KR20230037578A

KR20230037578A - 암 세포에 결합하고 방사성 핵종을 상기 세포로 표적화하는 항체

Info

Publication number: KR20230037578A
Application number: KR1020237003528A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더 하아스; 자비네 임호프-융; 크리스티안 클라인; 소피아 프로스트
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2023-03-16
Also published as: CN115867583A; IL298921A; PE20230434A1; BR112023000204A2; TW202216789A; CO2023001413A2; CA3187277A1; US20230272116A1; PH12023550019A1; AU2021303508A1; WO2022008688A1; EP4178985A1; MX2023000339A; JP2023533533A; CR20230076A

Abstract

본원 발명은 표적 세포 상에서 항원에 결합하고 방사성 핵종을 상기 세포로 표적화하는 항체 세트, 그리고 이들을 이용하는 방법에 관계한다. 이들 항체는 각각, VH의 C 말단에서 Fc의 N 말단에 융합된 표적 항원에 Fab 결합, 그리고 방사성-표지된 화합물에 VH 또는 VL 결합을 포함한다. 상기 VH 또는 VL은 C 말단에서 Fc의 N 말단에 융합된다. VH와 VL은 상기 항체가 scFv를 통해 표적 항원에 결합할 때, 항원 결합 부위를 형성한다.

Description

암 세포에 결합하고 방사성 핵종을 상기 세포로 표적화하는 항체

본원 발명은 표적 세포 상에서 항원에 결합하고 방사성 핵종을 상기 세포로 표적화하는 항체, 그리고 이들을 이용하는 방법에 관계한다.

본원 발명은 또한, 멀티도메인 단백질의 2개의 도메인을 연결하기 위한 링커에 관계한다.

다양한 임상적 세팅에서 개별 세포 또는 특정한 세포 유형의 선별적 파괴가 종종 바람직하다. 예를 들면, 암 요법의 주요한 목적은 건강한 세포와 조직을 무손상 및 손상되지 않은 상태로 남겨두면서, 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것이다.

이점에 관하여, 한쪽 "팔"이 표적 세포 상에서 표면 항원에 결합하고, 두 번째 "팔"이 효과기 모이어티 예컨대 약물에 결합하는 이중특이적 항체가 설계되었다. 매우 다양한 이중특이적 형식이 개발되긴 했지만, 이중특이적 항체를 개발하는 과제는 결코 사소하지 않다.

사전-표적화 방사면역요법 (PRIT)에서, 한편으로 종양 관련 항원 및 다른 한편으로 방사성-표지된 화합물에 대한 친화성을 갖는 항체 작제물이 이용된다. 첫 번째 단계에서, 항체가 투여되고 종양에 국지화된다. 차후에, 방사성-표지된 화합물이 투여된다. 방사성-표지된 화합물은 작기 때문에, 종양으로 빠르게 전달될 수 있고, 비 결합된 화합물은 빠르게 제거되는데, 이것은 종양 외부에서 방사선 노출을 감소시킨다 (Goldenberg et al Theranostics 2012, 2(5), 523-540). 유사한 절차가 영상에 또한 이용될 수 있다. 사전-표적화는 아비딘-비오틴을 이용한 이중특이적 항체 또는 시스템을 이용할 수 있으나, 후자는 아비딘/스트렙타비딘이 면역원성이라는 단점이 있다.

사전-표적화 방사면역요법 또는 영상의 방법은 제거제 또는 차단제를 통상적으로 이용하는 데, 이것은 항체를 투여하는 단계 및 방사성-표지된 화합물을 투여하는 단계 사이에 투여된다. 목적은 항체를 혈액으로부터 제거하고 및/또는 방사성-표지된 화합물에 대한 순환 항체의 결합 부위를 차단하는 것이다 (참조: 예를 들면 Karacay et al, Bioconj. Chem., 13(5), 1054-1070 (2002)). 제거제 또는 차단제의 이용은 불리한 독성을 제한하면서, 효율적인 치료를 위해 충분한 수준의 방사선이 투여될 수 있도록 하지만, 타이밍 및 용량이 주의 깊게 선택되어야 하고, 제거제가 부정적인 효과 예컨대 면역 반응의 위험을 유발할 가능성이 있다. 따라서, 제거 단계의 이용은 사전-표적화 방법에서 복잡한 양상이다.

본원 발명은 사전-표적화 방법에서 유용한 항체 세트, 그리고 이들을 이용하는 방법을 제공한다.

한 가지 양상에서, 본원 발명은 항체 세트로서,

i) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 V_H 도메인을 더욱 포함하지만, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 V_L 도메인을 포함하지 않는 첫 번째 항체; 및

ii) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 V_L 도메인을 더욱 포함하지만, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 V_H 도메인을 포함하지 않는 두 번째 항체를 포함하는 항체 세트를 제공하고,

여기서 첫 번째 항체의 상기 V_H 도메인 및 두 번째 항체의 상기 V_L 도메인은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위를 함께 형성할 수 있다.

특정한 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, Fc 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, a) Fc 도메인, b) 표적 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티 및 c) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 어느 하나 (하지만 둘 모두는 아님)를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 (b)의 항원 결합 모이어티의 C 말단은 Fc 도메인의 한쪽 아단위의 N 말단에 융합되고, (c)의 폴리펩티드의 C 말단은 Fc 도메인의 다른 아단위의 N 말단에 융합된다.

따라서, 첫 번째 항체는 다음을 포함하거나 또는 이들로 구성될 수 있고:

a) 제1와 두 번째 아단위를 포함하는 Fc 도메인;

b) 표적 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 항원 결합 모이어티; 및

c) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드;

여기서 (b)의 항원 결합 모이어티는 (a)의 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 N 말단에 융합되고, (c)의 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해 (a)의 Fc 도메인의 두 번째 아단위의 N 말단에 융합되고,

그리고 여기서 첫 번째 항체는 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하지 않는다.

두 번째 항체는 다음을 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수 있고:

a) 제1와 두 번째 아단위를 포함하는 Fc 도메인;

c) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드;

그리고 여기서 두 번째 항체는 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않는다.

첫 번째 및 두 번째 항체 중 어느 것도 그 자체로는, 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위를 포함하지 않는다. 첫 번째 항체는 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위로부터 유래된 V_H 도메인만을 갖고 V_L 도메인을 갖지 않는다. 두 번째 항체는 V_L 도메인만을 갖고 V_H 도메인을 갖지 않는다.

방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위는 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 V_H와 V_L 도메인이 연결될 때 형성된다. 이것은 예를 들면, 첫 번째 항체와 두 번째 항체가 동일한 개별 표적 세포에 또는 인접한 세포에 결합될 때 발생할 수 있다.

본원에서 설명된 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 본원에서 "단일 도메인 분할 항체", "SPLIT", "분할 항체", 헤미바디" 또는 "데미바디"로서 지칭될 수 있다. 방사성-표지된 화합물에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 함께 형성하는 V_H와 V_L 도메인은 2개의 항체 사이에 분할되고, 동일한 항체의 일부로서 존재하지 않는다.

분할 도메인 형식은 방사성-표지된 화합물이 그 자체로 첫 번째 항체 또는 그 자체로 두 번째 항체 중 어느 하나에도 결합할 수 없다는 것을 의미한다. 혈액 내에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 사이에는 안정된 연결이 거의 또는 전혀 없고, 따라서 방사성-표지된 화합물의 안정된 결합이 거의 또는 전혀 없다.

표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 본원에서 "표적 항원", "표적 세포 항원" 또는 "TA"로서 지칭될 수 있다. 본원 발명에 따라서, 전술된 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 상이한 표적 항원에 대한, 또는 동일한 표적 항원에 대한 결합 부위를 가질 수 있다. (의심할 여지를 없애기 위해, 항체가 동일한 표적 항원에 결합한다고 진술되는 경우에, 이것은 이들이 동일한 표적 항원에 결합할 수 있는 결합 부위를 갖고, 이들 항체가 서로 동일한 2개의 개별 항원 분자에 결합할 수 있을 가능성을 포함한다는 것을 의미한다). 예를 들면, 한 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 CEA에 결합한다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동일한 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다 (이것에 대한 결합 부위를 갖는다). 다른 구체예에서, 첫 번째 항체는 두 번째 항체와 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다 (이것에 대한 결합 부위를 갖는다).

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 표적 항원에 대한 동일한 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 다시 말하면, 이들은 V_L 및 V_H 서열을 포함하는, 표적 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 이러한 항원 결합 부위를 형성하는 V_L 및 V_H 서열은 첫 번째 항체에서 및 두 번째 항체에서 동일하다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, 표적 항원에 대해 일가이다. 다른 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, 표적 항원에 대해 이가이다. 일부 구체예에서 이들은 각각 이가이고 에피토프에 대해 단일특이적이다. 다른 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, 표적 항원에 대해 이중파라토픽이다, 다시 말하면, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, 표적 항원의 두 가지 상이한 에피토프에 대한 결합 부위를 갖는다.

Fc 영역의 존재는 방사면역요법 및 방사선영상의 맥락에서 유익성을 갖는다, 예를 들면 단백질의 순환 반감기를 연장하고 및/또는 더 작은 단편으로 관찰될 수 있는 것보다 더 높은 종양 흡수를 야기한다. 본원에서 설명된 "분할 도메인" 형식은 이러한 문맥에서 특히 유리할 수 있는데, 그 이유는 만약 그렇지 않으면, 순환 항체의 연장된 존재로 인해 발생할, 방사성-표지된 화합물과의 연결의 더 큰 가능성이 이것에 의해 경감되기 때문이다.

일부 구체예에서, Fc 도메인은 효과기 기능을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 변형된다.

다른 양상에서, 본원 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 항체 세트를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 다른 양상에서, 본원 발명은 본원에서 설명된 항체 중에서 하나 (다시 말하면, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 각각)를 각각 포함하는, 2개의 별개의 약학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

추가의 양상에서, 본원 발명은 본원에서 설명된 임의의 항체 또는 항체 세트를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트에 관계한다. 다른 양상에서, 본원 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 벡터 또는 벡터 세트, 임의적으로 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트에 관계한다. 추가의 목적에서 본원 발명은 본원 발명의 벡터 또는 벡터 세트를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 또는 숙주 세포 세트에 관계한다. 이에 더하여, 항체가 생산되도록 숙주 세포(들)를 배양하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법이 제공된다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 항체는 사전-표적화 방사면역요법 (PRIT)의 방법에서 또는 사전-표적화 방사선영상의 방법에서 용도를 발견한다.

한 가지 양상에서, 본원 발명은 다음 단계를 포함하는, 사전-표적화 방사면역요법의 방법을 제공한다:

i) 전술된 바와 같은 첫 번째 항체 및 두 번째 항체를 개체에게 투여하는 단계; 및

ii) 방사성-표지된 화합물을 상기 개체에게 차후에 투여하는 단계.

다른 양상에서, 본원 발명은 첫 번째 항체 및 두 번째 항체를 개체에게 투여하는 단계, 그리고 방사성-표지된 화합물을 상기 개체에게 차후에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 이용하기 위한, 전술된 첫 번째 항체와 두 번째 항체를 제공한다. 다른 양상에서, 본원 발명은 첫 번째 항체 및 두 번째 항체를 개체에게 투여하는 단계, 그리고 방사성-표지된 화합물을 상기 개체에게 차후에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 이용하기 위한, 전술된 바와 같은 첫 번째 항체를 제공한다. 다른 양상에서 본원 발명은 첫 번째 항체 및 두 번째 항체를 개체에게 투여하는 단계, 그리고 방사성-표지된 화합물을 상기 개체에게 차후에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 이용하기 위한, 전술된 바와 같은 두 번째 항체를 제공한다.

다른 양상에서, 본원 발명은 다음 단계를 포함하는, 방사선영상의 방법을 제공한다:

i) 본원에서 설명된 바와 같은 첫 번째 항체와 두 번째 항체를 개체에게 투여하되, 이들 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되는 단계;

ii) 방사성-표지된 화합물을 차후에 투여하는 단계; 및 임의적으로

iii) 방사성 핵종이 국지화된 조직 또는 장기를 영상화하는 단계.

다른 양상에서, 본원 발명은 인간 또는 동물 신체에서 실행되는 진단의 방법에 이용하기 위한, 본원에서 설명된 바와 같은 첫 번째 항체와 두 번째 항체를 제공하는데, 여기서 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

영상화 단계 이후에, 진단을 내리는 단계 및 임의적으로, 진단을 개체에게 전달하는 단계가 뒤따를 수 있다. 일부 구체예에서 상기 방법은 적합한 치료법을 결정하는 단계 및 임의적으로, 치료법을 개체에게 집행하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

상기 방법/용도 각각에서, 동일하거나 또는 인접한 표적 세포에 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 결합은 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 V_H와 V_L 도메인의 연결, 그리고 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위의 형성을 야기한다. 따라서, 방사성-표지된 화합물의 투여 후, 방사성-표지된 화합물은 V_H와 V_L의 연결에 의해 형성된 기능적 항원 결합 부위에 결합한다.

본원에서 설명된 임의의 방법과 용도에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다.

당해 분야에서 빈번하게, PRIT 또는 방사선영상의 방법은 제거 단계를 수반한다. 제거 단계는 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에 작용제를 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 작용제는 혈액으로부터 항체의 제거의 속도를 증가시키고 및/또는 항체에 대한 방사성-표지된 화합물의 결합을 차단한다.

본원에서 설명된 방법과 용도의 한 구체예에서, 상기 방법은 제거 단계를 포함하지 않는다. 다시 말하면, 이것은 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에 (다시 말하면, 이들 항체의 투여 후, 그러나 방사성-표지된 화합물의 투여 전), 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 임의적으로 방사성감작화제, 면역치료제 및/또는 화학요법제 이외에, 어떤 작용제도 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에 투여되지 않는다. 다른 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에 어떤 작용제도 투여되지 않는다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항체는 병용 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들면, 이들은 한 가지 이상의 방사성감작화제, 면역치료제 및/또는 화학요법제와 병용 투여될 수 있다: 방사성감작화제, 면역치료제 또는 화학요법제 및 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다.

본원에서 설명된 방사선영상 및 방사면역요법의 방법은 본원에서 더욱 논의된 바와 같이 임의적으로 병용될 수 있다.

추가의 양상에서, 본원 발명은 다음을 포함하는 키트를 제공한다:

i) 본원에서 설명된 바와 같은 첫 번째 항체와 두 번째 항체;

ii) 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결에 의해 형성된 항원 결합 부위에 결합하는 방사성-표지된 화합물.

임의적으로 키트는 본원에서 설명된 바와 같은 제거제 또는 차단제를 배제할 수 있다 (다시 말하면, 포함하지 않는다).

임의적으로 키트는 방사성감작화제, 면역치료제 또는 화학요법제를 더욱 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동일한 약학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 별개의 약학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 방사성-표지된 화합물은 항체와는 별개의 약학적 조성물 내에 존재한다.

다른 양상에서, 본원 발명은 신규한 펩티드 링커에 관계한다. 본 발명자들은 y개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 링커 내에, y 위치에서 Ser (다시 말하면, 링커의 마지막/C 말단 아미노산으로서 Ser)이 y+2 아미노산 (다시 말하면, 링커 내에 마지막 아미노산으로부터 C 말단 방향으로 2개 잔기 상에 배치된 아미노산)의 성격에 따라서, 이러한 y+2 아미노산의 글리코실화를 유도할 수 있다고 결정하였다. 이런 이유로 링커의 마지막 세린 잔기는 y-2 또는 y-3 위치에 배치되는 (다시 말하면, 링커의 마지막 세린 잔기가 링커 내에 마지막 아미노산으로부터 N 말단 방향으로 2개 또는 3개의 아미노산 위치에 있는) 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 Gly 및 Ser으로 이루어진 군에서 선택되는 y개의 연속 아미노산 잔기로 구성될 수 있는데, 예를 들면 여기서 y= 5 이상, 예를 들면, y=5 내지 100, 5 내지 70, 5 내지 60 또는 5 내지 50; 또는 y=10 내지 100; 10 내지 70, 10 내지 60 또는 10 내지 50; 예를 들면, 15 내지 31 또는 15 내지 30; 예를 들면, y=15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이고; 여기서 마지막 세린은 y-2 또는 y-3 위치에 있다. (따라서, y-2 위치에 세린, 그리고 y-1 및 y 위치에 글리신이 있을 수 있거나; 또는 y-3 위치에 세린, 그리고 y-2, y-1 및 y 위치에 글리신이 있을 수 있다). 일부 구체예에서 y=20 또는 21이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 (GxS)n(GGSGG) 또는 (GxS)n(GGSGGG)이고, G = 글리신, S = 세린, x = 4 및 n= 1 내지 20 또는 2 내지 20 또는 1 내지 10 또는 2 내지 10, 예를 들면, n= 2, 3, 4 또는 5, 6, 7, 8 또는 9, 예를 들면, n=2 내지 5 또는 2 내지 4인 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG (서열 번호: 150) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG (서열 번호: 151)일 수 있다.

본원 발명의 다른 양상에서, 본원 발명은 멀티도메인 단백질의 2개의 도메인을 연결하기 위한 상기 펩티드 링커의 용도에 관계한다. 다른 양상에서, 본원 발명은 적어도 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인을 포함하는 멀티도메인 단백질에 관계하는데, 여기서 상기 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인은 상기 링커에 의해 연결된다. 다른 양상에서 본원 발명은 멀티도메인 단백질에서 2개의 도메인을 연결하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 링커를 거쳐 상기 도메인을 연결하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 첫 번째 도메인, 링커 및 두 번째 도메인을 인코딩하는 핵산으로부터 멀티도메인 단백질을 발현하되, 상기 링커는 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인을 연결하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 도메인은 i) 항체의 Fc 도메인; ii) 항원 결합 모이어티; 및 iii) VL 또는 VH 도메인 (예를 들면, 분할 항체 또는 헤미바디에서 발견될 수 있는 바와 같이)에서 독립적으로 선택될 수 있다.

일부 구체예에서, 항원 결합 모이어티는 항체 단편 예컨대 Fv, Fab, 교차-Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv 또는 scFab); 또는 단일 도메인 항체 (dAbs) 예컨대 VHH일 수 있거나; 또는 비항체 결합 골격 예컨대 DARPin (설계된 안키린 반복 단백질); 어피바디; Sso7d; 모노바디 또는 안티칼린일 수 있다.

일부 구체예에서, 멀티도메인 단백질은 다중특이적 항체 예를 들면, 이중특이적 항체일 수 있다. 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인은 각각, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편일 수 있다. 다른 구체예에서, 링커가 다중특이적 항체에서 항체 단편을 Fc 도메인에 연결하는 데 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 멀티도메인 단백질은 항원 결합 모이어티인 첫 번째 도메인 (예컨대 항원에 결합할 수 있는 항체 단편), 그리고 VH 또는 VL 도메인 중 어느 하나인 두 번째 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커가 항원 결합 모이어티 (예를 들면, 항체 단편)를 VH 또는 VL 도메인에 연결하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서 항체 단편 (또는 상기 항체 단편이 하나 초과의 사슬을 포함하는 경우에는, 예를 들면, Fab의 경우에는 이의 한쪽 사슬)의 C 말단이 VH 또는 VL 도메인의 N 말단에 연결된다. 일부 구체예에서, 멀티도메인 단백질은 제1와 두 번째 아단위를 포함하는 Fc 도메인을 더욱 포함할 수 있고, 링커가 Fc 도메인의 첫 번째 또는 두 번째 아단위를 VH 또는 VL 도메인에 연결하는 데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, Fc 도메인의 첫 번째 또는 두 번째 아단위의 C 말단이 VH 또는 VL 도메인의 N 말단에 연결된다. 다른 구체예에서, VH 또는 VL 도메인의 C 말단이 Fc 도메인의 첫 번째 또는 두 번째 아단위의 N 말단에 연결된다.

일부 구체예에서, 멀티도메인 단백질은 본원에서 설명된 바와 같은 임의의 항체일 수 있다.

도 1은 비교 실시예에 속하는 표적 항원 (TA)-DOTAM 이중특이적 항체 (TA-DOTAM BsAb), 그리고 예시적인 TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 계통도 구조를 보여준다.
도 2는 종양 세포 상에서 분할-VH/VL DOTAM 결합체의 조립을 보여주는 계통도이다. TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체는 표적화된 세포 상에서 종양 항원 (TA)에 결합되지 않으면 ²¹²Pb-DOTAM에 유의미하게 결합하지 않을 것이고, 여기서 DOTAM 결합체의 2개의 도메인이 조립된다.
도 3은 제거제의 이용을 수반하는 3 단계 TA-PRIT 개념의 실례의 도식적 개요를 보여준다.
도 4는 제거제가 이용되지 않는 2 단계 TA-PRIT 개념의 실례의 도식적 개요를 보여준다.
도 5는 CEA 결합 적격성을 증명하는, MKN45 세포에 분할 항체의 결합을 보여준다. 항체의 검출은 인간 IgG 특이적 이차 항체를 이용하여 실행된다.
도 6은 DOTAM 결합 적격성을 증명하는, MKN45 세포에 분할 항체의 결합을 보여준다. 항체의 검출은 Pb-DOTAM-FITC를 이용하여 실행된다.
도 7의 A는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 실행된, CEA-분할-DOTAM-VH/VL를 이용한 2 단계 PRIT에 대한 예시적인 프로토콜을 보여준다 (h = 시간, d = 일, w = 주).
도 7의 B는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 실행된 3 단계 PRIT 대조에 대한 예시적인 프로토콜을 보여준다 (h = 시간, d = 일, w = 주).
도 8은 CEA-분할-DOTAM-VH 단독, CEA-분할-DOTAM-VL 단독 또는 조합된 2개의 상보성 항체 중 어느 한 가지에 의해 사전-표적화된, 또는 표준 3 단계 PRIT를 이용한, ²¹²Pb -DOTAM의 주사 6 시간 후, SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 사전-표적화된 ²¹²Pb-DOTAM의 생체분포를 보여준다 (%ID/g ± SD, n = 4).
도 9는 SCID 생쥐에서 IV 주사 후 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 약물동력학을 보여준다.
도 10은 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 2 단계 (위쪽) 또는 3 단계 (아래쪽)의 CEA-PRIT를 포함하는, 프로토콜 158의 실험 설계를 보여준다. *2/4 작제물에서 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 조정된 CEA 분할 DOTAM BsAb 용량.
도 11은 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 사전-표적화된 ²¹²Pb -DOTAM의 생체분포를 보여준다 (p.i. 6 시간). 분포는 CEA-DOTAM BsAb 또는 CEA-분할-DOTAM 항체의 이중파라토픽 조합에 의해 사전-표적화된, ²¹²Pb -DOTAM의 주사 6 시간 후, 종양 보유 SCID 생쥐에서 ²¹²Pb의 분포이다. 장기와 조직에서 방사성 내용물은 평균 % ID/g ± SD (n = 4)로서 표현된다.
도 12는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 3 단계 CEA-PRIT (위쪽), 2 단계 CEA-PRIT (중간), 또는 1 단계 CEA-RIT의 1회 주기를 포함하는, 프로토콜 160의 실험 일정을 보여준다. 생체분포 (BD) 스카우트는 방사선 주사 후 24 시간째에 안락사되었고, 반면 효능 군에서 생쥐는 종료 기준이 도달될 때까지 유지되고 조심스럽게 모니터링되었다.
도 13은 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 사전-표적화된 ²¹²Pb -DOTAM 및 ²¹²Pb -DOTAM-CEA-DOTAM 의 생체분포를 보여준다 (p.i. 24 시간). 분포는 CEA-DOTAM-사전-표적화된 ²¹²Pb-DOTAM 또는 전항온처리된 ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM의 주사 후 24 시간째에 종양 보유 SCID 생쥐에서 ²¹²Pb의 분포이다. 장기와 조직에서 방사성 내용물은 평균 % ID/g ± SD (n = 3)으로서 표현된다.
도 14는 BxPC3 모형 (n=10)에서 PRIT 치료된 군 및 대조 (군 A-E)에 대한 표준 오차를 갖는 종양 성장 평균을 보여준다. 곡선은 n<5에서 절두되었다. 반점 수직선은 연구 설계에 따른, 일부 또는 전체 군에 대한 ²¹²Pb-DOTAM 투여 (20 μCi)를 표시한다.
도 15는 BxPC3 모형 (n=10)에서 PRIT 치료된 군 및 대조 (군 A-E)에 대한 개별 종양 성장 곡선을 보여준다. 반점 수직선은 ²¹²Pb-표지화 화합물 (20 μCi)의 투여를 표시한다.
도 16은 BxPC3 모형에서 CEA-PRIT 및 CEA-RIT로 치료된 생쥐 (군 A-E, n=10)에서 평균 체중 감소를 보여준다. 곡선은 n<5에서 절두되었다. 반점 수직선은 연구 설계에 따른, 일부 또는 전체 군에 대한 ²¹²Pb-표지화 화합물의 투여를 표시한다.
도 17은 ²¹²Pb-DOTAM 주사 후 24 시간째에 희생 및 부검과 함께, SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 2 단계 CEA-PRIT를 포함하는, 프로토콜 175의 실험 설계를 보여준다. CEA-분할-DOTAM-VH-AST 용량은 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 조정되었다.
도 18은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체에 의해 사전-표적화된, ²¹²Pb-DOTAM의 주사 후 24 시간째에 종양 보유 SCID 생쥐에서 ²¹²Pb의 분포를 보여준다 (프로토콜 175). 장기와 조직에서 방사성 내용물은 평균 % ID/g ± SD (n = 4)로서 표현된다.
도 19는 ²¹²Pb-DOTAM 주사 후 6 시간째에 희생 및 부검과 함께, SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 2 단계 CEA-PRIT를 포함하는, 프로토콜 185의 실험 설계를 보여준다. CEA-분할-DOTAM-VH-AST (CH1A1A) 용량은 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 조정되었다.
도 20은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체에 의해 사전-표적화된, ²¹²Pb-DOTAM의 주사 6 시간 후 종양 보유 SCID 생쥐에서 ²¹²Pb의 분포를 보여준다 (프로토콜 185). 장기와 조직에서 방사성 내용물은 평균 % ID/g ± SD (n = 5)로서 표현된다.
도 21은 주사 후 7 일째에 2가지 선택된 SC BxPC3 종양에서 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍 (조합된 VH와 VL 항체)의 분포를 보여준다. 도 21의 A 및 B는 T84.66을 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL이 주사된 생쥐 A3으로부터 획득된 종양의 섹션을 보여주는데, 여기서 도 21의 A는 CEA 발현을 보여주고, B는 상응하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 분포를 보여준다. 도 21의 C 및 D는 CH1A1A를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL이 주사된 생쥐 C5로부터 획득된 종양 섹션을 보여준다: 도 21의 C는 CEA 발현을 보여주고, 도 21의 D는 상응하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 분포를 보여준다.
도 22는 ²¹²Pb-DOTAM 주사 후 6 시간째에 희생 및 부검과 함께, SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 2 단계 CEA-PRIT를 포함하는, 프로토콜 189의 실험 설계를 보여준다. CEA-분할-DOTAM-VH-AST (CH1A1A) 용량은 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 조정되었다.
도 23은 양성 대조 (CH1A1A 단독)와 비교하여, CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체 (T84.66 및 CH1A1A)의 이중파라토픽 쌍에 의해 사전-표적화된, ²¹²Pb-DOTAM의 주사 6 시간 후 종양 보유 SCID 생쥐에서 ²¹²Pb의 분포를 보여준다. 장기와 조직에서 방사성 내용물은 평균 % ID/g ± SD로서 표현된다.
도 24는 SPLIT 항체에 대한 FACS에 의해 결정된 바와 같은 평균 형광 강도 (MFI)를 보여준다. FACS에 의해 결정된 Pb-DOTA-FITC의 결합은 Pb-DOTA-FITC와 함께 양쪽 SPLIT 항체의 공동항온처리의 경우에만 목격될 수 있다. 단일 SPLIT 항체는 유의미한 신호를 발생시키지 않았다.
도 25의 A 내지 C는 본원에서 설명된 바와 같은 분할 항체의 예시적인 형식을 보여준다.
도 26은 칩 상에 포획된 비오틴화된 DOTAM에 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체의 결합을 사정하는, 실시예 8, 실험 1로부터 결과를 보여준다.
도 27은 칩 상에 포획된 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체에 DOTAM의 결합을 사정하는, 실시예 8, 실험 2로부터 결과를 보여준다.
도 28은 칩 상에 포획된 TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체 (항체 쌍)에 DOTAM의 결합을 사정하는, 실시예 8, 실험 3으로부터 결과를 보여준다.
도 29는 참조 항체에 비하여, 고정된 항-hFab를 이용하여 칩 상에 포획된 TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체 (항체 쌍)에 DOTAM의 결합을 사정하는, 실시예 11, 실험 1로부터 결과를 보여준다.
도 30은 항체 쌍에 결합과 비교하여, 고정된 항-hFab를 이용하여 칩 상에 포획된 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체에 DOTAM의 결합을 사정하는, 실시예 11, 실험 1로부터 결과를 보여준다.
도 31은 고정된 CEA를 이용하여 칩 상에 포획된 TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체 (항체 쌍)에 DOTAM의 결합을 사정하는, 실시예 11, 실험 2로부터 결과를 보여준다. 위쪽 이미지는 CEA 표적 표면 상에서 상호작용을 보여준다: 1. CEA 표적 표면 (일가 CEA 결합)으로부터 전구약물 A와 B의 강한 해리; 2. 전구약물 A+B+ DOTAM의 활성 복합체의 더 강한 결합 및 CEA 표적 표면으로부터 더 적은 해리를 발생시키는 DOTAM의 주입 및 표면 상에서 전구약물 A+B의 복합화; 3. 모노스트렙타비딘으로 판독. 아래쪽 이미지는 "이중 참조"되는 데이터를 보여준다. "이중 참조"로, 우리는 CEA 표적 표면으로부터 해리를 빼고, DOTAM 및 전구약물 A/B 상호작용의 순 반응만을 보여준다.

I. 정의

본원에서 목적으로 "수용자 인간 프레임워크"는 아래에 규정된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변화를 내포할 수 있다. 일부 양상에서, 아미노산 변화의 개수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 양상에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.

"친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (K_D)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 방법은 하기에서 설명된다.

"친화성 성숙된" 항체는 변경을 갖지 않는 부모 항체와 비교하여, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 한 가지 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하는데, 이런 변경은 항원에 대한 항체의 친화성에서 향상을 유발한다.

용어 "표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항체"는 항체가 상기 항원을 표적으로 하는 데 있어서 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 양상에서, 관련 없는, 비 항원 단백질에 대한 항체의 결합 정도는 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 계측될 때 상기 항원에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 양상에서, 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10^-8 M 이하, 예를 들면, 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들면, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (K_D)를 갖는다. 항체는 항체가 1 μM 이하의 K_D를 가질 때, 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원"에 특이적으로 결합"하는 것으로 일컬어진다. 일정한 양상에서, 항체는 상이한 종으로부터 상기 항원 사이에서 보존되는 상기 항원의 에피토프에 결합한다.

용어 "방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위" 또는 "방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위"는 항체가 방사성-표지된 화합물을 상기 항체와 연관시키기 위한 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 방사성-표지된 화합물에 결합할 수 있는, VH 및 VL 도메인을 포함하는 항원 결합 부위를 지칭한다. 한 양상에서, 관련 없는, 비 항원-화합물에 대한 항원 결합 부위의 결합 정도는 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 계측될 때, 방사성-표지된 화합물에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 양상에서, 방사성-표지된 화합물에 결합하는 항원 결합 부위는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10^-8 M 이하, 예를 들면, 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들면, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (K_D)를 갖는다. 이것은 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들면, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하, 또는 0.5pM 이하의 K_D를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들면, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 K_D로 방사성-표지된 화합물에 결합할 수 있다. 항원 결합 부위는 항원 결합 부위가 1 μM 이하의 K_D를 가질 때, 방사성-표지된 화합물"에 특이적으로 결합"하는 것으로 일컬어진다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체"는 또한, 기능적 항원 결합 부위의 VH 도메인 또는 VL 도메인 중 어느 하나를 포함하는 개별 헤미바디를 포괄한다.

"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, 교차-Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv 및 scFab); 단일 도메인 항체 (dAb); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다. 용어 "Fab 단편"은 면역글로불린의 중쇄의 VH와 CH1 도메인 및 경쇄의 VL과 CL 도메인으로 구성되는 단백질을 지칭한다. "Fab' 단편"은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편에 관한 논의를 위해, U.S. 특허 번호 5,869,046을 참조한다.

본원에서 이용된 바와 같이, "Fab 단편"에 대한 언급은 교차-Fab 단편 또는 scFab뿐만 아니라 전통적인 Fab 단편 (다시 말하면, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄, 그리고 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하는 것)을 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"은 중쇄와 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역 중 어느 한 가지가 교환되는 Fab 단편을 지칭한다. 교차-Fab 단편은 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 1 (CH1)로 구성되는 폴리펩티드 사슬, 그리고 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성되는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 명료함을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 불변 영역을 포함하는 펩티드 사슬은 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄" 로서 지칭된다. 반대로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드 사슬이 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄" 로서 지칭된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일 사슬"은 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결되는 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 단일 사슬 Fab 분자는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 펩티드 사슬을 형성하는 Fab 분자이다. 이와 같은 특정 구체예에서, Fab 경쇄의 C 말단은 단일 사슬 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N 말단에 연결된다.

비대칭적 Fab 팔은 또한, 정확한 Fab 대합을 주도하기 위해 하전된 또는 비-하전된 아미노산 돌연변이를 도메인 인터페이스 내로 도입함으로써 조작될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2016/172485.

"단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 펩티드 링커에 의해 연결된, 항체의 중쇄 (VH)와 경쇄 (VL)의 가변 도메인의 융합 단백질이다. 특히, 링커는 10 내지 25개 아미노산의 짧은 폴리펩티드이고, 통상적으로, 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나 또는 그 반대일 수 있다. 이러한 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 본래 항체의 특이성을 유지한다. ScFv 단편에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Pl

ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894와 5,587,458을 참조한다.

용어 "차단제"는 효과기 분자, 특히 방사성-표지된 화합물이 이러한 효과기 분자에 대한 기능적 결합 부위에 결합하는 것을 차단하는 작용제를 지칭한다. 일반적으로 상기 차단제는 효과기 분자에 대한 기능적 결합 부위에 결합한다, 예를 들면, 상기 기능적 결합 부위에 특이적으로 결합한다.

용어 "제거제"는 개체의 순환으로부터 항체의 청소율을 증가시키는 작용제를 지칭한다. 일반적으로 제거제는 항체에 결합한다, 예를 들면, 항체에 특이적으로 결합한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "제거 단계" 또는 "제거 시기"는 차단제 또는 제거제 중 어느 하나의 이용을 포괄한다. 일부 작용제는 제거제 및 차단제 둘 모두로서 기능할 수 있다.

용어 "에피토프"는 항체가 결합하는, 단백질성 또는 비단백질성 중 어느 한 가지인 항원 상에서 부위를 표시한다. 에피토프는 인접한 아미노산 스트레치 (선형 에피토프)로부터 둘 모두 형성될 수 있거나, 또는 예를 들면, 항원의 접힘으로 인해, 다시 말하면 단백질성 항원의 삼차 접힘에 의해 공간적으로 근접하는 비인접한 아미노산 (입체형태적 에피토프)을 포함할 수 있다. 선형 에피토프는 전형적으로, 변성제에 단백질성 항원의 노출 이후에도 항체에 의해 여전히 결합되는 반면, 입체형태적 에피토프는 전형적으로, 변성제로 처리 시에 파괴된다. 에피토프는 고유한 공간적 입체형태에서 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.

특정 에피토프에 결합하는 항체 (다시 말하면, 동일한 에피토프에 결합하는 것들)에 대한 선별검사는 당해 분야에서 일과적인 방법 예컨대 예를 들면, 제한 없이, 알라닌 스캐닝, 펩티드 블롯 (참조: Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), 펩티드 개열 분석, 에피토프 절제, 에피토프 추출, 항원의 화학적 변형 (참조: Prot. Sci. 9 (2000) 487-496), 그리고 교차 차단 (참조: "Antibodies", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)을 이용하여 실행될 수 있다.

변형 보조 프로파일링 (MAP)으로서 또한 알려져 있는 항원 구조 기반 항체 프로파일링 (ASAP)은 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 군중으로부터 획득된 항체 각각의 결합 프로필에 근거하여, 항원에 특이적으로 결합하는 다수의 단일클론 항체를 비닝하는 것을 가능하게 한다 (참조: 예를 들면, US 2004/0101920). 각 빈에서 항체는 다른 빈에 의해 나타내진 에피토프와 명백하게 상이하거나 또는 부분적으로 중첩하는 고유한 에피토프일 수 있는 동일한 에피토프에 결합한다.

또한 경쟁적 결합이 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는지를 쉽게 결정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 항원에 대한 참조 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단한다. 또한 예를 들면, 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건하에 항원에 결합하도록 허용된다. 과잉의 참조 항체의 제거 후, 항원에 결합하는 문제되는 항체의 능력이 사정된다. 만약 문제되는 항체가 참조 항체의 포화 결합 후 항원에 결합할 수 있으면, 문제되는 항체는 참조 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론될 수 있다. 그러나, 만약 문제되는 항체가 참조 항체의 포화 결합 후 항원에 결합할 수 없으면, 문제되는 항체는 참조 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 문제되는 항체가 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 입체적 이유로 결합이 단지 방해를 받는지를 확증하기 위해, 일과적인 실험 (예를 들면, 펩티드 돌연변이 및 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유세포분석 또는 당해 분야에서 가용한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 이용한 결합 분석)이 이용될 수 있다. 이러한 검정은 2가지 설정에서 실행되어야 한다, 다시 말하면 이들 항체 둘 모두 포화 항체이다. 만약 양쪽 설정에서, 단지 첫 번째 (포화) 항체만 항원에 결합할 수 있으면, 문제되는 항체 및 참조 항체는 항원에 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론될 수 있다.

일부 양상에서, 만약 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과잉의 한 항체가 경쟁적 결합 검정에서 계측될 때 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90% 또는 심지어 99% 또는 그 초과로 저해하면, 2개의 항체는 동일하거나 또는 중복 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다 (참조: 예를 들면, Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502).

일부 양상에서, 만약 한 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는, 항원 내에 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합 또한 감소시키거나 또는 제거하면, 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 만약 한 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 아미노산 돌연변이의 부분집합만 다른 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하면, 2개의 항체는 "중복 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.

용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.

항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 더욱 나눠질 수 있다. 일정한 양상에서, 항체는 IgG₁ 아이소타입이다. 일정한 양상에서, 항체는 Fc-영역 효과기 기능을 감소시키기 위한 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG₁ 아이소타입이다. 다른 양상에서, 항체는 IgG₂ 아이소타입이다. 일정한 양상에서, 항체는 IgG₄ 항체의 안정성을 향상시키기 위한, 힌지 영역에서 S228P 돌연변이를 갖는 IgG₄ 아이소타입이다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, γ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.

"효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 효과기 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 그리고 B 세포 활성화.

작용제, 예를 들면, 약학적 조성물의 "효과량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.

용어 "탠덤 Fab"는 펩티드 링커/테더를 통해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 항체를 지칭한다. 일부 구체예에서, 탠덤 Fab는 펩티드 링커/테더에 의해 연결된 하나의 Fab 단편 및 하나의 교차-Fab 단편을 포함할 수 있다.

본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 본원에서 용어 "Fc 도메인"은 첫 번째 불변 영역을 제외하고, 2개의 중쇄의 불변 영역을 내포하는 면역글로불린의 C 말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 따라서, Fc 도메인은 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 그리고 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인을 지칭한다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 카르복실 말단까지 걸친다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 개열을 겪을 수 있다. 이런 이유로 전장 중쇄를 인코딩하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 이것은 전장 중쇄의 개열된 변이체를 포함할 수 있다. 이것은 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신 (G446) 및 리신 (K447, EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 이런 이유로, Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447), 또는 C 말단 글리신 (Gly446) 및 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 양상에서, 본원 발명에 따른 항체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 양상에서, 본원 발명에 따른 항체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 이용된 바와 같이, Fc 도메인의 "아단위"는 이합체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중에서 하나, 다시 말하면, 이들 2개의 폴리펩티드 중에서 다른 것과 안정되게 연결되어 이합체성 Fc 도메인을 형성할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 아단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.

"프레임워크" 또는 "FR"은 상보성 결정 영역 (CDR) 이외에 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2- CDR-H2(CDR-L2)-FR3- CDR-H3(CDR-L3)-FR4.

용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.

"융합된"은 구성요소가 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 펩티드 결합에 의해 연결되는 것으로 의미된다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 일차 형질전환된 세포 및 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수도 있으며 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.

"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3의 경우에서와 같은 하위군이다. 한 양상에서, VL의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 양상에서, VH의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 III이다.

"인간화" 항체는 비인간 CDR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 양상에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 CDRs의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성이고 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인의 각 영역, 예를 들면 "상보성 결정 영역" ("CDR")을 지칭한다.

일반적으로, 항체는 6개의 CDR을 포함한다: VH에서 3개 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 그리고 VL에서 3개 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). 본원에서 예시적인 CDR은 하기를 포함한다:

(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 그리고

(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).

별도로 표시되지 않으면, CDR은 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 결정된다. 당업자는 CDR 지정이 Chothia, 위와 같음, McCallum, 위와 같음, 또는 임의의 다른 과학적으로 용인된 명명법 시스템에 따라서 또한 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 대신에, 본원에서 설명된 바와 같은 CDR-H1의 서열이 예를 들면, Pb-DOTAM 결합 가변 도메인의 경우에 Kabat26에서 Kabat35로 확장될 수 있다.

한 가지 양상에서, CDR 잔기는 서열 표에서 또는 본 명세서의 다른 곳에서 확인된 것들을 포함한다.

별도로 표시되지 않으면, HVR/CDR 잔기 및 가변 도메인에서 다른 잔기 (예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 넘버링된다.

"면역접합체"는 세포독성 작용제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한 가지 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.

"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 양상에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.

본원에서 설명된 바와 같은 분자는 "단리될 수 있다". "단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 양상에서, 항체는 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 결정될 때, 95% 또는 99%보다 높은 순도로 정제된다. 항체 순도의 사정을 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.

"멀티도메인 단백질"은 적어도 제1와 두 번째 단백질 도메인을 포함하는 단백질이다. 단백질 도메인은 안정된 단백질의 하부구조이고, 단백질의 나머지 부분과 무관하게 접힌다.

용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특이적으로 퓨린 또는 피리미딘 염기 (다시 말하면, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (다시 말하면, 데옥시리보오스 또는 리보오스), 그리고 인산염 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기의 서열에 의해 설명되는데, 여기서 상기 염기는 핵산 분자의 일차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'에서 3'로 나타내진다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 예를 들면, 상보성 DNA (cDNA) 및 유전체 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 그리고 이들 분자 중에서 두 가지 이상을 포함하는 혼성 중합체를 포괄한다. 핵산 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 이에 더하여, 용어 핵산 분자는 센스와 안티센스 가닥뿐만 아니라 단일 가닥과 이중 가닥 형태 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본원에서 설명된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 내포할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 실례는 유도체화된 당 또는 인산염 중추 연쇄 또는 화학적으로 변형된 잔기를 갖는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이런 DNA (예를 들면, cDNA) 또는 RNA (예를 들면, mRNA) 벡터는 변형되지 않거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 mRNA가 개체 내로 주입되어 항체가 생체내에서 생성될 수 있도록, RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 증강하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다 (참조: 예를 들면, Stadler er al, Nature Medicine 2017, 2017년 6월 12일 온라인 공개됨, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1).

"단리된" 핵산은 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

"항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄와 경쇄 (또는 이들의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서 이런 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 이상의 위치에서 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 동질성 항체의 모집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 모집단을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 동질성 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원 발명에 따른 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.

"나신 항체"는 이종성 모이어티 (예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 나신 항체는 약학적 조성물 내에 존재할 수 있다.

"선천적 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 선천적 IgG 항체는 디설피드 결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인 (VH), 그 이후에 3개의 불변 중쇄 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인 (VL), 그 이후에 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다.

용어 "포장 삽입물"은 치료 산물의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는 데 이용되는데, 이것은 이런 치료 산물의 이용에 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포한다.

참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 정렬의 목적으로 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 대안으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 소스 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087하에 등록되고 WO 2001/007611에서 설명된다.

별도로 표시되지 않으면, 본원에서 목적을 위해, 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값은 BLOSUM50 비교 매트릭스를 갖는 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 그 이후 버전의 ggsearch 프로그램을 이용하여 생성된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36에 의해 저술되었고, www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 또는 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta로부터 공개적으로 가용하다. 대안으로, 국부보다는 전역 정렬이 수행되도록 담보하기 위해 ggsearch (global protein:protein) 프로그램 및 디폴트 옵션 (BLOSUM50; 개방: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 이용하여, fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 접근 가능한 공개 서버가 서열을 비교하는 데 이용될 수 있다. 퍼센트 아미노산 동일성은 출력 정렬 헤더에서 제공된다.

용어 "약학적 조성물" 또는 "약학적 제제"는 그 안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 이러한 약학적 조성물이 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.

"약학적으로 허용되는 운반체"는 개체에게 비독성인, 약학적 조성물 또는 제제에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 운반체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 이용된 바와 같은 표적 항원에 대한 언급은 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 표적 항원을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 표적 항원뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 발생하는 표적 항원의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, 표적 항원의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 예를 들면, 표적 항원 CEA는 UniProt (www.uniprot.org) 수탁 번호 P06731 (버전 119), 또는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2에서 도시되는, 인간 CEA, 특히 암배아 항원 관련 세포 부착 분자 5 (CEACAM5)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 표적 항원의 다른 실례는 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP)이다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 UniProt (www.uniprot.org) 수탁 번호 Q12884 (버전 149), 또는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에서 도시된다. 표적 항원의 다른 실례는 GPRC5D이다 (인간 서열의 경우에 UniProt 번호 Q9NZD1 (버전 115); NCBI RefSeq 번호 NP_061124.1을 참조한다).

본원에서 언급된 바와 같이, 용어 "분할 항체", "분할 항체들", "단일 도메인 분할 항체" 또는 "SPLIT PRIT"는 방사성-표지된 화합물에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 함께 형성하는 VH와 VL 도메인이 2개의 항체 사이에 분할되고, 동일한 항체의 일부로서 존재하지 않는다는 것을 의미한다 (생체내 조립 전). "CEA 표적화 SPLIT PRIT"는 분할 항체 표적화 CEA를 지칭한다. 용어 "SPLIT PRIT"는 또한, 용어 "TA-분할-DOTAM-VH/VL" (예를 들면 여기서 "TA" 또는 표적 항원은 CEA, FAP 또는 GPRC5D이다)와 교체가능하게 이용될 수 있다. 용어 "CEA 표적화 SPLIT PRIT"는 용어 "CEA-분할-DOTAM-VH/VL"과 교체가능하게 이용될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 향상된 예후를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는 데 이용된다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. (참조: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 참조: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "Pb" 또는 "납"은 이의 이온, 예를 들면, Pb(II)를 포함한다. 다른 금속에 대한 언급 또한 이들의 이온을 포함한다. 따라서, 숙련된 독자는 예를 들면, 용어 납, Pb, ²¹²Pb 또는 ²⁰³Pb가 상기 원소의 이온 형태, 특히, Pb(II)를 포괄하는 것으로 의도된다는 것을 이해한다.

II. 조성물 및 방법

한 가지 양상에서, 본원 발명은 첫 번째 항체와 두 번째 항체를 포함하는 항체 세트에 부분적으로 기초되고, 여기서 각 항체는 표적 세포 상에서 항원에 결합할 수 있지만, 첫 번째 항체와 두 번째 항체가 서로 연결될 때에만 효과기 작용제에 대한 기능적 항원 결합 부위가 형성된다. 본원 발명의 항체는 예를 들면, 사전-표적화 면역요법 및/또는 사전-표적화 영상의 방법에 유용하다. 바람직한 양상에서 이들 방법은 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 제거한다.

A. 표적 항원

표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 본원에서 "표적 항원" 또는 "표적 세포 항원"으로 또한 명명된다. 이들 용어는 본원에서 교체가능하게 이용된다.

본원 발명은 치료 방법 및 거기에 이용을 위한 산물에 관계하는 한에 있어서, 환자의 세포, 예를 들면, 병든 세포에 표적화된 세포독성 활성에 의해 치료 가능한 임의의 질환에 적용 가능하다. 따라서, 표적 세포는 세포독성을 표적화하는 것이 바람직한 임의의 세포, 예를 들면, 임의의 병든 세포이다. 치료는 바람직하게는 종양 또는 암의 치료이다. 하지만, 본원 발명의 적용가능성은 종양 및 암에 한정되지 않는다. 예를 들면, 치료는 또한, 바이러스 감염 (감염된 세포를 표적으로 함으로써) 또는 T 세포 주동된 자가면역 질환 (T 세포를 표적으로 함으로써)의 치료일 수 있다. 감염된 세포의 표면 상에서 발현되는 바이러스 항원을 향해 지향된 면역독소가 다양한 바이러스 감염 예컨대 HIV, 광견병 및 EBV에 대해 조사되었다. Cai and Berger 2011 Antiviral Research 90(3):143-50에서는 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스로 감염된 세포의 표적화된 사멸을 위해 PE38을 내포하는 면역독소를 이용하였다. 이에 더하여, Resimmune® (A-dmDT390-bisFv(UCHT1))은 인간 악성 T 세포를 선택적으로 사멸시키고, 정상적인 T 세포를 일시적으로 고갈시키며, T 세포 주동된 자가면역 질환 예컨대 다발성 경화증 및 이식편 대 숙주 질환뿐만 아니라 이것에 대한 임상 시험이 진행 중인 T 세포 혈액암의 치료에 대한 잠재력을 갖는 것으로 고려된다. 유사하게, 본원 발명의 방법은 암 또는 종양 세포를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 방사선영상이 바람직한 임의의 세포 유형에 적용 가능할 수 있다.

따라서, 적합한 표적 항원은 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원을 포함할 수 있다.

이들 항원은 통상적으로, 과다발현되거나 또는 비정상적인 시점에 발현되는 정상 세포 표면 항원이다. 이상적으로는 표적 항원은 병든 세포 (예컨대 종양 세포) 상에서만 발현되지만, 이것은 실제로는 거의 관찰되지 않는다. 결과적으로, 표적 항원은 통상적으로, 병든 조직 및 건강한 조직 사이의 차별적 발현에 근거하여 선택된다.

세포 표면 마커 또는 표적 항원은 예를 들면, 종양 관련 항원일 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "종양 관련 항원" 또는 "종양 특이적 항원"은 항원이 종양(들) 및/또는 암(들)과 연관되도록, 종양 세포 및/또는 암 세포에 의해, 또는 종양의 간질의 다른 세포 예컨대 암 관련 섬유모세포에 의해 단독적으로 또는 지배적으로 발현되거나 또는 과다발현되는 임의의 분자 (예를 들면, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물 등)를 지칭한다. 종양 관련 항원은 정상적인, 비종양, 또는 비암성 세포에 의해 추가적으로 발현될 수 있다. 하지만, 이런 사례에서, 정상적인, 비종양, 또는 비암성 세포에 의한 종양 관련 항원의 발현은 종양 또는 암 세포에 의한 발현만큼 견실하지 않다. 이점에 관하여, 종양 또는 암 세포는 항원을 과다발현할 수 있거나, 또는 정상적인, 비종양, 또는 비암성 세포에 의한 항원의 발현과 비교하여, 훨씬 높은 수준으로 항원을 발현한다. 또한, 종양 관련 항원은 발달 또는 성숙의 상이한 상태의 세포에 의해 추가적으로 발현될 수 있다. 예를 들면, 종양 관련 항원은 배아 또는 태아 시기의 세포에 의해 추가적으로 발현될 수 있는데, 이들 세포는 정상적으로는 성체 숙주에서 발견되지 않는다. 대안으로, 종양 관련 항원은 줄기 세포 또는 전구체 세포에 의해 추가적으로 발현될 수 있는데, 이들 세포는 정상적으로는 성체 숙주에서 발견되지 않는다.

종양 관련 항원은 본원에서 설명된 암 및 종양을 비롯한, 임의의 암 또는 종양의 임의의 세포에 의해 발현된 항원일 수 있다. 종양 관련 항원은 이러한 종양 관련 항원이 단지 한 가지 유형의 암 또는 종양과 연관되거나 또는 이것에 특유하도록, 단지 한 가지 유형의 암 또는 종양의 종양 관련 항원일 수 있다. 대안으로, 종양 관련 항원은 한 가지 초과 유형의 암 또는 종양의 종양 관련 항원일 수 있다 (예를 들면, 이것에 특유할 수 있다). 예를 들면, 종양 관련 항원은 유방암 및 전립선암 세포 둘 모두에 의해 발현될 수 있고, 정상적인, 비종양, 또는 비암성 세포에 의해 전혀 발현되지 않는다.

본원 발명의 항체가 결합할 수 있는 예시적인 종양 관련 항원은 흑색종 관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 (MCSP), 점액소 1 (MUCl; 종양 관련 상피 점액소), 흑색종의 우선적으로 발현된 항원 (PRAME), 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), PSCA, EpCAM, Trop2 (EGP-1로서 또한 알려져 있는 영양모세포-2), 과립구 대식세포 집락 자극 인자 수용체 (GM-CSFR), CD56, 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2/neu) (erbB-2로서 또한 알려져 있음), CDS, CD7, 티로시나아제 관련된 단백질 (TRP) I, 그리고 TRP2를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 종양 항원은 분화 클러스터 (CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33 (시알산 결합 Ig 유사 렉틴 3, 골수 세포 표면 항원), CD79b, CD123 (인터류킨 3 수용체 알파), 트랜스페린 수용체, EGF 수용체, 메소텔린, 카드헤린, Lewis Y, 글리피칸-3, FAP (섬유모세포 활성화 단백질 알파), GPRC5D (G 단백질 연계 수용체 부류 C 그룹 5 구성원 D), PSMA (전립선 특이적 막 항원), CA9 = CAIX (탄산 탈수효소 IX), Ll CAM (신경 세포 부착 분자 L 1 ), 엔도시알린, HER3 (표피 성장 인자 수용체 패밀리 구성원 3의 활성화된 입체형태), Alkl/BMP9 복합체 (역형성 림프종 키나아제 1/뼈 형성 단백질 9), TPBG = 5T4 (영양모세포 당단백질), ROR1 (수용체 티로신 키나아제 유사 표면 항원), HER1 (표피 성장 인자 수용체의 활성화된 입체형태), 그리고 CLL1 (C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12, 구성원 A)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 메소텔린은 예를 들면, 난소암, 중피종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 난관암, 두경부암, 자궁경부암, 그리고 췌장암에서 발현된다. CD22는 예를 들면, 모발상 세포 백혈병, 만성 림프성 백혈병 (CLL), 전림프구성 백혈병 (PLL), 비호지킨 림프종, 소형 림프성 림프종 (SLL), 그리고 급성 림프성 백혈병 (ALL)에서 발현된다. CD25는 예를 들면, 모발상 세포 백혈병 및 호지킨 림프종을 비롯한, 백혈병 및 림프종에서 발현된다. Lewis Y 항원은 예를 들면, 방광암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 식도암, 위암, 폐암 및 췌장암에서 발현된다. CD33은 예를 들면, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수단구성 백혈병 (CML), 그리고 골수증식성 장애에서 발현된다.

종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 예시적인 항체는 트랜스페린 수용체에 대한 항체 (예를 들면, HB21 및 이의 변이체), CD22에 대한 항체 (예를 들면, RFB4 및 이의 변이체), CD25에 대한 항체 (예를 들면, 항-Tac 및 이의 변이체), 메소텔린에 대한 항체 (예를 들면, SS 1, MORAb-009, SS, HN1, HN2, MN, MB 및 이들의 변이체), 그리고 Lewis Y 항원에 대한 항체 (예를 들면, B3 및 이의 변이체)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이점에 관하여, 표적화 모이어티 (세포 결합 작용제)는 B3, RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2, HB21 및 MORAb-009, 그리고 이들의 항원 결합 부분으로 이루어진 군에서 선택되는 항체일 수 있다. 본원 발명의 키메라 분자에 이용하기 적합한 다른 예시적인 표적화 모이어티는 예를 들면 U.S. 특허 5,242,824 (항-트랜스페린 수용체); 5,846,535 (항-CD25); 5,889,157 (항-Lewis Y); 5,981,726 (항-Lewis Y); 5,990,296 (항-Lewis Y); 7,081,518 (항-메소텔린); 7,355,012 (항-CD22 및 항-CD25); 7,368,110 (항-메소텔린); 7,470,775 (항-CD30); 7,521,054 (항-CD25); 및 7,541,034 (항-CD22); U.S. 특허 출원 공보 2007/0189962 (항-CD22); Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000), 그리고 Kreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)에서 개시되고, 이들은 각각 본원에서 참조로서 편입된다.

크립토, CD30, CD19, CD33, 당단백질 NMB, CanAg, Her2 (ErbB2/Neu), CD56 (NCAM), CD22 (Siglec2), CD33 (Siglec3), CD79, CD138, PSCA, PSMA (전립선 특이적 막 항원), BCMA, CD20, CD70, E-셀렉틴, EphB2, 멜라노트랜스페린, Muc16 및 TMEFF2를 비롯한, 표적 특이적 종양 관련 항원에 대해 추가의 항체가 조성되었다. 이들, 또는 이들의 항원 결합 단편 중 임의의 것이 본원 발명에서 유용할 수 있다, 다시 말하면, 본원에서 설명된 항체 내로 통합될 수 있다.

본원 발명의 일부 구체예에서, 종양 관련 항원은 암배아 항원 (CEA)인 것이 바람직할 수 있다.

CEA는 이것이 상대적으로 느리게 내재화되고, 따라서 높은 백분율의 항체가 초기 치료 후, 방사성 핵종에 결합에 대해 세포의 표면 상에서 여전히 가용할 것이기 때문에, 본원 발명의 맥락에서 유리하다. 다른 낮은 내재화 표적/종양 관련 항원 역시 바람직할 수 있다. 종양 관련 항원의 다른 실례는 CD20 또는 HER2를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적은 EGP-1 (영양모세포-2로서 또한 알려져 있는 상피 당단백질-1), 결장 특이적 항원-p (CSAp) 또는 췌장 점액소 MUC1일 수 있다. 예를 들면 Goldenberg et al 2012 (Theranostics 2(5))를 참조하는데, 이것은 본원에서 참조로서 편입된다. 상기 참고문헌은 또한, CSAp에 결합하는 Mu-9 (Sharkey et al Cancer Res. 2003; 63: 354-63을 또한 참조한다), MUC1에 결합하는 hPAM4 (Gold et al Cancer Res. 2008: 68: 4819-26을 또한 참조한다), CD20에 결합하는 발투주맙 (Sharkey et al Cancer Res. 2008; 68: 5282-90을 또한 참조한다) 및 EGP-1에 결합하는 hRS7 (Cubas et al Biochim Biophys Acta 2009; 1796: 309-14를 또한 참조한다)과 같은 항체를 설명한다. 이들, 또는 이들의 항원 결합 부분 중 임의의 것이 본원 발명에서 유용할 수 있다, 다시 말하면, 본원에서 설명된 항체 내로 통합될 수 있다. CEA에 대해 조성된 항체의 한 가지 실례는 T84.66 (중쇄의 경우에 NCBI Acc No: CAA36980 및 경쇄의 경우에 CAA36979에서 도시된 바와 같음, 또는 WO2016/075278의 서열 번호 317 및 318에서 도시된 바와 같음), 그리고 이의 인간화 및 키메라 버전, 예컨대 WO2016/075278 A1 및/또는 WO2017/055389에서 설명된 바와 같은 T84.66-LCHA이다. 다른 실례는 WO2012/117002 및 WO2014/131712에서 설명된 바와 같은 항-CEA 항체인 CH1A1a, 그리고 CEA hMN-14 (US 6 676 924 및 US 5 874 540을 또한 참조한다)이다. 다른 항-CEA 항체는 M.J. Banfield et al, Proteins 1997, 29(2), 161-171에서 설명된 바와 같은 A5B7이다. 뮤린 항체 A5B7로부터 유래된 인간화 항체는 WO 92/01059 및 WO 2007/071422에서 개시되었다. 공동계류중인 출원 PCT/EP2020/067582를 또한 참조한다. A5B7의 인간화 버전의 실례는 A5H1EL1(G54A)이다. CEA에 대한 다른 예시적인 항체는 US7626011 및/또는 공동계류중인 출원 PCT/EP2020/067582에서 설명된 MFE23 및 이의 인간화 버전이다. CEA에 대한 항체의 또 다른 실례는 28A9이다. 이들, 또는 이들의 항원 결합 단편 중 임의의 것이 본원 발명에서 CEA 결합 모이어티를 형성하는 데 유용할 수 있다.

FAP (섬유모세포 활성화 단백질 알파) 또는 GPRC5D (G 단백질 연계 수용체 부류 C 그룹 5 구성원 D) 또한, 일부 구체예에서 바람직할 수 있다. FAP는 다수의 종양 유형, 예를 들면 췌장, 유방 및 폐암의 미세환경에서 광범위한 발현으로 인해, 영상 및 요법을 위한 확립된 표적이다 (Lindner, T., Loktev, A., Giesel, F. et al. Targeting of activated fibroblasts for imaging and therapy. EJNMMI radiopharm. chem. 4, 16 (2019)). FAP를 표적 항원으로서 이용한 SPLIT PRIT는 따라서, 활성화된 암 관련 섬유모세포 상에서 ²¹²Pb-DOTAM의 특이적 축적을 생성할 것으로 예상될 것이다. 결과적으로, 방출된 알파 방사선은 인접한 종양 세포에 대한 한정된 직접적인 종양-사멸 효과에 더하여, FAP 발현 악성 종양의 면역 억제에 부정적인 영향을 줄 것으로 예상될 것이다. G-단백질 연계 수용체 패밀리 C 그룹 5 구성원 D (GPRC5D)는 다발성 골수종 형질 세포에서 과다발현되는데 (Atamaniuk J, Gleiss A, Porpaczy E, Kainz B, Grunt TW, Raderer M, et al. Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest. 2012;42:953-60.), 확립된 SC (피하) 생체내 모형은 다발성 골수종 환자에서 발견된 발현, 예를 들면 OPM-2 및 NCI-H929를 반영한다 (Kodama T, Kochi Y, Nakai W, Mizuno H, Baba T, Habu K, et al. Anti-GPRC5D/CD3 bispecific T-cell-redirecting antibody for the treatment of multiple myeloma. Mol Cancer Ther. (2019) 18:1555-64). 우리는 이런 이유로, GPRC5D-분할-DOTAM을 표적 항원으로서 이용한 SPLIT PRIT가 ²¹²Pb-DOTAM의 종양 특이적 축적, 그 이후에 방사선 유발 종양 세포 사멸을 생성할 것으로 예상한다.

일부 구체예에서, 본원 발명의 항체는 표적 항원 (예를 들면, 본원에서 논의된 임의의 표적 항원)에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 이들은 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면 10^-7M 이하, 예를 들면 10^-7 내지 10^-13, 10^-8 M 이하, 예를 들면 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들면, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (K_D)로 결합할 수 있다.

한 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, "항원 A"로 명명될 수 있는 동일한 표적 항원에 결합할 수 있다 (다시 말하면, 이들은 동일한 표적 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다). 이들은 각각, 항원 A 상에서 동일한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 대안으로, 첫 번째 항체는 항원 A 상에서 첫 번째 에피토프에 결합할 수 있고, 두 번째 항체는 항원 A 상에서 상이한, 두 번째 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 이들 항체 중에서 하나는 CEA의 T84.66 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 항체는 CEA의 A5B7 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 항체 중에서 하나 또는 둘 모두, 항원 A에 대해 이중파라토픽일 수 있다 - 다시 말하면, 각각의 개별 항체가 항원 A의 두 가지 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 첫 번째 항체는 제1와 두 번째 결합 부위를 포함할 수 있는데, 이들은 각각, 항원 A의 제1와 두 번째 에피토프에 결합하고, 여기서 제1와 두 번째 에피토프는 서로 상이하다. 대안으로 또는 부가적으로, 두 번째 항체는 항원 A의 제1와 두 번째 에피토프에 결합하는 제1와 두 번째 결합 부위를 포함할 수 있는데, 여기서 제1와 두 번째 에피토프는 서로 상이하다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항체에 의해 결합된 에피토프 중에서 하나 또는 둘 모두, 두 번째 항체에 의해 결합된 에피토프 중에서 하나 또는 둘 모두와 상이할 수 있다. 다른 구체예에서, 첫 번째 항체에 의해 결합된 2개의 에피토프는 두 번째 항체에 의해 결합된 2개의 에피토프와 동일할 수 있다.

다른 구체예에서, 첫 번째 항체 및 두 번째 항체는 항원 A 및 항원 B로 각각 명명될 수 있는 상이한 표적 항원에 각각 결합할 수 있다.

B. 방사성-표지된 화합물

본원 발명에 따라서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결은 효과기 분자에 대한 기능적 결합 부위를 형성한다. 본원 발명에 따른 효과기 분자는 방사성-동위원소를 포함하는 방사성-표지된 화합물이다, 예를 들면, 방사성-표지된 합텐이다.

일부 구체예에서, 효과기 분자는 킬레이트화된 방사성-동위원소를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 효과기 분자에 대한 기능적 결합 부위는 킬레이터 및 방사성-동위원소를 포함하는 킬레이트에 결합할 수 있다. 다른 구체예에서, 이들 항체는 킬레이트화된 방사성-동위원소, 예를 들면, 히스타민-숙시닐-글리신 (HSG), 디곡시제닌, 비오틴 또는 카페인에 접합되는 모이어티에 결합할 수 있다.

킬레이터는 예를 들면, 여러 자리 분자 예컨대 아미노폴리카르복실산 또는 아미노폴리티오카르복실산, 또는 이들의 염 또는 기능적 변이체일 수 있다. 킬레이터는 예를 들면, 두자리 또는 세자리 또는 네자리일 수 있다. 적합한 금속 킬레이터의 실례는 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산, 또는 염 형태 예컨대 CaNa₂EDTA), DTPA (디에틸렌트리아민 펜타아세트산), DOTA (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), NOTA (2,2',2''-(1,4,7-트리아자노난-1,4,7-트리틸)트리아세트산), IDA (이미노디아세트산), MIDA ((메틸이미노)디아세트산), TTHA (3,6,9,12-테트라키스(카르복시메틸)-3,6,9,12-테트라- 아자테트라데칸디오산), TETA (2,2',2'',2'''-(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸- 1,4,8,11-테트라일)테트라아세트산), DOTAM (1,4,7,10-테트라키스(카바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸), HEHA (1,4,7,10,13,16-헥사아자시클로헥사데칸-1,4,7,10,13,16-헥사아세트산, Macrocyclics, Inc., Plano, Texas로부터 가용함), NTA (니트릴로트리아세트산) EDDHA (에틸렌디아민-N, N'-비스(2-히드록시페닐아세트산), BAL (2,3,-디메르캅토프로판올), DMSA (2,3-디메르캅토숙신산), DMPS (2,3-디메르캅토-1-프로판술폰산), D-페니실라민 (B-디메틸시스테인), MAG₃ (메르캅토아세틸트리글리신), Hynic (6-히드라지노피리딘-3-카르복실산), p-이소티오시아나토벤질-데스페리옥사민 (예를 들면, 영상을 위해 지르코늄으로 표지화됨), 그리고 금속을 킬레이트화할 수 있는 이들의 염 또는 기능적 변이체/유도체를 포함하는 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 킬레이터는 DOTA 또는 DOTAM, 또는 금속을 킬레이트화할 수 있는 이들의 염 또는 기능적 변이체/유도체인 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 킬레이터는 방사성-동위원소가 거기에 킬레이트화된 DOTA 또는 DOTAM일 수 있거나 또는 이것을 포함할 수 있다.

효과기 분자는 방사성 핵종과 함께, 상기 킬레이터의 기능적 변이체 또는 유도체를 포함하거나 또는 이들로 구성될 수 있다. 적합한 변이체/유도체는 일정한 한정된 정도까지 상이하고, 킬레이터로서 기능하는 능력을 유지하는 (다시 말하면 본원에서 설명된 목적 중 한 가지 이상에 이용될 만큼 충분한 활성을 유지하는) 구조를 갖는다. 기능적 변이체/유도체는 또한, 소형 분자, 폴리펩티드 또는 탄수화물을 비롯한, 한 가지 이상의 추가 모이어티 또는 치환체에 접합된 전술된 바와 같은 킬레이터를 포함할 수 있다. 이러한 부착은 예를 들면 킬레이터의 중추 부분 내에, 성분 탄소 중에서 하나를 통해 일어날 수 있다. 적합한 치환체는 예를 들면, 탄화수소 기 예컨대 알킬, 알케닐, 아릴 또는 알키닐; 히드록시 기; 알코올 기; 할로겐 원자; 니트로 기; 시아노 기; 술포닐 기; 티올 기; 아민 기; 옥소 기; 카르복시 기; 티오카르복시 기; 카르보닐 기; 아미드 기; 에스테르 기; 또는 헤테로아릴 기를 포함하는 헤테로환일 수 있다. 치환체는 예를 들면 아래의 "R¹" 기에 대해 규정된 것들 중에서 한 가지일 수 있다. 소형 분자는 예를 들면, 염료 (예컨대 Alexa 647 또는 Alexa 488), 비오틴 또는 비오틴 모이어티, 또는 페닐 또는 벤질 모이어티일 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들면, 올리고 펩티드, 예를 들면, 두 개 또는 세 개의 아미노산의 올리고펩티드일 수 있다. 예시적인 탄수화물은 덱스트란, 선형 또는 분지된 중합체 또는 공중합체 (예를 들면 폴리알킬렌, 폴리(에틸렌-리신), 폴리메타크릴레이트, 폴리아미노산, 다당류 또는 올리고당류, 덴드리머)를 포함한다. 유도체는 또한, 상기 명시된 바와 같은 화합물이 링커 모이어티를 통해 연결되는 킬레이터 화합물의 다합체를 포함할 수 있다. 유도체는 또한, 금속 이온을 킬레이트화하는 능력을 유지하는, 상기 화합물의 기능적 단편을 포함할 수 있다.

유도체의 특정 실례는 벤질-EDTA 및 히드록시에틸-티오우리도-벤질 EDTA, DOTA-벤젠 (예를 들면, (S-2-(4-아미노벤질)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 테트라아세트산), DOTA-비오틴, 그리고 DOTA-TyrLys-DOTA를 포함한다.

본원 발명의 일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결에 의해 형성된 기능적 결합 부위는 DOTAM 및 금속, 예를 들면, 납 (Pb)을 포함하는 금속 킬레이트에 결합한다. 앞서 언급된 바와 같이, "DOTAM"는 화학 명칭:

1,4,7,10-테트라키스(카바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸을 갖고,

이것은 하기 화학식의 화합물이다:

.

본원 발명은 일정한 양상 및 구체예에서 금속 이온을 통합하는, DOTAM의 기능적 변이체 또는 유도체를 또한 이용할 수 있다. DOTAM의 적합한 변이체/유도체는 DOTAM의 구조와 일정한 한정된 정도까지 상이하고, 기능하는 능력을 유지하는 (다시 말하면 본원에서 설명된 목적 중 한 가지 이상에 이용될 만큼 충분한 활성을 유지하는) 구조를 갖는다. 이런 양상 및 구체예에서, DOTAM 또는 DOTAM의 기능적 변이체/유도체는 WO 2010/099536에서 개시된 활성 변이체 중에서 한 가지일 수 있다. 적합한 기능적 변이체/유도체는 하기 화학식의 화합물:

또는 이의 약학적으로 허용되는 염일 수 있고; 여기서

R^N은 H, C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4-알킬, C_1-7 헤테로아릴 및 C_1-7헤테로아릴-C_1-4-알킬이고; 여기서 C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐 및 C_2-6 알키닐은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^w 기에 의해 임의적으로 치환되고; 여기서 상기 C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4-알킬, C_1-7 헤테로아릴 및 C_1-7헤테로아릴-C_1-4-알킬은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^x 기에 의해 임의적으로 치환되고;

L¹은 독립적으로 C_1-6알킬렌, C_1-6 알케닐렌, 또는 C_1-6 알키닐렌이고, 이들은 각각, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 R¹ 기에 의해 임의적으로 치환되고;

L²는 C_2-4 직쇄 알킬렌이고, 이것은 독립적으로 선택된 R¹ 기에 의해 임의적으로 치환되고; C_1-4 알킬 및 또는 C_1-4 할로알킬에서 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 기에 의해 임의적으로 치환되고;

R¹은 D¹-D²-D³, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-6 알콕시, C_1-6 할로알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, C_1-6 알킬술포닐, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 디-C_1-6 알킬아미노, C_1-4 알킬카르보닐, 카르복시, C_1-6 알콕시카르보닐, C_1-6 알킬카르보닐아미노, 디-C_1-6 알킬카르보닐아미노, C_1-6 알콕시카르보닐아미노, C_1-6 알콕시카르보닐(C_1-6 알킬)아미노, 카르바밀, C_1-6 알킬카르바밀 및 디-C_1-6 알킬카르바밀에서 독립적으로 선택되고;

각 D¹은 C_6-10 아릴-C_1-4 알킬, C_1-9 헤테로아릴-C_1-4 알킬, C_3-10 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-9 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, C_1-8 알킬렌, C_1-8 알케닐렌 및 C_1-8 알키닐렌에서 독립적으로 선택되고; 여기서 상기 C_1-8 알킬렌, C_1-8 알케닐렌 및 C_1-8 알키닐렌은 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R⁴ 기에 의해 임의적으로 치환되고; 여기서 상기 C_6-10 아릴-C_1-4 알킬, C_1-9 헤테로아릴-C_1-4 알킬, C_3-10 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-9 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R⁵ 기에 의해 임의적으로 치환되고;

각 D²는 독립적으로 부재하거나 또는 C_1-20 직쇄 알킬렌이고, 여기서 상기 C_1-20 직쇄 알킬렌의 1개 내지 6개의 비-인접한 메틸렌 기가 각각, 독립적으로 선택된 -D⁴- 모이어티에 의해 임의적으로 대체되고, 단서로써 상기 C_1-20 직쇄 알킬렌에서 적어도 하나의 메틸렌 단위가 -D⁴- 모이어티에 의해 임의적으로 대체되지 않고; 여기서 상기 C_1-20 직쇄 알킬렌은 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-4 알킬, C_1-4 할로알킬, C_1-4 알콕시, C_1-4 할로알콕시, 아미노, C_1-4알킬아미노, 디-C_1-4 알킬아미노, C_1-4 알킬카르보닐, 카르복시, C_1-4 알콕시카르보닐, C_1-4 알킬카르보닐아미노, 디-C_1-4 알킬카르보닐아미노, C_1-4 알콕시카르보닐아미노, C_1-4 알콕시카르보닐-(C_1-4 알킬)아미노, 카르바밀, C_1-4 알킬카르바밀 및 디-C_1-4 알킬카르바밀에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기에 의해 임의적으로 치환되고;

각 D³은 H, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_3-14 시클로알킬, C_3-14 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-14 헤테로시클로알킬, C_2-14 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, C_6-14 아릴, C_6-14 아릴-C_1-4 알킬, C_1-13 헤테로아릴, C_1-13 헤테로아릴-C_1-4 알킬에서 독립적으로 선택되고; 여기서 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R⁶ 기에 의해 임의적으로 치환되고; 여기서 상기 C_3-14 시클로알킬, C_3-14 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-14 헤테로시클로알킬, C_2-14 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, C_6-14 아릴, C_6-14 아릴-C_1-4 알킬, C_1-13 헤테로아릴, C_1-13 헤테로아릴-C_1-4 알킬은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R⁷ 기에 의해 임의적으로 치환되고;

각 D⁴는 -O-, -S-, -NR^aC(=O)-, -NR^aC(=S)-, -NR^bC(=O)NR^c-, -NR^bC(=S)NR^c-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)NR^a-, -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=O)NR^a-, -OC(=S)NR^a-, -NR^a-, -NR^bS(=O)NR^c- 및 NR^bS(=O)₂NR^O-에서 독립적으로 선택되고;

각 R⁴ 및 R⁶은 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-4 알콕시, C_1-4 할로알콕시, C_1-4 알킬티오, C_1-4 알킬술피닐, C_1-4 알킬술포닐, 아미노, C_1-4알킬아미노, 디-C_1-4 알킬아미노, C_1-4 알킬카르보닐, 카르복시, C_1-4 알콕시카르보닐, C_1-4 알킬카르보닐아미노, 디-C_1-4 알킬카르보닐아미노, C_1-4 알콕시카르보닐아미노, C_1-4 알콕시카르보닐-(C_1-4 알킬)아미노, 카르바밀, C_1-4 알킬카르바밀 및 디-C_1-4 알킬카르바밀에서 독립적으로 선택되고;

각 R⁵는 할로겐, 시아노, 시안산염, 이소티오시안산염, 니트로, 히드록실, C_1-4 알킬, C_2-4 알케닐, C_2-4 알키닐, C_1-4 알콕시, C_1-4 할로알콕시, C_1-4 알킬티오, C_1-4 알킬술피닐, C_1-4 알킬술포닐, 아미노, C_1-4알킬아미노, 디-C_1-4 알킬아미노, C_1-4 알킬카르보닐, 카르복시, C_1-4 알콕시카르보닐, C_1-4 알킬카르보닐아미노, 디-C_1-4 알킬카르보닐아미노, C_1-4 알콕시카르보닐아미노, C_1-4 알콕시카르보닐-(C_1-4 알킬)아미노, 카르바밀, C_1-4 알킬카르바밀 및 디-C_1-4 알킬카르바밀에서 독립적으로 선택되고;

각 R⁷은 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-6 알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4 알킬, C_1-7 헤테로아릴, C_1-7 헤테로아릴-C_1-4 알킬, -OR^O, -SR^O, -S(=O)R^P, -S(=O)₂R^P, -S(=O)NR^sR^t, -C(=O)R^P, -C(=O)OR^P, -C(=O)NR^sR^t, -OC(=O)R^P, -OC(=O)NR^sR^t, -NR^sR^t, -NR^qC(=O)R^r, -NR^qC(=O)OR^r, -NR^qC(=O)NR^r, -NR^qS(=O)₂R^r 및 -NR^PS(=O)₂NR^sR^t에서 독립적으로 선택되고; 여기서 상기 C_1-6 알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R' 기에 의해 임의적으로 치환되고; 여기서 상기 C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4 알킬, C_1-7 헤테로아릴, C_1-7 헤테로아릴-C_1-4 알킬은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R'' 기에 의해 임의적으로 치환되고;

각 R^a, R^b 및 R^c는 H, C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4 알킬, C_1-7 헤테로아릴, C_1-7 헤테로아릴-C_1-4 알킬에서 독립적으로 선택되고; 여기서 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^w 기에 의해 임의적으로 치환되고; 여기서 상기 C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4 알킬, C_1-7 헤테로아릴, C_1-7 헤테로아릴-C_1-4 알킬은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^x 기에 의해 임의적으로 치환되고;

각 R^o, R^p, R^q, R^r, R^s 및 R^t는 H, C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4 알킬, C_1-7 헤테로아릴, C_1-7 헤테로아릴-C_1-4 알킬에서 독립적으로 선택되고; 여기서 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^y 기에 의해 임의적으로 치환되고; 여기서 상기 C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4 알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4 알킬, C_1-7 헤테로아릴, C_1-7 헤테로아릴-C_1-4 알킬은 각각, 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^z 기에 의해 임의적으로 치환되고;

각 R', R^w 및 R^y는 히드록실, 시아노, 니트로, C_1-4 알콕시, C_1-4 할로알콕시, 아미노, C_1-4 알킬아미노 및 디-C_1-4 알킬아미노에서 독립적으로 선택되고;

각 R'', R^x 및 R^z는 히드록실, 할로겐, 시아노, 니트로, C_1-4 알킬, C_1-4 할로알킬, C_1-4 알콕시, C_1-4 할로알콕시, 아미노, C_1-4 알킬아미노 및 디-C_1-4 알킬아미노에서 독립적으로 선택되고;

단서로써 임의적으로 치환된 모이어티에서 각 원자의 원자가가 초과되지 않는다.

적절하게는, 상기 화학식의 기능적 변이체/유도체는 DOTAM의 것과 비슷하거나 또는 그 초과인, 본원 발명의 항체에 대한 친화성을 갖고, DOTAM의 것과 비슷하거나 또는 그 초과인, Pb에 대한 결합 강도를 갖는다 ("친화성"은 전술된 바와 같이, 해리 상수에 의해 계측된 바와 같다). 예를 들면, 본원 발명의 항체 또는 /Pb를 갖는 기능적/변이체 유도체의 해리 상수는 동일한 항체/Pb를 갖는 DOTAM의 해리 상수보다 1.1배 이하, 1.2배 이하, 1.3배 이하, 1.4배 이하, 1.5배 이하, 또는 2배 이하일 수 있다.

각 R^N은 H, C_1-6 알킬, 또는 C_1-6 할로알킬; 바람직하게는 H, C_1-4 알킬, 또는 C_1-4 할로알킬일 수 있다. 가장 바람직하게는, 각 R^N은 H이다.

DOTAM 변이체의 경우에, 1, 2, 3개 또는 가장 바람직하게는 각 L²가 C₂ 알킬렌인 것이 바람직하다. 유리하게는, DOTAM의 C₂ 알킬렌 변이체는 Pb에 대한 특히 높은 친화성을 가질 수 있다. L²에 대한 임의적 치환체는 R¹, C_1-4 알킬, 또는 C_1-4 할로알킬일 수 있다. 적절하게는, L²에 대한 임의적 치환체는 C_1-4 알킬 또는 C_1-4 할로알킬일 수 있다.

임의적으로, 각 L²는 치환되지 않은 C₂ 알킬렌 -CH₂CH₂-일 수 있다.

각 L¹은 바람직하게는 C_1-4 알킬렌, 더 바람직하게는 C₁ 알킬렌 예컨대 -CH₂-이다.

DOTAM의 기능적 변이체/유도체는 하기 화학식의 화합물일 수 있고:

여기서 각 Z는 독립적으로 앞서 규정된 바와 같은 R¹이고; p, q, r 및 s는 0, 1 또는 2이고; p+q+r+s는 1 이상이다. 바람직하게는, p, q, r 및 s는 0 또는 1이고 및/또는 p+q+r+s는 1이다. 예를 들면, 상기 화합물은 p+q+r+s = 1을 가질 수 있고, 여기서 Z는 p-SCN-벤질 모이어티이다 - 이런 화합물은 Macrocyclics, Inc. (Plano, Texas)로부터 상업적으로 가용하다.

본원 발명에서 유용한 방사성 핵종은 금속, 예컨대 납 (Pb), 루테튬 (Lu), 또는 이트륨 (Y)의 방사성-동위원소를 포함할 수 있다.

영상화 적용에서 특히 유용한 방사성 핵종은 감마 방출체인 방사성 핵종일 수 있다. 예를 들면, 이들은 ²⁰³Pb 또는 ²⁰⁵Bi에서 선택될 수 있다.

치료적 적용에서 특히 유용한 방사성 핵종은 알파 또는 베타 방출체인 방사성 핵종일 수 있다. 예를 들면, 이들은 ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, ²¹¹At, ²²⁷Th, ²²³Ra에서 선택될 수 있다.

일부 구체예에서, DOTAM (또는 이의 염 또는 기능적 변이체)는 Pb 또는 Bi 예컨대 상기 열거된 Pb 또는 Bi 방사성-동위원소 중에서 하나로 킬레이트화되는 것이 바람직할 수 있다. 다른 구체예에서, DOTA (또는 이의 염 또는 기능적 변이체)는 Lu 또는 Y 예컨대 상기 열거된 Lu 또는 Y 방사성-동위원소 중에서 하나로 킬레이트화되는 것이 바람직할 수 있다.

일부 구체예에서, 방법과 용도는 요법 및 영상의 조합된 방법을 포함할 수 있는데, 이들 방법은 방사성-동위원소의 혼합물, 예를 들면, 요법에 적합한 방사성-동위원소 및 영상에 적합한 방사성-동위원소를 이용한다. 예를 들면, 이들은 동일한 킬레이터에 의해 킬레이트화된, 동일한 금속의 상이한 방사성-동위원소일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 ²⁰³Pb-DOTAM 및 ²¹²Pb-DOTAM을 혼합물로서 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 감마 방출체 예컨대 ²⁰³Pb 또는 ²⁰⁵Bi를 이용한 선량측정의 첫 번째 주기, 그 이후에 알파 또는 베타 방출체 예컨대 ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, ²¹¹At, ²²⁷Th, 또는 ²²³Ra를 이용한 1회 이상 라운드의 치료를 포함할 수 있다. 이런 방법은 아래에 더욱 설명된다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결에 의해 형성된 기능적 결합 부위는 Pb-DOTAM 킬레이트에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결에 의해 형성된 기능적 결합 부위는 방사성-표지된 화합물에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 이것은 Pb-DOTAM 및/또는 표적에 대해, ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면 10^-7M 이하, 예를 들면 10^-7 내지 10^-13, 10^-8 M 이하, 예를 들면 10^-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)로, 방사성-표지된 화합물, 예컨대 Pb-DOTAM 킬레이트에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들면, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하, 또는 0.5pM 이하의 결합 친화성의 Kd 값으로 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들면, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 Kd로 금속 킬레이트에 결합할 수 있다.

C. DOTA에 대한 예시적인 항원 결합 부위

본원 발명의 특정한 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 연결되어 DOTA (또는 이의 기능적 유도체 또는 변이체), 예를 들면, Lu 또는 Y (예를 들면, ¹⁷⁷Lu 또는 ⁹⁰Y)로 킬레이트화된 DOTA에 대한 기능적 결합 부위를 형성한다. 예를 들면, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들면, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 Kd로, 방사성-표지된 화합물에 결합할 수 있다.

C825는 방사선금속 예컨대 ¹⁷⁷Lu 및 ⁹⁰Y와 복합화된 DOTA-Bn (S-2-(4-아미노벤질)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 테트라아세트산)에 대해 높은 친화성을 갖는 공지된 scFv이다 (예를 들면, 본원에서 참조로서 편입되는 Cheal et al 2018, Theranostics 2018 및 WO2010099536을 참조한다). C825의 CDR 서열 및 VL과 VH 서열은 본원에서 제공된다. 한 구체예에서, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 중쇄 가변 영역 형성 부분은 (a) 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함할 수 있다. 대안적 구체예에서, CDR-H1은 서열 GFSLTDYGVH (서열 번호: 148)를 가질 수 있다. 방사성-표지된 화합물에 대한 결합 부위의 경쇄 가변 영역 형성 부분은 (d) 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분 (첫 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 41의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 41에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 결합 부위는 바람직하게는 본원에서 설명된 바와 같은 친화성으로, Lu 또는 Y와 복합화된 DOTA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 41에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, 상기 항체는 서열 번호: 41에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VH는 (a) 서열 번호: 35 또는 서열 GFSLTDYGVH (서열 번호: 148)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 그리고 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

임의적으로, 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분 (두 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 42의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 42에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 결합 부위는 바람직하게는 본원에서 설명된 바와 같은 친화성으로, Lu 또는 Y와 복합화된 DOTA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 42에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, 상기 항체는 서열 번호: 42에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL은 (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 관련된 구체예는 명시적으로 조합으로 예기된다. 따라서, 기능적 항원 결합 부위는 첫 번째 항체와 두 번째 항체 각각에서, 앞서 규정된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 앞서 규정된 바와 같은 경쇄 가변 영역으로부터 형성될 수 있다.

임의의 상기 구체예에서, DOTA 복합체에 대한 결합 부위를 형성하는 경쇄와 중쇄 가변 영역은 인간화될 수 있다. 한 구체예에서, 경쇄와 중쇄 가변 영역은 임의의 상기 구체예의 경우에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 더욱 포함한다.

일부 구체예에서, 중쇄 가변 도메인은 아래에 더욱 논의된 바와 같이, 하나 이상의 C 말단 잔기 예컨대 하나 이상의 C 말단 알라닌 잔기, 또는 CH1 도메인의 N 말단으로부터 하나 이상의 잔기에 의해 확장될 수 있다.

D. DOTAM에 대한 예시적인 항원 결합 부위

본원 발명의 다른 특정한 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 연결되어 Pb-DOTAM 킬레이트 (Pb-DOTAM)에 대한 기능적 항원 결합 부위를 형성한다.

예시적인 항원 결합 부위는 WO2019/201959에서 설명되는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다.

일정한 구체예에서, Pb-DOTAM에 결합하는 기능적 항원 결합 부위는 하기 특성 중에서 한 가지 이상을 가질 수 있다:

ㆍ Pb-DOTAM 및 Bi-DOTAM에 특이적으로 결합한다;

ㆍ 다른 킬레이트화된 금속, 예컨대 Cu-DOTAM과 비교하여 Pb-DOTAM (및 임의적으로 Bi-DOTAM)에 대해 선택적이다;

ㆍ 매우 높은 친화성으로 Pb-DOTAM에 결합한다;

ㆍ Pb-DOTAM 상에서 WO2019/201959에서 설명된 항체 예를 들면, PRIT-0213 또는 PRIT-0214와 동일한 에피토프에 결합하고 및/또는 상기 항체와 동일한 접촉 잔기를 갖는다.

Pb의 방사성-동위원소는 진단 및 요법의 방법에서 유용하다. 본원 발명에서 이용될 수 있는 납의 특정 방사성-동위원소는 ²¹²Pb 및 ²⁰³Pb를 포함한다.

α-입자 방출체인 방사성 핵종은 짧은 경로 길이 및 높은 선형 에너지 전달의 조합으로 인해 β-방출체보다, 주변 조직에 대한 더 적은 손상과 함께 더 특이적인 종양 세포 사멸에 대한 잠재력을 갖는다. ²¹²Bi는 α-입자 방출체이지만, 이의 짧은 반감기가 이의 직접적인 이용을 어렵게 만든다. ²¹²Pb는 ²¹²Bi의 부모 방사성 핵종이고, ²¹²Bi의 생체내 발생기로서 역할하여, ²¹²Bi의 짧은 반감기를 효과적으로 극복할 수 있다 (Yong and Brechbiel, Dalton Trans. 2001 June 21; 40(23)6068-6076).

²⁰³Pb는 영상 동위원소로서 유용하다. 따라서, ²⁰³Pb-DOTAM에 결합된 항체는 방사성면역영상 (RII)에서 유용성을 가질 수 있다.

일반적으로, 방사선금속은 킬레이트화된 형태로 이용된다. 본원 발명의 일정한 양상에서, DOTAM이 킬레이트화제로서 이용된다. DOTAM은 Pb(II)의 안정된 킬레이터이다 (Yong and Brechbiel, Dalton Trans. 2001 June 21; 40(23)6068-6076; Chappell et al Nuclear Medicine and Biology, Vol. 27, pp. 93-100, 2000). 따라서, DOTAM은 상기 논의된 바와 같은 납의 동위원소, 예컨대 ²¹²Pb 및 ²⁰³Pb와 병용하는 데 특히 유용하다.

일부 구체예에서, 이들 항체는 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들면, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하 또는 0.5pM 이하의 결합 친화성의 Kd 값으로 Pb-DOTAM에 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들면, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 Kd로, 방사성-표지된 화합물에 결합할 수 있다.

일정한 구체예에서, 이들 항체는 DOTAM에 의해 킬레이트화된 Bi에 추가적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 이들 항체는 1nM, 500pM, 200pM, 100pM, 50pM, 10pM 이하, 예를 들면, 9pM, 8pM, 7pM, 6pM, 5pM 이하의 결합 친화성의 Kd 값으로 Bi-DOTAM (다시 말하면, 본원에서 "Bi-DOTAM 킬레이트"로 또한 명명되는, 비스무트와 복합화된 DOTAM을 포함하는 킬레이트)에 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들면, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 Kd로 금속 킬레이트에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 이들 항체는 유사한 친화성으로 Bi-DOTAM 및 Pb-DOTAM에 결합할 수 있다. 예를 들면, Bi-DOTAM/Pb-DOTAM에 대한 친화성의 비율, 예를 들면, Kd 값의 비율은 0.1-10, 예를 들면 1-10의 범위 안에 있는 것이 바람직할 수 있다.

한 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 중쇄 가변 영역 형성 부분은 (a) GFSLSTYSMS (서열 번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) FIGSRGDTYYASWAKG (서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) ERDPYGGGAYPPHL (서열 번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함할 수 있다. Pb-DOTAM에 대한 결합 부위의 경쇄 가변 영역 형성 부분은 (d) QSSHSVYSDNDLA (서열 번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) QASKLAS (서열 번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) LGGYDDESDTYG (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개 또는 3개 모두의 CDR을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 이들 항체는 각각, 서열 번호: 1-6의 아미노산 서열과 비교하여 치환, 예를 들면, 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 CDR-H1, CDR-H2 및/또는 CDR-H3 중에서 하나 이상, 또는 CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 항체는 본원에서 설명된 바와 동일한 접촉 잔기를 공유할 수 있다: 예를 들면, 이들 잔기는 불변할 수 있다. 이들 잔기는 다음을 포함할 수 있다:

a) 중쇄 CDR2에서: Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58, 그리고 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg 54;

b) 중쇄 CDR3에서: Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99, Ala100C 및/또는 Tyr100D, 그리고 임의적으로 또한 Pro100E;

c) 경쇄 CDR1에서: Tyr28 및/또는 Asp32;

d) 경쇄 CDR3에서: Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및/또는 Tyr96;

e) 경쇄 CDR2에서: 임의적으로 Gln50;

이들 모두 Kabat에 따라서 넘버링됨.

예를 들면, 일부 구체예에서, CDR-H2는 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG (서열 번호: 2), 또는 서열 번호: 2에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있는데, 여기서 이들 치환은 Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg 54를 포함하지 않는다 (이들 모두 Kabat에 따라서 넘버링됨).

일부 구체예에서, CDR-H2는 아래에 도시된 바와 같은 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 여기에서 및 하기의 치환 표에서, 치환은 생식계열 잔기 (밑줄 표시됨)에 기초되거나, 또는 이론적으로 입체적으로 적합되고 그리고 또한 부위에서 결정화된 레퍼토리로 발생하는 아미노산에 의한다. 일부 구체예에서, 앞서 언급된 바와 같은 잔기는 고정될 수 있고, 다른 잔기는 아래의 표에 따라서 치환될 수 있다: 다른 구체예에서, 임의의 잔기의 치환이 아래의 표에 따라서 만들어질 수 있다.

임의적으로, CDR-H3은 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL (서열 번호: 3), 또는 서열 번호: 3에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있는데, 여기서 이들 치환은 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E를 포함하지 않고/않거나 임의적으로 또한 Tyr99를 포함하지 않는다. 예를 들면, 일부 구체예에서 치환은 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99 Ala100C 및 Tyr100D를 포함하지 않는다.

일정한 구체예에서, CDR-H3은 아래에 도시된 바와 같은 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 앞서 언급된 바와 같은 잔기는 고정될 수 있고, 다른 잔기는 아래의 표에 따라서 치환될 수 있다: 다른 구체예에서, 임의의 잔기의 치환이 아래의 표에 따라서 만들어질 수 있다.

임의적으로, CDR-L1은 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA (서열 번호: 4), 또는 서열 번호: 4에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있는데, 여기서 이들 치환은 Tyr28 및/또는 Asp32 (Kabat 넘버링)를 포함하지 않는다.

일정한 구체예에서, CDR-L1은 아래에 도시된 바와 같은 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 다시 한 번, 일부 구체예에서, 앞서 언급된 바와 같은 잔기는 고정될 수 있고, 다른 잔기는 아래의 표에 따라서 치환될 수 있다: 다른 구체예에서, 임의의 잔기의 치환이 아래의 표에 따라서 만들어질 수 있다.

임의적으로, CDR-L3은 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG (서열 번호: 6), 또는 서열 번호: 6에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있고, 여기서 이들 치환은 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및/또는 Tyr96 (Kabat)을 포함하지 않는다.

일정한 구체예에서, CDR-L3은 아래에 도시된 바와 같은 하기 위치에서 치환될 수 있다. (대부분의 잔기가 용매 노출되고 항원 접촉이 없기 때문에, 많은 치환이 상상될 수 있다). 다시 한 번, 일부 구체예에서, 앞서 언급된 바와 같은 잔기는 고정될 수 있고, 다른 잔기는 아래의 표에 따라서 치환될 수 있다: 다른 구체예에서, 임의의 잔기의 치환이 아래의 표에 따라서 만들어질 수 있다.

이들 항체는 각각 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 5의 서열을 임의적으로 갖는 CDR-H1 또는 CDR-L2, 또는 거기에 상대적인 적어도 1개, 2개 또는 3개의 치환, 임의적으로 보존성 치환을 갖는 이의 변이체를 더욱 포함할 수 있다.

따라서, Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분은 적어도:

a) 중쇄 CDR2로서, 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG (서열 번호: 2), 또는 서열 번호: 2에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg54를 포함하지 않는 중쇄 CDR2;

b) 중쇄 CDR3으로서, 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL (서열 번호: 3), 또는 서열 번호: 3에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E를 포함하지 않고/않거나 임의적으로 또한 Tyr99를 포함하지 않는 중쇄 CDR3을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 중쇄 가변 도메인은 중쇄 CDR1로서, 임의적으로:

c) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS (서열 번호: 1), 또는 서열 번호: 1에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1을 부가적으로 포함한다.

다른 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분은 적어도:

d) 경쇄 CDR1로서, 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA (서열 번호: 4), 또는 서열 번호: 4에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Tyr28 및 Asp32를 포함하지 않는 경쇄 CDR1;

e) 경쇄 CDR3으로서, 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG (서열 번호: 6), 또는 서열 번호: 6에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및 Tyr96을 포함하지 않는 경쇄 CDR3을 포함한다.

일부 구체예에서, 경쇄 가변 도메인은 경쇄 CDR2로서, 임의적으로:

f) 아미노산 서열 QASKLAS (서열 번호: 5), 또는 서열 번호: 5에서 적어도 1개, 2개 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하고 Gln50을 임의적으로 포함하지 않는 경쇄 CDR2를 부가적으로 포함한다.

상기 명시된 바와 같은 (예를 들면, 가변 도메인의) CDR을 포함하는 서열의 변이체를 포함하는, 본원 발명의 임의의 구체예에서, 단백질은 상기 명시된 바와 같은 CDR 잔기 중 하나 이상에서 불변할 수 있다.

임의적으로, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분 (첫 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 7 및 서열 번호 9, 또는 서열 번호: 7 또는 서열 번호: 9에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 결합 부위는 바람직하게는 본원에서 설명된 바와 같은 친화성으로 Pb-DOTAM에 결합하는 능력을 유지한다. VH 서열은 상기 명시된 바와 같은 불변 잔기를 유지할 수 있다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 7 또는 서열 번호 9에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, 상기 항체는 서열 번호: 7 또는 서열 번호: 9에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VH는 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 그리고 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

더 특정한 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분은 추가의 N 말단 아미노산, 바람직하게는 최초 인간 생식계열 서열로부터 N 말단 아미노산, 다시 말하면 서열 번호: 7 또는 서열 번호: 9 중 어느 하나에 대하여 Q (글루타민)에 상응하는 N 말단 아미노산과 함께, 상기 명시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 변이체 서열을 포함한다. 작제물의 원하는 발현 수준을 허용하는, 이러한 위치에서 다른 적합한 잔기는 당업자에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 적합한 대안 아미노산은 V 생식계열 유전자 내에 이러한 위치에서 자연 발생하는 다른 아미노산, 예컨대 E, K, R, S, T, A, L, 또는 Y일 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 E일 수 있다. 다른 구체예에서, 적합한 대안 아미노산은 보존성 치환 예컨대 D, N 또는 V일 수 있다.

따라서, 한 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분 (첫 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 7의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 7에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체, 예를 들면, 전술된 바와 같은 변이체를 포함하고, 추가의 N 말단 잔기를 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분 (첫 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 9의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 9에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체, 예를 들면, 전술된 바와 같은 변이체를 포함하고, 추가의 N 말단 잔기를 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 추가의 N 말단 아미노산은 Q, E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 또는 V로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 Q이다. 다른 구체예에서 추가의 N 말단 아미노산은 Q, E, K, R, S, T, A, L 또는 Y로 구성된 군, 또는 Q 또는 E로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 추가의 N 말단 아미노산은 Q, D, N 또는 V로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

다른 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분 (첫 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 143의 아미노산 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함하거나 또는 이것으로 구성된다. 대안으로, 이것은 서열 번호: 143에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 143의 N 말단의 Q 잔기는 불변할 수 있거나, 또는 당업자에 의해 확인될 수 있는, 상기 단백질에 대한 원하는 발현 수준을 야기하는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 한 구체예에서, 이것은 E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기에 의해 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 E, K, R, S, T, A, L 및 Y로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 E로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서, 중쇄 가변 도메인은 서열 번호: 143에 비하여 하나 이상의 치환을 갖지만 결실이 없는 서열 번호: 143의 변이체를 포함할 수 있다 - 따라서, 한 구체예에서, 이것은 단지 하나 이상의 치환에 의해서만 서열 번호: 143와 상이할 수 있고, 서열 번호: 143에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 가질 수 있다. VH 서열은 상기 명시된 바와 같은 CDR에서 불변 잔기를 더욱 유지할 수 있다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 143에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 변이 (예를 들면, 치환, 삽입 또는 결실)는 CDR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다.

임의적으로, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분 (두 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 8에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Pb-DOTAM 결합 부위는 바람직하게는 본원에서 설명된 바와 같은 친화성으로 Pb-DOTAM에 결합하는 능력을 유지한다. VL 서열은 상기 명시된 바와 같은 불변 잔기를 유지할 수 있다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 8에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, 항-Pb-DOTAM 항체는 서열 번호: 8에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL은 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

더 특정한 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분은 추가의 N 말단 아미노산, 바람직하게는 최초 인간 생식계열 서열로부터 N 말단 아미노산, 다시 말하면 서열 번호: 8에 대하여 A에 상응하는 N 말단 아미노산과 함께, 상기 명시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 변이체 서열을 포함한다. 작제물의 원하는 발현 수준을 허용하는, 이러한 위치에서 다른 적합한 잔기는 당업자에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 적합한 대안 아미노산은 V 생식계열 유전자 내에 이러한 위치에서 자연 발생하는 다른 아미노산, 예컨대 D, N, E, Q, S, V 또는 L일 수 있다. 다른 구체예에서, 적합한 대안 아미노산은 보존성 치환 예컨대 T, Y, K 또는 R일 수 있다.

따라서, 한 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분 (두 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 8에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체, 예를 들면, 전술된 바와 같은 변이체를 포함하고, 추가의 N 말단 잔기를 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 추가의 N 말단 아미노산은 D, N, E, Q, S, A, V, L, T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 A 또는 S이다. 다른 구체예에서 추가의 N 말단 아미노산은 D, N, E, Q, S, A, V 및 L로 구성된 군, 또는 A 및 S로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 추가의 N 말단 아미노산은 A, T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된다.

다른 구체예에서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분 (두 번째 항체 상에서)은 서열 번호: 144의 아미노산 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함하거나 또는 이것으로 구성된다. 대안으로, 이것은 서열 번호: 144에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함할 수 있는데, 여기서 서열 번호: 144의 N 말단의 A 잔기는 불변하거나 또는 당업자에 의해 확인될 수 있는 다른 적합한 아미노산에 의해 치환된다. 한 구체예에서, 이것은 D, N, E, Q, S, A, V, L, T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 D, N, E, Q, S, V 및 L로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 S로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서, 경쇄 가변 도메인은 서열 번호: 144에 비하여 하나 이상의 치환을 갖지만 결실이 없는 서열 번호: 144의 변이체를 포함할 수 있다 - 따라서, 한 구체예에서, 이것은 단지 하나 이상의 치환에 의해서만 서열 번호: 144와 상이할 수 있고, 서열 번호: 144에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 가질 수 있다. VL 서열은 상기 명시된 바와 같은 CDR에서 불변 잔기를 더욱 유지할 수 있다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 144에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 변이 (예를 들면, 치환, 삽입 또는 결실)는 CDR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다.

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 관련된 구체예는 명시적으로 조합으로 예기된다. 따라서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위는 첫 번째 항체와 두 번째 항체 각각에서, 앞서 규정된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 앞서 규정된 바와 같은 경쇄 가변 영역으로부터 형성될 수 있다.

임의적으로, Pb-DOTAM 킬레이트에 대해 특이적인 항원 결합 부위는 서열 번호: 7 또는 서열 번호: 9로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 앞서 규정된 바와 같은 이의 변이체 (상기 논의된 바와 같은 N 말단 확장을 갖는 변이체 포함)를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 그리고 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 앞서 규정된 바와 같은 이의 변이체 (상기 논의된 바와 같은 N 말단 확장을 갖는 변이체 포함)를 포함하는 경쇄 가변 도메인으로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, Pb-DOTAM 킬레이트에 대해 특이적인 항원 결합 부위는 서열 번호: 7의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 그리고 서열 번호: 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 이것은 서열 번호: 9의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 그리고 서열 번호: 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인 (이들 서열의 번역후 변형)을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, Pb-DOTAM 킬레이트에 대해 특이적인 항원 결합 부위는 143의 아미노산 서열 또는 앞서 규정된 바와 같은 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 그리고 서열 번호: 144의 아미노산 서열 또는 앞서 규정된 바와 같은 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인으로부터 형성될 수 있다.

임의의 상기 구체예에서, 항-Pb-DOTAM 결합 부위를 형성하는 경쇄와 중쇄 가변 영역은 인간화될 수 있다. 한 구체예에서, 경쇄와 중쇄 가변 영역은 임의의 상기 구체예의 경우에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역은 임의의 상기 구체예의 경우에서와 같은 CDR을 포함하고, vk 1 39 및/또는 vh 2 26으로부터 유래된 프레임워크 영역을 더욱 포함한다. vk 1 39의 경우에, 일부 구체예에서 복귀돌연변이가 없을 수 있다. vh 2 26의 경우에, 생식계열 Ala49 잔기가 Gly49로 복귀돌연변될 수 있다.

E. CEA에 대한 예시적인 항원 결합 부위

상기 논의된 구체예와 조합될 수 있는, 본원 발명의 다른 특정한 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 항체에 의해 결합된 표적 항원은 CEA (암배아 항원)일 수 있다. CEA에 대해 조성된 항체는 T84.66 및 이의 인간화와 키메라 버전, 예컨대 WO2016/075278 A1 및/또는 WO2017/055389에서 설명된 바와 같은T84.66-LCHA, CH1A1a (WO2012/117002 및 WO2014/131712에서 설명된 바와 같은 항-CEA 항체), 그리고 CEA hMN-14 또는 라베투주맙 (예를 들면 US 6 676 924 및 US 5 874 540에서 설명된 바와 같음)을 포함한다. CEA에 대한 다른 예시적인 항체는 A5B7 (예를 들면 M.J. Banfield et al, Proteins 1997, 29(2), 161-171에서 설명된 바와 같음), 또는 WO 92/01059 및 WO 2007/071422에서 설명된 바와 같이 뮤린 A5B7로부터 유래된 인간화 항체이다. 공동계류중인 출원 PCT/EP2020/067582를 또한 참조한다. A5B7의 인간화 버전의 실례는 A5H1EL1(G54A)이다. CEA에 대한 다른 예시적인 항체는 MFE23 및 US 7 626 011 및/또는 공동계류중인 출원 PCT/EP2020/067582에서 설명된 이의 인간화 버전이다. 항-CEA 항체의 또 다른 실례는 28A9이다. 이들, 또는 이들의 항원 결합 단편 중 임의의 것이 본원 발명에서 CEA 결합 모이어티를 형성하는 데 이용될 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 모이어티는 일가 결합에 대해 1nM 이하, 500pM 이하, 200pM 이하, 또는 100pM 이하의 K_D 값으로 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 항체는 CEA의 CH1A1a 에피토프, A5B7 에피토프, MFE23 에피토프, T84.66 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 중에서 적어도 하나는 가용성 CEA (sCEA) 상에 존재하지 않는 CEA 에피토프에 결합한다. 가용성 CEA는 GPI 포스포리파아제에 의해 개열되고 혈액 내로 방출되는 CEA 분자의 일부이다. 가용성 CEA에서 발견되지 않는 에피토프의 실례는 CH1A1A 에피토프이다. 임의적으로, 첫 번째 및/또는 두 번째 항체 중에서 하나는 가용성 CEA 상에 존재하지 않는 에피토프에 결합하고, 다른 것은 가용성 CEA 상에 존재하는 에피토프에 결합한다.

CH1A1a 및 이의 부모 뮤린 항체 PR1A3에 대한 에피토프는 WO2012/117002A1 및 Durbin H. et al., Proc. Natl. Scad. Sci. USA, 91:4313-4317, 1994에서 설명된다. CH1A1a 에피토프에 결합하는 항체는 CEA 분자의 B3 도메인 및 GPI 앵커 내에 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 가지 양상에서, 상기 항체는 본원에서 서열 번호: 25의 VH 및 서열 번호 26의 VL을 갖는 CH1A1a 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. A5B7 에피토프는 공동계류중인 출원 PCT/EP2020/067582에서 설명된다. A5B7 에피토프에 결합하는 항체는 CEA의 A2 도메인, 다시 말하면, 서열 번호: 141의 아미노산을 포함하는 도메인에 결합한다:

PKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGP YECGIQNKLSVDHSDPVILN (서열 번호: 141).

한 가지 양상에서, 상기 항체는 본원에서 서열 번호: 49의 VH 및 서열 번호: 50의 VL을 갖는 A5B7 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.

한 가지 양상에서, 상기 항체는 WO2016/075278에서 설명된 T84.66과 동일한 에피토프에 결합한다. 상기 항체는 본원에서 서열 번호: 17의 VH 및 서열 번호: 18의 VL을 갖는 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

MFE23 에피토프는 공동계류중인 출원 PCT/EP2020/067582에서 설명된다. MFE23 에피토프에 결합하는 항체는 CEA의 A1 도메인, 다시 말하면, 서열 번호: 142의 아미노산을 포함하는 도메인에 결합한다:

PKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTAS YKCETQNPVSARRSDSVILN (서열 번호: 142).

한 가지 양상에서, 상기 항체는 본원에서 서열 번호: 127의 VH 도메인 및 서열 번호: 128의 VL 도메인을 갖는 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 항체는 본원에서 제공된 항체, 예를 들면, P1AD8749, P1AD8592, P1AE4956, P1AE4957, P1AF0709, P1AF0298, P1AF0710 또는 P1AF0711와 동일한 CEA-에피토프에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 서로 CEA의 동일한 에피토프에 결합한다. 따라서, 예를 들면, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 둘 모두 CH1A1a 에피토프, A5B7 에피토프, MFE23 에피토프, T84.66 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 및/또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 A5B7 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 T84.66 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있다. 예시적인 서열은 본원에서 개시된다.

다른 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 CEA의 상이한 에피토프에 결합한다. 따라서, 예를 들면, i) 하나의 항체는 CH1A1A 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 항체는 A5B7 에피토프, T84.66 에피토프, MFE23 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있거나; ii) 하나의 항체는 A5B7 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A 에피토프, T84.66 에피토프, MFE23 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있거나; iii) 하나의 항체는 MFE23 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A 에피토프, A5B7 에피토프, T84.66 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있거나; iv) 하나의 항체는 T84.66 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A 에피토프, A5B7 에피토프, MFE23 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있거나; 또는 v) 하나의 항체는 28A9 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 항체는 CH1A1a 에피토프, A5B7 에피토프, MFE23 에피토프, 또는 T84.66 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, i) 하나의 항체는 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있고, 다른 항체는 A5B7 또는 이의 인간화 버전으로부터, T84.66 또는 이의 인간화 버전으로부터, MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터, 또는 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; ii) 하나의 항체는 A5B7 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A로부터, T84.66 또는 이의 인간화 버전으로부터, MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터, 또는 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; iii) 하나의 항체는 MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A로부터, A5B7 또는 이의 인간화 버전으로부터, T84.66 또는 이의 인간화 버전으로부터, 또는 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; iv) 하나의 항체는 T84.66 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A로부터, A5B7 또는 이의 인간화 버전으로부터, MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터, 또는 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; v) 하나의 항체는 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A로부터, A5B7 또는 이의 인간화 버전으로부터, T84.66 또는 이의 인간화 버전으로부터, 또는 MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있다.

특정한 구체예에서, 하나의 항체는 CH1A1A 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 항체는 A5B7 에피토프에 결합할 수 있다. 첫 번째 항체는 항체 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 두 번째 항체는 A5B7 (이의 인간화 버전 포함)로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체는 항체 A5B7 (이의 인간화 버전 포함)로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 두 번째 항체는 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있다.

다른 특정한 구체예에서, 하나의 항체는 CH1A1A 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 항체는 T84.66 에피토프에 결합할 수 있다. 첫 번째 항체는 항체 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 두 번째 항체는 T84.66 (이의 인간화 버전 포함)으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체는 항체 T84.66 (이의 인간화 버전 포함)으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 두 번째 항체는 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 첫 번째 항체는 T84.66 에피토프에 결합하고 및/또는 아래의 (i)에서 설명된 바와 같은 항원 결합 부위를 가질 수 있고, 두 번째 항체는 CH1A1A 에피토프에 결합하고 및/또는 아래의 (ii)에서 설명된 바와 같은 항원 결합 부위를 가질 수 있다.

예시적인 CEA 결합 서열 i)-v)이 아래에 개시된다. 이들은 i) T84.66, ii) CH1A1A, iii) A5B7, iv) 28A9 및 v) MFE23으로부터 (또는 이들의 인간화 버전으로부터) 유래된 CEA 결합 서열의 실례를 제공한다.

i). 한 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함할 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 13에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

임의의 상기 구체예에서, 다중특이적 항체는 인간화될 수 있다. 한 구체예에서, 항-CEA 항원 결합 부위는 임의의 상기 구체예의 경우에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 더욱 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 17에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 17에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VH는 (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 18에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열 번호: 18에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL은 (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VH, 그리고 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 17 및 서열 번호: 18 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.

ii). 추가의 특정 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함할 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 21에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 25에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 25에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VH는 (a) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 26에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열 번호: 26에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL은 (a) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VH, 그리고 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 25 및 서열 번호: 26 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.

iii) 추가의 특정 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, CDR-H1은 서열 GFTFTDYYMN (서열 번호: 149)을 가질 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, CDR-H1은 서열 GFTFTDYYMN (서열 번호: 149)을 가질 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 45에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CDR-H1은 서열 GFTFTDYYMN (서열 번호: 149)을 가질 수 있다.

다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, CDR-H1은 서열 GFTFTDYYMN (서열 번호: 149)을 가질 수 있다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 49에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 49에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VH는 (a) 서열 번호: 43 또는 서열 GFTFTDYYMN (서열 번호: 149)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 50에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열 번호: 50에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL은 (a) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VH, 그리고 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 49 및 서열 번호: 50 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.

iv) 또 다른 특정한 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함할 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 61에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 65에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 65에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VH는 (a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 66에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열 번호: 66에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL은 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VH, 그리고 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 65 및 서열 번호: 66 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.

v). 또 다른 특정한 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

임의적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 다음을 포함할 수 있다:

VH CDR 서열 (a) 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는

VL CDR 서열 (a) 서열 번호: 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.

한 구체예에서, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열 번호: 127의 아미노산 서열, 또는 (더 바람직하게는) 서열 번호: 129, 130, 131, 132, 133 또는 134에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 128의 아미노산 서열 또는 (더 바람직하게는) 서열 번호: 135, 136, 137, 138, 139 또는 140에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.

특정한 양상에서, CEA에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은

(a) 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(b) 서열 번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(c) 서열 번호: 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(d) 서열 번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(e) 서열 번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(f) 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(g) 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 a) 내지 g)에서 언급된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 a) 내지 g)에서 언급된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 CEA에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다.

다른 구체예에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VH, 그리고 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VL을 포함한다.

F. 다른 표적에 대한 예시적인 항원 결합 부위

상기 논의된 구체예 (예를 들면, DOTA 또는 DOTAM에 대한 결합 부위)와 조합될 수 있는, 본원 발명의 다른 특정한 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 항체에 의해 결합된 표적 항원은 GPRC5D 또는 FAP일 수 있다.

임의적으로, GPRC5D 또는 FAP에 결합하는 항원 결합 모이어티는 일가 결합에 대해 1nM 이하, 500pM 이하, 200pM 이하, 또는 100pM 이하의 K_D 값으로 결합할 수 있다.

예시적인 GPRC5D 결합 서열은 아래에 설명된다.

한 구체예에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

임의적으로, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함할 수 있다.

임의적으로, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다.

임의적으로, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 69에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 양상에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

임의의 상기 구체예에서, 다중특이적 항체는 인간화될 수 있다. 한 구체예에서, 항- GPRC5D 항원 결합 부위는 임의의 상기 구체예의 경우에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 더욱 포함한다.

다른 구체예에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 73의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 GPRC5D에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 73에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 73에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VH는 (a) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 74의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 GPRC5D에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 74에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, GPRC5D에 대한 항원 결합 부위는 서열 번호: 74에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL은 (a) 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VH, 그리고 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 73 및 서열 번호: 74 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.

예시적인 FAP 결합 서열은 아래에 설명된다.

한 구체예에서, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

임의적으로, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함할 수 있다.

임의적으로, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함한다.

임의적으로, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 77에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 양상에서, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

임의의 상기 구체예에서, 다중특이적 항체는 인간화될 수 있다. 한 구체예에서, 항- FAP 항원 결합 부위는 임의의 상기 구체예의 경우에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 더욱 포함한다.

다른 구체예에서, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 81의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 FAP에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 81에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 81에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VH는 (a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 서열 번호: 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 친화성으로 FAP에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 구체예에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 82에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역 (다시 말하면, FR)에서 일어난다. 임의적으로, FAP에 대한 항원 결합 부위는 서열 번호: 82에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL은 (a) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VH, 그리고 앞서 제공된 임의의 구체예의 경우에서와 같은 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 81 및 서열 번호: 82 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.

G. 항체 형식

전술된 바와 같이, 본원 발명은

i) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 더욱 포함하지만, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하지 않는 첫 번째 항체; 및

ii) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 더욱 포함하지만, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않는 두 번째 항체를 포함하는 항체 세트에 관계하고,

여기서 첫 번째 항체의 상기 VH 도메인 및 두 번째 항체의 상기 VL 도메인은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위를 함께 형성할 수 있다.

본원 발명의 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, Fc 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역의 존재는 방사면역요법 및 방사선영상의 맥락에서 유익성을 갖는다, 예를 들면 단백질의 순환 반감기를 연장하고 및/또는 더 작은 단편으로 관찰될 수 있는 것보다 더 높은 종양 흡수를 야기한다.

특정한 구체예에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 훨씬 특정한 구체예에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 S228P (Kabat 넘버링)을 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 특정한 구체예에서 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.

일부 구체예에서, Fc 영역은 효과기 기능을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 조작되는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 Fc 영역 잔기 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 및/또는 329 중 하나 이상, 예를 들면, 234, 235 및/또는 329 중 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 Pro 329의 Gly로의 치환, Leu 234의 Ala로의 치환 및/또는 Leu 235의 Ala로의 치환 (EU 색인에 따른 넘버링)을 포함하도록 조작될 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체가 연결될 때, 이들은 방사성-표지된 화합물에 대해 일가인 항체 복합체를 형성하는 것이 바람직할 수 있다 - 다시 말하면, 이들 2개의 연결된 항체는 방사성-표지된 화합물에 대한 일가 결합을 제공한다. 따라서, 첫 번째 항체 및 두 번째 항체가 함께, 방사성-표지된 화합물에 대한 단지 하나의 완전한 기능적 결합 부위만을 형성하도록, 첫 번째 항체는 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 단지 하나의 VH 도메인만을 포함할 수 있고, 두 번째 항체는 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 단지 하나의 VL 도메인만을 포함할 수 있다.

융합은 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들면, 펩티드 링커를 통해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 융합은 링커를 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, Fc 영역은 힌지 영역 또는 다른 적합한 링커를 통해 항원 결합 모이어티에 융합될 수 있다. 유사하게, 항체 구조의 나머지 부분에, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 또는 VH 도메인의 연결이 링커를 통해 만들어질 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 2개 내지 20개 아미노산의 펩티드일 수 있다. 다른 구체예에서, 링커는 적어도 5개 또는 적어도 10개 아미노산; 예를 들면, 5개 내지 100개, 5개 내지 70개, 5개 내지 60개 또는 5개 내지 50개; 또는 10개 내지 100개, 10개 내지 70개, 10개 내지 60개 또는 10개 내지 50개, 예를 들면, 25개 내지 50개 아미노산의 펩티드일 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 길이에서 15-30개 아미노산, 예를 들면, 길이에서 15-25개, 예를 들면, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 아미노산인 것이 바람직할 수 있다. 링커는 강성 링커 또는 유연한 링커일 수 있다. 일부 구체예에서, 이것은 Thr, Ser, Gly 및/또는 Ala 잔기를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 유연한 링커이다. 예를 들면, 이것은 Gly 및 Ser 잔기를 포함하거나 또는 이들로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 반복 모티프 예컨대 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 가질 수 있는데, 여기서 n은 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 다른 구체예에서 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm인데, 여기서 G = 글리신, S = 세린, 그리고 (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n= 2, 3, 4 또는 5, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3), 예를 들면, x = 4 및 n= 2 또는 3, 예를 들면, x = 4, n= 2이다. 다른 적합한 펩티드 링커는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하는데, 여기서 "n"은 일반적으로 1 및 10 사이, 전형적으로 2 및 4 사이의 숫자이다. 다른 구체예에서 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm인데, 여기서 G = 글리신, S = 세린, 그리고 (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n= 2, 3, 4 또는 5, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3), 예를 들면, x = 4 및 n= 2 또는 3, 예를 들면, x = 4, n= 2이다. 일부 구체예에서, 링커는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 31)일 수 있거나 또는 이것을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG (서열 번호: 150) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGS (서열 번호: 152) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG (서열 번호: 151)이거나, 또는 이것을 포함할 수 있다. 다른 예시적인 펩티드 링커는 EPKSC(D)-(G₄S)₂이다. 추가적으로, 항원 결합 모이어티가 Fc 도메인 아단위의 N 말단에 융합되는 경우에, 이것은 추가의 펩티드 링커와 함께 또는 이것 없이, 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 부분을 통해 융합될 수 있다. 다른 링커가 이용될 수 있고, 당업자에 의해 확인될 수 있었다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 y개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 링커 내에, y 위치에서 Ser (다시 말하면, 링커의 마지막/C 말단 아미노산으로서 Ser)이 y+2 아미노산 (다시 말하면, 링커 내에 마지막 아미노산으로부터 C 말단 방향으로 2개 잔기 상에 배치된 아미노산)의 성격에 따라서, 이러한 y+2 아미노산의 글리코실화를 유도할 수 있다고 결정하였다. 이런 이유로, 링커의 마지막 세린 잔기는 y-2 또는 y-3 위치에 배치되는 것이 바람직할 수 있다 (다시 말하면, 링커의 마지막 세린 잔기는 링커 내에 마지막 아미노산으로부터 N 말단 방향으로 2 또는 3개 아미노산의 위치에 있는 것이 바람직할 수 있다). 적합한 링커는 본원에서 설명된 바와 같은 임의의 신규한 링커이다. 일부 특정한 구체예에서, 링커는 Gly 및 Ser으로 이루어진 군에서 선택되는 y개의 연속 아미노산 잔기로 구성될 수 있는데, 예를 들면 여기서 y=5 내지 100, 5 내지 70, 5 내지 60, 5 내지 50, 10 내지 100, 10 내지 70, 10 내지 60, 또는 10 내지 50, 예를 들면, 15 내지 31 또는 15 내지 30, 예를 들면, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이고, 여기서 마지막 세린은 y-2 또는 y-3 위치에 있다. (따라서, y-2 위치에서 세린 및 y-1과 y 위치에서 글리신이 있을 수 있거나; 또는 y-3 위치에서 세린 및 y-2, y-1과 y 위치에서 글리신이 있을 수 있다). 일부 구체예에서 y=20 또는 21인 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 (GxS)n(GGSGG) 또는 (GxS)n(GGSGGG) (G = 글리신, S = 세린, x = 4, 그리고 n= 1 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 10, 2 내지 10, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9, 예를 들면, n=2 내지 5 또는 n=2 내지 4)인 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG (서열 번호: 150) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG (서열 번호: 151)일 수 있다.

상기에서 언급된 바와 같이, 일부 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 항체는 각각, 표적 항원 (예를 들면, 종양 관련 항원)에 대해 다가, 예를 들면, 이가일 수 있다. 이것은 결합능을 증가시키는 이점을 가질 수 있다. 이들 항체는 다가, 예를 들면, 이가일 수 있고, 각각, 특정 에피토프 (이것은 첫 번째 항체와 두 번째 항체에 대해 동일한 에피토프일 수 있거나, 또는 첫 번째 항체와 두 번째 항체에 대해 상이할 수 있다)에 대해 단일특이적일 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 첫 번째 항체는 i) 표적 항원의 동일한 에피토프에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개 이상의 항원 결합 모이어티, 예를 들면, 항체 단편, ii) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 어느 하나 (하지만 둘 모두는 아님), 그리고 iii) Fc 영역을 포함할 수 있다. 두 번째 항체는 i) 표적 항원의 동일한 에피토프에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개 이상의 항원 결합 모이어티, 예를 들면, 항체 단편, ii) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 어느 하나 (하지만 둘 모두는 아님), 그리고 iii) Fc 영역을 포함할 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 에피토프는 첫 번째 항체와 두 번째 항체에 대해 동일할 수 있거나, 또는 첫 번째 항체와 두 번째 항체에 대해 상이할 수 있다.

예를 들면, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, 펩티드 테더를 통해 연결되는 탠덤 Fab, 다시 말하면, 2개의 Fab 단편 (Fab-테더-Fab)을 포함할 수 있는데, 여기서 첫 번째 Fab가 자체의 C 말단을 통해 두 번째 Fab의 N 말단에 연결된다.

이런 구체예에서, 경쇄 및 이들의 개별 중쇄의 정확한 조립은 교차-mab 기술을 이용함으로써 보조될 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 각 항체는 하나의 Fab 및 하나의 교차-Fab를 포함하는 탠덤 Fab를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 Fab 및 교차-Fab에서 선택되는 하나의 단편은 첫 번째 에피토프에 대해 특이적이고, 다른 단편은 두 번째 에피토프에 대해 특이적이다.

임의의 탠덤 Fab 구체예 (교차-Fab를 수반하는 것들 포함)에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체에서 이들 Fab 단편을 연결하는 펩티드 테더/링커는 본원에서 설명된 바와 같은 임의의 링커일 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 적어도 5개 아미노산의 길이, 바람직하게는 5개 내지 100개, 더 바람직하게는 10개 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한 구체예에서 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm인데, 여기서 G = 글리신, S = 세린, 그리고 (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n= 2, 3, 4 또는 5, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4 및 n= 2 또는 3, 더 바람직하게는 x = 4, n= 2이다. 한 구체예에서 상기 펩티드 테더는 (G4S)₂이다. 다른 구체예에서 링커는 본원에서 설명된 바와 같은 신규한 링커일 수 있다.

특정한 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, a) Fc 도메인, b) 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티 및 c) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 어느 하나 (하지만 둘 모두는 아님)를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 여기서 (b)의 항원 결합 모이어티는 Fc 도메인의 한쪽 사슬의 N 말단에 융합되고, (c)의 폴리펩티드의 C 말단은 Fc 도메인의 다른 사슬의 N 말단에 융합된다. 일부 구체예에서, (b)의 항원 결합 모이어티의 C 말단은 Fc 도메인의 다른 사슬의 N 말단에 융합된다.

따라서, 첫 번째 항체는 다음을 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수 있고:

a) 제1와 두 번째 아단위를 포함하는 Fc 도메인;

이러한 형식은 분할 항원 결합 부위의 VH 도메인의 자유 C 말단을 방지하고, 따라서 이미 존재하는 인간 항-VH (HAVH) 자가항체를 수반하는 항약물 항체 반응에 대한 잠재력을 감소시킨다.

일부 구체예에서, 항원 결합 모이어티는 항체 단편인 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 이것은 Fab인 것이 바람직할 수 있다.

첫 번째 및/또는 두 번째 항체에서, 항원 결합 모이어티는 Fab이고, 상기 Fab는 자체 중쇄의 C 말단에 의해 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 N 말단에 융합되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, Fab 단편은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄, 그리고 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하고, CH1 도메인의 C 말단이 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 N 말단에 융합된다.

(b)의 항원 결합 모이어티, 예를 들면, 항체 단편의 융합은 바람직하게는 힌지 영역을 통해 이루어진다. (c)의 폴리펩티드의 융합은 폴리펩티드의 C 말단 및 Fc 영역의 N 말단 사이에 배치된 링커를 통해 및/또는 상부 힌지 영역의 일부 또는 전부 (예를 들면, EU 넘버링 색인에 따른 Asp221 및 거기에서 C 말단의 잔기)를 통해 이루어질 수 있다. 한 구체예에서, (b)의 항체 단편은 Fab 단편일 수 있다. 한 구체예에서, 첫 번째 항체에서, (c)의 폴리펩티드는 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인으로 구성되고; 두 번째 항체에서 (c)의 폴리펩티드는 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인으로 구성된다.

따라서, 한 구체예에서, 첫 번째 항체는 다음을 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수 있고:

i) 완전한 경쇄;

ii) 완전한 중쇄;

iii) 추가의 Fc 사슬; 및

iv) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드;

여기서 (i)의 경쇄 및 (ii)의 중쇄는 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 제공하고; 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해, 바람직하게는 링커를 거쳐 (iii)의 N 말단에 융합된다.

v) 완전한 경쇄;

vi) 완전한 중쇄;

vii) 추가의 Fc 사슬; 및

viii) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드;

여기서 (v)의 경쇄 및 (vi)의 중쇄는 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 제공하고; 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해, 바람직하게는 링커를 거쳐 (vii)의 N 말단에 융합된다.

링커는 당업자에게 공지된 바와 같은 또는 본원에서 설명된 바와 같은 임의의 유연한 링커를 포함할 수 있다, 예를 들면, 이것은 본원에서 설명된 바와 같은 신규한 링커, 예를 들면, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG (서열 번호: 150)일 수 있다. 링커는 상부 힌지 영역의 일부 또는 전부를 더욱 포함할 수 있다, 예를 들면, Asp221에서부터 Fc 사슬의 시작 (예를 들면, Cys226에서)까지 확장될 수 있다.

방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 불변 영역 (예를 들면, CH1 또는 CL)을 포함하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 또는 VL 도메인으로 구성될 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 표적 항원에 대해 단일특이적이고 일가이다, 다시 말하면, 이들 항체는 표적 항원에 대한 항체 결합 부위를 포함하는 단지 하나의 항원 결합 모이어티 (예컨대 항체 단편)를 포함한다.

다른 구체예에서, 이들은 하나 초과, 예를 들면, 2개의 항원 결합 모이어티 (예를 들면, 항체 단편)를 포함할 수 있다. 이들은 나란히 연결될 수 있다. 예를 들면, 구성요소 (b)는 첫 번째 Fab 단편 및 두 번째 Fab 단편을 포함하는 탠덤 Fab를 포함할 수 있는데, 여기서 첫 번째 Fab 단편은 자체의 C 말단에 의해 펩티드 링커를 거쳐 두 번째 Fab 단편의 N 말단에 연결된다 (그리고 여기서 두 번째 Fab 단편의 C 말단은 (a)의 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 N 말단에 연결된다). 일부 구체예에서, 첫 번째 Fab 단편은 표적 항원 A의 첫 번째 에피토프에 결합하고, 두 번째 Fab 단편은 표적 항원 A의 두 번째 에피토프에 결합한다. 임의적으로 제1와 두 번째 단편에서 선택되는, 이들 Fab 단편 중에서 하나는 전통적인 Fab이고, 다른 것은 교차-Fab 또는 scFab이다.

이종이합체성 중쇄의 정확한 조립은 노브 인투 홀 기술에 의해 보조될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "전장 항체"는 2개의 "전장 항체 중쇄" 및 2개의 "전장 항체 경쇄"로 구성되는 항체를 표시한다. "전장 항체 중쇄"는 N 말단에서 C 말단 방향으로, VH-CH1-HR-CH2-CH3으로서 약칭되는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1 (CH1), 항체 힌지 영역 (HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2 (CH2) 및 항체 중쇄 불변 도메인 3 (CH3); 그리고 하위부류 IgE의 항체의 경우에는 임의적으로 항체 중쇄 불변 도메인 4 (CH4)로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는 "전장 항체 중쇄"는 N 말단에서 C 말단 방향으로, VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 구성되는 폴리펩티드이다. 교차-Mab 형성의 가능성은 "전장"에 대한 언급에 의해 배제되는 것으로 의도되지 않는다 - 따라서, 중쇄는 VH 도메인이 VL 도메인과 교환되거나, 또는 CH1 도메인이 CL 도메인과 교환될 수 있다. "전장 항체 경쇄"는 N 말단에서 C 말단 방향으로, VL-CL로서 약칭되는 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL)으로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 대안으로, 교차-Mab의 경우에는, VL 도메인이 VH 도메인과 교환될 수 있거나, 또는 CL 도메인이 CH1 도메인과 교환될 수 있다. 항체 경쇄 불변 도메인 (CL)은 κ (카파) 또는 γ (람다)일 수 있다. 2개의 전장 항체 사슬은 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이에, 그리고 전장 항체 중쇄의 힌지 영역 사이에 폴리펩티드간 이황화 결합을 통해 함께 연결된다. 전형적인 전장 항체의 실례는 IgG (예를 들면 IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 자연 항체이다. 본원 발명에 따른 전장 항체는 단일 종 예를 들면 인간으로부터 유래될 수 있거나, 또는 이들은 키메라화 또는 인간화 항체일 수 있다. 본원에서 설명된 전장 항체는 한 쌍의 VH와 VL에 의해 각각 형성된 2개의 항원 결합 부위를 포함하는데, 이들은 일부 구체예에서 둘 모두 동일한 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 상이한 항원에 결합할 수 있다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에서 마지막 아미노산을 표시한다.

b) 하에 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 d) 하에 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)의 N 말단은 VH 또는 VL 도메인의 N 말단에서 마지막 아미노산을 표시한다.

다중특이적 항체를 만들기 위한 공지된 기술 또한, 본원에서 설명된 임의의 이종이합체를 만드는 데 이용될 수 있다. 이들 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (참조: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)) 및 "노브-인-홀" 조작 (참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,731,168 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997))을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다른 방법은 항체 Fc-이종이합체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 조작하는 방법 (참조: 예를 들면, WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 교차연결하는 방법 (참조: 예를 들면, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 류신 지퍼를 이용하는 방법 (참조: 예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605); 그리고 경쇄 오대합 문제를 회피하기 위해 공통 경쇄 기술을 이용하는 방법 (참조: 예를 들면, WO 98/50431)을 포함한다.

전술된 바와 같은 전장 항체의 CH3 도메인은 예를 들면 WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681에서 여러 실례로 상세하게 설명되는 "노브 인투 홀" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이러한 방법에서 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이들 2개의 CH3 도메인을 내포하는 양쪽 중쇄의 이종이합체화를 증가시키기 위해 변경된다. 2개의 CH3 도메인 (2개의 중쇄의) 각각은 "노브"일 수 있고, 반면 다른 것은 "홀"이다. 예를 들면, EU 색인 넘버링에 따라서, 하나는 이른바 "노브 돌연변이" (T366W, 그리고 임의적으로 S354C 또는 Y349C 중에서 하나)를 포함하고, 다른 것은 이른바 "홀 돌연변이" (T366S, L368A 및 Y407V, 그리고 임의적으로 Y349C 또는 S354C)를 포함한다 (참조: 예를 들면, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73).

이황화 다리의 도입이 이종이합체를 안정시키고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 그리고 수율을 증가시키기 위해 부가적으로 또는 대안적으로 이용될 수 있다.

따라서 일부 구체예에서 첫 번째 및/또는 두 번째 항체는 전장 항체의 한쪽 중쇄의 CH3 도메인 및 전장 항체의 다른 중쇄의 CH3 도메인이 각각, 이들 항체 CH3 도메인 사이의 본래 인터페이스를 포함하는 인터페이스에서 만나는 것으로 더욱 특징화되고; 여기서 상기 인터페이스는 항체의 형성을 증진하기 위해 변경되고, 여기서 상기 변경은

a) 항체 내에 다른 중쇄의 CH3 도메인의 본래 인터페이스와 만나는 한쪽 중쇄의 CH3 도메인의 본래 인터페이스 내에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 그것에 의하여 다른 중쇄의 CH3 도메인의 인터페이스 내에 공동에 위치 가능한 한쪽 중쇄의 CH3 도메인의 인터페이스 내에 융기가 생성되도록, 한쪽 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고,

그리고

b) 항체 내에 첫 번째 CH3 도메인의 본래 인터페이스와 만나는 두 번째 CH3 도메인의 본래 인터페이스 내에서, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 그것에 의하여 첫 번째 CH3 도메인의 인터페이스 내에 융기가 위치 가능한 두 번째 CH3 도메인의 인터페이스 내에 공동이 생성되도록, 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되는 것으로 특징화된다.

더 큰 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 임의적으로 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 더 작은 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 임의적으로 알라닌 (a), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

임의적으로, 일부 구체예에서, 양쪽 CH3 도메인은 양쪽 CH3 도메인 사이에 이황화 다리가 형성될 수 있도록, 각 CH3 도메인의 상응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인 (C)의 도입에 의해 더욱 변경된다.

본원 발명의 다중특이적 (예를 들면, 이중파라토픽) 항체는 결합 팔 중 하나 (또는, 2개 초과의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에는, 하나 초과)에서 VH/VL 교환을 갖는 Fab 기반 이중특이적/다중특이적 항원 결합 분자의 생산에서 발생할 수 있는, 경쇄와 비-정합 중쇄의 오대합 (Bence-Jones-유형 부산물)을 감소시키는 데 특히 효율적인, 그 안에 포함된 Fab 분자 (교차-Fab 분자 포함)에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다 (본원에서 온전히 참조로서 편입되는 PCT 공개 번호 WO 2015/150447, 특히 그 안에 실시예를 또한 참조한다). 결합 팔 중 하나에서 발생하는 바람직하지 않은 부산물, 특히 Bence Jones-유형 부산물과 비교하여 원하는 다중특이적 항체의 비율은 Fab 분자의 CH1과 CL 도메인 내에 특정한 아미노산 위치에서 반대 전하로 하전된 아미노산의 도입 (때때로 본원에서 "전하 변경"으로서 지칭됨)에 의해 향상될 수 있다.

이런 이유로, 일부 구체예에서, Fab 분자를 포함하는 본원 발명의 항체는 본원에서 설명된 바와 같은 전하 변경을 포함하는 중쇄 불변 도메인 CH1 도메인, 그리고 본원에서 설명된 바와 같은 전하 변경을 포함하는 경쇄 불변 CL 도메인을 갖는 적어도 하나의 Fab를 포함한다.

전하 변경은 본원 발명의 항체 내에 포함된 전통적인 Fab 분자(들), 또는 본원 발명의 항체 내에 포함된 교차 Fab 분자(들) 중 어느 하나 (하지만 둘 모두는 아님)에서 만들어질 수 있다. 특정한 구체예에서, 전하 변경은 본원 발명의 항체 내에 포함된 전통적인 Fab 분자(들)에서 만들어진다.

일부 구체예에서, 전하 변경을 포함하는 경쇄 불변 도메인 CL 및 전하 변경을 포함하는 중쇄 불변 도메인 CH1을 포함하는 Fab 또는 교차-Fa에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서 전하 변경은 위치 124 및 임의적으로 위치 123 (Kabat에 따른 넘버링)에 있고, 중쇄 불변 도메인 CH1에서 전하 변경은 위치 147 및/또는 213 (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에 있다. 일부 구체예에서, 경쇄 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산은 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (Kabat에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 (바람직한 구체예에서 리신 (K)에 의해 독립적으로) 치환되고, 중쇄 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 및/또는 위치 213에서 아미노산은 글루타민산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.

H. 예시적인 항체

표적 결합 (예를 들면, CEA 결합, FAP 결합 또는 GPRC5D 결합)에 관련된 양상과 구체예 및 DOTA 결합에 관련된 양상과 구체예는 일부 구체예에서 조합될 수 있다. 다시 말하면, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, 예를 들면, 전술된 바와 같은 임의의 서열을 포함하는, CEA, FAP 또는 GPRC5D에 대한 결합 부위를 포함하고, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 연결되어 전술된 바와 같은 임의의 서열을 갖는, DOTA 킬레이트에 대한 결합 부위를 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, CEA 결합, FAP 또는 GPRC5D 및/또는 DOTA 결합에 관련된 양상과 구체예는 전술된 바와 같은 항체에 대한 바람직한 형식과 조합될 수 있는 것으로 명시적으로 예기된다 - 다시 말하면, 임의의 바람직한 형식에서, 표적 항원에 결합하는 부분은 전술된 바와 같은 CDR 또는 가변 영역 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 방사성 핵종-표지화 화합물에 결합하는 부분은 전술된 바와 같은 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 갖는 DOTA 결합체일 수 있다.

유사하게, 표적 결합 (예를 들면, CEA 결합, FAP 결합 또는 GPRC5D 결합)에 관련된 양상과 구체예 및 Pb-DOTAM 결합에 관련된 양상과 구체예는 일부 구체예에서 조합될 수 있다. 다시 말하면, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, 예를 들면, 전술된 바와 같은 임의의 서열을 포함하는, CEA, FAP 또는 GPRC5D에 대한 결합 부위를 포함하고, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 연결되어 전술된 바와 같은 임의의 서열을 갖는, Pb-DOTAM 킬레이트에 대한 결합 부위를 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, CEA 결합, FAP 또는 GPRC5D 및/또는 Pb-DOTAM 결합에 관련된 양상과 구체예는 전술된 바와 같은 항체에 대한 바람직한 형식과 조합될 수 있는 것으로 명시적으로 예기된다 - 다시 말하면, 임의의 바람직한 형식에서, 표적 항원에 결합하는 부분은 전술된 바와 같은 CDR 또는 가변 영역 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 방사성 핵종-표지화 화합물에 결합하는 부분은 전술된 바와 같은 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 갖는 Pb-DOTAM 결합체일 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체는 다음을 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수 있고:

a) 제1와 두 번째 아단위를 포함하는 Fc 도메인;

b) CEA, GPRC5D, FAP에서 선택되는 표적 항원, 임의적으로 CEA에 대한 항체 결합 부위를 포함하는 항체 단편; 및

c) Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 여기서 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 1-3의 중쇄 CDR을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 143에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖고;

여기서 (b)의 항체 단편은 (a)의 Fc 도메인의 첫 번째 아단위의 N 말단에 융합되고, (c)의 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해 (a)의 Fc 도메인의 두 번째 아단위의 N 말단에 융합되고,

Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH)의 경우에, 본 발명자들은 N 말단 잔기 예컨대 N 말단 Q가 서열 번호: 7에 부가될 수 있고 양질의 발현을 야기할 수 있다고 결정하였다. DOTAM에 대한 항원 결합 부위가 토끼 항체로부터 최초 개발되었고, 인간화 과정 동안, 토끼 서열과 유사하도록 인간 생식계열 서열의 N 말단 잔기가 제거되었다. N 말단의 Q 잔기는 인간 생식계열 서열로부터 유래된 본래 N 말단 잔기의 재삽입을 나타낸다. 따라서, 중쇄 가변 도메인이 서열 번호: 143의 변이체인 경우에, N 말단의 Q 잔기는 불변할 수 있거나, 또는 당업자에 의해 확인될 수 있었던, 상기 단백질에 대한 양질의 발현 수준을 제공하는 다른 적합한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 한 구체예에서, 이것은 E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 E, K, R, S, T, A, L 및 Y로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 E로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다.

a) 제1와 두 번째 아단위를 포함하는 Fc 도메인;

c) Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호: 4-6의 CDR을 포함하고 및/또는 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 8에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖고; 및/또는 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 144에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖고;

Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)의 경우에, 본 발명자들은 추가의 N 말단 잔기 예컨대 N 말단 A 또는 S가 서열 번호: 8에 부가될 수 있고 양질의 발현을 제공할 수 있다고 결정하였다. N 말단의 A 잔기는 인간 생식계열 서열로부터 유래된 본래 N 말단 잔기의 재삽입을 나타낸다. Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)이 서열 번호 144의 변이체인 경우에, N 말단의 A 잔기는 불변할 수 있거나, 또는 당업자에 의해 확인될 수 있었던 다른 적합한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 한 구체예에서, 이것은 D, N, E, Q, S, A, V, L, T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 D, N, E, Q, S, V 및 L로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 S로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서 이것은 T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 잔기로 치환될 수 있다.

특정한 구체예에서, 첫 번째 항체는 하기 펩티드를 포함할 수 있고:

i) 완전한 경쇄;

ii) 완전한 중쇄;

iii) 추가의 Fc 사슬; 및

iv) Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 여기서 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 1-3의 중쇄 CDR을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 143에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖고;

여기서 (i)의 경쇄 및 (ii)의 중쇄는 표적 항원, 예를 들면, CEA, GPRC5D 또는 FAP, 임의적으로 CEA에 대한 항원 결합 부위를 함께 제공하고; 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해, 바람직하게는 링커를 거쳐 (iii)의 N 말단에 융합된다.

v) 완전한 경쇄;

vi) 완전한 중쇄;

vii) 추가의 Fc 사슬; 및

viii) Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호: 4-6의 CDR을 포함하고 및/또는 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 8에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖고 및/또는 여기서 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 144에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖고;

여기서 (v)의 경쇄 및 (vi)의 중쇄는 표적 항원, 예를 들면, CEA, GPRC5D 또는 FAP, 임의적으로 CEA에 대한 항원 결합 부위를 함께 제공하고; 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해, 바람직하게는 링커를 거쳐 (vii)의 N 말단에 융합된다.

임의의 상기 구체예에서, 첫 번째 항체는 항체 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들면, 완전한 경쇄는 서열 번호 22-24의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호 26에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 서열 번호 34에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

완전한 중쇄는 서열 번호: 19-21의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 완전한 중쇄는 서열 번호 25에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

다른 특정한 구체예에서, 첫 번째 항체는 항체 A5B7 (이의 인간화 버전 포함)로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들면, 완전한 경쇄는 서열 번호 46-48의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호 50에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 서열 번호: 54에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 완전한 중쇄는 서열 번호: 43-45의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호 49에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

다른 특정한 구체예에서, 첫 번째 항체는 항체 T84.66 (이의 인간화 버전 포함)으로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들면, 완전한 경쇄는 서열 번호 14-16의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호 18에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 서열 번호: 89에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 완전한 중쇄는 서열 번호: 11-13의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호 17에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

다른 특정한 구체예에서, 첫 번째 항체는 항체 28A9 (이의 인간화 버전 포함)로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들면, 완전한 경쇄는 서열 번호 62-64의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호: 66에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 서열 번호: 96에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 완전한 중쇄는 서열 번호: 59-61의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호 65에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 두 번째 항체는 항체 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 완전한 중쇄는 서열 번호: 19-21의 CDR을 포함하고 및/또는 서열 번호 25에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다.

다른 특정한 구체예에서, 두 번째 항체는 A5B7 (이의 인간화 버전 포함)로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들면, 완전한 경쇄는 서열 번호 46-48의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호 50에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 서열 번호 58에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 완전한 중쇄는 서열 번호: 43-45의 CDR을 포함하고 및/또는 서열 번호 49에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다.

다른 특정한 구체예에서, 두 번째 항체는 항체 T84.66 (이의 인간화 버전 포함)으로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

다른 특정한 구체예에서, 두 번째 항체는 항체 28A9 (이의 인간화 버전 포함)로부터 유래된 CEA 결합 서열 (다시 말하면, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들면, 완전한 경쇄는 서열 번호 62-64의 CDR을 포함할 수 있고 및/또는 서열 번호 66에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 이것은 서열 번호: 96에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 CEA의 동일한 에피토프에 결합한다. 따라서, 예를 들면, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 항체 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 A5B7 (이의 인간화 버전 포함)로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 T84.66 (이의 인간화 버전 포함)으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 28A9 (이의 인간화 버전 포함)로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체와 두 번째 항체 둘 모두 MFE23 (이의 인간화 버전 포함)으로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, (ii)에서 경쇄 폴리펩티드는 (v)에서 경쇄와 동일한 서열을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

다른 구체예에서, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 상기 논의된 바와 같이, CEA의 상이한 에피토프에 결합한다. 따라서, 예를 들면, 첫 번째 항체는 항체 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고 두 번째 항체는 A5B7로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있거나; 또는, 첫 번째 항체는 항체 A5B7로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고 두 번째 항체는 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있다.

또 다른 특정한 구체예에서, 표적이 CEA일 수 있고, 예를 들면, 항체 CH1A1A로부터 유래된 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 형식이 도 25C에서 도시된 바와 같을 수 있다. 임의적으로, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 연결되어 Pb-DOTAM 킬레이트 (Pb-DOTAM)에 대한 기능적 항원 결합 부위를 형성한다.

따라서, 한 가지 실례에서:

i) 첫 번째 항체는 서열 번호: 112의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 114의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 115의 경쇄를 포함하고;

ii) 두 번째 항체는 서열 번호: 112의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 113의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 115의 경쇄를 포함한다.

바람직한 구체예에서:

i) 첫 번째 항체는 서열 번호: 112의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 146의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 115의 경쇄를 포함하고;

ii) 두 번째 항체는 서열 번호: 112의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 145의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 115의 경쇄를 포함한다.

I. 항체 변이체

일정한 구체예에서, 본원에서 제시된 항체의 아미노산 서열 변이체가 예기된다. 예를 들면, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 이들 서열 내로 삽입 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예컨대 항원 결합을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.

치환, 삽입 및 결실 변이체

일정한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심되는 부위는 HVR (CDR) 및 FR을 포함한다. 보존성 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 표 1에서 도시된다. 더 실제적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제하에 표 1에서 제공되고, 아미노산 측쇄 부류에 관하여 아래에 더욱 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 항체 내로 도입될 수 있고, 산물은 원하는 활성, 예를 들면, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 감소되거나 또는 제거된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별검사될 수 있다.

본래 잔기	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala (a)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu ; Val ; Met ; Ala ; Phe ; 노르류신	Leu
Leu (L)	노르류신 ; Ile ; Val ; Met ; Ala ; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile ; Leu ; Met ; Phe ; Ala ; 노르류신	Leu

아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 군화될 수 있다:

(1) 소수성 : 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향정위에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류로 교체하는 것을 수반할 것이다.

치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다 (예를 들면, 인간화 또는 인간 항체). 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 결과의 변이체(들)는 부모 항체에 비하여 일정한 생물학적 특성에서 변경 (예를 들면, 향상) (예를 들면, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)을 가질 것이고 및/또는 부모 항체의 실제적으로 유지된 일정한 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체인데, 이것은 예를 들면, 파지 전시 기반 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에서 설명된 것들을 이용하여 편의하게 생성될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지에서 전시되고 특정 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)에 대해 선별검사된다.

예를 들면, 항체 친화성을 향상시키기 위해 CDRs에서 변경 (예를 들면, 치환)이 만들어질 수 있다. 이런 변경은 CDR "핫스팟", 다시 말하면, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (참조: 예를 들면, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 및/또는 항원에 접촉하는 잔기에서 만들어질 수 있으며, 결과의 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 검사된다. 이차 라이브러리를 구축하고 이들로부터 재선별함에 의한 친화성 성숙은 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)에서 설명되었다. 친화성 성숙의 일부 양상에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들면, 오류 가능성 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이)에 의해, 성숙을 위해 선택된 가변적 유전자 내로 도입된다. 이차 라이브러리가 이후 창출된다. 상기 라이브러리는 이후, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별검사된다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 CDR-지향된 접근법을 수반하는데, 여기서 여러 CDR 잔기 (예를 들면, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 CDR 잔기는 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.

일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 이상의 CDR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성을 실제적으로 감소시키지 않는 보존성 변경 (예를 들면, 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 CDR에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 예를 들면, CDR에서 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 앞서 제공된 일정한 변이체 VH와 VL 서열에서, 각 CDR은 변경되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 내포한다.

돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)이 확인되고, 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가 치환은 초기 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항원 항체 복합체의 결정 구조는 항체 및 항원 사이의 접촉 포인트를 확인하는 데 이용될 수 있다. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 내포하는지를 결정하기 위해 선별검사될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들면, ADEPT (항체 지향된 효소 전구약물 요법)의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N 또는 C 말단에 융합을 포함한다.

글리코실화 변이체

일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변형된다. 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 창출되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변형함으로써 편의하게 달성될 수 있다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 거기에 부착된 올리고당류는 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 선천적 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연쇄에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 바이안테나리 올리고당류를 포함한다. 참조: 예를 들면, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당류는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고당류 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본원 발명의 항체에서 올리고당류의 변형은 일정한 향상된 특성을 갖는 항체 변이체를 창출하기 위해 만들어질 수 있다.

한 양상에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 비-푸코실화된 올리고당류, 다시 말하면 올리고당류 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이런 비-푸코실화된 올리고당류 ("비푸코실화된" 올리고당류로서 또한 지칭됨)는 특히 N-연결된 올리고당류인데, 이것은 바이안테나리 올리고당류 구조의 줄기에서 첫 번째 GlcNAc에 부착된 푸코오스 잔기를 결여한다. 한 양상에서, 선천적 또는 부모 항체와 비교하여 Fc 영역에서 증가된 비율의 비-푸코실화된 올리고당류를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 비-푸코실화된 올리고당류의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 또는 심지어 약 100% (다시 말하면, 푸코실화된 올리고당류가 존재하지 않는다)일 수 있다. 비-푸코실화된 올리고당류의 백분율은 예를 들면 WO 2006/082515에서 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 계측될 때, Asn 297에 부착된 모든 올리고당류의 합계 (예를 들면 복합체, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조)에 비하여, 푸코오스 잔기를 결여하는 올리고당류의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역 내에 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에서 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭하고; 하지만, Asn297은 또한, 항체에서 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297의 대략 ± 3개 아미노산 상류 또는 하류에, 다시 말하면, 위치 294 및 300 사이에 위치될 수 있다. Fc 영역에서 증가된 비율의 비-푸코실화된 올리고당류를 갖는 이런 항체는 향상된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 향상된 효과기 기능, 특히 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참조: 예를 들면, US 2003/0157108; US 2004/0093621.

감소된 푸코실화를 갖는 항체를 생산할 수 있는 세포주의 실례는 단백질 푸코실화에서 결함되는 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 그리고 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참조: 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO 2003/085107), 또는 GDP-푸코오스 합성 또는 전달체 단백질의 감소된 또는 전폐된 활성을 갖는 세포 (참조: 예를 들면, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282)를 포함한다.

추가의 양상에서, 항체 변이체는 양분된 올리고당류가 제공되는데, 예를 들면, 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고당류는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이런 항체 변이체는 전술된 바와 같이 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체의 실례는 예를 들면 Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에서 설명된다.

올리고당류 내에 적어도 하나의 갈락토오스 잔기가 Fc 영역에 부착되는 항체 변이체 역시 제공된다. 이런 항체 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에서 설명된다.

항체는 글리코실화의 정도가 감소하도록 변형되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서 항체는 비글리코실화되거나 또는 데글리코실화될 수 있다. 항체는 N297에서 치환, 예를 들면, N297D/A를 포함할 수 있다.

Fc 영역 변이체

일정한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어, Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

일정한 구체예에서, 본원 발명은 감소된 효과기 기능, 예를 들면, 감소되거나 또는 제거된 CDC, ADCC 및/또는 FcγR 결합을 갖는 항체 변이체를 예기한다. 일정한 양상에서, 본원 발명은 전부는 아니지만 일부 효과기 기능을 소유하는 항체 변이체를 예기하는데, 이들 기능으로 인해 이것은 생체내에서 항체의 반감기가 중요하고, 반면 일정한 효과기 기능 (예를 들면, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC))이 불필요하거나 또는 유해한 적용을 위한 바람직한 후보가 된다.

CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확증하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들면, 항체가 FcγR 결합을 결여 (따라서, ADCC 활성을 아마도 결여)하지만, FcRn 결합 능력을 유지하도록 담보하기 위해, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지 상에 표 3에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위한 시험관내 검정의 무제한적 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362 (예를 들면, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)을 참조한다) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)을 참조한다)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유세포분석법의 경우에 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96^® 비방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)을 참조한다. 이런 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예컨대 Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확증하기 위해, C1q 결합 검정 또한 실행될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 사정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 소실/반감기 결정이 또한, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 Al).

감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 (U.S. 특허 번호 6,737,056) 중에서 하나 이상의 치환, 예를 들면, P329G을 갖는 것들을 포함한다. 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).

일정한 양상에서, 항체 변이체는 FcγR 결합을 축소하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 234 및 235 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 가지 양상에서, 치환은 L234A 및 L235A (LALA)이다. 일정한 양상에서, 항체 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 D265A 및/또는 P329G를 더욱 포함한다. 한 가지 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 L234A, L235A 및 P329G (LALA-PG)이다. (참조: 예를 들면, WO 2012/130831). 다른 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 L234A, L235A 및 D265A (LALA-DA)이다. 대안적 치환은 임의적으로 D265A 및/또는 P329G 및/또는 P331S와 조합으로, L234F 및/또는 L235E를 포함한다.

다른 구체예에서, 감소된 효과기 기능을 갖는 IgG 아형 예컨대 IgG4 또는 IgG2를 이용하는 것이 가능할 수 있다.

FcR에 향상된 또는 축소된 결합을 갖는 일정한 항체 변이체가 설명된다. (참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 그리고 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

일부 구체예에서, 예를 들면, US 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (다시 말하면, 향상된 또는 축소된, 바람직하게는 축소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 야기하는, Fc 영역 내에 변경이 만들어진다.

일정한 양상에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 Fc 영역의 위치 253 및/또는 310 및/또는 435 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일정한 양상에서, 항체 변이체는 위치 253, 310 및 435에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 가지 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 I253A, H310A 및 H435A이다. 참조: 예를 들면, Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

일정한 양상에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 Fc 영역의 위치 310 및/또는 433 및/또는 436 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일정한 양상에서, 항체 변이체는 위치 310, 433 및 436에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 가지 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 H310A, H433A 및 Y436A이다. (참조: 예를 들면, WO 2014/177460 Al). 예를 들면, 일부 구체예에서, 보통의 FcRn 결합이 이용될 수 있다.

Fc 영역 변이체의 다른 실례와 관련하여, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 번호 5,648,260; U.S. 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 또한 참조한다.

본원에서 보고된 바와 같은 전장 항체의 중쇄의 C 말단은 아미노산 잔기 PGK로 끝나는 완전한 C 말단일 수 있다. 중쇄의 C 말단은 C 말단 아미노산 잔기 중에서 1개 또는 2개가 제거된 단축된 C 말단일 수 있다. 중쇄의 C 말단은 PG로 끝나는 단축된 C 말단일 수 있다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 양상 중 한 양상에서, 본원에서 특정된 바와 같은 C 말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C 말단 글리신 잔기 (G446, 아미노산 위치의 EU 색인 넘버링)를 포함한다. 이것은 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "전장 항체" 또는 "전장 중쇄"에 여전히 명시적으로 포괄된다.

항체 유도체

일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 당해 분야에서 공지되고 쉽게 가용한 추가의 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 무제한적 실례는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인해, 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 또는 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착되면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 숫자 및/또는 유형은 향상되는 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 이용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.

J. 재조합 방법과 조성물

항체는 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 방법과 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 본원에서 설명된 항체 세트를 인코딩하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산 세트가 제공된다.

예를 들면, 핵산 세트는 첫 번째 항체를 인코딩하는 하기 핵산을 포함할 수 있다:

i) 첫 번째 항체의 첫 번째 중쇄를 인코딩하는 핵산으로서, 여기서 상기 첫 번째 중쇄는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄를 포함하고;

ii) 첫 번째 항체의 두 번째 중쇄를 인코딩하는 핵산으로서, 여기서 상기 두 번째 중쇄는 N 말단에서 C 말단으로, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인; 임의적 링커; 및 Fc 아단위 (예를 들면, CH2-CH3)를 포함하고;

iii) 첫 번째 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산.

본원 발명에 따른 핵산 세트는 두 번째 항체를 인코딩하는 하기 핵산을 부가적으로 또는 대안으로 포함할 수 있다:

iv) 두 번째 항체의 첫 번째 중쇄를 인코딩하는 핵산으로서, 여기서 상기 첫 번째 중쇄는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄를 포함하고;

v) 두 번째 항체의 두 번째 중쇄를 인코딩하는 핵산으로서, 여기서 상기 두 번째 중쇄는 N 말단에서 C 말단으로, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인; 임의적 링커; 및 Fc 아단위 (예를 들면, CH2-CH3)를 포함하고; 및

iii) 두 번째 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산.

일부 구체예에서, 일정한 이들 핵산은 서로 동일할 수 있다. 예를 들면, (iii)에서 핵산은 전체 세트가 단지 5개의 구별되는 핵산 서열을 포함하도록, (vi)의 경우에서와 동일할 수 있다.

이들 핵산은 하나 이상의 핵산 분자 또는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

따라서, 추가의 구체예에서, 이런 핵산(들)을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 한 구체예에서, 각 개별 중쇄와 경쇄는 개별 플라스미드로부터 발현된다.

추가의 구체예에서, 이런 핵산(들) 또는 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포 세트가 제공된다. 한 구체예에서, 첫 번째 항체를 발현하는 첫 번째 숙주 세포가 제공되고, 두 번째 항체를 발현하는 두 번째 숙주 세포가 제공된다.

이와 같은 한 가지 구체예에서, 첫 번째 숙주 세포는 첫 번째 항체의 핵산을 집합적으로 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다 (예를 들면, 상기 벡터로 형질전환되었다). 두 번째 숙주 세포는 두 번째 항체의 핵산을 집합적으로 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다 (예를 들면, 상기 벡터로 형질전환되었다).

한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 구체예에서, 본원 발명에 따른 항체를 만드는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 상기 제시된 바와 같은 항체의 발현에 적합한 조건하에, 상기 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 그리고 임의적으로, 상기 항체를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.

항체의 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 핵산은 전통적인 절차를 이용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다.

항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들면, US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523을 참조한다. (대장균 (E. coli)에서 항체 단편의 발현을 설명하는, Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254를 또한 참조한다). 발현 후, 항체는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다.

원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

(글리코실화된) 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다.

식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIES^TM 기술을 설명).

척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에서 설명된 바와 같은 293 또는 293T 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에서 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562); TRI 세포 (예를 들면, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에서 설명된 바와 같이); MRC 5 세포; 그리고 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 그리고 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참조한다.

한 양상에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.

K. 검정

본원에서 제공된 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 검정에 의해, 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 선별검사되거나, 또는 특징화될 수 있다.

한 양상에서, 본원 발명의 항체는 예를 들면, 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 항원 결합 활성에 대해 검사된다.

항체 친화성

일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10^-8M 이하, 예를 들면 10^-8M 내지 10^-13M, 예를 들면 10^-9M 내지 10^-13 M)의, 또는 본원에서 별도로 명시된 바와 같은, 표적 항원에 대한 해리 상수 (K_D)를 갖는다.

일정한 구체예에서, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10^-8 M 이하, 예를 들면, 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들면, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의, 방사성-표지된 화합물에 대한 해리 상수 (K_D)를 갖는다. 일부 구체예에서, K_D는 1 nM 이하, 500pM 이하, 200pM 이하, 100pM 이하, 50pM 이하, 20pM 이하, 10pM 이하, 5pM 이하 또는 1pM 이하이거나, 또는 본원에서 별도로 명시된 바와 같다. 예를 들면, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들면, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 K_D로 방사성-표지된 화합물/금속 킬레이트에 결합할 수 있다.

한 구체예에서, K_D는 방사성-표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 계측된다. 한 구체예에서, RIA는 관심되는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원으로 수행된다. 예를 들면, 항원에 대한 Fab의 용해 결합 친화성은 표지화되지 않은 항원의 적정 연속의 존재에서 Fab를 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지화 항원과 평형시키고, 이후 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 평판으로 포획함으로써 계측된다 (참조: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). 검정을 위한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER^® 다중웰 평판 (Thermo Scientific)이 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 동안 코팅되고, 차후에, 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5 시간 동안 PBS에서 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비흡착성 평판 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원이 관심되는 Fab의 연속 희석액과 혼합된다 (예를 들면, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 사정과 일치). 관심되는 Fab는 이후, 하룻밤 동안 항온처리된다; 하지만, 항온처리는 평형이 도달되도록 담보하기 위해 더 긴 기간 (예를 들면, 약 65 시간) 동안 계속될 수도 있다. 그 후에, 혼합물이 실온에서 항온처리를 위해 포획 평판으로 이전된다 (예를 들면, 1 시간 동안). 용액은 이후, 제거되고, 평판이 PBS에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20^®)으로 8회 세척된다. 평판이 건조될 때, 150 μl/웰의 신틸란트 (MICROSCINT-20 ^TM; Packard)가 첨가되고, 이들 평판은 TOPCOUNT ^TM 감마 계수기 (Packard)에서 10 분 동안 계수된다. 최대 결합의 20%보다 적거나 같은 결합을 제공하는 각 Fab의 농도가 경쟁적 결합 검정에 이용하기 위해 선택된다.

다른 구체예에 따라서, K_D는 BIACORE^® 표면 플라스몬 공명 검정을 이용하여 계측된다. 예를 들면, BIACORE^®-2000 또는 BIACORE^®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 검정이 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 수행된다. 한 구체예에서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 사용설명서에 따라서 N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 거의 10 반응 단위 (RU)의 연계된 단백질을 달성하기 위해, 5 μl/분의 유속에서 주입 전 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된다. 항원의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 동역학 계측을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)이 거의 25 μl/분의 유속에서 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™) 계면활성제를 포함하는 PBS (PBST)에 주입된다. 연관 속도 (k온) 및 해리 속도 (k오프)는 연관과 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형 (BIACORE^® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (K_D)는 비율 k오프/k온으로서 계산된다. 참조: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). 온 레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1를 초과하면, 온 레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 달린 8000-시리즈 SLM-AMINCO^TM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 계측될 때 증가하는 농도의 항원의 존재에서 PBS, pH 7.2에서, 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역)의 증가 또는 감소를 계측하는 형광 퀀칭 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다.

다른 구체예에서, K_D는 SET (용해 평형화 적정) 검정을 이용하여 계측된다. 이러한 검정에 따라서, 검사 항체는 전형적으로 일정한 농도에서 적용되고 검사 항원의 연속 희석액과 혼합된다. 평형을 확립하기 위한 항온처리 후, 자유 항체의 일부가 항원 코팅된 표면에서 포획되고, 일반적으로 전기화학발광을 이용하여, 표지화된/태깅된 항-종 항체로 검출된다 (예를 들면 Haenel et al Analytical Biochemistry 339 (2005) 182-184에서 설명된 바와 같이).

예를 들면, 한 구체예에서 384-웰 스트렙타비딘 평판 (Nunc, Microcoat #11974998001)이 20 ng/ml의 농도로 PBS-완충액에서 25 μl/웰의 항원-비오틴-이성질체 혼합물과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리된다. 자유 항원으로 항체 샘플의 평형화를 위해: 0.01 nM - 1 nM의 항체가 2500 nM, 500 nM 또는 100 nM의 항원의 농도로 시작하여 1:3, 1:2 또는 1:1.7 희석 단계에서 유관한 항원으로 적정된다. 샘플이 4℃에서 하룻밤 동안, 밀봉된 REMP Storage 폴리프로필렌 마이크로평판 (Brooks)에서 항온처리된다. 하룻밤 항온처리 후, 스트렙타비딘 평판이 웰마다 90 μl PBST로 3x 세척된다. 평형화 평판으로부터 15 μl의 각 샘플이 검정 평판으로 전달되고 실온에서 15 분 동안 항온처리되고, 그 이후에 PBST 완충액을 이용한 3x 90 μl 세척 단계가 뒤따른다. 25 μl의 염소 항인간 IgG 항체-POD 접합체 (Jackson, 109-036-088, OSEP에서 1:4000)를 첨가함으로써 검출이 실행되고, 그 이후에 PBST 완충액을 이용한 6x 90 μl 세척 단계가 뒤따른다. 25 μl의 TMB 기질 (Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호.: 11835033001)이 각 웰에 첨가된다. 계측이 Safire2 판독기 (Tecan) 상에서 370/492 nm에서 수행된다.

다른 구체예에서, KinExA (역학적 배제) 검정을 이용하여 K_D가 계측된다. 이러한 검정에 따라서, 항원이 전형적으로, 일정한 농도의 항체 결합 부위 내로 적정되고, 샘플이 평형화되도록 허용되고, 이후 흐름 셀을 통해 빠르게 뽑아내지는데, 여기서 자유 항체 결합 부위는 항원 코팅된 비드 상에서 포획되는 반면, 항원 포화된 항체 복합체는 씻겨 나간다. 비드 포획된 항체는 이후, 표지화된, 예를 들면, 형광 표지화된 항-종 항체 (Bee et al PloS One, 2012; 7(4): e36261)로 검출된다. 예를 들면, 한 구체예에서, PBS pH 7.4를 작업 완충액으로서 이용하여 KinExA 실험이 실온 (RT)에서 수행된다. 샘플이 1 mg/ml BSA로 보충된 작업 완충액 ("샘플 완충액")에서 제조된다. 0.25 ml/분의 유속이 이용된다. 5 pM 결합 부위 농도를 갖는 일정한 양의 항체가 100 pM에서 시작하여 2배 연속 희석 (농도 범위 0.049 pM - 100 pM)에 의해 항원으로 적정된다. 항원이 없는 항체의 한 가지 샘플이 100% 신호 (다시 말하면 저해 없음)로서 역할을 한다. 평형이 도달될 수 있도록 하기 위해, 항원 항체 복합체가 실온에서 적어도 24 시간 동안 항온처리된다. 평형화된 혼합물은 이후, 용액의 평형 상태를 섭동하지 않으면서, 결합되지 않은 항체가 비드에 의해 포획될 수 있도록 하는 5 ml의 용적으로 KinExA 시스템에서 항원 연계 비드의 칼럼을 통해 뽑아내진다. 포획된 항체는 샘플 완충액에서 250 ng/ml Dylight 650ⓒ-접합된 항인간 Fc-단편 특이적 이차 항체를 이용하여 검출된다. 각 샘플은 모든 평형 실험에 대해 중복으로 계측된다. "표준 분석" 방법을 이용하여, KinExA 소프트웨어 (버전 4.0.11) 내에 내포된 1-부위 균일 결합 모형을 이용한 데이터의 비선형 회귀 분석으로부터 KD가 획득된다.

L. 치료 방법 및 조성물

본원에서 설명된 바와 같은 항체 세트가 치료 방법에 이용될 수 있다. 한 가지 양상에서 본원에서 설명된 바와 같은 항체 세트는 약제로서 이용하기 위해 제공된다. 일정한 양상에서, 치료 방법에 이용하기 위한 항체 세트가 제공된다.

상기 논의된 바와 같이, 일부 양상에서, 본원 발명에 따른 항체 세트는 개체에서 방사성 핵종을 표적 세포로 전달하는 것이 바람직한 임의의 치료에 적합하다. 예를 들면, 사전-표적화 방사면역요법의 방법에 이용하기 위한, 예를 들면, 암 치료를 위한 본원에서 설명된 바와 같은 항체 세트가 제공된다.

일정한 양상에서, 본원 발명은 항체 세트의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사전-표적화 방사면역요법의 방법에 이용하기 위한 항체 세트를 제공한다. 임의의 상기 양상에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.

상기에서 언급된 바와 같이, 치료는 환자의 병든 세포에 표적화된 세포독성 활성에 의해 치료 가능한 임의의 질환의 치료일 수 있다. 치료는 바람직하게는 종양 또는 암의 치료이다. 하지만, 본원 발명의 적용가능성은 종양 및 암에 한정되지 않는다. 예를 들면, 치료는 또한 바이러스 감염, 또는 다른 병원성 세균, 예를 들면, 원핵생물에 의한 감염의 치료일 수 있다. 임의적으로, 표적화는 또한, T 세포 주동된 자가면역 질환 또는 T 세포 혈액암의 치료를 위해 T 세포에 대한 것일 수 있다. 따라서, 치료되는 질환은 바이러스 감염 예컨대 HIV, 광견병, EBV 및 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스, 그리고 자가면역 질환 예컨대 다발성 경화증 및 이식편 대 숙주 질환 약물을 포함할 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "암"은 고형암 및 혈액암 둘 모두, 예컨대 림프종, 림프성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐 (NSCL) 암, 기관지폐포 세포 폐암, 골암, 췌장 관 선암종 (PDAC)을 비롯한 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 항문 부위의 암, 위암, 위암, 결장암 및/또는 직장암일 수 있는 결장직장암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 전립선암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중피종, 간세포암, 담도암, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 척수 축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 아교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평상피 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종, 상기 암 중 임의의 것의 불응성 버전, 상기 암 중 임의의 것의 관문-저해제 경험된 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 포함한다.

요법을 위해 방사성-동위원소를 세포, 조직 또는 장기로 표적화하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

i) 본원에서 설명된 바와 같은 첫 번째 항체와 두 번째 항체를 개체에게 투여하되 (동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로), 이들 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되며; 상기 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하는 단계;

그리고

ii) 방사성-표지된 화합물을 차후에 투여하되, 상기 방사성-표지된 화합물은 이러한 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합하는 단계.

방사성-표지된 화합물은 세포에 세포독성인 방사성-동위원소로 표지화된다. 적합한 방사성-동위원소는 상기 논의된 바와 같은 알파와 베타 방출체를 포함한다.

이중특이적 항체 (다시 말하면, 본원 발명에 따른 "분할" 항체 아님)를 이용하는 사전-표적화 방사면역요법의 방법에서는, 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에, 제거제 또는 차단제를 투여하는 것이 관례다. 제거제는 항체에 결합하고 신체로부터 이들의 청소율을 증강한다. 이들은 항이디오타입 항체를 포함한다. 차단제는 전형적으로, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위에 결합하지만, 그들 자체로는 방사성표지화되지 않는 작용제이다. 예를 들면, 방사성-표지된 화합물이 일정한 화학 원소 (예를 들면, 금속)의 방사성-동위원소로 부하된 킬레이터를 포함하는 경우에, 차단제는 동일한 원소 (예를 들면, 금속)의 비방사성 동위원소로 부하된 동일한 킬레이터를 포함할 수 있거나, 또는 비-부하된 킬레이터 또는 상이한 비방사성 모이어티 (예를 들면, 상이한 원소의 비방사성 동위원소) (이것이 항원 결합 부위에 의해 여전히 결합될 수 있다면)로 부하된 킬레이터를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 차단제는 분자의 크기 및/또는 수력학적 반지름을 증가시키는 모이어티를 추가적으로 포함할 수 있다. 이들은 순환 중인 항체에 결합하는 분자의 능력을 간섭하지 않으면서, 종양에 접근하는 상기 분자의 능력을 방해한다. 예시적인 모이어티는 친수성 중합체를 포함한다. 상기 모이어티는 예를 들면, 덱스트란, 덱스트린, PEG, 폴리시알산 (PSAs), 히알루론산, 히드록시에틸-전분 (HES) 또는 폴리(2-에틸 2-옥사졸린) (PEOZ)의 중합체 또는 공중합체일 수 있다. 다른 구체예에서 상기 모이어티는 비구조적 펩티드 또는 단백질 예컨대 XTEN 폴리펩티드 (비구조화된 친수성 단백질 중합체), 호모-아미노산 중합체 (HAP), 프롤린-알라닌-세린 중합체 (PAS), 엘라스틴 유사 펩티드 (ELP), 또는 젤라틴 유사 단백질 (GLK)일 수 있다. 다른 예시적인 모이어티는 단백질 예컨대 알부민 예를 들면, 소 혈청 알부민, 또는 IgG를 포함한다. 이들 모이어티/중합체에 적합한 분자량은 예를 들면, 적어도 50 kDa, 예를 들면 50 kDa 내지 2000 kDa 사이의 범위 안에 있을 수 있다. 예를 들면, 분자량은 200-800kDa, 임의적으로 300, 350, 400 또는 450 kDa 초과, 그리고 임의적으로 700, 650, 600 또는 550kDa 미만, 임의적으로 약 500kDa일 수 있다.

본원 발명의 일정한 양상에 따라서, 제거제 또는 차단제를 개체에게 투여하는 단계가 없다. 일정한 양상에서, 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에, 첫 번째 또는 두 번째 항체에 결합하는 임의의 작용제를 투여하는 단계가 없다. 일정한 양상에서, 임의적으로 화학요법제, 면역치료제 및 방사성감작화제에서 선택되는 화합물을 제외하고, 항체 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에, 임의의 작용제를 투여하는 단계가 없다. 일부 구체예에서, 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에 어떤 작용제도 투여되지 않는다. 일부 구체예에서 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에, 개체에게 어떤 다른 작용제의 주사 또는 주입도 없을 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 i) 항체 세트를 투여하는 단계 (여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다) 및 ii) 방사성-표지된 화합물을 차후에 투여하는 단계로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 사전-표적화 방사면역요법의 2 단계 방법일 수 있다. 치료는 이런 요법의 복수의 주기, 다시 말하면, 이들 2 단계의 복수의 주기를 수반할 수 있다. 예시적인 치료 주기 지속 기간은 28 일인데, 여기서 항체 세트는 주기의 1일 자에 투여되고, 방사성-표지된 화합물은 임의적으로 주기의 1,2,3,4,5,6,7, 또는 8일 자, 예를 들면, 7일 자에 투여될 수 있다. 치료 주기의 횟수는 변할 수 있다. 한 구체예에서, 4, 5, 또는 6회의 치료 주기가 있을 수 있다.

본 발명자들은 놀랍게도, 본원 발명에 따른 항체를 이용하면, 정상 조직에서 방사선의 과도한 축적을 방지하면서, 종양내로 방사성-표지된 화합물의 치료적으로 효과적인 흡수를 달성하는 것이 가능하다고 결정하였다. 실제로, 실시예에서 비표적 조직에서 방사선의 축적의 수준이 이중특이적 항체 및 제거 단계를 이용하는 3 단계 PRIT 방법에서보다 낮은 것으로 밝혀졌을 뿐만 아니라 더 간단한 절차가 이용된다.

일부 구체예에서, 일단 첫 번째 항체와 두 번째 항체가 표적 세포에 국지화되는 데 적합한 기간이 제공되면, 방사성-표지된 화합물이 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 방사성-표지된 화합물은 첫 번째 항체와 두 번째 항체 직후에, 또는 첫 번째 항체와 두 번째 항체 후 적어도 4 시간, 8 시간, 1 일, 또는 2 일째에 개체에게 투여될 수 있다. 임의적으로, 이것은 첫 번째 항체와 두 번째 항체 후 3 일, 5 일, 또는 7 일 이내에 투여될 수 있다. 특정한 구체예에서, 방사성-표지된 화합물은 첫 번째 항체와 두 번째 항체 후 2 내지 7 일째에 개체에게 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항체는 병용 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들면, 이들은 한 가지 이상의 화학요법제와 병용 투여될 수 있다: 화학요법제 및 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, 이들은 한 가지 이상의 면역치료제와 병용 투여될 수 있다: 면역치료제 및 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항체는 부가적으로 또는 대안으로, 방사성감작화제와 병용 투여될 수 있다. 방사성감작화제 및 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다.

본원 발명의 항체 (및 임의의 추가 치료제, 예를 들면, 방사성-표지된 화합물)는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 루트, 예를 들면, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다.

일부 구체예에서, 전술된 바와 같은 1회 이상의 치료 주기에 앞서 1회 이상의 선량측정 주기가 이용될 수 있다. 선량측정 주기는 i) 항체 세트를 투여하는 단계 (여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다) 및 ii) 감마-방출체로 방사성-표지된 영상에 적합한 화합물을 차후에 투여하는 단계 (여기서 상기 방사성-표지된 화합물은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합한다)를 포함할 수 있다. 화합물은 이것이 알파 또는 베타 방출체가 아닌 감마 방출체로 표지화된다는 점을 제외하고, 후속 치료 주기에서 이용된 화합물과 동일할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 선량측정 주기에서 이용된 방사성-표지된 화합물은 ²⁰³Pb-DOTAM일 수 있고, 치료 주기에 이용된 방사성-표지된 화합물은 ²¹²Pb-DOTAM일 수 있다. 환자는 종양내로 화합물의 흡수를 결정하고 및/또는 화합물의 흡수 선량을 추정하기 위해 영상화가 진행될 수 있다. 이러한 정보는 후속 치료 단계에서 예상된 방사선 노출을 추정하고, 치료 단계에 이용된 방사성-표지된 화합물의 선량을 안전한 수준으로 조정하는 데 이용될 수 있다.

M. 약학적 제제

본원에서 설명된 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 단일 약학적 조성물에서 또는 별개의 약학적 조성물에서 조제될 수 있다. 따라서, 추가의 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 본원에서 설명된 임의의 치료 또는 진단 방법에 이용하기 위한, 본원 발명의 첫 번째 항체와 두 번째 항체를 포함하는 약학적 조성물, 또는 본원 발명의 첫 번째 항체를 포함하는 첫 번째 약학적 제제 및 본원 발명의 두 번째 항체를 포함하는 두 번째 약학적 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 운반체를 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 약학적 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같은 적어도 한 가지 추가 치료제를 더욱 포함한다.

본원에서 설명된 바와 같은 항체의 약학적 제제는 동결 건조된 제제 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 한 가지 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 운반체와 혼합함으로써 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)).

약학적으로 허용되는 운반체는 일반적으로, 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 히스티딘, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 운반체는 틈새 약물 분산 작용제, 예컨대 가용성 중성 활성 히알루론산분해효소 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루론산분해효소 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Halozyme, Inc.)을 더욱 포함한다. rHuPH20을 포함하는 일정한 예시적인 sHASEGP 및 이용 방법은 US 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에서 설명된다. 한 가지 양상에서, sHASEGP는 한 가지 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 병용된다.

예시적인 동결 건조된 항체 조성물은 US 특허 번호 6,267,958에서 설명된다. 수성 항체 조성물은 US 특허 번호 6,171,586 및 WO 2006/044908에서 설명된 것들을 포함하는데, 후자 조성물은 히스티딘-아세트산염 완충액을 포함한다.

본원에서 제제는 또한, 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 한 가지 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 예를 들면, 상기 논의된 바와 같은 화학요법제, 면역치료제 및/또는 방사성감작화제를 더욱 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 활성 성분은 적절하게는, 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다.

활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.

지속된 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 항체를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.

생체내 투여에 이용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.

N. 진단과 검출을 위한 방법과 조성물

본원에서 설명된 바와 같은 항체 세트는 또한, 진단 또는 영상의 방법, 바람직하게는 사전-표적화 방사성면역영상을 포함하는 방법에 이용될 수 있다. 따라서, 본원 발명은 진단 및 영상의 방법을 제공한다. 이것은 본원에서 설명된 바와 같은 영상의 방법에서 항체 세트의 용도, 그리고 개체, 예를 들면, 인간 또는 동물 신체에서 실행된 진단의 방법에 이용하기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 항체 세트 (다시 말하면, 본원에서 설명된 바와 같은 첫 번째 항체와 두 번째 항체)를 더욱 제공한다.

영상 방법은 체내에서 표적 항원의 존재 및/또는 분포를 영상화하는 데 적합하다. 예를 들면, 상기 방법은 질환, 예컨대 상기 논의된 임의의 질환 상태와 연관된 항원을 발현하는 세포를 영상화하는 방법일 수 있다. 임의적으로 상기 방법은 종양 또는 암을 영상화하기 위한 것이다. 상기 방법은 증식성 장애 예컨대 암, 또는 감염성 질환을 겪는 것으로 의심되는 개체를 진단하기 위한 것일 수 있다.

일부 구체예에서 개체는 인간인 것이 바람직할 수 있다.

영상 또는 진단을 위해 방사성-동위원소를 조직 또는 장기로 표적화하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

i) 본원에서 설명된 바와 같은 첫 번째 항체와 두 번째 항체를 개체에게 투여하되 (동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로), 이들 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되며, 상기 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하는 단계;

그리고

임의적으로, 상기 방법은 다음 단계를 더욱 포함할 수 있다:

iii) 방사성-표지된 화합물이 국지화됐거나, 또는 국지화될 것으로 예상되는 조직 또는 장기를 영상화하는 단계.

임의적으로, 상기 방법은 진단을 내리는, 진단을 개체에게 전달하는, 및/또는 진단에 근거하여 적합한 치료법을 결정하고/결정하거나 상기 치료법을 집행하는 하나 이상의 단계를 더욱 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 본원 발명의 방법은 개체의 조직 또는 장기를 영상화하는 단계를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 개체는 하기 성분이 앞서 투여되었다:

i) 본원에서 설명된 바와 같은 첫 번째 항체와 두 번째 항체 (동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로), 여기서 이들 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되며, 여기서 상기 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하고;

ii) 방사성-표지된 화합물, 여기서 상기 방사성-표지된 화합물은 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결에 의해 형성된, 상기 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위에 결합한다.

본원에서 설명된 바와 같은 영상 및/또는 진단 방법에서, 방사성-표지된 화합물은 영상에 적합한 방사성-동위원소로 표지화된다. 적합한 방사성-동위원소는 상기 논의된 바와 같은 감마 방출체를 포함한다.

사전-표적화 방사선영상의 전통적인 방법에서, 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물, 예를 들면, 전술된 바와 같은 제거제 또는 차단제의 투여 사이에 제거제 또는 차단제를 투여하는 것이 관례다.

본원 발명의 일정한 구체예에서, 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계가 없다. 일정한 양상에서, 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에, 첫 번째 또는 두 번째 항체에 결합하는 임의의 작용제를 투여하는 단계가 없다. 일정한 양상에서, 임의적으로 화학요법제, 면역치료제 및 방사성감작화제에서 선택되는 화합물을 제외하고, 항체 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에, 임의의 작용제를 투여하는 단계가 없다. 일부 구체예에서, 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에 어떤 작용제도 투여되지 않는다. 일부 구체예에서 항체의 투여 및 방사성-표지된 화합물의 투여 사이에, 개체에게 어떤 다른 작용제의 주사 또는 주입도 없을 수 있다.

일부 구체예에서, 일단 첫 번째 항체와 두 번째 항체가 표적 세포로 국지화되는 데 적합한 기간이 제공되면, 방사성-표지된 화합물이 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 방사성-표지된 화합물은 첫 번째 항체와 두 번째 항체 직후에, 또는 첫 번째 항체와 두 번째 항체 후 적어도 4 시간, 8 시간, 1 일, 또는 2 일째에 개체에게 투여될 수 있다. 임의적으로, 이것은 첫 번째 항체와 두 번째 항체 후 3 일, 5 일, 또는 7 일 이내에 투여될 수 있다. 특정한 구체예에서, 방사성-표지된 화합물은 첫 번째 항체와 두 번째 항체 후 2 내지 7 일째에 개체에게 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, 영상 방법은 i) 항체 세트를 투여하는 단계 (여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다), ii) 방사성-표지된 화합물을 차후에 투여하는 단계 및 iii) 관심되는 조직 또는 장기를 영상화하는 단계로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 사전-표적화 방사선영상의 방법일 수 있다. 진단 방법은 상기 단계, 그 이후에 진단을 내리는 단계로 구성되거나 또는 본질적으로 구성될 수 있는데, 상기 진단은 이후 환자에게 전달될 수 있고 선택된 치료 섭생에 대한 및/또는 치료 섭생을 집행하기 위한 근거로서 이용될 수 있다.

표적 항원은 본원에서 논의된 바와 같은 임의의 표적 항원일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 상기 논의된 바와 같은 종양 특이적 항원일 수 있고, 영상은 종양 또는 종양들을 영상화하는 방법일 수 있다. 개체는 종양을 겪는 것으로 알려져 있거나 또는 의심될 수 있다.

예를 들면, 상기 방법은 폐암, 비소세포 폐 (NSCL) 암, 기관지폐포 세포 폐암, 골암, PDAC를 비롯한 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암 및/또는 결장암일 수 있는 결장직장암, 항문 부위의 암, 위암, 위암, 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 전립선암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중피종, 간세포암, 담도암, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 척수 축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 아교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평상피 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종, 상기 암 중 임의의 것의 불응성 버전, 또는 상기 암 중 임의의 것의 관문-저해제 경험된 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 겪거나 또는 겪는 것으로 의심되는 개체에서 종양을 영상화하는 방법일 수 있다.

본원 발명의 추가의 구체예

본원 발명의 추가의 구체예는 아래의 넘버링된 단락에서 명시된다.

1. 항체 세트로서:

ii) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 더욱 포함하지만, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않는 두 번째 항체를 포함하고,

2. 단락 1의 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, i) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편 및 ii) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함한다.

3. 단락 2의 항체 세트로서, 여기서 항체 단편은 적어도 하나의 Fv, scFv, 또는 Fab 또는 교차-Fab 단편에서 선택된다.

4. 단락 1-3 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각 Fc 도메인을 더욱 포함한다.

5. 단락 4의 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, i) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편, ii) Fc 영역 및 iii) Fc 영역에 융합된, 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함한다.

6. 단락 4 또는 5의 항체 세트로서, 여기서 Fc 도메인은 효과기 기능을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 변형된다.

7. 단락 4 내지 6 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 각각, a) Fc 도메인, b) 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티 및 c) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 (b)의 항원 결합 모이어티는 Fc 도메인의 한쪽 사슬의 N 말단에 융합되고, (c)의 폴리펩티드의 C 말단은 Fc 도메인의 다른 사슬의 N 말단에 융합된다.

8. 단락 7의 항체 세트로서, 여기서 (b)의 항원 결합 모이어티는 항체 단편, 예컨대 scFv, Fv, Fab 또는 교차 Fab이다.

9. 단락 8의 항체 세트로서, 여기서 (b)의 항원 결합 모이어티는 Fab이다.

10. 단락 7 내지 9 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는

i) 완전한 경쇄;

ii) 완전한 중쇄;

iii) 추가의 Fc 사슬; 및

iv) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하고;

여기서 (i)의 경쇄 및 (ii)의 중쇄는 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 제공하고; 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해 링커를 거쳐 (iii)의 N 말단에 융합되고;

두 번째 항체는

v) 완전한 경쇄;

vi) 완전한 중쇄;

vii) 추가의 Fc 사슬; 및

viii) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하고;

여기서 (v)의 경쇄 및 (vi)의 중쇄는 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 제공하고; 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해 링커를 거쳐 (vii)의 N 말단에 융합된다.

11. 선행하는 단락 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물은 방사성-표지된 DOTA 또는 이의 염 또는 기능적 변이체를 포함한다.

12. 선행하는 단락 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물은 Lu 또는 Y 방사성-동위원소로 방사성-표지된 DOTA 또는 이의 염 또는 기능적 변이체이다.

13. 단락 11 또는 12에 따른 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 (a) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.

14. 단락 11 내지 13 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 서열 번호: 41의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 41에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.

15. 단락 11 내지 14 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

16. 단락 11 내지 15 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 서열 번호: 42의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 42에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.

17. 단락 1 내지 10 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물은 Pb-DOTAM을 포함한다.

18. 단락 17에 따른 항체 세트로서, 여기서 Pb-DOTAM에 대한 기능적 결합 부위는 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들면, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하, 또는 0.5pM 이하의 결합 친화성의 KD 값으로 결합한다.

19. 단락 17 또는 단락 18에 따른 항체 세트로서, 여기서 Pb-DOTAM에 대한 기능적 결합 부위는 Pb-DOTAM 및 Bi-DOTAM에 결합한다.

20. 단락 17 내지 19 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은

b) 중쇄 CDR3으로서, 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL (서열 번호: 3), 또는 서열 번호: 3에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E를 포함하지 않고/않거나 임의적으로 또한 Tyr99를 포함하지 않는 중쇄 CDR3;

그리고 중쇄 CDR1로서, 임의적으로:

c) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS (서열 번호: 1), 또는 서열 번호: 1에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1을 포함한다;

21. 단락 30의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 (a) GFSLSTYSMS (서열 번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) FIGSRGDTYYASWAKG (서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) ERDPYGGGAYPPHL (서열 번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.

22. 단락 17 내지 21 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은

i) 서열 번호: 143의 아미노산 서열; 또는

ii) 서열 번호: 143에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 임의적으로 N 말단의 Q 잔기가 불변하거나, 또는 E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기에 의해 치환되는 서열 번호: 143의 변이체; 또는

iii) 단지 하나 이상의 치환에 의해서만 서열 번호: 143과 달라지고 서열 번호: 143에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되; 임의적으로 N 말단의 Q 잔기가 불변하는 서열 번호: 143의 변이체를 포함한다.

23. 단락 17 내지 21 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 서열 번호: 7의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 7에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하되, 임의적으로 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인이 추가의 N 말단 잔기, 예를 들면, Q, 또는 E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기를 더욱 포함한다.

24. 단락 17 내지 21 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 서열 번호: 9의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 9에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, N 말단 잔기, 예를 들면, Q, 또는 E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기를 임의적으로 더욱 포함한다.

25. 단락 17 내지 24 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은

e) 경쇄 CDR3으로서, 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG (서열 번호: 6), 또는 서열 번호: 6에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및 Tyr96을 포함하지 않는 경쇄 CDR3,

그리고 경쇄 CDR2로서, 임의적으로:

f) 아미노산 서열 QASKLAS (서열 번호: 5), 또는 서열 번호: 5에서 적어도 1개, 2개 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하고 Gln50을 임의적으로 포함하지 않는 경쇄 CDR2를 포함한다.

26. 단락 25의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 (d) QSSHSVYSDNDLA (서열 번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) QASKLAS (서열 번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) LGGYDDESDTYG (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

27. 단락 17 내지 26 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은

i) 서열 번호: 144의 아미노산 서열, 또는

ii) 서열 번호: 144에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 임의적으로 N 말단의 A 잔기가 불변하거나 또는 D, N, E, Q, S, A, V, L, T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 다른 아미노산에 의해 치환되는 서열 번호: 144의 변이체; 또는

iii) 단지 하나 이상의 치환에 의해서만 서열 번호: 144와 달라지고 서열 번호: 144에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되; 임의적으로 N 말단의 A 잔기가 불변하는 서열 번호: 144의 변이체를 포함한다.

28. 단락 17 내지 26 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 8에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 추가의 N 말단 잔기 예컨대 A; 또는 D, N, E, Q, S, A, V, L, T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 잔기를 임의적으로 더욱 포함한다.

29. 선행하는 단락 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동일한 표적 항원에 결합한다.

30. 단락 29의 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합한다.

31. 단락 29의 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 두 번째 항체와 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합한다.

32. 선행하는 단락 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 종양 관련 항원이다.

33. 선행하는 단락 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 암배아 항원 (CEA), CD20, HER2, EGP-1 (영양모세포-2로서 또한 알려져 있는 상피 당단백질-1), 결장 특이적 항원-p (CSAp), 췌장 점액소 MUC1, GPRC5D 및 FAP로 이루어진 군에서 선택된다.

34. 선행하는 단락 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 CEA, GPRC5D 및 FAP로 이루어진 군에서 선택된다.

35. 선행하는 단락 중 어느 하나의 항체 세트로서, 여기서 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 CEA이다

36. 단락 35에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위로서:

(a) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(d) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다.

37. 단락 35 또는 36에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 25, 또는 서열 번호: 25에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

38. 단락 35 내지 37 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 26, 또는 서열 번호: 26에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

39. 단락 35에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 (a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.

40. 단락 35 또는 39에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 49, 또는 서열 번호: 49에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

41. 단락 35, 39 또는 40 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 50, 또는 서열 번호: 50에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

42. 단락 35에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위로서:

(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다.

43. 단락 35 또는 42에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 17, 또는 서열 번호: 17에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

44. 단락 35, 42 또는 43에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 18, 또는 서열 번호: 18에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

45. 단락 35에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위로서:

(a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(d) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다.

46. 단락 35 또는 단락 45에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 65에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

47. 단락 35, 45 또는 46에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 66, 또는 서열 번호: 66에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

48. 단락 45에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 (a) 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호: 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.

49. 단락 35 또는 48에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 서열 번호: 129, 130, 131, 132, 133 또는 134에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열 번호: 135, 136, 137, 138, 139 또는 140에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.

50. 단락 35, 48 또는 49에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위로서:

(g) 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다.

51. 단락 35 내지 50 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위로서:

52. 단락 35 내지 51 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 25, 또는 서열 번호: 25에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

53. 단락 35 내지 52 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 26, 또는 서열 번호: 26에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

54. 단락 35 내지 50 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 (a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.

55. 단락 35 내지 50 또는 54 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 49, 또는 서열 번호: 49에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

56. 단락 35 내지 50, 54 또는 55 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 50, 또는 서열 번호: 50에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

57. 단락 35 내지 50 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위로서:

58. 단락 35 내지 50 또는 57 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 17, 또는 서열 번호: 17에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

59. 단락 35 내지 50, 57 또는 58 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 18, 또는 서열 번호: 18에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

60. 단락 35 내지 50 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위로서:

61. 단락 35 내지 50 또는 60 중 어느 하나에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 65, 또는 서열 번호: 65에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

62. 단락 35 내지 50, 60 또는 61에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 66, 또는 서열 번호: 66에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함한다.

63. 단락 35 내지 50에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 (a) 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호: 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.

64. 단락 35 내지 50 또는 63에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 서열 번호: 129, 130, 131, 132, 133 또는 134에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열 번호: 135, 136, 137, 138, 139 또는 140에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.

65. 단락 35 내지 50, 63 또는 64에 따른 항체 세트로서, 여기서 두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위로서:

66. 단락 35에 따른 항체 세트로서, 여기서 첫 번째 항체는 단락 36 내지 38 중 어느 하나에 따른 항체이고, 두 번째 항체는 단락 51 내지 53 중 어느 하나에 따른 항체이다.

67. 단락 1에 따른 항체 세트로서, 여기서:

68. 선행하는 단락 중 어느 한 하나의 항체 세트를 발현하는 핵산 세트.

69. 단락 68에 따른 핵산 세트를 포함하는 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트.

70. 단락 69의 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포 세트.

71. 사전-표적화 방사면역요법의 방법으로서,

i) 단락 1 내지 67 중 어느 하나에 따른 항체 세트를 개체에게 투여하되, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여되고, 이들 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되며; 상기 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하는 단계;

그리고

ii) 방사성-표지된 화합물을 차후에 투여하되, 상기 방사성-표지된 화합물은 이러한 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합하는 단계를 포함한다.

72. 단락 71의 방법으로서, 여기서 상기 방법은 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 포함하지 않는다.

73. 단락 71 또는 72의 방법으로서, 여기서 개체는 인간이다.

74. 단락 71 내지 73 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 표적 항원은 암 관련 또는 종양 관련 항원이고, 상기 방법은 종양 또는 암의 방사면역요법의 방법이다.

75. 단락 71 내지 74 중 어느 하나에 따른 사전-표적화 방사면역요법의 방법에 이용하기 위한, 단락 1 내지 67 중 어느 하나에 따른 항체 세트.

76. 방사선영상을 위해 방사성-동위원소를 조직 또는 장기로 표적화하는 방법으로서:

i) 단락 1 내지 67 중 어느 하나에 따른 항체 세트를 개체에게 투여하되, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여되고, 이들 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되며, 상기 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하는 단계;

그리고

77. 단락 76의 방법으로서, 여기서 상기 방법은 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 포함하지 않는다.

78. 단락 76 또는 77의 방법으로서, 여기서 상기 방법은 영상화하는 단계를 더욱 포함한다.

79. 단락 78의 방법으로서, 여기서 표적 항원은 암 또는 종양 관련 항원이고, 상기 방법은 종양 또는 암을 영상화하는 방법이다.

80. Gly 및 Ser로 이루어진 군에서 선택되는 y개의 연속 잔기로 구성되는 펩티드 링커로서, 여기서 y= 5 내지 100, 5 내지 70, 5 내지 60, 5 내지 50 또는 10 내지 100, 10 내지 70, 10 내지 60, 또는 10 내지 50이고, 마지막 세린은 y-2 또는 y-3 위치에 있다.

81. 단락 80의 펩티드 링커로서, 여기서 y=10 내지 50이다.

82. 단락 80의 펩티드 링커로서, 여기서 y= 15 내지 31 또는 15 내지 30이다;

83. 단락 82의 펩티드 링커로서, 여기서 y= 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이다.

84. 단락 83의 펩티드 링커로서, 여기서 y= 20 또는 21이다.

85. 서열 (GxS)n(GGSGG) 또는 (GxS)n(GGSGGG)로 구성되는, 단락 80의 펩티드 링커로서, 여기서 G = 글리신, S = 세린, x = 4, 그리고 n=1 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 10 또는 2 내지 10이다.

86. 단락 85의 펩티드 링커로서, 여기서 n= 2, 3, 4 또는 5이다.

87. 단락 85의 펩티드 링커로서, 여기서 n=2, 3 또는 4이다.

88. 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG (서열 번호: 150) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG (서열 번호: 151)로 구성되는, 단락 80의 펩티드 링커.

89. 멀티도메인 단백질의 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인을 연결하기 위한, 단락 80 내지 88 중 어느 하나의 펩티드 링커의 용도.

90. 적어도 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인을 포함하는 멀티도메인 단백질로서, 여기서 상기 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인은 단락 80 내지 88 중 어느 하나의 펩티드 링커에 의해 연결된다.

91. 멀티도메인 단백질이 항체인, 단락 89의 용도 또는 단락 90의 멀티도메인 단백질.

92. 멀티도메인 단백질이 이중특이적 항체인, 단락 89의 용도 또는 단락 90의 멀티도메인 단백질.

93. 첫 번째 도메인이 항원 결합 모이어티이고, 두 번째 도메인이 VH 또는 VL 도메인인, 단락 89의 용도 또는 단락 90의 멀티도메인 단백질.

94. 항원 결합 모이어티가 항체 단편인, 단락 93의 멀티도메인 결합 단백질의 용도.

95. 첫 번째 도메인이 Fc 도메인이고, 두 번째 도메인이 VH 또는 VL 도메인인, 단락 89의 용도 또는 단락 90의 멀티도메인 단백질.

III. 서열

IV. 실시예

다음은 본원 발명의 방법과 조성물의 실시예이다. 앞서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.

약어의 용어

ADA 항약물 항체

AST 알라닌, 세린, 트레오닌

BsAb 이중특이적 항체

CA 제거제

CEA 암배아 항원

DOTAM 1,4,7,10-테트라키스(카바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸

ID 주사된 용량

ELISA 효소 결합 면역흡착 검정

FAP 섬유모세포 활성화 단백질

GPRC5D G-단백질 연계된 수용체 패밀리 C 그룹 5 구성원 D

IV 정맥내

MW 분자량

PBS 인산염 완충된 식염수

p.i. 주사후

PK 약동학

PRIT 사전-표적화 방사면역요법

RIT 방사면역요법

RT 실온

SC 피하

SCID 중증 복합형 면역결핍

SD 표준 편차

SOPF 특정한 기회 감염 병원체 없음

SPLIT 분리된 v-도메인 연쇄 기술

TA 표적 항원

TGI 종양 성장 저해

TR 종양 퇴화

실시예 1: CEA-분할-DOTAM VH/VL 항체의 생성

표적 항원에 대한 결합 부위 및 방사성-표지된 화합물에 대한 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체를 이용한 PRIT (사전-표적화 방사면역요법)의 방법은 효과적인 표적화 및 높은 종양 대 정상 조직 흡수 선량 비율을 담보하기 위해, 항체 및 방사리간드의 투여 사이에 제거제 (CA)를 통상적으로 이용한다 (도 3 참조). 이와 같은 한 가지 방법의 실례에서, 주사된 BsAb가 종양내로 침투를 위한 충분한 시간, 일반적으로 4-10 일이 허용되고, 그 후 순환성 BsAb가 Pb-DOTAM-덱스트란-500 CA를 이용하여 중화된다. CA는 사전-표적화된 부위를 차단할, 종양내로 침투하지 않는 비표적화된 BsAb에 대한 ²¹²Pb-DOTAM 결합을 차단한다. 이러한 사전-표적화 섭생은 차후에 투여되는 방사성-표지된 킬레이트, ²¹²Pb-DOTAM의 효율적인 종양 축적을 가능하게 한다.

하지만, 제거제를 수반하는 방법에서, CA의 이용은 비효율적인 추가 단계를 상기 방법에 도입한다. 게다가, 복합적인 인자인 CA 투여의 타이밍 및 용량을 주의 깊게 선택하는 것이 중요할 수 있다.

제거제의 이용과 연관된 문제를 해소하기 위해, 본 발명자들은 DOTAM VL과 VH 도메인이 별개의 항체 상에서 발견되도록, 이들을 분할하는 전략을 제안하였다.

예시적인 분할 DOTAM VH/VL 항체의 생성은 아래에 더욱 논의된다.

항체 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현을 위한 플라스미드의 생성

원하는 단백질이 인간 배아 신장 세포 (HEK 293)의 일시적인 형질감염에 의해 발현되었다. 원하는 유전자/단백질 (예를 들면 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 추가의 도메인 (예를 들면 C 말단에서 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 내포하는 전장 항체 중쇄의 발현을 위해, 하기 기능적 요소를 포함하는 전사 단위가 이용되었다:

- 인트론 A를 포함하는 인간 시토메갈로바이러스 (P-CMV)로부터 극초기 인핸서 및 프로모터,

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역 (5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (SS),

- 발현되는 유전자/단백질, 그리고

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).

발현되는 원하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트에 더하여, 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는

- 대장균 (E. coli)에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터 복제 기점, 그리고

- 대장균 (E. coli)에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 내포하였다.

a) 항체 중쇄에 대한 발현 플라스미드

완전한 기능적 항체 중쇄, 그 이후에 추가의 항체 V-중쇄 또는 V-경쇄 도메인을 포함하는 C 말단 융합 유전자를 포함하는 항체 중쇄 인코딩 유전자가, G4Sx4 링커에 의해 각각 분리된 개별 서열 요소 (V-중쇄 또는 V-경쇄)를 코딩하는 DNA 단편을 인간 IgG 분자의 CH3 도메인의 C 말단에 융합함으로써 조립되었다 (VH-CH1-힌지-CH2-CH3-링커-VH 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-링커-VL). 2개의 CH3 도메인의 C 말단에서 하나의 VH 및 하나의 VL 도메인을 각각 보유하는 재조합 항체 분자가 노브 인투 홀 기술을 이용하여 발현되었다.

HEK293 세포에서 C 말단 VH 또는 VL 도메인을 갖는 항체 중쇄의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드는 C 말단 VH 또는 VL 도메인 발현 카세트를 갖는 항체 중쇄 단편 이외에, 대장균 (E. coli)에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터 유래된 복제 기점, 그리고 대장균 (E. coli)에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 포함하였다. C 말단 VH 또는 VL 도메인 융합 유전자를 갖는 항체 중쇄 단편의 전사 단위는 하기 기능적 요소를 포함한다:

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역 (5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 항체 중쇄 (VH-CH1-힌지-CH2-CH3-링커-VH 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-링커-VL) 인코딩 핵산, 그리고

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).

b) 항체 경쇄에 대한 발현 플라스미드

완전한 기능적 항체 경쇄를 포함하는 항체 경쇄 인코딩 유전자가, 개별 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합함으로써 조립되었다.

항체 경쇄의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드는 항체 경쇄 단편 이외에, 대장균 (E. coli)에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터 유래된 복제 기점, 그리고 대장균 (E. coli)에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 포함하였다. 항체 경쇄 단편의 전사 단위는 하기 기능적 요소를 포함한다:

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역 (5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 항체 경쇄 (VL-CL) 인코딩 핵산, 그리고

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).

항체 분자의 일시적인 발현

항체 분자가, F17 배지 (Invitrogen Corp.)에서 배양된 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293 유래됨)에서 생성되었다. 형질감염을 위해 "293 없는" 형질감염 시약 (Novagen)이 이용되었다. 전술된 바와 같은 개별 항체 중쇄와 경쇄 분자가 개별 발현 플라스미드로부터 발현되었다. 형질감염이 제조업체의 사용설명서에서 특정된 바와 같이 수행되었다. 면역글로불린 내포 세포 배양 상층액이 형질감염 후 3 내지 7 (3-7) 일째에 수확되었다. 상층액이 정제 때까지 감소된 온도 (예를 들면 -80℃)에서 보관되었다.

예를 들면 HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203에서 제공된다.

PRIT 헤미바디 (분할 항체)가 MabSelect Sure (친화성 크로마토그래피), 그 이후에 Superdex 200 (크기 배제 크로마토그래피)에 의해 정제되었다.

예시적인 항체의 서열은 아래에 요약된다.

DOTAM-VL-P1AD8592를 갖는 PRIT Split 항체의 경우에, 분석적 SEC 및 CE-SDS에 근거하여 1.372mg/mL의 농도 및 >96%의 순도를 갖는 5mg이 생산되었다. DOTAM-VH - P1AD8749를 갖는 PRIT Split 항체의 경우에, 분석적 SEC 및 CE-SDS에 근거하여 2.03mg/mL의 농도 및 >91%의 순도를 14mg이 생산되었다.

항체 P1AE4956 및 P1AE4957 또한 생성되었다. DOTAM-VL -P1AE4957을 갖는 PRIT Split 항체의 경우에, 분석적 SEC 및 CE-SDS에 근거하여 2.6mg/mL의 농도 및 >81.6%의 순도를 갖는 19 mg이 생산되었다. DOTAM-VH - P1AE4956을 갖는 PRIT Split 항체의 경우에, 분석적 SEC 및 CE-SDS에 근거하여 1.5mg/mL의 농도 및 >90%의 순도를 갖는 6.9mg이 생산되었다. ESI-MS가 PRIT 헤미바디의 정체를 확증하는 데 이용되었다.

실시예 2: 분할 항체 기능성의 FACS 분석

분할 항체 또는 헤미바디의 기능성을 사정하기 위해, 37℃에서 10 분 동안 아쿠타아제를 이용하여, MKN-45 세포가 배양 용기로부터 분리되었다. 차후에, 이들 세포는 PBS에서 2회 세척되고, 4x10⁶개 세포/웰의 최종 밀도로 96 웰 v-바닥 평판 내로 파종되었다.

헤미바디 P1AD8749와 P1AD8592 및 인간 ISO 대조가 1:1 혼합되고 도 5에서 표시된 바와 같은 농도로 세포에 첨가되었다. 차후에, 이들 세포는 얼음 위에서 1 시간 동안 배양되고 PBS에서 2회 세척되었다. 세포 펠렛이 재현탁되었고, 40μl/웰의 검출 시약, <인간 IgG(H+L)>FITC, (10μg/ml) 또는 Pb_Dotam_FITC 1:100 => (10μg/ml) 중 어느 하나가 PBS / 5% FCS에 첨가되었다. 얼음 위에서 60 분 배양 후, 이들 세포는 PBS에서 2회 세척되고, FACS canto를 이용한 FITC 형광의 계측을 위해 200μl PBS / 5% FCS에서 재현탁되었다.

MKN-45 세포 상에서 CEA에 대한 이들 헤미바디의 결합 능력을 사정하기 위해, 인간 IgG 특이적 이차 항체를 이용하는 항체를 이용하여 이들이 검출되었다 (도 5). 예상한 바와 같이, 이들 세포에서 인간 ISO 대조의 어떤 유의미한 결합도 관찰되지 않는다. 동일한 IgG 농도로 조정될 때, 양쪽 헤미바디뿐만 아니라 둘 모두의 조합은 MKN-45 세포에 용량 의존성 결합을 보여주는데, 예상한 바와 같이 매우 높은 농도에서 후크 효과가 확연하다. 이러한 실험은 CEA 결합이 이들 헤미바디에서 기능적이라는 것을 증명한다.

DOTAM에 대한 이들 헤미바디의 결합 능력을 사정하기 위해, 이들이 인간 ISO 대조, 또는 1:1 비율에서 그들의 개별 분할 항체 파트너의 존재에서 세포에 결합되었다. MKN-45 세포에 이들의 결합 후, 이들 세포는 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척되었다. 차후에, DOTAM 결합 적격 세포 결합된 항체를 검출하기 위해, Pb-DOTAM-FITC (형광 표지화된 Pb-DOTAM)가 첨가되었다 (도 6). 예상한 바와 같이, 분할 항체 파트너 중에서 하나가 인간 ISO 대조와 조합될 때에는, 이들 세포에서 어떤 유의미한 FITC도 관찰되지 않는다. 1:1 비율에서 양쪽 헤미바디의 조합만 용량 의존성 FITC 신호를 보여준다. 이러한 실험은 DOTAM 결합 부위가, 양쪽 헤미바디가 하나의 세포 상에서 합쳐질 때 기능적으로 된다는 것을 증명한다.

실시예 3: 생체내 연구

실시예 3a: 재료와 방법 - 일반적

모든 실험 프로토콜이 지역 당국 (Comit

R

gional d'Ethique de l'Exp

rimentation Animale du Limousin [CREEAL], Laboratoire D

partemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne)에 의해 검토되고 승인되었다. 암컷 중증 복합형 면역결핍 (SCID) 생쥐 (Charles River)가 윤리적 지침에 의거하여, 밝음 및 어둠 (12 시간/12 시간)의 일일 주기를 갖는 특정한 기회 감염 병원체 없는 (SOPF) 조건하에 유지되었다. 이들 동물이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 하기 위해, 도착 후 첫 5 일 동안에는 조작이 수행되지 않았다. 동물은 임상 증상 및 부작용 검출을 위해 매일 통제되었다.

Corning® Matrigel® 기저막 매트릭스 (성장 인자 감소됨; 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 세포 배양 배지에서 CEA 발현 종양 세포의 피하 (SC) 주입에 의해, 고형 이종이식편이 확립되었다. 종양 용적이 주 3회 수동 캘리퍼링을 통해 추정되고, 공식: 용적 = 0.5 x 길이 x 너비 ² 에 따라서 계산되었다. 종양 성장률에 따라서 추가 종양 계측이 필요에 따라 실행되었다.

생쥐가 만약 종양 부담, 주사의 부작용, 또는 다른 원인으로 인한 다루기 힘든 곤란 또는 통증의 징후를 보이면, 예정된 종결점 이전에 안락사되었다. 통증, 곤란, 또는 불편의 표시는 급성 체중 (BW) 감소, 추레한 털, 설사, 웅크린 자세, 그리고 기면을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 치료된 동물의 BW가 주 3회 계측되었고, 건강 상태에 따른 필요에 따라 추가로 계측되었다. 습성 사료가 방사선 주사 다음 날부터 시작하여, 7 일 동안 또는 모든 개체가 임의의 급성 BW 감소로부터 충분히 회복할 때까지, 모든 생쥐에게 제공되었다. BW 감소가 그들의 초기 BW의 20%를 초과하거나 또는 종양 용적이 3000 mm³에 도달한 생쥐는 즉시 안락사되었다. 윤리적 이유로 인해 안락사가 고려되는 다른 인자는 종양 상태 (예를 들면 괴사 부위, 혈액/액체 누출, 자상의 징후) 및 동물의 전반적인 외관 (예를 들면 털, 자세, 움직임)이다.

방사성 소변/대변의 재섭취를 최소화하기 위해, 모든 효능 연구 생쥐는 표준 침구가 있는 새로운 케이지로 이전되기에 앞서, ²¹²Pb-DOTAM 투여 후 4 시간 동안 바닥에 창살이 있는 케이지에 배치되었다. 모든 케이지는 이후, 주사후 (p.i.) 24 시간째에 교체되었다. 방사선 주사 후 24 시간 이내에 생체분포 목적으로 희생된 생쥐의 경우에는 이러한 절차가 수행되지 않았다.

안락사의 시점에서 경부 탈구를 통한 종료 전, 마취된 생쥐에서 안와후 출혈을 이용하여 정맥동으로부터 혈액이 수집되었고, 그 이후에 프로토콜에 규정된 대로, 방사능 계측 및/또는 조직학적 분석을 위한 추가 조직 수확이 뒤따랐다. 예상치 못한 또는 비정상적인 상태는 문서화되었다. 포르말린 고정을 위해 수집된 조직이 10% 중성 완충된 포르말린 (4℃)에 즉시 넣어지고, 5 일 후 인산염 완충된 식염수 (PBS; 4℃)로 이전되었다. 생체분포 목적을 위해 수집된 장기와 조직이 계량되고 2470 WIZARD² 자동 감마 계수기 (PerkinElmer)를 이용하여 방사능에 대해 계측되었고, 붕괴 및 배경에 대한 교정을 포함하는, 조직 그램당 주사된 선량 퍼센트 (% ID/g)가 차후에 계산되었다.

통계학적 분석이 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.) 및 JMP 12 (SAS Institute Inc.)를 이용하여 수행되었다. 종양 성장 저해 (TGI)의 곡선 분석이 하기 공식을 이용하여 평균 종양 용적에 근거하여 수행되었고:

여기서 d는 연구 일을 표시하고 0은 기준선 값을 표시한다. 운반제가 기준 집단으로서 선택되었다. 종양 퇴화 (TR)가 하기 공식에 따라서 계산되었고:

여기서 양성 값은 종양 퇴화를 표시하고, -1 미만의 값은 이중 기준선 값을 뛰어넘는 성장을 표시한다.

검사 화합물

설명된 연구에서 활용된 화합물은 아래의 표에서, 이중특이적 항체, 제거제 및 방사성-표지된 킬레이트에 대해 각각 제시된다.

CEA-DOTAM (RO7198427, PRIT-0213)은 CEA의 T84.66 에피토프를 표적으로 하는 완전 인간화 BsAb이다 (WO2019/201959를 또한 참조한다). PRIT-0213은

i) 아래에 도시된 바와 같은 첫 번째 중쇄;

ii) 아래에 도시된 바와 같은 두 번째 중쇄; 및

iii) 아래에 도시된 바와 같은 2개의 항체 경쇄로 구성된다.

DIG-DOTAM (RO7204012)은 음성 대조로서 이용된 비-CEA 결합 BsAb이다.

P1AD8749, P1AD8592, P1AE4956 및 P1AE4957은 CEA의 CH1A1A 또는 A5B7 에피토프를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체이다. 이들의 서열은 전술된다. 모든 항체 작제물은, 그들이 해동되고 정맥내 (IV) 또는 복막내 (IP) 투여를 위해 표준 운반제 완충액 (20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl; pH 6.0) 또는 0.9% NaCl에서 그들의 최종 개별 농도로 희석되는 주사의 일자 때까지 -80℃에서 보관되었다.

Pb-DOTAM-덱스트란-500 CA (RO7201869)는, 이것이 해동되고 IV 또는 IP 투여를 위해 PBS에서 희석되는 주사의 일자 때까지 -20℃에서 보관되었다.

방사성표지화를 위한 DOTAM 킬레이트는 Macrocyclics에 의해 제공되었고, Orano Med (Raz

s, France)에 의해 수행된 방사성표지화 전, -20℃에서 유지되었다. ²¹²Pb-DOTAM (RO7205834)이 토륨 발생기로부터 DOTAM으로 용리에 의해 생성되었고, 차후에 표지화 후 Ca로 퀀칭되었다. IV 주사를 위한 원하는 ²¹²Pb 활성 농도를 획득하기 위해, ²¹²Pb-DOTAM 용액이 0.9% NaCl로 희석되었다.

운반제 대조군에서 생쥐는 BsAb, CA 및 ²¹²Pb-DOTAM 대신에 운반제 완충액의 복수의 주사를 제공받았다.

이중특이적 항체

제거제

방사성-표지된 킬레이트

종양 모형

이용된 종양 세포주 및 생쥐에서 접종을 위해 주입된 양은 아래의 표에서 설명된다. BxPC3은 CEA를 자연적으로 발현하는, 인간 원발성 췌장 선암종 세포주이다. 10% 소 태아 혈청 (GE Healthcare Hyclone SH30088.03)으로 풍부해진 RPMI 1640 배지, GlutaMAX™ 보충물, HEPES (Gibco, 참조 번호 72400-021)에서 세포가 배양되었다. 연구 0일 자에 Corning® Matrigel® 기저막 매트릭스 (성장 인자 감소됨; 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 RPMI 배지에서 세포를 오른쪽 옆구리 내로 피하 주입함으로써, 각 SCID 생쥐에서 고형 이종이식편이 확립되었다.

종양 세포주

*European Collection of Authenticated Cell Cultures (Salisbury, UK)

실시예 3b: 프로토콜 144

프로토콜 144의 목적은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb를 이용한 2 단계 PRIT 후 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서, 사전-표적화된 ²¹²Pb-DOTAM의 PK 및 생체내 분포 데이터를 제공하는 것이었다.

2 단계 PRIT는 CEA-분할-DOTAM-VH 및 CEA-분할-DOTAM-VL (P1AD8749 및 P1AD8592)를 별개로 또는 함께 주사하고, 7 일 후 ²¹²Pb-DOTAM을 주사함으로써 수행되었다. 생쥐는 방사선 주사 6 시간 후 희생되었고, 방사능 계측을 위해 혈액 및 장기가 수확되었다. 이러한 2 단계 방식은 표준 CEA-DOTAM 이중특이적 항체, 7 일 후 Ca-DOTAM-덱스트란-500 CA, 그리고 CA 후 24 시간째에 ²¹²Pb-DOTAM을 이용한 3 단계 PRIT와 비교되었다.

CEA-분할-DOTAM-VH/VL 청소의 PK 데이터가 항체 주사 후 1 시간부터 7 일까지 반복된 혈액 샘플링에 의해 수집되고, 차후에 ELISA에 의해 분석되었다.

연구 개요는 도 7에서 도시된다. 도 7의 A는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서, CEA-분할-DOTAM-VH/VL PK에 대한 혈액 샘플링을 포함하는 2 단계 PRIT 섭생의 개요를 보여준다. 도 7의 B는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 생쥐에서 수행된, 3 단계 PRIT 섭생의 개요를 보여준다 (h = 시간, d = 일).

연구 설계

프로토콜 144의 시간 경과와 설계는 아래의 표에서 도시된다.

프로토콜 144의 시간 경과

프로토콜 144에서 연구 군

연구 0일 자에 RPMI/매트리겔에서 5x10⁶개 세포 (계대 26)를 오른쪽 옆구리 내로 SC 주입함으로써, 각 SCID 생쥐에서 고형 이종이식편이 확립되었다. 종양 세포 주입 14 일 후, 생쥐는 116 mm³의 평균 종양 용적을 갖는 실험군으로 분류되었다. ²¹²Pb-DOTAM이 접종 후 22일 자에 주사되었다; 평균 종양 용적은 21일 자에 140 mm³이었다.

군 Aa, Ba 및 Ca의 생쥐로부터 혈액이 CEA-분할-DOTAM-VH/VL주사 후 1 시간 (오른쪽 눈), 24 시간 (왼쪽 눈) 및 168 시간 (오른쪽 눈, 종료 시점)째에 마취하에 안와후 출혈을 통해 수집되었다. 유사하게, 샘플이 CEA-분할-DOTAM-VH/VL주사 후 4 시간 (오른쪽 눈), 72 시간 (왼쪽 눈) 및 168 시간 (오른쪽 눈, 종료 시점)째에 군 Ab, Bb 및 Cb의 생쥐로부터 채취되었다.

군 Aa, Ba, Ca 및 D의 생쥐는 ²¹²Pb-DOTAM의 주사 6 시간 후 희생되고 부검되었으며, 하기 장기와 조직이 방사성 내용물의 계측을 위해 수확되었다: 혈액, 피부, 방광, 위, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴골, 근육, 뇌, 꼬리, 귀 및 종양.

결과

주사 6 시간 후, 모든 수집된 조직에서 평균 ²¹²Pb 축적 및 청소율은 도 8에서 도시된다. CEA-분할-DOTAM-VH 또는 CEA-분할-DOTAM-VL 단독 중 어느 하나를 이용한 사전-표적화는 종양에서 방사능의 축적을 야기하지 않았다. 조합되면, 이들 2개의 상보적 항체는 표준 3 단계 PRIT 섭생에 대한 87 ± 15% ID/g와 비교하여, 2 단계 PRIT 후 65 ± 12% ID/g의 종양 흡수를 야기하였다. Tukey의 다중 비교 검정을 이용한 이원 변량 분석 (ANOVA)은 이들 2가지 PRIT 치료 사이에 종양 흡수의 차이가 방광에서의 차이 (2 단계와 3 단계 PRIT 각각에 대해 1 ± 2% ID/g 및 38 ± 17% ID/g)와 마찬가지로 유의미하다는 것을 보여주었다; 이러한 검사를 이용하면, 조직 축적에서 어떤 다른 차이도 통계학적으로 유의하지 않았다 (p = 0.05).

효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 분석된 바와 같은 IV 주사된 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 작제물의 청소율은 도 9에서 도시된다.

부작용 및 독성

본 연구와 관련된 부작용 또는 독성은 없었다.

결론

본 연구의 결과는 상보적 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체를 이용한 CA-독립된 2 단계 사전-표적화의 개념 증거를 증명하였다. 2 단계 PRIT 및 표준 3 단계 PRIT를 이용하여 ²¹²Pb-DOTAM의 높고 특이적인 종양 흡수가 달성되었는데, 이들 상보적 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체를 이용하면 정상 조직에서 방사능의 축적이 거의 없었다.

실시예 3c: 프로토콜 158

프로토콜 158의 목적은 제거제-독립된 2 단계 CEA-PRIT를 위해 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 이중파라토픽 (CH1A1A 및 A5B7) 쌍에 의해 사전-표적화된 생쥐에서 피하 BxPC3 종양에 대한 ²¹²Pb-DOTAM의 연관을 사정하는 것이었다. 종양 흡수는 표준 3 단계 CEA-PRIT의 것과 비교되었다.

피하 BxPC3 종양을 보유하는 생쥐는 다음 중 어느 한 가지가 주사되었다:

ㆍ CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체, 7 일 후 방사성-표지된 ²¹²Pb-DOTAM (2 단계 PRIT), 또는

ㆍ CEA-DOTAM BsAb, 7 일 후 CA, 그리고 최종적으로, 24 시간 후 방사성-표지된 ²¹²Pb-DOTAM (3 단계 PRIT).

²¹²Pb-DOTAM의 생체내 분포가 방사선 주사 6 시간 후 사정되었다. 연구 개요는 도 10에서 도시된다.

연구 설계

프로토콜 158의 시간 경과와 설계는 아래의 표에서 도시된다.

프로토콜 158의 시간 경과

프로토콜 158에서 연구 군

*35% 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 154 μg으로 조정된 P1AD8749 용량; **40% 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 167 μg으로 조정된 P1AD8592 용량.

연구 0일 자에 RPMI/매트리겔에서 5x10⁶개 세포 (계대 27)를 오른쪽 옆구리 내로 SC 주입함으로써, 각 SCID 생쥐에서 고형 이종이식편이 확립되었다. 종양 세포 주입 14 일 후, 생쥐는 177 mm³의 평균 종양 용적을 갖는 실험군으로 분류되었다. ²¹²Pb-DOTAM이 접종 후 20일 자에 주사되었다; 평균 종양 용적은 21일 자에 243 mm³이었다.

모든 군에서 생쥐는 ²¹²Pb-DOTAM의 주사 6 시간 후 희생되고 부검되었으며, 하기 장기와 조직이 방사성 내용물의 계측을 위해 수확되었다: 혈액, 피부, 방광, 위, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴골, 근육, 뇌, 꼬리 및 종양.

결과

주사 6 시간 후, 모든 수집된 조직에서 평균 ²¹²Pb 분포는 도 11에서 도시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 이용한 이원 변량 분석은, 양쪽 이중파라토픽 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍이 표준 3 단계 PRIT보다 더 낮은 축적을 산출한 방광을 제외하고, 이들 3가지 치료 사이에 ²¹²Pb의 정상 조직 흡수에서 어떤 유의미한 차이도 없다는 것을 보여주었다. 신장 흡수는 3가지 치료 모두에 대해 3-4% ID/g이었다. 어느 한쪽 이중파라토픽 조합은 3 단계 PRIT에 대한 67% ID/g와 비교하여, 대략 56% ID/g의 종양 축적을 야기하였다; 2 단계와 3 단계 PRIT 사이의 차이는 통계학적으로 유의하였다 (p < 0.0001).

부작용 및 독성

본 연구와 관련된 부작용 또는 독성은 없었다.

결론

본 연구는 표준 3 단계 PRIT와 비교하여, CA-독립된 2 단계 CEA-PRIT에 대한 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 이중파라토픽 쌍에 의해 사전-표적화된 생쥐에서 SC BxPC3 종양에 대한 ²¹²Pb-DOTAM의 연관을 사정하였다. 주사 6 시간 후 ²¹²Pb의 분포는 2 단계와 3 단계 PRIT에 대해 비슷하였는데, 종양에서는 높은 축적이 있었고 건강한 조직에서는 방사능이 거의 없었다. 이것은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체를 이용한 2 단계 CEA-PRIT에 대한 CEA 발현 종양의 이중파라토픽 사전-표적화의 개념 증거를 증명하였다.

실시예 3d: 프로토콜 160

프로토콜 160의 목적은 SC BxPC3 종양을 보유하는 생쥐에서, 상보적 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체를 이용한 CA-독립된 2 단계 CEA-PRIT의 3회 주기 후 치료 효능을 표준 3 단계 CEA-PRIT의 것과 비교하는 것이었다. 주사 전 ²¹²Pb-DOTAM와 함께 전항온처리된 BsAb를 이용한, 1 단계 CEA-RIT와 또한 비교되었다.

SC BxPC3 종양을 보유하는 생쥐는 다음 중 어느 한 가지가 주사되었다:

ㆍ CEA-DOTAM BsAb, 7 일 후 CA, 그리고 최종적으로, 24 시간 후 방사성-표지된 ²¹²Pb-DOTAM (3 단계 PRIT),

ㆍ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM BsAb (전항온처리됨; 1 단계 RIT).

상기 요법은 비-CEA 결합 대조 항체 (DIG-DOTAM) 및 치료 없음 (운반제)과의 비교를 또한 포함하여, 20 μCi의 ²¹²Pb-DOTAM의 3회 반복된 주기로 투여되었다. 각 치료 주기에서 ²¹²Pb-DOTAM 표적화 및 청소율을 확증하기 위한 생체분포 목적으로, 전용 생쥐가 희생되었다. 치료 효능이 TGI 및 TR의 관점에서 사정되었고, 이들 생쥐는 치료의 내약성을 사정하기 위해 연구의 지속 기간 동안 조심스럽게 모니터링되었다. 연구 개요는 도 12에서 도시된다.

프로토콜 160의 시간 경과와 설계는 아래의 표에서 도시된다.

프로토콜 160의 시간 경과

프로토콜 160에서 연구 군

*P1AD8749: 원액에서 35% 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 154 μg으로 조정된 용량; **P1AD8592; ***일차 치료 주기에서 급성 방사선 유발 독성으로 인해 3회 주기에서 1회 주기로 조정됨.

연구 0일 자에 RPMI/매트리겔에서 5x10⁶개 세포 (계대 24)를 오른쪽 옆구리 내로 SC 주입함으로써, SCID 생쥐에서 고형 이종이식편이 확립되었다. 종양 세포 주입 15 일 후, 생쥐는 122 mm³의 평균 종양 용적을 갖는 실험군으로 분류되었다. ²¹²Pb-DOTAM이 접종 후 23일 자에 주사되었다; 평균 종양 용적은 22일 자에 155 mm³이었다.

CEA-DOTAM 및 DIG-DOTAM 항체가 상기 표 (프로토콜 160에서 연구 군)에 따른 IP 투여를 위해 200 μL당 100 μg의 최종 농도로 운반제 완충액에 희석되었다. CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체가 200 μL당 100 μg의 각 작제물을 내포하는, IP 투여를 위한 하나의 단일 주사 용액 내로 함께 혼합되었다. P1AD8749의 경우에, 용량이 원액 (VH/VL을 보유하지 않는 분자의 쪽)에서 35% 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 154 μg으로 조정되었다. 도 12에서 실험 일정에 따라서, Ca-DOTAM-덱스트란-500 CA가 BsAb 주사 7 일 후 IP 투여되었고 (200 μL의 PBS당 25 μg), 24 시간 후 ²¹²Pb-DOTAM (RO7205834)이 뒤따랐다. PRIT 치료된 생쥐 (2 단계와 3 단계)는 100 μL의 Ca-퀀칭된 ²¹²Pb-DOTAM 용액 (100 μL 0.9% NaCl에서 20 μCi)이 IV 주사되었다.

1 단계 RIT로 치료된 생쥐는 단지 하나의 주사만 제공받았다: 사전 결합된 ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM (IV 주사를 위한 100 μL 0.9% NaCl에서 20 μCi/20 μg BsAb). ²¹²Pb-DOTAM를 CEA-DOTAM BsAb와 함께 37℃에서 10 분 동안 항온처리함으로써, 직접-표지화 항체가 제조되었다.

안락사의 시점에 군 A-E의 생쥐로부터 하기 장기와 조직이 수확되었다: 혈청, 간, 비장, 신장, 췌장 및 종양. 안락사 전, 살아있는 생쥐는 안와후 혈액 수집을 위해 마취되었다. 수집된 혈액 샘플이 10,000 rcf에서 5 분 동안 원심분리되었고, 결과의 혈청 분획물이 단리되고, 동결되고, -20℃에서 보관되었다. 절제된 조직이 10% 중성 완충된 포르말린 (4℃)에 즉시 넣어지고, 24 시간 후 1X PBS (4℃)로 이전되었다. 포르말린 고정된 샘플이 추가 처리 및 분석을 위해, Roche Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel Basel로 배송되었다.

군 F, G, J 및 M의 생쥐는 ²¹²Pb-DOTAM 또는 ²¹²Pb-DOTAM-BsAb의 제1이자 유일한 주사 후 24 시간째에 희생되고 부검되었으며; 군 H 및 K는 두 번째 ²¹²Pb-DOTAM 주사 후 24 시간째에 희생되고 부검되었으며; 군 I 및 L은 세 번째 ²¹²Pb-DOTAM 주사 후 24 시간째에 희생되고 부검되었다. 안락사의 시점에 경부 탈구를 통한 종료 전, 마취된 생쥐에서 안와후 출혈을 이용하여 혈액이 정맥동으로부터 수집되었다. 하기 장기와 조직이 또한, 생체분포 목적으로 수확되었다: 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 근육, 꼬리, 피부 및 종양.

결과

주사 24 시간 후, 모든 수집된 조직에서 평균 ²¹²Pb 축적 및 청소율이 도 13에서 각 요법 및 치료 주기에 대해 도시된다. 음성 대조는 종양에서 흡수가 없었다 (0.4% ID/g). Tukey의 다중 비교 검정을 이용한 이원 변량 분석 (ANOVA)은 이들 분포가 2 단계와 3 단계 PRIT에 대해 어떤 주기에서도 유의미하게 상이하지 않다는 것을 보여주었다; 하지만, 음성 대조 및 1 단계 RIT와 비교하여, 모든 주기에서 차이가 통계학적으로 유의하였다 (p < 0.05). 종양 흡수는 3 단계 PRIT의 경우에 25-45% ID/g 및 2 단계 PRIT의 경우에 25-30% ID/g이었으며, 치료 또는 주기 사이에 어떤 통계학적으로 유의한 차이도 없었다. 1 단계 RIT의 경우에, 종양 흡수는 하나의 유일한 치료 주기에서 99%이었다. 정상 조직에서 흡수는 양쪽 PRIT 섭생의 경우에는 매우 낮지만, 1 단계 RIT 후, 작은 방사성-표지된 DOTAM 킬레이트와 비교하여 전항온처리된 항체의 훨씬 긴 순환 시간으로 인해 모든 장기와 조직에서 훨씬 높았다.

평균 종양 발달 및 개별 종양 성장 곡선은 각각, 도 14 및 도 15에서 도시된다. 비치료된 운반제 군 및 DIG-DOTAM 군은 후자가 세 번째 치료 후 약간 더 낮은 배증 속도를 갖긴 하지만, 종양이 꾸준히 성장하였다. 대조적으로, PRIT 및 RIT 군에서 종양은 일차 치료 주기 후 크기가 감소하였고, 종양의 크기가 증가하기 시작하는, 접종 후 대략 10 주 때까지 종양 억제를 유지하였다. 2 단계와 3 단계 PRIT 치료는 거의 동일한 종양 억제를 야기하였다. 종양이 완전히 퇴화하지는 않았다.

모든 치료군이 평균에 근거하여 분석될 수 있는 최종일인 연구 83일 자에, TGI는 운반제 대조와 비교하여, CEA-DOTAM (3 단계) 및 CEA-분할-DOTAM-VH/VL (2-단계)을 이용한 PRIT에 대해 각각 91.7% 및 88.4%이었다. 1 단계 RIT에 대한 상응하는 수치는 72.6%이었고, 반면 비특이적 DIG-DOTAM 대조의 경우에는 TGI가 -59.7%이었다. 동일자에, 평균에 근거된 TR은 3 단계 CEA-DOTAM PRIT의 경우에 -1.9, 2 단계 CEA-분할-DOTAM-VH/VL PRIT의 경우에 -2.9, 1 단계 RIT의 경우에 -4.7, DIG-DOTAM PRIT의 경우에 -28.8, 그리고 운반제 대조의 경우에 -39.3이었다.

아래에 설명된 부작용으로 인해, 생존 분석은 통계학적으로 유관한 것으로 간주되지 않았다.

부작용 및 독성

모든 요법 군에서 BW 발달은 도 16에서 도시된다. 20 μCi의 ²¹²Pb-DOTAM를 이용한 2 단계와 3 단계 PRIT의 복수의 주기는 내약성이 양호했지만, 1 단계 RIT를 제공받는 생쥐에서는 급성 BW 감소가 발생하였는데, 군 E에서 8/10마리 생쥐가 20% 이상의 BW 하락으로 인해 첫 번째 RIT 주기 후 (²¹²Pb 방사선조사 6-11 일 후) 안락사되었다. 나머지 2마리의 RIT 생쥐는 어떤 추가 ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM 주사도 제공되지 않았지만, 종양 성장 사정을 위해 연속적으로 추적 조사되었다.

이에 더하여, 나빠지는 종양 상태, 다시 말하면 개방되거나 또는 누출되는 종양으로 인한 윤리적 이유로 다수의 생쥐가 희생되었다. DIG-DOTAM 군에서, 9/10마리 생쥐가 이런 이유로 3000 mm³의 종양 용적에 도달하기 전 안락사되었다; 비치료된 운반제 대조의 경우에, 상응하는 수치는 5/10마리이었다. PRIT 및 RIT 군에서는 이러한 문제가 덜 확연하였는데, 3 단계 PRIT, 2 단계 PRIT 및 1 단계 RIT 군 각각에서 1/10마리, 2/10마리 및 2/10마리 생쥐가 이런 이유로 안락사되었다. 이것은 도 15의 개별 종양 성장 곡선에서 반영된다.

마지막으로, 군 C에서 1마리 생쥐가 항문 아래 나빠지는 상처로 인해 안락사되었다.

모든 부작용은 아래의 표에서 열거된다.

프로토콜 160에서 부작용

²¹²Pb 방사선조사가 연구 23일 자 (1차 주기), 37일 자 (2차 주기) 및 51일 자 (3차 주기)에 수행되었다.

결론

3 단계 방식 (CEA-DOTAM BsAb, CA 및 ²¹²Pb-DOTAM) 및 2 단계 방식 (CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체 및 ²¹²Pb-DOTAM)을 이용한 CEA-PRIT 사이에 어떤 차이도 목격되지 않았다; TGI가 이들 2가지 치료에 대해 유의미하고 거의 동일하였으며, 20 μCi의 3회 주기가 양쪽 사례에서 안전하게 투여될 수 있었다. 대조적으로, 주사 전 CEA-DOTAM에 사전 결합된 20 μCi의 ²¹²Pb-DOTAM (1-단계 RIT)은 치료된 생쥐 중 대다수에서 내약성이 아니었다.

본 연구는 따라서, 개발된 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 작제물을 이용한 CA-독립된 2 단계 PRIT의 내약성 및 치료 효능을 증명하였다.

실시예 4: 프로토콜 175

프로토콜 175의 목적은 종양 및 건강한 조직에서 후속 ²¹²Pb 축적에 대한 증가된 주사된 사전-표적화 항체 양의 영향을 사정하는 것이었다. CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 2가지 상이한 용량이 비교되었다: 기준량 (100 μg) 및 2.5 배 높은 용량 (250 μg). 게다가, 항약물 항체 (ADA) 형성을 방지하기 위해 CEA-분할-DOTAM-VH 작제물의 VH를 확장하는 변형이 만들어졌다 (이것은 이전에 검사된 CEA-분할-DOTAM-VL 작제물과 함께 이용되었다). VH는 항체 CH1 도메인으로부터 첫 3개의 아미노산: 알라닌, 세린 및 트레오닌 (AST)을 포함하도록 확장되었고, 상기 작제물은 차후에 CEA-분할-DOTAM-VH-AST로서 지칭되었다.

항체 P1AD8592는 상기 실시예 1에서 이미 설명되었다. P1AF0171은 융합 HC가 잔기 AST에 의해 확장되는 점을 제외하고, P1AD8749와 동일하다 - 따라서, 항체 P1AD0171은 전술된 바와 같은 경쇄 D1AA3384 (서열 번호: 34), 전술된 바와 같은 첫 번째 중쇄 D1AC4022 (서열 번호: 28), 그리고 아래에 도시된 바와 같은 두 번째 중쇄 D1AE3669로 구성된다:

D1AE3669 (HCknob <CEA> CH1A1A Dotam-VH-AST)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSAST (서열 번호: 147)

ㆍ 1x 표준 용량의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb, 7 일 후 방사성-표지된 ²¹²Pb-DOTAM, 또는

ㆍ 2.5x 표준 용량의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb, 7 일 후 방사성-표지된 ²¹²Pb-DOTAM.

²¹²Pb-DOTAM의 생체내 분포가 방사선 주사 24 시간 후 사정되었다. 연구 개요는 도 17에서 도시된다.

연구 설계

프로토콜 175의 시간 경과와 설계는 아래에 도시된다.

프로토콜 175의 시간 경과

*낮은 화합물 농도 (작제물마다 200 μL = 전체적으로 400 μL)로 인해 IP 주사가 필요함

프로토콜 175에서 연구 군

*~30% 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 143 및 357 μg으로 조정된 P1AF0171 용량.

연구 0일 자에 RPMI/매트리겔에서 5x10⁶개 세포 (계대 24)를 오른쪽 옆구리 내로 SC 주입함으로써, 각 SCID 생쥐에서 고형 이종이식편이 확립되었다. 종양 세포 주입 21 일 후, 생쥐는 310 mm³의 평균 종양 용적을 갖는 실험군으로 분류되었다. ²¹²Pb-DOTAM이 접종 후 29일 자에 주사되었다; 평균 종양 용적은 30일 자에 462 mm³이었다.

모든 생쥐는 ²¹²Pb-DOTAM의 주사 24 시간 후 희생되고 부검되었으며, 하기 장기와 조직이 방사성 내용물의 계측을 위해 수확되었다: 혈액, 피부, 비장, 췌장, 신장, 간, 근육, 꼬리 및 종양.

결과

주사 24 시간 후, 모든 수집된 조직에서 평균 ²¹²Pb 분포는 도 18에서 도시된다. 2가지 용량 수준 사이에 ²¹²Pb의 종양 또는 정상 조직 흡수에서 어떤 유의미한 차이도 없었다. 종양 축적은 양쪽 치료군에 대해 30-31% ID/g이었고, 이 시점에서 <2% ID/g의 신장 흡수를 가졌다. 1마리 생쥐가 ²¹²Pb-DOTAM 주사 문제로 인해 꼬리에서 ~1 %ID/g을 갖긴 했지만, 다른 수집된 건강한 조직에서는 감지 가능한 ²¹²Pb 축적이 나타나지 않았다.

부작용 및 독성

본 연구와 관련된 부작용 또는 독성은 없었다.

결론

사전-표적화 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 용량을 2.5배 증가시키는 것은 이러한 생체내 모형에서, 차후에 투여된 ²¹²Pb-DOTAM의 종양 축적을 향상시키지 못하였다. 하지만, 이것은 또한, 정상 조직에서 방사능의 축적을 증가시키지 않았는데, 이것은 이러한 2 단계 사전-표적화 섭생을 이용하여 달성된 강한 특이성을 부각시킨다. 최종적으로, 이들 결과는 확장된-VH CEA-분할-DOTAM-VH-AST 작제물의 기능을 실증하였다.

실시예 5: 프로토콜 185

프로토콜 185의 목적은 T84.66 에피토프를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL을 사정하는 것이었다. P1AF0709 및 P1AF0298의 서열은 본원에서 제공된다. P1AF0709는 D1AE4688 (서열 번호: 83)의 첫 번째 중쇄 및 D1AA4920 (서열 번호: 84)의 두 번째 중쇄를 갖는다. P1AF0298은 D1AE4687 (서열 번호: 86)의 첫 번째 중쇄 및 D1AE3668 (서열 번호: 87)의 두 번째 중쇄를 갖는다. 둘 모두 D1AA4120 (서열 번호: 89)의 경쇄를 갖는다.

SC BxPC3 종양을 보유하는 생쥐는 표준 용량의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb (항체마다 100 μg), 6 일 후 방사성-표지된 ²¹²Pb-DOTAM이 주사되었다. ²¹²Pb-DOTAM의 생체내 분포가 방사선 주사 6 시간 후 사정되었다. 연구 개요는 도 19에서 도시된다.

연구 설계

프로토콜 185의 시간 경과와 설계는 아래에 도시된다.

프로토콜 185의 시간 경과

프로토콜 185에서 연구 군

*~30% 홀/홀 불순물을 보상하기 위해 143 μg으로 조정된 P1AF0171 용량.

연구 0일 자에 RPMI/매트리겔에서 5x10⁶개 세포 (계대 27)를 오른쪽 옆구리 내로 SC 주입함으로써, 각 SCID 생쥐에서 고형 이종이식편이 확립되었다. 종양 세포 주입 22 일 후, 생쥐는 224 mm³의 평균 종양 용적을 갖는 실험군으로 분류되었다. ²¹²Pb-DOTAM이 접종 후 28일 자에 주사되었는데, 이 시점에서 평균 종양 용적은 385 mm³에 도달하였다.

모든 생쥐는 ²¹²Pb-DOTAM의 주사 6 시간 후 희생되고 부검되었으며, 하기 장기와 조직이 방사성 내용물의 계측을 위해 수확되었다: 혈액, 피부, 비장, 췌장, 신장, 간, 근육, 꼬리 및 종양. 수집된 종양이 2개의 조각으로 분할되었다: 하나는 방사성 내용물에 대해 계측되었고, 다른 것은 Tissue-Tek® 최적 절삭 온도 (OCT) 삽입 배지를 내포하는 크리오몰드에 넣어지고 급속 동결을 위해 드라이아이스 위에 놓였다. OCT에서 동결된 샘플은 냉동절편, 면역형광 염색, 그리고 Zeiss Axio Scope.A1 모듈식 현미경을 이용한 분석 전, -80℃에서 유지되었다.

결과

주사 6 시간 후, 모든 수집된 조직에서 평균 ²¹²Pb 분포는 도 20에서 도시된다. 종양 축적은 40% ID/g (CH1A1A) 또는 44% ID/g (T84.66)이었다. 방사능의 유일한 다른 감지 가능한 축적은 신장에서 발견되었다: 2개의 군에 대해 p.i. 6 시간째에 3-5% ID/g.

T84.66 (군 A) 또는 CH1A1A (군 B) 중 어느 하나를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍의 종양내 분포의 실례는 도 21에서 도시된다. 패널 A와 C는 CEA 발현이 BxPC3 종양에서 높고 균일하다는 것을 보여주고, 패널 B와 D는 주사 7 일 후 항체 분포가 유사하게 분포된다는 것을 보여준다. 하지만, 군 A로부터 획득된 샘플은 군 B로부터 획득된 종양 샘플과 비교하여, 전반적으로 더 강한 신호를 나타냈는데, 이것은 T84.66이 CH1A1A보다 강한 결합체라는 증거를 제공한다.

부작용 및 독성

본 연구와 관련된 부작용 또는 독성은 없었다.

결론

이들 결과는 CEA의 T84.66 에피토프를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 작제물의 기능을 실증하였다. 사전-표적화된 CEA 발현 종양에서 212Pb의 결과적인 축적은 높고 특이적이었으며, CH1A1A 또는 T84.66 에피토프 중 어느 하나를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍은 CEA 발현 종양 내부에 균일하게 분포되었다.

실시예 6: 프로토콜 189

프로토콜 189의 목적은 CH1A1A VH-AST/VL을 표적으로 하는 양성 대조 쌍과 비교하여, T84.66 VH-AST/CH1A1A VL 및 T84.66 VL/CH1A1 VH-AST를 표적으로 하는 이중파라토픽 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체 쌍을 사정하는 것이었다. 이러한 이중파라토픽 조합은 2개의 에피토프 중에서 하나 (예를 들면 T84.66)만을 발현하는 가용성 CEA에서 완전 Pb-DOTAM 결합체의 형성을 불가능하게 만들고, 그것에 의하여 이의 잠재적인 부정적인 효과, 예컨대 증가된 순환 방사능 및 연관된 방사선 유발 독성, 그리고 종양 외 표적과의 경쟁으로 인한 감소된 효능을 경감하였다.

SC BxPC3 종양을 보유하는 생쥐는 표준 용량의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb (항체마다 100 μg), 7 일 후 방사성-표지된 ²¹²Pb-DOTAM이 주사되었다. ²¹²Pb-DOTAM의 생체내 분포가 방사선 주사 6 시간 후 사정되었다. 연구 개요는 도 22에서 도시된다.

연구 설계

프로토콜 189의 시간 경과와 설계는 아래에 도시된다.

프로토콜 189의 시간 경과

프로토콜 189에서 연구 군

연구 0일 자에 RPMI/매트리겔에서 5x10⁶개 세포 (계대 31)를 오른쪽 옆구리 내로 SC 주입함으로써, 각 SCID 생쥐에서 고형 이종이식편이 확립되었다. 종양 세포 주입 14 일 후, 생쥐는 343 mm³의 평균 종양 용적을 갖는 실험군으로 분류되었다. ²¹²Pb-DOTAM이 접종 후 22일 자에 주사되었다; 평균 종양 용적은 21일 자에 557 mm³에 도달하였다.

모든 생쥐는 ²¹²Pb-DOTAM의 주사 6 시간 후 희생되고 부검되었으며, 하기 장기와 조직이 방사성 내용물의 계측을 위해 수확되었다: 혈액, 피부, 비장, 췌장, 신장, 간, 근육, 꼬리 및 종양.

결과

주사 6 시간 후, 모든 수집된 조직에서 평균 ²¹²Pb 분포는 도 23에서 도시된다. 이중파라토픽 변이의 종양 축적은 T84.66 VH-AST + CH1A1A VL 및 T84.66 VL + CH1A1A VH-AST 각각에 대해 71% ID/g 및 46% ID/g이었다. 양성 CH1A1A 대조는 37% ID/g를 야기하였다. Tukey의 다중 비교 검정을 이용한 이원 변량 분석은 3개의 군 모두 종양 흡수의 관점에서 서로 매우 상이하다는 것을 보여주었다 (2개의 다른 군과 대비하여 T84.66 VH-AST + CH1A1A VL의 경우에 p<0.0001; CH1A1A 단독과 대비하여 T84.66 VL + CH1A1A VH-AST의 경우에 p = 0.0020). 비록 2개의 다른 군과 비교하여 T84.66 VH-AST + CH1A1A VL 조합의 경우에 혈액에서 약간 더 높은 체류: <1% ID/g와 비교하여 2% ID/g가 나타나긴 했지만, 어떤 다른 장기도 군 사이에 통계학적으로 유의한 차이를 보여주지 않았다. 신장 흡수는 비록 통계학적으로 유의한 것은 아니지만, 유사하게 약간 더 높았다: 다른 2개의 군에 대해 3% ID/g와 비교하여 T84.66 VH-AST + CH1A1A에 대해 4.5% ID/g.

부작용 및 독성

본 연구와 관련된 부작용 또는 독성은 없었다. 하지만, BxPC3 종양 성장이 훨씬 빨랐고, 더 큰 가변성으로, 본 연구에서 표준 성장률과 비교되었다. 부검 시에, 큰 종양 (대부분)이 액체로 채워져 있고 방사능 계측 전에 종양을 반으로 자르면 상기 액체가 비워지는 것으로 결론되었다; 이 액체는 아마도, 가속화된 성장률을 야기하긴 하지만 %IA/g에는 크게 영향을 주지 않았는데, 그 이유는 이들 종양이 개방된 후 계량되고 계측되었기 때문이다.

결론

이들 결과는 검사된 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 작제물을 이용한, CEA의 T84.66 및 CH1A1A 에피토프의 이중파라토픽 표적화의 기능을 실증하였고, 양성 CH1A1A 대조와 비교하여 이러한 조합에 대한 놀랍도록 높은 효능을 증명하였다. 사전-표적화된 CEA 발현 종양에서 ²¹²Pb의 결과적인 축적은 높고 특이적이었는데, 이것은 T84.66 VH-AST + CH1A1A VL 쌍에 대한 특정한 이점을 암시한다.

실시예 7

본 실시예에서는 본원에서 설명된 바와 같은 분할 항체에 의한, Pb-DOTA의 세포로의 모집을 조사한다.

P1AF0712는 서열 번호: 97의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 98의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 103의 경쇄를 갖는다. P1AF0713은 서열 번호: 100의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 101의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 103의 경쇄를 갖는다.

MKN-45 세포가 트립신을 이용하여 배양병으로부터 분리되고 Casy 세포 계수기를 이용하여 계수되었다. 4℃에서 펠렛팅한 후, 300g 세포가 FACS 완충액 (PBS에서 2.5% FCS)에서 재현탁되어, 96 웰 PP V-바닥-Platte (25 μL/웰 = 5.0E+04Zellen/웰)에 분여되는 2.0E+06 세포 /mL로 조정되었다.

DOTA-FITC를 이용한 FACS 염색

CEA 특이적 SPLIT 항체 (각각 P1AF0712 또는 P1AF0713)는 FACS 완충액에서 40 μg/mL로 조정되어, 10 μg/mL의 최종 농도가 되었다. 양쪽 항체는 조합되거나 또는 분리되어 세포에 첨가되고, 그 이후에 완충액이 첨가되고 4℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 차후에, FITC로 표지화된 Pb-DOTA가 이들 항체와 동몰 비율로 세포에 첨가되고 4℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 이들 세포는 이후, FACS 완충액에서 2회 세척되고, FACS Canto (BD, Pharmingen)를 이용한 계측을 위해 70 μl/웰 FACS 완충액에서 재현탁되었다. SPLIT 절반 중 어느 것도 형광 신호를 발생시키지 않는 것으로 밝혀졌는데 (도 24), 이것은 Pb-DOTA 결합 능력의 결여를 암시한다. 양쪽 SPLIT 절반의 조합만 Pb-DOTAM-FITC를 표적 세포로 모집할 수 있었다 (도 24).

<huIgG(H+L)A488>를 이용한 FACS 염색

CEA 특이적 SPLIT 항체 (각각 P1AF0712 또는 P1AF0713)는 FACS 완충액에서 40 μg/mL로 조정되어, 10 μg/mL의 최종 농도가 되었다. 양쪽 항체는 조합되거나 또는 분리되어 세포에 첨가되고, 그 이후에 완충액이 첨가되고 4℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 이들 세포는 이후, FACS 완충액에서 2회 세척되었다. 세척 후, 이들 세포는 이차 항체 (<huIgG(H+L)>-Alexa488, c=10 μg/mL)를 내포하는 50 μL FACS-완충액에서 재현탁되고 4℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 이들 세포는 이후, FACS 완충액에서 2회 세척되고, FACS Canto (BD, Pharmingen)를 이용한 계측을 위해 70 μl/웰 FACS 완충액에서 재현탁되었다. 양쪽 SPLIT 항체에 대한 EC50은 비슷하였는데, 이것은 양쪽 SPLIT 항체의 CEA 특이적 세포 결합을 암시한다. 혼합물 내에 더 많은 양의 항체로 인해, 아래의 표에서 볼 수 있는 바와 같이, 더 낮은 EC50이 이들 환경하에 획득되었다.

SPLIT 항체의 EC50 결정

이차 항체 기초된 검출 (<hu>488, 위쪽 패널) 또는 Pb-DOTA-FITC (DOTA-FITC, 아래쪽 패널) 중 어느 한 가지를 이용하여, EC50이 SPLIT 항체에 대해 결정되었다

실시예 8: Biacore 결합 실험

본 실시예에서는 참조 항체 CEA-DOTAM (RO7198427, PRIT-0213)와 비교하여, DOTAM에 대해 개별적으로 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL의 결합을 검사한다. 이것은 참조 항체와 비교하여, TA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍에 대한 DOTAM의 결합을 더욱 검사한다.

본 실시예에서 이용된 코딩 및 본 출원의 다른 곳에서 이용된 단백질 번호 사이의 대응은 아래에 도시된다. 서열 역시 제공된다. 참조 항체는 본 실시예에서 "PRIT_RS"로서 코딩된다.

이들 실험을 위해, PRIT SPLIT 항체가 MabSelect Sure (친화성 크로마토그래피)의 첫 번째 단계 및 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들면 POROS XS)의 두 번째 단계에 의해 정제되고, 이후 Superdex 200 (크기 배제 크로마토그래피)에 의해 연마되었다.

이들 실험은 25 ℃ 계측 온도에서 Biacore T200으로 수행되었다. 모든 Biacore T200 실험은 HBS-P+ (GE Healthcare, Br-1008-27) pH 7,4 작업 완충액에서 수행되었다. 상이한 DOTAM 분획물을 이용하여, 각각의 검사 항체/항체 쌍에 대해 2번의 실험이 수행되었다.

1. 첫 번째 실험에서, 칩 상에 포획된 비오틴화된 DOTAM에 대한 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체의 결합이 참조 항체에 비하여 사정되었다.

DOTAM (HBS-P+에서 120 nM 용액)이 CAP 칩 표면 상에 높은 밀도로 포획되었다 (10μl/분, 60 초). 이후 전구약물_A 또는 전구약물_B의 HBS-P+에서 600 nM 용액이 DOTAM 표면 위에 주입되었다 (10μl/분, 90 초). 해리가 10 μl/분의 유속에서 240 초 동안 모니터링되었다. 상대적 최대 반응 결정이 T200 평가 소프트웨어를 이용하여 평가되었다.

결과는 도 26에서 도시된다. 이들 개별 항체 중 어느 것도, 포획된 DOTAM에 결합을 보여주지 않았다.

2. 두 번째 실험에서, 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체가 먼저, 고정된 항-hFab를 이용하여 칩 상에 포획되었고, 이후 DOTAM-모노스트렙타비딘 복합체 (DOTAM + 모노스트렙타비딘 연계 600nM, 1:1 mol, 실온에서 1 시간)의 결합이 사정되었다.

전구약물_A 또는 전구약물 B의 HBS-P+에서 600 nM 용액이 항 hFab (GE Healthcare, BR-1008-27) CM5 칩 표면 (10μl/분, 120 초) 위에 주입되었다. 전구약물 A 또는 B 용액의 높은 밀도 포획 후, DOTAM-모노스트렙타비딘 복합체가 주입되었다 (20μl/분, 90 초). 해리가 20 μl/분의 유속에서 180 초 동안 모니터링되었다. 새로운 주기를 위해, 글리신 2.1 및 10μl/분으로 75 초 재생 시간을 이용함으로써 표면이 재생되었다. 상대적 최대 반응 결정이 T200 평가 소프트웨어를 이용하여 평가되었다.

결과는 도 27에서 도시된다. 낮은 백분율 최대 반응 (상기 도면에서 *로서 표시됨)은 "흔적" 또는 DOTAM-SA와의 비특이적 상호작용인 것으로 생각되고, 검정을 최적화해야 하는 필요성을 반영한다.

3. 세 번째 실험에서, DOTAM에 대한 TA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍의 결합이 참조 항체와 비교하여 사정된다. 항체가 먼저, 고정된 항-hFab를 이용하여 칩 상에 포획되었고, 이후 DOTAM-모노스트렙타비딘 복합체 (DOTAM + 모노스트렙타비딘 연계 600nM, 1:1 mol, 실온에서 1 시간)의 결합이 사정되었다.

전구약물_A 및 전구약물 B의 HBS-P+에서 300 nM 용액이 항 hFab (GE Healthcare, BR-1008-27) CM5 칩 표면 위에 주입되었다 (10μl/분, 120 초). 전구약물 A와 B 용액의 높은 밀도 포획 후, DOTAM-모노스트렙타비딘 복합체가 주입되었다 (20μl/분, 90 초). 해리가 20 μl/분의 유속에서 180 초 동안 모니터링되었다. 새로운 주기를 위해, 글리신 2.1 및 10μl/분으로 75 초 재생 시간을 이용함으로써 표면이 재생되었다. 상대적 최대 반응 결정이 T200 평가 소프트웨어를 이용하여 평가되었다.

결과는 도 28에서 도시된다. 모든 TA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍은 DOTA 결합체인 P6_AB (P1AF0712/P1AF0713) 쌍을 제외하고, DOTAM에 대해 유의미한 양의 결합을 보여주었다.

TA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍에 대해 유의미한 양의 DOTAM 결합을 보여주지만, 상기 쌍의 개별 구성원에 대해서는 그렇지 않은 유사한 결과가 FAP-결합체 P1AF8286 및 P1AF8287에 대해 또한 획득되었다. P1AF8286은 서열 번호: 108의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 109의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 111의 경쇄로 구성되고, P1AF8287은 서열 번호: 108의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 110의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 111의 경쇄로 구성된다. 하지만, 이러한 검정은 여전히 최적화되어야 한다.

실시예 9 CEA-분할-DOTAM VH/VL 항체의 생성

본 실시예에서는 도 25의 C에 도시된 바와 같은 형식을 갖는 항체의 생성을 설명한다.

원하는 단백질이 인간 배아 신장 세포 (HEK 293)의 일시적인 형질감염에 의해 발현되었다. 원하는 유전자/단백질의 발현을 위해, 하기 기능적 요소를 포함하는 전사 단위가 이용되었다:

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역 (5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (SS),

- 발현되는 유전자/단백질, 그리고

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).

- 대장균 (E. coli)에서 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 내포한다.

SPLIT 항체 분자의 일시적인 발현

SPLIT 분자의 일시적인 발현이 형질감염 시약 Expifectamine^TM 293 (Life Technologies)을 이용하여 현탁 적응 HEK Expi293F^TM (Life Technologies) 세포에서 수행되었다.

세포가 125 ml 진탕 플라스크 (37℃, 7 % CO2, 85 % 습도, 135 rpm에서 배양/진탕한다)에서 해동 후, 적어도 4회 희석 (용적 30 ml)에 의해 계대되었다. 이들 세포는 250 ml 용적에서 0.5-2.4x10⁶개 세포/ml로 확대되었다. 이후 세포가 분할되고 1 리터 진탕 플라스크에서 250 ml 용적에서 6x10⁵개 세포/ml의 밀도로 파종되었다. 24 시간 후, 대략 2.2-2.8x10⁶개 세포/ml의 세포 밀도로 형질감염이 수행되었다.

형질감염 전 250 μg 플라스미드-DNA가, 예열된 (수조; 37℃) Opti-MEM (Life Technologies)을 이용하여 12.5 ml의 최종 용적으로 희석되었다. 병렬적으로, ExpiFectamine 형질감염 시약이 12.5 ml Optim-MEM에서 준비되었다. 양쪽 용액은 실온에서 5 분 이하 동안 배양되고, 이후 온건한 혼합에 의해 합쳐지고, 그 이후에 실온에서 15-20 분 동안 배양되었다. 총 용적의 혼합물이 250 ml HEK-세포 배양 용적을 갖는 1 L 진탕 플라스크에 적가 방식으로 첨가되었다.

37℃, 7 % CO2, 85 % 습도, 135 rpm에서 6 또는 7 일 동안 배양/진탕한다. 16-24 시간 후, 1.25 ml 인핸서 1 (Life Technologies), 12.5 ml 인핸서 2 (Life Technologies) 및 3 g/L의 최종 농도로 글루코오스가 각 250 ml 배양액에 첨가되었다.

상층액이 2,000 rpm, 4℃에서 10 분 동안 첫 번째 원심분리 단계에 의해 수확되었다. 이후 이들 상층액은 4,000 rpm, 4℃에서, 20 분 동안 두 번째 스핀을 위해 새로운 원심분리 플라스크 내로 이전되었다. 그 후에 무세포 상층액이 0.22 μm 바틀탑-필터를 통해 여과되고 냉동기 (-20 ℃)에서 보관되었다.

SPLIT 항체 작제물의 정제

항원 결합 분자 내포 배양 상층액이 여과되고 2번 또는 3번의 크로마토그래피 단계에 의해 정제되었다. 항체가 PBS (1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4로 평형화된 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare)를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 포획되었다. 결합되지 않은 단백질이 평형화 완충액으로 세척함으로써 제거되었고, 항원 결합 분자가 100 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 3.0으로 회수되고, 용리 직후에 1 M 트리스-염기, pH 9.0을 이용하여 pH 6.0으로 중화되었다. POROSTM 50 XS (ThermoFisher)에서 이온 교환 크로마토그래피가 N 말단 융합 작제물에 대한 중간 정제 단계로서 이용되었다. 40 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.5를 부하 및 세척 완충액으로서 이용하여, 이온 교환 크로마토그래피가 수행되었다. 용리가 750 mM 아세트산나트륨 pH 5.5까지의 구배로 수행되었다. 분획물이 수집되고 CE-SDS 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 원하는 산물을 내포하는 분획물은 한 데 모아지고 마지막 크로마토그래피 단계에서 연마되었다. Superdex 200^TM (GE Healthcare)에서 크기 배제 크로마토그래피가 최종 정제 단계로서 이용되었다. 크기 배제 크로마토그래피는 20 mM 히스티딘 완충액, 0.14 M NaCl, pH 6.0에서 수행되었다. 이중특이적 항원 결합 분자 내포 용액이, 셀룰로오스 막 (Millipore, Billerica, MA)이 구비된 Amicon Ultra 원심 필터 단위로 농축되고 -80℃에서 보관되었다.

실시예 10: 발현 분석

단백질 수율이 도 25의 C에 도시된 바와 같은 N 말단 융합 형식을 갖는 2가지 상이한 항체 세트에 대해 계측되었다. 첫 번째 세트에서, 인간화 DOTAM 결합체의 VH와 VL 도메인이 VH 도메인에 대한 N 말단 Q 및 VL 도메인에 대한 N 말단 A를 내포하였다. 두 번째 세트에서, 이들은 각각, N 말단 G 및 S를 내포하였다. 이러한 형식에서, 인간화 DOTAM 결합체의 VH 도메인을 내포하는 항체는 N 말단 G는 성공적으로 발현되지 않지만 N 말단 Q는 성공적으로 발현되는 것으로 관찰되었다. G는 VH 도메인 내에 이 위치에서 전형적인 잔기가 아니다. VL 도메인을 내포하는 항체는 N 말단 S 또는 A 잔기 중 어느 하나가 성공적으로 발현되었는데, 이들 둘 모두 VL 도메인 내에 이 위치에서 전형적인 잔기이다. 결과는 아래의 표에서 도시된다.

실시예 11: Biacore 결합 실험

본 실시예에서는 DOTAM에 대한, 도 25의 C에 도시된 바와 같은 N 말단 융합 형식을 갖는 항체의 결합을 검사한다. 검사된 헤미바디는 전술된 바와 같은 P1AG1807 (TA-분할-DOTAM-VL) 및 P1AG1806 (TA-분할-DOTAM-VH)이었다. 이들은 하기 논의에서 "전구약물 A" 및 "전구약물 B"로서 또한 지칭된다.

2가지 실험 설정이 이용되었다.

1. 첫 번째 실험 설정에서, 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체가 먼저, 고정된 항-hFab를 이용하여 칩 상에 포획되었고, 이후 비오틴화된 Pb-DOTAM의 2가지 거울상이성질체의 결합이 사정되었다.

이들 실험은 25 ℃ 계측 온도에서 Biacore T200으로 수행되었다. 모든 Biacore T200 실험은 HBS-P+ (GE Healthcare, Br-1008-27) pH 7,4 작업 완충액에서 수행되었다. 전구약물_A 또는 전구약물_B의 HBS-P+에서 30 nM 용액이 항 hFc (GE Healthcare, BR-1008-39) CM5 칩 표면 위에 주입되었다 (10μl/분, 60 초). 전구약물 A 또는 B 용액의 높은 밀도 포획 후, 50nM DOTAM 용액 (10μl/분, 120 초), 이후 200nM 모노스트렙타비딘 용액 (10μl/분, 90 초)이 주입되었다. 해리가 10 μl/분의 유속에서 120 초 동안 모니터링되었다. 새로운 주기를 위해, 3M MgCl2 및 60 초 재생 시간을 이용함으로써 표면이 재생되었다. 상대적 반응 결정이 T200 평가 소프트웨어에 의해 평가되었다.

결합이 참조 항체 CEA-DOTAM (RO7198427, PRIT-0213)에 비하여 사정되었다. 결과는 도 29에서 도시된다. 전구약물 쌍 (P1AG1807 및 P1AG1806)이 안정되고 참조 항체에 대해 비슷한 DOTAM 결합을 갖는다는 것을 알 수 있다.

결합이 또한, 상기 쌍의 개별 구성원에 대해서 뿐만 아니라 양쪽 구성원 조합에 대해 사정되었다. (VH= P1AG1806; VL= P1AG1807). 단일 전구약물 VL 또는 VH의 경우에는 어떤 DOTAM 상호작용도 목격되지 않았고, 양쪽이 함께 있는 경우에 유의미한 결합이 목격되었다. 도 30을 참조한다.

2. 두 번째 실험 설정에서, 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체가 먼저, 고정된 CEA를 이용하여 칩 상에 포획되었고, 이후 비오틴화된 Pb-DOTAM의 2가지 거울상이성질체의 결합이 사정되었다.

이들 실험은 25 ℃ 계측 온도에서 Biacore T200으로 수행되었다. 모든 Biacore T200 실험은 HBS-P+ (GE Healthcare, Br-1008-27) pH 7,4 작업 완충액에서 수행되었다. 전구약물_A 또는 전구약물_B의 HBS-P+에서 30 nM 용액이 CEA 표적 (P1AA4176, pH 5.0에서 아민 연계에 의해 고정됨, > 3000 RU) CM5 칩 표면 위에 주입되었다 (10μl/분, 60 초). 전구약물 A 또는 B 용액의 높은 밀도 포획 후, 50nM DOTAM 용액 (10μl/분, 120 초), 이후 200nM 모노스트렙타비딘 용액 (10μl/분, 90 초)이 주입되었다. 해리가 10 μl/분의 유속에서 120 초 동안 모니터링되었다. 새로운 주기를 위해, 10 mM 글리신 pH 1.5 용액 및 60 초 재생 시간을 이용함으로써 표면이 재생되었다. 상대적 반응 결정이 T200 평가 소프트웨어에 의해 평가되었다.

도 31은 아래와 같이, CEA 표적 표면 상에서 상호작용을 보여준다:

a. 전구약물 A+B의 주입

1. CEA 표적 표면 (일가 CEA 결합)으로부터 전구약물 A와 B의 강한 해리;

2. 전구약물 A+B+ DOTAM의 활성 복합체의 더 강한 결합 및 CEA 표적 표면으로부터 더 적은 해리를 발생시키는 DOTAM의 주입 및 표면 상에서 전구약물 A+B의 복합화;

3. 모노스트렙타비딘으로 판독.

또한 "이중 참조"되는 데이터가 도시된다. "이중 참조"로, 우리는 CEA 표적 표면으로부터 해리를 빼고, DOTAM 및 전구약물 A/B 상호작용의 순 반응만을 보여준다.

이들 데이터 (도 29-31)는 본원 발명에 따른 헤미바디 (다시 말하면 쌍 P1AG1806/P1AG1807)가 표적 (예를 들면 CEA) 상에서 조립되어, 효과적인 DOTAM 결합을 제공하고, 따라서 방사성뉴클레오티드의 표적 세포로의 전달을 제공한다는 것을 증명한다. 이러한 DOTAM 결합은 참조 분자 Prit-0213으로 획득된 결과와 비슷하다.

비록 전술된 발명이 이해의 명료함을 위해 예시와 실례로서 일부 상세하게 설명되긴 했지만, 이들 설명과 실례는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허와 과학 문헌의 개시는 명시적으로 온전히 참조로서 편입된다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> ANTIBODIES WHICH BIND TO CANCER CELLS AND TARGET RADIONUCLIDES TO SAID CELLS <130> 00784507 <140> PCT/EP2021/069072 <141> 2021-07-08 <150> PCT/EP2020/069561 <151> 2020-07-10 <150> EP 21151246.2 <151> 2021-01-12 <160> 153 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 4 Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 5 Gln Ala Ser Lys 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Ser Gly Gly Ser 20 <210> 153 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 153 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu 465 470 475 480 Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 485 490 495 Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 500 505 510 Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr 515 520 525 Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 530 535 540 Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 545 550 555 560 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr 565 570 575 Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 580 585 590

Claims

i) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편, Fc 도메인, 및 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 항체로서, 여기서 상기 항체 단편의 C 말단이 Fc 도메인의 한쪽 사슬의 N 말단에 융합되고, 상기 폴리펩티드의 C 말단이 Fc 도메인의 다른 사슬의 N 말단에 융합되며, 상기 첫 번째 항체가 상기 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하지 않는, 첫 번째 항체; 및
ii) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 대해 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편, Fc 도메인, 및 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 항체로서, 여기서 상기 항체 단편의 C 말단이 Fc 도메인의 한쪽 사슬의 N 말단에 융합되고, 상기 폴리펩티드의 C 말단이 Fc 도메인의 다른 사슬의 N 말단에 융합되며, 상기 두 번째 항체가 상기 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않는 두 번째 항체
를 포함하고, 이때 상기 첫 번째 항체의 상기 VH 도메인 및 상기 두 번째 항체의 상기 VL 도메인은 상기 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위를 함께 형성할 수 있는, 항체 세트.
제1항에 있어서,
항체 단편은 적어도 하나의 Fv, scFv, Fab 및 교차-Fab 단편에서 선택되는, 항체 세트.
제2항에 있어서,
항체 단편은 Fab인, 항체 세트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
Fc 도메인은 효과기 기능을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 변형되는, 항체 세트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
첫 번째 항체는
i) 완전한 경쇄;
ii) 완전한 중쇄;
iii) 추가의 Fc 사슬; 및
iv) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드
를 포함하고;
여기서 (i)의 경쇄 및 (ii)의 중쇄는 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 제공하고; 여기서 상기 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해 링커(linker)를 거쳐 (iii)의 N 말단에 융합되고;
두 번째 항체는
v) 완전한 경쇄;
vi) 완전한 중쇄;
vii) 추가의 Fc 사슬; 및
viii) 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드
를 포함하고;
여기서 (v)의 경쇄 및 (vi)의 중쇄는 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 제공하고; 여기서 상기 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는 폴리펩티드는 자체의 C 말단에 의해 링커를 거쳐 (vii)의 N 말단에 융합되는, 항체 세트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물은 방사성-표지된 DOTA 또는 이의 염 또는 기능적 변이체를 포함하는, 항체 세트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물은 Lu 또는 Y 방사성-동위원소로 방사성-표지된 DOTA 또는 이의 염 또는 기능적 변이체인, 항체 세트.
제6항 또는 제7항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 (a) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항체 세트.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 서열 번호: 41의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 41에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 항체 세트.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 항체 세트.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 서열 번호: 42의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 42에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 항체 세트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물은 Pb-DOTAM을 포함하는, 항체 세트.
제12항에 있어서,
Pb-DOTAM에 대한 기능적 결합 부위는 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들면, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하, 또는 0.5pM 이하의 결합 친화성의 K_D 값으로 결합하는, 항체 세트.
제12항 또는 제13항에 있어서,
Pb-DOTAM에 대한 기능적 결합 부위는 Pb-DOTAM 및 Bi-DOTAM에 결합하는, 항체 세트.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 (a) 중쇄 CDR2, (b) 중쇄 CDR3, 및 중쇄 CDR1을 포함하고, 여기서
상기 중쇄 CDR2는 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열 번호: 2), 또는 서열 번호: 2에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg54를 포함하지 않고;
상기 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열 번호: 3), 또는 서열 번호: 3에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98을 포함하지 않고, 임의적으로 또한 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E를 포함하지 않고/않거나 임의적으로 또한 Tyr99를 포함하지 않고;
상기 중쇄 CDR1은 임의적으로, (c) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열 번호: 1), 또는 서열 번호: 1에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1인, 항체 세트.
제15항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 (a) GFSLSTYSMS(서열 번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) FIGSRGDTYYASWAKG(서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) ERDPYGGGAYPPHL(서열 번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항체 세트.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은
i) 서열 번호: 143의 아미노산 서열; 또는
ii) 서열 번호: 143에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 임의적으로 N 말단의 Q 잔기가 불변하거나, 또는 E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기에 의해 치환되는 서열 번호: 143의 변이체; 또는
iii) 단지 하나 이상의 치환에 의해서만 서열 번호: 143과 달라지고 서열 번호: 143에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 임의적으로 N 말단의 Q 잔기가 불변하는 서열 번호: 143의 변이체
를 포함하는, 항체 세트.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 서열 번호: 7의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 7에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하되, 임의적으로 방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 추가의 N 말단 잔기, 예를 들면, Q; 또는 E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기를 더욱 포함하는, 항체 세트.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 서열 번호: 9의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 9에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, N 말단 잔기, 예를 들면, Q; 또는 E, K, R, S, T, A, L, Y, D, N 및 V로 이루어진 군에서 선택되는 잔기를 임의적으로 더욱 포함하는, 항체 세트.
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 (d) 경쇄 CDR1, (e) 경쇄 CDR3, 및 경쇄 CDR2을 포함하고, 여기서
상기 경쇄 CDR1은 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열 번호: 4), 또는 서열 번호: 4에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Tyr28 및 Asp32를 포함하지 않고,
상기 경쇄 CDR3은 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열 번호: 6), 또는 서열 번호: 6에서 1개, 2개 또는 3개까지의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하되, 이들 치환이 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및 Tyr96을 포함하지 않고,
상기 경쇄 CDR2는 임의적으로, (f) 아미노산 서열 QASKLAS(서열 번호: 5), 또는 서열 번호: 5에서 적어도 1개, 2개 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하고 Gln50을 임의적으로 포함하지 않는 경쇄 CDR2인, 항체 세트.
제20항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 (d) QSSHSVYSDNDLA(서열 번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) QASKLAS(서열 번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) LGGYDDESDTYG(서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 항체 세트.
제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은
i) 서열 번호: 144의 아미노산 서열; 또는
ii) 서열 번호: 144에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 임의적으로 N 말단의 A 잔기가 불변하거나 또는 D, N, E, Q, S, A, V, L, T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 다른 아미노산에 의해 치환되는 서열 번호: 144의 변이체; 또는
iii) 단지 하나 이상의 치환에 의해서만 서열 번호: 144와 달라지고 서열 번호: 144에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되; 임의적으로 N 말단의 A 잔기가 불변하는 서열 번호: 144의 변이체
를 포함하는, 항체 세트.
제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
방사성-표지된 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 8에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 추가의 N 말단 잔기 예컨대 A; 또는 D, N, E, Q, S, A, V, L, T, Y, K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 잔기를 임의적으로 더욱 포함하는, 항체 세트.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동일한 표적 항원에 결합하는, 항체 세트.
제24항에 있어서,
첫 번째 항체와 두 번째 항체는 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합하는, 항체 세트.
제24항에 있어서,
첫 번째 항체는 두 번째 항체와 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합하는, 항체 세트.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 종양 관련 항원인, 항체 세트.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 암배아 항원(CEA), CD20, HER2, EGP-1(영양모세포-2로서 또한 알려져 있는 상피 당단백질-1), 결장 특이적 항원-p(CSAp), 췌장 점액소 MUC1, GPRC5D 및 FAP로 이루어진 군에서 선택되는, 항체 세트.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 CEA, GPRC5D 및 FAP로 이루어진 군에서 선택되는, 항체 세트.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원은 CEA인, 항체 세트.
제30항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 또는 제31항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 25, 및 서열 번호: 25에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 26, 및 서열 번호: 26에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 또는 제34항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 49, 및 서열 번호: 49에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 50, 및 서열 번호: 50에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 또는 제37항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항, 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 18, 및 서열 번호: 18에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 또는 제40항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 65, 및 서열 번호: 65에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 66, 및 서열 번호: 66에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제40항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 또는 제43항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는,
서열 번호: 129, 130, 131, 132, 133 또는 134에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
서열 번호: 135, 136, 137, 138, 139 또는 140에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함하는, 항체 세트.
제30항, 제43항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
첫 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 25, 및 서열 번호: 25에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 26, 및 서열 번호: 26에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 49, 및 서열 번호: 49에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항, 제49항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 50, 및 서열 번호: 50에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 및 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 17, 및 서열 번호: 17에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항, 제52항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 18, 및 서열 번호: 18에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 65, 및 서열 번호: 65에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항, 제55항 및 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 66, 또는 서열 번호: 66에 대해 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호: 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항 및 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
서열 번호: 129, 130, 131, 132, 133 또는 134에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
서열 번호: 135, 136, 137, 138, 139 또는 140에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함하는, 항체 세트.
제30항 내지 제45항, 제58항 및 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
두 번째 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고,
상기 항원 결합 부위는
(a) 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 항체 세트.
제30항에 있어서,
첫 번째 항체는 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 항체이고,
두 번째 항체는 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체인, 항체 세트.
제1항에 있어서,
i) 첫 번째 항체는 서열 번호: 112의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 146의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 115의 경쇄를 포함하고;
ii) 두 번째 항체는 서열 번호: 112의 첫 번째 중쇄, 서열 번호: 145의 두 번째 중쇄 및 서열 번호: 115의 경쇄를 포함하는, 항체 세트.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 항체 세트를 발현하는 핵산 세트.
제63항에 따른 핵산 세트를 포함하는 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트.
제64항의 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포 세트.
i) 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 항체 세트를 개체에게 투여하되, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여되고, 이들 항체는 표적 항원에 결합하고, 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되며; 상기 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하는 단계; 및
ii) 방사성-표지된 화합물을 차후에 투여하되, 상기 방사성-표지된 화합물은 이러한 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합하는 단계
를 포함하는, 사전-표적화 방사면역요법의 방법.
제66항에 있어서,
상기 방법은 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 포함하지 않는, 방법.
제66항 또는 제67항에 있어서,
개체는 인간인, 방법.
제66항 또는 제67항에 있어서,
표적 항원은 암 관련 또는 종양 관련 항원이고,
상기 방법은 종양 또는 암의 방사면역요법의 방법인, 방법.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 사전-표적화 방사면역요법의 방법에 이용하기 위한 항체 세트.
i) 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 항체 세트를 개체에게 투여하되, 첫 번째 항체와 두 번째 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여되고, 이들 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국지화되며, 상기 첫 번째 항체와 두 번째 항체의 연결은 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하는 단계; 및
ii) 방사성-표지된 화합물을 차후에 투여하되, 상기 방사성-표지된 화합물은 이러한 방사성-표지된 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합하는 단계
를 포함하는, 방사선영상을 위해 방사성-동위원소를 조직 또는 장기로 표적화하는 방법.
제71항에 있어서,
상기 방법은 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 포함하지 않는, 방법.
제71항 또는 제72항에 있어서,
상기 방법은 영상화하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
제73항에 있어서,
표적 항원은 암 또는 종양 관련 항원이고,
상기 방법은 종양 또는 암을 영상화하는 방법인, 방법.
Gly 및 Ser로 이루어진 군에서 선택되는 y개의 연속 잔기로 구성되는 펩티드 링커로서, 여기서 y는 5 내지 100, 5 내지 70, 5 내지 60, 5 내지 50 또는 10 내지 100, 10 내지 70, 10 내지 60, 또는 10 내지 50이고, 마지막 세린은 y-2 또는 y-3 위치에 있는, 펩티드 링커.
제75항에 있어서,
y는 10 내지 50인, 펩티드 링커.
제75항에 있어서,
y는 15 내지 31 또는 15 내지 30인, 펩티드 링커.
제77항에 있어서,
y는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25인, 펩티드 링커.
제78항에 있어서,
y는 20 또는 21인, 펩티드 링커.
제75항에 있어서,
펩티드 링커는 서열 (GxS)n(GGSGG) 또는 (GxS)n(GGSGGG)로 이루어지고, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, x는 4이고, n은 1 내지 20, 2 내지 20, 1 내지 10 또는 2 내지 10인, 펩티드 링커.
제80항에 있어서,
n은 2, 3, 4 또는 5인, 펩티드 링커.
제80항에 있어서,
n은 2, 3 또는 4인, 펩티드 링커.
제75항에 있어서,
서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(서열 번호: 150) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG(서열 번호: 151)로 이루어지는 펩티드 링커.
멀티도메인 단백질의 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인을 연결하기 위한, 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항의 펩티드 링커의 용도.
적어도 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인을 포함하는 멀티도메인 단백질로서, 여기서 상기 첫 번째 도메인과 두 번째 도메인은 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항의 펩티드 링커에 의해 연결되는, 멀티도메인 단백질.
제84항 또는 제85항에 있어서,
멀티도메인 단백질이 항체인, 용도 또는 멀티도메인 단백질.
제84항 또는 제85항에 있어서,
멀티도메인 단백질이 이중특이적 항체인, 용도 또는 멀티도메인 단백질.
제84항 또는 제85항에 있어서,
첫 번째 도메인이 항원 결합 모이어티이고, 두 번째 도메인이 VH 또는 VL 도메인인, 용도 또는 멀티도메인 단백질.
제88항에 있어서,
항원 결합 모이어티가 항체 단편인, 용도.
제84항 또는 제85항에 있어서,
첫 번째 도메인이 Fc 도메인이고, 두 번째 도메인이 VH 또는 VL 도메인인, 용도 또는 멀티도메인 단백질.