ES2720433T3

ES2720433T3 - Anticuerpos biespecíficos específicos para FAP y DR5, anticuerpos específicos para DR5 y procedimientos de uso

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Publication number: ES2720433T3
Application number: ES14714275T
Authority: ES
Inventors: Peter Bruenker; Sherif Daouti; Ningping Feng; Koller Claudia Ferrara; Guy Georges; Sandra Grau-Richards; Ralf Hosse; Christian Klein; Maximiliane Koenig; Joerg Moelleken; Ekkehard Moessner; Huifeng Niu; Kathryn E Packman; Valeria Runza; Stefan Seeber; Pablo Umana; Inja Waldhauer; Huisheng Wang; Barbara Weiser
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2014-04-01
Publication date: 2019-07-22
Anticipated expiration: 2034-04-01
Also published as: MA38554A3; CA2903595A1; JP2016515389A; KR20150139909A; PL2981552T3; MX2015013899A; ZA201506471B; TR201905458T4; TW201500372A; AU2014247175A1; AR095980A1; EA201500995A1; UA118028C2; TWI535736B; US20140370019A1; JP6316937B2; CR20150502A; AU2014247175B2; EP2981552B1; US11214622B2

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a DR5, que comprende (a) una región determinante de la complementariedad 1 (CDR1) de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1; (b) una región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2; (c) una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:96, SEQ ID NO.:98, SEQ ID NO.: 104 y SEQ ID NO.: 108; (d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4; (e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5; y (f) una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:99, SEQ ID NO.: 105, SEQ ID NO.: 109 y SEQ ID NO.:97.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos biespecíficos específicos para FAP y DR5, anticuerpos específicos para DR5 y procedimientos de uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno específico para el receptor de muerte 5 (DR5) y un segundo sitio de unión a antígeno específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), anticuerpos específicos para DR5, procedimientos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y usos de los mismos.

Antecedentes

Los anticuerpos monoclonales son agentes terapéuticos poderosos en el tratamiento del cáncer, puesto que seleccionan selectivamente antígenos que se expresan diferencialmente en las células cancerosas. La selección de los receptores de muerte para TRAIL (ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF) en células cancerosas con anticuerpos monoclonales agonistas representa una nueva generación de tratamientos con anticuerpos monoclonales, ya que pueden inducir directamente la apoptosis de las células seleccionadas.

Tras la unión de TRAIL, los receptores de muerte de la familia TNFR-SF, tales como DR4 y DR5, se trimerizan. La trimerización induce la vía apoptótica extrínseca y una cascada compleja de acontecimientos, incluyendo la activación de caspasa, que finalmente dan como resultado la muerte de las células diana. La inducción de la apoptosis se potencia además si tiene lugar la hiperagregación de DR5 (es decir, la agregación de múltiples trímeros). Aunque los receptores de muerte se expresan ampliamente en una variedad de tipos de células, la inducción de la apoptosis por medio de la vía extrínseca se restringe a las células tumorales. Puesto que los anticuerpos agonistas de unión a DR4 o DR5 pueden reticular los receptores de muerte y, de ahí, inducir la apoptosis, estos receptores son interesantes dianas en el tratamiento del cáncer. Al menos ocho moléculas que seleccionan los receptores de muerte participaron en el desarrollo clínico y se han evaluado en ensayos clínicos para determinar el posible tratamiento de diferentes indicaciones, tales como tumores sólidos avanzados, como los cánceres colorrectal o de pulmón. Además, ha habido intentos de tratar otras indicaciones, tales como linfoma y/o mieloma múltiple.

Drozitumab, un anticuerpo agonista para DR5 completamente humano descrito en los documentos US2007 / 0031414 A1 y WO2006/083971, muestra cierta actividad apoptótica in vitro en ausencia de reticulación a concentraciones altas. Sin embargo, los datos in vivo revelaron un modo de acción diferente: en ratones mutantes en FcyR (o cuando se usaron variantes de anticuerpos en las que se inhibió la unión a FcyR), Drozitumab fue inactivo, lo que indicaba que la actividad in vivo de esta molécula es principalmente dependiente de la reticulación mediada por FcyR. Esta molécula se sometió a prueba hasta que la fase clínica II parecía ser segura (no se alcanzó la DMT hasta 20 mg/kg), pero no demostró ninguna eficacia significativa.

Conatumumab (descrito en el documento EP1922337A), es otro anticuerpo agonista para DR5 completamente humano. La actividad de Conatumumab es estrictamente dependiente de la reticulación por medio de los receptores Fc. A diferencia de Drozitumab, este anticuerpo es no bloqueante de ligandos. Además, esta molécula solo mostró una eficacia muy limitada en los ensayos clínicos.

LBY-135, un anticuerpo quimérico para DR5, presenta características similares a Conatumumab con respecto a la actividad dependiente de la reticulación y la propiedad no bloqueante de ligandos y no demostró ninguna eficacia significativa en la monoterapia. Además, LBY-135 mostró signos de inmunogenia en parte de los pacientes incluidos en un ensayo de fase I.

Dulanermin, un ligando natural producido de forma recombinante de DR4 y DR5 (TRAIL), solo mostró respuestas objetivas limitadas en los ensayos clínicos. El uso del ligando natural es, en cierto modo, desventajoso: TRAIL selecciona múltiples receptores, incluyendo tanto los receptores de muerte como los receptores señuelo y, por lo tanto, la selectividad es una preocupación. Además, TRAIL tiene una semivida en sangre mucho más corta en comparación con los anticuerpos monoclonales anti-DR, un factor que afecta a los parámetros sobre la dosis y la pauta de administración. La tan corta semivida en sangre de TRAIL requiere dosis grandes y frecuentes en comparación con los anticuerpos monoclonales anti-DR. Además, el TRAIL recombinante es muy difícil y tedioso de producir.

El desarrollo de los tres anticuerpos agonistas para DR5 y el ligando descrito anteriormente se suspendió.

Dos anticuerpos completamente humanos adicionales, Mapatumumab (anti-DR4) y Lexatumumab (anti-DR5), todavía están en desarrollo, aunque estas moléculas tampoco presentaron una eficacia prometedora en la monoterapia.

Tigatuzumab es un anticuerpo agonista para DR5 humanizado que se describe como activo in vitro (ya a concentraciones bajas) en ausencia de reticulación secundaria que, por supuesto, tiene el riesgo de problemas de toxicidad sistémica. Sin embargo, como todos los demás anticuerpos agonistas para DR5 descritos, esta molécula tampoco ha demostrado una eficacia convincente en los estudios de fase I / fase II hasta el momento y la dosis máxima tolerada, DMT, solo se demostró hasta 8 mg/kg.

Se busca un enfoque diferente para inducir la apoptosis seleccionando un receptor de muerte con la molécula TAS266, un nanocuerpo tetramérico de unión a DR5 (documento WO2011098520A1). Debido a la configuración tetravalente de los restos de unión a DR5, se cree que se incrementa la reticulación de DR5 en comparación con los anticuerpos bivalentes estándar, lo que puede dar como resultado una actividad incrementada. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, estas moléculas tienen la desventaja de tener una semivida bastante corta (en comparación con los anticuerpos). Además, hay un riesgo incrementado de toxicidad sistémica, puesto que esta molécula tetramérica no selecciona el tumor.

La combinación del anticuerpo para DR5 Drozitumab con un resto de unión a antígeno tumoral o un antígeno presente en el estroma que rodea al tumor en una plataforma de anticuerpos biespecíficos se ha descrito por los autores de la presente solicitud como un nuevo enfoque para lograr dos efectos: en primer lugar, el anticuerpo de unión a DR5 puede seleccionar el sitio del tumor, lo que podría evitar problemas de toxicidad sistémica potenciales (especialmente al usar un anticuerpo para DR5 que presente actividad independiente de la reticulación). En segundo lugar, este resto que selecciona el tumor o estroma tumoral, a continuación, también sirve como la unidad de reticulación para inducir la hiperagregación de DR5 y, posteriormente, la apoptosis específica en el sitio del tumor. El concepto básico se ha demostrado usando moléculas de fusión Drozitumab_scFv que seleccionan tipos de tumores diferentes (véase el documento WO 2011/039126).

De particular interés en el mismo fueron los anticuerpos biespecíficos que se unen a DR5 y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP; número de acceso a GenBank AAC51668) humana. Se identificó originalmente la FAP humana en fibroblastos cultivados usando el anticuerpo monoclonal (mAb) F19 (descrito en el documento WO 93/05804, número de ATCC HB 8269). Se encontraron homólogos de la proteína en varias especies, incluyendo los ratones (Niedermeyer et al., Int J Cancer 71, 383-389 (1997), Niedermeyer et al., Eur J Biochem 254, 650-654 (1998); número de acceso a GenBank AAH19190). La fA p tiene una distribución en tejido única: se descubrió que su expresión estaba altamente regulada por incremento en los fibroblastos estromales reactivos de más de un 90 % de todos los tumores epiteliales primarios y metastásicos, incluyendo los carcinomas de pulmón, colorrectal, vejiga, ovárico y de mama, mientras que, en general, está ausente en los tejidos adultos normales (Rettig et a l, Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3114 (1988); Garin-Chesa et a l, Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235 7239 (1990)). Los informes posteriores mostraron que la FAP no solo se expresa en fibroblastos estromales, sino también en algunos tipos de células malignas de origen epitelial, y que la expresión de FAP se correlaciona directamente con el fenotipo maligno (Jin et al., Anticancer Res 23, 3195-3198 (2003)). De forma sorprendente, los inventores descubrieron que un anticuerpo biespecífico que selecciona FAP en el estroma y DR5 en la célula tumoral, en realidad, induce la apoptosis a pesar de que las dianas estén situadas en células diferentes.

Tras otra investigación, los autores de la presente solicitud descubrieron que todas las moléculas biespecíficas que contienen scFv descritas en el documento WO2011/039126 tienen algunos problemas intrínsecos con respecto a la productividad, estabilidad y formación de agregados, lo que da lugar a una actividad subóptima no específica.

En la presente solicitud, se proporcionan anticuerpos biespecíficos novedosos que seleccionan FAP y DR5. Los autores de la presente solicitud desarrollaron restos de unión a DR5 novedosos que solo son activos después de la reticulación. De ahí que la inducción de la apoptosis de las células tumorales sea dependiente de la hiperreticulación de DR5 por medio de FAP y sea independiente de las interacciones Fc/ FcR. Por lo tanto, además de los anticuerpos biespecíficos específicos para FAP y DR5, también se proporcionan en la misma anticuerpos novedosos que se unen a DR5.

Por el contrario, la actividad de las moléculas que seleccionan DR5 convencionales, como se describe anteriormente, es dependiente de la hiperagregación mediada por el receptor Fc (FcR), y está influenciada por la infiltración inmunitaria y el estado de activación en el tumor (Li y Ravetch, PNAS 2012; Wilson, Cancer Cell 2011; documento WO2011098520A1). Las interacciones Fc/FcR se pueden ver alteradas por las concentraciones fisiológicas de IgG humana. Por tanto, la actividad de las moléculas que seleccionan DR5 convencionales se limita a menudo a unas pocas células infiltrantes (Moessner, Blood 2010). Mediante el uso de un anticuerpo biespecífico que selecciona tanto DR5 como FAP, se puede incrementar significativamente el porcentaje de células tumorales sensibles mediante hiperreticulación por medio de FAP y se disminuye el riesgo de una resistencia intrínseca a los agonistas de DR5. Los restos de unión a DR5 novedosos solo son activos después de la reticulación con FAP, lo que podría dar como resultado un perfil de seguridad y toxicología mejorado en comparación con las proteínas de unión a DR5 Apomab y Tigatuzumab. Los agonistas de DR5 que se han sometido a prueba hasta el momento eran seguros a nivel clínico, sin embargo, estos programas clínicos se han visto obstaculizados por una eficacia baja de las moléculas que seleccionan DR5.

Además, los restos de unión a DR5 novedosos preferentes se unen a un epítopo diferente de Drozitumab.

Es importante destacar que se pueden emplear los restos de unión a DR5 novedosos en muchos formatos de anticuerpos biespecíficos que seleccionan DR5-FAP, incluyendo formatos biespecíficos tanto novedosos como establecidos. Por el contrario, solo son posibles las fusiones C terminales de un resto de unión a FAP con formatos de anticuerpos biespecíficos que seleccionan DR5-FAP basados en Drozitumab, ya que cualquier fusión N terminal a Drozitumab da como resultado moléculas inactivas. Por tanto, la provisión de los restos de unión a DR5 nuevos expande significativamente las posibilidades de emplear el resto que selecciona DR5 en diversos formatos de anticuerpos biespecíficos que seleccionan DR5-FAP. Esto es importante, en particular, ya que algunos formatos de anticuerpos biespecíficos tienen características superiores en términos de productividad y actividad.

En los mimos se proporcionan anticuerpos biespecíficos novedosos que comprenden restos de unión a DR5 novedosos y un resto de unión a FAP madurado en afinidad.

Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención se proporcionan en un formato de anticuerpos biespecíficos, en el que uno o más fragmentos Fab de entrecruzamiento se fusionan a una molécula de IgG. Los fragmentos Fab de entrecruzamiento son fragmentos Fab en los que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera. Se han descrito formatos de anticuerpos biespecíficos que comprenden fragmentos Fab de entrecruzamiento, por ejemplo, en los documentos WO2009080252, WO2009080253, WO2009080251, WO2009080254, WO2010/136172, WO2010/145792 y WO2013/026831.

Hasta el momento, solo se han descrito anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en un formato que contiene scFv (documento WO2011/039126). Además de las propiedades ventajosas de las proteínas de unión a DR5 novedosas divulgadas en el mismo, el uso de un formato biespecífico basado en Fab de entrecruzamiento da como resultado un rendimiento mejorado y menos agregados y productos secundarios durante la producción. Además, los anticuerpos biespecíficos que seleccionan DR5-FAP basados en scFv y scFab demostraron la tendencia de formar agregados y, por lo tanto, tienen un riesgo más alto de reticular de forma no específica DR5 incluso en ausencia de FAP. De ahí que estos formatos tengan la desventaja de inducir potencialmente la apoptosis en células distintas a diana (es decir, células sanas).

Los restos de unión a DR5 y FAP de los anticuerpos biespecíficos novedosos proporcionados en el presente documento presentan una eficacia in vivo superior en comparación con los anticuerpos para DR5 convencionales. Los anticuerpos biespecíficos preferentes de la presente invención se unen con una afinidad alta a FAP en el estroma tumoral y con una afinidad más baja a DR5 en la célula tumoral. Además, los anticuerpos biespecíficos que seleccionan DR5 y FAP proporcionados en el presente documento no reaccionan de forma cruzada con las proteínas relacionadas estrechamente DR4, DcR1, DcR2 (relacionadas estrechamente con DR5) y DPPIV (relacionada estrechamente con FAP). Además, ahora es posible proporcionar, por primera vez, un anticuerpo biespecífico para DR5-FAP en diversos formatos biespecíficos sin limitación en el número de valencias de cada especificidad de unión.

En resumen, los anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP novedosos proporcionados en los mismos son altamente específicos y potentes: Inducen selectivamente la apoptosis mediante la hiperagregación de DR5 en células tumorales de una manera dependiente de FAP, con baja unión a las células normales.

Sumario

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que combinan un sitio de unión a antígeno que selecciona el receptor de muerte 5 (DR5) con un segundo sitio de unión a antígeno que selecciona la proteína de activación de fibroblastos (FAP). De este modo, se reticulan los receptores de muerte y se induce la apoptosis de la célula tumoral seleccionada. La ventaja de estos anticuerpos biespecíficos agonistas para los receptores de muerte sobre los anticuerpos que seleccionan los receptores de muerte convencionales es la especificidad de la inducción de la apoptosis solo en el sitio donde se expresa la FAP, así como la potencia más alta de estos anticuerpos biespecíficos debido a la inducción de la hiperagregación de DR5. Además, se proporcionan anticuerpos novedosos que se unen a DR5. Como se explica anteriormente, los autores de la presente invención desarrollaron restos de unión a DR5 novedosos con propiedades superiores en comparación con las proteínas de unión a DR5 conocidas que se incorporan en los anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP novedosos y ventajosos.

En un modo de realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que se une al receptor de muerte 5 (DR5) y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP) que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende

(a) una región determinante de la complementariedad 1 (CDR1) de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2; (c) una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:96, SEQ ID NO.:98; SEQ ID NO.:104 y SEQ ID NO.:108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:99, SEQ ID NO.:105, SEQ ID NO.:109 y SEQ ID NO.:97;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:9 y SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:10 y SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:11 y SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:12 y SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:13 y SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:14 y SEQ ID NO.:38.

Se divulga un anticuerpo biespecífico que se une al receptor de muerte 5 (DR5) y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP), que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO.:1, SEQ ID NO.:17 y SEQ ID NO.:75;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:18, SEQ ID NO.:25 y SEQ ID NO.:83;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:84, SEQ ID NO.:96, SEQ ID NO.:98, SEQ ID NO.:104 y SEQ ID NO.:108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4, SEQ ID NO.:20, SEQ ID NO.:27 y SEQ ID NO.:86;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5, SEQ ID NO.:21 y SEQ ID NO.:28; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:87, SEQ ID NO.:99, SEQ ID NO.:105, SEQ ID NO.:109 y SEQ ID NO.:97;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9 y SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10 y SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11 y SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12 y SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13 y SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14 y SEQ ID NO.:38.

En un modo de realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico en el que el sitio de unión a antígeno específico para DR5 comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6

y el sitio de unión a antígeno específico para FAP comprende

(a) una cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

En un modo de realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico, en el que el sitio de unión a antígeno específico para DR5 comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:7 y SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:100 y SEQ ID NO.:101; SEQ ID NO.:102 y SEQ ID NO.:103; SEQ ID NO.:106 y SEQ ID NO.:107; SEQ ID NO.:94 y SEQ ID NO.:95; y en el que el sitio de unión a antígeno específico para FAP comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:15 y SEQ ID NO.:39; y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:16 y SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5 que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que comprenden una secuencia de aminoácidos de: SEQ ID NO.:7 y SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:23 y SEQ ID NO.:24; SEQ ID NO.:26 y SEQ ID NO.:24; SEQ ID NO.:23 y SEQ ID NO.:29; SEQ ID NO.:23 y SEQ ID NO.:30; SEQ ID NO.:26 y SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:26 y SEQ ID NO.:32; SEQ ID NO.:26 y SEQ ID NO.:30; SEQ ID NO.:23 y SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:82 y SEQ ID NO.:85; SEQ ID NO.:100 y SEQ ID NO.:101; SEQ ID NO.:102 y SEQ ID NO.:103; SEQ ID NO.:106 y SEQ ID NO.:107; SEQ ID NO.:94 y SEQ ID NO.:95;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:15 y SEQ ID NO.:39; y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16 y SEQ ID NO.:40.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

Preferentemente dicho anticuerpo biespecífico es humano o está humanizado.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para DR5, y al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para FAP.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para DR5, y al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que al menos uno de los fragmentos Fab se conecta a la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de la cadena ligera (VLCL) y al menos un fragmento Fab se conecta a la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de la cadena pesada (VHCH1).

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende

a) un dominio Fc,

b) dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5,

en el que dichos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena ligera constante (CL) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc,

c) dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en los que los dos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena pesada constante (CH1) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende

a) un dominio Fc,

en el que dichos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena pesada constante (CH1) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc,

c) dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en los que los dos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena ligera constante (CL) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para DR5, y al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico es bivalente tanto para DR5 como para FAP.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico es bivalente para DR5 y monovalente para FAP.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, tres fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico es trivalente para DR5 y monovalente para FAP.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico es monovalente para DR5 y monovalente para FAP.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para DR5, y al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del/de los fragmento(s) Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

En un modo de realización, al menos uno de dichos fragmentos Fab se conecta al dominio Fc por medio de un enlazador peptídico.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, que comprende la sustitución de uno o más aminoácidos que reduce la unión a los receptores Fc y/o la función efectora. En un modo de realización, dicha sustitución de uno o más aminoácidos es en una o más posiciones seleccionadas del grupo de L234, L235 y P329. En un modo de realización, cada subunidad del dominio Fc comprende sustituciones de tres aminoácidos que suprimen la unión a un receptor Fc activador o inhibidor y/o la función efectora, en la que dichas sustituciones de aminoácidos son L234A, L235A y P329G.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico en el que la parte Fc de la primera cadena pesada comprende un primer módulo de dimerización y la parte Fc de la segunda cadena pesada comprende un segundo módulo de dimerización, lo que permite una heterodimerización de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. En un modo de realización, el primer módulo de dimerización comprende botones y el segundo módulo de dimerización comprende ojales de acuerdo con la estrategia de botones en ojales.

En otro modo de realización, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a DR5, que comprende (a) una región determinante de la complementariedad 1 (CDR1) de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:96, SEQ ID NO.:98, SEQ ID NO.:104 y SEQ ID NO.:108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5; y

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo que se une específicamente a DR5, que comprende

(a) una región determinante de la complementariedad 1 (CDR1) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO.:1, SEQ ID NO.:17 y SEQ ID NO.:75;

(b) una región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:18, SEQ ID NO.:25 y SEQ ID NO.:83;

(c) una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:84, SEQ ID NO.:96, SEQ ID NO.:98, SEQ ID NO.:104 y SEQ ID NO.:108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:4, SEQ ID NO.:20, SEQ ID NO.:27 y SEQ ID NO.:86;

(e) una CDR2 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:5, SEQ ID NO.:21 y SEQ ID NO.:28; y (f) una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:87, SEQ ID NO.:99, SEQ ID NO.:105, SEQ ID NO.:109 y SEQ ID NO.:97;

En otro modo de realización, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a DR5, que comprende (a) una cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

(d) una cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una cadena ligera de SEQ ID NO.:6

En otro modo de realización, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a DR5, que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:7 y SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:82 y SEQ ID NO.:85; SEQ ID NO.:100 y SEQ ID NO.:101; SEQ ID NO.:102 y SEQ ID NO.:103; SEQ ID NO.:106 y SEQ ID NO.:107; SEQ ID NO.:94 y SEQ ID NO.:95.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo que se une específicamente a DR5, que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:7 y SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:23 y SEQ ID NO.:24; SEQ ID NO.:26 y SEQ ID NO.:24; SEQ ID NO.:23 y SEQ ID NO.:29; SEQ ID NO.:23 y SEQ ID NO.:30; SEQ ID NO.:26 y SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:26 y SEQ ID NO.:32; SEQ ID NO.:26 y SEQ ID NO.:30; SEQ ID NO.:23 y SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:82 y SEQ ID NO.:85; SEQ ID NO.:100 y SEQ ID NO.:101; SEQ ID NO.:102 y SEQ ID NO.:103; SEQ ID NO.:106 y SEQ ID NO.:107; SEQ ID NO.:94 y SEQ ID NO.:95;

En otro modo de realización, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a DR5 que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8.

En un segundo objetivo, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une específicamente a DR5 de la presente invención.

En un tercer objetivo, la presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que selecciona DR5 y FAP o un anticuerpo que se une específicamente a DR5 de la presente invención para el tratamiento del cáncer. En un modo de realización preferente, dicho cáncer es cáncer de páncreas o carcinoma colorrectal. En otro modo de realización, se proporciona el uso del anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une específicamente a DR5 como medicamento. Preferentemente, dicho uso es para el tratamiento del cáncer, preferentemente cáncer de páncreas o carcinoma colorrectal.

En otros objetivos, la presente invención se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la invención que se une específicamente a DR5, un vector de expresión que comprende dichos polinucleótidos aislados, una célula huésped procariota o eucariota que comprende dicho vector y un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar dicha célula huésped de modo que se produzca el anticuerpo.

En otros aspectos, se divulga una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una cadena pesada de un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une específicamente a DR5 de la presente invención, una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una cadena ligera de un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une específicamente a DR5 de la presente invención, un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención y una célula huésped procariota o eucariota que comprende un vector de la presente invención. Además, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de modo que se produzca el anticuerpo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: análisis de unión por FACS de dos líneas celulares diferentes (SW872 y GM05389) para los niveles de expresión de la proteína de activación de fibroblastos (FAP) humana (A). La intensidad de fluorescencia medida con concentraciones diferentes de un anticuerpo anti-FAP se muestra en un intervalo de tres magnitudes (barras negras, grises y rayadas). Las reacciones de control negativo como el anticuerpo secundario y las células solo se muestran como barras punteadas y blancas, respectivamente. Aunque las células GM05389 demuestran la expresión de FAP en todas las concentraciones de anticuerpos sometidas a prueba que estaban por encima del fondo, con las células SW872, solo se pudo detectar la expresión de FAP con la concentración de anticuerpos más alta usada (10 pg/ml), lo que indica que estas células no son adecuadas para los experimentos de unión basada en FAP/inducción de la apoptosis. Además, se muestra que esta línea celular apenas se somete a apoptosis mediada por Drozitumab (B). Drozitumab solo u otro anticuerpo anti-DR5 disponible comercialmente no indujeron una fragmentación del ADN pertinente. Solo cuando Drozitumab se reticula con un anticuerpo anti-Fc humano se puede observar un nivel bajo detectable de inducción de la apoptosis.

Figura 2: detección de la expresión de DR5 en dos líneas celulares tumorales humanas diferentes (la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 y la línea celular de carcinoma renal ACHN) por medio de unión por FACS con Drozitumab y detección posterior con un anticuerpo anti-Fc marcado. Ambas líneas celulares muestran niveles de expresión bajos y comparables de DR5 humano.

Figura 3: ensayo ELISA para la fragmentación del ADN para la detección de la apoptosis. Se cultivaron células diana ACHN (A) o MDA-Mb -231 (B) solas o bien en presencia de un igual número de fibroblastos GM05389 que expresaban FAP. Se añadieron anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP (fusiones a scFv) a una concentración de 0,1 pg/ml (A) y 0,7 nM, respectivamente (B) y las células se incubaron durante 24 h antes de la detección de la fragmentación del ADN. Para la reticulación de Drozitumab, se usaron 0,1 pg/ml de anticuerpo secundario anti-Fc.

Figura 4: ensayo ELISA para la fragmentación del ADN para la detección de la apoptosis. Inducción de la apoptosis en células ACHN mediante anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP (Drozitumab con scFab fusionado) en presencia o ausencia de fibroblastos que expresan FAP (GM05389). La actividad de las moléculas biespecíficas con restos de unión a FAP diferentes se compara con Drozitumab con o sin reticulación mediante un anticuerpo secundario anti-Fc. Se usaron anticuerpos en dos concentraciones diferentes (1,0 pg/ml y 0,1 pg/ml). En este contexto, las moléculas biespecíficas que contenían la fusión a scFab 4G8 (B) mostraron una actividad de inducción de la apoptosis superior en un ensayo para la fragmentación del ADN en comparación con las moléculas que contenían la scFab 3F2 (A).

Figura 5: representación esquemática de dos moléculas biespecíficas para DR5-FAP diferentes en la que el resto de CrossFab anti-FAP se fusiona mediante un enlazador estándar (G4S)4 al extremo C de IgG de Drozitumab. En un caso, (A), el CrossFab de VHCL se fusiona a IgG de Drozitumab, mientras que en (B) la cadena VLCH1 se conecta a la IgG como se indica. Estas dos moléculas son solo ejemplos de posibles formatos que usan combinaciones de IgG-CrossFab que también se usaron para las moléculas biespecíficas que contienen proteínas de unión a DR5 recién aisladas. Otras posibilidades incluyen el cruzamiento en la parte de IgG de la molécula, la implementación de puentes salinos y residuos cargados para estabilizar los CrossFab o el uso de longitudes y secuencias de enlazador diferentes.

Figura 6: comparación de los contenidos de agregados durante la purificación de formatos de anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP diferentes. Todos los formatos consisten en IgG de Drozitumab con un dominio de unión a FAP (clon 4G8) fusionado al extremo C. Los restos de unión a FAP consisten en un scFv estabilizado con disulfuro (A), un scFab (B) o bien un CrossFab (C). Los cromatogramas de la cromatografía de exclusión por tamaño preparativa mostraron claras diferencias entre las tres construcciones. Mientras que la producción de las moléculas de scFv y CrossFab fue comparable, la construcción que contenía scFab mostró un rendimiento más bajo y un contenido de agregados más alto. A partir de esta comparación, la molécula que contenía CrossFab parecía más prometedora.

Figura 7: análisis de la unión por FACS en células HEK293 de expresión de FAP humana recombinante. Se compararon las moléculas biespecíficas para DR5-FAP en el nuevo formato CrossFab con la molécula de scFab, la IgG 4G8 original y un control negativo no relacionado, Drozitumab. Las dos moléculas de CrossFab demostraron unirse a FAP al menos en el mismo intervalo que el control de IgG.

Figura 8: análisis por resonancia de plasmón superficial (RPS, Biacore) de la unión simultánea de moléculas de Drozitumab biespecífico-FAP (CrossFab) a DR5 y FAP humanos recombinantes. Se inmovilizó DR5 humano biotinilado-Fc como ligando sobre un chip con estreptavidina seguido de inyección del primer analito (moléculas biespecíficas de CrossFab). Después de la unión a DR5-Fc (asociación de 90 s) y un corto periodo de disociación (10 s), se añadió FAP (humana o murina) soluble recombinante en concentraciones diferentes (100 nM, 500 nM) como segundo analito y se midió la respuesta adicional. La unión del formato Drozitumab-X-FAP_A (A y B) se comparó con Drozitumab-X-FAP_B (C y D). Se midió cada construcción para determinar la unión a DR5 y a FAP humana (A, C) o murina (B, D). Mediante este análisis para todas las moléculas sometidas a prueba, se pudo demostrar una unión simultánea a DR5 y a FAP humana / murina.

Figura 9: ensayo ELISA para la fragmentación del ADN para la detección de la apoptosis. Resultados de un experimento de inducción de la apoptosis en el que se compararon dos moléculas de CrossFab (Drozitumab-X-Fab-A y Drozitumab-X-Fab-B) con Drozitumab y Drozitumab hiperreticulado en un ensayo de cocultivo de dos líneas celulares (MDA-MB-231 y GM05389). (A) La inducción de la apoptosis se detectó después de 24 h usando un ELISA de detección de muerte celular. Se usaron todas las construcciones sometidas a prueba en concentraciones de 7 nM y 0,7 nM. La inducción de la apoptosis de células diana y efectoras se compara con la apoptosis de células diana solas. (B) Comparación de la inducción de la apoptosis en vecindad mediante cocultivo en el ELISA de detección de muerte celular (fragmentación del ADN) con Drozitumab (+ /- reticulación mediante Fc) frente a moléculas biespecíficas para DR5-FAP que consisten en un CrossFab con FAP fusionado al extremo C de la cadena pesada de Drozitumab. La molécula que contiene el resto de unión a FAP madurado en afinidad (28H1) muestra una actividad superior en comparación con la molécula que contiene la proteína de unión a FAP con afinidad más baja.

Figura 10: ensayo ELISA para la fragmentación del ADN para la detección de la apoptosis. La inducción de la apoptosis por medio de moléculas de Drozitumab biespecífico-CrossFab con FAP es dependiente de la reticulación por medio de FAP. La figura 10 muestra los resultados de la inducción de la apoptosis en células MDA-MB-231 mediante moléculas de CrossFab reticuladas mediante FAP humana recombinante recubierta en una placa de ELISA. Mientras que la molécula de control (Drozitumab reticulado por medio del anticuerpo anti-Fc) muestra una inducción de la apoptosis similar, independiente del recubrimiento de FAP o de una proteína de control no relacionada, las construcciones biespecíficas solo presentaron una actividad apoptótica significativa cuando se recubría la FAP. Con el recubrimiento del plásmido de control solo a la concentración de la construcción más alta (7 nM), se pudo detectar la apoptosis, lo que probablemente se deba a la expresión de FAP de referencia de la línea celular MDA-MB-231. La actividad apoptótica fue similar para ambas moléculas de CrossFab sometidas a prueba y en el mismo intervalo como se observa con Drozitumab hiperreticulado.

Figura 11: comparación de la inducción de la apoptosis (fragmentación del ADN) en líneas celulares tumorales humanas diferentes en un experimento de cocultivo con fibroblastos humanos que expresan FAP, GM05389. Se comparan Drozitumab y Drozitumab hiperreticulado con una molécula de Drozitumab biespecífico-CrossFab con 4G8 (todas a concentraciones de 7,0 y 0,7 nM). Las líneas celulares tumorales usadas fueron MDA-MB-231 (cáncer de mama), U-87MG (glioblastoma), FaDu (carcinoma escamoso) o A549 (carcinoma de pulmón). La inducción de la apoptosis a una concentración de 7 nM fue similar para las cuatro líneas celulares, mientras que a 0,7 nM se observó una diferencia más pronunciada entre las líneas celulares.

Figura 12: representación esquemática de las construcciones del antígeno DR5 humano usadas para el aislamiento, cribado y caracterización de proteínas de unión a DR5 novedosas. Para todas las construcciones, se usó el mismo dominio de DR5 (dominio extracelular, DEC; aa 56 - 207) solo (A) como fusión a Fc dimérico (B) o bien como fusión a Fc monomérico (C) usando la tecnología de botón en ojal. Todos los antígenos se transfectaron de forma transitoria y se produjeron en células HEK293 EBNA.

Figura 13: cribado de 46 proteínas de unión a DR5 únicas (aisladas mediante presentación en fagos) para la inducción de la apoptosis en células MDA-MB-231 (ensayo para la fragmentación del ADN) después de la hiperreticulación con el anticuerpo secundario anti-Fc. Los anticuerpos se usaron a concentraciones de 7 nM (barras negras) y 0,7 nM (barras rayadas). La gran mayoría de las proteínas de unión a DR5 (42 / 46) pudieron inducir la fragmentación del ADN en grados diferentes después de la hiperreticulación.

Figura 14: inducción de la apoptosis en células MDA-MB-231 medida mediante el ensayo ELISA para la fragmentación del ADN mediante una serie seleccionada de proteínas de unión a DR5 novedosas en presencia o ausencia de un anticuerpo secundario anti-Fc de reticulación para evaluar si los anticuerpos para DR5 nuevos presentan actividad apoptótica sin reticulación secundaria. Las proteínas de unión a DR5 nuevas se compararon con Drozitumab, un anticuerpo que se sabe que es activo en determinado grado sin reticulación.

Figura 15: análisis de la inhibición de la proliferación celular (ensayo Cell TiterGlo) de tres células tumorales humanas diferentes (DLD-1, NCI H460 y MDA-MB-231) tras el tratamiento con anticuerpos para DR5 reticulados diferentes a una concentración de 7 nM.

Figura 16: evaluación de la inducción de la apoptosis medida mediante la activación de caspasa 8 en tres líneas celulares tumorales humanas (DLD-1, NCI H460 y MDA-MB-231) después del tratamiento con anticuerpos para DR5 reticulados a una concentración de 7 nM.

Figura 17: resultados de los experimentos de agrupamiento de epítopos mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore). Después de la unión de un primer anticuerpo a DR5 humano, se analizó la unión adicional de los anticuerpos adicionales que se iban a someter a prueba. Con la excepción del clon 422, que se podría solapar con el epítopo de Drozitumab, ninguna de las proteínas de unión a DR5 nuevas sometidas a prueba parece unirse a una región en DR5 que se solape con el epítopo de Drozitumab, mientras que entre sí podrían compartir al menos epítopos solapantes.

Figura 18: ensayo de competencia con TRAIL para determinar los anticuerpos bloqueantes de ligandos frente a los no bloqueantes de ligandos. Se inmovilizó TRAIT humano en un chip CM5. A continuación, se usó un complejo que consistía en DR5 humano-Fc y anticuerpo para DR5 como analito y se analizó la unión del complejo a TRAIL inmovilizado. Aunque la mayoría de las nuevas proteínas de unión de la presentación en fagos eran moléculas bloqueantes de TRAIL, una serie de anticuerpos para DR5 de la inmunización de conejos eran de clase no bloqueante.

Figura 19: efecto de TRAIL humano sobre la inhibición de la proliferación de células diana DLD-1 tras el tratamiento con anticuerpos agonistas para DR5 diferentes. Se incubaron células diana DLD-1 con anticuerpos para DR5 reticulados en ausencia (líneas continuas) o presencia (líneas punteadas) de concentraciones diferentes de TRAIL humano. Dependiendo del epítopo reconocido por los anticuerpos para DR5, la adición de TRAIL incrementó (no bloqueante de ligandos) o no incrementó (bloqueante de ligandos) la inhibición del crecimiento celular. TRAIL solo y un anticuerpo conocido por no bloquear TRAIL se incluyeron como controles.

Figura 20: ensayo ELISA para la fragmentación del ADN para la detección de la apoptosis. Actividad de inducción de la apoptosis de anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP (clon de FAP 28H1) diferentes en MDA-MB-231 como la línea celular diana en presencia o ausencia de FAP humana recombinante recubierta en una placa de 96 pocillos. En este contexto, la FAP recubierta debería imitar a la FAP expresada en el estroma tumoral. Los anticuerpos biespecíficos se sometieron a prueba a dos concentraciones (7,0 y 0,7 nM). Para las moléculas biespecíficas que contenían las proteínas de unión a DR5 novedosas, solo se detectó una inducción de la apoptosis dependiente de la concentración en presencia de FAP, mientras que la molécula de control que contenía Drozitumab también mostró cierta actividad en ausencia de FAP, lo que confirmó que la actividad de los anticuerpos para DR5 nuevos es estrictamente dependiente de la reticulación.

Figura 21: actividad de inducción de la apoptosis en vecindad de moléculas biespecíficas para DR5-FAP (formato CrossFab 2+2) en un ensayo de cocultivo usando MDA-MB-231 como células diana que expresan DR5 y GM05389 (fibroblastos FAP+) para la reticulación. Las moléculas que contenían proteínas de unión a DR5 recién aisladas diferentes se compararon con construcciones que contenían Drozitumab a tres concentraciones (7,0, 0,7 y 0,07 nM). En estas condiciones, no todas las construcciones biespecíficas sometidas a prueba presentaron la misma actividad en comparación con la reticulación por medio de mAb anti-Fc o por medio de FAP recombinante.

Esto demuestra que no todos los anticuerpos que pueden inducir, en principio, la apoptosis después de la reticulación tampoco lo harían en condiciones más naturales (en las que los antígenos, DR5 y FAP, se expresan en tipos de células diferentes).

Figura 22: ELISA de detección de muerte celular (fragmentación del ADN) con células diana MDA-MB-231 tratadas con Fab de unión a DR5 nuevos fusionados al extremo C de Fc humano, en comparación con Drozitumab, todo después de la reticulación con el anticuerpo anti-Fc. Todas las moléculas de fusión Fc sometidas a prueba pueden conferir inducción de la apoptosis en células diana en el mismo intervalo que Drozitumab reticulado, lo que indica que su capacidad de unión y actividad no se bloquea posicionando el Fc en su extremo N terminal. A: proteínas de unión a DR5 derivadas de presentación en fagos B: proteínas de unión a DR5 humanizadas derivadas de inmunización.

Figura 23: comparación de anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP (proteínas de unión a DR5 nuevas con fusión a CrossFab con 28H1 C terminal) para la inducción de la apoptosis en MDA-MB-231 como línea celular diana en un ensayo de cocultivo usando fibroblastos GM05389 (ensayo ELISA para la fragmentación del ADN para la detección de la apoptosis).

Figura 24: los anticuerpos para DR5-FAP biespecíficos inducen la apoptosis en células G401 en un ensayo en vecindad como se determina mediante fragmentación del ADN en un ELISA de detección de muerte celular.

Figura 25: representación esquemática de los formatos CrossFab biespecíficos para DR5-FAP adicionales que se evaluaron con respecto a la productividad y calidad. Estas cuatro moléculas difieren en la posición y valencia de los restos de unión a DR5 y FAP: se evaluaron dos moléculas 2+1, una construcción 3+1 y una construcción 1+1. Una molécula 2+1 contiene un CrossFab con FAP (28H1) fusionado al extremo C de una cadena pesada de DR5 (5E11) (A) mientras que un segundo formato 2+1 consiste en dos Fab para DR5 (5E11) fusionados al extremo N de un Fc con el homólogo de CrossMab para 28H1 (B). La tercera molécula (C) contiene tres Fab que seleccionan DR5 y un CrossFab con 28H1 fusionado al extremo C de una cadena pesada. En el formato 1 1 (D), la proteína de unión a DR5 n.° 174 se combina con el resto de unión a FAP 4B9 en disposición de CrossFab. Todas las construcciones dependen de la heterodimerización que usa la tecnología de botón en ojal.

Figura 26: actividad apoptótica de moléculas biespecíficas para DR5-FAP (A: 5E11-28H1; B: 18F11-28H1) en formatos diferentes como se mide mediante ELISA de detección de muerte celular para la fragmentación del ADN en células MDA-MB-231 cocultivadas con fibroblastos GM05489. El formato estándar 2+2 de Drozitumab-28H1 se comparó con las moléculas 5E11-28H1 y 18F11-28H1 en formatos 2+2, 2+1 y 3+1 a tres concentraciones diferentes.

Figura 27: inducción de la apoptosis en vecindad de la molécula 5E11-28H1 (formato 2+2) en comparación con tres formatos biespecíficos adicionales: 2+1, 2+1 (fusión de cabeza a cola) novedoso y 3+1. Se usaron MDA-MB-231 como células diana, se cocultivaron fibroblastos GM05389 para la reticulación dependiente de FAP y los anticuerpos biespecíficos se evaluaron a concentraciones de 700-0,007 nM.

Figura 28: nuevos formatos biespecíficos 5E11-28H1 (2+2) para la evaluación de la productividad, perfil de los productos secundarios y actividad. Las moléculas difieren en el sitio y el tipo de cruzamiento.

Figura 29: los resultados de la unión por FACS con 5E11-CrossFab con 28H1 en tres formatos diferentes en MDA-MB-231 en un intervalo de concentraciones de 0,0037 a 60 nM. Se usó un (Fab)²anti-Fc humano de cabra conjugado con PE para la detección.

Figura 30: ensayo ELISA para la fragmentación del ADN para la detección de la apoptosis. Inducción de la apoptosis de 4 variantes de CrossMab diferentes en los contextos de co (A) y monocultivo (B, C) como se detecta mediante fragmentación del ADN. Las 4 variantes diferentes inducen la apoptosis en células tumorales en el contexto de cocultivo de una manera dependiente de la dosis comparable. En contextos de monocultivo, no se induce ninguna apoptosis ni en la línea celular tumoral MDA-MB231 ni en la línea celular de fibroblastos GM05389, lo que destaca la especificidad y dependencia de FAP de la inducción de la apoptosis de las 4 variantes.

Figura 31: eficacia in vivo en modelos de tumores de xenoinjerto de ratón en los que se coinyectaron células DLD-1 (A; ratones atímicos) o MDA-MB-231 (B; ratones beis SCID) con fibroblastos 3T3 que expresaban mu FAP para garantizar la expresión de FAP en el estroma tumoral. Después de que se hubieran injertado los tumores, se realizó un tratamiento a 10 mg/kg mediante inyección i.v. de la molécula Drozitumab biespecífico-28H1 (triángulo) o Drozitumab solo (cuadrado) o el control con vehículo (rombo). Se determinó la eficacia por medio de la inhibición del crecimiento tumoral (ICT) en comparación con el control con vehículo.

Figura 32: evaluación de moléculas biespecíficas para DR5-FAP producidas para experimentos de eficacia in vivo para su actividad de inducción de la apoptosis. Las cuatro moléculas diferentes se sometieron a prueba en un ELISA de detección de muerte celular para la fragmentación del ADN de células DLD-1. Se usaron células 3T3 o 3T3 recombinantes que expresaban FAP murina en el ensayo de cocultivo para la reticulación. Se muestra el incremento en veces de la apoptosis en comparación con las células no tratadas.

Figura 33: viabilidad de las células DLD-1 después del tratamiento con anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP después del ensayo de cocultivo con células 3T3 o células 3T3 que expresan FAP murina (Cell TiterGlo). Se proporciona el porcentaje de viabilidad en comparación con un control no tratado.

Figura 34: modelos de xenoinjerto de ratón en los que se compararon moléculas biespecíficas para DR5-FAP diferentes (10 mg/kg) en el formato 2+2 con un control con vehículo. Todas las construcciones contenían el CrossFab con FAP 28H1 fusionado a proteínas de unión a DR5 diferentes: 5E11, 174 y 422. Además, se incluyó una molécula (5E11-28H1) en la que el Fc tenía mutaciones para inhibir cualquier interacción con FcyR (PGLALA). Se determinó la eficacia como la inhibición del crecimiento tumoral (ICT).

Figura 35: ensayo para la fragmentación del ADN. Los anticuerpos anti-DR5 inducen la muerte celular tras la hiperagregación del receptor de una manera dependiente de la dosis. Los anticuerpos anti-DR5 de conejo generados pudieron inducir la apoptosis de células MDA-MB231 con potencias diferentes, pero siempre de una manera dependiente de la dosis y solo después de la reticulación mediada por Fc de las moléculas de DR5 (panel superior). En ausencia de un anticuerpo secundario específico anti-Fc de conejo, no se detectó ninguna muerte celular significativa (panel inferior).

Figura 36: la viabilidad de las células se reduce mediante los anticuerpos anti-DR5 tras la hiperagregación del receptor de una manera dependiente de la dosis. Los anticuerpos anti-DR5 de conejo generados pudieron disminuir la viabilidad de las células MDA-MB231 con potencias variables, pero siempre de una manera dependiente de la dosis y solo después de la reticulación mediada por Fc de las moléculas de DR5 (panel superior). En ausencia de un anticuerpo secundario específico anti-Fc de conejo, la viabilidad de las células no se vio afectada en ninguna concentración de anticuerpos (panel inferior).

Figura 37: análisis de la inhibición de la proliferación celular (ensayo Cell TiterGlo) de tres células tumorales humanas diferentes (DLD-1, NCI H460 y MDA-MB-231) tras el tratamiento con anticuerpos para DR5 reticulados diferentes a una concentración de 7 nM.

Figura 38: evaluación de la inducción de la apoptosis medida mediante la activación de caspasa 8 en tres líneas celulares tumorales humanas (DLD-1, NCI H460 y MDA-MB-231) después del tratamiento con anticuerpos para DR5 reticulados a una concentración de 7 nM.

Figura 39: concentración activa relativa de muestras de anticuerpo para DR5 sometidas a agresión: Curva de respuesta ejemplar.

Figura 40: concentraciones activas relativas de anticuerpos para DR5 originales y sometidos a agresión derivados de inmunización.

Figura 41: concentraciones activas relativas de anticuerpos para DR5 originales y sometidos a agresión derivados de presentación en fagos.

Figura 42: análisis por resonancia de plasmón superficial (RPS, Biacore) de la unión simultánea de anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP diferentes a ambas dianas recombinantes. En una primera reacción, se determinó la unión de los anticuerpos biespecíficos a DR5 humano recombinante-Fc, seguido de un análisis de la unión a FAP humana recombinante (panel superior) o murina (panel inferior).

Figura 43: inducción de la apoptosis en líneas celulares tumorales DLD-1 y H460 mediante construcciones biespecíficas 2+2 en ensayos de cocultivo como se detecta mediante fragmentación del ADN. Mientras que una construcción biespecífica que contiene Drozitumab como componente de unión a DR5 ya induce la apoptosis en ausencia de FAP, todas las construcciones que contienen proteínas de unión a DR5 nuevas derivadas mediante inmunización solo inducen la apoptosis en presencia de fAp . Las construcciones con proteínas de unión a DR5 recién desarrolladas, tales como 0011-28H1 y 0016-28H1, pueden inducir la apoptosis en alto grado, especialmente a concentraciones bajas, en comparación con la construcción biespecífica que contiene Drozitumab.

Figura 44: unión de construcciones biespecíficas 2+2 anti-DR5-FAP a la línea celular tumoral que expresan DR5 MDA-MB-231 como se mide mediante análisis de citometría de flujo.

Figura 45: A Inducción de la apoptosis de variantes humanizadas después de la reticulación como se detecta mediante fragmentación del ADN (ELISA de detección de muerte celular): Las variantes humanizadas de DR5TAA-0011 (DR5TAA-0066 - DR5TAA-0075, líneas negras) inducen la apoptosis tras la reticulación con el anticuerpo secundario de una manera dependiente de la dosis. Varias variantes humanizadas, tales como DR5TAA-0067, DR5TAA-0071, DR5TAA-0074 y DR5TAA-0075, pueden inducir la apoptosis de una manera similar en relación con el máximo de inducción y dependencia de la dosis en comparación con la variante quimérica (DR5TAA-0052, líneas grises). B Ausencia de inducción de la apoptosis de variantes humanizadas sin reticulación adicional como se detecta mediante fragmentación del ADN (ELISA de detección de muerte celular): Las variantes humanizadas de DR5TAA-0011 (DR5TAA-0066 - DR5TAA-0075) no inducen ninguna apoptosis si no se reticulan por un anticuerpo secundario.

Figura 46: inducción comparable de muerte celular en un sistema de cocultivo mediante anticuerpos biespecíficos anti-DR5-FAP en los formatos 1 1 y 2+2.

Figura 47: gran especificidad de los anticuerpos biespecíficos anti-DR5-FAP en la inducción de la muerte celular solo en presencia de células tumorales y fibroblastos.

Figura 48: eficacia de los anti-DR5-FAP biespecíficos (proteína de unión a DR5: SEQ ID NO.:7 de VH, SEQ ID NO.:8 de VL, proteína de unión a FAP: SEQ iD NO.:15 de VH, SEQ ID NO.:16 de VL) en el modelo de xenoinjerto basado en líneas celulares de coinyección de CCR DLD-1

Figura 49: eficacia de los anti-DR5-FAP biespecíficos (proteína de unión a DR5: SEQ ID NO.:7 de VH, SEQ ID NO.:8 de VL, proteína de unión a FAP: SEQ ID NO.:15 de VH, SEQ ID NO.:16 de VL) en el modelo de xenoinjerto derivado de pacientes (XDP) basado en fragmentos de CCR Co5896

Descripción detallada de los modos de realización de la invención

I. Definiciones

Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su ligando (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su ligando Y se puede representar, en general, mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.

Un anticuerpo "madurado en afinidad " se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

El término "un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al receptor de muerte 5 (DR5) y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP)" se refiere a un anticuerpo biespecífico que se puede unir a DR5 y a FAP con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección de células que expresen DR5 y FAP). Específicamente, "un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al receptor de muerte 5 (DR5) y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP)" se refiere a un anticuerpo biespecífico que selecciona DR5 en una célula tumoral y FAP en el estroma que rodea a dicho tumor. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo biespecífico que une específicamente el receptor de muerte 5 (DR5) y la proteína de activación de fibroblastos (FAP) a una proteína distinta de FAP o distinta de DR5 no relacionada es menor de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a DR5 o FAP como se mide, por ejemplo, mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayos basados en resonancia de plasmón superficial (RPS) (por ejemplo, Biacore) o citometría de flujo (FACS). En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al receptor de muerte 5 (DR5) y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP) tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, de 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al receptor de muerte 5 (DR5) y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP) se une a un epítopo de DR5 o FAP que se conserva entre DR5 o FAP de especies diferentes. Preferentemente, dicho anticuerpo biespecífico se une a DR5 humano y de macaco cangrejero y a FAP humano, de macaco cangrejero y de ratón.

El término "un anticuerpo que se une específicamente al receptor de muerte 5 (DR5)" se refiere a un anticuerpo que se puede unir a DR5 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección de células que expresen DR5. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo que une específicamente el receptor de muerte 5 (DR5) a una proteína distinta de DR5 no relacionada es menor de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a DR5 como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA) o citometría de flujo (FACS). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une específicamente al receptor de muerte 5 (DR5) tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo de 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une específicamente al receptor de muerte 5 (DR5) se une a un epítopo de DR5 que se conserva entre DR5 de especies diferentes. Preferentemente dicho anticuerpo se une a DR5 humano y de macaco cangrejero. El término "un anticuerpo que se une específicamente al receptor de muerte 5 (DR5)" también engloba anticuerpos biespecíficos que se pueden unir a DR5 y a un segundo antígeno.

Se usa el término "anticuerpo" en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')²; diacuerpos, fragmentos cross-Fab; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos monocatenarios que tienen las características de un dominio VH, a saber, que se pueden ensamblar junto con un dominio VL, o de un dominio VL, a saber, que se pueden ensamblar junto con un dominio VH a un sitio de unión a antígeno funcional y que proporcionan, de este modo, la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud completa.

Como se usa en el presente documento, "fragmento Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. En un modo de realización, los anticuerpos biespecíficos de la invención comprenden al menos un fragmento Fab, en los que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera. Debido al intercambio de las regiones variables o bien de las regiones constantes, dicho fragmento Fab también se denomina "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento". Son posibles dos composiciones de cadena diferentes de una molécula de Fab de entrecruzamiento y están comprendidas en los anticuerpos biespecíficos de la invención: por un lado, se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, es decir, la molécula de Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Esta molécula de Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (vlvh). Por otro lado, cuando se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, la molécula de Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1). Esta molécula de Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (clch¹).

Un "fragmento Fab monocatenario" o "scFab" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un enlazador, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho enlazador tienen uno de los siguientes órdenes en sentido N terminal a C terminal: a) VH-CH1-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CH1, c) VH-CL-enlazador-VL-CH1 o d) VL-CH1-enlazador-VH-CL; y en el que dicho enlazador es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferentemente entre 32 y 50 aminoácidos. Dichos fragmentos Fab monocatenarios a) VH-CH1-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CH1, c) VH-CL-enlazador-VL-CH1 y d) VL-CH1-enlazador-VH-CL se estabilizan por medio del enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. Además, se podrían estabilizar además estas moléculas de Fab monocatenario mediante la generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, la posición 44 en la cadena pesada variable y la posición 100 en la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat). El término "extremo N" indica el último aminoácido del extremo N. El término "extremo C" indica el último aminoácido del extremo C.

Por "fusionados" o "conectados" se entiende que los componentes (por ejemplo, una molécula de Fab y una subunidad del dominio Fc) se unen mediante enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más enlazadores peptídicos.

El término "enlazador" como se usa en el presente documento se refiere a un enlazador peptídico y es preferentemente un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 5 aminoácidos, preferentemente con una longitud de 5 a 100, más preferentemente de 10 a 50 aminoácidos. En un modo de realización, dicho enlazador peptídico es (GxS)n o (GxS)nGm, siendo G = glicina, S = serina, y (x = 3, n= 3, 4, 5 o 6, y m= 0, 1, 2 o 3) o (x = 4,n= 2, 3, 4 o 5 y m= 0, 1,2 o 3), preferentemente x = 4 y n= 2 o 3, más preferentemente siendo x = 4, n= 2. En un modo de realización, dicho enlazador peptídico es (G4S)2.

El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), ó (IgD), £ (IgE), y (IgG) o p (IgM), algunos de los que se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, Y¹(IgG¹), Y²(IgG²), Y3 (lgG3), Y4 (IgG4), a¹(IgA¹) y a²(IgA²). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados ^kappa(k) ^{y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina}consiste esencialmente en dos moléculas de Fab y un dominio Fc enlazados por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

Como se usa en el presente documento, el término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de una molécula de unión a antígeno que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o todo un antígeno. Cuando un antígeno es grande, una molécula de unión a antígeno solo se puede unir a una parte particular del antígeno, denominándose dicha parte epítopo. Por ejemplo, se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, mediante uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente, normalmente preparado mediante técnicas de ADN recombinante. Son preferentes los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable de conejo y una región constante humana. Otras formas preferentes de "anticuerpos quiméricos" englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado de la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente en relación con la unión a C1q y/o unión al receptor Fc (FcR). Dichos anticuerpos quiméricos también se denominan "anticuerpos de intercambio de clase". Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas de ADN recombinante y transfección génica convencionales y son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; las patentes de EE. UU. n.os 5.202.238 y 5.204.244.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes de intercalación); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor Fc, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos mediante células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques.

Se entiende que el término "mutación de aminoácidos" como se usa en el presente documento engloba sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones de aminoácidos. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a un receptor Fc o asociación incrementada con otro péptido. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Las mutaciones de aminoácidos particulares son sustituciones de aminoácidos. Para el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fc, son preferentes, en particular, las sustituciones de aminoácidos no conservadoras, es decir, reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones de aminoácidos incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida a sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido mediante procedimientos distintos a la genomanipulación, tales como modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación de aminoácidos. Por ejemplo, una sustitución de prolina en la posición 329 del dominio Fc con glicina se puede indicar como 329G, G329, G³²⁹, P329G o Pro329Gly.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Se usa el término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG podrían variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Una "subunidad" de un dominio Fc como se usa en el presente documento se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que puede crear una autoasociación estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y un dominio constante CH3 de IgG.

Una "modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o previene la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad del dominio Fc con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la asociación como se usa en el presente documento, incluye, en particular, modificaciones separadas realizadas en cada una de las dos subunidades del dominio Fc que se desean asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en las que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades del dominio Fc. Por ejemplo, una modificación que promueve la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas de las subunidades del dominio Fc para hacer que su asociación sea estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. Por tanto, se produce la (hetero)dimerización entre un polipéptido que comprende la primera subunidad del dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad del dominio Fc, que podrían no ser idénticos en el sentido de que los otros componentes fusionados a cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no sean los mismos. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación de aminoácidos en el dominio Fc, específicamente una sustitución de aminoácidos. En un modo de realización particular, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación de aminoácidos separada, específicamente una sustitución de aminoácidos, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.

"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Los términos "célula huésped", "línea celular huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede que no sea completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Como también se menciona para los anticuerpos quiméricos y humanizados de acuerdo con la invención, el término "anticuerpo humano" como se usa en el presente documento comprende dichos anticuerpos que se modifican en la región constante para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente en relación con la unión a C1q y/o unión a FcR, por ejemplo, mediante "intercambio de clase", es decir, cambio o mutación de partes de Fc (por ejemplo, de IgG1 a IgG4 y/o mutación IgG1/IgG4).

Se pretende que el término "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados de una célula huésped, tal como una célula NS0 o CHO o de un animal (por ejemplo, un ratón), que sea transgénico para los genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados empleando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en forma reordenada. Los anticuerpos humanos recombinantes de acuerdo con la invención se han sometido a una hipermutación somática in vivo. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y están relacionadas con las secuencias de VH y VL de la estirpe germinal humana, pueden no existir de forma natural en el repertorio de la estirpe germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos de aminoácido que aparecen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En un modo de realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) se corresponden con las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las f R se corresponden con las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Otras formas de "anticuerpos humanizados" englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente de la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente en relación con la unión a C1q y/o unión al receptor Fc (FcR).

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis ^{HVR; tres en el}Vh ^(H1,h2, ^{H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden, en general, residuos de}aminoácido de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo las últimas las de variabilidad de secuencia más alta y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Los bucles hipervariables ejemplares aparecen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Las CDR ejemplares (CDR-L¹, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) aparecen en los residuos de aminoácido 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen solapamientos o subconjuntos de residuos de aminoácido cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y usa en el presente documento. Los residuos de aminoácido apropiados que engloban las CDR, como se define en cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla A como comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán en función de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA A. Definiciones de CDR1

1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla A es de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).

2 "AbM" con una "b" minúscula, como se usa en la tabla A, se refiere a las CDR como se define por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.

Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para las secuencias de la región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar de forma inequívoca este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin dependencia de ningún dato experimental más allá de la secuencia por sí misma. Como se usa en el presente documento, la "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de las posiciones de residuo de aminoácido específicas en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden, en general, los residuos de aminoácido que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son los residuos que entran en contacto con el antígeno. Las SDR están contenidas en regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) aparecen en los residuos de aminoácido 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más molécula(s) heteróloga(s), incluyendo, pero sin limitarse a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su medio natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, mediante electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (iEf ), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su medio natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a DR5 y un anticuerpo para FAP" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos del mismo), incluyendo dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades insignificantes. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; estando descritos en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no se conjuga con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.

Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

"Sin reactividad cruzada sustancial" significa que una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) no reconoce o se une específicamente a un antígeno diferente del antígeno diana real de la molécula (por ejemplo, un antígeno relacionado estrechamente con el antígeno diana), en particular, cuando se compara con ese antígeno diana. Por ejemplo, un anticuerpo se puede unir en menos de aproximadamente un 10 % a menos de aproximadamente un 5 % a un antígeno diferente del antígeno diana real, o se puede unir a dicho antígeno diferente del antígeno diana real en una cantidad que consiste en menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 % 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % o 0,1 %, preferentemente menos de aproximadamente un 2 %, 1 % o 0,5 %, y lo más preferentemente menos de aproximadamente un 0,2 % o 0,1 % de antígeno diferente del antígeno diana real.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido de una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, en la que se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen mediante el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como emparejamientos idénticos mediante el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no sea tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

El término "receptor de muerte 5 (DR5)", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier DR5 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba el DR5 no procesado "de longitud completa", así como cualquier forma de DR5 que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de DR5, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de un DR5 humano ejemplar se muestra en SEQ ID NO.:155.

El término "proteína de activación de fibroblastos (FAP)", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier FAP natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba la FAP no procesada "de longitud completa", así como cualquier forma de FAP que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de FAP, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. Preferentemente, un anticuerpo anti-FAP de la invención se une al dominio extracelular de FAP. La secuencia de aminoácidos de los ectodominios de FAP humana, murina y de macaco cangrejero (con una marca de poli-lisina C terminal y 6x His) se muestran en SEQ ID NO.:156, SEQ ID NO.:157 y SEQ iD NO.:158 respectivamente.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, la prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la reducción de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de las metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o atenuación de la enfermedad y la remisión o el pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término cáncer como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de tipo bronquioloalveolar, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma endometrial, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de partes blandas, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores de la médula espinal, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisario y sarcoma de Ewing, incluyendo versiones resistentes al tratamiento de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007).) Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

El término "sitio de unión a antígeno de un anticuerpo", cuando se usa en el presente documento, se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La porción de unión a antígeno de un anticuerpo comprende residuos de aminoácido de las "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las regiones "estructurales" o "FR" son aquellas regiones del dominio variable distintas de los residuos de la región hipervariable como se define en el presente documento. Por lo tanto, los dominios variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo comprenden desde el extremo N al C los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDr 3 y FR4. Especialmente, el Cd R3 de la cadena pesada es la región que más contribuye a la unión a antígeno y define las propiedades del anticuerpo. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y/o los residuos de un "bucle hipervariable".

La especificidad de los anticuerpos se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo de un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos. Los "anticuerpos biespecíficos" de acuerdo con la invención son anticuerpos que tienen dos especificidades de unión a antígeno diferentes. Los anticuerpos de la presente invención son específicos para dos antígenos diferentes, es decir, DR5 como primer antígeno y FAP como segundo antígeno.

El término anticuerpo "monoespecífico" como se usa en el presente documento indica un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión, de los que cada uno se une al mismo epítopo del mismo antígeno.

El término anticuerpo "biespecífico" como se usa en el presente documento indica un anticuerpo que tiene al menos dos sitios de unión, de los que cada uno se une a epítopos diferentes del mismo antígeno o de un antígeno diferente.

El anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En el presente documento se proporciona un anticuerpo biespecífico, con especificidades de unión para FAP y DR5. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de DR5. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos con respecto a las células que expresen DR5. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tengan especificidades diferentes (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) y la genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas con Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

En el presente documento también se incluyen anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende al menos un sitio de unión a antígeno que se une a FAP o a DR5, así como a otro antígeno diferente (véase el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

El término "-valente" como se usa en la presente solicitud indica la presencia de un número específicado de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son al menos "bivalentes" y pueden ser "trivalentes" o "multivalentes" (por ejemplo, "tetravalentes" o "hexavalentes").

Los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de unión y son biespecíficos. Es decir, los anticuerpos pueden ser biespecíficos incluso en casos donde haya más de dos sitios de unión (es decir, que el anticuerpo sea trivalente o multivalente). Los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios multivalentes, diacuerpos y triacuerpos, así como anticuerpos que tienen la estructura de dominio constante de anticuerpos de longitud completa a los que se unen otros sitios de unión a antígeno (por ejemplo, Fv monocatenario, un dominio VH y/o un dominio VL, Fab o (Fab)²) por medio de uno o más enlazadores peptídicos. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa de una única especie, o ser quimerizados o estar humanizados.

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se une. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se unen funcionalmente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

El término "aminoácido" como se usa en la presente solicitud indica el grupo de carboxi a-aminoácidos naturales que comprende alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V).

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo de células" se usan de manera intercambiable y todas dichas designaciones incluyen la descendencia. Por tanto, las palabras "transfectantes" y "células transfectadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados de la misma independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la descendencia puede que no sea exactamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o accidentales. Se incluye la descendencia variante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la célula transformada originalmente.

Como se usa en el presente documento, el término "unión" o "unión específica" se refiere a la unión del anticuerpo a un epítopo del antígeno en un ensayo in vitro, preferentemente en un ensayo de resonancia de plasmón superficial (RPS, BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno), kD (constante de disociación) y KD (kD/ka). Unión o unión específica significa una afinidad de unión (KD) de 10-8 mol/l o menos, preferentemente de 10-9 M a 10-13 mol/l.

La unión del anticuerpo al receptor de muerte se puede investigar mediante un ensayo en BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno), kD (constante de disociación) y KD (kD/ka).

El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipeptídico que se pueda unir específicamente a un anticuerpo. En determinados modos de realización, el determinante epítopo incluye agrupamientos de moléculas químicamente activos en la superficie, tales como aminoácidos, cadenas laterales glucídicas, fosforilo o sulfonilo y, en determinados modos de realización, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que se une por un anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación", en particular, con el prefijo "glucol-", así como el término "genomanipulación de la glucosilación" incluyen cualquier manipulación del patrón de glucosilación de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación de la glucosilación incluye la genomanipulación metabólica de la maquinaria de glucosilación de una célula, incluyendo manipulaciones genéticas de las vías de síntesis de oligosacáridos para lograr la glucosilación alterada de las glucoproteínas expresadas en las células. Además, la genomanipulación de la glucosilación incluye los efectos de las mutaciones y del medio celular sobre la glucosilación. En un modo de realización, la genomanipulación de la glucosilación es una alteración en la actividad de glucosiltransferasa. En un modo de realización particular, la genomanipulación da como resultado una actividad de glucosaminiltransferasa y/o actividad de fucosiltransferasa alterada.

II. Composiciones y procedimientos

En un aspecto, la invención se basa en anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno específico para el receptor de muerte 5 (DR5) para TRAIl y un segundo sitio de unión a antígeno específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP). En otro modo de realización, se proporcionan anticuerpos novedosos que seleccionan DR5. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el tratamiento o diagnóstico de cáncer.

A. Anticuerpos biespecíficos ejemplares que se unen a DR5 y a FAP

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos biespecíficos aislados que se unen a DR5 y a FAP. Los restos de unión a FAP se han descrito en el documento WO 2012/020006. Los restos de unión a FAP de particular interés que se van a usar en los anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP se indican en los modos de realización a continuación.

En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP reticula específicamente los receptores de muerte y se induce la apoptosis de la célula diana. La ventaja de estos anticuerpos biespecíficos agonistas para los receptores de muerte sobre los anticuerpos que seleccionan los receptores de muerte convencionales es la especificidad de la inducción de la apoptosis solo en el sitio donde se expresa la FAP. Como se explica anteriormente, los autores de la presente invención desarrollaron restos de unión a DR5 novedosos con propiedades superiores en comparación con las proteínas de unión a DR5 conocidas que se pueden incorporar en los anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP novedosos y ventajosos.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que se une al receptor de muerte 5 (DR5) y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP) que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:96, SEQ ID NO.:98, SEQ ID NO.:104 y SEQ ID NO.:108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:99, SEQ ID NO.:105, SEQ ID NO.:109 y SEQ ID NO.:97;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9 y SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10 y SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11 y SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12 y SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13 y SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14 y SEQ ID NO.:38.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

En un aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:21; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:21; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:25;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:21; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:25;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:21; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:27;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:27;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:25;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una a cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:25;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:75;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:83;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:84;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:86;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:87

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:75;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:83;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:84;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:86;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:87

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:96;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:99;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:96;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:99;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:104;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO:105;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:104;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO:105;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO:109;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO:109;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP, que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:98;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:97;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:98;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:97;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:25;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:27;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 14.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:25;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:27;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:33;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:35;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:38.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5 que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:7 y SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:100 y SEQ ID NO.:101; SEQ ID NO.:102 y SEQ ID NO.:103; SEQ ID NO.:106 y SEQ ID NO.:107; SEQ ID NO.:94 y SEQ ID NO.:95;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:15 y s Eq ID NO.:39; y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:16 y SEQ ID NO.:40.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:24; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:24; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:24; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:24; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:29; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:29; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:30; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:30; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:31; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:31; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:32; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:32; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:30; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:30; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:31; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:31; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:82 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:85; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:82 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:85; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:100 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:101; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:100 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:101; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:102 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:103; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:102 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:103; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:106 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:107; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:106 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:107; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:94 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:95; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:94 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:95; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:39 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:40.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:151.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:152.

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una región constante de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:153.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:151, en la que se ha retirado la lisina C terminal.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:152, en la que se ha retirado la lisina C terminal.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende un primer anticuerpo que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, comprendiendo dicho primer anticuerpo una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable de SEQ ID NO.:8, y una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO.:151 o SEQ ID NO.:152, y una región constante de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:153, y un segundo anticuerpo específico para FAP que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se define en cualquiera de los modos de realización anteriores. En un modo de realización, se ha retirado la lisina C terminal de la secuencia de aminoácidos de dicha región constante de la cadena pesada.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende un primer anticuerpo que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, comprendiendo dicho primer anticuerpo una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable de SEQ ID NO.:8, y una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO.:151 o SEQ ID NO.:152, y una región constante de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:153, y un segundo anticuerpo específico para FAP que comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:15 y una cadena ligera variable de SEQ iD NO.:16.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:131, SEQ ID NO.:132 y SEQ ID NO.:124.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:133, SEQ ID NO.:132 y SEQ ID NO.:124.

En un modo de realización preferente, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:134, SEQ ID NO.:132 y SEQ ID NO.:124.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:262, SEQ ID NO.:263 y SEQ ID NO.:132.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:135, SEQ ID NO.:136 y SEQ ID NO.:137.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:138, SEQ ID NO.:139 y SEQ ID NO.:137.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:274, SEQ ID NO.:275, y SEQ ID NO.:137.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:276, SEQ ID NO.:277, y SEQ ID NO.:132.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:278, SEQ ID NO.:279 y SEQ ID NO.:132.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:142, SEQ ID NO.:143, SEQ ID NO.:124 y SEQ ID NO.:132.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:145, SEQ ID NO.:146, SEQ ID NO.:124 y SEQ ID NO.:132.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:144, SEQ ID NO.:143, SEQ ID NO.:124 y SEQ ID NO.:132.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende SEQ ID NO.:159, SEQ ID NO.:160, SEQ ID NO.:161 y SEQ ID NO.:162.

En otro aspecto, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5 que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7, y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP que comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:15 y una cadena ligera variable de SEQ ID NO.:16.

En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a FAP y a DR5. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.:7. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO.:7, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5 que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8, y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP que comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:15 y una cadena ligera variable de SEQ ID NO.:16.

En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a DR5 y a FAP. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.:8. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO:8, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP, que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5 que comprende una cadena ligera variable de SEQ ID NO.:8 y una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:7; y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a FAP y a DR5. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.:15. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO.:15, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP, que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5 que comprende una cadena ligera variable de SEQ ID NO.:8 y una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:7, y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a DR5 y a FAP. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.:16. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO:16, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente. En un modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En otro aspecto de la invención, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo humano.

B. Anticuerpos ejemplares que se unen a DR5

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de anticuerpo que se unen a DR5. Estos anticuerpos agonistas para los receptores de muerte tienen propiedades superiores en comparación con las proteínas de unión a DR5 conocidas que se pueden incorporar en anticuerpos biespecíficos novedosos y ventajosos que seleccionan DR5 y un segundo antígeno.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5), que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(d) una cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una cadena ligera de SEQ ID NO.:5; y

(f) una cadena ligera de SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:99, SEQ ID NO.:105, SEQ ID NO.:109 y SEQ ID NO.:97.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5), que comprende (a) una cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una cadena pesada SEQ ID NO.:2;

(c) una cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

(d) una cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una cadena ligera de SEQ ID NO.:6.

En un aspecto, se divulga un anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5), que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una cadena ligera de SEQ ID NO.:21; y

(f) una cadena ligera de SEQ ID NO.:22.

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:25;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:21; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22.

En un aspecto, se divulga un anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5), que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:17;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:27;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22.

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:18;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22.

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:25;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:19;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:20;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:22.

En un aspecto, se divulga un anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5), que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:75;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:83;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:84;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:86;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:28;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:87.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5), que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:96;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:99.

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:104;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO:105.

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 109.

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:98;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:97.

En un modo de realización, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:7 y SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:82 y SEQ ID NO.:85; SEQ ID NO.:100 y SEQ ID NO.:101; SEQ ID NO.:102 y SEQ ID NO.:103; SEQ ID NO.:106 y SEQ ID NO.:107; SEQ ID NO.:94 y SEQ ID NO.:95.

En un modo de realización, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:24.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:24.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:29.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:30.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:31.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:32.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:26 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:30.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:23 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:31.

En un modo de realización, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:82 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:85.

En un modo de realización, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:100 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:101.

En un modo de realización, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:102 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:103.

En un modo de realización, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:106 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:107.

En un modo de realización, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:94 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:95.

En otro aspecto, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7.

En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero el anticuerpo que se une a DR5 que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a DR5. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.:7. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo que se une a DR5 comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 7, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, el anticuerpo que se une al receptor de muerte 5 (DR5) comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8.

En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo que se une a DR5 que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a DR5. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO.:8. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo que se une a DR5 comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 8, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a un segundo antígeno, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente. En un modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a un segundo antígeno, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente y en el que el anticuerpo tiene un formato como se indica para los anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en la sección C a continuación. En un modo de realización, se proporciona dicho anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a un segundo antígeno que comprende un VH como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los modos de realización proporcionados anteriormente, y que comprende una o más modificaciones en el dominio Fc como se indica para los anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en las secciones D y E a continuación.

En otro aspecto de la invención, un anticuerpo que se une a DR5 de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un modo de realización, dicho anticuerpo que se une a DR5 de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo humano.

C. Formatos ejemplares de anticuerpos biespecíficos que se unen a DR5 y a FAP

En un modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP comprende un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un Fv, Fab, Fab', scFv, xFab, scFab, diacuerpo o fragmento F(ab')². En otro modo de realización, el anticuerpo comprende un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.

Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son al menos bivalentes y pueden ser trivalentes o multivalentes, por ejemplo, tetravalentes o hexavalentes.

El anticuerpo biespecífico de la invención comprende un dominio Fc, al menos un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y al menos un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab.

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, al menos un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y al menos un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que al menos uno de los fragmentos Fab se conecta a la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de la cadena ligera (VLCL) y al menos un fragmento Fab se conecta a la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de la cadena pesada (VHCH1).

En cualquiera de los modos de realización, los fragmentos Fab se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un enlazador peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos. Los enlazadores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los enlazadores peptídicos no inmunogénicos adecuados incluyen, por ejemplo, los enlazadores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, siendo "n", en general, un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4. Un enlazador peptídico adecuado en particular para fusionar las cadenas ligeras de Fab del primer y del segundo resto de unión a antígeno entre sí es (G4S)2. Un enlazador peptídico ejemplar adecuada para conectar las cadenas pesadas de Fab del primer y del segundo resto de unión a antígeno es EPKSC(D)-(G4S)2 (SEQ ID NO.: 318). Adicionalmente, los enlazadores pueden comprender (una porción de) una región bisagra de inmunoglobulina. En particular, cuando un resto de unión a antígeno se fusiona al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede fusionar por medio de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un enlazador peptídico adicional.

Preferentemente, dichos anticuerpos biespecíficos son tetravalentes con dos sitios de unión, seleccionando cada uno FAP y DR5, respectivamente (formato 2+2). En otro modo de realización, dichos anticuerpos biespecíficos son tetravalentes con tres sitios de unión para DR5 y un sitio de unión para FAP (formato 3+1). Por ejemplo, se puede lograr el formato 3+1 a través de la fusión de un fragmento Fab que selecciona FAP y un fragmento Fab que selecciona DR5 al extremo C de la cadena pesada de una molécula de IgG que tenga dos sitios de unión a DR5. Esto se describe con más detalle a continuación.

En otro modo de realización preferente, dichos anticuerpos biespecíficos son trivalentes (formato 2+1) con dos sitios de unión que seleccionan cada uno DR5 y un sitio de unión que selecciona FAP. Por ejemplo, se puede lograr el formato 2+1 a través de la fusión de un fragmento Fab que selecciona FAP al extremo C de la cadena pesada de una molécula de IgG que tenga dos sitios de unión a DR5, en el que la parte Fc del primer anticuerpo se modifica de acuerdo con la estrategia de botones en ojales como se indica a continuación.

En otro modo de realización preferente, dichos anticuerpos biespecíficos son bivalentes (formato 1+1), es decir, monovalentes para cada DR5 y FAP. Los anticuerpos bivalentes de la invención tienen un sitio de unión que selecciona DR5 y un sitio de unión que selecciona FAP. Por ejemplo, se puede lograr el formato 1 1 mediante la tecnología de Crossmab descrita en Schaefer et al. Proc Natl Acad Sci u Sa 2011; 108:11187-92 y como se indica a continuación.

Los formatos ejemplares de anticuerpos biespecíficos de la invención se dan en las figuras 25 y 28.

En el mismo se proporcionan formatos de anticuerpos biespecíficos diferentes que se unen a DR5 y a FAP que comprenden cualquiera de las secuencias de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores.

1. Anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en un formato 2+2

En un modo de realización preferente, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab.

Puesto que el anticuerpo biespecífico anterior es bivalente tanto para FAP como para DR5, con 2 sitios de unión, cada uno para FAP y DR5, este formato también se denomina formato "2+2". Las estructuras ejemplares de anticuerpos biespecíficos con un formato 2+2 se representa en la figura 28. Debido al intercambio de las regiones variables o bien de las regiones constantes, los fragmentos Fab anteriores también se denominan "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento".

En un modo de realización preferente, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de ambos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

En otro modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de ambos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5.

En un modo de realización preferente, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de ambos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

En otro modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de ambos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5.

Debido al intercambio de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, los fragmentos Fab de entrecruzamiento específicos para FAP comprenden cada uno una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Estos fragmentos Fab de entrecruzamiento también se denominan CrossFab (vlvh) y comprenden cada uno una cadena VLCH1 y una VHCL.

En un modo de realización preferente, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de ambos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

En otro modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de ambos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5.

Debido al intercambio de las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, los fragmentos Fab de entrecruzamiento específicos para FAP comprenden cada uno una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1). Estos fragmentos Fab de entrecruzamiento también se denominan CrossFab (clch¹) y comprenden una cadena VHCL y una VLCH1.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc al que se fusionan dos fragmentos Fab al extremo N y dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab. En un modo de realización, dos fragmentos Fab se fusionan al extremo N del dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana. En un modo de realización, los dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada.

En un modo de realización, dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP se conectan al dominio Fc por medio de un enlazador peptídico. En un modo de realización, dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para FAP se conectan al extremo C de la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de un enlazador peptídico. En un modo de realización de este tipo, dichos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para FAP se conectan al extremo C de la segunda subunidad (cadena CH3) del dominio Fc por medio de un enlazador peptídico.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5 (es decir, dos fragmentos Fab específicos para DR5) y

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, en los que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera.

En otro modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión (fragmentos Fab) específicos para DR5, en la que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera y

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP.

En un modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5 y

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, en los que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab.

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, en los que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab.

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, en los que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG.

En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG. En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la cadena pesada constante (CH1) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc de dicha molécula de IgG. En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la segunda subunidad (CH3) del dominio Fc de dicha molécula de IgG.

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, en los que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG.

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, en los que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG.

En otro modo de realización preferente, los dos fragmentos Fab específicos para FAP se fusionan a la molécula de IgG mediante un enlazador peptídico, preferentemente un enlazador peptídico que tiene una longitud de aproximadamente 10-30 aminoácidos. Preferentemente dicho enlazador peptídico es un enlazador (G4S)2 o (G4S)4.

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, en los que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico. En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la cadena pesada constante (CH1) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la segunda subunidad (CH3) del dominio Fc de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, en los que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la cadena pesada constante (CH1) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico. En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C de la segunda subunidad (CH3) del dominio Fc de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para DR5 y dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que al menos uno de los fragmentos Fab se fusiona a la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de la cadena ligera (VLCL) y al menos un fragmento Fab se conecta a la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de la cadena pesada (VHCH1).

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende

a) un dominio Fc,

b) dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5, en los que dichos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena ligera constante (CL) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc,

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende

a) un dominio Fc,

b) dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5, en los que dichos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena ligera constante (CL) al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc,

c) dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en los que los dos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena pesada constante (CH1) a la segunda subunidad (CH3) del dominio Fc.

En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5 se fusionan cada uno al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana. En un modo de realización, los dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada.

En un modo de realización, dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP se conectan al dominio Fc por medio de un enlazador peptídico.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende

a) un dominio Fc,

b) dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5, en los que dichos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena pesada constante (CH1) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc,

c) dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en los que los dos fragmentos Fab se conectan en extremo N de la cadena ligera constante (CL) a la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende

a) un dominio Fc,

b) dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5, en los que dichos fragmentos Fab se conectan en el extremo C de la cadena pesada constante (CH1) al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc,

c) dos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en los que los dos fragmentos Fab se conectan en el extremo N de la cadena ligera constante (CL) al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc.

Anticuerpos ejemplares con un formato 2+2

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, que comprende una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6; y

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, que comprenden

una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 11;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 12;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 14;

en los que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6; y

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, que comprenden

una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:10;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:12;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:13;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:14;

en los que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, que comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable de SEQ ID NO.:8; y

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16, en los que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16, en los que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

En otro modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico de la invención comprende una modificación en la parte Fc de la molécula de IgG, como se indica a continuación.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico con un formato 2+2 como se describe anteriormente que comprende dos cadenas VH (DR5)-parte Fc - VH (fap) -CL de SEQ ID NO.: 131, dos cadenas ligeras kappa VL (DR5) de SEQ ID NO.:132 y dos cadenas VLCH1 (FAP) de SEQ ID NO.:124.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico con un formato 2+2 como se describe anteriormente que comprende dos cadenas VH (DR5)-parte Fc - Vh (fap) -CL de SEQ ID NO.: 133, dos cadenas ligeras kappa VL (DR5) de SEQ ID NO.:132 y dos cadenas VLCH1 (FAP) de SEQ ID NO.:124.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico con un formato 2+2 como se describe anteriormente que comprende dos cadenas VL (DR5)-parte Fc - Vh (fap) -CL de SEQ ID NO.: 134, dos cadenas ligeras kappa VL (DR5) de SEQ ID NO.:132 y dos cadenas VLCH1 (FAP) de SEQ ID NO.:124.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico con un formato 2+2 como se describe anteriormente que comprende dos cadenas VL (dr5)-CH1- parte Fc -VH(fap)-CH1 de SEQ ID NO. 135, dos cadenas VH(dr5) -CL de SEQ ID NO.:136 y dos cadenas ligeras kappa VL (fap) de SEQ ID NO.:137.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico con un formato 2+2 como se describe anteriormente, que comprende dos cadenas VH (dr5) CL- Fc- enlazador peptídico-VH(FAP) - CH1 de SEQ ID NO.:138, dos cadenas VL(dr5) -CH1 de SEQ ID NO.:139 y dos cadenas ligeras kappa VL (fap) de SEQ ID NO.:137.

2. Anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en un formato 2+1

un dominio Fc,

dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5,

y un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab. Puesto que los anticuerpos biespecíficos anteriores son trivalentes con un sitio de unión para FAP y dos sitios de unión para DR5, este formato también se denomina formato "2+1". De ahí que los anticuerpos biespecíficos proporcionados en la presente sección sean bivalentes para DR5 y monovalentes para FAP.

Una estructura ejemplar de un anticuerpo biespecífico con un formato 2+1 se representa en la figura 25 a) y b). Debido al intercambio de las regiones variables o bien de las regiones constantes, los fragmentos Fab anteriores también se denominan "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento". En un modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende

un dominio Fc,

dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5,

y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de los fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

un dominio Fc,

y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera del fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

Debido al intercambio de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, los fragmentos Fab de entrecruzamiento específicos para FAP comprenden cada uno una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Este fragmento Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (vlvh) y comprende una cadena VLCH1 y una VHCL.

un dominio Fc,

y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de ambos fragmentos Fab que comprenden el sitio de unión a antígeno específico para FAP.

Debido al intercambio de las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, los fragmentos Fab de entrecruzamiento específicos para FAP comprenden cada uno una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (c H1). Este fragmento Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (clch¹) y comprende una cadena VHCL y una VLCH1.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc al que se fusionan dos fragmentos Fab al extremo N.

En un modo de realización, dos fragmentos Fab se fusionan al extremo N del dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada.

Anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en un formato 2+1 con proteína de unión a FAP fusionada al extremo C

En un modo de realización, los dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización, un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para FAP se fusiona al extremo C de la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de un enlazador peptídico. En un modo de realización de este tipo, dicho fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP se fusiona al extremo C de la segunda subunidad (cadena CH3) del dominio Fc por medio de un enlazador peptídico. Una estructura ejemplar de un anticuerpo biespecífico para DR5-FAP en un formato 2+1 con la proteína de unión a FAP fusionada al extremo C se representa en la figura 25 a).

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión (fragmentos Fab) específicos para DR5 y b) un fragmento Fab específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera.

b) un fragmento Fab específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab.

b) un fragmento Fab específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab.

En un modo de realización preferente, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende

b) un fragmento Fab específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera, en el que el fragmento Fab se fusiona a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG.

En un modo de realización, dicho fragmento Fab específico para FAP de b) se fusiona al extremo C de la primera o segunda subunidad del dominio Fc de dicha molécula de IgG. En un modo de realización, dicho fragmento Fab de b) se fusiona al extremo C de la segunda subunidad (CH3) del dominio Fc de dicha molécula de IgG.

b) un fragmento Fab específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, en el que el fragmento Fab se fusiona a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG. En un modo de realización, dicho fragmento Fab específico para FAP de b) se fusiona al extremo C de la primera o segunda subunidad del dominio Fc de dicha molécula de IgG. En un modo de realización, dicho fragmento Fab de b) se fusiona al extremo C de la segunda subunidad (CH3) del dominio Fc de dicha molécula de IgG.

b) un fragmento Fab específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, en el que el fragmento Fab se fusiona a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG. En un modo de realización, dicho fragmento Fab específico para FAP de b) se fusiona al extremo C de la primera o segunda subunidad del dominio Fc de dicha molécula de IgG. En un modo de realización, dicho fragmento Fab de b) se fusiona al extremo C de la segunda subunidad (CH3) del dominio Fc de dicha molécula de IgG.

Anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en un formato 2+1 con proteína de unión a FAP fusionada al extremo N

En otro modo de realización, un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5, un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización, otro fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5 se fusiona al extremo N del fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5 de la molécula de IgG por medio de un enlazador peptídico. Una estructura ejemplar de un anticuerpo biespecífico para DR5-FAP en un formato 2+1 con la proteína de unión a FAP fusionada al extremo N se representa en la figura 25 b).

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión (fragmento Fab) específico para DR5 y un sitio de unión (fragmento Fab) específico para FAP, en la que el fragmento Fab específico para FAP es un fragmento Crossfab (es decir, se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera),

b) un fragmento Fab específico para DR5.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión específico para DR5 y un sitio de unión específico para FAP, en la que el fragmento Fab específico para FAP es un fragmento CrossFab (vlvh) (es decir, se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera),

b) un fragmento Fab específico para DR5.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión específico para DR5 y un sitio de unión específico para FAP, en la que el fragmento Fab específico para FAP es un fragmento CrossFab (clch¹(es decir, se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera),

b) un fragmento Fab específico para DR5.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión específico para DR5 y un sitio de unión específico para FAP, en la que el fragmento Fab específico para FAP es un fragmento Crossfab (es decir, se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera),

b) un fragmento Fab específico para DR5, en el que dicho fragmento Fab se fusiona al extremo N de la cadena pesada o ligera variable de la molécula de IgG.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión (fragmento Fab) específico para DR5 y un sitio de unión específico para FAP, en la que el fragmento Fab específico para FAP es un fragmento CrossFab (vlvh) (es decir, se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera).

En un modo de realización, el fragmento Fab específico para DR5 de b) se fusiona al extremo N de la cadena pesada o ligera variable del fragmento Fab específico para DR5 de a).

En otro modo de realización preferente, el fragmento Fab específico para DR5 se fusiona a la molécula de IgG mediante un enlazador peptídico, preferentemente un enlazador peptídico que tiene una longitud de aproximadamente 10 - 30 aminoácidos. Preferentemente dicho enlazador peptídico es un enlazador (G4S)2 o (G4S)4.

3. Anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en un formato 3+1

un dominio Fc,

tres fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5,

y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab. Puesto que el anticuerpo biespecífico anterior es tetravalente con un sitio de unión para FAP y tres sitios de unión para DR5, este formato también se denomina formato "3+1". De ahí que las moléculas biespecíficas descritas en la presente sección sean trivalentes para DR5 y monovalentes para FAP.

Una estructura ejemplar de un anticuerpo biespecífico con un formato 3+1 se representa en la figura 25 c). Debido al intercambio de las regiones variables o bien de las regiones constantes, los fragmentos Fab anteriores también se denominan "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento".

un dominio Fc,

Debido al intercambio de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, el fragmento Fab de entrecruzamiento específico para FAP comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Este fragmento Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (vlvh) y comprende una cadena VLCH1 y una VHCL.

un dominio Fc,

tres fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

Debido al intercambio de las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, los fragmentos Fab de entrecruzamiento específicos para FAP comprenden cada uno una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1). Este fragmento Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (clch¹) y comprende una cadena VHCL y una VLCH1.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc al que se fusionan dos fragmentos Fab al extremo N y dos fragmentos Fab se fusionan al extremo C, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del fragmento Fab específico para FAP.

En un modo de realización, dos fragmentos Fab se fusionan al extremo N del dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana. En un modo de realización, los dos fragmentos Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada.

c) un fragmento Fab específico para DR5.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión (fragmentos Fab) específicos para DR5 y b) un fragmento Fab específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab.

c) un fragmento Fab específico para DR5.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión (fragmentos Fab) específicos para DR5 y b) un fragmento Fab específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab.

c) un fragmento Fab específico para DR5.

c) un fragmento Fab específico para DR5,

en el que los fragmentos Fab de b) y c) se fusionan al extremo C de la primera o segunda subunidad del dominio Fc de dicha molécula de IgG.

En un modo de realización, dichos dos fragmentos Fab de b) y c) se fusionan al extremo C de la segunda subunidad (CH3) del dominio Fc de dicha molécula de IgG.

c) un fragmento Fab específico para DR5,

en el que los fragmentos Fab de b) y c) se fusionan a la primera o segunda subunidad del dominio Fc de dicha molécula de IgG.

c) un fragmento Fab específico para DR5,

En otro modo de realización preferente, los dos fragmentos Fab de b) y c) de cualquiera de los modos de realización descritos en la presente sección se fusionan a la molécula de IgG mediante un enlazador peptídico, preferentemente un enlazador peptídico que tiene una longitud de aproximadamente 10 - 30 aminoácidos. Preferentemente dicho enlazador peptídico es un enlazador (G4S)2 o (g 4s )4.

4. Anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP en un formato 1+1

un dominio Fc,

un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5,

y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab. Puesto que el anticuerpo biespecífico anterior es bivalente con un sitio de unión para FAP y un sitio de unión para DR5, este formato también se denomina formato "1 1". De ahí que los anticuerpos biespecíficos descritos en la presente sección sean monovalentes para DR5 y monovalentes para FAP. Una estructura ejemplar de un anticuerpo biespecífico con un formato 1+1 se representa en la figura 25 d). Debido al intercambio de las regiones variables o bien de las regiones constantes, el fragmento Fab anterior también se denomina "fragmento cross Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento". La molécula de IgG en un formato 1+1 también se denomina formato de Crossmab (véase Schaefer et al. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:11187-92).

un dominio Fc,

un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5.

y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

un dominio Fc,

y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

un dominio Fc,

y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende un dominio Fc al que se fusionan dos fragmentos Fab al extremo N, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab. En un modo de realización, los dos fragmentos Fab se fusionan al extremo N del dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana. En un modo de realización, el fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5, el fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada.

En un modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión específico para DR5 y un sitio de unión específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de un brazo (fragmento Fab) de la molécula de IgG.

En un modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión específico para DR5 y un sitio de unión específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un brazo (fragmento Fab) de la molécula de IgG. Este formato de anticuerpos también se denomina CrossMab(VHVL).

En un modo de realización, se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un brazo (fragmento Fab) de la molécula de IgG que comprende el sitio de unión específico para FAP.

En un modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión específico para DR5 y un sitio de unión específico para FAP, en el que se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de un brazo (fragmento Fab) de la molécula de IgG. Este formato de anticuerpos también se denomina CrossMab(CH¹CL).

En un modo de realización, se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de un brazo (fragmento Fab) de la molécula de IgG que comprende el sitio de unión específico para FAP.

En un modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con un sitio de unión específico para DR5 y un sitio de unión específico para FAP, en el que se intercambian los dominios VH-CH1 y VL-CL completos de un brazo (fragmento Fab) de la molécula de IgG. Esto significa que al menos uno de los fragmentos Fab se fusiona al extremo N del dominio Fc por medio de la cadena ligera (VLCL). En un modo de realización, el otro fragmento Fab se fusiona al extremo N del dominio Fc por medio de la cadena pesada (VHCH1).

Este formato de anticuerpos también se denomina CrossMabFab. En un modo de realización, ambos fragmentos Fab se fusionan al extremo N del dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina.

D. Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor Fc y/o la función efectora

En un modo de realización preferente, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende una molécula de inmunoglobulina G (IgG) en la que se modifica la parte Fc. La parte Fc modificada tiene una afinidad de unión reducida por los receptores Fcy en comparación con una parte Fc natural.

El dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, comprendiendo cada subunidad del mismo los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de forma estable entre sí.

En un modo de realización de acuerdo con la invención, el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹. En otro modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular, la sustitución de aminoácidos S228P. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende las sustituciones de aminoácidos L235E y S228P y P329G. Esta sustitución de aminoácidos reduce el intercambio in vivo en el brazo Fab de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro modo de realización particular, el dominio Fc es humano. Una secuencia ejemplar de una región Fc de IgG¹humana se da en SEQ ID NO.: 151.

El dominio Fc confiere propiedades farmacocinéticas favorables a los anticuerpos biespecíficos de la invención, incluyendo una larga semivida en suero que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución en tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a una selección indeseable de los anticuerpos biespecíficos de la invención con respecto a células que expresen receptores Fc en lugar de con respecto a células que tengan el antígeno preferentes. En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención presenta afinidad de unión con respecto a un receptor Fc reducida y/o una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc (o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión con respecto a un receptor Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural (o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc de IgG¹natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural (o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc de IgGi natural). En un modo de realización, el dominio Fc (o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor Fc y/o induce una función efectora. En un modo de realización particular, el receptor Fc es un receptor Fcy. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc humano. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor Fc es un receptor Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcyRIIIa humano. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc inhibidor. En un modo de realización específico, el receptor Fc es un receptor Fcy humano inhibidor, más específicamente FcgRIIB humano. En un modo de realización, la función efectora es una o más de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un modo de realización particular, la función efectora es ADCC. En un modo de realización, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar al receptor Fc neonatal (FcRn) en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular, más de aproximadamente un 80 %, más en particular, más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgG¹natural (o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc de IgG¹natural) a FcRn.

En determinados modos de realización, se genomanipula el dominio Fc para que tenga afinidad de unión con respecto a un receptor Fc reducida y/o una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En modos de realización particulares, el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención comprende la mutación de uno o más aminoácidos que reduce la afinidad de unión del dominio Fc a un receptor Fc y/o la función efectora. Típicamente, la misma mutación de uno o más aminoácidos está presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, la mutación de aminoácidos reduce la afinidad de unión del dominio Fc a un receptor Fc. En un modo de realización, la mutación de aminoácidos reduce la afinidad de unión del dominio Fc a un receptor Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde hay más de una mutación de aminoácidos que reduce la afinidad de unión del dominio Fc al receptor Fc, la combinación de estas mutaciones de aminoácidos puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc a un receptor Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc genomanipulado presentan menos de un 20 %, en particular, menos de un 10 %, más en particular, menos de un 5 % de la afinidad de unión con respecto a un receptor Fc en comparación con los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización particular, el receptor Fc es un receptor Fcy. En algunos modos de realización, el receptor Fc es un receptor Fc humano. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc inhibidor. En un modo de realización específico, el receptor Fc es un receptor Fcy humano inhibidor, más específicamente FcgRIIB humano. En algunos modos de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor Fc es un receptor Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión con respecto a un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión con respecto a C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión con respecto al receptor Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la preservación de la afinidad de unión al dominio Fc a dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) a FcRn. El dominio Fc, o los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden dicho dominio Fc, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, se genomanipula el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención para que tenga una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos mediante células presentadoras de antígenos reducida, unión a linfocitos NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa inductora de la apoptosis reducida, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es una o más de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un modo de realización, la ADCC reducida es menor de un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o un anticuerpo biespecífico de la invención que comprenda un dominio Fc no genomanipulado).

En un modo de realización, la mutación de aminoácidos que reduce la afinidad de unión del dominio Fc a un receptor Fc y/o la función efectora es una sustitución de aminoácidos. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución de aminoácidos en una posición de E233, L234, L235, N297, P331 y P329. En un modo de realización más específico, el dominio Fc comprende una sustitución de aminoácidos en una posición de L234, L235 y P329. En algunos modos de realización, el dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos L234A y L235A. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgGi, en particular, un dominio Fc de IgG¹humana. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución de aminoácidos en la posición P329. En un modo de realización más específico, la sustitución de aminoácidos es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución de aminoácidos en la posición P329 y una sustitución de otros aminoácidos en una posición seleccionada de E233, L234, L235, N297 y P331. En un modo de realización más específico, la sustitución de otros aminoácidos es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones P329, L234 y L235. En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹, en particular, un dominio Fc de IgG¹humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones de aminoácidos suprime casi completamente la unión al receptor Fcy de un dominio Fc de IgG¹humana, como se describe en la publicación de patente PCT n.° WO 2012/130831 A1. El documento WO 2012/130831 A1 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades, tales como la unión al receptor Fc o las funciones efectoras.

Los anticuerpos IgG4 presentan una afinidad de unión reducida con respecto a los receptores Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con los anticuerpos IgG¹. De ahí que en algunos modos de realización, el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención sea un dominio Fc de IgG4, en particular, un dominio Fc de IgG4 humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición S228, específicamente la sustitución de aminoácidos S228P. Para reducir además su afinidad de unión con respecto a un receptor Fc y/o su función efectora, en un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición L235, específicamente la sustitución de aminoácidos L235e . En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición P329, específicamente la sustitución de aminoácidos P329G. En un modo de realización particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones de aminoácidos S228P, L235E y P329G. Dichos mutantes en dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor Fcy se describen en la publicación de patente PCT n.° WO 2012/130831 A1.

En un modo de realización particular, el dominio Fc que presenta afinidad de unión con respecto a un receptor Fc reducida y/o una función efectora reducida en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural es un dominio Fc de IgG¹humana que comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y opcionalmente P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones de aminoácidos S228P, L235E y opcionalmente P329G.

En determinados modos de realización, se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación de aminoácidos en la posición N297, en particular, una sustitución de aminoácidos que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D).

Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación de patente PCT n.° WO 2012/130831 A1, los dominios Fc con unión al receptor Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos del dominio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes en Fc incluyen mutantes en Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante en Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se pueden preparar dominios Fc mutantes mediante deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos se pueden verificar, por ejemplo, mediante secuenciación.

Se puede determinar fácilmente la unión a los receptores Fc, por ejemplo, mediante ELISA, o mediante resonancia de plasmón superficial (RPS) usando instrumentación estándar, tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores Fc, tales como los que se pueden obtener mediante expresión recombinante. En el presente documento se describe dicho ensayo de unión adecuado. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de los dominios Fc o las moléculas biespecíficas de unión a antígeno que comprenden un dominio Fc para los receptores Fc usando líneas celulares conocidas porque expresan receptores Fc particulares, tales como el receptor FcYlIIa que expresa linfocitos NK humanos.

La función efectora de un dominio Fc, o de los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc, se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica. En el presente documento se describe un ensayo adecuado para medir la ADCC. Se describen otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); la patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radiactivo (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CelITechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad de ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

En algunos modos de realización, se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que se genomanipula el dominio Fc para que tenga una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden unir a C1q y, de ahí que tengan actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

La siguiente sección describe modos de realización preferentes de los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor Fc y/o la función efectora.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, en la que el dominio Fc presenta afinidad de unión con respecto a un receptor Fc reducida y/o una función efectora reducida en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural y

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, en la que el dominio Fc comprende la sustitución de uno o más aminoácidos que reduce la unión a un receptor Fc y/o la función efectora.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, en la que dicha sustitución de uno o más aminoácidos es en una o más posiciones de L234, L235 y P329

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, en la que cada subunidad del dominio Fc comprende sustituciones de tres aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc activador o inhibidor y/o la función efectora, en la que dichas sustituciones de aminoácidos son L234A, L235A y P329G.

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, en la que cada subunidad del dominio Fc comprende sustituciones de tres aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc activador o inhibidor y/o la función efectora, en la que dichas sustituciones de aminoácidos son L234A, L235A y P329G y

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, que comprende una CDR1 de la cadena pesada que consiste en SEQ ID NO.:1;

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6;

en la que cada subunidad del dominio Fc comprende sustituciones de tres aminoácidos que reducen la unión a receptores Fc activadores e inhibidores y/o la función efectora, en la que dichas sustituciones de aminoácidos son L234A, L235A y P329G y

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, que comprenden

una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 10;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 11;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 12;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 13;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 14;

en los que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:⁶;

en la que cada subunidad del dominio Fc comprende sustituciones de tres aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc activador o inhibidor y/o la función efectora, en la que dichas sustituciones de aminoácidos son L234A, L235A y P329G y

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, que comprenden

una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 10;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:11;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 12;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 13;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 14;

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:⁶;

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, que comprenden

una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 10;

una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 11;

una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 12;

una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 13;

una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 14;

a) una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, que comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable de SEQ ID NO.:⁸;

b) dos fragmentos Fab específicos para FAP, que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 16, en los que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera, en los que los dos fragmentos Fab se fusionan a la cadena pesada constante de dicha molécula de IgG mediante un enlazador peptídico.

E. Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización

Los anticuerpos para DR5-FAP biespecíficos de la invención comprenden restos de unión a antígeno diferentes, fusionados a una u otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto, las dos subunidades del dominio Fc están comprendidas típicamente en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de los anticuerpos biespecíficos de la invención en la producción recombinante, será ventajoso, por tanto, introducir en el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana está en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una cavidad ("ojal") correspondiente en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que se pueda posicionar la protuberancia en la cavidad para promover la formación de un heterodímero y dificultar la formación de un homodímero. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un modo de realización particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos de la invención un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando, de este modo, una protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad que se puede posicionar en una cavidad en el dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando, de este modo, una cavidad en el dominio CH3 de la segunda subunidad en el que se puede posicionar la protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad.

Se pueden realizar la protuberancia y la cavidad alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, mediante mutagénesis específica de sitio o mediante síntesis de péptidos.

En un modo de realización específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 407 por un residuo de valina (Y407V). En un modo de realización, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de serina (T366S) y se reemplaza el residuo de leucina en la posición 368 por un residuo de alanina (L368A).

Aún en otro modo de realización, en la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, lo que estabiliza además el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos de aminoácido en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos de aminoácido cargados, de modo que la formación de un homodímero se vuelva electrostáticamente desfavorable, pero la heterodimerización electrostáticamente favorable.

En un modo de realización, un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores comprende una molécula de inmunoglobulina G (IgG) con dos sitios de unión específicos para DR5, en el que la parte Fc de la primera cadena pesada comprende un primer módulo de dimerización y la parte Fc de la segunda cadena pesada comprende un segundo módulo de dimerización que permite una heterodimerización de las dos cadenas pesadas de la molécula de IgG.

En otro modo de realización preferente, el primer módulo de dimerización comprende botones y el segundo módulo de dimerización comprende ojales de acuerdo con la estrategia de botones en ojales (véase Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, volumen 2, número 1, febrero de 1996, pp. 73-73(1)).

F. Secuencias de ácido nucleico, vectores y procedimientos de

La invención proporciona además polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une a DR5 como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo. Los polinucleótidos que codifican anticuerpos biespecíficos o los anticuerpos que se unen a DR5 de la invención se pueden expresar como un único polinucleótido que codifique toda la molécula biespecífica de unión a antígeno o todo el anticuerpo que se une a DR5 o como múltiples polinucleótidos (por ejemplo, dos o más) que se coexpresen. Se pueden asociar polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar un anticuerpo biespecífico funcional o un anticuerpo que se une a DR5. Por ejemplo, la porción de cadena ligera de un fragmento Fab se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción del anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5 que comprenda la porción de cadena pesada del fragmento Fab, una subunidad del dominio Fc y opcionalmente (parte de) otro fragmento Fab. Cuando se coexpresen, los polipéptidos de cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de cadena ligera para formar el fragmento Fab. En otro ejemplo, la porción del anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5 proporcionado en el mismo que comprende una de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) uno o más fragmentos Fab se podría codificar por un polinucleótido separado de la porción del anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5 proporcionado en el mismo que comprende la otra de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) un fragmento Fab. Cuando se coexpresan, las subunidades del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.

En un modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo biespecífico de la invención o un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena pesada variable como se muestra en SEQ ID NO 167, 175, 183, 191, 199, 207 y 209.

En un modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo biespecífico de la invención o un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena ligera variable como se muestra en SEQ ID NO 171, 179, 187, 195, 203, 208 y 210.

En otro modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de polipéptido como se muestra en SEQ ID NO 222, 224, ^{2 26}, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,252, 253, 254, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 264 y 265.

En un modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo que se une a DR5 de la invención o un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena pesada variable como se muestra en SEQ ID NO 167,175, 183, 191 y 199.

En un modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo que se une a DR5 de la invención o un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena ligera variable como se muestra en SEQ ID NO 171, 179, 187, 195 y 203.

En otro modo de realización, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo biespecífico de la invención o un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena pesada variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 167, 175, 183, 191, 199, 207 o 209.

En otro modo de realización, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo biespecífico de la invención o un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena ligera variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 171, 179, 187, 195, 203, 208 o ^{2 10}.

En otro modo de realización, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo que se une a DR5 de la invención o un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena pesada variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 167, 175, 183, 191 o 199.

En otro modo de realización, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo que se une a DR5 de la invención o un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena ligera variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 171, 179, 187, 195 o 203.

En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.

En otros objetivos, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención y a una célula huésped procariota o eucariota que comprende un vector de la presente invención. Además, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de modo que se produzca el anticuerpo.

G. Variantes de anticuerpos

En determinados modos de realización, se contemplan variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos biespecíficos y anticuerpos que se unen a DR5 proporcionados en el presente documento, además de las descritas anteriormente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5. Se pueden preparar variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une a DR5 introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5, o mediante síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

1. Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados aspectos de la divulgación, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen sustituciones de uno o más aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla B bajo el encabezamiento de "sustituciones conservadoras". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla B bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y, como se describe además a continuación, en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenia disminuida, o ADCC o CDC mejorada.

TABLA B

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(⁶) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenia reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrán retenido sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Se pueden realizar dichas alteraciones en "puntos calientes" de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDR (a-CDR), sometiendo a prueba el VH o VL variante resultante para determinar su afinidad de unión. La maduración de la afinidad mediante construcción y reselección a partir de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunos modos de realización de la maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpos con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se seleccionan en particular CDR-H3 y CDR-L3.

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones en una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de la HVR o SDR. En determinados modos de realización de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se remplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para la sustitución. Las variantes se pueden cribar para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.

2. Variantes de glucosilación

En determinados modos de realización, se altera un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une a DR5 proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en que se glucosila el anticuerpo. La adición o deleción de sitios de glucosilación a un anticuerpo se puede conseguir convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se cree o retire uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5 comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido al mismo. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden típicamente un oligosacárido biantenario ramificado que se une, en general, mediante un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une a DR5 de la invención para crear variantes de anticuerpos con determinadas propiedades mejoradas.

En un modo de realización, se proporcionan variantes de anticuerpos biespecíficos o variantes de anticuerpos que se unen a DR5 que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa en la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a pequeñas variaciones de secuencia en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2003/0157108 (Presta, F.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosilados" o "deficitarios en fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lee 13 CHO deficitarias en fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); la publicación de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento W o 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con genes inactivados, tales como el gen alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con genes inactivados (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO 2003/085107).

Las variantes de anticuerpos biespecíficos o las variantes de anticuerpos que se unen a DR5 también están provistas de oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo que se une a DR5 se biseca mediante GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpos biespecíficos o variantes de anticuerpos que se unen a DR5 pueden tener una fucosilación reducida y/o una función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).

3. Variantes de anticuerpos genomanipulados con cisteína

En determinados modos de realización, puede ser deseable crear anticuerpos biespecíficos o anticuerpos que se unen a DR5 genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "tioMab", en los que uno o más residuos de un anticuerpo biespecífico o anticuerpos que se unen a DR5 se sustituyen con residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos aparecen en sitios accesibles del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo que se une a DR5. Sustituyendo esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se posicionan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado. En determinados modos de realización, se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.

H. Procedimientos y composiciones recombinantes

Los anticuerpos biespecíficos y los anticuerpos que se unen a DR5 de la invención se pueden obtener, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican los anticuerpos biespecíficos o los anticuerpos que se unen a DR5 (o fragmentos), por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan e insertan en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un modo de realización, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan la secuencia codificante de un anticuerpo biespecífico (fragmento) o de un anticuerpo (fragmento) que se una a DR5 junto con señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica el anticuerpo biespecífico (fragmento) o un anticuerpo (fragmento) que se une a DR5 (es decir, la región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, finalizadores transcripcionales, intrones, regiones no traducidas en 5' y 3' y similares, no son parte de una región codificante. Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes en una única construcción de polinucleótido, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de polinucleótido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector de la presente invención puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan pos o cotraduccionalmente en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o bien no fusionadas a un polinucleótido que codifique el anticuerpo biespecífico (fragmento) o un anticuerpo (fragmento) que se una a DR5 de la invención, o variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo. Se produce una asociación funcional cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal manera que dispone la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptidos y un promotor asociado con la misma) se "asocian funcionalmente" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere en la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico, ni interfiere en la capacidad de que se transcriba el molde de ADN. Por tanto, una región promotora se asociaría funcionalmente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor pudiera efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirija una transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, se pueden asociar funcionalmente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. En el presente documento se divulgan promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción. Es conocida una variedad de regiones de control de la transcripción por los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor inmediato temprano, junto con el intrón A), virus de simio 40 (por ejemplo, el potenciador temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrado, tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovina y a-globina de conejo, así como otras secuencias que puedan controlar la expresión génica en células eucariotas. Otras regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles por tetraciclinas). De forma similar, es conocida una variedad de elementos de control de la traducción por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y terminación de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular un sitio interno de entrada al ribosoma o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otras características tales como un origen de replicación, y/o elementos de integración cromosómica, tales como repeticiones terminales largas (RTL) retrovíricas, o repeticiones terminales invertidas (RTI) víricas adenoasociadas (VAA).

Se pueden asociar regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, si se desea la secreción del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo que se une a DR5, se puede disponer el ADN que codifica una secuencia señal en dirección 5' del ácido nucleico que codifica un anticuerpo biespecífico de la invención o el anticuerpo que se une a DR5 de la invención o un fragmento del mismo. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas segregadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína creciente a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos segregados por células de vertebrado tienen, en general, un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma segregada o "madura" del polipéptido. En determinados modos de realización se usa el péptido señal natural, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está funcionalmente asociado con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir con la secuencia líder del activador del plasminógeno tisular (TPA) humano o p-glucuronidasa de ratón.

El ADN que codifica una secuencia de proteínas corta que se podría usar para facilitar la purificación posterior (por ejemplo, una marca de histidina) o contribuir al marcado del anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5 se puede incluir dentro o en los extremos del anticuerpo biespecífico (fragmento) o del anticuerpo (fragmento) que se une al polinucleótido que codifica DR5.

En otro modo de realización, se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. En determinados modos de realización, se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, descritas en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica (parte de) un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une a d R5 de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier clase de sistema celular que se pueda genomanipular para generar los anticuerpos biespecíficos o un anticuerpo que se una a DR5 de la invención o fragmentos de los mismos. Las células huésped adecuadas para replicar y para soportar la expresión de los anticuerpos biespecíficos o de los anticuerpos que se unen a d R5 son bien conocidos en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o transducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes del anticuerpo biespecífico o de los anticuerpos que se unen a DR5 para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular, cuando no se necesita glucosilación. Después de su expresión, se puede aislar el polipéptido de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos y levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adapten para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T, como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1). células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TR1 (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 y células FS4. Otras líneas celulares huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células dhfr- CHO (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, Nj ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo unas pocas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20).

Son conocidas en la técnica tecnologías estándar para expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o bien la ligera de un dominio de unión a antígeno, tal como un anticuerpo, se pueden genomanipular para que también expresen la otra cadena de anticuerpo, de modo que el producto expresado sea un anticuerpo que tenga tanto una cadena pesada como una ligera.

En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une a DR5 de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo que se une a DR5, y recuperar el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5 de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Los componentes del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo que se une a DR5 se fusionan genéticamente entre sí. Los anticuerpos biespecíficos o los anticuerpos que se unen a DR5 se pueden diseñar de modo que sus componentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia enlazadora. La composición y longitud del enlazador se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. Los ejemplos de secuencias enlazadoras entre componentes diferentes de anticuerpos biespecíficos se encuentran en las secuencias proporcionadas en el presente documento. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión, si se desea, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

En determinados modos de realización, los fragmentos Fab que forman parte del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo que se une a DR5 comprenden al menos una región variable de anticuerpo que se puede unir a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte de y derivar de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Se pueden construir anticuerpos no naturales usando síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprendan cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 para McCafferty).

Se puede usar cualquier especie animal de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o región variable en los anticuerpos biespecíficos o los anticuerpos que se unen a DR5 de la invención. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, dominios de unión a antígeno o regiones variables no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, de primate o humano. Si se pretende que el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5 sea para uso humano, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo sean de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o completamente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 para Winter). La humanización se puede lograr mediante diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a, (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin retención de residuos de la región estructural críticos (por ejemplo, los que son importantes para retener buenas funciones de afinidad de unión a antígeno o de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de la especificidad (SDR o a-CDR; los residuos críticos para la interacción anticuerpo-antígeno) no humanas en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos completos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana mediante el reemplazo de residuos superficiales. Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA ⁸⁶, 10029-10033 (1989); las patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describe el injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebamizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describe el "barajado de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, ^{61 - 68}(2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" para el barajado de FR). Se pueden producir anticuerpos humanos y regiones variables humanas usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivar de anticuerpos monoclonales humanos preparados mediante el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). También se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se haya modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de la región variable de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos (véase por ejemplo, Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Los fagos presentan típicamente fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab.

En determinados modos de realización, los fragmentos Fab útiles en la presente invención se genomanipulan para que tengan una afinidad de unión potenciada, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos divulgados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132066. La capacidad del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo que se une a d R5 de la invención de unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien a través de otras técnicas consabidas por un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema B iAc ORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o dominio variable que compita con un anticuerpo de referencia por su unión a un antígeno particular. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une mediante el anticuerpo de referencia. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," en Methods in Molecular Biology vol. ⁶⁶(Humana Press, Totowa, NJ). En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba antígeno inmovilizado en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo por su unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces, eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por su unión al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Los anticuerpos biespecíficos o los anticuerpos que se unen a DR5 preparados como se describe en el presente documento se pueden purificar mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5. Por ejemplo, para la purificación mediante cromatografía de afinidad de los anticuerpos biespecíficos de la invención, se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. Se pueden usar cromatografía de afinidad secuencial con proteína A o G y cromatografía de exclusión por tamaño para aislar un anticuerpo biespecífico esencialmente como se describe en los ejemplos. La pureza del anticuerpo biespecífico o el anticuerpo que se une a DR5 se puede determinar mediante cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos que incluyen electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión y similares.

I. Ensayos

Los anticuerpos biespecíficos que se unen a DR5 y a FAP y los anticuerpos que se unen a DR5 proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar para determinar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.

1. Ensayos de afinidad

La afinidad del anticuerpo biespecífico y del anticuerpo que se une a DR5 proporcionado en el mismo por DR5 y/o FAP se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos mediante resonancia de plasmón superficial (RPS), usando instrumentación estándar, tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores o proteínas diana, tales como los que se pueden obtener mediante expresión recombinante. De forma alternativa, la unión del anticuerpo biespecífico y del anticuerpo que se une a d R5 proporcionado en el mismo a DR5 y/o FAP se puede evaluar usando líneas celulares que expresan el receptor o antígeno diana particular, por ejemplo, mediante citometría de flujo (FACS). Un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión se describe en lo que sigue y en los ejemplos a continuación.

De acuerdo con un modo de realización, se mide la Kd mediante resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

Para analizar la interacción entre la porción Fc y los receptores Fc, se captura el receptor Fc recombinante con marca His mediante un anticuerpo anti-Penta His (Qiagen) inmovilizado en chips CM5 y se usan las construcciones biespecíficas como analitos. En resumen, se activan chips de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El anticuerpo anti-pPnta-His se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, a 40 pg/ml antes de su inyección a un caudal de 5 pl/min para lograr aproximadamente 6500 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Posteriormente, el receptor Fc se captura durante 60 s a 4 o 10 nM. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie por cuadruplicado de la construcción biespecífica (intervalo entre 500 nM y 4000 nM) en HBS-EP (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de 30 pl/min durante 120 s.

Para determinar la afinidad con respecto al antígeno diana, las construcciones biespecíficas se capturan mediante un anticuerpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare) que se inmoviliza en una superficie de chip de sensor CM5 activada como se describe para el anticuerpo anti-Penta-His. La cantidad final de proteína acoplada es de aproximadamente 12000 UR. Las construcciones biespecíficas se capturan durante 90 s a 300 nM. Los antígenos diana se hacen pasar a través de las cubetas de lectura durante 180 s a un intervalo de concentraciones de 250 a 1000 nM con un caudal de 30 pl/min. La disociación se supervisa durante 180 s.

Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigen sustrayendo la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Se usó la respuesta en estado estacionario para derivar la constante de disociación KD mediante ajuste de curvas no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y las velocidades de disociación (kdis) usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIACORE® T100, versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (KD) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).

2. Ensayos de unión y otros ensayos

En un aspecto, se somete a prueba un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une a DR5 de la invención para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, mediante procedimientos conocidos, tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc.

En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compita con un anticuerpo anti-FAP específico o un anticuerpo anti-DR5 específico por su unión a FAP o DR5, respectivamente. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que está unido por un anticuerpo específico anti-FAP o un anticuerpo específico anti-DR5. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," en Methods in MolecularBiology vol. ⁶⁶(Humana Press, Totowa, NJ). Se describen otros procedimientos en la sección de ejemplos.

3. Ensayos de actividad

En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos biespecíficos que se unen a DR5 y a FAP o anticuerpos que se unen a DR5 de los mismos que tengan actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, fragmentación del ADN, inducción de la apoptosis y lisis de células seleccionadas. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.

En determinados modos de realización, se somete a prueba un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo que se une a DR5 de la invención para determinar dicha actividad biológica. Los ensayos para detectar la lisis (por ejemplo, mediante medición de la liberación de LDH) o la apoptosis (por ejemplo, usando el ensayo de TUNEL) de las células son bien conocidos en la técnica. También se describen ensayos para medir la ADCC o CDC en el documento WO 2004/065540 (véase el ejemplo 1 en el mismo).

J. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP o de un anticuerpo que se une a DR5 como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo biespecífico o anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente ¹⁰residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; glúcidos, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión intersticial de fármacos, tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLEn Ex ®, Baxter International, Inc.). Se describen determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, en las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, se combina una sHASEGP con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo, según sea necesario, para la indicación particular que se trate, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos principios activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son, en general, estériles. Se puede conseguir fácilmente la esterilidad, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

K. Composiciones y procedimientos terapéuticos

Se puede usar cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que se unen a DR5 y a FAP y de los anticuerpos novedosos que se unen a DR5 proporcionados en el presente documento en procedimientos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a d R5 y a FAP para su uso en el tratamiento del cáncer. En determinados modos de realización, se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a fA p . En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es preferentemente un ser humano. En un modo de realización preferente, dicho cáncer es cáncer de páncreas o carcinoma colorrectal.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a DR5 para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo que se une a d R5 para su uso en el tratamiento del cáncer. En determinados modos de realización, se proporciona un anticuerpo que se une a DR5 para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une a DR5 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que se une a DR5. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es preferentemente un ser humano. En un modo de realización preferente, dicho cáncer es cáncer de páncreas o carcinoma colorrectal.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP en la fabricación o preparación de un medicamento. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo que se une a DR5 en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento del cáncer. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de un cáncer, que comprende administrar a un individuo que tiene cáncer una cantidad eficaz del medicamento. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar el cáncer. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene cáncer una cantidad eficaz de un anticuerpo biespecífico que se une a DR5 y a FAP o de un anticuerpo novedoso que se une a DR5. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano. En un modo de realización preferente, dicho cáncer es cáncer de páncreas o carcinoma colorrectal.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que se unen a DR5 y a FAP proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que se unen a DR5 y a FAP proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que se unen a DR5 y a FAP proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos que se unen a DR5 proporcionado en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos que se unen a DR5 proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos que se unen a DR5 proporcionado en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Se puede administrar un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo novedoso que se une a DR5 de la invención mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo, en parte, de si la administración es breve o prolongada. En el presente documento, se contemplan diversas pautas posológicas, incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones únicas o múltiples en diversos puntos de tiempo, administración con inyección intravenosa rápida e infusión pulsada.

Los anticuerpos biespecíficos o los anticuerpos novedosos que se unen a DR5 de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos de cabecera. Aunque no es necesario, el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo novedoso que se une a DR5 se formula opcionalmente con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y por las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y mediante cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación adecuada de un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo novedoso que se une a DR5 de la invención dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo novedoso que se une a DR5 se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, del tratamiento previo, de la anamnesis del paciente y de la respuesta al anticuerpo biespecífico o al anticuerpo novedoso que se une a DR5, y del criterio del médico responsable. El anticuerpo biespecífico o el anticuerpo novedoso que se une a DR5 se administra adecuadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo novedoso que se une a DR5 puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, por ejemplo, ya sea mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, en general, se mantendría el tratamiento hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo novedoso que se une a DR5 estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg. Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo biespecífico o del anticuerpo novedoso que se une a DR5). Se puede administrar una dosis de carga inicial más alta, seguido de una o más dosis más bajas. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La evolución de este tratamiento se supervisa fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que se puede llevar a cabo cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de, o además de, un anticuerpo biespecífico que se una a DR5 y a FAP o un anticuerpo novedoso que se una a DR5 de la invención.

L. Artículos de fabricación

En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es, por sí misma o combinada con otra composición, eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo novedoso que se une a DR5 de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo novedoso que se une a DR5 de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de, o además de, un anticuerpo biespecífico que se una a DR5 y a FAP o un anticuerpo novedoso que se una a DR5 de la invención.

III. EJEMPLOS

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo, para los propósitos de claridad de comprensión, no se deben interpretar las descripciones y ejemplos como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1: Un anticuerpo biespecífico agonista para el receptor de muerte DR5-FAP puede mediar la apoptosis de una línea celular por medio de reticulación mediante una segunda línea celular.

Un enfoque de la inducción de la apoptosis mediante la reticulación de los receptores de muerte, como DR5 (aparte de la reticulación por medio de un antígeno expresado por la célula tumoral), selecciona el estroma que rodea al tumor. En ese caso, el antígeno seleccionado no se presenta directamente por las células tumorales, sino por un segundo tipo de célula diferente. Un ejemplo para esta clase de antígeno sería FAP (proteína de activación de fibroblastos). Esta proteína se expresa en fibroblastos activados, ya que se encuentran en el estroma tumoral.

Para investigar las posibilidades de inducción selectiva de tumor de la apoptosis usando anticuerpos biespecíficos agonistas para los receptores de muerte que seleccionan DR5 humano y un antígeno del estroma tumoral, se generaron moléculas biespecíficas que consisten en una parte de IgG1 que reconoce DR5 y un scFv de unión a FAP que se fusiona al extremo C de la cadena pesada del anticuerpo. La secuencia de la IgG que selecciona DR5 se tomó de la secuencia de Drozitumab como se describe en el documento US2007 / 0031414 A1. La secuencia de la cadena pesada y ligera variable de los restos scFv de unión a FAP se tomó de moléculas de Fab anti-FAP (3F2 o 4G8) aisladas mediante presentación en fagos como se describe en el documento WO2012/020006A1. Los scFv para FAP se fusionan mediante un conector (G⁴S⁾²al extremo C de la cadena pesada o cadena ligera de IgG anti-DR5. Ambos anticuerpos anti-FAP se unen a epítopos diferentes en la proteína de activación de fibroblastos (FAP) y tienen reactividad cruzada con los antígenos humanos, murinos y de macaco cangrejero.

Tabla 1: Descripción de moléculas biespecíficas para DR5-FAP sometidas a prueba con fusión C terminal de scFv de unión a FAP a la cadena pesada o ligera de DR5. Se proporcionan la longitud del enlazador y conector y los rendimientos de purificación.

En este tipo de contexto, se han de usar dos líneas celulares diferentes para los ensayos de actividad in vitro: una línea celular (la línea celular diana) que debería expresar DR5 humano, tiene que ser competente en la apoptosis, pero no necesita expresar FAP. La segunda línea celular (la línea celular efectora) tiene que ser negativa para la apoptosis (mediante resistencia a la apoptosis o bien no expresando DR5), pero necesita expresar FAP en la superficie.

Una posible línea celular efectora que cumple los criterios deseados es la línea celular de fibroblastos humanos GM05389. Como se muestra en la figura 1a, esta línea celular expresa niveles significativos de FAP en comparación con la línea celular SW872, que solo mostró la expresión de FAP con la concentración de anticuerpos sometida a prueba más alta (10 pg/ml), pero no se somete a apoptosis mediante Drozitumab no reticulado como se observa en la figura 1b. Por lo tanto, esta línea celular parece ser una línea celular efectora potencial en un ensayo de apoptosis donde se induce la fragmentación del ADN de una línea celular diana reticulando por medio de un antígeno expresado en una segunda línea celular.

Como línea celular diana, se usaron la línea celular de adenocarcinoma de riñón humano ACHN o la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231. Expresan niveles comparables y bajos de DR5 (figura 2) y son sensibles a la inducción de la apoptosis mediada por DR5. En la figura 3, se resumen los resultados de la inducción de la fragmentación del ADN de células ACHN en comparación con la combinación de líneas celulares ACHN y GM05389 mediante reticulación que selecciona el tumor de DR5 por medio de FAP. El anticuerpo de control (Drozitumab) induce la apoptosis tras la reticulación por medio de un anticuerpo secundario que selecciona la parte Fc (barras blancas) en ambas líneas celulares, pero también muestra cierta actividad sin reticulación. Las moléculas biespecíficas para DR5-FAP muestran una inducción significativa de la apoptosis en presencia de líneas celulares tanto diana como efectoras (barras negras). En ausencia de fibroblastos que expresen FAP (GM05389) hay una apoptosis ligeramente incrementada en comparación con Drozitumab no reticulado (barras grises). Se interpreta este resultado de una manera en la que se reticulan los receptores DR5 en células ACHN tras la unión al antígeno FAP expresado por la línea celular de fibroblastos GM05389. Todas las moléculas muestran una actividad apoptótica máxima comparable.

Ejemplo 2: Los anticuerpos agonistas biespecíficos para DR5 con proteínas de unión a FAP de reactividad cruzada en formato scFab fusionado a Drozitumab demuestran actividad apoptótica en ensayos de cocultivo

Como se demuestra en el ejemplo 1, los anticuerpos agonistas biespecíficos para DR5-FAP en los que se fusiona el resto que selecciona FAP en formato scFv al extremo C de la cadena pesada o ligera de Drozitumab (formato ²x²) pueden inducir la apoptosis en un contexto de cocultivo de dos líneas celulares en el que una línea celular expresa FAP (células efectoras), mientras que la segunda línea celular sirve como diana del receptor DR5.

Puesto que estas moléculas que contenían una fusión a scFv mostraron algunas propiedades desventajosas (rendimiento de producción bajo y tendencia a formar agregados), se generaron construcciones en las que la unidad de unión a FAP se reemplazó por entidades de Fab monocatenario (scFab), fusionadas al extremo C de la cadena pesada o bien ligera de Drozitumab, dando lugar a la producción de cuatro moléculas diferentes como se describe en la tabla 2. La conexión de las unidades de scFab a la parte de IgG de las moléculas biespecíficas se produce por medio de una secuencia (G⁴S)⁴, mientras que el enlazador interno de scFab consiste en 32 aminoácidos.

Estas moléculas se produjeron de forma transitoria mediante tecnologías recombinantes estándar y se purificaron en cantidades suficientes y en buena calidad para someter a prueba detallada la unión a FAP y a d R5 (FACS; Biacore, no mostrados).

Tabla 2: Descripción y caracterización de las fusiones Drozitumab-FAP (scFab) diferentes. En todas las moléculas, el scFab anti-FAP se fusiona mediante un conector eicosámero ((G⁴S)⁴) a Drozitumab.

El análisis de la inducción de la apoptosis de una línea celular diana que expresaba DR5 (por ejemplo, la línea celular de carcinoma renal ACHN) en presencia y ausencia de una segunda línea celular "efectora" que expresa FAP (por ejemplo, la línea de fibroblastos GM05389) se muestra en la figura 4a y 4b. La inducción de la apoptosis se analizó con un ensayo para la fragmentación del ADN. En los ensayos se usó una proporción de células diana con respecto a efectoras de 1:1 y se analizó la fragmentación del ADN después de 24 h de cocultivo en presencia de Drozitumab, Drozitumab hiperreticulado o las construcciones biespecíficos (todos usados en concentraciones de ¹pg/ml y ^{0 ,1}pg/ml).

Para todas las construcciones sometidas a prueba, se pudo demostrar que las moléculas biespecíficas, independientes de la proteína de unión a FAP usada (3F2 o bien 4G8) como scFab fusionados a Drozitumab, muestran una inducción de la apoptosis incrementada en células diana ACFEN solo en presencia de la línea celular efectora de fibroblastos. Sin embargo, a concentraciones altas de las moléculas biespecíficas, se pudo observar un bajo grado de actividad apoptótica en ausencia de fibroblastos que expresaban FAP. En general y de forma independiente de la proteína de unión a FAP usada, las moléculas con fusión de scFab al extremo C de la cadena pesada fueron más activas que las moléculas donde los scFab se fusionaron al extremo C de la cadena ligera. Además, las construcciones que contienen 4G8 parecían ser más potentes que las moléculas que contenían 3F2.

Sin embargo, la actividad de los formatos basados en scFab fue más baja en comparación con las construcciones basadas en scFv análogas.

Drozitumab sin reticulación adicional mediante los anticuerpos anti-Fc mostró una inducción de la apoptosis baja. Sin embargo, Drozitumab hiperreticulado por medio de un anticuerpo secundario anti-Fc solo, una situación altamente artificial, reveló la actividad apoptótica más alta que no se pudo alcanzar por ninguna de las moléculas sometidas a prueba.

Ejemplo 3: Los anticuerpos agonistas biespecíficos para DR5 - FAP en formato CrossFab demuestran características superiores a las de las moléculas que contienen scFab

Puesto que las moléculas biespecíficas que contenían scFab evaluadas todavía mostraban algunas características desventajosas (por ejemplo, rendimiento de expresión bajo, actividad apoptótica optimizable), se analizó un formato novedoso que debería superar estos inconvenientes: la fusión de una proteína de unión a FAP (4G8) en formato CrossFab al extremo C de la cadena pesada de Drozitumab. En este formato, se usa el resto de unión a FAP en un intercambio "de entrecruzamiento" de regiones variables en el fragmento Fab como se describe en la tabla 3 y se muestra en la figura 5. Las moléculas de CrossFab se unen por medio de un conector eicosámero ((G⁴S)⁴) a la cadena pesada de Drozitumab.

Tabla 3: Descripción y rendimientos de producción de construcciones de Drozitumab biespecífico-CrossFab con FAP en dos formatos diferentes.

Ambas moléculas de CrossFab (véase también la figura 5 para la organización de las construcciones) se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA (en células adheridas o bien en suspensión) y se purificaron con procedimientos estándar. En comparación con las construcciones biespecíficas que contenían scFab y scFv, las moléculas de CrossFab presentaron niveles de expresión significativamente incrementados, lo que dio lugar a rendimientos de producto aproximadamente ¹⁰veces más altos con contenidos de agregados bajos aceptables, como se muestra en la tabla 4.

La figura ⁶muestra el contenido de agregados durante la producción de moléculas biespecíficas para DR5-FAP diferentes. Los cromatogramas de cromatografía de exclusión por tamaño preparativa durante la purificación se muestran para la fusión de scFv (A), scFab (B) y CrossFab (C) al extremo C de la cadena pesada de Drozitumab. Las construcciones de fusión de scFv y scFab muestran contenidos de agregados significativamente más altos en comparación con la molécula que contiene CrossFab. La retirada de estos agregados durante la purificación da lugar a una enorme pérdida de material que se puede observar fácilmente a partir de los rendimientos obtenidos después de la purificación.

La unión de las moléculas a FAP humana, expresada en células HEK293 recombinantes, se detectó mediante análisis por FACS. La figura 7 muestra los resultados de unión a FACS de dos moléculas de Drozitumab-CrossFab (Drozitumab-X-FAP_A, barra de puntos, y Drozitumab-X-FAP_B, barra blanca) en comparación con una construcción de scFab análoga (barra rayada) o la molécula de IgG con FAP (4G8) correspondiente (barra negra). Las tres moléculas biespecíficas en las que se fusiona el resto de unión a FAP 4G8 al extremo C de la cadena pesada de Drozitumab se unen de forma similar o en un intervalo similar a la FAP humana expresada en las membranas de células HEK recombinantes, como la construcción de IgG, lo que indica que esta posición de fusión no tiene un efecto bloqueante N terminal sobre la proteína de unión a FAP sometida a prueba. Las moléculas de control negativo usadas en este ensayo (anticuerpo de detección secundario y Drozitumab) no se unen de manera detectable a las células HEK que expresan FAP.

Tabla 4: Comparación del rendimiento y la calidad de todas las moléculas biespecíficas para DR5-FAP diferentes sometidas a prueba.

En la figura ⁸, se muestran los resultados del análisis por resonancia de plasmón superficial (RPS, Biacore) en el que se evaluó la unión simultánea de las moléculas biespecíficas de CrossFab a DR5 y a FAP. Para este ensayo, se acopló el antígeno (DR5 humano como fusión a Fc, SEQ ID NO: 316) al chip Biacore seguido de la inyección de las moléculas de CrossFab como primer analito. Después de la unión de las moléculas de scFab a DR5, se usó FAP humana o murina soluble recombinante (SEQ ID NO.: 156 y 157) como segundo analito. Para todas las moléculas biespecíficas sometidas a prueba, se demostró la unión simultánea dependiente de la concentración a DR5 y FAP humana y murina, como se indica mediante el incremento de la tasa de respuesta global después de la inyección del primer analito, obtenido tras la inyección del segundo analito. Ambas moléculas biespecíficas tetravalentes de CrossFab (2x2; Drozitumab-X-FAP_A y Drozitumab-X-FAP_B) mostraron una unión similar a DR5 y FAP humana y murina (figura ⁸; A-D).

La figura 9 muestra la inducción de la apoptosis como se determina mediante el ensayo para la fragmentación del ADN después de 24 h de Drozitumab frente a dos moléculas de Drozitumab biespecífico-X-FAP diferentes y una construcción de Drozitumab_4G8_scFab en la línea celular de carcinoma de mama MDA-MB-231 en ausencia o presencia de células de fibroblastos que expresen FAP, GM05389. En las condiciones aplicadas, Drozitumab hiperreticulado y las moléculas biespecíficas para DR5-FAP presentan una inducción de la apoptosis dependiente de la concentración. Aunque las construcciones biespecíficas a concentraciones bajas parecían ser dependientes de la llamada apoptosis en vecindad (actividad apoptótica solo con líneas celulares que expresaban DR5 y FAP presentes) también indujeron la apoptosis de células MDA-MB-231 solas a concentraciones altas. Drozitumab hiperreticulado indujo niveles altos de apoptosis también a concentraciones bajas cuando solo estaban presentes las células MDA-MB-231. Ambas moléculas biespecíficas presentaron una inducción de la apoptosis máxima, ya a una concentración de 0,7 nM.

Para someter a prueba la especificidad de las construcciones biespecíficas para determinar que su actividad de inducción de la apoptosis es dependiente de la reticulación por medio de FAP, se eligió una configuración de ensayo diferente (figura 10). En este contexto, se recubrió FAP humana recombinante o una proteína de control no relacionada (barras blancas) sobre placas de ELISA. Estas proteínas se incubaron con las moléculas biespecíficas o los controles pertinentes antes de que se añadieran las células diana (MDA-MB-231) y se incubaran durante 24 h. Se pudo demostrar una fragmentación del ADN dependiente de la concentración indicativa de la inducción de la apoptosis para el Drozitumab reticulado (barras grises), una molécula biespecífica de scFab (barras rayadas) y las moléculas biespecíficas de CrossFab (barras negras) como se muestra en la figura 10. Mientras que la inducción de la apoptosis con Drozitumab reticulado siempre estuvo en el mismo intervalo con FAP o con la proteína de control recubierta (en todo el intervalo de concentraciones sometido a prueba), la actividad apoptótica de las moléculas de CrossFab fue más alta cuando se recubrió FAP sobre las placas en comparación con la proteína de control. A concentraciones de 0,7 nM y por debajo, solo se pudo detectar una apoptosis significativa en presencia de FAP recubierta, lo que indica una reticulación específica de DR5 en las células MDA-MB-231 diana. Las construcciones Drozitumab biespecífico-FAP que contienen el resto FAP fusionado como un CrossFab al extremo C de la cadena pesada de Drozitumab presentan una inducción de la apoptosis superior a la de Drozitumab solo a las concentraciones sometidas a prueba para líneas celulares tumorales diferentes analizadas en ensayos de apoptosis mediante cocultivo (ensayo para la fragmentación del ADN) durante 24 h como se muestra en la figura 11. En este ensayo, los fibroblastos que expresaban FAP (GM05389) se cocultivaron con una serie de líneas celulares tumorales diferentes (MDA-MB-231, cáncer de mama, barras negras; U-87MG, glioblastoma, barras grises; FaDu, cabeza y cuello, barras blancas y A549, cáncer de pulmón, barras rayadas) en presencia de Drozitumab, Drozitumab reticulado con anticuerpo anti-Fc, o bien la construcción Drozitumab-X-FAP (todos a concentraciones de 7 nM y 0,7 nM). La inducción de la apoptosis de Drozitumab reticulado a una concentración de 7 nM se fijó a un 100 % y, en consecuencia, se calcularon las actividades de las demás moléculas sometidas a prueba. Mientras que Drozitumab solo a una concentración de 7 nM mostró hasta un 50 % de actividad (dependiendo de la línea celular tumoral sometida a prueba), la molécula de CrossFab presentó una inducción de la apoptosis en el intervalo de un 75 - 90 % de Drozitumab reticulado con todas las líneas celulares sometidas a prueba. Drozitumab solo a 0,7 nM demostró una actividad baja, mientras que la molécula biespecífica presentó una actividad de inducción de la apoptosis significativa (hasta un 100 % con células FaDu, entre un 60 y un 90 % con las demás líneas celulares sometidas a prueba).

Ejemplo 4: Preparación de antígenos y herramientas de cribado para la generación de proteínas de unión a DR5 novedosas

Debido a algunas propiedades subóptimas de Drozitumab en formato biespecífico (rendimiento bajo, activo sin reticulación, fusión N terminal inactiva el anticuerpo), se aislaron anticuerpos para DR5 nuevos que superan estos inconvenientes. Para la generación de los antígenos adecuados que se van a usar en el aislamiento de las proteínas de unión a DR5 novedosas y para el cribado y selección de estas, se han construido una serie de proteínas de fusión. De cada gen receptor, se amplificó la región que codificaba el dominio extracelular (DEC) mediante PCR y se fusionó a un ligando proteico genérico para generar los siguientes formatos (como se representa en la figura ¹²):

1. Dominio extracelular (DEC) fusionado en marco a marca Avi y marca Hexahis

2. DEC fusionado a Fc de IgG1 humana que consiste en la región bisagra y los dominios CH2 y CH3 seguido de una marca Avi. Entre DEC y Fc se insertó un sitio de escisión por proteasa AcTev (--(dando como resultado un antígeno dimérico)

3. Como en 2, pero el DEC se fusiona a un Fc con mutaciones de botón en ojal. La fusión antígeno-Fc se coexpresa con el homólogo Fc-ojal para obtener antígenos monoméricos

Aunque las secuencias de DR5 humano y DR5 murino se conocían y estaban anotadas en la base de datos SwissProt, la secuencia del homólogo de macaco cangrejero no se ha descrito en la misma. En base a las homologías entre las secuencias del gen DR5 humano y de macaco de la India, se han diseñado cebadores que se usaron para el aislamiento del antígeno de macaco cangrejero de ARN preparado a partir de PBMC de macaco cangrejero. En resumen, se aisló ARN de la sangre de macaco cangrejero recién aislada usando el kit RNeasy de Qiagen. Después de la digestión con DNAsel y la elución del ARN, se usó el kit OneStep RT-PCR (síntesis y amplificación de ADNc) de Qiagen (número de catálogo 210212) para amplificar el gen DR5 de macaco cangrejero con GAB-4039 (GCT00 CJ C( l'GGAt'TJ C CATTlCC SEQ ID NO 163) y GAB4040 ( G A t t í . A U U Ü A ^üÜ IX X X ^jÍX ^{j ü}A G gEQ ID NO 164) como cebadores, diseñados de acuerdo con la secuencia de DR5 de macaco de la India conocida. El producto de PCR se clonó en pCR2.1 Topo (Invitrogen) para la secuenciación. El análisis de la secuencia reveló un 89 % de homología con respecto al dominio extracelular de DR5 humano. Usando los cebadores GAB-4145 (G T G C A T T C C A T C A C Ü C G A C A A T CC C T A G A T C C C C A G C G ; SEQ ID NO 165) y GAB-4146 (t¡ C'GT C G AC TG 4 TTCTTTGT O G A CA CA O I C A A T G TC A C ; SEQ ID NO 166), se clonó el dominio extracelular del gen DR5 de macaco cangrejero en un vector de expresión genérico en fusión con Fc humano.

La expresión de los genes deseados se produce bajo el control de un promotor MPSV. Además, se incluye un sitio de poliadenilación en 3' y una secuencia oriP para el mantenimiento estable de los plásmidos en células HEK293 que expresan el antígeno nuclear de EBV (EBNA).

Para la producción de los antígenos, se transfectaron vectores de expresión pertinentes en células HEK293 EBNA (transfección mediada por Ca²PO⁴o bien dependiente de PEI). Después de 5 - 7 días de cultivo, se obtuvieron los sobrenadantes y se purificaron por medio de unión a proteína A (antígenos que contenían Fc) o mediante cromatografía de afinidad NI2+ (moléculas que contenían marca His) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) posterior. Si hubiera sido necesario, las proteínas se biotinilaron por medio de la marca Avi C terminal. Esto se podría realizar in vivo, mediante cotransfección / coexpresión de un plásmido que codifique birA o bien después de la purificación del antígeno in vitro usando un kit de biotinilación de Avidity, n.° de cat. BIRA. Los siguientes antígenos se produjeron mediante expresión génica transitoria en HEK293 EBNA:

Tabla 5: Construcciones de antígeno y herramientas de cribado para el aislamiento de anticuerpos frente a DR5 humano

n.a.: no aplicable

Se adquirieron DR4-Fc humano recombinante (n.° de cat. 347-DR/CF), DcR1-Fc (n.° de cat. 630-TR/CF), DcR2-Fc /n.° de cat. 633-TR/CF) y OPG-Fc (n.° de cat. 805-=S/CF) de R&D Biosystems.

Ejemplo 5: Aislamiento de proteínas de unión a DR5 novedosas de colecciones Fab genéricas

Se seleccionaron anticuerpos con especificidad por DR5 humano de una colección de anticuerpos de presentación en fagos genérica en el formato Fab (DP47-3). Esta colección se construyó sobre la base de los genes de la estirpe germinal humana usando el apareamiento del dominio V Vk3_20 (cadena ligera kappa) y VH3_23 (cadena pesada) que comprende un espacio de secuencia aleatorizado en CDR3 de la cadena ligera (L3) y CDR3 de la cadena pesada (H3). La generación de la colección se realizó mediante el ensamblaje de 3 fragmentos amplificados por PCR empalmando mediante PCR con extensión por solapamiento (SOE). El fragmento 1 comprende el extremo 5' del gen del anticuerpo, incluyendo L3 aleatorizado, el fragmento 2 es un fragmento constante central que abarca desde L3 a H3, mientras que el fragmento 3 comprende H3 aleatorizado y la porción 3' del gen del anticuerpo. Se usaron las siguientes combinaciones de cebadores para generar estos fragmentos de colección para la colección DP47-3: fragmento 1 (LMB3 - LibL1b_nuevo), fragmento 2 (MS63 - MS64) y fragmento 3 (Lib2H - fdseqlong), respectivamente. Los parámetros de PCR para la producción de los fragmentos de colección fueron 5 min de desnaturalización inicial a 94 °C, 25 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 58 °C, 1 min a 72 °C y elongación terminal durante 10 min a 72 °C. Para la PCR de ensamblaje, usando proporciones equimolares de los 3 fragmentos como molde, los parámetros fueron 3 min de desnaturalización inicial a 94 °C y 5 ciclos de 30 s, 94 °C, 1 min, 58 °C, ²min, 72 °C. En este paso, se añadieron los cebadores externos y se realizaron ²⁰ciclos adicionales antes de una elongación terminal durante 10 min a 72 °C. Después del ensamblaje de cantidades suficientes de construcciones de Fab aleatorizadas de longitud completa, se digirieron con Ncol / Notl junto con un vector de fagémido aceptor tratado de forma similar. Se ligaron 22,8 pg de la colección de Fab con 16,2 pg de vector de fagémido. Se usaron uniones purificadas para ⁶⁸transformaciones para obtener un tamaño de la colección final de 4,2 x ¹⁰10. Las partículas de fagémido que presentan la colección de Fab se rescataron y se purificaron mediante purificación con PEG/NaCl para usarse para las selecciones.

Las selecciones se llevaron a cabo frente a DR5 humano monomérico o dimérico expresado en HEK293 fusionado a la porción Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Para la generación del antígeno monomérico, se aplicó el formato de botón en ojal en Fc para la heterodimerización de dos cadenas CH2-CH3 diferentes (de las que solo una tiene un ectodominio de DR5 humano como fusión N terminal). Los antígenos se biotinilaron enzimáticamente por medio de una marca avi. Se realizaron tandas de selección (panning) en solución de acuerdo con el siguiente patrón: 1. Preaclaramiento de ~ 10¹²partículas de fagémido usando hu IgG1 recubierta a 10 pg/ml sobre placas NUNC Maxisorp para evitar las proteínas de unión a Fc, 2. unión de partículas de fagémido de no unión a Fc del sobrenadante de la reacción de preaclaramiento a DR5 humano biotinilado 100 nM durante 0,5 h en un volumen total de 3 ml, 3. captura de hu DR5 biotinilado y fago de unión específica unido mediante incubación en placas de microvaloración recubiertas con neutravidina durante 10 min, 4. lavado de microesferas usando 5x 1 ml de PBS/Tween20 y 5x 1 ml de PBS, 5. elución de partículas de fago mediante adición de 1 ml de TEA (trietilamina) 100 mM durante 10 min y neutralización mediante adición de 500 pl de Tris/HCl 1 M, pH 7,4, ⁶. etapa de posaclaramiento de las partículas de fago eluidas en DcR2 humano para evitar las proteínas de unión de reactividad cruzada y 7. reinfección de las células TG1 de E. coli en fase logarítmica con las partículas de fago en el sobrenadante, infección con el fago auxiliar VCSM13 y posterior precipitación con PEG/NaCl de las partículas de fagémido para usarse en las siguientes tandas de selección. Las selecciones se llevaron a cabo en 3 tandas usando concentraciones de antígenos constantes a 100 nM. En la tanda 2, se realizó la captura de los complejos antígeno:fago mediante la adición de 5,4 x 10⁷microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 min en lugar de la captura en placas de microvaloración recubiertas con neutravidina. Las proteínas de unión específicas se identificaron mediante ELISA como sigue: Se recubrieron 100 pl de DR5 o DcR2 humano biotinilado 50 nM por pocillo en placas con neutravidina. Además, se recubrieron 10 pg/ml de IgG1 humana en placas NUNC Maxisorp. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRp. Se preseleccionaron los clones que presentaban señales en DR5 humano, pero ninguna en DcR2 humano e IgG1 humana, para otros análisis.

Se midió la afinidad (Kd) de los clones de Fab seleccionados mediante resonancia de plasmón superficial usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C con antígenos DR5 mono o bivalentes biotinilados inmovilizados en chips NLC mediante captura con neutravidina. Inmovilización de antígenos (ligando): Se diluyeron los antígenos recombinantes con PBST (fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) a 10 pg/ml, a continuación, se inyectaron a 30 pl/minuto a tiempos de contacto variables para lograr niveles de inmovilización de 200, 400 u 800 unidades de respuesta (UR) en orientación vertical. Inyección de analitos: Para las mediciones de cinética con dosis única, se cambió la dirección de inyección a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución por duplicado de Fab purificado (intervalos de concentración variables entre 100 y 3,125 nM) a 50, 60 o 100 pl/min a lo largo de canales separados 1-5, con tiempos de asociación de 120, 180 o 200 s, y tiempos de disociación de 200 o 240 s. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia. Se calcularon las constantes de velocidad de asociación (kas) y las constantes de velocidad de disociación (kdis) usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir en el programa informático ProteOn Manager v3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. La regeneración se realizó en orientación horizontal usando NaOH 50 mM a un caudal de 100 pl/min durante un tiempo de contacto de 18 s.

Ejemplo 6: Las proteínas de unión a DR5 seleccionadas pueden inducir la apoptosis tras la reticulación

Para identificar las proteínas de unión a DR5 que pueden inducir la apoptosis de células diana seleccionadas solo tras la reticulación, se convirtieron los anticuerpos aislados de una colección de Fab en el formato de hu IgG1 correspondiente. En resumen, se amplificaron las cadenas pesada variable y ligera variable de 46 proteínas de unión a DR5 únicas de la presentación en fagos mediante reacciones de PCR estándar usando los clones de Fab como molde. Los productos de PCR se purificaron e insertaron (mediante clonación basada en endonucleasas de restricción y ligasas o bien mediante "recombinación" usando el kit InFusion de Invitrogen) en vectores de expresión adecuados en los que se fusionan a la cadena pesada constante humana o ligera constante humana apropiada. Los casetes de expresión en estos vectores consisten en un promotor MPSV quimérico y un sitio de poliadenilación sintético. Además, los plásmidos contienen la región oriP del virus de Epstein-Barr para el mantenimiento estable de los plásmidos en células HEK293 que albergan el antígeno nuclear de EBV (EBNA). Los anticuerpos se produjeron de forma transitoria a una escala de 50 ml en células HEK293 EBNA como se describe. Para una purificación rápida y de alto rendimiento, los sobrenadantes se neutralizaron e incubaron con microesferas de ProteinA Sepharose Fast Flow (n.° de cat. de GE Healthcare 17-5138-01) durante 16 h. A continuación, se hizo pasar la mezcla de sobrenadante/microesfera por una columna PD-10 vacía y equilibrada (n.° de cat. de GE Healthcare 17-0435-01) mediante flujo por gravedad. Las microesferas retenidas se lavaron dos veces y el anticuerpo se eluyó en una etapa de pH bajo. Finalmente, la proteína eluida se neutralizó y su concentración se calculó usando la asorbancia a 280 nm y el coeficiente de extinción molar. El contenido de agregados de la muestra de anticuerpo se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica usando una columna Zorbax GF-250 (n.° de cat. de Agilent PSMO 845006).

Los resultados de este procedimiento de purificación se resumen en la tabla ⁶

Tabla 6: Sumario de los resultados de purificación, para SEQ ID NO véase la tabla ⁸

Esta transfección y producción a pequeña escala, seguido de una purificación por medio de microesferas de proteína A, proporcionó cantidades razonables de anticuerpos puros con un contenido de agregados muy bajo. En la figura 13 (a-e) se resumen los resultados de un ensayo ELISA para la fragmentación del ADN estándar para la detección de la apoptosis. Cada anticuerpo se sometió a prueba en dos concentraciones diferentes (1,0 pg/ml: barras negras y 0,1 pg/ml: barras rayadas con 1,0 y 0,1 pg/ml de anticuerpo anti-Fc para la reticulación, respectivamente). Los datos obtenidos se normalizaron a la actividad máxima de Drozitumab reticulado (a 1,0 pg/ml) que se fijó a un 100 %. La mayoría de los anticuerpos analizados pudieron inducir la inducción de la apoptosis dependiente de la concentración en células MDA-MB-231 después de la reticulación. Siete de las 46 proteínas de unión (15,2 %) mostraron claramente una actividad más alta, como Drozitumab a ambas concentraciones. Quince anticuerpos (32,6 %) estaban en el mismo intervalo de actividad que Drozitumab y veinte de las moléculas sometidas a prueba (43,5 %) indujeron la apoptosis tras la reticulación, pero en un grado mucho más bajo en comparación con Drozitumab. Las cuatro proteínas de unión restantes ("20E3", "19E6", 1B12" y "19C12", 8,7 %) eran inactivas y no inducían la apoptosis, incluso después de la reticulación por medio de un anticuerpo secundario anti-Fc.

Ejemplo 7: Caracterización de proteínas de unión a DR5 novedosas

En base a los resultados del cribado de la actividad apoptótica, se seleccionaron doce de los 46 anticuerpos para DR5 evaluados para un análisis y una caracterización adicionales y más detallados. Estos anticuerpos se volvieron a producir en células HEK293 EBNA transfectadas de forma transitoria y se purificaron usando columnas de afinidad con proteína A estándar seguido de cromatografía de exclusión por tamaño como se describe. Se determinaron el rendimiento y el contenido de monómeros / agregados (tabla 7). Los anticuerpos purificados se caracterizaron con respecto a la especificidad de la diana, la reactividad cruzada con especies y la afinidad (tabla ⁸). Además, se analizó la estabilidad térmica mediante DDL y se comparó la actividad de inducción de la apoptosis en presencia o ausencia de un anticuerpo secundario anti-Fc humano de reticulación.

Tabla 7: Serie de anticuerpos para DR5 seleccionados, para SEQ ID NO véase la tabla ⁸

Tabla 8: Caracterización de proteínas de unión a DR5 novedosas

Todos los anticuerpos analizados reconocen específicamente el DR5 humano y no se unen a los homólogos humanos más cercanos de la superfamilia de t Nf R, tales como DR4, los receptores señuelo (DcR1 y DcR2) y osteoprotegerina (OPG). Todos los anticuerpos para DR5 tienen reactividad cruzada con DR5 humano y de macaco cangrejero, pero no reconocen el homólogo murino (lo que no es inesperado debido a una homología de secuencia de solo aproximadamente un 30 %). Mientras que las afinidades con respecto a DR5 humano están en un intervalo bastante amplio (de 162 a 773 nM), todas las avideces medidas están en el intervalo nanomolar bajo (un dígito). Todas las proteínas de unión a DR5 sometidas a prueba revelan una estabilidad térmica alta con temperaturas de agregación muy por encima de 60 °C como se mide mediante experimentos de dispersión dinámica de la luz (DDL).

Para determinar la actividad funcional de una serie de proteínas de unión a DR5 seleccionadas, se analizó la inducción de la apoptosis usando un ensayo ELISA de detección de muerte celular (Roche; n.° 11 774425001) que detecta específicamente la fragmentación del ADN. Los anticuerpos se usaron a una concentración de 1,0 y 0,1 pg/ml en presencia de la misma concentración de anticuerpos secundarios anti-Fc humano para la reticulación. Para la comparación, se usaron anticuerpos a 1,0 pg/ml en ausencia del anticuerpo secundario para evaluar si la actividad de las proteínas de unión a DR5 seleccionadas depende de la reticulación o si ya son activas por sí solas. Se usó la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 como línea celular diana. En la figura 14 se resumen los resultados de la inducción de la apoptosis de proteínas de unión a DR5 diferentes. Después de la reticulación, todos los anticuerpos para DR5 recién aislados inducen la apoptosis en el mismo intervalo que el anticuerpo de control Drozitumab. Sin embargo, a diferencia de Drozitumab, que ya presenta una actividad de inducción de la apoptosis significativa sin reticulación, la actividad de las proteínas de unión a DR5 novedosas depende estrictamente de la reticulación por medio de un anticuerpo secundario. La actividad apoptótica no parece estar correlacionada con la afinidad de la proteína de unión a DR5 con respecto a su diana, puesto que esto fue similar para los anticuerpos tanto con la afinidad más alta como con la más baja con respecto a DR5 humano.

Se usaron dos ensayos adicionales para evaluar la actividad de las proteínas de unión a DR5 seleccionadas: La inhibición de la proliferación tras el tratamiento con anticuerpos reticulados se midió con un ensayo CellTiter-Glo (Promega n.° TB288). Además, la inducción de caspasa ⁸se determinó mediante un ensayo Caspase⁸-Glo (Promega n.° G8202). La figura 15 muestra la inhibición máxima de la proliferación a una concentración de 7 nM de proteínas de unión a DR5 reticuladas por medio del anticuerpo secundario anti-Fc de tres líneas celulares tumorales diferentes. Se comparó el efecto sobre la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano DFD-1 (barras negras) con la línea de cáncer de pulmón de células grandes HCI-H460 (barras rayadas) y la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (barras blancas). Para las tres líneas celulares se pudo detectar una inhibición significativa de la proliferación. Mientras que la inhibición de la proliferación de DFD-1 a 7 nM parece correlacionarse con la afinidad del anticuerpo para DR5, este no es el caso para NCI-H460 y solo hasta un determinado grado para MDA-MB-231.

Tabla 9: Valores de CI50 calculados para la inhibición de la proliferación usando el ensayo CellTiter-Glo

La figura 16 resume los resultados de la activación de caspasa ⁸tras el tratamiento con anticuerpos para DR5 reticulados mediante anti-Fc. La activación de caspasa ⁸máxima en tres líneas celulares tumorales diferentes (DLD-1, barras negras, NCI-H460, barras rayadas; y MDA-MB-231, barras blancas) se muestra a una concentración de 7 nM. Para todos los anticuerpos, se pudo detectar un nivel alto de activación de caspasa ⁸en las tres líneas celulares. La inducción de caspasa ⁸estuvo en el mismo intervalo para las diferentes líneas celulares, pero la correlación del nivel de inducción de caspasa ⁸con la afinidad de los anticuerpos no fue tan pronunciada como se observa en el ensayo CellTiter-Glo para la inhibición de la proliferación.

Tabla 10: Valores de CE50 calculados para la inducción de caspasa ⁸usando el ensayo Caspase ⁸-Glo

Ejemplo 8: Análisis de epítopos

Para caracterizar con más detalle la clase y localización relativa de los epítopos reconocidos por las proteínas de unión a DR5 recién aisladas, se han realizado análisis de inmunoelectrotransferencia / inmunotransferencia y mediciones con Biacore con IgG purificadas. La comparación de los resultados de inmunoelectrotransferencia frente a inmunotransferencia mostraría si los anticuerpos reconocen un epítopo lineal o uno conformacional, mientras que los experimentos de competencia en Biacore apuntarían a epítopos diferentes, idénticos o parcialmente solapantes.

Para diferenciar entre epítopos lineales o conformacionales, se separó DR5 humano mediante SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, se incubó con las proteínas de unión a DR5 diferentes y se detectó con un anticuerpo secundario anti-huFc-HRP (Sigma A0170). En paralelo, se imprimió DR5 humano sobre una membrana, se añadió el anticuerpo para DR5 y se detectó con el mismo anticuerpo secundario. La unión del antígeno solo en el experimento de inmunotransferencia apuntaría a un epítopo conformacional, puesto que en este contexto el antígeno se analiza en su conformación tridimensional natural, mientras que en el experimento de inmunoelectrotransferencia el antígeno se ha desnaturalizado y solo los epítopos lineales deberían ser accesibles.

Tabla 11: Sumario de los resultados del análisis de inmunoelectrotransferencia / inmunotransferencia

En base a estos resultados, se pudo llegar a la conclusión de que la mayoría de los anticuerpos analizados reconocen un epítopo conformacional en hu DR5, mientras que solo dos anticuerpos (5F6, 24B7) se unen claramente al antígeno desnaturalizado en el análisis de inmunoelectrotransferencia, lo que indica la unión a un epítopo lineal. La fuerte unión en inmunotransferencia y la débil unión en inmunoelectrotransferencia también apuntan a un epítopo conformacional, pero este probablemente contiene tramos lineales que se reconocen (18F11, 18F16).

Se realizaron ensayos de competencia de unión mediante resonancia de plasmón superficial (RPS, Biacore) en dos contextos diferentes. En el ensayo de no competitivo clásico, se inmoviliza una primera proteína de unión a DR5 en un chip seguido de la adición y unión de hu DR5. A continuación, se inyecta el segundo anticuerpo para DR5 y se analiza para determinar la unión adicional a DR5. En el ensayo tándem, se inmoviliza hu DR5 en un chip seguido de la adición de una primera proteína de unión a DR5. A continuación, se inyecta la segunda proteína de unión a DR5 y se analiza la unión adicional. La figura 17 resume los resultados de estos ensayos de competencia de unión (comparación de cuatro anticuerpos para DR5 nuevos con Drozitumab). A partir de estos ensayos de competencia, se pudo llegar a la conclusión de que los clones 5E11, 22E9 y 174 (SEQ ID NO.:88 de VH, SEQ ID NO.:89 de VL, véase, por ejemplo, el ejemplo 26) compartan probablemente un epítopo común, puesto que, una vez que uno de estos se haya unido a DR5, ninguno de los otros dos se podría unir al antígeno. Estos tres anticuerpos reconocen claramente un epítopo diferente, como Drozitumab. El sitio de unión del clon 422 (SEQ ID NO:82 de VH, SEQ ID NO.:85 de VL, véase, por ejemplo, el ejemplo 26) se podría solapar con el epítopo de 5E11, 22E9 y Drozitumab, pero, sin lugar a dudas, no con el del clon 174. Una respuesta clara a la pregunta del epítopo reconocido podría provenir de experimentos de cocristalización (DR5 mAb) seguido de un análisis de la estructura.

Para evaluar si los anticuerpos para DR5 reconocen un epítopo que sea similar o se solape con el sitio de unión del ligando a DR5, se configuró un ensayo de competencia con TRAIL en Biacore. Para ese propósito, se inmovilizó hu TRAIL recombinante (Preprotech n.° 310-04) en un chip CM5. Se usó un complejo preformado que consistía en DR5 humano-Fc y la proteína de unión a DR5 como analito y se determinó la unión a TRAIL inmovilizado. En la figura 18 se muestran los resultados del experimento de competencia con TRAIL. Con la excepción del clon 422 (línea de puntos en la figura 18b), todas las proteínas de unión a DR5 recién aisladas parecen unirse a un epítopo que al menos se solapa con el sitio de unión de TRAIL en DR5, puesto que ninguno de los complejos sometidos a prueba se puede unir a hu TRAIL inmovilizado (todas las líneas continuas). A diferencia de eso, DR5 solo (línea de rayas) o un complejo de DR5 con un anticuerpo de control (rayas cortas) mostraron una clara unión al ligando inmovilizado.

E je m p lo 9: Los a n tic u e rp o s p ara D R 5 no c o m p e tid o re s co n lig an d o d e m u e s tra n u na ac tiv id a d a p o p tó tic a in c re m e n ta d a in vitro en p re s e n c ia d e T R A IL en c o m p a ra c ió n co n las p ro te ín a s d e unión c o m p e tid o ra s con lig an d o

Durante el aislamiento y el cribado de las proteínas de unión a DR5 nuevas, se aislaron anticuerpos que reconocen epítopos diferentes en DR5 humano. Un posible criterio para clasificar los anticuerpos es agruparlos en moléculas bloqueantes de ligandos y no bloqueantes de ligandos. Entre las proteínas de unión seleccionadas se eligió un representante para cada uno de estos grupos: se identificó que el clon 5E11 bloquea la unión de TRAIL a DR5, mientras que el clon 422 es un anticuerpo no bloqueante de ligandos (figura 18).

Para evaluar el impacto de la unión a un epítopo que al menos se solapa con la unión de TRAIL, estos dos candidatos se analizaron para determinar la inhibición de la proliferación de células diana de CCR DLD-1 después de la reticulación con anticuerpos secundarios anti-Fc en presencia o ausencia de TRAIT humano. Se incubaron 4000 células diana DLD-1 por pocillo durante la noche a 37 °C antes de que se añadieran los anticuerpos reticulados: se usaron los anticuerpos 5E11, 422 y un anticuerpo de control que no bloquea TRAIL en seis concentraciones diferentes (partiendo de 6,67 nM en etapas de dilución de 2,5 veces hasta 0,068 nM). La reticulación se logró mediante adición de una concentración equimolar de anticuerpo secundario anti-Fc. Se añadió TRAIL en concentraciones de 10, 4, 1,6, 0,64, 0,256 y 0,102 nM a la concentración de anticuerpos respectiva. Después de 48 h de incubación, se añadió el reactivo de Cell TiterGlo. Los resultados de este ensayo de inhibición del crecimiento se muestran en la figura 19. Se demostró que el clon 422, el anticuerpo no bloqueante de ligandos, presentaba actividad antiproliferativa significativamente incrementada tras la adición de TRAIL humano en comparación con el clon 5E11, que se une a un epítopo solapante con el sitio de unión de TRAIL. La adición del anticuerpo 5E11 reticulado no tuvo ningún efecto aditivo sobre la inhibición del crecimiento mediante TRAIL solo. Por el contrario, usando el clon 422 reticulado en combinación con TRAIL humano demostró un efecto aditivo significativo sobre la actividad.

Se observaron resultados similares con un anticuerpo de control pertinente que se sabe que no bloquea la unión de TRAIL en DR5. Queda por evaluar si este efecto observado en un ensayo in vitro se puede traducir a contextos in vivo.

E je m p lo 10: C o n v e rs ió n en fo rm a to b ie s p e c ífic o 2+ 2

Para evaluar si se pueden usar las proteínas de unión a DR5 novedosas para la generación de anticuerpos biespecíficos para la inducción seleccionada de la apoptosis de células tumorales mediante hiperreticulación de DR5, se convirtió un conjunto de anticuerpos para DR5 en moléculas biespecíficas tetravalentes. Estos anticuerpos biespecíficos contienen dos restos de unión, cada uno para DR5 y FAP (proteína de activación de fibroblastos). Se combinaron diferentes anticuerpos para DR5 seleccionados con el anticuerpo 28H1 para FAP, se aisló una proteína de unión a FAP de reactividad cruzada humana / murina / de macaco cangrejero (hu/mu/cy) con afinidad alta y se maduró en afinidad mediante presentación en fagos. En el formato 2+2 usado, se fusionó el dominio de CrossFab con 28H1 (VHCL) al extremo C de la cadena pesada de anti-DR5 usando un conector (G⁴S)⁴. Las estructuras esquemáticas del formato 2+2 se muestran en la figura 28). A continuación, se muestran cadenas ejemplares de los anticuerpos biespecíficos en el formato ²+².

T a b la 12a: Moléculas tetravalentes biespecíficas de CrossMab para DR5 - FAP (todas con dominio de CrossFab con 28H1 (VHCL) fusionado al extremo C de la cadena pesada de anti-DR5 usando un conector (G⁴S)⁴, proteína de unión a FAP: SEQ ID NO.:15 de VH, VL SEQ ID NO.:16)

Tabla 12b: Datos de producción de moléculas tetravalentes biespecíficas de CrossMab para DR5 - FAP

Todas las moléculas biespecíficas para DR5 - FAP se produjeron en células HEK293 EBNA transfectadas de forma transitoria y se purificaron por medio de cromatografía con proteína A y de exclusión por tamaño. Los rendimientos de producto obtenidos estuvieron en un intervalo razonable (alrededor de 20 mg/l). El contenido de monómeros después de la etapa de purificación estaba por encima de un 96 % para todas las moléculas.

El análisis de unión a diana mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) reveló que todos los anticuerpos biespecíficos seleccionados en el formato 2+2 se podían unir simultáneamente a DR5 y a FAP (humana y murina) recombinantes como se representa en la figura 42.

Para evaluar si las moléculas biespecíficas para DR5-FAP pueden inducir la apoptosis de la línea celular diana MDA-MB-231, se recubrieron placas de 96 pocillos con FAP humana recombinante para la reticulación de DR5 en las células diana por medio de los anticuerpos biespecíficos añadidos posteriormente. Después de la adición de las células diana (MDA-MB 231) y la incubación durante 24 h, se determinó la inducción de la apoptosis mediante el ensayo ELISA para la fragmentación del ADN estándar. La figura 20 muestra la comparación de la inducción de la apoptosis de siete anticuerpos biespecíficos que contienen proteínas de unión a DR5 recién aisladas y el CrossFab con FAP 28H1 fusionado en el extremo C en comparación con Drozitumab a dos concentraciones diferentes (7,0 nM y 0,7 nM). Todas las moléculas fueron se sometieron a prueba en presencia y ausencia de FAP. Como se esperaba, a una concentración alta, la molécula biespecífica basada en Drozitumab ya indujo la apoptosis en ausencia de FAP de reticulación en un grado significativo. Por el contrario, las moléculas biespecíficas para DR5-FAP que usan las proteínas de unión a DR5 nuevas solo presentaron actividad de inducción de la apoptosis en presencia de FAP recubierta en las placas, lo que indica que esta actividad es dependiente de la reticulación por medio de FAP recombinante.

Para determinar si las moléculas biespecíficas también se podían reticular eficazmente por medio de FAP expresada en una línea celular diferente de DR5 y, de este modo, inducir la apoptosis, se configuró el llamado ensayo de cocultivo en vecindad. La figura 21 muestra los resultados de la inducción de la apoptosis en un experimento de cocultivo con una línea celular tumoral (MDA-MB-231) y fibroblastos que expresan FAP (GM05389) con tres concentraciones diferentes de moléculas biespecíficas (7,0, 0,7 y 0,07 nM). Las tres construcciones biespecíficas que contienen los restos de unión a DR5 de 5E11, 22E9 y 20F2, respectivamente fusionados a CrossFab con FAP 28H1 muestran un grado comparable de inducción de la apoptosis, ya que también se observó con las moléculas de IgG reticuladas anti-Fc correspondientes. A diferencia de eso, la molécula que contenía 6H4 como la parte de unión a DR5 presentó una actividad reducida en comparación con la IgG reticulada. Una de las moléculas sometidas a prueba (18H6 - 28H1) fue completamente inactiva a todas las concentraciones (a diferencia de la IgG reticulada), lo que indica que no todas las proteínas de unión a DR5 son adecuadas para la generación de moléculas biespecíficas para hiperreticular DR5 en células tumorales. Por lo tanto, es necesaria una evaluación cuidadosa del epítopo y de la actividad biespecífica para elegir el anticuerpo para DR5 correcto para el enfoque de inducción seleccionada de la apoptosis. En este sentido, son ventajosas, en particular, las proteínas de unión a DR5 que presentan una afinidad bastante baja con respecto a DR5 y una avidez alta en el formato biespecífico 2+2. La baja afinidad por DR5 previene la unión de los anticuerpos biespecíficos a las células normales y, de ahí que incremente la selectividad para inducir la apoptosis en células tumorales de una manera dependiente de FAP. Una proteína de unión que tiene estas características, por ejemplo, es la proteína de unión a DR55E1¹.

Como se describe, una de las desventajas de Drozitumab, que limita su uso en formatos biespecíficos, es el hecho de que este anticuerpo no permite la fusión N terminal de un segundo resto de unión. Esta configuración da lugar al bloqueo del extremo N de Drozitumab que inhibe la unión apropiada a DR5 y, de este modo, se previene la inducción de la apoptosis. Para someter a prueba si los anticuerpos para DR5 recién aislados se pueden usar en esta clase de formato, se generaron moléculas de fusión a Fc, en las que los Fab de proteínas de unión a DR5 seleccionadas se fusionaron en el extremo C a una región Fc humana por medio de un conector (G⁴S)⁴. Estas moléculas se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA, se purificaron por medio de microesferas de proteína A y se sometieron a prueba en un ensayo de inducción de la apoptosis. En la figura 22 a) se resumen los resultados del ensayo para la fragmentación del ADN en células MDA-MB-231 con estas moléculas de fusión Fc-DR5 después de la reticulación con IgG secundaria anti-Fc. Todas las moléculas sometidas a prueba pueden inducir la apoptosis de la línea celular diana, lo que indica que las proteínas de unión a DR5 elegidas no están bloqueadas en el extremo N, lo que genera una gama más amplia de formatos que se pueden usar con estas proteínas de unión.

Ejemplo 11: Caracterización de la estabilidad térmica del formato biespecífico 2+2 que contiene la proteína de unión a DR5 derivada de presentación en fagos

Se midió la estabilidad térmica de la proteína de unión a DR5 derivada de presentación en fagos convertida en el formato biespecífico 2+2 usando un sistema Optim 1000 (Avacta Group plc) como el cambio en la intensidad de la luz dispersada. En una matriz de microcubetas, se calentaron 9 pl de las muestras en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, a una concentración de 1 mg/ml de 25 °C a 90 °C a una velocidad de 0,1 °C/min.

La intensidad de la luz dispersada (láser de 266 nm) se registró cada 0,4 °C y se procesó con el programa informático IgorPro, versión 6.23 (Avacta Group plc). La temperatura de comienzo de la agregación se define como la temperatura a la que la intensidad de dispersión se empieza a incrementar.

Tabla 13: Temperaturas de comienzo de la agregación de anticuerpos biespecíficos (formato 2+2) que contienen proteínas de unión a DR5 derivadas de presentación en fagos como medida para la estabilidad térmica de las construcciones biespecíficas

Todos los anticuerpos para DR5 sometidos a prueba revelan una estabilidad térmica alta con temperaturas de agregación muy por encima de 60 °C, también cuando se clonan en construcciones biespecíficas 2+2.

Ejemplo 12: Los anticuerpos biespecíficos para DR5 - FAP pueden inducir la apoptosis en células diana diferentes

Se compararon nueve anticuerpos biespecíficos para DR5 - FAP en el formato 2+2 que comprendía proteínas de unión a DR5 recién aisladas (cuatro aisladas mediante presentación en fagos, cinco derivadas de la inmunización de conejos como se representa en los ejemplos 22 a 25) fusionadas al resto CrossFab con FAP 28H1 en un experimento paralelo para la inducción de la apoptosis en dos líneas celulares diferentes (MDA-MB-231 y G401) en un ensayo de cocultivo con fibroblastos FAP+ humanos, GM05389. Los anticuerpos biespecíficos se sometieron a prueba en un intervalo de concentraciones de 0,0007 - 7 nM. Los resultados del ensayo para la fragmentación del ADN se resumen en la figura 23 (MDA-MB-231) y en la figura 24 (G401). Todos los anticuerpos biespecíficos sometidos a prueba demostraron una buena actividad de inducción de la apoptosis en ambas líneas celulares. De acuerdo con los resultados obtenidos con las células MDA-MB-231, los anticuerpos se pudieron dividir en dos grupos. Lo obtenido a partir de la inmunización de conejos mostró el máximo de inducción de la apoptosis a una concentración de 0,7 nM e, incrementando además la concentración de anticuerpos, la actividad disminuyó ligeramente. Por el contrario, las proteínas de unión derivadas de presentación en fagos en el formato biespecífico ^{2 2}no mostró la disminución de la actividad a concentraciones altas, pero se mantuvo constante o incluso más incrementada hasta la concentración más alta. En el experimento con células G401 en cocultivo con fibroblastos GM05389, para ambos conjuntos de anticuerpos biespecíficos se alcanzó el máximo de inducción de la apoptosis ya a una concentración de 0,07 nM y, a continuación, se mantuvo constante. En este contexto, todas las moléculas se comportaron de forma similar en términos de niveles de inducción de la apoptosis.

Ejemplo 13: Comparación de formatos biespecíficos diferentes

Se ha demostrado que las moléculas biespecíficas para DR5-FAP en el formato CrossFab 2+2 se producen bien en una calidad muy buena y pueden mediar en la inducción de la apoptosis específica dependiente de la concentración en un contexto de cocultivo de dos líneas celulares. El grado de inducción de la apoptosis de estas moléculas biespecíficas está en el mismo intervalo que el observado con las proteínas de unión a DR5 correspondientes que se hiperreticularon por medio de un anticuerpo secundario anti-Fc. Para evaluar moléculas biespecíficas para DR5-FAP diferentes adicionales para determinar su capacidad de inducción de la apoptosis, se han generado las siguientes construcciones en las que las entidades de unión a DR5 y FAP se combinan en formatos diferentes y con valencias diferentes, como se muestra en la figura 25.

Tabla 14: Descripción de formatos biespecíficos de DR5-FAP alternativos

Todas las moléculas se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA y se purificaron de acuerdo con los protocolos de cromatografía con proteína A y de exclusión por tamaño estándar. Se analizaron el perfil de los productos secundarios y la calidad de las moléculas mediante análisis SDS-PAGE, SEC y Caliper.

Tabla 15: Sumario de los resultados de producción de moléculas biespecíficas para DR5-FAP adicionales

Como se resume en la tabla 15, estos formatos adicionales parecen ser más difíciles de producir y purificar en comparación con los formatos 2+2. Excepto uno (B16_E11A_001), todos muestran rendimientos de expresión más bajos que las moléculas ^{2 2}análogas. Sin embargo, los contenidos de agregados fueron bastante bajos ^{( < 2}%), pero en la mayoría de los casos también se pudieron detectar especies de peso molecular más bajo, lo que se podría deber a la purificación o degradación de las moléculas.

La actividad de inducción de la apoptosis en MDA-MB-231 se sometió a prueba en el ensayo de cocultivo con fibroblastos (fragmentación del a Dn ) a concentraciones diferentes (7,0; 0,7 y 0,07 nM). La figura 26 muestra los resultados de la actividad apoptótica de tres formatos diferentes (2+2; 2+1 y 3+1) en comparación con Drozitumab biespecífico en el formato 2+2. En este contexto, la molécula biespecífica 5E11-28H1 en el formato 2+2 mostró globalmente una actividad similar en comparación con el control con Drozitumab. A la concentración más baja, la molécula biespecífica 5E11-28H1 en el formato 2+2 había presentado una actividad incluso más alta en comparación con el control con Drozitumab. Por el contrario, los formatos 2+1 y 3+1 parecían ser menos activos en comparación con los formatos 2+2 (Drozitumab y 5E11). Si se analizan los mismos formatos con un proteína de unión a DR5 (18F11) diferente, las tres moléculas muestran una actividad de inducción de la apoptosis reducida en comparación con el anticuerpo biespecífico Drozitumab. Sin embargo, con la molécula biespecífica 18F11, se produjo la inducción de la apoptosis máxima a concentraciones más bajas (0,07 nM), mientras que la molécula basada en Drozitumab presenta una actividad más alta con una concentración creciente.

En un segundo conjunto de moléculas, se evaluó un formato 2+1 adicional para el anticuerpo biespecífico 5E11-28H1 en el que se fusionan de cabeza a cola dos restos de unión a DR5 a una parte de Fc-botón, mientras que el Fab que selecciona FAP se combina con un homólogo Fc-ojal. Se compararon los cuatro formatos en un amplio intervalo de concentraciones (que variaban de 7,0 a 0,0007 nM) en un ensayo para la fragmentación del ADN para la inducción de la apoptosis de MDA-MB-231 en cocultivo con fibroblastos GM05389 (figura 27). Ambas moléculas 2+1 tuvieron la actividad apoptótica más alta a una concentración de 0,7 nM, mientras que la molécula 3+1 mostró una inducción de la apoptosis máxima, ya a una concentración 10 veces más baja. Sin embargo, ninguno de los nuevos formatos parecía ser superior al formato ^{2 2}convencional.

Ejemplo 14: Prueba de actividad funcional de un formato biespecífico 1+1 en un sistema de ensayo de cocultivo

Además de las variantes de formato y valencia diferentes descritas en el ejemplo 12, se ha generado otra construcción en un formato 1 1 (como se representa en la figura 25 D) con la proteína de unión a DR5 0011 (= clon 174) en el Fab no entrecruzado y la proteína de unión a FAP 4B9 en el Fab entrecruzado (SEQ ID NO. 280 282). La actividad funcional del formato 1+1 se comparó con un formato 2+2 (como se representa en la figura 28 A, que contenía 0011 como proteína de unión a DR5 y 28H1 como proteína de unión a FAP; SEQ ID NO 287-289) y con la IgG quimérica de 0011 (SEQ ID NO 90-93) con o sin reticulación secundaria.

La inducción de la apoptosis se midió mediante ELISA de detección de muerte celular (CDDE, Roche n.° 11 774 425001) tras el tratamiento de las células con anticuerpos biespecíficos anti-DR5 y anti-DR5-FAP en presencia o ausencia de un anticuerpo secundario de reticulación en un sistema de cocultivo que consistía en células tumorales (MDA-MB-231) y fibroblastos (GM05389).

Día 1: Preparación de las células. La línea celular MDA-MB-231 adherida (adenocarcinoma de mama humano) se cultivó en medio DMEM (PAN) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco) y L-glutamina 2 mM (PAA), y se dividió normalmente dos veces por semana a 1:20. Los fibroblastos GM05389 se cultivaron en medio MEM Earle (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 15 % (Gibco) 1x NEAS (PAN) y L-glutamina 2 mM (PAA), y se dividieron normalmente dos veces por semana a 1:3.

Para los ensayos de cocultivo, los fibroblastos se sembraron el día 1 a una densidad de 1x10⁴células/100 pl/pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO². Se añadieron células tumorales y anticuerpos el día ².

Para los ensayos de monocultivo, las líneas celulares se sembraron en placas diferentes a la misma densidad, se incubaron durante la noche y se trataron con anticuerpos al día siguiente.

Día 2: Inducción de la apoptosis. Se aspiró el medio y se añadieron anticuerpos (IgG anti-DR5 o anticuerpos biespecíficos anti-DR5-FAP) a las células a concentraciones finales diferentes (véanse las figuras), solas o junto con el anticuerpo de reticulación (IgG antihumana de cabra, Sigma n.° I2136) en una proporción 1:1 en medio de ¹⁰⁰pl.

Para los ensayos de cocultivo, se añadieron inmediatamente células tumorales (1x10⁴células/100 pl/pocillo) en los fibroblastos después de que los anticuerpos alcanzaran un volumen final de ¹⁰⁰pl.

Los cultivos se incubaron a 37 °C durante 24 h.

Día 3: ELISA de detección de muerte celular (CDDE). Se realizó el inmunoensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche) con ligeros cambios. En resumen, se lisaron las células con 100 pl/pocillo de 2x-tampón de lisis durante 15 minutos a t. a. Se preparó una mezcla maestra que consistía en anticuerpos antihistona y anti-ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se mezcló con lisados diluidos 1:4 en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Roche). Después de una incubación de 2 horas a t. a., los pocillos se lavaron, se añadió sustrato ABTS y se incubaron a t. a. hasta que el desarrollo de color fue suficiente para el análisis fotométrico (10-30 min). La absorbancia se leyó a 405 nm con un Tecan Spectra Rainbow Reader.

Los resultados se muestran en las figuras 46 y 47.

Mientras que los anticuerpos monoespecíficos anti-DR5 (tanto 0011 quimérico como Drozitumab) no indujeron una apoptosis significativa por sí solos, la hiperagregación de las moléculas de DR5 en la superficie celular con un anticuerpo secundario dio lugar a la muerte celular a concentraciones alrededor de 0,7 mM. Sin embargo, se logró la mejor inducción de la apoptosis cuando se añadieron anticuerpos biespecíficos anti-DR5-FAP (en formato 1 1 o bien 2+2) al cocultivo, lo que dio lugar a la hiperagregación de DR5 en las células tumorales por medio del segundo resto que se une a FAP presente en la superficie de los fibroblastos (figura 46).

Mientras que los anticuerpos monoespecíficos anti-DR5 indujeron la apoptosis de las células MDA-MB-231 tras la reticulación, las moléculas biespecíficas frente a DR5 y fAp solo fueron funcionales en presencia de células tumorales que expresaban DR5 y fibroblastos asociados a tumores que expresaban FAP. Además, ninguna de las moléculas mostró ningún efecto sobre la viabilidad de los fibroblastos. (Apoptosis relativa en comparación con el control positivo de ensayo interno, véase la figura 47).

Estos datos de actividad demuestran que la inducción de la apoptosis específica de FAP también se puede lograr con un anticuerpo biespecífico para DR5-FAP en un formato 1 1 con una valencia para cada diana en una eficacia comparable a la de un formato 2+2.

Ejemplo 15: El formato biespecífico 2+2 como tecnología de plataforma genérica

Se ha demostrado que las moléculas biespecíficas para DR5-CrossFab con FAP en el formato 2+2 en las que la VHCL de 28H1 se fusiona al extremo C de la cadena pesada de 5E11 es un formato muy bueno. Para proteínas de unión a DR5 diferentes, se ha demostrado que son producibles con valores de producto razonables, son estables, solo presentan cantidades bajas de cadenas ligeras ausentes o mal apareadas y muestran de forma reproducible una buena actividad. No obstante, para extender el formato de la plataforma, se han generado moléculas biespecíficas de 5E11-28H1 adicionales que difieren en la clase y localización del punto de cruzamiento. Los cinco formatos adicionales evaluados y la molécula original se representan en la figura 28. Cuatro de las cinco moléculas adicionales no contienen un Fab de 28H1 entrecruzado, sino un dominio Fab estándar fusionado al extremo C de la cadena pesada de DR5 (5E11) (VHCH1 o bien VLCL que se fusiona mediante un conector (G⁴S)⁴).

Tabla 16: Descripción de moléculas para DR5-CrossFab con FAP adicionales

Tabla 17: Secuencias ejemplares de moléculas para DR5-CrossFab con FAP adicionales

Todas las moléculas se produjeron de forma transitoria a una escala de 200 ml en células HEK293 EBNA, se purificaron mediante cromatografía con proteína A y de exclusión por tamaño estándar y finalmente se analizaron y caracterizaron en comparación con el formato original (cruzamiento de CH1CL C terminal de 28H1 fusionado a la cadena pesada de 5E11, (molécula A, fig 28)).

Como se resume en la tabla 16, las cinco moléculas se pueden dividir en dos grupos: uno contiene los dos formatos en los que se entrecruzan todos los Fab (B E). Estas dos moléculas dieron valores de producto muy bajos e incluso después de la purificación todavía contenían cantidades altas de agregado. Por lo tanto, estas dos moléculas no se evaluaron adicionalmente. Los otros tres (cruzamiento de VHVL o CH1CL de 5E11 y cruzamiento del 28H1 C terminal como VHVL) presentaron una calidad de producto mucho mejor con respecto al rendimiento y al contenido de agregados. Las moléculas C y D también se sometieron a prueba para determinar la unión a diana en células MDA-MB-231 mediante FACS en comparación con la molécula A como se muestra en la figura 29. Además, se compararon la actividad funcional en términos de inducción de la apoptosis, la unión a diana simultánea e independiente, la estabilidad y tendencia a la agregación, así como los patrones de productos secundarios de las moléculas C, D y F con el formato A (ejemplos 22 a 25)

Ejemplo 16: Prueba de la actividad funcional de variantes de formato biespecífico 2+2 en un sistema de ensayo de cocultivo

Las cuatro variantes de formato 2+2 diferentes (formato A, C, D, F de la fig. 28) se compararon para determinar su actividad funcional para inducir la apoptosis como se mide mediante ELISA de detección de muerte celular (CDDE, Roche n.° 11 774 425 001) tras el tratamiento de las células con las construcciones en un sistema de cocultivo que consistía en células tumorales (MDA-MB-231) y fibroblastos (GM05389).

Día 1: Preparación de las células. La línea celular MDA-MB-231 adheridas (adenocarcinoma de mama humano) se cultivó en medio DMEM (PAN) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco) y L-glutamina 2 mM (PAA), y se dividió normalmente dos veces por semana a 1:20. Los fibroblastos GM05389 se cultivaron en medio MEM Earle (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 15 % (Gibco), 1x NEAS (PAN) y L-glutamina 2 mM (PAA), y se dividieron normalmente dos veces por semana a 1:3.

Para los ensayos de cocultivo, los fibroblastos y las células tumorales se sembraron en el mismo día cada uno a una densidad de 1x104 células/100 pl/pocillo en placas de 96 pocilios y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO². Para los ensayos de monocultivo se sembraron líneas celulares en placas diferentes a la misma densidad.

Día 2: Inducción de la apoptosis. Se aspiró el medio y se añadieron anticuerpos biespecíficos a las células a concentraciones finales diferentes (véanse las figuras) en medio de 100 pl.

Los cultivos se incubaron a 37 °C durante 24 h.

Los resultados se muestran en la figura 30. Inducción de la apoptosis de 4 variantes de CrossMab diferentes en los contextos de co (a) y monocultivo (b, c) como se detecta mediante fragmentación del ADN. Las 4 variantes diferentes inducen la apoptosis en células tumorales en el contexto de cocultivo de una manera dependiente de la dosis comparable. En contextos de monocultivo, no se induce ninguna apoptosis ni en la línea celular tumoral MDA-MB231 ni en la línea celular de fibroblastos GM05389, lo que destaca la especificidad y dependencia de FAP de la inducción de la apoptosis de las 4 variantes. Estos datos de actividad funcional demuestran que se puede usar el formato biespecífico 2+2 en configuraciones diferentes con respecto al tipo y sitio de cruzamiento.

Ejemplo 17: Prueba de unión a diana independiente y simultánea de variantes de formato biespecífico 2+2

Las cuatro variantes de formato 2+2 diferentes (formato A, C, D, F de la fig. 28) se compararon adicionalmente para determinar su capacidad de unirse a ambas dianas independiente y simultáneamente mediante ensayos de RPS.

Evaluación de la unión independiente a DR5 y a FAP a variantes de Crossmab diferentes

Se acoplaron alrededor de 3000 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (5 pg/ml de IgG antihumana (Fc); GE Healthcare, BR-1008-39) en un chip CM5 (g E Healthcare BR-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20 al 0,05 %), pH 7,4. La temperatura de la cubeta de lectura se fijó a 25 °C y la del bloque de muestra a 12 °C. Antes de la captura, se purgó dos veces la cubeta de lectura con tampón de migración.

El anticuerpo biespecífico se capturó inyectando una solución de 5 pg/ml durante 60 s a un flujo de 5 pl/min. La unión independiente de cada ligando al anticuerpo biespecífico se analizó determinando la capacidad de unión activa para cada ligando, añadido secuencial o bien simultáneamente (flujo de 10 pl/min):

1. Inyección de DR5 humano con una concentración de 5 pl/ml durante 180 s (identifica la única unión del antígeno).

2. Inyección de FAP humana con una concentración de 5 pl/ml durante 180 s (identifica la única unión del antígeno).

3. Inyección de DR5 humano con una concentración de 5 pg/ml y de FAP humana con una concentración de 5 pg/ml durante 180 s (identifica la unión de DR5 y de FAP al mismo tiempo).

La superficie se regeneró mediante un lavado de 60 s con una solución 3m MgCl2 a un caudal de 30 pl/min. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida a partir de una superficie anti-IgG humana.

El anticuerpo biespecífico se puede unir a ambos antígenos independientemente de forma mutua si la señal final resultante del enfoque 3 iguala a la suma de las señales finales individuales de los enfoques 1 y 2.

Tabla 18: Evaluación cuantitativa de la unión independiente a DR5 y a FAP de 4 variantes de Crossmab diferentes

Las 4 variantes de Crossmab diferentes se pueden unir a DR5 y a FAP mutuamente independientes.

Evaluación de la unión simultánea a DR5 y a FAP a Crossmab

En primer lugar, se acoplaron alrededor de 600 unidades de resonancia (UR) de DR5 (20 pg/ml) en un chip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20 al 0,05 %), pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. En segundo lugar, se inyectaron 10 pg/ml de solución del anticuerpo biespecífico durante 30 s a un flujo de 30 pl/min. En tercer lugar, se inyectó hFAP (10 pg/ml) durante 30 s a un flujo de 30 pl/min. La respuesta de unión de hFAP depende de la cantidad del anticuerpo biespecífico unido a hDR5 y muestra la unión simultánea. La superficie se regeneró mediante un lavado de 70 s con una solución de glicina a pH 2 (GE Healthcare BR-1003-55) a un caudal de 30 pl/min. La unión simultánea se muestra mediante una señal de unión específica adicional de hFAP al Crossmab unido a DR5 previo.

La evaluación de la unión simultánea a DR5 y a FAP de cuatro formatos de Crossmab (DR5TAA-0057, DR5TAA-0078, DR5TAA-0077 y DR5TAA-0081) mostró que las 4 variantes de Crossmab diferentes se pueden unir a FAP y DR5 simultáneamente.

Ejemplo 18: Prueba de estabilidad térmica y tendencia a la agregación de variantes de formato biespecífico 2+2

Las cuatro variantes de formato 2+2 diferentes (formato A, C, D, F de la fig. 28) se analizaron además para determinar su estabilidad térmica y para determinar su tendencia a formar agregados.

Estabilidad térmica

Temperatura de comienzo de la agregación: Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en histidina/cloruro de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos mediante centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 pm y se cubrieron con queroseno. El radio hidrodinámico se mide repetidamente mediante dispersión dinámica de la luz, mientras que las muestras se calientan a una velocidad de 0,05 °C/min de 25 °C a 80 °C. La temperatura de comienzo de la agregación se define como la temperatura a la que el radio hidrodinámico se empieza a incrementar.

Tendencia a la agregación

Las muestras se dializaron en tampón de formulación (His/HisCl 20 mM, trehalosa 240 mM, pH 6,0) y se ajustaron a una concentración de 1 mg/ml. Después de la filtración estéril sobre dispositivos con filtro centrífugo de 0,22 pm (Millipore), se almacenaron las muestras durante 2 semanas a 40 °C, mientras que la muestra de control se mantuvo a -80 °C. La formación de agregados se supervisó mediante SE-HPFC usando una columna TSK3000 SWXF (Tosoh) y se informó como la diferencia entre la muestra a 40 °C y a -80 °C.

Tabla 19: Evaluación de la estabilidad térmica y la tendencia a la agregación de 4 formatos de Crossmab diferentes.

La estabilidad térmica se redujo ligeramente en los formatos C, D y F en comparación con el formato original A, pero todavía con 61 °C y 60 °C en un buen intervalo.

La tendencia a la agregación fue muy baja para los formatos A, C y F y se incrementó ligeramente para el formato D.

E je m p lo 19: E v a lu a c ió n del perfil d e los p ro d u c to s s e c u n d a rio s d e v a ria n te s d e fo rm a to b ie s p e c ífic o 2+2 mediante e s p e c tro m e tría d e m a sas

Finalmente, las cuatro variantes de formato 2+2 diferentes (formato A, C, D, F de la fig. 28) se analizaron además para determinar su perfil de los productos secundarios mediante espectrometría de masas.

La masa total desglucosilada de las construcciones diferentes se determinó y confirmó por medio de ionización por electropulverización/espectrometría de masas (ESI-EM). Además, se detectaron y cuantificaron relativamente productos secundarios potenciales, tales como la sobrerrepresentación de LC. En resumen, se desglucosilaron 100 pg de anticuerpos purificados a una concentración de proteínas de hasta 3 mg/ml con 14 U de N-glucosidasa F (Roche) en NaH2PO4/Na2HPO4 100 mM, pH 7, a 37 °C durante 2 h y se desalaron posteriormente mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa total desglucosilada se determinó por medio de ESI-EM en un sistema de EM maXis UHR-TOF (Bruker) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).

Las construcciones de anticuerpos biespecíficos para DR5-FAP diferentes se analizaron mediante espectrometría de masas en su forma desglucosilada para evaluar la identidad e integridad del producto. La identidad se pudo confirmar para todas las construcciones evaluadas. Además, las diferentes construcciones mostraron varios productos secundarios, por ejemplo, con una sobrerrepresentación de un tipo de LC o con pérdida de una o dos LC. Todas las construcciones tenían perfiles de los subproductos cualitativa y cuantitativamente similares.

Todos los resultados de los ejemplos 13 y 30-33 muestran claramente que se puede usar el formato biespecífico 2+2 en configuraciones diferentes con respecto al tipo y sitio de cruzamiento. Esto hace al formato CrossFab 2+2 una tecnología de plataforma ampliamente aplicable.

E je m p lo 20: Las m o léc u las b ie s p e c ífic a s d e D ro z itu m a b -F A P p res en tan u na e fic a c ia in vivo s u p e rio r a la d e D ro z itu m a b no s e le c c io n a d o

Se ha demostrado en ensayos de actividad in vitro que Drozitumab biespecífico-FAP presenta una actividad de inducción de la apoptosis superior en comparación con Drozitumab solo que no está reticulado. Para evaluar si esto también se traduce en eficacia in vivo en modelos de tumores de ratón pertinentes, se han configurado modelos de xenoinjerto diferentes. Un problema con los modelos de tumores de ratón estándar es que la expresión de FAP normalmente es muy baja y no refleja en absoluto la situación humana. Para establecer modelos que se parezcan más estrechamente a la expresión de FAP en el estroma tumoral humano, se coinyectaron fibroblastos murinos (células 3T3) genomanipulados que expresan de forma recombinante FAP de ratón con las líneas celulares tumorales respectivas (línea celular de carcinoma colorrectal DLD-1 en ratones atímicos y línea de cáncer de mama MDA-MB-231 en ratones SCID). Para este propósito, se transfectaron de forma estable fibroblastos 3T3 con un plásmido que tiene un casete de expresión para el gen FAP murino de longitud completa bajo el control del promotor MPSV. Para la selección de clones estables, el vector lleva además otro casete de expresión para una puromicina acetiltransferasa que confiere resistencia a la puromicina. Se han seleccionado varios clones que expresan niveles diferentes de FAP murina como se juzga mediante los experimentos de unión por FACS. Se coinyectó una línea celular mu FAP-3T3 seleccionada con la línea celular tumoral DLD-1, lo que dio lugar a un crecimiento tumoral significativamente potenciado en comparación con las células DLD-1 inyectadas sin células 3T3 que expresaban mu FAP. Además, el análisis IHQ que usa anticuerpos anti-FAP humanos / de ratón de reactividad cruzada ha demostrado niveles altos de expresión de FAP en el estroma que rodea al tumor para ambas líneas celulares, como se esperaba. Por lo tanto, se usó este modelo de xenoinjerto subcutáneo coinjertado para evaluar la eficacia in vivo de la molécula de Drozitumab biespecífico-FAP en comparación con el anticuerpo Drozitumab no seleccionado original. Se coimplantaron 2x106 células tumorales con un 20 % de fibroblastos 3T3 que expresaban FAP murina. Doce (DLD-1) y diez días (MDA-MB-231) después de que se iniciara el tratamiento de implante de células tumorales. A los animales se les inyectó (i.v.) tampón, Drozitumab (10 mg/kg) o bien Drozitumab-FAP (10 mg/kg). Para compensar la diferencia de peso molecular de Drozitumab frente a Drozitumab biespecífico (Drozitumab es solo un 60 % de la masa molecular de la molécula biespecífica), este último se administró dos veces por semana, mientras que Drozitumab solo se administró una vez a la semana. En la figura 31 se resume el incremento de los volúmenes tumorales medios en mm3 con el tiempo. La figura 31 A muestra la eficacia in vivo de Drozitumab-FAP en comparación con Drozitumab y el control con tampón en el modelo de coinyección DLD-1 / mu FAP-3T3. Mientras que Drozitumab solo demostró una eficacia antitumoral moderada, dando como resultado una inhibición del crecimiento tumoral (ICT) de un 36 % en comparación con el control, la molécula biespecífica presentó una inhibición del crecimiento tumoral de un 99 % al final del estudio (día 33). En el modelo de coinyección de MDA-MB-231 / mu FAP-3T3, esta diferencia es incluso más pronunciada, puesto que en este modelo Drozitumab solo no mostró ninguna eficacia mejor que el control con tampón, mientras que el anticuerpo biespecífico Drozitumab-FAP presentó una inhibición del crecimiento tumoral de un 77 % al final del estudio el día 32 (figura 31 B). Este resultado podría indicar que la línea celular MDA-MB-231 es más resistente a la inducción de la apoptosis que la línea celular DLD-1.

Ejemplo 21: Evaluación de la actividad antitumoral de las moléculas biespecíficas para DR5-FAP usando proteínas de unión a DR5 recién aisladas en combinación con CrossFab con FAP 28H1.

La eficacia in vivo de tres proteínas de unión a DR5 diferentes (5E11, 174 y 422) en formato biespecífico fusionadas al anticuerpo 28H1 anti-FAP cuando se comparó paralelamente CrossFab en modelos de xenoinjerto de DLD-1 y MDA-MB-231, cada uno coinyectado con fibroblastos 3T3 que expresaban FAP murina. Se incluyó una cuarta molécula que consistía en 5E11-CrossFab con 28H1 con mutaciones en la región Fc que suprimen completamente la unión a los receptores Fcy (mientras que no se cambia la afinidad con respecto a FcRn). Para este propósito, se llevaron a cabo transfecciones transitorias y producciones a gran escala para generar suficiente material en células HEK.

Tabla 20: Producción de anticuerpos biespecíficos para experimentos in vivo. Todos los materiales presentaron un contenido de endotoxinas aceptable de < 0,23 UE/mg.

* L234A; L235A; P329G

Todas las moléculas se produjeron con buenos rendimientos con excelente calidad con respecto al contenido de agregados y endotoxinas. Se analizó la unión a los antígenos pertinentes mediante procedimientos diferentes (RPS y FRET) como se resume en la tabla 21.

Tabla 21 a: Afinidades / avideces de moléculas biespecíficas para DR5-FAP con respecto a antígenos humanos y de macaco cangrejero

* Mediciones con Biacore TagLite

Antes de que se iniciaran los experimentos in vivo, los materiales se sometieron a prueba en primer lugar para determinar la actividad de inducción de la apoptosis in vitro. La figura 32 resume los resultados de un ELISA de detección de muerte celular en el que se compararon cuatro moléculas biespecíficas para DR5-FAP diferentes a las concentraciones de 7,0, 0,7 y 0,07 nM. Se configuró el ensayo como un ensayo de cocultivo en el que se usaron las células DLD-1 como las células seleccionadas y las células 3T3 o 3T3 recombinantes que expresaban FAP murina sirvieron como las células efectoras para la reticulación. En el experimento de cocultivo con DLD-1 3T3 apenas se detectó ninguna inducción de la apoptosis en células DLD-1, mientras que en el contexto con células 3T3 que expresaban FAP se observó un incremento de 10 veces de la inducción de la apoptosis, lo que indica que esta actividad se debe a la reticulación por medio de FAP en la superficie de las células 3T3 recombinantes. Se realizó un experimento similar en el que se usaron las mismas moléculas biespecíficas, células diana y efectoras, para determinar la viabilidad de las células tras el tratamiento con los anticuerpos biespecíficos agonistas para DR5-FAP. Los resultados de este experimento se resumen en la figura 33. Aquí, solo se observó una reducción significativa de la viabilidad de las células de las células DLD-1 en presencia de células 3T3 que expresaban FAP mientras que con células 3T3 no modificadas (que no expresan FAP murina) no se observó ninguna reducción de la viabilidad.

Se usaron las cuatro moléculas biespecíficas para DR5-FAP para evaluar la eficacia in vivo en dos modelos de tumores diferentes, ambos coinyectados con un 20 % de fibroblastos 3T3 que expresaban FAP murina. Los resultados de estos experimentos de eficacia in vivo se muestran en la figura 34. Después del prendimiento del injerto del tumor y células de fibroblastos, el tratamiento se inició con 10 mg/kg administrados dos veces por semana por vía intravenosa (i.v.). Sin lugar a dudas, las cuatro moléculas pudieron controlar el crecimiento tumoral en ambos modelos, como se demuestra mediante la inhibición del crecimiento tumoral (ICT) significativa en comparación con el control con vehículo. El porcentaje absoluto de inhibición del crecimiento tumoral al final del estudio estaba en un intervalo similar para las cuatro moléculas. Se obtuvieron los siguientes resultados para el modelo DLD-1 y MDA-MB-231, respectivamente: 5E11_28H1 (Fc wt): 75 % / 95 %; 5E11_28H1 (PGLALA): 83 % / 99 %; clon 174: 66 % / 87 % y clon 422: 73 % / 89 %. Todas las moléculas fueron ligeramente más potentes en el modelo MDA-MB-231 que en el experimento con DLD-1.

Tabla 21 b): Sumario de las características del anticuerpo biespecífico para DR5-FAP preferente

Ejemplos 22 a 25: Generación y caracterización de restos de unión a DR5 nuevos mediante inmunización

Además de la selección de los anticuerpos para DR5 nuevos con propiedades mejoradas de una colección de presentación en fagos (como se describe anteriormente), también se generaron anticuerpos para DR5 nuevos mediante inmunización de conejos (ejemplos 22-25) seguido de una caracterización intensiva (ejemplos 26-28).

Ejemplo 22: Inmunización de conejos

Se inmunizó un conjunto de conejos con 400 pg de DR5 humano recombinante (fusión a Fc monomérico), se emulsionó con adyuvante completo de Freund, el día 0 mediante aplicación intradérmica, y con 200 pg cada uno de DR5-huFc, se emulsionó con adyuvante completo de Freund, en los días 7, 14, 35, 63 y 91, alternando aplicaciones intramusculares y subcutáneas. Se extrajo sangre (10 % de la volemia total estimada) en los días 21, 41, 69 y 97. Se preparó suero, que se usó para la determinación de los valores mediante ELISA (véase a continuación), y se aislaron células mononucleares periféricas, que se usaron como fuente de linfocitos B específicos de antígeno en el procedimiento de clonación con linfocitos B (ejemplo 17).

Se inmunizó genéticamente otro conjunto de conejos, usando un vector de expresión plasmídico que codificaba DR5 humano que carecía del dominio de muerte intracelular, mediante aplicación intradérmica de 400 pg de ADN vector, seguido de electroporación (5 pulsos cuadrados de 750 V/cm, duración de 10 ms, intervalo de 1 s). Los conejos recibieron 6 inmunizaciones consecutivas en los días 0, 14, 28, 49, 77 y 105. Se extrajo sangre (10 % de la volemia total estimada) en los días 35, 56, 84 y 112. Se preparó suero, que se usó para la determinación de los valores mediante ELISA (véase a continuación), y se aislaron células mononucleares periféricas, que se usaron como fuente de linfocitos B específicos de antígeno en el procedimiento de clonación con linfocitos B (ejemplo 23).

Determinación de los valores séricos

Se inmovilizó DR5 humano (fusión a Fc monomérico) en una placa NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 0,3125 pg/ml, 100 pl/pocillo, en PBS, seguido de bloqueo de la placa con Crotein C al 2 % en PBS, 200 pl/pocillo; aplicación de diluciones en serie de antisueros, por duplicado, en Crotein C al 0,5 % en PBS, 100 pl/pocillo; detección con anticuerpo anti-IgG de conejo de asno conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch) diluido 1:16000 en Crotein C al 0,5 % en PBS, 100 pl/pocillo. Para todas las etapas, las placas se incubaron durante 1 h a 37 °C. Entre todas las etapas, las placas se lavaron 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se desarrolló la señal mediante adición de BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 pl/pocillo; y se detuvo mediante adición de HCl 1 M, 100 pl/pocillo. La absorbancia se leyó a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros que da como resultado una señal semimáxima.

Ejemplo 23: Clonación de linfocitos B de conejos

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de conejo

Se usaron tres conejos (descritos en el ejemplo "Inmunización de conejos") como fuente de sangre. Se diluyó dos veces la sangre entera que contenía EDTA con 1x PBS (PAA, Pasching, Austria) antes de la centrifugación por densidad usando Lympholyte Mammal (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canadá) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las PBMC se lavaron dos veces con 1x PBS.

Medio EL-4 B5

RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) complementado con FCS al 10 % (Hyclone, Logan, UT, EE. UU.), glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina al 1 % (pAa , Pasching, Austria), piruvato de sodio 2 mM, HEPE 10 mM (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania) y b-mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco, Paisley, Escocia)

Reducción de macrófagos/monocitos

Se usaron placas de 6 pocillos estériles (calidad para el cultivo de células) para reducir los macrófagos y monocitos a través de adhesión inespecífica. Cada pocillo se llenó como máximo con 4 ml de medio y hasta 6x106 PBMC del conejo inmunizado y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la incubadora. Se usaron las células en el sobrenadante (linfocitos de sangre periférica (PBL)) para la etapa de selección de antígeno.

Recubrimiento de placas

Para la selección en placas de 6 pocillos recubiertas con estreptavidina estériles (Microcoat, Bernried, Alemania), se recubrieron con 2 pg/ml de d R5 humano recombinante biotinilado (fusión a Fc monomérico) en PBS durante 3 h a temperatura ambiente. Para la selección en células positivas para DR5 en superficie humanas, se sembraron células G401 en placas de 6 pocillos de cultivo de células estériles y se cultivaron para generar una monocapa de células confluentes. Antes de la selección, estas placas de 6 pocillos se lavaron tres veces con PBS estéril.

Enriquecimiento de linfocitos B en la proteína DR5 humana

Se sembraron placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubiertas con proteína DR5 humana o cubiertas con células G401 DR5-positivas humanas con hasta 6x106 PBL por 4 ml de medio y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la incubadora. Después de la etapa de enriquecimiento en el antígeno d R5, se retiraron las células no adheridas lavando cuidadosamente los pocillos 1-2 veces con 1 x PBS. Las células adherentes restantes se desprendieron mediante tripsina durante 10 min a 37 °C en la incubadora. La tripsinización se detuvo con medio EL-4 B5. Las células se mantuvieron en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

Tinción con inmunofluorescencia y citometría de flujo

Se usó anti-IgG con FITC (AbD Serotec, Dusseldorf, Alemania) para la clasificación de células individuales. Para la tinción superficial, se incubaron las células de la etapa de reducción y enriquecimiento con el anticuerpo anti-IgG con FITC en PBS y se incubaron durante 45 min en oscuridad a 4 °C. Después de la tinción, se lavaron dos veces las PBMC con PBS enfriado en hielo. Finalmente, las PBMC se resuspendieron en PBS enfriada con hielo y se sometieron inmediatamente a los análisis por FACS. Se añadió yoduro de propidio en una concentración de 5 pg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.) antes de los análisis por FACS para discriminar entre las células muertas y vivas. Se usaron un Becton Dickinson FACSAria equipado con un ordenador y el programa informático FACSDiva (BD Biosciences, EE. UU.) para la clasificación de células individuales.

Cultivo de linfocitos B

El cultivo de las linfocitos B de conejo se preparó mediante un procedimiento similar al descrito por Zubler et al. (1985). En resumen, se incubaron linfocitos B de conejo clasificados individuales en placas de 96 pocillos con 200 pl/pocillo de medio EL-4 B5 que contenía células Pansorbin (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemania), sobrenadante de timocito de conejo al 5 % (carga TSN-M13 (10242), MicroCoat, Bernried, Alemania) y células de timoma EL-4-B5 murinas irradiadas con rayos gamma (2,5 x 104/pocillo) durante 7 días a 37 °C en una atmósfera de un 5 % de CO²en la incubadora. Los sobrenadantes del cultivo de linfocitos B se retiraron para el cribado y se obtuvieron inmediatamente las células restantes y se congelaron a -80 °C en 100 pl de tampón RLT (Qiagen, Hilden, Alemania).

Ejemplo 24: PCR de linfocitos B y expresión recombinante

Aislamiento de ácido ribonucleico (ARN)

Las células de las que se tenía que aislar el ARN se sedimentaron en primer lugar mediante centrifugación. El sedimento celular se lisó mediante la adición de 100 pl de tampón RLT con 10 pl/ml de beta-mercaptoetanol. Las células se resuspendieron mediante mezclado múltiple con una pipeta y se transfirieron a una placa de múltiples pocillos. La placa se centrifugó brevemente a 200 x g y se congeló a -20 °C. El aislamiento del ARN se realizó con el kit NucleoSpin® 96 RNA (Macherey y Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa

La transcripción inversa se realizó con Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo con AccuPrime Pfx SuperMix (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada se amplificaron en reacciones separadas. Se usaron cebadores de PCR con solapamientos de 25 pb para seleccionar los vectores de expresión de anticuerpos. Los productos de PCR se purificaron con el kit NucleoSpin® 96 Extract II (Macherey & Nagel).

Secuenciación y clonación SLIC

Se secuenciaron los productos de PCR para determinar las secuencias de ADN de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. Los productos de PCR se clonaron en vectores de expresión mediante el llamado procedimiento de clonación SLIC, que se describe por Haun, R.S., et al., en BioTechniques 13 (1992) pp. 515-518 y Li, M.Z., et al, en Nature Methods 4 (2007) pp. 251-256. Los plásmidos para la expresión del anticuerpo se linealizaron mediante digestión con enzimas de restricción. Los plásmidos linealizados se purificaron mediante electroforesis en agarosa preparativa y se extrajeron del gel (Qiaquick Gel Extraction Kit / Qiagen). Los plásmidos purificados se añadieron a un protocolo de PCR usando cebadores solapantes (cavidad de 25 pb) para que se clone el producto de PCR. Tanto el vector como el inserto se trataron con ADN polimerasa T4 (Roche Applied Sciences) en ausencia de dNTP para generar protuberancias, a continuación, el vector y el inserto se incubaron con proteína RecA (New England Biolabs) y ATP para promover la recombinación. Los productos se transformaron en E. coli. Los ADN plasmídicos para la cadena ligera y las cadenas pesadas se aislaron y cada pareja se combinó para las transfecciones transitorias.

Transfección transitoria para la expresión de anticuerpos en células HEK293

Las células HEK293 (Invitrogen) se cultivaron en medio F17 (Gibco) a 1 x 106 células/ml. Se transfectaron 2 x 106 células HEK293 con 1 pg de plásmidos HC LC suspendidos en 293-Free (Novagen) y OptiMEM® (Gibco). Después de 7 días de incubación, se obtuvieron los sobrenadantes, se purificaron por medio de proteína A y se analizaron.

Ejemplo 25: Cribado de anticuerpos para DR5 derivados de inmunización

Los sobrenadantes de cultivo de linfocitos B se cribaron mediante múltiples ensayos de unión basados en ELISA paralelos en placas de microvaloración de 384 pocillos. Los anticuerpos que se unen a las células G401 que expresan DR5 y a DR5 humano recombinante biotinilado (fusión a Fc monomérico) y DR5 de macaco cangrejero (fusión a Fc dimérico), pero no a DR4 humano (TNFRSF10A; n.° de cat. de R&D Systems 347-DR-100) e IgG1 humana se seleccionaron como aciertos primarios. En un cribado secundario, se sometieron a prueba nuevamente los anticuerpos micropurificados expresados de forma recombinante en células HEK para determinar su unión a DR5 humano y de macaco cangrejero y adicionalmente para determinar la ausencia de unión a DR4 humano, DcR1 humano (interno), DcR2 humano (interno) u osteoprotegerina (OPG; n.° de cat. de R&D Systems 805-05 100). Además, se sometieron a prueba los anticuerpos en un ensayo de apoptosis funcional (ELISA de detección de muerte celular) en células G401 en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-Fc humano de reticulación. Solo se seleccionaron los anticuerpos que podían inducir la apoptosis tras la reticulación mediada por Fc (pero no en su ausencia) para su caracterización y desarrollo adicionales.

Se verificaron las secuencias de anticuerpos seleccionados después del cribado secundario y clonados en plásmidos de expresión mediante el procedimiento de clonación SLIC mediante subclonación y resecuenciación de las cadenas ligeras variables y pesadas variables.

A continuación, se usaron estos plásmidos de expresión subclonados y verificados en secuencia para transfecciones transitorias a escala más grande de células HEK293F, seguido de una purificación con proteína A, lo que permitió otras etapas de caracterización más intensificadas.

Ejemplo 26: Caracterización de las propiedades de unión de anticuerpos para DR5 derivados de inmunización

Los anticuerpos para DR5 seleccionados de la inmunización de conejos se caracterizaron para determinar sus propiedades de unión, reactividad cruzada con especies y especificidad mediante análisis por ELISA de unión y RPS.

Unión de anticuerpos monoclonales a receptores de unión a TRAIL (inmunoensayo)

Se realizaron inmunoensayos de unión a antígeno a temperatura ambiente en placas de microvaloración de 384 pocillos recubiertas con estreptavidina (MicroCoat Biotechnologie GmbH) con tampón PBS complementado con Tween®-20 al 0,05 % y BSA al 0,5 % (Roche Diagnostics GmbH). Se añadieron 125 ng/ml de proteína DR5 humana biotinilada (fusión a Fc monomérico) (interna) o 63 ng/ml de proteína DR5 biotinilada para hFc de macaco cangrejero (interna) o 63 ng/ml de proteína DcR2 biotinilada (TNFRSF10D) (interna) a los pocillos que contenían una mezcla de 1:3000 de conjugado anti-Fc de conejo-HRP (GE Healthcare) diluido y 1:50 de sobrenadantes de linfocitos B diluidos. Después de 90 min de incubación, la placa se lavó 6 veces con PBST (solución salina tamponada con fosfato con Tween®-20 al 0,2 %) y se desarrolló con solución de sustrato BM blue® HRP (BM blue®: 3,3'-5,5'-tetrametilbencidina, Roche Diagnostics GmbH) durante 30 minutos a t. a. La absorbancia se midió a 370 nm. El valor del blanco se definió sin adición de sobrenadante.

Para la selección negativa frente a la marca hFc del inmunógeno, se usó un inmunoensayo con una mezcla de IgG antihumana biotinilada (específica de Fab) de Jackson ImmunoResearch (n.° de cat. 109-066-006), IgG1 humana (interna) y conjugado anti-Fc de conejo-HRP y se procesó como se describe. Para someter a prueba la unión a receptores de unión a Trail relacionados como DR4 humano (TNFRSF10A; n.° de cat. de R&D Systems 347-DR-100), osteoprotegerina humana (OPG; n.° de cat. de R&D Systems 805-05-100) y DcR 1 humano (TNFRSF10C; n.° de cat. de R&D Systems 630-TR-100) se estableció un inmunoensayo capturando la quimera proteína-hFc respectiva con anticuerpo anti-Fc humano (n.° de cat. de Jackson ImmunoResearch 109-006-098) en una placa de microvaloración de 384 pocillos MaxiSorp (Sigma-Aldrich, Nunc).

Tabla 22: Unión de anticuerpos para DR5 (IgG de conejo) derivados mediante inmunización a DR5 humano (fusión a Fc monomérico) y DR5 de macaco cangrejero detectados mediante ELISA bioquímico (CE50 [ng/ml]). No se detectó ninguna unión significativa a DR5 de ratón, DR4 humano, DcR1, DcR2 y osteoprotegerina (datos no mostrados)

Los anticuerpos para DR5 seleccionados de la inmunización de conejos muestran propiedades de unión a DR5 humano y de macaco cangrejero buenas y comparables en ELISA, mientras que no reconocen DR5 murino. Todos los anticuerpos seleccionados son altamente específicos para DR5, ya que no dieron señales significativas en el ELISA de unión con respecto a DR4, DcR1, DcR2 y osteoprotegerin humanos.

Afinidad cinética por DR5

Se acoplaron alrededor de 3000-5000 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (10 pg/ml anticonejo de cabra; código de pedido JIR111 -005-046; Jackson Immuno Research) en un chip CM5 (GE Healthcare b R-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20 al 0,05 %), pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra se fijó a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración.

Los anticuerpos para DR5 se capturaron inyectando una solución de 1 pg/ml durante 30 s a un flujo de 10 pl/min. Se midió la asociación mediante inyección de DR5 humano recombinante (proteína de fusión His-Avi monomérica, interna) en diversas concentraciones en solución durante 120 s a un flujo de 30 pl/min, partiendo de 100 nM hasta 0,41 nM en diluciones 1:3. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 300 s y se activó al cambiar de la solución de muestra al tampón de migración. La superficie se regeneró mediante un lavado de 60 s con una solución de H3PO4 (ácido fosfórico) 100 mM a un caudal de 30 pl/min. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida a partir de una superficie de blanco. Las inyecciones de tampón también se sustraen (= referencia doble). Para el cálculo de KD y otros parámetros cinéticos se usó el modelo 1:1 de Langmuir.

Tabla 23: Afinidades cinéticas de anticuerpos para DR5 (IgG de conejo) derivados mediante inmunización

Ejemplo 27: Caracterización funcional de anticuerpos para DR5 derivados de inmunización

Fragmentación del ADN y viabilidad de las células

Los anticuerpos para DR5 se caracterizaron funcionalmente evaluando la apoptosis y la viabilidad de las células como se mide mediante ELISA de detección de muerte celular (CDDE, Roche n.° 11774425001) y Cell Titer Glo (CTG, Promega n.° G7573), respectivamente, tras el tratamiento con anticuerpos anti-DR5 en presencia o ausencia de un anticuerpo de reticulación.

Preparación de las células: la línea celular MDA-MB-231 adheridas (adenocarcinoma de mama humano) se cultivó en medio DMEM (PAN) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco) y L-glutamina 2 mM (PAA), y se dividió normalmente dos veces por semana a 1:10. Para el ensayo, se lavaron las células con PBS, se desprendieron del matraz con Accutase (PAA), se sembraron en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 1x104 células/pocillo (CDDE) o 0,25x104 células/pocillo (CTG) en 50 pl y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO².

Inducción de la apoptosis mediante anticuerpos anti-DR5 de conejo: se añadieron muestras (IgG anti-DR5 de conejo, DR5-TAA-n.°) a las células a concentraciones diferentes, solas o junto con el anticuerpo de reticulación (IgG anticonejo de cabra, Jackson Immunoresearch) en una proporción 1:1 en 50 pl en PBS, para inducir la reticulación de los receptores DR5, lo que dio lugar a la apoptosis. Las células se incubaron a 37 °C durante 24 h (CDDE) o 48 h (CTG).

A) Elisa de detección de muerte celular (CDDE): el inmunoensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche). En resumen, se aspiraron cuidadosamente los sobrenadantes y se lisaron las células con 200 pl/pocillo de tampón de lisis durante 30 minutos a t. a. Se preparó una mezcla maestra que consistía en anticuerpos antihistona y anti-ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se mezcló con los lisados diluidos 1:4 en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Roche). Después de una incubación de 2 horas a t. a., los pocillos se lavaron, se añadió sustrato ABTS y se incubaron a t. a. hasta que el desarrollo de color fue suficiente para el análisis fotométrico (10-30 min). La absorbancia se leyó a 405 nm con un Tecan Spectra Rainbow Reader.

La figura 35 muestra los resultados de este experimento: Los anticuerpos anti-DR5 de conejo generados pudieron inducir la apoptosis de células MDA-MB231 con potencias diferentes, pero siempre de una manera dependiente de la dosis y solo después de la reticulación mediada por Fc de las moléculas de DR5. En ausencia de un anticuerpo secundario específico anti-Fc de conejo, no se detectó ninguna muerte celular significativa.

B) Cell Titer Glo (CTG): el inmunoensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). En resumen, en primer lugar se lisaron las células en el tampón que contenía el sustrato de luminiscencia (100 pl). Después de un periodo de incubación de 10 minutos en un agitador, se midió la luminiscencia con el lector TECAN Infinite Plus.

La figura 36 muestra los resultados de este experimento: La viabilidad de las células se reduce mediante los anticuerpos anti-DR5 tras la hiperagregación del receptor de una manera dependiente de la dosis. Los anticuerpos anti-DR5 de conejo generados pudieron disminuir la viabilidad de las células MDA-MB231 con potencias variables, pero siempre de una manera dependiente de la dosis y solo después de la reticulación mediada por Fc de las moléculas de DR5. En ausencia de un anticuerpo secundario específico anti-Fc de conejo, la viabilidad de las células no se vio afectada en ninguna concentración de anticuerpos.

Viabilidad de las células y activación de caspasa 8

Se llevaron a cabo los ensayos de activación de caspasa 8 Caspase8-Glo (n.° de cat. de Promega G8202) y los ensayos de viabilidad de las células CellTiter-Glo (n.° de cat. de Promega TB288) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para los ensayos de activación de caspasa 8, se sembraron 10.000 células cancerosas en 75 pl por pocillo en placas blancas y opacas de 96 pocillos (n.° de cat. de BD Falcon BD353296) y se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO²durante la noche. A continuación, se añadieron anticuerpos anti-DR5 junto con anticuerpos anti-Fc de conejo (igual concentración molar de anticuerpos para DR5 y para Fc de conejo en 25 pl) en 6 diluciones en serie. Los anticuerpos se incubaron en las células a 37 °C con un 5 % de CO²durante 3 horas. A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 pl de sustrato para caspasa 8 en tampón de lisis y se mezcló bien. Después de la incubación de otros 30 minutos a 37 °C, se leyó la señal de luminiscencia en una placa Spectra Max M5.

Para los ensayos de viabilidad de las células, se sembraron 4.000 células cancerosas por pocillo en placas de fondo negro/transparente de 96 pocillos (n.° de cat. de BD Falcon BD353220) y se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO²durante la noche. A continuación, se añadieron anticuerpos anti-DR5 junto con anticuerpos anti-Fc de conejo (igual concentración molar de anticuerpos para DR5 y para Fc de conejo en 25 pl) en 6 diluciones en serie. Los anticuerpos se incubaron en las células a 37 °C con un 5 % de CO²durante 48 horas. A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 pl de reactivo de CellTiter-Glo y se mezcló bien. Después de la incubación de otros 10 minutos a temperatura ambiente, se leyó la señal de luminiscencia en un lector de placas Spectra Max M5.

La figura 37 muestra el análisis de la inhibición de la proliferación celular (ensayo Cell TiterGlo) de tres células tumorales humanas diferentes (DLD-1, NCI H460 y m DA-MB-231) tras el tratamiento con anticuerpos para DR5 reticulados diferentes a una concentración de 7 nM. La figura 38 muestra la inducción de la apoptosis medida mediante la activación de caspasa 8 en tres líneas celulares tumorales humanas (DLD-1, NCI H460 y MDA-MB-231) después del tratamiento con anticuerpos para DR5 reticulados a una concentración de 7 nM. Todos los anticuerpos para DR5 sometidos a prueba inducen una activación de caspasa 8 alta en todas las líneas celulares tumorales sometidas a prueba. Los anticuerpos para DR5 pudieron disminuir la viabilidad de todas las líneas celulares sometidas a prueba con potencias variables.

Ejemplo 28: evaluación de la estabilidad química de anticuerpos para DR5 derivados mediante presentación en fagos e inmunización

Generación de muestras de anticuerpo para DR5 sometidas a agresión

Para someter a prueba la estabilidad química de los anticuerpos para DR5, se generaron muestras sometidas a agresión y se caracterizaron funcionalmente con respecto a la unión a DR5. La agresión por pH alto induce, entre otras cosas, la desamidación de los puntos calientes de Asn reactiva, mientras que a un pH de 6,0, por ejemplo, se puede inducir la formación de succinimida a partir de residuos de Asn y Asp reactivos. Para la agresión por pH alto, se transfirieron las muestras en fosfato de sodio 20 mM, pH 8,0, y se incubaron durante 5 días a 40 °C. Para la agresión por pH bajo, se transfirieron las muestras a His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, y se incubaron durante 3 semanas a 40 °C. Una muestra de control se mantuvo a -80 °C.

Determinación de la concentración activa relativa de muestras de anticuerpo para DR5 sometidas a agresión

Se acoplaron alrededor de 5000 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (20 pg/ml anticonejo de cabra; código de pedido JIR111-005-046; Jackson Immuno Research) en un chip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20 al 0,05 %), pH 7,4. La temperatura de la cubeta de lectura se fijó a 25 °C y la del bloque de muestra a 12 °C. Antes de la captura, se purgó dos veces la cubeta de lectura con tampón de migración.

El anticuerpo biespecífico se capturó inyectando una solución 50 nM durante 60 s a un flujo de 10 pl/min. Se midió la asociación mediante inyección de DR5 humano en solución durante 90 s a un flujo de 30 pl/min a una concentración de 200 nM. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 90 s y se activó al cambiar de la solución de muestra al tampón de migración. La superficie se regeneró mediante un lavado de 60 s con una solución de H3PO4 (ácido fosfórico) al 0,85 % a un caudal de 30 pl/min. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida a partir de una superficie de blanco.

La concentración activa relativa del anticuerpo sometido a agresión es la proporción calculada a partir del nivel de captura y el nivel de unión (la unión en UR dividida por la captura en UR, en comparación con la muestra de referencia no sometida a agresión).

La figura 39 muestra una curva de respuesta ejemplar usada para la determinación de la concentración activa relativa de muestras de anticuerpo para DR5 sometidas a agresión. Las figuras 40 y 41 muestran concentraciones activas relativas de anticuerpos para DR5 originales y sometidos a agresión derivados de inmunización y de presentación en fagos. Además de los anticuerpos DR5TAA-0013 y DR5TAA-0010 que mostraron concentraciones activas relativas ligeramente reducidas después de la agresión a pH 6 y pH 8, respectivamente, todos los demás anticuerpos para DR5 no mostraron ninguna reducción pertinente de la concentración activa relativa después de la agresión por pH.

Ejemplo 29: Caracterización funcional de la proteína de unión a DR5 derivada mediante inmunización y presentación en fagos en formato biespecífico 2+2 en ensayos de cocultivo

Para evaluar si se pueden usar las proteínas de unión a DR5 novedosas derivadas mediante inmunización para la generación de anticuerpos biespecíficos para la inducción seleccionada de la apoptosis de células tumorales mediante hiperreticulación de d R5, se convirtió un conjunto de anticuerpos para DR5 en moléculas biespecíficas 2+2 (como se representa en la figura 18 A) en combinación con el anticuerpo 28H1 para FAP. Se sometieron a prueba las construcciones biespecíficas para determinar su actividad de inducción de la apoptosis en un ensayo de cocultivo.

Se siembran células tumorales DLD-1 o H460 (10.000 células/pocillo) en placas de 96 pocillos en cocultivo con células 3T3 o con células 3T3 transfectadas para expresar 2.500 células/pocillo de FAP murina) en un volumen total de 150 pl para tener en cuenta las muestras por triplicado para cada tratamiento. Después de 24 h, las células se tratan con 50 pl de anticuerpos (concentración 4X) durante 24 h (control no tratado: 50 pl de medio).

ELISA de detección de muerte celular: (n.° de cat. de Roche Applied Science 11774425001): El procedimiento se sigue exactamente como se establece en el protocolo del fabricante. Los valores Vmáx se extrapolan a partir de la medición de los ab a 405 nm (menos el valor de longitud de onda de referencia a 490 nm) cada minuto durante 10 minutos. Un promedio de los valores de fondo por triplicado (tampón de lisis solo) se sustrae de todas las muestras. Los datos se expresan como incremento en veces sobre la apoptosis en muestras no tratadas.

La figura 43 muestra la inducción de la apoptosis en líneas celulares tumorales DLD-1 y H460 mediante construcciones biespecíficas 2+2 en ensayos de cocultivo como se detecta mediante la fragmentación del ADN. Mientras que una construcción biespecífica que contiene Drozitumab como componente de unión a DR5 ya induce la apoptosis en ausencia de FAP, todas las construcciones que contienen proteínas de unión a DR5 nuevas derivadas mediante inmunización solo inducen la apoptosis en presencia de FAP. Las construcciones con proteínas de unión a DR5 recién desarrolladas, tales como 0011-28H1 y 0016-28H1, pueden inducir la apoptosis en alto grado, especialmente a concentraciones bajas, en comparación con la construcción biespecífica que contiene Drozitumab.

Ejemplo 30: Caracterización de la unión celular de la proteína de unión a DR5 derivada mediante inmunización y presentación en fagos en formato biespecífico 2+2

Las células se tiñeron (5x104/50 pl) con 24 pg/ml de cada construcción DR5-FAP o Drozitumab en tampón de tinción (PBS FCS al 5 %) durante 1 h en hielo. Después de lavar dos veces, se añadió el anticuerpo secundario anti-Ig humana de cabra AF488 (Invitrogen n.° A11013) a 10 pg/ml y las células se incubaron nuevamente 1 h en hielo protegidas de la luz directa. Después de dos etapas de lavado más, las células se midieron en FACS Canto.

Todas las construcciones sometidas a prueba muestran la unión a MDA-MB-231 con intensidades variables (véase la figura 44).

Ejemplo 31: Humanización de los dominios VH y VL de los anticuerpos para DR5 derivados mediante inmunización

El anticuerpo de unión a DR5 de conejo DR5TAA-0011 se humanizó usando regiones estructurales idénticas a las secuencias de la estirpe germinal humana. Las secuencias de la estirpe germinal humana hVH_3_64 (número de acceso a GenBank M99682) y hVH3_16 (número de acceso a GenBank P01767) fueron las 2 aceptoras para las variantes humanizadas de VH y las secuencias de la estirpe germinal humana hVK1_93 (número de acceso P04431) y hVK1 5 (número de acceso de GeneBank1 P0162) fueron las aceptoras para la humanización de VL. Se obtuvieron ocho anticuerpos para DR5 humanizados que comprendían una construcción de región variable de la cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO. 23 y 26 y una construcción de región variable de la cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO 24, 29, 30, 31 y 32 y se caracterizaron adicionalmente (ejemplos 27 a 29).

Tabla 24: Proteínas de unión a DR5 humanizadas derivadas mediante inmunización

Ejemplo 32: Caracterización funcional de la proteína de unión a DR5 humanizada derivada mediante inmunización

Los anticuerpos para DR5 humanizados se caracterizaron funcionalmente evaluando la apoptosis como se mide mediante ELISA de detección de muerte celular (CDDE, Roche n.° 11 774 425 001) tras el tratamiento con anticuerpos anti-DR5 humanizados en presencia o ausencia de un anticuerpo de reticulación. Preparación de las células: la línea celular MDA-MB-231 adheridas (adenocarcinoma de mama humano) se cultivó en medio DMEM (PAN) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco) y L-glutamina 2 mM (PAA), y se dividió normalmente dos veces por semana a 1:10. Para el ensayo, se lavaron las células con PBS, se desprendieron del matraz con Accutase (PAA), se sembraron en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 1x104 células/pocillo (CDDE) en 50 pl y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO².

Inducción de la apoptosis mediante anticuerpos anti-DR5 humanizados: se añadieron muestras (IgG anti-DR5 humanizadas, DR5-TAA-n.°) a las células a concentraciones diferentes, solas o junto con el anticuerpo de reticulación (IgG antihumana de cabra, Sigma n.° I2136) en una proporción 1:1 en 50 pl en PBS, para inducir la reticulación de los receptores DR5, lo que dio lugar a la apoptosis. Las células se incubaron a 37 °C durante 24 h (CDDE).

Elisa de detección de muerte celular (CDDE): el inmunoensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche). En resumen, se aspiraron cuidadosamente los sobrenadantes y se lisaron las células con 200 pl/pocillo de tampón de lisis durante 30 minutos a t. a. Se preparó una mezcla maestra que consistía en anticuerpos antihistona y anti-ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se mezcló con los lisados diluidos 1:4 en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Roche). Después de una incubación de 2 horas a t. a., los pocillos se lavaron, se añadió sustrato ABTS y se incubaron a t. a. hasta que el desarrollo de color fue suficiente para el análisis fotométrico (10-30 min). La absorbancia se leyó a 405 nm con un Tecan Spectra Rainbow Reader. Las señales para la apoptosis se normalizaron a la apoptosis del anticuerpo quimérico anti-DR5 a una concentración de 2 pg/ml. Los resultados se muestran en la figura 45: A Las variantes humanizadas de DR5TAA-0011 (DR5TAA-0066 - DR5TAA-0075, líneas negras) inducen la apoptosis tras la reticulación con el anticuerpo secundario de una manera dependiente de la dosis. Varias variantes humanizadas, tales como DR5TAA-0067, DR5TAA-0071, DR5TAA-0074 y DR5TAA-0075, pueden inducir la apoptosis de una manera similar en relación con el máximo de inducción y dependencia de la dosis en comparación con la variante quimérica (DR5TAA-0052, líneas grises). B Las variantes humanizadas de DR5TAA-0011 (DR5TAA-0066 - DR5TAA-0075) no inducen ninguna apoptosis si no se reticulan por un anticuerpo secundario. Por tanto, las variantes humanizadas también son adecuadas para usarse en formatos biespecíficos para inducir específicamente la apoptosis solo en presencia de FAP.

Los Fab de las variantes humanizadas seleccionadas se fusionaron en el extremo C a una región Fc humana por medio de un conector (G4S)4. Estas moléculas se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA, se purificaron por medio de microesferas de proteína A y se sometieron a prueba en un ensayo de inducción de la apoptosis. En la figura 22 b) se resumen los resultados del ensayo para la fragmentación del ADN en células MDA-MB-231 con estas moléculas de fusión Fc-DR5 después de la reticulación con IgG secundaria anti-Fc. Todas las moléculas sometidas a prueba pueden inducir la apoptosis de la línea celular diana, lo que indica que las proteínas de unión a DR5 elegidas no están bloqueadas en el extremo N, lo que genera una gama más amplia de formatos que se pueden usar con estas proteínas de unión.

Ejemplo 33: Caracterización de las afinidades de unión de la proteína de unión a DR5 humanizada derivada mediante inmunización

La proteína de unión a DR5 humanizada se caracterizó para determinar su afinidad de unión mediante análisis por RPS. Caracterización mediante BIAcore: Se usó un instrumento BIAcore 3000 (GE Healthcare) con un sensor CM5 montado en el sistema. El sensor se preacondicionó mediante inyección de 1 min a 100 pl/min de SDS al 0,1 %, NaOH 50 mM, HCl 10 mM y H3PO4100 mM. El sistema tampón fue HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, TWEEN 20 al 0,05 %. El tampón de muestra fue el sistema tampón complementado con 1 mg/ml de carboximetildextrano (Sigma). Se estableció un sistema de captura de anticuerpos antihumanos en la superficie del biosensor. Se inmovilizaron 8000 unidades de respuesta relativa de un anticuerpo policlonal específico de fragmento anti-FcY humano de cabra (Jackson Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando química con EDC/NHS. El sensor se desactivó usando etanolamina 1 M.

Se capturaron 20 nM de la muestra de anticuerpo respectiva durante 1 min a un caudal de 10 pl/min. Como referencia, se capturó IgG normal humana policlonal 20 nM (Roche, Ident. 11717570) en la cubeta de lectura de referencia 1 y se supervisaron las señales sustractivas.

En un modo de realización, se inyectó el analito DR5 de 23,3 kDa a 30 pl/min durante un tiempo de asociación de 3 min en series de concentración a 0 nM, 3,3 nM, 11 nM, 2 x 33 nM, 100 nM y 300 nM. Se supervisó la disociación del complejo durante 5 min.

El sistema se regeneró a 30 pl/min mediante una inyección de 1 min de tampón glicina 10 mM, pH 1,5, seguido de dos inyecciones de 1 min consecutivas de tampón glicina 10 mM, pH 1,7. Se evaluaron los parámetros cinéticos usando el programa informático de evaluación de Biacore de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se calcularon la constante de velocidad de asociación ka(1/Ms), la constante de velocidad de disociación kd (1/s) y la constante de disociación Kd de acuerdo con un modelo de Langmuir con Rmáx global.

Tabla 25: Afinidades cinéticas con respecto a DR5 humano monomérico de variantes humanizadas de DR5TAA-0011 (DR5TAA-0067 a DR5TAA-0075) en comparación con la forma quimérica de DR5TAA-0011 (DR5TAA-0052)

Las propiedades de unión cinética de las variantes humanizadas se mantuvieron en un factor de aprox. 3 para KD y kd y en un factor de aprox. 2 para ka en comparación con la variante quimérica.

Ejemplo 34: Caracterización de la estabilidad térmica y química de la proteína de unión a DR5 humanizada derivada mediante inmunización

La proteína de unión a DR5 humanizada se caracterizó para determinar su estabilidad térmica y química. Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en histidina/cloruro de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos mediante centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 pm y se cubrieron con queroseno. El radio hidrodinámico se mide repetidamente mediante dispersión dinámica de la luz, mientras que las muestras se calientan a una velocidad de 0,05 °C/min de 25 °C a 80 °C. La temperatura de comienzo de la agregación se define como la temperatura a la que el radio hidrodinámico se empieza a incrementar.

Tabla 26: Temperaturas de comienzo de la agregación de variantes humanizadas de DR5TAA-0011 (DR5TAA-0066-DR5TAA-0075) como una medida para la estabilidad térmica de los anticuerpos.

Las variantes humanizadas de DR5TAA-0011 revelan una estabilidad térmica alta con temperaturas de agregación de 68 °C y más altas.

Estabilidad química

Generación de muestras de anticuerpo para DR5 sometidas a agresión: Para someter a prueba la estabilidad química de los anticuerpos para DR5, se generaron muestras sometidas a agresión y se caracterizaron funcionalmente con respecto a la unión a DR5. La agresión por pH alto induce, entre otras cosas, la desamidación de los puntos calientes de Asn reactiva, mientras que a un pH de 6,0, por ejemplo, se puede inducir la formación de succinimida a partir de residuos de Asn y Asp reactivos. Para la agresión por pH alto, se transfirieron las muestras en fosfato de sodio 20 mM, pH 8,0, y se incubaron durante 5 días a 40 °C. Para la agresión por pH bajo, se transfirieron las muestras a His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, y se incubaron durante 3 semanas a 40 °C. Una muestra de control se mantuvo a -80 °C.

Análisis de muestras de anticuerpo para DR5 sometidas a agresión: Se usó un instrumento BIAcore 3000 (GE Healthcare) con un sensor CM5 montado en el sistema. El sensor se preacondicionó mediante inyección de 1 min a 100 pl/min de SDS al 0,1 %, NaOH 50 mM, HCl 10 mM y H3PO4 100 mM. El sistema tampón fue HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, TWEEN 20 al 0,05 %. El tampón de muestra fue el sistema tampón complementado con 1 mg/ml de carboximetildextrano (Sigma). Se estableció un sistema de captura de anticuerpos antihumanos en la superficie del biosensor. Se inmovilizaron 8000 unidades de respuesta relativa de un anticuerpo policlonal específico de fragmento anti-FcY humano de cabra (Jackson Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando química con EDC/NHS. El sensor se desactivó usando etanolamina 1 M.

En otro modo de realización, se inyectó el analito a 100 pl/min durante un tiempo de asociación de 2 min a 0 nM y 500 nM. Se supervisó la disociación del complejo durante 5 min.

Tabla 27: Concentraciones activas relativas de variantes humanizadas de DR5TAA-0011 antes y después de la prueba de agresión

La semivida del complejo anticuerpo/antígeno se calculó en minutos de acuerdo con la fórmula In(2)/(60*ta(). Se calculó la proporción molar: PM (anticuerpo) / PM (antígeno) * UT (antígeno) / NC (anticuerpo).

Se registraron los puntos del informe de datos poco antes del final de la inyección del anticuerpo (nivel de captura del anticuerpo, NC), así como poco antes de la inyección del analito (unión tardía, UT). Se usaron las alturas de la señal de respuesta del nivel de captura (NC) y unión tardía (UT) para caracterizar el rendimiento de unión del anticuerpo. El cociente de unión relativa se calculó UT/NC. Se formó un cociente a partir del cociente de unión relativa de una muestra de anticuerpo frente a una muestra de anticuerpo impactada no sometida a agresión (unión activa relativa).

Los resultados se muestran en la tabla 27. Las variantes humanizadas de DR5TAA-0011 se sometieron a la prueba de agresión. Ninguna de las variantes humanizadas mostró una unión alterada a DR5 humano en comparación con el material inicial no sometido a agresión.

Ejemplo 35: Materiales y procedimientos

A menos que se mencione de otro modo, se han usado los siguientes materiales y procedimientos en los experimentos indicados anteriormente.

Tecnologías de ADN recombinante

Todos los vectores de expresión de anticuerpos y antígenos se generaron usando una tecnología de ADN recombinante estándar como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los genes o fragmentos de genes se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o bien se generaron a partir de oligonucleótidos sintéticos en Geneart AG (Ratisbona, Alemania) mediante síntesis génica automática. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR o subclonados se confirmaron mediante secuenciación del ADN (Synergene GmbH, Suiza). El ADN plasmídico se transformó y amplificó en cepas huésped de E. coli adecuadas para la preparación de ADN plasmídico de calidad para la transfección usando kits Maxiprep (Qiagen) estándar. Para la producción de las moléculas biespecíficas, se transfectaron células HEK293 EBNA con plásmidos que codificaban los genes respectivos usando un procedimiento estándar basado en polietilenimina (PEI). La proporción de plásmido usada de los tres vectores de expresión fue 1:1:1. Las células transfectadas se cultivaron durante 7 días antes de que se obtuvieran los sobrenadantes para su purificación.

Transfección en células HEK293 EBNA

Todos los anticuerpos (biespecíficos) y antígenos (si no se obtuvieron a partir de una fuente comercial) usados en el presente documento se produjeron de forma transitoria en células HEK 293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediada por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación.

Las células HEK293 EBNA se cultivan en suspensión libre de suero en medio de cultivo CD para CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se siembran 400 millones de células HEK293-EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min mediante 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD para CHO precalentado. Los vectores de expresión se mezclaron en 20 ml de medio CD para CHO a una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla en vórtex durante 15 s y se incuba posteriormente durante 10 min a temperatura ambiente. Luego, se mezclan las células con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz de agitación de 500 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de un 5 % de CO². Después del tiempo de incubación, se añaden 160 ml de medio F17 y las células se cultivan durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade ácido valpórico 1 mM y medio de alimentación 1 al 7 %. Después de 7 días de cultivo, se obtiene el sobrenadante de cultivo para su purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtra de forma estéril (filtro de 0,22 pm) y se añade acida de sodio en una concentración final de 0,01 % p/v, y se mantiene a 4 °C. Después de la producción, se obtuvieron los sobrenadantes y se filtraron los sobrenadantes que contenían anticuerpos a través de filtros estériles de 0,22 pm y se almacenaron a 4 °C hasta su purificación.

Purificación: estándar microesferas de ProtA

Las proteínas se produjeron mediante expresión transitoria en células HEK293 EBNA. Todas las moléculas biespecíficas descritas aquí se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200).

El sobrenadante se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a la resina Mabselect Sure (GE Healthcare) rellenada en una columna Tricorn™ 5/50 (GE Healthcare, volumen de columna (vc) = 1 ml) equilibrada con tampón A (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, NaCl 250 mM). Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 5 volúmenes de columna (VC) de tampón A. La proteína de interés se eluyó en un gradiente de pH lineal de tampón B al 0-100 % (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, NaCl 1 M) con 12 VC. Finalmente, se incluyó una etapa adicional con 10 VC de tampón B seguido de una etapa de equilibrio de 5 VC de tampón A. Se combinaron las fracciones que contenían la proteína de interés y el pH se ajustó gradualmente a pH 6,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0). Las muestras se concentraron a 0,5-2 ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) y posteriormente se aplicaron a una columna de calidad preparativa HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 %. Se analizó el contenido de agregados de las fracciones eluidas usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-Arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7, a 25 °C. Se combinaron las fracciones que contenían menos de un 2 % de oligómeros y se concentraron a una concentración final de 1 - 1,5 mg/ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Las proteínas purificadas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.

Para una purificación rápida y de alto rendimiento, los sobrenadantes se neutralizaron usando una columna 1/40.° de Tris-HCl 2 M, pH 8, y se incubaron de forma rotativa con microesferas de ProteinA Sepharose Fast Flow (n.° de cat. de GE Healthcare 17-5138-01)) durante 19 h a 4 °C. A continuación, se hizo pasar la mezcla de sobrenadante/microesfera por una columna PD-10 vacía y equilibrada (n.° de cat. de GE Healthcare 17-0435-01) mediante flujo por gravedad. Las microesferas retenidas se lavaron dos veces con tampón de unión (Tris 10 mM, glicina 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0) y el anticuerpo se eluyó en una etapa de pH bajo (Tris 10 mM, glicina 50 mM, NaCl 100 mM, pH 2,5). Finalmente, la proteína eluida se neutralizó mediante adición de 1/40.° volumen de Tris-HCl 2 M, pH 8,0. La concentración de proteínas de los anticuerpos purificados se calculó a partir de la absorbancia medida a 280 nm y el coeficiente de extinción molar se calculó a partir de la secuencia de aminoácidos. El contenido de agregados de la muestra de anticuerpo se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica Zorbax GF-250 (n.° de cat. de Agilent PSMO 845006) equilibrada: tampón de migración (fosfato de sodio 200 mM, acida de sodio al 0,02 %, pH 7,0) a 25 °C.

Análisis de unión por FACS

Todas las líneas celulares diana usadas se analizaron para determinar los niveles de expresión relativa de los antígenos relacionados con tumores y receptores de muerte DR5 antes de que se realizaran los ensayos de apoptosis.

Se determinó el número y la viabilidad de las células. Para esto, se desprendieron células que crecían de forma adherida con un tampón de disociación celular (Gibco - Invitrogen n.° 13151-014). Se obtuvieron las células mediante centrifugación (4 min, 400 x g), se lavaron con tampón de FACS (PBS / BSA al 0,1 %) y se ajustó el número de células a 1,111 X 106 células / ml en tampón de FACs . Se usaron 180 pl de esta suspensión de células por pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos, lo que dio como resultado 2 x 105 células por pocillo. Las células se incubaron durante 30 min a 4 °C con el primer anticuerpo en la dilución apropiada. A continuación, se obtuvieron las células mediante centrifugación (4 min, 400 x g), se retiró completamente el sobrenadante y se lavaron una vez las células con 150 pl de tampón de FACS. Las células se resuspendieron en 12 pl de anticuerpo secundario diluido (en caso de que se usara el primer anticuerpo no marcado) o tampón de FACS durante 30 min a 4 °C en oscuridad. Después de dos etapas de lavado con tampón de FACS, se resuspendieron las células en 200 pl de tampón de FACS y se analizaron en un HTS FACSCanto II (BD, programa informático FACS Diva). De forma alternativa, las células se podrían fijar con 200 pl de PFA (paraformaldehído) al 2 % en tampón de FACS durante 20 min a 4 °C y analizarse más tarde. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Tabla 28: Anticuerpos y concentraciones para análisis de unión por FACS

Análisis por Biacore (resonancia de plasmón superficial, RPS)

La unión de las diversas proteínas de unión anti-DR5 como IgG o en un formato biespecífico se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (RPS). Todos los experimentos de RPS se realizaron en un Biacore T100 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).

Para la determinación de la reactividad cruzada con especies de las proteínas de unión a DR5, se acoplaron directamente DR5 biotinilado de ratón, humano y de macaco cangrejero a cubetas de lectura diferentes de un chip de sensor con estreptavidina (SA), cada uno con un nivel de inmovilización de aproximadamente 300 UR. Se inyectaron las diversas proteínas de unión a DR5, como las IgG, a una concentración de 500, 100 y 25 nM durante 60 s con un caudal de 30 ul/min, seguido de una fase de disociación de 90 s. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia, donde no se inmovilizó ninguna proteína.

En un segundo experimento, se determinó la especificidad de las proteínas de unión a DR5 inmovilizando huDR4Fc, huDcR1Fc, huDcR2Fc y rhuOPGFc a un chip de sensor CM5 mediante acoplamiento de amina. Los niveles de inmovilización fueron de entre 100 y 400 UR. Cada proteína de unión se hizo pasar por las cubetas de lectura diferentes a una concentración de 500, 100 y 25 nM durante 60 s con un caudal de 30 pl/min y se supervisó la fase de disociación durante 90 s. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia, donde no se inmovilizó ninguna proteína.

Además, se midió la avidez de las IgG, así como los formatos 2+2, en un chip CM5 con DEC de DR5 humano inmovilizado y de macaco cangrejero (los niveles de inmovilización fueron de alrededor de 100 UR). Cada construcción o IgG se hizo pasar por las cubetas de lectura diferentes a una concentración entre 500-0,97 nM en etapas de dilución 1:2 durante 90 s a 30 pl/min. Se analizó la disociación durante 120 s. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia, donde no se inmovilizó ninguna proteína. Se calcularon las constantes cinéticas usando el programa informático de evaluación de Biacore T100 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suecia), para ajustar las ecuaciones de velocidad para la unión 1:1 de Langmuir mediante integración numérica, como análisis cinético o bien análisis en estado estacionario.

Se evaluó la afinidad usando un formato de captura donde se acopló directamente un anticuerpo anti-Fab humano o anti-Fc humano (Biacore, Friburgo/Alemania) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 8.000-10000 UR. Las proteínas de unión a DR5 en formato IgG o 2+2 se capturaron a una concentración de 50 o 30 nM, respectivamente, durante 60 s a un caudal de 30 pl/min. Se llevó a cabo la inyección de DR5 humano o de macaco cangrejero en un intervalo de concentraciones de 500 - 0,975 nM (DR5 de macaco cangrejero) o 1000 - 0,975 nM (huDR5) en etapas de dilución 1:2 durante 120 s a 30 pl/min para el formato 2+2. La afinidad de las IgG solo se midió para huDR5 a una concentración de 2000 - 20 nM en etapas de dilución 1:3. Se evaluó la disociación durante un periodo de 120 s. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia, donde no se inmovilizó ninguna proteína. Se calcularon las constantes cinéticas usando el programa informático de evaluación de Biacore T100 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suecia), para ajustar las ecuaciones de velocidad para la unión 1:1 de Langmuir mediante integración numérica, como análisis cinético o bien análisis en estado estacionario.

El agrupamiento de epítopos se midió en dos formatos diferentes, con un ensayo no competitivo clásico o bien con un enfoque en tándem. En el ensayo no competitivo clásico, cada proteína de unión a DR5 se inmoviliza directamente mediante acoplamiento de amina a una cubeta de lectura en la superficie del chip CM5 con un nivel de inmovilización de diana de alrededor de 500 UR. Posteriormente, se hace pasar huDR5 por cada cubeta de lectura a una concentración de 500 nM durante 60 s (caudal de 30 pl/min), seguido de una inyección de otra proteína de unión a DR5 a una concentración de 30 nM durante 60 s (caudal de 30 pl/min). La disociación se supervisa durante un periodo de 60 s con el mismo caudal. Se usa la inyección de la misma proteína de unión a d R5 que la inmovilizada como control, ya que esto no debería dar lugar a un incremento de la respuesta si todo el DR5 se une mediante la proteína de unión inmovilizada.

En el enfoque en tándem, se inmovilizó huDR5ECD en un chip CM5 con una respuesta final de 250 UR. A continuación, se hizo pasar la primera proteína de unión a DR5 por la cubeta de lectura a una concentración de 20 nM durante 90 s, seguido de la inyección de una segunda proteína de unión a DR5 durante 90 s. Se supervisó la disociación durante un periodo de 90 s. El caudal fue de 30 pl/min para todas las etapas. Si las dos proteínas de unión reconocen un epítopo diferente, uno podría observar un incremento de las unidades de respuesta. Se usó la inyección de la misma proteína de unión a DR5 como control para confirmar que todas las moléculas de DR5 se saturaron mediante la primera inyección y que no se puede producir ninguna unión adicional al mismo epítopo.

Para determinar además si alguna de las proteínas de unión es bloqueante de ligandos, se inmovilizó rhuTRAIL (n.° de cat. de Peprotech 310-04) en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina con un nivel de inmovilización de 2000 UR. Se formaron complejos del DEC de huDR5 Fc o huDR5 con cada proteína de unión a DR5 que se iba a someter a prueba (DR5100 nM con IgG 500 nM) y el complejo se hizo pasar por la cubeta de lectura durante 90 s con un caudal de 50 pl/min. La disociación se evaluó durante un periodo de 120 s. Además, se usó un ensayo no competitivo clásico, donde se inyectó en primer lugar DEC de huDR5Fc o huDR5 a 100 nM seguido de una inyección de cada proteína de unión a DR5 a 500 nM. Los tiempos de contacto fueron 60 s para DR5 y 90 s para las IgG con un caudal de 30 pl/min. La etapa de disociación se llevó a cabo durante 90 s. Se consideró que las proteínas de unión que se podían unir a TRAIL, además de DR5, eran no bloqueantes de ligandos, mientras que las proteínas de unión que no mostraban ninguna unión adicional eran bloqueantes de ligandos.

La unión simultánea de las diversas proteínas de unión a DR5 en un formato 2+2 se confirmó en un chip SA que contenía huDR5Fc-biotina inmovilizado (nivel de inmovilización de alrededor de 1000 UR). En una primera etapa, se inyectó la construcción 2+2 durante 90 s, seguido de una inyección de FAP humana o bien murina a una concentración de 500 o 100 nM durante 90 s. Se supervisó la disociación durante 60 s. El caudal para todas las etapas fue de 30 pl/min. La unión simultánea se consideró verdadera si se observaba un incremento adicional de las unidades de respuesta tras la inyección de FAP humana o murina.

El agrupamiento de epítopos se midió en dos formatos diferentes, un ensayo no competitivo clásico o bien con un enfoque en tándem. En el ensayo no competitivo clásico, cada proteína de unión a DR5 se inmoviliza directamente mediante acoplamiento de amina a una cubeta de lectura en la superficie del chip CM5 con un nivel de inmovilización de diana de alrededor de 500 UR. A continuación, se hace pasar huDR5 por cada cubeta de lectura a una conc. de 500 nM durante 60 s (caudal de 30 ul/min), seguido de una inyección de otra proteína de unión a DR5 a una concentración de 30 nM durante 60 s (caudal de 30 ul/min). La disociación se supervisa durante un periodo de 60 s con el mismo caudal. Se usa la inyección de la misma proteína de unión a DR5 que la inmovilizada como control, ya que esto no debería dar lugar a un incremento de la respuesta si todo el DR5 se une mediante la proteína de unión inmovilizada.

En el enfoque en tándem, se inmovilizó huDR5ECD en un chip CM5 con una respuesta final de 250 UR. A continuación, se hace pasar la primera proteína de unión a DR5 por la cubeta de lectura a una concentración de 20 nM durante 90 s, seguido de la inyección de una segunda proteína de unión a DR5 durante 90 s. Se supervisó la disociación durante un periodo de 90 s. El caudal fue de 30 ul/min para todas las etapas. Si las dos proteínas de unión reconocen un epítopo diferente, uno podría observar un incremento de las unidades de respuesta. Se usó la inyección de la misma proteína de unión a DR5 como control para confirmar que todas las moléculas de DR5 se saturaron mediante la primera inyección y que no se puede producir ninguna unión adicional al mismo epítopo.

Para determinar además si alguna de las proteínas de unión es bloqueante de ligandos, se inmovilizó rhuTRAIL (n.° de cat. de Peprotech 310-04) en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina con un nivel de inmovilización de 2000 UR. Se formaron complejos del DEC de huDR5 Fc o huDR5 con cada proteína de unión a DR5 que se iba a someter a prueba (DR5100 nM con IgG 500 nM) y el complejo se hizo pasar por la cubeta de lectura durante 90 s con un caudal de 50 pl/min. La disociación se evaluó durante un periodo de 120 s. Además, se usó un ensayo no competitivo clásico, donde se inyectó en primer lugar DEC de huDR5Fc o huDR5 a 100 nM seguido de una inyección de cada proteína de unión a DR5 a 500 nM. Los tiempos de contacto fueron 60 s para DR5 y 90 s para las IgG con un caudal de 30 ul/min. La etapa de disociación se llevó a cabo durante 90 s. Se consideró que las proteínas de unión que se podían unir, además de DR5, a TRAIL eran no bloqueantes de ligandos, mientras que las proteínas de unión que no mostraban ninguna unión adicional eran bloqueantes de ligandos.

ELISA para la fragmentación del ADN

Para la determinación de la apoptosis inducida se usó el kit Cell Death Detection ELISA PLUS de Roche. En definitiva, se sembraron 104 células GM05389 que expresaban FAP por pocillo de una placa de 96 pocillos (después del desprendimiento y la determinación del número y viabilidad de las células) en 200 pl de medio apropiado y se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmósfera de un 5 % de CO². Al día siguiente, el medio se reemplazó por 100 pl de medio recién preparado que contenía los anticuerpos inductores de la apoptosis, anticuerpos de control y otros controles en concentraciones apropiadas:

Se usaron los anticuerpos biespecíficos y las IgG en una concentración final de 0,7 y 7 nM o como se indica; se usaron anticuerpos de reticulación a la misma molaridad que los anticuerpos primarios. Después de la adición de los anticuerpos, se añadieron 104 células tumorales sensibles a la apoptosis por pocillo.

Las células se incubaron durante 24 h a 37 °C, un 5 % de CO²para permitir la inducción de la apoptosis. Se obtuvieron las células mediante centrifugación (10 min, 200 x g) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en 200 pl de tampón de lisis (suministrado por el kit). El ADN intacto y las células lisadas se sedimentaron mediante centrifugación (10 min, 200 x g) y se analizaron 20 pl del sobrenadante que contenía el ADN fragmentado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para la inducción de la apoptosis.

Inhibición de la proliferación (CellTiterGIo)

Para los ensayos de viabilidad de las células, se sembraron 4.000 células tumorales / pocillo (en un volumen de 75 pl) en placas de fondo negro y transparente de 96 pocillos (n.° de cat. de BD Falcon BD353220) y se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmósfera humidificada de un 5 % de CO². A continuación, se añadieron 25 pl 4x de proteína de unión a DR5 más/menos Fc de conejo (igual nanomolar de proteínas de unión a DR5 y Fc) con 6 concentraciones de 2,5 x diluciones en serie. Después de la incubación a 37 °C con un 5 % de CO²durante 48 horas, se añadieron a cada pocillo 100 pl de reactivo de CellTiter-Glo y se mezcló bien. Después de la incubación durante otros 10 minutos a temperatura ambiente, se determinó la viabilidad de las células con un lector de placas Spectra Max M5 en contextos de luminiscencia.

Inducción de Caspasa 8 (Caspase Glo)

Para los ensayos de activación de caspasa 8, se sembraron 10.000 células cancerosas/pocillo en 75 pl en placas blancas y opacas de 96 pocillos (n.° de cat. de BD Falcon BD353296) y se incubaron durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO². A continuación, se añadieron 25 ul 4x de proteínas de unión a DR5 más/menos anti-Fc (proporciones equimolares de proteínas de unión a DR5 y anti-Fc) con 6 concentraciones de 2,5x diluciones en serie. Después de 3 horas de incubación a 37 °C con un 5 % de CO², se añadieron 100 pl de sustrato para caspasa 8 en tampón de lisis a cada pocillo. Después de una incubación adicional durante 30 minutos a 37 °C, se leyeron los resultados en un lector de placas Spectra Max M5 en contextos de luminiscencia.

Ensayos de FRET

La unión de moléculas biespecíficas en las células se determinó usando un ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) (llamado TagLite). Las células Hek EBNA se cultivaron hasta un 60-80 % de confluencia y se transfectaron con ADN plasmídico que codificaba el DEC de DR5 fusionado a una marca SNAP y MalE TM. En resumen, se mezclaron 2 pg de ADN con 4 ml de medio OptiMEM y 30 pl de Lipofectamine 2000 (n.° de cat. de Invitrogen 11668-019). La mezcla se incubó durante 20 min a t. a. Mientras tanto, las células Hek EBNA adheridas cultivadas en un matraz T75 se lavaron con 5 ml de D-PBS antes de añadir la mezcla de transfección y el medio de cultivo (6 ml) (DMEM, FCS al 10 %, glutamax, aminoácidos no esenciales). A continuación, las células se incubaron durante la noche en una incubadora humidificada (5 % de CO²) a 37 °C. Las células se lavaron con 5 ml de D-PBS, seguido de la adición de una mezcla de 5 ml de tampón TagLite (n.° de cat. de Cisbio) que contenía SNAP-Lumi4-Tb 100 nM (n.° de cat. de Cisbio). Esto dio como resultado la unión del colorante fluorescente a la marca SNAP fusionada al DR5. Después de un tiempo de incubación de 1 h a 37 °C, las células se lavaron con tampón TagLite para retirar el colorante no unido. Posteriormente, se comprobó la eficacia del marcado midiendo la señal fluorescente a 620 nm (excitación a 343 nm) de 10000 células en un formato de 384 pocillos (Reader, Victor, Perkin Elmer). A continuación, las células se congelaron en medio de cultivo sustituido con DMSO al 10 % y se almacenaron a -80 °C.

Para llevar a cabo un ensayo de unión, las células premarcadas se descongelaron, lavaron y se mezclaron 1000 células por pocillo con 5 pl de construcción a una concentración final que variaban entre 50 - 0,097 nM (etapas de dilución 1:2) y 5 pl de anti-huFc-d2 marcado. (concentración final de 150 nM). La señal fluorescente se midió a 620 nm para el donante fluorescente (Terbio) y a 665 nm para el colorante aceptor fluorescente después de 0 h, 1 h y 3 h de incubación a t. a. Se calculó la proporción de 665/620*1000 y se sustrajo la referencia (cubetas con anti-huFc-d2 150 nM). Para la determinación de KD, los resultados se analizaron en Graph Pad Prism con una unión específica de ajuste de sitio.

Determinación de la estabilidad térmica mediante dispersión dinámica de la luz (DDL)

La estabilidad térmica de la proteína se supervisa mediante dispersión dinámica de la luz (DDL). Se aplican por duplicado 30 pg de muestra de proteína filtrada con una concentración de proteínas de 1 mg/ml a un lector de placas Dynapro (Wyatt Technology Corporation; EE. UU.). La temperatura se eleva de 25 a 75 °C a 0,05 °C/min, obteniéndose el radio y la intensidad de dispersión total.

Tabla 29: Nombres y sobrenombres de clones de DR5 y construcciones biespecíficas

E je m p lo 36: E fic a c ia an titu m o ra l in vivo del a n tic u e rp o b ie s p e c ífic o p ara D R 5-F A P q u e c o m p re n d e la p ro te ín a d e unión a D R 5 5E 11 rec ién a is la d a en c o m b in a c ió n co n C ro s s F a b con FA P 28H1

La eficacia antitumoral in vivo del anticuerpo biespecífico para DR5-FAP (SEQ ID NO.:7 de VH, SEQ ID NO.:8 de VL) se demostró en modelos derivados de pacientes (XDP) basados en células y en fragmentos de diversos orígenes tumorales (por ejemplo, CCR y cáncer de páncreas) trasplantados en ratones atímicos. Como ejemplo, se muestran datos para el modelo de xenoinjerto de CCR DLD-1 (modelo de coinyección basado en líneas celulares) y Co5896 (basado en fragmentos).

A g e n te s d e p ru eb a

Se proporcionó el anticuerpo biespecífico para DR5-FAP (proteína de unión a DR5: SEQ ID NO.:7 de VH, SEQ ID NO.:8 de VL, proteína de unión a FAP: SEQ ID NO.:15 de VH, SEQ ID NO.:16 de VL) como solución madre de Roche, Penzberg, Alemania. El tampón para anticuerpo incluía histidina. La solución de anticuerpo se diluyó apropiadamente en tampón a partir de inyecciones madre anteriores.

L ín ea s c e lu la re s y c o n d ic io n e s d e c u ltiv o

Las células de CCR humanas DLD-1 se obtuvieron originalmente a partir de ATCC. La línea celular tumoral se cultivó de forma rutinaria en medio DMEM con alto contenido de glucosa con piruvato de sodio 1,0 mM complementado con suero fetal bovino al 10 %, L-glutamina 2,0 mM, HEPES 10 mM a 37 °C en una atmósfera saturada de agua a un 5 % de CO². El pase de cultivo se realizó con separación con tripsina / EDTA 1x cada tres días. Adicionalmente, los fibroblastos murinos NIH3T3 se adquirieron de ATCC y se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa con piruvato de sodio 1,0 mM, FCS al 10 % y L-glutamina 2,0 mM.

M o d e lo d e x e n o in je r to d e riv a d o d e p ac ie n te s (X D P )

El xenoinjerto de tumor de CCR Co5896 se obtuvo originalmente a partir de los pacientes y se pasó aproximadamente de tres a cinco veces hasta el establecimiento de patrones de crecimiento estables. Para los estudios in vivo posteriores, se obtuvieron fragmentos de tumor Co5896 a partir de xenoinjertos en pases en serie en ratones atímicos. Después de la extracción a partir de ratones donantes, los tumores se cortaron en fragmentos (4-5 mm de diámetro) y se dispusieron en PBS hasta su implantación subcutánea. Los ratones bajo anestesia con isofluorano recibieron implantes tumorales subcutáneos unilaterales en el costado.

A n im a le s

Los ratones atímicos se adquirieron de un criadero (por ejemplo, Charles River, Sulzfeld, Alemania) y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz /12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices vinculantes (GV-Solas; Felasa; TierschG). El protocolo del estudio experimental se revisó y aprobó por el gobierno local. Después de su llegada, los animales se mantuvieron en la parte de cuarentena de la instalación para animales durante una semana para acostumbrarse a un medio nuevo y para su observación. Se llevó a cabo una supervisión de la salud continua de forma regular. Se proporcionaron alimentos (Provimi Kliba 3337) y agua (pH acidificado 2,5-3) a voluntad.

S u p e rv is ió n

Los animales se controlaron diariamente para determinar los síntomas clínicos y la detección de efectos adversos. Para la supervisión a lo largo del experimento, se documentó el peso corporal de los animales.

T ra ta m ie n to d e los an im a le s

Se inició el tratamiento de los animales después de la aleatorización de los animales después del trasplante de células o fragmentos cuando la mediana del tamaño tumoral fue de aproximadamente 100-200 mm3. Se administró i.v. el anticuerpo como único agente a 10 o 30 mg/kg una o dos veces por semana durante varias semanas dependiendo del modelo. El vehículo correspondiente se administró en los mismos días.

E fic a c ia d e l an tic u e rp o

M o d e lo d e x e n o in je r to b asa d o en lín eas c e lu la re s d e c o in y e c c ió n d e C C R DLD-1

Se trataron ratones que tenían el xenoinjerto de CCR DLD-1 con el anticuerpo biespecífico para DR5-FAP (proteína de unión a DR5: SEQ ID NO.:7 de VH, SEQ ID NO.:8 de VL, proteína de unión a FAP: SEQ ID NO.:15 de VH, SEQ ID NO.:16 de VL) desde el día del estudio 9 al 20 en dosificaciones de 10 y 1,0 mg/kg durante 4 veces. Como resultado, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico para DR5-FAP (proteína de unión a DR5: SEQ ID NO.:7 de VH, SEQ ID NO.:8 de VL, proteína de unión a FAP: SEQ ID NO.:15 de VH, SEQ ID NO.:16 de VL) mostró una eficacia antitumoral significativa relacionada con la dosis con una fuerte eficacia antitumoral frente a xenoinjertos de DLD-1 s.c. La inhibición del crecimiento tumoral (ICT) se calculó a un 89 % (10 mg/kg) y un 79 % (1,0 mg/kg), respectivamente. Por el contrario, después del tratamiento con el anticuerpo mutante en Fc para DR5 drozitumab PG, LALA (10 mg/kg, una vez por semana) no se observó ninguna eficacia antitumoral (véase la figura 48). Se obtuvieron resultados similares con contenido de FAP alto (estudio de coinyección con DLD-1 / fibroblastos NIH3T3; proporción 80/20, figura 48) y contenido de FAP bajo (estudio de coinyección con DLD-1 / fibroblastos MRC5; proporción 30/70, datos no mostrados).

Modelo de xenoinjerto derivado de pacientes (XDP) basado en fragmentos de CCR Co5896

Se trataron ratones que tenían el xenoinjerto de CCR Co5896 con el anticuerpo biespecífico para DR5-FAP (proteína de unión a Dr 5: SEQ ID NO.:7 de VH, SEQ ID NO.: 8 de VL, proteína de unión a FAP: SEQ ID NO.:15 de VH, SEQ ID NO.:16 de VL) desde el día del estudio 18 al 34 en dosis de 3,0 mg/kg durante 6 veces. Como resultado, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico para DR5-FAP (proteína de unión a DR5: SEQ ID NO.:7 de VH, SEQ ID NO.:8 de VL, proteína de unión a FAP: SEQ ID NO.:15 de VH, SEQ ID NO.: 16 de VL) mostró una eficacia antitumoral significativa con una fuerte eficacia antitumoral frente a xenoinjertos derivados de pacientes de Co5896 s.c. La inhibición del crecimiento tumoral (ICT) se calculó a un 76 % (véase la figura 49). Se obtuvieron resultados similares en otros modelos de células de CCR (datos no mostrados).

Ejemplo 36: Prevalencia de FAP en tumores humanos

Se evaluó la prevalencia de FAP en tumores humanos mediante IHQ para comprender el posible uso clínico del anticuerpo biespecífico para DR5-FAP.

Se usó el anticuerpo anti-seprasa humana de rata (IgG2a, clon D8) de Vitatex (MABS1001) para inmunoteñir secciones de FFPET de 2,5 pm de diversas indicaciones tumorales en Ventana Benchmark XT. Las secciones se sometieron a un tratamiento con CC1 estándar seguido de una incubación con anticuerpos durante 60 min a 37 °C a una concentración de 5 pg/ml en un diluyente de anticuerpo Dako (S3022) y se detectó la tinción positiva usando el sistema de detección Ultraview DAB (Ventana n.° 760-4456). Se usó el anticuerpo de isotipo combinado de Abeam (ab18450) como control negativo.

El infiltrado estromal FAP+ estuvo presente en tumores humanos de indicaciones diferentes, incluyendo carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), cáncer de mama, cáncer colorrectal (CCR), cáncer de páncreas (CP), cáncer gástrico, carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) y mesotelioma, lo que marca indicaciones clínicas potencialmente interesantes para un anticuerpo biespecífico para DR5-FAP (tabla 30).

Tabla 30: Prevalencia de FAP en tumores humanos

Secuencias

1. Secuencias de aminoácidos de proteínas de unión a DR5 derivadas de presentación en fagos

2. Secuencias de aminoácidos de proteínas de unión a DR5 derivadas de presentación en fagos no funcionales

(CDRH1=SEQ ID NO.:1, CDRH2=SEQ ID NO.:2, CDRL1=SEQ ID NO.:4 y CDRL2=SEQ ID NO.:5)

3. Secuencias de aminoácidos de proteínas de unión a FAP

4. Secuencias de aminoácidos de moléculas biespecíficas que comprenden proteínas de unión a DR5 convencionales

5. Secuencias de aminoácidos de moléculas biespecíficas que comprenden proteínas de unión a DR5 derivadas de presentación en fagos

6. Secuencias de aminoácidos del dominio FC y cadenas ligeras constantes

7. Secuencias de aminoácidos de proteínas de unión a DR5 derivadas de inmunización de conejos Clon DR5TAA-0005_____________ (Sobrenombre: clon 039)

Cadena pesada

Cadena ligera

Cadena pesada

Cadena ligera

Clon DR5TAA-0013 (Sobrenombre: clon 298)

Cadena pesada

Cadena ligera

Cadena pesada

Cadena ligera

Cadena pesada

VH

Cadena ligera

Cadena pesada

Cadena ligera

8. Secuencias de aminoácidos de variante quimerizada de Mab DR5TAA-0011 de conejo

Cadena ligera

9. Secuencias de variantes humanizadas de Mab DR5TAA-0011 de conejo

Variantes humanizadas de la cadena pesada

HC (DR5 - FAP entrecruzado)

11. Secuencias de aminoácidos de construcciones biespecíficas que contienen proteína de unión a DR5 derivada de conejo humanizada

Construcción DR5TAA-0117 (CrossMab humanizado 2+2 que contiene 28H1 y DR5TAA-0067)

LC (DR5)

LC entrecruzada (FAP)

HC (DR5 - FAP entrecruzado)

Construcción DR5TAA-0118 (CrossMab humanizado 2+2 que contiene 28H1 y DR5TAA-0071)

LC (DR5)

LC entrecruzada (FAP)

HC (DR5 - FAP entrecruzado)

Construcción DR5TAA-0119 (CrossMab humanizado 2+2 que contiene 28H1 y DR5TAA-0075)

LC (DR5)

LC entrecruzada (FAP)

( ) HC (DR5 - FAP entrecruzado)

12. Secuencias de aminoácidos de fusiones C terminales de proteína de unión a DR5 derivada de conejo humanizada

13. Secuencias de ácido nucleico de proteínas de unión a DR5 y moléculas biespecíficas que las comprenden

4. Secuencias de DR5

5. Secuencias de FAP

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente a DR5, que comprende

(a) una región determinante de la complementariedad 1 (CDR1) de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1; (b) una región determinante de la complementariedad 2 (CDR2) de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2; (c) una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:96, SEQ ID NO.:98, SEQ ID NO.: 104 y SEQ ID NO.: 108;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:99, SEQ ID NO.: 105, SEQ ID NO.: 109 y SEQ ID NO.:97.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:7 y SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:82 y SEQ ID NO.:85; SEQ ID NO.: 100 y SEQ ID NO.:101; SEQ ID NO.:102 y SEQ ID NO.:103; SEQ ID NO.:106 y SEQ ID NO.:107; SEQ ID NO.:94 y SEQ ID NO.:95.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8.

5. Un anticuerpo biespecífico que se une al receptor de muerte 5 (DR5) y a la proteína de activación de fibroblastos (FAP), que comprende al menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5, que comprende

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:99, SEQ ID NO.: 105, SEQ ID NO.: 109 y SEQ ID NO.:97;

y al menos un sitio de unión a antígeno específico para FAP, que comprende

(b) una CDR2 de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.: 10 y SEQ ID NO.:34;

(c) una CDR3 de la cadena pesada seleccionada del grupo de SEQ ID NO.: 11 y SEQ ID NO.:35; (d) una CDR1 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.: 12 y SEQ ID NO.:36;

(e) una CDR2 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.: 13 y SEQ ID NO.:37;

(f) una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO.: 14 y SEQ ID NO.:38.

6. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 5, en el que el sitio de unión a antígeno específico para DR5 comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.:7 y SEQ ID NO.:8; Se Q ID No .:100 y SEQ ID NO.:101; SEQ ID NO.:102 y SEQ ID NO.:103; SEQ ID NO.: 106 y SEQ ID NO.: 107; SEQ ID NO.:94 y SEQ ID NO.:95; y en el que el sitio de unión a antígeno específico para FAP comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: SEQ ID NO.: 15 y SEQ ID NO.:39; y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO.: 16 y SEQ ID NO.:40.

7. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 5 o 6, en el que el sitio de unión a antígeno específico para DR5 comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:3;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:5;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.:6

y el sitio de unión a antígeno específico para FAP comprende

(a) una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO.:9;

(b) una CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 10;

(c) una CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO.: 11;

(d) una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 12;

(e) una CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 13;

(f) una CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO.: 14.

8. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el sitio de unión a antígeno específico para d R5 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8; y el sitio de unión a antígeno específico para FAP comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 15 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:16.

9. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que el anticuerpo es humano.

10. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que comprende un dominio Fc, al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para DR5, y al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para FAP, opcionalmente en el que al menos uno de los fragmentos Fab se conecta a la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de la cadena ligera (VLCL) y al menos un fragmento Fab se conecta a la primera o segunda subunidad del dominio Fc por medio de la cadena pesada (VHCH1).

11. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, que comprende un dominio Fc, al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para DR5, y al menos un fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno específico para FAP, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de al menos un fragmento Fab.

12. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 11, que comprende dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

13. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo biespecífico es bivalente tanto para DR5 como para FAP.

14. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 11, que comprende dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

15. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 14, en el que el anticuerpo biespecífico es bivalente para DR5 y monovalente para FAP.

16. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 15, que comprende adicionalmente un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5, opcionalmente en el que el anticuerpo biespecífico es bivalente para DR5 y monovalente para FAP.

17. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 11, que comprende un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para DR5, y un fragmento Fab que comprende un sitio de unión a antígeno específico para FAP, opcionalmente en el que el anticuerpo biespecífico es monovalente para DR5 y monovalente para FAP.

18. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en el que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del/de los fragmento(s) Fab que comprenden un sitio de unión a antígeno específico para FAP.

19. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que al menos uno de los fragmentos Fab se conecta al dominio Fc por medio de un enlazador peptídico.

20. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en el que el dominio Fc comprende la sustitución de uno o más aminoácidos que reduce la unión a un receptor Fc y/o la función efectora, opcionalmente en el que dicha sustitución de uno o más aminoácidos es en una o más posiciones seleccionadas del grupo de L234, L235 y P329.

21. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 20, en el que cada subunidad del dominio Fc comprende sustituciones de tres aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc activador o inhibidor y/o la función efectora, en el que dichas sustituciones de aminoácidos son L234A, L235A y P329G.

22. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, en el que la parte Fc de la primera cadena pesada comprende un primer módulo de dimerización y la parte Fc de la segunda cadena pesada comprende un segundo módulo de dimerización que permite una heterodimerización de las dos cadenas pesadas del primer anticuerpo, opcionalmente en el que el primer módulo de dimerización comprende botones y el segundo módulo de dimerización comprende ojales de acuerdo con la estrategia de botones en ojales.

23. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 4 o el anticuerpo biespecífico de las reivindicaciones 5 a 22.

24. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 4 o el anticuerpo biespecífico de las reivindicaciones 5 a 22 para su uso en el tratamiento del cáncer, opcionalmente en el que el cáncer es cáncer de páncreas o carcinoma colorrectal.

25. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 4 o el anticuerpo biespecífico de las reivindicaciones 5 a 22 para su uso como medicamento.

26. Polinucleótidos aislados que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 4.

27. Un vector de expresión que comprende los polinucleótidos de la reivindicación 26.

28. Una célula huésped procariota o eucariota que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 27.

29. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 28 de modo que se produzca el anticuerpo.