进一步实施方案中，第二CH3结构域还包含氨基酸K392E，T411E，D399R和S400R突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用在WO2011/143545描述的异二聚化方法，例如具有在选自由368和409组成的组的位置处的氨基酸修饰。
在一个实施方案中，可以备选地使用在WO2011/090762描述的异二聚化方法，其也使用上文所述的凸起-进-孔洞技术。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366W突变并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407A突变。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366Y突变并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407T突变。
在一个实施方案中，多特异性抗体是IgG2同种型的并且可以备选地使用在WO2010/129304描述的异二聚化方法。
在一个实施方案中，可以备选地使用在WO2009/089004描述的异二聚化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含用带负电氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)氨基酸置换K392或N392并且第二CH3结构域包含用带正电的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K，E356K，D356K，或E357K并且更优选D399K和E356K氨基酸)置换D399，E356，D356，或E357。在进一步实施方案中，第一CH3结构域还包含用带负电的氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)氨基酸置换K409或R409。在进一步实施方案中，第一CH3结构域进一步或备选地包含用带负电的氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))氨基酸置换K439和/或K370。
在一个实施方案中，可以备选地使用在WO2007/147901描述的异二聚化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸K253E，D282K，和K322D突变并且第二CH3结构域包含氨基酸D239K，E240K，和K292D突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用在WO2007/110205描述的异二聚化方法。
E.重组方法和组合物
抗体可以使用重组方法和组合物，例如，US4,816,567中所述制备。在一个实施方案中，提供编码本文所报道的抗体的一个或多个分离的核酸。这种核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在进一步实施方案中，提供一种以上包含这种核酸的质粒(例如，表达质粒)。在进一步实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含(例如，已转化有)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的质粒，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一质粒和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二质粒。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如中国苍鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备本文所报道的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文所述的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组生产本文所报道的抗体，分离例如如上文所述的编码抗体的核酸，并且插入一种以上质粒中，用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法可以容易地分离和测序这种核酸(例如，通过使用能够特异结合编码变体Fc-区多肽或抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的质粒的适当的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中生产，尤其是当不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，US5,648,237，US5,789,199，和US5,840,523(还参见Charlton，K.A.，在：MethodsinMolecularBiology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254中，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以将抗体从细菌细胞糊中以可溶级分分离并可以进一步纯化。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的质粒的适当的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或全部人糖基化形式的抗体。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
表达糖基化抗体的适当的宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫。已经鉴定了很多可以与昆虫细胞联合使用的杆状病毒株，尤其是用于草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，US5,959,177，US6,040,498，US6,420,548，US7,125,978，和US6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚胎肾系(例如，在Graham，F.L.，等人，J.GenVirol.36(1977)59-74)中所述的HEK293或293细胞；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(例如，在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬深细胞(MDCK)p；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；例如，在Mather，J.P.，等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国苍鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。对于适于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，MethodsinMolecularBiology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2004)，pp.255-268。
F.组合治疗
在某些实施方案中，本文报道的抗体或药物制剂单独施用(不具有另外的治疗剂)，用于治疗一种或多种本文所述的眼血管疾病。
在其它实施方案中，本文报道的抗体或药物制剂与一种或多种另外的治疗剂或方法组合施用，用于治疗一种或多种本文所述的血管眼疾病。
在其它实施方案中，本文报道的抗体或药物制剂与一种或多种另外的治疗剂组合配制并且施用，用于治疗一种或多种本文所述的血管眼疾病。
在某些实施方案中，本文提供的组合治疗包括这样的施用：本文报道的抗体或药物制剂与一种或多种另外的治疗剂先后施用，用于治疗一种或多种本文所述的眼血管疾病。
所述另外的治疗剂包括，但不限于，色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)，EyeOOl(抗-VEGF聚乙二醇化的适体)，角鲨胺，RETAANE(TM)(用于长效混悬液的乙酸阿奈可他(anecortaveacetate)；Alcon，Inc.)，考布他汀A4前药(CombretastatinA4Prodrug，CA4P)，MACUGEN(TM)，MIFEPREX(TM)(米非司酮(mifepristone)-ru486)，subtenon曲安奈德(triamcinoloneacetonide)，玻璃体内结晶曲安奈德(intravitrealcrystallinetriamcinoloneacetonide)，普啉司他(Prinomastat)(AG3340-合成的基质金属蛋白酶抑制剂，Pfizer)，氟西奈德(fluocinoloneacetonide)(包括氟轻松眼内植入物(fluocinoloneintraocularimplant)，Bausch&Lomb/ControlDeliverySystems)，VEGFR抑制剂(Sugen)，VEGF-Trap(Regeneron/Aventis)，VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)，伐他拉尼(vatalanib)(PTK787)和SU11248(舒尼替尼(sunitinib))，利诺胺(1inomide)，和整联蛋白v.β.3功能和拮抗剂的抑制剂。
可以与本文报道的抗体或药物制剂组合使用的其他的药物治疗剂包括，但不限于，使用非热激光的VISUDYNE(TM)，PKC412，Endovion(NeuroSearchA/S)，神经营养因子，包括，例如，胶质细胞衍生的神经营养因子和睫状神经营养因子，diatazem，多佐胺(dorzolamide)，Phototrop，9-顺式-视黄醛，眼药(包括Echo治疗)，包括碘依可酯(phospholineiodide)或依可酯(echothiophate)或碳酸酐酶抑制药(carbonicanhydraseinhibitors)，AE-941(AEternaLaboratories，Inc.)，Sirna-027(SimaTherapeutics，Inc.)，培加他尼(pegaptanib)(NeXstarPharmaceuticals/GileadSciences)，神经营养蛋白(neurotrophins)(包括，仅是举例，NT-4/5，Genentech)，Cand5(AcuityPharmaceuticals)，INS-37217(InspirePharmaceuticals)，整联蛋白拮抗剂(包括来自JeriniAG和AbbottLaboratories的那些)，EG-3306(ArkTherapeuticsLtd.)，BDM-E(BioDiemLtd.)，沙立度胺(thalidomide)(例如，由EntreMed，Inc.使用)，心脏营养素-1(cardiotrophin-1)(Genentech)，2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol)(Allergan/Oculex)，DL-8234(TorayIndustries)，NTC-200(Neurotech)，四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate)(UniversityofMichigan)，LYN-002(LynkeusBiotech)，微藻(microalgal)化合物(Aquasearch/Albany，MeraPharmaceuticals)，D-9120(CelltechGrouppic)，ATX-S10(HamamatsuPhotonics)，TGF-β2(Genzyme/Celtrix)，酪氨酸激酶抑制剂(Allergan，SUGEN，Pfizer)，NX-278-L(NeXstarPharmaceuticals/GileadSciences)，Opt-24(OPTISFranceSA)，视网膜细胞神经节神经保护剂(retinalcellganglionneuroprotectants)(CogentNeurosciences)，N-硝基吡唑衍生物(TexasA&MUniversitySystem)，KP-102(KrenitskyPharmaceuticals)，环孢素A(cyclosporinA)，Timitedretinaltranslocation，光动力学治疗，(包括，仅以举例方式，靶向受体的PDT，Bristol-MyersSquibb，Co.；与PDT一起注射的卟吩姆钠(porfimersodium)；维替泊芬(verteporfin)，QLTInc.；罗培泊芬(rostaporfin)与PDT，MiraventMedicalTechnologies；他拉泊芬钠(talaporfinsodium)与PDT，NipponPetroleum；莫特沙芬镥(motexafinlutetium)，Pharmacyclics，Inc.)，反义寡核苷酸(包括，例如，由NovagaliPharmaSA和ISIS-13650，IsisPharmaceuticals测试的产品)，激光光凝术，玻璃疣激光术，黄斑裂孔手术，黄斑易位手术，可植入的微型镜管，Phi-Motion血管造影术(还称为显微-激光治疗(Micro-LaserTherapy)和FeederVessel治疗)，质子束治疗，微刺激治疗，视网膜剥离和玻璃体手术，巩膜扣(ScleralBuckle)，黄斑下手术(SubmacularSurgery)，经瞳孔的热治疗(TranspupillaryThermotherapy)，光系统I治疗，应用RNA干扰(RNAi)，体外rheopheresis(extracorporealrheopheresis)(也称为膜分化的过滤和Rheotherapy(membranedifferentialfiltrationandRheotherapy))，微型芯片植入，干细胞治疗，基因替换治疗，核酶基因治疗(包括用于缺氧响应元件的基因治疗，OxfordBiomedica；Lentipak，Genetix；PDEF基因治疗，GenVec)，光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin，Inc.；视网膜细胞植入物，CellGenesys，Inc.)，和针灸。
任何抗-血管生成剂可以与本文报道的抗体或药物制剂组合使用，其包括，但不限于，Carmeliet和Jain，Nature407(2000)249-257所列出的那些。在某些实施方案中，所述抗-血管生成剂是另一种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，如VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和抗-VEGFR抗体、低分子量的VEGFR酪氨酸激酶抑制剂和它们的任意组合，并且这些包括抗-VEGF适体(例如，培加尼布(Pegaptanib))，可溶性重组诱饵受体(例如VEGFTrap)。在某些实施方案中，所述抗-血管生成剂包括皮质类固醇，拮抗剂类固醇，乙酸阿奈可他，血管生成抑制因子(angiostatin)，内皮他丁(endostatin)，减少VEGFR或VEGF配体表达的小干扰RNA′s，使用酪氨酸激酶抑制剂的后-VEGFR阻断，MMP抑制剂，IGFBP3，SDF-1阻断剂，PEDF，γ-分泌酶，δ-样配体4，整联蛋白拮抗剂，HIF-1α阻断，蛋白激酶CK2阻断，和使用血管内皮钙粘蛋白(CDl44)和间质衍生的因子(SDF)-I抗体抑制归巢到新生血管形成位点的干细胞(即，内皮祖细胞)。还可以使用靶向VEGF受体的小分子RTK抑制剂，包括PTK787。还可以使用具有针对新生血管形式的活性的试剂(不必是抗-VEGF化合物)，并且包括抗炎性药物，m-Tor抑制剂，雷帕霉素(rapamycin)，依维莫司(everolismus)，temsirolismus，环孢素(cyclospohne)，抗-TNF试剂，抗-补体试剂，和非类固醇类的抗炎剂。还可以使用神经保护性且能够潜在地减少干性黄斑变性的进展的试剂，诸如称为“神经类固醇”的药物种类。这些包括下述药物，如脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone)(DHEA)(商标名称：Prastera(R)和Fidelin(R))，硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosteronesulfate)，和硫酸孕烯诺龙(pregnenolonesulfate)。任何AMD(年龄相关的黄斑变性)治疗剂可以与本文报道的双特异性抗体或药物制剂组合使用，包括，但不限于，与PDT组合的维替泊芬，培加他尼钠(pegaptanibsodium)，锌或抗氧化剂(单独的或以任意组合的)。
G.药物制剂
本文所述的抗体的药物制剂通过将具有所需纯度的这种抗体与一种以上任选的药用载体(Remington′sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.(ed.)(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式混合来制备。药用载体通常在使用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括，但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯胺；苄索氯铵(benzethoniumchloride)；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲苯酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或葡糖胺；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；盐形成反离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中示例性的药用载体还包括间质药物分散剂如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(BaxterInternational，Inc.)。某些示例性的sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20，在US2005/0260186和US2006/0104968中描述。在一个方面，sHASEGP与一种以上另外的糖胺聚糖(glycosaminoglycanases)如软骨素酶组合。
示例性的冻干的抗体制剂在US6,267,958中描述。水性抗体制剂包括在US6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的制剂还可以含有大于一种对于治疗的特定适应症所必需的活性成分，优选为具有彼此不不利地影响的互补活性的那些。这样的活性成分适当地以对于预期目的有效的量组合存在。
在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中，活性成分可以捕获在例如，通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这种技术在Remington′sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.(编辑)(1980)中描述。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适当实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质是成形物品的形式，例如膜，或微胶囊。
要用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，通过经无菌滤膜过滤，可以容易实现无菌。
H.治疗方法和组合物
本文提供的任意抗体可以用于治疗方法。
在一个方面，提供用作药物的本文所报道的抗体。在进一步方面，提供一种抗体，所述抗体用于治疗眼血管疾病的。在某些实施方案中，提供一种抗体，所述抗体用于治疗的方法。在某些实施方案中，提供一种抗体，所述抗体用于治疗患有眼血管疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗体。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种额外治疗剂，例如，部分D中所述的。在进一步实施方案中，本发明提供一种抗体，所述抗体用于抑制眼中血管形成。在某些实施方案中，本发明提供一种抗体，所述抗体用于抑制个体中血管形成的方法，所述方法包括向所述个体施用有效的抗体以抑制血管形成。根据上述任意实施方案的“个体”在一个优选的实施方案中是人。
在进一步方面，本发明提供抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗眼血管疾病。在进一步实施方案中，所述药物用于治疗眼血管疾病的方法，所述方法包括向患有眼血管疾病的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，上文所述的。在进一步实施方案中，所述药物用于抑制血管形成。在进一步实施方案中，所述药物用于在抑制个体中血管形成的方法中使用，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物以抑制血管形成。根据上述任意实施方案的“个体”可以是人。
在进一步方面，本发明提供治疗血管眼疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有这种血管眼疾病的个体施用有效量的本文报道的抗体。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所述。根据任意上述实施方案的“个体”可以使人。
在进一步方面，本发明提供用于抑制个体眼中血管形成的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所报道的抗体以抑制血管形成。在一个实施方案中，“个体”是人。
在进一步方面，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含本文提供的任意抗体，例如，所述抗体用于任意的上述治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任意抗体和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任意抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，下文所述的。
在治疗中，本文报道的抗体可以单独使用或与其他药剂组合使用。例如，本文所报道的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共施用。
本文所报道的抗体(和任意的另外的治疗剂)可以通过任意的适当方法施用，包括肠胃外，肺内，和鼻内，并且，如果需要局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。剂量给药可以通过任意适当的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是否短暂或长期。各种剂量给药时间安排包括但不限于经各种时间点单次或多次施用，大剂量施用，并且在本文中考虑脉冲输注。
将以与良好医学实践一致的方式，配制、剂量给药和施用本文报道的抗体。在这种情况下考虑的因素包括要治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂递送位点、施用方法、施用时间安排和执业医生已知的其它因素。需要，但任选地与一种以上当前使用的药剂一起配制抗体以预防或治疗讨论的病症。这种其他药剂的有效量取决于存在于所述制剂中的抗体量，病症或治疗的类型，和上文讨论的其它因素。这些通常以相同剂量并且以本文所述的施用途径使用，或以本文所述的剂量的约1至99％，或以经验上/临床上确定为合适的任意剂量和任意途径使用。
为了预防或治疗疾病，本文所报道的抗体(当单独或与一种以上其它另外的治疗剂组合使用)的适当剂量将取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重度和进程、施用抗体是否为了预防或治疗目的、在前的治疗、患者的临床史和对抗体的响应，和主治医师的判断。适当地将抗体以一次或经一系列治疗施用给患者。根据疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是候选施用给患者的初始候选剂量，不论，例如，通过一次以上分开的施用，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多，这取决于上文提及的因素。对于根据状况经数天或更长时间重复施用，治疗将通常持续，直到出现所希望的疾病症状的抑制。一个示例性的抗体剂量范围将从约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，一次以上剂量的约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)可以施用于患者。这种剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如从而患者接受约二至约二十个，或例如约六个剂量的抗体)。可以施用初始的较高加载剂量，接着一次以上的较低剂量。这种治疗的进展可以容易通过常规技术和测定监测。
III.制造的物品
在本文报道的另一方面，提供制造的物品，其含有用于治疗、预防和/或诊断上文所述的病症的材料。制造的物品包含容器和在容器上或与容器相关的标签或药品说明书。适当的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳其自身或与其它制剂组合对于治疗、预防和/或诊断病况有效的制剂并且可以具有无菌入口端口(例如容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针头刺破的塞子的小瓶)。制剂中的至少一种活性剂是本文报道的抗体。标签或药品说明书标明，制剂用于治疗选择的病症。此外，制造的物品可以包含(a)具有包含在其中的制剂的第一容器，其中所述制剂包含本文报道的抗体；和(b)包含在其中制剂的第二容器，其中所述制剂还包含毒性或另外的治疗剂。本文报道的该实施方案中的制造的物品还可以包含药品说明书，所述药品说明书标明，制剂可以用于治疗特定病况。备选地，或另外，制造的物品还可以包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括其它从商业和用户的角度而言所需的材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、针头和注射器。
要理解，替代本文所报道的抗体或除了本文所报道的抗体之外，任意上述的制造的物品可以包括本文报道的免疫缀合物。
IV.具体的实施方案
1.一种包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，由此，所述抗体在第一Fc-区多肽中和在第二Fc-区多肽中包含以下突变的组合
i)I253A、H310A和H435A，或
ii)H310A、H433A和Y436A，或
iii)L251D、L314D和L432D，或
iv)i)至iii)的组合。
2.一种包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，由此，所述抗体以比得上或小于在第一Fc-区多肽中和在第二Fc-区多肽中具有以下突变的抗体的亲和力特异结合人FcRn
i)I253A、H310A和H435A，或
ii)H310A、H433A和Y436A，或
iii)L251D、L314D和L432D，或
iv)i)至iii)的组合。
3.一种包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，其中
i)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变I253A、H310A和H435A，或
ii)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
iii)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iv)所述第一Fc-区多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变H310A、H433A和Y436A，或
b)突变L251D、L314D和L432D，
或
v)所述第一Fc-区多肽包含突变H310A、H433A和Y436A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变L251D，L314D和L432D。
4.一种包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，其中
α)所述第一和第二Fc-区多肽二者都是人IgG1或人IgG4亚类的(源自人源)，并且第一Fc-区多肽中包含一种或两种选自i)组I253A、H310A和H435A，或ii)组H310A、H433A和Y436A，或iii)组L251D、L314D和L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)的突变并且在第二Fc-区多肽中包含一种或两种选自包含突变L251D、I253A、H310A、L314D、L432D、H433A、H435A和Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)的组的突变，从而所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变当一并考虑时，导致突变i)I253A、H310A和H435A，或ii)H310A、H433A和Y436A，或iii)L251D、L314D和L432D包含在变体(人)IgG型Fc-区中，或
β)所述第一和第二Fc-区多肽二者都是人IgG1或人IgG4亚类的(即源自人源)并且二者都在Fc-区中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)，由此，或者所有突变在第一或第二Fc-区多肽中，或者一种或两种突变在第一Fc-区多肽中并且一种或两种突变在第二Fc-区多肽中，从而所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变当一并考虑时，导致突变i)I253A、H310A和H435A，或ii)H310A、H433A和Y436A，或iii)L251D、L314D和L432D包含在Fc-区中，或
γ)所述第一和第二Fc-区多肽二者都是人IgG1或人IgG4亚类的(即源自人源)，并且在第一以及在第二Fc-区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)，或包含第一Fc-区多肽中突变I253A/H310A/H435A的组合和第二Fc-区多肽中突变H310A/H433A/Y436A的组合(根据KabatEU索引编号系统编号)。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双价抗体。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体，其中
i)所述第一Fc-区多肽选自包含以下各项的组
-人IgG1Fc-区多肽，
-人IgG2Fc-区多肽，
-人IgG3Fc-区多肽，
-人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变L234A，L235A的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变K392D的人IgG1、IgG2或IgG4，和
-具有突变N392D的人IgG3，
和
ii)所述第二Fc-区多肽选自包含以下各项的组
-人IgG1Fc-区多肽，
-人IgG2Fc-区多肽，
-人IgG3Fc-区多肽，
-人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变D399K、D356K和/或E357K的人IgG1，和
-具有突变D399K、E356K和/或E357K的人IgG2、IgG3或IgG4。
8.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体，其中
i)所述第一Fc-区多肽具有选自包含SEQIDNO：60、61、62、63、64、65、67、69、70、71、73、75、76、78、80、81、82和84的组的氨基酸序列，和
ii)所述第二Fc-区多肽具有选自包含SEQIDNO：60、61、62、63、64、66、68、69、70、72、74、75、76、77、79、81、83和85的组的氨基酸序列。
9.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体，其中
i)所述第一Fc-区多肽是人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是人IgG1Fc-区多肽，或
ii)所述第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽，或
iii)所述第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，或
iv)所述第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，或
v)所述第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，或
vi)所述第一Fc-区多肽是人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是人IgG4Fc-区多肽，或
vii)所述第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，或
viii)所述第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，或
ix)所述第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，或
x)所述第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽。
10.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体，其中
i)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：60的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：60的氨基酸序列，或
ii)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：64的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：64的氨基酸序列，或
iii)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：70的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：70的氨基酸序列，或
iv)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：68的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：67的氨基酸序列，或
v)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：74的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：73的氨基酸序列，或
vi)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：63的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：63的氨基酸序列，或
vii)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：75的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：75的氨基酸序列，或
viii)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：76的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：76的氨基酸序列，或
ix)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：79的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：80的氨基酸序列，或
x)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：85的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：84的氨基酸序列。
11.根据实施方案5至10中任一项所述的抗体，其中所述双特异性抗体具有一个特异结合人ANG-2的结合特异性和一个特异结合人VEGF的结合特异性。
12.根据实施方案5至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：14的CDR3H区，SEQIDNO：15的CDR2H区，和SEQIDNO：16的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：17的CDR3L区，SEQIDNO：18的CDR2L区，和SEQIDNO：19的CDR1L区，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：22的CDR3H区，SEQIDNO：23的CDR2H区，和SEQIDNO：24的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：25的CDR3L区，SEQIDNO：26的CDR2L区，和SEQIDNO：27的CDR1L区。
13.根据实施方案5至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQIDNO：20的氨基酸序列作为重链可变结构域VH和SEQIDNO：21的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQIDNO：28的氨基酸序列作为重链可变结构域VH和SEQIDNO：29的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL。
14.根据实施方案5至13中任一项所述的抗体，其中包含
a)特异结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)特异结合ANG-2的第二全长抗体的修饰的重链和修饰的轻链，其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
15.根据实施方案14所述的抗体，其中包含
a)SEQIDNO：102的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：36的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：103的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链和SEQIDNO：37的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
16.根据实施方案14所述的抗体，其中包含
a)SEQIDNO：104的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：40的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：105的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链和SEQIDNO：41的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
17.根据实施方案14所述的抗体，其中包含
a)SEQIDNO：106的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：44的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：107的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链和SEQIDNO：45的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
18.根据实施方案5至13中任一项所述的抗体，其中包含
a)特异结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链，以及
b)特异结合ANG-2的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N-末端经由肽接头与轻链的C-末端连接。
19.根据实施方案18所述的抗体，其中包含
a)SEQIDNO：108的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：48的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：109的氨基酸序列作为经由肽接头与第二全长抗体的轻链连接的第二全长抗体的重链。
20.根据实施方案18所述的抗体，其中包含
a)SEQIDNO：110的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：51的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：111的氨基酸序列作为经由肽接头与第二全长抗体的轻链连接的第二全长抗体的重链。
21.根据实施方案18至20中任一项所述的抗体，其中，第二全长抗体的重链和轻链的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)通过在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100(根据KabatEU索引编号系统编号)之间引入二硫键而二硫化物稳定化。
22.根据实施方案1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
所述抗体包含SEQIDNO：34、35、36和37的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：38、39、40和41的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：42、43、44和45的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：46、47和48的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：49、50和51的氨基酸序列，
并且
所述双特异性抗体包含在两个Fc-区多肽中均包含突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类的Fc-区。
23.根据实施方案1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
所述可变结构域包含在各个可变结构域中具有0、1、2、或3个突变的SEQIDNO：20、21、28和29，并且
所述双特异性抗体包含在两个Fc-区多肽都包含突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类的Fc-区。
24.根据实施方案1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
所述抗体包含SEQIDNO：20、21、28和29的氨基酸序列，
并且
所述双特异性抗体包含在两个Fc-区多肽中均具有突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类的Fc-区。
25.根据实施方案1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：14的CDR3H区，SEQIDNO：15的CDR2H区，和SEQIDNO：16的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：17的CDR3L区，SEQIDNO：18的CDR2L区，和SEQIDNO：19的CDR1L区，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：22的CDR3H区，SEQIDNO：23的CDR2H区，和SEQIDNO：24的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：25的CDR3L区，SEQIDNO：26的CDR2L区，和SEQIDNO：27的CDR1L区，并且
iii)所述双特异性抗体包含具有突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类(源自人源)的恒定重链区，
并且其中，可变结构域就SEQIDNO：20、21、28和29而言包含不多于3个突变。
26.根据实施方案1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：14的CDR3H区，SEQIDNO：15的CDR2H区，和SEQIDNO：16的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：17的CDR3L区，SEQIDNO：18的CDR2L区，和SEQIDNO：19的CDR1L区，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：22的CDR3H区，SEQIDNO：23的CDR2H区，和SEQIDNO：24的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：25的CDR3L区，SEQIDNO：26的CDR2L区，和SEQIDNO：27的CDR1L区，并且
iii)所述双特异性抗体包含在两个Fc-区多肽中均具有突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类的Fc-区。
27.根据实施方案1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
所述双特异性抗体包含在两个Fc-区多肽中均具有突变I253A，H310A和H435A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1或人IgG4亚类的Fc-区。
28.根据实施方案1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体。
29.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其包含SEQIDNO：102，SEQIDNO：103，SEQIDNO：36，和SEQIDNO：37的氨基酸序列。
30.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其包含SEQIDNO：104，SEQIDNO：105，SEQIDNO：40，和SEQIDNO：41的氨基酸序列。
31.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其包含SEQIDNO：106，SEQIDNO：107，SEQIDNO：44，和SEQIDNO：45的氨基酸序列。
32.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其包含SEQIDNO：108，SEQIDNO：109，和SEQIDNO：48的氨基酸序列。
33.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其包含SEQIDNO：110，SEQIDNO：111，和SEQIDNO：51的氨基酸序列。
34.根据实施方案1至33中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体不结合人FcRn。
35.根据实施方案1至34中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合或不结合葡萄球菌蛋白A。
36.根据实施方案34至35中任一项所述的抗体，其中所述结合或不结合由表面等离子共振决定。
37.根据实施方案1至26中任一项所述的抗体，其中所述抗体
-与在Fc-区多肽中没有所述突变的相应双特异性抗体相比，显示较低的血清浓度(在小鼠FcRn缺陷，但对人FcRn为半合子转基因的小鼠中玻璃体内施用后96小时)(如实施例6中所述的测定法中确定)，和/或
-与在Fc-区多肽中没有所述突变的相应双特异性抗体相比，在全右眼裂解物中显示类似的(因子0.8至1.2)浓度(在小鼠FcRn缺陷，但对人FcRn为半合子转基因的小鼠中，右眼中玻璃体内施用后96小时)(如实施例6中所述的测定法中确定)。
38.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体用于将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环的用途。
39.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用作药物。
40.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗眼血管疾病。
41.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除的用途。
42.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除。
43.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体用于治疗眼疾病，特别是眼血管疾病的用途。
44.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环的用途。
45.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
46.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗眼疾病。
47.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用于将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运至血液循环。
48.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除。
49.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗眼疾病，特别是眼血管疾病。
50.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
51.一种治疗具有眼血管疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施方案1至37中任一项所述的抗体。
52.一种用于在个体中将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环中的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施方案1至37中任一项所述的抗体以将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运至血液循环中。
53.一种在个体中将一种以上可溶性受体配体从眼移除的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施方案1至37中任一项所述的抗体以从眼移除一种以上可溶性受体配体。
54.一种在个体中将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施方案1至37中任一项所述的抗体以将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
55.一种在个体中将可溶性受体配体从玻璃体内空间或眼跨血眼屏障转运入血液循环中的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施方案1至37中任一项所述的抗体以将可溶性受体配体从玻璃体内空间或眼跨血眼屏障转运入血液循环中。
56.一种药物制剂，所述药物制剂包含根据实施方案1至37中任一项所述的抗体。
57.一种药物制剂，所述药物制剂包含根据实施方案1至37中任一项所述的抗体，其用于治疗眼血管疾病。
58.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗眼血管疾病。
59.一种治疗患有眼血管疾病的患者的方法，所述方法通过向需要这种治疗的患者施用根据实施方案1至37中任一项所述的抗体进行。
60.根据实施方案55至56中任一项所述的药物制剂，其中所述抗体通过玻璃体内施用给药。
61.根据实施方案51至55和59中任一项所述的施用，其中所述施用通过玻璃体内给药。
V.实施例
以下是本文报道的方法和制剂的实施例。要理解，如果有上文提供的一般描述，可以实行各种其他实施方案。
尽管为了理解清楚，通过说明和实施例详细描述了在前的发明，所述描述和实施例不应该被认为限制本文报道的范围。本文引用的所有发明和科学文献通过引用明确以其整体并入。
方法
电喷雾电离质谱(ESI-MS)
通过加入0.5μLN-Glycanaseplus(Roche)和磷酸钠缓冲液(0.1M，pH7.1)将蛋白等份(50μg)去糖基化，以获得115μL的最终样品体积。将混合物在37℃孵育18h。之后为了还原和变性，加入60μL在4M胍*HCl(Pierce)和50μL8M胍*HCl中的0.5MTCEP(Pierce)。将混合物在37℃孵育30min。将样品通过尺寸排阻层析(琼脂糖G-25，等梯度，具有2％甲酸的40％乙腈)脱盐。在装有纳米ESI源(TriVersaNanoMate，Advion)的Q-TOF仪器(maXis，Bruker)上记录ESI质谱(+ve)。MS参数设置如下：转移：漏斗RF，400Vpp；ISCID能量，0eV；多极RF，400Vpp；四极：离子能量，4.0eV；低质量，600m/z；Source：干燥气体，8L/min；干燥气体温度，160℃；碰撞小室：碰撞能量，10eV；碰撞RF：2000Vpp；离子冷却器：离子冷却器RF，300Vpp；转移时间：120μs；预脉冲储存，10μs；扫描范围m/z600至2000。对于数据评估，使用内部开发的软件(MassAnalyzer)。
FcRn表面等离子共振(SPR)分析
通过表面等离子共振(SPR)技术，使用BIAcoreT100仪器(BIAcoreAB，Uppsala，Sweden)分析野生型抗体和突变体对FcRn的结合性质。该系统对于分子相互作用的研究已得到确认。其允许对配体/分析物结合的实时监测，并且因此在各种测定设置中确定动力学参数。SPR-技术基于临近金包被的生物传感器芯片的表面的折射率的测量。折射率的改变表明由固定的配体与溶液中注射的分析物之间的相互作用引起的表面上的质量变化。如果分子结合表面上固定的配体，质量增加，如果解离，质量减小。在本测定中，通过胺偶联将FcRn受体固定在BIAcoreCM5-生物传感器芯片(GEHealthcareBioscience，Uppsala，Sweden)上至400响应单位(RU)的水平。在室温以PBS，0.05％Tween-20TMpH6.0(GEHealthcareBioscience)作为运行和稀释缓冲液进行测定。在室温将200nM的抗体样品以50μL/min的流速注射。结合(Association)时间为180秒，解离阶段用360秒。通过短注射HBS-P，pH8.0达到芯片表面再生。SPR-数据的评估通过比较在注射后180秒和注射后300秒的生物响应信号高度来进行。相应参数是RU最大水平(注射后180秒)和晚的稳定性(注射后300秒)。
蛋白A表面等离子共振(SPR)分析
测定基于表面等离子共振光谱。将蛋白A固定在SPR生物传感器表面。通过将样品注射入SPR光谱仪的流动室内，其与固定的蛋白A形成复合物，导致传感器芯片表面上的质量增加，并且因此导致更高的响应(因为1RU定义为1pg/mm2)。之后，通过将样品-蛋白A-复合物溶解而再生传感器芯片。然后对于响应单位(RU)高的信号和解离行为评价获得的响应。
通过使用GEHealthcare的胺偶联试剂盒，在pH4.0，约3,500响应单位(RU)的蛋白A(20μg/mL)偶联在CM5芯片(GEHealthcare)上。
样品和系统缓冲液是HBS-P+(0.01MHEPES，0.15MNaCl，0.005％无菌过滤的表面活性剂P20，pH7.4)。流动室温度设为25℃并且样品室温度设为12℃。将系统用运行缓冲液引发。随后，将5nM的样品组合溶液以30μL/min的流速注射120秒，接着是300秒的解离阶段。然后通过两次以30μL/min的流速30秒长注射甘氨酸-HClpH1.5将传感器芯片表面再生。一式三份测量各个样品。
双特异的抗体及其各自的序列
如本文使用的术语“具有(所述)突变IHH-AAA”是指在IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中突变I253A(Ile253Ala)，H310A(His310Ala)，和H435A(His435Ala)的组合(根据Kabat的EU索引编号)，如本文使用的术语“具有(所述)突变HHY-AAA”是指IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中突变H310A(His310Ala)，H433A(His433Ala)和Y436A(Tyr436Ala)的组合(根据Kabat的EU索引编号)，如本文使用的术语“具有(所述)突变P329GLALA”是指IgG1亚类的恒定重链区中突变L234A(Leu234Ala)，L235A(Leu235Ala)和P329G(Pro329Gly)的组合(根据Kabat的EU索引编号)，并且如本文使用的术语“具有(所述)突变SPLE”是指IgG4亚类的恒定重链区中突变S228P(Ser228Pro)和L235E(Leu235Glu)的组合(根据Kabat的EU索引编号)。
一般
在Kabat，E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)中提供关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。根据EU编号(Edelman，G.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991))对抗体链的氨基酸残基进行编号和描述。
重组DNA技术
将标准方法用于操作DNA，如在Sambrook，J.，等，Molecular克隆：Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)中所述。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。
基因合成
按照Geneart(Regensburg，德国)提供的详细说明定购需要的基因片段。
DNA序列确定
通过在MediGenomixGmbH(Martinsried，德国)或SequiServeGmbH(Vaterstetten，德国)进行的双链测序来确定DNA序列。
DNA和蛋白序列分析和序列数据处理
使用GCG′s(GeneticsComputerGroup，Madison，Wisconsin)软件包10.2版本和Infomax′s质粒NT1Advancesuite版本8.0来用于序列产生、作图、分析、注释和举例说明。
表达质粒
为了表达所述的抗体，使用基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA构造(organization)或基于具有CMV启动子的基因组构造的用于瞬时表达(例如在HEK293-F细胞中)的表达质粒。
由下述元件组成抗体基因的转录单位：
-5’末端处的独特限制位点
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-在cDNA组构的情形中，内含子A序列，
-人免疫球蛋白基因的5’-非翻译区，
-编码免疫球蛋白重链信号序列的核酸，
-编码作为cDNA或在具有免疫球蛋白外显子-内含子组构的基因组组构中的人抗体链(野生型或具有结构域交换)的核酸，
-具有多腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和
-3’末端处的独特限制位点。
除抗体表达盒以外，所述质粒包括：
-复制起点，其容许该质粒在大肠杆菌(E.coli)中复制，和
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，和
-来自小家鼠(Musmusculus)的二氢叶酸还原酶基因作为在真核细胞中的选择性标记。
编码抗体链的核酸通过PCR和/或基因合成产生，并使用已知的重组方法和技术，通过在各自的质粒中例如利用特有的限制性位点来连接相应的核酸区段来装配。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制剂来制备更大量的质粒(NucleobondAX，Macherey-Nagel)。
细胞培养技术
如在CurrentProtocolsinCellBiology(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编)，JohnWiley&Sons，Inc中所述使用标准细胞培养技术。
双特异性抗体通过在悬浮生长的HEK293-F细胞中瞬时共转染各种表达质粒进行表达，如下文所述。
实施例1
表达和纯化
在HEK293-F系统中瞬时转染
通过利用HEK293-F系统(Invitrogen)按照制造商的说明瞬时转染各种质粒(例如，编码重链和修饰的重链和相应的轻链和修饰的轻链)来生成单特异性和双特异性抗体。简言之，用各个表达质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物来转染在摇瓶中或在搅拌发酵器中在无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，HEK293-F细胞以1*106个细胞/mL的密度接种在600mL中并以120rpm，8％CO2温育。次日，用大约42mL的混合物，以大约1.5*106个细胞/mL的细胞密度来转染细胞，所述混合物为A)具有600μg分别编码等摩尔比的重链或修饰的重链，和相应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)的20mLOpti-MEM(Invitrogen)和B)20ml具有1.2mL293fectin或fectin(2μl/mL)的Opti-MEM的混合物。在发酵过程中根据葡萄糖的消耗，添加葡萄糖溶液。在5-10天后收获包含分泌的抗体的上清液，并且直接由上清液纯化抗体，或冷冻并保存上清液。
纯化
通过使用MabSelectSure-琼脂糖TM(用于非IHH-AAA突变体)(GEHealthcare，Sweden)或KappaSelect-Agarose(用于IHH-AAA突变体)(GEHealthcare，Sweden)的亲和层析法，使用丁基-琼脂糖(GEHealthcare，Sweden)的疏水相互作用层析法和Superdex200尺寸排阻(GEHealthcare，Sweden)层析法，从细胞培养上清液纯化双特异性抗体。
简言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mMNa2HPO4，1mMKH2PO4，137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.4)平衡(非IHH-AAA突变和野生型抗体)的MabSelectSuRe树脂上，用平衡缓冲液洗涤，并用pH3.0的25mM柠檬酸钠洗脱。IHH-AAA突变体捕获在用25mMTris，50mMNaCl，pH7.2平衡的KappaSelect选择树脂上，用平衡缓冲液洗涤，并用pH2.9的25mM柠檬酸钠洗脱。汇集洗脱的抗体级分，并用2MTris，pH9.0中和。通过加入1.6M硫酸铵溶液至硫酸铵的终浓度为0.8M并用乙酸调节pH至pH5.0，制备抗体汇集物用于疏水相互作用层析。用35mM乙酸钠，0.8M硫酸铵，pH5.0平衡丁基-琼脂糖树脂后，将所述抗体上样到树脂上，用平衡缓冲液洗涤，并用线性梯度洗脱到pH5.0的35mM乙酸钠中。汇集含有(单特异性或双特异性)抗体的级分，进一步使用用20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0平衡的Superdex20026/60GL(GEHealthcare，Sweden)柱通过大小排阻层析纯化。汇集含有(单特异性或双特异性)抗体的级分，使用Vivaspin超滤装置(SartoriusStedimBiotechS.A.，France)浓缩至需要的浓度，并且保存在-80℃。
表：双特异的<VEGF-ANG-2>抗体的产量
在每个纯化步骤后通过使用微流体Labchip技术(microfluidicLabchip技术，CaliperLifeScience，USA)的CE-SDS分析纯度和抗体完整性。制备五μl的蛋白溶液用于利用HT蛋白表达试剂盒按照供应商的使用说明进行CE-SDS分析和使用HT蛋白表达芯片在LabChipGXII系统上分析。数据利用LabChipGX软件进行分析。
表：通过由CE-SDS确定的不同顺序的纯化步骤去除典型的副产物。
使用Superdex200分析性大小排阻柱(GEHealthcare，Sweden)在2xPBS(20mMNa2HPO4，2mMKH2PO4，274mMNaCl和5.4mMKCl，pH7.4)运行缓冲液中在25℃通过高效SEC分析抗体样品的聚集物含量。将25μg蛋白以0.75mL/min的流速注射到柱上，并且等度洗脱50分钟。
类似地，制备并纯化<VEGF-ANG-2>双特异性抗体VEGFang2-0012和VEGFang2-0201，具有下述产量：
此外可以类似地制备和纯化<VEGF-ANG-2>双特异性抗体，具有IHH-AAA突变和具有SPLE突变(SEQIDNO：42，SEQIDNO：43，SEQIDNO：44，SEQIDNO：45)的<VEGF-ANG-2>CrossMAbIgG4，具有IHH-AAA突变(SEQIDNO：46，SEQIDNO：47，SEQIDNO：48)的<VEGF-ANG-2>OAscFabIgG1，具有IHH-AAA突变和具有SPLE突变(SEQIDNO：49，SEQIDNO：50，SEQIDNO：51)的<VEGF-ANG-2>OAscFabIgG4，具有HHY-AAA突变和P329GLALA突变(SEQIDNO：90，SEQIDNO：91，SEQIDNO：40，SEQIDNO：41)的<VEGF-ANG-2>CrossMabIgG1，具有HHY-AAA突变和SPLE突变(SEQIDNO：92，SEQIDNO：93，SEQIDNO：44，SEQIDNO：45)的<VEGF-ANG-2>CrossMabIgG4，具有HHY-AAA突变(SEQIDNO：94，SEQIDNO：95，SEQIDNO：48)的<VEGF-ANG-2>OAscFabIgG1，和具有HHY-AAA突变和SPLE突变(SEQIDNO：96，SEQIDNO：97，SEQIDNO：51)的<VEGF-ANG-2>OAscFabIgG4，以及<IGF-1R>单特异抗体<IGF-1R>野生型(SEQIDNO：88，SEQIDNO：89)，具有IHH-AAA突变(SEQIDNO：88，SEQIDNO：90)的<IGF-1R>IgG1，具有YTE突变(SEQIDNO：88，SEQIDNO：91)的<IGF-1R>IgG1，具有KiH突变(SEQIDNO：88，SEQIDNO：92，SEQIDNO：93)的<IGF-1R>IgG1野生型，在孔洞链(SEQIDNO：88，SEQIDNO：94，SEQIDNO：95)中具有KiH突变和IHH-AAA突变的<IGF-1R>IgG1，在孔洞链(SEQIDNO：88，SEQIDNO：96，SEQIDNO：97)中具有KiH突变和HHY-AAA突变的<IGF-1R>IgG1，具有KiH突变和YTE突变(SEQIDNO：88，SEQIDNO：98，SEQIDNO：99)的<IGF-1R>IgG1，具有KiH突变和DDD突变(SEQIDNO：88，SEQIDNO：100，SEQIDNO：101)的<IGF-1R>IgG1，和具有HHY-AAA突变(SEQIDNO：88，SEQIDNO：112)的<IGF-1R>IgG1。
实施例2
分析和可展性(Developability)
小规模的基于DLS的粘度测量。
粘度测量基本上按照(He，F.等，AnalyticalBiochemistry(分析生物化学)399(2009)141-143)中所述进行。简言之，在加入聚苯乙烯胶乳珠(直径为300nm)和聚山梨醇酯20(0.02％v/v)之前，将样品浓缩至在pH5.5的200mM精氨酸琥珀酸酯中的各种蛋白浓度。通过经由0.4μm滤板的离心将样品转移到光学384-孔平板中，并用石蜡油覆盖。通过在25℃的动力光散射确定胶乳珠的表观直径。溶液的粘度可以计算为：η＝η0(rh/rh，0)(η：粘度；η0：水的粘度；rh：胶乳珠的表观流体动力学半径；rh，0：胶乳珠在水中的流体动力学半径。
为了允许在相同的浓度下比较各种样品，将粘度-浓度数据用门尼方程(Mooneyequation)(方程1)(Mooney，M.，Colloid.Sci.，6(1951)162-170；Monkos，K.，Biochem.Biophys.Acta304(1997)1339)和由此内插的数据进行拟合。
方程1
(S：蛋白的流体动力学相互作用参数；K：自集因子(self-crowdingfactor)；Φ：溶解的蛋白的体积分数)
结果显示在图2中：与在Fc区不具有IHH-AAA突变的VEGFang2-0015相比，在Fc区具有IHH-AAA突变的VEGFang2-0016在所有检测温度均显示出较低的粘度。
DLS聚集开始温度
在20mM组氨酸/组氨酸盐酸盐，140mMNaCl，pH6.0中以1mg/mL的浓度制备样品，通过经由0.4μm滤板的离心转移到光学384-孔平板中，并且用石蜡油覆盖。在以0.05℃/min的速率从25℃至80℃加热所述样品时，通过动力光散射重复测量流体动力学半径。聚集开始的温度定义为流体动力学半径开始增加的温度。结果显示在图3中。在图3中，显示了不具有IHH-AAA突变的VEGFang2-0015相对于在Fc区具有IHH-AAA突变的VEGFang2-0016的聚集。VEGFang2-0016表现出61℃的聚集开始温度，而不具有IHH-AAA突变的VEGFang2-0015表现出60℃的聚集开始温度。
DLS时程
在20mM组氨酸/组氨酸盐酸盐，140mMNaCl，pH6.0中以1mg/mL的浓度制备样品，通过经由0.4μm滤板的离心转移到光学384-孔平板中，并且用石蜡油覆盖。在将所述样品保持在50℃的恒定温度多至145小时时，通过动力光散射重复测量流体动力学半径。在该实验中，天然未折叠的蛋白在升高的温度下的聚集倾向将引起平均颗粒直径随时间的增加。这种基于DLS的方法对聚集物非常灵敏，原因在于这些聚集物高比例地(over-proportionally)贡献于三色的光强度。甚至在50℃(接近聚集开始温度的温度，见上文)145小时后，对于VEGFang2-0015和VEGFang2-0016二者，仅发现小于0.5nm的平均颗粒直径增加。
以100mg/ml在40℃存储七天
将样品浓缩至在pH5.5的200mM精氨酸琥珀酸酯中100mg/mL的终浓度，无菌过滤并且在40℃静置保存七天。在保存之前和之后，通过大小排阻层析法确定高分子量和低分子量种类(分别为HMWs和LMWs)的含量。在保存的样品与制备后立即测量的样品之间的HMW和LMW含量的差别分别报告为“HMW增加”和“LMW增加”。结果显示在下表和图4中，其显示与VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)相比，VEGFang2-0015(无IHH-AAA突变)表现出更高的主峰减少和更高的HMW增加。令人惊讶地，与VEGFang2-0015(无IHH-AAA突变)相比，VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)显示出较低的聚集倾向性。
表：在40℃七天后的δ主峰、HMW和LMW峰
使用T100或T200仪器(GEHealthcare)在25℃通过表面等离子共振(SPR)评价<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的功能分析。系统充分建立用于分子相互作用的研究。SPR-技术是基于接近于金包被的生物传感器芯片表面的折射率的测量。折射率的改变表示由固定的配体与以溶液注射的分析物之间的相互作用引起的表面上的质量变化。如果分子结合表面上固定的配体，则质量增加，并且反之亦然，在分析物与固定的配体解离的情形中，质量减少(反映复合物解离)。SPR允许对配体/分析物结合的持续的实时监测，由此确定缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。
实施例3
对VEGF，ANG-2，FcγR和FcRn的结合
VEGF同种型动力学亲和性包括物种-交叉-反应性的评估
使用由GEHealthcare供应的胺偶联试剂盒，将大约12,000个共振单位(RU)的捕获系统(10μg/mL山羊抗人F(Ab)’2；订单码(OrderCode)：28958325；GEHealthcareBio-SciencesAB，Sweden)在pH5.0偶联到CM5芯片(GEHealthcareBR-1005-30)上。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸缓冲盐水，包含0.05％吐温20TM)pH7.4。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并且用运行缓冲液致敏两次。通过以5μL/min的流速注射50nM溶液30秒而捕获双特异性抗体。通过300秒的以30μL/min的流速从300nM开始以1∶3稀释注射在溶液中不同浓度的人hVEGF121、小鼠mVEGF120或大鼠rVEGF164测量缔合。解离相监测多至1200秒，并且通过由样品溶液转换至运行缓冲液而引发。通过用pH2.1的甘氨酸溶液以30μL/min的流速洗涤60秒而使表面再生。通过减去由山羊抗人F(Ab’)2表面获得的反应而校正本体折射率差异(Bulkrefractiveindexdifferences)。也减去空白注射液(＝双重参比)。使用Langmuir1∶1模型计算表观KD和其他动力学参数。结果在下文显示。
ANG-2溶液亲和力包括物种-交叉-反应性的评估
通过确定平衡混合物中游离相互作用配偶体的浓度，溶液亲和力测量相互作用的亲和力。溶液亲和力测定包括混合<VEGF-ANG-2>双特异性抗体，保持在恒定浓度，使用不同浓度的配体(＝ANG-2)。使用由GEHealthcare供应的胺偶联试剂盒，将最大可能共振单位(例如，17,000个共振单位(RU))的抗体在pH5.0固定在CM5芯片(GEHealthcareBR-1005-30)表面上。样品和系统缓冲液是HBS-PpH7.4。流动池设置为25℃，并且样品区组设置为12℃，并用运行缓冲液致敏两次。为了产生校正曲线，将增加浓度的ANG-2注射到含有固定的VEGF-ANG-2>双特异性抗体的BIAcore流动池中。结合的ANG-2的量确定为共振单位(RU)并且针对浓度绘图。每种配体溶液(对于VEGF-ANG-2>双特异性抗体，从0至200nM的11个浓度)用10nMANG-2温育，并且允许在室温达到平衡。由在用已知量的ANG-2测量溶液响应之前和之后产生的校正曲线确定游离的ANG-2浓度。使用游离ANG-2浓度作为y轴和用于抑制所用的抗体浓度作为x轴，利用Model201，使用XLfit4(IDBS软件)设置4-参数拟合。通过确定该曲线的拐点计算亲和力。通过用0.85％H3PO4溶液以30μL/min的流速洗涤一次30秒，使表面再生。通过减去由空白偶联的表面获得的响应校正本体折射率差异。结果在下文显示。
FcRn稳态亲和力
对于FcRn测量，稳态亲和力用于比较针对彼此的双特异性抗体。将人FcRn稀释到偶联缓冲液(10μg/mL，乙酸钠pH5.0)中，并且使用BIAcore向导通过靶向固定方法固定在C1-芯片(GEHealthcareBR-1005-35)上至终响应200RU。流动池设置为25℃，并且样品区组设置为12℃，用运行缓冲液致敏两次。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸缓冲盐水，包含0.05％吐温20TM)pH6.0。为了对每种抗体评估不同的IgG浓度，制备62.5nM、125nM、250nM和500nM的浓度。流速设定为30μL/min，并且将不同的样品连续注射到芯片表面上，选择180秒的缔合时间。通过以30μL/min的流速注射pH8的PBS-T60秒而使表面再生。通过减去由空白表面获得的响应而校正本体折射率差异。也减去缓冲液注射(＝双重参比)。使用来自BIA-Evaluation软件的方法计算稳态亲和力。简言之，将RU值针对所分析的浓度绘图，产生剂量-响应曲线。基于2-参数拟合，计算上渐进线，允许确定半最大RU值，由此确定亲和力。结果显示在图5和下表。类似地，可以确定针对食蟹猴、小鼠和兔FcRn的亲和力。
FcγRIIIa测定
使用直接结合测定进行FcγRIIIa测定。通过使用由GEHealthcare供应的胺偶联试剂盒将大约3,000个共振单位(RU)的捕获系统(1μg/mLPenta-His；Qiagen)在pH5.0偶联到CM5芯片(GEHealthcareBR-1005-30)上。样品和系统缓冲液为HBS-P+pH7.4。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并且用运行缓冲液致敏两次。通过以5μL/min的流速注射100nM溶液60秒来捕获FcγRIIIa-His-受体。通过以30μL/min的流速注射100nM的双特异性抗体或单特异性对照抗体(IgG1亚类的抗-Dig和IgG4亚类抗体)180秒来测量结合。通过用pH2.5的甘氨酸溶液以30μL/min的流速洗涤120秒使表面再生。由于FcγRIIIa结合不同于Langmuir1∶1模型，利用这一测定仅确定结合/无结合。以相似的方式可以确定FcγRIa和FcγRIIa结合。结果显示在图6中，其中其遵循通过引入突变P329GLALA，没能检测到更多的针对FcγRIIIa的结合。
针对<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的独立的VEGF-和ANG-2-结合 的评估
通过使用由GEHealthcare供应的胺偶联试剂盒，将大约3,500个共振单位(RU)的捕获系统(10μg/mL山羊抗人IgG；GEHealthcareBio-SciencesAB，Sweden)在pH5.0偶联到CM4芯片(GEHealthcareBR-1005-34)上。样品和系统缓冲液为PBS-T(10mM磷酸缓冲盐水，包含0.05％吐温20TM)pH7.4。流动池的温度设置为25℃，样品区组的温度设置为12℃。捕获前，将流动池用运行缓冲液致敏两次。
通过以5μL/min的流速注射10nM溶液60秒来捕获所述双特异性抗体。通过确定针对顺序或同时添加(流速为30μL/min)的每种配体的活性结合能力来分析每种配体与所述双特异性抗体的独立结合：
1.注射浓度为200nM的人VEGF180秒(鉴定单一抗原结合)
2.注射浓度为100nM的人ANG-2180秒(鉴定单一抗原结合)
3.注射浓度为200nM的人VEGF180秒，接着另外注射浓度为100nM的人ANG-2180秒(在VEGF的存在下鉴定ANG-2结合)
4.注射浓度为100nM的人ANG-2180秒，接着另外注射浓度为200nM的人VEGF(在ANG-2的存在下鉴定VEGF结合)
5.共同注射浓度为200nM的人VEGF和浓度为100nM的人ANG-2180秒(同时鉴定VEGF结合和ANG-2结合)。
通过以30μL/min的流速用3MMgCl2溶液洗涤60秒使表面再生。通过减去由山羊抗人IgG表面获得的响应而校正本体折射率差异。
如果上述方法3，4&5得到的最终信号等于或与方法1和2各自的最终信号的总和相似，则所述双特异性抗体能够独立地交互地结合两种抗原。结果显示在下表中，其中两种抗体VEGFang2-0016、VEGFang2-0012都显示出能够独立地交互地结合VEGF和ANG-2。
对<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的同时VEGF-和ANG-2-结合的评估
第一，通过使用由GEHealthcare供应的胺偶联试剂盒，将大约1,600个共振单位(RU)的VEGF(20μg/mL)在pH5.0偶联到CM4芯片(GEHealthcareBR-1005-34)上。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸缓冲盐水，包含0.05％吐温20TM)pH7.4。。流动池设置为25℃，并且样品区组设置为12℃，并且用运行缓冲液致敏两次。第二，将50nM双特异性抗体溶液以30μL/min的流速注射180sec。第三，以30μL/min的流速注射hANG-2180秒。hANG-2的结合响应取决于与VEGF结合的双特异性抗体的量，并且表现出同时结合。通过用0.85％H3PO4溶液以30μL/min的流速洗涤60秒使表面再生。通过hANG-2与之前VEGF结合的<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的另外的特异性结合信号显示同时结合。对于两种双特异性抗体VEGFang2-0015和VEGFang2-0016，可以检测到与<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的同时的VEGF-和ANG-2-结合(数据未显示)。
表：结果：针对来自不同物种的VEGF同种型的动力学亲和力
表：结果：对ANG-2的溶液亲和力
表：结果：<VEGF-ANG-2>双特异性抗体对FcRn的亲和力
表：结果：对FcγRI-IIIa的结合
表：结果：VEGF-和ANG-2针对<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的独立的结合
实施例4
质谱法
本部分描述<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的表征，重点强调正确的组装。通过去糖基化的、并且完好或IdeS-消化(化脓链球菌(S.pyogenes)的IgG-降解酶)的VEGF-ANG-2>双特异性抗体的电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)来验证预测的一级结构。IdeS-消化这样进行：在100mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4，pH7.1中用2μgIdeS蛋白酶(制造者)在37℃温育100μg纯化的抗体5小时。随后，将所述抗体以1mg/mL的蛋白浓度在37℃在100mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4，pH7.1中用N-糖苷酶F、神经氨酸酶和O-糖苷酶(Roche)中去糖基化多至16小时，然后在SephadexG25柱(GEHealthcare)上通过HPLC脱盐。通过在装配有TriVersaNanoMate来源(Advion)的maXis4GUHR-QTOFMS系统(BrukerDaltonik)上进行的ESI-MS确定总质量。
关于IdeS-消化的、去糖基化的(下表)、或完好的、去糖基化的(下表)分子获得的质量对应于由<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的氨基酸序列推断的预测质量，所述双特异性抗体由两个不同的轻链LCANG-2和LCLucentis以及两个不同的重链HCANG-2和HCLucentis组成。
表：去糖基化的且IdeS-消化的双特异性<VEGF/ANG2>抗体VEGFang2-0201(无IHH-AAA突变)和VEGFang2-0012(有IHH-AAA突变)的质量
表：去糖基化的<VEGF/ANG2>抗体VEGFang2-0016(有IHH-AAA突变)和VEGFang2-0015(无IHH-AAA突变)的质量
实施例5
FcRn层析
与链霉抗生物素琼脂糖偶联：
向生物素化且透析的受体中加入1克链霉抗生物素蛋白琼脂糖(GEHealthcare)，并且摇动温育两小时。将受体衍生的琼脂糖填装到1mLXK柱(GEHealthcare)中。
使用FcRn亲和柱层析：
条件：
柱尺寸：50mmx5mm
床高度：5cm
上样：50μg样品
平衡缓冲液：20mMMES，具有150mMNaCl，调节至pH5.5
洗脱缓冲液：20mMTris/HCl，具有150mMNaCl，调节至pH8.8
洗脱：7.5CV平衡缓冲液，在30CV100％洗脱缓冲液中，10CV洗脱缓冲液中
人FcRn亲和柱层析
在下表中，提供<VEGF-ANG-2>双特异性抗体在包含人FcRn的亲和柱上的保留时间。数据使用上述条件获得。
表：结果：<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的保留时间
抗体 保留时间[min]
VEGFAng2-0015(没有IHH-AAA突变) 78.5
VEGFAng2-0201(没有IHH-AAA突变) 78.9
VEGFAng2-0012(有IHH-AAA突变) 2.7(空隙峰)
VEGFAng2-0016(有IHH-AAA突变) 2.7(空隙峰)
实施例6
具有IHH-AAA突变的抗体的药代动力学(PK)性质
使用针对人FcRn为转基因的FcRn小鼠得到的PK数据
在存活阶段
本研究包括雌性C57BL/6J小鼠(背景)；缺失FcRn但是对人FcRn是半合子转基因的小鼠(huFcRn，品系276-/tg)。
第1部分：
所有小鼠都玻璃体内注射一次，注射到右眼中2μL/只动物的适当的溶液(即，21μg化合物/只动物(VEGFAng2-0015(无IHH-AAA突变)或23.6μg化合物/只动物(VEGFAng2-0016(有IHH-AAA突变))。
将小鼠分成2组，每组6只动物。组1在第2、24和96小时采集血样，组2在给药后7、48和168小时采集血样。
向小鼠右眼玻璃体内的注射通过使用来自德国柏林PrecisionInstruments，Inc.的用于纳升注射的NanoFil微注射器系统。用2.5％异氟醚麻醉小鼠，并且对于小鼠眼的显现，使用具有40倍放大率的LeicaMZFL3显微镜和具有LeicaKL2500LCD闪光的环形光(ring-light)。然后，使用35号针头注射2μL的化合物。
通过对侧眼的眼球后静脉丛从每只动物采集血液，用于确定血清中的化合物水平。
在室温1小时后，通过在4℃离心(9,300xg)3分钟，从血液获得至少50μL的血清样品。离心后将血清样品直接冷冻，并且在分析之前冷冻保存在-80℃。组1的动物的治疗的眼在治疗后96小时分离出来，并且组2的动物的眼在治疗后168小时分离出来。在分析之前，样品冷冻保存在-80℃。
第2部分：
所有小鼠通过尾静脉静脉内注射一次，注射200μL/只动物的适当的溶液(即，21μg化合物/只动物(VEGFAng2-0015(无IHH-AAA突变))或23.6μg化合物/只动物(VEGFAng2-0016(有IHH-AAA突变))。
将小鼠分成2组，每组5只动物。组1在第1、24和96小时采集血样，组2在给药后7、48和168小时采集血样。从每只动物经由眼球后静脉丛采集血液，用于血清血清中的化合物水平。
在室温1小时后，通过在4℃离心(9,300xg)3分钟，从血液获得至少50μL的血清样品。离心后将血清样品直接冷冻，并且在分析之前冷冻保存在-80℃。
制备全眼裂解物(小鼠)
通过物理-化学破碎来自实验室动物的全眼获得眼裂解物。对于机械分解，将每只眼转移到1.5-mL具有圆锥形底部的微瓶中。冷冻并解冻后，眼用1mL细胞洗涤缓冲液洗涤一次(Bio-Rad，Bio-Plex细胞裂解试剂盒，Cat.No.171-304011)。在下一步骤中，加入500μL新鲜制备的细胞裂解缓冲液，并且使用1.5mL组织碾磨研棒(KimbleChase，1.5mL研棒，Art.No.749521-1500)将眼碾碎。然后，将混合物冷冻并解冻五次，并且再次碾磨。为了分离裂解物和其余的组织，将样品以4,500g离心4分钟。离心后，收集上清液，并且以定量ELISA进一步分析之前保存在-20℃。
分析
利用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定<VEGF-ANG-2>抗体在小鼠血清和眼裂解物中的浓度。
为了定量小鼠血清样品和眼裂解物中的<VEGF-ANG-2>抗体，进行标准固相系列夹心免疫测定，其中使用生物素酰化和洋地黄毒苷化的(digoxigenylated)单克隆抗体作为捕获和检测抗体。为了证实分析物双特异性的完整性，所述生物素酰化的捕获抗体识别抗-VEGF-结合位点，而所述洋地黄毒苷化的检测抗体将于分析物的ANG-2结合位点结合。然后，用与抗洋地黄毒苷抗体偶联的辣根过氧化物酶检测在链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定平板(SA-MTP)的固相上的捕获抗体分析物和检测抗体的结合的免疫复合物。洗去SA-MTP的未结合的物质并且加入ABTS-底物后，得到的信号与结合在SA-MTP的固相上的分析物的量成比例。然后，通过参照平行分析的校正剂将测量的样品信号转化成浓度来进行定量。
在第一步中，SA-MTP用100μL/孔的浓度为1μg/mL的生物素酰化的捕获抗体溶液(抗-独特型抗体mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS))在MTP-摇动器上以500rpm包被1小时。同时制备校正剂、QC-样品和样品。将校正剂和QC-样品稀释至2％血清基质；稀释样品直到信号在校正剂的线性范围内。
用捕获抗体包被SA-MTP后，用洗涤缓冲液300μL/孔洗涤平板三次。然后，将100μL/孔的校正剂、QC-样品和样品移液到SA-MTP上，并以500rpm再温育1小时。现在，分析物通过捕获抗体以其抗-VEGF结合位点结合在SA-MTP的固相上。温育并通过洗涤平板去除未结合的分析物后，向SA-MTP加入100μL/孔浓度为250ng/mL的第一检测抗体(抗-独特型抗体mAb<Id-<ANG-2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu))。同样地，将平板在摇动器上以500rpm温育1小时。洗涤后，向SA-MTP的孔中加入100μL/孔浓度为50mU/mL的第二检测抗体(pAb<洋地黄毒苷>S-Fab-POD(poly))，并且将平板以500rpm再温育1小时。在最后的洗涤步骤去除过量的检测抗体后，加入100μL/孔的底物(ABTS)。抗体-酶缀合物催化底物的颜色反应。然后，通过ELISA读取仪以405nm波长(参比波长：490nm([405/490]nm))测量信号。
药代动力学评价
利用药代动力学评价程序WinNonlinTM(Pharsight)，版本5.2.1通过非房室分析(non-compartmentalanalysis)计算药代动力学参数。
结果：
A)血清浓度
血清浓度的结果显示在以下表和图7B至7C中。
表：VEGFAng2-0015(没有IHH-AAA突变)：玻璃体内和静脉内施用后血 清浓度的比较
玻璃体内施用后的血清浓度 静脉内施用后的血清浓度
ID 平均浓度[μg/mL] 平均浓度[μg/mL]
1h 17.7
2h 9.8
7h 10.4 12.1
24h 6.4 8.3
48h 6.5 6.9
96h 3.4 4.1
168h 2.9 2.7
表：VEGFAng2-0016(具有IHH-AAA突变)：玻璃体内和静脉内施用后血 清浓度的比较
表：VEGFang2-0015(没有IHH-AAA突变)和VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)：玻璃体内施用后血清浓度的比较)
VEGFang2-0015(没有 VEGFang2-0016(具有
IHH-AAA突变) IHH-AAA突变)
ID 平均浓度[μg/mL] 平均浓度[μg/mL]
2h 9.8 7.0
7h 10.4 8.7
24h 6.4 2.2
48h 6.5 1.0
96h 3.4 0.1
168h 2.9 0.0
表：VEGFang2-0015(没有IHH-AAA突变)和VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)：静脉内施用后血清浓度的比较
结果：
B)左眼和右眼的眼裂解物的浓度
关于眼裂解物中的浓度的结果显示在下表和图7D-7E中。
表：在玻璃体内应用到右眼中后VEGFang2-0015(无IHH-AAA突变)在眼裂解物中的浓度
表：静脉内施用后眼裂解物中VEGFang2-0015(没有IHH-AAA突变)的浓度
表：玻璃体内施用于右眼后眼裂解物中VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)的浓度
表：静脉内施用后眼裂解物中VEGFang2-0016(具有IHH-AAA突变)的浓度
结果总结：
玻璃体内应用后，与无IHH-AAA突变的双特异性<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0015相比，在眼裂解物中，本文报道的双特异性<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0016(有IHH-AAA突变)显示出相似的浓度(96和168小时后)。
此外，玻璃体内应用后，与无IHH-AAA突变的双特异性<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0015相比，在血清中，本文报道的双特异性<VEGF-ANG-2>抗体VEGFang2-0016(有IHH-AAA突变)另外显示出更快速的清除和更短的半衰期。
实施例7
小鼠角膜微囊血管发生测定
为了检测具有各自的SEQIDNO：20和21的VEGF结合的VH和VL和具有SEQIDNO：28和29的ANG-2结合的VH和VL的双特异性<VEGF-ANG-2>抗体在体内对VEGF诱导的血管发生的抗血管发生作用，进行了小鼠角膜微囊血管发生测定。在该测定中，将VEGF浸没的Nylaflo圆片以与边缘血管(limbalvessel)固定距离植入到无血管的角膜的囊中。血管立即向角膜中生长，倾向于发展VEGF梯度。8-10周龄的雌性Balb/c小鼠购自德国苏尔茨费尔德的CharlesRiver。按照Rogers，M.S.，等，Nat.Protoc.2(2007)2545-2550所述的方法修改流程。简言之，在显微镜下，在麻醉的小鼠中使用手术刀片和尖锐的镊子在从边缘到角膜顶部的大约1mm处制备宽度约为500μm的微囊。植入直径为0.6mm的圆片(PallCorporation，Michigan)，并且使植入区域的表面变平滑。圆片在相应的生长因子或在赋形剂(vehicle)中温育至少30分钟。在3、5和7天后(或备选地，仅在3、5和7天后)，对眼睛拍照，并且测量血管反应。通过计算新血管面积/角膜的总面积的百分数来定量测定。
所述圆片负载300ngVEGF或作为对照的PBS，并植入7天。在第3、5和/或7天，随时监测从边缘到圆片的血管生长。在圆片植入前的一天，以10mg/kg的剂量静脉内施用抗体(由于静脉内应用，血清-稳定的VEGFang2-0015(无IHH-AAA突变)(其与VEGFang2-0016区别仅在于IHH-AAA突变，并且具有相同的抗-VEGF和抗-ANG-2VHs和VLs来介导效应)用作替代物)，用于检测在体内对VEGF-诱导的血管发生的抗血管发生作用。对照组的动物接受赋形剂。应用体积为10mL/kg。
实施例8
具有HHY-AAA突变的抗体的药代动力学(PK)性质
对于人FcRn为转基因的FcRn小鼠的PK数据
在存活阶段：
研究包括雌性C57BL/6J小鼠(背景)；小鼠FcRn缺陷，但对于人FcRn为半合子转基因的(huFcRn，品系276-/tg)
第1部分：
将所有小鼠用适当的IGF-1R0033，IGF-1R0035，IGF-1R0045溶液玻璃体内注射入右眼一次(即22.2μg化合物/动物的IGF-1R0033，24.4μg化合物/动物IGF-1R0035，32.0μg化合物/动物IGF-1R和32.0μg化合物/动物的IGF-1R0045)。
将十三只小鼠分配为2组，分别为每组6只和7只动物。剂量给药后，在第2，24和96小时从组1采集血液样品并且在第7，48和168小时从组2采集血液样品。
通过使用来自WorldPrecisionInstruments，Inc.，Berlin，Germany的用于纳升注射的NanoFil微量注射器系统向小鼠右眼进行玻璃体内注射。将小鼠用2.5％异氟烷麻醉，并且为了使小鼠眼可视化，使用40倍放大的LeicaMZFL3显微镜和具有LeicaKL2500LCD发光的环形发光体。随后，使用35-剂量注射器注射2μL的化合物。
通过来自各个动物的对侧眼的眼球后静脉丛收集血液，用于确定血清中的化合物水平。
在室温1小时后，通过在4℃离心(9,300xg)3分钟，从血液获得至少50μL的血清样品。离心后将血清样品直接冷冻并在分析前储存在-80℃。处理后96小时，分离组1的动物的处理的眼睛并且处理后168小时分离组2的动物的。分析前，将样品储存在-80℃。
第2部分：
经尾静脉用适当的IGF-1R0033，IGF-1R0035，IGF-1R0045溶液(即22.2μg化合物/动物的IGF-1R0033，24.4μg化合物/动物IGF-1R0035，32.0μg化合物/动物IGF-1R和32.0μg化合物/动物的IGF-1R0045)静脉内注射所有小鼠一次。
将十二只小鼠分配为2组，每组6只动物。剂量给药后，在第1，24和96小时从组1采集血液样品并且在第7，48和168小时从组2采集。通过来自各个动物的眼球后静脉丛收集血液，用于确定血清中的化合物水平。
在室温1小时后，通过在4℃离心(9,300xg)3分钟，从血液获得至少50μL的血清样品。离心后将血清样品直接冷冻并在分析前冷冻储存在-80℃。
细胞裂解缓冲液的制备
小心混合100μL因子1，50μL因子2和24.73mL细胞裂解缓冲液(均来自Bio-Rad，Bio-PlexCellLysisKit，目录号171-304011)并且添加125μLPMSF-溶液(174.4mg苯基甲基磺酰氟溶解在2.0mLDMSO中)。
全眼裂解物的制备(小鼠)
通过物理化学分解实验动物的全眼，获得眼裂解物。对于机械破坏，将各个眼转移至1.5mL的具有锥形底的微量小瓶中。融化后，将眼用1mL细胞洗涤缓冲液洗涤一次(Bio-Rad，Bio-PlexCellLysisKit，目录号171-304011)。在接着的步骤中，加入500μL新鲜制备的细胞裂解缓冲液并且使用1.5mL组织研磨杵(VWRInt.，Art.No.431-0098)将眼研磨。然后将混合物冻融五次并再次研磨。为了将裂解物从残留的组织中分离，将样品在4500xg离心4分钟。离心后，收集上清并储存在-20℃，直到进一步在定量ELISA中分析。
分析(血清)
为了定量小鼠血清样品中的抗体，进行标准固相顺序夹心免疫测定，使用生物素化和洋地黄毒苷化的单克隆抗体作为捕获和检测抗体。血清占约全部血液样品体积的50％。
更详细的，小鼠血清样品中的抗体浓度通过人-IgG(Fab)特异性酶联免疫吸附测定来确定。在室温，将链霉亲和素包被的微量滴定板用作为捕获抗体的，稀释在测定缓冲液中的生物素化的抗-人Fab(κ)单克隆抗体M-1.7.10-IgG孵育一小时，伴有搅拌。用磷酸缓冲的盐聚山梨醇酯-20(Tween20)洗涤三次后，加入不同稀释度的血清样品，接着在室温第二次孵育一小时。重复洗涤三次之后，结合的抗体通过随后与地高辛偶联的抗-人Fab(CH1)单克隆抗体M-1.19.31-IgG孵育，接着与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-地高辛抗体孵育来检测。使用ABTS(2，2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)；RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)作为HRP底物，形成有色反应产物。在405nm读取产生的反应产物的吸光度(ABTS；参考波长：490nm)。
所有样品，阳性和阴性对照样品都一式两份进行分析并且针对提供的抗体标准校准。
分析(眼裂解物)
小鼠眼裂解物样品中分析物的浓度使用基于仪器平台(RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)的定量电化学发光免疫测定(ECLIA)方法，在非GLP条件下确定。
37℃将未稀释的上清(眼裂解物)与捕获和检测分子孵育9分钟。生物素化的抗-人-Fab(κ)单克隆抗体M-1.7.10-IgG用作捕获分子并且钌(II)三(双吡啶基)3 2+标记的抗-人-Fab(CH1)单克隆抗体M-1.19.31-IgG用于检测。加入链霉亲和素包被的磁性微粒并在37℃另外孵育9分钟，以允许由于生物素-链霉亲和素的相互作用导致的进行的复合物的结合。微粒被磁性捕获在电极上并且使用共反应物三丙胺(TPA)产生化学发光信号。通过光电倍增检测器测量获得的信号。
表：标准图表IGF-1R0033
表：标准图表IGF-1R0035
表：标准图表IGF-1R0045
结果：
A)血清浓度
血清浓度结果显示在下标和图17中。
表：IGF-1R0033(没有HHY-AAA突变)：玻璃体内和静脉内施用后血清浓 度的比较(n.d.＝未确定)
表：IGF-1R0035(在一个Fc-区多肽中具有HHY-AAA突变)：玻璃体内和 静脉内施用后血清浓度的比较
表：IGF-1R0045(在两个Fc-区多肽中均具有HHY-AAA突变)：玻璃体内 和静脉内施用后血清浓度的比较(BLQ＝在定量极限以下)
表：静脉内施用相对1μg应用的抗体标准化的抗体IGF-1R0033，0035和0045后血清浓度的比较
结果：
B)左眼和右眼的眼裂解物中的浓度
眼裂解物中的浓度结果显示在下表和图18至20中。
表：玻璃体内施用于右眼后，IGF-1R0033(没有HHY-AAA突变)在眼裂解物中的浓度
表：静脉内施用后眼裂解物中IGF-1R0033(没有HHY-AAA突变)的浓度(BLQ＝低于定量极限)
表：玻璃体内施用于右眼后眼裂解物中IGF-1R0035(在一个Fc-区多肽中具有HHY-AAA突变)的浓度
表：静脉内施用后眼裂解物中IGF-1R0035(在一个Fc-区多肽中具有HHY-AAA突变)的浓度(BLQ＝低于定量极限)
表：玻璃体内施用于右眼后IGF-1R0045(在两个Fc-区多肽中均具有HHY-AAA突变)眼裂解物中的浓度
表：静脉内施用后眼裂解物中IGF-1R0045(在两个Fc-区多肽中均具有HHY-AAA突变)的浓度(BLQ＝低于定量极限)
表：玻璃体内施用于右眼后眼裂解物中相对1μg应用的抗体标准化的IGF-1R0033，0035和0045的浓度
结果总结：
在玻璃体内施用后，与没有HHY-AAA突变的抗-IGF-1R抗体(IGF-1R0033)相比，本文报道的抗-IGF-1R抗体0035和0045(具有一侧或两侧的HHY-AAA突变)在眼裂解物中显示类似的浓度(96和168小时后)。
此外，在玻璃体内施用后，与没有HHY-AAA突变的抗-IGF-1R抗体(IGF-1R0033)相比，本文报道的抗-IGF-1R抗体0035和0045(具有一侧或两侧的HHY-AAA突变)另外显示在血清中较快的清除和较短的半衰期。
尽管为了清楚理解，已经通过说明和实施例描述了前述发明的一些细节，本说明书和实施例不应该被认为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确通过引用以其整体并入本文。

Claims (53)

1.一种包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，由此，所述抗体在第一Fc-区多肽中和在第二Fc-区多肽中包含以下突变的组合
i)I253A、H310A和H435A，或
ii)H310A、H433A和Y436A，或
iii)L251D、L314D和L432D，或
iv)i)至iii)的组合，
由此，在i)的情况下，所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
所述抗体包含SEQIDNO：34、35、36和37的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：38、39、40和41的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：42、43、44和45的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：46、47和48的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：49、50和51的氨基酸序列。
2.一种包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，由此，所述抗体以比得上或小于在第一Fc-区多肽中和在第二Fc-区多肽中具有以下突变的组合的抗体的亲和力特异结合人FcRn
i)I253A、H310A和H435A，或
ii)H310A、H433A和Y436A，或
iii)L251D、L314D和L432D，或
iv)i)至iii)的组合，
由此，在i)的情况下，所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
所述抗体包含SEQIDNO：34、35、36和37的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：38、39、40和41的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：42、43、44和45的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：46、47和48的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：49，50，和51的氨基酸序列。
3.一种包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，其中
i)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变I253A、H310A和H435A，或
ii)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
iii)所述第一和第二Fc-区多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iv)所述第一Fc-区多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变H310A、H433A和Y436A，或
b)突变L251D、L314D和L432D，
或
v)所述第一Fc-区多肽包含突变H310A、H433A和Y436A并且所述第二Fc-区多肽包含
a)突变L251D，L314D和L432D，
由此，在i)的情况下，所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
所述抗体包含SEQIDNO：34、35、36和37的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：38、39、40和41的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：42、43、44和45的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：46、47和48的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：49、50和51的氨基酸序列。
4.一种包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽的抗体，其中
α)所述第一和第二Fc-区多肽二者都是人IgG1或人IgG4亚类的(源自人源)，并且在第一Fc-区多肽中包含一种或两种选自i)组I253A、H310A和H435A，或ii)组H310A、H433A和Y436A，或iii)组L251D、L314D和L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)的突变并且在第二Fc-区多肽中包含一种或两种选自包含突变L251D、I253A、H310A、L314D、L432D、H433A、H435A和Y436A(根据KabatEU索引编号系统编号)的组的突变，从而所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变当一并考虑时，导致突变i)I253A、H310A和H435A，或ii)H310A、H433A和Y436A，或iii)L251D、L314D和L432D包含在Fc-区中，或
β)所述第一和第二Fc-区多肽二者都是人IgG1或人IgG4亚类的(即源自人源)并且二者都在Fc-区中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据KabatEU索引编号系统编号)，由此，所有突变在第一或第二Fc-区多肽中，或者一种或两种突变在第一Fc-区多肽中并且一种或两种突变在第二Fc-区多肽中，从而所述第一和第二Fc-区多肽中的所有突变当一并考虑时，导致突变i)I253A、H310A和H435A，或ii)H310A、H433A和Y436A，或iii)L251D、L314D和L432D包含在Fc-区中，或
γ)所述第一和第二Fc-区多肽二者都是人IgG1或人IgG4亚类的(即源自人源)，并且在第一以及在第二Fc-区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D(根据KabatEU索引编号系统编号)，或包含第一Fc-区多肽中的突变I253A/H310A/H435A的组合和第二Fc-区多肽中的突变H310A/H433A/Y436A的组合(根据KabatEU索引编号系统编号)，
由此，在两种Fc-区多肽中突变I253A/H310A/H435A的组合的情况下，所述抗体不是包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，
其中
所述抗体包含SEQIDNO：34、35、36和37的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：38、39、40和41的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：42、43、44和45的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：46、47和48的氨基酸序列，或
所述抗体包含SEQIDNO：49、50和51的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体是双特异性抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体是双价抗体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其特征在于
i)所述第一Fc-区多肽选自包含以下各项的组
-人IgG1Fc-区多肽，
-人IgG2Fc-区多肽，
-人IgG3Fc-区多肽，
-人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变L234A，L235A的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变K392D的人IgG1、IgG2或IgG4，和
-具有突变N392D的人IgG3，
和
ii)所述第二Fc-区多肽选自包含以下各项的组
-人IgG1Fc-区多肽，
-人IgG2Fc-区多肽，
-人IgG3Fc-区多肽，
-人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变D399K、D356K和/或E357K的人IgG1，和
-具有突变D399K、E356K和/或E357K的人IgG2、IgG3或IgG4。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其特征在于
i)所述第一Fc-区多肽具有选自包含SEQIDNO：60、61、62、63、64、65、67、69、70、71、73、75、76、78、80、81、82和84的组的氨基酸序列，和
ii)所述第二Fc-区多肽具有选自包含SEQIDNO：60、61、62、63、64、66、68、69、70、72、74、75、76、77、79、81、83和85的组的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其特征在于
i)所述第一Fc-区多肽是人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是人IgG1Fc-区多肽，或
ii)所述第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽，或
iii)所述第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，或
iv)所述第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，或
v)所述第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，或
Vi)所述第一Fc-区多肽是人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是人IgG4Fc-区多肽，或
vii)所述第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，或
viii)所述第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，或
ix)所述第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，或
x)所述第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽并且所述第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其特征在于
i)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：60的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：60的氨基酸序列，或
ii)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：64的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：64的氨基酸序列，或
iii)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：70的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：70的氨基酸序列，或
iv)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：68的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：67的氨基酸序列，或
v)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：74的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：73的氨基酸序列，或
vi)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：63的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：63的氨基酸序列，或
vii)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：75的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：75的氨基酸序列，或
viii)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：76的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：76的氨基酸序列，或
ix)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：79的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：80的氨基酸序列，或
x)所述第一Fc-区多肽具有SEQIDNO：85的氨基酸序列并且所述第二Fc-区多肽具有SEQIDNO：84的氨基酸序列。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的抗体，其特征在于所述双特异性抗体具有一个特异结合人ANG-2的结合特异性和一个特异结合人VEGF的结合特异性。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：14的CDR3H区，SEQIDNO：15的CDR2H区，和SEQIDNO：16的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：17的CDR3L区，SEQIDNO：18的CDR2L区，和SEQIDNO：19的CDR1L区，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQIDNO：22的CDR3H区，SEQIDNO：23的CDR2H区，和SEQIDNO：24的CDR1H区，并且在轻链可变结构域中包含SEQIDNO：25的CDR3L区，SEQIDNO：26的CDR2L区，和SEQIDNO：27的CDR1L区。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点，
其中
i)特异结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQIDNO：20的氨基酸序列作为重链可变结构域VH和SEQIDNO：21的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL，并且
ii)特异结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQIDNO：28的氨基酸序列作为重链可变结构域VH和SEQIDNO：29的氨基酸序列作为轻链可变结构域VL。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的抗体，其特征在于包含
a)特异结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)特异结合ANG-2的第二全长抗体的修饰的重链和修饰的轻链，其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
15.根据权利要求14所述的抗体，其特征在于包含
a)SEQIDNO：102的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：36的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：103的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链和SEQIDNO：37的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
16.根据权利要求14所述的抗体，其特征在于包含
a)SEQIDNO：104的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：40的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：105的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链和SEQIDNO：41的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
17.根据权利要求14所述的抗体，其特征在于包含
a)SEQIDNO：106的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：44的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：107的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的重链和SEQIDNO：45的氨基酸序列作为第二全长抗体的修饰的轻链。
18.根据权利要求5至13中任一项所述的抗体，其特征在于包含
a)特异结合VEGF的第一全长抗体的重链和轻链，以及
b)特异结合ANG-2的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N-末端经由肽接头与轻链的C-末端连接。
19.根据权利要求18所述的抗体，其特征在于包含
a)SEQIDNO：108的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：48的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：109的氨基酸序列作为经由肽接头与第二全长抗体的轻链连接的第二全长抗体的重链。
20.根据权利要求18所述的抗体，其特征在于包含
a)SEQIDNO：110的氨基酸序列作为第一全长抗体的重链和SEQIDNO：51的氨基酸序列作为第一全长抗体的轻链，以及
b)SEQIDNO：111的氨基酸序列作为经由肽接头与第二全长抗体的轻链连接的第二全长抗体的重链。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的抗体，其特征在于，第二全长抗体的重链和轻链的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)通过在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100(根据KabatEU索引编号系统编号)之间引入二硫键而被二硫化物稳定化。
22.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：102、SEQIDNO：103、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37的氨基酸序列。
23.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：104，SEQIDNO：105，SEQIDNO：40，和SEQIDNO：41的氨基酸序列。
24.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：106、SEQIDNO：107、SEQIDNO：44和SEQIDNO：45的氨基酸序列。
25.一种特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：108、SEQIDNO：109和SEQIDNO：48的氨基酸序列。
26.一种包含特异结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异结合人ANG-2的第二抗原结合位点的双特异性双价抗体，其特征在于包含SEQIDNO：110、SEQIDNO：111和SEQIDNO：51的氨基酸序列。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体不结合人FcRn。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体结合或不结合葡萄球菌蛋白A。
29.根据权利要求27至28中任一项所述的抗体，其特征在于所述结合或不结合由表面等离子共振确定。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体
-与在Fc-区多肽中没有所述突变的相应双特异性抗体相比，显示较低的血清浓度(在小鼠FcRn缺陷，但对人FcRn为半合子转基因的小鼠中玻璃体内施用后96小时)(如实施例6中所述的测定法中确定)，和/或
-与在Fc-区多肽中没有所述突变的相应双特异性抗体相比，在全右眼裂解物中显示类似的(因子0.8至1.2)浓度(在小鼠FcRn缺陷，但对人FcRn为半合子转基因的小鼠中，右眼中玻璃体内施用后96小时)(如实施例6中所述的测定法中确定)。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体用于将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环的用途。
32.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用作药物。
33.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗眼血管疾病。
34.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除的用途。
35.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除。
36.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体用于治疗眼疾病，特别是眼血管疾病的用途。
37.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环的用途。
38.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
39.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗眼疾病。
40.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用于将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运至血液循环。
41.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从眼移除。
42.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗眼疾病，特别是眼血管疾病。
43.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，所述抗体用于将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
44.一种治疗具有眼血管疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的抗体。
45.一种用于在个体中将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环中的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的抗体以将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运至血液循环中。
46.一种在个体中将一种以上可溶性受体配体从眼移除的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的抗体以从眼移除一种以上可溶性受体配体。
47.一种在个体中将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的抗体以将一种以上可溶性受体配体从玻璃体内空间转运至血液循环。
48.一种在个体中将可溶性受体配体从玻璃体内空间或眼跨血眼屏障转运入血液循环中的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的抗体以将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障转运入血液循环中。
49.一种药物制剂，所述药物制剂包含根据权利要求1至30中任一项所述的抗体。
50.一种药物制剂，所述药物制剂包含根据权利要求1至30中任一项所述的抗体，其用于治疗眼血管疾病。
51.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗眼血管疾病。
52.一种治疗患有眼血管疾病的患者的方法，所述方法通过向需要这种治疗的患者施用根据权利要求1至30中任一项所述的抗体进行。
53.根据权利要求49至50中任一项所述的药物制剂和根据权利要求52所述的方法，其特征在于所述抗体经玻璃体内应用来施用。
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