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JP7426190B2 - ヒトＦｃＲｎ結合改変抗体及び使用方法 - Google Patents

ヒトＦｃＲｎ結合改変抗体及び使用方法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、ヒト新生児Ｆｃレセプターに関して改変された結合親和性を有する可溶性レセプターリガンドに特異的に結合する抗体及びＦｃ領域融合ポリペプチド、それらの生産方法、これらの抗体を含有する医薬製剤、及びその使用に関する。
背景
血管新生は、固形腫瘍、眼内新生血管症候群、例えば増殖性網膜症又は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、関節リウマチ、及び乾癬を含む様々な障害の病因に関与する（Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239;及びGarner, A., Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710）。
ラニビズマブ（商品名Lucentis（登録商標））は、ベバシズマブ（アバスチン）と同じ親マウス抗体由来のモノクローナル抗体フラグメントである。しかしながら、それは、ＶＥＧＦ－Ａへのより強い結合を提供するように親和性成熟されている（国際公開公報第９８／４５３３１号）。ＶＥＧＦ－Ａの遮断がいくらかの全身毒性に関連し得ることが公知であるため、血中半減期及びその結果として全身毒性を減少させるために、ラニビズマブはＦｃ領域が削除されている。それは、「湿潤」型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）（加齢に伴う視力低下の一般的な形態）を処置するために承認されている抗血管新生薬剤である。
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）などの眼血管疾患は、それぞれ異常脈絡膜又は網膜新生血管形成に起因する。先進国では、それらは視力低下の主な原因である。網膜は、ニューロン、グリア、及び血管要素の明確に定義された層からなるので、比較的小さな障害（例えば、血管増殖又は浮腫に見られるもの）が、視覚機能の有意な減少につながり得る。網膜色素変性症（ＲＰ）などの遺伝性網膜変性もまた、細動脈狭窄及び血管萎縮などの血管異常に関連する。それらに罹患する者は３，５００人に１人であり、進行性夜盲、視野欠損、視神経萎縮、細動脈減弱、及び視力の中心喪失を特徴とし、完全な失明に進行することが多い。
虚血性網膜症は、血流の減少及び低酸素状態をもたらす網膜血管系の喪失又は機能不全を特徴とする。網膜は、新たな血管を成長させるためシグナルを生成することによって低酸素状態に応答するが、これらの新たな血管は、通常は脆弱で無秩序なものである。それはこれらの新たな異常血管の成長であり、それらは漏出して出血につながり得るか、又は網膜剥離をもたらし得る瘢痕化につながり得るため、視力への脅威の大半を作り出す。虚血性網膜症の現在の処置は病的な血管の成長を停止させようとするものであるが、それらの成長を駆動する根本的な虚血に対処するものではない。さらに、糖尿病性網膜症（これは、何百万人が罹患している虚血性網膜症である）の標準的な処置は、新たな血管の成長を停止させて中心視力を保護するために、レーザーを用いて網膜の一部を破壊することを含む。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（これは、血管成長の主なプロモーターである）の機能を遮断する戦略が用いられている。短期的には、抗ＶＥＧＦ治療は視力を改善させ得るが、根本的な虚血には対処するものではなく、有益な側副血管を含む全ての血管成長を阻害するため、実際にはこの症状を悪化させ得る。虚血性の脳、心臓又は四肢において新たな血管成長が必要であり得る高齢者及び／又は糖尿病患者では、これらの薬物の全身曝露に関する深刻な懸念もある。
典型的には、眼疾患の場合、Ｆａｂ又はＦａｂ２のようなより小さな抗体フラグメントは短い血清半減期を有し、全身毒性のリスクがより低いため、硝子体内適用を介して使用されることが多い。しかしながら、典型的には、このより小さなフラグメントもより短い硝子体内半減期を有し（例えば、血清中への拡散がより速いことに起因する）、典型的にはより頻繁に投与されなければならない。
ほとんど全てのＦｃレセプターは、抗体の対称的なＦｃ領域に非対称的に結合する。
例えば、ヒトＦｃγレセプターＩＩＩＡは、２つのＦｃ領域ポリペプチド上の異なるアミノ酸残基と相互作用する。したがって、（例えば、残基２３３～２３８のより小さいヒンジ領域において）非対称的に導入された突然変異は、抗体とヒトＦｃγレセプターＩＩＩＡとの相互作用を増加又は減少させるのに使用されなければならない。
しかし、ヒト新生児ＦｃレセプターＦｃＲｎ間の相互作用は対称的である：２つのＦｃＲｎ分子は、２：１の化学量論比で単一のＩｇＧと結合し得る（例えば、Huber, A.W., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083を参照のこと）。したがって、非対称的に導入された突然変異は、両方に対する／による結合ではなく１つのＦｃＲｎに対する／による結合を減少させる。
非対称的なＩｇＧ様分子の例には、限定されないが、以下の技術を用いて得られたもの、又は以下の形式を使用するものが含まれる：Triomab/Quadroma、ノブイントゥホール（Knobs-into-Holes）、CrossMabs、静電的にマッチした抗体、LUZ-Y、Strand Exchange Engineered Domain body、Biclonic及びDuoBody。
国際公開公報第２０１２／１２５８５０号では、Ｆｃ領域において非対称的な置換を含むＦｃ含有タンパク質であって、ヒトＦｃγレセプターＩＩＩＡに対する結合が増加しており、ＡＤＣＣ活性が増強しているＦｃ含有タンパク質が報告されている。
国際公開公報第２０１２／５８７６８号では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離されたヘテロ多量体であって、前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性でヘテロ二量体形成を促進するためのアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマレセプターの選択的結合を促進するための非対称的なアミノ酸改変を含む変異体ＣＨ２ドメインをさらに含むヘテロ多量体。
国際公開公報第２０１１／１３１７４６号では、２つの単一特異性出発タンパク質のＣＨ３領域において非対称的な突然変異を導入することによって、Ｆａｂアーム交換反応を強制的に方向性にして、それにより非常に安定なヘテロ二量体タンパク質が得られ得ると報告されている。
Kim et al. (Kim, H., et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (2008) 2025-2029)は、網膜色素上皮及び脈絡膜組織を除いて、眼組織（毛様体及び虹彩、網膜、結膜、角膜、レンズ及び視神経束を含む）が、予測サイズのＦｃＲｎ転写産物の存在を示したと報告している。血液眼関門はＦｃＲｎレセプターの発現を示したが、これは、眼組織から血液系へのＩｇＧ輸送がこのレセプターを使用し得ることを示している。網膜などの眼内組織は、血液眼関門によって血液系から分離されているので、硝子体内注射の直後に、血液系において全長抗体が検出されるとは予想されない。しかしながら、サル及びヒトからの最近の薬物動態データは全て、硝子体内のベバシズマブが、硝子体内注射後数時間以内に血液中に現れることを示している。したがって、結膜リンパ管におけるＦｃＲｎレセプターの機能は、結膜空間から抗原－抗体ＩｇＧ複合体を効率的に排除するための流出レセプターとして機能することであり得る。同様の分子量にもかかわらず、ＩｇＧ（１５０kDa）は房水中で検出された；しかしながら、ＩｇＡ（１６０kDa）は検出されなかった。血清から房水へのＩｇＧ及びＩｇＡの浸透の間の不一致は、ＩｇＧ選択的なＦｃＲｎレセプターの存在によって説明され得る。
Kimらは、網膜障害の場合、直接的な硝子体内注射が、治療抗体を眼後部に送達するための一般的なアプローチになっているとさらに報告している（Kim, H., et al., Mol. Vis. 15 (2009) 2803-2812）。硝子体内投与されたベバシズマブ（ｌｇＧ）及びニワトリＩｇＹは両方とも、内境界膜障壁を乗り越えて、より深部の網膜構造に拡散した。網膜を通って拡散した後、ベバシズマブは血液網膜関門を越えて全身循環に漏出した。網膜内のニワトリＩｇＹは、血液網膜関門の反管腔側に沿って局在していたに過ぎなかった。さらに、脈絡膜血管は、ニワトリＩｇＹの存在について陰性であった。硝子体内投与後のベバシズマブの生理学的に関連する血清レベルは、注射量の最大３０％に相当することが見出された。これは、全身性副作用のリスクが、以前に認識されていたよりも大きいことを示唆している。血液眼関門は、全長ＩｇＧを全身循環に輸送して除去するための特異的機構を示す。Kimらの現在の研究は、この機構が新生児Ｆｃレセプターであるという仮説を裏付けている。
しかし、ＦｃＲｎに対する結合はその循環半減期を延長して、全身性副作用を生じさせる可能性がある。
当技術分野では、虚血性網膜症などの様々な眼血管疾患を治療及び予防するための優れた手段が必要とされている。
Magdelaine-Beuzelin, Cらは、眼科学の治療抗体について、流行は巡ると報告している（MABS 2 (2010) 176-180）。
Steinbrook, Rは、the price of sight - Ranibizumab, Bevacizumab, and the treatment of macular degeneration (New Eng. J. Med.355 (2006) 1409-1412)を報告している。
米国特許出願公開第２０１１／２３６３８８号では、二重特異性二価抗ＶＥＧＦ／抗ＡＮＧ－２抗体が報告されている。
Kuo, T.Tらは、neonatal Fc receptor: from immunity to therapeutics (J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789)について報告している。
Medesan, Cらは、delineation of the amino acid residues involved in transcytosis and catabolism of mouse IgG1 (J. Immunol. 158 (1997) 2211-2217)を報告している。
Qiao, S.-Wらは、dependence of antibody-mediated presentation of antigen on FcRn (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 9337-9342)を報告している。
Kim, J.Kらは、mapping of the site on human IgG for binding of the MHC class I-related receptor, FcRn (Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825)を報告している。
Kuo, T.Tらは、neonatal Fc receptor and IgG-based therapeutics (MABS 3 (2011) 422-438)について報告している。
概要
眼内だけではなく残存体内にも存在する抗原をターゲティングする／に結合する抗体を使用する場合、眼から血中への血液眼関門通過後の短い全身半減期が、副作用を回避するために有益である。
また、レセプターのリガンドに特異的に結合する抗体であって、眼疾患の処置に有効な抗体の場合、抗体－抗原複合体（＝抗体－レセプターリガンド－複合体）を後で眼から除去し、その後、副作用を回避するために、（分離後に又は複合体として）抗体を全身循環から除去しなければならない（すなわち、抗体は、眼からレセプターリガンドを除去するためのビヒクルとして機能し、それにより、レセプターシグナル伝達を阻害し、全身性副作用を回避するために血液循環から迅速に除去される）。
ヒト新生児Ｆｃレセプターに結合しないＦｃ領域を含む抗体は、血液眼関門を通過し得ることが見出された。前記抗体はヒトＦｃＲｎに結合しないが、ＦｃＲｎに対する結合は、血液眼関門を通過する輸送に必要であると考えられるので、これは驚くべきことである。
本明細書で報告される一態様は、可溶性レセプターリガンドを眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体の使用である。
本明細書で報告される一態様は、医薬として使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
本明細書で報告される一態様は、眼血管疾患を処置するのに使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
本明細書で報告される一態様は、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体の使用である。
本明細書で報告される一態様は、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去するのに使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
本明細書で報告される一態様は、眼疾患、特に眼血管疾患を処置するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体の使用である。
本明細書で報告される一態様は、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体の使用である。
本明細書で報告される一態様は、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送するのに使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、表面プラズモン共鳴を使用した場合に検出可能なＦｃＲｎ結合性を有しない。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ｐＨ６において１．７μM超のＫｄ値で（すなわち、低い親和性で）、ヒトＦｃＲｎに結合する。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有するＦｃ領域を含む抗体と同じか又はそれよりも短いＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム保持時間を有する。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、３分間以下のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム保持時間を有する。
一実施態様では、ＦｃＲｎアフィニティーカラムは、５０mm×５mmのカラム寸法を有し、ベッド高は５cmであり、ローディングは抗体５０μgである。一実施態様では、平衡化緩衝液は、ｐＨ５．５に調整された１５０mM ＮａＣｌを含む２０mM ＭＥＳであり、溶出緩衝液は、ｐＨ８．８に調整された１５０mM ＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌであり、溶出は、平衡化緩衝液を７．５CVでアプライし、０％～１００％溶出緩衝液を３０CVでアプライし、その後、溶出緩衝液を１０CVでアプライすることによる。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有するＦｃ領域を含む抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号１１２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号０３の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
一実施態様では、抗体は、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ２５１Ｓ、Ｍ２５２Ｔ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｗ、Ｓ２５４Ｒ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ｌ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）の少なくとも１つを有するＦｃ領域を含む抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
一実施態様では、抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有するＦｃ領域を含む抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
一実施態様では、抗体は、配列番号０１又は配列番号１１２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号０３の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗体、又は配列番号０２又は配列番号１１２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号０４の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
一実施態様では、抗体は、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ２５１Ｓ、Ｍ２５２Ｔ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｗ、Ｓ２５４Ｒ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ｌ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを有する。
一実施態様では、抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ２５１Ｓ、Ｍ２５２Ｔ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｗ、Ｓ２５４Ｒ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ｌ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）の少なくとも１つを有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ２５１Ｓ、Ｍ２５２Ｔ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｗ、Ｓ２５４Ｒ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ｌ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）の少なくとも１つを有する。
一実施態様では、抗体は、両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、少なくとも突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有する。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を有する。
一実施態様では、抗体は、全長抗体である。
一実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施態様では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
一実施態様では、抗体は、単一特異性抗体である。
一実施態様では、抗体は、二重特異性抗体である。
本明細書で報告される一態様は、眼疾患を処置するのに使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
本明細書で報告される一態様は、可溶性レセプターリガンドを眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送するのに使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
本明細書で報告される一態様は、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去するのに使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
本明細書で報告される一態様は、眼疾患、特に眼血管疾患を処置するのに使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
本明細書で報告される一態様は、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送するのに使用するための、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有するＦｃ領域を含む抗体である。
全ての態様の一実施態様では、抗体の処置又は適用は、硝子体内適用によるものである。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、表面プラズモン共鳴を使用した場合に検出可能なＦｃＲｎ結合性を有しない。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ｐＨ６において１．７μM超のＫｄ値で（すなわち、低い親和性で）、ヒトＦｃＲｎに結合する。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有するＦｃ領域を含む抗体と同じか又はそれよりも短いＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム保持時間を有する。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、３分間以下のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム保持時間を有する。
一実施態様では、ＦｃＲｎアフィニティーカラムは、５０mm×５mmのカラム寸法を有し、ベッド高は５cmであり、ローディングは抗体５０μgである。一実施態様では、平衡化緩衝液は、ｐＨ５．５に調整された１５０mM ＮａＣｌを含む２０mM ＭＥＳであり、溶出緩衝液は、ｐＨ８．８に調整された１５０mM ＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌであり、溶出は、平衡化緩衝液を７．５CVでアプライし、０％～１００％溶出緩衝液を３０CVでアプライし、その後、溶出緩衝液を１０CVでアプライすることによる。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有するＦｃ領域を含む抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号１１２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号０３の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
一実施態様では、抗体は、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ２５１Ｓ、Ｍ２５２Ｔ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｗ、Ｓ２５４Ｒ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ｌ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）の少なくとも１つを有するＦｃ領域を含む抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
一実施態様では、抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有するＦｃ領域を含む抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
一実施態様では、抗体は、配列番号０１又は配列番号１１２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号０３の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗体、又は配列番号０２又は配列番号１１２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号０４の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗体とほぼ同じか又はそれよりも低い親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する。
一実施態様では、抗体は、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ２５１Ｓ、Ｍ２５２Ｔ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｗ、Ｓ２５４Ｒ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ｌ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを有する。
一実施態様では、抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ２５１Ｓ、Ｍ２５２Ｔ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｗ、Ｓ２５４Ｒ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ｌ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）の少なくとも１つを有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ２５１Ｓ、Ｍ２５２Ｔ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｗ、Ｓ２５４Ｒ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ｌ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）の少なくとも１つを有する。
一実施態様では、抗体は、両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、少なくとも突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有する。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を有する。
一実施態様では、抗体は、全長抗体である。
一実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施態様では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
一実施態様では、抗体は、単一特異性抗体である。
一実施態様では、抗体は、二重特異性抗体である。
本明細書で報告される一態様は、眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与することを含む方法である。
本明細書で報告される一態様は、個体において可溶性レセプターリガンドを眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送するための方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与して、可溶性レセプターリガンドを眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送することを含む方法である。
本明細書で報告される一態様は、個体において１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去するための方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与して、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去することを含む方法である。
本明細書で報告される一態様は、個体において１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送するための方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与して、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送することを含む方法である。
本明細書で報告される一態様は、個体において可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔又は眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送するための方法であって、有効量の本明細書で報告される抗体を該個体に投与して、可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔又は眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送することを含む方法である。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチドと、第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｙ４３６Ａを含むか、又は
ｉｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含むか、又は
ｉｉｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、又は
ｉｖ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｙ４３６Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが
ａ）突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、若しくは
ｂ）突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、若しくは
ｃ）突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ
を含むか、
又は
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが
ａ）突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、若しくは
ｂ）突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ
を含むか、
又は
ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが
ａ）突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ
を含む。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトＦｃＲｎに特異的に結合しない。全ての態様の一実施態様では、抗体は、ブドウ球菌プロテインＡに特異的に結合しない。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトＦｃＲｎに特異的に結合しない。全ての態様の一実施態様では、抗体は、ブドウ球菌プロテインＡに特異的に結合する。
全ての態様の一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（「ホール」）をさらに含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（「ノブ」）を含む。
全ての態様の一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａをさらに含む。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｐ３２９Ｇをさらに含む。
全ての態様の一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅをさらに含む。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｐ３２９Ｇをさらに含む。
一実施態様では、ヒトＩｇＧクラスのＦｃ領域は、変異体ヒトＩｇＧクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域である。
一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドをペアリングしてＦｃ領域を形成すると、ヘテロ二量体が形成される。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１４のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１６のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１７のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２２のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号２４のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉｉ）二重特異性抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（ヒト起源に由来する）定常重鎖領域を含む。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１４のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１６のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１７のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２２のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号２４のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉｉ）二重特異性抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（ヒト起源に由来する）定常重鎖領域を含み、
可変ドメインは、配列番号２０、２１、２８及び２９に対して３つ以下の突然変異を含む。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、二重特異性抗体は、両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（すなわち、ヒト起源に由来する）定常重鎖領域を含む。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではない。
ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異（＝突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）の組み合わせ）を有する＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体の概念及び利点のスキーム。 小規模ＤＬＳベース粘度測定：２００mMアルギニン／スクシナート（ｐＨ５．５）中の１５０mg/mLにおける推定粘度（（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６と、（このようなＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）参照抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５との比較）。 ２０mMヒスチジン緩衝液、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）における温度（ＤＬＳ凝集開始温度を含む）に応じたＤＬＳ凝集（本明細書で報告される（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６と、（このようなＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）参照抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５との比較）。 ４０℃、１００mg/mLにおける７日間の保存（メインピークの減少及び高分子量（ＨＭＷ）の増加）（低凝集を示した本明細書で報告される（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６と、（このようなＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）参照抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５との比較）。 Ａ：（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５及びＢ：（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６のＦｃＲｎ定常状態親和性。 Ａ：（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５及びＢ：（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６のＦｃＲｎ定常状態親和性。 ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しないＶＥＧＦａｎｇ２－００１５及びＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有するＶＥＧＦａｎｇ２－００１６のＦｃガンマＲＩＩＩａ相互作用測定（両方とも、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ突然変異を有するＩｇＧ１サブクラスである；コントロールとして、ＩｇＧ１サブクラスの抗ジゴキシゲニン抗体（抗Ｄｉｇ）及びＩｇＧ４ベースの抗体を使用した）。 血清及び全眼溶解物中の＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体の濃度を決定するための薬物動態（ＰＫ）－ＥＬＩＳＡアッセイ原理の概略図。 静脈内（ｉ．ｖ．）適用後の血清濃度：ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しないＶＥＧＦａｎｇ２－００１５と、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有するＶＥＧＦａｎｇ２－００１６との比較。 硝子体内適用後の血清濃度：ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しないＶＥＧＦａｎｇ２－００１５と、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有するＶＥＧＦａｎｇ２－００１６との比較。 （静脈内適用と比較した、右眼にのみ硝子体内適用した後の）右眼及び左眼における（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６の眼溶解物中濃度：硝子体内適用後の右眼においてのみ、有意な濃度を検出することができた；（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６の血清半減期は短いため、静脈内適用後において、眼溶解物中濃度を検出することができなかった。 （静脈内適用と比較した、右眼にのみ硝子体内適用した後の）右眼及び左眼における（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５の眼溶解物中濃度：右眼では（及び左眼ではある程度）、硝子体内適用後において、ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５濃度を検出することができた；これは、右眼から血清へ及びそこから左眼への拡散を示しており、これは、（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５の長い半減期によって説明することができる；（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）血清安定ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５の眼への拡散により、静脈内適用後においても、両眼に関する有意な眼溶解物中濃度を検出することができた。 ＦｃＲｎ結合能に関して操作した抗体は、ＳＰＲ分析において、参照野生型（ｗｔ）抗体と比較して、長期（ＹＴＥ突然変異）又は短期（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異）のin vivo半減期、増強（ＹＴＥ突然変異）又は減少した結合（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異）だけではなく、増強又は減少したＦｃＲｎカラムクロマトグラフィー保持時間も示す；ａ）１０mg/kgをｈｕＦｃＲｎトランスジェニック雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス＋／－２７６に単回静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス適用した後のＰＫデータ：野生型ＩｇＧ並びにＹＴＥ及びＩＨＨ－ＡＡＡ Ｆｃ改変ＩｇＧのＡＵＣデータ；ｂ）BIAcoreセンサーグラム；ｃ）ＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出；野生型抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体（参照）、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体のＹＴＥ突然変異体、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体のＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異体。 ＦｃＲｎ結合能に関して操作した抗体は、ＳＰＲ分析において、参照野生型（ｗｔ）抗体と比較して、長期（ＹＴＥ突然変異）又は短期（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異）のin vivo半減期、増強（ＹＴＥ突然変異）又は減少した結合（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異）だけではなく、増強又は減少したＦｃＲｎカラムクロマトグラフィー保持時間も示す；ａ）１０mg/kgをｈｕＦｃＲｎトランスジェニック雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス＋／－２７６に単回静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス適用した後のＰＫデータ：野生型ＩｇＧ並びにＹＴＥ及びＩＨＨ－ＡＡＡ Ｆｃ改変ＩｇＧのＡＵＣデータ；ｂ）BIAcoreセンサーグラム；ｃ）ＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出；野生型抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体（参照）、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体のＹＴＥ突然変異体、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体のＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異体。 ＦｃＲｎ結合能に関して操作した抗体は、ＳＰＲ分析において、参照野生型（ｗｔ）抗体と比較して、長期（ＹＴＥ突然変異）又は短期（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異）のin vivo半減期、増強（ＹＴＥ突然変異）又は減少した結合（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異）だけではなく、増強又は減少したＦｃＲｎカラムクロマトグラフィー保持時間も示す；ａ）１０mg/kgをｈｕＦｃＲｎトランスジェニック雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス＋／－２７６に単回静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス適用した後のＰＫデータ：野生型ＩｇＧ並びにＹＴＥ及びＩＨＨ－ＡＡＡ Ｆｃ改変ＩｇＧのＡＵＣデータ；ｂ）BIAcoreセンサーグラム；ｃ）ＦｃＲｎアフィニティーカラム溶出；野生型抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体（参照）、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体のＹＴＥ突然変異体、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体のＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異体。 Ｆｃ領域に導入した突然変異の数に応じたＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー保持時間の変化。 Ｆｃ領域に導入した突然変異の非対称分布に応じたＦｃＲｎ結合の変化。 両方の重鎖において突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを有する二重特異性＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体（ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２－０１２１）の、２つの連続プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出クロマトグラム。 両方の重鎖において突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを有する抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体（ＩＧＦ－１Ｒ－００４５）の、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出クロマトグラム。 ＣＭ５チップ上に固定化したプロテインＡに対するＩｇＧ Ｆｃ領域改変＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体の結合。 ＦｃＲｎアフィニティーカラムにおける異なる＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体の溶出クロマトグラム。 ブドウ球菌プロテインＡに対する異なる融合ポリペプチドの結合（ＳＰＲ）。 固定化プロテインＡに対する異なる＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体及び抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体突然変異体の結合（ＳＰＲ）。 抗体ＩＧＦ－１Ｒ００３３、００３５及び００４５を静脈内適用した後の血清濃度の比較。 抗体ＩＧＦ－１Ｒ００３３を硝子体内適用及び静脈内適用した後の眼溶解物中濃度の比較。 抗体ＩＧＦ－１Ｒ００３５を硝子体内適用及び静脈内適用した後の眼溶解物中濃度の比較。 抗体ＩＧＦ－１Ｒ００４５を硝子体内適用及び静脈内適用した後の眼溶解物中濃度の比較。
発明の実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
「約」という用語は、その後に続く数値の＋／－２０％の範囲を意味する。一実施態様では、約という用語は、その後に続く数値の＋／－１０％の範囲を意味する。一実施態様では、約という用語は、その後に続く数値の＋／－５％の範囲を意味する。
本明細書の目的のために、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるように、ヒト免役グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免役グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、又はアミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、配列において、ＶＬヒト免役グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
「親和性成熟」抗体は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす変化を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）において１つ以上の変化を有する抗体を指す。
「変化」という用語は、改変抗体又は融合ポリペプチドを得るための、親抗体又は融合ポリペプチド（例えば、少なくともＦｃ領域のＦｃＲｎ結合部分を含む融合ポリペプチド）における１つ以上のアミノ酸残基の突然変異（置換）、挿入（付加）又は欠失を意味する。「突然変異」という用語は、特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されることを意味する。例えば、突然変異Ｌ２３４Ａは、抗体Ｆｃ領域（ポリペプチド）における２３４位のアミノ酸残基リシンがアミノ酸残基アラニンによって置換されること（リシンのアラニンによる置換）を意味する（ナンバリングは、ＥＵインデックスに従う）。
「アミノ酸突然変異」という用語は、少なくとも１つの既存のアミノ酸残基を別の異なるアミノ酸残基（＝置換アミノ酸残基）で置換することを意味する。置換アミノ酸残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」であり得、アラニン（３文字記号：ａｌａ、１文字記号：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）からなる群より選択され得る。置換アミノ酸残基は、「天然に存在しないアミノ酸残基」であり得る。例えば、米国特許第６，５８６，２０７号、国際公開公報第９８／４８０３２号、国際公開公報第０３／０７３２３８号、米国特許出願公開第２００４／０２１４９８８号、国際公開公報第２００５／３５７２７号、国際公開公報第２００５／７４５２４号、Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024;及びWang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10（これらは全て、参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
「アミノ酸挿入」という用語は、アミノ酸配列中の所定の位置に少なくとも１つのアミノ酸残基を（さらに）組み入れることを意味する。一実施態様では、挿入は、１つ又は２つのアミノ酸残基の挿入である。挿入されるアミノ酸残基は、任意の天然に存在するアミノ酸残基又は天然に存在しないアミノ酸残基であり得る。
「アミノ酸欠失」という用語は、アミノ酸配列中の所定の位置において少なくとも１つのアミノ酸残基を取り除くことを意味する。
本明細書で使用される「ＡＮＧ－２」という用語は、例えば、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60及びCheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91に記載されているヒトアンギオポエチン２（ＡＮＧ－２）（あるいは、ＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２で省略される）（配列番号３１）を指す。アンジオポエチン－１（配列番号３２）及び２は、Ｔｉｅｓ（血管内皮細胞内で選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリー）のリガンドとして発見された（Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-248）。現在、アンジオポエチンファミリーの４つの明確なメンバーがある。アンジオポエチン－３及び４（ＡＮＧ－３及びＡＮＧ－４）は、マウス及びヒトにおける同じ遺伝子座の大きく分岐したカウンターパートに相当し得る（Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-356; Kim, I., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 26523-26528）。ＡＮＧ－１及びＡＮＧ－２は、本来は、それぞれアゴニスト及びアンタゴニストとして組織培養実験において同定された（ＡＮＧ－１については、Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-1169；及びＡＮＧ－２については、Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照のこと）。公知のアンジオポエチンは全て、Ｔｉｅ２（配列番号３３）に主に結合し、ＡＮＧ－１及び－２は両方とも、３nM（Ｋｄ）の親和性でＴｉｅ２に結合する（Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60）。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原及び／又はプロテインＡ及び／又はＦｃＲｎ結合活性を示す限り、限定されないが、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）及び抗体フラグメントを含む様々な抗体構造体を包含する。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照抗体の結合を５０％以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいてその抗原に対する抗体の結合を５０％以上遮断する参照抗体を指す。例示的な競合アッセイが本明細書で提供される。
「非対称的なＦｃ領域」という用語は、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムにしたがう対応する位置において異なるアミノ酸残基を有するＦｃ領域ポリペプチドのペアを意味する。
「ＦｃＲｎ結合に関して非対称的なＦｃ領域」という用語は、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムにしたがって決定される対応する位置において異なるアミノ酸残基を有する２本のポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を意味し、異なる位置は、ヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対するＦｃ領域の結合に影響を与える。本明細書における目的のために、「ＦｃＲｎ結合に関して非対称的なＦｃ領域」におけるＦｃ領域の２本のポリペプチド鎖間の差異は、例えば二重特異性抗体の生産の場合に、ヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を容易にするために導入された差異を含まない。これらの差異も非対称的であり得る（すなわち、２本の鎖は、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムにしたがう対応しないアミノ酸残基において差異を有する）。これらの差異はヘテロ二量体化を容易にし、ホモ二量体化を減少させる。このような差異の例は、いわゆる「ノブイントゥホール」置換である（例えば、米国特許第７，６９５，９３６号及び米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号を参照のこと）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の個々のポリペプチド鎖における以下のノブ及びホール置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出された：１）一方の鎖におけるＹ４０７Ｔ及び他方の鎖におけるＴ３６６Ｙ；２）一方の鎖におけるＹ４０７Ａ及び他方の鎖におけるＴ３６６Ｗ；３）一方の鎖におけるＦ４０５Ａ及び他方の鎖におけるＴ３９４Ｗ；４）一方の鎖におけるＦ４０５Ｗ及び他方の鎖におけるＴ３９４Ｓ；５）一方の鎖におけるＹ４０７Ｔ及び他方の鎖におけるＴ３６６Ｙ；６）一方の鎖におけるＴ３６６Ｙ及びＦ４０５Ａ並びに他方の鎖におけるＴ３９４Ｗ及びＹ４０７Ｔ；７）一方の鎖におけるＴ３６６Ｗ及びＦ４０５Ｗ並びに他方の鎖におけるＴ３９４Ｓ及びＹ４０７Ａ；８）一方の鎖におけるＦ４０５Ｗ及びＹ４０７Ａ並びに他方の鎖におけるＴ３６６Ｗ及びＴ３９４Ｓ；並びに９）一方の鎖におけるＴ３６６Ｗ並びに他方の鎖におけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（列挙されている最後のものが特に適切である）。加えて、２本のＦｃ領域ポリペプチド鎖間において新たなジスルフィド結合を作り出す変化は、ヘテロ二量体形成を容易にする（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号を参照のこと）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の個々のポリペプチド鎖において新たな鎖間ジスルフィド結合を形成するための適切な間隔のシステイン残基をもたらす以下の置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出された：一方の鎖におけるＹ３４９Ｃ及び他方におけるＳ３５４Ｃ；一方の鎖におけるＹ３４９Ｃ及び他方におけるＥ３５６Ｃ；一方の鎖におけるＹ３４９Ｃ及び他方におけるＥ３５７Ｃ；一方の鎖におけるＬ３５１Ｃ及び他方におけるＳ３５４Ｃ；一方の鎖におけるＴ３９４Ｃ及び他方におけるＥ３９７Ｃ；又は一方の鎖におけるＤ３９９Ｃ及び他方におけるＫ３９２Ｃ。ヘテロ二量体化を容易にするアミノ酸変化のさらなる例は、いわゆる「電荷対置換」である（例えば、国際公開公報第２００９／０８９００４号を参照のこと）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の個々のポリペプチド鎖における以下の電荷対置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出された：１）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ又はＫ４０９Ｅ及び他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ又はＤ３９９Ｒ；２）一方の鎖におけるＫ３９２Ｄ又はＫ３９２Ｅ及び他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ又はＤ３９９Ｒ；３）一方の鎖におけるＫ４３９Ｄ又はＫ４３９Ｅ及び他方の鎖におけるＥ３５６Ｋ又はＥ３５６Ｒ；４）一方の鎖におけるＫ３７０Ｄ又はＫ３７０Ｅ及び他方の鎖におけるＥ３５７Ｋ又はＥ３５７Ｒ；５）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３６０Ｄ＋他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ；６）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄ＋他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ；７）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ＋他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ及びＥ３５７Ｋ；８）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ並びに他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ；９）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ並びに他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ；１０）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ並びに他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ及びＤ３５７Ｋ；１１）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄ並びに他方の鎖におけるＤ３９９Ｋ及びＤ３５７Ｋ；１２）一方の鎖におけるＤ３９９Ｋ並びに他方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３６０Ｄ；並びに１３）一方の鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ４３９Ｄ並びに他方におけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ。
「（抗原に対する）結合」という用語は、in vitroアッセイにおける（一実施態様では、抗体を表面に結合させ、抗体に対する抗原の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定する結合アッセイにおける）、抗体のその抗原に対する結合を意味する。結合は、１０－８Ｍ以下、いくつかの実施態様では１０－１３～１０－８Ｍ、いくつかの実施態様では１０－１３～１０－９Ｍの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
結合は、BIAcoreアッセイ（GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Sweden）によって調査され得る。結合の親和性は、ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合速度定数）、ｋｄ（解離定数）及びＫＤ（ｋｄ／ｋａ）という用語によって定義される。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来するが、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
「ＣＨ２ドメイン」という用語は、およそＥＵ位置２３１位からＥＵ位置３４０位（KabatのＥＵナンバリングシステム）に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一実施態様では、ＣＨ２ドメインは、配列番号０９のアミノ酸配列：ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＥＳＴＹＲＷＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫを有する。
「ＣＨ３ドメイン」という用語は、およそＥＵ位置３４１位からＥＵ位置４４６位に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一実施態様では、ＣＨ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列：ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧを有する。
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと称される。
「同程度の長さ」という用語は、２つのポリペプチドが同数のアミノ酸残基を含むか、又は長さが１アミノ酸残基以上及び多くとも最大１０アミノ酸残基異なり得ることを意味する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは同数のアミノ酸残基を含むか、又は１～１０アミノ酸残基の数だけ異なる。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは同数のアミノ酸残基を含むか、又は１～５アミノ酸残基の数だけ異なる。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは同数のアミノ酸残基を含むか、又は１～３アミノ酸残基の数だけ異なる。
「エフェクター機能」は、抗体クラスにより異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；並びにＢ細胞活性化が含まれる。
薬剤（例えば、医薬製剤）の「有効量」は、必要な投与量及び期間で、所望の治療的結果又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
「Ｆｃ融合ポリペプチド」という用語は、結合ドメイン（例えば、単鎖抗体などの抗原結合ドメイン、又はレセプターのリガンドなどのポリペプチド）と、所望のターゲット／プロテインＡ及び／又はＦｃＲｎ結合活性を示す抗体Ｆｃ領域との融合物を意味する。
「ヒト起源のＦｃ領域」という用語は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含有するヒト起源の免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端に及ぶ。一実施態様では、Ｆｃ領域は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいし、又は存在しなくてもよい。本明細書において特に指定がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242に記載されているＥＵナンバリングシステム（これは、ＥＵインデックスとも称される）に従う。Ｆｃ領域は、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合され得る２つの重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドから構成される。
「ＦｃＲｎ」という用語は、ヒト新生児Ｆｃレセプターを意味する。ＦｃＲｎは、リソソーム分解経路からＩｇＧをサルベージするように機能して、クリアランスの減少及び半減期の増加をもたらす。ＦｃＲｎは、２つのポリペプチド（５０kDaのクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）及び１５kDaのβ２－ミクログロブリン（β２ｍ））からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、高い親和性で、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２－ＣＨ３部分に結合する。ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用は厳密にｐＨ依存性であり、１：２の化学量論比で起こり、１つのＩｇＧが、その２本の重鎖を介して２つのＦｃＲｎ分子に結合する（Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083）。酸性ｐＨ（ｐＨ＜６．５）のエンドソーム中でＦｃＲｎ結合が起こり、中性の細胞表面（ｐＨ約７．４）でＩｇＧが放出される。相互作用のｐＨ感受性は、エンドソームの酸性環境内でのレセプターに対する結合によって、細胞中へ飲作用されるＩｇＧの細胞内分解からのＦｃＲｎ媒介性保護を容易にする。次いで、ＦｃＲｎは、ＦｃＲｎ－ＩｇＧ複合体が細胞外の中性ｐＨ環境に曝露された際に、細胞表面にＩｇＧを再循環させ、続いて血流中に放出するのを容易にする。
「Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合部分」という用語は、およそＥＵ位置２４３位からＥＵ位置２６１位、並びにおよそＥＵ位置２７５位からＥＵ位置２９３位、並びにおよそＥＵ位置３０２位からＥＵ位置３１９位、並びにおよそＥＵ位置３３６位からＥＵ位置３４８位、並びにおよそＥＵ位置３６７位からＥＵ位置３９３位及びＥＵ位置４０８位、並びにおよそＥＵ位置４２４位からＥＵ位置４４０位に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一実施態様では、KabatのＥＵナンバリングによる以下のアミノ酸残基の１つ以上が変化される：Ｆ２４３、Ｐ２４４、Ｐ２４５Ｐ、Ｋ２４６、Ｐ２４７、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｐ２５７、Ｅ２５８、Ｖ２５９、Ｔ２６０、Ｃ２６１、Ｆ２７５、Ｎ２７６、Ｗ２７７、Ｙ２７８、Ｖ２７９、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｖ２８４、Ｈ２８５、Ｎ２８６、Ａ２８７、Ｋ２８８、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｐ２９１、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｓ３０４、Ｖ３０５、Ｌ３０６、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｌ３０９、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｗ３１３、Ｌ３１４、Ｎ３１５、Ｇ３１６、Ｋ３１７、Ｅ３１８、Ｙ３１９、Ｉ３３６、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ａ３３９、Ｋ３４０、Ｇ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｐ３４６、Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｃ３６７、Ｖ３６９、Ｆ３７２、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ｉ３７７、Ａ３７８、Ｖ３７９、Ｅ３８０、Ｗ３８１、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｎ３８４、Ｇ３８５、Ｑ３８６、Ｐ３８７、Ｅ３８８、Ｎ３８９、Ｙ３９１、Ｔ３９３、Ｓ４０８、Ｓ４２４、Ｃ４２５、Ｓ４２６、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４２９、Ｅ４３０、Ａ４３１、Ｌ４３２、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、Ｙ４３６、Ｔ４３７、Ｑ４３８、Ｋ４３９及びＳ４４０（ＥＵナンバリング）。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
「全長抗体」という用語は、ネイティブな抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を意味する。全長抗体は、例えば、全長抗体の鎖の１本以上にコンジュゲートされたｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂなどのさらなるドメインを含み得る。
「ヘテロ二量体」又は「ヘテロ二量体の」という用語は、KabatのＥＵインデックスにしたがって決定される対応する位置において、少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する（例えば、同程度の長さの）２本のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
「ホモ二量体」又は「ホモ二量体の」という用語は、KabatのＥＵインデックスにしたがって決定される対応する位置において、同一のアミノ酸配列を有する同程度の長さの２本のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
本明細書で報告される抗体又はＦｃ領域融合ポリペプチドは、焦点の突然変異又は特性に関して決定されるそのＦｃ領域に関して、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。例えば、ＦｃＲｎ及び／又はプロテインＡ結合（すなわち、焦点の特性）に関して、Ｆｃ領域（抗体）は、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ（これらの突然変異は、Ｆｃ領域融合ポリペプチド又は抗体のＦｃＲｎ及び／又はプロテインＡ結合特性に関して焦点が合っている）に関してホモ二量体（すなわち、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドは両方とも、これらの突然変異を含む）であるが、それと同時に、それぞれ突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（これらの突然変異は、ＦｃＲｎ及び／又はプロテインＡ結合特性ではなく重鎖のヘテロ二量体化を対象とするので、これらの突然変異は焦点のものではない）並びに突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗに関してヘテロ二量体である（第１のセットは、第１のＦｃ領域ポリペプチドにのみ含まれるのに対して、第２のセットは、第２のＦｃ領域ポリペプチドにのみ含まれる）。さらに、例えば、本明細書で報告されるＦｃ領域融合ポリペプチド又は抗体は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａ（すなわち、これらの突然変異は全て、二量体ポリペプチドのＦｃＲｎ及び／又はプロテインＡ結合特性を対象とする）に関してヘテロ二量体であり得る（すなわち、一方のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含むのに対して、他方のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含む）。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は同義的に使用され、外来性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を意味する。宿主細胞には、「トンスフォーマント」及び「トランスフォーメーション細胞」が含まれ、継代の回数にかかわらず、初代トランスフォーメーション細胞及びそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同一ではなくてもよく、突然変異を含有し得る。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫は、本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免役グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般的に、ヒト免役グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位集団から行われる。一般的に、配列の下位集団は、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3にあるような下位集団である。一実施態様では、ＶＬの場合、下位集団は、上記Kabatらにあるような下位集団カッパＩである。一実施態様では、ＶＨの場合、下位集団は、上記Kabatらにあるような下位集団ＩＩＩである。
「に由来する」という用語は、少なくとも１つの位置において変化を導入することによって、アミノ酸配列が親アミノ酸配列から生じることを意味する。したがって、由来するアミノ酸配列は、少なくとも１つの対応する位置において、対応する親アミノ酸配列と異なる（抗体Ｆｃ領域について、ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）。一実施態様では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において１～１５アミノ酸残基異なる。一実施態様では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において１～１０アミノ酸残基異なる。一実施態様では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において１～６アミノ酸残基異なる。同様に、由来するアミノ酸配列は、その親アミノ酸配列と高いアミノ酸配列同一性を有する。一実施態様では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、８０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一実施態様では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一実施態様では、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
「ヒトＦｃ領域ポリペプチド」という用語は、「ネイティブな」又は「野生型」ヒトＦｃ領域ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を意味する。「変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つの「アミノ酸変化」によって「ネイティブな」又は「野生型」ヒトＦｃ領域ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を意味する。「ヒトＦｃ領域」は、２つのヒトＦｃ領域ポリペプチドからなる。「変異体（ヒト）Ｆｃ領域」は、２つのＦｃ領域ポリペプチドであって、その両方が変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドであり得るか、又は一方がヒトＦｃ領域ポリペプチドであり、他方が変異体（ヒト）Ｆｃ領域ポリペプチドである２つのＦｃ領域ポリペプチドからなる。
一実施態様では、ヒトＦｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、又は配列番号６１のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域ポリペプチド、又は配列番号６２のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域ポリペプチド、又は配列番号６３のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０又は６１又は６２又は６３のＦｃ領域ポリペプチドに由来し、配列番号６０又は６１又は６２又は６３のＦｃ領域ポリペプチドと比較して、少なくとも１個のアミノ酸突然変異を有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、約１～約１０個のアミノ酸突然変異、一実施態様では約１～約５個のアミノ酸突然変異を含む／有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０又は６１又は６２又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドと少なくとも約８０％の相同性を有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０又は６１又は６２又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドと少なくとも約９０％の相同性を有する。一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、配列番号６０又は６１又は６２又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドと少なくとも約９５％の相同性を有する。
配列番号６０又は６１又は６２又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドに由来するＦｃ領域ポリペプチドは、含まれるアミノ酸変化によって定義される。したがって、例えば、Ｐ３２９Ｇという用語は、ヒトＦｃ領域ポリペプチドに由来するＦｃ領域ポリペプチドであって、配列番号６０又は６１又は６２又は６３のヒトＦｃ領域ポリペプチドと比べて、アミノ酸位置３２９位におけるプロリンからグリシンへの突然変異を有するＦｃ領域ポリペプチドを意味する。
本明細書で使用される、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されているKabatナンバリングシステムにしたがってナンバリングされており、本明細書では「ナンバリングはKabatに従う」と表現されている。具体的には、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のKabatナンバリングシステム（６４７～６６０ページを参照のこと）は、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３ページを参照のこと）は、定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用される。
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000001
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000002
Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000003
Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000004
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ突然変異及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000005
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000006
Ｐ３２９Ｇ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000007
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ突然変異及びＰ３２９Ｇ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000008
Ｐ３２９Ｇ突然変異及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000009
Ｐ３２９Ｇ突然変異及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000010
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000011
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ突然変異及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000012
ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000013
Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000014
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ突然変異及びＰ３２９Ｇ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000015
Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000016
Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000017
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000018
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000019
Ｐ３２９Ｇ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000020
Ｐ３２９Ｇ及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000021
Ｐ３２９Ｇ及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000022
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ及びＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000023
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ及びＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域由来のＦｃ領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0007426190000024
異なるヒトＦｃ領域のアライメントを以下に示す（ＥＵナンバリング）：
Figure 0007426190000025
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基と、ヒトＦＲに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を場合により含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、構造的に定義されたループ（超可変ループ）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含有する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ（ＶＨにおいて３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬにおいて３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３））を含む。本明細書で示されるＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）において存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）において存在するＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）において存在する抗原接触点（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）及び９４－１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
一実施態様では、ＨＶＲ残基は、本明細書の他の箇所で特定されるものを含む。
特に指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメインにおける他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書においてKabatのＥＵインデックスナンバリングシステム（Kabat et al、上掲）にしたがってナンバリングされる。
特に指示がない限り、本明細書で使用される「ＩＧＦ－１Ｒ」という用語は、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源に由来する任意のネイティブなＩＧＦ－１Ｒを指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＩＧＦ－１Ｒ、及び細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＩＧＦ－１Ｒを包含する。この用語はまた、ＩＧＦ－１Ｒの天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又はアレル変異体を包含する。ヒトＩＧＦ－１Ｒのアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、個体又は被験体はヒトである。
「単離された」抗体は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフ法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定した場合に、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体の純度の評価方法の概説については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
「単離された」核酸は、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、核酸分子を通常含有する細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、その核酸分子は、染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はそれらのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子（単一のプラスミド又は別個のプラスミド中のこのような核酸分子、及び宿主細胞内の１つ以上の位置に存在するこのような核酸分子を含む）を指す。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指す。すなわち、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる可能な変異体抗体であって、一般に微量で存在する変異体抗体を除いて、この集団を含む個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用すべきモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、リコンビナントＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製することができ、このような方法、及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイティブな抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブなＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＨ）とそれに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＬ）とそれに続く軽鎖定常（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と称される２種類の１つに割り当てることができる。
「添付文書」という用語は、このような治療製品の適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌についての情報及び／又はその使用に関する警告を含有する治療製品の市販パッケージに通例含まれる説明書を指すために使用される。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントさせ、必要な場合にはギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを実現した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の部分とみなさない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の技能の範囲内である様々な方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大限のアライメントを実現するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントさせるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のためには、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して、アミノ酸配列同一性％の値を得る。配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２は、Genentech, Inc.の著作物であり、ソースコードはユーザー向け文書と共にU.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。配列比較パラメータは全て、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変化しない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較のために使用される状況において、所定のアミノ酸配列Ｂに対する所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所定のアミノ酸配列Ｂに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、又は含む所定のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のように計算される。
１００×比Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムによるＡ及びＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないと認識されよう。特に明記されない限り、本明細書で使用されるアミノ酸配列同一性％の値は全て、直前の段落に記載されているように、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータープログラムを使用して得られる。
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物学的活性が有効になるのを可能にするような形態の調製物であって、その製剤を投与する被験体に対して許容し得ないほど毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容し得る担体」は、医薬製剤中の有効成分以外の成分であって、被験体に対して非毒性の成分を指す。薬学的に許容し得る担体には、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定化剤又は保存剤が含まれる。
本明細書で使用される「ペプチドリンカー」という用語は、アミノ酸配列を有するペプチド（一実施態様では、これは合成起源のものである）を意味する。一実施態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも３０アミノ酸長、一実施態様では３２～５０アミノ酸長のアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施態様では、ペプチドリンカーは、３２～４０アミノ酸長のアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施態様では、ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ（Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン）、（ｘ＝３、ｎ＝８、９又は１０）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７又は８）であり、一実施態様ではｘ＝４、ｎ＝６又は７であり、一実施態様ではｘ＝４、ｎ＝７である。一実施態様では、ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２である。
本明細書で使用される「リコンビナント抗体」という用語は、リコンビナント手段によって調製、発現、作製又は単離される全ての抗体（キメラ、ヒト化及びヒト）を意味する。これには、ＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又は宿主細胞にトランスフェクションされたリコンビナント発現プラスミドを使用して発現された抗体が含まれる。このようなリコンビナント抗体は、再構成された形態で可変領域及び定常領域を有する。本明細書で報告されるリコンビナント抗体は、in vivo体細胞超変異に供され得る。したがって、リコンビナント抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来しこれらに関係するが、in vivoではヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
本明細書で使用される「処置」（及びその文法的変化形、例えば「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床的病状の経過中に実施され得る。処置の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症候の軽減、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的転帰の減少、転移の予防、疾患の進行速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本明細書で報告される抗体又はＦｃ領域融合ポリペプチドは、疾患の発症を遅らせるために、又は疾患の進行を遅くするために使用される。
本出願内で使用される「価」という用語は、（抗体）分子において指定数の結合部位が存在することを意味する。したがって、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、（抗体）分子においてそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位が存在することを意味する。本明細書で報告されるように、本明細書で報告される二重特異性抗体は、好ましい一実施態様では「二価」である。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体のその抗原に対する結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。一般的に、抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは類似構造を有し、各ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91)を参照のこと）。１つのＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的ＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングし得る。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと）
「眼血管疾患」という用語は、限定されないが、眼内新生血管形成症候群、例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞症、黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、網膜血管腫増殖、黄斑毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩新生血管形成、眼内新生血管形成、角膜新生血管形成、網膜新生血管形成、脈絡膜新生血管形成及び網膜変性を含む（例えば、Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710を参照のこと）。
本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、それが連結された別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのプラスミド、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたプラスミドを含む。特定のプラスミドは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指令することができる。このようなプラスミドは、本明細書では「発現プラスミド」と称される。
本明細書で使用される「ＶＥＧＦ」という用語は、Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-1309; Houck et al., Mol. Endocrin. 5 (1991) 1806-1814; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-1312及びConnolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-20024によって記載されているようにヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ａ）、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子（ヒトＶＥＧＦ１６５の前駆体配列のアミノ酸２７～１９１：配列番号３０；アミノ酸１～２６は、シグナルペプチドに相当する）、及び関連する１２１、１８９及び２０６の血管内皮細胞成長因子アイソフォームと、それに加えてそれらの成長因子の天然に存在するアレル形態及びプロセシング形態とを指す。ＶＥＧＦは、腫瘍及び眼内障害に関連する正常及び異常な血管新生及び新生血管のレギュレーションに関与する（Ferrara, N., et al., Endocrin. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934;及びDvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039）。ＶＥＧＦは、いくつかの供給源から単離され、いくつかのアイソフォームを含むホモ二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞に対して高特異的な分裂促進活性を示す。
本明細書で使用される「（前記）突然変異ＩＨＨ－ＡＡＡを有する」という用語は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｉ２５３Ａ（Ｉｌｅ２５３Ａｌａ）、Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）及びＨ４３５Ａ（Ｈｉｓ４３５Ａｌａ）の組み合わせを指し、本明細書で使用される「（前記）突然変異ＨＨＹ－ＡＡＡを有する」という用語は、突然変異Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）、Ｈ４３３Ａ（Ｈｉｓ４３３Ａｌａ）及びＹ４３６Ａ（Ｔｙｒ４３６Ａｌａ）の組み合わせを指し、本明細書で使用される「（前記）突然変異ＹＴＥを有する」という用語は、突然変異Ｍ２５２Ｙ（Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ）、Ｓ２５４Ｔ（Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ）及びＴ２５６Ｅ（Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ）の組み合わせを指す（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
本明細書で使用される「（前記）突然変異Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡを有する」という用語は、ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）の組み合わせを指す（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で使用される「（前記）突然変異ＳＰＬＥを有する」という用語は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｓ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）及びＬ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）の組み合わせを指す（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。本明細書で使用される「（前記）突然変異ＳＰＬＥ及びＰ３２９Ｇを有する」という用語は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｓ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）、Ｌ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）の組み合わせを指す（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、ＦｃＲｎ結合性を有しない抗体は、眼内において、ＦｃＲｎ結合性を有する抗体と比較して実質的に変化した半減期を有しないが、全身血液循環から迅速に除去され、眼外における全身性副作用が全くないか又は非常に限定的であるため、硝子体内適用に有益であるという知見に少なくとも部分的に基づくものである。本明細書で報告される抗体は、例えば、眼血管疾患の診断又は治療に有用である。
本発明は、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対する免疫グロブリンＦｃ領域の結合に影響を及ぼす（すなわち、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を減少させるか又は排除さえする）特定の突然変異又は突然変異の組み合わせは、ブドウ球菌プロテインＡに対するＦｃ領域の結合を同時に排除しないという知見に少なくとも部分的に基づくものである。例えば、カッパ軽鎖を含む抗体のみに結合する特異的及び種限定的なアフィニティークロマトグラフィー材料（例えば、KappaSelect（商標）など）が不要であるため、これは、用いられ得る精製プロセスに対して重大な影響を及ぼす。したがって、本明細書で報告される突然変異によって、プロテインＡに対する結合を維持しながら、ＦｃＲｎに対する結合を減少させるか又は排除さえすることが同時に可能である。
本発明は、Ｆｃ領域の各Ｆｃ領域ポリペプチドにおいて様々な突然変異を使用することによって、オーダーメイドのＦｃＲｎ結合性を有するヘテロ二量体分子（例えば、二重特異性抗体など）を提供することができ、それにより、オーダーメイドの全身半減期を有する抗体を提供することができるという知見に少なくとも部分的に基づくものである。
本発明は、Ｆｃ領域の各Ｆｃ領域ポリペプチドにおいて様々な突然変異を使用することによって、一方では減少又は排除さえされたＦｃＲｎ結合性を有するが、他方ではブドウ球菌プロテインＡ結合能を維持するヘテロ二量体分子（例えば、二重特異性抗体など）を提供することができるという知見に少なくとも部分的に基づくものである。プロテインＡに対するこの結合は、ホモ二量体副産物からヘテロ二量体抗体を分離するのに使用され得る。例えば、ノブイントゥホールアプローチを使用して、一方のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを他方のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａと組み合わせることによって、一方ではＦｃＲｎに結合しないが（両方の突然変異セットがヒトＦｃＲｎに関してサイレントである）、ブドウ球菌プロテインＡに対する結合を維持するヘテロ二量体Ｆｃ領域を得ることができる（突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有するＦｃ領域ポリペプチドはＦｃＲｎに結合せず、プロテインＡに結合しないのに対して、突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを有するＦｃ領域ポリペプチドはＦｃＲｎに結合しないが、プロテインＡに依然として結合する）。したがって、ホモ二量体ホール－ホール副産物はプロテインＡにもはや結合しないので、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用してこれを除去し得る。したがって、ノブイントゥホールアプローチを、ホール鎖における突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ並びにノブ鎖における突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａと組み合わせることによって、ホモ二量体ホール－ホール副産物からのヘテロ二量体ノブイントゥホール産物の精製／分離を容易にし得る。
突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ａ、又はＬ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、又はＬ２５１Ｓ、Ｌ３１４Ｓ、Ｌ４３２Ｓの組み合わせは、プロテインＡに対する結合の喪失をもたらすのに対して、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ａ、又はＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、Ｙ４３６Ａ、又はＬ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄの組み合わせは、ヒト新生児Ｆｃレセプターに対する結合の喪失をもたらす。
以下の表は、相互作用に関与するか、又は相互作用を改変するために変化させたＦｃ領域中のアミノ酸残基の例示的な概要を示す。
Figure 0007426190000026
Figure 0007426190000027

Figure 0007426190000028
本明細書で報告される改変／突然変異は、ヒトＦｃＲｎなどの１つ以上のＦｃレセプターに対する結合特異性を変化させる。同時に、ヒトＦｃＲｎに対する結合を変化させる突然変異のいくつかは、プロテインＡに対する結合を変化させない。
特定の実施態様では、突然変異は、これらの突然変異を欠く対応する抗体と比較して、抗体の血清半減期を変化させるか又は実質的に変化させる。
さらなる特定の実施態様では、突然変異は、これらの突然変異を欠く対応する抗体と比較して、プロテインＡに対する抗体の結合を変化させないか又は実質的に変化させない。
Ａ．新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）
新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は、in vivoにおけるＩｇＧクラスの抗体の代謝運命に重要である。ＦｃＲｎは、リソソーム分解経路から野生型ＩｇＧをサルベージするように機能して、クリアランスの減少及び半減期の増加をもたらす。それは、２つのポリペプチド（５０kDaのクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）及び１５kDaのβ２－ミクログロブリン（β２ｍ））からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、高い親和性で、クラスＩｇＧの抗体のＦｃ領域のＣＨ２－ＣＨ３部分に結合する。クラスＩｇＧの抗体とＦｃＲｎとの間の相互作用はｐＨ依存性であり、１：２の化学量論比で起こる（すなわち、１つのＩｇＧ抗体分子は、その２つの重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを介して、２つのＦｃＲｎ分子と相互作用し得る）（例えば、Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083を参照のこと）。
したがって、ＩｇＧのin vitroＦｃＲｎ結合特性／特徴は、血液循環におけるそのin vivo薬物動態特性の指標である。
ＦｃＲｎと、ＩｇＧクラスの抗体のＦｃ領域との間の相互作用では、重鎖ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの様々なアミノ酸残基が関与している。ＦｃＲｎと相互作用するアミノ酸残基は、およそＥＵ位置２４３位～ＥＵ位置２６１位、およそＥＵ位置２７５位～ＥＵ位置２９３位、およそＥＵ位置３０２位～ＥＵ位置３１９位、およそＥＵ位置３３６位～ＥＵ位置３４８位、およそＥＵ位置３６７位～ＥＵ位置３９３位、ＥＵ位置４０８位及びおよそＥＵ位置４２４位～ＥＵ位置４４０に位置する。より具体的には、KabatのＥＵインデックスナンバリングによる以下のアミノ酸残基が、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの間の相互作用に関与する：Ｆ２４３、Ｐ２４４、Ｐ２４５Ｐ、Ｋ２４６、Ｐ２４７、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｐ２５７、Ｅ２５８、Ｖ２５９、Ｔ２６０、Ｃ２６１、Ｆ２７５、Ｎ２７６、Ｗ２７７、Ｙ２７８、Ｖ２７９、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｖ２８４、Ｈ２８５、Ｎ２８６、Ａ２８７、Ｋ２８８、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｐ２９１、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｓ３０４、Ｖ３０５、Ｌ３０６、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｌ３０９、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｗ３１３、Ｌ３１４、Ｎ３１５、Ｇ３１６、Ｋ３１７、Ｅ３１８、Ｙ３１９、Ｉ３３６、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ａ３３９、Ｋ３４０、Ｇ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｐ３４６、Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｃ３６７、Ｖ３６９、Ｆ３７２、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ｉ３７７、Ａ３７８、Ｖ３７９、Ｅ３８０、Ｗ３８１、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｎ３８４、Ｇ３８５、Ｑ３８６、Ｐ３８７、Ｅ３８８、Ｎ３８９、Ｙ３９１、Ｔ３９３、Ｓ４０８、Ｓ４２４、Ｃ４２５、Ｓ４２６、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４２９、Ｅ４３０、Ａ４３１、Ｌ４３２、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、Ｙ４３６、Ｔ４３７、Ｑ４３８、Ｋ４３９及びＳ４４０。
部位特異的突然変異誘発研究では、ＩｇＧのＦｃ領域における重要なＦｃＲｎ結合部位は、ヒスチジン３１０、ヒスチジン４３５及びイソロイシン２５３、並びにそれら程ではないにせよヒスチジン４３３及びチロシン４３６であることが証明されている（例えば、Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825; Raghavan, M., et al., Biochem. 34 (1995) 14649-146579; Medesan, C., et al., J Immunol. 158 (1997) 2211-2217を参照のこと）。
ＦｃＲｎに対するＩｇＧ結合を増加させるための方法が、様々なアミノ酸残基（トレオニン２５０、メチオニン２５２、セリン２５４、トレオニン２５６、トレオニン３０７、グルタミン酸３８０、メチオニン４２８、ヒスチジン４３３及びアスパラギン４３４）においてＩｇＧを突然変異させることによって実施されている（Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789を参照のこと）
いくつかの場合では、減少した血液循環半減期を有する抗体が望ましい。例えば、硝子体内適用用の薬物は、患者において長い眼内半減期及び短い循環半減期を有するべきである。このような抗体はまた、例えば、眼内の疾患部位に対する曝露の増加という利点を有する。
ＦｃＲｎ結合及びそれにより血液循環半減期に影響を及ぼす様々な突然変異が公知である。マウスＦｃ－マウスＦｃＲｎ相互作用に重要なＦｃ残基が、部位特異的突然変異誘発によって同定されている（例えば、Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180を参照のこと）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４及びＨ４３５（KabatのＥＵナンバリング）が、相互作用に関与している（Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０及びＨ４３５は、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎとの相互作用に重要であることが見出された（Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825）。タンパク質間相互作用研究によってＦｃＲｎ結合を改善するために、残基Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６ＥがDall'Acquaらによって記載されている（Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524）。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５及びＹ４３６が相互作用に重要であることが示されている（Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)では、残基２４８～２５９位及び３０１～３１７位及び３７６～３８２位及び４２４～４３７位の様々な突然変異体が報告及び検査されている。例示的な突然変異及びＦｃＲｎ結合に対するそれらの効果を以下の表に記載する。
Figure 0007426190000029
Figure 0007426190000030

Figure 0007426190000031

Figure 0007426190000032
１つのＦｃ領域ポリペプチドにおける１つの片側突然変異は、ＦｃＲｎに対する結合を有意に弱めるのに十分であることが見出された。Ｆｃ領域に導入される突然変異が多いほど、ＦｃＲｎに対する結合が弱くなる。しかし、片側非対称性突然変異は、ＦｃＲｎ結合を完全に阻害するのに十分でない。ＦｃＲｎ結合を完全に阻害するためには、両側突然変異が必要である。
ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼすためのＩｇＧ１ Ｆｃ領域の対称的な操作の結果を以下の表に示す（突然変異のアライメント及びＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラム保持時間）。
Figure 0007426190000033
物質はフロースルー（ボイドピーク）にあるため、３分間未満の保持時間は非結合に対応する。
単一突然変異Ｈ３１０Ａは、任意のＦｃＲｎ結合性を削除するための最もサイレントな対称性突然変異である。
対称性単一突然変異Ｉ２５３Ａ及びＨ４３５Ａは、０．３～０．４分間の相対的な保持時間シフトをもたらす。これは、一般的に、検出不可能な結合とみなされ得る。
単一突然変異Ｙ４３６Ａは、ＦｃＲｎアフィニティーカラムに対する検出可能な相互作用強度をもたらす。この理論に縛られるものではないが、この突然変異は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異）の組み合わせなどのゼロ相互作用と区別され得るＦｃＲｎ媒介性半減期を有し得る。
対称的に改変された抗ＨＥＲ２抗体を用いて得られた結果を以下の表に示す（参照用に国際公開公報第２００６／０３１３７０号を参照のこと）。
Figure 0007426190000034
Ｆｃ領域におけるＦｃＲｎ結合に影響を与える非対称性突然変異の導入効果が、ノブイントゥホール技術を使用してアセンブルされた二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ－２抗体で例証されている（例えば、米国特許第７，６９５，９３６号、米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号；「ホール鎖」突然変異：Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、「ノブ鎖」突然変異：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを参照のこと）。ＦｃＲｎ結合に対する導入された突然変異の効果は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー法を使用して容易に決定され得る（図９及び以下の表を参照のこと）。ＦｃＲｎアフィニティーカラムからより遅く溶出される（すなわち、より長いＦｃＲｎアフィニティーカラム保持時間を有する）抗体は、より長いin vivo半減期を有し、その逆もまた同様である。
Figure 0007426190000035
Ｆｃ領域におけるＦｃＲｎ結合に影響を与える非対称性突然変異の導入効果が、非対称性突然変異の導入を可能にするためのノブイントゥホール技術を使用してアセンブルされた単一特異性抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体でさらに例証されている（例えば、米国特許第７，６９５，９３６号、米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号；「ホール鎖」突然変異：Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、「ノブ鎖」突然変異：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを参照のこと）。ＦｃＲｎ結合に対する導入された突然変異の効果は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー法を使用して容易に決定され得る（以下の表を参照のこと）。ＦｃＲｎアフィニティーカラムからより遅く溶出される（すなわち、より長いＦｃＲｎアフィニティーカラム保持時間を有する）抗体は、より長いin vivo半減期を有し、その逆もまた同様である。
Figure 0007426190000036
非対称性ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異及びＬＬＬ－ＤＤＤ突然変異（ＬＬＬ－ＤＤＤ突然変異＝Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ）は、対応する親抗体又は野生型抗体よりも弱い結合を示す。
対称性ＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異（＝突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａの組み合わせ）は、ヒトＦｃＲｎにもはや結合しないＦｃ領域をもたらすが、プロテインＡに対する結合は維持される（図１１、図１２、図１３及び図１４を参照のこと）。
Ｆｃ領域におけるＦｃＲｎ結合に影響を与える非対称性突然変異の導入効果が、非対称性突然変異の導入を可能にするためのノブイントゥホール技術を使用してアセンブルされた単一特異性抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体（ＩＧＦ－１Ｒ）、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＡＮＧ－２抗体（ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２）、及び両重鎖のＣ末端が融合した全長抗体（融合）でさらに例証されている（例えば、米国特許第７，６９５，９３６号、米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号；「ホール鎖」突然変異：Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ、「ノブ鎖」突然変異：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びプロテインＡ結合に対する導入された突然変異の効果は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー法、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー法及びＳＰＲベースの方法を使用して容易に決定され得る（以下の表を参照のこと）。
Figure 0007426190000037
Figure 0007426190000038
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される変異体ヒトＩｇＧクラスＦｃ領域を含む抗体である。
Ｆｃ領域ポリペプチドは、上記特徴を抗体又はその融合パートナーに付与する。
融合パートナーは、生物学的活性を有する任意の分子であって、そのin vivo半減期が減少又は増加されるものである（すなわち、そのin vivo半減期が明確に定義され、その目的の用途に合わせて作られるものである）任意の分子であり得る。
Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、例えば、本明細書で報告される変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域と、ターゲットに結合するレセプタータンパク質（例えば、ＴＮＦＲ－Ｆｃ領域融合ポリペプチド（ＴＮＦＲ＝ヒト腫瘍壊死因子レセプター）、又はＩＬ－１Ｒ－Ｆｃ領域融合ポリペプチド（ＩＬ－１Ｒ＝ヒトインターロイキン－１レセプター）、又はＶＥＧＦＲ－Ｆｃ領域融合ポリペプチド（ＶＥＧＦＲ＝ヒト血管内皮成長因子レセプター）、又はＡＮＧ２Ｒ－Ｆｃ領域融合ポリペプチド（ＡＮＧ２Ｒ＝ヒトアンジオポエチン２レセプター）などのリガンドを含む）とを含み得る。
Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、例えば、本明細書で報告される変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域と、ターゲットに結合する抗体フラグメント（例えば、抗体Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ（例えば、Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1126-1136を参照のこと）又はドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、国際公開公報第２００４／０５８８２１及び国際公開公報第２００３／００２６０９号を参照のこと）を含む）とを含み得る。
Ｆｃ領域融合ポリペプチドは、例えば、本明細書で報告される変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域と、レセプターリガンド（天然に存在するもの又は人工的なもののいずれか）とを含み得る。
Ｂ．眼血管疾患
眼血管疾患は、新たな血管の増殖及び眼組織（例えば、網膜又は角膜）構造への侵入の変化又はアンレギュレーションを特徴とする任意の病理学的症状である。
一実施態様では、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、乾燥型加齢黄斑変性症（乾燥型ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、血管炎（例えば、網膜中心静脈閉塞症）、乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、多巣性脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ（シェーグレン病）及び他の眼疾患からなる群より選択され、前記眼疾患又は障害は、眼新生血管、血管漏出及び／又は網膜浮腫に関連する。
本明細書で報告される抗体は、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、ＣＭＥ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ、ＰＤＲ、眼瞼炎、ドライアイ及びブドウ膜炎、また好ましい一実施態様では、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、眼瞼炎及びドライアイ、また好ましい一実施態様では、ＣＭＥ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ及びＰＤＲ、また好ましい一実施態様では、眼瞼炎及びドライアイ、特に、滲出型ＡＭＤ及び乾燥型ＡＭＤ、また、特に、滲出型ＡＭＤの予防及び処置に有用である。
いくつかの実施態様では、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症からなる群より選択される。
角膜新生血管に関連する他の疾患には、限定されないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪部角角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン病、酒さ性ざ瘡、フィレクテヌローシス、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切開及び角膜移植拒絶が含まれる。
網膜／脈絡膜新生血管に関連する疾患には、限定されないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜色素変性、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経ピット、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷及びレーザー後合併症が含まれる。
他の疾患には、限定されないが、ルベオーシスに関連する疾患（角の新生血管）、及び線維性血管性組織又は線維組織の異常増殖によって引き起こされる疾患（全ての形態の増殖性硝子体網膜症を含む）が含まれる。
未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、未熟児が罹患する眼疾患である。それは、網膜血管の無秩序な成長によって引き起こされ、瘢痕及び網膜剥離をもたらし得ると考えられる。ＲＯＰは軽度であり得、自然に解消し得るが、深刻な場合には失明につながり得る。このようなものとして、全ての早産乳児はＲＯＰのリスクがあり、非常に低い出生体重はさらなるリスク因子である。酸素毒性及び相対的低酸素状態は両方とも、ＲＯＰの発生に寄与し得る。
黄斑変性症は、高齢者において主に見られる医学的症状であり、眼瞼内層の中心部（網膜の黄斑領域として公知である）が菲薄化、萎縮及び一部の場合には出血を被る。これは、中心視力の低下（これは、細部の判別不能、読み取り不能又は顔の認識不能を引き起こす）をもたらし得る。American Academy of Ophthalmologyによれば、今日の米国では、それは、５０歳以上の者の中心視力の低下（失明）の主要な原因である。若者が罹患するいくつかの黄斑ジストロフィーを黄斑変性症と称することもあるが、この用語は、一般的に、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）を指す。
加齢黄斑変性は、網膜色素上皮と基礎脈絡膜との間のドルーゼンと称される黄斑（詳細な中心視力を提供する網膜の中心領域であり、中心窩と称される）における特徴的な黄色沈着で始まる。これらの初期変化（加齢性黄斑変性症とも称される）を有する大半の人々は、良好な視力を有する。ドルーゼンを有する人々は、進行性ＡＭＤの発生へと進み得る。このリスクは、ドルーゼンが大きくて多数の場合に極めて高くなり、黄斑下の色素性細胞層における障害に関連する。大きくて柔軟なドルーゼンはコレステロール沈着の増加に関連し、コレステロール降下薬又はRheo Procedureに応答し得る。
深刻な視力低下の原因となる進行性ＡＭＤは、２つの形態を有する：乾燥型及び滲出型。中央域の萎縮（乾燥型の進行性ＡＭＤ）は、網膜下の網膜色素上皮層の萎縮から生じ、眼の中央部における光レセプター（桿体及び錐体）の喪失を通じて視力低下を引き起こす。この症状に利用可能な処置はないが、National Eye Instituteなどにより、高用量の抗酸化剤、ルテイン及びゼアキサンチンを含むビタミンサプリメントが、乾燥黄斑変性の進行を遅らせ、一部の患者では視力を改善することが実証されている。
網膜色素変性症（ＲＰ）は、一群の遺伝的眼疾患である。ＲＰの症候の進行では、夜盲が、一般的に、トンネル視に数年又は数十年先立って起こる。ＲＰを有する多くの人々は、４０代又は５０代までは法定盲人になることなく、一生を通じていくらかの視力を保持する。他の者は、一部の場合には子供のうちからＲＰから全盲に進行する。ＲＰの進行は、各事例において異なる。ＲＰは、遺伝性網膜ジストロフィー（これは、網膜の光レセプター（桿体及び錐体）又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の異常が、進行性の視力低下につながる一群の遺伝性障害である）の一種である。罹患者は、最初に、暗順応障害又は夜盲症（夜盲）を経験し、続いて、周辺視野の低下（トンネル視として公知である）及び時として疾患の後期に中心視力の低下を経験する。
体液及びタンパク質の沈着が眼の黄斑（黄色の網膜中心窩）の上又は下に集積すると、黄斑浮腫が生じてそれを肥厚化及び腫脹させる。黄斑は、眼球後部の網膜の中心付近にあるので、この腫脹は中心視力を歪め得る。この領域は、明瞭で明確な中心視力を提供する密集した錐体を保持して、視線の一直線上にある形、色及び細部を把握することを可能にする。嚢胞様黄斑浮腫は、嚢胞形成を含む黄斑浮腫の一種である。
Ｃ．例示的な抗体
一態様では、本発明は、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有する単離された抗体を提供する（すなわち、これらの抗体は、Ｆｃ領域において（すなわち、両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて）突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を有する抗体と同程度か又はそれ未満の親和性で、ヒトＦｃＲｎに結合する）。
本明細書で報告される１つの例示的な抗体は、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有する抗体であって、第１のＦｃ領域ポリペプチドと、第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含み、
ｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含むか、又は
ｉｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、又は
ｉｉｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが
ａ）突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、若しくは
ｂ）突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ
を含むか、
又は
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが
ａ）突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ
を含む抗体である。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトＦｃＲｎに特異的に結合しない。全ての態様の一実施態様では、抗体は、ブドウ球菌プロテインＡに特異的に結合しない。
全ての態様の一実施態様では、抗体は、ヒトＦｃＲｎに特異的に結合しない。全ての態様の一実施態様では、抗体は、ブドウ球菌プロテインＡに特異的に結合する。
全ての態様の一実施態様では、第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（「ホール」）をさらに含み、第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（「ノブ」）をさらに含む。
全ての態様の一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａをさらに含む。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｐ３２９Ｇをさらに含む。
全ての態様の一実施態様では、Ｆｃ領域ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅをさらに含む。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｐ３２９Ｇをさらに含む。
一実施態様では、抗体は、二重特異性抗体である。一実施態様では、二重特異性抗体は、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する１つの結合特異性と、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する１つの結合特異性とを有する。
本明細書で報告され、また本発明の一態様の１つの例示的な抗体は、無効化されたＦｃＲｎ結合性を有する二重特異性二価抗体であって、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含み、
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１４のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１６のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１７のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２２のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号２４のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉｉ）両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域であって、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが該ＩｇＧクラスＦｃ領域に含まれることになるように、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、ｉ）群Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）群Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）群Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）から選択される突然変異の１つ又は２つを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含む群から選択される突然変異の１つ又は２つを含むＩｇＧクラスＦｃ領域を含む二重特異性二価抗体である。
全ての態様の一実施態様では、ＩｇＧクラスＦｃ領域は、変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域である。一実施態様では、変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域は、ＩｇＧクラスヘテロ二量体Ｆｃ領域である。
全ての態様の一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドをペアリングして（機能的な）ＩｇＧクラスＦｃ領域を形成すると、ヘテロ二量体が形成される。
一実施態様では、ヒトＦｃ領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１サブクラス又はＩｇＧ４サブクラスのヒトＦｃ領域ポリペプチドである。
一実施態様では、ヒトＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１サブクラスのヒトＦｃ領域ポリペプチドである。
一実施態様では、ヒトＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するＩｇＧ４サブクラスのヒトＦｃ領域ポリペプチドである。
一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗをさらに含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖをさらに含む。
一実施態様では、二重特異性抗体は、
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号２０のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号２８のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号２９のアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする。
一実施態様では、二重特異性抗体は、Ｆｃ領域がｉｉｉ）ヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。一実施態様では、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）をさらに含むことを特徴とする。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗをさらに含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖをさらに含む。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗをさらに含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖをさらに含む。
一実施態様では、二重特異性抗体は、Ｆｃ領域がｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする。一実施態様では、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域が、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）をさらに含むことを特徴とする。一実施態様では、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域が、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）をさらに含むことを特徴とする。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗをさらに含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖをさらに含む。一実施態様では、第１のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗをさらに含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドは、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖをさらに含む。
一実施態様では、二重特異性抗体は、両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（すなわち、ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域であって、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが該Ｆｃ領域に含まれることになるように、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、ｉ）群Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）群Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）群Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）から選択される突然変異の１つ又は２つを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含む群から選択される突然変異の１つ又は２つを含むＦｃ領域を含む。
一実施態様では、二重特異性抗体は、両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（すなわち、ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域であって、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが該Ｆｃ領域に含まれることになるように、Ｆｃ領域において、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含み、それにより、全ての突然変異が第１の若しくは第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあるか、又は１つ若しくは２つの突然変異が第１のＦｃ領域ポリペプチド内にあり、１つ若しくは２つの突然変異が第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあるＦｃ領域を含む。
本明細書で報告される他のさらなる態様は、二重特異性抗体を含む医薬製剤、眼血管疾患を処置するのに使用するための医薬製剤、眼血管疾患を処置するための医薬を製造するための二重特異性抗体の使用、二重特異性抗体をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、眼血管疾患を患っている患者を処置する方法である。一実施態様では、二重特異性抗体又は二重特異性抗体を含む医薬製剤は、硝子体内適用を介して投与される。
本発明に係るさらなる態様は、本明細書で報告される二重特異性抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子である。
本発明はさらに、本明細書で報告される核酸を含有する発現プラスミドであって、原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞において該核酸を発現することができる発現プラスミド、及び本明細書で報告される二重特異性抗体をリコンビナント生産するためのこのようなプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。
本発明は、本明細書で報告されるプラスミドを含む原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞をさらに含む。
本発明は、本明細書で報告される二重特異性抗体を生産するための方法であって、原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞において本明細書で報告される核酸を発現させること、及び該細胞又は該細胞培養上清から該二重特異性抗体を回収することを特徴とする方法をさらに含む。一実施態様は、本明細書で報告される二重特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）該抗体をコードする核酸分子を含むプラスミドで宿主細胞をトランスフォーメーションする工程、
ｂ）該抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、及び
ｃ）該培養物から該抗体を回収する工程
を含む方法である。
本発明は、二重特異性抗体を生産するためのこのような方法によって得られた抗体をさらに含む。
本明細書で報告される抗体は、Ｆｃ領域におけるそれらの特定の改変であって、眼血管疾患を患っている患者に利益をもたらす特定の改変により、非常に有益な特性を有する。それらは、（定常重鎖領域を有しないより小さな抗体フラグメントと比較して）硝子体内環境における高い安定性及び眼からの遅い拡散を示す（これらの場所において、実際の疾患が存在し、処置される）（したがって、処置スケジュールは、例えば、Ｆａｂ及び（Ｆａｂ）２フラグメントのような非全長ＩｇＧ様抗体と比較して潜在的に改善され得る）。一方、本明細書で報告される抗体は、血清から非常に迅速に除去される（これは、全身曝露から生じる潜在的な副作用を減少させるために非常に望ましい）。驚くべきことに、それらはまた、（定常領域において突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有しないバージョンと比較して）より低い粘度を示すので（図２を参照のこと）、眼疾患の処置において細い針による硝子体内適用に特に有用である（このような適用の場合、典型的には、細い針を使用するので、高い粘度が適切な適用をかなり困難にする）。より低い粘度はまた、より高濃度の製剤を可能にする。また、驚くべきことに、（眼内の凝集はこのような処置中に合併症につながり得るので）本明細書で報告される抗体は、保存中に、（Ｆｃ領域において突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有しないバージョンと比較して）より低い凝集傾向（これは、眼内の硝子体内適用に重要である）を示す（図４を参照のこと）。本明細書で報告される二重特異性抗体は、血管疾患の阻害において優れた有効性を示す。特定の実施態様では、本明細書で報告される二重特異性抗体は、定常領域における特定の改変（例えば、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）により、血栓及び／又は不要な細胞死（例えば、ＡＤＣＣによる）のような副作用のリスクを減少させる有益な特性（例えば、Ｆｃガンマレセプターに対する非結合／Ｆｃガンマレセプターの非結合）を示す。
一実施態様では、本明細書で報告されるように、本明細書で報告される二重特異性抗体は二価である。
本発明に係る一態様では、本明細書で報告されるこのような二重特異性二価抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の全長抗体の改変重鎖及び改変軽鎖であって、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている改変重鎖及び改変軽鎖
を含むことを特徴とする。
ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）に特異的に結合する二重特異性抗体に関するこの二重特異性二価抗体フォーマットは、国際公開公報第２００９／０８０２５３号に記載されている（ノブイントゥホール改変ＣＨ３ドメインを含む）。この二重特異性二価抗体フォーマットをベースとする抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂと称される。
一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１０２のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号３６のアミノ酸配列、並びに
ｂ）第２の全長抗体の改変重鎖として配列番号１０３のアミノ酸配列、及び第２の全長抗体の改変軽鎖として配列番号３７のアミノ酸配列
を含むことを特徴とする。
一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１０４のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号４０のアミノ酸配列、並びに
ｂ）第２の全長抗体の改変重鎖として配列番号１０５のアミノ酸配列、及び第２の全長抗体の改変軽鎖として配列番号４１のアミノ酸配列
を含むことを特徴とする。
一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１０６のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号４４のアミノ酸配列、並びに
ｂ）第２の全長抗体の改変重鎖として配列番号１０７のアミノ酸配列、及び第２の全長抗体の改変軽鎖として配列番号４５のアミノ酸配列
を含むことを特徴とする。
したがって、本明細書で報告される一態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号３６及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。
したがって、本明細書で報告される一態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号４０及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。
したがって、本明細書で報告される一態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号４４及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。
本明細書で報告される別の態様では、本明細書で報告される二重特異性抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、該重鎖のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して該軽鎖のＣ末端に連結されている重鎖及び軽鎖を含むことを特徴とする。
ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）に特異的に結合するこの二重特異性抗体に関するこの二重特異性二価抗体フォーマットは、国際公開公報第２０１１／１１７３３０号に記載されている（ノブイントゥホール改変ＣＨ３ドメインを含む）。この二重特異性二価抗体フォーマットをベースとする抗体は、ワンアーム単鎖Ｆａｂ（ＯＡｓｃＦａｂ）と命名されている。
一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１０８のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号４８のアミノ酸配列、並びに
ｂ）ペプチドリンカーを介して第２の全長抗体の軽鎖に連結された第２の全長抗体の重鎖として配列番号１０９のアミノ酸配列
を含むことを特徴とする。
一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１１０のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号５１のアミノ酸配列、並びに
ｂ）ペプチドリンカーを介して第２の全長抗体の軽鎖に連結された第２の全長抗体の重鎖として配列番号１１１のアミノ酸配列
を含むことを特徴とする。
一実施態様では、第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、以下の位置：重鎖可変ドメインの４４位と軽鎖可変ドメインの１００位（ナンバリングは、Kabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）のＥＵインデックスに従う）との間のジスルフィド結合の導入によってさらに安定化される。安定化のためにジスルフィド結合を導入する技術は、例えば、国際公開公報第９４／０２９３５０号、Rajagopal, V., et al, Prot. Eng. 10 (1997) 1453-1459, Kobayashi et al., Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393及びSchmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721に記載されている。
したがって、本明細書で報告される一態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１０８、配列番号１０９及び配列番号４８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。
したがって、本明細書で報告される一態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。
一実施態様では、本明細書で報告される二重特異性二価抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, 及び Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681において、数例を用いて詳細に記載されている「ノブイントゥホール」技術によって変化される。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面が、これら２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させるように変化される。（２つの重鎖の）２つの各ＣＨ３ドメインは「ノブ」であり得る一方、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収率を増加させる。
本明細書で報告される全ての態様の好ましい一実施態様では、二重特異性抗体は、
一方の重鎖のＣＨ３ドメイン及び他方の重鎖のＣＨ３ドメインがそれぞれ、抗体ＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスを含むインターフェイスで接触することを特徴とし、
該インターフェイスは、該二重特異性抗体の形成を促進するように変化されており、該変化は、
ａ）該二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスと接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内において、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより、他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティで位置決定可能な突出部が、一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内において発生するように、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化され、
及び
ｂ）該二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスと接触する第２のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内において、
アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより、第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突出部が位置決定可能であるキャビティが、第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内において発生するように、
他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化されることを特徴とする。
したがって、好ましい一実施態様では、本発明に係る抗体は、
ａ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインがそれぞれ、抗体ＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスにおいて変化を含むインターフェイスで接触することを特徴とし、
ｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより、他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティで位置決定可能な突出部が、一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内において発生し、
及び
ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより、第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突出部が位置決定可能であるキャビティが、第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内において発生する。
好ましい一実施態様では、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
好ましい一実施態様では、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。
一実施態様では、両方のＣＨ３ドメイン間においてジスルフィド架橋が形成し得るように、ＣＨ３ドメインは両方とも、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるシステイン残基（Ｃ）の導入によってさらに変化される。
一実施態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含む。例えば、Ｙ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異を「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに導入し、Ｙ３４９Ｃ又はＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異を「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに導入することによって、ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681）。
一実施態様では、本明細書で報告される二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、突然変異Ｙ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ及び突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、突然変異Ｓ３５４Ｃ又はＥ３５６Ｃ又はＹ３４９Ｃ並びに突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。好ましい一実施態様では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＹ３４９Ｃ突然変異、及び他方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＳ３５４Ｃ突然変異が鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングは、Kabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）のＥＵインデックスに従う）。好ましい一実施態様では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＹ３４９Ｃ突然変異、及び他方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＳ３５４Ｃ突然変異が鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングは、Kabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）のＥＵインデックスに従う）。
しかし、欧州特許出願公開第１８７０４５９Ａ１号に記載されている他のノブイントゥホール技術も代替的又は付加的に使用され得る。したがって、二重特異性抗体の別の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ突然変異、並びに「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ突然変異である（ナンバリングは、Kabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）のＥＵインデックスに従う）。
別の実施態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、それに加えて、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
一実施態様では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、それに加えて、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内においてＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
一実施態様では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を含み、それに加えて、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
本明細書で報告される一実施態様では、本明細書で報告される二重特異性抗体は、以下の特性の１つ以上を有することを特徴とする：
－ （マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックなマウスにおいて、硝子体内適用の９６時間後に）（実施例６に記載されているアッセイで決定すると）ｉｉｉ）に記載されている突然変異を有しない対応する二重特異性抗体と比較して低い血清濃度を示し、及び／又は
－ （マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックなマウスにおいて、右眼の硝子体内適用の９６時間後に）（実施例６に記載されているアッセイで決定すると）ｉｉｉ）に記載されている突然変異を有しない対応する二重特異性抗体と比較して、類似（係数０．８～１．２）の全右眼溶解物中濃度を示し、及び
－ 無効化されたヒトＦｃＲｎ結合性を有し、及び／又は
－ （ＳＰＲによって決定すると）ブドウ球菌プロテインＡ結合性を有さず、及び／又は
－ （ＳＰＲによって決定すると）維持されたブドウ球菌プロテインＡ結合性を有する。
一実施態様では、二重特異性二価抗体は、
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含むことを特徴とし、
ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号２０のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号２８のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２９のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）二重特異性抗体が、
α）両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域であって、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域に含まれることになるように、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、ｉ）群Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）群Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）群Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）から選択される突然変異の１つ又は２つを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含む群から選択される突然変異の１つ又は２つを含むＩｇＧクラスＦｃ領域、又は
β）両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（すなわち、ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域であって、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが該Ｆｃ領域に含まれることになるように、該Ｆｃ領域において、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を両方が含み、それにより、全ての突然変異が第１の若しくは第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあるか、又は１つ若しくは２つの突然変異が第１のＦｃ領域ポリペプチド内にあり、１つ若しくは２つの突然変異が第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあるＩｇＧクラスＦｃ領域、又は
γ）両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（すなわち、ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域であって、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含むか、又は第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて突然変異の組み合わせＩ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて突然変異の組み合わせＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含むＩｇＧクラスＦｃ領域
を含み、
以下の特性の１つ以上を有することを特徴とする：
－ （マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックなマウスにおいて、硝子体内適用の９６時間後に）（実施例６に記載されているアッセイで決定すると）ｉｉｉ）に記載されている突然変異を有しない対応する二重特異性抗体と比較して低い血清濃度を示し、及び／又は
－ （マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックなマウスにおいて、右眼の硝子体内適用の９６時間後に）（実施例６に記載されているアッセイで決定すると）ｉｉｉ）に記載されている突然変異を有しない対応する二重特異性抗体と比較して、類似（係数０．８～１．２）の全右眼溶解物中濃度を示し、及び／又は
－ 無効化されたヒトＦｃＲｎ結合性を有し、及び／又は
－ （ＳＰＲによって決定すると）ブドウ球菌プロテインＡ結合性を有さず、及び／又は
－ （ＳＰＲによって決定すると）維持されたブドウ球菌プロテインＡ結合性を有する。
一実施態様では、二重特異性抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含むことを特徴とし、
ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として、１個、２個又は３個のアミノ酸残基置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として、１個、２個又は３個のアミノ酸残基置換を有する配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として、１個、２個又は３個のアミノ酸残基置換を有する配列番号２８のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として、１個、２個又は３個のアミノ酸残基置換を有する配列番号のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）二重特異性抗体が、
α）両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域であって、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域に含まれることになるように、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、ｉ）群Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）群Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）群Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）から選択される突然変異の１つ又は２つを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含む群から選択される突然変異の１つ又は２つを含むＩｇＧクラスＦｃ領域、又は
β）両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（すなわち、ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域であって、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが該Ｆｃ領域に含まれることになるように、該Ｆｃ領域において、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を両方が含み、それにより、全ての突然変異が第１の若しくは第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあるか、又は１つ若しくは２つの突然変異が第１のＦｃ領域ポリペプチド内にあり、１つ若しくは２つの突然変異が第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあるＩｇＧクラスＦｃ領域、又は
γ）両方ともヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（すなわち、ヒト起源に由来する）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＩｇＧクラスＦｃ領域であって、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含むか、又は第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて突然変異の組み合わせＩ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて突然変異の組み合わせＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含むＩｇＧクラスＦｃ領域
を含み、
以下の特性の１つ以上を有することを特徴とする：
－ （マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックなマウスにおいて、硝子体内適用の９６時間後に）（実施例６に記載されているアッセイで決定すると）ｉｉｉ）に記載されている突然変異を有しない対応する二重特異性抗体と比較して低い血清濃度を示し、及び／又は
－ （マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックなマウスにおいて、右眼の硝子体内適用の９６時間後に）（実施例６に記載されているアッセイで決定すると）ｉｉｉ）に記載されている突然変異を有しない対応する二重特異性抗体と比較して、類似（係数０．８～１．２）の全右眼溶解物中濃度を示し、及び／又は
－ 無効化されたヒトＦｃＲｎ結合性を有し、及び／又は
－ （ＳＰＲによって決定すると）ブドウ球菌プロテインＡ結合性を有さず、及び／又は
－ （ＳＰＲによって決定すると）維持されたブドウ球菌プロテインＡ結合性を有する。
本明細書で報告される二重特異性抗体の抗原結合部位は、様々な程度で抗原結合部位の親和性に寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。３つの重鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の程度は、配列間の変動に応じてこれらの領域が定義されたコンパイルアミノ酸配列データベースとの比較によって決定される。
本明細書で報告される抗体は、リコンビナント手段によって生産される。したがって、本発明の一態様は、本明細書で報告される抗体をコードする核酸であり、さらなる態様は、本明細書で報告される抗体をコードする核酸を含む細胞である。リコンビナント生産のための方法が当技術水準で広く公知であり、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質発現と、それに続く抗体の単離及び通常は薬学的に許容され得る純度への精製を含む。宿主細胞における上記抗体の発現では、標準的な方法によって、各（改変）軽鎖及び重鎖をコードする核酸を発現プラスミドに挿入する。ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母又はE. coli細胞のような適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞において発現を実施し、前記細胞（培養上清又は溶解後の細胞）から抗体を回収する。抗体の一般的なリコンビナント生産方法が当技術水準で周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202、Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282、Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160及びWerner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説文献に記載されている。
したがって、本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される二重特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）該抗体をコードする核酸分子を含むプラスミドで宿主細胞をトランスフォーメーションする工程、
ｂ）該抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、及び
ｃ）該培養物から該抗体を回収する工程
を含む方法である。
一実施態様では、ｃ）の回収工程は、軽鎖定常ドメイン特異的捕捉試薬（これは、例えば、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖が二重特異性抗体に使用されるかに応じて、カッパ定常軽鎖又はラムダ定常軽鎖に対して特異的である）の使用を含む。一実施態様では、軽鎖特異的捕捉試薬は、結合溶出モードに使用される。このような軽鎖定常ドメイン特異的捕捉試薬の例は、例えば、KappaSelect（商標）及びLambdaFabSelect（商標）（GE Healthcare/BACから入手可能）であり、これらは、高い流速及び低い背圧を大規模で可能にする高度に強固なアガロースビーズマトリックスをベースとするものである。これらの材料は、それぞれカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖の定常領域に結合するリガンドを含有する（すなわち、該軽鎖の定常領域を欠くフラグメントは結合しない；図１）。したがって、両方とも、軽鎖の定常領域を含有する他のターゲット分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ）に結合することができる。長い親水性スペーサーアームを介してリガンドをマトリックスに付着させて、それらをターゲット分子に対する結合に容易に利用可能にする。それらは、ヒトＩｇカッパ又はラムダのいずれかについてスクリーニングされる単鎖抗体フラグメントをベースとする。
一実施態様では、ｃ）の回収工程は、Ｆｃ領域特異的捕捉試薬の使用を含む。一実施態様では、Ｆｃ領域特異的捕捉試薬は、結合溶出モードで使用される。このようなＦｃ領域特異的捕捉試薬の例は、例えば、ブドウ球菌プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィー材料である。
二重特異性抗体は、従来の免疫グロブリン精製手段、例えばアフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡセファロース、KappaSelect（商標）、LambdaFabSelect（商標））、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動又は透析などによって培養培地から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して配列決定される。Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源としての役割を果たし得る。単離したら、ＤＮＡを発現プラスミドに挿入し、次いで、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又はミエローマ細胞）にこれをトランスフェクションして、宿主細胞においてリコンビナントモノクローナル抗体を合成し得る。
本明細書で報告される（二重特異性）抗体のいくつかは、ディファレンシャルに改変されたＦｃ領域を含むことによって、単離／精製の容易性を提供し、ここで、前記改変の少なくとも１つは、ｉ）プロテインＡに対する（二重特異性）抗体のディファレンシャルな親和性、及びｉｉ）ヒトＦｃＲｎに対する（二重特異性）抗体のディファレンシャルな親和性をもたらし、（二重特異性）抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、破砕細胞から、培地から、又は抗体の混合物から単離可能である。
細胞成分又は他の混入物（例えば、他の細胞核酸又はタンパク質）を、標準的な技術（アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動を含む）、及び当技術分野で周知の他のものによって排除するために、抗体の精製を実施する（例えば、Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと）。微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モード交換）、チオフィリック吸着（例えば、ベータ－メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドによる）、疎水的相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル－セファロース、アザ－アレノフィリック樹脂又はｍ－アミノフェニルボロン酸による）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料による）、サイズ排除クロマトグラフィー及び電気泳動方法（例えば、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動）などの様々な方法が十分に確立されており、タンパク質精製に広く使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。
本明細書で報告されるヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ－２に対する二価二重特異性抗体は、有益な有効性／安全性プロファイルを有し得、抗ＶＥＧＦ及び抗ＡＮＧ－２治療を必要とする患者に利益を提供し得る。
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される抗体を含む医薬製剤である。本明細書で報告される別の態様は、医薬製剤を製造するための、本明細書で報告される抗体の使用である。本明細書で報告されるさらなる態様は、本明細書で報告される抗体を含む医薬製剤を製造するための方法である。別の態様では、医薬担体と一緒に製剤化された本明細書で報告される抗体を含有する製剤（例えば、医薬製剤）が提供される。
本明細書で報告される製剤は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与され得る。当業者によって認識されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化し得る。本明細書で報告される化合物を特定の投与経路によって投与するためには、その不活性化を防止するための材料で化合物をコーティングするか、又は前記材料と化合物を同時投与することが必要であり得る。例えば、化合物は、適切な担体（例えば、リポソーム）又は希釈剤で被験体に投与され得る。薬学的に許容され得る希釈剤には、生理食塩水及び水性緩衝溶液が含まれる。医薬担体には、滅菌注射溶液又は分散剤の即時調製のための滅菌水溶液又は分散剤及び滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。
限定されないが、眼内適用又は局所適用を含む多くの可能な送達様式が使用され得る。一実施態様では、適用は眼内であり、限定されないが、結膜下注射、前房内注射、側頭部角膜縁を介した前眼房中への注射、基質内注射、角膜内注射、網膜下注射、眼房水注射、テノン嚢下注射又は持続送達デバイス、硝子体内注射（例えば、硝子体前部、中部又は後部注射）が含まれる。一実施態様では、適用は局所的であり、限定されないが、角膜への点眼が含まれる。
一実施態様では、本明細書で報告される二重特異性抗体又は医薬製剤は、硝子体内適用を介して、例えば、硝子体内注射を介して投与される。これは、当技術分野で公知の標準的な手順にしたがって実施され得る（例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206及びWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185を参照のこと）。
いくつかの実施態様では、本明細書で報告される治療キットは、本明細書に記載される医薬製剤中に存在する（二重特異性）抗体の１つ以上の用量と、医薬製剤の硝子体内注射のための適切なデバイスと、注射を行うのに適切な被験体及びプロトコールを詳述する説明書とを含み得る。これらの実施態様では、製剤は、典型的には、処置を必要とする被験体に、硝子体内注射を介して投与される。これは、当技術分野で公知の標準的な手順にしたがって実施され得る（例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206及びWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185を参照のこと）。
製剤はまた、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順（上記）によって、並びに様々な抗菌薬剤及び抗真菌薬剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって保証され得る。また、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを製剤に含めることが望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
選択される投与経路にかかわらず、本明細書で報告される化合物（これは、適切な水和形態で使用され得る）及び／又は本明細書で報告される医薬製剤は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容され得る剤形に製剤化される。
本明細書で報告される医薬製剤中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性を伴わず、特定の患者、製剤及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な量の有効成分が得られるように変化され得る。選択される投与量レベルは、用いられる本明細書で報告される特定の製剤の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、他の薬物、用いられる特定の製剤と組み合わせて使用される化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康及び過去の病歴、並びに医学分野で周知の同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存するであろう。
製剤は滅菌されてなければならならず、製剤がシリンジによって送達可能である程度に液体でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは、等張緩衝生理食塩水である。
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合では、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール及び塩化ナトリウムを製剤に含めることが好ましい。
製剤は、結膜下投与のための活性剤を含む眼科用デポー製剤を含み得る。眼科用デポー製剤は、本質的に純粋な活性剤、例えば本明細書で報告される二重特異性抗体の微粒子を含む。本明細書で報告される二重特異性抗体を含む微粒子は、生体適合性の薬学的に許容され得るポリマー又は脂質封入剤に包埋され得る。デポー製剤は、長期間にわたって全て又は実質的に全ての活性物質を放出するように適合され得る。ポリマー又は脂質マトリックスは、存在する場合には、全て又は実質的に全ての活性剤の放出後において、投与部位から輸送されるように十分に分解するよう適合され得る。デポー製剤は、薬学的に許容され得るポリマーと、溶解又は分散した活性剤とを含む液体製剤であり得る。注射すると、ポリマーは、例えば、ゲル化又は沈殿によって注射部位でデポーを形成する。
本明細書で報告される別の態様は、眼血管疾患を処置するのに使用するための、本明細書で報告される二重特異性抗体である。
本明細書で報告される一実施態様は、眼血管疾患を処置するのに使用するための、本明細書で報告される二重特異性抗体である。
本明細書で報告される別の態様は、眼血管疾患を処置するのに使用するための、本明細書で報告される医薬製剤である。
本明細書で報告される別の態様は、眼血管疾患を処置するための医薬を製造するための、本明細書で報告される抗体の使用である。
本明細書で報告される別の態様は、本明細書で報告される抗体をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、眼血管疾患を患っている患者を処置する方法である。
ここで、本明細書で使用される「含む」という用語は、「からなる」という用語を含むことを明記する。したがって、「含む」という用語を含有する全ての態様及び実施態様は、「からなる」という用語によって同様に開示される。
Ｄ．改変
さらなる態様では、上記実施態様のいずれかに係る抗体は、以下のセクション１～６に記載されている特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて取り込み得る。
１．抗体の親和性
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、１００nM以下、１０nM以下（例えば、１０－７Ｍ以下、例えば１０－７Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
一実施態様では、Ｋｄは、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、BIACORE（登録商標）-2000又はBIACORE（登録商標）-3000 (GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ)を使用したアッセイは、約１０反応単位（RU）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。一実施態様では、供給業者の説明書にしたがって、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によりカルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、GE Healthcare Inc.）を活性化する。１０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で抗原を５μg/mL（約０．２μM）に希釈してから、５μL／分の流速で注射して、およそ１０反応単位（RU）のカップリングタンパク質を達成する。抗原の注射後、１Ｍエタノールアミンを注射して、未反応の基をブロッキングする。反応速度測定のために、（例えば、Ｆａｂの）２倍系列希釈物（０．７８nM～５００nM）を、０．０５％ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃で、およそ２５μL／分の流速で注射する。単純な１対１Langmuir結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Software version 3.2）を使用して、会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881）を参照のこと）。オン速度が、上記表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、撹拌キュベットを備えるストップトフロー装着分光光度計（Aviv Instruments）又は8000-series SLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）などの分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２０nM抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、１６nm帯域通過）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって、オン速度を決定し得る。
２．キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合フラグメントが含まれる。
特定の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を減少させる。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその部分）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部を場合により含む。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善させるために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に概説されており、例えば、Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号及び米国特許第７，０８７，４０９号；Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを説明）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェシング」を説明）；Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 （「ＦＲシャッフリング」を説明）； Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68;及びKlimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（「ＦＲシャッフリング」に対する「誘導選択」アプローチを説明）にさらに記載されている。
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、限定されないが、「ベストフィット」法（例えば、Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照のこと）を使用して選択されたフレームワーク領域；特定のサブグループの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及びPresta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照のこと）；及びＦＲライブラリーをスクリーニングして得られたフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618を参照のこと）が含まれる。
３．ヒト抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して生産され得る。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol.5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。典型的には、このような動物は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか、若しくは動物の染色体中にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。このようなトランスジェニックマウスでは、一般的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照のこと。また、例えば、XENOMOUSE（商標）技術を説明する米国特許第６，０７５，１８１号及び米国特許第６，１５０，５８４号；HUMAB（登録商標）技術を説明する米国特許第５，７７０，４２９号；K-M MOUSE（登録商標）技術を説明する米国特許第７，０４１，８７０号並びにVELOCIMOUSE（登録商標）技術を説明する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照のこと。このような動物によって生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と結合させることによってさらに改変され得る。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている（例えば、Kozbor, D.,J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63;及びBoerner, P., et al., J. Immunol.147 (1991) 86-95を参照のこと）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体が、Li, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562に記載されている。さらなる方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生産を説明）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト－ヒトハイブリドーマを説明）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191にも記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製され得る。次いで、このような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載されている。
４．ライブラリー由来の抗体
本明細書で報告される抗体は、所望の１つ以上の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を有する抗体についてこのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に概説されており、例えば、McCafferty, J. et al., Nature348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132にさらに記載されている。
特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ遺伝子のレパートリー及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいて無作為に組換え、次いで、Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されているように、抗原結合ファージについてそれらをスクリーニングし得る。典型的には、ファージは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント又はＦａｂフラグメントのいずれかとして抗体フラグメントを提示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを必要とせずに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734によって記載されているように、ナイーブなレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、免疫化せずに、広範囲の非自己抗原及びまた自己抗原に対する単一の抗体供給源を提供し得る。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388によって記載されているように、幹細胞由来の非再構成Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、in vitroでの再構成を達成することによって、ナイーブなライブラリーを合成的に作製し得る。ヒト抗体ファージライブラリーを説明している特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号、米国特許出願公開第２００５／０２６６０００号、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２６号、米国特許出願公開第２００７／０１６０５９８号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４号、米国特許出願公開第２００７／０２９２９３６号及び米国特許出願公開第２００９／０００２３６０号が含まれる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体フラグメントは、本明細書ではヒト抗体又はヒト抗体フラグメントとみなされる。
５．多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性の一方は第１の抗原に対するものであり、他方は異なる第２の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、抗原の少なくとも１つを発現する細胞に細胞傷害性物質を位置決定するのにも使用され得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対のリコンビナント同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、国際公開公報第９３／０８８２９号及びTraunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照のこと）及び「ノブインホール（knob-in-hole）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が含まれる。また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電気的ステアリング効果を操作すること（国際公開公報第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照のこと）；二重特異性抗体を生産するためのロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを生産するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照のこと）；並びに例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって、多重特異性抗体を作製することもできる。
「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照のこと）。
本明細書の抗体又はフラグメントはまた、「二重作用性Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。
本明細書の抗体又はフラグメントはまた、国際公開公報第２００９／０８０２５１号、国際公開公報第２００９／０８０２５２号、国際公開公報第２００９／０８０２５３号、国際公開公報第２００９／０８０２５４号、国際公開公報第２０１０／１１２１９３号、国際公開公報第２０１０／１１５５８９号、国際公開公報第２０１０／１３６１７２号、国際公開公報第２０１０／１４５７９２号及び国際公開公報第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体を含む。
６．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、残基中への挿入及び／又は残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を示すことを条件として、最終構築物を得るために欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行い得る。
ａ）置換変異体、挿入変異体及び欠失変異体
特定の実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。目的の置換突然変異誘発部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、以下の表の「好ましい置換」という項目に示されている。アミノ酸側鎖クラスに関して以下にさらに記載されているように、より実質的な変更は、以下の表の「例示的置換」という項目に提供されている。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、所望の活性、例えば、保持／改善した抗原結合、減少した免疫原性、又は改善したＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについて生成物をスクリーニングし得る。
Figure 0007426190000039
アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
置換変異体の一種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる研究のために選択される得られた変異体は、親抗体を基準として特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変異体は親和性成熟抗体であり、これは、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術、例えば本明細書に記載されるものを使用して簡便に作製され得る。簡潔に言えば、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異体抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
例えば、抗体親和性を改善させるために、ＨＶＲ中に変化（例えば、置換）を行い得る。このような変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」（すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で突然変異を経験するコドンにコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照のこと）及び／又は抗原と接触する残基）中に行われ得、得られた変異体ＶＨ又は変異体ＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェーンシャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、同時に４～６個の残基）をランダム化するＨＶＲを対象とするアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３がターゲティングされることが多い。
特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、このような変化によって、抗体が抗原に結合する能力が実質的に減少しない限り、１つ以上のＨＶＲ内に存在し得る。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的変化（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲ中に行い得る。このような変化は、例えば、ＨＶＲ中の抗原接触残基の外側であり得る。上記変異体ＶＨ配列及び変異体ＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは変化されないか、又は１個、２個、若しくは３個以下のアミノ酸置換を含有する。
突然変異誘発のためにターゲティングされ得る抗体の残基又は領域を同定するために有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称され、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085によって記載されている。この方法では、残基又はターゲット残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性アミノ酸又は負電荷を持つアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置換して、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかを決定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換を導入し得る。あるいは又は加えて、抗体と抗原の接触点を特定するための抗原－抗体複合体の結晶構造が使用され得る。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補としてターゲティング又は排除され得る。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかを決定し得る。
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００残基以上を含有するポリペプチドに及ぶアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、（例えば、ＡＤＥＰＴのための）酵素又は抗体の血清半減期を長くするポリペプチドへの、抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
ｂ）グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように変化される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製又は排除されるようにアミノ酸配列を変化することによって、簡便に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物を変化し得る。典型的には、哺乳動物細胞によって産生されるネイティブな抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般的に結合している分枝状の二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照のこと）。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」中のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、特定の特性が改善した抗体変異体を作製するために、本明細書で報告される抗体中のオリゴ糖に改変を行い得る。
一実施態様では、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合されたフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば国際公開公報第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定して、Ａｓｎ２９７に結合した糖構造物全て（例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物及び高マンノース構造物）の合計に対するＡｓｎ２９７における糖鎖間のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の２９７位当たり（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を指す；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体の軽微な配列変異が原因で、２９７位からアミノ酸±約３個だけ上流又は下流に、すなわち、２９４位と３００位の間に位置し得る。このようなフコシル化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号を参照のこと。「脱フコシル化された」又は「フコースを欠く」抗体変異体に関連した刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開公報第２０００／６１７３９号；国際公開公報第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開公報第２００３／０８５１１９号；国際公開公報第２００３／０８４５７０号；国際公開公報第２００５／０３５５８６号；国際公開公報第２００５／０３５７７８号；国際公開公報第２００５／０５３７４２号；国際公開公報第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠陥があるＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開公報第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えば、α－１，６－フコシル基転移酵素遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開公報第２００３／０８５１０７号を参照のこと）が含まれる。
分岐オリゴ糖を有する抗体変異体であって、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって分岐している抗体変異体が提供される。このような抗体変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善したＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開公報第２００３／０１１８７８号；米国特許第６，６０２，６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体もまた、提供される。このような抗体変異体は、改善したＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開公報第１９９７／３００８７号；国際公開公報第１９９８／５８９６４号；及び国際公開公報第１９９９／２２７６４号に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
特定の実施態様では、１つ以上のさらなるアミノ酸改変を本明細書で提供される抗体のＦｃ領域中に導入し、それによりＦｃ領域変異体を作製することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換／突然変異）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
特定の実施態様では、本発明は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変異体を企図する。このことにより、その抗体は、in vivoでの抗体の半減期が重要ではあるが、特定のエフェクター機能（ＣＤＣ及びＡＤＣＣなど）が不必要又は有害である用途に望ましい候補となる。in vitro及び／又はin vivo細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／消失を確認し得る。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体はＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）がＦｃＲｎ結合能を保持していることを裏付けることができる。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのin vitroアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063;及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照のこと）；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用い得る（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA;及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、in vivoで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているもののような動物モデルにおいて評価され得る。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体はＣ１ｑに結合することができないため、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる（例えば、国際公開公報第２００６／０２９８７９号及び国際公開公報第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと）。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施し得る（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052;及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びin vivoクリアランス／半減期の決定はまた、当技術分野で公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照のこと）。
減少したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８位、２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、３２７位及び３２９位の１つ以上が置換されたものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ領域変異体には、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位の２つ以上において置換を有するＦｃ領域変異体（残基２６５位及び２９７位のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ領域変異体を含む）が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
改善又は減弱したＦｃＲ結合性を有する特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開公報第２００４／０５６３１２号及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照のこと）。
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善させる１つ以上のアミノ酸置換（例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位及び／又は３３４位（残基のＥＵナンバリング）における置換）を有するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開公報第９９／５１６４２号及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されているように、変化（すなわち、改善又は減弱のいずれか）したＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらす変化をＦｃ領域中に行い得る。
増加した半減期及び改善した新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合性（これは、胎児への母親のＩｇＧの移行に関与する）を有する抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善させる１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ領域変異体には、Ｆｃ領域残基：２３８位、２５６位、２６５位、２７２位、２８６位、３０３位、３０５位、３０７位、３１１位、３１２位、３１７位、３４０位、３５６位、３６０位、３６２位、３７６位、３７８位、３８０位、３８２位、４１３位、４２４位又は４３４位の１つ以上において置換（例えば、Ｆｃ領域残基４３４位の置換）を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開公報第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ）システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、その結果、抗体の接近可能な部位に位置づけられ、本明細書にさらに記載されるように、薬物部分又はリンカー－薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートさせて免疫コンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の実施態様では、次の残基の任意の１つ以上をシステインで置換し得る：軽鎖のＶ２０５（Kabatのナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているようにして作製することができる。
ｅ）抗体誘導体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能である付加的な非タンパク性部分を含むようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に適切な部分には、水溶性ポリマーが含まれるがそれに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダム共重合体のいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレン（ｐｒｏｌｙｌｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造の際に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分枝状又は非分枝状であり得る。抗体に結合されるポリマーの数は変動してよく、複数のポリマーが結合される場合、それらは同じ分子又は異なる分子であり得る。通常、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改善しようとする抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が所定の条件下で治療法において使用されるかなどを含む考慮すべき事柄に基づいて決定することができる。
別の実施態様では、抗体と放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク性部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長のものであり得、普通の細胞には害を与えないが、抗体－非タンパク性部分の近位にある細胞が死滅する温度まで非タンパク性部分を加熱する波長が含まれるが、それに限定されるわけではない。
ｆ）ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化を強化するためのＣＨ３改変に関するいくつかのアプローチが存在し、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許出願公開第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２０５８７６８号、国際公開公報第２０１３１５７９５４号、国際公開公報第２０１３０９６２９１号に詳細に記載されている。典型的には、このようなアプローチの全てにおいて、各ＣＨ３ドメイン（又は、それを含む重鎖）がもはやそれ自体とホモ二量体化することができないが、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインと強制的にヘテロ二量体化するように（第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１のＣＨ３ドメイン間又は２つの第２のＣＨ３ドメイン間でホモ二量体が形成されないように）、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは両方とも相補的に操作される。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なるアプローチは、本発明に係る多重特異性抗体における重鎖－軽鎖改変（一方の結合アームにおけるＶＨ及びＶＬ交換／置換、並びにＣＨ１／ＣＬインターフェイスにおける逆の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた様々な代替方法として企図され、Bence-Jones型副産物と誤対合する軽鎖を減少させる。
本発明の好ましい一実施態様では（多重特異性抗体が重鎖においてＣＨ３ドメインを含む場合）、本発明に係る前記多重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、国際公開公報第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621;及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681；国際公開公報第９８／０５０４３１号において、数例を用いて詳細に記載されている「ノブイントゥホール」技術によって変化され得る。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面が、これら２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させるように変化される。（２つの重鎖の）２つの各ＣＨ３ドメインは「ノブ」であり得る一方、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収率を増加させる。
したがって、本発明の一実施態様では、前記多重特異性抗体は（各重鎖においてＣＨ３ドメインを含み）、ａ）の抗体の第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメイン、及びｂ）の抗体の第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインはそれぞれ、抗体ＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスを含むインターフェイスと接触することをさらに特徴とし、
前記インターフェイスは、多重特異性抗体の形成を促進するように変化されており、該変化は、
ｉ）該多重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスと接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内において、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより、他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティで位置決定可能な突出部が、一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内において発生するように、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化され、
及び
ｉｉ）該多重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスと接触する第２のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内において、
アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより、第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突出部が位置決定可能であるキャビティが、第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内において発生するように、
他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変化されることを特徴とする。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。
本発明の一態様では、両方のＣＨ３ドメイン間においてジスルフィド架橋が形成し得るように、ＣＨ３ドメインは両方とも、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてシステイン（Ｃ）の導入によってさらに変化される。
好ましい一実施態様では、前記多重特異性抗体は、「ノブ鎖」の第１のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール鎖」の第２のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む。例えば、アミノ酸Ｙ３４９Ｃ突然変異を「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに導入し、アミノ酸Ｅ３５６Ｃ突然変異又はアミノ酸Ｓ３５４Ｃ突然変異を「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに導入することによって、ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)。
好ましい一実施態様では、前記多重特異性抗体は（各重鎖においてＣＨ３ドメインを含み）、２つのＣＨ３ドメインの一方において、アミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、アミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるアミノ酸Ｓ３５４Ｃ突然変異、及び他方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるアミノ酸Ｙ３４９Ｃ突然変異が鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングは、Kabatに従う）。
ヘテロ二量体化を強化するためのＣＨ３改変に関する他の技術が本発明の代替方法として企図され、例えば、国際公開公報第９６／２７０１１号、国際公開公報第９８／０５０４３１号、欧州特許出願公開第１８７０４５９号、国際公開公報第２００７／１１０２０５号、国際公開公報第２００７／１４７９０１号、国際公開公報第２００９／０８９００４号、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号、国際公開公報第２０１１／９０７５４号、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号、国際公開公報第２０１３／１５７９５４号、国際公開公報第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
一実施態様では、欧州特許出願公開第１８７０４５９Ａ１号に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用され得る。このアプローチは、両方の重鎖間のＣＨ３／ＣＨ３ドメインインターフェイスの特定のアミノ酸位置における逆の電荷を有する荷電アミノ酸の置換／突然変異の導入に基づくものである。前記多重特異性抗体の好ましい一実施態様は、（多重特異性抗体の）第１のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び多重特異性抗体の第２のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異である（ナンバリングは、Kabatに従う）。
別の実施態様では、前記多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含み、それに加えて、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
別の実施態様では、前記多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、アミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、アミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は前記多重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方において、アミノ酸Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、２つのＣＨ３ドメインの他方において、アミノ酸Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含み、それに加えて、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてアミノ酸Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。
一実施態様では、国際公開公報第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用され得る。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｋ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸Ｌ３５１Ｄ突然変異を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｋ突然変異をさらに含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅから選択されるアミノ酸突然変異（好ましくは、Ｌ３６８Ｅ）をさらに含む。
一実施態様では、国際公開公報第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用され得る。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ突然変異を含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２におけるさらなるアミノ酸突然変異（例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択される）を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆ突然変異を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ａ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ突然変異を含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒ突然変異を含む。
一実施態様では、例えば、３６８及び４０９からなる群より選択される位置におけるアミノ酸改変を用いて、国際公開公報第２０１１／１４３５４５号に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用され得る。
一実施態様では、国際公開公報第２０１１／０９０７６２号に記載されているヘテロ二量体化アプローチ（これは、上記ノブイントゥホール技術も使用する）が代替的に使用され得る。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ａ突然変異を含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｙ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ｔ突然変異を含む。
一実施態様では、多重特異性抗体はＩｇＧ２アイソタイプであり、国際公開公報第２０１０／１２９３０４号に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用され得る。
一実施態様では、国際公開公報第２００９／０８９００４号に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用され得る。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負電荷アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正電荷アミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）によるアミノ酸置換を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負電荷アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）によるアミノ酸置換をさらに含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負電荷アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるアミノ酸置換をさらに又は代替的に含む。
一実施態様では、国際公開公報第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用され得る。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄ突然変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄ突然変異を含む。
一実施態様では、国際公開公報第２００７／１１０２０５号に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代替的に使用され得る。
Ｅ．リコンビナント方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、リコンビナント法及びリコンビナント組成物を使用して作製することができる。一実施態様では、本明細書で報告される抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。さらなる実施態様では、このような核酸を含む１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド）が提供される。さらなる実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むプラスミド、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のプラスミド及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のプラスミドを含む（例えば、それらでトランスフォーメーションされている）。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、本明細書で報告される抗体を作製する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適切な条件下で、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階、及び場合により、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収する段階を含む。
本明細書で報告される抗体をリコンビナント作製する場合、例えば前述したような抗体をコードする核酸は、単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のプラスミド中に挿入される。このような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、変異体Ｆｃ領域ポリペプチド又は抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離及び配列決定され得る。
抗体をコードするプラスミドのクローニング又は発現に適切な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には特に、細菌において産生させることができる。細菌における抗体フラグメント及び抗体ポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照のこと。（E. coliにおける抗体フラグメントの発現を説明するCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードするプラスミドのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的又は全面的にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株及び酵母株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 及び Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現のために適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号及び米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのPLANTIBODIES（商標）技術を説明している）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように順応させた哺乳動物細胞株が、有用である場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によってトランスフォーメーションされたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載されているＨＥＫ２９３又は２９３細胞）；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されている、ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適切ないくつかの哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
Ｆ．併用処置
特定の実施態様では、本明細書で報告される抗体又は医薬製剤は、本明細書に記載される１つ以上の眼血管疾患を処置するために（さらなる治療剤なしで）単独で投与される。
他の実施態様では、本明細書で報告される抗体又は医薬製剤は、１つ以上のさらなる治療剤、又は本明細書に記載される１つ以上の眼血管疾患を処置するための方法と組み合わせて投与される。
他の実施態様では、本明細書で報告される抗体又は医薬製剤は、１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて製剤化され、本明細書に記載される１つ以上の眼血管疾患を処置するために投与される。
特定の実施態様では、本明細書で提供される併用処置は、本明細書で報告される抗体又は医薬製剤が、本明細書に記載される１つ以上の眼血管疾患を処置するために１つ以上のさらなる治療剤と共に逐次投与されることを含む。
さらなる治療剤は、限定されないが、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｒｐＲＳ）、EyeOOl（抗ＶＥＧＦペグ化アプタマー）、スクアラミン、RETAANE（商標）（デポー懸濁液用の酢酸アネコルタブ；Alcon, Inc.）、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）、MACUGEN（商標）、MIFEPREX（商標）（ミフェプリストン－ｒｕ４８６）、サブテノントリアムシノロンアセトニド、硝子体内結晶トリアムシノロンアセトニド、プリノマスタット（ＡＧ３３４０合成マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、Pfizer）、フルオシノロンアセトニド（フルオシノン眼内インプラントを含む、Bausch & Lomb/Control Delivery Systems）、ＶＥＧＦＲ阻害剤（Sugen）、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（Regeneron/Aventis）、ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害剤、例えば４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（ｌ－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４－（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イルオキシ）－６－メトキシ－７－（３－ピロリジン－１－イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）及びＳＵ１１２４８（スニチニブ）、リノマイド、並びにインテグリンｖ．ベータ．３機能及びアンギオスタチンの阻害剤を含む。
本明細書で報告される抗体又は医薬製剤との組み合わせにおいて使用することができる他の医薬的治療は、限定されないが、非熱レーザーを用いたVISUDYNE（商標）、ＰＫＣ４１２、Endovion（NeuroSearch A／S）、神経栄養因子（例として、グリア由来の神経栄養因子及び毛様体神経栄養因子を含む）、ジアタゼム、ドルゾラミド、フォトトロプ、９－シス－レチナール、目薬（エコー治療を含む）（ヨウ化ホスホリン又はエコチオフェート又は炭酸脱水酵素阻害剤を含む）、ＡＥ－９４１（AEterna Laboratories, Inc.）、Sirna-027(Sima Therapeutics, Inc.)、ペガプタニブ(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、ニューロトロフィン（例として、ＮＴ－４／５、Genentechを含む）、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、ＩＮＳ－３７２１７（Inspire Pharmaceuticals）、インテグリンアンタゴニスト（Jerini AG及びAbbott Laboratoriesからのものを含む）、ＥＧ－３３０６（Ark Therapeutics Ltd．）、ＢＤＭ－Ｅ（BioDiem Ltd．）、サリドマイド（例えば、EntreMed, Inc.によって使用される通り）、カルジオトロフィン１（Genentech）、２－メトキシエストラジオール（Allergan/Oculex）、ＤＬ－８２３４（Toray Industries）、ＮＴＣ－２００（Neurotech）、テトラチオモリブデート（ミシガン大学）、ＬＹＮ－００２（Lynkeus Biotech）、微細藻類化合物（Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals）、Ｄ－９１２０（Celltech Group pic）、ＡＴＸ－Ｓ１０（Hamamatsu Photonics）、ＴＧＦ－β２（Genzyme/Celtrix）、チロシンキナーゼ阻害剤（Allergan, SUGEN, Pfizer）、ＮＸ－２７８－Ｌ（NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences）、Ｏｐｔ－２４（OPTIS France SA）、網膜細胞神経節神経保護剤（Cogent Neurosciences）、Ｎ－ニトロピラゾール誘導体（Texas A&M University System）、ＫＰ－１０２（Krenitsky Pharmaceuticals）、シクロスポリンＡ、Ｔｉｍｉｔｅｄ網膜転座、光線力学治療（例として、レセプターをターゲティングするＰＤＴ、Bristol-Myers Squibb, Co.；ＰＤＴを用いた注射用のポルフィマーナトリウム；ベルテポルフィン、QLT Inc.；ＰＤＴを伴うロスタポルフィン、Miravent Medical Technologies；ＰＤＴを伴うタラポルフィンナトリウム、Nippon Petroleum；モテキサフィンルテチウム、Pharmacyclics, Inc.）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例として、Novagali Pharma SAによってテストされた産物及びＩＳＩＳ－１３６５０、Isis Pharmaceuticalsを含む）、レーザー光凝固、ドルーゼンレーザー加工、黄斑円孔手術、黄斑転座手術、移植可能ミニチュアテレスコープ、ファイモーション血管造影（また、マイクロレーザー治療及びフィーダーベッセル処置として公知である）、陽子線治療、微小刺激治療、網膜剥離及び硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔温熱治療、光化学系Ｉ治療、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレシス（また、膜差ろ過及びＲｈｅｏｔｈｅｒａｐｙとして公知である）、マイクロチップ移植、幹細胞治療、遺伝子交換治療、リボザイム遺伝子治療（低酸素応答エレメント用の遺伝子治療を含む、Oxford Biomedica;Lentipak、Genetix；ＰＤＥＦ遺伝子治療、GenVec）、光レセプター／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞、Diacrin, Inc.；網膜細胞移植、Cell Genesys, Inc.を含む）及び鍼を含む。
任意の抗血管新生薬剤を、本明細書で報告される抗体又は医薬製剤（限定されないが、Carmeliet and Jain, 2000, Nature 407: 249-257によって列挙されるものを含む）との組み合わせにおいて使用することができる。特定の実施態様では、抗血管新生薬剤は、別のＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦレセプターフラグメント、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを遮断することが可能であるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤及びそれらの任意の組み合わせなどであり、これらは、抗ＶＥＧＦアプタマー（例えば、ペガプタニブ）、可溶性リコンビナントデコイレセプター（例えば、ＶＥＧＦトラップ）を含む。特定の実施態様では、抗血管新生薬剤は、コルチコステロイド、血管新生抑制ステロイド、酢酸アネコルタブ、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦＲ又はＶＥＧＦリガンドの発現を減少させる低分子干渉ＲＮＡ、チロシンキナーゼ阻害剤を用いたＶＥＧＦＲ後の遮断、ＭＭＰ阻害剤、ＩＧＦＢＰ３、ＳＤＦ－１遮断薬、ＰＥＤＦ、ガンマ－セクレターゼ、デルタ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、ＨＩＦ－１アルファ遮断、プロテインキナーゼＣＫ２遮断及び血管内皮カドヘリン（ＣＤ－１４４）及び間質由来因子（ＳＤＦ）－Ｉ抗体を使用した新生血管部位への幹細胞（すなわち、内皮前駆細胞）ホーミングの阻害を含む。ＶＥＧＦレセプター（ＰＴＫ７８７を含む）をターゲティングする小分子ＲＴＫ阻害剤を使用することもできる。必ずしも抗ＶＥＧＦ化合物ではない新生血管に対して活性を有する薬剤も使用することができ、抗炎症薬物、ｍ－Ｔｏｒ阻害剤、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、シクロスポリン、抗ＴＮＦ薬剤、抗補体薬剤及び非ステロイド性抗炎症薬剤を含み得る。神経保護的であり、乾燥型黄斑変性の進行を潜在的に減少させることができる薬剤も使用することができる（例えば、「神経ステロイド」と称される薬物のクラスなど）。これらは、薬物、例えばデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（ブランド名：Prastera（登録商標）及びFidelin（登録商標））、デヒドロエピアンドロステロン硫酸及びプレグネノロン硫酸などを含む。任意のＡＭＤ（加齢性黄斑変性症）治療剤は、本明細書で報告される二重特異性抗体又は医薬製剤との組み合わせにおいて使用することができ、限定されないが、ＰＤＴとの組み合わせにおけるベルテポルフィン、ペガプタニブナトリウム、亜鉛又は抗酸化剤（単独で又は任意の組み合わせにおいて）を含む。
Ｇ．医薬製剤
本明細書に記載される抗体の医薬製剤は、所望の程度の純度を有するこのような抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容し得る担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水性液剤の形態で調製される。一般的に、薬学的に許容し得る担体は、使用される投与量及び濃度において受容者に非毒性であり、限定されないが、次のものが含まれる：リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール；メチルパラベン若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリ（ビニルピロリドン）のような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムのような塩を形成する対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン系界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容し得る担体には、さらに、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）のような侵入型薬物分散剤、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）のようなヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。ｒｈｕＰＨ２０を含む、いくつかの例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼのような１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤が、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。
本明細書における製剤はまた、処置される特定の適応症に対する必要に応じて複数の有効成分、好ましくは、補完的な活性を有し、互いに悪影響を及ぼさないものも含み得る。このような有効成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせられて存在するのが適切である。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に閉じ込めることができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
通常、in vivo投与のために使用される製剤は、滅菌済みである。無菌状態は、例えば、滅菌ろ過膜に通してろ過することによって、容易に実現することができる。
Ｈ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗体のいずれかは、治療方法に使用され得る。
一態様では、医薬として使用するための、本明細書で報告される抗体が提供される。さらなる態様では、眼血管疾患を処置するのに使用するための抗体が提供される。特定の実施態様では、処置方法に使用のための抗体が提供される。特定の実施態様では、眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の抗体を該個体に投与することを含む方法に使用するための抗体が提供される。このような一実施態様では、前記方法は、有効量の（例えば、上記セクションＤに記載される）少なくとも１つのさらなる治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、眼における血管新生を阻害するのに使用するための抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体における血管新生を阻害する方法であって、有効の抗体を該個体に投与して血管新生を阻害することを含む方法に使用するための抗体を提供する。好ましい一実施態様では、上記実施態様のいずれかに係る「個体」はヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、眼血管疾患を処置するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、眼血管疾患を処置する方法であって、有効量の医薬を、眼血管疾患を有する個体に投与することを含む方法に使用するためのものである。このような一実施態様では、前記方法は、有効量の（例えば、上記）少なくとも１つのさらなる治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、血管新生を阻害するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、個体における血管新生を阻害する方法であって、有効の医薬を該個体に投与して血管新生を阻害することを含む方法に使用するためのものである。上記実施態様のいずれかに係る「個体」はヒトであり得る。
さらなる態様では、本発明は、眼血管疾患を処置するための方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、有効量の本明細書で報告される抗体を、そのような眼血管疾患を有する個体に投与することを含む。このような一実施態様では、前記方法は、有効量の下記の少なくとも１つのさらなる治療剤を個体に投与することをさらに含む。上記実施態様のいずれかに係る「個体」はヒトであり得る。
さらなる態様では、本発明は、個体の眼における血管新生を阻害するための方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、有効量の本明細書で報告される抗体を個体に投与して血管新生を阻害することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
さらなる態様では、本発明は、例えば、上記治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書で提供される抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施態様では、医薬製剤は、本明細書で提供される抗体のいずれかと、薬学的に許容し得る担体とを含む。別の実施態様では、医薬製剤は、本明細書で提供される抗体のいずれかと、例えば、下記の少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む。
本明細書で報告される抗体は、治療において、単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本明細書で報告される抗体は、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与され得る。
本明細書で報告される抗体（及び任意のさらなる治療剤）は、非経口、肺内及び鼻腔内、並びに局所処置のために所望される場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、任意の適切な経路による、例えば、投与が短時間であるか又は慢性的であるかに部分的に応じて、静脈内又は皮下注射などの、注射によるものであり得る。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含むが、これらに限定されない、様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。
本明細書で報告される抗体は、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化され、投薬され、投与されるであろう。この文脈における考慮の要因には、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理及び医療従事者に既知の他の要因が含まれる。抗体は、必要ではないが、任意に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用される１つ以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類及び上に考察された他の要因に依存する。これらは、一般的に、本明細書に記載されるのと同じ投与量で、本明細書に記載される投与経路により、又は本明細書に記載される投与量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投与量で、任意の経路によって、使用される。
疾患の予防又は治療のために、本明細書で報告される抗体の適切な投与量（単独で又は１つ以上の他のさらなる治療剤と組み合わせて使用されるとき）は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への反応、並びに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は、患者に、１回で又は一連の処置にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によってであれ、連続注入によってであれ、約１μg/kg～１５mg/kg（例えば、０．５mg/kg～１０mg/kg）の抗体が、患者への投与のための初回の候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上述の要因に応じて、約１μg/kg～１００mg/kg以上の範囲であり得る。症状に応じて数日間又はより長い日数にわたる反復投与について、処置は、一般的に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５mg/kg～約１０mg/kgの範囲内であろう。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１回以上の用量が患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間毎に（例えば、患者が抗体の約２～約２０回、又は例えば、約６回用量を受容するように）投与され得る。初回のより高い負荷用量、続いて１回以上のより低い用量が投与され得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
ＩＩＩ．製品
本明細書で報告される別の態様では、前述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製品が提供される。製品は、容器及び容器の上又は容器に添えられたラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなど様々な材料から形成され得る。容器は、単独であるか、又は症状を治療、予防及び／若しくは診断するのに有効な別の製剤と組み合わせられた製剤を収容し、無菌取出口を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができる栓を有する静注液バッグ又はバイアルであり得る）。製剤中の少なくとも１つの活性物質は、本明細書で報告される抗体である。ラベル又は添付文書は、その製剤が、選ばれた症状を処置するのに使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）本明細書で報告される抗体を含む製剤がその中に含まれる第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害剤又はそうでなければ治療剤を含む製剤がその中に含まれる第２の容器を含み得る。本明細書で報告されるこの態様の製品は、それらの製剤を使用して特定の症状を処置できることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは又は加えて、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容し得る緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含み得る。
上記の製品のいずれかは、本明細書で報告される抗体の代わりに又は抗体に加えて、本明細書で報告される免疫コンジュゲートを含み得ることが理解される。
ＩＶ．特定の実施態様
１．第１のＦｃ領域ポリペプチドと、第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含む抗体であって、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異の組み合わせ
ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又は
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又は
ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ、又は
ｉｖ）ｉ）～ｉｉｉ）の組み合わせ
を含む、抗体。
２．第１のＦｃ領域ポリペプチドと、第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含む抗体であって、抗体が、第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異
ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又は
ｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又は
ｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ、又は
ｉｖ）ｉ）～ｉｉｉ）の組み合わせ
を有する抗体に匹敵する、又はより低い親和性でヒトＦｃＲｎに特異的に結合する、抗体。
３．第１のＦｃ領域ポリペプチドと、第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含む抗体であって、
ｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含むか、又は
ｉｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含むか、又は
ｉｉｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄを含むか、又は
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが
ａ）突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、若しくは
ｂ）突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ
を含むか、
又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドが
ａ）突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ
を含む、抗体。
４．第１のＦｃ領域ポリペプチドと、第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含む抗体であって、
α）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり（ヒト起源に由来し）、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが変異体（ヒト）ＩｇＧクラスＦｃ領域に含まれることになるように、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、ｉ）群Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）群Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）群Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）から選択される突然変異の１つ又は２つを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｌ２５１Ｄ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ４３２Ｄ、Ｈ４３３Ａ、Ｈ４３５Ａ及びＹ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含む群から選択される突然変異の１つ又は２つを含み、又は
β）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり（すなわち、ヒト起源に由来し）、総合すると、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおける突然変異の全ての結果として、突然変異ｉ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ、又はｉｉ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａ、又はｉｉｉ）Ｌ２５１Ｄ、Ｌ３１４Ｄ及びＬ４３２Ｄが該Ｆｃ領域に含まれることになるように、該Ｆｃ領域において、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ又はそれらの組み合わせ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を両方が含み、それにより、全ての突然変異が第１の若しくは第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあるか、又は１つ若しくは２つの突然変異が第１のＦｃ領域ポリペプチド内にあり、１つ若しくは２つの突然変異が第２のＦｃ領域ポリペプチド内にあり、又は
γ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが両方とも、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり（すなわち、ヒト起源に由来し）、第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ又はＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ又はＬ２５１Ｄ／Ｌ３１４Ｄ／Ｌ４３２Ｄ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含むか、又は第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて突然変異の組み合わせＩ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて突然変異の組み合わせＨ３１０Ａ／Ｈ４３３Ａ／Ｙ４３６Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）を含む、抗体。
５．二重特異性抗体である、実施態様１～４のいずれか１つに係る抗体。
６．二価抗体である、実施態様１～５のいずれか１つに係る抗体。
７．
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、
－ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｋ３９２Ｄを有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４、並びに
－ 突然変異Ｎ３９２Ｄを有するヒトＩｇＧ３
を含む群から選択され、
及び
ｉｉ）第２のＦｃ領域ポリペプチドが、
－ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
－ 突然変異Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３５６Ｋ及び／又はＥ３５７Ｋを有するヒトＩｇＧ１、並びに
－ 突然変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ及び／又はＥ３５７Ｋを有するヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４
を含む群から選択される、実施態様１～６のいずれか１つに係る抗体。
８．
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６９、７０、７１、７３、７５、７６、７８、８０、８１、８２及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６６、６８、６９、７０、７２、７４、７５、７６、７７、７９、８１、８３及び８５を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する、実施態様１～６のいずれか１つに係る抗体。
９．
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドがヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドがヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドがヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドがヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｖｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｉｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
ｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドである、実施態様１～６のいずれか１つに係る抗体。
１０．
ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６０のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６０のアミノ酸配列を有するか、又は
ｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６４のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６４のアミノ酸配列を有するか、又は
ｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７０のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７０のアミノ酸配列を有するか、又は
ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６８のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６７のアミノ酸配列を有するか、又は
ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７４のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７３のアミノ酸配列を有するか、又は
ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６３のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号６３のアミノ酸配列を有するか、又は
ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７５のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７５のアミノ酸配列を有するか、又は
ｖｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７６のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７６のアミノ酸配列を有するか、又は
ｉｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号７９のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号８０のアミノ酸配列を有するか、又は
ｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号８５のアミノ酸配列を有し、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号８４のアミノ酸配列を有する、実施態様１～６のいずれか１つに係る抗体。
１１．二重特異性抗体が、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する１つの結合特異性と、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する１つの結合特異性とを有する、実施態様５～１０のいずれか１つに係る抗体。
１２．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含み、
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１４のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１６のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１７のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２２のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号２４のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域を含む、実施態様５～１１のいずれか１つに係る抗体。
１３．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含み、
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号２０のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号２８のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号２９のアミノ酸配列を含む、実施態様５～１２のいずれか１つに係る抗体。
１４．
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の全長抗体の改変重鎖及び改変軽鎖であって、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている改変重鎖及び改変軽鎖を含む、実施態様５～１３のいずれか１つに係る抗体。
１５．
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１０２のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号３６のアミノ酸配列、並びに
ｂ）第２の全長抗体の改変重鎖として配列番号１０３のアミノ酸配列、及び第２の全長抗体の改変軽鎖として配列番号３７のアミノ酸配列を含む、実施態様１４に係る抗体。
１６．
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１０４のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号４０のアミノ酸配列、並びに
ｂ）第２の全長抗体の改変重鎖として配列番号１０５のアミノ酸配列、及び第２の全長抗体の改変軽鎖として配列番号４１のアミノ酸配列を含む、実施態様１４に係る抗体。
１７．
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１０６のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号４４のアミノ酸配列、並びに
ｂ）第２の全長抗体の改変重鎖として配列番号１０７のアミノ酸配列、及び第２の全長抗体の改変軽鎖として配列番号４５のアミノ酸配列を含む、実施態様１４に係る抗体。
１８．
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、並びに
ｂ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖であって、該重鎖のＮ末端が、ペプチドリンカーを介して該軽鎖のＣ末端に連結されている重鎖及び軽鎖を含むことを特徴とする、実施態様５～１３のいずれか１つに係る抗体。
１９．
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１０８のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号４８のアミノ酸配列、並びに
ｂ）ペプチドリンカーを介して第２の全長抗体の軽鎖に連結された第２の全長抗体の重鎖として配列番号１０９のアミノ酸配列を含む、実施態様１８に係る抗体。
２０．
ａ）第１の全長抗体の重鎖として配列番号１１０のアミノ酸配列、及び第１の全長抗体の軽鎖として配列番号５１のアミノ酸配列、並びに
ｂ）ペプチドリンカーを介して第２の全長抗体の軽鎖に連結された第２の全長抗体の重鎖として配列番号１１１のアミノ酸配列を含む、実施態様１８に係る抗体。
２１．第２の全長抗体の重鎖及び軽鎖の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、重鎖可変ドメインの４４位と軽鎖可変ドメインの１００位（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）との間のジスルフィド結合の導入によってジスルフィド安定化されている、実施態様１８～２０のいずれか１つに係る抗体。
２２．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、
配列番号３４、３５、３６及び３７のアミノ酸配列を含むか、又は
配列番号３８、３９、４０及び４１のアミノ酸配列を含むか、又は
配列番号４２、４３、４４及び４５のアミノ酸配列を含むか、又は
配列番号４６、４７及び４８のアミノ酸配列を含むか、又は
配列番号４９、５０及び５１のアミノ酸配列を含み、
及び
両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を含む、実施態様１～２１のいずれか１つに係る抗体。
２３．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、
可変ドメインが、各可変ドメインにおいて、０個、１個、２個又は３個の突然変異を有する配列番号２０、２１、２８及び２９を含み、
両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を含む、実施態様１～２１のいずれか１つに係る抗体。
２４．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、
配列番号２０、２１、２８及び２９のアミノ酸配列を含み、
及び
両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を含む、実施態様１～２１のいずれか１つに係る抗体。
２５．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１４のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１６のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１７のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２２のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号２４のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉｉ）突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの（ヒト起源に由来する）定常重鎖領域を含み、
可変ドメインが、配列番号２０、２１、２８及び２９に関して３個以下の突然変異を含む、実施態様１～２１のいずれか１つに係る抗体。
２６．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１４のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１６のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１７のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２２のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号２４のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
ｉｉｉ）両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を含む、
実施態様１～２１のいずれか１つに係る抗体。
２７．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではなく、
両方のＦｃ領域ポリペプチドにおいて、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａ（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を含む、実施態様１～２１のいずれか１つに係る抗体。
２８．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体ではない、実施態様１～２１のいずれか１つに係る抗体。
２９．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号３６及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む、二重特異性二価抗体。
３０．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号４０及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む、二重特異性二価抗体。
３１．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号４４及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む、二重特異性二価抗体。
３２．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１０８、配列番号１０９及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む、二重特異性二価抗体。
３３．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む、二重特異性二価抗体。
３４．ヒトＦｃＲｎに結合しない、実施態様１～３３のいずれか１つに係る抗体。
３５．ブドウ球菌プロテインＡに結合するか、又はブドウ球菌プロテインＡに結合しない、実施態様１～３４のいずれか１つに係る抗体。
３６．結合又は非結合が表面プラズモン共鳴によって決定される、実施態様３４～３５のいずれか１つに係る抗体。
３７．
－ （マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックなマウスにおいて、硝子体内適用の９６時間後に）（実施例６に記載されているアッセイで決定すると）Ｆｃ領域ポリペプチドにおいて突然変異を有しない対応する二重特異性抗体と比較して低い血清濃度を示し、及び／又は
－ （マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックなマウスにおいて、右眼の硝子体内適用の９６時間後に）（実施例６に記載されているアッセイで決定すると）Ｆｃ領域ポリペプチドにおいて突然変異を有しない対応する二重特異性抗体と比較して、類似（係数０．８～１．２）の全右眼溶解物中濃度を示す、実施態様１～３６のいずれか１つに係る抗体。
３８．可溶性レセプターリガンドを眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体の使用。
３９．医薬として使用するため、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
４０．眼血管疾患を処置するのに使用するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
４１．１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体の使用。
４２．１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去するのに使用するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
４３．眼疾患、特に眼血管疾患を処置するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体の使用。
４４．１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体の使用。
４５．１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送するのに使用するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
４６．眼疾患を処置するのに使用するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
４７．可溶性レセプターリガンドを眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送するのに使用するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
４８．１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去するのに使用するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
４９．眼疾患、特に眼血管疾患を処置するのに使用するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
５０．１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送するのに使用するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体。
５１．眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体を該個体に投与することを含む、方法。
５２．個体において可溶性レセプターリガンドを眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送するための方法であって、有効量の実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体を該個体に投与して、可溶性レセプターリガンドを眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送することを含む、方法。
５３．個体において１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去するための方法であって、有効量の実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体を該個体に投与して、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを眼から除去することを含む、方法。
５４．個体において１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送するための方法であって、有効量の実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体を該個体に投与して、１つ以上の可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔から血液循環に輸送することを含む、方法。
５５．個体において可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔又は眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送するための方法であって、有効量の実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体を該個体に投与して、可溶性レセプターリガンドを硝子体内腔又は眼から血液眼関門を通して血液循環に輸送することを含む、方法。
５６．実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体を含む、医薬製剤。
５７．眼血管疾患を処置するのに使用するための医薬製剤であって、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体を含む、医薬製剤。
５８．眼血管疾患を処置するための医薬を製造するための、実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体の使用。
５９．実施態様１～３７のいずれか１つに係る抗体を、このような処置を必要とする患者に投与することによって、眼血管疾患を患っている患者を処置する方法。
６０．抗体が硝子体内適用によって投与される、実施態様５５～５６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
６１．硝子体内適用である、実施態様５１～５５及び５９のいずれか一項に記載の投与。
Ｖ．実施例
以下は、本明細書で報告される方法及び製剤の実施例である。上に示されている一般的な説明を考慮して、様々な他の実施態様を実施し得ると理解される。
理解を明確にする目的のために、例示及び実施例によって上記本発明をいくらか詳細に説明したが、前記説明及び実施例は、本明細書で報告される範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
方法
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）
N-Glycanase plus (Roche)０．５μL及びリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．１）を追加してタンパク質アリコート（５０μg）を脱グリコシル化し、最終サンプル容量１１５μLを得た。混合物を３７℃で１８時間インキュベーションした。その後、還元及び変性のために、０．５Ｍ ＴＣＥＰ（Pierce）の４Ｍグアニジン＊ＨＣｌ（Pierce）溶液６０μL及び８Ｍグアニジン＊ＨＣｌ ５０μLを追加した。混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした。サイズ排除クロマトグラフィー（Sepharose G-25、アイソクラチック、２％ギ酸を含む４０％アセトニトリル）によって、サンプルを脱塩した。nano ESI source (TriVersa NanoMate, Advion)を備えるQ-TOF機器(maXis, Bruker)において、ＥＳＩ質量スペクトル（＋ｖｅ）を記録した。ＭＳパラメータの設定は以下のとおりであった：転送：ファンネルＲＦ、４００Vpp；ＩＳＣＩＤエネルギー、０eV；多重極ＲＦ、４００Vpp；四重極：イオンエネルギー、４．０eV；低質量、６００ｍ／ｚ；ソース：乾性ガス、８Ｌ／分；乾性ガス温度、１６０℃；コリジョンセル：コリジョンエネルギー、１０eV；コリジョンＲＦ：２０００Vpp；イオンクーラー：イオンクーラーＲＦ、３００Vpp；転送時間：１２０μs；プレプラスストレージ、１０μs；スキャン範囲ｍ／ｚ６００～２０００。データ評価については、自社開発のソフトウェア（MassAnalyzer）を使用した。
ＦｃＲｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
BIAcore T100機器（BIAcore AB, Uppsala, Sweden）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって、ＦｃＲｎに対する野生型抗体及び突然変異体の結合特性を分析した。このシステムは、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。それは、リガンド／分析物結合の連続的なリアルタイムモニタリング、及びしたがって様々なアッセイ設定における動態パラメータの決定を可能にする。ＳＰＲ技術は、金コーティングバイオセンサーチップの表面付近の屈折率の測定に基づくものである。屈折率の変化は、固定化リガンドと、溶液に注入された分析物との相互作用によって引き起こされる表面の質量変化を示す。分子が表面上の固定化リガンドに結合する場合には質量が増加し、解離の場合には質量が減少する。現在のアッセイでは、アミンカップリングを介して、ＦｃＲｎレセプターをBIAcoreＣＭ５バイオセンサーチップ（GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden）上に４００反応単位（RU）レベルまで固定化した。ランニング緩衝液及び希釈緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％Tween-20（商標）（ｐＨ６．０）（GE Healthcare Bioscience）を用いて、アッセイを室温で行った。流速５０μL／分で２００nMの抗体サンプルを室温で注入した。会合時間は１８０秒間であり、解離段階には３６０秒間を要した。ＨＢＳ－Ｐ（ｐＨ８．０）の短注入によって、チップ表面の再生を達成した。注入１８０秒後及び注入３００秒後における生物学的反応シグナルの高さの比較によって、ＳＰＲデータの評価を実施した。対応するパラメータは、RU最大レベル（注入１８０秒後）及び後期安定性（注入終了３００秒後）である。
プロテインＡ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
アッセイは、表面プラズモン共鳴分光法に基づくものである。プロテインＡをＳＰＲバイオセンサーの表面上に固定化する。サンプルをＳＰＲスペクトロメータのフローセルに注入することによって、それが固定化プロテインＡと複合体を形成して、センサーチップ表面上の質量が増加するため、反応がより高くなる（１RUを１pg/mm２と定義する）。その後、サンプル－プロテインＡ複合体を溶解することによって、センサーチップを再生する。次いで、得られた反応を、反応単位（RU）のシグナルの高さ及び解離挙動について評価する。
GE Healthcareのアミンカップリングキットを使用することによって、約３，５００反応単位（RU）のプロテインＡ（２０μg/mL）をＣＭ５チップ（GE Healthcare）上にｐＨ４．０でカップリングした。
サンプル及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ－Ｐ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、滅菌ろ過０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。フローセルの温度を２５℃に設定し、サンプルコンパートメントの温度を１２℃に設定した。このシステムをランニング緩衝液でプライミングした。次いで、サンプル構築物の５nM溶液を流速３０μL／分で１２０秒間注入し、次いで３００秒間の解離段階を行った。次いで、流速３０μL／分でのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の２回の３０秒間の長注入によって、センサーチップ表面を再生した。各サンプルを３回反復で測定した。
Figure 0007426190000040
本明細書で使用される「（前記）突然変異ＩＨＨ－ＡＡＡを有する」という用語は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｉ２５３Ａ（Ｉｌｅ２５３Ａｌａ）、Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）及びＨ４３５Ａ（Ｈｉｓ４３５Ａｌａ）の組み合わせを指し（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、本明細書で使用される「（前記）突然変異ＨＨＹ－ＡＡＡを有する」という用語は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）、Ｈ４３３Ａ（Ｈｉｓ４３３Ａｌａ）及びＹ４３６Ａ（Ｔｙｒ４３６Ａｌａ）の組み合わせを指し（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、本明細書で使用される「（前記）突然変異Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡを有する」という用語は、ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）の組み合わせを指し（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）、本明細書で使用される「（前記）突然変異ＳＰＬＥを有する」という用語は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域における突然変異Ｓ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）及びＬ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）の組み合わせを指す（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスに従う）。
Figure 0007426190000041
一般
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示されている。ＥＵナンバリングにしたがって、抗体鎖のアミノ酸残基をナンバリング及び参照する（Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。
リコンビナントＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。製造業者の説明書にしたがって、分子生物学的試薬を使用した。
遺伝子合成
Geneart (Regensburg, Germany)の所定の仕様にしたがって、所望の遺伝子セグメントを順に整列した。
ＤＮＡ配列決定
MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany)又はSequiServe GmbH (Vaterstetten, Germany)で実施した二本鎖配列決定によって、ＤＮＡ配列を決定した。
ＤＮＡ及びタンパク質配列分析並びに配列データ管理
ＧＣＧの（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びInfomaxのPlasmid NT1 Advance suite version 8.0を配列の作成、マッピング、分析、アノテーション及び図示に使用した。
発現プラスミド
記載されている抗体の発現のために、ＣＭＶ－イントロンＡプロモーターを用いる若しくは用いないｃＤＮＡ構築、又はＣＭＶプロモーターを用いるゲノム構築のいずれかに基づく（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における）一過性発現のための発現プラスミドを使用した。
抗体遺伝子の転写単位は、以下の要素から構成されていた：
－ ５’末端の固有の制限部位、
－ ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ｃＤＮＡ構築の場合にはイントロンＡ配列、
－ ヒト免疫グロブリン遺伝子の５’非翻訳領域、
－ 免疫グロブリン重鎖シグナル配列をコードする核酸、
－ ｃＤＮＡとして、又は免疫グロブリンエクソン－イントロン構築によるゲノム構築における（野生型であるか又はドメイン交換された）ヒト抗体鎖をコードする核酸、
－ ポリアデニル化シグナル配列を有する３’非翻訳領域、及び
－ ３’末端の固有の制限部位。
抗体発現カセットの他に、プラスミドは、以下のものを含有していた：
－ E. coliにおけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
－ E. coliにおけるアンピシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ遺伝子、及び
－ 真核細胞における選択可能マーカーとしての、Mus musculus由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子。
抗体鎖をコードする核酸をＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって作製し、公知のリコンビナント方法及び技術によって、例えば、各プラスミドにおける固有の制限部位を使用して、一致する核酸セグメントを連結することによってアセンブルした。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。一過性トランスフェクションのために、トランスフォーメーションE. coli培養物（Nucleobond AX, Macherey-Nagel）からのプラスミド調製によって、より多量のプラスミドを調製した。
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
下記のように、懸濁液中で成長しているＨＥＫ２９－Ｆ細胞における各発現プラスミドの一過性コトランスフェクションによって、二重特異性抗体を発現させた。
実施例１
発現及び精製
ＨＥＫ２９３－Ｆシステムにおける一過性トランスフェクション
製造業者の説明書にしたがってＨＥＫ２９３－Ｆシステム（Invitrogen）を使用して、（例えば、重鎖及び改変重鎖、並びに対応する軽鎖及び改変軽鎖をコードする）各プラスミドによる一過性トランスフェクションによって、単一特異性抗体及び二重特異性抗体を作製した。簡潔に言えば、振盪フラスコ又は撹拌発酵槽のいずれかの無血清FreeStyle（商標）２９３発現培地（Invitrogen）において、懸濁液中で成長しているＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Invitrogen）を、各発現プラスミド及び293fectin（商標）又はフェクチン（Invitrogen）の混合物でトランスフェクションした。２Ｌ振盪フラスコ（Corning）の場合、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を６００mL中、細胞１＊１０６個／mLの密度で播種し、１２０rpm、８％ＣＯ２でインキュベーションした。翌日、Ａ）それぞれ重鎖又は改変重鎖及び対応する軽鎖をコードする全プラスミドＤＮＡ（１μg/mL）６００μgを等モル比で含むOpti-MEM（Invitrogen）２０mL並びにＢ）２９３フェクチン又はフェクチン（２μl/mL）１．２mLを含むOpti-MEM ２０mlの混合物約４２mLを、細胞約１．５＊１０６個／mLの細胞密度で細胞にトランスフェクションした。グルコース消費に応じて、グルコース溶液を発酵過程中に追加した。５～１０日後に、分泌抗体を含有する上清を回収し、上清から抗体を直接精製したか、又は上清を凍結保存した。
精製
MabSelectSure-Sepharose（商標）（非ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異体の場合）（GE Healthcare, Sweden）又はKappaSelect-Agarose（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異体の場合）（GE Healthcare, Sweden）を使用するアフィニティークロマトグラフィー、butyl-Sepharose (GE Healthcare, Sweden)を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びSuperdex 200 size exclusion (GE Healthcare, Sweden)クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から二重特異性抗体を精製した。
簡潔に言えば、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ及び２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化（非ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異及び野生型抗体）したMabSelectSuRe樹脂上に滅菌ろ過細胞培養上清を捕捉し、平衡緩衝液で洗浄し、２５mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出した。２５mMトリス、５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）で平衡化したKappaSelect樹脂上にＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異体を捕捉し、平衡緩衝液で洗浄し、２５mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）で溶出した。溶出した抗体画分をプールし、２Ｍトリス（ｐＨ９．０）で中和した。疎水性相互作用クロマトグラフィーのために、０．８Ｍ硫酸アンモニウムの最終濃度まで１．６Ｍ硫酸アンモニウム溶液を追加することによって抗体プールを調製し、酢酸を使用してｐＨをｐＨ５．０に調整した。３５mM酢酸ナトリウム、０．８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ５．０）でbutyl-Sepharose樹脂を平衡化した後、抗体を樹脂にアプライし、平衡緩衝液で洗浄し、３５mM酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）の直線勾配で溶出した。（単一特異性又は二重特異性）抗体を含有する画分をプールし、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）で平衡化したSuperdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden)カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。（単一特異性又は二重特異性）抗体を含有する画分をプールし、Vivaspin ultrafiltration devices (Sartorius Stedim Biotech S.A., France)を使用して必要濃度に濃縮し、－８０℃で保存した。
Figure 0007426190000042
microfluidic Labchip technology (Caliper Life Science, USA)を使用するＣＥ－ＳＤＳによる各精製工程後に、純度及び抗体の完全性を分析した。製造業者の説明書にしたがってHT Protein Express Reagent Kitを使用して、タンパク質溶液５μLをＣＥ－ＳＤＳ分析のために調製し、HT Protein Express Chipを使用してLabChip GXII systemで分析した。LabChip GX Softwareを使用して、データを分析した。
Figure 0007426190000043
２５℃の２×ＰＢＳ（２０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、２mM ＫＨ２ＰＯ４、２７４mM ＮａＣｌ及び５．４mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）ランニング緩衝液中、Superdex 200 analytical size-exclusion column (GE Healthcare, Sweden)を使用して高速ＳＥＣによって、抗体サンプルの凝集体含量を分析した。流速０．７５mL／分でタンパク質２５μgをカラムに注入し、５０分間かけてアイソクラチックに溶出した。
同様に、以下の収量で、＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１２及びＶＥＧＦａｎｇ２－０２０１を調製及び精製した：
Figure 0007426190000044
また、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異及びＳＰＬＥ突然変異（配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５）を有する＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＩｇＧ４、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異（配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８）を有する＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞ＯＡｓｃＦａｂ ＩｇＧ１、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異及びＳＰＬＥ突然変異（配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１）を有する＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞ＯＡｓｃＦａｂ ＩｇＧ４、ＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異及びＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ突然変異（配列番号９０、配列番号９１、配列番号４０、配列番号４１）を有する＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞ＣｒｏｓｓＭａｂ ＩｇＧ１、ＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異及びＳＰＬＥ突然変異（配列番号９２、配列番号９３、配列番号４４、配列番号４５）を有する＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞ＣｒｏｓｓＭａｂ ＩｇＧ４、ＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異（配列番号９４、配列番号９５、配列番号４８）を有する＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞ＯＡｓｃＦａｂ ＩｇＧ１、及びＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異及びＳＰＬＥ突然変異（配列番号９６、配列番号９７、配列番号５１）を有する＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞ＯＡｓｃＦａｂ ＩｇＧ４、並びにさらに＜ＩＧＦ－１Ｒ＞単一特異性抗体＜ＩＧＦ－１Ｒ＞野生型（配列番号８８、配列番号８９）、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異（配列番号８８、配列番号９０）を有する＜ＩＧＦ－１Ｒ＞ＩｇＧ１、ＹＴＥ突然変異（配列番号８８、配列番号９１）を有する＜ＩＧＦ－１Ｒ＞ＩｇＧ１、ＫｉＨ突然変異（配列番号８８、配列番号９２、配列番号９３）を有する＜ＩＧＦ－１Ｒ＞ＩｇＧ１野生型、ホール鎖においてＫｉＨ突然変異及びＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異（配列番号８８、配列番号９４、配列番号９５）を有する＜ＩＧＦ－１Ｒ＞ＩｇＧ１、ホール鎖においてＫｉＨ突然変異及びＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異（配列番号８８、配列番号９６、配列番号９７）を有する＜ＩＧＦ－１Ｒ＞ＩｇＧ１、ＫｉＨ突然変異及びＹＴＥ突然変異（配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９）を有する＜ＩＧＦ－１Ｒ＞ＩｇＧ１、ＫｉＨ突然変異及びＤＤＤ突然変異（配列番号８８、配列番号１００、配列番号１０１）を有する＜ＩＧＦ－１Ｒ＞ＩｇＧ１、及びＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異（配列番号８８、配列番号１１２）を有する＜ＩＧＦ－１Ｒ＞ＩｇＧ１を同様に調製及び精製することができる。
実施例２
分析及び発展性
小規模ＤＬＳベース粘度測定
本質的には（He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-143）に記載されているように、粘度測定を実施した。簡潔に言えば、２００mMコハク酸アルギニン（ｐＨ５．５）中、サンプルを様々なタンパク質濃度に濃縮してから、ポリスチレンラテックスビーズ（直径３００nm）及びポリソルベート２０（０．０２％v/v）を追加した。０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離によってサンプルをオプティカル３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。２５℃で動的光散乱によって、ラテックスビーズの見掛けの直径を決定した。η＝η０（ｒｈ／ｒｈ、０）（η：粘度；η０：水の粘度；ｒｈ：ラテックスビーズの見掛けの流体力学的半径；ｒｈ、０：水中におけるラテックスビーズの流体力学半径）として、溶液の粘度を計算することができる。
同じ濃度における様々なサンプルの比較を可能にするために、Mooney方程式（方程式１）（Mooney, M., Colloid. Sci., 6 (1951) 162-170; Monkos, K., Biochem. Biophys. Acta 304 (1997) 1339）によって粘度－濃度データをフィッティングし、それに応じてデータを補間した。
Figure 0007426190000045
（Ｓ：タンパク質の流体力学的相互作用パラメータ；Ｋ：自己込み合い因子；Φ：溶解タンパク質の体積分率）
結果を図２に示す：Ｆｃ領域においてＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有するＶＥＧＦａｎｇ２－００１６は、全ての測定温度で、Ｆｃ領域においてＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しないＶＥＧＦａｎｇ２－００１５と比較して低い粘度を示す。
ＤＬＳ凝集開始温度
２０mMヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、１mg/mLの濃度でサンプルを調製し、０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離によってオプティカル３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。サンプルを０．０５℃／分の速度で２５℃から８０℃に加熱しながら、動的光散乱によって流体力学半径を繰り返し測定した。凝集開始温度は、流体力学半径が増加し始める温度と定義する。結果を図３に示す。図３では、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しないＶＥＧＦａｎｇ２－００１５対Ｆｃ領域においてＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有するＶＥＧＦａｎｇ２－００１６の凝集を示す。ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６は、６１℃の凝集開始温度を示したのに対して、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しないＶＥＧＦａｎｇ２－００１５は、６０℃の開始温度を示した。
ＤＬＳ時間経過
２０mMヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、１mg/mLの濃度でサンプルを調製し、０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離によってオプティカル３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。最大１４５時間にわたってサンプルを５０℃の一定温度に維持しながら、動的光散乱によって流体力学半径を繰り返し測定した。この実験では、ネイティブなアンフォールドタンパク質の高温での凝集傾向は、経時的な平均粒径の増加につながるであろう。凝集物は散乱光強度に過比例的に寄与するため、このＤＬＳベースの方法は、凝集物に対して非常に高感度である。５０℃（凝集開始温度付近の温度、上記を参照のこと）で１４５時間経過した後であっても、ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５及びＶＥＧＦａｎｇ２－００１６の両方について、わずか０．５nm未満の平均粒径の増加が見出された。
１００mg/mL、４０℃での７日間保存
２００mMコハク酸アルギニン（ｐＨ５．５）中、サンプルを１００mg/mLの最終濃度に濃縮し、滅菌ろ過し、４０℃で７日間静止保存した。保存前後において、サイズ排除クロマトグラフィーによって、高分子量種及び低分子量種（それぞれＨＭＷ及びＬＭＷ）の含量を決定した。保存サンプルと、調製直後に測定したサンプルとの間のＨＭＷ及びＬＭＷ含量の差異をそれぞれ「ＨＭＷ増加」及び「ＬＭＷ増加」として報告する。結果は以下の表及び図４に示されており、（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５は、（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６と比較して、主ピークの大きな減少及び大きなＨＭＷ増加を示すことが示されている。驚くべきことに、（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６は、（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５と比較して低い凝集傾向を示した。
Figure 0007426190000046
２５℃でBIAcore（登録商標）T100又はT200機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体の機能分析を評価した。BIAcore（登録商標）システムは、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。ＳＰＲ技術は、金コーティングバイオセンサーチップの表面付近の屈折率の測定に基づくものである。屈折率の変化は、固定化リガンドと、溶液に注入された分析物との相互作用によって引き起こされる表面の質量変化を示す。分子が表面上の固定化リガンドに結合する場合には質量が増加し、反対に、分析物が固定化リガンドから解離する場合には質量が減少する（複合体の解離を反映）。ＳＰＲは、リガンド／分析物結合の連続的なリアルタイムモニタリング、並びにしたがって会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡定数（ＫＤ）の決定を可能にする。
実施例３
ＶＥＧＦ、ＡＮＧ－２、ＦｃガンマＲ及びＦｃＲｎに対する結合
種交差反応性の評価を含むＶＥＧＦアイソフォームの動態親和性
GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、捕捉システム（１０μg/mLヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２；オーダーコード：２８９５８３２５；GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden）約１２，０００共鳴単位（RU）をｐＨ５．０でＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）上にカップリングした。サンプル及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Tween-20（商標）を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．４）であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回プライミングした。５０nM溶液を流量５μL／分で３０秒間注入することによって、二重特異性抗体を捕捉した。１：３希釈の３００nMから開始して、様々な濃度のヒトｈＶＥＧＦ１２１、マウスｍＶＥＧＦ１２０又はラットｒＶＥＧＦ１６４溶液を流量３０μL／分で３００秒間注入することによって、会合を測定した。解離段階を最大１２００秒間モニタリングし、サンプル溶液からランニング緩衝液に交換することによってトリガーした。流速３０μL／分のグリシン溶液（ｐＨ２．１）で６０秒間洗浄することによって、表面を再生した。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面から得られた反応を減算することによって、バルク屈折率の差異を補正した。ブランク注入も減算した（＝二重参照）。見掛けのＫＤ及び他の動態パラメータの計算のために、Langmuir１：１モデルを使用した。結果を以下に示す。
種交差反応性の評価を含むＡＮＧ－２溶液の親和性
溶液の親和性では、平衡混合物中の遊離相互作用パートナーの濃度を決定することによって、相互作用の親和性を測定する。溶液の親和性アッセイは、一定濃度に維持した＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体と、様々な濃度のリガンド（＝ＡＮＧ－２）との混合を含む。GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用して、最大可能共鳴単位（例えば、１７，０００共鳴単位（RU））の抗体をｐＨ５．０でＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）表面上に固定化した。サンプル及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ－Ｐ（ｐＨ７．４）であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回プライミングした。較正曲線を作成するために、固定化ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体を含有するBIAcoreフローセルに漸増濃度のＡＮＧ－２を注入した。結合したＡＮＧ－２の量を共鳴単位（RU）として決定し、濃度に対してプロットした。各リガンドの溶液（ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体については、０～２００nMの１１種の濃度）を１０nM ＡＮＧ－２と共にインキュベーションし、室温で平衡状態にした。既知量のＡＮＧ－２を用いて溶液の反応を測定する前後に作成した較正曲線から、遊離ＡＮＧ－２濃度を決定した。遊離ＡＮＧ－２濃度をｙ軸として使用し、阻害用抗体の使用濃度をｘ軸として使用したモデル２０１を使用するXLfit4 (IDBS Software)を用いて、４パラメータフィッティングを設定した。この曲線の変曲点を決定することによって、親和性を計算した。流速３０μL／分の０．８５％Ｈ３ＰＯ４溶液による３０秒間の洗浄を１回行うことによって、表面を再生した。ブランクカップリング表面から得られた反応を減算することによって、バルク屈折率の差異を補正した。結果を以下に示す。
ＦｃＲｎの定常状態親和性
ＦｃＲｎ測定のために、定常状態親和性を使用して、互いに対する二重特異性抗体を比較した。ヒトＦｃＲｎをカップリング緩衝液（１０μg/mL、酢酸Ｎａ ｐＨ５．０）中に希釈し、最終反応２００RUのBIAcoreウィザードを使用してターゲティング固定化手順によって、Ｃ１チップ（GE Healthcare BR-1005-35）上に固定化した。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回プライミングした。サンプル及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Tween-20（商標）を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ６．０）であった。各抗体の様々なＩｇＧ濃度を評価するために、６２．５nM、１２５nM、２５０nM及び５００nMの濃度を調製した。流速を３０μL／分に設定し、１８０秒間の会合時間を選択して様々なサンプルをチップ表面上に連続注入した。ＰＢＳ－Ｔ（ｐＨ８）を流速３０μL／分で６０秒間注入することによって、表面を再生した。ブランク表面から得られた反応を減算することによって、バルク屈折率の差異を補正した。緩衝液の注入も減算した（＝二重参照）。定常状態親和性を計算するために、BIA評価ソフトウェアの方法を使用した。簡潔に言えば、分析濃度に対してRU値をプロットして、用量反応曲線を作成した。２パラメータフィッティングに基づいて、上側漸近線を計算して、半最大RU値及びしたがって親和性を決定することができた。結果を図５及び以下の表に示す。同様に、カニクイザル、マウス及びウサギＦｃＲｎに対する親和性を決定することができる。
ＦｃガンマＲＩＩＩａ測定
ＦｃガンマＲＩＩＩａ測定のために、直接結合アッセイを使用した。GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、捕捉システム（１μg/mL Penta-His;Quiagen）約３，０００共鳴単位（RU）をｐＨ５．０でＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）上にカップリングした。サンプル及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ－Ｐ＋（ｐＨ７．４）であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回プライミングした。１００nM溶液を流量５μL／分で６０秒間注入することによって、ＦｃガンマＲＩＩＩａ－Ｈｉｓ－レセプターを捕捉した。１００nM二重特異性抗体又は単一特異性コントロール抗体（ＩｇＧ１サブクラス及びＩｇＧ４サブクラス抗体のための抗ジゴキシゲニン抗体（抗Ｄｉｇ））を流量３０μL／分で１８０秒間注入することによって、結合を測定した。流速３０μL／分のグリシン溶液（ｐＨ２．１）による１２０秒間の洗浄によって、表面を再生した。ＦｃガンマＲＩＩＩａ結合はLangmuir１：１モデルと異なるため、このアッセイを用いて結合／非結合のみを決定した。同様に、ＦｃガンマＲＩａ及びＦｃガンマＲＩＩａ結合を決定することができる。結果は図６に示されており、突然変異Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡの導入によって、ＦｃガンマＲＩＩＩａに対するより多くの結合を検出することはできなかったということである。
＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体に対するＶＥＧＦ及びＡＮＧ－２独立結合の評価
GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、捕捉システム（１０μg/mLヤギ抗ヒトＩｇＧ；GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden）約３，５００共鳴単位（RU）をｐＨ５．０でＣＭ４チップ（GE Healthcare BR-1005-34）上にカップリングした。サンプル及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Tween-20（商標）を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．４）であった。フローセルの温度を２５℃に設定し、サンプルブロックの温度を１２℃に設定した。捕捉前に、ランニング緩衝液でフローセルを２回プライミングした。
１０nM溶液を流量５μL／分で６０秒間注入することによって、二重特異性抗体を捕捉した。逐次に又は同時に追加した各リガンド（流量３０μL／分）に対する活性結合能を決定することによって、二重特異性抗体に対する各リガンドの独立結合を分析した：
１．濃度２００nMのヒトＶＥＧＦを１８０秒間注入（抗原の単一結合を同定する）。
２．濃度１００nMのヒトＡＮＧ－２を１８０秒間注入（抗原の単一結合を同定する）。
３．濃度２００nMのヒトＶＥＧＦを１８０秒間注入し、次いで、濃度１００nMのヒトＡＮＧ－２をさらに１８０秒間注入（ＶＥＧＦの存在下におけるＡＮＧ－２の結合を同定する）。
４．濃度１００nMのヒトＡＮＧ－２を１８０秒間注入し、次いで、濃度２００nMのヒトＶＥＧＦをさらに注入（ＡＮＧ－２の存在下におけるＶＥＧＦの結合を同定する）。
５．濃度２００nMのヒトＶＥＧＦの及び濃度１００nMのヒトＡＮＧ－２を１８０秒間同時注入（ＶＥＧＦ及びＡＮＧ－２の結合を同時に同定する）。
流速３０μL／分の３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液による６０秒間の洗浄によって、表面を再生した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ表面から得られた反応を減算することによって、バルク屈折率の差異を補正した。
アプローチ３、４及び５の得られた最終シグナルが、アプローチ１及び２の個々の最終シグナルの合計と同等又は類似である場合、二重特異性抗体は相互に独立して両方の抗原に結合することができた。結果は以下の表に示されており、両方の抗体（ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６、ＶＥＧＦａｎｇ２－００１２）が、相互に独立してＶＥＧＦ及びＡＮＧ－２に結合することができることが示された。
＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二特異性抗体に対するＶＥＧＦ及びＡＮＧ－２の同時結合の評価
第１に、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、ＶＥＧＦ（２０μg/mL）約１，６００共鳴単位（RU）をｐＨ５．０でＣＭ４チップ（GE Healthcare BR-1005-34）上にカップリングした。サンプル及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Tween-20（商標）を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．４）であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回プライミングした。第２に、二重特異性抗体の５０nM溶液を流量３０μL／分で１８０秒間注入した。第３に、ｈＡＮＧ－２を流量３０μL／分で１８０秒間注入した。ｈＡＮＧ－２の結合反応は、ＶＥＧＦに結合した二重特異性抗体の量に依存し、同時結合を示す。流速３０μL／分の０．８５％Ｈ３ＰＯ４溶液による６０秒間の洗浄によって、表面を再生した。先のＶＥＧＦ結合＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異的抗体に対するｈＡＮＧ－２のさらなる特異的結合シグナルによって、同時結合は示される。二重特異性抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５及びＶＥＧＦａｎｇ２－００１６の両方について、＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体に対するＶＥＧＦ及びＡＮＧ－２の同時結合を検出することができた（データは示さず）。
Figure 0007426190000047
Figure 0007426190000048
Figure 0007426190000049
Figure 0007426190000050
Figure 0007426190000051
実施例４
質量分析
このセクションでは、正確なアセンブリを重視した＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体の特性決定を説明する。脱グリコシル化した＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体、インタクトな＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体又はＩｄｅＳ消化（S. pyogenesのＩｇＧ分解酵素）した＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって、予想一次構造を確認した。精製抗体１００μgを１００mmol/L ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．１）中、ＩｄｅＳプロテアーゼ（Fabricator）２μgと共に３７℃で５時間インキュベーションして、ＩｄｅＳ消化を実施した。続いて、１００mmol/L ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．１）中、ＮグリコシダーゼＦ、ノイラミニダーゼ及びＯ－グリコシダーゼ（Roche）を用いて抗体を３７℃、タンパク質濃度１mg/mLで最大１６時間脱グリコシル化し、続いて、Sephadex G25 column (GE Healthcare)のＨＰＬＣによって脱塩した。TriVersa NanoMate source (Advion)を備えるmaXis 4G UHR-QTOF MS system (Bruker Daltonik)におけるＥＳＩ－ＭＳによって、全質量を決定した。
ＩｄｅＳ消化した分子、脱グリコシル化した分子（以下の表）、又はインタクトな分子、脱グリコシル化した分子（以下の表）について得られた質量は、２本の異なる軽鎖ＬＣＡＮＧ－２及びＬＣＬｕｃｅｎｔｉｓと、２本の異なる重鎖ＨＣＡＮＧ－２及びＨＣＬｕｃｅｎｔｉｓとからなる＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体のアミノ酸配列から推定される予測質量に対応する。
Figure 0007426190000052
Figure 0007426190000053
実施例５
ＦｃＲｎクロマトグラフィー
ストレプトアビジンセファロースに対するカップリング：
１グラムストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare）をビオチン化透析レセプターに追加し、振盪しながら２時間インキュベーションした。レセプター誘導化セファロースを1 mL XK column (GE Healthcare)に充填した。
ＦｃＲｎアフィニティーカラムを使用したクロマトグラフィー：
条件：
カラム寸法：５０mm×５mm
床高さ：５cm
ローディング：サンプル５０μg
平衡緩衝液：１５０mM ＮａＣｌを含む２０mM ＭＥＳ（ｐＨ５．５に調整）
溶出緩衝液：１５０mM ＮａＣｌを含む２０mMトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８に調整）
溶出：７．５CVで平衡化緩衝液、３０CVで１００％溶出緩衝液に、１０CVで溶出緩衝液
ヒトＦｃＲｎアフィニティーカラムクロマトグラフィー
以下の表において、ヒトＦｃＲｎを含むアフィニティーカラム上での＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞二重特異性抗体の保持時間を示す。上記条件を使用して、データを得た。
Figure 0007426190000054
実施例６
ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する抗体の薬物動態（ＰＫ）特性
ヒトＦｃＲｎについてトランスジェニックなＦｃＲｎマウスのＰＫデータ
生活相において：
本研究には、マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックな雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（バックグラウンド）（ｈｕＦｃＲｎ、２７６－／ｔｇ系統）が含まれていた。
パート１
２μL／動物の適切な溶液（すなわち、化合物２１μg／動物（（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）ＶＥＧＦＡｎｇ２－００１５）又は化合物２３．６μg／動物（（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）ＶＥＧＦＡｎｇ２－００１６））を全てのマウスの右眼に１回硝子体内注射した。
マウスを２つのグループ（それぞれ動物６匹）に分けた。グループ１からは投与１時間後、２４時間後及び９６時間後において、並びにグループ２からは投与７時間後、４８時間後及び１６８時間後において、血液サンプルを採取した。
World Precision Instruments, Inc., Berlin, Germanyのナノリットル注射用NanoFil Microsyringe systemを使用することによって、マウス右眼の硝子体への注射を実施した。２．５％イソフルランでマウスを麻酔し、マウスの眼の可視化のために、倍率４０倍及びLeica KL 2500 LCDライトニングのリングライトと共にLeica MZFL 3顕微鏡を使用した。続いて、３５ゲージ針を使用して、化合物２μLを注射した。
血清中の化合物レベルを決定するために、各動物の対側眼の眼球後静脈叢を介して血液を採取した。
室温で１時間経過後、４℃で３分間遠心分離（９，３００×ｇ）することによって、血液から血清サンプル少なくとも５０μLを得た。遠心分離直後に血清サンプルを凍結し、分析まで－８０℃で凍結保存した。処置９６時間後にグループ１の動物の処置眼を単離し、処置１６８時間後にグループ２の動物の処置眼を単離した。サンプルを分析まで－８０℃で凍結保存した。
パート２
２００μL／動物の適切な溶液（すなわち、化合物２１μg／動物（（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）ＶＥＧＦＡｎｇ２－００１５）又は化合物２３．６μg／動物（（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）ＶＥＧＦＡｎｇ２－００１６））を全てのマウスに尾静脈を介して１回静脈内注射した。
マウスを２つのグループ（それぞれ動物５匹）に分けた。グループ１からは投与１時間後、２４時間後及び９６時間後において、並びにグループ２からは投与７時間後、４８時間後及び１６８時間後において、血液サンプルを採取した。血清中の化合物レベルを決定するために、各動物の眼球後静脈叢を介して血液を採取した。
室温で１時間経過後、４℃で３分間遠心分離（９，３００×ｇ）することによって、血液から血清サンプル少なくとも５０μLを得た。遠心分離直後に血清サンプルを凍結し、分析まで－８０℃で凍結保存した。
全眼溶解物の調製（マウス）
実験動物の眼全体の物理化学的な分解によって、眼溶解物を得た。機械的破壊のために、円錐形の底部を有する１．５mLマイクロバイアルに各眼を移した。凍結解凍後、細胞洗浄緩衝液１mL（Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011)で眼を１回洗浄した。次の工程では、新たに調製した細胞溶解緩衝液５００μLを追加し、１．５mL組織粉砕乳棒（Kimble Chase, 1.5 mL pestle, Art. No. 749521-1500）を使用して眼を粉砕した。次いで、混合物を５回凍結解凍し、再度粉砕した。残りの組織から溶解物を分離するために、サンプルを４，５００ｇで４分間遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、定量ＥＬＩＳＡでのさらなる分析まで－２０℃で保存した。
分析
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、マウス血清及び眼溶解物中の＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体の濃度を決定した。
マウス血清サンプル及び眼溶解物中の＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体を定量するために、捕捉抗体及び検出抗体として使用したビオチン化及びジゴキシゲニン化モノクローナル抗体を用いる標準的な固相シリアルサンドイッチイムノアッセイを実施した。分析物の二重特異性の完全性を検証するために、ビオチン化捕捉抗体はＶＥＧＦ結合部位を認識するのに対して、ジゴキシゲニン化検出抗体は分析物のＡＮＧ－２結合部位に結合するであろう。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼをカップリングした抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレート（ＳＡ－ＭＴＰ）の固相上の捕捉抗体、分析物及び検出抗体の結合免疫複合体を検出した。ＳＡ－ＭＴＰから未結合の物質を洗浄し、ABTS基質を追加した後、得られたシグナルは、ＳＡ－ＭＴＰの固相上に結合した分析物の量に比例していた。次いで、平行して分析した標準物質を参照して、サンプルの測定シグナルを濃度に変換することによって、定量を行った。
最初の工程では、５００rpmのＭＴＰシェイカー上において、濃度１μg/mLのビオチン化捕捉抗体溶液（抗イディオタイプ抗体ｍＡｂ＜Ｉｄ＜ＶＥＧＦ＞＞Ｍ－２．４５．５１－ＩｇＧ－Ｂｉ（ＤＤＳ））を１ウェル当たり１００μL用いてＳＡ－ＭＴＰを１時間コーティングした。その間に、標準物質、ＱＣ－サンプル及びサンプルを調製した。標準物質及びＱＣ－サンプルを２％血清マトリックスに希釈した；シグナルが標準物質の直線範囲内になるまでサンプルを希釈した。
捕捉抗体でＳＡ－ＭＴＰをコーティングした後、１ウェル当たり洗浄緩衝液３００μLでプレートを３回洗浄した。続いて、１ウェル当たり標準物質、ＱＣ－サンプル及びサンプル１００μLをＳＡ－ＭＴＰ上にピペッティングし、５００rpmで再度１時間インキュベーションした。この時点で、分析物は、その抗ＶＥＧＦ結合部位によって捕捉抗体を介してＳＡ－ＭＴＰの固相に結合していた。インキュベーションし、プレートを洗浄することによって未結合の分析物を除去した後、濃度２５０ng/mLの第１の検出抗体（抗イディオタイプ抗体ｍＡｂ＜Ｉｄ－＜ＡＮＧ－２＞＞Ｍ－２．６．８１－ＩｇＧ－Ｄｉｇ（ＸＯＳｕ））をＳＡ－ＭＴＰに１ウェル当たり１００μL追加した。再度、５００rpmのシェイカー上において、プレートを１時間インキュベーションした。洗浄後、濃度５０mU/mLの第２の検出抗体（ｐＡｂ＜ジゴキシゲニン＞Ｓ－Ｆａｂ－ＰＯＤ（ポリ））をＳＡ－ＭＴＰのウェルに１ウェル当たり１００μL追加し、プレートを５００rpmで再度１時間インキュベーションした。過剰の検出抗体を除去する最終洗浄工程の後、１ウェル当たり基質（ABTS）１００μLを追加した。抗体－酵素コンジュゲートは、ABTS（登録商標）基質の発色反応を触媒する。次いで、ＥＬＩＳＡリーダーによって、シグナルを波長４０５nm（参照波長：４９０nm（［４０５／４９０］nm））で測定した。
薬物動態評価
薬物動態評価プログラムWinNonlin（商標）（Pharsight）（バージョン５．２．１）を使用して非コンパートメント分析によって、薬物動態パラメータを計算した。
結果：
Ａ）血清濃度
血清濃度の結果を以下の表及び図７Ｂ～７Ｃに示す。
Figure 0007426190000055
Figure 0007426190000056
Figure 0007426190000057
Figure 0007426190000058
結果：
Ｂ）左眼及び右眼の眼溶解物中濃度
眼溶解物中濃度の結果を以下の表及び図７Ｄ～７Ｅに示す。
Figure 0007426190000059
Figure 0007426190000060
Figure 0007426190000061
Figure 0007426190000062
結果の概要：
硝子体内適用後、（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）本明細書で報告される二重特異性＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６は、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない二重特異性＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５と比較して、類似の眼溶解物中濃度（９６時間後及び１６８時間後）を示す。
また加えて、硝子体内適用後、（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有する）本明細書で報告される二重特異性＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１６は、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない二重特異性＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５と比較して、速いクリアランス及び短い血清半減期を示す。
実施例７
マウス角膜マイクロポケット血管新生アッセイ
配列番号２０及び２１の各ＶＥＧＦ結合ＶＨ及びＶＬと、配列番号２８及び２９のＡＮＧ－２結合ＶＨ及びＶＬとを有する二重特異性＜ＶＥＧＦ－ＡＮＧ－２＞抗体の、in vivoにおけるＶＥＧＦ誘導性血管新生に対する抗血管新生効果を試験するために、マウス角膜マイクロポケット血管新生アッセイを実施した。このアッセイでは、角膜縁血管に対して一定距離の場所において、ＶＥＧＦ浸漬Nylafloディスクを無血管角膜のポケットに移植した。血管は、発達中のＶＥＧＦ勾配に向かって角膜に直ぐに成長する。８～１０週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Charles River, Sulzfeld, Germanyから購入した。Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550によって記載されている方法にしたがって、プロトコールを改変した。簡潔に言えば、麻酔マウスにおいて、手術用ナイフ及び鋭いピンセットを使用して、角膜縁から角膜上部までの約１mmの場所に、幅約５００μmのマイクロポケットを顕微鏡下で調製した。直径０．６mmのディスク（Nylaflo（登録商標）, Pall Corporation, Michigan）を移植し、移植領域の表面を滑らかにした。対応する成長因子又はビヒクル中で、ディスクを少なくとも３０分間インキュベーションした。３日間、５日間及び７日間後において（又はあるいは、３日間、５日間又は７日間後にのみ）、眼を撮影し、血管反応を測定した。総角膜面積当たりの新たな血管面積の割合を計算することによって、アッセイを定量した。
ＶＥＧＦ ３００ng又はＰＢＳ（コントロールとして）でディスクをロードし、７日間移植した。３日目、５日目及び／又は７日目に、角膜縁からディスクまでの血管の伸長を経時的にモニタリングした。in vivoにおけるＶＥＧＦ誘導性血管新生に対する抗血管新生効果を試験するために、ディスク移植の１日前に、抗体を用量１０mg/kgで静脈内投与した（静脈内適用であるため、（ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異を有しない）血清安定ＶＥＧＦａｎｇ２－００１５（これは、ＩＨＨ－ＡＡＡ突然変異の点においてのみＶＥＧＦａｎｇ２－００１６と異なり、有効性を媒介するための同じ抗ＶＥＧＦ及び抗ＡＮＧ－２ ＶＨ及びＶＬを有する）を代わりに使用した）。コントロール群の動物にはビヒクルを投与する。適用容量は、１０mL/kgであった。
実施例８
ＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異を有する抗体の薬物動態（ＰＫ）特性
ヒトＦｃＲｎについてトランスジェニックなＦｃＲｎマウスのＰＫデータ
生活相において：
本研究には、マウスＦｃＲｎ欠損性であるが、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックな雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（バックグラウンド）（ｈｕＦｃＲｎ、２７６－／ｔｇ系統）が含まれていた。
パート１：
ＩＧＦ－１Ｒ００３３、ＩＧＦ－１Ｒ００３５、ＩＧＦ－１Ｒ００４５の適切な溶液（すなわち、化合物２２．２μg／動物のＩＧＦ－１Ｒ００３３、化合物２４．４μg／動物のＩＧＦ－１Ｒ００３５、化合物３２．０μg／動物のＩＧＦ－１Ｒ及び化合物３２．０μg／動物のＩＧＦ－１Ｒ００４５）を全てのマウスの右眼に１回硝子体内注射した。
１３匹のマウスを２つのグループ（それぞれ動物６匹及び７匹）に分けた。グループ１からは投与２時間後、２４時間後及び９６時間後において、並びにグループ２からは投与７時間後、４８時間後及び１６８時間後において、血液サンプルを採取する。
World Precision Instruments, Inc., Berlin, Germanyのナノリットル注射用NanoFil Microsyringe systemを使用することによって、マウス右眼の硝子体への注射を実施した。２．５％イソフルランでマウスを麻酔し、マウスの眼の可視化のために、倍率４０倍及びLeica KL 2500 LCDライトニングのリングライトと共にLeica MZFL 3顕微鏡を使用した。続いて、３５ゲージ針を使用して、化合物２μLを注射した。
血清中の化合物レベルを決定するために、各動物の対側眼の眼球後静脈叢を介して血液を採取した。
室温で１時間経過後、４℃で３分間遠心分離（９，３００×ｇ）することによって、血液から血清サンプル少なくとも５０μLを得た。遠心分離直後に血清サンプルを凍結し、分析まで－８０℃で凍結保存した。処置９６時間後にグループ１の動物の処置眼を単離し、処置１６８時間後にグループ２の動物の処置眼を単離した。サンプルを分析まで－８０℃で凍結保存した。
パート２
ＩＧＦ－１Ｒ００３３、ＩＧＦ－１Ｒ００３５、ＩＧＦ－１Ｒ００４５の適切な溶液（すなわち、化合物２２．２μg／動物のＩＧＦ－１Ｒ００３３、化合物２４．４μg／動物のＩＧＦ－１Ｒ００３５、化合物３２．０μg／動物のＩＧＦ－１Ｒ及び化合物３２．０μg／動物のＩＧＦ－１Ｒ００４５）を全てのマウスに尾静脈を介して１回静脈内注射した。
１２匹のマウスを２つのグループ（それぞれ動物６匹）に分けた。グループ１からは投与１時間後、２４時間後及び９６時間後において、並びにグループ２からは投与７時間後、４８時間後及び１６８時間後において、血液サンプルを採取する。血清中の化合物レベルを決定するために、各動物の眼球後静脈叢を介して血液を採取した。
室温で１時間経過後、４℃で３分間遠心分離（９，３００×ｇ）することによって、血液から血清サンプル少なくとも５０μLを得た。遠心分離直後に血清サンプルを凍結し、分析まで－８０℃で凍結保存した。
細胞溶解緩衝液の調製
ファクター１ １００μL、ファクター２ ５０μL及び細胞溶解緩衝液２４．７３mL（これらは全て、Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011のものである）を慎重に混合し、ＰＭＳＦ溶液１２５μL（ＤＭＳＯ ２．０mL中で希釈したフェニルメチルスルホニルフルオライド１７４．４mg）を追加した。
全眼溶解物の調製（マウス）
実験動物の眼全体の物理化学的な分解によって、眼溶解物を得た。機械的破壊のために、円錐形の底部を有する１．５mLマイクロバイアルに各眼を移した。解凍後、細胞洗浄緩衝液１mL（Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011)で眼を１回洗浄した。次の工程では、新たに調製した細胞溶解緩衝液５００μLを追加し、１．５mL組織粉砕乳棒（VWR Int., Art. No. 431-0098）を使用して眼を粉砕した。次いで、混合物を５回凍結解凍し、再度粉砕した。残りの組織から溶解物を分離するために、サンプルを４５００×ｇで４分間遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、定量ＥＬＩＳＡでのさらなる分析まで－２０℃で保存した。
分析（血清）
マウス血清サンプル中の抗体を定量するために、捕捉抗体及び検出抗体としてビオチン化及びジゴキシゲニン化モノクローナル抗体を用いる標準的な固相シリアルサンドイッチイムノアッセイを実施する。血清は、全血液サンプル容量の約５０％を占める。
ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）特異的酵素結合免疫吸着アッセイによって、マウス血清サンプル中のより詳細な抗体濃度を決定した。アッセイ緩衝液で希釈したビオチン化抗ヒトＦａｂ（カッパ）モノクローナル抗体Ｍ－１．７．１０－ＩｇＧ（捕捉抗体として）と共にストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートを撹拌しながら室温で１時間インキュベーションした。リン酸緩衝生理食塩水－ポリソルベート２０（Tween20）で３回洗浄した後、様々な希釈の血清サンプルを追加し、次いで、２回目のインキュベーションを室温で１時間行った。３回反復洗浄した後、続いて、ジゴキシゲニンコンジュゲート抗ヒトＦａｂ（ＣＨ１）モノクローナル抗体Ｍ－１．１９．３１－ＩｇＧと共にインキュベーションし、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベーションすることによって、結合した抗体を検出した。ABTS（２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）をＨＲＰ基質として使用して、発色反応生成物を形成した。得られた反応生成物の吸光度を４０５nm（ABTS；参照波長；４９０nm）で読んだ。
全てのサンプル、ポジティブコントロールサンプル及びネガティブコントロールサンプルを繰り返して分析し、規定の抗体標準に対して較正した。
分析（眼溶解物）
非ＧＬＰ条件下でELECSYS（登録商標）機器プラットフォーム（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）に基づく適格な電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）法を使用して、マウス眼溶解物サンプル中の分析物の濃度を決定した。
非希釈上清（眼溶解物）を捕捉分子及び検出分子と共に３７℃で９分間インキュベーションした。ビオチン化抗ヒトＦａｂ（カッパ）モノクローナル抗体Ｍ－１．７．１０－ＩｇＧを捕捉分子として使用し、ルテニウム（ＩＩ）トリス（ビスピリジル）３ ２＋標識抗ヒト－Ｆａｂ（ＣＨ１）モノクローナル抗体Ｍ－１．１９．３１－ＩｇＧを検出に使用した。ストレプトアビジンコーティング磁性微粒子を追加し、３７℃でさらに９分間インキュベーションして、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用による予形成免疫複合体の結合を可能にした。微粒子を電極上に磁気的に補足し、共反応物質トリプロピルアミン（ＴＰＡ）を使用して化学発光シグナルを発生させた。光電子増倍管検出器によって、得られたシグナルを測定した。
Figure 0007426190000063
Figure 0007426190000064
Figure 0007426190000065
結果：
Ａ）血清濃度
血清濃度の結果を以下の表及び図１７に示す。
Figure 0007426190000066
Figure 0007426190000067
Figure 0007426190000068
Figure 0007426190000069
結果：
Ｂ）左眼及び右眼の眼溶解物中濃度
眼溶解物中濃度の結果を以下の表及び図１８～２０に示す。
Figure 0007426190000070
Figure 0007426190000071
Figure 0007426190000072
Figure 0007426190000073
Figure 0007426190000074
Figure 0007426190000075
Figure 0007426190000076
結果の概要：
硝子体内適用後、（片側又は両側のＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異を有する）本明細書で報告される抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体００３５及び００４５は、ＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異を有しない抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体（ＩＧＦ－１Ｒ００３３）と比較して、類似の眼溶解物中濃度（９６時間後及び１６８時間後）を示す。
また加えて、硝子体内適用後、（片側又は両側のＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異を有する）本明細書で報告される抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体００３５及び００４５は、ＨＨＹ－ＡＡＡ突然変異を有しない抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体（ＩＧＦ－１Ｒ００３３）と比較して、速いクリアランス及び短い血清半減期を示す。
理解を明確にする目的のために、例示及び実施例によって上記本発明をいくらか詳細に説明したが、前記説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

Claims (13)

  1. 第１のＦｃ領域ポリペプチドと、第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含む抗体であって、
    ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、
    －ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
    －ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域ポリペプチド、又は
    －ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド
    を含む群から選択され、
    ｉｉ）第２のＦｃ領域ポリペプチドが、
    －ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域ポリペプチド、
    －ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域ポリペプチド、又は
    －ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ポリペプチド
    を含む群から選択され、及び
    ｉｉｉ）第１の及び第２のＦｃ領域ポリペプチドが突然変異Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａを含む（ナンバリングは、KabatのＥＵインデックスナンバリングシステムに従う）、
    抗体。
  2. 二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項１に係る抗体。
  3. 二価抗体であることを特徴とする、請求項１～２のいずれか１つに係る抗体。
  4. ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、
    － ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、及び
    － 突然変異Ｋ３９２Ｄを有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４
    を含む群から選択され、
    及び
    ｉｉ）第２のＦｃ領域ポリペプチドが、
    － ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域 ポリペプチド、
    － 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド、
    － 突然変異Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３５６Ｋ及び／又はＥ３５７Ｋを有するヒトＩｇＧ１、並びに
    － 突然変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ及び／又はＥ３５７Ｋを有するヒトＩｇＧ２、又はＩｇＧ４
    を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１つに係る抗体。
  5. ｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドがヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドがヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｉｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｖ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｖｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドがヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドがヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｖｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｖｉｉｉ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｉｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであるか、又は
    ｘ）第１のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであり、第２のＦｃ領域ポリペプチドが、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１つに係る抗体。
  6. 二重特異性抗体が、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する１つの結合特異性と、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する１つの結合特異性とを有することを特徴とする、請求項２～５のいずれか１つに係る抗体。
  7. ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含み、
    ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１４のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１６のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１７のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、
    ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号２２のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号２４のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２５のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、請求項２～６のいずれか１つに係る抗体。
  8. ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含み、
    ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号２０のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
    ｉｉ）ＡＮＧ－２に特異的に結合する第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号２８のアミノ酸配列、及び軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号２９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２～７のいずれか１つに係る抗体。
  9. 医薬として使用するための、請求項１～８のいずれか１つに係る抗体。
  10. 眼血管疾患を処置するのに使用するための、請求項１～８のいずれか１つに係る抗体。
  11. 請求項１～８のいずれか１つに係る抗体を含む、医薬製剤。
  12. 眼血管疾患を処置するのに使用するための医薬製剤であって、請求項１～８のいずれか１つに係る抗体を含む、医薬製剤。
  13. 眼血管疾患を処置するための医薬を製造するための、請求項１～８のいずれか１つに係る抗体の使用。
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