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PT2099823E - Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações - Google Patents

Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações Download PDF

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PT2099823E
PT2099823E PT78689668T PT07868966T PT2099823E PT 2099823 E PT2099823 E PT 2099823E PT 78689668 T PT78689668 T PT 78689668T PT 07868966 T PT07868966 T PT 07868966T PT 2099823 E PT2099823 E PT 2099823E
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PT
Portugal
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antibody
agent
quot
binding
variant
Prior art date
Application number
PT78689668T
Other languages
English (en)
Inventor
Charlotte Mcdonagh
Paul Carter
Django Sussman
Original Assignee
Seattle Genetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39493020&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT2099823(E) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Seattle Genetics Inc filed Critical Seattle Genetics Inc
Publication of PT2099823E publication Critical patent/PT2099823E/pt

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    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
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Description

ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações"
ANTECEDENTES DO INVENTO A conjugação de anticorpo a fármacos citotóxicos é uma das vias mais promissoras para melhorar a actividade terapêutica de anticorpos e reduzir a toxicidade sistémica de fármacos. Pelo menos seis conjugados anticorpo-fármaco (ADC) progrediram para desenvolvimento clinico. Uma caracteristica dos anticorpos que potencialmente limita o índice terapêutico (i.e., dose tolerada máxima/dose curativa mínima) de um ADC é toxicidade para um não alvo. Tal especificidade pode ser específica ou não específica. A absorção de ADC pelo não alvo pode levar ao catabolismo de ADC, libertação do fármaco e/ou toxicidade.
Assim, existe necessidade de ADC e outros agentes de ligação ao alvo que possam exercer um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador clinicamente útil nas células alvo, especialmente sem exercer efeitos indesejáveis em células que não são alvo. Tais ADC e outros agentes de ligação ao alvo seriam agentes terapêuticos úteis contra cancros que expressam um antigénio alvo ou doenças imunitárias que expressam antigénios alvo. O presente invento cumpre estas e outras necessidades. (A citação de qualquer referência neste pedido não constitui admissão que tal referência é especialidade anterior a este pedido).
SUMÁRIO SUCINTO DO INVENTO O presente invento proporciona conjugados de anticorpo variante e fármaco (ADC) e agentes de ligação ao alvo variantes relacionados e métodos relativos ao uso de tais ADC e agentes de ligação para a profilaxia ou tratamento de cancros e doenças imunológicas. Os ADC variantes e agentes de ligação ao alvo variantes relacionados, sozinhos ou em 2 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ combinação com um agente terapêutico, exercem um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador em células alvo.
Num aspecto, o invento proporciona um agente de ligação ao alvo variante, compreendendo uma região de ligação compreendendo uma região Fv de anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especif icamente a um antigénio alvo; uma região Fc de uma região constante de IgGl de imunoglobulina humana, a região Fc compreendendo pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido envolvido na interacção de ligação de um receptor IIIA de Fc gama (Fc ) com a região Fc; em que pelo menos uma substituição compreende introdução de um resíduo de cisteína na posição de aminoácido 239 da região Fc, que é S239C de acordo com o índice EU tal como apresentado em Kabat; e um agente terapêutico que exerce um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador conjugado directa ou indirectamente ao resíduo de cisteína introduzido; em que o agente de ligação ao alvo variante exerce um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador numa célula que expressa o antigénio alvo; e em que o agente de ligação ao alvo variante apresenta ligação reduzida a um receptor Fc IIIA. O agente de ligio ao alvo variante liga-se especificamente a um antigénio alvo e inclui pelo menos uma CDR ou região variável de um anticorpo. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo variante é um anticorpo. O agente de ligação ao alvo variante inclui pelo menos uma modificação (e.g., uma substituição, adição ou deleção de aminoácido) num domínio (e.g., uma região de uma Fc, também denominada uma região Fc) ou próximo deste que medeia a ligação a um ou mais receptores Fc , resultando numa ligação enfraquecida a um ou mais receptores Fc . O agente de ligação ao alvo variante pode apresentar respostas de ADCC, ADCP e/ou CDC reduzidas. Pelo menos uma modificação é a substituição de um resíduo de aminoácido envolvido na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc com cisteína.
Noutro aspecto, o invento proporciona o agente de ligação ao alvo variante para uso no tratamento de um cancro que 3 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ expressa um antigénio alvo num indivíduo. O tratamento geralmente inclui administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente de ligação ao alvo variante. O agente de ligação ao alvo variante liga-se especificamente a um antigénio alvo e inclui pelo menos uma CDR ou região variável de um anticorpo. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo variante é um anticorpo. O agente de ligação ao alvo variante inclui pelo menos uma modificação (e.g., uma substituição, adição ou deleção de aminoácido) num domínio ou (e.g., uma região Fc) ou próximo deste envolvido na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc resultando numa ligação enfraquecida a um ou mais receptores Fc . O agente de ligão ao alvo variante pode apresentar respostas de ADCC, ADCP e/ou CDC reduzidas. Pelo menos uma modificação é a substituição de um resíduo de aminoácido envolvido na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc com cislsa. A substituição de aminoácido afecta a interacção de ligação da região Fc com o receptor Fc RlIIa. A substitção de aminoácido do aminoácido nativo para um resíduo de cisteína é introduzida na posição de aminoácido 239. O agente de ligação ao alvo variante pode ser, por exemplo, um anticorpo. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo (e.g. anticorpo) liga-se especificamente a CD20, CD30, CD33 ou CD70. Em algumas concretizações, o anticorpo variante compete para ligação a CD70 com anticorpo monoclonal 1F6 ou 2F2. Noutras concretizações, o anticorpo é uma variante de anticorpo 1F6 humanizado. O anticorpo pode ser, por exemplo, monovalente, bivalente ou multivalente.
O cancro pode ser, por exemplo, um tumor renal, um linfoma de células B, um carcinoma do cólon, doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma não Hodgkin, um linfoma de células do manto, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda, um carcinoma nasofaríngeo, tumor cerebral ou um carcinoma tímico. O tumor renal pode ser, por exemplo, um carcinoma de células renais. O 4 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ tumor cerebral pode ser, por exemplo, um glioma, um glioblastoma, um astrocitoma ou um meningioma. O indivíduo pode ser, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano.
Também descrevemos o agente de ligação ao alvo variante para uso num método para tratar uma doença imunológica. O tratamento inclui administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um agente de ligação ao alvo variante. O agente de ligação ao alvo variante liga-se especificamente a um antigénio alvo numa célula imunitária e inclui pelo menos uma CDR ou região variável de um anticorpo. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo variante é um anticorpo. O agente de ligação ao alvo variante inclui pelo menos uma modificação (e.g., uma substituição, adição ou deleção de aminoácido) num domínio (e.g., uma região Fc) ou próximo deste envolvido na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc , resultando em ligação enfraquecida a um ou mais receptores Fc . O agente de ligão ao alvo variante pode apresentar respostas de ADCC, ADCP e/ou CDC reduzidas no indivíduo. Pelo menos uma modificação é a substituição de um resíduo de aminoácido envolvido na interacção de ligação da região Fc com um ou mais receptores Fc com cisiea. 0 agente de ligação ao alvo variante pode ser, por exemplo, um anticorpo. Em algumas concretizações, o anticorpo inclui uma região constante humana. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo (e.g., anticorpo) liga-se especificamente a CD19, CD20, CD30 ou CD70. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo variante compete para ligação a CD70 com anticorpo monoclonal 1F6 ou 2F2. Noutras concretizações, o anticorpo é uma variante de anticorpo 1F6 humanizado. O anticorpo pode ser, por exemplo, monovalente, bivalente ou multivalente. A doença imunológica pode ser, por exemplo, uma doença imunológica mediada por células T. Em algumas concretizações, a doença imunológica mediada por células T compreende células T activadas. Em algumas concretizações, as células T activadas 5 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ expressam CD70. Em algumas concretizações, as células T em repouso não são eliminadas substancialmente por administração do agente de ligação ao alvo variante. A doença imunológica mediada por células T pode também ser, por exemplo, artrite reumatóide, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistémico (LES), diabetes de tipo I, asma, dermatite atópica, rinite alérgica, púrpura trombocitopénica, esclerose múltipla, psoriase, sindrome de Sjõgren, tiroidite de Hashimoto, doença de Graves, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, tuberculose ou doença de enxerto contra hospedeiro. Noutras concretizações, a doença imunológica é uma doença activada por linfócitos B. O indivíduo pode ser, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano.
Num aspecto relacionado também se proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de um cancro ou de uma doença imunológica. A composição farmacêutica inclui um agente de ligação ao alvo variante ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e pelo menos um ingrediente farmaceuticamente compatível. Proporciona-se adicionalmente um kit farmacêutico incluindo um primeiro recipiente compreendendo um agente de ligação ao alvo variante, em que o agente está liofilizado, e um segundo recipiente compreendendo um diluente farmaceuticamente aceitável. O presente invento pode ser entendido mais completamente por referência à seguinte descrição detalhada do invento, exemplos não limitativos de concretizações específicas do invento e às figuras e listagem de sequências em anexo.
DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS
Rllb
A figura 1 é um diagrama esquemático que representa a interacção mediada por anticorpo entre células efectoras e células alvo (e.g., células de tumor). Levam-se células efectoras com receptores Fc gama (Fc ), Fc RI (CD64), Fc (CD32b) ou Fc RUIa (CD16), para a proximidade deéèulas de tumor através da ligação do domínio Fc de anticorpos que se ligam a antigénios na superfície da célula de tumor. Fc RI 6 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ induz actividade de ADCC, Fc Rllb induz actividade de inibição e Fc RlIIa induz actividade de ADCP nas células de tumor que são alvo do anticorpo. Fc RI, Fc Rllb e Fc RlIIa são expressos numa variedade de tecidos normais, leucócitos, todas as células derivadas de mielóide, células endoteliais e algumas células epiteliais. A figura 2 apresenta as sequências de aminoácidos dos domínios constantes humanos dos isotipos (A) IgGl (SEQ ID NO:31), (B) IgG2 (SEQ ID NO:32), (C) IgG3 (SEQ ID NO:33) e (D)
IgG4 (SEQ ID NO:34). A figura 3 apresenta as sequências de aminoácidos das
variantes de isotipo (A) IgGl (SEQ ID NO:35), (B) IgG2 (SEQ ID NO:36) e (C) IgG4 (SEQ ID NO:37) do derivado HJLA de anticorpo 1F6 humanizado. A sequência de aminoácidos de hlF6 IgGl é a mesma de SEQ ID NO:16. A figura 4 apresenta as sequências de aminoácidos das variantes de domínio Fc de (A) IgGlvl (SEQ ID NO: 38) e (B)
IgG4v3 (SEQ ID NO:39) do derivado HJLA de anticorpo 1F6 humanizado. (A) hlF6 IgGlvl difere de hlF6 IgGl em três substituições de aminoácidos: E233P, L234V e L235A (sistema de numeração de Kabat), que correspondem aos aminoácidos 253-255, respectivamente (sublinhados na figura). (B) 1F6 IgG4v3 difere de hlF6 IgG4 em quatro substituições de aminoácidos: S228P, L235A, G237A e E318A (numeração de Kabat), que correspondem aos aminoácidos 245, 252, 254 e 335, respectivamente (sublinhados na figura). A figura 5 é um diagrama esquemático representando a estrutura de anticorpos anti-CD70 humanizados (hlF6) e variante hlF6. Gl, G2 e G4 indicam anticorpos com as regiões constantes dos isotipos IgGl, IgG2 e IgG4, respectivamente.
Glvl indica a variante lhF6 IgGl com as substituições de aminoácidos E233P, L234V e L235A, que resultam numa ligação enfraquecida a Fc R. G4v3 indica a variante lhF6 IgG4 com as substituições de aminoácidos S228P, L235A, G237A e E318A, que resultam numa ligação enfraquecida a Fc R. 7 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ A figura 6 apresenta a afinidade de ligação de anticorpos anti-CD70 humanizados (hlF6) e variante hlF6 para células 780-0 que expressam CD70. Cada anticorpo (Gl, Glvl, G2, G4 e G4v3, tal como indicado) foi reduzido e marcado com Alexa Fluor 488 C5 maleimida (AF488) e incubaram-se diluições em série com células 786-0. Detectaram-se células marcadas usando um analisador FACS LSRII e analisaram-se os dados usando uma equação de modelo de ligação de um local usando Prism v4.01.
Os dados de afinidade de ligação aparente indicam que a alteração do isotipo IgG (Gl, G2, G4) ou mutação do esqueleto Fc (Glvl, G4v3) não afecta a ligação a antigénio. A figura 7 apresenta a expressão de superfície celular de Fc RUIa eméòulas CHO transfectadas. Analisaram-se a linha celular parental, CHO DG44 e duas linhas celulares transfectadas estavelmente com um vector de expressão Fc RlIIa completo, 158F e 158V, por FACS usando um anticorpo anti-Fc RlIIa humano conjugado a ficoeritrina (PE). A figura 8 apresenta a ligação de anticorpos anti-CD70 humanizados (hlF6) a células CHO que expressam Fc RlIIa completo. A linha celular parental, CHO DG44 e duas linhas celulares transfectadas estavelmente com um vector de expressão Fc RlIIa completo158F e 158V foram incubadas com anticorpo hlF6 marcado com AF488. Detectaram-se as células marcadas usando um analisador FACS LSRII. A figura 9 apresenta a ligação de competição de anticorpos anti-CD70 humanizados (hlF6) e variante hlF6 a células CHO que expressam Fc RlIIa completo. Isolou-se uma linha de células CHO estável que expressa Fc RlIIa humano completo, 158V, por clonagem por diluição limitante e combinou-se com diluições em série de hlF6 IgGl parental ou variantes hlF6 na presença de hlF6 IgGl marcado com Alexa Fluor 488 100 nM. Detectaram-se as células marcadas usando um analisador FACS LSRII. As interacções de ligação de hlF6 IgGl e variantes hlF6 a células que expressam Fc RlIIa foram compáireis aos relatos da literatura. Apenas hlF6 IgGl (triângulo branco) interactuou 8 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ significativamente com Fc RlIIa (painel da esquerda). A conjugação de hlF6 IgGl com o derivado MMAF de auristatina não afectou a ligação do anticorpo a Fc RlIIa (painel da direita). A figura 10 apresenta a ligação de competição de anticorpos anti-CD70 humanizados (hlF6) e variantes hlF6 a células CHO que expressam Fc RI completo. Isoleiâe uma linha celular CHO estável que expressa Fc RI humano completo por clonagem por diluição limitada e combinou-se com diluições em série de hlF6 IgGl parental ou variantes hlF6 na presença de hlF6 IgGl marcado com Alexa Fluor 488 50 nM. Detectaram-se as células marcadas usando um analisador FACS LSRII. As interacções de ligação de hlF6 IgGl e variantes hlF6 a ambos os Fc RI foram compáveis com os relatos da literatura. hlF6 IgGl (triângulos branco) e hlF6 IgG4 (triângulos brancos invertidos) apresentaram um padrão semelhante de elevada afinidade de ligação a Fc RI, enquanto ãa se verificou qualquer interacção significativa com as outras variantes, IgGlvl (losango branco), IgG2 (quadrado branco) e IgG4v3 (circulo branco) (painel da esquerda). A conjugação de hlF6 IgGl ou hlF6 IgG4 com o derivado de auristatina MMAF (IgGl-F4 e IgG4-F4, respectivamente) não afectou a ligação destes anticorpos a Fc RI (painel da direita). A figura 11 apresenta a ligação de competição de uma variante de anticorpos hlF6 com a substituição de cisteína introduzida, S239C, em células CHO que expressam Fc RlIIa completo (painel da esquerda) ou Fc RI (painel da direita). Os ensaios foram efectuados tal como descrito anteriormente. A variante IgGl S239C, quer não conjugada, quer conjugada a vcMMAF (média de 2 fármacos/anticorpo) apresentou ligação reduzida a células que expressam Fc RlIIa, mas não a células que expressam Fc RI. 0 controlo, anticorpo hlF6 parental, liga-se a células que expressam Fc RlIIae células que expressam Fc RI. A figura 12 apresenta a eficácia in vivo de conjugados com fármaco de anticorpo anti-CD70 humanizado (hlF6) e variante hlF6 num modelo de xenoenxerto de carcinoma de células renais 9 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 786-0. Trataram-se ratinhos nus, que tinham sido injectados subcutaneamente com células de carcinoma de células renais 786-0, com uma única administração i.v. de 0,5 mg/kg (painel superior) ou 1,5 mg/kg (painel inferior) do conjugado indicado de anticorpo hlF6 ou variante hlF6 e fármaco MMAF quando o volume médio de tumor atingiu 100 mm3. Dosearam-se nove (9) animais para cada grupo de tratamento e dosearam-se seis (6) animais apenas com veiculo. Os estudos de eficácia in vivo indicaram que: hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (losangos) tem eficácia aumentada comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (triângulos); hlF6 IgG2 v cMMAF 4 (círculos) também apresentou eficácia melhorada comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (triângulos); hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (quadrados) tem uma eficácia equivalente comparativamente a hlF6 IgG4 vcMMAF4 (triângulos invertidos); e hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (losangos) têm eficácia melhorada comparativamente a hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (quadrados). A figura 13 apresenta a eficácia in vivo de conjugados de fármaco e anticorpo anti-CD70 humanizado (hlF6) e variante hlF6 num modelo de xenoenxerto de carcinoma de células renais 786-0. Trataram-se ratinhos nus, que tinham sido injectados subcutaneamente com células de carcinoma de células renais 786-0, com uma única administração i.v. de 0,5 mg/kg ou 1,5 mg/kg do conjugado indicado de anticorpo hlF6 ou variante hlF6 com fármaco MMAF quando o volume médio de tumor atingiu 100 mm3. Dosearam-se nove (9) animais para cada grupo de tratamento e dosearam-se seis (6) animais apenas com veículo. Os estudos de eficácia in vivo indicaram que: hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (losangos) tem eficácia aumentada comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (quadrados) ; hlF6 IgG2 vcMMAF4 (triângulos) também tem eficácia aumentada comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (quadrados); hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (cruzes) tem eficácia equivalente comparativamente a hlF6 IgG4 vcMMAF4 (círculos); e hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (losangos) tem eficácia aumentada comparativamente a hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (cruzes). A figura 14 apresenta a eficácia in vivo de conjugados de fármaco e anticorpo anti-CD70 humanizado (hlF6) num modelo de xenoenxerto de carcinoma de células renais 786-0. Trataram-se 10 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ ratinhos nus, que tinham sido injectados subcutaneamente com células de carcinoma de células renais 786-0, com uma única administração i.v. de 1,5 mg/kg ou 4,5 mg/kg de cada conjugado variante hlF6-mcMMAF quando o volume médio de tumor atingiu 100 mm3. Os estudos de eficácia in vivo indicaram que: hlF6 IgGlvl mcMMAF4 (losangos) tem eficácia aumentada comparativamente a hlF6 IgGl mcMMAF4 (triângulos); hlF6 IgG2 vcMMAF4 (quadrados) também tem eficácia aumentada comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (triângulos). A figura 15 apresenta a eficácia in vivo de conjugados de fármaco e anticorpo anti-CD70 humanizado (hlF6) num modelo de xenoenxerto de carcinoma células renais UMRC-3. Trataram-se ratinhos nus, que tinham sido injectados subcutaneamente com células de carcinoma células renais UMRC-3 com administração i.v. q4dx4 de veiculo (não tratado), anticorpo hlF6 a 10 mg/kg, conjugado de anticorpo hlF6-fármaco MMAF hlF6 vcMMAF4 a 3 mg/kg, conjugado de anticorpo hlF6-fármaco MMAF hlF6 mcMMAF a 10 mg/kg ou conjugado de anticorpo de controlo-fármaco MMAF cAClO vcMMAF a 3 mg/kg quando o volume médio de tumor atingiu 100 mm3. Dosearam-se nove (9) animais para cada grupo de tratamento e dosearam-se seis (6) animais apenas com veiculo. Os estudos de eficácia in vivo indicaram que: hlF6 vcMMAF4 (quadrados azuis) e hlF6 mcMMAF (quadrados vermelhos) têm eficácia comparável a hlF6 não conjugado (quadrados brancos) ou a um conjugado de anticorpo de controlo cAClO e fármaco MMAF (triângulos). A figura 16 apresenta a eficácia in vivo de conjugados de fármaco e anticorpo anti-CD70 humanizado (hlF6) e variantes num modelo de xenoenxerto de carcinoma de células renais UMRC-3. Injectaram-se ratinhos nus subcutaneamente com células de carcinoma de células renais UMRC-3. Iniciou-se o tratamento com as quantidades indicadas de anticorpo quando o volume de tumor atingiu aproximadamente 100 mm3. Relativamente ao painel A, os animais foram doseados i.v. q4dx4 sem anticorpo (não tratados), 1 mg/kg ou 3 mg/kg de 1F6vcMMAF4, lF6GlvlvcMMAF4, lF6G2vcMMAF4, lF6G4vcMMAF4 ou 1F6G4v3vcMMAF4. O ponto final do estudo medido foi volume de tumor. Relativamente ao painel b, 11 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ os animais foram doseados i.v. q4dx4 sem anticorpo (não tratados), 3 mg/kg ou 6 mg/kg de 1F6vcMMAF4, 1F6G1v1vcMMAF4, 1F6G2vcMMAF4, 1F6G4vcMMAF4 ou 1F6G4v3vcMMAF4. O ponto final do estudo medido foi volume de tumor. A figura 17 apresenta a farmacocinética in vivo de conjugados de anticorpo anti-CD70 humanizado (hlF6) e variante hlF6 com fármaco. Trataram-se os ratinhos tal como descrito na figura 11. Retirou-se sangue de três (3) ratinhos tratados com a dose de 1,5 mg/kg de cada conjugado de anticorpo hlF6 ou variante hlF6 com fármaco MMAF 1 h, 1 d, 7 d e 14 d após a administração de fármaco. Mediram-se as concentrações séricas dos conjugados de anticorpo e fármaco nestes pontos temporais usando um ELISA de ligação anti-idiotipo. hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (triângulos) e hlF6 IgG2 vcMMAF4 (triângulos invertidos) depuraram mais lentamente de circulação comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (quadrados) . hlF6 IgG4 vcMMAF4 (losangos) e hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (círculos) depuraram mais lentamente de circulação comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (quadrados).
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento proporciona agentes de ligação ao alvo variantes. Também descrevemos métodos para usar tais agentes de ligação para a profilaxia ou tratamento de cancros e doenças imunológicas. Os agentes de ligação ao alvo variantes incluem uma região de ligação que se liga especificamente a um antigénio alvo (e.g., do domínio extracelular da molécula alvo) . Os agentes de ligação ao alvo variantes incluem pelo menos uma modificação (e.g., substituição, adição ou deleção de aminoácido) num domínio (e.g., uma região Fc) , ou na sua proximidade, envolvido na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc , resultando numa ligão enfraquecida a receptor(es) Fc (tipicamente um receptor Fc humano). Surpreendentemente, os agentes de ligação ao alvo variantes com ligação enfraquecida a receptor(es) Fc apresentam potência aumentada contra células alvo, comparativamente ao agente de ligação não modificado comparável. O agente de ligação ao alvo variante pode também 12 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ proporcionar exposição in vivo aumentada, comparativamente ao agente de ligação não modificado (e.g.r AUC aumentada). Também se considera que tais agentes de ligação ao alvo variantes apresentarão toxicidade reduzida para não alvos, comparativamente com os seus compostos parentais não variantes. O agente de ligação ao alvo variante tem tipicamente função ADCC, ADCP e/ou CDC reduzida ou ausente. O agente de ligação ao alvo variante pode exercer um efeito citostático, citotóxico ou de imunomodulação.
Num aspecto, as composições referem-se a agentes de ligação ao alvo variantes, tais como anticorpos e derivados de anticorpos. Os agentes de ligação ao alvo variantes incluem uma região ou domínio constante de um anticorpo. A região ou domínio constante de anticorpo é do subtipo IgG. A região ou domínio constante de anticorpo tem um domínio (e.g. uma região Fc) que pode interactuar com células efectoras ou de complemento para mediar um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador resultando na depleção ou inibição da proliferação de células que expressam o alvo. A região Fc tem pelo menos uma modificação (e.g., substituição, adição ou deleção de aminoácido) de modo a enfraquecer a ligação a um ou mais que um ou mais receptores Fc e a reduzir uma ou mais funções de efector (e.g., resposta de ADCC, ADCP e/ou CDC). Pelo menos uma modificação é a substituição de um resíduo de aminoácido envolvido na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc por cisiea. Também descrevemos a substituição de três resíduos de aminoácidos contíguos envolvidos na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc por asparagina-X-serina ou asparagina-X- treonina, em que X não é prolina. O agente de ligação ao alvo variante pode ser um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado ou um seu fragmento ou derivado. Num exemplo de concretização, o anticorpo variante, seu fragmento ou derivado compete com o anticorpo monoclonal murino (mAb) 1F6 ou 2F2 para ligação a CD70 e compreende sequências de região constante de anticorpo humano. 13 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ A substituição de aminoácido afecta a interacção de ligação da região Fc com o receptor Fc RlIIa. A substituição de aminoácido do aminoácido nativo para um resíduo de cisteína é introduzida na posição de aminoácido 239.
Num exemplo de concretização, o agente de ligação ao alvo variante tem ligação ou absorção por células não alvo diminuídas. Por exemplo, a ligação ou absorção por células não alvo pode ser reduzida pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% comparativamente ao agente de ligação ao alvo não variante. Noutro exemplo de concretização, o agente de ligação ao alvo variante apresenta ligação reduzida a um ou mais receptores Fc , mas mantém a capacidade de se ligar a receptores FcRn. Num exemplo de concretização, o agente de ligação ao alvo variante exerce um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador.
Em algumas concretizações, o nível no soro sanguíneo do agente de ligação ao alvo variante é aumentado relativamente ao agente de ligação ao alvo não variante. Por exemplo, o nível no soro sanguíneo do agente de ligação ao alvo variante pode aumentar pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% relativamente ao agente de ligação ao alvo não variante.
Em algumas concretizações, a semivida no soro sanguíneo do agente de ligação ao alvo variante é aumentada relativamente a um agente de ligação ao alvo não variante. Por exemplo, a semivida no soro sanguíneo do agente de ligação ao alvo variante pode aumentar pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% relativamente a um agente de ligação ao alvo não variante.
Em algumas concretizações, a potência do agente de ligação ao alvo variante é aumentada relativamente a um agente de 14 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ ligação ao alvo não variante. Por exemplo, a potência do agente de ligação ao alvo variante pode aumentar pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% relativamente a um agente de ligação ao alvo não variante.
Também se incluem composições farmacêuticas compreendendo um agente de ligação ao alvo variante e um ingrediente (e.g., transportador ou excipiente) farmaceuticamente compatível.
Também se incluem kits e artigos de fabrico compreendendo um agente de ligação ao alvo variante.
Para a clareza da divulgação, e sem intuitos limitativos, a descrição detalhada do invento está dividida nas subsecções, que se seguem. I. Definições e abreviaturas
Salvo indicação em contrário, todas as expressões técnicas e científicas aqui usadas têm o significado normalmente entendido por um perito na especialidade pertinente aos métodos e composições descritos. Quando aqui se usam nomes comerciais, os requerentes pretendem incluir independentemente a formulação do produto de marca registada, o fármaco genérico e o(s) ingrediente(s) activo(s) farmacêutico(s) do produto de marca registada. Tal como aqui usadas, as seguintes expressões ou frases têm os significados que lhes são atribuídos, salvo indicação em contrário.
As expressões "agente de ligação ao alvo" e "agente de ligação anti-alvo" tal como aqui usadas significam um anticorpo, ou um derivado ou um fragmento de um anticorpo ou outro agente que se liga a um antigénio alvo e compreende pelo menos uma parte de uma região Fc. A expressão "agente de ligação ao alvo" também inclui um anticorpo, ou um derivado ou um fragmento de um anticorpo ou outro agente que se liga a um antigénio alvo e compreende pelo menos uma parte de uma região 15 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Fc conjugada a um agente terapêutico que exerce um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo compreende adicionalmente pelo menos uma CDR ou região variável de um anticorpo ou um seu derivado que se liga ao antigénio alvo. A expressão "agente de ligação ao alvo" inclui "agente de ligação ao alvo variante" definido seguidamente. A expressão "conjugado anticorpo-fármaco" ou "ADC" tal como aqui usada significa um anticorpo, ou um derivado ou um fragmento de um anticorpo, ou outro agente que se liga a um antigénio alvo e compreende pelo menos uma parte de uma região
Fc conjugada a um agente terapêutico que exerce um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador. A expressão "variante" tal como aqui usada significa um agente de ligação ao alvo, tal como um anticorpo, ou um derivado ou um fragmento de um agente de ligação ao alvo, que inclui pelo menos uma modificação (e.g., substituição, adição ou deleção de aminoácido) num domínio (e.g., uma região Fc) envolvido na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc , resultando em lição enfraquecida a um ou mais receptores Fc . O agente de ligão ao alvo variante pode apresentar respostas de ADCC, ADCP e/ou CDC reduzidas ou ausentes. Uma "variante" também inclui um agente de ligação ao alvo, ou um derivado ou um fragmento de um agente de ligação ao alvo, que inclui um domínio (e.g., uma região Fc) de um domínio constante de um isotipo IgG diferente de IgGl (e.g., IgG2, IgG3 ou IgG4). A expressão "região Fc" ou "domínio Fc" refere-se à(s) região(ões) de uma região constante de anticorpo (e.g., IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) que está envolvida na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc e(g., Fc RI (CD64) , Fc Rllb (CD32b) ou Fc RlIIa (CD16) . As loca$õea das regiões ou domínios das regiões constantes de isotipo IgG são conhecidas na especialidade e são descritas, por exemplo, em Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 e Canfield e Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491 e 16 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Sondermann et al., 2000, Nature 406(6793): 267-73. As regiões ou domínios Fc incluem, por exemplo e sem limitação, a região de dobra e o domínio Ch2 . A expressão "ligação enfraquecida a um ou mais receptores Fc " ou "ligação enfraquecida a um receptor Fc " refere-se capacidade diminuída de um agente de ligação ao alvo variante para se ligar a um receptor Fc , comparativamente a um agente de ligação ao alvo não variante. Em algumas concretizações, a ligação do agente de ligação ao alvo variante a um receptor Fc é reduzida pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% relativamente a um agente de ligação ao alvo não variante.
As expressões "liga-se especificamente" e "ligação específica" significam que o agente de ligação reagirá de uma forma selectiva com o seu antigénio correspondente (e.g., CD70) e não com uma variedade de outros antigénios (e.g., moléculas diferentes de CD70).
Tal como aqui usada, a expressão "funcional" no contexto de um agente de ligação ao alvo indica que o agente de ligação é capaz de se ligar especificamente a um antigénio alvo.
As expressões "inibir" e "inibição de" tal como aqui usadas significam reduzir numa quantidade mensurável ou evitá-lo completamente. A expressão "esgotar" no contexto do efeito de um agente de ligação a células que expressam alvo refere-se a uma redução do número ou eliminação das células que expressam alvo. "Anticorpos intactos" e "imunoglobulinas intactas" são aqui definidos como glicoproteínas heterotetraméricas, tipicamente com cerca de 150 000 Dalton, compostos por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada covalentemente a uma 17 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ cadeia pesada através de uma ligação dissulfureto, formando um heterodimero. 0 heterotetrâmero é formado por ligação covalente dissulfureto entre duas cadeias pesadas idênticas de tais heterodimeros. Embora as cadeias pesada e leve estejam ligadas conjuntamente através de uma ligação dissulfureto, o número de ligações dissulfureto entre as duas cadeias pesadas varia com o isotipo de imunoglobulina (Ig). Cada cadeia pesada e leve também tem pontes dissulfureto intra-cadeia espaçadas regularmente. Cada cadeia pesada tem, no terminal amino, um domínio variável (VH) , seguido por três ou quatro domínios constantes (ChI, Ch2, Ch3 e/ou Ch4), bem como uma região de dobra (J) entre ChI e Ch2 . Cada cadeia leve tem dois domínios, um domínio variável (Vl) amino-terminal e um domínio constante (Cl) carboxilo-terminal. O domínio Vl associa-se não covalentemente ao domínio Vh, enquanto o domínio Cl está usualmente ligado covalentemente ao domínio ChI através de uma ligação dissulfureto. Pensa-se que determinados resíduos de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeias leve e pesada (Chothia et ai., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663). A expressão "hipervariável" refere-se a determinadas sequências dentro dos domínios variáveis que diferem amplamente na sequência entre anticorpos e contêm resíduos que estão directamente envolvidos na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu determinante antigénico específico. A hipervariabilidade, tanto no domínio de cadeia leve, como de cadeia pesada, está concentrada em três segmentos conhecidos como regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou ansas hipervariáveis (HVL). As CDR definem-se por comparação de sequência em Kabat et al., 1991, em: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health,
Bethesda, M.D., enquanto as HVL são definidas estruturalmente de acordo com a estrutura tridimensional do domínio variável, tal como descrito por Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917. Quando estes dois métodos resultam em identificações ligeiramente diferentes de uma CDR, prefere-se a definição estrutural. Tal como definido por Kabat (consultar 18 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Pub. No. 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, M.D., 1991), CDR-L1 está posicionado cerca dos resíduos 24-34, CDR-L2 cerca dos resíduos 50-56 e CDR-L3 cerca dos resíduos 89-97 do domínio variável de cadeia leve e a cerca de 31-35 em CDR-H1, cerca de 50-65 em CDR-H2 e cerca de 95-102 em CDR-H3 no domínio variável de cadeia pesada.
As três CDR no interior de cada cadeia pesada e leve estão separadas por regiões de esqueleto (FR), que contêm sequências que tendem a ser menos variáveis. Do terminal amino para o terminal carboxilo dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve, as FR e CDR estão arranjadas na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As FR têm uma configuração predominantemente em folha , o que aproxima as CDR no
interior de cada uma das cadeias entre si, bem como às CDR da outra cadeia. A conformação resultante contribui para o local de ligação ao antigénio (consultar Kabat et al., 1991, NIH
Publ. No. 91-3242, Vol. I, páginas 647-669), embora nem todos os resíduos CDR estejam necessariamente envolvidos directamente na ligação de antigénio.
Os resíduos FR e os domínios constantes de Ig tipicamente não estão envolvidos directamente na ligação de antigénio, mas podem contribuir para a ligação de antigénio ou mediar a função efectora do anticorpo. Alguns resíduos FR podem ter um efeito significativo na ligação de antigénio, pelo menos de três formas: 1) por ligação não covalente directamente a um epítopo; 2) por interacção com um ou mais resíduos CDR e 3) afectando a interface entre as cadeias pesada e leve. Os domínios constantes medeiam várias funções efectoras de Ig, tal como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP).
As cadeias leves de imunoglobulinas de vertebrados são atribuídas a uma de duas classes distintas, capa (k) e 19 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ lambda ( ) , com base na seqncia de aminoácidos do domínio constante. Por comparação, as cadeias pesadas de imunoglobulinas de mamífero são atribuídas a uma de cinco classes principais, de acordo com as sequências dos domínios constantes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA são divididas adicionalmente em subclasses (isotipos), e.g., IgGl, IgG2,
IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas denominam-se , , , e μ, respectivamente.
As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das classes das imunoglobulinas nativas são bem conhecidas. A expressão "anticorpo" é aqui usada no sentido mais lato e abrange especificamente anticorpos completos e nativos, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais completos), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (e.g. anticorpos biespecíficos) e seus fragmentos de anticorpo ou de ligação ao antigénio, tais como domínios variáveis e outras partes de anticorpos que apresentam uma actividade biológica pretendida, e.g. ligação a um antigénio alvo. e. g. A expressão "anticorpo monoclonal" (mAb) refere-se a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos; i.e. os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto em mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único determinante antigénico, também denominado epítopo. O adjectivo "monoclonal" é indicativo de uma população de anticorpos substancialmente homogénea dirigidos ao epítopo idêntico e não deve ser interpretado como necessitando de produção do anticorpo por qualquer método específico. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer técnica ou metodologia conhecida na especialidade; por exemplo, o método de hibridoma primeiramente descrito por Kõhler et al. , 1975, Nature 256:495 ou métodos de ADN recombinante conhecidos na especialidade (consultar, 20 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ patente U.S. Ν.2 4 816 567) . Noutro exemplo, também se podem isolar anticorpos monoclonais de bibliotecas de anticorpo de fago, usando as técnicas descritas em Clackson et al., 1991,
Nature 352: 624-628 e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597.
Contrariamente, os anticorpos numa preparação de anticorpos policlonais são tipicamente uma população heterogénea de isotipos e/ou classes de imunoglobulina e também apresentam uma variedade de especificidades de epitopos. A expressão anticorpo "quimérico", tal como aqui usada, é um tipo de anticorpo monoclonal no qual uma parte ou a sequência de aminoácidos completa numa ou mais regiões ou domínios da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga ou é derivada da sequência correspondente num anticorpo monoclonal de outras espécies ou que pertence a outra classe ou isotipo de imunoglobulina ou de uma sequência consensual. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de tais anticorpos, desde que o fragmento de anticorpo apresente a actividade biológica pretendida do seu anticorpo parental, por exemplo ligação ao mesmo epítopo (consultar, e.g. patente U.S. N.2 4 816 567; e Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad Sei. USA 81:6851-6855). Os métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na especialidade. (Consultar, e.g. Morrison, 1985. Science 229:1202; Oi et al., 1986,
BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; patentes U.S. N.2 5 807 715; 4 816 567; e 4 816 397).
As expressões "fragmento de anticorpo" referem-se a uma parte de um anticorpo completo no qual se mantém uma região variável ou uma capacidade funcional, por exemplo, ligação específica a epítopo. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem um fragmento Fab, Fab' , F(ab'2,) Fd, Fv, scFv e scFv-Fc, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, anticorpo linear, anticorpo de cadeia simples e outros anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de 21 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ anticorpos, não se lhes limitando. (Consultar Holliger e Hudson, 2005, Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.)
Um fragmento de anticorpo "Fv em cadeia simples" ou "scFv" é um derivado de Fv em cadeia simples compreendendo os domínios Vh e VL de uma anticorpo, no qual os domínios estão presentes como uma única cadeia polipeptídica e que é capaz de reconhecer e ligar antigénio. O polipéptido scFv contém opcionalmente um ligante de polipéptido posicionado entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme uma estrutura tridimensional pretendida para ligação de antigénio (consultar, e.g. Pluckthun, 1994, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore ed., Springer-Verlag, New York, p. 269-315). A expressão "diacorpo" refere-se a um pequeno fragmento de anticorpo com dois locais de ligação ao antigénio. Cada fragmento contém um domínio variável de cadeia pesada (Vh) concatenado a um domínio variável de cadeia leve (VL) para formar um polipéptido VH-VL ou VL-VH. Usando um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios Vh-Vl ligados são forçados a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia, criando dois locais de ligação ao antigénio. Descrevem-se diacorpos mais completamente, por exemplo, em EP 404097; WO 93/11161; e Hollinger et al., 1993, Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 90:6444-6448. A expressão "anticorpo linear" refere-se a anticorpos que compreendem um par de segmentos Fd em tandem (Vh-Ch1-Vh-Ch1 ) que formam um par de regiões de ligação ao antigénio. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíf icos, tal como descrito em Zapata et al., 1995,
Protein Eng. 8(10):1057-1062.
Um "anticorpo humanizado" refere-se a um derivado de sequência de aminoácidos de imunoglobulina ou seu fragmento que é capaz de se ligar a um antigénio pré-determinado e que compreende uma cadeia polipeptídica de região variável com 22 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ regiões de esqueleto que têm substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e uma ou mais CDR que têm substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina não humana.
Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são aqui denominados resíduos de "importação", que são tipicamente retirados de um domínio de anticorpo de "importação", em particular um domínio variável. Um resíduo, sequência ou anticorpo de importação tem uma afinidade e/ou especificidade pretendidas ou outras actividades biológicas pretendidas, tal como aqui discutido.
Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões de esqueleto são as de uma sequência de imunoglobulina humana, tais como, por exemplo, de uma sequência consensual ou de linha germinal. 0 anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma parte de um domínio Fc de imunoglobulina, tipicamente de uma imunoglobulina humana. Por exemplo, o anticorpo pode conter a cadeia leve, bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo pode também incluir as regiões ChI, de dobra (J), Ch2, Ch3 e/ou Ch4 da cadeia pesada, tal como adequado. O anticorpo humanizado é um IgGl. A região ou domínio constante pode incluir, por exemplo, um domínio constante de fixação de complemento quando se pretende que o anticorpo humanizado apresente actividade citotóxica (e.g. IgGl).
As regiões FR e CDR do anticorpo humanizado não têm que corresponder precisamente às sequências parentais, e.g. a CDR de importação ou a FR consensual podem ser alteradas por substituição, inserção ou deleção de pelo menos um resíduo, de 23 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ modo que ο resíduo CDR ou FR nesse local não corresponda nem ao anticorpo consensual, nem ao de importação. Tais mutações tipicamente não serão extensas. Usualmente, pelo menos 75% dos resíduos de anticorpo humanizado corresponderão aos das sequências FR e CDR parentais, mais frequentemente pelo menos 90% e com a maior frequência mais de 95%. "Célula imunitária" tal como aqui usada refere-se a uma célula de linhagem hematopoiética envolvida na regulação de uma resposta imunitária. Em concretizações típicas, uma célula imunitária é um linfócito T, um linfócito B, uma célula NK, um monócito/macrófago ou uma célula dendrítica. "Célula efectora" tal como aqui usada refere-se a uma célula que expressa um receptor de superfície para o domínio Fc de uma imunoglobulina (FcR) . Por exemplo, as células que expressam FCR de superfície para IgG, incluindo Fc RIII (CD16) , Fc RII (CD32) e Fc RIII (CD64), podem actuar como células efectoras. Tais células efectoras incluem monócitos, macrófagos, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e eosinófilos.
Um "agente terapêutico" é um agente que exerce um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador em células de cancro, células imunitárias activadas ou outra população de células alvo. Os exemplos de agentes terapêuticos incluem agentes citotóxicos, agente quimioterapêuticos, agentes citostáticos e agentes de imunomodulação.
Um "efeito citotóxico" refere-se ao esgotamento, eliminação e/ou morte de uma célula alvo. Um "agente citotóxico" refere-se a um agente que tem um efeito citotóxico numa célula. Pretende-se que a expressão inclua isótopos radioactivos (tais como I131, I125, Y90 e Re186) , agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como toxinas activas enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal e seus fragmentos. Tais agentes citotóxicos podem ser acoplados a um anticorpo, e.g. um anticorpo, e usados, por exemplo, para tratar um doente indicado para terapia com o 24 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ anticorpo. Numa concretização, "agente citotóxico" inclui anticorpos monoclonais, e.g. anticorpos usados em combinação com os anticorpos humanizados aqui descritos.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes de alquilação, tais como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina) e seus derivados; criptoficinas (em particular criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina, auristatinas (incluindo análogos monometil-auristatina E e monometil-auristatina F (consultar, e.g. pedido publicado U.S. N.2 2005-0238649, publicado a 27 de Outubro de 2005, aqui incorporado na sua globalidade); duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina; trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como antibióticos enediino (e.g., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamall e caliqueamicina phill, consultar por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186; dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos cromoproteína enediino relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, 25 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adriamycin™) (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubucina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reconstituinte de ácido fólico, tal como ácido frolinico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; democolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucideo; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona, mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2' , 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitabronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, e.g. paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gencitabina (Gemzar™); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido 26 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ (VP-16); ifasfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina (Navelbine™); novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides tal como ácido retinóico; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos anteriores. Também se incluem nesta definição agentes anti-hormonais que actuam regulando ou inibindo a acção de hormonas em tumores, tais como anti-estrogénios e moduladores de receptor de estrogénio selectivo (SERM) incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston™); inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas supra-renais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace™), exemestano, formestano, fadrozole, vorozole (Rivisor™), letrozole (Femara™) e anastrozole (Arimidex™); e anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos anteriores. A expressão "profármaco" tal como aqui usada refere-se a um precursor ou forma derivada de uma substância activa farmaceuticamente que é menos citotóxica para células de tumor comparativamente ao fármaco parental e que é capaz de ser enzimaticamente activado ou convertido para a sua forma parental mais activa. Consultar, por exemplo, Wilman, 1986, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy", em Biochemical Society Transactions, 14, p. 375-382, 615th Meeting Belfast; e Stella et ai., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, em: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), p. 247-267, Humana Press. Os profármacos úteis incluem profármacos contendo fosfato, profármacos contendo tiofosfato, profármacos contendo sulfato, profármacos contendo péptido, profármacos modificados com D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos contendo -lactama, profármacos contendo fenoxiacetamida substituída e opcionalmente 27 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ profármacos contendo fenilacetamida substituída, 5- fluorocitosina e outros profármacos 5-fluorouridina, não se lhes limitando, que podem ser convertidos no fármaco livre citotóxico mais activo. Os exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatizados para uma forma profármaco incluem os agentes quimioterapêuticos descritos anteriormente, não se lhes limitando.
Um "efeito citostático" refere-se à inibição de proliferação celular. Um "agente citostático" refere-se a um agente que tem um efeito citostático numa célula, inibindo assim o crescimento e/ou expansão de um subconjunto específico de células. A expressão "efeito de imunomodulação" tal como aqui usado refere-se a uma estimulação (imunoestimulante) ou inibição (imunomodulador) do desenvolvimento ou manutenção de uma resposta imunológica. A inibição pode ser efectuada, por exemplo, por eliminação de células imunitárias (e.g. linfócitos T ou B); indução ou geração de células imunitárias que podem modular (e.g., regular negativamente) a capacidade funcional de outras células; indução de um estado insensível em células imunitárias (e.g. anergia); ou aumentar, diminuir ou alterar a actividade ou função de células imunitárias incluindo, por exemplo, alterar o padrão de proteínas expressas por essas células (e.g. produção e/ou excreção alterada de determinadas classes de moléculas, tais como citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, factores de transcrição, cinases, moléculas de co-estimulação ou outros receptores de superfície celular e semelhantes) . Um "agente de imunomodulação" refere-se a um agente que tem um efeito de imunomodulação numa célula. Em algumas concretizações, um agente de imunomodulação tem um efeito citotóxico ou citostático numa célula imunitária que promove uma resposta imunitária. A expressão "marcador" refere-se a um composto ou composição detectável que está directa ou indirectamente conjugado ao anticorpo. O marcador pode ser ele próprio 28 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ detectável {e.g., marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável. Pode preparar-se um agente de ligação ao alvo variante marcado e usar-se em várias aplicações incluindo diagnóstico in vitro e in vivo.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante à qual está usualmente associada na fonte natural do ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente da forma ou estado no qual se encontra na natureza. Assim, as moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que expressam usualmente anticorpo, por exemplo, em que a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente da existente em células naturais. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de polinucleótido necessárias para expressão de uma sequência de codificação ligada operacionalmente num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo adequadas para uso em células procarióticas incluem, por exemplo, sequências de promotor, operador e de local de ligação de ribossoma. As sequências de controlo eucarióticas incluem promotores, sinais de poliadenilação e facilitadores, não se lhes limitando. Estas sequências de controlo podem ser utilizadas para expressão e produção de agente de ligação anti-alvo em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.
Uma sequência de ácido nucleico está "ligada operacionalmente" quando está colocada numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, uma pré-sequência de ácido nucleico ou líder de excreção está ligada operacionalmente a um ácido nucleico que codifica um polipéptido caso seja expressa como uma pré-proteína que participa na excreção do polipéptido; um promotor ou 29 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ facilitador está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação caso afecte a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossoma está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação caso esteja posicionado de modo a facilitar tradução. Geralmente, "ligada operacionalmente" significa que as sequências de ADN a serem ligadas são contíguas e, no caso de um líder de excreção, contíguas e em quadro de leitura. No entanto, os facilitadores são opcionalmente contíguos. A ligação pode ser conseguida por ligação em locais de restrição convenientes. Caso tais locais não existam, podem usar-se adaptadores ou ligantes de oligonucleótido sintéticos para ligar as sequências de ADN. A expressão "polipéptido" refere-se a um polímero de aminoácidos e seus equivalentes e não se refere a um comprimento específico de um produto; assim, "péptidos" e "proteínas" estão incluídos na definição de um polipéptido. Também se incluem na definição de polipéptidos os "anticorpos" tal como aqui definidos. Uma "região de polipéptido" refere-se a um segmento de um polipéptido, segmento esse que pode conter, por exemplo, um ou mais domínios ou motivos (e.g. uma região de polipéptido de um anticorpo pode conter, por exemplo, uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR)). A expressão "fragmento" refere-se a uma parte de um polipéptido tipicamente com pelo menos 20 aminoácidos contíguos ou pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipéptido. Um "derivado" é um polipéptido ou seu fragmento com uma ou mais substituições de aminoácidos não conservativas ou conservativas relativamente a um segundo polipéptido; ou um polipéptido ou seu fragmento que é modificado por ligação covalente de uma segunda molécula tal como, e.g. por ligação de um polipéptido heterólogo ou por glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Incluem-se adicionalmente na definição de "derivado", por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (e.g. aminoácidos não naturais e semelhantes), polipéptidos com ligações não substituídas, bem como outras modificações conhecidas na especialidade, tanto de ocorrência natural como não natural. 30 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Um polipéptido "isolado" é o que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com usos em diagnóstico ou terapêuticos do polipéptido e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Um polipéptido isolado inclui um anticorpo ou um seu fragmento ou derivado isolado. "Anticorpo" inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, dado que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente.
Em determinadas concretizações, o anticorpo será purificado (1) a mais de 95% em peso de anticorpo tal como determinado pelo método de Lowry e noutros aspectos a mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por utilização de um sequenciador de corpo rotativo ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras usando coloração de azul de Coomassie ou, de preferência, de prata. A expressão "heterólogo", no contexto de um polipéptido, significa que é de uma fonte diferente (e.g. uma célula, tecido, organismo ou espécie) comparativamente a outro polipéptido, pelo que os dois polipéptidos são diferentes. Tipicamente, um polipéptido heterólogo é de uma espécie diferente.
No contexto de polipéptidos imunoglobulina ou seus fragmentos, "substituição conservativa" significa uma ou mais substituições de aminoácidos que não reduzem substancialmente a ligação específica (e.g. tal como medida por KD) do polipéptido imunoglobulina ou seu fragmento a um antigénio (i.e. substituições que aumentam a afinidade de ligação, que não alteram significativamente a afinidade de ligação ou que diminuem a afinidade de ligação não mais do que cerca de 40%, tipicamente não mais do que cerca de 30%, mais tipicamente não 31 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ mais do que cerca de 20%, ainda mais tipicamente não mais do que cerca de 10% ou mais tipicamente não mais do que cerca de 5%, tal como determinado por ensaios de ligação padrão tais como, e.g. ELISA).
As expressões "idêntico" ou "percentagem de identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm os mesmos ou que têm uma determinada percentagem de nucleótidos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas para máxima correspondência. Para determinar a percentagem de identidade, as sequências são alinhadas para objectivos de comparação óptima (e.g. podem introduzir-se intervalos na sequência de um primeiro aminoácido ou sequência de ácido nucleico para alinhamento óptimo com uma segunda sequência de aminoácidos ou ácido nucleico). Comparam-se então os resíduos de aminoácidos ou nucleótidos nas posições de aminoácido ou posições de nucleótido correspondentes. Quando se ocupa uma posição da primeira sequência pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleótido na posição correspondente da segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (i.e., % identidade = n.2 posições idênticas/n.2 total de posições (e.g. posições sobrepostas) x 100). Em algumas concretizações, as duas sequências têm o mesmo comprimento. A expressão "substancialmente idêntico", no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60% ou pelo menos 65% de identidade; tipicamente pelo menos 70% ou pelo menos 75% de identidade; mais tipicamente pelo menos 80% ou pelo menos 85% de identidade; e ainda mais tipicamente pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade (e.g. tal como determinado usando um dos métodos apresentados seguidamente). 32 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
As expressões "similaridade" ou "percentagem de similaridade" no contexto de duas ou mais sequências de polipéptidos referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos que são iguais ou substituídos conservativamente quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, tal como medido usando um dos métodos apresentados seguidamente. Como exemplo, pode considerar-se que uma primeira sequência de aminoácidos é similar a uma segunda sequência de aminoácidos quando a primeira sequência de aminoácidos é pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% idêntica ou substituída conservativamente relativamente à segunda sequência de aminoácidos quando comparada a um número de aminoácidos igual ao número contido na primeira sequência ou quando comparada a um alinhamento de polipéptidos que foi alinhado, e.g. por um dos métodos apresentados seguidamente.
As expressões "similaridade substancial" ou "substancialmente similares", no contexto de sequências de polipéptido, indicam que uma região de polipéptido tem uma sequência com pelo menos 70%, tipicamente pelo menos 80%, mais tipicamente pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de similaridade de sequência com uma sequência de referência. Por exemplo, um polipéptido é substancialmente similar a um segundo polipéptido, por exemplo, quando os dois péptidos diferem por uma ou mais substituições conservativas.
No contexto de anticorpos ou seus derivados, uma proteína que tem uma ou mais regiões de polipéptido substancialmente idênticas ou substancialmente similares a uma ou mais regiões de ligação ao antigénio (e.g. uma região variável de cadeia pesada ou leve ou uma CDR de cadeia pesada ou leve) de um anticorpo retém a ligação específica a um epítopo reconhecido pelo anticorpo, tal como determinado usando qualquer de vários imunoensaios padrão conhecidos na especialidade ou tal como aqui referido. A determinação da percentagem de identidade ou percentagem de similaridade entre duas sequências pode ser conseguida 33 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, não limitante, de um algoritmo matemático usado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, modificado tal como em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo está incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Podem efectuar-se buscas de nucleótidos BLAST com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleótidos homólogas a um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse. Podem efectuar-se buscas de proteína BLAST com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas à proteína de interesse. Para obter alinhamentos com intervalos para efeitos de comparação pode usar-se Gapped BLAST tal como descrito em Altschul et ai., 1997, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402. Alternativamente, pode usar-se PSI-Blast para efectuar uma busca iterativa que detecta relações distantes entre moléculas (Idem). Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, podem usar-se os parâmetros por omissão dos respectivos programas (e.g. XBLAST e NBLAST). Outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989): Tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de utilitários de alinhamento de sequências GCG. Quando se utiliza o programa ALIGN para comparação de sequências de aminoácidos pode usar-se uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalização por comprimento de intervalo de 12 e uma penalização por intervalo de 4. São conhecidos na especialidade algoritmos adicionais para análise de sequências e incluem ADVANCE e ADAM tal como descrito em Torellis e Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444-8. Em FASTA, ktup é uma opção de controlo que estabelece a sensibilidade e velocidade da busca. Quando ktup=2, encontram-se regiões similares nas duas sequências em comparação por inspecção de pares de resíduos alinhados; quando ktup=l, analisam-se aminoácidos alinhados 34 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ individuais. Pode seleccionar-se um valor de ktup de 2 ou 1 para sequências proteína ou de 1 a 6 para sequências de ADN. Por omissão, caso não se especifique, ktup é 2 para proteínas e 6 para ADN. Alternativamente, o alinhamento de sequência de proteína pode ser efectuado usando o algoritmo CLUSTAL W, tal como descrito em Higgins et ai., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402.
Tal como aqui usadas, as expressões "célula", "linha celular" e "cultura celular" são usadas indiferentemente e todas essas designações incluem a sua descendência. Assim, "produtos de transformação" e "células transformadas" incluem a célula individual primária e as culturas dela derivadas, independentemente do número de transferências. Também se deve considerar que o conteúdo de ADN de toda a descendência pode não ser precisamente idêntico devido a mutações deliberadas ou de ocorrência natural. Também se inclui a descendência mutante que tem a mesma função ou actividade biológica tal como rastreada na célula transformada original. Quando se pretende designações distintas, será evidente pelo contexto. A expressão "indivíduo" para objectivos de tratamento refere-se a qualquer animal, em particular um animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domesticados e de quinta, animais de zoológico, desporto ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas e semelhantes. De preferência, o indivíduo é humano.
Uma "perturbação", tal como aqui usada, e as expressões "perturbação associada a alvo" e "doença associada a alvo" referem-se a qualquer condição que beneficiaria de tratamento com um agente de ligação anti-alvo, tal como aqui descrito. Uma "perturbação associada ao alvo" e "doença associada ao alvo" tipicamente expressa o antigénio alvo ou um seu fragmento, na superfície celular. Tal inclui doenças crónicas e agudas incluindo as condições patológicas que predispõe o mamífero à doença em cauda. Os exemplos não limitativos de perturbações a serem aqui tratadas incluem cancro, malignidades hematológicas, tumores benignos e malignos, 35 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ leucemias e malignidades linfóides, carcinomas e doenças inflamatórias, angiogénicas e imunológicas. Divulgam-se seguidamente exemplos específicos de doenças.
As expressões "tratamento" e "terapia" e semelhantes, tal como aqui usadas, pretendem incluir medidas terapêuticas, bem como profilácticas ou supressoras para uma doença ou perturbação que leva a qualquer efeito clinicamente desejável ou benéfico, incluindo diminuição ou alívio de um ou mais sintomas, regressão, abrandamento ou cessação de progressão da doença ou perturbação, não se lhes limitando. Assim, por exemplo, a expressão tratamento inclui a administração de um agente antes ou após o início de um sintoma de uma doença ou perturbação, prevenindo ou removendo assim todos os sinais da doença ou perturbação. Como outro exemplo, a expressão inclui a administração após manifestação clínica da doença para combater os sintomas da doença. Adicionalmente, a administração de um agente após início e após se terem desenvolvido sintomas clínicos quando a administração afecta os parâmetros clínicos da doença ou perturbação, tal como o grau de danos a tecidos ou a quantidade ou extensão de metástases, quer o tratamento leve ou não a melhoras na doença, compreende "tratamento" ou "terapia" tal como aqui usadas.
Tal como aqui usadas, as expressões "prevenção" ou "prevenir" referem-se à administração de um agente de ligação anti-alvo a um indivíduo antes do início de um sintoma clínico ou de diagnóstico de um cancro ou doença imunológica que expressa alvo (e.g. administração a um indivíduo com uma predisposição ou um risco elevado de contrair o cancro ou doença imunológica que expressa alvo) para (a) bloquear a ocorrência ou início do cancro ou doença imunológica que expressa alvo, ou um ou mais dos seus sintomas clínicos ou de diagnóstico, (b) inibir a gravidade ou início do cancro ou doença imunológica que expressa alvo ou (c) para diminuir a probabilidade de início do cancro ou doença imunológica que expressa alvo. 36 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ A expressão "infusão intravenosa" refere-se à introdução de um agente, e.g. um agente terapêutico, na veia de um doente animal ou humano ao longo de um período de tempo superior a aproximadamente 15 minutos, sendo em geral entre aproximadamente 30 a 90 minutos. A expressão "bolus intravenoso" ou "impulso intravenoso" refere-se a administração de fármaco numa veia de um animal ou humano de modo que o corpo receba o fármaco em aproximadamente 15 minutos ou menos, em geral 5 minutos ou menos. A expressão "administração subcutânea" refere-se à introdução de um agente, e.g. um agente terapêutico, sob a pele de um doente animal ou humano, tipicamente numa bolsa entre a pele e o tecido subjacente, por libertação relativamente lenta e prolongada a partir de um receptáculo de fármaco. A criação da bolsa pode ser feita picando a pele ou puxando-a para cima e afastando-a do tecido subjacente. A expressão "literatura inclusa" é usada para referir as instruções que se incluem usualmente em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contém informação sobre as indicações, uso, administração, contra-indicações e/ou precauções relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.
Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para entrega de um fármaco (tal como um anticorpo) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são usualmente arranjados numa formação em bicamada, semelhante ao arranjo dos lípidos das membranas biológicas. A expressão "infusão subcutânea" refere-se à introdução de um fármaco sob a pele de um doente animal ou humano, de preferência no interior de uma bolsa entre a pele e o tecido subjacente, através de entrega relativamente lenta e prolongada de um receptáculo de fármaco durante um período de tempo incluindo 30 minutos ou menos ou 90 minutos ou menos, não se lhes limitando. Opcionalmente, a infusão pode ser feita 37 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ por implantação subcutânea de uma bomba de entrega de fármaco sob a pele do doente animal ou humano, em que a bomba entrega uma quantidade de fármaco predeterminada, durante um período de tempo predeterminado, tal como 30 minutos, 90 minutos ou um período de tempo que abrange a duração do regime de tratamento. A expressão "bolus subcutâneo" refere-se a administração de fármaco por baixo da pele de um doente animal ou humano, em que a entrega de fármaco do bolus é em menos de aproximadamente 15 minutos; noutro aspecto, em menos de 5 minutos e ainda noutro aspecto em menos de 60 segundos. Ainda num outro aspecto, a administração é no interior de uma bolsa entre a pele e o tecido subjacente, em que a bolsa pode ser criada picando a pele ou puxando-a para cima e afastando-a do tecido subjacente. A expressão "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de um agente de ligação anti-alvo (e.g., um anticorpo ou derivado ou outro agente de ligação) que é suficiente para inibir a ocorrência ou melhorar um ou mais sintomas clínicos ou de diagnóstico de um cancro ou doença imunológica num indivíduo. Uma quantidade eficaz de um agente é administrada de acordo com os métodos aqui descritos num "regime eficaz". A expressão "regime eficaz" refere-se a uma combinação de quantidade de agente e frequência de dosagem adequada para conseguir o tratamento ou prevenção de cancro ou doença imunológica. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" é usada para referir uma quantidade de um agente terapêutico com um resultado benéfico para o doente, por exemplo um efeito de paragem de crescimento ou deleção da célula. Num aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz tem actividade apoptótica ou é capaz de induzir morte celular. Noutro aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma concentração sérica alvo que se demonstrou ser eficaz, por exemplo, para atrasar a progressão da doença. A eficácia pode ser medida por meios convencionais, dependendo da condição a ser tratada. Por exemplo, em doenças neoplásicas 38 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ caracterizadas por células que expressam um antigénio alvo, a eficácia pode ser medido por avaliação do tempo para progressão da doença (TTP) ou determinando as taxas de resposta (RR). A expressão "farmaceuticamente aceitável" tal como aqui usada significa aprovada por uma agência de regulação do governo federal ou estadual ou listada na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em humanos. A expressão "ingrediente farmaceuticamente compatível" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável com o qual se administra um agente de ligação ao alvo. A frase "sal farmaceuticamente aceitável", tal como aqui usada, refere-se a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um agente de ligação anti-alvo ou agente terapêutico. O agente de ligação anti-alvo ou agente terapêutico contém pelo menos um grupo amino e assim podem formar-se sais de adição de ácido com este grupo amino ou outros grupos adequados. Os exemplos de sais incluem sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartarato, oleato, tanato, pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e pamoato (i.e. 1,1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)), não se lhes limitando. Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula tal como um ião acetato, um ião succinato ou outro contra-ião. O contra-ião pode ser qualquer parte orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga no composto parental. Adicionalmente, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais do que um átomo carregado na sua estrutura. Nos casos em que existem múltiplos átomos carregados, o sal farmaceuticamente aceitável pode ter múltiplos contra-iões. Assim, um sal farmaceuticamente 39 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contra-iões. "Solvato farmaceuticamente aceitável" ou "solvato" refere-se a uma associação de uma ou mais moléculas de solvente e um agente de ligação anti-alvo e/ou agente terapêutico. Os exemplos de solventes que formam solvatos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético e etanolamina, não se lhes limitando. A abreviatura "AFP" refere-se a dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina-p-fenilenodiamina. A abreviatura "MMAE" refere-se a monometil-auristatina E. A abreviatura "AEB" refere-se a um éster produzido por reacção de auristatina E com ácido para-acetilbenzóico. A abreviatura "AEVB" refere-se a um éster produzido por reacção de auristatina E com ácido benzoílvalérico. A abreviatura "MMAF" refere-se a dovalina-valina- dolaisoleunina-dolaproina-fenilalanina.
As abreviaturas "fk" e "phe-lys" referem-se ao ligante fenilalanina-lisina. A abreviatura "mc" refere-se a maleimidocaproílo.
As abreviaturas "vc" e "val-cit" referem-se ao ligante peptidico valina-citrulina. A abreviatura "mcMMAF" refere-se a maleimidocaproí1-MMAF. A abreviatura "vcMMAF" refere-se a ligante maleimidocaproí1-valina-citruiina-p-aminobenzilcarbamollo. 40 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ II. Anticorpos e seus derivados
As composições e métodos aqui descritos abrangem o uso de um agente de ligação ao alvo variante que se liga especificamente a um antigénio alvo numa célula. O agente de ligação ao alvo pode exercer um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador nas células de cancro, células imunitárias ou outras células alvo que expressam antigénio alvo. O agente de ligação ao alvo pode ser, por exemplo, um anticorpo, um fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo, um seu derivado ou outro agente de ligação compreendendo uma parte de uma região Fc de um anticorpo. O agente de ligação ao alvo pode também incluir pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo de ligação ao alvo.
Num aspecto, o agente de ligação ao alvo compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) idênticas, substancialmente idênticas ou substancialmente similares a uma ou mais CDR de um anticorpo de ligação ao alvo. Por exemplo, o agente de ligação pode incluir uma CDR de cadeia pesada e/ou uma CDR de cadeia leve que é idêntica ou substancialmente idêntica ou substancialmente similar a uma CDR de cadeia pesada correspondente (regiões Hl, H2 ou H3) ou CDR de cadeia leve correspondente (regiões Ll, L2 ou L3) de um anticorpo monoclonal. Em concretizações típicas, o agente de ligação anti-alvo tem duas ou três CDR de cadeia pesada e/ou duas ou três CDR de cadeia leve que são idênticas, substancialmente idênticas ou substancialmente similares às CDR de cadeia pesada e/ou leve correspondentes de um anticorpo monoclonal.
Numa concretização específica, podem usar-se anticorpos conhecidos para o tratamento ou prevenção de cancro. Os anticorpos imunoespecíficos para um antigénio de célula de cancro podem ser obtidos comercialmente ou produzidos por qualquer método conhecido dos peritos na especialidade, tal como, e.g. técnicas de expressão recombinante. A sequência de nucleótidos que codifica anticorpos imunoespecíficos para um antigénio de célula de cancro pode ser obtida, e.g. da base de 41 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ dados GenBank ou de uma base de dados semelhante, publicações da literatura ou por clonagem e sequenciação de rotina. Os exemplos de anticorpos disponíveis para o tratamento de cancro incluem anticorpo monoclonal humanizado anti-HER2, HERCEPTIN (trastuzumab; Genentech) para o tratamento de doentes com cancro de mama metastático; RITUXAN (rituximab; Genentech) que é um anticorpo monoclonal quimérico anti-CD20 para o tratamento de doentes com linfoma não Hodgkin; OvaRex (AltaRex Corporation, MA) que é um anticorpo murino para o tratamento de cancro de ovário; Panorex (Glaxo Wellcome, NC) que é um anticorpo IgG2a murino para o tratamento de cancro colorrectal; Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY) que é um anticorpo quimérico anti-EGFR IgG para o tratamento de cancros positivos para factor de crescimento epidérmico, tal como cancro da cabeça e pescoço; Vitaxin (Medlmmune, Inc., MD) que é um anticorpo humanizado para o tratamento de sarcoma; Campath I/H (Leukosite, MA) que é um anticorpo IgGl humanizado para o tratamento de leucemia linfocítica crónica (CLL); Smart MI 95 (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo humanizado anti-CD33 IgG para o tratamento de leucemia mielóide aguda (AML); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ) que é um anticorpo humanizado anti-CD22 IgG para o tratamento de linfoma não Hodgkin; Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo humanizado anti-HLA-DR para o tratamento de linfoma não Hodgkin; Oncolym (Techniclone, Inc., CA) que é um anticorpo murino anti-HLA-DrlO marcado radioquimicamente para o tratamento de linfoma não Hodgkin; Allomune (BioTransplant, CA) que é um mAb humanizado anti-CD2 para o tratamento de doença de Hodgkin ou linfoma não Hodgkin; Avastin (Genentech, Inc., CA) que é um anticorpo humanizado anti-VEGF para o tratamento de cancros de pulmão e colorrectal; Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ e Amgen, CA) que é um anticorpo anti-CD22 para o tratamento de linfoma não Hodgkin; e CEAcide (Immunomedics, NJ) que é um anticorpo humanizado anti-CEA para o tratamento de cancro colorrectal, não se lhes limitando.
Outros anticorpos úteis no tratamento de cancro incluem anticorpos contra os seguintes antigénios: CA125 (ovário), 42 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ CA15 3 (C3.ircinoin3.s) r CA19 9 (c8.ircinorn3.s) r L5 (C3.ircinoin0.s) , Lewis Y (c3.ircinoin3.s) f L0wis X (c3.ircinorn3.s) , 3.1f3. f©tOprOt0Ín3. (carcinomas), CA 242 (colorrectal), fosfatase alcalina placentária (carcinomas), antigénio especifico da próstata (próstata), fosfatase ácida prostática (próstata), factor de crescimento epidérmico (carcinomas), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE-4 (carcinomas), receptor anti-transferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MUC1-KLH (cancro da mama), CEA (colorrectal), gplOO (melanoma), MARTI (melanoma), PSA (próstata), receptor de IL-2 (leucemia de células T e linfomas), CD20 (linfoma não Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), CD22 (linfoma), gonadotropina coriónica humana (carcinoma), CD38 (mieloma múltiplo), CD40 (linfoma), mucina (carcinomas), P21 (carcinomas), MPG (melanoma) e produto de oncogene Neu (carcinomas), não se lhes limitando. Alguns anticorpos específicos úteis incluem BR96 mAb (Trail, P.A., Willner, D., Lasch, S.J., Henderson, A.J., Hofstead, S.J., Casazza, A.M., Firestone, R.A., Hellstrõm, I., Hellstrõm, K.E., "Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates" Science 1993, 261, 212- 215), BR64 (Trail, PA, Willner, D, Knipe, J., Henderson, A.J., Lasch, S.J., Zoeckler, M.E., Trailsmith, M.D., Doyle, T.W., King, H.D., Casazza, A.M., Braslawsky, G.R., Brown, J.P., Hofstead, S.J., (Greenfield, R. S., Firestone, R. A., Mosure, K., Kadow, D.F., Yang, M.B., Hellstrõm, K.E. e Hellstrõm, I. "Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin
Immunoconjugates" Câncer Research 1997, 57, 100 105, mAb contra o antigénio CD40, tal como S2C6 mAb (Francisco, J.A., Donaldson, K.L., Chace, D., Siegall, C.B. e Wahl, A.F. "Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14" Câncer Res. 2000, 60, 3225-3231), mAb contra o antigénio CD70, tal como 1F6 mAb e 2F2 mAb e mAb contra o antigénio CD30, tal como AC10 (Bowen, M.A., Olsen, K.J., Cheng, L., Avila, D. e Podack, E.R. "Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT" J. Immunol., 151, 5896-5906, 1993: Wahl et al., 2002 Câncer Res. 62(13):3736-42), não se lhes limitando. Podem usar-se muitos outros anticorpos de internalização que se ligam a antigénios 43 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ associados a tumor e foram revistos (Franke, A. E., Sievers, E.L. e Scheinberg, D.A., "Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review" Câncer Biother Radiopharm. 2000, 15, 459 76; Murray, J.L., "Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age" Semin Oncol. 2000, 27, 64 70; Breitling, F. e Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley and Sons, New York, 1998).
Em determinadas concretizações, o anticorpo não é Trastuzumab (anti-HER2 humanizado completo (PM 145167)), Herceptin F(ab')2 (derivado de anti-HER2 enzimaticamente (PM 100 000)), 4D5 (antiHER2 murino completo de hibridoma), rhu4D5 (anticorpo humanizado completo, expresso transitoriamente) , rhuFab4D5 (Fab humanizado recombinante (PM 47738)), 4D5Fc8 (antiHER2 completo, murino, com domínio de ligação FcRn mutado) ou Hg (4D5 humanizado completo "sem dobra", com as cisteinas da dobra de cadeia pesada mutadas para serina. Expressa em E. coli (portanto não glicosilado)).
Numa concretização especifica, o agente de ligação ao alvo (e.g. anticorpo) compreende uma região de ligação que se liga especificamente a CD20, CD30, CD33 ou CD70.
Noutra concretização especifica, usam-se anticorpos conhecidos para o tratamento ou prevenção de uma doença auto-imune de acordo com as composições do invento. Os anticorpos imunoespecificos para um antigénio de uma célula que é responsável pela produção de anticorpos auto-imunes podem ser obtidos de qualquer organização (e.g. um cientista universitária ou de uma empresa) ou produzidos por qualquer método conhecido dos peritos na especialidade tal como, e.g. síntese química ou técnicas de expressão recombinante. Noutra concretização, os anticorpos úteis são imunoespecificos para o tratamento de doenças auto-imunes incluindo anticorpo antinuclear; Anti-ADN ds; Anti-ADN ss, anticorpo anti-cardiolipina IgM, IgG; anticorpo anti-fosfolípido IgM, IgG; anticorpo anti-SM; anticorpo anti-mitocondrial; anticorpo da tiróide; anticorpo microssómico; anticorpo tiroglobulina; Anti-SCL 70; Anti Jo; Anti U1RNP; Anti La/SSB; Anti SSA; Anti- 44 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ SSB; anticorpo anti-células peritais; anti-histonas; anti-RNP; C ANCA; P ANCA; anti-centrómero; anti-fibrilarina e anticorpo anti-GBM, não se lhes limitando.
Em determinadas concretizações, os anticorpos úteis podem ligar-se a um receptor ou um complexo de receptores expresso num linfócito activado. O receptor ou complexo de receptores pode compreender um membro da superfamilia de genes de imunoglobulina, um membro da superfamilia de receptores TNF, uma integrina, um receptor de citocina, um receptor quimiocina, uma proteína de histocompatibilidade major, uma lectina ou uma proteína de controlo de complemento. Os exemplos não limitativos de membros da superfamilia de imunoglobulina adequados são CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD28, CD7 9, CD90, CD152/CTLA4, PD1 e ICOS. Os exemplos não limitativos de membros da superfamilia de receptores TNF adequados são CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4 1BB, TNF Rl, TNFR 2, RANK, TACI, BCMA, osteoprotegerina, Apo2/TRAIL Rl, TRAIL R2, TRAIL R3, TRAIL R4 e APO 3. Os exemplos não limitativos de integrinas adequadas são CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 e CD104. Os exemplos não limitativos de lectinas adequadas são lectina tipo C, tipo S e tipo I.
Numa concretização específica, o agente de ligação ao alvo (e.g., anticorpo) compreende uma região de ligação que se liga especificamente a CD19, CD20, CD30 ou CD70.
Numa concretização específica, o agente de ligação ao alvo compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) idênticas, substancialmente idênticas ou substancialmente similares a uma ou mais CDR de anticorpo monoclonal murino 1F6. (As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 1F6 apresentam-se em SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22, respectivamente e são divulgadas na publicação de patente internacional N.2 WO 04/073656. Por exemplo, o agente de ligação pode incluir uma CDR de cadeia pesada e/ou uma CDR de cadeia leve que é idêntica ou 45 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ substancialmente idêntica ou substancialmente similar a uma CDR de cadeia pesada correspondente (regiões Hl, H2 ou H3) ou CDR de cadeia leve correspondente (regiões Ll, L2 ou L3) de mAb 1F6. Em concretizações típicas, o agente de ligação anti-alvo tem duas ou três CDR de cadeia pesada e/ou duas ou três CDR de cadeia leve que são idênticas, substancialmente idênticas ou substancialmente similares às CDR de cadeia pesada e/ou leve correspondentes de mAb 1F6.
Por exemplo, em determinadas concretizações, quando o agente de ligação anti-alvo tem pelo menos uma CDR de cadeia pesada substancialmente idêntica ou substancialmente similar a uma CDR de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de ligação ao alvo, o agente de ligação pode incluir adicionalmente pelo menos uma CDR de cadeia leve que é substancialmente idêntica ou substancialmente similar a uma CDR de cadeia leve do anticorpo monoclonal de ligação ao alvo.
Em determinadas concretizações, o agente de ligação anti-alvo inclui um domínio variável de cadeia pesada ou leve, em que o domínio variável tem (a) um conjunto de três CDR idênticas, substancialmente idênticas ou substancialmente similares às CDR correspondentes de um anticorpo monoclonal de ligação ao alvo e (b) um conjunto de quatro regiões variáveis de esqueleto de uma imunoglobulina humana. Por exemplo, um anticorpo anti-CD70 pode incluir domínio(s) variável(is) de cadeia pesada e/ou leve, em que o(s) domínio(s) variável(eis) tem (a) um conjunto de três CDR, no qual o conjunto de CDR é de um anticorpo monoclonal 1F6 e (b) um conjunto de quatro regiões de esqueleto derivadas de uma IgG humana. O anticorpo pode opcionalmente incluir uma região de dobra. Num exemplo de concretização, o anticorpo anti-CD70 é um anticorpo completamente humanizado.
Noutro aspecto, o agente de ligação ao alvo compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) substancialmente idênticas ou substancialmente similares a uma ou mais CDR de anticorpo monoclonal 2F2. (As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos das regiões variáveis da 46 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ cadeia pesada e leve de 2F2 apresentam-se em SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO:28, e SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:30, respectivamente, e divulgam-se em publicação de patente internacional N.2 WO 04/073656) . Por exemplo, o agente de ligação pode incluir uma CDR de cadeia pesada e/ou CDR de cadeia leve que é idêntica ou substancialmente idêntica ou substancialmente similar a uma CDR de cadeia pesada correspondente (regiões Hl, H2 ou H3) ou CDR de cadeia leve correspondente (regiões Ll, L2 ou L3) de mAb 2F2. Em concretizações típicas, o agente de ligação anti-alvo tem duas ou três CDR de cadeia pesada e/ou duas ou três CDR de cadeia leve que são idênticas, substancialmente idênticas ou substancialmente similares às CDR de cadeia pesada e/ou leve correspondentes de mAb 2F2.
Por exemplo, em determinadas concretizações, quando um anticorpo anti-CD70 tem pelo menos uma CDR de cadeia pesada substancialmente idêntica ou substancialmente similar a uma CDR de cadeia pesada de mAb 2F2, o anticorpo ou seu derivado pode incluir adicionalmente pelo menos uma CDR de cadeia leve que é substancialmente idêntica ou substancialmente similar a uma CDR de cadeia leve de mAb 2F2.
Em determinadas concretizações, o agente de ligação anti-alvo inclui um domínio variável de cadeia pesada ou leve, em que o domínio variável tem (a) um conjunto de três CDR idênticas, substancialmente idênticas ou substancialmente similares às CDR correspondentes de mAb 2F2 e (b) um conjunto de quatro regiões de esqueleto de regiões variáveis de uma imunoglobulina humana. Por exemplo, um anticorpo anti-CD70 pode incluir domínio (s) variável (eis) de cadeia pesada e/ou leve, em que o(s) domínio(s) variável(eis) tem (a) um conjunto de três CDR, no qual o conjunto das CDR é de anticorpo monoclonal 2F2 e (b) um conjunto de quatro regiões de esqueleto derivadas de uma IgG humana. O anticorpo pode opcionalmente incluir uma região de dobra. Num exemplo de concretização, o anticorpo anti-CD70 é um anticorpo completamente humanizado. 47 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Em determinadas concretizações, as regiões de esqueleto são seleccionadas de sequências de exão VH, JH, V e J de linha germinal humana. Por exemplo, podem seleccionar-se sequências aceitadoras para humanização de FR de um domínio clF6 VH dos exões VH1-18 de VH de linha germinal (Matsuda et al, 1993, Nature Genetics 3:88-94) ou VHl-2 (Shin et ai., 1991, EMBO J. 10:3641-3645) e para a região de dobra (JH) , exão Jh-6 (Mattila et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:2578- 2582) . Noutros exemplos, o exão B3 de linha germinal V (Cox et al. , 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836) e J J -1 (Hieter et al., 1982, J. Blol, Chem. 257:1516-1522) podem ser seleccionadas como sequências aceitadoras para a humanização do domínio VL de clF6.
Em determinadas concretizações, a sequência da região de esqueleto do anticorpo anti-CD70 humanizado inclui um derivado do exão de linha germinal humana aceitadora usada, incluindo derivados no qual se reintroduziram resíduos dadores de ratinho. Estes resíduos incluem reintrodução do resíduo dador de ratinho numa ou mais das posições H46, H67, H68, H69, H70, H71, H80, H81, H82, H82A e H91 no domínio Vh, de acordo com a convenção de numeração de Kabat. A seguinte tabela 1 indica as regiões de 1F6 e 2F2 humanizadas às quais correspondem cada uma das SEQ ID NO. 48 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Tabela 1 'raoiEDO^rTs^“''iDl AMINOACIDO | NO: | Nucleótido .......ΐ....... ““"J Aminoácido ~~2~ Nucleótido 3 """í Aminoácido 4 Nucleótido ~~5~ \ Aminoácido ........6....... $ Nucleótido 7 Aminoácido T~ Nucleótido 9 § Aminoácido 10 """5 Nucleótido .....IT" Aminoácido 12..... Nucleótido t 13 """í Aminoácido 14 Nucleótido ™Ϊ5 Aminoácido ™Ϊ6~ | Nucleótido .....ΤΤ """í Aminoácido "TF” 5 Nucleótido 19..... | Aminoácido "To™ """í Nucleótido 21 Aminoácido "'TF'" | Nucleótido 23™ "1 Aminoácido Nucleótido "'TF | Aminoácido Nucleótido '"5- .....27™ """í Aminoácido ......28 $ Nucleótido ""29..... ξ Aminoácido 30
MOLÉCULA ^ Região variável de cadeia pesada clF6 ^ Região variável de cadeia pesada clF6 | hlF6 hVH-D + domínio constante de hlgGi | hlF6 hVH-D + domínio constante de hlgGi
| hlF 6 hVH—E
I hlF 6hVH-E ^ hlF6 hVH-E + domínio constante de hlgGi ^ hlF6 hVH-E + domínio constante de hlgGi ξ...........................................%..............................................................
I hlF6 hVH-H I hl F 6 "hVH-Η | hlF6 hVH-H + domínio constante de hlgGi | hlF6 hVH-Η + domínio constante de hlgGi | TfTTTj
I hlF 6 hVH-J | hlF6 hVH-J + domínio constante de hlgGi | hlF6 hVH-J + domínio constante de hlgGi I "" | hlF 6 hVH-M ” | hlF6 hVH-Μ + domínio constante de hlgGi | hlF6 hVH-Μ + domínio constante de hlgGi
Região variável de cadeia leve clF6 Região variável de cadeia leve clF6 hV[,A + domínio constante humano hViA + domínio constante humano
Região variável de cadeia pesada c2F2 Região variável de cadeia pesada c2F2 Região variável de cadeia leve c2F2 Região variável de cadeia leve c2F2
Em determinadas concretizações, o agente de ligação ao alvo pode ser um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antigénio de anticorpo 1F6 ou 2F2. Em algumas 49 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ concretizações, ο anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 18 ou aminoácidos 20-137 de SEQ ID NO: 4. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24.
Em determinadas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 ou aminoácidos 20-137 de SEQ ID NO:4. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 85% idêntica à
sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 ou aminoácidos 20-137 de SEQ ID NO: 4. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:18 ou aminoácidos 20-137 de SEQ ID NO:4. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:18 ou aminoácidos 20-137 de SEQ ID NO:4. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 ou aminoácidos 20-137 de SEQ ID NO: 4. Em algumas concretizações, o polipéptido não tem a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de anticorpo 1F6 ou 2F2.
Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é 50 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24. Em algumas concretizações, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma cadeia polipeptídica que é pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24. Em algumas concretizações, o polipéptido não tem a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de anticorpo 1F6 ou 2F2.
Em algumas concretizações, o agente de ligação anti-alvo compete com anticorpo monoclonal 1F6 ou 2F2 para ligação a CD70 humano. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo não induz um sinal agonista ou antagonista quando se liga a CD70 (e.g. não estimula proliferação). Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo bloqueia a ligação de CD27 a CD70 em pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%. O agente de ligação ao alvo pode ser um anticorpo, tal como um anticorpo humanizado, um anticorpo em cadeia simples, um scFv, um diacorpo, um Fab, um minicorpo, um scFv-Fc, um Fv, ou semelhantes. Em algumas concretizações, pode ligar-se uma região de ligação ao antigénio a um domínio ou domínios Fc tais como, por exemplo, os domínios de dobra-CH2-CH3 de uma imunoglobulina, ou uma parte ou fragmento de um ou mais domínios efectores. Os fragmentos de anticorpo de ligação ao antigénio, incluindo anticorpos em cadeia simples, podem compreender, por exemplo, uma ou mais regiões variáveis em combinação com a globalidade ou uma parte de um domínio Fc (e.g. apenas um domínio Ch2 e/ou Ch3 ou em combinação com um domínio ChI, dobra e/ou Cl). Igualmente, os fragmentos de ligação ao antigénio podem compreender qualquer combinação de domínios Fc. Em algumas concretizações, o anticorpo pode ser 51 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ um anticorpo em cadeia simples compreendendo uma região variável de ligação ao antigénio ligada a dominios dobra-CH2-Ch3.
Os dominios Fc do agente de ligaçao ao alvo podem ser de qualquer isotipo adequado de imunoglobulina humana. 0 agente de ligação ao alvo pode ser conjugado a um agente terapêutico, tal como um agente citotóxico, citostático ou de imunomodulação. Numa concretização especifica, o agente de ligação ao alvo é conjugado a um agente terapêutico, tal como um agente citotóxico, citostático ou de imunomodulação. Descrevem-se aqui agentes terapêuticos adequados.
Os agentes citotóxicos adequados podem ser, por exemplo, uma auristatina, um agente de ligação ao sulco menor de ADN, um agente de alquilação de sulco menor de ADN, um enediino, uma lexitropsina, uma duocarmicina, um taxano, uma puromicina, uma dolastatina, um maitansinóide e um alcaloide de vinca. Em determinadas concretizações, o agente citotóxico é AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretatastatina, caliqueamicina, maitansina, DM-1 ou netropsina. Outros agentes citotóxicos adequados incluem agentes anti-tubulina, tal como auristatina, um alcaloide de vinca, uma podofilotoxina, um taxano, um derivado de bacatina, uma criptofisina, um maitansinóide, uma combretastatina ou uma dolastatina. Em concretizações especificas, o agente anti-tubulina é AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorrelbina, VP-16, camptotecina, paclitaxel, docetaxel, epotilona A, epotilona B, nocodazole, colchicinas, colcimida, estramustina, cemadotina, discodermolida, maitansina, DM-1 ou eleuterrobina.
Os agentes de imunomodulação adequados incluem, por exemplo, ganciclovir, etanercept, ciclosporina, tacrolimo, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato de mofetil, metotrexato, cortisol, aldosterona, dexametasona, um 52 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ inibidor de ciclo-oxigenase, um inibidor de 5-lipoxigenase ou um antagonista de receptor de leucotrienos.
Em conjugados de anticorpo e fármaco (ADC), o anticorpo pode ser conjugado directamente ao agente citotóxico ou através de um ligante. Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes cliváveis e não cliváveis. Um ligante clivável é tipicamente susceptível a clivagem em condições intracelulares. Os ligantes cliváveis adequados incluem, por exemplo, um ligante clivável peptídico, clivável por uma protease intracelular, tal como uma protease lisossómica ou uma protease endossómica. Em exemplos de concretizações, o ligante pode ser um ligante dipéptido, tal como um ligante valina-citrulina (val-cit) ou fenilalanina-lisina (phe-lys). Outros ligantes adequados incluem ligantes hidrolisáveis a um pH inferior a 5,5, tal como um ligante hidrazona. Os ligantes cliváveis adicionais adequados incluem ligantes de dissulfureto.
Em algumas concretizações, um agente de ligação ao alvo pode ser um anticorpo quimérico, compreendendo uma região Fc humana ou não humana ou uma sua parte. Por exemplo, o anticorpo pode incluir um domínio Fc ou parte de origem não humana, e.g., roedor (e.g., ratinho ou rato), burro, ovelha, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelídeo, cavalo, galinha ou macaco (e.g., macaco macaca, rhesus ou semelhantes).
Uma agente de ligação ao alvo, tal como um anticorpo, pode ser monoespecífico, biespecífico, triespecífico ou de maior multi-especificidade. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um antigénio alvo e/ou podem ser específicos tanto para um antigénio alvo, como para um antigénio heterólogo. (Consultar, e.g., publicação PCT N.2 WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 e WO 92/05793; Tutt et ai., 1991, J. Immunol. 147:60-69; patentes U.S. N.2 4 474 893; 4 714 681; 4 925 648; 5 573 920; e 5 601 819; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553). Os anticorpos multiespecíficos, incluindo anticorpos biespecíficos e triespecíficos, úteis para a prática dos métodos aqui 53 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ descritos são anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigénio alvo e a um segundo receptor ou complexo de receptores de superfície celular. Em algumas concretizações, a ligação da parte de anticorpo multiespecífico à segunda molécula ou complexo de receptores de superfície celular pode melhorar as funções do agente de ligação ao alvo.
Os agentes de ligação ao alvo e seus derivados podem também ser descritos ou especificados em termos da sua afinidade de ligação ao antigénio alvo. As afinidades de ligação típicas incluem as que têm uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X IO"2 M, IO-2 M, 5 X IO'3 M, 10-3 M, 5 X lCr4 Μ, IO-4 M, 5 X IO”5 M, IO-5 M, 5 X 10-6 M, X LO s 1 O \—1 10-7 Μ, IO-7 M, 5 X IO-8 M, 10-8 M, 5 X IO-9 M, 10-9 M, 5 X 10-1° M, 10_1° M, 5 X 10-31 M, 10-31 M, 5 X IO-12 M, 10“12 M, 5 X 10“13 Μ, IO”13 M, 5 X ΙΟ'14 Μ, IO-14 M , 5 X 10 -15 M ou 10-15 M.
Os anticorpos monoclonais úteis do invento são populações homogéneas de anticorpos para um determinante antigénico específico, e.g. um antigénio celular (tal como um antigénio celular de cancro ou um efector não maligno ou antigénio celular acessório), um antigénio vírico, um antigénio microbiano, uma proteína, um péptido, um hidrato de carbono, um produto químico, um ácido nucleico, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio). Pode preparar-se um anticorpo monoclonal (mAb) para um antigénio de interesse usando qualquer técnica conhecida na especialidade incluindo, e.g. o uso de tecnologias de hibridoma, recombinante e disposição de fagos ou uma sua combinação. As técnicas de hibridoma são discutidas na generalidade em, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed., 1988); e Hammerling et al., em Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, p. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Estas incluem a técnica de hibridoma originalmente descrita por Kõhler e Milstein (1975, Nature 256, 495-497), a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, 54 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Alan R. Liss, Inc., p. 77-96), não se lhes limitando. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA e IgD e qualquer sua subclasse. O hibridoma que produz os mAb para uso neste invento pode ser cultivado in vitro ou in vivo.
Os exemplos de métodos de disposição de fagos que podem ser usados para preparar os anticorpos incluem, e.g. os divulgados em Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol Biol. 227:381; Marks et al. , 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Quan e Cárter, 2002, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics in Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu e Fick Jr., ed., Mareei Dekker, New York, NY, capitulo 20, p. 427-469; Brinkman et al.r 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; pedido PCT N.2 PCT/GB91/01134; publicações PCT N.2 WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 e patentes U.S. N. 2 5 698 426; 5 223 409; 5 403 484; 5 580 717; 5 427 908; 5 750 753; 5 821 047; 5 571 698; 5 427 908; 5 516 637; 5 780 225; 5 658 727; 5 733 743 e 5 969 108 .
Os exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir anticorpos em cadeia simples incluem os descritos em patentes U.S. 4 946 778 e 5 258 498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:7995-7999; e Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040 .
Os anticorpos monoclonais úteis incluem anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos e fragmentos de anticorpos activos funcionalmente, não se lhes limitando. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados por qualquer de numerosas técnicas conhecidas na especialidade (consultar, e.g., Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et 55 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16; e patentes U.S. N.2 5 939 598 e 5 770 429) .
Podem produzir-se anticorpos completamente humanos usando ratinhos transgénicos que são incapazes de expressar genes de cadeias pesada e leve de imunoglobulina endógena, mas que podem expressar genes de cadeia pesada e leve humana. Os ratinhos transgénicos são imunizados de forma normal com um antigénio seleccionado, e.g. todo ou parte de um polipéptido do invento. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio podem ser obtidos usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana contidos nos ratinhos transgénicos rearranjam-se durante a diferenciação de células B e subsequentemente sofrem troca de classe e mutação somática. Assim, usando tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma revisão desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, consultar, e.g., Lonberg e Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, consultar, e.g. patentes U.S. N.2 5 625 126; 5 633 425; 5 569 825; 5 661 016; e 5 545 806. Podem obter-se outros anticorpos humanos comercialmente, por exemplo, de Abgcnix, Inc. (Freemont, CA) e Medarex (Sunnyvale, CA).
Podem gerar-se anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo seleccionado usando uma técnica denominada "selecção guiada". Nesta abordagem usa-se um anticorpo monoclonal não humano seleccionado, e.g. um anticorpo de ratinho, para guiar a selecção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo. (consultar, e.g., Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na especialidade, incluindo bibliotecas de disposição de fagos (Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al. , 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Quan e Cárter, 2002, The rise of monoclonal antlbodles as therapeutics, em Anti-IgE and Allergic Disease, 56 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Jardieu e Fick Jr., ed., Mareei Dekker, New York, NY, capítulo 20, p. 427-469).
Adicionalmente, os anticorpos recombinantes, tais como os anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, compreendendo partes tanto humanas, como não humanas, que podem ser preparados usando técnicas de ADN recombinante, são anticorpos úteis. (Consultar, e.g., Cabilly et al., patente U.S. N.2 4 816 567; e Boss et al. , patente U.S. N.2 4 816 397, ambas aqui incorporadas por referência na sua globalidade.) Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) da espécie não humana e uma região de esqueleto de uma molécula de imunoglobulina humana. (Consultar, e.g., Queen, patente U.S. N.2 5 585 089, que se incorpora aqui por referência na sua globalidade.)
Em algumas concretizações, resíduos de esqueleto nas regiões de esqueleto humanas serão substituídos pelos resíduos correspondentes da CDR de anticorpo dador para alterar, de preferência melhorar, a ligação de antigénio. Estas substituições de esqueleto são identificadas por métodos bem conhecidos na especialidade, e.g. por modelação das interaeções dos resíduos da CDR e esqueleto para identificar os resíduos de esqueleto importantes para ligação de antigénio e comparação de sequência para identificar resíduos de esqueleto pouco usuais em determinadas posições. (Consultar, e.g. patente U.S. N.2 5 585 089; Riechmann et al., 1988,
Nature 332:323.) Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na especialidade incluindo, por exemplo, transplante de CDR (consultar, e.g., EP 0239400; publicação PCT N.2 WO 91/09967; patentes U.S. N.2 5 225 539; 5 530 101; e 5 585 089), formação de cobertura ou reformação de superfície (consultar, e.g. EP 0592106; EP 0519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7 ( 6) :805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:969-973) e permuta de cadeia (consultar e.g. patente U.S. N.2 5 565 332). 57 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Tais anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidos por técnicas de ADN recombinante conhecidas na especialidade, por exemplo usando métodos descritos em publicações internacionais N.2 WO 87/02671 e WO 86/01533; publicações de patente europeia N.2 EP 0184187; EP 0171496; EP 0173494; e EP 012023; patentes U.S. N.2 4 816 567 e 5 225 539; Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et ai., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc.
Natl. Acid. Sei. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Câncer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446- 449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Câncer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; e Beidler et al., 1988, J. Immunol 141:4053-4060.
Em algumas concretizações, o anticorpo é monoespecifico. O anticorpo pode também ser um anticorpo biespecifico. Os métodos para preparar anticorpos biespecificos são conhecidos na especialidade. A produção tradicional de anticorpos biespecificos completos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm diferentes especificidades (consultar, e.g., Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Dado a distribuição aleatória das cadeias pesada e leve de
imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecifica correcta. Divulgam-se procedimentos similares em publicação internacional N.2 WO 93/08829 e Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.
De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação pretendidas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão tipicamente é uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte dos domínios de 58 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ dobra, CH2 e CH3. É preferível que a primeira região constante de cadeia pesada (ChI) , contendo o local necessário para a ligação de cadeia leve, esteja presente em pelo menos uma das fusões. Inserem-se os ácidos nucleicos com sequências que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, caso se pretenda, a cadeia leve de imunoglobulina, em vectores de expressão separados e são co-transfectados para um organismo hospedeiro adequado. Tal proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em concretizações em que o uso de razões desiguais das três cadeias polipeptídicas usadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. No entanto, é possível inserir as sequências de codificação de duas ou todas as três cadeias polipeptídicas num vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em elevados rendimentos ou quando as razões não têm um significado particular.
Numa concretização desta abordagem, os anticorpos biespecíficos podem ter uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico pretendido de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, dado que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina apenas em metade da molécula biespecifica proporciona uma forma fácil de separação (publicação internacional N.2 WO 94/04690.
Para detalhes adicionais para gerar anticorpos biespecíficos consultar, por exemplo, Suresh et al., 1996, Methods in Enzymology 121:210; Rodrigues et al., 1993, J. Immunology 151:6954-6961; Cárter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Cárter et al., 1995, J. Hematotherapy 4:463-470; Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology 16:677-681. Usando tais técnicas, podem preparar-se anticorpos biespecíficos para uso no tratamento ou prevenção de doença, tal como aqui definido. 59 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Também se descrevem anticorpos bifuncionais em publicação de patente europeia N.2 EP 0105360. Tal como divulgado nesta referência, podem derivar-se anticorpos híbridos ou bifuncionais, quer biologicamente, e.g., por técnicas de fusão celular, quer quimicamente, especialmente com agentes de reticulação ou reagentes de formação de pontes dissulfureto, e podem compreender anticorpos completos ou seus fragmentos. Divulgam-se métodos para obter tais anticorpos híbridos, por exemplo em publicação internacional N.2 WO 83/03679 e publicação de patente europeia N.2 EP 0217577. O anticorpo também pode ser um fragmento, derivado ou análogo de um anticorpo funcionalmente activo que se liga imunoespecificamente a um antigénio alvo pretendido (e.g., um antigénio de célula de cancro ou um antigénio de célula efectora não maligna) ou outros anticorpos que se ligam a célula (s) ou matriz alvo. A este respeito, "funcionalmente activo" significa que o fragmento, derivado ou análogo é capaz de desencadear anticorpos anti-anti-idiotipo, que reconhecem o mesmo antigénio que o anticorpo, do qual é derivado o fragmento, derivado ou análogo, reconhece. Num exemplo de concretização, a antigenicidade do idiotipo da molécula de imunoglobulina pode ser melhorada por deleção de sequências de esqueleto e CDR que são C-terminal à sequência CDR que reconhece especificamente o antigénio. Para determinar quais as sequências CDR que ligam o antigénio podem usar-se péptidos sintéticos contendo as sequências CDR em ensaios de ligação com antigénio, por qualquer método de ensaio de ligação conhecido na especialidade (e.g., o ensaio de BIAcore) (consultar, e.g., Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, National Institute of Health, Bethesda, Md; Kabat et al., 1980, J. Immunology 125 (3) :961-969) .
Outros anticorpos úteis incluem fragmentos de anticorpos tais como fragmentos F (ab' fragmentos Fab' , fragmentos Fab, Fv, anticorpos em cadeia simples (SCA) (e.g., tal como descrito em patente U.S. N.2 4 946 778; Bird, 1988, Science 60 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; e Ward et ai., 1989, Nature 334:544-54), scFv, sc-Fv-Fc, FvdsFv, minicorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, não se lhes limitando, ou qualquer outra molécula compreendendo CDR e que tem a mesma especificidade do anticorpo.
Noutras concretizações, o anticorpo é uma proteína de fusão de um anticorpo ou um seu fragmento funcionalmente activo, por exemplo no qual o anticorpo está fundido através de uma ligação covalente (e.g., uma ligação peptídica), a N-terminal ou a C-terminal de uma sequência de aminoácidos de outra proteína (ou sua parte, tipicamente pelo menos uma parte de 10, 20 ou 50 aminoácidos da proteína) que não é o anticorpo. Em algumas concretizações, o anticorpo ou seu fragmento pode ser ligado covalentemente a outra proteína no N-terminal do domínio constante.
Tal como apresentado anteriormente, um agente de ligação ao alvo pode ser um derivado de um anticorpo de ligação a alvo. Geralmente, um derivado de anticorpo compreende um fragmento de ligação ao antigénio ou polipéptidos substituídos conservativamente e pelo menos uma região de polipéptido ou outra parte heteróloga ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode ser modificado, e.g. pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula. As modificações típicas incluem, e.g. desglicosilação, glicosilação, acetilação, modificação com PEG, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protectores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular (e.g. uma molécula de ligação de albumina) ou outras proteínas e semelhantes. Pode efectuar-se qualquer de várias modificações químicas por técnicas conhecidas, incluindo clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc, não se lhes limitando.
Em algumas concretizações, o derivado de anticorpo é um multímero, tal como, por exemplo, um dímero, compreendendo um ou mais monómeros, em que cada monómero inclui (i) uma região 61 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ de ligação ao antigénio de um anticorpo ou uma região de polipéptido dele derivado (tal como, e.g. por substituição conservativa de um ou mais aminoácidos) e (ii) uma região de polipéptido de multimerização (e.g., dimerização), de modo que o derivado de anticorpo forme multimeros (e.g., homodímeros) que se ligam especificamente ao antigénio alvo. Em concretizações típicas, uma região de ligação ao antigénio de um anticorpo ou uma região de polipéptido dele derivada é fundida recombinante ou quimicamente a uma proteína heteróloga, em que a proteína heteróloga compreende um domínio de dimerização ou multimerização. Antes da administração do derivado de anticorpo a um indivíduo para o objectivo de tratar ou prevenir doenças imunológicas ou cancros, o derivado é sujeito a condições que permitem a formação de um homodímero ou heterodímero. Um heterodímero, tal como aqui usado, pode compreender domínios de dimerização idênticos mas diferentes regiões de ligação ao antigénio, regiões de ligação ao antigénio idênticas mas domínios de dimerização diferentes ou regiões de ligação ao antigénio e domínios de dimerização diferentes.
Os domínios de dimerização típicos são os originários de factores de transcrição. Numa concretização, o domínio de dimerização é o de uma região básica de uma cremalheira de leucina ("bZIP") (consultar Vinson et al., 1989, Science 246:911-916) . Os domínios de cremalheira de leucina úteis incluem, por exemplo, os do factor de transcrição GCN4 de levedura, do factor de transcrição CCAAT/proteína C de ligação a facilitador/EBP de mamífero e a transformação nuclear em produtos de oncogene, Fos e Jun. (Consultar, e.g., Landschultz et al., 1988, Science 240:1759-64; Baxevanis e Vinson, 1993,
Curr. Op. Gen. Devei. 3:278-285; O' Sheaet al., 1989, Science 243:538-542). Noutra concretização, o domínio de dimerização é o de uma região básica de proteína hélice-ansa-hélice ("bHLH"). (Consultar, e.g., Murre et al., 1989, Cell 56:777-783. Consultar Davis et al., 1990, Cell 60:733-746; Voronova e Baltimore, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4722-26.) São proteínas hHLH particularmente úteis myc, max e mac. 62 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Ainda noutras concretizações, o domínio de dimerização é uma região constante de imunoglobulina tal como, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada ou um seu domínio (e.g., um domínio ChI, um domínio Ch2 e/ou um domínio Ch3) . (Consultar, e.g., patentes U.S. N.2 5 155 027; 5 336 603; 5 359 046; e 5 349 053; EP 0367166; e WO 96/04388). São conhecidos heterodímeros que se formam entre Fos e Jun (Bohmann et ai., 1987, Science 238:1386-1392), entre membros da família ATF/CREB (Hai et al., 1989, Genes Dev. 3:2083- 2090), entre membros da família C/EBP (Cao et al., 1991, Genes Dev. 5:1538-52; Williams et al., 1991, Genes Dev. 5:1553-67; Roman et al., 1990, Genes Dev. 4:1404-15) e entre membros das famílias ATF/CREB e Fos/Jun (Hai e Curran, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:3720-24). Assim, quando se administra um agente de ligação ao alvo variante a um indivíduo como um heterodímero compreendendo diferentes domínios de dimerização, pode usar-se qualquer combinação dos anteriores.
Noutras concretizações, um derivado de anticorpo é um anticorpo conjugado a um segundo anticorpo (um "heteroconjugado de anticorpo") (consultar, e.g., patente U.S. N.2 4 676 980) . Os heteroconjugados úteis para a levar à prática dos presentes métodos compreendem um anticorpo que se liga ao antigénio alvo (e.g., um anticorpo que tem as CDR e/ou cadeias pesadas de um anticorpo monoclonal, e.g. 2F2 ou 1F6) e um anticorpo que se liga a um receptor ou complexo de receptores de superfície. Em concretizações típicas, a ligação da parte do anticorpo multiespecífico à segunda molécula ou complexo de receptores de superfície celular melhora as funções do anticorpo. Noutras concretizações, o anticorpo pode ser um agente terapêutico. Descrevem-se aqui agentes terapêuticos de anticorpo adequados.
Em exemplos de concretizações, o anticorpo ou seu derivado inibe competitivamente a ligação de um anticorpo monoclonal ao seu antigénio alvo ou a um ligando do antigénio alvo, tal como determinado por qualquer método conhecido na especialidade para determinar ligação competitiva (e.g. um imunoensaio). Em 63 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ concretizações típicas, ο anticorpo inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal ou do ligando em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 75%. Noutras concretizações, o anticorpo inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal ou do ligando em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%.
Em exemplos de concretizações, o anticorpo ou seu derivado inibe competitivamente a ligação de mAb 1F6 ou 2F2 a CD70, tal como determinado por qualquer método conhecido na especialidade para determinar ligação competitiva (tal como, e.g. os imunoensaios aqui descritos). Em concretizações típicas, o anticorpo inibe competitivamente a ligação de 1F6 ou 2F2 a CD70 em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 75%. Noutras concretizações, o anticorpo inibe competitivamente a ligação de 1F6 ou 2F2 a CD70 em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%.
Podem ensaiar-se os anticorpos para ligação específica a um antigénio alvo por qualquer de vários métodos conhecidos. Os imunoensaios que podem ser usados incluem, por exemplo, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos usando técnicas tais como transferência "Western", radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reacções de precipitina, reacções de precipitina por difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteína A. Tais ensaios são de rotina e são bem conhecidos na especialidade. (Consultar, e.g., Ausubel et ai., ed., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., New York, 4a ed. 1999); Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999.)
Adicionalmente, a afinidade de ligação de um anticorpo ao seu antigénio alvo e a velocidade de dissociação de uma interacção anticorpo-alvo pode ser determinada por ensaios de 64 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ ligação competitivos. Um exemplo de um ensaio de ligação competitivo é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antigénio marcado (e.g., 3H ou 125I) com o anticorpo de interesse, na presença de quantidades crescentes de antigénio não marcado, e a detecção do anticorpo ligado ao antigénio marcado. A afinidade do anticorpo para o antigénio alvo e as velocidades de dissociação podem ser determinadas a partir dos dados por análise do gráfico de Scatchard. A competição com um segundo anticorpo também pode ser determinada usando radioimunoensaios. Neste caso, o antigénio é incubado com o anticorpo de interesse conjugado a um composto marcado (e.g., 3H ou 125I) , na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado. Alternativamente, a afinidade de ligação de um anticorpo ao seu antigénio e as velocidades de associação e dissociação de uma interacção anticorpo-antigénio podem ser determinadas por ressonância plasmónica de superfície. Em algumas concretizações, os anticorpos ou seus derivados podem dirigir-se e acumular-se na membrana de uma célula que expressa antigénio alvo.
De acordo com os métodos aqui descritos, os agentes de ligação ao alvo variantes (e.g. anticorpos ou seus derivados ou fragmentos), quando conjugados a um agente terapêutico, podem ser internalizados e acumulam-se numa célula que expressa antigénio alvo, onde o agente terapêutico exerce um efeito (e.g. um efeito citotóxico, citostático ou de imunomodulação). Em concretizações adicionais, os agentes de ligação ao alvo variantes (e.g. anticorpos ou seus derivados ou fragmentos) , quando conjugados a um agente terapêutico, podem ser dirigidos a uma célula que expressa um antigénio alvo na membrana, onde se acumulam e onde o agente terapêutico exerce um efeito (e.g., um efeito citotóxico, citostático ou de imunomodulação). Ainda noutras concretizações, os agentes de ligação ao alvo variantes (e.g., anticorpos ou seus derivados ou fragmentos), quando conjugados a um agente terapêutico, podem ser dirigidos a uma molécula biológica numa célula (e.g. um agente inflamatório) e acumulam-se nela ou em células adjacentes que excretam ou se ligam à molécula 65 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ biológica, onde ο agente terapêutico exerce um efeito (e.g. um efeito citotóxico, citostático ou de imunomodulação).
Pode determinar-se facilmente se um determinado agente de ligação ao alvo variante (e.g. anticorpo ou seu derivado ou fragmento), quando conjugado a um agente terapêutico, exerce um efeito terapêutico correspondente por ligação a uma célula que expressa o antigénio alvo, e.g. através de (1) incubação de células que expressam antigénio alvo independentemente com o agente de ligação ao alvo, (2) incubação das células com um reagente secundário que está conjugado ao agente terapêutico e que se liga especificamente ao agente de ligação ao alvo e (3) ensaio das células para o efeito terapêutico correspondente. Podem avaliar-se facilmente vários anticorpos ou derivados de anticorpo através de tais ensaios usando um reagente secundário que se liga especificamente a uma região de polipéptido compartilhada por cada anticorpo ou seu derivado (e.g. um anticorpo anti-Ig). Por exemplo, um mAb anti-CD70 que liga CD70 e exerce um efeito citotóxico quando conjugado a um agente citotóxico (e.g. uma auristatina tal como, por exemplo, AFP, MMAF ou MMAE) pode ser identificado por um ensaio de imunotoxicidade indirecto tal como, por exemplo, descrito por Chun et ai., 2003, Suplemento a Clinicai Câncer Research, Vol. 9. Sucintamente, o agente citotóxico é conjugado a um anticorpo secundário (e.g. para mAb murinos, um anti-IgG de ratinho policlonal); incubam-se células que expressam CD70 com o anticorpo primário e com o anticorpo secundário conjugado a agente citotóxico (e.g. em placas de 96 poços, usando sobrenadante de hibridoma para o anticorpo primário); e avalia-se a citotoxicidade dependente de anticorpo primário num ensaio de citotoxicidade padrão (e.g. um ensaio de viabilidade celular MTT).
Os anticorpos e seus derivados podem ser produzidos por métodos conhecidos na especialidade para a síntese de proteínas, tipicamente e.g. por técnicas de expressão recombinante. A expressão recombinante de um anticorpo ou seu derivado que se liga ao antigénio alvo inclui tipicamente a construção de um vector de expressão contendo um ácido 66 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ nucleico que codifica o anticorpo ou seu derivado. Pode produzir-se um vector para a produção da molécula de proteína por tecnologia de ADN recombinante, usando técnicas conhecidas na especialidade. Podem usar-se técnicas tais como, por exemplo, as descritas em Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3â ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2a ed., 1989); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., John Wiley and Sons, New York, 4a ed., 1999); e Glick e Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and
Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2a ed., 1998) para métodos de ácido nucleico recombinante, síntese de ácido nucleico, cultura celular, incorporação de transgene e expressão de proteína recombinante.
Por exemplo, para expressão recombinante de um anticorpo, um vector de expressão pode codificar uma sua cadeia pesada ou leve, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, ligada operacionalmente a um promotor. Um vector de expressão pode incluir, por exemplo, a sequência de nucleótidos que codifica a região constante da molécula de anticorpo (consultar, e.g., publicações PCT N.2 WO 86/05807 e WO 89/01036; e patente U.S. N.2 5 122 464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado para tal vector para a expressão da cadeia pesada ou leve completa. O vector de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir o anticorpo. Em concretizações típicas para a expressão de anticorpos em cadeia dupla, os vectores que codificam as cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobulina completa.
Podem usar-se vários sistemas de vectores de expressão em hospedeiros procarióticos e eucarióticos para expressar um anticorpo ou seu derivado. Tipicamente, usam-se células eucarióticas, em particular para moléculas de anticorpo 67 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ recombinante completas, para a expressão da proteína recombinante. Por exemplo, células de mamífero tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), conjuntamente com um vector, tal como o elemento promotor do gene precoce intermediário major de citomegalovírus humano, é um sistema de expressão eficaz para a produção de anticorpos e seus derivados (consultar, e.g. Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Biotechnology 8:2).
Outros sistemas de expressão-hospedeiro incluem, por exemplo, sistemas de expressão baseados em plasmídeo em células bacterianas (consultar, e.g., Ruther et al., 1983, EMBO 1,2:1791; Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acld Res. 13:3101-3109; Van Heeke e Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); sistemas de insecto tal como, e.g. o uso do vector de expressão de virus de poliedrose nuclear de
Autographa californica (AcNPV) em células de Spodoptera frugiperda; e sistemas de expressão baseados em virus em células de mamífero, tais como, e.g. sistemas baseados em adenovírus (consultar, e.g., Logan e Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:355-359; Bittner et al., 1987, Methods Enzymol. 153:51-544).
Adicionalmente, pode seleccionar-se uma estirpe de célula hospedeira que modula a expressão das sequências inseridas ou que modifica e processa o produto génico da forma específica pretendida. Podem seleccionar-se linhas celulares ou sistemas hospedeiros adequados para assegurar a modificação e processamento correcto (e.g. glicosilação, fosforilação e clivagem) da proteína expressa. Para este fim, podem usar-se células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento adequado do produto de transcrição primário e produto génico. Tais células hospedeiras de mamífero incluem, por exemplo CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 e W138.
Tipicamente usa-se um sistema de expressão estável para produção prolongada e de elevado rendimento do anticorpo recombinante ou seu derivado ou outro agente de ligação ao 68 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ alvo. Por exemplo, podem modificar-se racionalmente linhas celulares que expressam estavelmente o anticorpo ou seu derivado por transformação de células hospedeiras com ADN controlado por elementos de controlo de expressão adequados (e.g. sequências de promotor e facilitador, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação) e um marcador seleccionável, seguido por cultura das células transformadas num meio selectivo. O marcador seleccionável confere resistência à selecção e permite que as células integrem estavelmente o ADN nos seus cromossomas e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos para linhas celulares. Podem usar-se vários sistemas de selecção incluindo, por exemplo, os genes de timidina-cinase de virus herpes simplex, de hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase e de adenina-fosforribosiltransferase, que podem ser usados em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Igualmente, pode usar-se resistência a antimetabolito como base de selecção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato; gpt, que confere resistência a ácido micofenólico; neo, que confere resistência a aminoglicósido G-418; e hygro, que confere resistência a higromicina. Podem aplicar-se rotineiramente métodos usualmente conhecidos na especialidade de tecnologia de ADN recombinante para seleccionar o clone recombinante pretendido e tais métodos são descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. ed., John Wiley and Sons, N.Y., 1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual (Stockton Press, N.Y., 1990); Current Protocols in Human Genetics (Dracopoli et al. ed., John Wiley and Sons, N.Y., 1994, capítulos 12 e 13); e Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1.
Os níveis de expressão de um anticorpo ou derivado podem ser aumentados por amplificação de vector. (Consultar na generalidade, e.g., Bebbington e Hentschel, The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987) .) Quando um marcador no sistema de vector que expressa um anticorpo ou seu derivado é amplificável, um 69 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ aumento do nível de inibidor presente no meio de cultura da célula hospedeira seleccionará células hospedeiras que têm um número de cópias aumentado de um gene marcador que confere resistência ao inibidor. O número de cópias de um gene de um anticorpo associado também será aumentado, aumentando assim a expressão do anticorpo ou seu derivado (consultar Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
Quando o anticorpo compreende tanto a cadeia pesada, como a cadeia leve ou seus derivados, a célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vectores de expressão, em que o primeiro vector codifica a proteína de cadeia pesada e o vector segundo codifica a proteína de cadeia leve. Os dois vectores podem conter marcadores seleccionáveis idênticos que permitem expressão igual de proteínas de cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode usar-se um único vector que codifica e é capaz de expressar proteínas tanto de cadeia pesada, como leve. Em tais situações, coloca-se tipicamente a cadeia leve antes da cadeia pesada para evitar um excesso tóxico de cadeia pesada livre (consultar Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2197). As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.
Uma vez produzido um anticorpo ou seu derivado (e.g. por um animal, síntese química ou expressão recombinante), este pode ser purificado por qualquer método adequado para purificação de proteínas incluindo, por exemplo, por cromatografia (e.g. cromatografia de permuta iónica ou de afinidade (tal como, por exemplo, cromatografia de proteína A para purificação de anticorpos com uma região Fc intacta)), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Um anticorpo ou seu derivado pode, por exemplo, ser fundido a uma sequência marcadora, tal como um péptido, para facilitar a purificação por cromatografia de afinidade. As sequências de aminoácidos marcadoras adequadas incluem, e.g. um péptido hexa-histidina, tal como o marcador proporcionado pelo vector pQE (QIAGEN, Inc. , Chatsworth, CA, 91311) e o marcador "HA", que 70 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) e o marcador "flag".
Uma vez produzido o anticorpo ou seu derivado, determina-se a sua capacidade de exercer um efeito citostático ou citotóxico na expressão de células de cancro ou num efeito de imunomodulação numa célula imunitária pelos métodos descritos seguidamente ou tal como conhecido na especialidade.
Para minimizar a actividade do anticorpo ter como alvo células (e.g. células imunitárias ou células de cancro), pode usar-se um anticorpo que se liga especificamente a antigénio alvo ligado a membrana celular, mas não a antigénio solúvel, de modo que o anticorpo se concentre na superfície celular da célula alvo.
Tipicamente, o agente de ligação ao alvo (e.g. anticorpo ou derivado) está substancialmente purificado (e.g. substancialmente isento de substâncias que limitam o seu efeito ou produzem efeitos secundários indesejáveis). Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo está pelo menos cerca de 40% puro, pelo menos cerca de 50% puro ou pelo menos cerca de 60% puro. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo está pelo menos cerca de 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95% ou 95-98% puro. Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo está aproximadamente 99% puro. III. Outros agentes de ligação ao alvo
Os agentes de ligação ao alvo adicionais incluem proteínas de fusão (i.e. proteínas que são fundidas recombinantemente ou conjugadas quimicamente, incluindo conjugação covalente e não covalente) a proteínas heterólogas (de tipicamente pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou pelo menos 100 aminoácidos). Tais agentes de ligação ao alvo podem incluir uma parte que se liga ao antigénio alvo e um domínio Fc de imunoglobulina (Ig) variante ou um seu equivalente funcional. 71 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Tal como aqui usado, um equivalente funcional do domínio Fc de Ig liga-se a receptor Fc numa célula imunitária com actividade fagocítica ou lítica ou por ligação de um ou mais domínios efectores Fc a componentes do sistema de complemento. Uma variante de um equivalente funcional de domínio Fc de Ig apresenta ligação reduzida a um receptor Fc , tal como aqui descrito adicionalmente. A proteína de fusão não tem necessariamente que estar directamente ligada, mas pode ocorrer através de sequências ligantes.
Por exemplo, pode produzir-se recombinantemente um agente de ligação ao alvo por fusão da região de codificação de uma ou mais CDR ou da região variável de um anticorpo em quadro de leitura com uma sequência de codificação para uma proteína heteróloga. A proteína heteróloga pode incluir, por exemplo, um domínio Fc variante de Ig, uma variante de um seu equivalente funcional ou outro domínio funcional para proporcionar uma ou mais das seguintes características: promover expressão estável; proporcionar um meio de facilitar expressão recombinante de elevado rendimento; proporcionar uma actividade citostática, citotóxica ou de imunomodulação; e/ou proporcionar um domínio de multimerização.
Em algumas concretizações, o agente de ligação ao alvo pode incluir uma ou mais CDR de um anticorpo que se liga ao antigénio alvo, pelo menos uma parte de uma região Fc, e apresenta ligação reduzida para um receptor Fc IV. Conjugados de anticorpo e fármaco
As composições úteis no tratamento de um cancro ou doença imunológica que expressa antigénio alvo compreendem conjugados de anticorpo e fármaco (ADC) ou derivados de ADC. Um "ADC", tal como aqui usado, refere-se a um anticorpo conjugado a um agente terapêutico. Um "derivado de ADC", tal como aqui usado, refere-se a derivado de um anticorpo conjugado a um agente terapêutico. Um "ADC" ou "derivado de ADC" também inclui outros agentes de ligação que ligam um antigénio alvo e compreende pelo menos uma parte de uma região Fc conjugada a 72 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ um agente terapêutico. Em determinadas concretizações, o ADC compreende um anticorpo anti-CD70 (e.g. mAb 1F6 ou 2F2 ou um seu fragmento ou derivado incluindo, por exemplo, uma sua forma quimérica ou humanizada) . Os ADC ou derivados de ADC, tal como aqui descritos, produzem efeitos clinicamente benéficos nas células que expressam antigénio alvo quando administrados a um indivíduo com um cancro ou doença imunológica que expressa antigénio, tipicamente quando administrado sozinho, mas também em combinação com outros agentes terapêuticos.
Em concretizações típicas, o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação é conjugado a um agente citotóxico ou de imunomodulação, de modo que o ADC ou derivado de ADC resultante exerça um efeito citotóxico ou citostático numa célula de cancro que expressa antigénio alvo ou um efeito citotóxico, citostático ou de imunomodulação numa célula imunitária (e.g. um linfócito ou célula dendrítica activada) quando absorvido ou internalizado pela célula. São partes particularmente adequadas para conjugação a anticorpos ou derivados de anticorpo, ou outros agentes de ligação, agentes quimioterapêuticos, enzimas de conversão de profármacos, isótopos ou compostos radioactivos ou toxinas. Por exemplo, um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação pode ser conjugado a um agente citotóxico, tal como um agente quimioterapêutico (consultar seguidamente), ou uma toxina (e.g. um agente citostático ou citocida tal como, e.g. abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina de difteria). Apresentam-se seguidamente exemplos de agentes adicionais que são úteis para conjugar a moléculas de anticorpo.
Noutras concretizações, o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação é conjugado a uma enzima de conversão de profármaco. A enzima de conversão de profármaco pode ser fundida recombinantemente ao anticorpo ou seu derivado ou conjugada quimicamente a ele usando métodos conhecidos. Os exemplos de enzimas de conversão de profármaco são carboxipeptidase G2, beta-glucuronidase, penicilina-V-amidase, 73 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ penicilina-G-amidase, -lactamase, -glucosidase, nitro-redutase e carboxipeptidase A. São bem conhecidas técnicas para conjugar agentes terapêuticos a proteínas e em particular a anticorpos. (Consultar, e.g., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy" em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy (Reisfeld et al. ed., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" em Controlled Drug Delivery (Robinson et al. ed., Mareei Dekker, Inc., 2a ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review" em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications (Pinchera et al. ed., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy" em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy (Baldwin et al. ed., Academic Press, 1985); e Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Consultar também, e.g., publicação PCT WO 89/12624).
De acordo com os métodos aqui descritos, o ADC ou derivado de ADC é internalizado e acumula-se no interior de uma célula que expressa antigénio alvo, onde o ADC ou derivado de ADC exerce um efeito terapêutico (e.g., um efeito citotóxico, citostático ou de imunomodulação).
Tipicamente, quando se usa um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação conjugado a um agente terapêutico (e.g. um fármaco ou uma enzima de conversão de profármaco), o agente é preferentemente activo quando internalizado por células do cancro a ser tratado ou por células imunitárias activadas (e.g. linfócitos ou células dendríticas activadas). Noutras concretizações, o ADC ou derivado de ADC não é internalizado e o fármaco é eficaz a eliminar ou inibir células que expressam antigénio alvo por ligação à membrana celular. Ainda noutras concretizações, o ADC ou seus derivados ADC podem ser dirigidos a moléculas biológicas numa célula (e.g. um agente inflamatório) e acumular-se em células que excretam ou que se ligam à molécula biológica ou em células 74 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ adjacentes, onde ο agente terapêutico exerce um efeito (e.g., um efeito citotóxico, citostático ou de imunomodulação).
Para minimizar a actividade do agente terapêutico fora das células imunitárias activadas ou células de cancro que expressam antigénio alvo, pode usar-se um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação que se liga especificamente a antigénio alvo ligado a membrana celular, mas não a antigénio alvo solúvel, de modo que o agente terapêutico se concentre na superfície celular da célula imunitária activada ou célula de cancro que expressa antigénio alvo. Alternativamente, numa concretização mais típica, o agente terapêutico é conjugado de forma a reduzir a sua actividade, a menos que seja clivado do anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação (e.g. por hidrólise ou por um agente de clivagem). Em tais concretizações, o agente terapêutico é ligado ao seu derivado ou outro agente de ligação com um ligante clivável que é sensível a clivagem no ambiente intracelular da célula imunitária activada ou célula de cancro que expressa antigénio alvo, mas que não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, de modo que o conjugado é clivado do ou do seu derivado ou do outro agente de ligação quando é internalizado pela célula imunitária activada ou célula de cancro que expressa antigénio alvo (e.g. no endossoma ou, por exemplo devido a sensibilidade a pH ou sensibilidade a protease, no ambiente lisossómico ou em cavéolos).
Adicionalmente, em determinadas concretizações, o ADC ou derivado de ADC compreende um agente terapêutico que é carregado relativamente à membrana plasmática, minimizando assim adicionalmente a capacidade do agente atravessar a membrana plasmática após internalização por uma célula. Tal como aqui usado, um "agente carregado" significa um agente que (a) está polarizado, de modo que uma região do agente tem uma carga relativamente à membrana plasmática ou (b) tem uma carga global relativamente à membrana plasmática. 75 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Tipicamente, ο ADC ou derivado de ADC está substancialmente purificado (e.g. substancialmente isento de substâncias que limitam o seu efeito ou produzem efeitos secundários indesejados) . Em determinadas concretizações especificas, o ADC ou derivado de ADC está 40% puro, mais tipicamente cerca de 50% puro e ainda mais tipicamente cerca de 60% puro. Noutras concretizações especificas, o ADC ou derivado de ADC está pelo menos aproximadamente 60-65%, 65- 70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95% ou 95-98% puro.
Noutra concretização especifica, o ADC ou derivado de ADC é aproximadamente 99% puro. A. Liqantes
Tipicamente, o ADC ou derivado de ADC compreende uma reqião liqante entre o agente terapêutico e o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. Tal como mencionado anteriormente, em concretizações típicas, o ligante é clivável em condições intracelulares, de modo que a clivagem do ligante liberta o agente terapêutico do anticorpo no ambiente intracelular.
Por exemplo, em algumas concretizações, o ligante é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (e.g. dentro de um lisossoma ou endossoma ou cavéolo) . O ligante pode ser, e.g. um ligante peptidilo que é clivado por uma enzima peptidase ou protease intracelular, incluindo uma protease lisossómica ou endossómica, não se lhes limitando. Tipicamente, o ligante peptidilo tem pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento. Os agentes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e plasmina, sabendo-se que todas elas hidrolisam derivados dipéptido de fármaco resultando na libertação do fármaco activo dentro de células alvo (consultar, e.g. Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Mais típicos são ligantes peptidilo que são cliváveis por enzimas que estão presentes em células que expressam CD70. Por exemplo, pode usar-se um ligante peptidilo que é clivável pela protease catepsina-B dependente 76 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ de tiol, que é altamente expressa em tecido canceroso (e.g. um ligante Phe-Leu ou um ligante Gly-Phe-Leu-Gly). São descritos outros ligantes, e.g. em patente U.S. N.2 6 214 345. Em concretizações especificas, o ligante peptidilo clivável por uma protease intracelular é um ligante Val-Cit ou um ligante Phe-Lys (consultar, e.g. patente U.S. 6 214 345, que descreve a síntese de doxorrubicina com o ligante val-cit). Uma vantagem de usar libertação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades séricas dos conjugados são tipicamente elevadas.
Noutras concretizações, o ligante clivável é sensível a pH, i.e. sensível a hidrólise a determinados valores de pH. Tipicamente, o ligante sensível a pH é hidrolisável em condições ácidas. Por exemplo, pode usar-se um ligante lábil a ácido que é hidrolisável no lisossoma (e.g. uma hidrazona, semicarbazona, tio-semicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou semelhantes). (Consultar, e.g. patentes U.S. N.e 5 122 368; 5 824 805; 5 622 929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutic 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Tais ligantes são relativamente estáveis em condições de pH neutro, tais como as do sangue, mas são instáveis a pH inferior a 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossoma. Em determinadas concretizações, o ligante hidrolisável é um ligante tioéter (tal como, e.g. um tioéter ligado ao agente terapêutico através de uma ligação acil-hidrazona (consultar, e.g. patente U.S. N.2 5 622 929)).
Ainda noutras concretizações, o ligante é clivável em condições redutoras (e.g. um ligante dissulfureto). São conhecidos na especialidade vários ligantes dissulfureto incluindo, por exemplo, os que podem ser formados usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato) , SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-
piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridilditio)tolueno) , SPDB e SMPT (Consultar, e.g. Thorpe et al., 1987, Câncer Res. 47:5924- 5931; Wawrzynczak et al., em Immunoconjugates: Antibody 77 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Conjugates in Radioimagery and Therapy of Câncer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Consultar também patente U.S. N.2 4 880 935.)
Ainda noutras concretizações especificas, o ligante é um ligante malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), um ligante maleimidobenzoilo (Lau et ai., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304) ou um análogo 3' -N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
Tipicamente, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Tal como aqui usado, "não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular", no contexto de um ligante, significa que não mais do que cerca de 20%, tipicamente não mais do que cerca de 15%, mais tipicamente não mais do que cerca de 10% e ainda mais tipicamente não mais do que cerca de 5%, não mais do que cerca de 3% ou não mais do que cerca de 1% dos ligantes, numa amostra de ADC ou derivado de ADC, são clivados quando o ADC ou derivado de ADC está presente num ambiente extracelular (e.g. em plasma) . Pode determinar-se se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, por exemplo, por incubação independente com plasma de ambos (a) o ADC ou derivado de ADC (a "amostra ADC") e (b) uma quantidade equimolar de anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação ou agente terapêutico não conjugado (a "amostra de controlo") durante um período de tempo predeterminado (e.g. 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e seguidamente comparando a quantidade de anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação ou agente terapêutico não conjugado presente na amostra de ADC com a presente na amostra de controlo, tal como medido por exemplo por cromatografia líquida de elevado desempenho.
Noutras concretizações não mutuamente exclusivas, o ligante promove internalização celular. Em determinadas concretizações, o ligante promove internalização celular quando conjugado ao agente terapêutico (i.e. no meio da parte ligante-agente terapêutico do ADC ou derivado de ADC, tal como aqui descrito). Ainda noutras concretizações, o ligante 78 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ promove internalização celular quando conjugado tanto ao agente terapêutico, como ao anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação (i.e. no meio do ADC ou derivado de ADC, tal como aqui descrito).
Descrevem-se uma variedade de ligantes que podem ser usados nas presentes composições e métodos em WO 2004010957 intitulado "Drug Conjugates and Their Use for Treating Câncer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease" apresentado a 31 de Julho de 2003 e pedido provisório U.S. N.2 60/400 403, intitulado "Drug Conjugates and their use for treating câncer, an autoimmune disease or an infectious disease", apresentado a 31 de Julho de 2002.
Em determinadas concretizações, a unidade ligante tem a seguinte fórmula geral: —T—W—Y— em que: -T- é uma unidade tensora; a é 0 ou 1; cada -W- é independentemente uma unidade de aminoácido; w é independentemente um número inteiro na gama de 0 a 12; -Y- é uma unidade espaçadora; e y é 0, 1 ou 2. 1. A unidade tensora A unidade tensora (-T-), quando presente, liga a unidade de anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação a uma unidade de aminoácido (-W-). Os grupos funcionais úteis que podem estar presentes num anticorpo de ligação ao antigénio alvo, quer naturalmente, quer através de manipulação química, incluem sulfidrilo, amino, hidroxilo, o grupo hidroxilo anomérico de um hidrato de carbono e carboxilo, não se lhes limitando. Os grupos funcionais adequados são sulfidrilo e 79 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ amino. Os grupos sulfidrilo podem ser gerados por redução de pontes dissulfureto intramoleculares de um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. Alternativamente, podem gerar-se grupos sulfidrilo por reacção de um grupo amino de uma parte lisina de um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação com 2-iminotiolano (reagente de Traut) ou outros reagentes de geração de sulfidrilo. Em concretizações especificas, o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação é um anticorpo recombinante ou seu derivado ou outro agente de ligação e é concebido racionalmente para ter uma ou mais lisinas. Noutras concretizações, o anticorpo recombinante ou seu derivado ou outro agente de ligação é concebido racionalmente para ter grupos sulfidrilo adicionais, e.g. cisteinas adicionais.
Em determinadas concretizações especificas, a unidade tensora forma uma ligação com um átomo de enxofre da unidade de anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. O átomo de enxofre pode ser derivado de um grupo sulfidrilo (-SH) de um anticorpo reduzido ou seu derivado ou outro agente de ligação (A). Apresentam-se unidades tensoras representativas destas concretizações entre os parêntesis rectos da fórmulas (Ia) e (Ib; consultar seguidamente), em que A-, -W-, -Y-, -D, w e y são tal como definidos anteriormente e R1 é seleccionado de -Ci-Cio alcileno-, -C3-C8 carbociclo-, -0-(C1-C8 alquilo)-, -arileno-, -C1-C10 alcileno-arileno-, -arileno-Ci-Cio alcileno-, -C1-C10 alcileno-(C3-C8 carbociclo)-, - (C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alcileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alcileno-(C3-C8 heterociclo)-, - (C3-C8 heterociclo) -C1-C10 alcileno-, - (CH2CH2O) r- e - (CH2CH2O) r-CH2-; e r é um número inteiro na gama de 1-10. 80 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ Α- Ο l-R1-C(0 W«
-γ—D (Ia) [ Η | \-j-CH2—CO N—R1—C(O)—Ww—Yy—D m
Uma unidade tensora ilustrativa é a da fórmula (Ia) em que R1 é - (CH2) s-:
Outra unidade tensora ilustrativa é a de fórmula (Ia) em que R1 é - (CH2CH20) r-CH2- e r é 2:
Ainda outra unidade tensora fórmula (Ib) em que R1 é — (CH2) 5—: ilustrativa de
O
O
Em determinadas outras concretizações especificas, a unidade tensora está ligada à unidade de anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação (A) através de uma ligação dissulfureto entre um átomo de enxofre da unidade de anticorpo 81 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ ou seu derivado ou outro agente de ligação e um átomo de enxofre da unidade tensora. Apresenta-se uma unidade tensora representativa desta concretização entre parêntesis rectos da fórmula (II), em que R1, A-, -W-, -Y-, -D, w e y são definidos como anteriormente.
(Π)
Noutras concretizações especificas, o grupo reactivo do tensor contém um local reactivo que pode ser reactivo com um grupo amino de um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. 0 grupo amino pode ser o de uma arginina ou de uma lisina. Os locais reactivos de amino adequados incluem ésteres activados, tais como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, anidridos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos, não se lhes limitando. Apresentam-se unidades tensoras representativas destas concretizações entre parêntesis rectos das fórmulas (Illa) e (Illb), em que R1, A-, -W-, -Y-, -D, w e y são tal como definidos anteriormente;
(Tila) (Illb)
S II
A- -CW-R1-C(0)--ww—Yy—D
H
Ainda noutro aspecto, a função reactiva do tensor contém um local reactivo que é reactivo para um grupo hidrato de carbono modificado que pode estar presente num anticorpo ou 82 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ seu derivado ou outro agente de ligação. Numa concretização especifica, o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação é glicosilado enzimaticamente para proporcionar uma parte de hidrato de carbono. O hidrato de carbono pode ser oxidado suavemente com um reagente tal como periodato de sódio e pode-se condensar a unidade carbonilo resultante do hidrato de carbono oxidado com um tensor que contém uma funcionalidade tal como uma hidrazida, uma oxima, uma amina reactiva, uma hidrazina, uma tio-semicarbazida, um carboxilato de hidrazina e uma aril-hidrazida, tal como as descritas por Kaneko et ai., 1991, Bioconjugate Chem 2:133-41. Apresentam-se unidades tensoras representativas desta concretização dentro de parêntesis rectos das fórmulas (IVa)-(IVc), em que R1, A-, -W-, -Y-, -D, w e y são tal como definidos anteriormente.
-N-NH—R-C(0)-|—Wm—Y—D (TV a)
-N-O—R1-C(0) Ww—Yy-D (TVb) qsr-NH- υ —ϋ-R1-C(0}-
-Ww—Y~D (IVc) 2. A unidade de aminoácido A unidade de aminoácido (-W-) liga a unidade tensora (-T-) à unidade espaçadora (-Y-), caso esteja presente a unidade espaçadora, e liga a unidade tensora ao agente citotóxico ou citostático (unidade de fármaco; D) caso a unidade espaçadora esteja ausente. 83 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ -Ww- é uma unidade dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido ou dodecapéptido. Cada unidade -W- independentemente tem a fórmula apresentada seguidamente dentro de parêntesis rectos e w é um número inteiro na gama de 2 a 12:
em que R2 é hidrogénio, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, benzilo, p-hidroxibenzilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, - (CH2) 3NHC (=NH) NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2) 3NHCOCH3, - (CH2) 3NHCHO, - (CH2) 4NHC (=NH) NH2, - (CH2) 4NH2, - (CH2) 4NHCOCH3, - (CH2) 4NHCHO, - (CH2) 3nhconh2, - (CH2) 4nhconh2, -CH2CH2CH (OH) ch2nh2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenil, ciclo-hexilo,
84 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ A unidade de aminoácido da unidade ligante pode ser clivada enzimaticamente por uma enzima, incluindo uma protéase associada a tumor, não se lhe limitando, para libertar a unidade de fármaco (-D) que é protonada in vivo quando é libertada para proporcionar um fármaco citotóxico (D) .
Apresentam-se unidades W„ ilustrativas nas fórmulas (V)-(VII) :
seguintes: Rf (CH2) 4nh2; (CH2) 4NH2; (CH2) 4NH2; (CH2) 3NHCONH2; (CH2) 3NHCONH2; (CH2) 3NHCONH2; (CH2) 3NHCONH2; (CH2) 3NHCONH2; em que R3 e R4 são os Rf
Benzilo
Metilo
Isopropilo
Isopropilo
Benzilo
Isobutilo sec-butilo
H
Benzilo Benzilo metilo; e (CH2) 3nhc (=nh)nh2; 85 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
(VI) em que R3, R4 e R5 são os seguintes: R3 R4 R5 Benzilo benzilo (CH2) 4NH2; Isopropilo benzilo (ch2) 4NH2; H benzilo (ch2) 4NH2;
(VII) em que R3, R4, R5 e R6 são os seguintes: Ri H; e isobutilo.
Rf H metilo ró Benzilo Isobutilo
Ri isobutilo metilo
As unidades de aminoácido adequadas incluem unidades de fórmula (V), não se lhes limitando, em que: R3 é benzilo e R4 é - (CH2) 4NH2; R3 é isopropilo e R4 é -(CtbNNfh; ou R3 é isopropilo e R4 é -(CH2) 3NHCONH2. Outra unidade de aminoácido adequada é uma unidade de fórmula (VI), em que: R3 é benzilo, R4 é benzilo e R5 é -(CH2)4NH2. 86 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Podem conceber-se unidades -W„- e optimizarem-se na sua selectividade para clivagem enzimática para uma determinada protease associada a tumor. As unidades -Ww- adequadas são aquelas cuja clivagem é catalisada pelas proteases catepsina B, C e D e plasmina.
Numa concretização, -Ww- é uma unidade dipéptido, tripéptido ou tetrapéptido.
Quando R2, R3, R4, R5 ou R6 não são hidrogénio, carbono ao qual estão ligados R2, R3, R4, R5 ou R6 é o átomo quiral. de R2, R3, R4, ou (R) .
Cada átomo de carbono ao qual estão ligados R5 ou R6 está independentemente na configuração (S)
Em determinada concretização, a unidade de aminoácido é um dipéptido fenilalanina-lisina (ligante Phe-Lys ou FK) . Noutra concretização, a unidade de aminoácido é um dipéptido valina-citrulina (ligante Val-Cit ou VC). 3. A unidade espaçadora A unidade espaçadora (-Y-), quando presente, liga uma unidade de aminoácido à unidade de fármaco. As unidades espaçadoras são de dois tipos gerais: auto-imolativas e não auto-imolativas. Uma unidade espaçadora não auto-imolativa é uma em que parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à unidade de fármaco após clivagem enzimática de uma unidade de aminoácido do conjugado anticorpo-ligante-fármaco ou do composto fármaco-ligante. Os exemplos de unidades espaçadoras não auto-imolativas incluem uma unidade espaçadora (glicina-glicina) e uma unidade espaçadora de glicina (ambas apresentadas no esquema 1), não se lhes limitando. Quando um conjugado anticorpo-ligante-fármaco contendo uma unidade espaçadora glicina-glicina ou uma unidade espaçadora glicina sofre clivagem enzimática através de uma protease associada a célula de tumor, uma protease associada a célula de cancro ou uma protease associada a linfócito, é clivada uma parte glicina-glicina-fármaco ou uma parte glicina-fármaco de 87 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ A-T-Ww-. Para libertar o fármaco, deveria ocorrer uma reacção de hidrólise independente no interior da célula alvo para clivar a ligação da unidade glicina-fármaco.
Numa concretização típica, -Yy- é um éter p-aminobenzílico que pode ser substituído com Qm em que Q é -Ci-Cs alquilo, -Ci-Ce alcoxi, -halogéneo, -nitro ou -ciano; e m é um número inteiro na gama de 0-4.
Esquema 1
Numa concretização, uma unidade espaçadora (-Y-) não auto-imolativa é -Gly-Gly-. 4
H-As-W*—Gly—D
L·—j-A—W„,—Gly—Gly-J—D clivagem enzimática clivagem enz imát ica
Gly-D hidrólise
Gly-Gly-D rólise | fármaco fármaco
Noutra concretização, uma unidade espaçadora (-Y-) não auto-imolativa é -Gly-.
Numa concretização, o composto fármaco-ligante ou um conjugado anticorpo anti-CD70-ligante-fármaco não tem uma unidade espaçadora (y=0).
Alternativamente, um conjugado de anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação-ligante-fármaco, contendo uma unidade espaçadora auto-imolativa, pode libertar o fármaco (D) sem a necessidade de uma etapa de hidrólise separada. Nestas concretizações, -Y- é uma unidade álcool p-aminobenzílico (PAB) que está ligada a -W„- através do átomo de azoto do grupo PAB e ligado directamente a -D através de um grupo carbonato, carbamato ou éter (esquema 2 e esquema 3). 88 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Esquema 2
eliminação 1,6 fármaco em que Q é -Ci-Cs alquilo, -Ci-Cs alcoxi, -ciano; m é um número inteiro na gama de inteiro na gama de 1-20. -halogéneo, 0-4; e p é -nitro ou um número
Esquema 3
clivagem enzimática ΟI NHa- r
D eliminação 1, 6 fármaco 89 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ em que Q é -Ci-Cs alquilo, -Ci-Cs alcoxi, -halogéneo, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro na gama de 0-4; e p é um número inteiro na gama de 1-20.
Outros exemplos de espaçadores auto-imolativos incluem compostos aromáticos que são electronicamente equivalentes ao grupo PAB, tal como derivados 2-aminoimidazol-5-metanol (consultar Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237, para exemplos) e orto- ou para-aminobenzilacetais, não se lhes limitando. Podem usar-se espaçadores que sofrem ciclização facilmente por hidrólise da ligação amida, tais como amidas de ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas cíclicos biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] adequadamente substituídos (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). A eliminação de fármacos contendo amina que são substituídos na posição de glicina (Kingsbury, et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) são também exemplos de estratégias de espaçador auto-imolativo que podem ser aplicadas a conjugados anticorpo-ligante-fármaco.
Numa concretização alternativa, a unidade espaçadora é uma unidade bis(hidroximetil)estireno ramificada (BHMS) (esquema 4), que pode ser usada para incorporar fármacos adicionais.
Esquema 4
clivagem enzimática
Qm CH20(C{0)VD H20(C(0))n'D 2 fármacos em que Q é -Ci-Cs alquilo, -Ci-Cs alcoxi, -halogéneo, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro na gama de 0-4; n é 0 ou 1; e p é um número inteiro na gama de 1-20. 90 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Numa concretização, as duas partes -D são iguais.
Noutra concretização, as duas partes -D são diferentes.
As unidades espaçadoras típicas (-Yy-) são representadas pelas fórmulas (VIII)-(X):
em que Q é Ci-Cs alquilo, Ci-Cs alcoxi, halogéneo, nitro ou ciano; e m é um número inteiro na gama de 0-4; f—hn-ch2-co-| ΟΧ); e |—NHCH2C(0)-NHCH2C(0) (X) B. Agentes terapêuticos
De acordo com os métodos aqui descritos, qualquer agente que exerça um efeito terapêutico em células de cancro ou células imunitárias activadas pode ser usado como o agente terapêutico para conjugação a um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. (Consultar, e.g., WO 2004/010957, "Drug Conjugates and Their Use for Treating Câncer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease" (anteriormente) e pedido provisório U.S. N.2 60/400 403 (anteriormente)). 91 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Tipicamente, ο agente terapêutico é um agente citotóxico ou imunossupressor.
As classes úteis de agentes citotóxicos ou de imunomodulação incluem, por exemplo, agentes anti-tubulina, auristatinas, agentes de ligação de sulco menor de ADN, inibidores de replicação de ADN, agentes alquilantes (e.g. complexos de platina tais como cisplatina, mono(platina), bis(platina) e complexos de platina trinucleares e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etoposidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureias, platinóis, compostos de pré-formação, antimetabolitos purina, puromicinas, sensibilizadores de radiação, esteróides, taxanos, inibidores de topoisomerase, alcaloides de vinca ou semelhantes.
Os agentes citotóxicos ou de imunomodulação individuais incluem, por exemplo, um androgénio, antramicina (AMC), asparaginase, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, bussulfano, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatina, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatina, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinósido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina, decarbazina, docetaxel, doxorrubicina, um estrogénio, 5-fluorodesoxiuridina, 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiureia, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalano, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazole, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, tenoposido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorrelbina, VP-16 e VM-26.
Em algumas concretizações típicas, o agente terapêutico é um agente citotóxico. Os agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, dolastatinas (e.g. auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), agentes de ligação ao sulco menor de ADN (e.g. enediinos e lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (e.g. 92 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ paclitaxel e docetaxel), puromicinas, alcaloides de vinca, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A e B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinóides, discodermolida, eleuterobina e mitoxantrona.
Em determinadas concretizações, o agente citotóxico é um agente quimioterapêutico convencional tal como, por exemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalano, alcaloides de vinca, metotrexato, mitomicina C ou etoposido. Além disso, podem ligar-se agentes potentes, tais como análogos CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina e palitoxina aos anticorpos ou seus derivados.
Em concretizações especificas, o agente citotóxico ou citostático é auristatina E (também conhecida na especialidade como dolastatina-10) ou um seu derivado. Tipicamente, o derivado de auristatina E é, e.g. um éster formado entre auristatina E e um cetoácido. Por exemplo, auristatina E pode reagir com ácido para-acetilbenzóico ou ácido benzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outros derivados tipicos de auristatina incluem AFP, MMAF e MMAE. A síntese e estrutura de auristatina E e seus derivados descrevem-se em pedidos de patente U.S. N.2 09/845 786 (pedido de publicação de patente U.S. N.2 20030083263) e 10/001 191; pedido de patente internacional N.2 PCT/US03/24209, pedido de patente internacional N. 2 PCT/US02/13435 e patentes U.S. N. 2 6 323 315; 6 239 104; 6 034 0 65; 5 780 588; 5 665 860; 5 663 149; 5 635 483; 5 599 902; 5 554 725; 5 530 097; 5 521 284; 5 504 191; 5 410 024; 5 138 036; 5 076 973; 4 986 988; 4 978 744; 4 879 278; 4 816 444; e 4 486 414.
Em concretizações específicas, o agente citotóxico é um agente de ligação ao sulco menor de ADN. (Consultar, e.g. patente U.S. N.2 6 130 237.) Por exemplo, em determinadas concretizações, um agente de ligação ao sulco menor é um composto CBI. Noutras concretizações, o agente de ligação ao sulco menor é um enediino (e.g., caliqueamicina). 93 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Em determinadas concretizações, o ADC ou derivado de ADC compreende um agente anti-tubulina. Os exemplos de agentes anti-tubulina incluem taxanos (e.g. Taxol® (paclitaxel) , Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alcaloides de vinca (e.g. vincristina, vinblastina, vindesina e vinorrelbina) e dolastatinas (e.g. auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB), não se lhes limitando. Outros agentes anti-tubulina incluem, por exemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (e.g. epotilona A e B), nocodazole, colchicina e colcimida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinóides, combretastatinas, discodermolida e eleuterobina.
Em determinadas concretizações, o agente citotóxico é um maitansinóide, outro grupo de agentes anti-tubulina. Por exemplo, em concretizações especificas, o maitansinóide é maitansina ou DM-1 (ImmunoGen, Inc.; consultar também Chari et al., 1992, Câncer Res. 52:127-131).
Em determinadas concretizações, o agente terapêutico não é um radioisótopo.
Em determinadas concretizações, o agente citotóxico ou de imunomodulação é um antimetabolito. O antimetabolito pode ser, por exemplo, um antagonista purina (e.g. azatioprina ou micofenolato de mofetil), um inibidor de di-hidrofolato- redutase (e.g. metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, arabinósido de citidina, amantadina, didesoxiuridina, iododesoxiuridina, poscarnet ou trifluridina.
Noutras concretizações, o agente citotóxico ou de imunomodulação é tacrolimo, ciclosporina ou rapamicina. Em concretizações adicionais, o agente citotóxico é aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoina, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozole, trióxido de arsénico, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, Darbepoietina alfa, Denileucina diftitox, dexrazoxano, propionato de dromostanolona, epirrubicina, Epoietina alfa, 94 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ exemestano, Filgrastim, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab idarrubicina, ifosfamida, mesilato alfa-2a, irinotecano, letrozole, mecloretamina ou mostarda de azoto, metoxsaleno, mitomicina nandrolona, oprelvecina, pegademase, pegaspargase, pipobromano, plicamicina, quinacrina, estreptozocina, testolactona, Trastuzumab, tretinoina, t e estramustina, fludarabina, goserelina,
Interferão levamisola, mesna, metotrexato, fenpropionato de pamidronato, pentostatina, procarbazina,
Sargramostim, teniposideo,
Tositumomab, valrubicina, vinblastina, zoledronato. floxuridina ozogamicina de imatinib leucovorina megestrol C, mitotano oxaliplatina pegfilgrastim porfímero de sódio rasburicase, Rituximab tamoxifeno, temozolomideo tioguanina, toremifeno mostarda de uracilo vincristina, vinorrelbina
Em concretizações adicionais, o fármaco é um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado, RITUXAN (rituximab; Genentech; um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; um anticorpo IgG2a murino); Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY; um anticorpo anti-EGFR IgG quimérico); Vitaxin (Medlmmune, Inc., MD; Campath I/H (Leukosite, MA; um anticorpo IgGl humanizado); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; um anticorpo anti-CD33 IgG humanizado); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ; um anticorpo anti-CD22 IgG humanizado); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; um anticorpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; um anticorpo anti-HLA-Drl0 murino marcado radioquimicamente); Allomune (BioTransplant, CA; um anti-CD2 mAb humanizado); Avastin (Genentech, Inc., CA; um anticorpo anti-VEGF humanizado); Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ e Amgen, CA; um anticorpo anti-CD22); e CEAcide (Immunomedics, NJ; um anticorpo anti-CEA humanizado).
Outros anticorpos adequados incluem anticorpos contra os seguintes antigénios: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, Lewis Y, Lewis X, alfa f etoproteina, CA 242, fosfatase alcalina de placenta, antigénio especifico de próstata, fosfatase ácida de 95 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ próstata, factor de crescimento epidérmico, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor anti-transferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gplOO, MARTI, antigénio especifico de próstata, receptor IL-2, CD20, CD52, CD33, CD22, gonadotropina coriónica humana, CD38, CD40, mucina, P21, MPG e produto de oncogene Neu, não se lhes limitando.
Em determinadas concretizações, o agente terapêutico é um agente de imunomodulação. O agente de imunomodulação pode ser, por exemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimo, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato de mofetil ou metotrexato. Alternativamente, o agente de imunomodulação pode ser, por exemplo, um glucocorticóide (e.g. cortisol ou aldosterona) ou um análogo de glucocorticóide (e.g. prednisona ou dexametasona).
Em determinadas concretizações típicas, o agente de imunomodulação é um agente anti-inflamatório, tal como derivados arilcarboxílicos, derivados contendo pirazole, derivados de oxicam e derivados de ácido nicotínico. As classes de agentes anti-inflamatórios incluem, por exemplo, inibidores de ciclo-oxigenase, inibidores de 5-lipoxigenase e antagonistas de receptores de leucotrienos.
Os inibidores de ciclo-oxigenase adequados incluem ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, carprofeno, diclofenac, diflunisal, fenbufeno, fenoprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, tolmetina e ácido acetilsalicílico.
Os inibidores de lipoxigenase adequados incluem inibidores redox (e.g. derivados de catecol butano, ácido nordi-hidroguaiarético (NDGA), masoprocol, fenidona, Ianopaleno, indazolinonas, nafazatrom, benzofulanol, alquil-hidroxilamina) e inibidores não redox (e.g. hidroxitiazoles, metoxialquiltiazoles, benzopiranos e seus derivados, metoxitetra-hidropirana, ácidos boswélicos e derivados acetilados de ácidos boswélicos e ácidos 96 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ quinolinometoxifenilacéticos substituídos com radicais cicloalquilo) e precursores de inibidores redox.
Outros inibidores de lipoxigenase adequados incluem antioxidantes (e.g. fenóis, propilgalhato, flavonóides e/ou substratos de ocorrência natural contendo flavonóides, derivados hidroxilados das flavonas, flavonol, di-hidroquercetina, luteolina, galangina, orobol, derivados de chalcona, 4,2' ,4' -tri-hidroxichalcona, orto-aminofenóis, N-hidroxiureias, benzofuranóis, ebselen e espécies que aumentam a actividade de seleno-enzimas redutoras), agentes quelantes de ferro (e.g. ácidos hidroxámicos e seus derivados, N-hidroxiureias, 2-benzil-l-naftol, catecóis, hidroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naftol, sulfasalazina, zileuton, ácido 5-hidroxi-antranílico e ácidos 4-(omega- arilalquil)fenilalcanóicos), compostos contendo imidazole (e.g. cetoconazole e itraconazole), fenotiazinas e derivados de benzopirano.
Ainda outros inibidores de lipoxigenase adequados incluem inibidores de eicosanóides (e.g. ácidos octadecatetraenóico, eicosatetraenóico, docosapentaenóico, eicosa-hexaenóico e docosa-hexaenóico e seus ésteres, PGE1 (prostaglandina El) , PGA2 (prostaglandina A2), viprostol, ácidos 15-mono-hidroxieicosatetraenóico, 15-mono-hidroxi-eicosatrienóico e 15-mono-hidroxieicosapentaenóico e leucotrienos B5, C5 e D5), compostos que interferem com o fluxo de cálcio, fenotiazinas, difenilbutilaminas, verapamil, fuscosídeo, curcumina, ácido clorogénico, ácido caféico, ácido 5,8,11,14-eicosatetraenóico (ETYA), hidroxifenilretinamida, Ionapalen, esculina, dietilcarbamazina, fenantrolina, baicaleina, proxicromil, tioéteres, dialilsulfureto e di-(1-propenil)sulfureto.
Os antagonistas de receptores de leucotrienos incluem calcitriol, ontazolast, Bayer Bay-x-1005, Ciba-Geigy CGS-25019C, ebselen, Leo Denmark ETH-615, Lilly LY-293111, Ono ONO-4057, Terumo TMK-688, Boehringer Ingleheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, Ono ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone-Poulenc 97 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Rorer RP 66153, SmithKline Beecham SB-201146, SmithKline Beecham SB-201993, SmithKline Beecham SB-209247, Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products WAY 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert CI-987, Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck and Co. MK-591, Merck and Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG 14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKline Beecham SK&F-104493, Leo Denmark SR-2566, Tanabe T-757 e Teijin TEI-1338. 1. Fármacos de dolastatina
Em determinadas concretizações, o agente citotóxico ou citostático é uma dolastatina. Em concretizações mais especificas, a dolastatina é da classe auristatina. Tal como agui utilizada, a expressão dolastatina abrange auristatinas de ocorrência natural e derivados de ocorrência não natural, por exemplo MMAE. Assim, numa concretização especifica, o agente citotóxico ou citostático é MMAE (fórmula XI) . Noutra concretização especifica, o agente citotóxico ou citostático é AFP (fórmula XVI).
(XI)
Em determinadas concretizações, o agente citotóxico ou citostático é uma dolastatina com as fórmulas XII-XXI. ΕΡ 2
099 823/PT 98
(XIV)
(XV) 99 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
(ΧνΐΠ)
(XVIV) 100 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
(XX) ο
C. Formação de ADC e derivados de ADC
Pode obter-se geração de ADC e derivados de ADC por qualquer técnica conhecida do perito na especialidade.
Sucintamente, as ADC compreendem um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação, um fármaco e opcionalmente um ligante que liga o fármaco e o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. Estão disponíveis várias reacções diferentes para ligação covalente de fármacos a anticorpos ou seus derivados ou outros agentes de ligação. Tal obtém-se muitas vezes por reacção dos resíduos de aminoácidos da molécula, incluindo os grupos amina de lisina, os grupos de ácido carboxílico livres de ácido glutâmico e ácido aspártico, os grupos sulfidrilo de cisteína e as diferentes partes dos aminoácidos aromáticos. Um dos métodos de ligação covalente não específica mais habitualmente utilizado é a reacção de carbodiimida para ligar um grupo carboxilo (ou amino) de um composto a grupos amino (ou carboxilo) do anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. Adicionalmente, têm sido usados agentes bifuncionais tais como dialdeídos ou 101 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ imidoésteres para ligar o grupo amino de um compostos a grupos amino da molécula. Também está disponível para ligação de fármacos a anticorpos a reacção de base de Schiff. Este método envolve a oxidação por periodato de um fármaco que contém grupos glicol ou hidroxilo, formando assim um aldeído que reage então com o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. A ligação ocorre através da formação de uma base de Schiff com grupos amino da molécula. Podem também usar-se isotiocianatos como agentes de acoplamento para ligar covalentemente fármacos a anticorpos ou seus derivados ou outros agentes de ligação. O perito na arte conhece outras técnicas e estão abrangidas pelo âmbito do presente invento. Descrevem-se exemplos não limitativos de tais técnicas em, e.g.r patentes U.S. n.2 5 665 358; 5 643 573; e 5 556 623.
Em algumas concretizações conjuga-se uma região de ligação (tal como um anticorpo) a um conjugado ligante-f ármaco tal como divulgado nos pedidos US publicados n.2 2006-0074008 ou 2005-0238649 ou pedido internacional publicado n.2 WO 05/084390. Em algumas concretizações, quando se introduz um resíduo de cisteína, pode conjugar-se uma região de ligação a um conjugado ligante-fármaco tal como divulgado no pedido de patente U.S. publicado n.2 2007-092940 ou Givol et ai., 1965, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 53:676-84. Geralmente, as ligações dissulfureto intercadeia e o(s) resíduo(s) de cisteína introduzidos do anticorpo são completamente reduzidos, seguido de reoxidação parcial dos dissulfureto intercadeia (e.g., com cobre, ar ou ácido di-hidroascórbico). O fármaco ligante é então conjugado com os resíduos de cisteína introduzidos.
Em determinadas concretizações, faz-se reagir um intermediário, que é o precursor do ligante, com o fármaco em condições adequadas. Em determinadas concretizações, usam-se grupos reactivos no fármaco e/ou no intermediário. O produto da reacção entre o fármaco e o intermediário ou o fármaco derivatizado, reage subsequentemente com o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação em condições adequadas. 102 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ V. Métodos de modificar anticorpos e agentes de ligação
Os anticorpos de ligação ao alvo ou seus derivados ou outros agentes de ligação ao alvo podem também incluir análogos e derivados gue são modificados, e.g., por deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos das seguências de aminoácidos do anticorpo ou agente de ligação ou por ligação covalente de gualguer tipo de moléculas desde gue tal ligação covalente permita gue o anticorpo retenha a sua imunoespecificidade de ligação ao antigénio.
Por exemplo, os derivados e análogos dos anticorpos ou seus derivados ou outro agentes de ligação incluem os que sofreram modificação adicional, e.g., por glicosilação, desglicosilação, acetilação, derivatização com PEG, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de protecção/bloqueamento conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma unidade de anticorpo celular ou outra proteína, etc. Podem efectuar-se quaisquer de várias modificações químicas por técnicas conhecidas, incluindo clivagem química, acetilação, formilação, síntese metabólica na presença de tunicamicina ou semelhantes, não se lhes limitando.
Adicionalmente, o análogo ou derivado pode conter um ou mais aminoácidos não naturais.
Em concretizações específicas, pode pretender-se melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. (Consultar, e.g., publicação de patente U.S. n.2 2006/0003412 e 2006/0008882). Preparam-se derivados de sequência de aminoácidos dos anticorpos por introdução de alterações de nucleótidos apropriadas no ácido nucleico do anticorpo ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos das sequências de aminoácidos do anticorpo. Efectua-se qualquer combinação de deleções, inserções e substituições para chegar à construção final, desde que a construção final apresente as características pretendidas. As alterações de aminoácidos também podem alterar os processos pós-tradução do anticorpo, 103 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ tal como alterar o número ou posição dos locais de glicosilação.
Um método útil para identificação de determinados resíduos ou regiões do anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação gue são regiões favorecidas para mutagénese denomina-se "mutagénese por varrimento de alanina" tal como descrito por Cunningham e Wells, 1989, Science 244:1081-1085. Aqui, identificam-se um resíduo ou grupo de resíduos alvo (e.g., resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituem-se por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (tipicamente alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o antigénio. As localizações de aminoácidos que demonstrem sensibilidade funcional às substituições são então refinadas por introdução de derivados adicionais ou diferentes ou em substituição nos locais de substituição. Assim, quando o local de introdução de uma variação de sequência de aminoácidos é pré-determinado, a natureza da própria mutação não necessita ser pré-determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em determinado local, efectua-se varrimento com alanina ou mutagénese aleatória no codão ou região alvo e rastreiam-se os derivados de anticorpo expressos para a actividade pretendida.
As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de amino terminais e/ou carboxilos terminais com uma gama de comprimentos entre um resíduo até polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intra-sequência com um ou múltiplos resíduos de aminoácidos. Os exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação com um resíduo metionilo N-terminal ou o anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação fundido com um polipéptido citotóxico.
Outro tipo de derivado é um derivado de substituição de aminoácido. Estes derivados têm uma substituição por um resíduo diferente de pelo menos um resíduo de aminoácido no anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação. Os locais de maior interesse para mutagénese por substituição 104 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ incluem as regiões hipervariáveis, mas também se consideram alterações de região de esqueleto.
Obtêm-se modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo por selecção de substituições que diferem significativamente no seu efeito de manter (a) a estrutura do esqueleto de polipéptido na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural dividem-se em grupos com base nas suas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
As substituições não conservativas de aminoácidos incluirão permuta de um membro de uma dessas classes por um de outra classe.
Um tipo específico de derivado de substituição envolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (e.g., um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, o(s) derivado(s) resultante(s) seleccionados para desenvolvimento posterior teriam melhorado as propriedades do anticorpo parental a partir do qual são gerados. Um modo conveniente para gerar tais derivados de substituição envolve maturação por afinidade usando disposição de fagos. Sucintamente, mutam-se vários locais de região hipervariável (e.g., 6-7 locais) para gerar todas as substituições amino possíveis em cada local. Os derivados de anticorpo assim gerados são apresentados de forma monovalente a partir de partículas fágicas filamentosas como fusões do produto do 105 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ gene III de Μ13 empacotado no interior de cada partícula. Os derivados dispostos pelo fago são então rastreados para a actividade biológica (e.g., afinidade de ligação). De forma a identificar locais de região hipervariável candidatos para modificação, pode efectuar-se mutagénese por varrimento de alanina para identificar resíduos de região hipervariável que contribuam significativamente para ligação de antigénio. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o antigénio. Tais resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez gerados tais derivados, submete-se o painel de derivados a rastreio e podem seleccionar-se anticorpos com propriedades melhores em um ou mais ensaios relevantes para desenvolvimento posterior. O anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação é modificado relativamente à ligação de um ou mais receptores Fc gama (Fc ) (Fc fè).g., de modo a reduzir a ligação a um ou mais Fc R. Tal modificação pode também resultar na redução de citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Esta modificação pode ser obtida por introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos (e.g., substituições de aminoácidos não conservativas) numa região Fc do anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação ou na proximidade desta. Alternativa ou adicionalmente, podem introduzir-se resíduos de cisteína na região Fc ou na proximidade desta, permitindo assim a formação de um ligação dissulfureto intercadeia nesta região. Alternativa ou adicionalmente, podem introduzir-se um ou mais locais de glicosilação com ligação em N na região Fc ou na proximidade desta, permitindo assim glicosilação pós-tradução nesta região, tal como descrito anteriormente. O anticorpo homodimérico ou seu derivado ou outro agente de ligação assim gerado pode ter capacidade enfraquecida de ligação a receptores de Fc gama. O anticorpo homodimérico assim gerado pode também ter capacidade de 106 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ internalização deficiente e/ou respostas de ADCC, ADCP e/ou CDC diminuídas. A substituição de aminoácidos afecta a interacção da ligação da região Fc com o receptor Fc RlIIa. Introduz-se a substituição de aminoácidos do aminoácido nativo por uma cisteína na posição de aminoácido 239.
Em algumas concretizações, para aumentar adicionalmente a semivida no soro do anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação, pode-se modificar qualquer epítopo de ligação de receptor de salvação no anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação tal como descrito em patente U.S. n.2 5 739 277, por exemplo. Tal como aqui utilizada, a expressão "epítopo de ligação de receptor de salvação" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula IgG (e.g., IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semivida no soro in vivo da molécula IgG. Alternativamente, a semivida no soro do anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação pode ser aumentada por modificação da região Fc de um anticorpo (e.g., domínio constante de IgG) relativamente à ligação de receptores Fc gama (Fc ), como descrito seguidamente.
Os anticorpos podem ser glicosilados em posições conservadas nas suas regiões constantes (consultar, e.g., Jefferis e Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright e
Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). As cadeias laterais de oligossacáridos das imunoglobulinas podem afectar a função da proteína (consultar, e.g., Boyd et ai., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe e Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) e a interacção intramolecular entre partes da glicoproteína que pode afectar a conformação e superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (consultar, e.g., Jefferis e Lund, anteriormente; Wyss e Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Os oligossacáridos podem também servir para dirigir determinada glicoproteína a determinadas moléculas com base nas estruturas de reconhecimento específico. Por exemplo, foi relatado que numa IgG não 107 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ galactosilada, a parte de oligossacárido "gira" para fora do espaço inter-CH2 e os resíduos N-acetilglucosamina terminais ficam disponíveis para ligar proteína de ligação de manose (consultar, e.g., Malhotra et al., 1995, Nature Med. 1:237- 243) . A remoção dos oligossacáridos de CAMPATH-1H (um anticorpo IgGl monoclonal murino humanizado recombinante que reconhece o antigénio CDw52 de linfócitos humanos) por glicopeptidase produzida em células de ovário de hamster chinês (CHO) resultou numa redução completa da lise mediada por complemento (CMCL) (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318), enquanto a remoção selectiva de resíduos de ácido siálico usando neuraminidase não resultou em qualquer perda de DMCL. Relatou-se também que a glicosilação de anticorpos afecta ADCC. Em particular, relatou-se que células CHO com expressão regulada por tetraciclina de (1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GlcNAc bisseccionado, apresentavam actividade ADCC melhorada (consultar, e.g., Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176- 180) . A glicosilação de anticorpos é tipicamente quer ligada a N quer ligada a O. A ligação em N refere-se à ligação da parte de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripéptido asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da parte de hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer destas sequências de tripéptido num polipéptido cria um local de glicosilação potencial. A glicosilação ligada a O refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactosa ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais habitualmente serina ou treonina, apesar de se poderem também usar 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina.
Os derivados de anticorpos glicosilados são derivados nos quais o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Alteração pretende significar eliminar uma ou mais partes de 108 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ hidrato de carbono verificadas no anticorpo, adicionando uma ou mais partes de hidrato de carbono ao anticorpo, alterando a composição de glicosilação (i.e., padrão de glicosilação), a extensão da glicosilação ou semelhantes. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente obtida por alteração da sequência de aminoácidos de modo a conter uma ou mais das sequências de tripéptido anteriormente descritas (para locais de glicosilação ligados a N). A alteração pode também ser efectuada por adição ou por substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina da sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação ligados a O) . De igual modo, pode obter-se remoção de locais de glicosilação por alteração de aminoácidos nos locais nativos de glicosilação do anticorpo. A sequência de aminoácidos é habitualmente alterada por alteração da sequência de ácidos nucleicos subjacente. Estes métodos incluem, isolamento de uma fonte natural (no caso de derivados de sequências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação de mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR ou mutagénese por cassete de um derivado preparado anteriormente ou de uma versão não derivada do anticorpo, não se lhes limitando. A glicosilação (incluindo padrão de glicosilação) de anticorpos pode também ser alterada sem alterar a sequência de aminoácidos ou a sequência de nucleótidos subjacente. A glicosilação depende largamente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Dado que o tipo de células usado para expressão de glicoproteínas recombinantes, e.g., anticorpos, como agentes terapêuticos potenciais é raramente a célula nativa, podem esperar-se variações significativas no padrão de glicosilação dos anticorpos. Consultar, e.g., Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:90 62-907 0. Além da escolha de células hospedeiras, os factores que afectam glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem modo de crescimento, formulação de meios, densidade da cultura, 109 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ oxigenação, ρΗ, esquemas de purificação e semelhantes. Têm sido propostos vários métodos para alterar o padrão de glicosilação obtido num organismo hospedeiro especifico, incluindo introduzir ou sobre-expressar determinadas enzimas envolvidas na produção de oligossacáridos (consultar, e.g., patentes U.S. n.2 5 047 335; 5 510 261; e 5 278 299) . A glicosilação ou determinados tipos de glicosilação, pode ser removida enzimaticamente da glicoproteina, por exemplo usando endoglicosidase H (Endo H) . Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser modificada por engenharia genética, e.g., tornada deficiente no processamento de determinados tipos de polissacáridos. Estas e outras técnicas semelhantes são bem conhecidas na especialidade. A estrutura de glicosilação dos anticorpos pode ser facilmente analisada por técnicas de análise de hidratos de carbono convencionais incluindo cromatografia de lectina, RMN, espectrometria de massa, HPLC, GPC, análise de composição em monossacáridos, digestão enzimática sequencial e HPAEC-PAD, que usa cromatografia de permuta aniónica a pH elevado para separar oligossacáridos com base na carga. São também conhecidos métodos para libertar oligossacáridos com objectivos analíticos e incluem, tratamento enzimático (habitualmente efectuado usando N-glicosidase peptídica F/endo- -galactosidase), eliminação usando ambiente alcalino rigoroso para libertar principalmente as estruturas ligadas em O e métodos químicos usando hidrazina anidra para libertar oligossacáridos ligados em N ou ligados em 0, não se lhes limitando.
Os anticorpos ou seus derivados ou outros agentes de ligação podem ter modificações (e.g., substituições, deleções ou adições) no resíduo de aminoácido que interage com receptores Fc . Nomeadamente, os anticorpos ou seus derivados ou outros agentes de ligação incluem anticorpos ou seus derivados ou outros agentes de ligação apresentando modificações nos resíduos de aminoácidos identificados como envolvidos na interacção de ligação entre o domínio Fc e um ou mais receptores Fc (consultar seguidamente), assim como 110 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ anticorpos ou seus derivados ou outros agentes de ligação com modificações nos residuos de aminoácidos identificados como estando envolvidos na interacção entre o domínio anti-Fc e o receptor FcRn (consultar, e.g., publicação internacional n.2 WO 97/34631). VI. Métodos para alterar ligação de agentes de ligação ao alvo a receptores Fc
Em algumas concretizações, a ligação de um agente de ligação ao alvo a um ou mais receptores Fc pode ser enfraquecida usando uma ou mais abordagens de concepção racional de anticorpos conhecidas na especialidade. Em algumas concretizações, a ligação de um agente de ligação ao alvo a um ou mais receptores Fc pode ser enfraquecida por redução das funções efectoras do agente de ligação ao alvo usando uma ou mais abordagens de concepção racional de anticorpos conhecidas na especialidade. Proporcionam-se seguidamente exemplos ilustrativos e não limitativos de tais abordagens. A ligação ao receptor Fc é mediada através da interacção de uma região de um anticorpo com um receptor Fc gama (Fc ) (Fc R) . A região ou domínio Fc refere-se à região ou regiões de uma região constante de um anticorpo (e.g., IgGl, IgG2,
IgG3 ou IgG4) que estão envolvidas na interacção de ligação da região Fc a um ou mais receptores Fc e(g., Fc RI (CD64) ,
Fc Rllb (CD32b) ou Fc RUIa (CD16) . Tanto o estado de glicosilação como a sequência de aminoácidos primária da região IgG Fc têm efeitos funcionais na interacção entre a região Fc e Fc R.
Sabe-se que a substituição de posições de aminoácidos específicas na região Fc das regiões constantes do isotipo IgG tem efeitos funcionais na capacidade de um anticorpo se ligar a um ou mais receptores Fc . Consultarp.g., Shields et ai., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, e Canfield e Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491. A região Fc inclui, por exemplo, resíduos de aminoácidos na região de dobra e no domínio Ch2, não se lhes limitando. Pode esperar-se que a 111 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc ou parte de uma região constante de IgG com aminoácidos não conservativos altere, i.e., reduza a afinidade da interacção entre a região Fc e Fc R. São bem conhecidos na especialidade métodos para introduzir substituições de aminoácidos não conservativas num anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação.
Alternativa ou adicionalmente, podem introduzir-se um ou mais resíduos de cisteína na região Fc ou parte de uma região constante de IgG ou perto destas, permitindo assim formação de ligação dissulfureto intercadeia nesta região. Pode esperar-se que tal formação de ligação dissulfureto intercadeia cause impedimento estereoquímico, reduzindo assim a afinidade da interacção de ligação entre a região Fc e Fc R. 0(s) resíduo(s) de cisteína introduzido(s) na região Fc de uma região constante de IgG ou perto desta podem também servir como locais para conjugação com agentes terapêuticos (i.e., acoplamento de fármacos citotóxicos usando reagentes específicos de tióis tal como derivados de fármacos maleimida. Pode esperar-se que a presença de um agente terapêutico cause impedimento estereoquímico, reduzindo assim a afinidade da interacção de ligação entre a região Fc e Fc .R São bem conhecidos na especialidade métodos para introduzir resíduos de cisteína num anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação.
Alternativa ou adicionalmente, podem introduzir-se um ou mais locais de glicosilação ligados a N na região Fc de uma região constante de IgG ou perto desta, permitindo assim glicosilação pós-tradução nesta região. Pode esperar-se que tal glicosilação ligada a N cause impedimento estereoquímico, reduzindo assim a afinidade da interacção de ligação entre a região Fc e Fc R. São bem conhecidos na especialidade métodos para introduzir locais de glicosilação ligados a N num anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação.
Uma substituição sistemática de aminoácidos expostos ao solvente da região Fc de IgGl humana gerou derivados IgG com 112 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ afinidades de ligação a Fc alteradas (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Por exemplo, comparativamente com IgGl parental, um subconjunto destes derivados envolvendo substituições em Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334 ou Ser298/Glu333/Lys334 para Ala demonstrou aumento tanto na afinidade de ligação a Fc R como na actividade ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 27 6:6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol. Biol. 336:1239-49). Contrariamente, comparativamente com IgGl parental, um subconjunto destes derivados envolvendo substituições de Glu233 por Pro/Leu234 por Val/Leu235 por Ala e deleção Gly 236, Pro238 por Ala, Asp265 por Ala, Asn297 por Ala, Ala 327 por Gin ou Pro329 por Ala demonstra diminuições nas afinidades de ligação a todos os Fc R; a substituição de Asp265 por Ala também resultou em diminuição da actividade ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Demonstrou-se que os aminoácidos da região de dobra e do domínio Ch2 contribuem para a elevada afinidade de IgG humana por Fc R (Canfield e Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491). Estas posições de aminoácidos ou de aminoácidos na sua proximidade, envolvidas na mediação da interacção de ligação entre a região Fc e Fc R são alvos potenciais para substituição por aminoácidos não conservativas e/ou introdução de uma ou mais cisteínas e/ou introdução de um ou mais locais de glicosilação ligados a N. A semivida in vivo de um anticorpo pode ter também impacto nas suas funções efectoras. Em algumas concretizações, pretende-se aumentar a semivida de um anticorpo para modificar as suas actividades terapêuticas. Em algumas concretizações, pretende-se diminuir a semivida de um anticorpo para modificar as suas actividades terapêuticas. FcRn é um receptor que é estruturalmente semelhante ao antigénio MHC de classe I que se associa de forma não covalente a 2-microglobulina. FcRn regula o catabolismo dos IgG e a sua transcitose através dos tecidos (Ghetie e Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie e Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). A interacção IgG-FcRn ocorre a pH 6,0 (pH das vesículas intracelulares) mas não a pH 7,4 (pH do sangue); esta interacção permite que os IgG sejam reciclados de volta à circulação (Ghetie e Ward, 113 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 2000, Αηη. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie e Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113) . A região de IgGi humana que está envolvida em ligação a FcRn foi mapeada (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). As substituições por alanina nas posições Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380,
Glu382 ou Asn434 de IgGi humana aumentam a ligação a FcRn (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Espera-se que as moléculas de IgGi com estas substituições tenham semividas séricas mais prolongadas. Consequentemente, estas moléculas de IgGi modificadas podem ser capazes de efectuar as suas funções efectoras e portanto de exercer as suas eficácias terapêuticas ao longo de um período de tempo mais prolongado comparativamente com igGi não modificadas.
Numa concretização, os agentes de ligação ao alvo variantes, que têm ligação enfraquecida a um ou mais Fc R retêm, pelo menos em alguma extensão, a capacidade de ligar FcRn. Num exemplo de concretização, os agentes de ligação ao alvo variantes, que têm ligação enfraquecida a um ou mais Fc R, rêtfn a capacidade de ligar FcRn. A capacidade de um anticorpo ou seu derivado ou outro agente de ligação ligar FcRn pode ser medida por técnicas conhecidas na especialidade (e.g., Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). O agente de ligação ao alvo variante liga-se a FcRn com pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da afinidade de um agente de ligação ao alvo não variante a FcRn. VII. Modelos animais de doenças imunológicas ou cancros
Os agentes de ligação anti-alvo, e.g., anticorpos ou derivados, podem ser ensaiados ou validados em modelos animais de doenças imunológicas ou cancros. Vários modelos animais estabelecidos de doenças imunológicas ou cancros são conhecidos do perito na especialidade, podendo qualquer deles ser usado para ensaiar a eficácia de um agente de ligação ao alvo. Descrevem-se seguidamente exemplos não limitativos de tais modelos. 114 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Foram descritos exemplos de modelos animais de doenças auto-imunes sistémicas e especificas de órgãos incluindo diabetes, lúpus, esclerose sistémica, síndrome de Sjõgren, encefalomielite auto-imune experimental (esclerose múltipla), tiroidite, miastenia grave, artrite, uveite e doença inflamatória do intestino por Bigazzi, "Animal Models of Autoimmunity: Spontaneous and Induced" em The Autoimmune Diseases (Rose e Mackay ed., Academic Press, 1998) e em "Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease" em Current Protocols in Immunology (Coligan et al. ed., Wiley and Sons, 1997) .
Doenças alérgicas, e.g., asma e dermatite, podem também ser modeladas em roedores. A hipersensibilidade das vias aéreas pode ser induzida em ratinhos por ovalbumina (Tomkinson et al., 2001, J. Immunol. 166:5792-800) ou antigénio de ovo de Schistosoma mansoni (Tesciuba et al., 2001, J. Immunol. 167:1996-2003). A estirpe Nc/Nga de ratinhos apresentou aumento acentuado de IgE sérica e desenvolveu espontaneamente lesões de tipo dermatite atópica (Vestergaard et al., 2000, Mol. Med. Today 6:209-10; Watanabe et al., 1997, Int. Immunol. 9:461-66; Saskawa et al., 2001, Int. Arch. Allergy Immunol. 126:239-47). A injecção de linfócitos de dador imunocompetente num hospedeiro histo-incompatível irradiado letalmente é uma abordagem clássica para induzir GVHD em ratinhos. Alternativamente, o modelo murino parental B6D2F1 proporciona um sistema para induzir GVHD tanto aguda como crónica. Neste modelo os ratinhos B6D2F1 são descendência F1 de um cruzamento entre as estirpes parentais de ratinhos C57BL/6 e DBA/2. A transferência de células linfóides DBA/2 para ratinhos não irradiados B6D2F1 provoca GVHD crónica, enquanto a transferência de células linfóides C57BL/6, C57BL/10 ou B10.D2 provoca GVHD aguda (Slayback et al., 2000, Bone Marrow Transpt. 26:931-938; Kataoka et al., 2001, Immunology 103:310-318) . 115 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Adicionalmente, tanto células estaminais hematopoiéticas humanas como células linfóides de sangue periférico maduras podem ser enxertadas em ratinhos SCID e estas células linfo-hematopoiéticas humanas permanecem funcionais em ratinhos SCID (McCune et al., 1988, Science 241:1632-1639; Kamel-Reid e Dick, 1988, Science 242:1706-1709; Mosier et al., 1988, Nature 335:256-259). Tal proporcionou um sistema de modelo de animal pequeno para o ensaio directo de agentes terapêuticas potenciais em células linfóides humanas. (Consultar, e.g., Tournoy et al., 2001, J. Immunol. 166:6982-6991).
Além disso, podem criar-se modelos de animal pequeno para analisar as eficácias in vivo dos agentes de ligação ao alvo por implantação de linhas celulares de tumor humano que expressam antigénio alvo, em estirpes de roedores imunodeficientes apropriadas, e.g., ratinhos nus atimicos ou ratinhos SCID. Exemplos de antigénios alvo que expressam linhas celulares de linfoma humano incluem, por exemplo, Daudi (Ghetie et al., 1994, Blood 83:1329-36; Ghetie et ai., 1990, Int. J. Câncer 15:481-85; de Mont et ai., 2001, Câncer Res. 61:7654-59), HS-Sultan (Cattan e Maung, 1996, Câncer Chemother. Pharmacol. 38:548-52; Cattan e Douglas, 1994, Leuk. Res. 18:513-22), Raji (Ochakovskaya et al., 2001, Clin. Câncer Res. 7:1505-10; Breisto et al., 1999, Câncer Res. 59:2944-49), e CA46 (Kreitman et al., 1999, Int. J. Câncer 81:148-55). Um exemplo não limitativo de uma linha de linfoma de Hodgkin é L428 (Drexler, 1993, Leuk. Lymphoma 9:1-25; Dewan et al., 2005, Câncer Sei. 96:466-473). Exemplos não limitativos de linhas celulares de carcinoma de células renais humanas incluindo 786-0 (Ananth et ai., 1999, Câncer Res. 59:2210-16; Datta et al., 2001, Câncer Res. 61:1768-75), ACHN (Hara et al., 2001, J. Urol. 166:2491-94; Miyake et al., 2002, J. Urol. 167:2203-08), Caki-1 (Prewett et al., 1998, Clin. Câncer Res. 4:2957-66; Shi e Siemann, 2002, Br. J. Câncer 87:119-26) e Caki-2 (Zellweger et al., 2001, Neoplasia 3:360-67). Exemplos não limitativos de linhas celulares de carcinoma nasofaringeo incluem C15 e C17 (Busson et ai., 1988, Int. J. Câncer 42:599-606; Bernheim et al., 1993, Câncer Genet. Cytogenet. 66:11-5). Exemplos não limitativos de linhas celulares de glioma humano 116 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ incluem U373 (Palma et al., 2000, Br. J. Câncer 82:480-7) e U87MG (Johns et al., 2002, Int. J. Câncer 98 :398-408).
Exemplos não limitativos de linhas celulares de mieloma múltiplo incluem MM.1S (Greenstein et al., 2003, Experimental Hematology 31:271-282) e L363 (Diehl et al., 1978, Blut 36:331-338). (Consultar também Drexler e Matsuo, 2000, Leukemia Research 24:681-703). Estas linhas celulares de tumor podem ser estabelecidas em hospedeiros roedores imunodeficientes quer como tumor sólido por injecções subcutâneas quer como tumores disseminados por injecções intravenosas. Uma vez estabelecidos num hospedeiro, estes modelos de xenoenxerto de tumor podem ser aplicados para avaliar as eficácias terapêuticas do agente de ligação ao alvo tal como aqui descrito na modulação do crescimento de tumor in vi vo. VIII. Doenças
Os agentes de ligação ao alvo (e.g., anticorpos e derivados ou anticorpos e derivados conjugados com agentes terapêuticos) tal como aqui descritos são úteis para tratar ou evitar um cancro que expressa antigénio alvo ou uma doença imunológica caracterizada pela expressão do antigénio alvo por activação inadequada de células imunitárias (e.g., linfócitos ou células dendriticas). Tal expressão de um antigénio alvo pode ser devida a, por exemplo, niveis aumentados de proteina alvo à superfície das células e/ou antigenicidade alterada do antigénio expresso. Obtém-se tratamento ou prevenção da doença imunológica, de acordo com os métodos aqui descritos, por administração a um individuo que necessite de tal tratamento ou prevenção de uma quantidade eficaz do agente de ligação ao alvo, em que o agente (i) se liga a células imunitárias (e.g., células imunitárias activadas) que expressam o antigénio alvo e que estão associadas com o estado de doença e (ii) exerce um efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador nas células imunitárias.
As doenças imunológicas que se caracterizam por activação inapropriada de células imunitárias e que podem ser tratadas 117 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ ou evitadas pelos métodos aqui descritos podem classificar-se, por exemplo, pelo tipo de reacção ou pelo tipo de reacções de hipersensibilidade subjacente(s) à doença. Estas reacções classificam-se tipicamente em quatro tipos: reacções anafilácticas, reacções citotóxicas (citoliticas), reacções complexas imunitárias ou reacções de imunidade mediada por células (CMI) (também denominadas reacções de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH)). (Consultar, e.g., Fundamental Immunology (William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3a ed. 1993).)
Os exemplos específicos de tais doenças imunológicas incluem as seguintes: artrite reumatóide, artrite psoriática, doenças desmielinizantes auto-imunes (e.g., esclerose múltipla, encefalomielite alérgica), oftalmoplastia endócrina, uveoretinite, lúpus eritematoso sistémico, miastenia grave, doença de Grave, glomerulonefrite, doença hepática auto-imune, doença inflamatória do intestino (e.g., doença de Crohn), anafilaxia, reacção alérgica, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus tipo I, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, fibromialgia, polimiosite, dermatomiosite, insuficiência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, uveíte auto-imune, doença de Addison, adrenalite, tiroidite, tiroidite de Hashimoto, doença da tiróide auto-imune, anemia perniciosa, arofia gástrica, hepatite crónica, hepatite lupóide, aterosclerose, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressler, trombocitopenia auto-imune, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, pênfigo vulgar, pênfigo, dermatite herpética, alopecia arcata, penfigóide, escleroderma, esclerose sistémica progressiva, síndrome de CREST (calcinose, fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia e escleroterapia), infertilidade auto-imune masculina e feminina, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, doença mista do tecido conjuntivo, poli-arterite nodosa, vasculite necrotizante sistémica, dermatite atópica, rinite atópica, síndrome de Goodpasture, doença de Chagas, sarcoidose, febre reumática, asma, aborto recorrente, síndrome anti-fosfolípidos, pulmão do agricultor, eritema multiforme, 118 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, hepatite activa crónica auto-imune, pulmão dos criadores de aves, necrólise epidérmica tóxica, síndrome de Alport, alveolite, alveolite alérgica, alveolite fibrótica, doença pulmonar intersticial, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, reacção a transfusão, arterite de Takayasu, polimialgia reumática, arterite temporal, esquistossomose, arterite de células gigantes, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, eczema, granulomatose linfomatóide, doença de Behcet, síndrome de Caplan, doença de Kawasaki, dengue, encefalomielite, endocardite, fibrose endomiocárdica, endoftalmite, eritema elevatum et diutinum, psoríase, eritroblastose fetal, fascite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filaríase, ciclite, ciclite crónica, ciclite heterocrónica, ciclite de Fuch, nefropatia IgA, púrpura de Henoch-Schonlein, doença de enxerto contra hospedeiro, rejeição de transplante, cardiomiopatia, síndrome de Eaton-Lambert, policondrite recidivante, crioglobulinemia, macroglobulemia de Waldenstrom, síndrome de Evan e insuficiência auto-imune das gónadas.
Assim, os métodos aqui descritos abrangem tratamento de doenças de linfócitos B (e.g., lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artrite reumatóide e diabetes de tipo I), linfócitos Thi (e.g., artrite reumatóide, esclerose múltipla, psoríase, síndrome de Sjorgren, tiroidite de Hashimoto, doença de Grave, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, tuberculose ou doença de enxerto contra hospedeiro) ou linfócitos Th2 (e.g., dermatite atópica, lúpus eritematoso sistémico, asma atópica, rinoconjuntivite, rinite alérgica, síndrome de Omenn, esclerose sistémica ou doença de enxerto contra hospedeiro crónica). Geralmente, as doenças envolvendo células dendríticas envolvem doenças de linfócitos Thi ou linfócitos Th2.
Em algumas concretizações, a doença imunológica é uma doença imunológica mediada por células T, tal como uma doença de células T na qual as células T activadas associadas com a doença expressam o antigénio alvo. Os agentes de ligação anti-alvo (e.g., anticorpos ou derivados) podem ser administrados 119 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ para eliminar células T. Numa concretização especifica, a administração de anticorpos ou derivados pode eliminar células T activadas que expressam CD70, enquanto as células T em repouso não são substancialmente eliminadas pelo anti-CD70 ou derivado. Neste contexto, "não são substancialmente eliminadas" siqnifica que menos de cerca de 60% ou menos de cerca de 70% ou menos de cerca de 80% de células T em repouso não são eliminadas.
Os agentes de ligação ao alvo (e.g., anticorpos e derivados ou anticorpos e derivados conjugados com agentes terapêuticos) são também úteis para tratar ou evitar um cancro que expressa antigénio alvo. O tratamento ou prevenção de um cancro, de acordo com os métodos aqui descritos, obtém-se por administração a um indivíduo que necessite de tal tratamento ou prevenção de uma quantidade eficaz do agente de ligação ao alvo, em que o anticorpo ou derivado (i) se liga a células de cancro que expressam o antigénio alvo e (ii) exerce um efeito citotóxico ou citostático para eliminar ou inibir a proliferação das células de cancro que expressam antigénio alvo. O efeito citotóxico, citostático ou imunomodulador é exercido pela conjugação a um agente citotóxico, citostático ou imunomodulador.
Os cancros que podem ser tratados por utilização de um agente de ligação ao alvo incluem malignidades e doenças relacionadas, tal como as seguintes: uma leucemia, tal como uma leucemia aguda, tal como leucemia linfocítica aguda ou leucemia mielocítica aguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica ou eritroleucemia) ou uma leucemia crónica, tal como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica ou leucemia linfocítica crónica; policitemia vera; um linfoma, tal como doença de Hodgkin ou doença de não Hodgkin (linfoma); mieloma múltiplo; macroglobulinemia de Waldenstrom; doença de cadeia pesada; ou um tumor sólido, tal como sarcomas e carcinomas (e.g., fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, osteossarcoma, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de 120 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, carcinoma colorrectal, cancro pancreático, cancro de mama, cancro dos ovários, cancro da próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma da medula, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do dueto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, cancro cervical, cancro do útero, tumor testicular, carcinoma do pulmão, carcinoma de células pequenas do pulmão, carcinoma de células não pequenas do pulmão, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofaríngeo ou carcinoma esofágico.
Os cancros que expressam CD7 0 que podem ser tratados ou prevenidos pelos métodos aqui descritos incluem, por exemplo, diferentes subtipos de linfoma não Hodgkin (NHL indolentes, NHL foliculares, linfomas linfocíticos pequenos, NHL linfoplasmacíticos ou NHL da zona marginal); doença de Hodgkin (e.g., células Reed-Sternberg); cancros da linhagem de células B, incluindo, e.g., linfomas de células B grandes difusas, linfomas foliculares, linfoma de Burkitt, linfomas de células do manto, leucemias linfocíticas de células B (e.g., leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica); linfomas de células B positivos para vírus de Epstein-Barr; carcinomas de células renais (e.g., células claras e papilares); carcinomas nasofaríngeos; carcinomas tímicos; gliomas; glioblastomas; neuroblastomas; astrocitomas; meningiomas; macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas múltiplos; e carcinomas do cólon, do estômago e rectal. O cancro pode ser, por exemplo, recém diagnosticado, pré-tratado ou refractário ou recorrente. Em algumas concretizações, um cancro que expressa CD70 tem pelo menos cerca de 15 000, pelo menos cerca de 10 000 ou pelo menos cerca de 5 000 moléculas de CD70 por célula. 121 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ IX. Composições farmacêuticas compreendendo conjugados de agentes de ligação ao alvo variantes e sua administração
Uma composição compreendendo um agente de ligação ao alvo (e.g., um anticorpo ou derivado, sozinho ou conjugado com um agente terapêutico) pode ser administrada a um indivíduo com uma doença imunológica ou um cancro ou em risco de contrair uma doença imunológica ou um cancro. O invento proporciona adicionalmente o uso de um agente de ligação ao alvo (e.g., um anticorpo ou derivado, sozinho ou conjugado com um agente terapêutico) no fabrico de um medicamento para prevenção ou tratamento de cancro ou doença imunológica. A expressão "indivíduo" tal como agui utilizada significa gualguer doente mamífero ao gual se pode administrar um agente de ligação ao alvo, incluindo, e.g., humanos e mamíferos não humanos, tal como primatas, roedores e cães. Os indivíduos gue se pretendem tratar especificamente usando os métodos agui descritos incluem humanos. Os agentes de ligação ao alvo podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outras composições na prevenção ou tratamento da doença imunológica ou de um cancro. São conhecidos vários sistemas de entrega e podem ser usados para administrar o agente de ligação ao alvo. Os métodos de introdução incluem as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral, não se lhes limitando. O agente de ligação ao alvo pode ser administrado, por exemplo por infusão ou injecção em bolus (e.g., intravenoso ou subcutâneo), por absorção através dos revestimentos epitelial ou mucocutâneo (e.g., mucosa oral, rectal e mucosa intestinal, e semelhantes) e pode ser administrado conjuntamente com outros agentes activos biologicamente tais como agentes quimioterapêuticos. A administração pode ser sistémica ou local.
Em concretizações específicas, a composição de agente de ligação ao alvo é administrada por injecção, através de um cateter, através de um supositório ou através de um implante, 122 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ sendo ο implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo uma membrana, tal como uma membrana sielástica ou uma fibra. Tipicamente, quando se administra a composição usam-se materiais que não absorvem o agente de ligação anti-alvo.
Em outras concretizações, o agente de ligação anti-alvo é entregue num sistema de libertação controlada. Numa concretização, pode usar-se uma bomba (consultar Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Noutra concretização, podem usar-se materiais poliméricos. (Consultar Medicai Applications of Controlled Release (Langer e Wise ed. CRC Press, Boca Raton, Flórida, 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen e Bali ed., Wiley, New York, 1984); Ranger e Peppas, 1983, Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Consultar também Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Discutem-se outros sistemas de libertação controlada, por exemplo, em Langer, anteriormente. lactose
Pode administrar-se um agente de ligação ao alvo (e.g., um anticorpo ou derivado, sozinho ou conjugado com um agente terapêutico) como composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de ligação e um ou mais ingredientes farmaceuticamente compatíveis. Por exemplo, a composição farmacêutica inclui tipicamente um ou mais transportadores farmacêuticos (e.g., líquidos estéreis, tal como água e óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes). A água é um transportador mais típico quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Podem também utilizar-se soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol como transportadores líquidos, nomeadamente para soluções injectáveis. Os excipientes farmaceuticamente adequados incluem, por exemplo, amido, glucose, lactose, sacarose, 123 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ gelatina, malte, arroz, farinha, gesso, sílica gel, estearato de sódio, mono-estearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite magro em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, caso pretendido, pode também conter guantidades minoritárias de agentes molhantes e emulsionantes ou agentes de tamponamento de pH. Estas composições podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação controlada e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e transportadores tradicionais tais como triglicéridos. As formulações orais podem incluir transportadores padrão tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc., de grau farmacêutico. Descrevem-se exemplos de transportadores farmacêuticos adequados em "Remington' s Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína, tipicamente na forma purificada, conjuntamente com uma quantidade adequada de transportador de modo a proporcionar a forma para administração adequada ao doente. As formulações correspondem ao modo de administração.
Em concretizações típicas, a composição farmacêutica é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções isotónicas estéreis em tampão aquoso. Quando necessário, a composição farmacêutica pode também incluir um agente de solubilização e um anestésico local tal como lidocaína para apaziguar a dor no local da injecção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado isento de água num recipiente selado hermeticamente tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade do agente activo. Quando o produto farmacêutico é administrado por infusão, este pode ser dispensado com uma garrafa de infusão contendo água ou soro fisiológico de grau farmacêutico estéril. Quando o produto farmacêutico é administrado por injecção, pode proporcionar-se 124 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ uma ampola de água ou soro fisiológico para injecção estéril de modo a que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
Além disso, a composição farmacêutica pode ser proporcionada como um kit farmacêutico compreendendo (a) um recipiente contendo um agente de ligação ao alvo (e.g., um anticorpo ou derivado, sozinho ou conjugado com um agente terapêutico) em forma liofilizada e (b) um segundo recipiente contendo um diluente farmaceuticamente aceitável (e.g., água estéril) para injecção. Pode usar-se o diluente farmaceuticamente aceitável para reconstituição ou diluição do agente de ligação ao alvo liofilizado. Pode estar opcionalmente associado a tais recipientes uma nota na forma prescrita por uma agência governamental reguladora do fabrico, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, reflectindo essa nota aprovação pela agência de fabrico, uso ou venda para administração humana. A quantidade do agente de ligação ao alvo (e.g., um anticorpo ou derivado, sozinho ou conjugado a um agente terapêutico) que é eficaz no tratamento ou prevenção de uma doença imunológica ou um cancro pode ser determinada por técnicas clinicas padrão. Além disso, podem utilizar-se opcionalmente ensaios in vitro para ajudar na identificação de gamas de dosagem óptimas. A dose exacta a utilizar na formulação dependerá também da via de administração e do estágio da doença imunológica ou cancro e deve ser decidida de acordo com a opinião do médico assistente e das condições especificas de cada doente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de ensaio in vitro ou de modelos animais.
Por exemplo, a toxicidade e a eficácia terapêutica do anticorpo ou derivado podem ser determinadas em culturas celulares ou animais experimentais através de procedimentos farmacêuticos padrão para determinar o LD50 (a dose letal para 50% da população) e o ED50 (a dose terapeut icamente eficaz para 50% da população) . A razão de dose entre os efeitos 125 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode expressar-se como a razão LD50/ED50. Prefere-se um agente de ligação ao alvo (e.g., um anticorpo ou derivado) que apresente um índice terapêutico elevado. Quando o agente de ligação ao alvo apresenta efeitos secundários tóxicos, pode usar-se um sistema de entrega que dirige o agente de ligação ao alvo ao local do tecido afectado, para minimizar danos potenciais a células que não expressam o antigénio alvo e assim reduzir os efeitos secundários.
Os dados obtidos dos ensaios de cultura de células e os estudos animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagem para uso em humanos. A dosagem do agente de ligação ao alvo situa-se tipicamente na gama de concentrações em circulação que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar nesta gama dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. Para um agente de ligação ao alvo usado no método, pode estimar-se inicialmente a dose terapeuticamente eficaz a partir de ensaios com cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma gama de concentração no plasma circulante que inclui o IC50 (i.e., a concentração do composto de ensaio que leva a metade da inibição máxima dos sintomas) tal como determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar de modo mais correcto as doses úteis em humanos. Os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de elevado desempenho.
De um modo geral, a dosagem do agente de ligação ao antigénio administrado ao doente com uma doença imunológica ou cancro é cerca de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Mais tipicamente, a dosagem administrada a um indivíduo é 0,1 mg/kg a 50 mg/kg do peso corporal do indivíduo, ainda mais tipicamente 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg ou 1 mg/kg a 20 mg/kg, 15 mg/kg, 12 mg/kg, 10 mg/kg, 7,5 mg/kg, 5 mg/kg ou 3 mg/kg do peso corporal do indivíduo. De um modo geral, os anticorpos humano têm uma semivida mais prolongada no interior do corpo humano do que anticorpos de 126 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ outras espécies devido à resposta imunitária a proteínas exógenas. Assim, são muitas vezes possíveis dosagens menores de agente de ligação ao alvo compreendendo anticorpos humanizados ou quiméricos e uma administração menos frequente.
Pode administrar-se uma dose de um agente de ligação ao alvo, por exemplo, diariamente, uma vez por semana (semanalmente), duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, quinzenalmente, mensalmente ou de outro modo conforme necessário.
Em algumas concretizações, a dosagem de um agente de ligação anti-alvo corresponde a uma dosagem sub-óptima (i.e., abaixo do ECso para o agente de ligação anti-alvo (e.g., um conjugado anticorpo-fármaco). Por exemplo, a dosagem de um agente de ligação anti-alvo pode compreender uma dosagem seleccionada dos 25% inferiores, 15% inferiores, 10% inferiores ou 5% inferiores da janela terapêutica. Tal como aqui utilizada, a expressão "janela terapêutica" refere-se à gama de dosagem de um fármaco ou da sua concentração num sistema corporal que proporciona terapia segura e eficaz.
Em algumas concretizações, a dosagem de um agente de ligação ao alvo é de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 0,9 mg/kg ou cerca de 0,15 a cerca de 0,75 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Tal dosagem pode ser administrada desde 1 a cerca de 15 vezes por semana. Cada dose pode ser a mesma ou diferente. Por exemplo, pode administrar-se uma dosagem de cerca de 0,15 mg/kg de um agente de ligação anti-alvo desde 1 a 10 vezes em cada período de quatro dias, cinco dias, seis dias ou sete dias.
Em algumas concretizações, as composições farmacêuticas compreendendo o agente de ligação ao alvo podem compreender adicionalmente um agente terapêutico (e.g., um agente citotóxico ou imunomodulador não conjugado tal como, por exemplo, qualquer daqueles aqui descritos). O agente de ligação anti-alvo pode também ser co-administrado em 127 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ combinação com um ou mais agentes terapêuticos para o tratamento ou prevenção de doenças imunológicas ou cancros. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um agente terapêutico (e.g., um agente citostático, citotóxico ou imunomodulador, tal como um agente citostático, citotóxico ou imunomodulador não conjugado tal como agueles utilizados convencionalmente para o tratamento de cancros ou doenças imunológicas). A terapia de combinação pode também incluir, e.g., administração de um agente gue tem como alvo um receptor ou complexo de receptor diferente do antigénio alvo à superfície de linfócitos activados, células dendriticas ou células de cancro. Um exemplo de tal agente inclui um segundo anticorpo que se liga a uma molécula à superfície de um linfócito activado, célula dendrítica ou célula de cancro. Outro exemplo inclui um ligando que tem como alvo tal receptor ou complexo de receptor. Tipicamente, tal anticorpo ou ligando liga-se a um receptor de superfície celular em linfócitos activados, células dendriticas ou células de cancro e aumenta o efeito citotóxico ou citostático do agente de ligação ao alvo por transmissão de um sinal citostático ou citotóxico ao linfócito, célula dendrítica ou célula de cancro activados. Tal administração combinatória pode ter um efeito aditivo ou sinérgico em parâmetros de doença (e.g., gravidade de um sintoma, número de sintomas ou frequência de recidivas).
Relativamente aos regimes terapêuticos para administração combinatória, numa concretização específica, administra-se um agente de ligação anti-alvo concomitantemente com um agente terapêutico. Noutra concretização específica, administra-se o agente terapêutico antes ou após a administração do agente de ligação ao alvo, durante pelo menos uma hora e até vários meses, por exemplo pelo menos uma hora, cinco horas, 12 horas, um dia, uma semana, um mês ou três meses, antes ou após administração do agente de ligação ao alvo. Em algumas concretizações, o indivíduo é monitorizado após administração do agente de ligação anti-alvo e opcionalmente o agente terapêutico. 128 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ Ο agente terapêutico pode ser, por exemplo, qualquer agente que exerça um efeito terapêutico em células de cancro ou células imunitárias activadas. Tipicamente, o agente terapêutico é um agente citotóxico ou imunomodulador. Tal administração combinatória pode ter um efeito aditivo ou sinérgico nos parâmetros da doença (e.g., gravidade de um sintoma, número de sintomas ou frequência de recidivas).
As classes úteis de agente citotóxicos ou imunomoduladores incluem, por exemplo, agentes anti-tubulina, auristatinas, ligantes do sulco menor do ADN, inibidores da replicação de ADN, agentes alquilantes (e.g., complexos de platina tal como cis-platina, mono(platina), bis (platina) e complexos trinucleares de platina e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etoposidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureias, platinóis, compostos de pré-formação, antimetabolitos purínicos, puromicinas, sensibilizadores de irradiação, esteróides, taxanos, inibidores de topoisomerase, alcaloides de vinca e semelhantes.
Os agentes citotóxicos ou imunomoduladores individuais exemplo, um incluem, por asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, arabinósido dactinomicina docetaxel, androgénio, antramicina (AMC), 5-azacitidina, azatioprina, sulfoximina de butionina, carmustina (BSNU), CC-1065, colchicina, ciclofosfamida, de citidina, citocalasina B, (actinomicina), daunorrubicina, doxorrubicina, um bleomicina, camptotecina, clorambucilo, citarabina, dacarbazina, decarbazina, estrogénio, 5-fluorodesoxiuridina, 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiureia, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalano, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazole, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, rapamicila (Sirolimus), estreptozotocina, tenoposido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorrelbina, VP-16 e VM-26. 129 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Em algumas concretizações típicas, o agente terapêutico é um agente citotóxico. Os agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, dolastatinas (e.g., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), ligantes do sulco menor do ADN (e.g., enediinas e lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (e.g., paclitaxel e docetaxel), puromicinas, alcaloides de vinca, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A e B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinóides, discodermolida, eleuterobina e mitoxantrona.
Em algumas concretizações, o agente citotóxico é um agente quimioterapêutico convencional tal como, por exemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalano, alcaloides de vinca, metotrexato, mitomicina C ou etoposido. Em algumas concretizações, o agente terapêutico pode ser uma terapia combinada, tal como CHOP (Ciclofosfamida, Doxorrubicina, Prednisolona e Vincristina), CHOP-R (Ciclofosfamida, Doxorrubicina, Prednisolona e Vincristina e Rituximab), ICE (Idarrubicina, dose elevada de arabinósido de Citosina e Etoposido) ou ABVD (Doxorrubicina, Bleomicina, Vinblastina e Dacarbazina). Os agentes tal como análogos CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina e paltoxina podem ser ligados ao agente de ligação ao alvo variante.
Em concretizações específicas, o agente citotóxico ou citostático é auristatina E ou um seu derivado. Tipicamente, o derivado de auristatina E é, e.g., um éster formado entre a auristatina E e um cetoácido. Por exemplo, a auristatina E pode reagir com ácido para-acetilbenzóico ou ácido benzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outros derivados de auristatina típicos incluem AFP, MMAF e MMAE. A síntese e estrutura da auristatina E e dos seus derivados descrevem-se nas publicações de pedido i de patente u. s. n. 2 20030083263 e 20050009751) , patentes U.S. n. 2 6 323 315 ; 6 239 104; 6 034 065; 5 780 588; 5 665 860; 5 663 149 ; 5 635 483; 5 599 902; 5 554 725; 5 530 097; 130 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 5 521 284; 5 504 191; 5 410 024; 5 138 036; 5 076 973; 4 986 988; 4 978 744; 4 879 278; 4 816 444; e 4 486 414.
Em concretizações específicas, o agente citotóxico é um agente de ligação ao sulco menor do ADN. (Consultar, e.g., patente U.S. n.2 6 130 237) . Por exemplo, em algumas concretizações, o agente de ligação ao sulco menor é um composto CBI. Em outras concretizações, o agente de ligação ao sulco menor do ADN é uma enediina (e.g., caliqueamicina).
Os exemplos de agentes anti-tubulina incluem taxanos (e.g., Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alcaloides de vinca (e.g., vincristina, vinblastina, vindesina e vinorrelbina) e dolastatinas (e.g., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB), não se lhes limitando. Outros agentes anti-tubulina incluem, por exemplo, derivados bacatina, análogos de taxano (e.g., epotilona A e B), nocodazole, colchicina e colcimida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinóides, combretastatinas, discodermolida e eleuterrobina.
Em algumas concretizações, o agente citotóxico é um maitansinóide, outro grupo de agentes anti-tubulina. Por exemplo, em concretizações específicas, o maitansinóide é maitansina ou DM-1 (ImmunoGen, Inc.; consultar também Chari et al., 1992, Câncer Res. 52:127-131).
Em algumas concretizações, o agente terapêutico não é um radioisótopo. Em algumas concretizações, o agente terapêutico não é ricina ou saporina.
Em determinadas concretizações, o agente terapêutico é um agente anti-VEGF, tal como AVASTIN (bevacizumab) ou NEXAVAR (Sorafenib); um bloqueador PDGF, tal como SUTENT (malato de sunitinib); ou um inibidor de cinase, tal como NEXAVAR (sorafenib tosilateor).
Em algumas concretizações, o agente citotóxico ou imunomodulador é um antimetabolito. O antimetabolito pode ser, 131 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ por exemplo, um antagonista purínico (e.g., azotioprina ou micofenolato de mofetil), um inibidor de di-hidrofolato reductase (e.g., metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, arabinósido de citidina, amantadina, didesoxiuridina, iododesoxiuridina, poscarnet ou trifluridina.
Noutras concretizações, o agente citotóxico ou imunomodulador é tacrolimo, ciclosporina ou rapamicina. Em concretizações adicionais o agente citotóxico é aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoina, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozole, trióxido de arsénico, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, Darbepoetina alfa, Denileucina diftitox, dexrazoxano, propionato de dromostanolona, epirrubicina, Epoetina alfa, estramustina, exemestano, Filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, goserelina, idarrubicina, ifosfamida, mesilato de imatinib, interferão alfa-2a, irinotecano, letrozole, leucovorina, levamisole, mecloretamina ou mostarda de azoto, megestrol, mesna, metotrexato, metoxsalen, mitomicina C, mitotano, fenpropionato de nandrolona, oprelvekina, oxaliplatina, pamidronato, pegademase, pegaspargase, pegfilgrastim, pentostatina, pipobromano, plicamicina, porfimero sódico, procarbazina, quinacrina, rasburicase, Sargramostim, estreptozocina, tamoxifen, temozolomida, teniposídeo, testolactona, tioguanina, toremifene, Tositumomab, Trastuzumab, tretinoina, mostrada de uracilo, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vinorrelbina ou zoledronato.
Em concretizações adicionais, o agente terapêutico é um anticorpo, tal como anticorpo monoclonal anti HER2 humanizado, RITUXAN (rituximab; Genentech; anticorpo monoclonal quimérico anti CD20); OVAREX (AltaRex Corporation, MA) ; PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; anticorpo IgG2a murino); Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY; um anticorpo quimérico anti-EGFR IgG) ; Vitaxin (Medlmmune, Inc., MD; Campath I/H (Leukosite, MA; um anticorpo IgGl humanizado) ; Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; um anticorpo anti-CD33 IgG humanizado); 132 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ; anticorpo anti-CD22 IgG humanizado); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; um anticorpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; um anticorpo murino e-HLA-DrlO radiomarcado); Allomune (BioTransplant, CA; um mAb anti-CD2 humanizado); Avastin (Genentech, Inc., CA; um anticorpo anti-VEGF humanizado); Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ e Amgen, CA; um anticorpo anti-CD22); CEAcide (Immunomedics, NJ; um anticorpo anti-CEA humanizado); ou um anticorpo anti-CD40 (e.g., tal como divulgado em patente U.S. n.2 6 838 261).
Outros anticorpos adequados incluem anticorpos contra os seguintes antigénios: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, Lewis Y, Lewis X, alfafetoproteina, CA 242, fosfatase alcalina placentária, antigénio de membrana especifico da próstata, fosfatase ácida prostática, factor de crescimento epidérmico, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor anti-transferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gplOO, MARTI, Antigénio Específico da Próstata, receptor IL-2, CD20, CD52, CD30, CD33, CD22, gonadotropina coriónica humana, CD38, CD40, mucina, P21, MPG, produto do oncogene Neu, não se lhes limitando.
Em algumas concretizações, o agente terapêutico é um agente imunomodulador. O agente imunomodulador pode ser, por exemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimo, ciclosporina, rapamicina, REVLIMID (lenalidomide), ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato de mofetil ou metotrexato. Alternativamente, o agente imunomodulador pode ser, por exemplo, um glucocorticóide (e.g., cortisol ou aldosterona) ou um análogo de glucocorticóide (e.g., prednisona ou dexametasona).
Em algumas concretizações típicas, o agente imunomodulador é um agente anti-inflamatório, tais como derivados arilcarboxílicos, derivados contendo pirazole, derivados oxicam e derivados de ácido nicotínico. As classes de agentes anti-inflamatórios incluem, por exemplo, inibidores da cicloxigenase, inibidores da 5-lipoxigenase e antagonistas de 133 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ receptor de leucotrienos. Em algumas concretizações, o agente imunomodulador é uma citocina, tal como G-CSF, GM-CSF ou IL-2.
Os inibidores da cicloxigenase adeguados incluem ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, carprofen, diclofenac, diflunisal, fenbufeno, fenoprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, tolmetin e ácido acetilsalicilico.
Os inibidores de lipoxigenase adeguados incluem inibidores redox (e.g., derivados de catecol butano, ácido nordi-hidroguaiarético (NDGA), masoprocol, fenidona, Ianopalen, indazolinonas, nafazatrom, benzofuranol, alquil-hidroxilamina) e inibidores não redox (e.g., hidroxitiazoles, metoxialquiltiazoles, benzopiranos e seus derivados, metoxitetra-hidropirano, ácidos boswélicos e derivados acetilados de ácidos boswélicos e ácidos quinolinometoxifenoacéticos substituídos com radicais cicloalquilo) e precursores de inibidores redox.
Outros inibidores de lipoxigenase adequados incluem antioxidantes (e.g., fenóis, propilgalato, flavonóides e/ou substratos de ocorrência natural contendo flavonóides, derivados hidroxilados das flavonas, flavonol, di-hidroquercetina, luteolina, galangina, orobol, derivados de chalcona, 4,2' ,4' -tri-hidroxichalcona, ortoaminofenóis, N-hidroxiureias, benzofuranóis, ebselen e espécies que aumentam a actividade das selenoenzimas redutoras), agentes de quelação de ferro (e.g., ácidos hidroxâmicos e seus derivados, N-hidroxiureias, 2-benzil-l-naftol, catecóis, hidroxilaminas, canosol trolox C, catecol, naftol, sulfassalazina, zyleuton, ácido 5-hidroxiantranílico e ácidos 4-(omega- arilalquil)fenilalcanóicos) , compostos contendo imidazole (e.g., cetoconazole e itraconazole) , fenotiazinas e derivados benzopirano. e
Ainda outros inibidores de lipoxigenase adequados incluem inibidores de eicosanóides (e.g., ácidos octadecatetraenóico, eicosatetraenóico, docosapentaenóico, eicosa-hexaenóico 134 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ docosa-hexaenóico e seus ésteres, PGE1 (prostaglandina El), PGA2 (prostaglandina A2), viprostol, ácidos 15-mono-hidroxieicosatetraenóico, 15-mono-hidroxieicosatrienóico e 15-mono-hidroxieicosapentaenóico e leucotrienos B5, C5 e D5) , compostos que interferem com os fluxos de cálcio, fenotiazinas, difenilbutilaminas, verapamil, fuscosideo, curcumina, ácido clorogénico, ácido caféico, ácido 5,8,11,14-eicosatetraenóicos (ETYA), hidroxifenilretinamida, Ionapalen, esculina, dietilcarbamazina, fenantrolina, baicaleina, proxicromil, tioéteres, dialilssulfureto e di-(l-propenil)sulfureto.
Os antagonistas dos receptores de leucotrieno incluem calcitriol, ontazolast, Bayer Bay-x-1005, Ciba-Geigy CGS-25019C, ebselen, Leo Denmark ETH-615, Lilly LY-293111, Ono ONO-4057, Terumo TMK-688, Boehringer Ingleheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, Ono ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone-Poulenc Rorer RP 66153, SmithKline Beecham SB-201146, SmithKline
Beecham SB-201993, SmithKline Beecham SB-209247, Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products Way 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert CI-987, Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck and Co. MK-591, Merck and Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG 14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKline Beecham SKandF-104493, Leo Denmark SR-2566, Tanabe T-757 e Teijin TEI-1338. O invento é descrito adicionalmente nos exemplos seguintes, que não se pretende que limitem o âmbito do invento. As linhas celulares descritas nos exemplos seguintes foram mantidas em cultura de acordo com as condições especificadas pela American Type Culture Collection (ATCC) ou Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha (DMSZ) ou tal como conhecido de outro modo. Os reagentes de cultura celular foram obtidos de Invitrogen Corp., Carlsbad, CA. 135 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
EXEMPLOS I. Produção de derivados de anticorpos anti-CD70 humanizados
Geraram-se anticorpos anti-CD70 humanizados tal como descrito no pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005 e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909.
As sequências de nucleótidos e de aminoácidos das regiões variáveis pesada e leve do anticorpo monoclonal murino anti-CD70, 1F6 e um derivado quimérico de 1F6, clF6, são apresentadas como SEQ ID NOS:l, 2, 21 e 22, respectivamente. (Consultar também o pedido de patente U.S. n.2 60/645 355, apresentado a 19 de Janeiro de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909). Escolheram-se sequências aceitadoras humanas para humanização de clF6 a partir das sequências VH, Jh, V e J do exão da linha germinal humana. Escolheram-se sequências aceitadoras para humanização do domínio VH de clF6 a partir dos exões VH1-18 da linha germinal VH (Matsuda et al., 1993, Nature Genetics 3:88- 94) ou Vh1-2 (Shin et al., 1991, EMBO J. 10:3641-3645) e exão
Jh~6 de Jh (Mattila et al., 1995, Eur. J. Immunol 25:2578-2582). Escolheram-se o exão B3 de V da linha germinal (Coist al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836) e o exão J -1 de J (Hieter et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-1522) como sequências aceitadoras para humanização do domínio Vl de clF6. Enxertaram-se as CDR de 1F6 murino, determinadas de acordo com a definição de Kabat, no molde escolhido de linha germinal humana. Sucintamente, geraram-se oligonucleótidos sintéticos sobrepostos abrangendo o domínio VH ou VL humanizado e usou-se extensão e sobreposição por PCR para montar cada domínio. Usaram-se locais de restrição incorporados no produto de PCR para clonagem direccional dos domínios VH e VL no vector de expressão pCMV em quadro de leitura com os domínios constantes de IgGl humana ou com o domínio constante capa ( ) , respectivamente. 136 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Escolheram-se várias posições de esqueleto para reintrodução de resíduos dadores de ratinho. Estas foram as posições H46, H67, H68, H69, H70, H71, H80, H81, H82, H82A e H91 no domínio Vh, de acordo com a convenção de numeração de Kabat. Não se alteraram quaisquer posições de esqueleto no domínio Vl, apesar dos resíduos CDR1 de ratinho nas posições L25 e L33 serem escolhidos para introdução do resíduo aceitador humano para essa posição.
Geraram-se vários derivados de 1F6 humanizado por incorporação de diferentes combinações de resíduos dadores de esqueleto de ratinho no domínio VH ou resíduos CDR humanos no domínio Vl. Estes derivados são resumidos na tabela 2 e na tabela 3 seguidamente.
Tabela 2
Derivado VH Sequência de exão aceitador VH Resíduos de esqueleto dadores hVH A VH1-18 H71, H91 hVH B VH1-18 H71 hVH C VH1-18 H91 hVH D VH1-18 nenhum hVH E VH1-2 nenhum hVH F VH1-18 H67, H68, H69, H70, H71 hVH G VH1-18 H8 0, H81, H82, H82A hVH H VH1-18 H67, H68, H69, H70, H71, H80, H81, H82, H82A H > VH1-18 H46, H71, H91 hVH J VH1-2 H46 hVH K VH1-2 H71 hVH L VH1-2 H4 6, H71 hVH M VH1-18 H4 6, H67, H68, H69, H70, H71 hVH N VH1-18 H69, H7 0, H71, H80 137 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Tabela 3
Derivado VL Resíduos aceitadores de CDR hVL A nenhum hVL B L25 hVL C L33 hVL D L25, L33 JX. Actividade in vitro de derivados de anticorpo 1F6 humanizado 1. Afinidade de ligação
Os derivados HDLA de anticorpo 1F6 humanizado (hVHD e hVLA) , HHLA (hVHH e hVLA) e HJLA (hVHJ e HVLA) e clF6 foram expressos transitoriamente em células 293, marcadas com európio usando o quelato Eu-Nl iodoacetamida (Perkin Elmer) e analisaram-se por ligação de saturação a um painel de linhas celulares positivas para CD70 tal como descrito detalhadamente no pedido de patente U.S. n.£ 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. Apresentam-se os resultados seguidamente na tabela 4.
Tabela 4
Afinidade de ligação aparente KD (nM) Linha Antigénio/ clF6 hlF6 hlF6 hlF6 celular Célula HDLA HHLA HJLA ACHN 30 000 0,30 1,44 0,29 0, 68 Caki-1 235 000 1,28 1,29 1,22 1,36 Caki-2 99 000 0,26 0,86 LO \—1 O 0,37 786-0 252 000 0,56 0,55 0,28 0,46 138 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Os valores de KD para os muito semelhantes a clF6 ensaiadas, confirmando que reduziu significativamente antigénio.
2. Actividade ADCC derivados 1F6 humanizados foram em todas as linhas celulares o processo de humanização não a actividade de ligação ao
Mediu-se a capacidade dos derivados de anticorpo 1F6 humanizados HHLA, HJLA e HELA mediarem ADCC contra linhas celulares CD70+ usando um ensaio de libertação de 51Cr padrão tal como descrito detalhadamente em pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. Os derivados de 1F6 humanizado lisaram células CD70+ de um modo dependente da dose, enquanto o anticorpo mlF6 murino CD7 0 e Ig humano de controlo não ligante não foram eficazes.
3. Actividade CDC
Analisou-se a capacidade do derivado HJLA do anticorpo 1F6 humanizado mediar CDC em linhas celulares CD70+, tal como descrito detalhadamente no pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. Usando este ensaio, clF6 e derivado HJLA de 1F6 humanizado mediaram lise dependente da dose de células alvo CD70+ de uma maneira equivalente.
4. Actividade ADCP
Analisou-se a capacidade do derivado HJLA de anticorpo 1F6 humanizado mediar fagocitose na linha celular de carcinoma renal CD70+ 786-0, tal como descrito detalhadamente no pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. Usando este ensaio, clF6 e derivado HJLA de 1F6 humanizado, mas não um anticorpo de controlo não ligante, facilitaram a fagocitose de células alvo CD70+ de uma forma dependente da dose de anticorpo e numa extensão equivalente. 139 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 5. Citotoxicidade
Avaliaram-se conjugados de fármaco de derivados de anticorpo 1F6 humanizado para actividade citotóxica in vitro tal como descrito detalhadamente no pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. Os derivados de 1F6 humanizados HELA (hVHE e IiVlA) , HHLA, HJLA e HMLA (hVHM e HVlA) e clF6 foram expressos transitoriamente em células 293 conjugados com vcMMAF (descrito no pedido de patente U.S. n.2 10/983 340; publicado como publicação de patente U.S. n.fi 2005/0238649, 27 de Outubro de 2005) a um nível de carga de oito unidades de fármaco por anticorpo e ensaiou-se para citotoxicidade em duas linhas celulares CD70+. Apresentam-se os resultados seguidamente na tabela 5.
Tabela 5 hlF6-vcMMAF N.2 de resíduos FR de ratinho Caki-1 IC50 [ng/ml] 786-0 IC5o [ng/ml] hlF6 HELA-F8 0 3,4 (média = 2,87, n = 3) 5, 2 (média = 3,9, n = 3) hlF6 HHLA-F8 9 1,4 (média = 1,87, n = 3) 2, 3 (média = 1,93, n = 3) hlF6 HJLA-F8 1 2,2 (média = 2,3, n = 3) 3,4 (média = 3,03, n = 3) hlF6 HMLA-F8 6 1,8 (média = 2,07, n = 3) 2, 8 (média = 2,03, n = 3) clF6 (293)-F8 0 1,8 (média = 2,17, n = 3) 2,4 (média = 1,45, n = 3)
Os valores de IC50 para os quatro derivados humanizados situam-se num intervalo de duas vezes o valor de clF6 em ambas as linhas celulares ensaiadas. 140 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ III. Actividade in vivo de conjugados de fármaco com anticorpo 1F6 humanizado 1. Modelo de carcinoma de células renais 786-0 em ratinhos nus
Expressaram-se transitoriamente em células 293 derivados HDLA, HHLA, HJLA e HELA do anticorpo 1F6 humanizado, conjugados com mcMMAF (descrito no pedido de patente U.S. n.2 10/983 340; publicado como publicação de patente U.S. n.2 2005/0238649, 27 de Outubro de 2005) a um nivel de carga de oito unidades de fármaco por anticorpo e avaliaram-se para eficácia in vivo num modelo de tumor sólido de carcinoma de células renais 786-0 em ratinhos nus tal como descrito detalhadamente em pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. Os resultados indicaram que o volume de tumor foi grandemente reduzido em todos os ratinhos tratados com conjugado anticorpo-fármaco comparativamente com ratinhos não tratados e todos os derivados de 1F6 humanizado conjugados com mcMMAF foram comparáveis em eficácia com clF6 mcMMAF. 2. Modelos de xenoenxerto de ratinho SCID de linfoma disseminado e mieloma múltiplo
Avaliou-se o derivado HJLA de 1F6 humanizado para actividade anti-tumor in vivo em modelos de xenoenxerto de ratinho de linfoma disseminado e mieloma múltiplo tal como descrito detalhadamente em pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. Os resultados mostraram que em cada modelo de tumor, a sobrevivência de ratinhos tratados com derivado HJLA de 1F6 humanizado foi prolongada significativamente comparativamente com a de ratinhos não tratados ou ratinhos a receber anticorpo de controlo não ligante. Em xenoenxerto de mieloma múltiplo, analisou-se o nivel de proteína monoclonal derivada de tumor (cadeia leve nos soros de ratinhos individuais. As concentrações 141 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ circulantes de cadeia leve foram significativamente menores em ratinhos tratados com derivado de 1F6 humanizado HJLA comparativamente com ratinhos não tratados, o que é consistente com as taxas de sobrevivência aumentada dos ratinhos. 3. Deleção in vitro de células T específicas de antigénio CD70 +
Ensaiou-se a capacidade do derivado de anticorpo 1F6 HJLA eliminar células T activadas específicas de antigénio tal como descrito detalhadamente em pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. A adição de derivado de anticorpo 1F6 HJLA humanizado limitou significativamente a expansão das células CD8 + /V 17 específicas de antigénio de uma forma dependente da dose de anticorpo. Estes resultados mostraram que o 1F6 humanizado tem como alvo selectivo células T activadas por antigénio e evita a sua expansão. Esta actividade foi revertida em larga medida quando se bloquearam receptores Fc RIII com um anticorpo específico anti-CD 16, indicando que a deleção das células reactivas com péptido foi mediada através de interacção de anticorpo 1F6 humanizado com células efectoras apresentando Fc RIII 4. O anticorpo anti-CD70 não afecta células espectadoras negativas para antigénio TCRCD8+ ou
Determinou-se o efeito de depleção mediada por 1F6 sobre células T espectadoras negativas para antigénio tal como descrito detalhadamente em pedido de patente U.S. n.2 60/673 070, apresentado a 19 de Abril de 2005; e publicação internacional PCT n.2 WO 2006/113909. Tal como apresentado anteriormente, clF6 e derivados de anticorpo 1F6 humanizado apresentaram afinidades de ligação, capacidade de mediar funções efectoras e capacidade de eliminar subconjuntos de células T CD8+ activadas, comparáveis. O tratamento com anticorpo clF6 não perturbou significativamente as representações relativas de outras famílias V 142 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ CD4+; não se observou qualquer grupo a ser eliminado. Estes dados demonstraram que a exposição a anticorpos anti-CD70 eliminou selectivamente células T activadas CDR70+ sem causar danos secundários detectáveis a populações de células T espectadoras.
IV. Produção de variantes de derivado hlF6 humanizado de HJLA
Preparam-se conjugados fármaco-anticorpo por ligação especifica de local de fármacos citotóxicos em locais nos quais se sabe haver interacção do anticorpo com receptores Fc (Fc R) . Obtém-se ligação de fármaco especifica de local por modificação de um (ou mais) resíduos de anticorpo por substituição de aminoácidos com um ou mais aminoácidos não conservativos. Numa variação desta abordagem, obtém-se ligação de fármaco específica do local por modificação de um (ou mais) resíduos de anticorpo com um ou mais resíduos de cisteína e acoplamento de fármacos citotóxicos usando reagentes específicos de tiol tais como derivados de maleimida de fármacos. Alternativamente, obtém-se o bloqueamento específico do local da ligação de Fc R por concepção racional de um local para glicosilação ligada a N em Fc no local que interage com Fc R ou perto deste. Estas abordagens são geralmente resumidas como se segue:
Usou-se a seguinte abordagem para substituir um ou mais aminoácidos num domínio Fc envolvido na interacção de ligação a um ou mais receptores Fc , ou perto deste: i) Seleccionar resíduos chave envolvidos na interacção de ligação entre receptores Fc e domínios Fc. ii) Mutar um (ou mais) resíduos de contacto chave (substituir aminoácido com um aminoácido não conservativo) . iii) Expressar variante de anticorpo em hospedeiro mamífero e purificar. iv) Acoplar um derivado maleimida de um ou mais fármacos citotóxicos (e.g., um ligante maleimida acoplado a um 143 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ fármaco citotóxico) a pelo menos algumas de outras cisteínas acessíveis a solvente. v) Medir ligação da ligação de ADC a Fc R (consultar/s. g., Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-6604). vi) Caracterizar in vitro e in vivo a actividade anti-tumor de ADC (consultar, e.g., Doronina et al., 2003, Nat.
Biotechnol. 21:778-784 e Francisco et al., 2003, Blood 102:1458-1465) .
Usa-se a seguinte abordagem para introduzir um ou mais resíduos de cisteína num domínio Fc envolvido na interacção de ligação a um ou mais receptores Fc , ou na proximidade destes: i) Seleccionar resíduos chave envolvidos na ligação de interacção entre Fc Re domínios Fc. ii) Mutar um (ou mais) resíduos de contacto chave para cisteína (uma cisteína concebida racionalmente). iii) Expressar a variante de anticorpo num hospedeiro mamífero e purificar. iv) Acoplar o derivado de maleimida de fármacos citotóxicos (e.g., um ligante de maleimida acoplado a um fármaco citotóxico) a resíduo(s) de cisteína concebido(s) racionalmente e opcionalmente, pelo menos algumas de outras cisteínas acessíveis ao solvente.
v) Determinar ligação da ligação de ADC variante a Fc R (consultar, e.g., Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276 : 6591-6604) . vi) Caracterizar in vitro e in vivo a actividade anti-tumor de ADC (consultar, e.g., Doronina et al., 2003, Nat.
Biotechnol. 21:778-784 e Francisco et al., 2003, Blood 102:1458-1465) .
Utiliza-se a seguinte abordagem para introduzir um ou mais locais para glicosilação ligada a N num domínio Fc envolvido na interacção de ligação a um ou mais receptores Fc , ou na proximidade destes: 144 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ vii) Seleccionar resíduos chave envolvidos na ligação de interacção entre receptores Fc e domínios Fc. viii) Mutar grupos de três resíduos para criar um local para glicosilação ligada a N: asparagina-qualquer aminoácido (X)-serina ou asparagina-X-treonina, em que X não é prolina. ix) Expressar a variante de anticorpo em hospedeiro mamífero e purificar x) Determinar se os locais de glicosilação consensuais são utilizados no hospedeiro mamífero para ligação de hidrato de carbono. xi) Acoplar um derivado de maleimida de fármacos citotóxicos (e.g., um ligante de maleimida acoplado a um fármaco citotóxico) a pelo menos algumas de outras cisteínas acessíveis ao solvente. xii) Medir ligação da ligação de ADC a Fc R (consultar^.g., Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-6604). xiii) Caracterizar in vitro e in vivo a actividade anti-tumor de ADC (consultar, e.g., Doronina et al., 2003, Nat. Biotechnol. 21:778-784 e Francisco et al., 2003, Blood 102:1458-1465) .
Nestes estudos, podem identificar-se os resíduos envolvidos nas interacções de ligação entre receptores Fc e domínios Fc, por exemplo, como aqueles resíduos que estão funcionalmente envolvidos na ligação receptor Fc -domínios Fc. (Consultar de um modo geral, Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Os resíduos envolvidos na interacção de ligação entre receptores Fc e domínios Fc podem também ser identificados como aqueles presentes na interface estrutural. (Consultar de um modo geral, Sondermann et al., 2000, Nature 406 (6793) :267-73.)
Os estudos aqui descritos seguidamente ilustram os efeitos de prevenir ou reduzir a interacção de um ADC com Fc R sobre a eficácia in vitro e in vivo de anti-CD70 ADC. Modificou-se um anticorpo 1F6 humanizado através de: i) substituição do 145 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ domínio constante de IgGl pelos domínios constantes de IgG2 ou IgG4; ou ii) mutação do resíduo de aminoácidos no domínio Fc de um domínio constante de IgGl que se sabe ser importante para ligação a Fc R. 1. Variantes de isotipo
Seleccionou-se o derivado do anticorpo 1F6 humanizado HJLA (IlVhJ e hVLA) como molde para modificação do domínio Fc tal como descrito seguidamente. Tal como descrito detalhadamente anteriormente, o derivado de 1F6 humanizado HJLA contém a cadeia pesada variável hVHJ fundida com os domínios constantes de IgGl humana e a cadeia leve variável hViA. fundida a um domínio constante capa ( ) . A sequência de nucleótidos e aminoácidos da cadeia pesada variável de hlF6 hVHJ apresentam-se em SEQ ID NOs:13 e 14, respectivamente e a sequência de nucleótidos e aminoácidos da cadeia pesada variável hlF6 hVHJ fundida com os domínios constantes de IgGl humana apresentam-se em SEQ ID NOs:15 e 16, respectivamente. A sequência de nucleótidos e aminoácidos da cadeia leve variável de hlF6 hVLA apresentam-se em SEQ ID NOs:23 e 24, respectivamente e a sequência de nucleótidos e aminoácidos da cadeia leve variável de hlF6 hVLA fundida com o domínio constante apresentam-se em SEQ ID NOs:25 e 26, respectivamente.
Apresentam-se na figura 2 as sequências de aminoácidos dos domínios constantes dos isotipos IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos.
Geraram-se variantes de isotipo de derivado de anticorpo 1F6 humanizado HJLA, nos quais se substituiu o domínio constante of IqGl pelo domínio constante de IgG2 ou IgG4, de um modo geral tal como anteriormente descrito, excepto que se utilizaram as regiões constantes de IgG2 ou IgG4 humanas.
Apresentam-se na figura 3 as sequências de aminoácidos dos variantes de isotipo de IgG2 e IgG4 do derivado de hlF6 HJLA. 146 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Podem gerar-se de igual modo variantes de isotipo adicionais de anticorpos anti-CD70 humanizados (e.g., hlF6), incluindo, por exemplo, variantes de isotipo de IgGl nos quais partes do domínio constante de IgGl na proximidade do domínio Fc envolvidos na interacção de ligação a um ou mais receptores Fc são substituídos pelos domínios análogos de IgG2, IgG3 ou IgG4. 2. Variantes de domínio Fc
Geraram-se variantes do derivado de anticorpo 1F6 humanizado HJLA, nos quais os resíduos de aminoácidos no domínio Fc de IgGl que se sabem serem importantes para ligação a Fc R foram mutados para impedir a ligação a um ou mais Fc R, usando técnicas padrão de biologia molecular.
Conceberam-se racionalmente duas variantes de hlF6. hlF6 IgGlvl contém as seguintes mutações: E233P:L234V:L235A, que prejudicam seriamente a ligação a Fc RI, Fc RIIA, Fc RIIB e Fc RIIIA, mas têm um impacto mínimo na ligação a FcRn (Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613-24). hlF6 IgG4v3 contém as seguintes mutações: S228P:L235A:G237A:E318A (Hutchins et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:11980-4). A mutação S228P torna a dobra "do tipo IgGi" (CPPC) , o que favorece o emparelhamento de ligações dissulfureto intercadeia pesada relativamente a ligações intercadeia leve (Angal et al., 1993,
Mol. Immunol. 30:105-108; Bloom et al., 1997, Protein Sei. 6:407-415). Sabe-se que as mutações de alanina impedem a ligação a Fc Re Clq (Hutchinet al., anteriormente).
Apresentam-se na figura 4 as sequências de aminoácidos dos variantes de domínio Fc de IgGl e IgG4 do derivado de hlF6 HJLA (IgGlvl e IgG4v3).
Podem gerar-se de igual modo variantes de domínio Fc adicionais de anticorpos anti-CD70 humanizados (e.g., hlF6), incluindo, por exemplo, variantes de domínio Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos não conservativas, introdução de um ou mais resíduos de cisteína ou introdução de 147 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ um ou mais locais de glicosilação ligada a N, num domínio Fc envolvido na interacção de ligação com um ou mais receptores Fc , ou perto destes. A figura 5 é um diagrama esquemático que representa a estrutura dos variantes de anticorpo anti-CD70 humanizado (hlF66) . Gl, G2 e G4 indicam anticorpos com os domínios constantes dos isotipos IgGl, IgG2 e IgG4, respectivamente.
Glvl indica o variante de IgGl lhF6 com as substituições de aminoácidos E233P, L234V e L235A que resultam em ligação deficiente a Fc R. G4v3 indica o variante de IgG4 lhF6 com as substituições de aminoácidos S228P, L235A, G237A e E318A que resultam em ligação deficiente a Fc R.
Usando estes métodos e métodos semelhantes, podem gerar-se agentes de ligação ao alvo variantes que se ligam a CD70 ou a outros antigénios alvo. V. Ligação in vitro de anticorpos hlF6 variantes a células apresentando os receptores Fc A expressão do receptor Fc (Fc R) está espalhada em células imunitárias humanas normais e pode contribuir para absorção de ADC por tecido não alvo. Os anticorpos de isotipo IgGl humano ligam-se com maior eficiência Fc R do que os isotipos IgG4 e IgG2. Previu-se que a mutação dos resíduos Fc envolvidos na ligação a Fc R ou a alteração do isotipo Ig, diminuiria a localização de ADC em órgãos não alvo, resultando em diminuição de toxicidade, aumentando as concentrações de ADC em circulação e melhorando a direcção a tumor. Gerou-se um painel de isotipo IgG hlF6 e ADC de variante de ligação Fc para ensaiar os efeitos de menor ligação a Fc R sobre a eficácia e toxicidade de ADC. Consultar a figura 5.
Ambos os isotipos IgG2 e IgG4 interactuaram com receptores Fc com menor afinidade do que o isotipo IgGl (consultar a figura 6). 148 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Desenvolveram-se ensaios baseados em células para confirmar a redução da ligação de anticorpos variantes hlF6 a Fc RI e Fc RUIa humanos e para demonstrar que cada variante hlF6 mantém a actividade de ligação a antigénio.
Avaliaram-se anticorpos variantes hlF6 para actividade de ligação a antigénio. Sucintamente, reduziu-se cada variante de anticorpo hlF6 e marcou-se com Alexa Fluor 488 C5 maleimida (AF488). Combinaram-se então células 786-0 positivas para CD70 (figura 6) ou células L428 (não apresentado) com diluições em série de cada anticorpo marcado. Detectaram-se células marcadas usando um analisador FACS LSRII. Analisaram-se os dados usando uma equação de modelo de ligação a um local usando Prism v4.01. Os dados de afinidade de ligação aparente (tabela 6) indicam que a alteração do isotipo IgG (Gl, G2, G4) ou a mutação do esqueleto Fc (Glvl, G4v3) não têm impacto sobre a actividade de ligação ao antigénio.
Tabela 6
Resumo da ligação de anticorpo hlF6 variante a linhas celulares 786-0 e L428 CD70+ Células 786-0 Células L428 AF/Ab KD médio Desvio padrão AF/Ab KD médio Desvio padrão hlF6 Gl 3,4 1,27 0,121 3,4 0, 311 0,017 hlF6 Glvl 3, 6 1,13 0,249 3, 6 0, 288 0,041 hlF6 G2 4,4 0,95 0, 309 4,4 0, 110 0,031 hlF6 G4 4,2 1,14 0, 339 4,2 0, 253 0,058 hlF6 G4v3 4,3 1,30 0, 081 4,3 0, 325 0,077
Usando este ensaio e ensaios semelhantes, podem avaliar-agentes de ligação ao alvo variantes para ligação a CD70 ou a outros antigénios alvo. 149 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ VI. Produção de linha celulares CHO que expressam estavelmente Fc RS Fc RlIIa
Estabeleceram-se ensaios de competição de ligação baseados em células para estudar as interacções de anticorpos hlF6 variantes com receptor I Fc (Fc RI) e receptor Illa Fc (Fc RlIIa) humanos.
Os receptores completos Fc RI e Fc RlIIa humanos foram expressos estavelmente em células CHO e isolaram-se linhas celulares por clonagem com diluição limitativa. A figura 7 apresenta expressão de superfície celular de Fc RlIIa na linha celular parental, CHO DG44 e duas linhas celulares transfectadas de forma estável com um vector de expressão completo Fc RlIIa, 158F e 158V. Analisou-se a superfície celular de Fc RlIIa por FACS usando um anticorpo Fc RlIIa anti-humano conjugado com ficoeritrina (PE).
Usando estas ou outras linhas celulares, podem avaliar-se agentes de ligação ao alvo variantes para ligação a células que expressam receptores Fc RI e Fc RlIIa. VII. Ligação in vitro de anticorpos hlF6 variantes a linhas celulares CHO que expressam estavelmente Fc IRe Fc RlIIa
Determinou-se ligação de anticorpo anti-CD70 (hlF6) humanizado a células CHO que expressam Fc RlIIa completo por ligação de saturação. A linha celular parental, CHO DG44 e duas linhas celulares estavelmente transfectadas com um vector de expressão completo Fc RlIIa, 158F (afinidade baixa) e 158V (afinidade elevada), foram incubadas com anticorpo hlF6 marcado com AF488. Detectaram-se células marcadas usando um analisar FACS LSRII. A figura 8 mostra que o anticorpo hlF6 se liga a células que expressam Fc RlIIa.
Determinou-se também ligação de variantes de anticorpos anti-CD70 (hlF6) humanizados a células CHO que expressam Fc RlIIa completo por ligação de competição. Combinou-se uma linha celular CHO que expressa estavelmente Fc RlIIa humano, 150 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 158V, com diluições em série do IgGl hlF6 parental ou variantes de hlF6 na presença de hlF6 IgGl marcado com Alexa Fluor 488 100 nM. Detectaram-se células marcadas usando um analisador FACS LSRII. As interacções de ligação de hlF6 IgGl e variantes com Fc RlIIa foram comparáveis a relatos da literatura. Apenas hlF6 IgGl (triângulos brancos) interagiram significativamente com Fc RlIIa figura 9, painel da esguerda). A conjugação de hlF6 IgGl com uma carga média de 4 auristatinas MMAF/anticorpo, não afectou significativamente a ligação do anticorpo a Fc RlIIafigura 9, comparar os painéis da esquerda e da direita).
Determinou-se a ligação de anticorpo anti-CD70 (hlF6) humanizados a células CHO que expressam Fc RI completo por ligação de competição. Combinou-se uma linha celular CHO gue expressa estavelmente Fc RI humano com dilções em série do IgGl hlF6 parental ou variantes de hlF6 na presença de hlF6 IgGl marcado com Alexa Fluor 488 50 nM. Detectaram-se células marcadas usando um analisador FACS LSRII. As interacções de ligação de hlF6 IgGl e variantes a Fc RI foram compáifeis a relatos da literatura. hlF6 IgGl (triângulos brancos) e hl F6 IgG4 (triângulos brancos invertidos) ligaram-se a Fc RI com elevada afinidade enguanto hlF6 IgG2 e variantes de hlF6 IgGlvl e IgG4v3 (losangos) se ligaram com afinidade reduzida e não mostraram qualquer interacção significativa (figura 10, painel da esquerda). A conjugação de hlF6 IgGl, hlF6 IgGlvl, hlF6 IgG2, hlF6 IgG4 ou hlF6 IgG4v3 com uma carga média de 4 auristatinas MMAF/anticorpo, não afectou a ligação do anticorpo a Fc RI (figura 10, comparar os painéis da esquerda e da direita).
RlIIa.
Usando este ensaio e outras semelhantes, podem avaliar-se agentes de ligação ao alvo variantes para ligação a células que expressam receptores Fc RI e Fc 151 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ VIII. Ligação in vitro de conjugados de fármaco e variante de anticorpo hlF6 a linhas celulares CHO que expressam estavelmente Fc RI e Fc RlIIa
Conjugaram-se hlF6 IgGl e variantes de hlF6 a vcMMAF com uma carga média de 4 fármacos/anticorpo.
Usando os ensaios anteriormente descritos ou variações de tais ensaios, podem avaliar-se conjugados de agentes de ligação ao alvo variantes e fármaco para ligação a células que expressam receptores Fc RI e Fc RlIIa. IX. Eficácia in vitro de conjugados de fármaco e variante de anticorpo hlF6
Efectuaram-se ensaios de inibição de crescimento num painel de linhas celulares positivas para CD70: 786-0, Caki-1, L428, UMRC-3 e LP1 e uma linha celular negativa para CD70: HCT-116. Trataram-se as células com diluições em série de hlF6 IgGl vcMMAF(4), hlF6 IgGlvl vcMMAF(4), hlF6 IgG2 vcMMAF(4), hlF6 IgG4 vcMMAF (4) e hlF6 IgG4v3 vcMMAF (4) . Não se observou qualquer diferença significativa de citotoxicidade entre os conjugados de variante hlF6 e fármaco ao longo do painel de linha celular CD70+ (tabela 7).
Tabela 7
Valores de IC50 para conjugados de variante de hlF6 vcMMAF (4) num painel celular CD70+ hlF6—ADC (n.2 de receptores CD70) 786-0 190 000 Caki-1 136 000 L428 105 000 UMRC-3 70 000 LP-1 34 000 HCT-116 (CD70“) hlF6 Glvl-vcMMAF(4 ) 9 5 3 29 22 Sem efeito hlF6 G2-vcMMAF(4) 16 7 25 31 34 Sem efeito hlF6 G4-vcMMAF(4) 26 17 18 35 42 Sem efeito hlF6 G4v3-vcMMAF(4) 22 8 14 26 28 Sem efeito hlF6 Gl-vcMMAF(4) 8 6 3 34 21 Sem efeito
Usando este ensaio ou ensaios relacionados, podem avaliar-se conjugados de agente de ligação ao alvo variante e fármaco 152 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ para actividade citotóxica sobre células que expressam antigénio alvo. X. Conjugados de variante de anticorpo hlF6 e fármaco com resíduos de cisteína introduzidos
Prepararam-se variantes de anticorpo 1F6 humanizado por mutação de resíduos de aminoácidos no domínio Fc de IgGl que estão envolvidos na ligação do domínio Fc a Fc R. Geraram-se as mutações usando técnicas padrão de biologia molecular.
Conceberam-se racionalmente seis variantes de hlF6. hlF6 IgGl G236C contém uma substituição de glicina para cisteína na posição 236; hlF6 IgGl P238C contém uma substituição de prolina para cisteína na posição 238; hlF6 IgGl S239C contém uma substituição de serina para cisteína na posição 239; hlF6 IgGl D265C contém uma substituição de aspartato para cisteína na posição 265; hlF6 IgGl E269C contém uma substituição de glutamato para cisteína na posição 269; e hlF6 IgGl A327C contém uma substituição de alanina para cisteína na posição 327. Os anticorpos foram purificados por métodos padrão.
Desenvolveram-se ensaios baseados em células para confirmar a ligação reduzida de quatro dos anticorpos hlF6 variantes a Fc RI e Fc RlIIa humanos e para demonstrar que cada variante hlF6 retém actividade de ligação ao antigénio. Conjugou-se a variante de anticorpo S239C a vcMMAF tal como descrito anteriormente ou pode ser conjugado tal como descrito no pedido U.S. publicado n.2 2007-092940 ou Givol et al. (anteriormente).
Avaliaram-se as variantes de anticorpos hlF6 para actividade de ligação ao antigénio, tal como descrito anteriormente. Os dados de afinidade de ligação aparente (tabela 8) indicam que a introdução de substituições de cisteína na região Fc não reduziu substancialmente a ligação. 153 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Tabela δ
Afinidade de ligação de mutantes anti-CD70 Cys
Variantes anti-CD70 (hlF6) humanizados Ligação a células 786-0 KD de IgG IC5o IgGvcF2 (nM) ICso IgG IgGl 0, 6 1,3 IgGl S239C 1,0 1,1 IgGl D265C 1,1 0, 9 IgGl E269C 0,8 0, 9 IgGl A327C 0,5 1,1
Determinou-se a ligação de uma das variantes, IgGl S239C, a células CHO que expressam Fc RlIIa e Fc RI completos tal como descrito anteriormente. Relativamente à figura 11, a variante IgGl S239C, não conjugada ou conjugada a vcMMAF (média de 2 fármacos/anticorpo) apresentou ligação reduzida a células que expressam Fc RlIJa mas não a células que expressam Fc RI. O anticorpo parental de controlo hlF6, liga-se a células que expressam Fc RlIIa a células que expressam Fc RI .
Podem gerar-se adicionalmente de modo semelhante variantes de domínio Fc incluindo, por exemplo, variantes de domínio Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos por cisteína, por exemplo, nas posições 234, 235, 237, 267, 298, 299, 326, 330 ou 332. Utilizando os ensaios descritos, podem avaliar-se agentes de ligação ao alvo variantes para ligação a células que expressam receptores Fc RI e Fc RlIIa. XI. Eficácia in vivo de conjugados de variantes de anticorpo hlF6 e fármaco
Os dados de eficácia in vivo sugerem que a diminuição da ligação a Fc R melhora a potência de um ADC. Num modelo de xenoenxerto de carcinoma de células renais, injectaram-se subcutaneamente ratinhos nus com células 786-0 e seguidamente trataram-se com uma administração i.v. única de 0,5 mg/kg 154 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ (figura 12, painel superior) ou 1,5 mg/kg (figura 12, painel inferior) de cada conjugado de variante de anticorpo anti-CD70 humanizado (hlF6) e fármaco assim gue o volume médio de tumor atingiu 100 mm3. Dosearam-se nove (9) animais para cada grupo de tratamento e seis (6) animais com veiculo sozinho. Surpreendentemente, este estudo de eficácia in vivo indicou que: hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (losangos) tinham eficácia aumentada comparativamente com hlF6 IgGl vcMMAF4 (triângulos); hlF6 IgG2 vcMMAF4 (círculos) também tinham eficácia aumentada comparativamente com hlF6 IgGl vcMMAF4 (triângulos); e hlF6 IgGlvl v cMMAF 4 (losangos) tinham eficácia aumentada comparativamente com hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (quadrados). Apesar da ligação muito diminuída a Fc R apresentada por hlF6 IgG4 (triângulos invertidos) e hlF6 IgG4v3 (quadrados), os conjugados de fármaco destas moléculas foram menos eficazes do que o conjugado de fármaco parental hlF6 IgGl (triângulos).
Apresenta-se na figura 13 um segundo estudo in vivo.
Trataram-se ratinhos nus injectados subcutaneamente com células 786-0 de carcinoma de células renais, com uma única administração i.v. de 0,5 mg/kg ou 1,5 mg/kg de cada conjugado de variante de hlF6 e fármaco MMAF assim que o volume médio de tumor atingiu 100 mm3. Dosearam-se nove (9) animais para cada grupo de tratamento e seis (6) animais foram doseados com veículo sozinho. Os estudos de eficácia in vivo indicaram que: hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (losangos) tinham eficácia aumentada comparativamente com hlF6 IgGl vcMMAF4 (quadrados) ; hlF6 IgG2 vcMMAF4 (triângulos) também tinham eficácia aumentada comparativamente com hlF6 IgGl vcMMAF4 (quadrados); hlF6
IgG4v3 vcMMAF4 (cruzes) tinham eficácia equivalente comparativamente com hlF6 IgG4 vcMMAF4 (círculos); e hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (losangos) tinham eficácia aumentada comparativamente com hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (cruzes).
Apresenta-se na figura 14 um terceiro estudo in vivo.
Trataram-se ratinhos nus injectados subcutaneamente com células 786-0 de carcinoma de células renais, com uma única administração i.v. de 1,5 mg/kg ou 4,5 mg/kg de cada conjugado de variante de hlF6 e fármaco mcMMAF assim que o volume médio 155 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ de tumor atingiu 100 mm3. Os estudos de eficácia in vivo indicaram que: hlF6 IgGlvl mcMMAF4 (losangos) tinham eficácia aumentada comparativamente com hlF6 IgGl mcMMAF4 (triângulos); hlF6 IgG2 vcMMAF4 (quadrados) também tinham eficácia aumentada comparativamente com hlF6 IgGl vcMMAF4 (triângulos).
Efectuou-se um quarto estudo in vivo para avaliar a diferença de actividade de conjugados de variantes de anticorpo hlF6 e fármaco num modelo diferente de xenoenxerto de carcinoma de células renais CD70+. Células UMRC-3 de carcinoma de células renais, guando injectadas em ratinhos nus formam tumores; os tamanhos destes tumores podem ser significativamente reduzidos por tratamento com conjugados de anticorpo hlF6 e fármaco MMAF mas não com anticorpo hlF6 não conjugado (consultar figura 15). Injectaram-se subcutaneamente ratinhos nus com células UMRC-3 de carcinoma de células renais. Iniciou-se o tratamento com as quantidades indicadas de anticorpo quando o volume de tumor atingiu aproximadamente 100 mm3. Dosearam-se os animais g4dx4 i.v. sem anticorpo (não tratados), 1 mg/kg 1F6vcMMAF4, 3 mg/kg 1F6vcMMAF4, 1 mg/kg 1F6Glvl vcMMAF4, 3 mg/kg 1F6G1v1vcMMAF4, 1 mg/kg 1F6G2vcMMAF4, 3 mg/kg 1F6G2vcMMAF4, 1 mg/kg 1F6G4vcMMAF4, 3 mg/kg ÍF6G4vcMMAF4, 1 mg/kg 1F6G4v3vcMMAF4 ou 3 mg/kg 1F6G4v3vcMMAF4. O ponto final medido do estudo foi o volume de tumor. Para determinar a farmacocinética in vivo das variantes de anticorpos hlF6, retirou-se sangue (veia safena, 20 μΐ) para cada grupo imediatamente antes de cada dose e seguidamente lh, 6h, 2d, 4d após a quarta dose.
Num estudo relacionado, dosearam-se animais q4dx4 i.v sem anticorpo (não tratados), 3 mg/kg 1F6vcMMAF4, 6 mg/kg 1F6vcMMAF4, 3 mg/kg 1F6G1v1vcMMAF4, 6 mg/kg 1F6G1v1vcMMAF4, 3 mg/kg 1F6G2vcMMAF4, 6 mg/kg 1F6G2vcMMAF4, 3 mg/kg 1F6G4vcMMAF4, 3 mg/kg 1F6G4vcMMAF4, 3 mg/kg 1F6G4v3vcMMAF4 ou 6 mg/kg 1F6G4v3vcMMAF4. O ponto final medido do estudo foi o volume de tumor. Para determinar a farmacocinética in vivo das variantes de anticorpos hlF6, retirou-se sangue (veia safena, 20 μΐ) para cada grupo imediatamente antes de cada dose e seguidamente lh, 6h, 2d, 4d após a quarta dose. 156 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Relativamente à figura 16A, os estudos de eficácia in vivo indicaram que: hlF6 vcMMAF4 e todos os ADC variantes tinham eficácias semelhantes para doses de 1 mg/kg. Contrariamente, a 3 mg/kg, IgG2 vcMMAF4 (losangos) e IgG4 vcMMAF4 (círculos) tinham uma eficácia algo aumentada comparativamente com hlF6 IgGl v cMMAF 4 (triângulos brancos), hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (círculos negros) e hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (triângulos negros) e com o controlo 1F6 IgG4 vcMMAF4 (cruzes).
Relativamente à figura 16B, os estudos de eficácia in vivo indicaram que: a 3 mg/kg hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (triângulos negros) tinham a melhor eficácia, enquanto hlF6 IgGl vcMMAF4 (triângulos brancos), hlF6 IgG2 vcMMAF4 (losangos) , hlF6 IgG4 v cMMAF 4 (círculos) e hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (círculos negros) tinham eficácias semelhantes mas algo aumentadas. A 6 mg/kg hlF6 IgGl vcMMAF4 e todas as variantes de anticorpo apresentaram eficácias semelhantes.
Usando estes ensaios ou ensaios relacionados, podem avaliar-se conjugados de agente de ligação variante e fármaco para eficácia in vivo contra tumores que expressam antigénio alvo. XII. Doses máximas toleradas de conjugados de variantes de anticorpo hlF6 e fármaco em ratinhos
Para determinar a dose tolerada máxima (MTD) das variantes de anticorpo, injectaram-se grupos de ratinhos Balb/c (n = 3) com 40, 60 ou 80 mg/kg de ADC variantes através da veia da cauda para determinar a dose única máxima tolerada. Monitorizaram-se os ratinhos diariamente durante 14 dias e registaram-se tanto o peso como as observações clínicas. Eutanasiaram-se os ratinhos que desenvolveram sinais de desconforto significativos. O anticorpo anti-CD70, hlF6, liga-se a CD70 humano mas não apresenta reactividade cruzada com o antigénio correspondente de ratinho. Assim, podem explorar-se em ratinho as toxicidades 157 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ independentes de antigénio mas não as toxicidades dependentes de antigénio dos ADC anti-CD70. Todos os ADC foram tolerados a > 40 mg/kg sendo IgG2-F4 ligeiramente melhor tolerado (> 60 mg/kg). Assim IgG2-F4 e IgGlvl-F4 têm um índice terapêutico que é melhorado de pelo menos 2 vezes comparativamente com o ADC IgGl-F4 parental. XIII. Farmacocinética in vivo de conjugados de variante de anticorpo hlF6 e fármaco
No estudo descrito no exemplo X, retirou-se sangue de três (3) ratinhos tratados com uma dose de 1,5 mg/kg de cada conjugado de variante de anticorpo hlF6 e fármaco vcMMAF 1 h, 1 d, 7d e 14d após administração do fármaco. Mediram-se as concentrações séricas de conjugados anticorpo-fármaco a esses pontos temporais usando um ELISA de ligação anti-idiotipo.
Relativamente à figura 17, hlF6 IgGlvl vcMMAF4 (triângulos) e hlF6 IgG2 vcMMAF4 (triângulos invertidos) depuraram mais lentamente da circulação comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (quadrados) . hlF6 IgG4 vcMMAF4 (losangos) e hlF6 IgG4v3 vcMMAF4 (círculos) também depuraram mais lentamente da circulação comparativamente a hlF6 IgGl vcMMAF4 (quadrados). A depuração mais rápida de IgG4 humano comparativamente a IgGl ou IgG2 humanos da circulação de ratinho não foi inesperada uma vez que tal tinha sido anteriormente observado (Zuckier et al., 1994, Câncer 73:794- 799). A depuração mais rápida dos conjugados de fármaco IgG4 e IgG4v3 da circulação de ratinho comparativamente com conjugados de fármaco IgGl, IgG2 e IgGlvl ocorre provavelmente através de mecanismos independentes de Fc R. Os dados de depuração são também resumidos na tabela 9. Tal como ilustrado na tabela, a potência melhorada de conjugados de variantes de IgGlvl e IgG2 e fármaco correlaciona-se com a exposição (AUC). A redução da ligação a Fc R por concepção racional do domínio Fc de IgGl pode melhorar a eficácia e potencialmente a janela terapêutica, por redução da absorção pelo órgão não alvo aumentando assim as concentrações de conjugado de 158 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ anticorpo e fármaco em circulação e melhorando a absorção pelo tumor.
Utilizando este ensaio ou um ensaio relacionado, podem avaliar-se os conjugados de agente de ligação ao alvo variante e fármaco relativamente à farmacocinética in vivo.
Tabela 9
Segurança e farmacocinética do conjugado anticorpo-fármaco
IgGl-F4 IgGlvl- F4 IgG2-F4 IgG4-F4 IgG4v3- F4 Segurança MTD (mg/kg) * > 40 > 40 > 60 > 40 > 40 Variáveis farmacocinéticasf Ti/2 (dias) 5,4 ± 1,1 5,3 ± 0,7 5,9 ± 1,2 2,8 ± 0,3 3,7 AUC (dia-gg/ml) 200 ± 23 432 ± 19 469 ± 115 204 ± 74 97 Depuração (ml/dia/kg) 51 ± 5 23 ± 1 23 ± 5 61 ± 17 103 XIV. Distribuição tecidular in vivo dos conjugados de variante de anticorpo hlF6 e fármaco
Investigou-se a distribuição tecidular in vivo de conjugados de anticorpo hlF6 humanizado e de variantes de anticorpo hlF6 e fármaco (ADC). Injectaram-se ratinhos subcutaneamente com células de carcinoma renal 786-0 tal como anteriormente descrito e seguidamente administrou-se intravenosamente 1,5 mg/kg de hlF6 G1 vc[3H]MMAF ou hl F6 Glvl vc [3H]MMAF. Às 4 horas, 1 dia e 3 dias após injecção, mediu-se [3H]MMAF e/ou [3H]MMAF-ADC no soro, no tumor e em tecidos (i.e., figado, rim, intestinos, conteúdo intestinal e baço). Homogeneizaram-se tumor e tecidos na presença de metanol (i.e., os precipitados [3H]MMAF-ADC). A suspensão contém fármaco total (i.e., [3H] MMAF-ADC mais [3H]MMAF) e o sobrenadante contém fármaco livre (i.e., [3H]MMAF). 159 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Aparentemente, a variante hlF6 Glvl-vcMMAF separou-se do soro mais lentamente do que hlF6 Gl-vcMMAF a todos os três pontos temporais (4 horas, 1 dia e 3 dias) . (Note-se que o ensaio mede tanto o MMAF livre como o MMAF conjugados ao anticorpo hlF6). 0 [3H]MMAF total apareceu rapidamente nos tumores, estando a medida às 4 horas perto dos pontos temporais mais tardios; o [3H]MMAF livre apareceu nos tumores mais lentamente. Às 4 horas, a maioria do [3H]MMAF apareceu ligado a ADC, enquanto o [3H]MMAF livre foi dominante a pontos temporais mais tardios. Às 72 h, apareceu mais [3H]MMAF livre nos tumores de ratinhos tratados com variante hlF6 Glvl comparativamente com hlF6 G1. É possível que o aumento da semivida da variante hlF6 Glvl-vc[3H]MMAF em circulação contribua para o aumento da presença de [3H]MMAF nos tumores. Às quatro horas, os ratinhos injectados com variante hlF6 Glvl-vc [3H] MMAF tinham uma quantidade de fármaco significativamente menor (ligado a ADC e livre) no fígado e intestinos comparativamente com ratinhos injectados com hlF6 Glvl-vc[3H] MMAF. Estas diferenças, contudo, desapareceram nos pontos temporais mais tardios. Estes dados são consistentes com o facto do fígado ser responsável por degradação de ADC seguida de excreção biliar.
Aparentemente a variante hlF6 Glvl-vcMMAF depurou pelo rim e baço mais lentamente do que hlF6 Gl-vcMMAF, o que é semelhante aos resultados obtidos no soro.
Resumidamente, por medição de [3H]MMAF-ADC, a variante hlF6 Glvl depura mais lentamente da circulação do que hlF6 Gl, o que é consistente com a farmacocinética in vivo (consultar seguidamente). No tumor, aparece mais [3H]MMAF livre no tumor aos 3 dias após injecção para a variante hlF6 Glvl comparativamente com hlF6 Gl, o que é consistente com maior potência in vivo. A maior concentração de [3H]MMAF-ADC no soro parece conduzir a uma maior concentração de fármaco livre no tumor. Observaram-se menores [3H]MMAF-ADC e [3H]MMAF livre no 160 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ fígado, intestinos e conteúdo intestinal às 4 h para a variante hlF6 Glvl comparativamente com hlF6 G1. Finalmente, o rim e baço têm concentrações de [3H]MMAF-ADC semelhantes ao soro, mas o fármaco livre às 4 h é inferior para a variante hlF6 Glvl comparativamente com hlF6 G1. Estes resultados são consistentes com a ligação reduzida de um ADC a receptores Fc gama estar associada a uma semivida sérica mais prolongada e aumento da acumulação de fármaco no tumor.
Usando estes ensaios ou ensaios relacionados, podem avaliar-se os conjugados de agente de ligação ao alvo variante e fármaco para biodistribuição in vivo.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Seattle Genetics, Inc.
McDonagh, Charlotte Cárter, Paul Sussman, Django
<120> AGENTES DE LIGAÇÃO AO ALVO VARIANTES E SUAS UTILIZAÇÕES
<130> 020-00102WO <150> 60/872 239 <151> 2006-12-01 <150> 60/918 563 <151> 2007-03-16 <160> 39 <170> Patent In versão 3.5
<210> 1 <211> 411 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 1 atggctlggg tgtggacctl gctatlcctg aiggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 60 atccagltgg t gcagt ct gg acctgaggtg aagaagcct g gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ct gggt at ac cttcacaaac t at ggaat ga actgggtgaa gcaggct cca 180 ggaaagggt t t aaagt ggal gggctggata aacacct aca ctggagagcc aacatatgct 240 gatgccttca agggacggt t tgccttctct 11 ggaaacct ct gccagcac tgcctatttg 300 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag agactacggc 360 gactatggta tggactactg gggtcaagga acct cagt ca ccgtctcctc a 411 161 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <210> 2 <211> 137 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Kfet AI a Tr p Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu Itet AI a AI a Al a Q n Sar 1 5 10 15 AI a G y AI a 3 n 11 B 3 n Leu Vai 3 π Ser o y Pr o 3 u Vai Lys Lys 20 25 30 Pr o 3 y G u Thr Vai Lys 11 e Ser Cys Lys AI a Ser α y Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Qy Vbt Asn Trp Vai Lys 3 n AI a Pro 3 y Lys Qy Leu 50 55 60 Lys 65 Trp ÍV&t Qy Trp I I Θ 70 Asr Thr Tyr Thr 0y 75 Q u Pr o Thr Tyr Al a 80 Asp AI a Phe Lys 0 y Arg Phe AI a Phe Ser Leu 3 u Thr Ser AI a Ser 65 90 95 Thr AI a Tyr Leu 0 π I I e Asn Asn Leu Lys Asn 3 u Asp Thr Al a Thr 100 105 110 Tyr Phe cys AI a Arg Asp Tyr Q y Asp Tyr ay IVfet Asp Tyr Trp 3 y 115 120 125 G π a y Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 <210> 3 <211> 1404 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> CDR murina, FR humana em domínio HV 162 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 4 467 PRT Artificial
CDR murina, FR humana no domínio HV <400> 3 at ggd t ggg gt 1 cagct gg t gcaaggcí t ggacaagggc gal gcct t ca gagct gagga gact at ggt a aagggcccat gccctgggct ggcgccct ga t cect cagca aacgt gaat c gacaaaacl c 11 cct ct t cc tgcgtggtgg ggcgtggagg cgt gtggt ca tgcaaggtct gggcagcccc aaccaggt ca tgggágagca gacggct cct aacgt cl t ct ct ct ccct gt <210> <211> <212> <213> <220> <223> t gt ggacct t t gcagtct gg ct ggt t acac 11 gagt ggat agggcagagl gcct gagat c t ggact act g cggt ct t ccc gcct ggt caa ccagcggcgl gcgt ggt gac acaagcccag acacat gccc ccccaaaacc t ggacglgag t gcat aat gc gcgt cct cac ccaacaaagc gagaaccaca gcct gacct g at gggcagcc t ct t cct ct a cat gct ccgt ct ccgggi aa gct at t cct g agct gaggtg ct 11 accaac gggat ggat c caccat gacc t gacgacacg gggtcaagga cct ggcaccc ggact act t c gcacacct t c cgt gccct cc caacaccaag accgt gccca caaggacacc ccacgaagac caagacaaag cgt cct gcac cct cccagcc ggt gt acacc cct ggt caaa ggagaacaac cagcaagct c gat gcat gag at ga at ggcagct g aagaagcct g t at ggaat ga aacacct aca acagacacat gccgt gt at t accaccgt ca t cct ccaaga cccgaaccgg ccggct gt cc agcagct t gg glggacaaga gcacct gaac ct cat gat ct cctgaggt ca ccgcgggagg caggactggc cccat cgaga ct gcccccat ggct t ct at c t acaagacca accgt ggaca gct ct gcaca cccaaagt gc gggcct cagt act gggt gcg ct ggagagcc ccacgagcac act gtgcgag ccgt ct cct c gcacct ct gg t gacggt gt c t acagt cct c gcacccagac aagt t gagcc t cct gggggg cccggacccc agt t caactg agcagt acaa t gaat ggcaa aaaccatct c cccgggat ga ccagcgacat cgcct cccgt agagcaggtg accact acac ccaagcacag gaaggt ct cc acaggcccct aacat at gct agcct acatg agact acggc agct agcacc gggcacagcg gt ggaact ca aggact ct ac ct acat ct gc caaat ct t gt accgt cagt c t gaggt caca gt acgt ggac cagcacgt ac ggagt acaag caaagccaaa gct gaccaag cgccgt ggag gct ggactcc gcagcagggg gcagaagagc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1404 163 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <400> - 4 IVbt AI a Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu ivbt AI a AI a AI a Q π Ser 1 5 10 15 AI a α n AI a G n Vai α n Leu Vai G n Ser Gy AI a G u Vai Lys Lys 20 25 30 Pro Gy AI a Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys AI a Ser Gy Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Q y IVbt Asn Trp Vai Arg Q n AI a Pro Gy G n Q y Leu 50 55 60 Q u Trp Mit G y Trp 91 e Asn Thr Tyr Thr G y G u Pro Thr Tyr AI a 65 70 75 60 Asp AI a Phe Lys Gy Arg Vai Thr ivfet Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr AI a Tyr Wfet G u Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr AI a Vai 100 105 110 Tyr Tyr cys AI a Arg Asp Tyr Gy Asp Tyr Gy IVbt Asp Tyr Trp Gy 115 120 125 G n G y Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ai a Ser Thr Lys Gy Pr o Ser 130 135 140 Vai Phe Pr o Leu AI a Pr o Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gy Gy Thr AI a 145 150 155 160 AI a Leu G y O/Ê Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pr o G u Pro Vai Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gy Ala Leu Thr Ser ay Vai Hl s Thr Phe Pro AI a 180 185 190 Vai Leu Q n Ser Ser Qy Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu G y Thr □ n Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn Hl s 210. 215 220 164 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai G u Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr Hi s Thr Cys Pr o Pr o Cys Pr o Al a Pr o α u Leu Leu Gy 245 250 255 G y Pro Ser Vai Phe Leu PhB Pr o Pr o Lys Pr o Lys Asp Thr Leu Ntet 260 265 270 1 1 9 Ser Arg Thr Pr o G u Vai Thr cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Hi s 275 280 285 G u Asp Pr o G u Vai Lys Phe Asn Tr p Tyr Vai Asp G y Vai G u Vai 290 295 300 H E Asn AI a Lys Thr Lys Pr o Arg G u G u G n Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu Hi s G n A3p Tr p Leu Asn Gy 325 330 335 Lys 3 u Tyr Lys cys Lys Vai Ser Asn Lys Al a Leu Pro Al a Pro I I e 340 345 350 Q U Lys Thr 1 1 Θ Ser Lys Al a Lys 0 y α π Pr o Arg G u Pro Q n Vai 355 360 365 Tyr Thr Leu Pr o Pro Ser Arg Asp α u Leu Thr Lys Asn G n Vai Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Vai Lys G y Phe Tyr Pr o Ser Asp I 1 e Al a Vai G u 385 390 395 400 Trp G u Ser Asn 3 y α n Pro G u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pr o Pro 405 410 415 Vai Leu Asp Ser Asp Cl y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp α n G r G y Asn Vai Phe Ser cys Ser Vai iyht 435 440 445 H s G u AI a Leu Hi s Asn Hi s Tyr Thr G n Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pr o G y Lys 465 <210> 5 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, FR humana 165 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <400> 5 caggttcagc tggtgcagtc tggsgctgag gtgaagaagc ct ggggcct c agtgaaggtc 60 t ccl gcaagg cttctgglta cacctttacc aactatggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacct acactggaga gccaacatat 180 gctgatgcct t caagggcag agtcaccatg accagagaca catccatcag cacagcctac 240 at ggagci ga gcaggct gag at ct gacgac acggccgt gt at t act glgc gagagact ac 300 ggcgactatg gtatggacta ctggggtcaa ggaaccaccg tcaccgtctc ct ca 354 <210> 6 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR murina, FR humana <400> 6 0 Π Vai 0 n Leu Vai 0 n Ser 0 y AI a G u Vai Lys Lys Pr o 0 y Ai a 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Çys Lys AI a Ser Q y Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 3 y Asn Trp Vai Arg 0 π AI a Pr o G y G n G y Leu G u Trp M»t 35 40 45 3 y Trp 11 e Asn Thr Tyr Thr 0 y Ou Pr 0 Thr Tyr AI a Asp AI a Phe 50 55 60 Lys Q y Arg Vai Thr rvbi Thr Arg Asp Thr Ser I I e Ser Thr AI a Tyr 65 70 75 80 m 3 u Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr AI a Vai Tyr Tyr cys 85 90 95 AI a Arg Asp Tyr <3y Asp Tyr o y Mit Asp Tyr Trp Gy G n α y Thr 100 105 110 Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 7 <211> 1404 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> CDR murina, FR humana no domínio HV 60 166 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 8 467 PRT Artificial
CDR murina, FR humana no domínio HV <400> 7 atggctlggg gt!caget gg tgcaaggct 1 ggacaagggc gat gcct t ca gagctgagca gact at ggt a aagggcccat gccct gggct ggcgccct ga t ccct cagca aacgt gaat c gacaaaact c 11 cct cl t cc tgcgt ggt gg ggcgtggagg cgl gt ggt ca t gcaaggt ct gggcagcccc aaccaggt ca t gggagagca gacggct cct aacgt ct t ct ct ct ccct gt <210> <211> <212> <213> <220> <223> t gt ggaccl t t gcagt ct gg ct ggt t acac 11 gagt ggat agggcagagt ggctgagat c t ggactactg cgglct t ccc gcclggt caa ccagcggcgt gcgt ggt gac acaagcccag acacat gccc ccccaaaacc t ggacgtgag t gcat aat gc gcglcct cac ccaacaaagc gagaaccaca gcclgacct g at gggcagcc t ct t cct ct a cat gct ccgt ct ccgggt aa gct at tcctg agct gaggt g ct 11 accaac gggat ggat c caccat gapc t gacgacacg gggt caagga cct ggcaccc ggact act t c gcacacct t c cgt gccct cc caacaccaag accgt gccca caaggacacc ccacgaagac caagacaaag cgt cct gcac cct cccagcc ggt gt acacc cct ggt caaa ggagaacaac cagcaagctc gat gcat gag atga at ggcagct g aagaagcct g t at ggaat ga aacacct aca agagacacat gccgtgt at t accaccgt ca t cct ccaaga cccgaaccgg ccggclgt cc agcagct t gg gt ggacaaga gcacct gâac ct cat gat ct cct gaggt ca ccgcgggagg caggact ggc cccat cgaga ct gcccccat ggct t ct at c t acaagacca accgt ggaca gct ct gcaca cccaaagt gc gggcct cagt actgggtgcg ct ggagagcc ccat cagcac act gtgcgag ccgt ct cct c gcacct ct gg tgacggtgtc t acagt cct c gcacccagac aagt t gagcc t cct gggggg cccggacccc agt t caact g agcagt acaa t gaat ggcaa aaaccat ct C cccgggat ga ccagcgacat cgcct cccgt agagcaggt g accact acac ccaagcacag gaaggt ctcc acaggcccct aacat at gct agcct acat g agactacggc agct agcacc gggcacagcg gt ggaactca aggact ctac ct acat ctgc caaat ct tgt accgt cagt c t gaggt caca gt acgtggac cagcacgt ac ggagt acaag caaagccaaa gct gaccaag cgccgt ggag gct ggact cc gcagcagggg gcagaagagc 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1404 167 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <400> 8 l\fet 1 AI a Trp Vai Trp 5 Thr Leu Leu Phe Leu 10 Nbt Al a Al a Al a 3 n 15 Ser AI a 3 n AI a 3 n Vai G n Leu Vai G n Ser G y Al a G u Vai Lys Lys 20 25 30 pr ο 3 y AI a Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Al a Ser 3 y Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr 3 y Mst Asn Trp Vai Arg 3 n Al a Pro 3 y 3 n ay Leu 50 55 60 G u 65 Trp m Gy Trp 11 e 70 Asn Thr Tyr Thr Gy 75 G u Pro Thr Tyr Al a 80 Asp AI a Phe Lys ay 85 Arg Vai Thr Wbt Thr 90 Arg Asp Thr Ser 11 e 95 Ser Thr AI a Tyr hfel G U Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Al a Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys AI a Arg Asp Tyr 3 y Asp Tyr G y IVbt Asp Tyr Trp G y 115 120 125 3 n 3 y Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Al a Ser Thr Lys 3 y Pro Ser 130 135 140 Vai Phe Pr o Leu AI a Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gy G y Thr Ai a H CA 145 150 155 1 OU AI a Leu Gy Cys Leu 165 Vai Lys Asp Tyr Phe 170 Pro 3 u Pro Vai Thr 175 Vai Ser Tr p Asn Ser 3 y AI a Leu Thr Ser Gy Vai Hi s Thr Phe Pr o Al a 180 185 190 Vai Leu G n Ser Ser G y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu 3 y Thr G π Thr Tyr 11 e Cys Asn Vai Asn Hi s 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai G u Pr o Lys ser Qrs AJA 225 230 235 240 Asp Lys Thr Hi s Thr Cys Pro Pr o cys Pro Al a Pro Q u Leu Leu G y 245 250 255 α y Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu M»t 260 265 270 11 θ Ser Arg Thr Pro G u Vai Thr cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser H s 275 280 285 3 u Asp Pr o 3 u Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 3 y Vai 3 u Vai 290 295 300 H s Asn AI a Lys Thr Lys Pro Arg 3 u G u G n Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 168 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu Hi s 3 π Asp Trp Leu Asn G y 325 330 335 Lys α u Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Al a Leu Pr o Al a Pr o I I e 340 345 350 Q u Lys Thr 11 e Ser Lys Al a Lys Qy 3 n Pr o Arg G u Pro G n Vai 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 3 u Leu Thr Lys Asn G n Vai Ser 370 375 380 Leu 385 Thr cys Leu Vai Lys 390 Qy Phe Tyr Pr o Ser 395 Asp I 1 θ Al a Vai G u 400 Trp 3 u Ser Asn 3 y 3 π Pro α u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pr o Pr o 405 410 415 Vai Leu Asp Ser Asp Q y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp G n G n Qy Asn Vai Phe Ser cys Ser Vai lUht 435 440 445 Hi s 0 u Al a Leu H S Asn H S Tyr Thr 3 n Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Pr ο G y Lys 465 <210> 9 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 9 caggttcagc tggtgcagtc Iggagctgag gt gaagaagc ctggggcctc agt gaaggt c 60 tcctgcaagg cttctggtta cacclltacc aact al ggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cct ggacaag ggct t gagt g gat gggatgg at caacacct acact ggaga gccaacat at 180 gctgatgcct tcaagggcag attlgccttc tctttggaca catccacgag cacagcctac 240 ttgcagatca acagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagactac 300 ggcgactatg gtatggacta ctggggtcaa ggaaccaccg tcaccgtctc ctca 354 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana 169 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <400> 10 □ η Vai Q π Leu Vai G η Ser G y AI a G u Vai Lys Lys Pr o G y AI a 1 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Oys Lys AI a Ser G y Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Gv Utet Asn TrpVal ArgGn Ala Pr o GyGnGy Leu Gu Trp IWbt y 35 40 45
Gv Trp ΙΙθ Asn Thr Tyr Thr Gy Gu Pr o Thr Tyr Ala Asp Ala Phe 50 55 60
Lvs Gv Ara Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Qn lie Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gy Asp Tyr G y IVfet Asp Tyr Trp Gy Gn Gy Thr 100 105 110
Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 11 <211> 1404 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 11 atggcttggg fgtggacctt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 60 gt t cagct gg tgcagtctgg agci gaggt g aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggttacac cttlaccaac tatggaatga actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc 11 gagt ggat gggat ggat c aacacctaca ct ggagagcc aacat atgct 240 gatgccttca agggcagalt igccttctcl ttggacacat ccacgagcac agcctacttg 300 cagai caaca gcct gagal c t gacgacacg gccgt gi at t act gt gcgag agact acggc 360 gact at ggl a tggactaclg gggtcaagga accaccgtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccl t c ccggct gt cc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgcccicc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 170 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgt cagt c 730 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac geo cgtgtggtca gcgt cd cac cglcctgcac caggact ggc t gaat ggcaa ggagt acaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cclcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca gglgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 114o aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct cal gct ccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ct ct cccl gt ct ccgggt aa atga 1404 <210> 12 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 12
Mst A a Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu A a A a A a G n Ser 1 5 .10 15 Ai a G n AI a G n Vai G n Leu Vai G π Ser Qy A a G u Vai Lys Lys 20 25 30 Pro G y A a Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys ai a Ser Q y Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr G y IVfet Asn Trp Vai Arg Q n A a Pro G y G n G y Leu 50 55 60 G u Trp Wbt G y Trp 11 e Asn Thr Tyr Thr Gy 3 u Pr 0 Thr Tyr A a 65 70 75 80 Asp AI a Phe Lys Gy Arg Phe A a Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr A ã Tyr Leu G n 11 e Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr A a Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys A a fia g Asp Tyr g y Asp Tyr Gy Mít fgp Tyr Trp Gy 115 120 125 171 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ G η Qy Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser AJ a Ser Thr Lys Gy Pro Ser 130 135 140 Vai Phe Pr o Leu AI a Pr o Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gy Q y Thr Al a 145 150 155 160 Af a Leu G y Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pr o G u Pr o Vai Thr Vai 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gy AI a Leu Thr Ser G y Vai Hi s Thr Phe Pro Al a 180 185 190 Vai Leu G n Ser Ser Q y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu G y Thr G n Thr Tyr 11 θ cys Asn Vai Asn Hi s 210 215 220 Lys Pr o Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai G u Pr o Lys Ser cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr Hl s Thr cys Pro Pro cys Pr o AI a Pro G u Leu Leu Gy 245 250 255 Gy Pr o Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pr o Lys Pro Lys Asp Thr Leu Vfet 260 265 270 11 e Ser Arg Thr Pro G u Vai TTir cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Hi s 275 280 285 Q u Asp Pro α u Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Q y Vai G u Vai 290 295 300 N s Asn AI a Lys Thr Lys Pr o Arg G u G u G n Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu Hi s G n Asp Trp Leu Asn Gy 325 330 335 Lys G u Tyr I ys cys l ys Vai Ser Asn Lys AI a Leu Pr o Al a Pr o I I e 340 345 350 □ u Lys Thr I I e Ser Lys AI a Lys G y G π Pr o Arg G u Pr o G n Vai 355 360 365 Tyr Thr Leu Pr o Pro Ser Arg Asp G u Leu Thr Lys Asn Q n Vai Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Vai Lys G y Phe Tyr Pr o Ser Asp 1! e AI a Vai G u 385 390 395 400 Trp Q u Ser Asn Gy G n Pro G u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pr o Pro 405 410 415 172 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Vai Leu Asp Ser Asp Gy Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp G n G n Gy Asn Vai Phe Ser Qrs Ser Vai Wtet 435 440 445 Hi s ,G u AI a Leu Hí s Asn Hi s Tyr Thr G n Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gy Lys 465 <210 > 13 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 13 caggt t cagc tggtgcagtc tggagctgag gt gaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 t cct gcaagg cttctggtta cacctttacc aact at ggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttaagtg gatgggatgg atcaacacct acactggaga gccaacatat 180 gct gat gcct t caagggcag agi caccat g accagagaca cat ccat cag cacagcct ac 240 at ggagct ga gcaggct gag at ct gacgac acggccgt gt at t act gt gc gagagact ac 300 ggcgact at g gtatggacta ctggggtcaa ggaaccaccg tcaccgtctc ct ca 354 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 14 G n Vai G n Leu Vai G n Ser Gy A a G u Vai Lys Lys Pro Gy AI a 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys AI a Ser Gy Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 G y Mst Asn Trp Vai Arg G π A a Pr o Gy G n G y Leu Lys Trp M»t 35 40 45 G y Trp 11 e Asn Thr Tyr Thr Gy G U Pr o Thr Tyr AI a Asp AI a Phe 50 55 60 Lys G y Arg Vai Thr Mst Thr Arg Asp Thr Ser 7R I I θ Ser Thr AI a Tyr an 173 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Mst 0 u Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr AI a Vai Tyr Tyr Oys 85 90 95 AI a Arg Asp Tyr 100 ay Asp Tyr □ y Wbt 105 Asp Tyr Trp 0 y 0 π 110 0 y Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 15 <211> 1404 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 15 atggcttggg t gt ggacct t gd at t cct g at ggcagct g cccaaagt gc ccaagcacag 60 gt t cagctgg t gcagtct gg agcl gaggt g aagaagcct g gggcct cagt gaaggt ct cc 120 tgcaaggctt ct ggtt acac ct 11accaac t at ggaat ga aclgggt gcg acaggcccct 180 ggacaagggc 11 aagt ggat gggat ggat c aacacct aca ct ggagagcc aacat at gct 240 gat gcct t ca agggcagagt caccat gacc agagacacat ccat cagcac agcct acat g 300 gagct gagca ggct gagat c t gacgacacg gccgtgt at 1 actgt gcgag agact acggc 360 gact at ggt a t ggact act g gggt caagga accaccgt ca ccgt ct cct c agctagcacc 420 aagggcccat cggt ct t ccc cct ggcaccc t cct ccaaga gcacct ct gg gggcacagcg 480 gccctgggct gcct ggt caa ggact act t c cccgaaccgg t gacggt gt c gt ggaact ca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacacctt c ccggctgt cc t acagt cct c aggact ct ac 600 lccctcagca gcgtggt gac cgt gccct cc agcagctt gg gcacccagac ct acat ctgc 660 aacgt gaat c acaagcccag caacaccaag gt ggacaaga aagt t gagcc caaat ct t gt 720 gacaaaact c acacat gccc accgt gccca gcacctgaac t cctgggggg accgt cagt c 780 11 ccl ct t cc ccccaaaacc caaggacacc ct cat gat ct cccggacccc t gaggt caca 840 t gcgl ggt gg tggacgt gag ccacgaagac cct gaggt ca agtt caactg gt acgtggac 900 ggcg!ggagg t gcat aal gc caagacaaag ccgcgggagg agcagt acaa cagcacgt ac 960 cgt gt ggt ca gcgt cct cac cgt cct gcac caggactggc t gaat ggcaa ggagiacaag 1020 t gcaaggt ct ccaacaaagc cct cccagcc cccat cgaga aaaccat ct c caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggt gt acacc ct gcccccat cccgggat ga gct gaccaag 1140 aaccaggt ca gcct gac cl g cclggtcaaa ggct t ct at c ccagcgacat cgccgtggag 1200 t gggagagca at gggcagcc ggagaacaac t acaagacca cgcct cccgt gct ggactcc 1260 gacggctcct t ct t cct ct a cagcaagct c accgt ggaca agagcaggt g gcagcagggg 1320 aacgt ct t ct cat gct ccgt gat gcat gag gct ct gcaca accact acac gcagaagagc 1380 ct ct ccct gt ct ccgggt aa at ga 1404 174 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <210> 16 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 16 MH AI a Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu l\*t Al a Al a Al a Q n Ser 1 5 10 15 AI a G n Al a G n Vai G n Leu Vai G n Ser Gy Al a G u Vai Lys Lys 20 25 · 30 Pro ay Al a Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Al a Ser Gy Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gy l/ht Asn Trp Vai Arg G n Al a Pro Gy G π Gy Leu 50 55 60 Lys Tr p MH Qy Trp 11 e Asn Thr Tyr Thr Gy G u Pro Thr Tyr A! a 65 70 75 80 Asp Al a Phe Lys G y Arg Vai Thr Nfet Thr Arg Asp Thr Ser I 1 Θ Ser 85 90 95 Thr AI a. Tyr Mst G u Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Al a Vai 100 105 110 Tyr Tyr Qrs Ai a Arg Asp Tyr Gy Asp Tyr Gy Mst Asp Tyr Trp G y 115 120 125 Q n g y Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Al a Ser Thr Lys Gy Pro Ser 130 135 140 Vai Phe Pro Leu Al a Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Θ y Gy Thr Al a 145 150 155 160 AI a Leu ay Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pr o G u Pro Vai Thr Vai 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gy Al a Leu Thr Ser G y Vai Hi s Thr Phe Pro Al a 180 185 190 Vai Leu G π Ser Ser Q y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gy Thr G n Thr Tyr 11 e Cys Asn Vai Asn Hs 210 215 220 Lys Pr o Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai G u Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr Η s Thr Cys Pro Pr o Cys Pro Al a Pro G u Leu Leu G y 245 250 255 175 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ Q y Pr o Ser Vai Phe Leu Phe Pr o Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu kbt 260 265 270 11 θ Sor Arg Thr Pro 3 u Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser H s 275 280 285 3 u Asp Pr o 3 u Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 3 y Vai 3 u Vai 290 295 300 H s Asn AI a Lys Thr Lys Pr o Arg 3 u 3 u Q n Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu H s 3 n Asp Trp Leu Asn 3 y 325 330 335 Lys 3 u Tyr Lys cys Lys Vai Ser Asn Lys AI a Leu Pr o A a Pr o 11 e 340 345 350 3 u Lys Thr 1 1 θ Ser Lys A a Lys G y 3 n Pr o Arg Q u Pro Q n Vai 355 360 365 Tyr Thr Lou Pro Pr o Ser Arg Asp G u Leu Thr Lys Asn 3 π Vai Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Vai Lys 3 y Phe Tyr Pr o Ser Asp I I o AI a Vai 3 u 335 390 395 400 Trp G u Ser Asn 3y 3 n Pr o G u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pr o Pro 405 410 415 Vai Leu Asp Ser Asp 3y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp 3 π 3 π 3 y Asn Vai Phe Ser Oys Ser Vai Ntet 435 440 445 H S 3 u AI a Leu H s Asn H s Tyr Thr Q n Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Pro 3 y Lys 465 <210> 17 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana 176 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <4 0 0 > 17 caggttcagc t ggl gcagl c tggagctgag gt gaagaagc ctggggcctc agt gaaggt c 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactalggaa t gaact gggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttaagtg galgggafgg atcaaoacct acactggaga gccaacatal 160 gctgatgcct t caagggcag atltgccttc tctttggaca catccacgag cacagcctae 240 atggagotga ggagcclgag atctgacgac acggccgtgt attactglgc gagagactac 300 ggcgactatg glatggacta ctgggglcaa ggaaccaccg t caccgt ct c ct ca 354 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 18 Q n Vai G r Leu Vai 3 n Ser G y Al a o u Vai Lys Lys Pro Gy AJ a 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Al a Ser Gy Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 α v rvbt Asn Trp Vai Arg 3 π AJ a Pr o Gy 3 n Gy Leu Lys Trp IVtet 35 40 45 G y Tr p I I θ Asn Thr Tyr Thr G y G u Pro Thr Tyr Al a Asp Ala Phe 50 55 60 Lys G y Ar g Phe Al a Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Al a Tyr 65 70 75 80 IVbt 3 u Leu Arg Ser Leu Ar g Ser Asp Asp Thr Al a Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 AI ã Arg Asp Tyr 3 y Asp Tyr G y ivbt Asp Tyr Trp Qy 3 n Gy Thr 100 105 110 Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 19 <211 > 1404 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 19 60 atggcttggg tgtggacctt gctattcclg atggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 177 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ gt t cagct gg t gcagl ct gg agctgaggt g aagaagcct g gggcct cagt gaaggt ct cc 120 t gcaaggct t ct ggt t acac ct 11 accaac t at ggaat ga actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc 11 aagt ggat gggat ggat c aacacct aca ct ggagagcc aacat atgct 240 gatgccttca agggcagatt t gcct tct ct 11 ggacacat ccacgagcac agcct acat g 300 gagct gagga gcct gagat c t gacgacacg gccgt gt at t actgt gcgag agact acggc 360 gact ai ggt a t ggact act g gggt caagga accaccgt ca ccgt ct cct c agct agcacc 420 aagggcccat cgglct t ccc cct ggcaccc t cct ccaaga gcacct ct gg gggcacagcg 480 gecctggget gcct ggt caa ggact act t c cccgaaccgg t gacggtgt c gt ggaactca 540 ggcgcectga ccagcggcgt gcacacct t c ccggct gt cc t acagt cct c aggact ct ac 600 t ccct cagca gcgt ggt gac cgt gccct cc agcagct t gg gcacccagac ctacat ctgc 660 aacgi gaat c acaagcccag caacaccaag gt ggacaaga aagt t gagcc caaat ct tgt 720 gacaaaact c acacat gccc accgt gccca gcacct gaac t cct gggggg accgt cagt c 780 11 cct ct t cc ccccaaaacc caaggacacc ct cat gat ct cccggacccc t gaggt caca 840 i gcgtggt gg t ggacgt gag ccacgaagac cct gaggt ca agt t caact g gt acgt ggac 900 ggcgt ggagg t gcat aat gc caagacaaag ccgcgggagg agcagt acaa cagcacgtac 960 cgt gt ggt ca gcgt cct cac cgt cct gcac caggactggc tgaat ggcaa ggagt acaag 1020 t gcaaggt ct ccaacaaagc cct cccagcc cccat cgaga aaaccat ct c caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggt gt acacc ct gcccccat cccgggatga gct gaccaag 1140 aaccaggt ca gcct gacctg cct ggt caaa ggct t ct at c ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca at gggcagcc ggagaacaac t acaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggct cct t ct t cct ct a cagcaagct c accgt ggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgt ctlct cat gct ccgt gat gcat gag gct ct gcaca accact acac gcagaagagc 1380 ct ct ccct gt ct ccgggt aa at ga 1404 <210> 20 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR murina, resíduos murinos em FR humana <400> 20 IVfet AI a Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu Ifet AI a Al a AJ a Q n Ser 1 5 10 15 AI a G n AI a Q n Vai G n Leu Vai G n Ser ay AI a G u Val Lys LyS 20 25 30 Pr o G y Ala Ser Vai Lys Vai Ser cys Lys AI a Ser α y Tyr Thr Phe 35 40 45 178 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Thr Asn Tyr Gy h/fel Asn Trp Val Arg G'n AI a Pro G y G n G y Leu 50 55 60 Lys Trp Wtet Gy Trp 11 e Asn Thr Tyr Thr G y G u Pr o Thr Tyr AI a 65 70 75 80 Asp AI a Phe Lys Gy Arg Phe AI a Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr AI a Tyr Wbt G u Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr AI a Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys AI a Arg Asp Tyr Gy Asp Tyr Gy Mst Asp Tyr. Trp G y 115 120 125 G n G y Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser AI a Ser Thr Lys Gy Pro Ser 130 135 140 Vai Phs Pr o Leu AI a Pr o Ser Ser Lys Ser Thr Ser G y G y Thr AI a 145 150 155 160 AI a Leu Q y cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Q u Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser G y AI a Leu Thr Ser Gy Val H s Thr Phe Pr o AI a 180 185 190 Vai Leu G n Ser Ser Gy Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gy Thr G n Thr Tyr 11 e Asn Val Asn H s 210 215 220 Lys Pr o Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Val G u Pr o Lys Ser cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr H s Thr 245 cys Pro Pro cys Pro 250 AI a Pro G u Leu Leu 255 Gy □ V Pr o Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pr o Lys Asp Thr Leu l\fet w 7 260 265 270 11 e Ser Ar g Thr Pr o G u Val Thr cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s 275 280 285 Q u Asp 290 Pro G u Vai Lys Phe 295 Asn Trp Tyr Val Asp 300 Q y Val Q u Val H 3 305 Asn AI a Lys Thr Lys 310 Pro Arg 3 u G u G π 315 Tyr Asn Ser Thr Tyr 320 Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Val Leu H s G n Asp Trp Leu Asn G y 325 330 335 Lys 3 U Tyr Lys 340 Cys Lys Val Ser Asn 345 Lys AI a Lei i Pro i AI a Pr < 350 ) lli 179 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ G u Lys Thr I I e Ser Lys AI a Lys 355 360 Tyr Thr Leu Pr o Pro Ser Arg Asp 370 375 Leu Thr cys Leu Vai Lys Q y Phe 385 390 Trp G u Ser Asn Q y G n Pro G u 405 Vai Leu Asp Ser Asp Gy Ser Phe 420 Asp Lys Ser Arg Trp G π 3 n ay 435 440 H s G u AI a Leu Hí s Asn Hi s Tyr 450 455 Pro Gy Lyã 465
Gy a n Pro Arg G u Pro G n Vai 365 G u Leu Thr Lys Asn G n Vai Ser 380 Tyr Pr o Ser Asp I I e Ai a Vai G u 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 425 430 Asn Vai Phe Ser CVs Ser Vai Wbt 445 Thr Q n Lys Ser Leu Ser Leu Ser 460
<210> 21 <211> 396 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 21 atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacattgtgc t gacacagt c icctgcttcc ttagctgtat ct ct ggggca gagggccacc 120 atctcalgca gggccagcaa aagtgtcagt acaictggct atagttttat gcactggtat 160 caacagaaac caggacagcc acccaaact c ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 240 ggggt ccct g ccaggt t cag t ggcagt ggg t ct gggacag act t caccct caacat ccat 300 cct gt ggagg aggaggat gc t gcaacct at t act glcagc acagtaggga ggt 1 ccgt gg 360 acgt t cggt g gaggcaccaa gct ggaaatc aaacgg 396
<210> 22 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 flfet G u Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pr o 15 10 15 180 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 3y Ser Thr Gy 20 Asp JI θ Val Leu Thr 25 G π Ser Pr o AI a Ser 30 Leu AI a Val Ser Leu G y G n Arg AI a Thr 11 e Ser cys Arg Ai a Ser Lys Ser 35 40 45 Vai Ser Thr Ser 0y Tyr Ser Phe IVbt Hi s Trp Tyr Q n G π Lys Pro 50 55 60 α y a n Pr o Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu AI a Ser Asn Leu Q u Ser 65 70 75 80 ay Val Pr o AI a Arg Phe Ser ay Ser G y Ser G y Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Asn 11 e Hi s Pro Val G u G u G li Asp AI a AI a Thr Tyr Tyr cys 100 105 110 a π Hi s Ser 115 Arg O u Val Pro Trp 120 Thr Phe Q y G y as Thr Lys Leu G u I I e Lys Arg 130 <210> 23 <211> 336 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, FR humana <400> 23 gacatcgtga ígacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc at caact gca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttttal gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacc ttgcatccaa cctagaatcc 180 ggggtccctg accgat t cag tggcagcggg tctgggacag atltcacict caccatcagc 240 agcctgcagg ctgaagatgl ggcagtttat tactgtcagc acagt aggga ggt I ecgi gg 300 acgt t cggt c agggcaccaa ggt ggaaat c aaacgt 336 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR murina, FR humana <400> 24
Asp II e Vai Itàt Thr Q n Ser Pr o Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gy 15 10 15 181 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ G u Arg Al a Thr 11 e Asn Cys Arg 20 G y Tyr Ser Phe Nfet Hi s Trp Tyr 35 40 Lys Leu Leu I I B Tyr Leu Al a Ser 50 55 Arg Phe Ser G y Ser Qy Ser Qy 65 70 Ser Leu Q π Al a G u Asp Vai Al a 65 G u Vai Pro Trp Thr Phe 3 y O n 100
Al a Ser Lys Ser Vai Ser Thr Ser 25 30 Q n 3 n Lys Pr o Gy G n Pr o Pro 45 Asn Leu G u Ser Gy Vai Pro Asp 60 Thr Asp Phe Thr Leu Thr 11 e Ser 75 80 Vai Tyr Tyr Oys <3 n H s Ser Arg 90 95 G y Thr Lys Vai <3 u II θ Lys Arg 105 110 <210> 25 <211> 717 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> CDR murina, FR humana <4 Ο Ο > 25 atggagacag acacactcct gl 1 at gggt a ct gct gct ct gggttccagg ttccactggt 60 gacatcgtga tgacccagtc tccagaclcc ctggctgtgt cl ct gggcga gagggccacc 120 atcaactgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttttat gcactggtac 180 cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacc ttgcatccaa cctagaatcc 240 ggggtccctg accgattcag t ggcagcggg t ct gggacag at 11 cact ct caccatcagc 300 agcctgcagg ct gaagat gt ggcagtttat t act gt cagc acagt aggga ggttccgtgg 360 acgttcggtc agggcaccaa ggt ggaaat c aaacgt acgg tggctgcacc atctgtcttc 420 at ct t cccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cct ct gt t gt gtgcctgctg 480 aataacttct at cccagaga ggccaaagt a cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccct ga cgct gagcaa agcagact ac gagaaacaca aagt ct acgc ct gcgaagt C 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717 <210> 26 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial <220> FR humana <223> CDR murina 182 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <400> 26 iwbt G u Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai· Leu Leu Leu Trp Vai Pr o 1 5 10 15 G y Ser Thr Gy Asp I I e Vai Wfet Thr G n Ser Pr o Asp Ser Leu Al a 20 25 30 Vai Ser Leu Q y 3 u Arg Al a Thr I I e Asn Cys Arg Al a Ser Lys Ser 35 40 45 Vai Ser Thr Ser Gy Tyr Ser Phe Iwfet Hi s Trp Tyr G n G n Lys Pr o 50 55 60 G y G n Pro Pro Lys Leu Leu 11 e Tyr Leu Al a Ser Asn Leu Q u Ser 65 70 75 80 G y Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gy Ser Gy Ser G y Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr 11 e Ser Ser Leu G n Al a Q u Asp Vai Al a Vai Tyr Tyr cys 100 105 110 G n H s Ser Arg G u Vai Pr o Trp Thr Phe Oy G n Gy Thr Lys Vai 115 120 125 G u 11 e Lys Arg Thr Vai Al a Al a Pr o Ser Vai Phe I I e Phe Pr o Pro 130 135 140 Ser Asp G u G n Leu Lys Ser Gy Thr Al a Ser Vai Vai cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg G u Al a Lys Vai G n Trp Lys vai Asp Asn 165 170 175 AI a Leu G n Ser Q y Asn Ser G n G u Ser Vai Thr G u G n Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Al a 195 200 205 Asp Tyr Q u Lys Hi s Lys Vai Tyr Al a Cys G u Vai Thr Hi s G n Gy 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gy G u Cys 225 230 235
<210> 27 <211> 411 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 27 at ggaat gga cctgggtctt tctcttcctc ctgccagtaa ctgcagatgt ccaatcccag gttcagctgc aacagtctgg aactgagctg atgacgeetg gggcctcagt gaegatgtcc 183 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ tgcaagactt ctggctacac at t cagt acc tactggatag agt gggt aaa acagaggcct 180 ggacat ggcc ttgagtggat t ggagaaat t ttacctggaa gt ggt t al ac tgactacaat 240 gagaagttca aggccaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agccl acatg 300 caactcagca gcctggcatc t gaggacl ct ggçgt ct at t actgtgcaag atgggatagg 360 ctctatgda tggactactg gggtcaagga acct cagt ca ccgtctcctc a 411
<210> 28 <211> 137 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28
Wtet 3 u Trp Thr Trp Vai Phe Leu 1 5 Vai a π Ser 3 n Vai 3 n Leu 3 n 20 Pr D 3 y Al a Ser Vai Thr A/bt Ser 35 40 Ser Thr Tyr Trp I I Θ 3 u Trp Vai 50 55 α u Trp 11 e 3 y 3 u 11 e Leu 3 y 65 70 α u Lys Phe Lys Al a 85 Lys Al a Thr Thr Al a Tyr lYfet 3 n Leu Ser Ser 100 Tyr Tyr CVs Al a Ar g Trp Asp Arg 115 120 Qy 3y Thr Ser Vai Thr Vai Ser 130 135
Phe Leu Leu Ser Vai Thr At a Asp 10 15 3 π Ser ay Thr 3 u Leu Mat Thr 25 30 cys Lys Thr Ser 3y 45 Tyr Thr Phe Lys 3 n Arg Pro a y Ki s Qy Leu 60 Pr o Ser ay Tyr Thr Asp Tyr Asn 75 80 Phe Thr Al a Asp Thr Ser Ser Asn 90 95 Leu Al a Ser 3 u Asp Ser Al a Vai 105 110 Leu Tyr Ai a Wfet Asp 125 Tyr Trp 3 y Ser
<210> 29 <211> 396 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 29 60 120 180 240 ctgctgctct gggt t ccagg tt ccact ggt ttaactgtat ctctggggca gaagaccacc acatciggct atagttttat gcactggtac ct cat ct al c ttgcgtccaa cctaccatct at ggagacag acacacl cct gttatgggta gacattglgc tgacacagtc tcclgcttcc atctcatgca gggccagcaa gagtgtcagt caactgaaac caggacagtc acccaaactc 300 184 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 360 396 ggggtccctg ccaggttcag t ggcagt ggg tctgggacag acttcaccct caaaat ccat cctgtggagg aggaggal gc t gcaacct at tactgtcagc acagt aggga gattccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggaaata acacgg
<210> 30 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30
Nfet □ u Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro 1 5 10 15 G y Ser Thr Gy Asp I I e Vai Leu Thr G n Ser Pr o AI a Ser Leu Thr 20 25 30 Vai Ser Leu Gy Θ n Lys Thr Thr II e Ser Cys Arg AI a Ser Lys Ser 35 40 45 Vai Ser Thr Ser G y Tyr Ser Phe Wfet H s Trp Tyr G n Leu Lys Pro 50 55 60 Gy G π Ser Pro Lys Leu Leu 11 Θ Tyr Leu AI a Ser Asp Leu Pr o Ser 65 70 75 80 Gy Vai Pro AI a Arg PhB Ser Gy Ser Q y Ser G y Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys I I B Hi s Pro Vai G u Q u 3 u Asp AI a AI a Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 G n H s Ser Ar g G u lie Pr o Tyr Thr Phe Gy G y Gy Thr Lys Leu 115 120 125 G u 11 e Thr Arg 130 <210> 31 <211> 330 <212> PRT <213> Humana <400> 31
Ala Ser Thr Lys 0y Pr o Ser Vai Phe Pr o Leu AI a Pr o Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser G y G y Thr AI a AI a Leu G y Cys' Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pr o G u Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser G y AI a Leu Thr Ser 35 40 45 185 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ α y Vai 50 H s Thr Phe Pro AI a 55 Val Leu 0 n Ser Ser 60 a y Leu Tyr Ser Leu 65 Ser Ser Val Val Thr 70 Val Pro Ser Ser Ser 75 Leu Qy Thr 0 n Thr 80 Tyr 11 e cys Asn Val 85 Asn Η ε Lys Pr o Ser 90 Asn Thr Lys Val Asp 95 Lys Lys Vai α u Pr o 100 Lys Ser cys Asp Lys 105 Thr Hi s Thr Cys Pro 110 Pr o Cys Pro AI a Pr o 115 G u Leu Leu 0 y 0y 120 Pr o Ser Val Phe Leu 125 Phe Pro Pro Lys Pr o 130 Lys Asp Thr Leu 135 I I e Ser Arg Thr Pr o 140 0 u Val Thr cys Vai 145 Vai Val Asp Val Ser 150 H S G u Asp Pro 0 u 155 Val Lys Phe Asn Trp 160 Tyr Val Asp Q y Val 155 0 u Val H s Asn AI a 170 Lys Thr Lys Pr o Arg 175 0 u α u α π Tyr Asn 180 SBr Thr Tyr Arg Val 185 Val Ser Val Leu Thr 190 Val Leu Hi s a n Asp 195 Trp Leu Asn α y Lys 200 0 u Tyr Lys cys Lys 205 Val Ser Asn Lys AI a 210 Leu Pfo AI a Pr o 11 Θ 215 α u Lys Thr 11 e Ser 220 Lys Al a Lys 0y α r 225 Pro Arg α u Pr o α n 230 Val Tyr Thr Leu Pro 235 Pr o Ser Arg Asp G u 240 Leu Thr Lys Asn α n 245 Val Sor Leu Thr cys 250 Leu Val Lys Qy Phe Tyr 255 Pro Ser Asp I I 9 260 AI a Val 0 u Trp Q u 265 Ser Asn ay 0 n Pro 270 G u Asn Asn Tyr Lys 275 Thr Thr Pr o Pro Val 280 Leu Asp Ser Asp u Ser Phe Phe Leu Tyr 290 Ser Lys Leu Thr Val 295 Asp Lys Ser Arg Trp 300 G n 0 n 0y Asn Val 305 Phe Ser cys Ser Val 310 Mst Hi s 0 u AI a Leu 315 H 3 Asn H s Tyr Thr 320 Q n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 0y Lys 325 330 <210> 32 <211> 326 <212> PRT <213> Humana 186 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <400> 32 AI a Ser Thr Lys G y Pro Ser Val Phe Pr o Leu Al a Pr o cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr· Ser G u Ser Thr Al a Al a Leu Gy Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro 0 u Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser 3y Al a Leu Thr Ser 35 40 45 □ y Vai H s Thr Phe Pro Al a Val Leu G π Ser Ser Gy Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pr o Ser Ser Asn Phe Gy Thr G n Thr 65 70 75 80 Tyr Thr cys Asn Vai 85 Asp H s Lys Pr o Ser 90 Asn Thr Lys Val Asp 95 Lys Thr Vai Q u Arg Lys Cys cys Val G u Cys Pro Pro cys Pro AI a Pro 100 105 110 Pro Vai Al a Gy Pr o Ser Val Phe Leu Phe Pr o Pr o Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met 11 θ Ser Arg Thr Pr o G u Val Thr φε Val Val Val Asp 130 135 140 Vai Ser H s G u Asp Pro G u Val G n Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gy 160 145 150 155 Vai 0 u Vai H. s Asn 165 Al a Lys Thr Lys Pro 170 Arg G U G u G n Phe 175 Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Val Leu Thr Val Val H s G n Asp Trp 180 185 190 Leu Asn G y Lys G u Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys G y Leu Pro 195 200 205 AI a Pro 11 e □ u Lys Thr 11 e Ser Lys Thr Lys Gy G n Pro Arg 0 u 210 215 220 Pro 0 n Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg G u G u Wbt Thr Lys Asn 240 225 230 235 187 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ G η Vai Ser Leu Thr 245 Cys Leu Vai Lys Gy 250 Phe Tyr Pr 0 Ser Asp 255 I I e AI a Vai G u Trp 260 G u Ser Asn Qy 0 n 265 Pro G u Asn Asn Tyr 270 Lys Thr Thr Pr □ Pr 0 275 m Leu Asp Ser Asp 280 0y Ser Phe Phe Leu 285 Tyr Ser Lys Leu Thr 290 Vai Asp Lys Ser Arg 295 Trp G n G n Gy Asn 300 Vai Phe Ser Cys Ser 305 Vai IVfet Hi s G u AI a 310 Leu Hi s Asn Hi s Tyr 315 Thr G n Lys Ser Leu 320 Ser Leu Ser Pro Q y 325 Lys <210> 33 <211> 290 <212> PRT <213> Humana <400> 33 α r 1 3 n O y Vai 5 Asn cys Thr Vai Ser 10 Ser G u Leu Lys Thr 15 Pro Leu α y Asp Thr 20 Thr Hi s Thr Cys Pr o 25 Arg Cys Pr o 3 u Pro 30 Lys Ser Cys Asp Thr 35 Pro Pro Pr o Cys Pr o 40 Arg cys Pro G u Pro 45 Lys Ser Cys Asp Thr 50 Pro Pro Pro Cys Pro 55 Arg cys Pro G u Pro 60 Lys Ser Cys Asp Thr 65 Pro Pr o Pr o Cys Pro 70 Arg cys Pr o AI a Pr o 75 G u Leu Leu Gy Gy 80 Pro Ser Vai Phe Leu 65 Phe Pro Pr o Lys Pr o 90 Lys Asp Thr Leu Wbt 95 11 e Ser Arg Thr Pro 100 G u Vai Thr cys Vai 105 Vai Vai Asp Vai Ser 110 Hi S Ou Asp Pro G u 115 Vai G n Phe Lys Trp 120 Tyr Vai Asp Gy Vai 125 Q n Vai Hi s Asn AI a 130 Lys Thr Lys Pr o Arg 135 G u G n α π Phe Asn 140 Ser Thr Phe Arg Vai 145 Vai Ser Vai Leu Thr 150 Vai Leu H S G n Asn 155 Trp Leu Asp Gy Lys 160 G u Tyr Lys cys Lys 165 Vai Ser Asn Lys AI a 170 Leu Pro AI a Pr o I I e 175 0 u 188 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Lys Thr 11 e Ser 180 Lys Thr Lys Gy G n 185 Pr o Arg 3 u Pro 3 n 190 Vai Tyr Thr Leu Pr o Pro Ser Arg 3 u 3 u Wbt Thr Lys Asn 3 π Vai Ser Leu 195 200 205 Thr Cys Leu Vai Lys <3y Phe Tyr Pro Ser Asp I I e Al a Vai 3 u Trp 210 215 220 3 u Ser Ser 3 y 3 n Pro 3 u Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro m 225 230 235 240 Leu Asp Ser Asp □ y 245 Ser Phe Phe Leu Tyr 250 Ser Lys Leu Thr Vai 255 Asp Lys Ser Arg Trp 260 G n G n Q y Asn 11 e 265 Phe Ser cys Ser Vai 270 M)t Hi s G u AI a Leu Hi ε Asn Arg Phe Thr G n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pr o 275 280 285 3 y Lys 290 <210> 34 <211> 327 <212> PRT <213> Humana <400> 34 AI a Ser 1 Thr Lys Gy 5 Pr o Ser Vai Phe Pro 10 Leu Al a Pro cys Ser 15 Arg Ser Thr Ser 3 u 20 Ser Thr AI a Al a Leu 25 Gy Cys Leu Vai Lys 30 Asp Tyr Phe Pro 3 u Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser ay Al a Leu Thr Ser 35 40 45 Gy Vai Hi s Thr Phe Pr o AI a Vai Leu G n Ser Ser 3 y Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pr o Ser Ser Ser Leu 3 y Thr Lys Thr 80 55 70 75 Tyr Thr Cys Asn Vai Asp H S Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 189 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Arg Vai 0 u Ser Lys Tyr Qy Pro Pr o cys Pro Ser Cys Pro AI a Pro 100 105 110 Q u Phe Leu α y 3 y Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pr o Pr o Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Mst 11 e Ser Arg Thr Pro 0 u Va! Thr Cys Vai Vai Vai 130 135 140 Asp Vai Ser 0 n 0 u Asp Pr o G u Vai G n Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 145 150 155 160 Q y Vai 0 u Vai Hi s Asn AI a Lys Thr Lys Pr o Arg 0 u 0 U 0 n Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu H s 0 n Asp 180 185 190 Trp Leu Asn 0y Lys 0 u Tyr Lys cys Lys Vai Ser Asn Lys 3 y Leu 195 200 205 Pr o Ser Ser I I e 0 u Lys Thr I I e Ser Lys AI a Lys α y 0 n Pr o Arg 210 215 220 Q u Pr o 0 n Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 0 n 0 u 0 u IVfet Thr Lys 225 230 235 240 Asn Q π Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys 0 y Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 1 I s AI a Vai 0 u Trp 0 u Ser Asn Qy G n Pro 0 u Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pr o Pr o Vai Leu Asp Ser Asp 3 y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp G n 0 u 0 y Asn Vai Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Vai Nfet Hi s G u AI a Leu H s Asn H s Tyr Thr 0 n Lys Ser 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu O y Lys 325
<210> 35 <211> 467 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado 190 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ <400> 35 AI a Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu Mat A a A a AI a G n Ser 1 5 10 15 AI a G n A a α n Vai G n Leu Vai G n Ser G y AI a G u Vai Lys Lys 20 25 30 Pro 3 y Ai a Ser Vai Lys Vai Ser cys Lys A a Ser G y Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr G y Mst Asn Trp Vai Arg G n A a Pro Gy G n Gy Leu 50 55 60 Lys Trp rvfet G y Trp 11 e Asn Thr Tyr Thr Qy Asn Pro Thr Tyr A a 65 70 75 Θ0 Asp AI a Phe Lys 3 y Arg Vai Thr vet Thr Arg Asp Thr Ser I I e Ser 85 90 95 Thr AI a Tyr IVfet 3 u Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr A a Vai 100 105 110 Tyr Tyr cys 115 A a Arg Asp Tyr 3y 120 Asp Tyr Gy Wbt Asp 125 Tyr Trp Gy 3 n 3 y Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser AI a Ser Thr Lys Q y Pr o Ser 130 135 140 Vai Phe Pr o Leu A a Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser G y Gy Thr AI a 145 150 155 160 AI a Leu Q y Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro G u Pro Vai Thr Vai 165 170 175 Ser Trp Asn Ser 3 y A a Leu Thr Ser G y Vai Hi s Thr Phe Pro A a 180 185 190 Vai Leu G n Ser Ser G y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu G y Thr G π Thr Tyr II e cys Asn Vai Asn Hi s 210 215 220 Lys Pr o Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Q u Pro Lys Ser cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr N s Thr Cys Pro Pro cys Pro AI a Pro G u Leu Leu Oy 245 250 255 3 y Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pr o Lys Asp Thr Leu m 260 265 270 191 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ I I e Ser Arg Thr Pr o G u Vai Thr 275 280 G u Asp Pro Q u Vai Lys Phe Asn 290 295 Hi s Asn AI a Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 325 Lys G u Tyr Lys 340 Cys Lys Vai Ser G u Lys Thr 11 e Ser Lys AI a Lys 355 360 Tyr Thr Leu Pr o Pr o Ser Arg Asp 370 375 Leu 385 Thr Cys Leu Vai Lys 390 G y Phe Tr p 0 u Ser Asn 0 y G n Pro G u 405 Vai Leu Asp Ser Asp G y Ser Phe 420 Asp Lys Ser Arg Trp G n G n G y 435 440 H s G u AI a Leu Hi s Asn Η Ξ Tyr 450 455 cys Vat Vai Vai Asp Vai Ser Hi s 285
Trp Tyr Vai Asp G y Vai Gu Vai 300 Q u G u 0 n Tyr Asn Ser Thr Tyr 315 320
Leu Hi 5 G n Asp Trp Leu Asn Gy 330 335
Asn Lys Ala Leu Pr o Ala Pr o Ife 345 350
Gy Gn Pr O Ar g Gu Pr o Gn Vai 365 G u Leu Thr Lys Asn G ri Vai Ser 380
Tyr Pro Ser Asp l I e A a Vai Gu 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 410 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 425 430
Asn Vai Phe Ser CVs Ser Vai l\tet 445
Thr G n Lys Ser Leu Ser Leu Ser 460
Pr ο G y Lys 465 <210> 36 <211> 463 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 36 IVbt AI a Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu Ivfet AlaAlaAlaGn Ser 15 10 15 AI a 3 n AI a 3 n Vai G n Leu Vai G n Ser G y AI a Θ u Vai Lys Lys 20 25 30 192 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Pro G y AI a Ser Vai Lys Vai Ser cys Lys AI a Ser G y Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr <3 y MH Asn Trp Vai Arg a n AI a Pro ay G n Gy Leu 50 55 60 Lys Trp Wbt G y Trp 11 e Asn Thr Tyr Thr Gy Asn Pro Thr Tyr AI a 65 70 75 80 Asp AI a Phe Lys Gy Arg Vai Thr MH Thr Arg Asp Thr Ser 11 e Ser Θ5 90 95 Thr AI a Tyr mr G u Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr AI a Vai 100 105 110 Jyr Tyr cys 115 AI a Arg Asp Tyr G y 120 Asp Tyr Gy IVfet Asp 125 Tyr Trp ay G n a y Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser AI a Ser Thr Lys G y Pro Ser 130 135 140 Vai Phe Pro Leu AI a Pr o cys Ser Arg Ser Thr Ser a u Ser Thr AI a 145 150 155 160 AI a Leu G y cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro G u Pr o Vai Thr Vai 165 170 175 Ser Trp Asn Ser a y Ai a Leu Thr Ser Gy Vai H s Thr Phe Pro AI a 180 185 190 Vai Leu Q π Ser Ser G y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 195 200 205 Pr o Ser Ser Asn Phe G y Thr G n Thr Tyr Thr cys Asn Vai Asp H S 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai 3 u Arg Lys cys Cys 225 230 235 240 Vai G u Cys Pro Pr o Cys Pr o AI a Pro Pr o Vai AI a Gy Pro Ser Vai 245 250 255 Phs Leu Phe Pr e Pr o Lys Pr o Lys Asp Thr Leu fvfel I I e Ser Arg Thr 260 265 270 Pro G u Vai Thr cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser H s G u Asp Pr o G u 275 280 285 Vai G n Phe Asn Trp Tyr Vai Asp ay Vai G u Vai Hi s Asn AI a Lys 290 295 300 193 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Thr Lys Pro Arg G u Q u G n Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser 305 310 315 320 Vai Leu Thr Vai Vai H s G n Asp Trp Leu Asn Gy Lys G u Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Vai Ser Asn Lys G y Leu Pro AI a Pro I I e G u Lys Thr I I e 340 345 350 Ser Lys Thr Lys G y G n Pro Arg G u Pr o G n Vai Tyr Thr Leu Pr o 355 360 365 Pr o Ser Arg α u α u Wfet Thr Lys Asn G n Vai Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Vai Lys Q y Phe Tyr Pro Ser Asp I I e AI a Vai G u Trp G u Ser Asn 385 390 395 400 α y a n Pro a u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pr o Pro lyfet Leu Asp Ser 405 410 415 Asp ay Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp a n α n a y Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai N/fet Hi s G u AI a Leu 435 440 445 H s Asn H S Tyr Thr G n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gy Lys 450 455 460
<210> 37 <211> 464 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 37 IVfet AI a Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Wbt AI a Al a Al a G n Ser 1 5 10 15 AI a G n AI a G n Val G n Leu Val G n Ser G y Al a G u Val Lys Lys 20 25 30 Pr o G y AI a Ser Val Lys Val Ser Cys Lys AI a Ser G y Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn —I □ y Wfet Asn Tr p Val Arg G n Al a Pr o G y G n Gy Leu 50 55 60 Lys Trp 3y Trp 11 e Asn Thr Tyr Thr Q y Asn Pr 0 Thr —I *< Al a 65 70 75 80 194 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Asp AI a Phe Lys Gy Arg Val Thr IV&t Thr Arg Asp Thr Ser I I e Ser 85 90 95 Thr AI a Tyr Whl G u Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr AI a Val 100 105 110 Tyr Tyr cys 115 AI a Arg Asp Tyr G y 120 Asp Tyr G y Vfet Asp 125 Tyr Trp Gy Q η 3y Thr Thr Vai Thr Val Ser Ser AI a Ser Thr Lys G y Pr o Ser 130 135 140 Vai Phe Pr o Leu AI a Pr o Cys Ser Arg Ser Thr Ser G u Ser Thr AI a 145 150 155 160 AI a Leu ay Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pr o G u Pr o Val Thr Val 165 170 175 Ser Tr p Asn Ser a y AI a Leu Thr Ser G y Val l-í s Thr Phe Pro AI a 180 185 190 Vai Leu a n Ser Ser G y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pr o Ser Ser Ser Leu ay Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp H s 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val G u Ser Lys Tyr G y 225 230 235 240 Pro Pr o cys Pro Ser Cys Pro AI a Pr O G u Phe Leu Gy Gy Pro Ser 245 250 255 Vai Phe Leu Phe Pr o Pr o Lys Pro Lys Asp Thr Leu IVtet I I e Ser Arg 260 265 270 Thr Pr o a u Vai Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser G π G u Asp Pr o 275 280 285 a u Vai a n Phe Asn Tr p Tyr Val Asp <3 y Val G u Val Hi s Asn AI a 290 295 300 Lys Thr Lys Pr o Arg □ u G u G n Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Vai Leu Thr Val Leu Hi s G n Asp Trp Leu Asn G y Lys G u Tyr 325 330 335 Lys cys Lys Vai Ser Asn Lys Q y Leu Pr o Ser Ser 11 e G u Lys Thr 340 345. 350 195 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 11 θ Ser Lys A a Lys G y G n Pr o Ag G u Pro Q n Vai Tyr Thr Leu 355 360 365 Ργ ο Pro Ser G n G u G u IVbt Thr Lys Asn G n Vai Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Leu Vai Lys Q y Phe Tyr Pro Ser Asp 1 1 e A a Vai Q U Trp 3 u Ser 385 390 395 400 Asn Gty G n Pr o G u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pr o Pro Vai Leu Asp 405 410 415 Ser Asp G y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ag Leu Thr Vai Asp Lys Ser 420 425 430 Arg Trp 3 n 3 u G y Asn Vai Phe Ser Qys Ser Vai m Hl s G u A a 435 44D 445 Leu H 3 Asn H s Tyr Thr Q n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Q y Lys 450 455 460 <21 0> 38 <21 1> 467 <212> PRT <21 3> Sequência art ifi ciai <220> <22 3> Anticorpo humani zado <400> 38 I^tet AI a Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu Wbl A a A a A a 3 n Ser 1 5 10 15 AI a a n A a Q n Vai Q n Leu Vai G π Ser G y AI a G u Vai Lys Lys 20 25 30 Pr o □ y A a Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys AI a Ser Q y Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn 50 Tyr 3y Ntet A$n Trp 55 Vai Ag G n A a Pro 60 Qy G π Gy Leu Lys Trp Ivfet 3y Trp I I e Asn Thr Tyr Thr G y Asn Pro Thr Tyr A a 65 70 75 SO Asp AI a Phe Lys G y Arg Vai Thr Wfet Thr Ag Asp Thr Ser 11 e Ser 85 90 95 Thr AI a Tyr tVbt Q u Leu Ser Ag Leu Ag Ser Asp Asp Thr A a Vai 100 105 110 Tyr Tyr CVs A a Arg Asp Tyr Q Ϊ Asp Tyr Q y Nfet Asp Tyr Trp Gy 115 120 125 196 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 0 η 3y Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Al a Ser Thr Lys 0 y Pr o Ser 130 135 140 Vai Phe Pro Leu AI a Pr o Ser Ser Lys Ser Thr Ser Qy 0 y Thr Al a 145 150 155 160 AI a Leu Q y cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pr o Q u Pr o Vai Thr Vai 165 170 175 Ser Trp Asn Ser 0y AI a Leu Thr Ser 0 y Vai Hi s Thr Phe Pr o Al a 1Θ0 185 190 Vai Leu Q n Ser Ser 0 y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 195 200 205 Pr ο Ser Ser Ser Leu 0 y Thr 0 n Thr Tyr 11 e Cys Asn Vai Asn H s 210 215 220 Lys Pr o Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai 0 u Pr o Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr Hí s Thr cys Pro Pro cys Pr o Al a Pr o Pr o Vai Al a Qy 245 250 255 ay Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 II e Ser Arg Thr Pro 0 u Vai Thr cys Vai Vai Vai Asp Vai. Ser Hi s 275 280 285 0 u Asp Pro Q u Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 0 y Vai 0 u Vai 290 295 300 H s Asn AI a Lys Thr Lys Pr o Arg 0 U 0 u 0 Π Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu H s 0 n Asp Trp Leu Asn 3 y 325 330 335 Lys 3 u Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Al a Leu Pr o Al a Pr o I I e 340 345 350 a u Lys Thr 1 1 e Ser Lys AI a Lys 0y 0 n Pro Ar g 0 u Pr o 0 n Vai 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pr o Ser Arg Asp <3 u Leu Thr Lys Asn G n Vai Ser 370 375 380 Leu Thr cys Leu Vai Lys Q y Phe Tyr Pr o Ser Asp 11 e Al a Vai G u 385 390 395 400 197 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Trp G υ Ser Asn 0 y G n Pro G u Asn Asr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415
Vai Leu Asp Ser Asp O y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Cl π <3 n d y Asn Vai Phe Ser Qjs Ser Vai Mel 435 440 445
Hl s Q u AI a Leu Hi s Asn H s Tyr Thr 3 π Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Pr □ 3 y Lys 465
<210> 39 <211> 464 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Anticorpo humanizado <400> 39
Wbt Ala Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu Nfet AI a AI a AI a Qn Ser 15 10 15
AlaGnAlaGnVal G n Leu Vai G π Ser G y AI a G u Vai Lys Lys 20 25 30
Pro G y AI a Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys AI a Ser G y Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Asn Tyr Qy m Asn Trp Vai Arg Gn Ala Pro Gy Gn Gy Leu 50 55 60
Lvs Tr o Nfet Gy Trp II e Asn Thr Tyr Thr Gy Asn Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80
Asp Ala Phe Lys Gy Arg Va! Thr IVbt Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser 85 90 95
Thr Ai a Tyr Wbt G u Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr AI a Vai 100 105 110
Tvr Tyr Qrs Ala Arg Asp Tyr 3y Asp Tyr G y litet Asp Tyr Trp Gy 1 115 120 125
Gn Gv Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gy Pro Ser 130 135 140
Vai Phe Pro Leu Ala Pro C^s Ser Arg Ser Thr Ser Gu Ser Thr Ala 145 150 155 160 198 ΕΡ 2 099 823/ΡΤ
Ai a Leu G y Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro G u Pro Vai Thr Vai 165 170 175 Ser Trp Asn Ser G y AI a Leu Thr Ser G y Vai H s Thr Phe Pr o Al a 180 185 190 Vai Leu 0 n Ser Ser G y Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu G y Thr Lys Thr Tyr Thr CVs Asn Va! Asp Hi s 210 215 220 Lys Pr o Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Arg Vai G u Ser Lys Tyr G y 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Pr o Cys Pr o AI a Pr o G u Phe AI a G y Al a Pr o Ser 245 250 255 Vai Phe Leu Phe Pr o Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Nfet 11 e Ser Arg 260 265 270 Thr Pr o G u Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser □ n □ u Asp Pro 275 280 285 G u Vai Q n Phe Asn Trp Tyr Vai Asp G y Vai Q u Vai H s Asn Al a 290 295 300 Lys Thr Lys Pro Arg G u Q u G n Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai 305 310 315 320 Ser Vai Leu Thr Vai Leu H s Q n Asp Trp Leu Asn Gy Lys Al a Tyr 325 330 335 Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys O y Leu Pro Ser Ser 11 e G u Lys Thr 340 345 350 1 1 e Ser Lys AI a Lys Gy G n Pro Arg Q U Pro 0 n Vai Tyr Thr Leu 355 360 365 Pro Pro Ser G n G u G u Wfet Thr Lys Asn G n Vai Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Leu Vai Lys Gy Phe Tyr Pr o Ser Asp 11 e AI a Vai Q u Trp 0 Lf Ser 385 390 395 400 Asn □ y G n Pr o G u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pr o Pr o Vai Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gy Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser 420 425 430 Arg Trp G n Q u Gy Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai IVfet Hi s G u Al a 435 440 445 Leu Hl s Asn Hi s Tyr Thr 0 π Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu G y Lys 450 455 460
Lisboa, 2014-12-10

Claims (15)

  1. ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Agente de ligação ao alvo variante, compreendo: uma região de ligação compreendendo uma região Fv de anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente a um antigénio alvo; uma região Fc da região constante de uma imunoglobulina IgGl humana, compreendendo a região Fc pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido envolvido na interacção de ligação do receptor Fc gama (Fc ) IIIA com a região Fc; em que pelo menos uma substituição compreende a introdução de um resíduo de cisteína na posição de aminoácido 239 da região Fc, que é S239C de acordo com o índice EU tal como estabelecido em Kabat; e um agente terapêutico que exerce um efeito citotóxico, citostático ou de imunomodulação, conjugado directa ou indirectamente com o resíduo de cisteína introduzido; em que o agente de ligação ao alvo variante exerce um efeito citotóxico, citostático ou de imunomodulação numa célula que expressa o antigénio alvo; e em que o agente de ligação ao alvo variante apresenta ligação reduzida a um receptor Fc IIIA.
  2. 2. Agente de ligação ao alvo variante da reivindicação 1, em que o agente terapêutico é um agente citotóxico.
  3. 3. Agente de ligação ao alvo variante da reivindicação 1 ou 2, em que o agente terapêutico é uma auristatina, um agente de ligação ao sulco menor do ADN, um agente alquilante do sulco menor do ADN, uma enediina, uma lexitropsina, uma duocarmicina, um taxano, uma puromicina, uma dolastatina, um maitansinóide ou um alcaloide de vinca. ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 2/3
  4. 4. Agente de ligação ao alvo variante da reivindicação 1 ou 2, em que o agente terapêutico é um agente anti-tubulina.
  5. 5. Agente de ligação ao alvo variante da reivindicação 4, em que o agente anti-tubulina é uma auristatina.
  6. 6. Agente de ligação ao alvo variante da reivindicação 5, em que a auristatina é MMAF.
  7. 7. Agente de ligação ao alvo variante da reivindicação 5, em que a auristatina é MMAE.
  8. 8. Agente de ligação ao alvo variante de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a região de ligação se liga especificamente a CD20, CD30, CD33 ou CD70.
  9. 9. Agente de ligação ao alvo variante da reivindicação 8, em que a região de ligação se liga especificamente a CD33.
  10. 10. Agente de ligação ao alvo variante de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o agente de ligação ao alvo variante é um anticorpo conjugado com um agente citotóxico.
  11. 11. Agente de ligação ao alvo variante da reivindicação 1, em que o agente terapêutico é um fármaco citotóxico e em que o fármaco citotóxico está conjugado com o resíduo de cisteína introduzido como um fármaco citotóxico derivatizado com maleimida.
  12. 12. Agente de ligação ao alvo variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para uso no tratamento de cancro num indivíduo, em que o agente terapêutico é um agente citotóxico e em que a região de ligação do agente de ΕΡ 2 099 823/ΡΤ 3/3 ligação ao alvo variante compreende uma região Fv de um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente a um antigénio alvo expresso por células de cancro.
  13. 13. Agente de ligação ao alvo variante de acordo com a reivindicação 12 para uso de acordo com a reivindicação 12, em que o cancro é um tumor renal, um linfoma de células B, um carcinoma do cólon, doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrõm, linfoma não Hodgkin, um linfoma de células do manto, leucemia linfocitica crónica, leucemia linfocitica aguda, um carcinoma nasofaringeo, tumor cerebral ou um carcinoma timico.
  14. 14. Agente de ligação ao alvo variante de acordo com a reivindicação 13 para uso de acordo com a reivindicação 13, em que o cancro é leucemia mielocitica aguda.
  15. 15. Composição farmacêutica compreendendo um agente de ligação ao alvo variante de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e pelo menos um ingrediente farmaceuticamente compatível. Lisboa, 2014-12-10
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