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CN120152989A - 抗cd19/抗cd28双特异性抗体的组合疗法 - Google Patents

抗cd19/抗cd28双特异性抗体的组合疗法 Download PDF

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CN120152989A CN202380076490.0A CN202380076490A CN120152989A CN 120152989 A CN120152989 A CN 120152989A CN 202380076490 A CN202380076490 A CN 202380076490A CN 120152989 A CN120152989 A CN 120152989A
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T·霍费尔
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J·山姆
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Abstract

本发明涉及采用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4‑1BB(CD137)激动剂的组合的组合疗法，以及这些组合疗法用于治疗B细胞癌症诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的用途。

Description

抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合疗法
技术领域
本发明涉及采用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的组合疗法，以及这些组合疗法用于治疗诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)等B细胞增殖性疾患的用途。
背景技术
B细胞增殖性疾患描述了包括白血病和淋巴瘤的恶性肿瘤的异质性群体。淋巴瘤从淋巴细胞发展而来，包括两大类：霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在美国，B细胞起源的淋巴瘤约占所有非霍奇金淋巴瘤病例的80-85％，并且根据B细胞起源中的基因型和表型表达模式，B细胞亚群内存在相当大的异质性。例如，B细胞淋巴瘤亚群包括生长缓慢的惰性疾病和无法治愈的疾病，比如滤泡性淋巴瘤(FL)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)，以及更具侵袭性的亚型，套细胞淋巴瘤(MCL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的NHL类型，占所有NHL诊断的大约30％至40％，其次是滤泡性淋巴瘤(FL；占所有NHL诊断的20％至25％)和套细胞淋巴瘤(MCL；占所有NHL诊断的6％至10％)。B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)是成人中最常见的白血病，美国每年大约有15,000例新病例(美国癌症协会，2015)。尽管有多种药物可用于治疗B细胞增殖性疾患，但仍需要开发安全有效的疗法以延长患者的缓解期并提高治愈率。
抗CD20/抗CD3双特异性抗体是一种靶向B细胞上表达的CD20和T细胞上存在的CD3ε链(CD3ε)的分子。同时结合导致T细胞活化和T细胞介导的B细胞杀伤。在存在表达CD20的B细胞的情况下，无论是循环还是组织驻留，药理活性剂量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体都会触发T细胞活化和相关细胞因子释放。格菲妥单抗(Glofitamab)是一种T细胞双特异性(TCB)抗体，其靶向在B细胞上表达的CD20和存在于T细胞上的CD3ε链(CD3ε)。与外周血中的B细胞耗竭平行，抗CD20/抗CD3双特异性抗体导致首次施用后24小时内外周血中T细胞的短暂减少，以及细胞因子释放达到峰值，随后快速T细胞恢复并且在72小时内细胞因子水平回到基线。因此，为了实现肿瘤细胞的完全消除，需要保存T细胞活化并向癌细胞递送持久性免疫应答的额外试剂。
4-1BB(CD137)是由活化的T细胞表达的组织坏死因子(TNF)受体超家族的可诱导成员。许多其他免疫细胞也表达4-1BB，包括NK细胞、B细胞、NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、树突细胞(DC)和非造血来源的细胞，诸如内皮细胞和平滑肌细胞。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多数是可诱导的，并且受各种刺激信号(诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号传导)驱动。在1993年鉴定了4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)。已经表明，4-1BBL的表达仅限于专职抗原呈递细胞(APC)诸如B细胞、DC和巨噬细胞上。4-1BBL的可诱导表达是T细胞(包括αβ和γδT细胞亚群两者)和内皮细胞的特征。
通过4-1BB受体进行的共刺激(例如通过4-1BBL连接)激活T细胞(CD4+和CD8+两个亚群)内的多个信号传导级联，有力地增强了T细胞活化。与TCR触发相组合，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞增殖、刺激淋巴因子分泌并且降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性。这种机制被进一步推进，作为癌症免疫疗法概念的第一个证明。在对荷瘤小鼠施用针对4-1BB的激动性抗体的临床前模型中，产生了强效的抗肿瘤作用。后来，越来越多的证据指示，4-1BB通常只有在与其他免疫调节化合物、化学治疗剂、肿瘤特异性疫苗接种或放射疗法组合施用时才能表现出其作为抗肿瘤剂的效力(Bartkowiak和Curran，2015)。
TNFR超家族的信号传导需要三聚配体的交联以与受体接合，需要野生型Fc结合的4-1BB激动性抗体也是如此。然而，全身施用具有功能活性Fc结构域的4-1BB特异性激动性抗体导致与肝毒性相关联的CD8+T细胞的流入，该肝毒性在小鼠体内不存在功能性Fc受体的情况下减弱或明显改善。在临床中，Fc感受态4-1BB激动性Ab(BMS-663513)(NCT00612664)引起4级肝炎，导致试验终止。因此，需要有效且更安全的4-1BB激动剂。其示例是由三聚体且因此具有生物活性的4-1BB配体和对肿瘤抗原CD19具有特异性的抗原结合结构域以及沉默Fc结构域构成的抗原结合分子(在本文中被称为CD19-4-1BBL)。该构建体已在WO 2016/075278中描述，并且通过靶向CD19的B细胞特异性交联替换了导致Fc介导的毒性的非特异性FcγR介导的交联。
CD19是B细胞恶性肿瘤免疫疗法的理想靶标，因为它在B细胞的表面上表达，并且对这些细胞几乎都具有特异性。在B细胞发育期间，CD19在B细胞上比CD20更广泛地表达，因此通常CD20阳性细胞也将表达CD19。在B细胞朝向浆细胞(抗体分泌细胞)分化期间，B细胞下调CD20表达。有时，B细胞淋巴瘤也下调CD20的表达，但对于CD19仍然是阳性的。因此，靶向CD19和CD20两者将广泛地覆盖淋巴瘤中的患病B细胞，这也可能使选择压力从CD20偏离到CD19和CD20两者。尽管尚不清楚CD19是否直接有助于B细胞致癌作用，但其表达在大多数B细胞肿瘤(诸如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤)上是高度保守的。在急性白血病中，CD19在几乎所有亚型上是稳定的并且持续地表达，而只有少数白血病表达CD20。
CD28是共刺激分子亚家族的创始成员，其特征在于成对的V-set免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域附接到单个跨膜结构域和含有关键信号传导基序的细胞质结构域。该亚家族的其他成员包括ICOS、CTLA-4、PD1、PD1H、TIGIT和BTLA。CD28表达仅限于T细胞，并且普遍存在于所有初始型亚群和大多数经历抗原刺激的亚群中，包括那些表达PD-1或CTLA-4的亚群。CD28和CTLA-4高度同源并竞争结合相同的B7分子CD80和CD86，这两种分子在树突状细胞、B细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞上表达。CTLA-4对B7配体家族的更高亲和力使CTLA-4在配体结合方面胜过CD28并抑制效应T细胞应答。相比之下，PD-1被示出为通过使CD28的细胞质结构域部分去磷酸化来抑制CD28信号传导。最近的证据展示，PD-L1/PD-1和CTLA-4检查点抑制剂的抗癌作用取决于CD28。CD28在CD4和CD8阳性T细胞的细胞表面上组成型地表达。在经由TCR或CD3接合提供所谓的信号1后，经由CD28的共刺激激活T细胞内的多个信号传导级联，以增强T细胞介导的免疫应答。CD28介导的信号2被认为是经由免疫突触处的共聚类而发生的。CD28激动性抗体可以与信号1提供者(诸如靶向CD3的抗体)一起施用，以增强免疫应答。免疫刺激是一种复杂的级联，并且失控应答具有重大危险。人CD28抗体TGN1412的I期研究在2006年引发了一场危及生命的细胞因子风暴。与TGN1412相反，抗CD19/抗CD28双特异性抗体避免自主T细胞活化，因为只有在存在表达CD19的肿瘤细胞和经由TCR或CD3接合的信号1的情况下，才会诱导T细胞增殖、细胞因子分泌和肿瘤细胞杀伤。
随着最近开发出第二代和更后代的被基因工程化以表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)以用于CD19阳性恶性肿瘤患者，CD28作为免疫治疗靶标重新获得了极大的关注。概念验证已被几项试验证明，这些试验示出，使用自体抗CD19导向的CAR-T疗法(包括CD28信号传导结构域)的经重度预治疗的NHL患者的应答率为64％至82％。然而，仍然必须解决CAR-T细胞疗法的主要局限性，包括B细胞恶性肿瘤中危及生命的CAR-T细胞相关毒性抑制和抗性、输注后不良事件(诸如细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性)，以及非人CAR的宿主排斥。一般的障碍包括细胞制造局限性、T细胞的基线质量以及输注时间。对于自体CAR-T细胞疗法，从患者的T细胞制备工程化CAR T细胞需要4到6周的时间，并且延迟可能会损害治疗的结果。相比之下，双特异性抗体是现成可获得的。
鉴于目前的标准护理治疗无法治愈所有患有B细胞增殖性疾患的患者，显然需要开发有效且特异性的新疗法。
发明内容
本发明涉及抗CD20/抗CD3双特异性抗体及其在与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合中的用途，该组合用于在用于治疗癌症、特别是用于治疗B细胞增殖性疾患的组合疗法中使用。已经发现，在抑制肿瘤生长和消除肿瘤细胞方面，本文描述的组合疗法比用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与单独的抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合或与单独的靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合进行治疗更有效。
在一个方面，本发明提供了一种抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合，该组合用于在用于治疗B细胞增殖性疾患的组合疗法中使用。
在另一方面，本发明提供了抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向抗CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合在制造药物中的用途，该药物用于在用于治疗B细胞增殖性疾患的组合疗法中使用。
在又另一方面，本发明提供了一种治疗有此需要的个体的B细胞癌症的方法，该方法包括向所述个体施用包括抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向抗CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的组合疗法。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在组合疗法中使用的试剂盒，该试剂盒包括包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一药物、包含抗CD19/抗CD28双特异性抗体的第二药物和包含靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的第三药物，并且任选地进一步包括包装插页，该包装插页包括针对将第一药物与第二药物组合施用以治疗个体的癌症的说明。
在另一方面，提供了一种包含用于治疗B细胞增殖性疾患的抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物，其中抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂组合使用。
在特定的方面，提供了如上文所描述的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中组合疗法包括用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合的第一治疗方案和用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的第二治疗方案。
在一个方面，第一治疗方案包括1至5个治疗周期，并且第二治疗方案从接下来的治疗周期开始。在另一方面，第一治疗方案包括1至5个治疗周期，并且第二治疗方案从接下来的治疗周期开始。在一个方面，第一治疗方案包括4个治疗周期，并且第二治疗方案从治疗周期5开始。在一个方面，在第一治疗方案的结束与第二治疗方案的开始之间存在一周的时间间隔。
在所有这些方面，提供了用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中在组合疗法之前，用II型抗CD20抗体、优选地奥滨尤妥珠单抗进行预先治疗，并且其中预先治疗与组合疗法之间的时间段足以减少对II型抗CD20抗体、优选为奥滨尤妥珠单抗有应答的个体中的B细胞。
在本发明的一个方面，靶向CD19的4-1BB激动剂包含4-1BBL的三个胞外域，每个胞外域包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列。更特别地，4-1BBL的胞外域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一个方面，靶向CD19的4-1BB激动剂包含Fc结构域，特别是IgG1或IgG4 Fc结构域，该Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低或消除与Fc受体的结合和/或效应子功能。更特别地，靶向CD19的4-1BB激动剂包含IgG1Fc结构域，其包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat的EU编号)。
在进一步的方面，提供了如上文所描述的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中靶向CD19的4-1BB激动剂包含能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)，该重链可变区包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，以及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，该轻链可变区包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，以及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。特别地，靶向CD19的4-1BB激动剂包含能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)，该重链可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在另一方面，提供了根据前述段落中任一项所述的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中靶向CD19的4-1BB激动剂包含
(a)第一多肽，其包含：(a1)4-1BBL的第一胞外域或其片段，其在C末端处与4-1BBL的第二胞外域或其片段的N末端融合，(a2)4-1BBL的第二胞外域或其片段，其在C末端处与CL结构域的N末端融合，(a3)CL结构域，其在C末端处与Fc结构域的亚基中的一者(例如第一亚基)的N末端融合，和(a4)Fc结构域的亚基中的一者(例如第一亚基)；
(b)第二多肽，其包含：(b1)4-1BBL的第三胞外域或其片段，其在C末端处与CH1结构域的N末端融合，和(b2)CH1结构域；
(c)第三多肽，其包含：(c1)与CD19结合的Fab分子的重链，其在C末端处与Fc结构域的亚基中的另一者(例如第二亚基)的N末端融合，和(c2)Fc结构域的亚基中的另一者(例如第二亚基)；以及
(d)第四多肽，其包含与CD19结合的Fab分子的轻链。
在一个方面，提供了如上文所描述的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中靶向CD19的4-1BB激动剂包含：第一多肽，其包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQID NO:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更具体地，靶向CD19的4-1BB激动剂包含：第一多肽，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；第三多肽，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在进一步的方面，提供了如上文所公开的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3)；以及第二抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD20)和轻链可变区(VLCD20)。在一个方面，第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD3)，其包含SEQ ID NO:22的CDR-H1序列、SEQ ID NO:23的CDR-H2序列和SEQ ID NO:24的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD3)，其包含SEQ ID NO:25的CDR-L1序列、SEQ ID NO:26的CDR-L2序列和SEQ ID NO:27的CDR-L3序列。在一个方面，第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD3)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD3)，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD20)，其包含SEQID NO:30的CDR-H1序列、SEQ ID NO:31的CDR-H2序列和SEQ ID NO:32的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD20)，其包含SEQ ID NO:33的CDR-L1序列、SEQ ID NO:34的CDR-L2序列和SEQ ID NO:35的CDR-L3序列。在一个方面，第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD20)，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD20)，其包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列。
在进一步的方面，提供了如上文所公开的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含与CD20结合的第三抗原结合结构域。在一个特定的方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：第一多肽，其包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四和第五多肽，两者均包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更特别地，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：第一多肽，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；第三多肽，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及第四和第五多肽，两者均包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。更特别地，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是格菲妥单抗。
在一个方面，提供了如上文所公开的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含：第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)；以及第二抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)。在一个方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD28)，其包含SEQ ID NO:42的CDR-H1序列、SEQ ID NO:43的CDR-H2序列和SEQ ID NO:44的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD20)，其包含SEQ ID NO:45的CDR-L1序列、SEQ ID NO:46的CDR-L2序列和SEQ ID NO:47的CDR-L3序列。在一个方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD28)，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD28)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一个方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD19)，其包含SEQ ID NO:10的CDR-H1序列、SEQ ID NO:11的CDR-H2序列和SEQ ID NO:12的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD19)，其包含SEQ ID NO:13的CDR-L1序列、SEQ IDNO:14的CDR-L2序列和SEQ ID NO:15的CDR-L3序列。在一个方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD19)，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD19)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如上文所描述的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含Fc结构域，特别是IgG1或IgG4 Fc结构域，该Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低或消除与Fc受体的结合和/或效应子功能。更特别地，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含IgG1 Fc结构域，其包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat的EU编号)。
在一个特定的方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含：第一多肽，其包含与SEQID NO:50的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更特别地，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含：第一多肽，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；第三多肽，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在进一步的方面，本发明提供了如上文所描述的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中组合疗法以约一周至约三周的间隔施用。
在一个方面，提供了如上文所公开的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中B细胞增殖性疾患选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘带淋巴瘤(MZL)、多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组。在一个特定的方面，B细胞增殖性疾患为弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在进一步的方面，本发明提供了如上文所公开的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中抗CD20/抗CD3双特异性抗体、抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂静脉注射地施用。在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体、抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂皮下地施用。
附图说明
图1A至图1C是如实例中所使用的特定CD19-4-1BBL抗原结合分子、特定抗CD20/抗CD3双特异性抗体和特定抗CD19/抗CD28双特异性抗体的示意图。分别在实例1、2和3中更详细地描述这些分子。粗黑点代表旋杵臼结构修饰。*代表CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电变体)。图1A示出了一种单价CD19 4-1BBL三聚体，其含有经修饰的抗原结合分子，其中在4-1BBL二聚体和4-1BBL单体附近的CH1和CL结构域进行修饰。该分子在本文中被命名为CD19-4-1BBL。在图1B中示出了2+1形式的示例性的双特异性抗CD20/抗CD3抗体(被命名为CD20-TCB或格菲妥单抗(Glofitamab))。在图1C中示出了1+1crossfab形式的示例性的双特异性抗CD19/抗CD28抗体。CD19抗原结合结构域的VH和VL结构域被交换，使得VH结构域是轻链的一部分，并且VL结构域是重链的一部分。
图2A至图2D示出，在IVB期B细胞淋巴瘤患者的恶性脾脏切除术中，与单独的CD20-TCB治疗相比，CD20-TCB与CD19-4-1BBL或CD19-CD28的组合增强T细胞的活化，如通过所选细胞因子的释放所测量的。示出的是细胞因子颗粒酶B(GzB、图2A)、IFNγ(图2B)、IL-8(图2C)和IL-2(图图2D)的释放。
图3示出了一项功效研究的研究设计，以评估CD20-TCB与CD19-4-1BBL和CD19-CD28在人源化NSG小鼠的人OCI-Ly18异种移植中的三重组合效应。示出的是用于不同治疗组A至G(每组10只小鼠)的设计，即在不同时间点处的各种注射。
图4A至图4G示出了人源化NSG小鼠的OCI-Ly18异种移植的功效研究结果。示出的是如在y轴上所绘制的个体小鼠中针对七个治疗组的肿瘤的生长。图4A示出了载体组中每只个体小鼠的肿瘤生长，图4B是用CD20-TCB治疗的小鼠，图4C是用CD20-TCB和CD19-CD28治疗的小鼠，并且图4D是用CD20-TCB和CD19-4-1BBL治疗的小鼠。图4E示出了首先接受CD20-TCB与CD19-4-1BBL的组合治疗并且在第66天将治疗转换到CD20-TCB与CD19-CD28的组合的小鼠的肿瘤生长。图4F示出了首先接受CD20-TCB与CD19-CD28的组合治疗并且此后(在第66天)接受CD20-TCB与CD19-4-1BBL的组合治疗的小鼠的肿瘤生长。可以看出，在所有接受治疗的动物中，接受前四个周期从CD19-CD28开始随后是CD19-4-1BBL组合治疗直到研究终止的交替治疗方案的组实现了肿瘤在120天内得到完全的控制，而前四个周期从CD19-4-1BBL开始随后是CD19-CD28组合治疗的交替治疗方案并不能完全抑制肿瘤生长。图4G示出了接受CD20-TCB、CD19-4-1BBL和CD19-CD28的伴随三重组合治疗的小鼠的肿瘤生长。有趣地，与单独用CD20-TCB和CD19-4-1BBL进行治疗相比，同时施用CD20-TCB、CD19-CD28和CD19-4-1BBL没有改善肿瘤生长控制。
图5示出了三重组合功效研究的至事件发生时间分析。使用1500m3的肿瘤体积截断值。将存活概率(以％为单位)相对于时间(以天数为单位)绘制成图。首先用CD20-TCB与CD19-CD28的组合治疗，然后用CD20-TCB与CD19-4-1BBL的组合治疗的小鼠存活机会最高(100％)。
图6示出了一项功效研究的研究设计，以评估CD20-TCB与CD19-4-1BBL和CD19-CD28在人源化BRGS-CD47小鼠的人OCI-Ly18异种移植中的三重组合效应。示出的是用于不同治疗组A至G(每组10只小鼠)的设计，即在不同时间点处的各种注射。与第一项人源化NSG小鼠研究相比，该组合治疗早一周开始。
图7A至图7G示出了人源化BRGS-CD47小鼠的OCI-Ly18异种移植的功效研究结果。示出的是如在y轴上所绘制的个体小鼠中针对七个治疗组的肿瘤的生长。图7A示出了载体组中每只个体小鼠的肿瘤生长，图7B是仅用CD20-TCB治疗的小鼠，图7C是用CD20-TCB和CD19-CD28治疗的小鼠，并且图7D是用CD20-TCB和CD19-4-1BBL治疗的小鼠。组合治疗从第27天开始。图7E示出了首先接受CD20-TCB与CD19-4-1BBL的组合治疗并且在第55天将治疗转换到CD20-TCB与CD19-CD28的组合的小鼠的肿瘤生长。图7F示出了首先接受CD20-TCB与CD19-CD28的组合治疗并且此后(在第55天)接受CD20-TCB与CD19-4-1BBL的组合治疗的小鼠的肿瘤生长。可以看出，在大多数接受治疗的动物中，接受前四个周期从CD19-CD28开始随后是CD19-4-1BBL组合治疗直到研究终止的交替治疗方案的组实现了肿瘤在94天内得到较好的控制，而前四个周期从CD19-4-1BBL开始随后是CD19-CD28组合治疗的交替治疗方案并不能完全抑制肿瘤生长。图7G示出了接受CD20-TCB、CD19-4-1BBL和CD19-CD28的伴随三重组合治疗的小鼠的肿瘤生长。在该实验中，该伴随组中的肿瘤控制要比CD20-TCB与CD19-4-1BBL的组合更强，这可能是由于较早开始组合治疗而导致的。接受前四个周期从CD19-CD28开始随后是CD19-4-1BBL组合治疗直到研究终止的交替治疗方案的组(图7F)实现了肿瘤控制在94天内与伴随施用相似。
图8A至图8C示出了两项研究中的相应治疗方案之间的比较。示出的是首先接受CD20-TCB与CD19-4-1BBL的组合治疗并且在第55天接受CD20-TCB与CD19-CD28的组合治疗的小鼠的肿瘤生长差异(图8A)、首先接受CD20-TCB与CD19-CD28的组合治疗并且此后(在第55天)接受CD20-TCB与CD19-4-1BBL的组合治疗的小鼠的肿瘤生长差异(图8B)，以及接受CD20-TCB、CD19-4-1BBL和CD19-CD28的伴随三重组合治疗的小鼠的肿瘤生长差异(图8C)，指示组合治疗早一周开始比组合治疗晚开始能更好地控制肿瘤。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广泛意义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。本文中的术语“抗体”在最广泛意义上使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。然而，双特异性抗原结合分子还可以包含与其他抗原决定簇结合的额外抗原结合位点。在某些方面，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同细胞或同一细胞上表达的两种抗原决定簇。因此，根据本公开的术语“双特异性”也可以包括三特异性分子，例如包含CD28抗体和针对两种不同靶细胞抗原的两个抗原结合结构域的双特异性分子。
如本文所用，术语“与B细胞表面抗原结合的抗原结合结构域”或“能够与B细胞表面抗原特异性地结合的部分”是指与B细胞表面上的抗原决定簇特异性地结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过其靶细胞抗原活化信号传导。在特定的方面，抗原结合结构域能够将与其附接的实体(例如CD28激动剂)引导到(例如B细胞上的)靶位点。能够与B细胞表面抗原特异性地结合的抗原结合结构域包括如本文所进一步定义的抗体及其片段。另外，能够与B细胞表面抗原特异性结合的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域的结合结构域(参见例如WO 2002/020565)。
本申请中所用的术语“价态”表示在对一种独特抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子中存在特定数量的对一种独特抗原决定簇具有特异性的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在对特定抗原决定簇具有特异性的两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在本发明的特定方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子对特定抗原决定簇可以是单价的，意味着它们对所述抗原决定簇仅具有一个结合位点，或者对特定抗原决定簇可以是二价或四价的，意味着它们对所述抗原决定簇分别具有两个结合位点或四个结合位点。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用地是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，之后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，该五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，该分子包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、crossFab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如：EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化，以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指这样的抗体片段，其包含含有可变轻链(VL)结构域和轻链的恒定结构域(CL)的轻链片段，以及可变重链(VH)结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。
所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域发生交换(即互相替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1构成的肽链(VL-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL构成的肽链(VH-CL，在N末端至C末端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链的恒定结构域和Fab重链的恒定结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。
与之相比，所谓“常规”Fab分子，意指处于其天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变结构域和恒定结构域构成的重链(VH-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由轻链可变结构域和恒定结构域构成的轻链(VL-CL，在N末端至C末端方向)。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，通过十至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96中。另外，抗体片段包含单链多肽，该单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
作为参考分子的“与相同表位结合的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。
术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原较大的情况下，抗原结合分子可以仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与该位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个特定实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”意指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示，解离常数(Kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
如本文所用，“B细胞表面抗原”是指呈现于B淋巴细胞、特别是恶性B淋巴细胞(在该情形下，抗原也被称为“恶性B细胞表面抗原”)的表面上的抗原决定簇。在血液学恶性肿瘤的免疫疗法方面，几种B细胞表面抗原令人关注。在一个方面，B细胞表面抗原选自由CD19、CD79b、CD20、CD22和CD37组成的组。
术语“CD19”是指B淋巴细胞抗原CD19，也称为B淋巴细胞表面抗原B4或T细胞表面抗原Leu-12，并且除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD19，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CD19的氨基酸序列示出于Uniprot登录号P15391(160版，SEQ ID NO:54)中。所述术语涵盖“全长”未加工的人CD19以及由细胞中加工产生的任何形式的人CD19，只要如本文报道的抗体与其结合即可。CD19是一种结构不同的细胞表面受体，表达于人B细胞的表面上，所述人B细胞包括但不限于前B细胞、早期发育中的B细胞(即未成熟B细胞)、通过终末分化成浆细胞的成熟B细胞和恶性B细胞。CD19由大多数前B急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、前淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞白血病和一些无效急性(Null-acute)淋巴细胞白血病表达。CD19在浆细胞上的表达进一步表明它可能在分化的B细胞肿瘤(诸如多发性骨髓瘤)上表达。因此，CD19抗原是治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和/或急性淋巴细胞白血病的免疫疗法的靶标。
“CD20”是指B淋巴细胞抗原CD20，也被称为B淋巴细胞表面抗原B1或白细胞表面抗原Leu-16，并且除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD20，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CD20的氨基酸序列示出于Uniprot登录号P11836(149版，SEQID NO:55)中。CD20是一种疏水性跨膜蛋白，分子量约为35kD，在前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上表达。对应的人类基因为跨膜4结构域、亚家族A成员1，也称为MS4A1。该基因编码跨膜4A基因家族的成员。该新生蛋白家族的成员的特征在于共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界，并且在造血细胞和非淋巴组织中表现出独特的表达模式。该基因编码B淋巴细胞表面分子，该分子在B细胞发育和分化为浆细胞的过程中起作用。该家族成员在家族成员的簇中定位于11q12。该基因的替代性的剪接产生两种编码相同蛋白质的转录物变体。术语“CD20”涵盖“全长”的未加工CD20，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD20。该术语还涵盖CD20的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。
术语“抗CD20抗体”和“结合CD20的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合CD20，使得所述抗体可用作靶向CD20的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，抗CD20抗体与不相关的非CD20蛋白的结合程度小于该抗体与CD20的结合程度的约10％。在某些实施例中，与CD20结合的抗体的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施例中，抗CD20抗体与CD20的表位结合，该表位在来自不同物种的CD20中是保守的。
“II型抗CD20抗体”是指具有II型抗CD20抗体的结合特性和生物活性的抗CD20抗体，如Cragg等人，Blood 103(2004)2738-2743；Cragg等人，Blood 101(2003)1045-1052，Klein等人，mAbs 5(2013)，22-33中所描述的，并总结于下表A中。
表A.I型和II型抗CD20抗体的性质
I型抗CD20抗体 II型抗CD20抗体
结合I类CD20表位 结合II类CD20表位
将CD20定位至脂筏 不将CD20定位至脂筏
高CDC* 低CDC*
ADCC活性* ADCC活性*
与B细胞的完全结合能力 约对B细胞的半结合能力
弱同型聚合 同型聚合
低细胞死亡诱导 强细胞死亡诱导
*如果IgG1同种型
II型抗CD20抗体的实例包括，例如，奥滨尤妥珠单抗(GA101)，托西莫单抗(B1)，人源化的B-Ly1抗体IgG1(如WO 2005/044859中公开的嵌合的人源化IgG1抗体)、11B8 IgG1(如WO 2004/035607所公开)和AT80 IgG1。
在一方面，II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:36的重链可变区序列(VHCD20)和/或SEQ ID NO:37的轻链可变区序列(VLCD20)。在另一方面，与非工程化的抗体相比，II型抗CD20抗体被工程化以在Fc区具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在一方面，II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。在特定的方面，II型抗CD20抗体包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。该抗体被命名为GA101或奥滨尤妥珠单抗(建议INN,WHO Drug Information,第26卷,第4期,2012,第453页)。
商品名为或
I型抗CD20抗体的实例包括例如利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、维妥组单抗(veltuzumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥克立珠单抗(ocrelizumab)、PRO131921、乌妥昔单抗(ublituximab)、HI47 IgG3(ECACC，杂交瘤)、2C6IgG1(如WO 2005/103081中所公开)、2F2 IgG1(如WO 2004/035607和WO 2005/103081中所公开)和2H7 IgG1(如WO 2004/056312中所公开)。
术语“减少”(及其语法变体，诸如“减少(reduce)”或“减少(reducing)”)，例如B细胞数量减少或细胞因子释放的数量减少，是指相应量的减少，如通过本领域已知的适当方法所测量的。为清楚起见，该术语还包括降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全去除或消除。相反，“增加的”是指相应数量的增加。
如本文所用的“T细胞抗原”是指存在于T淋巴细胞、特别是细胞毒性T淋巴细胞表面的抗原决定簇。
如本文所用，“T细胞活化性治疗剂”是指能够在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂，特别是被设计用于在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂。T细胞活化性治疗剂的实例包括与活化性T细胞抗原特异性结合的双特异性抗体，诸如CD3和靶细胞抗原诸如CD20或CD19。其他实例包括嵌合抗原受体(CAR)，其包含T细胞活化结构域和特异性结合靶细胞抗原(例如CD20或CD19)的抗原结合部分。
如本文所用的“活化性T细胞抗原”是指通过T淋巴细胞、特别是细胞毒性T淋巴细胞表达的抗原决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导或增强T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。示例性的活化性T细胞抗原是CD3。
除非另外指明，否则术语“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD3，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列以UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(144版)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1示出。还可参见SEQ ID NO:58。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列示出于NCBI GenBank号BAB71849.1中。还可参见SEQ ID NO:59。
除非另外指明，否则术语“CD28”(分化簇28，Tp44)是指来自任何脊椎动物来源的任何CD28蛋白，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。CD28在T细胞上表达并提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。除了T细胞受体(TCR)之外，通过CD28刺激T细胞可以为各种白介素的产生提供有效的信号。CD28为CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白质的受体，并且是唯一在初始T细胞上组成型表达的B7受体。人CD28的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号P10747(SEQ ID NO:60)中。
“激动性抗体”是指包含针对给定受体的激动功能的抗体。通常，当激动剂配体(因子)与受体结合时，受体蛋白的三级结构发生变化，受体被激活(当受体为膜蛋白时，通常转导细胞生长信号等)。如果受体是二聚体形成类型，激动性抗体可以在适当的距离和角度使受体二聚化，因此与配体的作用类似。合适的抗受体抗体可以模拟配体进行的受体二聚化，因此可以成为激动性抗体。
“CD28激动性抗体”或“CD28常规激动性抗体”是模仿CD28天然配体(CD80或CD86)在存在T细胞受体信号时增强T细胞活化的作用的抗体(“信号2”)。T细胞需要两个信号才能完全激活。在生理条件下，“信号1”由T细胞受体(TCR)分子与抗原呈递细胞(APC)上的肽/主要组织相容性复合物(MHC)复合物的相互作用产生，“信号2”由共刺激受体，例如CD28提供。CD28激动性抗原结合分子能够共刺激T细胞(信号2)。它还能够与对TCR复合物具有特异性的分子联合诱导T细胞增殖和细胞因子分泌，但是CD28激动性抗原结合分子在没有额外刺激TCR的情况下不能完全激活T细胞。然而，存在CD28特异性抗原结合分子的亚类，即所谓的CD28超激动性抗原结合分子。“CD28超激动性抗体”是能够在不额外刺激TCR的情况下完全活化T细胞的CD28抗体。CD28超激动性抗体能够诱导T细胞增殖和细胞因子分泌，而无需预先活化T细胞(信号1)。CD28超激动性抗体的示例是TGN1412(公开在WO 2006/050949中)。
术语“抗CD28抗体”、“抗CD28”、“CD28抗体”和“与CD28特异性结合的抗体”是指能够以足够亲和力结合CD28的抗体，以便该抗体用作在靶向CD28中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)所测得的，抗CD28抗体与不相关的非CD28蛋白的结合程度小于该抗体与CD28结合程度的约10％。在某些实施例中，与CD28结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-6M或更小，例如10-6M至10-13M，例如10-8M至10-10M)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”来进一步阐明。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并且确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。一般来讲，抗体包含六个CDR；三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域的技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。
如本文所用，术语“亲和力成熟的”在抗原结合分子(例如抗体)的上下文中是指源自参考抗原结合分子的抗原结合分子，例如通过突变，结合与参考抗体相同的抗原，优选结合相同的表位；并且具有比参考抗原结合分子更高的对抗原的亲和力。亲和力成熟通常涉及抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基的修饰。通常，亲和力成熟的抗原结合分子结合与初始参考抗原结合分子相同的表位。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少，或2个或更少。在一些实施例中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历过人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其他形式为这样的抗体，其中相对于原始抗体，恒定区已经过额外的修饰或改变以产生根据本发明的特性，尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。
“人”抗体是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“CH1结构域”表示大致从EU 118位延伸至EU 215位(根据Kabat的EU编号系统)的抗体重链多肽部分。在一个方面，CH1结构域具有ASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列。通常，具有EPKSC的氨基酸序列(SEQ ID NO:62)的片段跟随以连接CH1结构域与铰链区，
术语“铰链区”表示抗体重链多肽的在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域的部分，例如根据Kabat的EU编号系统从约位置216至约位置230，或根据Kabat的EU编号系统从约位置226至约位置230。其他IgG亚类的铰链区可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。铰链区通常是由两种氨基酸序列相同的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含多达25个氨基酸残基，并且是柔性的，允许相关联靶结合位点独立地移动。铰链区可细分为三个结构域：上铰链区、中铰链区和下铰链区(参见例如，Roux等人,J.Immunol.161(1998)4083)。
本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgGCH3结构域。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从约EU 231位的氨基酸残基延伸至约EU 340位的氨基酸残基(根据Kabat的EU编号系统)。在一个方面，CH2结构域具有APELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列。CH2结构域的独特之处在于它与另一个结构域的配对不紧密。相反，两个N连接的支链碳水化合物链介于完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。在一个实施例中，碳水化合物链连接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以为天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。
“CH3结构域”包括Fc区中残基C末端至CH2结构域的延伸部分，表示大致从EU 341位延伸至EU 446位(根据Kabat的EU编号系统)的抗体重链多肽部分。在一个方面，CH3结构域具有GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在其一个链中具有引入的“凸起”(“杵”)并在其另一个链中具有相应的引入的“空腔”(“臼”)的CH3结构域；参见美国专利号5,821,333，其以引用方式明确并入本文)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异源二聚化。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。
“杵臼结构”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人,ProtEng 9,617-621(1996)以及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在具体实施例中，杵修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而臼修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含杵修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含臼修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。举例而言，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见，例如，Bowie,J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
术语“野生型Fc结构域”表示与自然界中发现的Fc结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc结构域包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc区、天然人IgG3 Fc区和天然人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。人IgG1 Fc区在SEQ ID NO:65中表示。
术语“变体(人)Fc结构域”表示与“野生型”(人)Fc结构域氨基酸序列的氨基酸序列区别在于至少一个“氨基酸突变”的氨基酸序列。在一个方面，与天然Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸突变，诸如在天然Fc区中从约一个到约十个氨基酸突变，并且在一个方面，从约一个到约五个氨基酸突变。在一个方面，(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约95％的同源性。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
Fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用来介导，该Fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来裂解涂有相应抗体的红细胞以及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR由其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义：IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合描述于例如：Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.，Annu.修订版，Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；以及Gessner,J.E.等人，Ann.Hematol.76(1998)231-248中。
IgG抗体(FcγR)Fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴定出三类FcγR，其中包括：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并且在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。Fc区IgG中在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)中的至少一个残基处的修饰降低与FcγRI的结合。在233-236位的IgG2残基被IgG1和IgG4取代，使得与FcγRI的结合力降低103倍，并且消除了人单核细胞对抗体敏化红细胞的应答(Armour,K.L.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合IgG，并得到广泛表达。该受体可分为两种亚型，即FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于许多参与杀伤的细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)中，并且似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且存在于B细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞中。在B细胞上，它似乎起到抑制免疫球蛋白进一步产生以及同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB用于抑制由FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可能通过IgE与其单独受体的结合而有助于抑制这些细胞的活化。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIA的结合力降低。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG，并且包括两种类型。FcγRIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上，并且介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上的表达水平高。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIIA的结合力降低。
Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604描述了人IgG1上与Fc受体的结合位点的定位、上述突变位点以及测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞细胞毒性”是导致免疫效应子细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。例如，通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(例如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞或NK细胞(在本质上表达FcγRIIIA))的结合，来研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。特别地，测量NK细胞上与FcγR的结合。
“活化性Fc受体”是如下Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。特定的活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
如本文所用，术语“效应子细胞”是指在其表面显示效应子部分受体(例如细胞因子受体)和/或Fc受体的淋巴细胞群体，它们透过该受体来结合效应子部分(例如细胞因子)和/或抗体的Fc区并有助于破坏靶细胞，例如肿瘤细胞。效应细胞可以例如介导细胞毒性或吞噬作用。效应子细胞包括但不限于效应子T细胞，诸如CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞、γδT细胞、NK细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。
“胞外域”是延伸到细胞外空间(即靶细胞外的空间)的膜蛋白的结构域。胞外域通常是蛋白质的启动与表面接触从而导致信号转导的部分。因此，如本文所定义的4-1BBL的胞外域是指4-1BBL的延伸到细胞外空间中的部分(胞外域)，但也包括其负责三聚化和用于与相应的受体4-1BB结合的较短部分或片段。因此，术语“4-1BBL的胞外域或其片段”是指形成胞外域的4-1BBL的胞外域或其仍然能够与受体结合的部分(受体结合结构域)。
“4-1BBL”或“4-1BB配体”或“CD137L”为共刺激TNF配体家族成员，其能够共刺激T细胞的增生和细胞因子产生。共刺激TNF家族配体可以在与其相应的TNF受体相互作用后共同刺激TCR信号，并且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集，从而启动导致T细胞活化的信号级联反应。4-1BBL是II型跨膜蛋白。已经描述了具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的完整或全长4-1BBL在细胞表面形成三聚体。三聚体的形成是由4-1BBL胞外域的特异性基序促成的。所述基序在本文中被指定为“三聚化区域”。人4-1BBL序列(SEQ ID NO:9)的氨基酸50-254形成了4-1BBL的胞外域，但即使是其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施例中，术语“4-1BBL的胞外域或其片段”是指具有选自SEQ ID NO:4(人4-1BBL的氨基酸52-254)、SEQ ID NO:1(人4-1BBL的氨基酸71-254)、SEQ ID NO:3(人4-1BBL的氨基酸80-254)、SEQ ID NO:2(人4-1BBL的氨基酸85-254)、SEQ ID NO:5(人4-1BBL的氨基酸71-248)、SEQ ID NO:6(人4-1BBL的氨基酸85-248)、SEQ ID NO:7(人4-1BBL的氨基酸80-248)、SEQ ID NO:8(人4-1BBL的氨基酸52-248)和SEQ ID NO:9(人4-1BBL的氨基酸50-254)的氨基酸序列的多肽，但能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“4-1BB”或“CD137”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然4-1BB，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工4-1BB，以及通过细胞中加工产生的任何形式的4-1BB。该术语还涵盖4-1BB的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人4-1BB的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:67(Uniprot登录号Q07011)中。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸(通常约2至20个氨基酸)的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性接头肽是例如(G4S)2(SEQ ID NO:68)。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile,I)、亮氨酸(leu,L)、赖氨酸(lys,K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser,S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸(val,V)。
“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和4-1BBL的胞外域)通过肽键、直接或经由一个或多个肽接头连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不将任何保守取代考虑为该序列同一性的一部分的情况下，与该参考多肽序列中的氨基酸残基相同的该候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性值％。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，UNIX操作系统包括数字UNIXV4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以替代性地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与或针对给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X为由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y为B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些实施例中，考虑了本文提供的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。用于取代诱变的感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守性取代在表C中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标分子中，并对产物进行期望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)筛选。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其片段通常经由Fc区的N末端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文所用，术语“增加的/降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量的增加/减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度减少/增加。ADCC的增加/降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，相对于通过相同类型的未工程改造宿主细胞所产生的相同抗体介导的ADCC，通过经本文所公开的方法工程改造为具有改变的糖基化模式(例如，以表达糖基转移酶、GnTIII或其他糖基转移酶)的宿主细胞所产生的抗体介导的ADCC增加。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)在某些实施例中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的取代。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcγR结合的氨基酸取代的Fc区，例如Fc区的234位和235位的取代(残基的EU编号)。一方面，取代是L234A和L235A(LALA)。在某些方面，抗体变体进一步包含在源自人IgG1 Fc区的Fc区中的D265A和/或P329G。在一个方面，在源自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和P329G(LALA-PG)。(参见例如WO2012/130831)。在另一个方面，在源自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和D265A(LALA-DA)。
在一些实施例中，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述，在Fc区中进行改变，导致改变(即，改善或减少)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合(其负责将母体IgG转移至胎儿)(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117:587(1976)，以及Kim,J.K.等人,J.Immunol.24:249(1994))的抗体描述于US2005/0014934(Hinton等人)中。那些抗体包含这样的Fc区，该Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(参见，例如美国专利号7,371,826；Dall'Acqua,W.F.等人.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的253、和/或310和/或435位的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置253、310和435位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是I253A、H310A和H435A。参见例如Grevys,A.等人,J.Immunol.194(2015)5497-5508。
在另一方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的310、和/或433和/或436位的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置310、433和436位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是H310A、H433A和Y436A。(参见，例如，WO 2014/177460 Al)。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应证、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌和/或警告的信息。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程期间进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
如本文所用，术语“癌症”是指增殖性疾病，诸如淋巴瘤或淋巴细胞性白血病或黑色素瘤。
“B细胞增殖性疾患”意指一种疾病，其中患者中B细胞数量与健康受试者的B细胞数量相比有所增加，特别是其中B细胞数量的增加是疾病的原因或标志。“CD20阳性B细胞增殖性疾患”是B细胞增殖性疾患，其中B细胞，特别是恶性B细胞(除正常B细胞外)表达CD20。示例性的B细胞增殖疾病包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)，以及某些类型的多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)。特定的B细胞增殖病症为非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在特定的方面，B细胞增殖病症为弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
本发明涉及一种抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合，该组合用于在用于治疗B细胞增殖性疾患的组合疗法中使用。在人源化NSG小鼠中用格菲妥单抗和CD19-CD28进行的计划安排研究表明，安全且强效的治疗方案是使用Gazyva预治疗，随后在第一治疗周期以三天的间隔交错输注格菲妥单抗和抗CD19/抗CD28双特异性抗体CD19-CD28。在携带难以治疗的播散性WSU-DLCL2DLBCL肿瘤模型的huNSG小鼠中，与相应的单一疗法组相比，格菲妥单抗与CD19-CD28的组合治疗导致了无肿瘤动物的形成。体内作用方式研究揭示，对于CD4+和CD8+T细胞亚群两者，格菲妥单抗介导的T细胞浸润强烈地增强，而没有任何调节性T细胞活性增加的证据。用CD19-CD28进行的二线治疗能够延长格菲妥单抗应答的持续时间，并且在皮下OCI-Ly18DLBCL模型中延迟肿瘤体内复发。有趣地，CD19-CD28与靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂(CD19-4-1BBL)的交替在第一治疗周期给予CD19-CD28随后在以后的周期给予CD19-4-1BBL时，在超过120天的格菲妥单抗治疗期间完全防止了肿瘤复发。最后，CD19-CD28在离体DLBCL患者样品中增强了格菲妥单抗介导的细胞因子分泌和T细胞活化，这验证了其不仅对来源于健康供体的T细胞而且对来源于患者的T细胞的活性。综合起来，临床前数据示出，将CD19-CD28与CD20TCB组合在r/r NHL患者中以加深和进一步延长治疗应答是有充分理由的，然而最佳的计划安排包括与CD20 TCB(格菲妥单抗)和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂(CD19-4-1BBL)的组合治疗交替。
用于本发明的示例性抗CD20/抗CD3双特异性抗体
如本文所用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体是包含与CD3结合的第一抗原结合结构域和与CD20结合的第二抗原结合结构域的双特异性抗体。
因此，如本文所用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3)的第一抗原结合结构域，以及包含重链可变区(VHCD20)和轻链可变区(VLCD20)的第二抗原结合结构域。
在一个特定的方面，组合使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，其包含：重链可变区(VHCD3)，其包含SEQ ID NO:22的CDR-H1序列、SEQ ID NO:23的CDR-H2序列和SEQ ID NO:24的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD3)，其包含SEQ ID NO:25的CDR-L1序列、SEQ ID NO:26的CDR-L2序列和SEQ ID NO:27的CDR-L3序列。更特别地，该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，其包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(VHCD3)和/或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(VLCD3)。在进一步的方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：重链可变区(VHCD3)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD3)，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一个方面，特异性结合CD3的抗体是全长抗体。在一方面，与CD3特异性结合的抗体是人IgG类抗体，特别是人IgG1类抗体。在一个方面，特异性结合CD3的抗体是抗体片段，特别是Fab分子或scFv分子，更特别是Fab分子。在一个特定方面，特异性结合CD3的抗体是交叉Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换(即，被彼此替换)。在一个方面，特异性结合CD3的抗体是人源化抗体。
在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的CDR-H1序列、SEQ ID NO:31的CDR-H2序列和SEQ ID NO:32的CDR-H3序列，该轻链可变区包含SEQ IDNO:33的CDR-L1序列、SEQ ID NO:34的CDR-L2序列和SEQ ID NO:35的CDR-L3序列。更具体地，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，其包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(VHCD20)和/或与SEQ IDNO:37的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(VLCD20)。在进一步的方面，抗CD20/抗CD3双特异性包含第二抗原结合结构域，其包括包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列的重链可变区(VHCD20)和/或包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD20)。
在另一个特定的方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含与CD20结合的第三抗原结合结构域。特别地，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第三抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的CDR-H1序列、SEQID NO:31的CDR-H2序列和SEQ ID NO:32的CDR-H3序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:33的CDR-L1序列、SEQ ID NO:34的CDR-L2序列和SEQ ID NO:35的CDR-L3序列。更特别地，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第三抗原结合结构域，其包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区(VHCD20)和/或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区(VLCD20)。在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第三抗原结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区(VHCD20)和/或包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区(VLCD20)。
在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是双特异性抗体，其中第一抗原结合结构域是其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换的交叉Fab分子，并且第二和第三(如果存在的话)抗原结合结构域是常规Fab分子。
在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是双特异性抗体，其中(i)第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且第三抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合，或(ii)第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且第三抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合。
Fab分子可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)2肽接头(SEQ ID NO:68)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含Fc结构域，其包含减少与Fc受体的结合和/或降低效应子功能的一个或多个氨基酸取代。特别地，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含IgG1 Fc结构域，其包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
在特定的方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：第一多肽，其包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四和第五多肽，两者均包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在进一步特定的实施例中，双特异性抗体包含SEQ ID NO:38的多肽序列、SEQ ID NO:39的多肽序列、SEQ IDNO:40的多肽序列和SEQ ID NO:41的两倍的多肽序列(CD20 TCB)。在一个特定的方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是格菲妥单抗。
格菲妥单抗(WHO药物信息(药物物质的国际非专利名称)，推荐INN：清单83，2020年，第34卷，第1期，第39页；拟定INN：清单121WHO药物信息，第33卷，第2期，2019年，第276页，也被称为CD20-TCB、RO7082859或RG6026；CAS编号：2229047-91-8)是一种T细胞接合双特异性(TCB)全长抗体，其具有2:1的分子构型，以用于与B细胞上的CD20进行二价结合并与T细胞上的CD3(特别是CD3ε链(CD3e))进行单价结合。其CD3结合区域通过灵活的接头融合到头到尾形式的CD20结合区域之一。这种结构赋予格菲妥单抗相对于具有其他1:1构型的CD20-CD3双特异性抗体的优异的体外效力，并在临床前DLBCL模型中产生重要的抗肿瘤功效。CD20双价在存在竞争性抗CD20抗体的情况下保留了这种效力，提供了与这些药物进行预治疗或组合治疗的机会。格菲妥单抗包含一个工程化的异二聚体Fc区，完全去除了与FcgR和C1q的结合。通过同时结合人表达CD20的肿瘤细胞和T细胞上T细胞受体(TCR)复合物的CD3e，除了T细胞活化、增殖和细胞因子释放外，它还诱导肿瘤细胞裂解。格菲妥单抗介导的B细胞裂解是CD20特异性的，在没有CD20表达或T细胞与表达CD20的细胞没有同时结合(交联)的情况下不会发生。除了杀伤之外，T细胞还因CD3交联而被活化，这可通过T细胞活化标记物(CD25和CD69)的增加、细胞因子释放(IFNγ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-10)、细胞毒性颗粒释放(颗粒酶B)和T细胞增殖来检测。格菲妥单抗的分子结构的示意性图片描绘在图1B中。
特定的其他双特异性抗体描述在PCT公开号WO 2016/020309 A1或WO 2015/095392A1中。在进一步的方面，抗体是莫妥珠单抗(Moxetumomab)。
在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体还可以包含双特异性T细胞接合物在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是13676。在另一方面，双特异性抗体是REGN1979。在另一方面，双特异性抗体是FBTA05(Lymphomun)。
用于本发明的示例性4-1BB激动剂
特别地，与抗CD20/抗CD3双特异性抗体组合使用的靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是包含4-1BBL的分子。特别地，用于本发明的4-1BB激动剂包含4-1BBL的三个胞外域或其片段。
在特定的方面，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是包含4-1BBL的三个胞外域或其片段的分子，并且其中4-1BBL的胞外域包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
已经示出，包含至少一个能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域的4-1BB激动剂不会被CD19内化到B细胞中，并且因此不会失去其与肿瘤微环境相互作用的能力。在一个方面，提供了一种4-1BB激动剂，其不会在B细胞中内化，从而维持其活性。
在另一方面，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是一种抗原结合分子，其包含4-1BBL的三个胞外域或其片段和至少一个能够与CD19特异性地结合的部分，其中能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域是食蟹猴交叉反应性的，即能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域与人和食蟹猴CD19特异性地结合。
在进一步的方面，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是一种抗原结合分子，其包含4-1BBL的三个胞外域或其片段和至少一个能够与CD19特异性地结合的部分，其中能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)，该重链可变区包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQID NO:11的氨基酸序列，以及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，该轻链可变区包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，以及(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在进一步的方面，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是一种抗原结合分子，其包含4-1BBL的三个胞外域或其片段和至少一个能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域，其中能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)，该重链可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列
在另一方面，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是一种抗原结合分子，其进一步包含由能够稳定缔合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。在一个方面，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是一种抗原结合分子，其包含IgG Fc结构域，尤其是IgG1 Fc结构域或IgG4Fc结构域。特别地，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是一种抗原结合分子，其包含Fc结构域，该Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的氨基酸取代。在特定的方面，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是一种抗原结合分子，其包含IgG1 Fc结构域，该结构域包含氨基酸取代L234A，L235A和P329G。
在一个方面，靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂是一种抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与CD19特异性地结合的抗原结合结构域，(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且特征在于，第二多肽包含4-1BBL的一个胞外域或其片段。
在另一方面，靶向CD19的4-1BB激动剂包含
(a)第一多肽，其包含：(a1)4-1BBL的第一胞外域或其片段，其在C末端处与4-1BBL的第二胞外域或其片段的N末端融合，(a2)4-1BBL的第二胞外域或其片段，其在C末端处与CL结构域的N末端融合，(a3)CL结构域，其在C末端处与Fc结构域的亚基中的一者(例如第一亚基)的N末端融合，和(a4)Fc结构域的亚基中的一者(例如第一亚基)；
(b)第二多肽，其包含：(b1)4-1BBL的第三胞外域或其片段，其在C末端处与CH1结构域的N末端融合，和(b2)CH1结构域；
(c)第三多肽，其包含：(c1)与CD19结合的Fab分子的重链，其在C末端处与Fc结构域的亚基中的另一者(例如第二亚基)的N末端融合，和(c2)Fc结构域的亚基中的另一者(例如第二亚基)；以及
(d)第四多肽，其包含与CD19结合的Fab分子的轻链。
在一个特定的方面，靶向CD19的4-1BB激动剂包含：第一多肽，其包含与SEQ IDNO:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更具体地，靶向CD19的4-1BB激动剂包含：第一多肽，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列；第三多肽，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在特定的方面，靶向CD19的4-1BB激动剂是靶向CD19的4-1BB配体(CD19-4-1BBL)或englumafusp alfa。
Englumafusp alfa(WHO药物信息(药物物质的国际非专利名称)，推荐INN：清单89，2023年，第37卷，第1期，第97页，也被称为CD19-4-1BBL、RO7227166、RG6076；CAS编号：2417199-08-5)是一种靶向CD19的4-1BB配体(CD19-4-1BBL)。该分子的潜在作用方式在于，在通过将4-1BB阳性活化的效应子细胞与CD19阳性肿瘤靶标交联、分别通过靶向肿瘤的T细胞双特异性(TCB)抗体或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)进行活化后，增强肿瘤浸润性T细胞或NK细胞的效应子功能。4-1BB的交联导致免疫细胞的共刺激，即增强效果或功能(例如，干扰素-γ和IL2的增殖和产生)、保护细胞免于死亡(例如，抗凋亡通路的上调)，以及促进免疫记忆的发展和持久免疫应答的创建。通过选择性地促进表达CD19的肿瘤的微环境中的免疫应答，脱靶免疫应答的风险受到限制。通过消除Fcγ受体(FcγR)和C1q复合物与IgG1抗体部分的相互作用来进一步提高englumafusp alfa的安全性，以通过抑制FcγR介导的先天免疫效应子细胞(诸如NK细胞或巨噬细胞/单核细胞)的共活化来防止触发ADCC和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。englumafusp alfa的分子结构的示意性图片描绘在图1A中。
在进一步的方面，4-1BB激动剂是抗CD19/抗4-1BB双特异性抗体。
用于本发明的示例性抗CD28双特异性抗体
如本文所用的抗CD28双特异性抗体是双特异性激动性CD28抗体，其包含：能够与CD28特异性地结合的抗原结合结构域；能够与B细胞表面抗原特异性地结合的抗原结合结构域；以及由能够稳定缔合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，该Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。在一个方面，如本文所描述的双特异性激动性CD28抗体的特征在于与CD28单价结合。在进一步的方面，如本文所描述的双特异性激动性CD28抗体的特征在于与B细胞表面抗原单价结合。特别地，B细胞表面抗原是CD19。
在一个方面，提供了如上文所定义的双特异性激动性CD28抗体，其中Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一个特定方面，由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域是IgG1Fc结构域。特别地，Fc结构域包含降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个方面，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，并且包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，如本文所用的抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含：第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)；以及第二抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)。
在进一步的方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD28)，其包含SEQ ID NO:42的CDR-H1序列、SEQ IDNO:43的CDR-H2序列和SEQ ID NO:44的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD28)，其包含SEQID NO:45的CDR-L1序列、SEQ ID NO:46的CDR-L2序列和SEQ ID NO:47的CDR-L3序列。在一个进一步的方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD28)，其包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD28)，其包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD28)，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD28)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一个方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD19)，其包含SEQ ID NO:10的CDR-H1序列、SEQ ID NO:11的CDR-H2序列和SEQ ID NO:12的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD19)，其包含SEQ IDNO:13的CDR-L1序列、SEQ ID NO:14的CDR-L2序列和SEQ ID NO:15的CDR-L3序列。在一个方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD19)，其包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD19)，其包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD19)，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD19)，其包含SEQID NO:17的氨基酸序列。
在一个特定的方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含：第一多肽，其包含与SEQID NO:50的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更特别地，抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含：第一多肽，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；第二多肽，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；第三多肽，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。抗CD19/抗CD28双特异性抗体的分子结构的示意性图片描绘在图1C中。
用于本发明的双特异性抗体的制备
在某些方面，组合中使用的治疗剂包括多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，结合特异性针对不同的抗原。在某些方面，结合特异性针对同一抗原上的不同表位。可以将双特异性抗体制成全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829以及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵臼”工程改造(参见例如，美国专利号5,731,168)。还可以通过工程化改造静电操纵效应来制备多特异性抗体，以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如,Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备如例如在Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所描述的三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见，例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与两个不同抗原结合的抗原结合位点(参见例如，US2008/0069820)。本文还包括“Crossmab”抗体(参见例如WO2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080253或WO2009/080254)。
用于制备双特异性抗体片段的另一种技术是“双特异性T细胞衔接子”或方法(参见，例如，WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261和WO2008/119567)。该方法利用排列在单个多肽上的两个抗体可变结构域。例如，单条多肽链包括两个单链Fv(scFv)片段，每个片段均具有被多肽接头隔开的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域，多肽接头的长度足以允许两个结构域之间的分子内缔合。该单个多肽进一步包括两个scFv片段之间的多肽间隔区序列。每个scFv识别不同的表位，并且这些表位可以对不同的细胞类型具有特异性，这样当每个scFv与其同源表位接合时，两种不同细胞类型的细胞会紧密接近或束缚在一起。该方法的一个特定实施例包括识别由免疫细胞表达的细胞表面抗原(例如，T细胞上的CD3多肽)的scFv，该scFv与另一个识别靶细胞(诸如恶性或肿瘤细胞)表达的细胞表面抗原的scFv连接。
由于其是单一多肽，因此双特异性T细胞衔接子可以使用本领域已知的任何原核或真核细胞表达系统(例如，CHO细胞系)来表达。然而，可能需要特定的纯化技术(参见，例如，EP1691833)将单体双特异性T细胞衔接子与其他多聚体物种分离，这些多聚体物种可能具有不同于单体的预期活性的生物活性。在一个示例性纯化方案中，首先使含有分泌多肽的溶液经受金属亲和色谱法，并且用咪唑浓度梯度洗脱多肽。使用阴离子交换色谱法进一步纯化该洗脱液，并且使用氯化钠浓度梯度洗脱多肽。最后，使该洗脱液经受尺寸排阻色谱法，以将单体与多聚体分离。在一个方面，用于发明的双特异性双特异性抗体由单一多肽链构成，该单一多肽链包含两个通过肽接头彼此融合的单链FV片段(scFV)。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
本发明的抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。
Fc结构域为本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定方面，如与天然IgG1Fc结构域相比，本发明的抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个方面，Fc基本上不结合到Fc受体和/或不诱导效应子功能。在一个特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个具体的方面，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，Fc结构域不诱导效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。
在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如，取代)。
在一个特定方面，本发明提供一种抗体，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，特别是与Fcγ受体的结合。
在一个方面，本发明抗体的Fc结构域包含降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。特别地，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位(EU编号)处包含氨基酸取代。特别地，Fc结构域包含IgG重链234和235位(EU编号)和/或329位(EU编号)的氨基酸取代。更具体地，提供根据本发明的抗体，其包含在IgG重链中具有氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)的Fc结构域。氨基酸取代L234A和L235A是指所谓的LALA突变。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除人IgG1Fc结构域的Fcγ受体结合，并且描述在国际专利申请公开号WO 2012/130831 A1中，该专利申请公开还描述制备此类突变Fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
具有降低的Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域还包括具有Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
在另一方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。在一个更具体的方面，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G(EU编号)的IgG4 Fc结构域。WO 2012/130831中也描述了此类IgG4 Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合特性。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变型Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化性抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域的效应子功能，或包含Fc结构域的本发明的抗体，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量ADCC的合适测定。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad SciUSA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(威斯康星州，麦迪逊市，普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定目标分子的ADCC活性。
在一些方面，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定，以确定本发明的双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性(参见例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
本发明的双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点，因此该Fc结构域的两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性抗体的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。
在特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，其包括Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一些方面，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起，该凸起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的凸起可定位在空腔内。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体的这种方面，在Fc结构域的第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换并且在Fc结构域的第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换，并且任选地位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据Kabat EU索引编号)。在另一个方面，在Fc结构域的第一亚基中，除此之外，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替换或者位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替换(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在Fc结构域的第二亚基中，除此之外，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替换(根据Kabat EU索引编号)。在一个优选方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
如本文报道的双特异性抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含含有C-末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施例中，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
Fab结构域中的修饰
在一个方面，本文使用的分子是双特异性抗体，其中在Fab片段的一者中，可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL被交换。根据Crossmab技术制备双特异性抗体。
在WO2009/080252和Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191中详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)。它们明显减少了由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配导致的副产物(与没有此类结构域交换的方法相比)。在特定的方面，额外的Fab片段是Fab片段，其中可变结构域VL和VH彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分并且VL结构域是重链的一部分。
在一个方面，本发明涉及一种双特异性激动性CD28抗原结合分子，其特征在于与CD28单价结合，该抗原结合分子包含：(a)一个能够与CD28特异性地结合的抗原结合结构域，(b)至少一个能够与肿瘤相关抗原特异性地结合的抗原结合结构域，以及(c)由能够稳定缔合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，该Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，其中在能够与肿瘤相关抗原特异性地结合的Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，使得CH1结构域是轻链的一部分，并且CL结构域是重链的一部分。
在另一方面，并且为了进一步改善正确配对，本文使用的双特异性抗体(例如特征在于与CD28单价结合的双特异性激动性CD28抗体)包含：(a)一个能够与CD28特异性地结合的Fab片段，(b)一个能够与CD19特异性地结合的Fab结构域，以及(c)由能够稳定缔合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，该Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，可以含有不同的带电氨基酸取代(所谓的“带电残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。在特定的方面，本发明涉及双特异性激动性CD28抗原结合分子，其中在CL结构域之一中，第123位(EU编号)氨基酸已被精氨酸(R)取代并且第124位(EU编号)氨基酸已被赖氨酸(K)取代，其中在CH1结构域之一中，第147位(EU编号)和第213位(EU编号)氨基酸已被谷氨酸(E)取代。在一个特定的方面，在能够与CD28特异性结合的Fab片段的CL结构域中，第123位(EU编号)氨基酸已被精氨酸(R)取代，第124位(EU编号)氨基酸已被赖氨酸(K)取代，并且在能够与CD28特异性结合的Fab片段的CH1结构域中，第147位(EU编号)氨基酸和第213位(EU编号)氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
更特别地，本文使用的双特异性可以包含Fab，其中在CL结构域中，位置123(EU编号)处的氨基酸已被精氨酸(R)替换并且位置124(EU编号)处的氨基酸已被赖氨酸(K)取代，并且其中在与TNF配体家族成员相邻的CH1结构域中，位置147(EU编号)处和位置213(EU编号)处的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
药物组合物、药物、制剂和施用途径
在进一步的方面，提供了包含抗CD20/抗CD3抗体、抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的药物组合物或药物，其例如用于以下治疗方法中的任一者。在一个方面，药物组合物包含本文提供的抗体和至少一种药用赋形剂。在另一方面，药物组合物包含本文提供的抗体和至少一种额外的治疗剂，例如如以下所描述的。
如本文所公开的药物组合物包含溶解或分散在药用赋形剂中的治疗有效量的一种或多种双特异性抗体。短语“药用或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(诸如例如人)时不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种抗体和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将鉴于本公开而为本领域的技术人员已知，如由Remington's PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Printing Company,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。特别地，组合物为冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。
包含本文公开的双特异性抗原结合分子的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，这些载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的施用途径。
双特异性抗体可以被配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
双特异性抗体的施用
抗CD20/抗CD3双特异性抗体、抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂(在本文中统称为物质)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果期望用于局部治疗的话，则可以通过病灶内施用。然而，本文所公开的方法对于通过肠胃外、特别是静脉内输注施用的治疗剂特别有用。
肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。在一方面，治疗剂是胃肠外施用的，特别是静脉内施用的。在一个特定的方面，该物质通过静脉内输注施用。在另一方面，该物质是皮下施用的。
抗CD20/抗CD3双特异性抗体、抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。抗CD20/抗CD3双特异性抗体、抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂不必是目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂，但任选地与这些药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的治疗剂的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文描述的剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
可以通过任何合适的方式，包括肠胃外、肺内和鼻内施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体，并且如果期望局部治疗，则可以通过病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。在一个方面，肠胃外，特别是静脉内，例如通过静脉内输注施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体。在一个方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体，特别是格菲妥单抗的输注率为至少4小时。在一个方面，可以减少或延长抗CD20/抗CD3双特异性抗体的输注时间。在一个方面，在不存在输注相关不良事件的情况下，后续周期中格菲妥单抗的输注时间减少到2小时±15分钟。在一个方面，对于具有经历细胞因子释放综合征(CRS)的高风险的受试者，输注时间增加到高达8小时。在一个方面，例如，对于CRS的风险可能增加的患者、在其先前剂量的格菲妥单抗中经历IRR或CRS的患者或在后续剂量下再次发生IRR/CRS的风险增加的患者，格菲妥单抗的输注时间延长到高达8小时。
在一个特定的方面，本文公开了如本文所描述的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中组合疗法包括抗CD20/抗CD3双特异性抗体、抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的伴随施用。在某些方面，伴随施用用于一个或多个治疗周期，特别是3至8个治疗周期。治疗周期的长度对应于7天或14天或21天，特别是7天或14天。
特别地，本公开还涉及如本文所描述的用于使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中组合疗法包括用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合的第一治疗方案和用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的第二治疗方案。
在一个方面，用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合的第一治疗方案是单一施用(一个治疗周期)。在某些方面，用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合的第一治疗方案的施用是两个或更多个治疗周期。在一个方面，第一治疗方案包括1至5个治疗周期，并且第二治疗方案从接下来的治疗周期开始。在另一方面，第一治疗方案包括3至5个治疗周期，并且第二治疗方案从接下来的治疗周期开始。在一个方面，第一治疗方案包括4个治疗周期，并且第二治疗方案从治疗周期5开始。在一个方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体比抗CD20/抗CD3双特异性抗体晚一个小时施用，但在同一治疗周期(例如7天)中施用。在另一方面，抗CD19/抗CD28双特异性抗体比抗CD20/抗CD3双特异性抗体晚2天施用，但在(例如7天或14天或21天的)同一治疗周期中施用。
在一个方面，用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的第二治疗方案是单一施用(一个治疗周期)。在某些方面，用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的第二治疗方案的施用是两个或多个治疗周期。在一个方面，第二治疗方案包括1至5个治疗周期。在另一方面，第二治疗方案包括3至5个治疗周期。在一个方面，第二治疗方案包括2个或更多个治疗周期，并且随后将重复第一治疗方案。在一个方面，重复的第一治疗方案从下一治疗周期开始。在一个方面，重复的第一治疗方案随后将是重复的第二治疗方案(交替施用)。
在一个这样的方面，每周、每两周或每三周，特别是每两周施用物质。在一个方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体以治疗有效量施用。在一个方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体以约50μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约300μg/kg、约400μg/kg、约500μg/kg、约600μg/kg、约700μg/kg，约800μg/kg、约900μg/kg或约1000μg/kg的剂量施用。在一个方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体以比相应治疗方案中抗CD20/抗CD3双特异性抗体的剂量低的剂量施用，而不施用抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂。在一个方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的施用包括初始施用第一剂量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体，以及一次或多次后续施用第二剂量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体，其中第二剂量高于第一剂量。在一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的施用包括初始施用第一剂量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体，以及一次或多次后续施用第二剂量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体，其中第一剂量不低于第二剂量。
在一个方面，在一至三个单一施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体的治疗周期之后，将开始用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合的第一治疗方案。在一个方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体将每周施用。在最后单独的单一施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体之后一周，将开始用抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合的第一治疗方案。
在另一方面，在根据本发明的治疗方案中施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体是抗CD20/抗CD3双特异性抗体对受试者的第一次施用(至少在同一疗程内)。在一个方面，在施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体之前不向受试者施用抗CD19/抗CD28双特异性抗体。在另一方面，在施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体之前施用抗CD19/抗CD28双特异性抗体。
在所有这些方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合用于在组合治疗中使用，其中在开始施用组合治疗之前，治疗方案从单独施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体开始并持续一个或多个治疗周期，特别是三至五个治疗周期。在一个特定的方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体在每个单一施用治疗周期中以递增的剂量施用(递升给药)。
在一个方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体用于在与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合中使用，其中在组合治疗之前，用II型抗CD20抗体、优选地奥滨尤妥珠单抗进行预先治疗，其中预先治疗与组合治疗之间的时间段足以减少对II型抗CD20抗体、优选为奥滨尤妥珠单抗有应答的个体中的B细胞。在一个特定的方面，在用抗CD20/抗CD3双特异性抗体的首次治疗之前7天施用奥滨尤妥珠单抗。在一个特定的方面，在用抗CD20/抗CD3双特异性抗体的首次治疗之前7天施用奥滨尤妥珠单抗，并且在第一治疗周期的第1天施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体，随后在组合治疗从第二治疗周期开始之前，在第一治疗周期的第3天和第8天，施用两个逐步更高剂量水平的抗CD20/抗CD3双特异性抗体。
T细胞的活化可导致严重的细胞因子释放综合征(CRS)。在TeGenero进行的第1阶段研究中(Suntharalingam等人，N Engl J Med(2006)355,1018-1028)，所有6名健康志愿者在输注不当剂量的T细胞刺激性超级激动剂抗CD28单克隆抗体后，都迅速经历了接近致命的严重细胞因子释放综合征(CRS)。通过用II型抗CD20抗体如奥滨尤妥珠单抗预治疗受试者，可以显著减少与向受试者施用T细胞活化治疗剂(例如抗CD20/抗CD3双特异性抗体)相关的细胞因子释放。使用预治疗(Gpt)应有助于快速耗尽外周血和次级淋巴器官中的B细胞，从而降低因T细胞活化治疗剂的强烈的全身性T细胞活化而导致的高度相关不良事件(AE)(例如CRS)的风险，同时支持了T细胞活化治疗剂的暴露水平，其从给药开始就足够高以介导肿瘤细胞消除。迄今为止，在正在进行的奥滨尤妥珠单抗临床试验中，已经在数百名患者中评估和管理了奥滨尤妥珠单抗的安全性概况(包括细胞因子释放)。最后，除了支持T细胞活化治疗剂例如抗CD20/抗CD3双特异性抗体的安全性外，Gpt还应有助于防止针对这些独特分子形成抗药抗体(ADA)。
上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，治疗剂的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施例中，治疗剂的施用和另外的治疗剂的施用在彼此相距约1个月内，或在约1周、2周或3周内，或在约1天、2天、3天、4天、5天或6天内进行。
治疗方法和组合物
CD20和CD19在除干细胞和浆细胞之外的大多数B细胞(泛B细胞标记物)上表达，并且经常在大多数人B细胞恶性肿瘤上表达，诸如淋巴瘤和白血病，例如在非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞性白血病中表达。识别不同细胞群体上的两种细胞表面蛋白的双特异性抗体有希望重定向细胞毒性免疫细胞以破坏致病性靶细胞。
在一个方面，提供了一种治疗有此需要的个体的B细胞癌症的方法，该方法包括向所述个体施用包括抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向抗CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的组合疗法。
在一个这样的方面，所述方法进一步包括向受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在进一步的实施例中，本文提供了一种用于耗尽B细胞的方法，该方法包括向受试者施用有效量的抗CD20/抗CD3抗体和抗CD19/抗CD28双特异性抗体和/或靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂。根据上述方面中的任一者的“个体”或“受试者”优选地是人。
在进一步的方面，提供了一种用于在癌症免疫疗法中使用的组合物，该组合物包含抗CD20/抗CD3抗体和抗CD19/抗CD28双特异性抗体和/或靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂。在某些方面，提供了一种用于在癌症免疫疗法的方法中使用的组合物，该组合物包含抗CD20/抗CD3抗体和抗CD19/抗CD28双特异性抗体和/或靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂。
在进一步的方面，本文提供了包含抗CD20/抗CD3抗体和抗CD19/抗CD28双特异性抗体和/或靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施例中，药物用于B细胞增殖性疾患的治疗。在进一步的实施例中，药物用于在治疗B细胞增殖性疾患的方法中使用，该方法包括向患有B细胞增殖性疾患的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施例中，该方法进一步包含向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在进一步的实施例中，药物用于耗尽B细胞。B细胞增殖性疾患选自由以下项组成的组：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)，套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)。在一个特定的方面，B细胞癌症是非霍奇金淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在另一方面，本文提供了治疗B细胞癌症的方法。在一个实施例中，该方法包括向患有此种B细胞癌症的个体施用有效量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合。在一个此类实施例中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种如下文所述的另外的治疗剂。根据任何上述实施例的“个体”可以为人。在一个实施例中，B细胞癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一个实施例中，B细胞癌是非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴细胞性白血病。
上述组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本文报道的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的施用以及额外的治疗剂的施用在彼此相距约一个月内，或在彼此相距约一周、两周或三周内，或在彼此相距约一天、二天、三天、四天、五天或六天内进行。
如本文所报道的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合(以及任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果期望用于局部治疗的话，则可以通过病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
如本文所报道的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。所述抗体不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的制剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文描述的剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
在另一方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合用于在组合疗法中使用，其中在组合治疗之前，用II型抗CD20抗体、优选地奥滨尤妥珠单抗进行预先治疗，其中预先治疗与组合治疗之间的时间段足以减少对II型抗CD20抗体、优选为奥滨尤妥珠单抗有应答的个体中的B细胞。
T细胞的活化可导致严重的细胞因子释放综合征(CRS)。在TeGenero进行的第1阶段研究中(Suntharalingam等人，N Engl J Med(2006)355,1018-1028)，所有6名健康志愿者在输注不当剂量的T细胞刺激性超级激动剂抗CD28单克隆抗体后，都迅速经历了接近致命的严重细胞因子释放综合征(CRS)。通过用II型抗CD20抗体如奥滨尤妥珠单抗预治疗受试者，可以显著减少与向受试者施用T细胞活化治疗剂(例如抗CD20/抗CD3双特异性抗体)相关的细胞因子释放。使用预治疗(Gpt)应有助于快速耗尽外周血和次级淋巴器官中的B细胞，从而降低因T细胞活化治疗剂的强烈的全身性T细胞活化而导致的高度相关不良事件(AE)(例如CRS)的风险，同时支持了T细胞活化治疗剂的暴露水平，其从给药开始就足够高以介导肿瘤细胞消除。迄今为止，在正在进行的奥滨尤妥珠单抗临床试验中，已经在数百名患者中评估和管理了奥滨尤妥珠单抗的安全性概况(包括细胞因子释放)。最后，除了支持T细胞活化治疗剂例如抗CD20/抗CD3双特异性抗体的安全性外，Gpt还应有助于防止针对这些独特分子形成抗药抗体(ADA)。
其他药剂和治疗
本发明的抗原结合分子可以在治疗中与一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类额外治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，额外的治疗剂是另一抗癌剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用融合蛋白的量、病症或治疗的类型，以及上文讨论的其他因素。抗原结合分子通常以与如本文所描述相同的剂量和施用途径，或本文描述的剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。
上述此类联合疗法涵盖组合的施用(其中两种或更多种治疗剂被包括在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，本发明的抗原结合分子的施用可以在施用额外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。
制品(试剂盒)
在另一方面，提供了一种试剂盒，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的材料。该试剂盒包括至少一个容器和在该容器上或与该容器相关联的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉内注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。该容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断该病症的组合物组合，并且该容器可具有无菌入口(例如该容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒中的至少三种活性剂是抗CD20/抗CD3双特异性抗体、抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂。
在特定的方面，提供了一种用于治疗或延迟受试者的癌症进展的试剂盒，该试剂盒包括包装件，该包装件包含：(A)第一组合物，其包含作为活性成分的抗CD20/抗CD3双特异性抗体和药用载体；(B)第二组合物，其包含作为活性成分的抗CD19/抗CD28双特异性抗体和药用载体；(C)第三组合物，其包含作为活性成分的靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂和药用载体；以及针对在组合疗法中使用这些组合物的说明书。
标签或包装插页指示组合物如何用于治疗所选病症并提供在组合疗法中使用组合物的说明。此外，试剂盒可以包括：(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗CD20/抗CD3双特异性抗体；以及(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含抗CD19/抗CD28双特异性抗体；以及(c)其中装有组合物的第三容器，其中该组合物包含靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂。此外，试剂盒可以包括一个或多个其他容器，这些容器包含可以用于组合的其他活性成分。本发明的该实施例中的制品可进一步包括包装插页，该包装插页指示这些组合物可以用于治疗特定病况。
替代地或另外地，试剂盒可进一步包括第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户的角度所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
药物
在另一方面，提供了一种包含用于治疗B细胞增殖性疾患的抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物，其中抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂组合使用。
在一个方面，提供了一种包含用于治疗B细胞增殖性疾患的抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物，其中该双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂组合使用。在一个方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体和抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂以单一组合物施用或以两种或更多种不同的组合物分开地施用。在一个特定的方面，抗CD20/抗CD3双特异性抗体和抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂以三种不同的组合物分开地施用。
表B(序列)：
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。根据如上所定义的根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))的编号系统来对抗体链的氨基酸进行编号和引用。
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实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
实例1
CD19-41BBL抗原结合分子的制备、纯化和表征
如国际专利申请出版号WO 2016/075278 A1、特别是实例7.2.7中所描述制备含有靶向CD19的4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(构建4.5)。
为了制备，将包括与人CL结构域融合的二聚体4-1BB配体的多肽与杵上的人IgG1重链CH2和CH3结构域在框中一起进行亚克隆。将包括4-1BB配体的一个胞外域的多肽与人IgG1-CH1结构域融合。为了提高正确配对，在交叉的CH-CL(带电变体)、CL结构域E123R和Q124K，以及CH1结构域K147E和K213E(根据Kabat的EU编号)中额外地引入氨基酸突变。
将编码CD19抗体克隆8B8-2B11的重链和轻链DNA序列的可变区与臼的恒定重链或人IgG1的恒定轻链在框中一起进行亚克隆。根据WO 2012/130831中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W突变的二聚配体-Fc杵链、单体CH1融合、所靶向的含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CD19-Fc臼链和抗CD19轻链的组合允许生成异源二聚体，该异源二聚体包括组装的三聚4-1BB配体和CD19结合Fab。该分子在本文中被称为CD19-4-1BBL。
CD19-4-1BBL包含SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在图1A中示出了含有靶向CD19的4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的示意图。
分别在WO 2016/075278、实例7.4和实例8至11中详细地描述了含有靶向和未靶向CD19的4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的产生和表征。
实例2
T细胞双特异性(TCB)抗体的制备、纯化和表征
根据WO 2016/020309 A1中描述的方法已经制备了TCB分子。
在实验中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(CD20 CD3 TCB或CD20 TCB或格菲妥单抗)对应于如WO 2016/020309 A1的实例1中所描述的分子B。分子B是“2+1IgG CrossFab”抗体并且包括两条不同的重链和两条不同的轻链。引入CH3结构域中的点突变(“杵臼结构”)以促进两条不同重链的组装。根据WO 2012/130831中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。进行CD3结合Fab中的VH和VL结构域的交换，以及CD20结合Fab中的CH和CL结构域中的点突变，以促进两条不同轻链的正确组装。2+1意指分子具有对于CD20具有特异性的两个抗原结合结构域和对于CD3具有特异性的一个抗原结合结构域。
CD20 TCB包含SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的氨基酸序列。图1B中显示了2+1形式的双特异性抗体的示意图。
该分子在WO 2016/020309 A1的实施例1中进一步表征。
实例3
CD19-CD28双特异性抗体的制备、纯化和表征
如国际专利申请出版号WO 2020/127618 A1中所描述制备CD19-CD28双特异性抗体。
更特别地，在实例18中描述了生成和产生。对于相应表达质粒的生成，将CD19抗体克隆8B8-2B11和CD28抗体克隆SA_v8的可变结构域序列与预插入在相应受体哺乳动物表达载体中的相应恒定区在框中一起进行亚克隆。在图1C中示出了所得分子的示意性描述。它是“1+1IgG1CrossFab”抗体，并且由两条不同的重链和两条不同的轻链构成。引入CH3结构域中的点突变(“杵臼结构”)以促进两条不同重链的组装。根据WO 2012/130831中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。进行CD19结合Fab中的VH和VL结构域的交换，以及CD28结合Fab中的CH和CL结构域中的点突变，以促进两条不同轻链的正确组装。
CD20 TCB包含SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
实例4
CD19-CD28、CD19-4-1BBL和CD20 TCB的离体组合疗法
本发明人的假设是CD19-CD28以及CD19-4-1BBL可以与CD20-TCB协同以进行T细胞活化。为了测试这一点，本发明人从IVB期B细胞淋巴瘤患者中消化恶性脾脏切除物，并且将细胞与单独的CD20-TCB(25pM)或两种共刺激物CD19-CD28或CD19-4-1BBL(1nM)中的一者或TCB和共刺激物的组合一起孵育。在3天之后，使用CBA试剂盒来确定上清液中的细胞因子释放(流式细胞小球微阵列术，BD Biosciences)。图2A至图2D示出，CD20-TCB诱导细胞因子释放(GzB、IFNg、IL-2和IL-8)，并且CD19-CD28以及CD19-4-1BBL可以进一步推动CD20-TCB诱导的细胞因子释放(尤其是IFNg和IL-2，分别参见图2B和图2D)。与CD20-TCB和CD19-CD28或CD19-4-1BBL的双重组合相比，CD20-TCB和两种共刺激物(使用0.5nM或1nM的每种共刺激物)的三重组合示出了进一步增加的细胞因子释放(尤其是IFNg和IL-2)。
实例5
评估CD20-TCB与CD19-4-1BBL和CD19-CD28在人源化NSG小鼠中的三重组合效应的功效研究
本文描述的功效研究旨在评估CD20-TCB与CD19-CD28和CD19-41BBL在完全人源化NSG小鼠的CD19/CD20阳性人淋巴瘤模型中的潜在三重组合效应。
人OCI-Ly18(弥漫性大B细胞淋巴瘤；DLBCL)最初获自ATCC，并且在扩增之后保藏在Roche Glycart内部细胞库中。在含10％ FCS和1x Glutamax的RPMI中培养细胞。在5％CO2下，在水饱和的气氛中于37℃下培养细胞。将混合有50微升Matrigel的50微升细胞悬浮液(5x106NALM6细胞)用22G至30G针头皮下注射到麻醉小鼠的侧面。
根据规定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将实验开始时的4-5周龄的雌性NSG小鼠(在杰克逊实验室繁殖)维持在不含特定病原体的条件下，其中日循环为12h光照/12h黑暗。实验研究方案经过地方政府的审查和批准(ZH183/2020)。到达之后，将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康状态监测。对小鼠腹膜内注射15mg/kg的白消安，随后在一天后静脉注射1x105个从脐带血中分离的人造血干细胞。在干细胞注射后第14-16周，对小鼠进行舌下放血并且通过流式细胞术针对成功的人源化对血液进行分析。将有效移植的小鼠根据它们的人T细胞频率随机化为不同的处理组。当时，小鼠如所描述被皮下地注射肿瘤细胞(图3)，并且当肿瘤大小达到大约250mm3时(在第12天)，用化合物或组氨酸缓冲液(载体；A组)治疗。向所有小鼠i.v.注射200μl适当的溶液。为了获得每200μl适量的化合物，在需要时用组氨酸缓冲液稀释贮备溶液(表1)。对于组合治疗(C组至G组)，将抗体混合并伴随地注射。所有组合治疗在接受GAZYVA和三个周期的CD20-TCB之后的肿瘤细胞注射后第38天开始。如图3中所显示的，C组接受CD19-CD28组合治疗，并且D组接受CD19-4-1BBL组合治疗。G组从第38天开始接受伴随地注射的三重组合。E组和F组接受交替的治疗方案，其中治疗从CD19-CD28(F组)或CD19-4-1BBL(E组)开始，持续四个周期，随后在所有治疗周期的剩余时间注射另一种共刺激分子。
表1：该实验中使用的组合物
表2：组及其治疗方案
使用卡尺每周测量肿瘤生长三次，并按下式计算肿瘤体积：
Tv：(W2/2)×L(W：宽度，L：长度)
在总共15个循环的治疗之后，该研究在第120天终止。
图4A至图4G将肿瘤生长示出为每组和每只小鼠的个体肿瘤生长动力学。如此处所描述的，在所有接受治疗的动物中，CD20-TCB单一疗法(图4B)最初诱导了强肿瘤生长抑制，随后肿瘤复发。用CD19-CD28的组合治疗(图4C)在几只小鼠中诱导了肿瘤长出的轻度延迟。CD19-41BBL组合(图4D)显示了肿瘤复发的延迟更加均匀。然而，大多数动物在研究终止之前达到终止标准(肿瘤体积大于2000mm3)。与仅CD19-4-1BBL的组合臂相比，从第38天开始接受伴随地注射的三重组合的治疗组(图4G)在增加的治疗活性持续时间方面没有示出任何进一步的改善。有趣地，在所有接受治疗的动物中，接受前四个周期从CD19-CD28开始随后是CD19-4-1BBL组合治疗直到研究终止的交替治疗方案的组(图4F)实现了肿瘤在120天内得到完全的控制。相比之下，从CD19-4-1BBL开始随后是CD19-CD28的交替方案并未示出这种肿瘤控制(图4E)。
使用1500m3的肿瘤体积截断值的至事件发生时间分析(图5)示出，当在前4个治疗周期中给予CD19-CD28并在接下来的治疗周期中给予CD19-4-1BBL时，格菲妥单抗与CD19-CD28和CD19-4-1BBL的组合具有强协同效应。
实例6
评估CD20-TCB与CD19-4-1BBL和CD19-CD28在人源化BRGS-CD47小鼠中的三重组合效应的功效研究
第二项功效研究在人源化BRGS-CD47小鼠中进行，并且旨在评估当组合治疗早一周开始时，CD20-TCB与CD19-CD28和CD19-41BBL在CD19/CD20阳性人淋巴瘤模型中的潜在三重组合效应。
人OCI-Ly18(弥漫性大B细胞淋巴瘤；DLBCL)最初获自ATCC，并且在扩增之后保藏在Roche Glycart内部细胞库中。在含10％ FCS和1x Glutamax的RPMI中培养细胞。在5％CO2下，在水饱和的气氛中于37℃下培养细胞。将混合有50微升Matrigel的50微升细胞悬浮液(5x106NALM6细胞)用22G至30G针头皮下注射到麻醉小鼠的侧面。
在杰克逊实验室，通过在4-5周龄时注射人造血干细胞来生成雌性人源化BRGS-CD47小鼠。在确认植入后，人源化小鼠在15-16周龄时被运送到罗氏(Roche)。在到达后，将小鼠维持一周以适应新环境并进行观察。定期地进行持续健康监测，并且根据规定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将小鼠维持在无特定病原体的条件下，日循环为12h光照/12h黑暗。实验研究方案经过地方政府的审查和批准(ZH181/2020)。小鼠如所描述被皮下地注射肿瘤细胞(图6)，并且当肿瘤大小达到大约250mm3时(在第10天)，用化合物或组氨酸缓冲液(载体；A组)治疗。向所有小鼠i.v.注射200μl适当的溶液。为了获得每200μl适量的化合物，在需要时用组氨酸缓冲液稀释贮备溶液(表1)。对于组合治疗(C组至G组)，将抗体混合并伴随地注射。所有组合治疗在接受GAZYVA和两个周期的CD20-TCB之后的肿瘤细胞注射后第27天开始。如图6中所显示的，C组接受CD19-CD28组合治疗，并且D组接受CD19-4-1BBL组合治疗。G组从第27天开始接受伴随地注射的三重组合。E组和F组接受交替的治疗方案，其中治疗从CD19-CD28(F组)或CD19-4-1BBL(E组)开始，持续四个周期，随后在所有治疗周期的剩余时间注射另一种共刺激分子。
表3：该实验中使用的组合物
表4：组及其治疗方案
使用卡尺每周测量肿瘤生长三次，并按下式计算肿瘤体积：
Tv：(W2/2)×L(W：宽度，L：长度)
在总共13个循环的治疗之后，该研究在第94天终止。
图7A至图7G将肿瘤生长示出为每组和每只小鼠的个体肿瘤生长动力学。如此处所描述的，在所有接受治疗的动物中，CD20-TCB单一疗法(图7B)最初诱导了强肿瘤生长抑制，随后肿瘤复发。用CD19-CD28的组合治疗(图7C)在几只小鼠中诱导了肿瘤长出的延迟，并且在少数小鼠中诱导了肿瘤控制。CD19-41BBL组合(图7D)显示了类似的肿瘤复发延迟。与仅CD19-4-1BBL和CD19-CD28的组合臂相比，从第27天开始接受伴随地注射的三重组合的治疗组(图7G)在增加的治疗活性持续时间方面示出了卓越的肿瘤控制。由于组合治疗的更早开始，在该实验中，该伴随组中的肿瘤控制可能会更强。接受前四个周期从CD19-CD28开始随后是CD19-4-1BBL组合治疗直到研究终止的交替治疗方案的组(图7F)实现了肿瘤控制在94天内与伴随施用相似。相比之下，从CD19-4-1BBL开始随后是CD19-CD28的交替方案并未示出这种明显的肿瘤控制(图7E)。
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Claims (35)

1.一种抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合，其供使用在用于治疗B细胞增殖性疾患的组合疗法中。
2.抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向抗CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合在制造药物中的用途，所述药物供使用在用于治疗B细胞增殖性疾患的组合疗法中。
3.一种治疗有此需要的个体的B细胞癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用包括抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向抗CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的组合疗法。
4.一种供使用在组合疗法中的试剂盒，所述试剂盒包括：包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一药物、包含抗CD19/抗CD28双特异性抗体的第二药物和包含靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的第三药物，并且任选地进一步包括包装插页，所述包装插页包括针对施用所述第一药物与所述第二药物的组合以用于治疗个体的癌症的说明。
5.一种药物，所述药物包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体，其用于治疗B细胞增殖性疾患，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂组合使用。
6.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述组合疗法包括用所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体的组合的第一治疗方案和用所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体与靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合的第二治疗方案。
7.根据权利要求5所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述第一治疗方案包括1至5个治疗周期，并且所述第二治疗方案从下一个治疗周期开始。
8.根据权利要求7或8所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述第一治疗方案包括4个治疗周期，并且所述第二治疗方案从第5个治疗周期开始。
9.根据权利要求6所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中在所述第一治疗方案的结束与所述第二治疗方案的开始之间存在一周的时间间隔。
10.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中在用抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的所述组合疗法之前，用II型抗CD20抗体、优选为奥滨尤妥珠单抗进行预先治疗，并且其中所述预先治疗与所述组合疗法之间的时间段足以减少对所述II型抗CD20抗体、优选为奥滨尤妥珠单抗有应答的所述个体中的B细胞。
11.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述靶向CD19的4-1BB激动剂包含4-1BBL的三个胞外域，每个胞外域包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述靶向CD19的4-1BB激动剂包含Fc结构域，特别是IgG1或IgG4 Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低或消除与Fc受体的结合和/或效应子功能。
13.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述靶向CD19的4-1BB激动剂包含能够与CD19特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)，所述重链可变区包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述轻链可变区包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述靶向CD19的4-1BB激动剂包含能够与CD19特异性结合的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述靶向CD19的4-1BB激动剂包含
(a)第一多肽，其包含：(a1)4-1BBL的第一胞外域或其片段，其在C末端处与4-1BBL的第二胞外域或其片段的N末端融合，(a2)4-1BBL的所述第二胞外域或其片段，其在C末端处与CL结构域的N末端融合，(a3)CL结构域，其在C末端处与所述Fc结构域的亚基中的一者(例如第一亚基)的N末端融合，和(a4)所述Fc结构域的所述亚基中的一者(例如所述第一亚基)；
(b)第二多肽，其包含：(b1)4-1BBL的第三胞外域或其片段，其在C末端处与CH1结构域的N末端融合，和(b2)所述CH1结构域；
(c)第三多肽，其包含：(c1)与CD19结合的Fab分子的重链，其在C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的另一者(例如第二亚基)的N末端融合，和(c2)所述Fc结构域的所述亚基中的另一者(例如所述第二亚基)；以及
(d)第四多肽，其包含与CD19结合的Fab分子的轻链。
16.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述靶向CD19的4-1BB激动剂包含：第一多肽，其包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述靶向CD19的4-1BB激动剂为恩璐玛芙普α。
18.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3)；以及第二抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD20)和轻链可变区(VLCD20)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD3)，其包含SEQ ID NO:22的CDR-H1序列、SEQ ID NO:23的CDR-H2序列和SEQ ID NO:24的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD3)，其包含SEQ ID NO:25的CDR-L1序列、SEQ ID NO:26的CDR-L2序列和SEQ ID NO:27的CDR-L3序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD3)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD3)，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
21.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD20)，其包含SEQ ID NO:30的CDR-H1序列、SEQ ID NO:31的CDR-H2序列和SEQ ID NO:32的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD20)，其包含SEQID NO:33的CDR-L1序列、SEQ ID NO:34的CDR-L2序列和SEQID NO:35的CDR-L3序列。
22.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD20)，其包含SEQ ID
NO:36的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD20)，其包含SEQ ID
NO:37的氨基酸序列。
23.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含与CD20结合的第三抗原结合结构域。
24.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：第一多肽，其包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四多肽和第五多肽，两者均包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
25.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体为格菲妥单抗。
26.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含：第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD28)和轻链可变区(VLCD28)；以及第二抗原结合结构域，其包含重链可变区(VHCD19)和轻链可变区(VLCD19)。
27.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD28)，其包含SEQ ID NO:42的CDR-H1序列、SEQ ID NO:43的CDR-H2序列和SEQ ID NO:44的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD28)，其包含SEQ ID NO:45的CDR-L1序列、SEQ ID NO:46的CDR-L2序列和SEQ ID NO:47的CDR-L3序列。
28.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD28)，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD28)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
29.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD19)，其包含SEQ ID NO:10的CDR-H1序列、SEQ ID NO:11的CDR-H2序列和SEQ ID NO:12的CDR-H3序列；和/或轻链可变区(VLCD19)，其包含SEQ ID NO:13的CDR-L1序列、SEQ ID NO:14的CDR-L2序列和SEQ ID NO:15的CDR-L3序列。
30.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHCD19)，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和/或轻链可变区(VLCD19)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
31.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含Fc结构域，特别是IgG1或IgG4Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低或消除与Fc受体的结合和/或效应子功能。
32.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述抗CD19/抗CD28双特异性抗体包含：第一多肽，其包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第二多肽，其包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；第三多肽，其包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及第四多肽，其包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
33.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述组合疗法以约一周至约三周的间隔施用。
34.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述B细胞增殖性疾患选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组。
35.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗CD19/抗CD28双特异性抗体和靶向CD19的4-1BB(CD137)激动剂的组合、用途、方法、试剂盒或药物，其中所述B细胞增殖性疾患为非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
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