KR20230061458A - Vegf-a 및 ang2에 결합하는 항체 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 예를 들어, 이중특이성 Fab 단편 형태의 항-VEGF-A/항-ANG2 항체 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

VEGF-A 및 ANG2에 결합하는 항체 및 사용 방법

발명의 분야

본 발명은 항-VEGF-A/항-ANG2 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

VEGF 및 ANG2에 결합하는 이중특이성 항체는 이전에 보고된 바 있으며, 연령 관련 황반 변성증과 같은 안구 혈관 질환의 치료를 위해 제안되어 왔다. VEGF에 특이적으로 결합하는 Fab 결합 팔과 ANG2에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 결합 팔을 포함하는 전장 IgG1 항체인 파리시맙(INN)은 DME 및 nAMD 치료를 위한 임상 3상 연구에서 현재 평가되고 있는 가장 진보된 이중특이성 치료제이다(Sharma, A., Kumar, N., Kuppermann, BD et al. Eye 34, 802-804 (2020)).

안구 혈관 질환의 치료를 위한, VEGF 및 ANG2를 표적으로 하는 또 다른 병용 치료가 지난 수 년 동안 제안되어 왔다(예를 들어, WO2016/122996 A1, WO2018/037000A1, WO2019/200006A2, US 2020/0102381 A1).

가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL)의 하나의 쌍에 2개의 파라토프를 포함하는 다중특이성 항체가 WO2008/027236; WO2010/108127 및 Bostrom, J. 외, Science 323 (2009) 1610-1614 및 WO2012/163520에 기재된 바 있다.

WO2012/163520에는 VH 및 VL 도메인의 하나의 쌍에 2개의 파라토프를 포함하는 이중특이성 항체(“DutaFabs”)가 개시되어 있다. WO2012/163520의 이중특이성 항체의 각각의 파라토프는 중쇄 및 경쇄 CDR 유래 아미노산을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR-H1 및 CDR-H3, 뿐만 아니라 경쇄 CDR-L2는 제1 파라토프에 기여하고 경쇄 CDR-L1 및 CDR-L3, 뿐만 아니라 중쇄 CDR-H2는 제2 파라토프에 기여한다. 개별 파라토프들을 포함하는 단일특이성 항체는 제1 또는 제2 파라토프가 다양한 서로 다른 Fab-라이브러리로부터 독립적으로 단리된다. 상기 단일특이성 항체의 아미노산 서열이 확인되고 이중 파라토프 VH 및 VL 쌍으로 병합된다. VEGF 및 IL-6에 특이적으로 결합하는 하나의 예시적인 Fab 단편은 WO2012/163520에 개시되어 있다.

그러나, 예를 들어, 표준 치료에 비해 효능을 개선하고 작용 기간을 개선하여 결과적으로 유리체강내 주사 빈도를 감소시켜 환자에 대한 투여 부담을 줄여주는 VEGF 및 ANG2에 결합하는 개선된 치료 항체가 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 항체 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

한 양상에서 본 발명은 가변 경쇄 도메인(VL 도메인) 및 가변 중쇄 도메인(VH 도메인)의 하나의 동족쌍 내부에 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 VEGF-A 파라토프는 항체의 CDR-H2, CDR-L1 및 CDR-L3 유래 아미노산 잔기를 포함하고, ANG2 파라토프는 항체의 CDR-H1, CDR-H3 및 CDR-L2 유래 아미노산 잔기를 포함한다.

한 양상에서 본 발명은 가변 경쇄 도메인(VL 도메인) 및 가변 중쇄 도메인(VH 도메인)의 하나의 동족쌍 내부에 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 상기 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인의 쌍은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 동시에 결합한다.

한 양상에서 본 발명은 가변 경쇄 도메인(VL 도메인) 및 가변 중쇄 도메인(VH 도메인)의 하나의 동족쌍 내부에 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하고, 이 항체는 서열 번호 19의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 20의 가변 경쇄 도메인을 가진 항체와 동일한 인간 VEGF-A 상의 에피토프에 그리고 이와 동일한 인간 ANG2 상의 에피토프에 결합한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에, 그리고 (ii)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 정적 광 산란(SLS)에 의해 측정했을 때, 한 실시형태에서 재료 및 일반적인 방법 섹션의 “열 안정성” 장에 기재된 바와 같은 SLS에 의해 측정했을 때, 70℃이상의 응집 개시 온도를 나타낸다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 정적 광 산란(SLS)에 의해 측정했을 때, 한 실시형태에서 재료 및 일반적인 방법 섹션의 “열 안정성” 장에 기재된 바와 같은 SLS에 의해 측정했을 때, 80℃초과의 용융 온도를 나타낸다.

한 양상에서 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 180 mg/ml의 항체 Fab 단편을 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은 실시예 8에 기재된 라텍스-비드 DLS 방법에 따른 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20℃에서 20 cP 미만의 점도를 갖는다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 서열 번호 21의 아미노산 서열, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다.

한 양상에서 본 발명은 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하는 VH 도메인, 및 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다. 한 실시형태에서, 항체는 다음과 같은 VH 도메인의 아미노산 잔기: D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, 및 D95, 및 다음과 같은 VL 도메인의 아미노산 잔기: I2, Y3, Y27, W27a, E32, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VEGF-A 파라토프; 및 다음과 같은 VH 도메인의 아미노산 잔기: H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, R94, V96, F98, 및 F99, 및 다음과 같은 VL 도메인의 아미노산 잔기: E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, 및 Y91를 포함하는 ANG2 파라토프를 포함한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, R66 및 R94를 포함함); 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 아미노산 잔기 I2, Y3, L46, F49, 및 E57을 포함함)을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 아미노산 치환은 서열 번호 19의 위치 1, 2, 4 내지 25, 28, 35d 내지 54, 59, 60, 67 내지 93, 97, 101 내지 113 중 하나 이상에 위치함); 및 (b) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인(여기서 아미노산 치환은 서열 번호 20의 위치 1, 4 내지 26, 27b 내지 27d, 33 내지 45, 47, 48, 51, 52, 58 내지 90, 96 내지 107에 위치함)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.

한 양상에서 본 발명은 서열 번호 19의 VH 서열 및 서열 번호 20의 VL 서열을 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 서열 번호 24의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 25의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에, 그리고 (ii)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 이 항체는 (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; 그리고 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에, 그리고 (ii)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합한다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 70 °C 이상의 응집 개시 온도를 나타낸다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 70 °C 이상의 응집 개시 온도를 나타낸다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80 °C 초과의 용융 온도를 나타낸다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80 °C 초과의 용융 온도를 나타낸다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 항체 Fab 단편의 180 mg/ml를 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은 실시예 8에 기재된 바와 같은 라텍스-비드 DLS 방법을 사용한 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20 °C에서 20 cP 미만의 점도를 가진다.

한 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 항체 Fab 단편의 180 mg/ml를 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은 실시예 8에 기재된 바와 같은 라텍스-비드 DLS 방법을 사용한 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20 °C에서 20 cP 미만의 점도를 가진다.

본 발명의 한 실시형태는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체 단편에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시형태는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 이중특이성 항체 단편에 관한 것이다. 한 실시형태에서 항체 단편은 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ 또는 이들로부터 유래된 단일 사슬 항체로부터 선택된다. 본 발명의 한 실시형태는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 Fab 단편에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시형태는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 Fv 단편에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시형태는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 전장 IgG 항체에 관한 것이다.

한 양상에서 본 발명은 본 발명의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시형태에서 숙주 세포는 CHO 세포이다. 한 실시형태에서 숙주 세포는 대장균 세포이다.

한 양상에서 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 배양하여 항체가 생산되는 단계를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체의 생산 방법을 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 항체를 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 추가로 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제제를 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 추가로 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 사전 충전형 주사기를 제공한다.

한 양상에서 본 발명은 추가로 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안구 이식물을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 포트 전달 장치를 포함한다.

본 발명의 한 양상에서 항체 또는 약학 제제는 포트 전달 장치에 의해 투여된다.

한 양상에서 본 발명은 약제로 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공하고, 한 실시형태에서는 혈관 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.

한 양상에서 본 발명은 약제, 한 실시형태에서 혈관 질환 치료용 약제의 제조에 있어서 본 발명의 항체 또는 본 발명의 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 또는 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 또는 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 것을 포함하는, 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 항체 Fab 단편의 형태로 제공되는 경우에도 그의 표적 항원에 독립적으로 결합할 수 있는 치료용 항-VEGF-A/항-ANG2 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는 안구 혈관 질환의 치료에 적합하다. 본 발명의 항체는 낮은 유효 투여량을 뒷받침하는 두 표적에 대한 높은 친화도 및 장기간 동안 유리한 높은 안정성과 같이 이를 치료적으로 사용할 수 있게 하는 몇 가지 유용한 특성을 제공한다. 비-항체 접근법과 비교하여 본 발명의 항체는 높은 인간성과 인공 도메인 및 링커의 결여로 인해 더 수용 가능한 경향이 있다. 또한, 본 발명의 항체는 안구 적용에 적합한 점도를 갖는 고농도 액체 제형으로 제공되는 것이 유리하다. 고농도로 제공될 수 있기 때문에, 본 발명의 항체를 사용한 치료는 한 번의 치료에 더 높은 용량의 치료제가 적용될 수 있어 치료 주기를 더 길게 할 수 있게 하기 때문에, 환자에게 더 수용 가능하다. 또한, 치료를 위한 이중특이성 Fab 단편으로서 사용되는 경우, 본 발명의 항체는 이중특이성 전장 IgG 항체와 비교할 때 용량 당 더 많은 결합 부위를 허용한다.

도면의 설명
도 1: 본 발명의 항-VEGF-A/항-ANG2 항체의 Fab 단편의 개략도. CDR 아미노산의 배열(상부 이미지)을 포함하는 동족 VH/VL 쌍의 하향식 도면이 도시되어 있다. VH 도메인은 회색으로 표시되고 VL 도메인은 흰색으로 표시된다. 또한, CDR 영역의 공간적 배열이 표시된다. 본 발명의 항체의 파라토프 영역은 H-CDR2, L-CDR1 및 L-CDR2 영역에 배열된 VEGF-A 파라토프와 H- CDR1, H-CDR3 및 L-CDR2 영역에 배열된 ANG2 파라토프를 가진다.
도 2: 본 발명의 예시적인 항-VEGF-A/항-ANG2 항체의 VH 도메인의 아미노산 서열. 아미노산 위치의 카밧 넘버링은 물론 CDR 및 FR 영역이 표시된다. 실시예 13에서 확인된 바와 같이 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프에 기여하는 아미노산 위치가 강조 표시되어 있다.
도 3: 본 발명의 예시적인 항-VEGF-A/항-ANG2 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열. 아미노산 위치의 카밧 넘버링은 물론 CDR 및 FR 영역이 표시된다. 실시예 13에서 확인된 바와 같이 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프에 기여하는 아미노산 위치가 강조 표시되어 있다.
도 4: 실시예 5에 따라 SPR을 통해 평가된, VEGF-A 및 ANG2에 대한 이중특이성 항체 P1AD9820의 독립적인 항원 결합.
도 5: 실시예 11에서 테스트한, 표시된 항체들의 VEGF-A121 및 VEGF-A165 차단 활성.
도 6: 실시예 11에서 테스트한, 표시된 본 발명의 항체 및 선행 기술 항체 유사체들의 VEGF-A121 및 VEGF-A165 차단 활성.
도 7: 실시예 10에서 테스트한, 표시된 본 발명의 항체 및 선행 기술 항체 유사체들의 VEGF-A 억제 분석을 위한 리포터 유전자 분석(RGA).
도 8: 실시예 10에서 테스트한, 표시된 본 발명의 항체 및 선행 기술 항체 유사체들의 ANG2 억제 분석을 위한 pTie2-분석.
도 9: 실시예 12에서 테스트한, P1AD9820에 의해 매개된 ANG1 억제.
도 10: 실시예 8에서 테스트하여 라텍스 비드 DLS 방법으로 측정된, 대장균에서 생성된 P1AA0902(왼쪽 위) 및 P1AD9820(오른쪽 위) Fab 단편 및 CHO에서 생성된 P1AD9820(중간)의 점도.

발명의 상세한 설명

1. 정의

본 명세서에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어들은 해당 분야의 숙련된 기술자들이 통상적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 내용상 달리 필요로 하는 것이 아닌 한, 단수형 용어들은 복수형을 포함하며, 복수형 용어들은 단수형을 포함한다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 본원에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, “~를 포함하는”이라는 용어는 “~로 이루어진”이라는 용어를 포함해야 한다.

특정 값(예를 들어, 온도, 농도, 시간 및 기타)과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 “약”은 용어 “약”이 나타내는 특정 값의 +/- 1%의 변동을 지칭할 것이다.

본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면, 단클론 항체, 다중특이성 항체 (예를 들면, 이중특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.

“단리된” 항체는 자연 환경의 구성성분에서 분리된 항체이다. 일부 실시형태들에 있어서, 항체는 예를 들면, 전기영동의 (예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프 (예로써, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 항체 순도 평가 방법의 검토는, 예를 들어, Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)를 참고하라.

본원에서 사용되는 용어 “단클론 항체”는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 예를 들어, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 “단클론(monoclonal)”은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다.

용어 “전장 항체”, “온전한 항체” 및 “전 항체 (whole antibody)”는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다.

항체의 “분류(class)”란 항체의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있으며: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들 중 몇몇은 하위부류(동형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분화될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 항체는 IgG₁ 이소형의 항체이다. 특정 실시형태에서, 항체는 Fc-영역 효과기 기능을 감소시키는 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG₁ 이소형이다. 다른 실시형태들에서, 항체는 IgG₂ 이소형의 항체이다. 특정 실시형태에서, 항체는 IgG₄ 항체의 안정성을 개선하기 위해 힌지 영역에 S228P 돌연변이를 갖는 IgG₄ 이소형이다. 상이한 면역글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 (κ) 및 람다 (λ)라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.

본원에서 용어 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 색인에 따른다.

“가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FRs)과 3개의 초가변 영역 (HVR들)을 포함한다 (예컨대, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91페이지(2007) 참조). 본 발명의 항체에서, VH 도메인 및 VL 도메인의 단일 쌍, 즉, 동족 VH/VL 쌍은 그의 2개의 표적: VEGF-A 및 ANG2에 특이적으로 결합한다.

“DutaFab”은 WO2012/163520에 개시된 이중특이성 항체이다. DutaFab에서 단일 쌍의 VH 도메인과 VL 도메인은 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 하나의 파라토프는 CDR-H2, CDR-L1 및 CDR-L3의 아미노산 잔기를 포함하고 다른 파라토프는 CDR-H1, CDR-H3 및 CDR-L2의 아미노 잔기를 포함한다. DutaFab은 동족 VH/VL 쌍 내부에 2개의 중첩되지 않는 파라토프를 포함하고 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 단일특이성 Fab 단편을 포함하는 라이브러리들의 스크리닝에 의한 DutaFab 및 이들의 생성 방법은 WO2012/163520에 개시되어 있다.

“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 정의에서 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.

“인간 공통 프레임워크”는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에 있어서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열들의 하위그룹들은 Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서와 같은 하위그룹이다. 한 실시형태에서, VL의 경우, 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 한 실시형태에서, VH의 경우, 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에서와 같은 하위그룹 III이다.

“항체 단편”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 “파라토프” 또는 “항원 결합 부위”는 항원을 인식하고 결합하는 항체의 일부를 의미한다. 파라토프는 Fv 영역의 3차 구조에서 공간적으로 근접하게 배열된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로부터의 여러 개별 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 본 발명의 항체는 하나의 동족 VH/VL 쌍에 2개의 파라토프를 포함한다.

본원에서 사용되는 “VEGF-A 파라토프”는 VEGF-A에 결합하는 파라토프 또는 항원 결합 부위이다. 본 발명의 항체의 VEGF-A 파라토프는 항체의 CDR-H2, CDR-L1 및 CDR-L3의 아미노산 잔기를 포함한다.

본원에 사용된 “ANG2 파라토프”는 ANG2에 결합하는 파라토프 또는 항원 결합 부위이다. 본 발명의 항체의 ANG2 파라토프는 항체의 CDR-H1, CDR-H3 및 CDR-L2 유래 아미노산 잔기를 포함한다.

본원에서 사용되는 “혈관 내피 성장 인자”(약어로 “VEGF”)라는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원 유래의 임의의 천연 VEGF를 지칭한다. 이 용어는 “전장”의, 비처리 VEGF, 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 VEGF을 포함한다. 이 용어는 또한 VEGF의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 VEGF의 아미노산 서열은 서열 번호 26에 제시되어 있다.

용어 “항-VEGF-A 항체” 및 “VEGF-A에 결합하는 항체”는 항체가 VEGF-A를 표적하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 VEGF-A에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 한 실시형태에서, 관련없는, 비-VEGF-A 단백질에 항-VEGF-A 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 VEGF-A에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에서, VEGF-A에 결합하는 항체는 ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM 또는 ≤ 0.01 nM의 해리 상수(K_D)를 갖는다. 항체의 K_D가 1μM 이하일 때 항체는 VEGF-A에 “특이적으로 결합”한다고 한다.

본원에서 사용되는 용어 “안지오포이에틴-2”(약어 “ANG2”)은, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처로부터의 임의의 천연 ANG2를 나타낸다. 이 용어는 “전장”의, 비처리 ANG2, 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 ANG2를 포함한다. 이 용어는 또한 ANG2의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 ANG2의 아미노산 서열은 서열 번호 27에 제시되어 있다.

용어 “항-ANG2 항체” 및 “항-ANG2에 결합하는 항체”는 항체가 항-ANG2를 표적하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 항-ANG2에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 한 실시형태에서, 관련없는, 비-항-ANG2 단백질에 대한 항-ANG2 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 항-ANG2에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에서, ANG2에 결합하는 항체는 ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM 또는 ≤ 0.03 nM의 해리 상수(K_D)를 갖는다. 항체의 K_D가 1μM 이하일 때 항체는 항-ANG2에 “특이적으로 결합”한다고 한다.

본 발명의 항체는 “인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 동시에 결합”하는데, 이는 (a) 인간 ANG2에 결합된 본 발명의 항체 Fab 단편이 (또한) 인간 VEGF-A에 특이적으로 결합하고, (b) 인간 VEGF-A에 결합된 본 발명의 항체 Fab 단편이 (또한) 인간 ANG2에 특이적으로 결합함을 의미한다. 동시 결합은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”은, 서열이 초가변이고 항원-접촉 잔기를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH 도메인에 3개(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 및 VL 도메인에 3개(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 가변 도메인의 CDR 잔기 및 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 상기 카밧 넘버링 체계에 따라 넘버링된다 (Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

본원에서 사용된 “프레임워크” 또는 “FR”은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 아미노산 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 프레임워크는 일반적으로 4가지 프레임워크 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR 및 FR 아미노산 서열들은 일반적으로 (a) VH 도메인에서: FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4; 그리고 (b) VL 도메인에서: FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4의 순서로 나타난다.

본원에서 사용되는 카밧 넘버링 체계에 따르면, 프레임워크 및 CDR 영역은 가변 도메인의 다음 영역에 위치한다:

* CDR-H1에서 위치 35b와 36 사이에 추가 아미노산이 존재할 수 있으며, 본원에서 도 2 및 3에 예시된 바와 같이 위치 “35c”, “35d” 및 “35e”로 지칭됨

본원에 언급된 카밧 넘버링 체계에 따른 아미노산 위치는 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 정렬하여 도 2 및 3에 예시되어 있다. 아미노산 서열 내의 특정 위치에 있는 아미노산은 본원에서 당업계에 잘 알려진 바와 같이 각각의 아미노산 및 아미노산 위치를 언급함으로써 지칭된다. “E2”는 각각의 항체 도메인의 아미노산 서열의 카밧 위치 2에 위치한 글루탐산 잔기를 지칭한다.

“친화도”는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 짝(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 본 명세서에 기재된 “결합 친화도”는 결합쌍(예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 그 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(K_D)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 해당 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정 될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시형태는 본원에 기재되어 있다.

용어 “에피토프”는 항체가 결합하는 단백질성 또는 비단백질성 항원 상의 부위를 나타낸다. 에피토프는 인접한 아미노산 스트레치(선형 에피토프)로부터 형성될 수 있거나, 예를 들어, 항원의 폴딩으로 인해, 즉, 단백질성 항원의 3차 폴딩에 의해 공간적으로 근접하게 되는 비연속 아미노산(입체형 에피토프)을 포함할 수 있다. 선형 에피토프는 전형적으로 단백질성 항원이 변성제에 노출된 후에도 여전히 항체에 의해 결합되는 반면, 입체형 에피토프는 전형적으로 변성제로 처리시 파괴된다. 에피토프는 고유한 공간 형태에 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8-10개 아미노산을 포함한다.

특정 에피토프에 결합하는 항체(즉, 동일한 에피토프에 결합하는 항체)에 대한 스크리닝은, 예를 들어, 제한 없이 알라닌 스캐닝, 펩티드 블롯(Meth. Mol. Biol. 248(2004) 443-463) 참조), 펩티드 절단 분석, 에피토프 절제, 에피토프 추출, 항원의 화학적 변형(Prot. Sci. 9 (2000) 487-496 참조) 및 교차 차단(“Antibodies” 참조, Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)과 같은 당업계의 관례적인 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

변형-보조 프로파일링(Modification-Assisted Profiling, MAP)로도 알려진 항원 구조-기반 항체 프로파일링(ASAP)은 다수 내지 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면의 항체 각각의 결합 프로파일을 기반으로 VEGF-A 또는 ANG2에 특이적으로 결합하는 다수의 단클론 항체를 비닝할 수 있다(예를 들어, US 2004/0101920 참조). 각 빈의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는데, 이 에피토프는 또 다른 빈으로 표시되는 에피토프와 뚜렷하게 다르거나 부분적으로 중첩되는 고유의 에피토프일 수 있다.

또한 경쟁적 결합은 항체가 본 발명의 참조 항체와 동일한 VEGF-A 또는 ANG2의 에피토프에 결합하는지 또는 이러한 결합에 대해 경쟁하는지를 용이하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 참조 항체와 “VEGF-A 및 ANG2의 동일한 에피토프에 결합하는 항체”는 각각의 경쟁 분석에서 참조 항체의 그 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단함을 의미하고, 반대로, 참조 항체는 각각의 경쟁 분석에서 상기 항체의 그 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 또한 예를 들어, 한 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 참조 항체를 포화 조건에서 VEGF-A 또는 ANG2에 결합하게 한다. 과량의 참조 항체를 제거한 후, 해당 항체가 VEGF-A 또는 ANG2에 결합하는 능력을 평가한다. 해당 항체가 참조 항체의 포화 결합 후 VEGF-A 또는 ANG2에 결합할 수 있는 경우, 해당 항체가 참조 항체와 다른 에피토프에 결합한다고 결론 내릴 수 있다. 그러나 참조 항체의 포화 결합 후 해당 항체가 VEGF-A 또는 ANG2에 결합할 수 없는 경우, 해당 항체는 참조 항체가 결합한 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 해당 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 입체적인 이유로 인해 결합이 방해를 받는지 확인하기 위해, 관례적인 실험(예를 들어, ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유동 세포 분석 또는 기타 당업계에서 이용가능한 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석)을 사용할 수 있다. 이 분석은 두 가지 설정, 즉, 두 항체가 모두 포화 항체인 상태에서 수행되어야 한다. 만약, 두 설정 모두에서 첫 번째(포화) 항체만 VEGF-A 또는 ANG2에 결합할 수 있는 경우, 해당 항체와 참조 항체가 VEGF-A 또는 ANG2에 결합하기 위해 경쟁한다고 결론을 내릴 수 있다.

일부 실시형태에서, 경쟁적 결합 분석에서 측정했을 때 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과량의 한 항체가 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90% 또는 심지어 99% 이상 억제하는 경우, 2개 항체들은 동일 또는 중첩 에피토프에 결합하는 것으로 보인다(예를 들어, Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502 참조).

일부 실시형태에서, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는, 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합도 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 하위 집합만이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 두 항체는 “중첩되는 에피토프”를 갖는 것으로 간주된다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 “아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)”는, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 정렬 목적에 있어서 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 대안적으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에서 제작되었으며 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었으며, WO 2000/005319에 기재되어 있다.

달리 언급이 없는 한, 본원의 목적을 위해 아미노산 서열 동일성% 값은 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 이상의 ggsearch 프로그램을 사용하여 또한 이후 BLOSUM50 비교 매트릭스를 사용하여 생성된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson 및 D. J. Lipman(1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson 외 공저 (1997) Genomics 46:24-36에 의해 개발되었으며 www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml or www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta로부터 공중이 이용가능하다. 또는 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 액세스할 수 있는 공용 서버를 사용하여 ggsearch(글로벌 단백질:단백질) 프로그램 및 기본 옵션(BLOSUM50; 열기: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 사용하여 서열들을 비교하여, 로컬이 아닌 글로벌 정렬이 수행되도록 할 수 있다. 아미노산 동일성 퍼센트는 출력 정렬 헤더에 제공된다.

“면역접합체”는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.

용어 “핵산 분자” 또는 “폴리뉴클레오티드”는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특히 퓨린- 또는 피리미딘 염기 (즉, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (즉, 데옥시리보스 또는 리보스) 및 포스페이트 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기 서열로 기재되며, 이 염기는 핵산 분자의 1차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기들의 서열은 일반적으로 5'으로부터 3'으로 제시된다. 본원에서, 용어 핵산 분자는, 예를 들어, 상보적 DNA (cDNA) 및 게놈 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히, 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태들, 그리고 둘 이상의 이러한 분자들을 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 또한, 핵산 분자라는 용어는 센스 및 안티센스 가닥 모두, 뿐만 아니라 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 더욱이, 본원에 기재된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 예에는 유도된 당 또는 포스페이트 백본 연결부 또는 화학적으로 변형된 잔기가 있는 변형된 뉴클레오티드 염기가 포함된다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이러한 DNA (예를 들어, cDNA) 또는 RNA (예를 들어, mRNA) 벡터는 비변형 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 개선하기 위하여 화학적으로 변형될 수 있으며, 이러한 mRNA는 대상체에 주사되어 생체내에서 항체를 생성할 수 있다 (예를 들어, 2017년 6월 12일 온라인으로 공개된 Stadler 등, Nature Medicine 2017, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1 참고).

“단리된” 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.

항체를 “인코딩하는 단리된 핵산”은, 단일 벡터 또는 별도의 벡터에 있는 이러한 핵산 분자를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 “벡터”는 이것이 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어에는 자가-복제 핵산 구조체로서의 벡터 그리고 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 “발현 벡터”로 지칭된다.

용어 “숙주 세포(host cell)”, “숙주 세포주(cell line)”, 및 “숙주 세포 배양물(culture)”은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 “형질전환체” 및 “형질전환된 세포”를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.

용어 “약학 조성물” 또는 “약학 제제 (pharmaceutical formulation)”란 이 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 약학 조성물이 투여되는 대상체에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.

“약학적으로 허용되는 담체”는 활성 성분 이외에 약학 조성물 또는 제형 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

제제, 예를 들어, 약학 조성물의 “유효량”은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그리고 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.

“개체” 또는 “대상체”는 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예컨대, 인간 및 비인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태들에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

본원에서 사용되는 “치료” (및 “치료하다” 또는 “치료하는”과 같은 이의 문법적 변형)는 치료를 받는 개체의 질환의 자연적 과정을 변경하려는 시도에 있어서의 임상적 개입을 의미하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 일부 실시형태들에 있어서, 본 발명의 항체는 질환 또는 질환의 발달을 지연 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 이용된다.

본원에서 사용되는 용어 “안구 질환”은 병리학적 혈관신생 및/또는 위축과 관련된 임의의 안구 질환을 포함한다. 안구 질환은 망막 또는 각막과 같은 안구 조직의 구조 내부로의 변경되거나 조절되지 않는 새로운 혈관의 증식 및/또는 침범을 특징으로 할 수 있다. 안구 질환은 망막 조직(광 수용체 및 기저 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막모세혈관층)의 위축을 특징으로 할 수 있다. 비-제한적 안구 질환은, 예를 들어 AMD(예를 들어, 습성 AMD, 건성 AMD, 중간 AMD, 진행성 AMD 및 지도모양 위축(GA)), 황반 변성, 황반 부종, DME(예를 들어, 초점, 비-중심 DME 및 미만성 중심 관련 DME), 망막 병증, 당뇨병성 망막증(DR)(예를 들어, 증식성 DR(PDR), 비증식성 DR(NPDR) 및 고 지대 DR), 기타 허혈 관련 망막 병증, ROP, 망막 정맥 폐색(RVO)(예를 들어, 중앙(CRVO) 및 분지(BRVO) 형태), CNV(예를 들어, 근시 CNV), 각막 혈관 신생, 각막 혈관 신생과 관련된 질환, 망막 혈관 신생, 망막/맥락막 혈관 신생과 관련된 질환, 중심 장액성 망막 병증(CSR), 병리적 근시, 폰 히펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, FEVR, 코우츠병, 노리 병, 골다공증-가성 신경교종 증후군(OPPG)과 관련된 망막 이상, 결막하 출혈, 피부홍조, 안구 신생혈관 질환, 신혈관 녹내장, 색소성 망막염(RP), 고혈압성 망막 병증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관 확장증, 홍채 혈관 신생, 안구 내 혈관 신생, 망막 변성, 낭포성 황반 부종(CME), 혈관염, 유두 부종, 망막염(CMV 망막염을 포함하지만, 이에 제한되지는 않음), 안구 흑색종, 망막 모세포종, 결막염(예를 들어, 감염성 결막염 및 비감염성(예를 들어, 알레르기성 결막염), 레버 선천성 흑암시(레버 선천성 흑암시 또는 LCA라고도 공지됨), 포도막염(감염성 및 비감염성 포도막염을 포함), 맥락 막염(예를 들어, 다초점 맥락 막염), 안구 히스토플라스마증, 안검염, 안구 건조증, 외상성 안구 손상, 쇼그렌 병 및 기타 안과 장애들을 포함하고, 상기 질환은 안구 혈관 신생, 혈관 누출 및/또는 망막 부종 또는 망막 위축과 관련이 있다. 또 다른 예시적인 안구 질환은 망막 층간분리증(망막 감각신경층의 비정상적 분할), 피부홍조와 관련된 질환(각의 신생 혈관) 및 모든 형태의 증식성 유리체 망막 병증을 포함한 섬유 혈관 또는 섬유 조직의 비정상적인 증식으로 인한 질환을 포함한다. 각막 신생혈관신생과 관련된 예시적인 질환은 유행병 각결막염, 비타민 A 결핍, 콘택트 렌즈 과도착용, 아토피성 각막염, 상윤부 각막염, 익상편 건성 각막염, 쇼그렌 증후군, 여드름 장미증, 필렉테눌로시스, 매독, 마이코박테리아 감염, 지질 변성, 화학적 화상, 박테리아 궤양, 진균 궤양, 단순 포진 감염, 대상포진 감염, 원생동물 감염, 카포시 육종, 잠식성 각막궤양, 테리엔 변연 변성, 변연 표피박리, 류마티스성 관절염, 전신 낭창, 다발동맥염, 외상, 베게너 유육종증, 공막염, 스티븐 존슨 증후군, 방사상 각막절개, 및 각막 이식 거부를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 혈관 누출 증가, 동맥류 및 모세 혈관 탈락을 포함한 맥락막 신생 혈관신생 및 망막 혈관계의 결함과 관련된 예시적인 질환은 당뇨병성 망막 병증, 황반 변성, 겸상 적혈구 빈혈, 유육종, 매독, 탄성섬유 가성 황색종, 페제트병, 정맥 폐색, 동맥 폐쇄, 경동맥 폐색 질환, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 라임 병, 전신성 홍반성 루푸스, 미숙아 망막 병증, 망막 부종(황반 부종을 포함), 일스병, 베체트 병, 망막염 또는 맥락막염을 유발하는 감염(예를 들어, 다초점 맥락막), 추정된 안구 히스토플라스마증, 베스트 병(유리 체형 황반 변성), 근시, 시신경 유두 소와, 평면부염, 망막 박리(예를 들어, 만성 망막 박리), 과다점성 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저 치료후 합병증을 포함하지만, 이제 제한되는 것은 아니다. 망막 조직의 위축(광수용체 및 기저 RPE)과 관련된 예시적인 질환은 위축성 또는 삼출성 AMD(예를 들어, 지도모양 위축 또는 진행성 건성 AMD), 황반 위축(예를 들어, 혈관 신생과 관련된 위축 및/또는 지도모양 위축), 당뇨병성 망막병증, 스타가르트 병, 소르스비 안저 이영양증, 망막 층간분리증 및 색소성 망막염을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

“약품 설명서”라는 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상용 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 지칭하는 데 사용된다.

2. 본 발명의 실시형태들의 상세한 설명

한 양상에서, 본 발명은 부분적으로 치료 적용을 위한 이중특이성 항체의 제공을 기반으로 한다. 특정 양상에서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 혈관 질환, 예를 들어, 안구 혈관 질환의 진단 또는 치료에 유용하다.

A. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 예시적인 항체

한 양상에서, 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공한다. 한 양상에서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 한 양상에서, 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

특정 양상에서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공되며, 이 항체는 VL 도메인과 VH 도메인의 한 동족 쌍 내부에 VEGF-A 파라토프(즉, VEGF-A에 결합하는 항원 결합 부위) 및 ANG2 파라토프(즉, ANG2에 결합하는 항원 결합 부위)를 포함하고, 여기서

· VEGF-A 파라토프는 항체의 CDR-H2, CDR-L1 및 CDR-L3 유래 아미노산 잔기를 포함하고, ANG2 파라토프는 항체의 CDR-H1, CDR-H3 및 CDR-L2 유래 아미노산 잔기를 포함하고; 및/또는

· 상기 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인의 쌍은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 동시에 결합하고; 및/또는

· 이 항체는 서열 번호 19의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 20의 가변 경쇄 도메인을 가진 항체와 동일한 인간 VEGF-A 상의 에피토프에 그리고 이와 동일한 인간 ANG2 상의 에피토프에 결합하고; 및/또는

· 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i) KinExA에 의해 측정했을 때 50pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에 결합하고, (ii) KinExA에 의해 측정했을 때 50pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합하고; 및/또는

· 이 항체의 항체 Fab 단편은 70℃ 이상의 응집 개시 온도를 나타내고; 및/또는

· 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80°C 이상의 융점을 나타내고; 및/또는

· 180 mg/ml의 항체 Fab 단편을 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은, 실시예 8에 기재된 라텍스-비드 DLS 방법에 따른 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20℃에서 20 cP 미만의 점도를 갖는다.

또 다른 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다.

또 다른 양상에서 본 발명은 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하는 VH 도메인, 및 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다. 한 실시형태에서, 항체는 다음과 같은 VH 도메인의 아미노산 잔기: D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, 및 D95, 및 다음과 같은 VL 도메인의 아미노산 잔기: I2, Y3, Y27, W27a, E32, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VEGF-A 파라토프; 및 다음과 같은 VH 도메인의 아미노산 잔기: H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, R94, V96, F98, 및 F99, 및 다음과 같은 VL 도메인의 아미노산 잔기: E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, 및 Y91를 포함하는 ANG2 파라토프를 포함한다.

또 다른 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하고); 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하고)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다.

또 다른 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, R66 및 R94를 포함함); 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 아미노산 잔기 I2, Y3, L46, F49, 및 E57을 포함함)을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다.

또 다른 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 아미노산 치환은 서열 번호 19의 위치 1, 2, 4 내지 25, 28, 35d 내지 54, 59, 60, 67 내지 93, 97, 101 내지 113 중 하나 이상에 위치함); 및 (b) 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인(여기서 아미노산 치환은 서열 번호 20의 위치 1, 4 내지 26, 27b 내지 27d, 33 내지 45, 47, 48, 51, 52, 58 내지 90, 96 내지 107에 위치함)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다.

또 다른 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공하며, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.

한 양상에서, 본 발명은 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열 대비 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양상에서, 서열 번호 19에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양상에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 양상에서, VH는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.

한 양상에서, 본 발명은 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열 대비 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체는 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양상에서, 서열 번호 20에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양상에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 특정 양상에서, VL 도메인은 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

또 다른 양상에서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공되며, 이 항체는 상기 제공된 임의의 양상에서와 같은 VH 서열 및 상기 제공된 임의의 양상에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 한 양상에서, 상기 항체는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하여 각각 서열 번호 19 및 서열 번호 20의 VH 및 VL 서열을 포함한다.

또 다른 양상에서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공되며, 이 항체는 서열 번호 24의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 25의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 양상에서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공되며, 이 항체는 서열 번호 17의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 18의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 추가 양상에서, 임의의 상기 양상에 따라 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체는 단클론 항체이다. 한 양상에서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')₂ 단편이다. 또 다른 양상에서, 항체는 전장 항체이다.

또 다른 양상에서, 상기 양상들 중 어느 하나에 따른 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체는 아래 섹션 1-5에 기재된 바와 같이, 상기 특징들을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:

1. 항체 친화도

특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM 또는 ≤ 0.01 nM의 해리 상수(K_D)로 VEGF-A에 결합한다. 바람직한 실시형태에서 본원에 제공된 항체는 ≤ 10pM, 바람직한 실시형태에서 ≤ 5pM의 해리 상수(K_D)로 인간 VEGF-A에 결합한다. 바람직한 실시형태에서 본원에 제공된 항체는 ≤ 10pM, 바람직한 실시형태에서 ≤ 5pM의 해리 상수(K_D)로 인간 VEGFA-121에 결합한다. 바람직한 실시형태에서 본원에 제공된 항체는 ≤ 10pM, 바람직한 실시형태에서 ≤ 5pM의 해리 상수(K_D)로 인간 VEGFA-165에 결합한다.

특정 실시형태에서, ANG2에 결합하는 항체는 ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM 또는 ≤ 0.03 nM의 해리 상수(K_D)를 갖는다. 바람직한 실시형태에서 본원에 제공된 항체는 ≤ 10pM, 바람직한 실시형태에서 ≤ 5pM의 해리 상수(K_D)로 인간 ANG2에 결합한다.

한 양상에서, K_D는 BIACORE^® 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 측정된다.

또 다른 양상에서, K_D는 KinExA 분석을 사용하여 측정된다. 한 실시형태에서, K_D는 VEGF-A 결합의 K_D 검출 또는 ANG2 결합의 K_D 검출을 위해, 재료 및 일반적인 방법 섹션에서 아래 기재된 바와 같은 조건하에 KinExA 분석을 사용하여 측정된다.

예를 들어, VEGF-A에 결합하는 항체의 K_D는 Sapidyne Instruments(Boise, ID)의 KinExA 3200 기기를 사용하는 분석에서 측정되고, PMMA 비드는 KinExA 핸드북 프로토콜(Adsorption coating, Sapidyne)에 따라 1ml PBS(pH7.4) 중 30μg의 항-VEGF-항체 MAB293(R&D)를 사용하여 항원으로 코팅된다. KinExA 평형 분석은 실행 완충액으로서 0.01% BSA 및 0.01% Tween20이 포함된 PBS pH 7.4를 사용하여 실온에서 수행되며, 샘플 및 비드는 LowCross 완충액(Candor Bioscience)에서 준비된다. 0.25 ml/min의 유속이 사용된다. 일정한 양의 VEGFA-121-His(50pM 및 두 번째 실험에서는 500pM)를 테스트 항체로 사용하여 적정하고, 평형화된 혼합물을 50pM의 일정한 VEGF의 경우 750μl, 500pM의 일정한 VEGF의 경우 125μl 부피의 KinExA 시스템에서 항-VEGF 항체(Mab293) 커플링된 비드들의 컬럼을 통과시킨다. 결합된 VEGFA-121의 검출은 농도가 250ng/ml인 두 번째 비오티닐화된 항-VEGF 항체(BAF293)를 사용하고 샘플 완충액에 250ng/ml 스트렙타비딘 Alexa Fluor™ 647 접합체를 주입하여 수행된다. K_D는 “표준 분석” 방법을 사용하여 KinExA 소프트웨어(버전 4.0.11)에 포함된 단일 부위 균일 결합 모델을 사용하여 데이터를 비선형 회귀 분석하여 얻는다. 이 소프트웨어는 K_D를 계산하고 데이터 포인트들을 이론적 K_D 곡선에 핏팅하여 95% 신뢰 구간을 결정한다. 95% 신뢰 구간은 K_D 낮음과 K_D 높음으로 표시된다.

예를 들어, ANG2에 결합하는 항체의 K_D는 Sapidyne Instruments(Boise, ID)의 KinExA 3200 기기를 사용하는 분석에서 측정되고, PMMA 비드는 KinExA 핸드북 프로토콜(Adsorption coating, Sapidyne)에 따라 1ml PBS(pH7.4) 중 20μg의 항-Ang2-항체 MAB098(R&D)를 사용하여 항원으로 코팅된다. KinExA 평형 분석은 실행 완충액으로서 0.01% BSA 및 0.01% Tween20이 포함된 PBS pH 7.4를 사용하여 실온에서 수행되며, 샘플 및 비드는 LowCross 완충액(Candor Bioscience)에서 준비된다. 0.25 ml/분의 유속이 사용된다. 일정한 양의 Ang2A-RBD-muFc(50pM 및 두 번째 실험에서는 500pM)를 테스트 항체로 사용하여 적정하고, 평형화된 혼합물을 50pM의 일정한 Ang2의 경우 750μl, 500pM의 일정한 Ang2의 경우 188μl 부피의 KinExA 시스템에서 항-Ang2 항체(MAB098) 커플링된 비드들의 컬럼을 통과시킨다. 결합된 Ang2의 검출은 농도가 250ng/ml인 두 번째 비오티닐화 항-Ang2 항체(BAM0981)를 사용한 후 샘플 완충액에 250ng/ml 스트렙타비딘 Alexa Fluor™ 647 접합체를 주입하여 수행된다. K_D는 “표준 분석” 방법을 사용하여 KinExA 소프트웨어(버전 4.0.11)에 포함된 단일 부위 균일 결합 모델을 사용하여 데이터를 비선형 회귀 분석하여 얻는다. 이 소프트웨어는 K_D를 계산하고 데이터 포인트들을 이론적 K_D 곡선에 핏팅하여 95% 신뢰 구간을 결정한다. 95% 신뢰 구간은 K_D 낮음과 K_D 높음으로 표시된다.

2. 항체 단편

특정 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 항체 단편이다.

한 양상에서, 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')₂ 단편, 특히, 본원에 기재된 바와 같은 Fab 단편이다. 온전한 항체들의 파파인 분해는 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(각각 VH 및 VL) 및 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1) 또한 함유하는 2개의 동일한 항원-결합 단편들, 소위 “Fab” 단편들을 생성한다. 따라서 용어 “Fab 단편”은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. “Fab' 단편”은 항체 힌지(hinge)의 영역으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 잔기들의 부가에 의해, Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')₂ 단편을 생성한다. 구조 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편에 대한 논의는 미국 특허 제5,869,046을 참조하라.

항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해 소화, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 대장균, CHO)에 의한 재조합 제조를 포함한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

바람직한 실시형태에서 본원에 제공된 항체는 Fab 단편이다.

한 실시형태에서 본원에 제공된 항체의 VH 도메인은 인간 VH3 프레임워크를 포함한다.

한 실시형태에서 본원에 제공된 항체의 VL 도메인은 인간 V카파1 프레임워크를 포함한다.

한 실시형태에서 본원에 제공된 항체의 CL 도메인은 카파 이소형이다.

한 실시형태에서 본원에 제공된 항체의 CH1 도메인은 인간 IgG1 이소형이다.

바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 카파 이소형의 CL 도메인 및 인간 IgG1 이소형의 CH1 도메인을 포함하는 Fab 단편이다.

3. 열 안정성

본원에서 제공되는 항체는 우수한 열 안정성을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체의 Fab 단편은 70℃이상의 응집 개시 온도를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체의 Fab 단편은 동적 광산란에 의해 측정했을 때 80℃초과의 융점을 나타낸다.

4. 다중특이성 항체

특정 양상에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이성 항체이다. “다중특이성 항체”는 최소 2가지 상이한 부위들, 즉, 상이한 항원들 상의 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 단클론 항체들이다. 특정 양상들에서, 다중특이성 항체는 3개 이상의 결합 특이성을 가진다.

본원에 제공된 항체를 포함하는 3개 이상의 결합 특이성을 갖는 다중 특이적 항체는 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 팔들에서 도메인 교차에 의해, 즉, VH/VL 도메인들 (예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447 참조), CH1/CL 도메인들 (예컨대, WO 2009/080253) 또는 완전한 Fab 팔들 (예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299 참고, 또한 Schaefer 외, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, 및 Klein 외, MAbs 8 (2016) 1010-20 참고)을 교환함으로써 비대칭 형태로 제공될 수 있다. 다중특이성 항체에 대한 다양한 추가적인 분자 형태들이 당업계에 공지되어 있으며 본원에 포함된다 (예를 들어, Spiess 외, Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106 참조).

5. 항체 변이체

특정 양상에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 상기 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질들을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 상기 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 내부에 적절한 변형을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특성, 예를 들어, 항원 결합을 보유하는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합이라도 이루어질 수 있다.

특정 양상들에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체들이 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위에는 CDR들 및 FR들이 포함된다. 보존적 치환들을 아래 표에서 “바람직한 치환”이라는 제목으로 나타낸다. 더 많은 실질적인 변화가 표 1의 “예시적 치환”이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 분류를 참조하여 이하에서 추가로 설명된다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입하고 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 생성물을 스크리닝할 수 있다.

표

아미노산은 다음과 같이 공통적인 측쇄 성질들에 따라 그룹화될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 측쇄 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존성 치환들은 이들 분류 중 하나의 구성원을 또 다른 분류의 구성원으로 교환하게 할 것이다.

치환적 변이체의 한 가지 유형은 모 항체의 하나 또는 그 이상의 CDR 잔기의 치환(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)과 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선별된 생성된 변이체(들)은 모 항체와 비교하였을 때, 특정 생물학적 성질들(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어, 개선)을 가지거나 및/또는 모 항체의 특정 생물학적 성질들을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 CDR 잔기는 돌연변이되며, 변이체 항체는 파지 상에서 디스플레이되며, 그리고 특정 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.

치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경으로 이 항체가 항원에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 CDR들에서 나타날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에 제공된 보존적 치환)이 CDR들에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, CDR들의 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 특정 변이체 VH 및 VL 서열들에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.

돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는데 유용한 방법은 “알라닌 스캐닝 돌연변이유발”로 지칭되며, Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 기재되어 있다. 이 방법에서, 표적 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예컨대, 하전된 잔기, 예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu)이 식별되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어, 항원과 항체의 상호작용이 영향을 받았는지를 판단한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 간의 접촉점을 동정할 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로서 표적되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 이들을 스크리닝할 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 효소(예를 들어, ADEPT (항체 지시된 효소 전구약물 요법)의 경우)에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.

a) 당화 변이체

특정 양상들에서, 본원에서 제공된 항체는 이 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 이루어질 수 있다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 올리고사카라이드가 변경될 수 있다. 포유동물 세포들에 의해 만들어지는 천연 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결부에 의해 일반적으로 부착된 분지화된, 이촉각성(biantennary) 올리고사카라이드를 전형적으로 포함한다. 예를 들어, Wright 외 TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예로써, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 상기 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 “스템(stem)”에 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드의 변형이 이루어질 수 있다.

한 양상에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 비-푸코실화된 올리고사카라이드, 다시 말하면 올리고사카라이드 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이런 비-푸코실화된 올리고사카라이드 (“아푸코실화된” 올리고사카라이드로서 또한 지칭됨)는 특히 N-연결된 올리고사카라이드인데, 이것은 이촉각성 올리고사카라이드 구조의 줄기에서 첫 번째 GlcNAc에 부착된 푸코오스 잔기가 없다. 한 양상에서, 선천적 또는 모 항체와 비교하여 Fc 영역에서 증가된 비율의 비-푸코실화 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 비-푸코실화 올리고사카라이드의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80% 또는 심지어 약 100% (즉, 푸코실화 올리고사카라이드가 존재하지 않음) 일 수 있다. 비-푸코실화 올리고사카라이드의 백분율은, 예를 들어, WO 2006/082515에 설명되어 있는 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된, Asn 297에 부착된 모든 올리고사카라이드(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조들)의 합에 대한 푸코스 잔기가 없는 올리고사카라이드의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ± 3의 아미노산, 가령, 위치 294와 300 사이에 또한 위치할 수 있다. Fc 영역에서 증가된 비-푸코실화된 올리고사카라이드를 갖는 이러한 항체는 개선된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 개선된 효과기 기능, 특히 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조.

푸코실화가 감소된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 외, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원 US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki 외, Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO 2003/085107 참조), 또는 GDP-푸코스 합성 또는 수송체 단백질의 활성이 감소되거나 제거된 세포 (예를 들어, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282 참조)가 포함된다.

한 추가 양상에서, 항체의 Fc 영역의 이촉각성 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 양분되어 있는, 양분된 올리고사카라이드를 가진 항체 변이체들이 제공된다. 이러한 항체 변이체는 상기 기재된 바와 같이 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체들의 예들은, 예컨대, Umana 외, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara 외, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.

Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에 최소한 한 개의 갈락토스 잔기를 가진 항체 변이체들이 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 설명되어 있다.

b) Fc 영역 변이체

특정 양상들에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

특정 양상들에서, 본 발명은 전체 효과기 기능이 아닌 일부만을 보유하는 항체 변이체를 고려하는데, 이들 변이체는 항체의 반감기도 중요하지만, 특정 효과기 기능 (가령, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC))은 불필요하거나 또는 유해한 용도에 바람직한 후보물질이 될 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 FcγR 결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인, NK 세포는 오로지 FcγRIII만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적 실시예는 미국 특허 제 5,500,362 (예컨대, Hellstrom, I. 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참조)에 설명되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 분석 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 그리고 CytoTox 96^® 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예컨대, Clynes 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 상기 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 이로 인하여 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 실행될 수 있다. 예로써, WO　2006/029879와 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다 (예를 들면, Gazzano-Santoro 외. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외. Blood. 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, M.S. 및 M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004) 참고). 또한 FcRn 결합과 생체내 제거율/반감기 결정은 해당 분야에 공지된 방법들을 이용하여 또한 실시될 수 있다 (예컨대, Petkova, S.B. 외. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) WO 2013/120929 Al 참조).

감소된 효과기 기능을 가진 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 또는 그 이상의 치환을 가진 것들을 포함한다(미국 특허 제6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 “DANA” Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 특허 번호 7,332,581).

FcRs에 대한 결합이 개선된 또는 감소된 특정 항체 변이체들이 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조.)

특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기는 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.

특정 양상들에서, 항체 변이체는 FcγR 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예컨대 Fc 영역의 위치 234 및 235(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 특정 양상들에서, 상기 항체 변이체는 인간 IgG₁ Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에 D265A 및/또는 P329G를 추가로 포함한다. 한 양상에서, 치환은 인간 IgG₁ Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역의 L234A, L235A 및 P329G (LALA-PG)이다. (예를 들어, WO 2012/130831 참조). 또 다른 양상에서, 치환은 인간 IgG₁ Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역의 L234A, L235A 및 D265A (LALA-DA)이다.

일부 양상들에서, Fc 영역 안에 예로써, 미국 특허 제 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 외 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 기재된 바와 같이, 변경된 (예를 들어, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 변경시키는 변경이 이루어진다.

태아로 모계 IgGs의 전달을 담당하는, 증가된 반감기와 신생아의 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체들(Guyer 외, J. Immunol. 117:587 (1976) 그리고 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994))은 US2005/0014934 (Hinton 외)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 치환들을 가진 Fc 영역을 내부에 포함한다. 이러한 Fc 변이체들에는 다음 중 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 치환을 갖는 것들이 포함된다: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예컨대 Fc 영역 잔기 434의 치환(예컨대, 미국 특허 제 7,371,826; Dall'Acqua, W.F., 외, J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524를 참조).

마우스 Fc-마우스 FcRn 상호작용에 중요한 Fc 영역 잔기는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 확인되었다(예를 들어, Dall'Acqua, W.F., 외, J. Immunol 169 (2002) 5171-5180을 참조). 잔기 I253, H310, H433, N434, 및 H435 (EU 색인 넘버링)는 상호작용에 관여한다 (Medesan, C., 외, Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., 외, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). 잔기 I253, H310 및 H435는 인간 Fc와 뮤린 FcRn의 상호작용에 중요한 것임이 밝혀졌다(Kim, J.K., 외, Eur.J.Immunol.29 (1999) 2819). 인간 Fc-인간 FcRn 복합체에 관한 연구는 잔기 I253, S254, H435, 및 Y436이 이러한 상호작용에 중요함을 보여주었다(Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., 외, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Yeung, Y. A. 외(J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)에서, 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437의 다양한 돌연변이체가 보고 및 조사되었다.

특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc-영역의 위치 253, 및/또는 310, 및/또는 435 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 253, 310 및 435에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 I253A, H310A 및 H435A이다. 예를 들어, Grevys, A., 외, J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508를 참조하라.

특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예컨대 Fc 영역의 위치 310, 및/또는 433, 및/또는 436(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 310, 433 및 436에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 상기 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 H310A, H433A 및 Y436A이다. (예를 들어, WO 2014/177460 A1 참조).

특정 양상들에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 252, 및/또는 254, 및/또는 256 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 252, 254, 및 256에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 상기 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 M252Y, S254T 및 T256E이다. Fc 영역 변이체들의 다른 예들에 관하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260; 미국 특허 제5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참조.

본원에 보고된 항체 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 끝나는 완전한 C-말단 일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 C 말단 아미노산 잔기 중 1개 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 한 바람직한 양상에서, 중쇄의 C-말단은 PG로 끝나는 단축된 C-말단이다. 본원에 보고된 모든 양상들 중 한 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, 아미노산 위치의 Kabat EU 색인 넘버링)를 포함한다. 본원에 보고된 모든 양상들 중 한 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신 잔기 (G446, 아미노산 위치의 EU 색인 넘버링)를 포함한다.

c) 시스테인 조작된 항체 변이체

특정 양상들에 있어서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 대체된, 시스테인 조작된 항체, 예컨대, THIOMAB™ 항체를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 특정 양상들에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근가능한 부위에서 나타난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이러한 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 예를 들어, 다음에서 설명되는 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 시스테인 조작된 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541, 8,30,930, 7,855,275, 9,000,130 또는 WO 2016040856에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.

6. 면역접합체

본 발명은 또한 하나 이상의 물질에 접합된(화학적으로 결합된); 한 실시형태에서 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위 원소에 접합된, 본원에 제공된 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.

한 실시형태에서 본 발명은 중합체에 접합된 본원에 제공된 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본원에서 사용되는 “중합체”라는 용어는 화학적 중합체 및 단백질 중합체를 포함한다. 한 실시형태에서 면역접합체는 연장된 재조합 폴리펩티드(XTEN)에 접합된 본원에 제공된 항체를 포함한다. “확장된 재조합 폴리펩티드”는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, US20190083577에 개시되어 있다. 한 실시형태에서 면역접합체는 (a)GGSPAGSCTSP, GASASCAPSTG, TAEAAGCGTAEAAA 및 GPEPTCPAPSG로부터 선택된 서열을 포함하고/하거나 (b) 36 내지 3000개 L-아미노산 잔기 길이이고/이거나 (c) 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P) 잔기들의 합이 XTEN의 총 아미노산 잔기의 90% 이상을 구성하는 XTEN을 포함한다.

B. 재조합 방법 및 조성물

항체는 예를 들어, US 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 이들 방법을 위해 항체를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산(들)이 제공된다.

한 양상에서, 본 발명의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.

한 양상에서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 이 때 이 방법은 상기 제공된, 항체를 인코딩하는 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 그리고 선택적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.

인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체의 재조합 생산을 위하여, 예컨대, 상기 기재한 항체를 인코드하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포 안에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위하여 하나 이상의 벡터 안으로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 시퀀싱하거나 재조합 방법에 의해 생성되거나 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.

항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편들 및 폴리펩티드 발현과 관련하여 예컨대, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523호를 참고하라. (대장균(E. coli)에서 항체 단편들의 발현을 설명하는Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 또한 참고) 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가로 정제될 수 있다. 한 실시형태에서 숙주 세포는 대장균 세포이다.

척추동물 세포들 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 개조시킨 포유동물 세포주들이 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham, F.L. 외, J. Gen Virol. 36, (1977) 59-74에 설명된 293 또는 293T 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, J.P. Biol. Reprod. 23, (1980) 243-252에 설명된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 마우스 유방 종양 (MMT 060562), (예를 들면, Mather, J.P. 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383, (1982) 44-68에 설명된) TRI 세포, MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 (Urlaub, G. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 Y0, NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토는 예컨대, Yazaki, P. 및 Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참고하라.

한 양상태에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)다. 한 바람직한 실시형태에서 숙주 세포는 CHO 세포이다. CHO 세포에서 본 발명의 항체의 생산은 항체의 주사가능성을 개선할 수 있다.

C. 약학 조성물

한 추가 양상에서, 예를 들어, 아래 치료 방법 중 어느 하나에 사용하기 위한 본원에 제공된 임의의 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 양상에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 양상에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 항체 및 적어도 하나의 추가 치료제, 예를 들어 아래 기재되는 치료제를 포함한다.

본원에 기재된 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체의 약학 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 동결 건조된 조성물 또는 수용액의 형태로 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 약학적으로 허용되는 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이며, 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 히스티딘, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 낮은 분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 복합체 (예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 세포간(insterstitial) 약물 분산 물질, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(HYLENEX^®, Halozyme, Inc.)을 포함한다. rHuPH20를 포함하는 특정 예시적인 sHASEGP 및 이를 이용하는 방법은 미국 공개 특허 출원 제2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 양상에서, sHASEGP는 하나 또는 그 이상의 추가 글리코사미노글리카나제, 예를 들어, 콘드로이티나제와 조합된다.

예시적인 동결건조된 항체 조성물은 미국 특허 제 6,267,958에 기재되어 있다.수용액 항체 조성물은 미국 특허 제 6,171,586 및 WO 2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 조성물은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.

본원의 약학 조성물은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 둘 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도한 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.

활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 준비된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼 (macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.

지속 방출을 위한 약학 조성물이 제조될 수 있다. 지속 방출 제재의 적합한 예들에는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다.

생체내 투여에 사용되는 약학 조성물은 일반적으로 멸균이다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다.

D. 치료 방법 및 투여 경로

본원에 제공된, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.

한 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공된다. 추가 양상에서, 혈관 질환을 치료하는데 사용하기 위한 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양상에서, 치료 방법에 사용하기 위한 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 양상들에서, 본 발명은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 유효량의 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 한 양상에서, 상기 방법은 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 추가 치료제)를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 양상에서, 본 발명은 혈관신생 억제에 사용하기 위한 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 양상들에서, 본 발명은 혈관신생을 억제하기 위해 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 유효량의 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 혈관신생을 억제하는 방법에서 사용하기 위한 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 제공한다. 상기 임의의 양상들에 따른 “개체”는 바람직하게는 인간이다.

추가 양상에서, 안구 질환을 치료하는데 사용하기 위한 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체가 제공된다. 한 실시형태에서, 안구 질환은, AMD(한 실시형태에서, 습성 AMD, 건성 AMD, 중간 AMD, 진행성 AMD 및 지도모양 위축(GA)), 황반 변성, 황반 부종, DME(한 실시형태에서, 초점, 비-중심 DME 및 미만성 중심 관련 DME), 망막 병증, 당뇨병성 망막증(DR)(한 실시형태에서, 증식성 DR(PDR), 비증식성 DR(NPDR) 및 고 지대 DR), 기타 허혈 관련 망막 병증, ROP, 망막 정맥 폐색(RVO)(한 실시형태에서, 중앙(CRVO) 및 분지(BRVO) 형태), CNV(한 실시형태에서, 근시 CNV), 각막 혈관 신생, 각막 혈관 신생과 관련된 질환, 망막 혈관 신생, 망막/맥락막 혈관 신생과 관련된 질환, 중심 장액성 망막 병증(CSR), 병리적 근시, 폰 히펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, FEVR, 코우츠병, 노리 병, 골다공증-가성 신경교종 증후군(OPPG)과 관련된 망막 이상, 결막하 출혈, 피부홍조, 안구 신생혈관 질환, 신혈관 녹내장, 색소성 망막염(RP), 고혈압성 망막 병증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관 확장증, 홍채 혈관 신생, 안구 내 혈관 신생, 망막 변성, 낭포성 황반 부종(CME), 혈관염, 유두 부종, 망막염(CMV 망막염을 포함하지만, 이에 제한되지는 않음), 안구 흑색종, 망막 모세포종, 결막염(한 실시형태에서, 감염성 결막염 및 비감염성(한 실시형태에서, 알레르기성 결막염), 레버 선천성 흑암시(레버 선천성 흑암시 또는 LCA라고도 공지됨), 포도막염(감염성 및 비감염성 포도막염을 포함), 맥락 막염(한 실시형태에서, 다초점 맥락 막염), 안구 히스토플라스마증, 안검염, 안구 건조증, 외상성 안구 손상, 쇼그렌 병 및 기타 안과 장애들로부터 선택되고, 상기 질환은 안구 혈관 신생, 혈관 누출 및/또는 망막 부종 또는 망막 위축과 관련이 있다. 하나의 실시형태에서 안구 질환은 AMD(한 실시형태에서 습성 AMD, 건성 AMD, 중간 AMD, 진행성 AMD 및 지도모양 위축(GA)), 황반 변성, 황반 부종, DME(한 실시형태에서 초점, 비중심 DME 및 미만성, 중추 관련 DME), 망막병증, 당뇨병성 망막병증(DR)(한 실시형태에서 증식성 DR(PDR), 비증식성 DR(NPDR) 및 고도 DR로부터 선택된다.

추가 양상에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에 있어서 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체의 용도를 제공한다. 한 양상에서, 약제는 혈관 질환 치료용이다. 한 추가 양상에서, 약제는 혈관 질환이 있는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 혈관 질환을 치료하는 방법에서의 용도에 관한 것이다. 이러한 한 양상에서, 상기 방법은 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

한 양상에서, 약제는 안구 질환 치료용이다. 한 추가 양상에서, 약제는 안구 질환이 있는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 안구 질환을 치료하는 방법에서의 용도에 관한 것이다. 이러한 한 양상에서, 상기 방법은 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

추가 양상에서, 본 발명은 혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 양상에서, 상기 방법은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체의 유효량을 이러한 혈관 질환을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 양상에서, 상기 방법은, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 안구 질환의 치료 방법을 제공한다. 한 양상에서, 상기 방법은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체의 유효량을 이러한 안구 질환을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 양상에서, 상기 방법은, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

상기 양상 중 하나에 따른 “개체”는 인간일 수 있다.

한 추가 양상에서, 본 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 본원에 제공된 임의의 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 양상에서, 약학 조성물은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 본원에 제공된 임의의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 양상에서, 약학 조성물은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 본원에 제공된 임의의 항체 및 적어도 하나의 추가 치료제, 예를 들어 아래 기재되는 치료제를 포함한다.

본 발명의 항체는 유리체내 투여(예를 들어, 유리체내 주사) 또는 포트 전달 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 포트 전달 장치를 사용하여 포트 전달 장치를 재충전하기 전 6개월 이상, 하나의 실시형태에서 8개월 이상, 하나의 실시형태에서 9개월 이상, 하나의 실시형태에서 12개월 이상의 기간에 걸쳐 투여된다. 한 실시형태에서 본 발명의 항체는 포트 전달 장치를 사용하여 투여되며, 이 항체는 150 mg/ml 이상의 농도로 포트 전달 장치에 적용되며, 한 실시형태에서는 200 mg/ml 이상의 농도로 적용된다 .

본 발명의 항체는 단독으로 투여되거나 병용 요법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 본 발명의 항체를 투여하는 것과 적어도 하나의 추가 치료제(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 추가 치료제)를 투여하는 것을 포함한다.

상기 임의의 실시형태들에 따른(또는 이에 적용되는) 특정 실시형태들에서, 안구 장애는 증식성 망막 병증, 맥락막 혈관 신생(CNV), 연령-관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 및 기타 허혈 관련 망막 병증, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 히펠-린다우 병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 정맥 폐색(RVO)(CRVO 및 BRVO를 포함), 각막 신생혈관신생, 망막 신생혈관 혈성 및 미숙아 망막 병증(ROP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 안내구 신생 혈관 질환이다.

일부 경우에, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체는 안구 장애, 예를 들어, 본원에 기재된 안구 장애(예를 들어, AMD(예를 들어, 습식 AMD), DME, DR, RVO 또는 GA)의 치료를 위한 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 투여될 수 있다.

임의의 적합한 AMD 치료제는 안구 장애(예를 들어, AMD, DME, DR, RVO, 또는 GA)의 치료를 위해 본원에 제공된 바와 같은 인간 VEGF 및 인간 ANG2에 결합하는 항체와 병용하여 추가 치료제로서 투여될 수 있으며, 여기에는 VEGF 길항제, 예를 들어 항-VEGF 항체(예를 들어, LUCENTIS®(라니비주맙), RTH-258(이전의 ESBA-1008, 항-VEGF 단일 사슬 항체 단편; Novartis), 또는 이중특이성 항-VEGF 항체(예를 들어, 항-VEGF/항-안지오포에이틴 2 이중특이성 항체, 예를 들어, 파리시맙; Roche)), 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질(예를 들어, EYLEA®(애플리버셉트)), 항- VEGF DARPin®(예를 들어, 아비시파르 페골; Molecular Partners AG/Allergan), 또는 항-VEGF 앱타머(예를 들어, MACUGEN®(페갑타닙 소듐)); 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 길항제, 예를 들어 항-PDGF 항체, 항-PDGFR 항체(예를 들어, REGN2176-3), 항-PDGF-BB 페길화된 앱타머(예를 들어, FOVISTA®; Ophthotech/Novartis ), 가용성 PDGFR 수용체 융합 단백질, 또는 이중 PDGF/VEGF 길항제(예를 들어, 소분자 억제제(예를 들어, DE-120(Santen) 또는 X-82(TyrogeneX)) 또는 이중특이성 항-PDGF/항-VEGF 항체)); VISUDYNE®(베르테포르핀)과 광역학 요법 병용; 항산화제; 보체 시스템 길항제, 예를 들어 보체 인자 C5 길항제(예를 들어, 소분자 억제제(예를 들어, ARC-1905; Opthotech) 또는 항-C5 항체(예를 들어, LFG-316; Novartis), 프로퍼딘 길항제(예를 들어, 항-프로퍼딘 항체, 예를 들어, CLG-561; Alcon), 또는 보체 인자 D 길항제(예를 들어, 항-보체 인자 D 항체, 예를 들어, 람팔리주맙; Roche)); C3 차단 펩티드(예를 들어, APL-2, Appellis); 시각 주기 조절제(예를 들어, 에믹수스타트 염산염); 스쿠알라민(예를 들어, OHR-102; Ohr Pharmaceutical); 비타민 및 미네랄 보충제(예를 들어, 연령 관련 안구 질환 연구 1(AREDS1, 아연 및/또는 항산화제) 및 연구 2(AREDS2, 아연, 항산화제, 루테인, 제아잔틴 및/또는 오메가-3 지방산)에 기재된 것들); 세포 기반 요법, 예를 들어 NT-501(Renexus); PH-05206388(Pfizer), huCNS-SC 세포 이식(StemCells), CNTO-2476(제대 줄기 세포주, Janssen), OpRegen(RPE 세포 현탁액, Cell Cure Neurosciences) 또는 MA09-hRPE 세포 이식(Ocata Therapeutics) ); 조직 인자 길항제(예를 들어, hI-con1; Iconic Therapeutics); 알파-아드레날린성 수용체 효능제(예를 들어, 브리모니딘 타르트레이트; Allergan); 펩티드 백신(예를 들어, S-646240; Shionogi); 아밀로이드 베타 길항제(예를 들어, 항-베타 아밀로이드 단클론 항체, 예를 들어, GSK-933776); S1P 길항제(예를 들어, 항-S1P 항체, 예를 들어, iSONEP™; Lpath Inc); ROBO4 길항제(예를 들어, 항-ROBO4 항체, 예를 들어, DS-7080a; Daiichi Sankyo); 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현하는 렌티바이러스 벡터(예를 들어, RetinoStat); 및 이들의 임의의 조합이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 경우에, AMD 치료제(이전의 AMD 치료제들을 포함)는 공동 제형화될 수 있다. 예를 들어, 항-PDGFR 항체 REGN2176-3은 애플리버셉트(EYLEA®)와 공동 제형화될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 공동 제형은 인간 VEGF 및 인간 ANG2에 결합하는 본 발명의 항체와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다.

VEGF 길항제(예를 들어, 루센티스® 또는 아일리아®), 코르티코 스테로이드(예를 들어, 코르티코스테로이드 임플란트(예를 들어, 오저덱스(OZURDEX)®(덱사메타손 유리체내 임플란트) 또는 일루비엔(ILUVIEN)®(플루오시놀론 아세토나이드 유리체내 임플란트)), 유리 체내 주사(예를 들어, 트리암시놀론 아세토나이드)에 의한 투여를 위해 제형화된 코르티코스테로이드 또는 이들의 조합을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 임의의 적합한 DME 및/또는 DR 치료제는 안구 질환(예를 들어, AMD, DME, DR, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 인간 VEGF 및 인간 ANG2에 결합하는 본 발명의 항체와 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다.

인간 VEGF 및 인간 ANG2에 결합하는 본원에 제공된 항체는 안구 장애(예를 들어, AMD, DME, DR, RVO 또는 GA)의 치료를 위한 요법 또는 수술 절차, 예를 들어 레이저 광응고(예를 들어, 범망막 광응고(PRP)), 드루젠 레이저, 황반 구멍 수술, 황반 전좌 수술, 이식형 소형 망원경, PHI-모션 혈관 조영술(마이크로 레이저 요법 및 영양 혈관 치료라고도 공지됨), 양성자 빔 요법, 미세 자극 요법, 망막 박리 및 유리체 수술, 공막 누름 조각, 황반하 수술, 동공 열요법, 광계 I 요법, RNA 간섭 사용(RNAi), 체외 유동술(막 차등 여과 및 유동술 요법이라고도 공지됨), 마이크로 칩 이식, 줄기 세포 요법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법(저산소 반응 요소에 대한 유전자 요법 포함, 옥스포드 바이오메디카(Oxford Biomedica); 렌티팍(Lentipak), 제네틱스(Genetix); 및 PDEF 유전자 치료, 젠벡(GenVec)), 광 수용체/망막 세포 이식(이식 가능한 망막 상피 세포를 포함, 디아크린(주)(Diacrin, Inc.)); 망막 세포 이식, 예컨대 Astellas Pharma US, Inc., ReNeuron, CHA Biotech), 침술 및 이들의 조합과 병용 투여될 수 있다.

상기의 이러한 병용 요법은 병용 투여(두 가지 또는 그 이상의 요법제가 동일한 또는 별도 제제 안에 함유됨), 및 별도 투여를 포함하고, 이 경우, 인간 VEGF 및 인간 ANG2에 결합하는 본 발명의 항체의 투여는 추가적인 요법제 및/또는 요법제들의 투여 이전, 동시 및/또는 이후에 일어날 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 VEGF 및 인간 ANG2에 결합하는 본 발명의 항체의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 간에 약 1, 2, 3, 4 또는 5개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내에 이루어진다.

본 발명의 항체 (및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료의 경우 필요에 따라 병변내 투여 될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 부분적으로 투여가 잠시 동안인지 또는 만성적인지에 따라, 예컨대, 주사, 이를 테면, 정맥 또는 피하 주사에 의한 것일 수 있다. 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 비롯한(그러나 이에 제한되지 않는) 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.

본 발명의 항체는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 제형화, 투여 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려해야 할 요소에는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 공지된 기타 요소가 포함된다. 항체는 꼭 그럴 필요는 없지만, 문제의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 선택적으로 제형화된다. 이러한 다른 물질들의 유효량은 약학 조성물에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 그리고 상기에서 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 설명된 투여 경로로 동일한 투여량으로 이용되거나, 또는 본원에서 논의된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 이용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위한, 본 발명의 항체의 적절한 용량(단독으로 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 상기 항체는 한 번에 또는 일련의 치료일정에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따르면, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체는 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 상기 언급된 요소들에 따라, 하나의 전형적인 일일 투여량의 범위는 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상이 될 수 있다. 수일 또는 보다 장기에 걸친 반복된 투여를 위하여, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증세가 바람직하게 억제될 때까지 지속될 것이다. 상기 항체 또는 면역접합체의 한 가지 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위 일 것이다. 따라서, 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg 또는 10mg/kg(또는 이의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들면 상기 환자는 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면 약 6회 용량의 항체를 제공받는다). 초기에는 보다 높은 부하 용량, 후속하여 보다 낮은 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터된다.

E. 제조 물품

본 발명의 또 다른 양상에서, 상기 설명된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 상기 제조 물품은 용기 및 용기 위에 또는 용기에 결합된 라벨 또는 약품 설명서를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료들, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 자체가 조성물을 보유하거나 병태의 치료, 방지 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 복합된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘이 뚫을 수 있는 마개를 가진 정맥 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 약품 설명서에는 이 조성물이 선택된 병태 치료에 이용된다는 것이 명시되어 있다.

더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 포함된 제1 용기, 여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함하고; 그리고 (b) 조성물이 포함된 제2 용기, 여기에서 상기 조성물은 또 다른 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에서 제조물품은 이 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있음이 표시된 약품 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 한편, 또는 추가적으로, 상기 제조 물품은 약학적으로-허용되는 완충액, 가령, 주사 (BWFI)용 정균수, 포스페이트 완충 염수, Ringer 용액 및 덱스트로즈 용액이 포함된 제2 (또는 제 3) 용기를 더 포함할 수 있다. 제조 물품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여 상업적으로 그리고 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다.

F. 장치

본 발명의 항체는 안구 이식물을 사용하여, 한 실시형태에서는 포트 전달 장치를 사용하여 눈에 투여될 수 있다.

포트 전달 장치는 소정 개월(예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 이상의 개월)의 기간에 걸쳐 치료제(예를 들어, 본 발명의 항체)를 방출 할 수 있는 이식가능하고 재충전가능한 장치이다. 사용될 수 있는 예시적인 포트 전달 장치는 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 공보 제 WO　2010/088548, WO2015/085234, WO 2013/116061, WO 2012/019176, WO　2013/040247, 및 WO 2012/019047(이들 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 ForSight Labs, LLC 및/또는 ForSight VISION4사의 장치들을 포함한다.

예를 들어, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체를 함유하는 저장소를 포함하는 포트 전달 장치를 제공한다. 포트 전달 장치는 근위 영역, 저장소와 유체 연통하는 근위 영역에 커플링된 관형 몸체, 및 저장소와 유체 연통하고 조성물을 눈으로 방출하도록 구성된 하나 이상의 배출구를 추가로 포함할 수 있다. 관형 몸체는 눈의 절개부 또는 개구부를 통해 삽입되도록 구성된 약 0.5mm 이하의 외경을 가질 수 있다. 이 장치는 길이가 약 1mm 내지 약 15mm(예를 들어, 약 1mm, 약 2mm, 약 4mm, 약 5mm, 약 6mm, 약 7mm, 약 9mm, 약 11mm, 약 13mm, 또는 약 15mm 길이)일 수 있다. 저장소는 임의의 적절한 부피를 가질 수 있다. 일부 경우에, 저장소는 약 1μl 내지 약 100μl(예를 들어, 약 1μl, 약 5μl, 약 10μl, 약 20μl, 약 50μl, 약 75μl, 또는 약 100μl)의 부피를 갖는다. 이러한 장치 또는 그 구성부들은 임의의 적절한 재료, 예를 들어, 폴리이미드로 만들어질 수 있다.

일부 예에서, 포트 전달 장치는 본원에 기재된 임의의 항체 및 하나 이상의 추가 화합물을 함유하는 저장소를 포함한다.

일부 경우에, 포트 전달 장치는 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항체 접합체 및 추가적인 VEGF 길항제를 포함한다.

3. 본 발명의 구체적인 실시형태

본 발명의 구체적인 실시형태들을 다음에 나열한다.

1. 가변 경쇄 도메인(VL 도메인) 및 가변 중쇄 도메인(VH 도메인)의 하나의 동족쌍 내부에 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 여기서 VEGF-A 파라토프는 항체의 CDR-H2, CDR-L1 및 CDR-L3 유래 아미노산 잔기를 포함하고, ANG2 파라토프는 항체의 CDR-H1, CDR-H3 및 CDR-L2 유래 아미노산 잔기를 포함하는, 항체.

2. 가변 경쇄 도메인(VL 도메인) 및 가변 중쇄 도메인(VH 도메인)의 하나의 동족쌍 내부에 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 여기서 상기 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인의 쌍은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 동시에 결합하는, 항체.

3. 가변 경쇄 도메인(VL 도메인) 및 가변 중쇄 도메인(VH 도메인)의 하나의 동족쌍 내부에 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 이 항체는 서열 번호 19의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 20의 가변 경쇄 도메인을 가진 항체와 동일한 인간 VEGF-A 상의 에피토프에 그리고 이와 동일한 인간 ANG2 상의 에피토프에 결합하는, 항체.

4. 가변 경쇄 도메인(VL 도메인) 및 가변 중쇄 도메인(VH 도메인)의 하나의 동족쌍 내부에 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 여기서

· VEGF-A 파라토프는 항체의 CDR-H2, CDR-L1 및 CDR-L3 유래 아미노산 잔기를 포함하고, ANG2 파라토프는 항체의 CDR-H1, CDR-H3 및 CDR-L2 유래 아미노산 잔기를 포함하고/하거나;

· 상기 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인의 쌍은 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 동시에 결합하고/하거나;

· 이 항체는 서열 번호 19의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 20의 가변 경쇄 도메인을 가진 항체와 동일한 인간 VEGF-A 상의 에피토프에 그리고 이와 동일한 인간 ANG2 상의 에피토프에 결합하고/하거나;

· 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i) KinExA에 의해 측정했을 때 50pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에 결합하고, (ii) KinExA에 의해 측정했을 때 50pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합하고/하거나;

· 이 항체의 항체 Fab 단편은 70℃이상의 응집 개시 온도를 나타내고/내거나;

· 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80°C 이상의 융점을 나타내고/내거나;

· 180 mg/ml의 항체 Fab 단편을 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은, 실시예 8에 기재된 라텍스-비드 DLS 방법에 따른 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20℃에서 20 cP 미만의 점도를 갖는, 항체.

5. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항체.

6. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항체.

7. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.

8. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.

9. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하는 VH 도메인, 및 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.

10. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 이 항체는 서열 번호 19의 VH 도메인 및 서열 번호 20의 VL을 갖는 항체의 VEGF-A 파라토프 및 ANG2 파라토프에 포함된 아미노산 잔기들을 포함하는, 항체.

11. 실시형태 9 또는 10에 있어서, 다음을 포함하는 항체:

- 다음과 같은 VH 도메인의 아미노산 잔기: D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, 및 D95, 및 다음과 같은 VL 도메인의 아미노산 잔기: I2, Y3, Y27, W27a, E32, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VEGF-A 파라토프; 및

- 다음과 같은 VH 도메인의 아미노산 잔기: H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, R94, V96, F98, 및 F99, 및 다음과 같은 VL 도메인의 아미노산 잔기: E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, 및 Y91를 포함하는 ANG2 파라토프.

12. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하는 VH 도메인, 및 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.

13. 실시형태 12에 있어서, 다음을 포함하는 항체:

- 다음과 같은 VH 도메인의 아미노산 잔기: D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, 및 D95, 및 다음과 같은 VL 도메인의 아미노산 잔기: I2, Y3, Y27, W27a, E32, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VEGF-A 파라토프; 및

- 다음과 같은 VH 도메인의 아미노산 잔기: H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, R94, V96, F98, 및 F99, 및 다음과 같은 VL 도메인의 아미노산 잔기: E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, 및 Y91를 포함하는 ANG2 파라토프.

14. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항체.

15. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함함); 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함함)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.

16. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항체.

17. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, R66 및 R94를 포함함); 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 아미노산 잔기 I2, Y3, L46, F49, 및 E57을 포함함)을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.

18. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항체.

19. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, (a) 최대 15개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 최대 15개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 항체.

20. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, (a) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 아미노산 치환은 서열 번호 19의 위치 1, 2, 4 내지 25, 28, 35d 내지 54, 59, 60, 67 내지 93, 97, 101 내지 113 중 하나 이상에 위치함); 및 (b) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인(여기서 아미노산 치환은 서열 번호 20의 위치 1, 4 내지 26, 27b 내지 27d, 33 내지 45, 47, 48, 51, 52, 58 내지 90, 96 내지 107에 위치함)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.

21. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 항체.

22. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, (a) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 최대 15개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 항체.

23. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 19의 VH 서열 및 서열 번호 20의 VL 서열을 포함하는, 항체.

24. 서열 번호 19의 VH 서열 및 서열 번호 20의 VL 서열을 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는, 항체.

25. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 24의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 25의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 항체.

26. 서열 번호 24의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 25의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체.

27. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 17의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 18의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 항체.

28. 서열 번호 17의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 18의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체.

29. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 항체 Fab 단편은 (i) KinExA에 의해 측정했을 때 50pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에 결합하고, (ii) KinExA에 의해 측정했을 때 50pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합하는, 항체.

30. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에, 그리고 (ii)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에 결합하는, 항체.

31. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에, 그리고 (ii)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합하는, 항체.

32. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에, 그리고 (ii)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합하는, 항체.

33. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, VH 및 VL 도메인의 하나의 쌍 내부에: (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하는 VH 도메인, 및 (ii) 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에, 그리고 (ii)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합하는, 항체.

34. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 (i)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에, 그리고 (ii)KinExA에 의해 측정했을 때 50 pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합하는, 항체.

35. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 이 항체의 항체 Fab 단편은 70℃이상의 응집 개시 온도를 나타내는, 항체.

36. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체의 항체 Fab 단편은 70℃이상의 응집 개시 온도를 나타내는, 항체.

37. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 70 °C 이상의 응집 개시 온도를 나타내는, 항체.

38. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 이 항체의 항체 Fab 단편은 70 °C 이상의 응집 개시 온도를 나타내는, 항체.

39. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, VH 및 VL 도메인의 하나의 쌍 내부에: (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하는 VH 도메인, 및 (ii) 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 이 항체의 항체 Fab 단편은 70 °C 이상의 응집 개시 온도를 나타내는, 항체.

40. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 이 항체의 항체 Fab 단편은 70 °C 이상의 응집 개시 온도를 나타내는, 항체.

41. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80°C 이상의 융점을 나타내는, 항체.

42. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80°C 이상의 융점을 나타내는, 항체.

43. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80 °C 초과의 용융 온도를 나타내는, 항체.

44. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80 °C 초과의 용융 온도를 나타내는, 항체.

45. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, VH 및 VL 도메인의 하나의 쌍 내부에: (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하는 VH 도메인, 및 (ii) 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80 °C 초과의 용융 온도를 나타내는, 항체.

46. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 이 항체의 항체 Fab 단편은 동적 광산란으로 측정했을 때 80 °C 초과의 용융 온도를 나타내는, 항체.

47. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 180 mg/ml의 항체 Fab 단편을 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은, 실시예 8에 기재된 라텍스-비드 DLS 방법에 따른 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20℃에서 20 cP 미만의 점도를 갖는, 항체.

48. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 여기서 180 mg/ml의 항체 Fab 단편을 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은 실시예 8에 기재된 라텍스-비드 DLS 방법에 따른 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20℃에서 20 cP 미만의 점도를 갖는, 항체.

49. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 항체 Fab 단편의 180 mg/ml를 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은 실시예 8에 기재된 바와 같은 라텍스-비드 DLS 방법을 사용한 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20 °C에서 20 cP 미만의 점도를 갖는, 항체.

50. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 여기서 항체 Fab 단편의 180 mg/ml를 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은 실시예 8에 기재된 바와 같은 라텍스-비드 DLS 방법을 사용한 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20 °C에서 20 cP 미만의 점도를 갖는, 항체.

51. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, VH 및 VL 도메인의 하나의 쌍 내부에: (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98, 및 F99를 포함하는 VH 도메인, 및 (ii) 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94, 및 P95를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르며, 여기서 항체 Fab 단편의 180 mg/ml를 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은 실시예 8에 기재된 바와 같은 라텍스-비드 DLS 방법을 사용한 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20 °C에서 20 cP 미만의 점도를 갖는, 항체.

52. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 이 항체는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 항체 Fab 단편의 180 mg/ml를 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은 실시예 8에 기재된 바와 같은 라텍스-비드 DLS 방법을 사용한 동적 광 산란에 의해 검출하였을 때 20 °C에서 20 cP 미만의 점도를 갖는, 항체.

53. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 단클론 항체인, 항체.

54. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체 단편인, 항체.

55. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항체는 이중특이성인, 항체.

56. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항체는 Fab 단편인, 항체.

57. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항체는 이중특이성 항체 단편인, 항체.

58. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항체는 다중특이성 항체인, 항체.

59. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항체는 인간 VEGF-A에 특이적으로 결합하는, 항체.

60. 전술한 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 항체는 인간 ANG2에 특이적으로 결합하는, 항체.

61. 실시형태 1 내지 58 중 어느 하나의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.

62. 실시형태 59의 핵산을 포함하는 숙주 세포.

63. 실시형태 61의 핵산을 포함하는 발현 벡터.

64. 실시형태 60의 숙주 세포를 배양하여 항체가 생산되는 단계를 포함하는, 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체의 생산 방법.

65. 실시형태 64에 있어서, 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

66. 실시형태 64 또는 65에 있어서, 숙주 세포는 대장균 세포인, 방법.

67. 실시형태 64 또는 65에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포인, 방법.

68. 실시형태 64 또는 65의 방법에 의해 생산된 항체.

69. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제제.

70. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 항체.

71. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 혈관 질환의 치료에 사용하기 위한, 항체.

72. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 안구 혈관 질환의 치료에 사용하기 위한, 항체.

73. 약제의 제조에서, 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 65의 약학 조성물의 용도.

74. 혈관신생을 억제하기 위한 약제의 제조에서, 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 65의 약학 조성물의 용도.

75. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 69의 약학 제제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법.

76. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 69의 약학 제제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 안구 혈관 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법.

77. 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법으로서, 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 69의 약학 제제의 유효량을 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 것을 포함하는, 방법.

78. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 69의 약학 제제를 포함하는 포트 전달 장치.

79. 포트 전달 장치에 의해 안구 투여하기 위한, 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 69의 약학 제제.

80. 실시형태 79의 포트 전달 장치에 의해 안구 투여하기 위한, 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 69의 약학 제제로서, 여기서 투여는 포트 전달 장치가 재충전되기 전 6개월 이상, 한 실시형태예에서 8개월 이상, 한 실시형태에서 9개월 이상의 기간에 걸쳐 이루어지는, 항체 또는 약학 제제.

81. 포트 전달 장치를 사용하여 항체 또는 약학 제제를 투여함으로써 약제로서 사용하기 위한 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나의 항체 또는 실시형태 69의 약학 제제로서, 이 항체는 150 mg 이상의 농도로, 한 실시형태에서 200 mg/ml 이상의 농도로 포트 전달 장치에 적용되는, 항체 또는 약학 제제.

아미노산 서열의 설명

실시예

다음의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고 제시된 절차에서 수정이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

재료 및 일반적인 방법

인간 VEGF-A121 친화성 Kinexa:

기기 및 재료:

오토샘플러가 있는 Sapidyne Instruments사(Boise, ID)의 KinExA 3200 기기를 사용했다. 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 비드는 Sapidyne에서 구입했고, 항-VEGF 항체는 R&D Systems(Mab293, BAF293)에서 구입했다. 스트렙타비딘 Alexa Fluor™ 647 접합체는 Thermo Fisher Scientific(S21374)에서 구입했다. PBS(포스페이트 완충 식염수), BSA(소 혈청 알부민 분획 V), VEGFA-121(서열 번호 28)을 회사 내부(Roche)에서 제조하였다.

항원 코팅 비드의 제조

PMMA 비드는 KinExA 핸드북 프로토콜에 따라 코팅되었다(흡착 코팅, Sapidyne). 먼저 흡착 코팅을 위해 비드들의 바이알(200mg) 하나 당 1ml PBS(pH7.4) 중의 30μg의 항-VEGF-항체 MAB293(R&D)을 첨가했다. 실온에서 2시간 동안 회전시킨 후, 상층액을 제거하고 블로킹 용액(완충액 중 10mg/ml BSA) 1ml를 채우고 1시간 동안 흔들었다.

KinExA 평형 분석

모든 KinExA 실험은 실행 완충액으로 0.01% BSA 및 0.01% Tween20(BioRad, #161-0781)이 포함된 PBS pH 7.4를 사용하여 실온(RT)에서 수행되었다. 샘플 및 비드는 이전 측정들에서 관찰된 비특이적 결합을 줄이기 위해 LowCross 완충액(Candor Bioscience)에서 준비되었다. 0.25ml/분의 유속을 사용했다. 일정한 양의 VEGFA-121-His(50pM 및 두 번째 실험에서 500pM)를 테스트 항체로 4nM(농도 범위 1.95pM - 4000pM)에서 시작하여 2배 연속 희석시켜 적정했다. 항원-항체 복합체는 평형에 도달할 수 있도록 RT에서 적어도 8시간 동안 인큐베이션되었다. 그런 다음 평형화된 혼합물을 50pM 일정한 VEGF의 경우 750μl의 부피 그리고 500pM 일정한 VEGF의 경우 125μl의 부피의 KinExA 시스템에서 항-VEGF 항체(Mab293) 커플링된 비드들의 컬럼을 통해 통과시켜, 용액의 평형 상태를 방해하지 않고 결합되지 않은 VEGFA-121을 비드들에 포획시켰다. 결합된 VEGFA-121은 농도가 250ng/ml인 두 번째 비오티닐화된 항-VEGF 항체(BAF293)를 사용하고 샘플 완충액에 250ng/ml 스트렙타비딘 Alexa Fluor™ 647 접합체를 주입하여 검출되었다. 각 샘플은 모든 평형 실험에 대해 중복 측정되었다. K_D는 “표준 분석” 방법을 사용하여 KinExA 소프트웨어(버전 4.0.11)에 포함된 단일 부위 균일 결합 모델을 사용하여 데이터를 비선형 회귀 분석하여 얻었다. 이 소프트웨어는 K_D를 계산하고 데이터 포인트들을 이론적 K_D 곡선에 핏팅하여 95% 신뢰 구간을 결정한다. 95% 신뢰 구간은 K_D 낮음과 K_D 높음으로 표시된다.

최종 K_D 결정을 위해 서로 다른 일정한 VEGFA-121 농도를 사용한 두 측정값의 n-곡선 결정이 수행되었다. n-곡선 분석은 보다 정확한 K_D를 결정하기 위해 동일한 축에서 여러 표준 K_D 실험들을 분석하는 데 사용될 수 있다.

인간 ANG2 친화성 Kinexa:

기기 및 재료:

오토샘플러가 있는 Sapidyne Instruments사(Boise, ID)의 KinExA 3200 기기를 사용했다. 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 비드는 Sapidyne에서 구입했고, 항-Ang2 항체는 R&D Systems(MAB098, BAM0981)에서 구입했다. 스트렙타비딘 Alexa Fluor™ 647 접합체는 Thermo Fisher Scientific(S21374)에서 구입했다. PBS(포스페이트 완충 식염수), BSA(소 혈청 알부민 분획 V), Ang2(서열 번호 27)을 회사 내부(Roche)에서 제조하였다.

항원 코팅된 비드의 제조

PMMA 비드는 KinExA 핸드북 프로토콜에 따라 코팅되었다(흡착 코팅, Sapidyne). 먼저 흡착 코팅을 위해 비드들의 바이알(200mg) 하나 당 1ml PBS(pH7.4) 중의 20 μg의 항-Ang2-항체 MAB098(R&D)을 첨가했다. 실온에서 2시간 동안 회전시킨 후, 상층액을 제거하고 블로킹 용액(완충액 중 10mg/ml BSA) 1ml를 채우고 1시간 동안 흔들었다.

KinExA 평형 분석

모든 KinExA 실험은 실행 완충액으로 0.01% BSA 및 0.01% Tween20(BioRad, #161-0781)이 포함된 PBS pH 7.4를 사용하여 실온(RT)에서 수행되었다. 샘플 및 비드는 이전 측정들에서 관찰된 비특이적 결합을 줄이기 위해 LowCross 완충액(Candor Bioscience)에서 준비되었다. 0.25ml/분의 유속을 사용했다. 일정한 양의 Ang2-RBD-muFc(50pM 및 두 번째 실험에서 500pM)를 테스트 항체로 4nM(농도 범위 1.95pM - 4000pM)에서 시작하여 2배 연속 희석시켜 적정했다. 항원-항체 복합체는 평형에 도달할 수 있도록 RT에서 적어도 8시간 동안 인큐베이션되었다. 그런 다음 평형화된 혼합물을 50pM 일정한 Ang2의 경우 750μl의 부피 그리고 500pM 일정한 Ang2의 경우 188μl의 부피의 KinExA 시스템에서 항-Ang2 항체(MAB098) 커플링된 비드들의 컬럼을 통해 통과시켜, 용액의 평형 상태를 방해하지 않고 결합되지 않은 Ang2을 비드들에 포획시켰다. 결합된 Ang2는 농도가 250ng/ml인 두 번째 비오티닐화된 항-Ang2 항체(BAM0981)를 사용하고 샘플 완충액에 250ng/ml 스트렙타비딘 Alexa Fluor™ 647 접합체를 주입하여 검출되었다. 각 샘플은 모든 평형 실험에 대해 중복 측정되었다. K_D는 “표준 분석” 방법을 사용하여 KinExA 소프트웨어(버전 4.0.11)에 포함된 단일 부위 균일 결합 모델을 사용하여 데이터를 비선형 회귀 분석하여 얻었다. 이 소프트웨어는 K_D를 계산하고 데이터 포인트들을 이론적 K_D 곡선에 핏팅하여 95% 신뢰 구간을 결정한다. 95% 신뢰 구간은 K_D 낮음과 K_D 높음으로 표시된다.

최종 K_D 결정을 위해 서로 다른 일정한 Ang2 농도를 사용한 두 측정값의 n-곡선 결정이 수행되었다. n-곡선 분석은 보다 정확한 K_D를 결정하기 위해 동일한 축에서 여러 표준 K_D 실험들을 분석하는 데 사용될 수 있다.

표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가된 인간 VEGF-A 결합 동역학:

항-His 포획 항체(GE Healthcare 28995056)를 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 시리즈 S 센서 칩 C1(GE Healthcare BR100535)에 고정화시켜 약 600 공명 단위(RU)의 표면 밀도를 생성했다. 실행 및 희석 완충액으로 HBS-P+(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)를 사용했다. 인간 VEGF-A121-His는 각각 약 10 및 20 RU의 리간드 밀도로 표면에 포획되었다. 테스트 항체의 연속 희석액(3.7 - 300 nM, 1:3 희석)을 각각 60초 동안 연속적으로 주입하고, 30 μl/분의 유속에서 3600초 동안 해리를 모니터링했다(단일 주기 동역학). 5μl/분의 유속으로 60초 동안 10mM 글리신 pH 1.5를 주입하여 표면을 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이는 블랭크 주입을 빼고 포획된 인간 VEGF-A121이 없는 대조군 유세포로부터 얻은 반응을 빼서 수정했다. 곡선 피팅은 Biacore 평가 소프트웨어 내부의 1:1 Langmuir 결합 모델을 사용하여 수행되었다.

교차반응성 시험을 위한 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가된 VEGF-A 결합 동역학:

항-His 포획 항체(GE Healthcare 28995056)를 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 시리즈 S 센서 칩 C1(GE Healthcare BR100535)에 고정화시켜 약 600 공명 단위(RU)의 표면 밀도를 생성했다. 실행 및 희석 완충액으로 HBS-P+(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)를 사용했다. 지시된 종들로부터 얻은 VEGF-A121-His는 각각 약 10 및 20 RU의 리간드 밀도로 표면에 포획되었다. 테스트 항체의 연속 희석액(3.7 - 300 nM, 1:3 희석)을 각각 60초 동안 연속적으로 주입하고, 30 μl/분의 유속에서 3600초 동안 해리를 모니터링했다(단일 주기 동역학). 5μl/분의 유속으로 60초 동안 10mM 글리신 pH 1.5를 주입하여 표면을 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이는 블랭크 주입을 빼고 포획된 VEGF-A121이 없는 대조군 유세포로부터 얻은 반응을 빼서 수정했다. 곡선 피팅은 Biacore 평가 소프트웨어 내부의 1:1 Langmuir 결합 모델을 사용하여 수행되었다.

표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가된 인간 ANG2 결합 동역학:

항-Fab 포획 항체(GE Healthcare 28958325)를 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 시리즈 S 센서 칩 C1(GE Healthcare BR100535)에 고정화시켜 약 800 공명 단위(RU)의 표면 밀도를 생성했다. 실행 및 희석 완충액으로 HBS-P+(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)를 사용했으며 측정 온도는 25°C였다. 5 μl/분의 유속으로 60초 동안 50 nM 용액을 주입하여 테스트된 항체를 포획하였다. 회합은 30 μl/분(0.07 nM - 50 nM, 1:3 희석)의 유속으로 180초 동안 용액 중에서의 다양한 농도로 인간 Ang2-RBD를 주입하여 측정되었다. 해리 단계는 최대 900초 동안 모니터링되었으며 30μl/분의 유속으로 샘플 용액으로부터 실행 버퍼로 전환시킴으로써 촉발되었다. 10mM 글리신 pH 2.1을 30μl/분의 유속으로 60초 동안 주입하여 표면을 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이는 블랭크 주입을 빼고 포획된 테스트 항체가 없는 참조 유동 세포로부터 얻은 반응을 빼어 보정되었다. 곡선 피팅은 Biacore 평가 소프트웨어 내부의 1:1 Langmuir 결합 모델을 사용하여 수행되었다.

교차반응성 시험을 위한 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가된 ANG2 결합 동역학:

항-Fab 포획 항체(GE Healthcare 28958325)를 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 시리즈 S 센서 칩 C1(GE Healthcare BR100535)에 고정화시켜 약 800 공명 단위(RU)의 표면 밀도를 생성했다. 실행 및 희석 완충액으로 HBS-P+(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)를 사용했으며 측정 온도는 25°C였다. 5 μl/분의 유속으로 60초 동안 50 nM 용액을 주입하여 테스트된 항체를 포획하였다. 회합은 30 μl/분(0.07 nM - 50 nM, 1:3 희석)의 유속으로 180초 동안 용액 중에서의 다양한 농도로 지시된 종들에서 유래한 Ang2-RBD를 주입하여 측정되었다. 해리 단계는 최대 600초 동안 모니터링되었으며 30μl/분의 유속으로 샘플 용액으로부터 실행 버퍼로 전환시킴으로써 촉발되었다. 10mM 글리신 pH 2.1을 30μl/분의 유속으로 60초 동안 주입하여 표면을 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이는 블랭크 주입을 빼고 포획된 항체가 없는 참조 유세포로부터 얻은 반응을 빼어 보정되었다. 곡선 피팅은 Biacore 평가 소프트웨어 내부의 1:1 Langmuir 결합 모델을 사용하여 수행되었다.

표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용한, 표적 항원에 대한 독립적인 결합의 평가

포획 시스템(항-Fab 포획 항체(GE Healthcare 28958325))의 약 5000개 공명 단위(RU)를 GE Healthcare사에서 공급한 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩(GE Healthcare BR100530)에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충액은 HBS-P+(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)였다. 유동 세포의 온도는 25°C로, 샘플 블록의 온도는 12°C로 설정했다. 포획하기 전에 유동 세포를 실행 완충액으로 세 번 프라이밍했다.

6.5μg/ml 용액을 5μl/분의 흐름으로 60초 동안 주입하여 이중특이성 Fab를 포획하였다. 이중특이성 Fab에 대한 각각의 리간드의 독립적인 결합은 순차적으로 또는 동시에(10 μl/분의 흐름) 첨가되는 각각의 리간드에 대한 활성 결합 능력을 결정함으로써 다음과 같이 분석되었다:

1) 60초 동안 1μg/ml의 농도로 인간 VEGFA-121을 주입(항원의 단일 결합을 확인).

2) 60초 동안 5μg/ml의 농도로 인간 Ang2를 주입(항원의 단일 결합을 확인)

3) 60초 동안 1μg/ml의 농도로 인간 VEGFA-121을 주입한 후 60초 동안 5μg/ml의 농도로 인간 Ang2를 추가 주입(VEGFA-121의 존재하에서 Ang2의 결합을 확인).

4) 60초 동안 5μg/ml의 농도로 인간 Ang2을 주입한 후 60초 동안 1μg/ml의 농도로 인간 VEGFA-121을 추가 주입(Ang2의 존재하에서 VEGFA-121의 결합을 확인).

5) 1μg/ml 농도의 인간 VEGFA-121과 5μg/ml 농도의 인간 Ang2를 60초간 동시 주입(VEGFA-121과 Ang2의 동시 결합을 확인).

10mM 글리신 pH 2.1을 30μl/분의 유속으로 60초 동안 주입하여 표면을 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이는 블랭크 주입을 빼고 포획된 이중특이성 Fab가 없는 참조 유세포로부터 얻은 반응을 빼어 보정되었다. 이중특이성 항체는 접근법 3, 4 및 5에서 생성된 최종 신호가 접근법 1 및 2의 개별 최종 신호의 합과 동일한 경우 상호 독립적으로 두 항원에 결합할 수 있다.

열 안정성:

이중특이성 항체 Fab 단편의 샘플을 20mM 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 140mM NaCl, pH 6.0에서 1mg/mL의 농도로 제조하고 10μL 마이크로-큐벳 어레이로 옮겼다. UNcle 기기(Unchained Labs)를 사용하여 266nm 레이저로 여기 시 정적 광산란 데이터 및 형광 데이터를 기록하고 샘플을 30°C에서 90°C까지 0.1°C/분의 속도로 가열한다. 샘플은 삼중으로 측정되었다.

개시 온도의 평가는 UNcle 분석 소프트웨어에 의해 수행되었다. 응집 개시 온도는 산란광 강도가 증가하기 시작하는 온도로 정의된다. 열에 대한 형광 신호의 무게 중심 평균(BCM)의 이동으로 단백질의 변성을 모니터링했다. 용융 온도는 BCM(nm) 대 온도 곡선의 변곡점으로 정의된다.

물리화학적 안정성:

항체 샘플을 20mM His/HisCl, 140mM NaCl, pH 6.0에서 제형화하고, 3개의 분취물로 나누었다: 하나의 분취물을 각각 PBS로 재완충하고, 2개의 분취물을 원래 제제에 보관하였다. PBS 분취물과 하나의 His/HisCl 분취물을 1 mg/ml에서 40°C(His/NaCl) 또는 37°C(PBS)에서 2주(2w) 동안 인큐베이션하고, PBS 샘플을 총 4주(4w) 동안 추가로 인큐베이션했다. 세 번째 대조군 분취물 샘플은 -80°C에서 보관되었다. 인큐베이션 종료 후, 샘플을 상대적 활성 농도(Biacore; 스트레스를 가한 각 결합제의 두 분취물의 활성 농도는 스트레스를 가하지 않은 4℃분취물로 정규화됨), 응집(SEC) 및 단편화(모세관 전기영동 또는 SDS-PAGE, CE-SDS)에 대해 분석하고 및 미처리 대조군과 비교하였다.

기능적 안정성 테스트를 위해 SPR에 의해 평가된 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2 결합 동역학

VEGFA-121(회사 내부), 단백질 A(Pierce/Thermo Scientific 21181) 및 항인간 Fab 포획 항체(GE Healthcare 28958325)를 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 시리즈 S 센서 칩 CM5(GE Healthcare 29104988)에 서로 다른 유동 세포 상에서 고정시켜, hVEGFA-121 및 단백질 A에 대해 3000의 표면 밀도 및 항-인간 Fab 포획 항체에 대해 12000 공명 단위(RU)를 생성하였다. 실행 및 희석 완충액으로 HBS-N(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, GE Healthcare)을 사용했다. 다음 농도 측정을 위한 샘플 및 실행 완충액은 HBS-P(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20; GE Healthcare)였다. 유동 세포의 온도는 25°C로, 샘플 블록의 온도는 12°C로 설정했다. 유동 세포는 농도 측정 전에 실행 완충액으로 두 번 프라이밍되었다. 먼저, 10μg/ml 용액을 10μl/분의 유속으로 120초 동안 주입하여 인간 Ang2-RBD-hFc Dimer를 포획하였다. 테스트 항체는 1 μg/ml의 농도에서 5 μl/분의 유속으로 60초 동안 용액에 주입되었다. 해리 단계는 최대 30초 동안 모니터링되었으며 샘플 용액에서 실행 완충액으로 바꾸어 촉발되었다.

hVEGFA-121 표면은 30μl/분의 유속으로 10mM 글리신 pH2.0 용액으로 30초 동안 세척하여 재생되었다. 단백질 A 표면은 30μl/분의 유속으로 10mM 글리신 pH1.5 용액으로 30초 동안 세척하여 재생되었다. 마지막으로 항-인간 Fab 항체 표면을 10mM 글리신 pH 2.1 용액으로 30μl/분의 유속으로 60초 동안 세척하여 재생시켰다.

벌크 굴절률 차이는 블랭크 표면으로부터 얻은 반응을 빼서 수정했다. 평가를 위해, 결합 반응을 취했다.

상대 활성 농도는 각 온도의 스트레스를 가한 샘플을 스트레스를 가하지 않은 상응하는 샘플에 대해 참조하여 계산되었다.

항원의 결합 신호를 정규화하기 위해, hVEGF-A121 결합 및 Ang2 결합을 항체 샘플의 항-Fab 결합에 대해 정규화했다.

실시예 1:

이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편의 생성

이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편은, 예를 들어 WO2012/163520에 기재된 바와 같은 방법에 의해, VEGF-A 및 ANG2에 결합하는 단일특이성 항체를 독립적으로 스크리닝하고 이어서 아미노산 서열을 이중 파라토프 HC/LC 쌍으로 병합하여 VEGF-A 및 ANG2에 결합하는 Fab 단편을 형성함으로써 생성되었다.

합성 Fab 단편의 2개의 별개의 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하였는데, 여기서 제1 파지 디스플레이 라이브러리에서 Fab 단편의 CDR-H1, CDR-H3 및 CDR-L2 영역들 내부의 잔기들이 다양화되었고, 제2 파지 디스플레이 라이브러리에서 Fab 단편의 CDR-L1, CDR-L3 및 CDR-H2 영역들 내부의 잔기들이 다양화되었다. 각 라이브러리에서 다른 3개의 CDR 영역은 불변 더미 서열로서 다양화되지 않은 상태로 유지되었다. 두 라이브러리에서 Fab 단편의 CH1 도메인은 절단된 유전자 III 단백질에 링커를 통해 융합되어 파지 디스플레이를 용이하게 한다.

파지 라이브러리 패닝에 의해, 제1 라이브러리에는 인간 ANG2에 대한 결합제가 농축되었고 제2 라이브러리에는 인간 VEGF-A에 대한 결합제가 농축되었다. 패닝 후, 농축된 두 파지미드 벡터 풀 모두에 대해 플라스미드 미니프렙을 생성하였다. 미니프렙을 제한 효소로 분해하여 절단된 유전자-III 단백질을 인코딩하는 영역을 절제하고 결찰에 의해 다시 원형화하여, 각각 ANG2 결합제 또는 VEGF-A 결합제에 대해 농축된 가용성 Fab 단편들을 인코딩하는 발현 벡터들의 풀들을 얻었다. 이들 벡터 풀을 TG1 대장균 세포로 형질전환하고 개별 콜로니들을 선택하여 마이크로타이터 플레이트에서 개별 Fab 클론의 가용성 발현을 위해 배양했다. 가용성 Fab 단편을 포함하는 상층액을 ANG2 또는 VEGF-A에 대한 결합에 대해 표준 ELISA 방법을 사용하여 스크리닝하고, 특정 결합제를 생성하는 TG1 클론들을 DNA 플라스미드 제조 및 시퀀싱하여 ANG2 또는 VEGF-A 각각에 특이적으로 결합하는 VH 및 VL 서열들의 쌍들을 얻었다.

이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 VH 및 VL 서열들의 하나의 쌍은 (1) ANG2-특이적 Fab의 VH 서열에서 무관한 VH 잔기 52b 내지 65를 VEGF-A-특이적 Fab의 선택된 VH 잔기 52b 내지 65로 대체하여, 잠재적으로 VEGF-A-특이적 파라토프의 일부인 CDR-H2 잔기를 ANG2 결합제 중쇄로 치환하고, 그리고 (2) VEGF-A-특이적 Fab의 VL 서열에서 관련된 VL 잔기 49 내지 57을 ANG2-특이적 Fab의 선택된 VL 잔기 49 내지 57로 대체하여, 잠재적으로 ANG2-특이적 파라토프의 일부인 CDR-L2 잔기를 VEGF-A 결합제 경쇄로 치환함으로써, 모의로 설계되었다.

실시예 2:

이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편 P1AA8906의 발현

상기와 같이 생성된 이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 VH 및 VL 서열들의 설계된 쌍을 합성하고 CH1 및 C카파 도메인을 인코딩하는 유전자 서열과 함께 인프레임 대장균 발현 벡터에 클로닝하였다. 벡터를 TG1 대장균 세포에 형질전환시키고, 개별 콜로니를 이중특이성 항체 Fab 단편의 가용성 발현을 위해 배양하였다. 친화성 크로마토그래피에 의해 TG1 배양 상층액으로부터 이중특이성 항체를 정제하고, ANG2 및 VEGF-A 모두에 대한 특이적 결합을 확인하였다.

이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 항체 “P1AA8906”이 선택되었고, 서열 번호 9의 중쇄 및 서열 번호 10의 경쇄를 특징으로 한다.

추가 분석을 위해, 본 발명의 항-VEGF-A/항-ANG2 항체를 표준 재조합 방법에 의해 CHO 세포에 형질전환시키고 그로부터 발현시켰다.

실시예 3:

이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편 P1AA8906의 특성화

이중특이성 항체 P1AA8906의 결합 친화도는 상기 “재료 및 일반적인 방법” 섹션에서 기재된 바와 같이 SPR 및 KinExA에 의해 평가되었다.

표 1: 인간 VEGFA-121 결합:

* Biacore® 사양 외

KinExA 분석은 다음 조건에서 수행되었다: VEGF-A-121 농도: 100 pM / 1000 pM (CBP), P1AA8906 4nM - 0pM (1:2 희석, 12x), 실온에서 사전 인큐베이션 시간 ~8시간.

표 2: 인간 ANG2 결합:

KinExA 분석은 다음 조건에서 수행되었다: VEGF-A-121 농도: 100 pM / 1000 pM (CBP), P1AA8906 4nM - 0pM (1:2 희석, 12x), 실온에서 사전 인큐베이션 시간 ~8시간.

이중특이성 항체 P1AA8906의 열 안정성은 상기 “재료 및 일반적인 방법” 섹션에서 기재된 바와 같이 평가되었다.

표 3: 열 안정성

이중특이성 항체 P1AA8906의 물리화학적 안정성을 상기 “재료 및 일반적인 방법” 섹션에서 기재된 바와 같이 평가되었다.

표 4: 물리화학적 안정성(SEC)

표 5: 물리화학적 안정성 (CE-SDS)

실시예 4:

이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편 P1AA8906의 개선

위에서 기재한 바와 같이, P1AA8906은 VEGF-A에 대한 높은 열 안정성과 유리한 친화도를 나타내면서 ANG2에 대하여는 나노몰 범위의 친화도 그리고 스트레스 하에서 증가하는 중합체량 불순물을 형성하는 경향을 나타낸다. 눈에 치료제를 주입해야 하는 안구 혈관 질환의 치료를 위해, 치료 효과의 지속성을 높이고 환자의 불편을 최소화하기 위해 표적 항원에 대한 높은 친화도 그리고 매우 고 농도의 치료제를 제공하는 것이 바람직하다. 따라서 원하는 목적을 위해 친화도를 증가시키고 물리화학적 안정성을 개선하는 것이 바람직하다.

결과적으로, 임상 적용을 위해 항체는, 예를 들어, ANG2 결합(특히 해리 속도를 개선함으로써) 및 스트레스에 대한 민감성을 감소시키는 것과 관련하여 추가 개선을 필요로 하였다. VH 및 VL 도메인에 별개의 아미노산 치환들을 도입함으로써 여러 차례의 성숙을 수행하였다. 성숙하는 동안 항체 P1AA8906으로부터 유도된 후보 항체를 스크리닝하고 수율, 친화도, 동시 항원 결합, 친수성, 안정성, 점도 및 기타 매개변수와 관련하여 원하는 특성에 기초하여 선택하였다.

복수의 테스트 후보 항체 분자들로부터 개선된 후보 항체 P1AA0902가 선택되었다. 이 분자에서 시작하여 VH 및 VL 도메인에 별개의 아미노산 치환을 다시 도입하여 추가 최적화 라운드를 수행했다. 후보 선택은 원하는 특성, 특히, ANG2 결합을 개선하고 고농도에서 주사 가능성을 보장하면서도, 다른 유리한 특성, 예를 들어, VEGF-A 친화도, 동시 항원 결합 및 열 안정성을 유지하는 것에 기반한다.

복수의 테스트 후보 항체 분자들로부터 개선된 또 다른 후보 항체 P1AD9820가 선택되었다.

표 6: 이중특이성 Fab 단편 P1AA8906, P1AA0902, P1AD9820의 아미노산 서열(숫자는 본원에서 사용된 서열 번호를 나타냄)

도 2 및 3은 생성된 이중특이성 단편의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인의 정렬을 예시한다. VH 및 VL 도메인 내의 아미노산 위치의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따른다. 단순함을 위해, 프레임워크 및 CDR 아미노산 위치를 추가로 예시하는 도면에 넘버링이 포함되어 있다.

후보 항체는 실시예 2에 기재된 바와 같이 발현되었다.

실시예 5:

개선된 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편의 항원 결합 동역학

후보 항체에 대한 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 대한 결합 동역학을 명시된 Fab 단편들(표 4에 예시된 아미노산 서열)을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 평가하였다. 본 발명의 항체의 항원 결합 동역학을 선행 기술 분자 파리시맙(INN, 이전에는 RG7716이라고도 함), 항-VEGF 결합제 애플리버셉트(INN) 및 브롤루시주맙(INN) 및 항-ANG2 결합제 네스바쿠맙(INN)과 비교하기 위해, 전술한 선행 기술 항체들을 이들 각각의 INN에 개시된 동일한 아미노산 서열들의 재조합 발현에 의해 제조하였다. 참조 분자는 회사 내부 제제임을 강조하기 위해 본원에서 “유사체”라고도 명명한다.

표 7: 인간 VEGFA-121 결합(KinExA)

표 8: 인간 VEGFA-121 결합(SPR)

* Biacore® 사양 외

표 9: 인간 VEGF-A 결합(KinExA에 의해 측정된 K _D )

표 10: 인간 ANG2 결합(KinExA)

표 11: 인간 ANG2 결합(SPR)

표 12: 인간 ANG2 결합(KinExA에 의해 측정된 K _D )

인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 대한 후보 항체들의 독립적인 결합을 상기 “재료 및 일반적인 방법” 섹션에서 기재한 바와 같이 SPR로 분석하였다.

표 13: 인간 VEGFA-121 및 인간 ANG2에 대한 독립적인 결합

다른 종들의 VEGF-A 및 ANG2에 대한 교차 반응성은 상기 “재료 및 일반적인 방법” 섹션에서 기재한 바와 같이 평가되었다.

표 14: 다른 종의 VEGF-A에 대한 P1AD9820 Fab 단편의 교차 반응성 평가

*K_D는 분석 설정에 따라 다르다. 표시된 K_D는 위에서 설명한 교차 반응성 테스트 설정에 유효하다.

표 15: 다른 종의 ANG2에 대한 P1AD9820 Fab 단편의 교차 반응성 평가

*K_D는 분석 설정에 따라 다르다. 표시된 K_D는 위에서 설명한 교차 반응성 테스트 설정에 유효하다.

실시예 6:

개선된 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편의 열 안정성

상기 명시된 이중특이성 항체들의 열 안정성은 상기 “재료 및 일반적인 방법” 섹션에서 기재된 바와 같이 실시예 3과 동일한 조건하에서 평가되었다.

표 16: 열 안정성

실시예 7:

개선된 이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편의 생물물리학적 특성(안정성)

상기 명시된 이중특이성 항체들의 생물물리학적 안정성은 상기 “재료 및 일반적인 방법” 섹션에서 기재된 바와 같이 실시예 3과 동일한 조건하에서 평가되었다.

표 17: 물리화학적 안정성(SEC)

실시예 8:

개선된 이중특이성 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편의 생물물리학적 특성(동적 광산란(DLS)에 의한 점도 평가)

전술한 바와 같은 P1AA0902 및 P1AD9820 Fab 단편을 표준 방법에 의해 대장균 세포에서 발현시켰다.

점도는 전술한 바와 같이 라텍스-비드 DLS 방법으로 측정하였다(He F et al.; Anal Biochem. 2010 Apr 1;399(1):141-3). 구체적으로, 명시된 물질들을 사용하여 다음 프로토콜을 따랐다.

점도 평가:

기기 및 재료:

Greiner Bio-One 마이크로플레이트를 구비한 Wyatt DLS 플레이트 판독기.

3000 시리즈 Nanosphere™ 사이즈 스탠다드(Thermofisher 카탈로그 번호 3300A)

Tween 20 (Roche, 카탈로그 번호 11332465001) 및 실리콘 오일, 예를 들어, (Alfa Aesar 카탈로그 번호 A12728)

농도 결정용 UV 광도계(예를 들어, Nanodrop 8000).

샘플 준비:

항체 샘플을 재완충시키고 20mM His/HCl, pH 6.0(완충액) 및 0.02% Tween 20(최종 농도)으로 희석했다. 0.03% 농도의 고체 비드를 첨가하였다. 최소 4가지 농도가 준비되었으며, 가능한 최고 농도는 약 200mg/mL였다. 무항체 대조군으로서 2개의 블랭크 샘플이 필요하였다: 하나는 물에 재현탁된 나노스피어 비드를 포함하고, 다른 하나는 완충액에 재현탁된 나노스피어 비드를 포함한다. 샘플을 마이크로 플레이트로 옮기고 각 웰을 실리콘 오일로 덮었다.

Wyatt DLS 플레이트 판독기로 측정

모든 샘플과 블랭크는 5°C 단계로 15 내지 35°C의 다양한 온도에서 분석되었다. 획득 시간은 30초이고 획득 횟수는 샘플 및 온도당 40회이다.

데이터 분석

nm 단위의 원시 데이터 Dapp(겉보기 반경)을 소프트웨어 템플릿(Microsoft Dynamics 7.0 이상)의 개요에 표시하였다. 점도는 식(ηreal = Dapp * ηH2O / Dreal)로 계산하였다. Dreal은 블랭크 샘플에서 측정된 비드 크기이며 비드 크기(300nm)와 동일하다. 계산된 점도를 엑셀 곡선으로 나타내었다. Mooney 곡선 핏(Excel)을 사용하여 주어진 농도에서 점도를 외삽할 수 있다. 여기서 점도가 20cP를 초과하는 최대 단백질 농도를 계산하였다.

20 °C에서 20 cP의 점도에 도달하는, 명시된 항체의 최대 농도를 아래에 표시한다. 결과를 도 10에도 나타낸다.

표 18: DLS 비드법에 의한 점도. 20°C에서 20 cP에 도달하는, 명시된 항체의 최대 실시가능한 농도를 나타낸다. 항체 Fab 단편은 대장균에서 발현되었다.

결과는 본 발명의 항체가 주사가능성에 대한 허용가능한 점도 한계 미만의 점도를 포함하는 고농도로 제제화될 수 있음을 나타낸다. 두 테스트 항체 모두 고도로 농축 가능한 것으로 나타났지만, 그 효과는 P1AD9820 항체에서 더 두드러졌다.

결과적으로, 본 발명의 항체는 제한된 주사 부피로 높은 몰 용량을 제공할 수 있기 때문에 안구 적용에 매우 적합하며, 이는 높은 효능과 조합될 때 지속성을 높이고 결과적으로 투여 빈도를 감소시키므로, 환자 측의 어려움을 줄이는 데 바람직하다.

다른 일련의 실험에서, 표준 재조합 방법에 따라 CHO 세포에서 생성된 P1AD9820의 점도를 상기 기재한 바와 같이 분석하였다.

20 °C에서 20 cP의 점도에 도달하는, 명시된 항체의 최대 농도를 아래에 표시한다. 결과를 도 10에도 나타낸다.

표 19: DLS 비드법에 의한 점도. 20°C에서 20 cP에 도달하는, 명시된 항체의 최대 실시가능한 농도를 나타낸다. 항체 Fab 단편은 대장균에서 발현되었다.

실시예 9:

개선된 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편의 기능적 안정성

P1AD9820 Fab 단편은 상기 “재료 및 일반적인 방법” 섹션(물리화학적 안정성)에서 기재한 바와 같이 상이한 스트레스 조건하에서 처리되었다. 그리하여 생성된 스트레스를 가한 항체 샘플의 항원 결합을 상기 기재한 바와 같이 분석하였다(“재료 및 일반적인 방법” 섹션: 기능적 안정성 테스트를 위해 SPR에 의해 평가된 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2 결합 동역학).

표 20: 스트레스를 가한 P1AD9820 샘플에 대한 항원 결합(SPR)

실시예 10:

개선된 항-VEGF-A/항-ANG2 Fab 단편의 기능적 특성화

후보 항체의 ANG2 및 VEGF-A 억제를 세포 기반 분석에서 다음과 같이 평가하였다:

ANG2 억제: pTie2-분석

후보 항체 및 선택된 참조 분자(네스바쿠맙 유사체, 서열 번호 29 및 30에 따른 재조합 발현에 의한 회사 내부 제조)를 MEM 알파-배지에서 250nM 내지 0.14nM 범위의 11가지 농도로 사전 인큐베이션하였다. 40μl의 3배 농축된 항 Ang2 항체를 3배 농축된 c=3,9μg/ml에서 40μl Ang-2와 혼합하고 세포 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 선별 없이 FreeStyle 배지에 현탁된 40μl/웰 Hek293_HOMSA-Tie2-Clone22_B11 세포를 웰당 40000개 세포의 밀도로 RT에서 10분 동안 첨가했다. 그런 다음 Ang2 인산화는 저온 용해 완충액을 프로테아제 억제제와 함께 첨가하여 중단되었다. 진탕하는 동안 maxisorp-플레이트-결합된 항 Tie2 항체는 RT에서 90분 동안 세포 용해물의 Tie2를 고정화시켰다. PBS에서 세척 단계 후, 0.05% Tween20, 인산화된 Tie2에 특이적인 비오티닐화된 항체를 실온에서 1시간 동안 3μg/ml의 최종 농도까지 첨가했다. 세 번의 세척 단계 후, 405/690nm에서 1M H2SO2로 중단한 후 Tecan Sunrise 플레이트 판독기를 사용하여 최종 비색 종말점을 평가하기 위해 HRP 커플링된 스트렙타비딘을 RT에서 30분 동안 최종 농도 100mU/ml까지 첨가하여 POD를 변환했다. 결과를 아래 도 8에 나타낸다.

표 21: ANG2 억제(IC50, 세포 기반 분석)

VEGF-A 억제: 리포터 유전자 분석(RGA)

분석을 위해 4배 농축된 테스트 항체 또는 참조 분자 37.5μl를 4배 농축된 37.5μl의 VEGF-A121(R&D, c=100μg/ml)과 함께 실온에서 15분 동안 사전 인큐베이션하였다. 그런 다음 혼합물을 40000 세포/웰의 밀도로 75μl/웰 Hek_NFAT_KDR_Luc 세포에 첨가하고 세포 인큐베이터에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 웰 당 100μl BioGlo 시약을 추가한 후 Infinite Pro 플레이트판독기(Tecan)를 사용하여 발광을 평가했다. 결과를 아래 도 7에 나타낸다.

표 22: VEGF-A 억제(IC50, 세포 기반 분석)

실시예 11:

hVEGF-A121 및 hVEGF-A165 차단 활성(VEGF 기준 분석)

Maxisorp 96-웰 플레이트(ThermoScientific #442404)를 실온에서 1시간 동안 1μg/mL의 최종 농도에서 200mM NaHCO₃, pH 9.4 중 50μL/웰의 hVEGFR-1-Fc로 코팅하였다. 명시된 후보 Fab 단편들을 280 μL PBST-1%BSA에서 409.6 nM의 농도로 희석했다. 2배 연속 희석을 위해 이 희석된 Fab 샘플 140μL를 PBST-1%BSA 140μL와 혼합하고 부드러운 피펫팅으로 7회 혼합했다. 이 2배 희석 단계를 9번 더 반복했다. 둥근 바닥 96-웰 플레이트를 PBST-1%BSA에서 50 μL/웰의 2 nM VEGF-A121 또는 2 nM VEGF-A165로 사전에 충전하였다. Fab 희석액 50μL를 VEGF 플레이트에 첨가하고 6회 혼합하고 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, maxisorp 플레이트를 PBST로 2회 세척한 후 200 μL의 2% MPBST를 첨가하고 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 PBST로 2회 세척하였다. 50 μl의 Fab-VEGF 프리믹스를 Maxisorp 플레이트로 옮기고 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 PBST로 2회 세척하고 항-VEGF-bio 항체(PBST에서 1:2000 희석) 및 SA-HRP(PBST에서 1:2000 희석) 50 μL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 6회 세척하고 50 μL의 TMB 기질 용액을 첨가하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막으로 50 μL 1N 황산을 첨가하여 반응을 멈추고 450 nm에서 흡광도를 판독한다. 결과를 도 5와 6에 나타낸다.

실시예 12:

ANG1에 대한 ANG2의 선택적 결합

Ang-1에 대한 Ang-2 선택성은 안구 안전성에 중요한 속성일 수 있다: P1AD9820 Fab의 ANG1 억제를 세포 기반 분석에서 평가하였다.

ANG-1은 기아 상태에서 성장한 HUVEC 생존력의 약한 유도인자이다. 따라서 ANG-1 중화 항체로 생존력을 억제할 수 있다. 항체 RO5314196(이전 LC-08 - Thomas M, Kienast Y, Scheuer W, et al. A novel angiopoietin-2 selective fully human antibody with potent anti-tumoral and anti-angiogenic efficacy and superior side effect profile compared to Pan-Angiopoietin-1/-2 inhibitors.　PLoS One. 2013;8(2):e54923. doi:10.1371/journal.pone.0054923)은 ANG-1을 중화함으로써 HUVEC 생존력을 억제하며, 본 분석을 위한 양성 대조군으로 사용되었다. Gibco사의 의 AF(부착 인자)(카탈로그 번호 S-006-100)로 코팅된 Corning사의 세포 배양 플라스크 T162(카탈로그 번호 3151)를 사용하여 계대 5까지 HUVEC를 유지시켰다. 생존율 분석을 위해 HUVEC를 Accutase®로 분리한 다음 PBS-/-로 세척했다. 그 후, 세포를 0.5% FBS가 포함된 EBM-2에서 피브로넥틴-코팅된 96웰 플레이트에 10.000개 세포/100μl 웰의 세포 밀도로 씨딩하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, P1AD9820 또는 Ang-1 결합 양성 대조군 RO5314196을 EBM/0.5% FBS에서 10x 작업 농도로 희석했다. 시작 농도는 1000μg/ml였으며 이후 457.2μg/ml에서 끝나는 3배 8지점 희석 시리즈가 이어졌다. ANG-1은 2400 ng/ml에 해당하는 20x 작업 농도로 설정되었다. 다음으로, 10배 사전 희석된 P1AD9820 10μl 및 이어서 20배 ANG-1 용액 5μl를 플레이트 당 4개 웰의 세포에 사중으로 첨가했다. 각 실험일에, 각 조건은 2개의 플레이트에서 중복으로 수행되었다. 세포를 37℃5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 분석을 위해, 각 웰에 11μl의 alamarBlue®를 첨가한 후 세포 배양 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 흡광도는 600nm의 기준 파장으로 570nm에서 검출되었다.

각각의 실험에 대해, 각 조건이 4중으로 수행되는 2개의 분석 플레이트를 사용하여 조건들을 반복하였다. 자극되지 않은 세포들의 배경 신호를 실험 웰에서 빼고 조건 당 평균 신호를 계산했다. 추가 처리 없이 ANG-1(120 ng/ml)로 자극된 세포로부터 100% 반응 수준을 계산하였고, 항체-처리된 웰로부터 얻은 신호는 100% 반응의 백분율 억제로 표현하였다. P1AD9820 및 RO5314196의 경우, 각 항체 처리에 대한 백분율 억제를 n=4 독립 실험에서 측정하고 평균 및 평균의 표준 오차를 계산했다. ExcelXLfit 소프트웨어(IDBS)를 사용하여 각 항체 농도에 대한 평균 데이터로부터 IC₅₀ 값을 계산했다. 농도-반응 곡선은 기본 및 최대 억제 활성에 대해 계산된 5개 매개변수 로지스틱 모델(A+((BA)/(1+((C/x)^D))))을 사용하여 비선형 회귀 분석에 의해 피팅되었다.

세포 기반 분석은 P1AD9820에 의해 매개되는 ANG1 억제를 검출하지 못했다.

실시예 13:

P1AD9820 Fab 단편의 구조 분석

P1AD9820 Fab의 구조 분석을 x-선 결정학에 의해 다음과 같이 수행되었다:

삼원 복합체 안지오포이에틴 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820의 복합체 형성 및 정제. 복합체 형성을 위해 P1AD9820 Fab 및 인간 VEGF-A121(Peprotech)을 1.1:1 몰비로 혼합하였다. 4℃에서 45분 동안 인큐베이션한 후, 안지오포이에틴2-RBD를 1.25:1의 P1AD9820에 대한 몰비로 첨가한 후, 4℃에서 추가로 60분 동안 첨가하였다. 생성된 삼원 복합체를 37℃에서 13시간 동안 PNGaseF(NEB)로 추가로 탈당화하고 마지막 단계에서 Superdex200(16/600) 컬럼에서 겔여과 크로마토그래피로 정제했다. 삼원 복합체를 함유하는 분획들을 모으고 3.55mg/ml로 농축하였다.

삼원 안지오포이에틴 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820의 결정화. 초기 결정화 시험은 14.5mg/ml의 단백질 농도에서 21°C에서 시팅 드롭(sitting drop) 증기 확산 설정에서 수행되었다. 결정들은 35% MPD, 0.1M Na/K 포스페이트 pH 6.2에서 1일 이내에 나타났다. 판 모양의 결정들은 일주일 만에 100x80x30 μm의 최종 크기로 성장했다. 추가 최적화 단계 없이 스크리닝 플레이트에서 결정들을 직접 수확했다.

데이터 수집 및 구조 결정. 데이터 수집을 위해 결정들을 추가 동결 방지제 없이 침전제 용액에서 100K로 급속 냉각시켰다. 스위스 광원(Villigen, 스위스)의 빔라인 X10SA에서 PILATUS 6M 검출기를 사용하여 1.0000Å의 파장에서 회절 데이터를 수집했다. 데이터는 XDS(Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010))로 처리되었으며 SADABS(BRUKER)로 확장되었다. 결정들은 셀 축들이 a= 165.74Å, b= 90.27Å, c= 127.89Å, =112.05°인 공간 그룹 C2에 속하며 2.08Å의 해상도로 회절된다. 구조는 검색 모델로서 Ang2-VEGF-Fab 삼원 복합체의 관련 회사 내부 구조의 격자를 사용하여 PHASER를 이용한 분자 대체에 의해 결정되었다(McCoy, A.J, Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Storoni, L.C., and Read, R.J. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)). 후속하여 CCP4 제품군(Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)) 및 Buster (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O　. (2011). Buster version 2.9.5 Cambridge, United Kingdom　: Global Phasing Ltd)의 프로그램들을 사용하여 데이터를 정제하였다. COOT(Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG and Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010))를 사용하여 차등 전자 밀도를 사용한 단백질을 수동으로 재구성했다. 두 구조 모두에 대한 데이터 수집 및 정제 통계를 표 23에 요약한다. 모든 그래픽 표현은 PYMOL(DeLano Scientific, Palo Alto, CA, 2002)을 사용하여 준비되었다.

표 23: 데이터 수집 및 구조 정제 통계

¹ 괄호 안의 값은 최고 해상도 빈을 지칭한다.

² R_merge= I- <I>/ I, 여기서 I는 강도이다.

³ R_작업= S

F_o-<F_c>

/ Fo, 여기서 F_o는 관찰된 값이고 F_c는 계산된 구조 계수 진폭이다.

⁴ R_free는 정제 과정에서 생략된 전체 데이터의 5%를 기준으로 계산되었다.

각각의 항원, VEGF-A 및 ANG2와 접촉하는 아미노산 잔기들은 삼원 복합체 안지오포이에틴 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820의 결정 구조로부터 확인되었다. VH 및 VL 도메인 내의 파라토프 아미노산 잔기의 위치에 대한 예시가 도 2 및 도 3에 도시되어 있다.

항원 결합에 기여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기는 표 24(가변 중쇄 도메인 아미노산 잔기의 경우) 및 표 25(가변 경쇄 도메인 아미노산 잔기의 경우)에서 확인된다. 아미노산 위치는 카밧 넘버링 체계에 따라 넘버링된다(동일한 넘버링이 도 2 및 3에서 사용됨). 항원 결합에 관여하는 아미노산 위치는 VH 또는 VL 도메인에서 카밧 위치에 의해 식별된다(또한 도 2 및 3의 번호 참조).

표 24: P1AD9820의 결정 구조 분석으로 확인된 항원 결합에 관여하는 가변 중쇄 아미노산 잔기

표 25: P1AD9820의 결정 구조 분석으로 확인된 항원 결합에 관여하는 가변 경쇄 아미노산 잔기

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antibody that binds to VEGF-A and ANG2 and methods of use <130> P36370 <140> PCT/EP2021/074195 <141> 2021-09-02 <150> EP20194610.0 <151> 2020-09-04 <150> EP20209591.5 <151> 2020-11-24 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH domain of P1AA8906 <400> 1 Asp Phe Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Glu Phe Glu Tyr Asp Asp 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 35 40 45 Ser Ile Ser Pro Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of P1AA8906 <400> 2 Ala Ile Tyr Met His Gln Glu 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Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of P1AA0902 <400> 12 Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Phe Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2 of P1AA0902 <400> 13 Ser Ile Ser Gly Arg Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile 1 5 10 15 Gly <210> 14 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Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 <210> 25 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of P1AD9820 Fab fragment <400> 25 Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Tyr Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 26 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp 165 170 175 Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys 180 185 190 His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn 195 200 205 Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr 210 215 220 Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 225 230 <210> 27 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 210 215 220 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 275 280 285 Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300 Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln 325 330 335 Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg 355 360 365 Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380 Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 405 410 415 Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 420 425 430 Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln 450 455 460 Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495 <210> 28 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys 130 135 140 Pro Arg Arg 145 <210> 29 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nesvacumab Mab LC <400> 29 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Gln Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 30 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nesvacumab Mab HC <400> 30 Ala Val Gln Leu Val Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450

Claims (16)

1. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (d) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체.
2. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, (d) (i) 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29 및 Y30을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 R66 및 R94를 포함하는 FR3을 갖는 인간 중쇄 프레임워크를 포함하는 VH 도메인; 및 (e) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (f) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, (g) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 (h) (i) 아미노산 잔기 I2 및 Y3을 포함하는 FR1, (ii) 아미노산 잔기 L46 및 F49를 포함하는 FR2, (iii) 아미노산 잔기 E57을 포함하는 FR3을 갖는 인간 경쇄 프레임워크를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인(여기서 VH 도메인은 아미노산 잔기 H3, D26, F27, E29, Y30, D35b, D35c, D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65, R66, R94, D95, V96, F98 및 F99를 포함함); 및 (b) 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인(여기서 VL 도메인은 아미노산 잔기 I2, Y3, Y27, W27a, E32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, E57, Y91, R92, Y93, H94 및 P95를 포함함)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 도메인의 넘버링은 카밧 넘버링 체계에 따르는, 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 최대 15개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 최대 15개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체.
6. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체로서, 서열 번호 19의 VH 서열 및 서열 번호 20의 VL 서열을 포함하는 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 항체 Fab 단편은 (i) KinExA에 의해 측정했을 때 50pM 미만의 K_D로 인간 VEGF-A121에 결합하고, (ii) KinExA에 의해 측정했을 때 50pM 미만의 K_D로 인간 ANG2에 결합하는, 항체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 180 mg/ml의 항체 Fab 단편을 포함하는 20mM His/HisHCl, pH 6.0 용액은, 실시예 8에 기재된 라텍스-비드 DLS 방법에 따른 동적 광 산란에 의해 검출했을 때 20℃에서 20 cP 미만의 점도를 갖는, 항체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fab 단편인, 항체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
11. 제10항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
12. 인간 VEGF-A 및 인간 ANG2에 결합하는 항체를 생산하는 방법으로서, 제11항에 따른 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포인, 방법.
14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제제.
15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 포트 전달 장치.
16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 항체.

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