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CN105308069A - 对fap和dr5特异性的双特异性抗体、对dr5特异性的抗体及使用方法 - Google Patents

对fap和dr5特异性的双特异性抗体、对dr5特异性的抗体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的双特异性抗体，对DR5特异性的抗体，用于生成它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，和它们的用途。

Description

对FAP和DR5特异性的双特异性抗体、对DR5特异性的抗体及使用方法
发明领域
本发明涉及包含对死亡受体5(DR5)特异性的第一抗原结合位点和对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性的第二抗原结合位点的双特异性抗体，对DR5特异性的抗体，用于生成它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，和它们的用途。
发明背景
单克隆抗体是癌症治疗中有力的治疗剂，因为它们选择性靶向癌症细胞上差异表达的抗原。用激动性单克隆抗体靶向癌细胞上的TRAIL(TNF相关凋亡诱导性配体)死亡受体代表新一代单克隆抗体疗法，因为它们能够直接诱导靶定细胞凋亡。
在结合TRAIL后，TNFR-SF家族的死亡受体诸如DR4和DR5变成三聚化。三聚化诱导外在的凋亡途径和复杂的事件级联，包括胱天蛋白酶活化，其最终导致杀死靶细胞。如果发生DR5超聚簇(即多个三聚体聚簇)的话，凋亡诱导得到进一步增强。虽然死亡受体在多种细胞类型上广泛表达，但是经外在途径的凋亡诱导局限于肿瘤细胞。既然激动性DR4或DR5结合抗体能够交联死亡受体及由此诱导凋亡，那么这些受体就是癌症疗法中感兴趣的靶物。至少八种死亡受体靶向性分子进入了临床开发且已经在临床试验中评估不同适应症的可能治疗，诸如晚期实体瘤，像结肠直肠或肺癌。另外，已经尝试治疗其它适应症，诸如淋巴瘤和/或多发性骨髓瘤。
US2007/0031414A1和WO2006/083971中记载的完全人的DR5激动性抗体Drozitumab在高浓度在交联缺失下显示一些体外凋亡活性。然而，体内数据揭示了一种不同的作用模式：在FcγR突变型小鼠中(或当使用FcγR结合受到抑制的抗体变体时)，Drozitumab没有活性，指示这种分子的体内活性主要依赖于FcγR介导的交联。这种分子测试到临床II期，看来是安全的(直到20mg/kg没有达到MTD)，但是没有展现任何显著功效。
EP1922337A中记载的Conatumumab是另一种完全人的DR5激动性抗体。Conatumumab的活性严格依赖于经Fc受体的交联。与Drozitumab形成对比，这种抗体是非配体阻断性的。同样，这种分子在临床试验中只显示非常有限的功效。
嵌合DR5抗体LBY-135展现就交联依赖性活性和非配体阻断性特性而言与Conatumumab类似的特征，而且在单一疗法中没有展现任何显著功效。另外，LBY-135在部分登记I期试验的患者中显示免疫原性的迹象。
DR4和DR5(TRAIL)的重组生产天然配体Dulanermin在临床试验中只显示有限的客观响应。天然配体的使用不知何故是不利的：TRAIL靶向多种受体，包括死亡受体和诱饵受体二者，因此，选择性堪忧。另外，TRAIL具有与单克隆抗DR抗体相比短得多的血液半衰期，这个因素影响剂量和时间表参数。与单克隆抗DR抗体相比，TRAIL很短的血液半衰期要求大和频繁的剂量。另外，重组TRAIL的生产非常困难且冗长。
上文所述三种DR5激动性抗体和配体的开发均已中止。
另外两种完全人的抗体，Mapatumumab(抗DR4)和Lexatumumab(抗DR5)，仍在开发中，虽然这些分子也没有在单一疗法中展现有希望的功效。
Tigatuzumab是一种人源化DR5激动性抗体，据记载在体外在次级交联缺失下(在低浓度已经)有活性，这当然带来系统性毒性问题的风险。然而，正如所有其它记载的激动性DR5抗体，这种分子也至今没有在I/II期研究中展现令人信服的功效，而且最大耐受剂量MTD证明只有8mg/kg。
用分子TAS266，一种四聚体DR5结合性纳米抗体(WO2011098520A1)，从事通过靶向死亡受体来诱导凋亡的一种不同办法。由于DR5结合模块的四价构造，认为DR5交联与标准二价抗体相比升高，这可导致活性升高。然而，由于它们的尺寸较小，这些分子具有(与抗体相比)半衰期相当短的缺点。另外，既然这种四聚体分子没有靶向肿瘤，那么系统性毒性的风险升高。
本申请的发明人已经将在双特异性抗体平台中组合DR5抗体Drozitumab与肿瘤抗原结合模块或肿瘤周围的基质中存在的抗原描述为实现两项效果的一种新办法：第一，可以将DR5结合抗体靶向肿瘤部位，这可避免潜在的系统性毒性问题(尤其当使用展现交联不依赖性活性的DR5抗体时)。第二，这种肿瘤或肿瘤基质靶向性模块然后也充当交联单元来诱导DR5超聚簇和随后的肿瘤部位特异性凋亡。已经使用靶向不同肿瘤类型的Drozitumab_scFv融合分子证明了基本概念(参见WO2011/039126)。
其中特别感兴趣的是结合DR5和人成纤维细胞活化蛋白(FAP；GenBank登录号AAC51668)的双特异性抗体。人FAP最初是使用单克隆抗体(mAb)F19(记载于WO93/05804，ATCC编号HB8269)在培养的成纤维细胞中鉴定的。在数个物种中发现了该蛋白质的同系物，包括小鼠(Niedermeyeretal.，IntJCancer71，383-389(1997)；Niedermeyeretal.，EurJBiochem254，650-654(1998)；GenBank登录号AAH19190)。FAP具有独特的组织分布：发现它的表达在超过90％的所有原发性和转移性上皮肿瘤，包括肺，结肠直肠，膀胱，卵巢和乳腺癌的反应性基质成纤维细胞上高度上调，而它通常在正常成年组织中缺失(Rettigetal.，ProcNatlAcadSciUSA85，3110-3114(1988)；Garin-Chesaetal.，ProcNatlAcadSciUSA87，7235-7239(1990))。后续报告显示FAP不仅在基质成纤维细胞中表达，而且在一些类型的上皮起源的恶性细胞中表达，而且FAP表达与恶性表型直接相关(Jinetal.，AnticancerRes23，3195-3198(2003))。令人惊讶的是，发明人发现靶向基质中的FAP和肿瘤细胞上的DR5的双特异性抗体实际诱导凋亡，尽管各靶物位于不同细胞上。
在进一步调查后，本申请的发明人发现WO2011/039126中记载的含有scFv的双特异性分子均就生产力，稳定性和聚集体形成(导致亚最佳，非特异性活性)而言有一些内在问题。
在本申请中提供新颖的靶向FAP和DR5的双特异性抗体。本申请的发明人开发了新颖的DR5结合模块，它们只在交联后有活性。因此，肿瘤细胞凋亡的诱导依赖于DR5经FAP的超交联，而且依赖于Fc/FcR相互作用。因此，在对FAP特异性和DR5的双特异性抗体以外，本文中还提供新颖的结合DR5的抗体。
相反，上文所述常规DR5靶向性分子的活性依赖于Fc受体(FcR)介导的超聚簇，而且受肿瘤中的免疫浸润和活化状态影响(Li和Ravetch，PNAS2012；Wilson，CancerCell2011；WO2011098520A1)。Fc/FcR相互作用可受生理性人IgG水平削弱。因此，常规DR5靶向性分子的活性常常限于少数浸润细胞(Moessner，Blood2010)。通过使用靶向DR5和FAP二者的双特异性抗体，敏感性肿瘤细胞的百分比可通过经FAP的超交联显著增大，而且针对DR5激动剂的内在抗性的风险降低。新颖的DR5结合模块只在与FAP交联后有活性，这可导致与DR5结合物Apomab和Tigatuzumab相比改善的安全性和毒性概况。至今已经测试的DR5激动剂在临床中是安全的，然而这些临床程序受到DR5靶向性分子的低功效阻碍。
另外，优选的新颖DR5结合模块与Drozitumab结合不同表位。
重要的是，在多种双特异性DR5-FAP靶向性抗体型式中可采用新颖的DR5结合模块，包括新颖的和已建立的双特异性型式二者。相反，只有FAP结合模块的C端融合对于基于Drozitumab的双特异性DR5-FAP靶向性抗体型式是有可能的，因为对Drozitumab的任何N末端融合产生没有活性的分子。因此，新DR5结合模块的提供显著扩张在各种双特异性DR5-FAP靶向性抗体型式中采用DR5靶向性模块的可能性。这是特别重要的，因为有些双特异性抗体型式就可生产性和活性而言具有卓越特征。
本文中提供的是新颖的双特异性抗体，其包含新颖的DR5结合模块和亲和力成熟的FAP结合模块。
以双特异性抗体型式提供本发明的双特异性抗体，其中一个或多个交换-Fab片段融合至IgG分子。交换Fab片段为如下的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。包含交换Fab片段的双特异性抗体型式已经描述于例如WO2009080252，WO2009080253，WO2009080251，WO2009080254，WO2010/136172，WO2010/145792和WO2013/026831。
迄今为止，只记载了含有scFv的型式的DR5-FAP双特异性抗体(WO2011/039126)。在其中披露的新颖的DR5结合物的不利特性以外，基于交换Fab的双特异性型式的使用导致生成期间改善的产量和更少的聚集体和副产物。另外，基于scFv和scFab的DR5-FAP靶向性双特异性抗体展现形成聚集体的趋势，因此带来更高的非特异性交联DR5的风险，即使在FAP缺失下。因此，这些型式具有在非靶细胞(即健康细胞)中潜在诱导凋亡的缺点。
本文中提供的新颖的双特异性抗体的DR5和FAP结合模块展现与常规DR5抗体相比卓越的体内功效。本发明的优选双特异性抗体以高亲和力结合肿瘤基质上的FAP并以较低亲和力结合肿瘤细胞上的DR5。此外，本文中提供的DR5和FAP靶向性双特异性抗体不与密切相关的蛋白质DR4，DcR1，DcR2(与DR5密切相关)和DPPIV(与FAP密切相关)交叉反应。另外，现在第一次有可能提供各种双特异性型式的DR5-FAP双特异性抗体，对每种结合特异性的效价没有限制。
综上所述，本文中提供的新颖双特异性DR5-FAP抗体是高度特异性且有力的：它们以FAP依赖性方式在肿瘤细胞中通过DR5超聚簇选择性诱导凋亡，对正常细胞的结合较低。
发明概述
本发明涉及组合死亡受体5(DR5)靶向性抗原结合位点与靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)的第二抗原结合位点的双特异性抗体。由此，死亡受体变成交联且靶定的肿瘤细胞的凋亡得以诱导。这些双特异性死亡受体激动性抗体胜过常规死亡受体靶向性抗体的优势在于只在FAP表达的部位诱导凋亡的特异性以及这些双特异性抗体诱导DR5超聚簇所致的更高效力。另外，提供新颖的结合DR5的抗体。如上所述，本发明的发明人开发了与可并入新颖的且有利的DR5-FAP双特异性抗体中的已知的DR5结合物相比具有卓越特性的新颖的DR5结合模块。
在一个实施方案中，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，所述对DR5特异性的抗原结合位点包含：
(a)SEQIDNO.:1，SEQIDNO.:17和SEQIDNO.:75的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:18，SEQIDNO.:25和SEQIDNO.:83的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:19，SEQIDNO.:84，SEQIDNO.:96，SEQIDNO.:98，SEQIDNO.:104和SEQIDNO.:108的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:20，SEQIDNO.:27和SEQIDNO.:86的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5，SEQIDNO.:21和SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:6，SEQIDNO.:22，SEQIDNO.:87，SEQIDNO.:99，SEQIDNO.:105，SEQIDNO.:109和SEQIDNO.:97的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含：
(a)SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10和SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11和SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12和SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13和SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14和SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供一种双特异性抗体，其中对DR5特异性的抗原结合位点包含：
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:6的轻链CDR3，
且对FAP特异性的抗原结合位点包含：
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含下述氨基酸序列的可变重链和可变轻链：SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:29；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:32；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:82和SEQIDNO.:85；SEQIDNO.:100和SEQIDNO.:101；SEQIDNO.:102和SEQIDNO.:103；SEQIDNO.:106和SEQIDNO.:107；SEQIDNO.:94和SEQIDNO.:95，
和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15和SEQIDNO.:39的氨基酸序列的可变重链；和包含SEQIDNO.:16和SEQIDNO.:40的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:8的氨基酸序列的可变轻链，和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
优选地，所述双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含所述对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含所述对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含所述对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含所述对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段经轻链(VLCL)连接至Fc域的第一或第二亚基且至少一个Fab片段经重链(VHCH1)连接至Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：
a)一个Fc域，
b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定轻链(CL)的C末端处连接至所述Fc域的第一或第二亚基，
c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述两个Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至所述Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：
a)一个Fc域，
b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至所述Fc域的第一或第二亚基，
c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述两个Fab片段在恒定轻链(CL)的C末端处连接至所述Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体对DR5和FAP二者是二价的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体对DR5是二价的且对FAP是单价的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体对DR5是三价的且对FAP是单价的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体对DR5是单价的且对FAP是单价的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，至少一个所述Fab片段经肽接头连接至Fc域。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，其包含一处或多处降低结合Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述一处或多处氨基酸替代在一个或多个选自下组的位置：L234，L235，和P329。在一个实施方案中，Fc域的每个亚基包含三处消除结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的Fc部分包含第二二聚化模块，容许抗体的两条重链异二聚化。在一个实施方案中，依照节入穴策略，第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包含穴。
在又一个实施方案中，提供一种特异性结合DR5的抗体，其包含：
(a)选自下组的重链互补决定区1(CDR1)：SEQIDNO.:1，SEQIDNO.:17和SEQIDNO.:75；
(b)选自下组的重链互补决定区2(CDR2)：SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:18，SEQIDNO.:25和SEQIDNO.:83；
(c)选自下组的重链互补决定区3(CDR3)：SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:19，SEQIDNO.:84，SEQIDNO.:96，SEQIDNO.:98，SEQIDNO.:104和SEQIDNO.:108；
(d)选自下组的轻链CDR1：SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:20，SEQIDNO.:27和SEQIDNO.:86；
(e)选自下组的轻链CDR2：SEQIDNO.:5，SEQIDNO.:21和SEQIDNO.:28；和
(f)选自下组的轻链CDR3：SEQIDNO.:6，SEQIDNO.:22，SEQIDNO.:87，SEQIDNO.:99，SEQIDNO.:105，SEQIDNO.:109和SEQIDNO.:97。
在又一个实施方案中，提供一种特异性结合DR5的抗体，其包含：
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:6的轻链CDR3。
在又一个实施方案中，提供一种特异性结合DR5的抗体，其包含包含选自下组的氨基酸序列的可变重链和可变轻链：SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:29；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:32；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:82和SEQIDNO.:85；SEQIDNO.:100和SEQIDNO.:101；SEQIDNO.:102和SEQIDNO.:103；SEQIDNO.:106和SEQIDNO.:107；SEQIDNO.:94和SEQIDNO.:95。
在又一个实施方案中，提供一种特异性结合DR5的抗体，其包含包含SEQIDNO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:8的氨基酸序列的可变轻链。
在第二个目标中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体或特异性结合DR5的抗体。
在第三个目标中，本发明涉及本发明的靶向DR5和FAP的双特异性抗体或特异性结合DR5的抗体，其用于治疗癌症。在一个优选的实施方案中，所述癌症为胰腺癌或结肠直肠癌。在另一个实施方案中，提供双特异性抗体或特异性结合DR5的抗体作为药物的用途。优选地，所述用途为用于治疗癌症，优选胰腺癌症或结肠直肠癌。
在又一些目标中，本发明涉及包含的序列编码本发明的双特异性抗体或特异性结合DR5的抗体的重链的核酸序列，包含的序列编码本发明的双特异性抗体或特异性结合DR5的抗体的轻链的核酸序列，包含本发明的核酸序列的表达载体，和包含本发明的载体的原核或真核宿主细胞。另外，提供生成抗体的方法，其包括培养宿主细胞，使得抗体生成。
附图简述
图1：两种不同细胞系(SW872和GM05389)的人成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达水平的FACS结合分析(A)。显示三个量级的范围(黑色，灰色和阴影线条)上以不同浓度的抗FAP抗体测量的荧光强度。阴性对照反应如二抗和仅细胞分别以带点和白色条显示。虽然GM05389细胞在所有测试的抗体浓度上显示超出背景的FAP表达，但是SW872细胞只在使用的最高抗体浓度(10μg/ml)能检测到FAP表达，指示这些细胞不适合于基于FAP的结合/凋亡诱导实验。另外，显示了这种细胞系几乎不经历Drozitumab介导的凋亡(B)。单独的Drozitumab或另一种商品化抗DR5抗体不诱导有关的DNA片段化。只有在Drozitumab用抗人Fc抗体交联时能观察到可检测的低水平凋亡诱导。
图2：两种不同人肿瘤细胞系(乳腺癌细胞系MDA-MB-231和肾癌细胞系ACHN)上的DR5表达的检测，经由用Drozitumab进行的FACS结合和随后用经标记抗Fc抗体进行的检测。两种细胞系均显示相当的，低表达水平的人DR5。
图3：用于检测凋亡的DNA片段化ELISA测定法。单独地或在等数目的FAP表达性GM05389成纤维细胞存在下培养ACHN(A)或MDA-MB-231(B)靶细胞。分别以0.1μg/ml(A)和0.7nM(B)的浓度添加DR5-FAP双特异性抗体(scFv融合物)，并将细胞温育24小时，之后检测DNA片段化。对于Drozitumab交联，使用0.1μg/ml抗Fc二抗。
图4：用于检测凋亡的DNA片段化ELISA测定法。在FAP性表达成纤维细胞(GM05389)存在或缺失下双特异性DR5-FAP抗体(融合有scFab的Drozitumab)对ACHN细胞的凋亡诱导。将具有不同FAP结合模块的双特异性分子的活性与有或无通过抗Fc二抗的交联的Drozitumab比较。以两种不同浓度(1.0μg/ml和0.1μg/ml)使用抗体。在这些设置中，含有4G8scFab融合的双特异性分子(B)在DNA片段化测定法中显示与含有3F2scFab的分子(A)相比卓越的凋亡诱导活性。
图5：两种不同双特异性DR5-FAP分子的示意性呈现，其中抗FAPCrossFab模块通过标准(G4S)4接头融合至DrozitumabIgG的C末端。在一种情况(A)中，VHCLCrossFab融合至DrozitumabIgG，而在(B)中，VLCH1链连接至IgG，如所示的。这两种分子只是使用IgG-CrossFab组合的可能型式的例子，其还用于含有新分离的DR5结合物的双特异性分子。其它可能性包括分子的IgG部分的交叉，执行盐桥和带电荷残基以稳定CrossFab或使用不同接头长度和序列。
图6：不同双特异性DR5-FAP抗体型式纯化期间聚集体含量的比较。所有型式均由有FAP结合域(克隆4G8)融合至C末端的DrozitumabIgG组成。FAP结合模块由二硫化物稳定的scFv(A)，scFab(B)或CrossFab(C)任一组成。制备性大小排阻层析的层析图显示三种构建体之间的清楚差异。虽然scFv和CrossFab分子的生成是相当的，但是含有scFab的构建体显示更低的产量和更高的聚集体含量。从这项比较看含有CrossFab的分子最有希望。
图7：重组，人FAP表达性HEK293细胞上的FACS结合的分析。将新的CrossFab型式的DR5-FAP双特异性分子与scFab分子，亲本4G8IgG和无关阴性对照Drozitumab比较。这两种CrossFab分子显示出至少在与IgG对照相同的范围中结合FAP。
图8：双特异性Drozitumab-FAP分子(CrossFabs)同时结合重组人DR5和FAP的表面等离振子共振(SPR，Biacore)分析。将生物素化人DR5-Fc作为配体固定化到链霉亲合素芯片上，接着注射第一分析物(双特异性CrossFab分子)。在结合DR5-Fc(90秒结合)和短解离期(10秒)之后，以不同浓度(100nM，500nM)添加重组可溶性FAP(人或鼠)作为第二分析物，并测量另外的响应。将Drozitumab-X-FAP_A型式(A和B)的结合与Drozitumab-X-FAP_B(C和D)比较。对每一种构建体测量结合DR5和人(A，C)或鼠FAP(B，D)。通过对所有测试分子的这项分析，能证明对DR5和人/鼠FAP的同时结合。
图9：用于检测凋亡的DNA片段化ELISA测定法。凋亡诱导实验的结果，其中将两种CrossFab分子(Drozitumab-X-Fab-A和Drozitumab-X-Fab-B)与Drozitumab和超交联的Drozitumab在两细胞系(MDA-MB-231和GM05389)共培养测定法中比较。(A)24小时后使用细胞死亡检测ELISA检测凋亡诱导。以7nM和0.7nM的浓度使用所有测试的构建体。将靶细胞和效应细胞的凋亡诱导与单独的靶细胞的凋亡比较。(B)Drozitumab(+/-Fc交联)较之由融合至Drozitumab重链的C末端的FAPCrossFab组成的双特异性DR5-FAP分子的细胞死亡检测ELISA(DNA片段化)中的共培养旁观者凋亡诱导的比较。含有亲和力成熟的FAP结合模块(28H1)的分子显示与含有更低亲和力FAP结合物的分子相比卓越的活性。
图10：用于检测凋亡的DNA片段化ELISA测定法。经双特异性Drozitumab-FAPCrossFab分子的凋亡诱导依赖于经FAP的交联。图10显示通过包被至ELISA板的重组人FAP交联的CrossFab分子对MDA-MB-231细胞的凋亡诱导的结果。虽然对照分子(经抗Fc抗体交联的Drozitumab)不依赖于FAP或无关对照蛋白质的包被显示相似的凋亡诱导，但是双特异性构建体只在包被FAP时展现显著的凋亡活性。凭借包被对照质粒，只在最高构建体浓度(7nM)能检测到凋亡，这大概是由于MDA-MB-231细胞系上的基础FAP表达。凋亡活性对于全部两种测试的CrossFab分子是相似的且在与用超交联的Drozitumab观察到的相同的范围中。
图11：与FAP表达性人成纤维细胞GM05389的共培养实验中对不同人肿瘤细胞系的凋亡诱导(DNA片段化)的比较。将Drozitumab和超交联的Drozitumab与双特异性Drozitumab-4G8CrossFab分子比较(均以7.0和0.7nM的浓度)。使用的肿瘤细胞系为MDA-MB-231(乳腺癌)，U-87MG(成胶质细胞瘤)，FaDu(鳞癌)或A549(肺癌)。浓度为7nM时的凋亡诱导对所有四种细胞系是相似的，而在0.7nM时观察到细胞系之间更加突出的差异。
图12：用于分离，筛选和表征新颖的DR5结合物的人DR5抗原构建体的示意图。对于所有构建体，单独地(A)，作为二聚体Fc融合物(B)或作为单体Fc融合物(C)(使用节入穴技术)任一使用相同的DR5域(胞外域，ECD；aa56–207)。在HEK293EBNA细胞中瞬时转染和生成所有抗原。
图13：对46种独特DR5结合物(通过噬菌体展示分离)筛选在用抗Fc二抗超交联后诱导MDA-MB-231细胞凋亡(DNA片段化测定法)。以7nM(黑色条)和0.7nM(阴影线条)的浓度使用抗体。绝大多数DR5结合物(42/46)能够在超交联后诱导不同程度的DNA片段化。
图14：在交联性抗Fc二抗存在或缺失下MDA-MB-231细胞中选定系列的新颖的DR5结合物所致的凋亡诱导(经DNA片段化ELISA测定法测量)以评估新的DR5抗体是否在没有次级交联的情况下展现凋亡活性。将新的DR5结合物与Drozitumab(一种已知在没有交联的情况下有某种程度的活性的抗体)比较。
图15：用浓度为7nM的不同的交联的DR5抗体处理后三种不同人肿瘤细胞(DLD-1，NCIH460和MDA-MB-231)的细胞增殖抑制的分析(CellTiterGlo测定法)。
图16：用浓度为7nM的交联的DR5抗体处理后三种人肿瘤细胞系(DLD-1，NCIH460和MDA-MB-231)中的凋亡诱导的评估(通过胱天蛋白酶8活化测量)。
图17：通过表面等离振子共振(Biacore)进行的表位结合实验的结果。在第一抗体结合人DR5后，分析要测试的别的抗体的进一步结合。除可能与Drozitumab表位交叠的克隆422外，测试的新的DR5结合物无一看来结合DR5上与Drozitumab表位交叠的区域，而它们彼此间可能至少分享交叠表位。
图18：用于比较测定配体阻断性和配体非阻断性抗体的TRAIL竞争测定法。在CM5芯片上固定化人TRAIL。然后使用由人DR5-Fc和DR5抗体组成的复合物作为分析物，并分析复合物对固定化TRAIL的结合。虽然大多数来自噬菌体展示的新的结合物是TRAIL阻断性分子，但是一些来自家兔免疫接种的DR5抗体是非阻断性类别的。
图19：人TRAIL对用不同DR5激动性抗体处理后的DLD-1靶细胞增殖抑制的影响。在不同浓度的人TRAIL缺失(实线)或存在(点虚线)下将DLD-1靶细胞与交联的DR5抗体一起温育。根据DR5抗体识别的表位，添加TRAIL确实有(非配体阻断性)或没有(配体阻断性)提高细胞生长抑制。包括单独的TRAIL和一种已知不阻断TRAIL的抗体作为对照。
图20：用于检测凋亡的DNA片段化ELISA测定法。在96孔板上包被的重组人FAP存在或缺失下不同DR5-FAP双特异性抗体(FAP克隆28H1)对作为靶细胞系的MDA-MB-231的凋亡诱导活性。在这种设置中，包被的FAP应当模拟肿瘤基质中表达的FAP。在两种浓度(7.0和0.7nM)测试双特异性抗体。对于含有新颖的DR5结合物的双特异性分子，只在FAP存在下检测到浓度依赖性凋亡诱导，而含有Drozitumab的对照分子在FAP缺失下也显示一些活性，确认了新的DR5抗体的活性严格依赖于交联。
图21：双特异性DR5-FAP分子(2+2CrossFab型式)在共培养测定法中的旁观者凋亡诱导活性，使用MDA-MB-231作为DR5表达性靶细胞和GM05389(FAP+成纤维细胞)进行交联。在三种浓度(7.0，0.7和0.07nM)将含有不同新分离的DR5结合物的分子与含有Drozitumab的构建体比较。在这些条件下，并非所有测试的双特异性构建体均展现与经抗Fc单抗或经重组FAP的交联相比相同的活性。这显示了并非每一种能主要在交联后诱导凋亡的抗体在更加天然的条件(其中抗原DR5和FAP在不同细胞类型上表达)下也会这样。
图22：用融合至人Fc的C末端的新的DR5结合Fab处理的MDA-MB-231靶细胞的细胞死亡检测ELISA(DNA片段化)，与Drozitumab相比，均在用抗Fc抗体交联之后。测试的Fc融合物分子均能够在与交联的Drozitumab相同的范围中赋予对靶细胞的凋亡诱导，指示他们的结合和活性能力不受Fc放置于它们的N末端阻断。A：自噬菌体展示衍生的DR5结合物，B：自免疫接种衍生的人源化DR5结合物。
图23：在使用GM05389成纤维细胞的共培养测定法中对双特异性DR5-FAP抗体(具有C末端28H1CrossFab融合的新的DR5结合物)比较以MDA-MB-231作为靶细胞系的凋亡诱导(DNA片段化ELISA测定法用于检测凋亡)。
图24：在旁观者测定法中双特异性DR5-FAP抗体对G401细胞诱导凋亡，如在细胞死亡检测ELISA中通过DNA片段化测定的。
图25：就生产力和品质而言评估的别的双特异性DR5-FAPCrossFab型式的示意性呈现。这四种分子在DR5和FAP结合模块的位置和效价方面不同：评估了两种2+1分子，一种3+1和一种1+1构建体。一种2+1分子含有融合至DR5(5E11)重链的C末端的一个FAP(28H1)CrossFab(A)，而第二种2+1型式由融合至Fc的N末端的两个DR5(5E11)Fab及28H1CrossMab配对物组成(B)。第三种分子(C)含有三个DR5靶向性Fab和在重链的C末端融合的一个28H1CrossFab。在1+1型式(D)中，DR5结合物#174与FAP结合模块4B9以CrossFab安排组合。所有构建体依赖于使用节入穴技术的异二聚化。
图26：不同型式的双特异性DR5-FAP分子(A：5E11-28H1；B：18F11-28H1)的凋亡活性，如通过与GM05489成纤维细胞共培养的MDA-MB-231细胞中的DNA片段化的细胞死亡检测ELISA测量的。在三个不同浓度，标准2+2型式的Drozitumab-28H1与2+2，2+1和3+1型式的5E11-28H1和18F11-28H1分子相当。
图27：5E11-28H1分子(2+2型式)的旁观者凋亡诱导，与三种别的双特异性型式比较：2+1，新颖的2+1(头-尾融合)和3+1。使用MDA-MB-231作为靶细胞，共培养GM05389成纤维细胞进行FAP依赖性交联，并以700-0.007nM的浓度评估双特异性抗体。
图28：新的双特异性5E11-28H1型式(2+2)，用于评估生产力，副产物概况和活性。各分子在交叉位点和类型方面不同。
A：28H1的C末端交叉(CH1CL)B：整个N末端5E11Fab的交叉
C：5E11的N末端VHVL交叉D：5E11的N末端CH1CL交叉
E：C末端28H1Fab的整个交叉F：C末端28H1Fab的交叉(VHVL)
图29：在自0.0037至60nM的浓度范围上三种不同型式的5E11-28H1CrossFab对MDA-MB-231的FACS结合结果。使用一种PE缀合的山羊抗人Fc(Fab)2进行检测。
图30：用于检测凋亡的DNA片段化ELISA测定法。4种不同CrossMab变体在共培养(A)和单培养(B，C)设置中的凋亡诱导，如通过DNA片段化检测的。4种不同变体在共培养设置中均以相当的剂量依赖性方式在肿瘤细胞中诱导凋亡。在单培养设置中，在MDA-MB231肿瘤细胞系中或在GM05389成纤维细胞细胞系中均没有诱导凋亡，指出所有4种变体的凋亡诱导的特异性和FAP依赖性。
图31：小鼠异种移植物肿瘤模型中的体内功效，其中与muFAP表达性3T3成纤维细胞共注射DLD-1(A；裸小鼠)或MDA-MB-231(B；SCID米色小鼠)细胞以确保肿瘤基质中的FAP表达。在肿瘤移植后，以10mg/kg通过静脉内注射双特异性Drozitumab-28H1分子(三角形)或单独的Drozitumab(正方形)或媒介对照(菱形)实施处理。通过与媒介对照相比的肿瘤生长抑制(TGI)测定功效。
图32：对为体内功效实验生成的双特异性DR5-FAP分子评估它们的凋亡诱导活性。在DLD-1细胞的DNA片段化的细胞死亡检测ELISA中测试四种不同分子。在共培养测定法中使用3T3或表达鼠FAP的重组3T3细胞进行交联。显示了与未处理细胞相比的凋亡倍数升高。
图33：与3T3细胞或表达鼠FAP的3T3细胞的共培养测定法后用DR5-FAP双特异性抗体处理后DLD-1细胞的存活力(CellTiterGlo)。给出了存活力与未处理对照相比的百分比。
图34：小鼠异种移植物模型，在其中比较2+2型式的不同DR5-FAP双特异性分子(10mg/kg)与媒介对照。所有构建体含有融合至不同DR5结合物(5E11，174和422)的28H1FAPCrossFab。包括另一种分子(5E11-28H1)，其中Fc携带突变以抑制任何FcγR相互作用(PGLALA)。以肿瘤生长抑制(TGI)测定功效。
图35：DNA片段化测定法。抗DR5抗体以剂量依赖性方式在受体超聚簇后诱导细胞死亡。生成的家兔抗DR5抗体能够以不同效力诱导MDA-MB231细胞凋亡，但是总是以剂量依赖性方式且只在Fc介导的DR5分子交联之后(上部小图)。在抗家兔Fc特异性二抗缺失下，没有检测到显著的细胞死亡(下部小图)。
图36：抗DR5抗体以剂量依赖性方式在受体超聚簇后降低细胞存活力。生成的家兔抗DR5抗体能够以不同效力降低MDA-MB231细胞的存活力，但是总是以剂量依赖性方式且只在Fc介导的DR5分子交联之后(上部小图)。在抗家兔Fc特异性二抗缺失下，细胞存活力在任何抗体浓度不受影响(下部小图)。
图37：用浓度为7nM的不同的交联的DR5抗体处理后三种不同人肿瘤细胞(DLD-1，NCIH460和MDA-MB-231)中的细胞增殖抑制的分析(CellTiterGlo测定法)。
图38：用浓度为7nM的交联的DR5抗体处理后三种人肿瘤细胞系(DLD-1，NCIH460和MDA-MB-231)中的凋亡诱导的评估，通过胱天蛋白酶8活化测量。
图39：加压DR5抗体样品的相对活性浓度：例示性响应曲线。
图40：自免疫接种衍生的初始和加压DR5抗体的相对活性浓度。
图41：自噬菌体展示衍生的初始和加压DR5抗体的相对活性浓度。
图42：不同DR5-FAP双特异性抗体对全部两种重组靶物的同时结合的表面等离振子共振(SPR，Biacore)分析。在第一项反应中，测定双特异性抗体对重组人DR5-Fc的结合，接着分析对重组人(上部小图)或鼠FAP(下部小图)的结合。
图43：在共培养测定法中2+2双特异性构建体对DLD-1和H460肿瘤细胞系中的凋亡的诱导，如通过DNA片段化检测的。虽然含有Drozitumab作为DR5结合构件的双特异性构建体早就在FAP缺失下诱导凋亡，但是含有通过免疫接种衍生的新的DR5结合物的构建体均只在FAP存在下诱导凋亡。与含有Drozitumab的双特异性构建体相比，具有新开发的DR5结合物(诸如0011-28H1和0016-28H1)的构建体能够以更高的程度诱导凋亡，尤其在低浓度。
图44：抗DR5-FAP双特异性2+2构建体对DR5表达性肿瘤细胞系MDA-MB-231的结合，如通过流式细胞术分析测量的。
图45：A，交联后人源化变体的凋亡诱导，如通过DNA片段化(细胞死亡检测ELISA)检测的：DR5TAA-0011的人源化变体(DR5TAA-0066–DR5TAA-0075，黑色线)在用二抗交联后以剂量依赖性方式诱导凋亡。数种人源化变体，诸如DR5TAA-0067，DR5TAA-0071，DR5TAA-0074和DR5TAA-0075，能够就最大诱导和剂量依赖性以与嵌合变体(DR5TAA-0052，灰色线)相比相似的方式诱导凋亡。B，在没有别的交联的情况下人源化变体的凋亡诱导的缺失，如通过DNA片段化(细胞死亡检测ELISA)检测的：如果没有通过二抗交联的话，DR5TAA-0011的人源化变体(DR5TAA-0066–DR5TAA-0075)不诱导凋亡。
图46：1+1和2+2型式的双特异性抗DR5-FAP抗体在共培养系统中相当的细胞死亡诱导。
图47：双特异性抗DR5-FAP抗体只在肿瘤细胞和成纤维细胞二者存在下诱导细胞死亡的极大特异性。
图48：双特异性抗DR5-FAP(DR5结合物：VHSEQIDNO.:7，VLSEQIDNO.:8，FAP结合物：VHSEQIDNO.:15，VLSEQIDNO.:16)在基于DLD-1CRC共注射细胞系的异种移植物模型中的功效。
图49：双特异性抗DR5-FAP(DR5结合物：VHSEQIDNO.:7，VLSEQIDNO.:8，FAP结合物：VHSEQIDNO.:15，VLSEQIDNO.:16)在基于Co5896CRC碎片的患者衍生异种移植物模型(PDX)中的功效。
发明详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体”指如下的双特异性抗体，其能够以足够亲和力结合DR5和FAP，使得该抗体可用作靶向表达DR5和FAP的细胞的诊断剂和/或治疗剂。具体而言，“特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体”指靶向肿瘤细胞上的DR5和所述肿瘤周围的基质中的FAP的双特异性抗体。在一个实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体结合无关非FAP或非DR5蛋白质的程度小于该抗体对DR5或FAP的结合的约10％，如例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、基于表面等离振子共振(SPR)的测定法(例如Biacore)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体结合在来自不同物种的DR5或FAP间保守的DR5或FAP表位。优选地，所述双特异性抗体结合人和猕猴DR5及人、猕猴和小鼠FAP。
术语“特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体”指如下的抗体，其能够以足够亲和力结合DR5，使得该抗体可用作靶向表达DR5的细胞的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体结合无关非DR5蛋白质的程度小于该抗体对DR5的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体结合在来自不同物种的DR5间保守的DR5表位。优选地，所述抗体结合人和猕猴DR5。术语“特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体”还涵盖能够结合DR5和第二抗原的双特异性抗体。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中的如下部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；cross-Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，scFv抗体记载于Huston,J.S.,MethodsinEnzymol.203(1991)46-96。另外，抗体片段包含具有VH域或VL域的特征(即能够与VL域或VH域一起装配成功能性抗原结合位点，并且由此提供全长抗体的抗原结合特性)的单链多肽。
如本文中使用的，“Fab片段”指包含轻链片段(其包含VL域和轻链恒定域(CL))及VH域和重链第一恒定域(CH1)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含至少一个Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。由于可变区或恒定区任一的交换，所述Fab片段也称作“cross-Fab”片段或“xFab”片段或“交换Fab”片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重和轻链的可变区是交换的，即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的一条肽链及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的一条肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(VLVH)。另一方面，当Fab重和轻链的恒定区交换时，交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的一条肽链及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的一条肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH)、抗体恒定域1(CH1)、抗体轻链可变域(VL)、抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头N端至C端方向具有下述次序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸、优选介于32和50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL经CL域和CH1域之间的天然二硫键稳定化。另外，通过经插入半胱氨酸残基(例如可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100，依照Kabat编号方式)生成链间二硫键可以进一步稳定化这些单链Fab分子。术语“N端”表示N端最后一个氨基酸，术语“C端”表示C端最后一个氨基酸。
“融合”或“连接”表示各成分(例如Fab分子和Fc域亚基)是通过肽键相连接的，或是直接的或是经由一个或多个肽接头。
如本文中使用的，术语“接头”指肽接头且优选是具有长度为至少5个氨基酸，优选长度为5-100个，更优选10-50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3、4、5或6且m＝0、1、2或3)或(x＝4且n＝2、3、4或5且m＝0、1、2或3)，优选地x＝4且n＝2或3，更优选地x＝4且n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(G4S)2。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“嵌合”抗体指其中重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体，其通常通过重组DNA技术来制备。包含家兔可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中恒定区已经自初始抗体的恒定区修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合)的。此类嵌合抗体又称为“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于生成嵌合抗体的方法牵涉常规的重组DNA和基因转染技术，其是本领域中公知的。参见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855；美国专利No.5,202,238和5,204,244。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。
如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对Fc受体的结合，或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸替代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991的。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgGFc域的亚基包含IgGCH2和IgGCH3恒定域。
“促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，异二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的组分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。正如关于依照本发明的嵌合和人源化抗体也提及的，如本文中使用的，术语“人抗体”也包含恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性的此类抗体，尤其在C1q结合和/或FcR结合方面，例如通过“类转换”即Fc部分的改变或突变(例如自IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但可以不天然存在于体内的人抗体种系全集内的序列。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合)的。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35B(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。高变区(HVR)也称作互补决定区(CDR)，而且这些术语在述及形成抗原结合区的可变区部分时在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1983)及由Chothia等,JMolBiol196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表A中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基编号将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。
表A：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等(见下文)提出的编号惯例。
2如表A中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由OxfordMolecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”系统用于任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等,U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,“SequenceofProteinsofImmunologicalInterest”(1983)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号系统。
除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”的核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“没有实质性交叉反应性”意指分子(例如，抗体)不识别或特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原(例如与靶抗原密切相关的抗原)，特别地在与该靶抗原相比时。例如，抗体可以结合少于约10％至少于约5％的与实际靶抗原不同的抗原，或者可以以由少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、或0.1％组成的量结合所述与实际靶抗原不同的抗原，优选地少于约2％、1％、或0.5％，且最优选地少于约0.2％或0.1％与实际靶抗原不同的抗原。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指处于如下的制剂，其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
如本文中使用的，术语“死亡受体5(DR5)”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然DR5，除非另外指明。该术语涵盖“全长”、未加工的DR5以及DR5因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖DR5的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。例示性人DR5的氨基酸序列显示于SEQIDNO:155。
如本文中使用的，术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然FAP，除非另外指明。该术语涵盖“全长”、未加工的FAP以及FAP因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖FAP的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。优选地，本发明的抗FAP抗体结合FAP的胞外域。例示性人、小鼠和猕猴FAP胞外域(带C端聚赖氨酸和6xHis标签)的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO:156、SEQIDNO:157、和SEQIDNO:158。
在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
如本文中使用的，术语“癌症”指增殖性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌(stomachcancer,gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、何杰金(Hodgkin)氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)新生物、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、施旺细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(见例如Kindt等KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
术语“抗体的抗原结合位点”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是可变域中那些与本文中定义的高变区残基不同的区。因此，抗体的轻和重链可变域自N至C端包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。尤其地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大且限定抗体特性的区。CDR和FR区依照Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。
抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。依照本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体是对两种不同抗原特异性，即作为第一抗原的DR5和作为第二抗原的FAP。
如本文中使用的，术语“单特异性”抗体表示抗体具有一个或多个结合位点，每个结合相同抗原的相同表位。
如本文中使用的，术语“双特异性”抗体表示抗体具有至少两个结合位点，每个结合不同抗原或相同抗原的不同表位。
本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体指对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。本文中提供双特异性抗体，其具有针对FAP和DR5的结合特异性。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合DR5的两种不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位于表达DR5的细胞。可以作为全长抗体或抗体片段制备双特异性抗体。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983))、WO93/08829、和Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))、和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含至少一个结合FAP或DR5以及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US2008/0069820)。
如本申请内使用的，术语“效价”或“价”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。如此，术语“二价”、“四价”、和“六价”分别表示抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点、和六个结合位点。依照本发明的双特异性抗体至少是“二价”的，而且可以是“三价”的或“多价”的(例如“四价”或“六价”)。
本发明的抗体具有两个或更多个结合位点且是双特异性的。就是说，该抗体可以是双特异性的，即使在有超过两个结合位点的情况中(即该抗体是三价或多价的)。本发明的双特异性抗体包括例如多价单链抗体、双抗体和三抗体，以及如下的抗体，该抗体具有全长抗体的恒定域结构，对其经一个或多个肽接头连接别的抗原结合位点(例如单链Fv、VH域和/或VL域、Fab、或(Fab)2)。所述抗体可以是来自单一物种的全长，或者是嵌合化的或人源化的。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸组，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)、和缬氨酸(val，V)。
如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不管传代的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
如本文中所使用的，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在表面等离振子共振测定法(SPR,BIAcore,GE-HealthcareUppsala,Sweden)中抗体对抗原的表位的结合。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)限定。结合或特异性结合意指10-8mol/l或更小，优选10-8M至10-13M的结合亲和力(KD)。
抗体对死亡受体的结合可以通过BIAcore测定法(GE-HealthcareUppsala,Sweden)来调查。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)限定。
术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体结合的区域。
如本文中所使用的，认为特别地具有前缀“糖”的术语“工程化”或“工程化改造”及术语“糖基化工程”包括对天然存在的或重组的多肽或其片段的糖基化样式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机制的代谢工程，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程是糖基转移酶活性的变化。在一个具体的实施方案中，工程化改造导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。
II.组合物和方法
一方面，本发明基于包含对TRAIL死亡受体5(DR5)特异性的第一抗原结合位点和对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性的第二抗原结合位点的双特异性抗体。在另一个实施方案中，提供靶向DR5的新颖抗体。本发明的抗体可用于例如治疗或诊断癌症。
A.例示性的结合DR5和FAP的双特异性抗体
在一个方面，本发明提供分离的结合DR5和FAP的双特异性抗体。FAP结合模块已经记载于WO2012/020006，通过援引将其完整收录。下述实施方案中描绘了在DR5-FAP双特异性抗体中使用特别感兴趣的FAP结合模块。
在某些实施方案中，结合DR5和FAP的双特异性抗体特异性交联死亡受体且靶细胞的凋亡得以诱导。这些双特异性死亡受体激动性抗体胜过常规死亡受体靶向性抗体的优势在于只在FAP表达的部位诱导凋亡的特异性。如上文描绘的，本发明的发明人开发了与可并入新颖的且有利的DR5-FAP双特异性抗体中的已知的DR5结合物相比具有卓越特性的新颖的DR5结合模块。
在一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1，SEQIDNO.:17和SEQIDNO.:75的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:18，SEQIDNO.:25和SEQIDNO.:83的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:19，SEQIDNO.:84，SEQIDNO.:96，SEQIDNO.:98，SEQIDNO.:104和SEQIDNO.:108的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:20，SEQIDNO.:27和SEQIDNO.:86的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5，SEQIDNO.:21和SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:6，SEQIDNO.:22，SEQIDNO.:87，SEQIDNO.:99，SEQIDNO.:105，SEQIDNO.:109和SEQIDNO.:97的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10和SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11和SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12和SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13和SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14和SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:6的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:6的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:21的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:21的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:25的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:21的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:25的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:21的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:27的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:27的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:25的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:25的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:75的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:83的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:84的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:86的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:87的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:75的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:83的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:84的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:86的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:87的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:96的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:99的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:96的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:99的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:104的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO:105的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:104的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO:105的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:108的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO:109的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:108的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO:109的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:98的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:97的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:98的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:97的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:25的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:27的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:25的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:27的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)SEQIDNO.:33的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:34的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:35的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:36的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:37的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:38的轻链CDR3。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含选自下组的氨基酸序列的可变重链和可变轻链：SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:29；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:32；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:82和SEQIDNO.:85；SEQIDNO.:100和SEQIDNO.:101；SEQIDNO.:102和SEQIDNO.:103；SEQIDNO.:106和SEQIDNO.:107；SEQIDNO.:94和SEQIDNO.:95；
和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含选自下组的氨基酸序列的可变重链：SEQIDNO.:15和SEQIDNO.:39；和包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变区：SEQIDNO.:16和SEQIDNO.:40。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:8的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:8的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:24的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:24的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:24的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:24的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:29的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:29的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:30的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:30的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:31的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:31的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:32的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:32的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:30的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:30的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:31的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:31的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:82的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:85的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:82的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:85的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:100的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:101的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:100的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:101的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:102的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:103的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:102的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:103的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:106的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:107的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:106的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:107的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:94的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:95的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:94的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:95的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQIDNO.:39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:40的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含重链恒定区，其包含SEQIDNO.:151的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含重链恒定区，其包含SEQIDNO.:152的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含轻链恒定区，其包含SEQIDNO.:153的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含重链恒定区，其包含SEQIDNO.:151的氨基酸序列，其中C末端赖氨酸已经消除。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含重链恒定区，其包含SEQIDNO.:152的氨基酸序列，其中C末端赖氨酸已经消除。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点的第一抗体，所述第一抗体包含SEQIDNO.:7的可变重链和SEQIDNO.:8的可变轻链，和包含选自SEQIDNO.:151或SEQIDNO.:152的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQIDNO.:153的氨基酸序列的轻链恒定区，和对FAP特异性的第二抗体，所述第二抗体包含一种或多种上文任何实施方案中限定的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重链恒定区的氨基酸序列的C末端赖氨酸已经消除。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点的第一抗体，所述第一抗体包含SEQIDNO.:7的可变重链和SEQIDNO.:8的可变轻链，和包含选自SEQIDNO.:151或SEQIDNO.:152的氨基酸序列的重链恒定区，和包含SEQIDNO.:153的氨基酸序列的轻链恒定区，和对FAP特异性的第二抗体，所述第二抗体包含SEQIDNO.:15的可变重链和SEQIDNO.:16的可变轻链。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:131，SEQIDNO.:132和SEQIDNO.:124。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:133，SEQIDNO.:132和SEQIDNO.:124。
在一个优选的实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:134，SEQIDNO.:132和SEQIDNO.:124。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:262，SEQIDNO.:263和SEQIDNO.:132。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:135，SEQIDNO.:136和SEQIDNO.:137。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:138，SEQIDNO.:139和SEQIDNO.:137。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:274，SEQIDNO.:275，和SEQIDNO.:137。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:276，SEQIDNO.:277，和SEQIDNO.:132。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:278，SEQIDNO.:279和SEQIDNO.:132。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:142，SEQIDNO.:143，SEQIDNO.:124和SEQIDNO.:132。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:145，SEQIDNO.:146，SEQIDNO.:124和SEQIDNO.:132。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:144，SEQIDNO.:143，SEQIDNO.:124和SEQIDNO.:132。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQIDNO.:159，SEQIDNO.:160，SEQIDNO.:161和SEQIDNO.:162。
在另一个方面，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含与SEQIDNO.:7的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列，和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含SEQIDNO.:15的可变重链和SEQIDNO.:16的可变轻链。
在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5和FAP的双特异性抗体保留结合FAP和DR5的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO.:7中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQIDNO.:7中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含与SEQIDNO.:8的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列，和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含SEQIDNO.:15的可变重链和SEQIDNO.:16的可变轻链。
在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5和FAP的双特异性抗体保留结合DR5和FAP的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO.:8中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQIDNO:8中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，所述对DR5特异性的抗原结合位点包含SEQIDNO.:8的可变轻链和SEQIDNO.:7的可变重链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，所述对FAP特异性的抗原结合位点包含与SEQIDNO.:15的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5和FAP的双特异性抗体保留结合FAP和DR5的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO.:15中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQIDNO.:15中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，所述对DR5特异性的抗原结合位点包含SEQIDNO.:8的可变轻链和SEQIDNO.:7的可变重链，和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，所述对FAP特异性的抗原结合位点包含与SEQIDNO.:16的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5和FAP的双特异性抗体保留结合DR5和FAP的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO.:16中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQIDNO:16中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，及SEQIDNO:15和SEQIDNO:16中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体为人抗体。
B.例示性的结合DR5的抗体
在一个方面，本发明提供分离的结合DR5的抗体和抗体片段。这些死亡受体激动性抗体与可并入新颖的且有利的靶向DR5和第二抗原的双特异性抗体中的已知的DR5结合物相比具有卓越特性。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:1，SEQIDNO.:17和SEQIDNO.:75的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:18，SEQIDNO.:25和SEQIDNO.:83的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:19，SEQIDNO.:84，SEQIDNO.:96，SEQIDNO.:98，SEQIDNO.:104和SEQIDNO.:108的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:20，SEQIDNO.:27和SEQIDNO.:86的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5，SEQIDNO.:21和SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:6，SEQIDNO.:22，SEQIDNO.:87，SEQIDNO.:99，SEQIDNO.:105，SEQIDNO.:109和SEQIDNO.:97的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:6的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:21的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:25的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:21的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:27的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:18的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:17的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:25的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:19的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:20的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:22的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:75的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:83的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:84的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:86的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:28的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:87的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:96的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:99的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:104的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO:105的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:108的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO:109的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供一种结合死亡受体5(DR5)的抗体，其包含
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:98的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；和
(f)SEQIDNO.:97的轻链CDR3。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含选自下组的氨基酸序列的可变重链和可变轻链：SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:29；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:32；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:82和SEQIDNO.:85；SEQIDNO.:100和SEQIDNO.:101；SEQIDNO.:102和SEQIDNO.:103；SEQIDNO.:106和SEQIDNO.:107；SEQIDNO.:94和SEQIDNO.:95。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:8的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:24的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:24的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:29的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:30的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:31的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:32的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:26的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:30的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:23的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:31的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:82的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:85的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:100的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:101的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:102的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:103的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:106的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:107的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含包含SEQIDNO.:94的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:95的氨基酸序列的可变轻链。
在另一个方面，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含与SEQIDNO.:7的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。
在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5的抗体保留结合DR5的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO.:7中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，结合DR5的抗体包含SEQIDNO.:7中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，结合死亡受体5(DR5)的抗体包含与SEQIDNO.:8的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。
在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5的抗体保留结合DR5的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO.:8中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，结合DR5的抗体包含SEQIDNO:8中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供结合DR5和第二抗原的双特异性抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQIDNO:7和SEQIDNO:8中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，提供结合DR5和第二抗原的双特异性抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL，且其中该抗体具有下文C节关于DR5-FAP双特异性抗体描绘的型式。在另一个实施方案中，提供所述双特异性结合DR5和第二抗原的抗体，其包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL，且其包含一处或多处下文D和E节关于DR5-FAP双特异性抗体描绘的Fc域修饰。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的结合DR5的抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5的抗体为人抗体。
C.例示性的结合DR5和FAP的双特异性抗体的型式
在一个实施方案中，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，xFab，scFab，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体包含全长抗体，例如完整IgG1抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。
依照本发明的双特异性抗体至少是二价的且可以是三价的或多价的，例如四价的或六价的。
本发明的双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在另一个实施方案中，双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段经轻链(VLCL)连接至Fc域的第一或第二亚基且至少一个Fab片段经重链(VHCH1)连接至Fc域的第一或第二亚基。
在任何实施方案中，Fab片段可以直接或经由包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽接头融合至Fc域或彼此融合。肽接头是本领域已知的，而且本文中有描述。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n，(SG4)n，(G4S)n或G4(SG4)n肽接头。“n”一般为1和10之间，通常2和4之间的数值。一种对于将第一和第二抗原结合模块的Fab轻链彼此融合特别合适的肽接头为(G4S)2。一种适合于连接第一和第二抗原结合模块的Fab重链的例示性肽接头为EPKSC(D)-(G4S)2(SEQIDNO.:318)。另外，接头可以包含(部分)免疫球蛋白铰链区。特别地，在抗原结合模块融合至Fc域亚基的N末端的情况中，它可以经免疫球蛋白铰链区或其部分融合，有或无另外的肽接头。
优选地，所述双特异性抗体是四价的，具有各两个靶向FAP和DR5的结合位点(2+2型式)。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，具有三个针对DR5的结合位点和一个针对FAP的结合位点(3+1型式)。3+1型式可以例如经由将一个靶向FAP的Fab片段和一个靶向DR5的Fab片段融合至具有两个DR5结合位点的IgG分子的重链的C末端来实现。这在下文中更加详细的描绘。
在另一个优选实施方案中，所述双特异性抗体是三价的(2+1型式)，具有两个靶向DR5的结合位点和一个靶向FAP的结合位点。2+1型式可以例如经由将靶向FAP的Fab片段融合至具有两个DR5结合位点的IgG分子的重链的C末端来实现，其中第一抗体的Fc部分是依照下文描述的节入穴策略修饰的。
在另一个优选实施方案中，所述双特异性抗体是二价的(1+1型式)，即对DR5和FAP每项是单价的。本发明的二价抗体具有一个靶向DR5的结合位点和一个靶向FAP的结合位点。1+1型式可以例如通过Schaeferetal。ProcNatlAcadSciUSA2011；108:11187-92中描述和下文描绘的Crossmab技术来实现。
图25和28中给出本发明的双特异性抗体的例示性型式。
其中提供的是包含依照任何上述实施方案的任何序列的结合DR5和FAP的不同双特异性抗体型式。
1.2+2型式的双特异性DR5-FAP抗体
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，
其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
既然上述双特异性抗体对FAP和DR5二者是二价的，具有各2个针对FAP和DR5的结合位点，那么这种型式也称作“2+2”型式。图28中描绘具有2+2型式的双特异性抗体的例示性结构。由于可变区或恒定区任一的交换，上述Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在另一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，
其中全部两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区是交换的。
在另一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，
其中全部两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区是交换的。
由于Fab重和轻链的可变区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这些交换Fab片段也称作CrossFab(VLVH)且各自包含VLCH1和VHCL链。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。
在另一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。
由于Fab重和轻链的恒定区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链，和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这些交换Fab片段也称作CrossFab(CLCH1)且包含VHCL和VLCH1链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个Fc域，对其两个Fab片段融合至N末端且两个Fab片段融合至C末端，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
在一个实施方案中，两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头连接至Fc域。在一个实施方案中，两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头连接至Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个此类实施方案中，所述包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头连接至Fc域的第二亚基(CH3链)的C末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(即两个对DR5特异性的Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在另一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，其中两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至恒定重链(CH1)的C末端至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至恒定重链(CH1)的C末端至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至恒定重链(CH1)的C末端至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在又一个优选的实施方案中，两个对FAP特异性的Fab片段通过肽接头融合至IgG分子，优选具有约10-30个氨基酸的长度的肽接头。优选地，所述肽接头为(G4S)2或(G4S)4接头。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至恒定重链(CH1)的C末端至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至恒定重链(CH1)的C末端至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段经轻链(VLCL)连接至Fc域的第一或第二亚基且至少一个Fab片段经重链(VHCH1)连接至Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含一个Fc域，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段经轻链(VLCL)融合至Fc域的第一或第二亚基且至少一个Fab片段经重链(VHCH1)连接至Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含
a)一个Fc域，
b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定轻链(CL)的C末端处连接至Fc域的第一或第二亚基，
c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中两个Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含
a)一个Fc域，
b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定轻链(CL)的C末端处连接至Fc域的第一亚基的N末端，
c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中两个Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至Fc域的第二亚基(CH3)。
在一个实施方案中，所述两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
在一个实施方案中，两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头连接至Fc域。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含
a)一个Fc域，
b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至Fc域的第一或第二亚基，
c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中两个Fab片段在恒定轻链(CL)的N末端处连接至Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含
a)一个Fc域，
b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至Fc域的第一亚基的N末端，
c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中两个Fab片段在恒定轻链(CL)的N末端处连接至Fc域的第二亚基的N末端。
在一个实施方案中，所述两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
例示性的具有2+2型式的抗体
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含
SEQIDNO.:1的重链CDR1；
SEQIDNO.:2的重链CDR2；
SEQIDNO.:3的重链CDR3；
SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
SEQIDNO.:6的轻链CDR3；和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含
SEQIDNO.:9的重链CDR1；
SEQIDNO.:10的重链CDR2；
SEQIDNO.:11的重链CDR3；
SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
SEQIDNO.:14的轻链CDR3；
其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含
SEQIDNO.:1的重链CDR1；
SEQIDNO.:2的重链CDR2；
SEQIDNO.:3的重链CDR3；
SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
SEQIDNO.:6的轻链CDR3；和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含
SEQIDNO.:9的重链CDR1；
SEQIDNO.:10的重链CDR2；
SEQIDNO.:11的重链CDR3；
SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
SEQIDNO.:14的轻链CDR3；
其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQIDNO.:7的可变重链和SEQIDNO.:8的可变轻链；和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区；其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQIDNO.:7的可变重链和SEQIDNO.:8的可变轻链；和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区；其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在另一个实施方案中，本发明的所述双特异性抗体包含IgG分子的Fc部分中的修饰，如下文描绘的。
在一个实施方案中，提供具有上文所述2+2型式的双特异性抗体，其包含两个SEQIDNO.:131的VH(DR5)-Fc部分-VH(FAP)-CL链，两个SEQIDNO.:132的VL(DR5)-卡帕轻链和两个SEQIDNO.:124的VLCH1(FAP)链。
在一个实施方案中，提供具有如上所述2+2型式的双特异性抗体，其包含两个SEQIDNO.:133的VH(DR5)-Fc部分-VH(FAP)-CL链，两个SEQIDNO.:132的VL(DR5)-卡帕轻链和两个SEQIDNO.:124的VLCH1(FAP)链。
在一个实施方案中，提供具有如上所述2+2型式的双特异性抗体，其包含两个SEQIDNO.:134的VH(DR5)-Fc部分VH(FAP)-CL链，两个SEQIDNO.:132的VL(DR5)-卡帕轻链和两个SEQIDNO.:124的VLCH1(FAP)链。
在一个实施方案中，提供具有如上所述2+2型式的双特异性抗体，其包含两个SEQIDNO.:135的VL(DR5)-CH1-Fc部分-VH(FAP)-CH1链，两个SEQIDNO.:136的VH(DR5)-CL链和两个SEQIDNO.:137的VL(FAP)-卡帕轻链。
在一个实施方案中，提供具有如上所述2+2型式的双特异性抗体，其包含两个SEQIDNO.:138的VH(DR5)-CL-Fc-肽接头-VH(FAP)-CH1链，两个SEQIDNO.:139的VL(DR5)-CH1链和两个SEQIDNO.:137的VL(FAP)-卡帕轻链。
2.2+1型式的双特异性DR5-FAP抗体
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，
其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
既然上述双特异性抗体是三价的，具有一个针对FAP的结合位点和两个针对DR5的结合位点，那么这种型式也称作“2+1”型式。因此，这节中提供的双特异性抗体对DR5是二价的且对FAP是单价的。
图25a)和b)中描绘具有2+1型式的双特异性抗体的例示性结构。由于可变区或恒定区任一的交换，上述Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区是交换的。
由于Fab重和轻链的可变区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这些交换Fab片段也称作CrossFab(VLVH)且包含VLCH1和VHCL链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。
由于Fab重和轻链的恒定区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链，和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这些交换Fab片段也称作CrossFab(CLCH1)且包含VHCL和VLCH1链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个Fc域，对其两个Fab片段融合至N末端。
在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
有FAP结合物融合至C末端的2+1型式的双特异性DR5-FAP抗体
在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个实施方案中，一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头融合至Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个此类实施方案中，所述包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头融合至Fc域的第二亚基(CH3链)的C末端。图25a)中描绘有FAP结合物融合至C末端的2+1型式的双特异性DR5-FAP抗体的例示性结构。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，其中Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，b)的所述对FAP特异性的Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个实施方案中，b)的所述Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，b)的所述对FAP特异性的Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个实施方案中，b)的所述Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，b)的所述Fab片段对FAP特异性的融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个实施方案中，所述Fab片段ofb)融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
有FAP结合物融合至N末端的2+1型式的双特异性DR5-FAP抗体
在另一个实施方案中，一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个实施方案中，另一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头融合至IgG分子的包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的N末端。图25b)中描绘有FAP结合物融合至N末端的2+1型式的双特异性DR5-FAP抗体的例示性结构。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)和一个对FAP特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为Crossfab片段(即重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的)。
b)一个对DR5特异性的Fab片段。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为CrossFab(VLVH)片段(即重和轻链的可变区是交换的)。
b)一个对DR5特异性的Fab片段。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为CrossFab(CLCH1)片段(即重和轻链的恒定区是交换的)。
b)一个对DR5特异性的Fab片段。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为Crossfab片段(即重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的)。
b)一个对DR5特异性的Fab片段，其中所述Fab片段融合至IgG分子的可变重或轻链的N末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为CrossFab(VLVH)片段(即重和轻链的可变区是交换的)。
b)一个对DR5特异性的Fab片段，其中所述Fab片段融合至IgG分子的可变重或轻链的N末端。
在一个实施方案中，b)的对DR5特异性的Fab片段融合至a)的对DR5特异性的Fab片段的可变重或轻链的N末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为CrossFab(CLCH1)片段(即重和轻链的恒定区是交换的)。
b)一个对DR5特异性的Fab片段，其中所述Fab片段融合至IgG分子的可变重或轻链的N末端。
在一个实施方案中，b)的对DR5特异性的Fab片段融合至a)的对DR5特异性的Fab片段的可变重或轻链的N末端。
在又一个优选的实施方案中，对DR5特异性的Fab片段通过肽接头融合至IgG分子，优选具有约10–30个氨基酸的长度的肽接头。优选地，所述肽接头为(G4S)2或(G4S)4接头。
在另一个实施方案中所述本发明的双特异性抗体包含IgG分子的Fc部分中的修饰，如下文描绘的。
3.3+1型式的双特异性DR5-FAP抗体
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，
其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
既然上述双特异性抗体是四价的，具有一个针对FAP的结合位点和三个针对DR5的结合位点，那么这种型式也称作“3+1”型式。因此，这节中描述的双特异性分子对DR5是三价的且对FAP是单价的。
图25c)中描绘3+1型式的双特异性抗体的例示性结构。由于可变区或恒定区任一的交换，上述Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区是交换的。
由于Fab重和轻链的可变区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这种交换Fab片段也称作CrossFab(VLVH)且包含VLCH1和VHCL链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。
由于Fab重和轻链的恒定区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链，和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这种交换Fab片段也称作CrossFab(CLCH1)且包含VHCL和VLCH1链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个Fc域，对其两个Fab片段融合至N末端且两个Fab片段融合至C末端，其中一个对FAP特异性的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
c)一个对DR5特异性的Fab片段。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的。
c)一个对DR5特异性的Fab片段。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的。
c)一个对DR5特异性的Fab片段。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
c)一个对DR5特异性的Fab片段，
其中b)和c)的Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基的C末端。
在一个实施方案中，b)和c)的所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的。
c)一个对DR5特异性的Fab片段，
其中b)和c)的Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，b)和c)的所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和
b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的。
c)一个对DR5特异性的Fab片段，
其中b)和c)的Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。
在一个实施方案中，b)和c)的所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。
在又一个优选的实施方案中，这节中描述的任何实施方案的b)和c)的两个Fab片段通过肽接头融合至IgG分子，优选具有约10–30个氨基酸的长度的肽接头。优选地，所述肽接头为(G4S)2或(G4S)4接头。
在另一个实施方案中，所述本发明的双特异性抗体包含IgG分子的Fc部分中的修饰，如下文描绘的。
4.1+1型式的双特异性DR5-FAP抗体
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，
其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
既然上述双特异性抗体是二价的，具有一个针对FAP的结合位点和一个针对DR5的结合位点，那么这种型式也称作“1+1”型式。因此，这节中描述的双特异性抗体对DR5是单价的且对FAP是单价的。图25d)中描绘1+1型式的双特异性抗体的例示性结构。由于可变区或恒定区任一的交换，上述Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。1+1型式的IgG分子也称作Crossmab型式(参见Schaeferetal.,ProcNatlAcadSciUSA2011；108:11187-92)。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和
一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个Fc域，对其两个Fab片段融合至N末端，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子的一个臂(Fab片段)的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子的一个臂(Fab片段)的重和轻链的可变区是交换的。这种抗体型式也称作CrossMab(VHVL)。
在一个实施方案中，IgG分子的包含对FAP特异性的结合位点的一个臂(Fab片段)的重和轻链的可变区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子的一个臂(Fab片段)的重和轻链的恒定区是交换的。这种抗体型式也称作CrossMab(CH1CL)。
在一个实施方案中，IgG分子的包含对FAP特异性的结合位点的一个臂(Fab片段)的重和轻链的恒定区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子的一个臂(Fab片段)的整个VH-CH1和VL-CL域是交换的。这意味着至少一个Fab片段经轻链(VLCL)融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，另一个Fab片段经重链(VHCH1)融合至Fc域的N末端。
这种抗体型式也称作CrossMabFab。在一个实施方案中，全部两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。
D.降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc部分是经过修饰的。经过修饰的Fc部分具有与野生型Fc部分相比降低的对Fcγ受体的结合亲和力。
本发明的双特异性抗体的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。
在依照本发明的一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域是IgGFc域。在一个具体的实施方案中，Fc域是IgG1Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG4Fc域。在一个更加具体的实施方案中，Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代S228P的IgG4Fc域。在一个更加具体的实施方案中，Fc域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G的IgG4Fc域。此氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等,DrugMetabolismandDisposition38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中，Fc域是人的。人IgG1Fc区的一种例示性序列在SEQIDNO:151中给出。
Fc域赋予本发明的双特异性抗体以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而，在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域展现出与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出与天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的本发明的双特异性抗体)相比少于50％、优选少于20％、更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的本发明的双特异性抗体)相比少于50％、优选少于20％、更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIB。在一个实施方案中，效应器功能是CDC，ADCC，ADCP，和细胞因子分泌中的一项或多项。在一个具体的实施方案中，所述效应器功能是ADCC。在一个实施方案中，所述Fc域展现出与天然IgG1Fc域相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出超过约70％、特别是超过约80％、更特别是超过约90％的天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的本发明的双特异性抗体)对FcRn的结合亲和力时，实现基本相似的对FcRn的结合。
在某些实施方案中，Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化Fc域的本发明的双特异性抗体展现出与包含非工程化Fc域的本发明的双特异性抗体相比少于20％、特别是少于10％、更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcgRIIB。在一些实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更特别是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出非工程化形式的Fc域(或包含所述非工程化形式的Fc域的本发明的双特异性抗体)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时，实现基本相似的对FcRn的结合，即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的本发明的双特异性抗体可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，降低的对NK细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的诱导凋亡的直接信号传导，降低的树突细胞成熟，或降低的T细胞引发。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的CDC，降低的ADCC，降低的ADCP，和降低的细胞因子分泌中的一项或多项。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中，所述降低的ADCC小于20％的由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的本发明的双特异性抗体)诱导的ADCC。
在一个实施方案中，所述降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中，Fc域包含在E233，L234，L235，N297，P331和P329位置处的氨基酸替代。在一个更特定的实施方案中，Fc域包含在L234，L235和P329位置处的氨基酸替代。在一些实施方案中，Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1Fc域，特别是人IgG1Fc域。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中，氨基酸替代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代：E233，L234，L235，N297和P331。在一个更加特定的实施方案中，所述又一处氨基酸替代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在具体的实施方案中，所述Fc域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸替代。在更具体的实施方案中，所述Fc域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329GLALA”)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1Fc域，特别是人IgG1Fc域。氨基酸替代组合“P329GLALA”几乎完全消除了人IgG1Fc域的Fcγ受体结合，如记载于PCT专利申请No.PCT/EP2012/055393，其通过提述完整并入本文。PCT/EP2012/055393还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。
IgG4抗体展现出与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域是IgG4Fc域，特别是人IgG4Fc域。在一个实施方案中，所述IgG4Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，所述IgG4Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E。在另一个实施方案中，所述IgG4Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代P329G。在一个具体的实施方案中，所述IgG4Fc域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P、L235E和P329G。此类IgG4Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT专利申请No.PCT/EP2012/055393，其通过提述完整并入本文。
在一个具体的实施方案中，展现出与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1Fc域，或包含氨基酸替代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4Fc域。
在某些实施方案中，已消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中，所述Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸替代。
在上文和PCT专利申请No.PCT/EP2012/055393中描述的Fc域以外，具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处的替代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其具有残基265和297到丙氨酸的替代(美国专利No.7,332,581)。
可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除、替代、插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。
可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GEHealthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行，并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。本文中描述了一种合适的此类结合测定法。或者，可使用已知表达特定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来估测Fc域或包含Fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的本发明的双特异性抗体的效应器功能。本文中描述了用于测量ADCC的一种合适的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等，ProcNatlAcadSciUSA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,ProcNatlAcadSciUSA82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等,JExpMed166,1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等,ProcNatlAcadSciUSA95,652-656(1998)的。
在一些实施方案中，Fc域对补体成分(特别是对C1q)的结合是降低的。因而，在其中Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等,JImmunolMethods202,163(1996)；Cragg等,Blood101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。
下面的部分描述本发明的双特异性抗体的优选实施方案，其包含降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域展现与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域包含一处或多处降低结合Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中所述一处或多处氨基酸替代在L234，L235，和P329中的一个或多个位置，
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的。
在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含
SEQIDNO.:1的重链CDR1；
SEQIDNO.:2的重链CDR2；
SEQIDNO.:3的重链CDR3；
SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
SEQIDNO.:6的轻链CDR3；
其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性和抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含
SEQIDNO.:9的重链CDR1；
SEQIDNO.:10的重链CDR2；
SEQIDNO.:11的重链CDR3；
SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
SEQIDNO.:14的轻链CDR3；
其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含
SEQIDNO.:1的重链CDR1；
SEQIDNO.:2的重链CDR2；
SEQIDNO.:3的重链CDR3；
SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
SEQIDNO.:6的轻链CDR3；
其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含
SEQIDNO.:9的重链CDR1；
SEQIDNO.:10的重链CDR2；
SEQIDNO.:11的重链CDR3；
SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
SEQIDNO.:14的轻链CDR3；
其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含
SEQIDNO.:1的重链CDR1；
SEQIDNO.:2的重链CDR2；
SEQIDNO.:3的重链CDR3；
SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
SEQIDNO.:6的轻链CDR3；
其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含
SEQIDNO.:9的重链CDR1；
SEQIDNO.:10的重链CDR2；
SEQIDNO.:11的重链CDR3；
SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
SEQIDNO.:14的轻链CDR3；
其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQIDNO.:7的可变重链和SEQIDNO.:8的可变轻链；
其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQIDNO.:7的可变重链和SEQIDNO.:8的可变轻链；
其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含
a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含SEQIDNO.:7的可变重链和SEQIDNO.:8的可变轻链；其中Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和
b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。
E.促进异二聚化的Fc域修饰
本发明的双特异性DR5-FAP抗体包含不同的抗原结合模块，其融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个，如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中本发明的双特异性抗体的产率和纯度，如此在本发明的双特异性抗体的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。
因而，在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgGFc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc域的CH3域中。
在一个特定的实施方案中，所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。
节-入-穴技术记载于例如US5,731,168；US7,695,936；Ridgway等,ProtEng9,617-621(1996)和Carter,JImmunolMeth248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而，在一个具体的实施方案中，在本发明的双特异性抗体的Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，而且在Fc域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。
在一个特定的实施方案中，在Fc域第一亚基的CH3域中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)，而在Fc域第二亚基的CH3域中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)。
在还有又一个实施方案中，在Fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)，而在Fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥，进一步稳定了二聚体(Carter,JImmunolMethods248,7-15(2001))。
在一个备选的实施方案中，促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostaticsteeringeffect)的修饰，例如如记载于PCT公开文本WO2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个免疫球蛋白G(IgG)分子，其具有两个对DR5特异性的结合位点，其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的Fc部分包含第二二聚化模块，容许IgG分子的两条重链异二聚化。
在又一个优选的实施方案中，依照节入穴策略(参见CarterP.；RidgwayJ.B.B.；PrestaL.G.:Immunotechnology,Volume2,Number1,February1996,pp.73-73(1))，第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包含穴。
F.核酸序列，载体和方法
本发明进一步提供编码本文所述双特异性抗体或结合DR5的抗体或其片段的分离的多核苷酸。编码本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体的多核苷酸可以作为编码完整双特异性抗原结合分子或完整结合DR5的抗体的单条多核苷酸或作为多条(例如两条或更多条)共表达的多核苷酸来表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性双特异性抗体或结合DR5的抗体。例如，Fab片段的轻链部分可以与双特异性抗体或结合DR5的抗体中包含Fab片段的重链部分，Fc域亚基和任选(部分)另一个Fab片段的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽会与轻链多肽联合以形成Fab片段。又例如，本文中提供的双特异性抗体或结合DR5的抗体中包含两个Fc域亚基中的一个和任选(部分)一个或多个Fab片段的部分可以与本文中提供的双特异性抗体或结合DR5的抗体中包含两个Fc域亚基中的另一个和任选(部分)Fab片段的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc域亚基会领会以形成Fc域。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQIDNO167，175，183，191，199，207和209中所示的可变重链序列的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQIDNO171，179，187，195，203，208和210中所示的可变轻链序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQIDNO222，224，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，258，259，260，261，264和265中所示的多肽序列的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的结合DR5的抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQIDNO167，175，183，191和199中所示的可变重链序列的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的结合DR5的抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQIDNO171，179，187，195和203中所示的可变轻链序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO167，175，183，191，199，207或209中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变重链序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO171，179，187，195，203，208或210中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变轻链序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的结合DR5的抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO167，175，183，191或199中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变重链序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的结合DR5的抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO171，179，187，195或203中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变轻链序列的序列。
在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸为DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸为RNA，例如信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链的或双链的。
在又一些目标中，本发明涉及包含本发明的核酸序列的表达载体，和包含本发明的载体的原核或真核宿主细胞。另外，提供生成抗体的方法，其包括培养宿主细胞，使得抗体生成。
G.抗体变体
在某些实施方案中，在上文描述的那些以外，还涵盖本文中提供的双特异性抗体或结合DR5的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善双特异性抗体或结合DR5的抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码双特异性抗体或结合DR5的抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备双特异性抗体或结合DR5的抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。
1.替代、插入、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表B中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表B中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改进的ADCC或CDC。
表B
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将一个残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基诸如Arg、Asp、His、Lys、和Glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
2.糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的双特异性抗体或结合DR5的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在双特异性抗体或结合DR5的抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了双特异性抗体变体或结合DR5的抗体的变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请NoUS2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的双特异性抗体变体或结合DR5的抗体的变体，例如其中附着于双特异性抗体或结合DR5的抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类双特异性抗体变体或结合DR5的抗体的变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
3.经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的双特异性抗体或结合DR5的抗体，例如，“thioMAb”，其中双特异性抗体或结合DR5的抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于双特异性抗体或结合DR5的抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
H.重组方法和组合物
可以例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相肽合成)或重组生成来获得本发明的双特异性抗体和结合DR5的抗体。对于重组生成，分离一种或多种编码所述双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序这类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中(在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中)克隆编码双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如在单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且若两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，连同内含子-A)、猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔-球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，诸如复制起点和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌双特异性抗体或结合DR5的抗体，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明双特异性抗体或本发明结合DR5的抗体或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长中的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记双特异性抗体或结合DR5的抗体的短蛋白质序列的DNA纳入双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)编码多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个这类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明双特异性抗体或结合DR5的抗体(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何种类能工程化改造以生成本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体或其片段的细胞系统。适用于复制双特异性抗体或结合DR5的抗体及支持其表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的双特异性抗体或结合DR5的抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，特别是在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中与细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合多肽编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)，和Li等,NatBiotech24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham等,JGenVirol36,59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,BiolReprod23,243-251(1980)的)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)，牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(HepG2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather等,AnnalsN.Y.AcadSci383,44-68(1982)的)、MRC5细胞和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域诸如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。
在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体的方法，其中所述方法包括在适合于双特异性抗体或结合DR5的抗体表达的条件下培养包含编码双特异性抗体或结合DR5的抗体的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收双特异性抗体或结合DR5的抗体。
双特异性抗体或结合DR5的抗体的组分彼此遗传融合。双特异性抗体或结合DR5的抗体可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法确定接头的组成和长度，并可以测试功效。双特异性抗体不同组分之间的接头序列的例子见于本文中提供的序列。还可包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合物的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，双特异性抗体或结合DR5的抗体的Fab片段形成部分至少包含能够结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区能形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分及自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies,alaboratorymanual”,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
可以将任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区用于本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区可以是鼠、灵长类或人起源的。如果双特异性抗体或结合DR5的抗体意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,FrontBiosci13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann等,Nature332,323-329(1988)；Queen等,ProcNatlAcadSciUSA86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Jones等,Nature321,522-525(1986)；Morrison等,ProcNatlAcadSci81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,AdvImmunol44,65-92(1988)；Verhoeyen等,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun31(3),169-217(1994)；Kashmiri等,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,MolImmunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等,Methods36,61-68(2005)以及Klimka等,BrJCancer83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于vanDijk和vandeWinkel,CurrOpinPharmacol5,368-74(2001)以及Lonberg,CurrOpinImmunol20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分及自其衍生(参见例如MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,NatBiotech23,1117-1125(2005))。还可以通过分离自人衍生的噬菌体展示库选择的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等，于MethodsinMolecularBiology178,1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等,Nature348,552-554；Clackson等,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。
在某些实施方案中，将可用于本发明的Fab片段工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORET100系统上分析)(Liljeblad等,GlycoJ17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体、抗体片段、抗原结合域或可变域。在某些实施方案中，这类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols,”于MethodsinMolecularBiologyvol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一经标记抗体和测试其与第一经抗体竞争对抗原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManualch.14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的双特异性抗体或结合DR5的抗体，所述技术诸如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，可以使用双特异性抗体或结合DR5的抗体结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的双特异性抗体的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以连续使用蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离双特异性抗体，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定双特异性抗体或结合DR5的抗体的纯度，包括凝胶电泳、高压液相层析等。
1.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的结合DR5和FAP的双特异性抗体和结合DR5的抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.亲和力测定法
可以依照实施例中提出的方法使用标准的仪器如BIAcore仪(GEHealthcare)通过表面等离振子共振(SPR)测定本文中提供的双特异性抗体和结合DR5的抗体对DR5和/或FAP的亲和力，而且可以诸如通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估本文中提供的双特异性抗体和结合DR5的抗体对DR5和/或FAP的结合。一个用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案记载于下文和下文实施例。
依照一个实施方案，通过表面等离振子共振使用T100仪(GEHealthcare)于25℃测量KD。
为了分析Fc部分与Fc受体之间的相互作用，通过固定化于CM5芯片上的抗五His抗体(Qiagen)来捕捉带His标签的重组Fc受体并将双特异性构建体用作分析物。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GEHealthcare)依照供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗五His抗体用10mM醋酸钠pH5.0稀释至40μg/ml，接着以5μl/分钟的流速注射以实现约6500响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。然后，在4或10nM捕捉Fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释液(范围为约500nM至4000nM)在HBS-EP(GEHealthcare,10mMHEPES,150mMNaCl,3mMEDTA,0.05％表面活性剂P20,pH7.4)中于25℃以30μl/分钟的流速注射120秒。
为了测定对靶抗原的亲和力，通过固定化于活化CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GEHealthcare)来捕捉双特异性构建体，如对于抗五-His抗体所描述的。偶联蛋白质的最终量为约12000RU。双特异性构建体在300nM捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。
通过扣除在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。使用稳定态响应通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来导出解离常数KD。使用简单的1对1Langmuir结合模型(BIACORET100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k结合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(KD)计算为比率k解离/k结合。参见例如Chen等,JMolBiol293,865-881(1999)。
2.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹、等来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定分别与特定抗FAP抗体或特定抗DR5抗体竞争对FAP或DR5的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与特定抗FAP抗体或特定抗DR5抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols”,MethodsinMolecularBiologyvol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)。实施例部分描述了别的方法。
3.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的结合DR5和FAP的双特异性抗体或结合DR5的抗体的测定法。生物学活性可包括例如DNA片段化、诱导凋亡和靶细胞裂解。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体测试此类生物学活性。用于检测细胞裂解(例如通过测量LDH释放)或凋亡(例如使用TUNEL测定法)的测定法是本领域公知的。用于测量ADCC或CDC的测定法还记载于WO2004/065540(参见其中的实施例1)，通过述及将其完整内容收入本文。
J.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类双特异性抗体或抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的结合DR5和FAP的双特异性抗体或结合DR5的抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20BaxterInternational,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
K.治疗性方法和组合物
可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何结合DR5和FAP的双特异性抗体和结合DR5的新颖抗体。
在一个方面，提供了作为药物使用的结合DR5和FAP的双特异性抗体。在又一些方面，提供了在治疗癌症中使用的结合DR5和FAP的双特异性抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的结合DR5和FAP的双特异性抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有癌症的个体的方法中使用的结合DR5和FAP的双特异性抗体，所述治疗包括对个体施用有效量的结合DR5和FAP的双特异性抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。在一个优选实施方案中，所述癌症是胰腺癌或结肠直肠癌。
在一个方面，提供了作为药物使用的结合DR5的抗体。在又一些方面，提供了在治疗癌症中使用的结合DR5的抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的结合DR5的抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有癌症的个体的方法中使用的结合DR5的抗体，所述治疗包括对个体施用有效量的结合DR5的抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。在一个优选实施方案中，所述癌症是胰腺癌或结肠直肠癌。
在又一方面，本发明提供了结合DR5和FAP的双特异性抗体在制造或制备药物中的用途。在另一方面，本发明提供了结合DR5的抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，药物用于治疗癌症的方法，包括对具有癌症的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有癌症的个体施用有效量的结合DR5和FAP的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。在一个优选实施方案中，所述癌症是胰腺癌或结肠直肠癌。
在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何结合DR5和FAP的双特异性抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合DR5和FAP的双特异性抗体和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合DR5和FAP的双特异性抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何结合DR5的抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合DR5的抗体和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合DR5的抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体会以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病症的起因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体无需但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、病症或治疗的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以本文所述相同的剂量和给药途径使用，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验/临床确定为合适的。
为了预防或治疗疾病，本发明的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体的合适剂量会取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次分开的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗通常会持续直至出现病症得到期望的抑制为止。双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体以一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一剂或多剂。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周(例如使得患者得到约2-约20剂，或例如约6剂双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体)。可给予初始较高的加载剂量，接着给予较低的一或多剂。然而，可使用其它剂量方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
应当理解，可以替换本发明的结合DR5和FAP的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体或在本发明的结合DR5和FAP的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。
L.制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充本发明的结合DR5和FAP的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体。
III.实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。
实施例1：DR5-FAP死亡受体激动性双特异性抗体能够经第二种细胞系的交联介导一种细胞系的凋亡。
一种通过死亡受体(如DR5)的交联(除经由肿瘤细胞表达的抗原的交联之外)来诱导凋亡的办法靶向肿瘤周围的基质。在该情况中，靶定抗原不由肿瘤细胞直接展示，而是由第二种不同细胞类型展示。这类抗原的一个例子会是FAP(成纤维细胞活化蛋白)。这种蛋白质在活化的成纤维细胞上表达，正如在肿瘤基质中发现它们那样。
为了调查使用靶向人DR5和来自肿瘤基质的抗原的双特异性死亡受体激动性抗体实现肿瘤靶向凋亡诱导的可能性，生成了由识别DR5的IgG1部分和融合至抗体重链C末端的FAP结合性scFv组成的双特异性分子。DR5靶向性IgG的序列取自US2007/0031414A1中记载的Drozitumab序列。FAP结合性scFv模块的可变重和轻链的序列取自WO2012/020006A1中记载的通过噬菌体展示分离的Fab抗FAP分子(3F2或4G8)。FAPscFv通过(G4S)2连接头融合至抗DR5IgG重链或轻链的C末端。全部两个抗FAP抗体结合成纤维细胞活化蛋白(FAP)上的不同表位且与人，鼠和猕猴抗原有交叉反应性。
表1：测试的具有FAP结合性scFv对DR5重或轻链的C末端融合的双特异性DR5-FAP分子的描述。给出了接头和连接头长度和纯化产量。
在这类设置中，体外活性测定法不得不使用两种不同细胞系：一种细胞系(靶细胞系)应表达人DR5，不得不是有凋亡能力的但不需要表达FAP。第二种细胞系(效应细胞系)不得不是凋亡阴性的(或是通过凋亡抗性或是通过不表达DR5)但需要在表面上表达FAP。
一种满足期望标准的可能的效应细胞系是人成纤维细胞细胞系GM05389。与细胞系SW872(只在测试的最高抗体浓度(10μg/ml)显示FAP表达但不经历非交联的Drozitumab所致凋亡，如在图1b中看到的)相比，如图1a中所示，这种细胞系表达显著水平的FAP。因此，这种细胞系看来是凋亡测定法中的潜在效应细胞系，其中通过经第二种细胞系上表达的抗原的交联诱导靶细胞系的DNA片段化。
作为靶细胞系，使用人肾腺癌细胞系ACHN或人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。它们表达相当的低水平的DR5(图2)且对DR5介导的凋亡诱导敏感。在图3中，汇总了ACHN细胞的DNA片段化诱导的结果，与通过经FAP的肿瘤靶向DR5交联实现的ACHN和GM05389细胞系的组合比较。对照抗体(Drozitumab)在全部两种细胞系中在经靶向Fc部分的二抗交联后诱导凋亡(白色条)，但是在没有交联的情况中也显示一些活性。双特异性DR5-FAP分子在靶和效应细胞系二者存在下显示显著的凋亡诱导(黑色条)。在FAP表达性成纤维细胞(GM05389)缺失下，与非交联的Drozitumab(灰色条)相比，凋亡有轻微升高。我们将这种结果解读为ACHN细胞上的DR5受体在结合由成纤维细胞细胞系GM05389表达的FAP抗原后交联。所有分子显示相当的最大凋亡活性。
实施例2：具有融合至Drozitumab的scFab型式的交叉反应性FAP结合物的DR5双特异性激动性抗体在共培养测定法中展现凋亡活性
如实施例1中证明的，其中scFv型式的FAP靶向性模块融合至Drozitumab重或轻链的C末端的DR5-FAP双特异性激动性抗体(2x2型式)在两细胞系共培养设置中(其中一种细胞系表达FAP(效应细胞)而第二种细胞系充当DR5受体靶物)能够诱导凋亡。
既然这些含有scFv融合的分子显示一些不利特性(低生产产量和形成聚集体的趋势)，生成了如下的构建体，其中FAP结合性单元用单链Fab实体(scFab)替换，融合至Drozitumab的重或轻链任一的C末端，导致生成四种不同分子，如表2中描述的。scFab单元连接至双特异性分子的IgG部分经(G4S)4序列发生，而scFab内部接头由32个氨基酸组成。
通过标准重组技术瞬时生成这些分子，并以足够量和好质量纯化，用于详细测试FAP和DR5结合(FACS；Biacore，未显示)。
表2：不同Drozitumab-FAP(scFab)融合物的描述和表征。在所有分子中，抗FAPscFab通过20聚物连接头((G4S)4)融合至Drozitumab。
图4a和4b中显示在第二种FAP表达性‘效应’细胞系(例如成纤维细胞系GM05389)存在和缺失下DR5表达性靶细胞系(例如肾癌细胞系ACHN)的凋亡诱导的分析。以DNA片段化测定法分析凋亡诱导。在该测定法中，使用1:1的靶对效应细胞比，并分析在Drozitumab，超交联的Drozitumab或双特异性构建体存在下(均以1μg/ml和0.1μg/ml的浓度使用)共培养24小时后的DNA片段化。
对于所有测试的构建体，能证明，不依赖于使用的作为scFab融合至Drozitumab的FAP结合物(3F2或4G8)，双特异性分子只在成纤维细胞效应细胞系存在下显示ACHN靶细胞中升高的凋亡诱导。然而，在高浓度的双特异性分子，在FAP表达性成纤维细胞缺失下能观察到低程度的凋亡活性。一般而言且不依赖于使用的FAP结合物，有scFab融合至重链的C末端的分子比scFab融合至轻链的C末端的分子更有活性。另外，含有4G8的构建体看来比含有3F2的分子更有力。然而，基于scFab的型式的活性与类似的基于scFv的构建体相比要低。
没有通过抗Fc抗体的另外交联的Drozitumab显示低凋亡诱导。然而，单独经抗Fc二抗超交联(一种高度人工的情形)的Drozitumab揭示最高凋亡活性，是任何测试的分子无法达到的。
实施例3：CrossFab型式的DR5-FAP双特异性激动性抗体展现胜过含有scFab的分子的卓越特征
既然评估的含有scFab的双特异性分子仍然显示一些不利特征(例如低表达产量，可优化的凋亡活性)，那么分析一种新颖的应克服这些缺点的型式：CrossFab型式的FAP结合物(4G8)融合至Drozitumab重链的C末端。在这种型式中，以Fab片段中的可变区‘交换’调换使用FAP结合模块，如表3中描述和图5中显示的。CrossFab分子经20聚物连接头((G4S)4)连接至Drozitumab重链。
表3：两种不同型式的双特异性Drozitumab–FAPCrossFab构建体的描述和生成产量。
在HEK293EBNA细胞(贴壁或悬浮细胞)中瞬时生成全部两种CrossFab分子(构建体的组合也可见图5)，并用标准方法纯化。与含有scFab和scFv的双特异性构建体相比，CrossFab分子展现显著升高的表达水平，导致要高大约10倍的产物产量及可接受的低聚集体含量，如表4中所示。
图6显示不同双特异性DR5-FAP分子生成期间的聚集体含量。对融合至Drozitumab重链的C末端的scFv(A)，scFab(B)和CrossFab(C)显示了来自纯化期间的制备性大小排阻层析的层析图。scFv和scFab融合构建体显示与含有CrossFab的分子相比显著要高的聚集体含量。在纯化期间去除这些聚集体导致物质大量损失，这可以从纯化后获得的产量容易地看到。
通过FACS分析来检测分子对重组HEK293细胞上表达的人FAP的结合。图7显示两种Drozitumab-CrossFab分子(Drozitumab–X–FAP_A，点条和Drozitumab–X–FAP_B，白色条)的FACS结合结果，与类似的scFab构建体(阴影线条)或相应的FAP(4G8)IgG分子(黑色条)比较。4G8FAP结合模块融合至Drozitumab重链的C末端的三种双特异性分子均与IgG构建体相似地或在相似范围中结合重组HEK细胞的膜上表达的人FAP，指示这种融合位置对测试的FAP结合物没有N末端阻断效应。这种测定法中使用的阴性对照分子(检测二抗和Drozitumab)不以可检测方式结合FAP表达性HEK细胞。
表4：所有测试的不同双特异性DR5-FAP分子的产量和品质的比较
在图8中显示了表面等离振子共振分析(SPR，Biacore)的结果，其中评估双特异性CrossFab分子对DR5和FAP的同时结合。对于这种测定法，将抗原(人DR5，作为Fc融合物，SEQIDNO.:316)偶联至Biacore芯片，接着注射CrossFab分子作为第一分析物。在scFab分子结合DR5后，使用重组可溶性人或鼠FAP(SEQIDNO.:156和157)作为第二分析物。对于所有测试的双特异性分子，证明了对DR5和人和鼠FAP的同时结合的浓度依赖性，如注射第二分析物后获得的，注射第一分析物后的总体响应率的升高指示的。全部两种四价双特异性CrossFab分子(2x2；Drozitumab-X-FAP_A和Drozitumab-X-FAP_B)显示相似的对DR5和人和鼠FAP的结合(图8；A-D)。
图9显示在FAP表达性成纤维细胞细胞GM05389缺失或存在下Drozitumab较之两种不同双特异性Drozitumab–X–FAP分子和一种Drozitumab_4G8_scFab构建体24小时后对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的凋亡诱导，如通过DNA片段化测定法测定的。在应用的条件下，超交联的Drozitumab和双特异性DR5-FAP分子展现浓度依赖性凋亡诱导。虽然双特异性构建体在低浓度看来依赖于所谓的旁观者凋亡(只在DR5和FAP表达性细胞系存在时的凋亡活性)，但是它们还在高浓度单独诱导MDA-MB-231细胞凋亡。只在MDA-MB-231细胞存在时，超交联的Drozitumab也在低浓度诱导高水平的凋亡。全部两种双特异性分子在0.7nM的浓度就展现最大凋亡诱导。
为了对双特异性构建体测试它们依赖于经FAP的交联的凋亡诱导活性的特异性，选择一种不同测定法设置(图10)。在这种设置中，将重组人FAP或一种无关对照蛋白质(白色条)包被到ELISA板上。将这些蛋白质与双特异性分子或有关对照一起温育，之后添加靶细胞(MDA-MB-231)并温育24小时。对超交联的Drozitumab(灰色条)，一种双特异性scFab分子(阴影线条)和双特异性CrossFab分子(黑色条)能证明浓度依赖性DNA片段化(指示凋亡诱导)，如图10中所示。虽然交联的Drozitumab的凋亡诱导对于包被的FAP或对照蛋白质在相同的范围中(在整个测试浓度范围上)，但是CrossFab分子的凋亡活性在将FAP包被到板上时与对照蛋白质相比要高。在0.7nM及以下的浓度，只在包被的FAP存在下能检测到显著的凋亡，指示DR5在靶MDA-MB-231细胞上的特异性交联。含有作为CrossFab融合至Drozitumab重链的C末端的FAP模块的双特异性Drozitumab-FAP构建体在测试的浓度对共培养凋亡测定法(DNA片段化测定法)中分析的不同肿瘤细胞系在24小时里展现胜过单独的Drozitumab的卓越的凋亡诱导，如图11中所示。在这种测定法中，在Drozitumab，用抗Fc抗体交联的Drozitumab，或Drozitumab-X-FAP构建体(均以7nM和0.7nM的浓度)存在下将FAP表达性成纤维细胞(GM05389)与一系列不同肿瘤细胞系(MDA-MB-231，乳腺癌症，黑色条；U-87MG，成胶质细胞瘤，灰色条；FaDu，头和颈，白色条和A549，肺癌症，阴影线条)共培养。将浓度为7nM的交联的Drozitumab的凋亡诱导设定为100％，并相应计算其它测试分子的活性。虽然单独的Drozitumab在7nM的浓度显示多至50％的活性(依赖于测试的肿瘤细胞系)，但是CrossFab分子对所有测试的细胞系展现在超交联的Drozitumab的75-90％范围中的凋亡诱导。单独的Drozitumab在0.7nM展现低活性，而双特异性分子展示显著的凋亡诱导活性(对FaDu细胞多至100％，对其它测试的细胞系介于60和90％之间)。
实施例4：抗原制备和用于生成新颖DR5结合物的筛选工具
由于双特异性型式的Drozitumab的一些亚最佳特性(低生产力，没有交联的情况下有活性，N末端融合灭活抗体)，分离了新的克服这些缺点的DR5抗体。为了生成合适抗原用于分离新颖的DR5结合物及筛选和选择它们，构建了一系列融合蛋白。通过PCR自每种受体基因扩增胞外域(ECD)编码区，并融合至一种通用蛋白质配偶以生成下述型式(如图12中所示)：
1.将胞外域(ECD)同框地融合至Avi标签和6xhis标签
2.将ECD融合至由铰链区和CH2和CH3域组成的人IgG1Fc，接着是Avi标签。在ECD和Fc之间插入AcTev蛋白酶切割位点(--(产生二聚体抗原)
3.同2，但是将ECD融合至具有节入穴突变的Fc。将抗原-Fc融合物与Fc-穴配对物共表达以获得单体抗原
虽然人DR5和鼠DR5的序列是已知的且在SwissProt数据库中有注解，但是那里没有记载猕猴同系物的序列。基于人和猕猴DR5基因序列间的同源性，设计了引物，用于自制备自猕猴PBMC的RNA分离猕猴抗原。简言之，使用来自Qiagen的RNeasy试剂盒自新鲜分离的猕猴血液分离RNA。DNAseI消化和RNA洗脱后，使用来自Qiagen(产品目录号210212)的一步RT-PCR试剂盒(cDNA合成和扩增)来扩增猕猴DR5基因，用依照已知的猕猴DR5序列设计的GAB-4039(GCTGGCTCCTGGACTTCCATTTCC，SEQIDNO163)和GAB4040(GACCCAGGGAGGCGCGGGGAG；SEQIDNO164)作为引物。将PCR产物克隆入pCR2.1Topo(Invitrogen)中进行测序。序列分析揭示与人DR5胞外域的89％同源性。使用引物GAB-4145(GTGCATTCCATCACCCGACAATCCCTAGATCCCCAGCG；SEQIDNO165)和GAB-4146(GCGTCGACTGATTCTTTGTGGACACACTCAATGTCAC；SEQIDNO166)将猕猴DR5基因的胞外域克隆入一种通用表达载体中，与人Fc融合。
期望基因的表达在MPSV启动子控制下发生。另外，包括3’多腺苷酸化位点和oriP序列(用于质粒在EBV核抗原(EBNA)表达性HEK293细胞中的稳定维持)。
为了生成抗原，将有关表达载体转染入HEK293EBNA细胞中(Ca2PO4介导的或PEI依赖性的转染)。培养5-7天后，收获上清液，并经蛋白A结合(含有Fc的抗原)或通过NI2+亲和层析(含有His标签的分子)和随后大小排阻层析(SEC)来纯化。在必要时，经C末端Avi标签生物素化蛋白质。这可以在体内通过birA编码质粒的共转染/共表达或在体外在纯化抗原后使用来自Avidity的生物素化试剂盒(产品目录号BIRA)来实施。通过HEK293EBNA中的瞬时基因表达来生成下述抗原：
表5：抗原构建体和用于分离针对人DR5的抗体的筛选工具
# 抗原 氨基酸 型式 来源 登录号
1 人DR5 56-207 ECD-Avi-his Open Biosystems BC001281.1 O14763
2 人DR5 56-207 ECD-AcTev-hu Fc-Avi 如上文 O14763
3 人DR5 56-207 ECD-AcTev-hu Fc节-Avi 如上文 O14763
4 鼠DR5 53-153 ECD-AcTev-hu Fc-Avi Open Biosystems BC065141.1 Q9QZM4
5 猕猴DR5 58-185 ECD-AcTev-hu Fc-Avi 本文和WO 2004/101608 A2 SEQ ID NO.:317
n.a.：不适用
重组人DR4-Fc(产品目录号347-DR/CF)，DcR1-Fc(产品目录号630-TR/CF)，DcR2-Fc(产品目录号633-TR/CF)和OPG-Fc(产品目录号805-＝S/CF)购自R&DBiosystems。
实施例5：自通用Fab文库分离新颖的抗DR5结合物
自一个Fab型式的通用噬菌体展示抗体文库(DP47-3)选择对人DR5具有特异性的抗体。这个文库是基于人种系基因构建的，使用在轻链CDR3(L3)和重链CDR3(H3)中包含随机化序列空间的Vk3_20(卡帕轻链)和VH3_23(重链)配对的V域。通过交叠延伸剪接(SOE)PCR装配3种PCR扩增片段来实施文库生成。片段1包含抗体基因的5’端，包括随机化L3，片段2为中央恒定片段，跨越自L3至H3，而片段3包含随机化H3和抗体基因的3’部分。分别使用下述引物组合来生成用于DP47-3文库的这些文库片段：片段1(LMB3-LibL1b_new)，片段2(MS63-MS64)和片段3(Lib2H-fdseqlong)。用于生成文库片段的PCR参数为94℃初始退火5分钟，25个循环的94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟和72℃终末延伸10分钟。对于装配PCR，使用等摩尔比的3种片段作为模板，参数为94℃初始变性3分钟和5个循环的94℃30秒钟，58℃1分钟，72℃2分钟。在这个阶段，添加外部引物，并实施另外20个循环，之后是72℃终末延伸10分钟。在装配足够量的全长随机化Fab构建体后，将它们用NcoI/NotI消化，与类似处理的受体噬菌粒载体并行。将22.8μgFab文库与16.2μg噬菌粒载体连接。将经过纯化的连接物用于68次转化以获得4.2x1010的最终文库大小。挽救展示Fab文库的噬菌粒颗粒，并通过PEG/NaCl纯化来纯化以用于选择。
针对融合至人IgG1抗体Fc部分的HEK293表达的单体或二聚体人DR5进行选择。为了生成单体抗原，应用Fc节入穴型式以实现两条不同CH2-CH3链(其中只有一条作为N末端融合携带人DR5外域)的异二聚化。经avi标签酶促生物素化抗原。依照下述样式在溶液中实施多轮淘选：1.使用以10μg/ml包被到NUNCmaxisorp板上的huIgG1预清洁约1012个噬菌粒颗粒以避免Fc结合物，2.在1ml的总体积中使来自预清洁反应上清液的非Fc结合噬菌粒颗粒与100nM生物素化人DR5结合0.5小时，3.通过在中性亲合素包被的微量滴定板上温育10分钟来捕捉生物素化的huDR5和附着的特异性结合噬菌体，4.使用5x1mlPBS/Tween20和5x1mlPBS清洗珠，5.通过添加1ml100mMTEA(三乙胺)10分钟来洗脱噬菌体颗粒，并通过添加500μl1MTris/HClpH7.4来中和，6.洗脱的噬菌体颗粒在人DcR2上的后清洁步骤以避免交叉反应性结合物，并7.将对数期大肠杆菌TG1细胞再感染上清液中的噬菌体颗粒，感染辅助噬菌体VCSM13并随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，以用于后续多轮选择。使用100nM的恒定抗原浓度在3轮上进行选择。在第2轮中，通过添加5.4x107个链霉亲合素包被的磁珠10分钟来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉，代替中性亲合素包被的微量滴定板上的捕捉。如下通过ELISA鉴定特异性结合物：在中性亲合素板上每孔包被100μl50nM生物素化人DR5或DcR2。此外，在NUNCmaxisorp板上包被10μg/ml人IgG1。添加含有Fab的细菌上清液，并通过使用抗Flag/HRP二抗经它们的Flag标签检测结合性Fab。对人DR5展现信号但对人DcR2和人IgG1不展现信号的克隆通过初审用于进一步分析。
使用ProteOnXPR36仪器(Biorad)通过表面等离振子共振测量选定的Fab克隆的亲和力(KD)，于25℃，用在NLC芯片上固定化的生物素化单价或二价DR5抗原，通过中性亲合素捕捉。抗原(配体)的固定化：将重组抗原用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠pH7.4，0.005％Tween20)稀释至10μg/ml，然后以30μl/min注射不同接触时间，以实现垂直取向200，400或800个响应单位(RU)的固定化水平。分析物的注射：对于单发动力学测量，注射方向改成水平取向，沿分开的通道1-5以50，60或100μl/min同时注射经过纯化的Fab的两倍稀释系列(介于100和3.125nM之间的不同浓度范围)，结合时间120，180或200s，解离时间200或240s。沿第六通道注射缓冲液(PBST)以提供“在线”空白作参照。通过同时拟合结合和解离传感图在ProteOnManagerv3.1软件中使用简单一对一Langmuir结合模型计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。以比koff/kon计算平衡解离常数(KD)。以100μl/min的流速使用50mMNaOH在水平取向实施再生，接触时间18秒。
实施例6：选定的DR5结合物能够在交联后诱导凋亡
为了鉴定能够只在交联后诱导选定靶细胞凋亡的DR5结合物，将自Fab文库分离的抗体转变成相应的huIgG1型式。简言之，使用Fab克隆作为模板，通过标准PCR反应扩增来自噬菌体展示的46种独特DR5结合物的可变重和可变轻链。纯化PCR产物并插入(通过基于限制性内切核酸酶和连接酶的克隆，或通过使用来自Invitrogen的InFusion试剂盒进行的‘重组工程’)合适的表达载体中，其中它们融合至适宜的人恒定重或人恒定轻链。这些载体中的表达盒由嵌合MPSV启动子和合成多腺苷酸化位点组成。另外，质粒含有来自EpsteinBarr病毒的oriP区，以实现质粒在包含EBV核抗原(EBNA)的HEK293细胞中的稳定维持。如描述的，在HEK293EBNA细胞中以50ml规模瞬时生成抗体。对于快速和高通量纯化，中和上清液并与蛋白ASepharose快流珠(GEHealthcare产品目录号17-5138-01)一起温育16小时。然后通过重力流使上清液/珠混合物通过空的经过平衡的PD-10柱(GEHealthcare产品目录号17-0435-01)。将保留的珠清洗两次，并用低pH步骤洗脱抗体。最后，中和洗脱的蛋白质并使用280nm吸光度和摩尔消光系数计算它的浓度。使用ZorbaxGF-250柱(Agilent产品目录号PSMO845006)通过分析性大小排阻层析分析抗体样品的聚集体含量。
表6中汇总了这种纯化规程的结果。
表6：纯化结果的汇总，SEQIDNO见表8
抗DR5单抗 滴度[mg/ml] 产量[mg/ml] 单体含量[％]
3E6 47.3 32.9 100
4C3 43.6 21.2 100
5E11 38.2 29.9 100
5F6 40.4 38.0 100
6A8 41.9 28.1 100
6F8 64.4 45.1 99
7B12 75.1 44.6 100
7H9 54.7 38.5 99
18F11 77.6 54.4 100
18F12 66.6 33.4 99
18H6 54.6 48.5 100
19F10 61.1 36.7 100
20F2 65.9 41.0 99
21C3 51.4 40.6 97
212 53.6 27.1 99
23C7 49.8 27.2 100
24B7 38.5 28.9 100
1B12 179.3 78.1 100
2C5 116.2 48.7 98
2E5 144.3 67.7 100
2F11 146.2 67.3 100
4A6 148.0 83.2 100
4F5 110.5 48.7 100
4G9 128.1 80.9 100
6F6 161.3 86.3 100
6H4 128.1 65.8 100
8D2 136.6 65.8 100
17A7 136.1 62.7 100
17H5 155.7 77.1 100
18A4 138.9 67.1 100
18A6 103.9 54.7 100
18A12 118.1 63.3 100
18E6 90.8 44.3 100
18F6 99.3 36.0 100
19C12 192.6 70.6 92
19D6 144.9 81.7 97
19G7 117.0 63.1 100
20E3 116.4 51.7 100
20F1 75.5 40.7 100
21H3 127.1 45.1 98
22E6 130.9 61.2 98
22E9 137.5 60.2 100
23G10 127.9 43.5 100
6F9 96.8 48.2 100
6G7 114.7 59.3 100
17A8 102.1 60.0 100
这种小规模转染和生成，继以经蛋白A珠的纯化产生合理量的纯抗体及很低的聚集体含量。在图13(a-e)中汇总了用于检测凋亡的标准DNA片段化ELISA测定法的结果。以两种不同浓度测试每种抗体(1.0μg/ml：黑色条和0.1μg/ml：阴影线条及分别为1.0和0.1μg/ml抗Fc抗体进行交联)。将获得的数据针对设定为100％的交联的Drozitumab的最大活性(在1.0μg/ml)标准化。大多数分析的抗体能够在交联后在MDA-MB-231细胞中诱导浓度依赖性凋亡诱导。46种结合物中的7种(15.2％)清楚地显示在全部两种浓度比Drozitumab要高的活性。15种抗体(32.6％)在与Drozitumab相同的活性范围中且测试的分子中的20种(43.5％)确实在交联后诱导凋亡但程度与Drozitumab相比低得多。剩余4种结合物(“20E3”，“19E6”，1B12”和“19C12”，8.7％)没有活性且不诱导凋亡，甚至在经抗Fc二抗交联后。
实施例7：新颖的DR5结合物的表征
基于凋亡活性筛选的结果，选择46种评估的DR5抗体中的12种进行另外的更加详细的分析和表征。如描述的，在瞬时转染的HEK293EBNA细胞中再生成这些抗体，并使用标准蛋白A亲和柱，继以大小排阻层析来纯化。测定产量和单体/聚集体含量(表7)。就靶特异性，物种交叉反应性和亲和力表征经过纯化的抗体(表8)。另外，通过DLS分析热稳定性并比较在交联性抗人Fc二抗存在或缺失下的凋亡诱导活性。
表7：选定的DR5抗体的系列，SEQIDNO见表8
表8：新颖的DR5结合物的表征
抗体 SEQ ID NO.VH/VL 亲和力[nM] 亲合力[nM] 聚集温度[℃]
18F11 94/95 504 1.1 64
18H6 555 2.7 n.d.
18E6 471 2.2 66
6H4 773 8.9 65
5F6 552 1.5 66
20F2 106/107 431 4.8 66
4G9 478 6.4 65
22E9 100/101 217 1.5 64
21H3 102/103 259 1.6 64
4F5 575 4.4 n.d.
5E11 7/8 162 1.1 65
24B7 300 2.3 65
所有分析的抗体特异性识别人DR5且不结合来自TNFR超家族的最亲近的人同系物，诸如DR4，诱饵受体(DcR1和DcR2)和护骨蛋白(OPG)。所有DR5抗体与人和猕猴DR5有交叉反应性但不识别鼠对应物(由于仅约30％的序列同源性，这并不出乎意料)。虽然对人DR5的亲和力在较宽的范围中(自162至773nM)，但是所有测量的亲合力在低(一位数)纳摩尔范围中。所有测试的DR5结合物揭示高热稳定性，聚集温度完全超出60℃，如通过动态光散射(DLS)实验测量的。
为了测定一系列选定的DR5结合物的功能性活性，使用一种特异性检测DNA片段化的细胞死亡检测ELISA测定法(Roche；#11774425001)分析凋亡诱导。在相同浓度的用于交联的抗人Fc二抗存在下以1.0和0.1μg/ml的浓度使用抗体。为了比较，在二抗缺失下以1.0μg/ml使用抗体以评估选定的DR5结合物的活性是否依赖于交联或它们是否自身就有活性。使用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为靶细胞系。在图14中汇总了不同DR5结合物的凋亡诱导的结果。在交联后，所有新分离的DR5抗体在与对照抗体Drozitumab相同的范围中诱导凋亡。然而，与在没有交联的情况下就展现显著的凋亡诱导活性的Drozitumab不同，新颖的DR5结合物的活性严格依赖于经二抗的交联。既然凋亡活性对于具有最高和最低的对人DR5的亲和力的抗体是相似的，凋亡活性看来与DR5结合物对它的靶物的亲和力无关。
使用另外两种测定法来评估选定的DR5结合物的活性：用CellTiter-Glo测定法(Promega，#TB288)测量用交联的抗体处理后的增殖抑制。另外，通过胱天蛋白酶8-Glo测定法(Promega，#G8202)测定胱天蛋白酶8的诱导。图15显示浓度为7nM的经抗Fc二抗交联的DR5结合物对三种不同肿瘤细胞系的最大增殖抑制。将对人结肠直肠腺癌细胞系DLD-1(黑色条)的作用与大细胞肺癌症系HCI-H460(阴影线条)和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(白色条)进行比较。对于所有三种细胞系，能检测到显著的增殖抑制。虽然DLD-1在7nM的增殖抑制看来与DR5抗体的亲和力有关，但是NCI-H460并非如此而MDA-MB-231只有某种程度如此。
表9：增殖抑制的计算IC50值，使用CellTiter-Glo测定法
抗体 SEQ ID NO.VH/VL DLD-1 NCI-H460 MDA-MB-231
5E11 7/8 0.50 3.91 >7.00
22E9 100/101 0.56 4.00 >7.00
21H3 102/103 1.57 6.20 >7.00
24B7 1.86 5.00 >7.00
20F2 106/107 2.01 6.53 >7.00
4G9 4.30 >7.00 >7.00
18E6 4.62 6.89 >7.00
5F6 6.39 >7.00 >7.00
18F11 94/95 >7.00 >7.00 >7.00
4F5 >7.00 >7.00 >7.00
6H4 >7.00 >7.00 >7.00
图16汇总了用抗Fc交联的DR5抗体处理后的胱天蛋白酶8活化的结果。显示了三种不同肿瘤细胞系(DLD-1，黑色条；NCI-H460，阴影线条；和MDA-MB-231，白色条)中在7nM的浓度的最大胱天蛋白酶8活化。对于所有抗体，能在所有三种细胞系中检测到高水平的胱天蛋白酶8活化。不同细胞系的胱天蛋白酶8的诱导在相同的范围中，但是胱天蛋白酶8诱导水平与抗体亲和力的关联不如在CellTiter-Glo测定法中对增殖抑制看到的突出。
表10：胱天蛋白酶8诱导的计算EC50值，使用胱天蛋白酶8-Glo测定法
抗体 SEQ ID NO.VH/VL DLD-1 NCI-H460 MDA-MB-231
5E11 7/8 0.13 0.03 0.14
22E9 100/101 0.15 0.05 0.24
21H3 102/103 0.20 0.09 0.31
24B7 0.21 0.09 0.26
20F2 106/107 0.31 0.13 0.33
4G9 0.48 0.38 1.04
18E6 0.33 0.13 0.35
5F6 0.76 0.28 1.00
18F11 94/95 0.36 0.37 0.43
4F5 0.49 0.16 0.89
6H4 1.84 0.70 0.99
实施例8：表位分析
为了更加详细地表征受新分离的DR5结合物识别的表位的种类和相对定位，用经过纯化的IgG实施了Western/点印迹分析和Biacore测量。比较Western印迹与点印迹结果会显示抗体是识别线性还是构象表位，而Biacore竞争实验会暗示不同的，相同的或部分交叠的表位。
为了区分线性或构象表位，通过SDS-PAGE分开人DR5，印迹到硝酸纤维素膜上，与不同DR5结合物一起温育，并用抗huFc-HRP二抗(SigmaA0170)检测。平行地，将人DR5点到膜上，添加DR5抗体，并用相同的二抗检测。只在点印迹实验中的抗原结合会暗示构象表位，因为在这种设置中抗原以它的天然三维构象得以分析，而在Western印迹实验中抗原已变性且只应有线性表位可及。
表11：来自Western/点印迹分析的结果的汇总
抗DR5单抗 SEQ ID NO.VH/VL Western印迹中的信号 点印迹中的信号
4G9 + +++
6H4 + ++
5F6 +++ +++
18F11 94/95 ++ +++
18H6 ++ +++
20F2 106/107 + +++
18E6 + +++
22E9 100/101 - ++
21H3 102/103 - +++
4F5 - ++
5E11 7/8 - +++
24B7 +++ +++
基于这些结果可以得出结论，大多数分析的抗体识别huDR5上的构象表位，而只有两种抗体(5F6，24B7)在Western印迹分析中清楚地结合变性抗原，指示结合线性表位。点印迹中的强结合和Western印迹中的弱结合也暗示构象表位，但是这大概含有受到识别的线性区段(18F11，18H6)。
以两种不同设置实施通过表面等离振子共振(SPR，Biacore)进行的结合竞争测定法。在经典的三明治式测定法中，在芯片上固定化第一DR5结合物，接着是huDR5的添加和结合。然后注射第二DR5抗体，并分析另外的对DR5的结合。在串联测定法中，在芯片上固定化huDR5，接着添加第一DR5结合物。然后注射第二DR5结合物并分析另外的结合。图17汇总了这些结合竞争测定法(比较四种新的DR5抗体与Drozitumab)的结果。从这些竞争测定法可以得出结论，克隆5E11，22E9和174(VHSEQIDNO.:88，VLSEQIDNO.:89，见例如实施例26)大概分享一种共同表位，因为一旦这些中的一种结合DR5，另两种无一能结合抗原。这三种抗体明显识别与Drozitumab不同的表位。克隆422(VHSEQIDNO.:82，VLSEQIDNO.:85，见例如实施例26)的结合位点可能与5E11，22E9和Drozitumab的表位交叠，但是明确不与克隆174的表位交叠。从共结晶实验(DR5+单抗)继以结构分析可能得到对识别表位问题的明确回答。
为了评估DR5抗体是否识别与DR5配体结合位点相似或交叠的表位，建立了Biacore中的TRAIL竞争测定法。为该目的，在CM5芯片上固定化重组huTRAIL(Preprotech，No310-04)。使用由人DR5-Fc和DR5结合物组成的预形成复合物作为分析物，并测定对固定化TRAIL的结合。在图18中显示了TRAIL竞争实验的结果。除克隆422(图18b中的点线)以外，所有新分离的DR5结合物看来结合至少与DR5上的TRAIL结合位点交叠的表位，因为测试的复合物无一能够结合固定化的huTRAIL(所有实线)。与其相反，单独的DR5(虚线)或DR5与对照抗体的复合物(短线)显示对固定化配体的清楚结合。
实施例9：非配体竞争性DR5抗体在TRAIL存在下展现与配体竞争性结合物相比升高的体外凋亡活性
在分离和筛选新的DR5结合物期间，分离识别人DR5上不同表位的抗体。抗体分类的一种可能标准是将它们以配体阻断性和配体非阻断性分子分组。在选定的结合物中，为这些组每一个选择一个代表：克隆5E11鉴定为阻断TRAIL结合DR5，而克隆422是配体非阻断性抗体(图18)。
为了评估结合至少与TRAIL结合交叠的表位的影响，对这两种候选物分析在人TRAIL存在或缺失下用抗Fc二抗交联后DLD-1CRC靶细胞的增殖抑制。将每孔4000个DLD-1靶细胞于37℃温育过夜，之后添加交联的抗体：以六种不同浓度(始于6.67nM，2.5倍稀释步骤，降至0.068nM)使用抗体5E11，422和一种不阻断TRAIL的对照抗体。通过添加等摩尔浓度的抗Fc二抗来实现交联。以10，4，1.6，0.64，0.256和0.102nM的浓度将TRAIL添加至相应抗体浓度。温育48小时后，添加CellTiterGlo试剂。图19中显示了这种生长抑制测定法的结果。显示了在添加人TRAIL后，非配体阻断性抗体克隆422展现与结合TRAIL结合位点交叠性表位的克隆5E11相比显著升高的抗增殖活性。添加交联的5E11抗体对单独的TRAIL所致生长抑制没有叠加效应。相反，与人TRAIL组合使用交联的克隆422对活性显示显著的叠加效应。
用一种已知不阻断DR5上的TRAIL结合的相关对照抗体观察到类似结果。在体外测定法中观察到的这种效应是否能转变入体内设置中仍然有待评估。
实施例10：双特异性2+2型式的转变
为了评估新颖的DR5结合物是否可用于生成通过DR5超交联靶向诱导肿瘤细胞凋亡的双特异性抗体，将一组DR5抗体转变成四价双特异性分子。这些双特异性抗体含有针对DR5和FAP(成纤维细胞活化蛋白)的各两个结合模块。将不同的选定DR5抗体与FAP抗体28H1组合，后者是通过噬菌体展示分离及亲和力成熟的一种高亲和力人/鼠/猕猴(hu/mu/cy)交叉反应性FAP结合物。在所使用的2+2型式中，使用(G4S)4连接头将28H1CrossFab域(VHCL)融合至抗DR5重链的C末端。图28中显示了2+2型式的示意性结构。下面是2+2型式的双特异性抗体的例示性链。
表12a：双特异性四价DR5-FAPCrossMab分子(均使用(G4S)4连接头将28H1CrossFab域(VHCL)融合至抗DR5重链的C末端，FAP结合物：VHSEQIDNO.:15，VLSEQIDNO.:16)
表12b：双特异性四价DR5–FAPCrossMab分子的生产数据
DR5结合物 生产产量[mg/L] 最终的单体[％] 凋亡诱导
5E11 20.3 96.7 +++
22E9 18.1 99.0 +++
21H3 7.6 96.3 +++
20F2 19.3 100.0 +++
18E6 25.1 100.0 ++
5F6 18.9 99.4 +
18F11 22.3 96.7 +
6H4 18.5 100.0 ++
18H6 17.5 99.6 ---
在瞬时转染的HEK293EBNA细胞中生成所有DR5-FAP双特异性分子，并经蛋白A和大小排阻层析纯化。获得的产物产量在合理范围中(20mg/L左右)。所有分子在最终纯化步骤后的单体含量均在96％以上。
通过表面等离振子共振(Biacore)进行的靶物结合分析揭示了所有选定的2+2型式的双特异性抗体能够同时结合重组DR5和FAP(人和鼠)，如图42中所示。
为了评估DR5-FAP双特异性分子是否能够诱导MDA-MB-231靶细胞系凋亡，用重组人FAP包被96孔板，用于靶细胞上的DR5经后续添加的双特异性抗体的交联。添加靶细胞(MDA-MB231)并温育24小时后，通过标准DNA片段化ELISA测定法测定凋亡诱导。图20显示在两种不同浓度(7.0nM和0.7nM)7种含有新分离的DR5结合物和C末端融合的28H1FAPCrossFab的双特异性抗体的凋亡诱导与Drozitumab相比的比较。在FAP存在和缺失下测试所有分子。正如预期的，在高浓度，基于Drozitumab的双特异性分子在交联性FAP缺失下就诱导显著程度的凋亡。相反，使用新的DR5结合物的DR5-FAP双特异性分子只在板上包被的FAP存在下展现凋亡诱导活性，指示这种活性依赖于经重组FAP的交联。
为了确定双特异性分子是否还能经与DR5不同的细胞系上表达的FAP有效交联并由此诱导凋亡，设立了所谓的旁观者共培养测定法。图21显示在双特异性分子的三种不同浓度(7.0，0.7和0.07nM)，肿瘤细胞系(MDA-MB-231)和FAP表达性成纤维细胞(GM05389)共培养实验中的凋亡诱导的结果。含有融合至28H1FAPCrossFab的分别来自5E11，22E9和20F2的DR5结合模块的三种双特异性构建体显示相当程度的凋亡诱导，正如用对应的抗Fc交联的IgG分子也观察到的。与之相反，含有6H4作为DR5结合部分的分子展现与交联的IgG相比降低的活性。测试的分子之一(18H6-28H1)在所有浓度完全没有活性(与交联的IgG相反)，指示并非所有DR5结合物均适合于生成超交联肿瘤细胞上的DR5的双特异性分子。因此，需要仔细评估表位和双特异性活性来选择正确的DR5抗体用于靶向凋亡诱导办法。在这点上，以2+2双特异性型式展现相当低的对DR5的亲和力和高的亲合力的DR5结合物是特别有利的。低的对DR5的亲和力防止双特异性抗体结合正常细胞并因此提高以FAP依赖性方式诱导肿瘤细胞凋亡的选择性。具有这些特征的一种结合物是例如DR5结合物5E11。
如描述的，Drozitumab的一个限制它以双特异性型式使用的缺点是这种抗体不容许N末端融合第二结合模块的事实。这种构造导致封闭Drozitumab的N末端，这抑制对DR5的正确结合并由此阻止凋亡诱导。为了测试新分离的DR5抗体是否能以这类型式使用，生成了Fc融合分子，其中将选定DR5结合物的Fab经(G4S)4连接头融合至人Fc区的C末端。在HEK293EBNA细胞中瞬时生成这些分子，经蛋白A珠纯化，并在凋亡诱导测定法中测试。在图22a)中汇总了使用这些Fc-DR5融合物分子，用二级抗FcIgG交联后，MDA-MB-231细胞中的DNA片段化测定法的结果。所有测试的分子均能够诱导靶细胞系凋亡，指示选择的DR5结合物的N末端没有被封闭，这打开了广泛的型式能用于这些结合物。
实施例11：含有噬菌体展示衍生的DR5结合物的2+2双特异性型式的热稳定性的表征
使用Optim1000系统(AvactaGroupplc)以散射光强度的变化测量转变成2+2双特异性型式的噬菌体展示衍生的DR5结合物的热稳定性。在微量杯阵列中，20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中浓度为1mg/mL的9μL样品以0.1℃/min的速率自25℃加热至90℃。每0.4℃记录散射光强度(266nm激光)，并用软件IgorPro，Version6.23(AvactaGroupplc)加工。聚集启动温度定义为散射强度开始升高时的温度。
表13：含有噬菌体展示衍生的DR5结合物的双特异性抗体(2+2型式)的聚集启动温度，作为双特异性构建体的热稳定性的测量
所有测试的DR5抗体揭示高热稳定性，聚集温度完全超出60℃，克隆入2+2双特异性构建体中时也是。
实施例12：DR5-FAP双特异性抗体能够诱导不同靶细胞凋亡
在一项并肩实验中对9种包含融合至FAP28H1CrossFab模块的新分离的DR5结合物(4种通过噬菌体展示分离，5种自家兔免疫接种衍生，如实施例22至25中所述)的2+2型式的DR5-FAP双特异性抗体比较两种不同细胞系(MDA-MB-231和G401)在与GM05389人FAP+成纤维细胞的共培养测定法中的凋亡诱导。在0.0007-7nM的浓度范围上测试双特异性抗体。图23(MDA-MB-231)和图24(G401)中汇总DNA片段化测定法的结果。所有测试的双特异性抗体对全部两种细胞系展现较好的凋亡诱导活性。根据用MDA-MB-231细胞获得的结果，抗体可分成两组。自家兔免疫接种获得的在0.7nM的浓度显示最大凋亡诱导且活性随抗体浓度进一步升高而略微降低。相反，双特异性2+2型式的噬菌体展示衍生的结合物没有显示活性在高浓度的下降，而是保持恒定或甚至升高更多直至最高浓度。在G401细胞与GM05389成纤维细胞共培养的实验中，对于全部两组双特异性抗体，在0.07nM的浓度就达到了最大凋亡诱导，然后保持恒定。在这种设置中，所有分子就凋亡诱导水平而言性能相似。
实施例13：不同双特异性型式的比较
已经证明2+2CrossFab型式的DR5-FAP双特异性分子以很好的品质生成且能够在两细胞系共培养设置中介导浓度依赖性特异性凋亡诱导。这些双特异性分子的凋亡诱导程度在与用经抗Fc二抗超交联的相应DR5结合物观察到的相同的范围中。为了对别的不同的DR5-FAP双特异性分子评估它们的凋亡诱导能力，已经生成下述构建体，其中以不同型式及以不同效价组合DR5和FAP结合实体，如图25中所示。
表14：备选DR5-FAP双特异性型式的描述
在HEK293EBNA细胞中瞬时生成所有分子，并依照标准蛋白A和大小排阻层析方案来纯化。通过SDS-PAGE，SEC和Caliper分析来分析分子的副产物概况和品质。
表15：别的双特异性DR5-FAP分子的生产结果的汇总
如表15中汇总的，这些别的型式看来与2+2型式相比更难以生产和纯化。除一种(B16_E11A_001)外，均显示比类似2+2分子更低的表达产量。然而，聚集体含量相当低(<2％)，但是在大多数情况中也能检测到低分子量种类，这可能是由于分子的纯化或降解。
在成纤维细胞共培养测定法(DNA片段化)中以不同浓度(7.0；0.7和0.07nM)测试对MDA-MB-231的凋亡诱导活性。图26显示与2+2型式的双特异性Drozitumab相比三种不同型式(2+2；2+1和3+1)的凋亡活性的结果。在这种设置中，2+2型式的5E11-28H1双特异性分子总体显示与Drozitumab对照相比相似的活性。在最低浓度，2+2型式的5E11-28H1双特异性分子展示与Drozitumab对照相比甚至更高的活性。相反，2+1和3+1型式看来与全部两种2+2型式(Drozitumab和5E11)相比活性更低。如果用不同DR5结合物(18F11)分析相同型式，那么所有三种分子显示与Drozitumab双特异性抗体相比降低的凋亡诱导活性。然而，18F11双特异性分子在更低的浓度(0.07nM)发生最大凋亡诱导，而基于Drozitumab的分子随浓度升高展现更高活性。
在第二组分子中，对5E11-28H1双特异性抗体评估另一种2+1型式，其中将两个DR5结合模块头-尾融合至Fc-节部分，而将FAP靶向性Fab与Fc-穴配对物组合。在用于与GM05389成纤维细胞共培养的MDA-MB-231的凋亡诱导的DNA片段化测定法中，在宽浓度范围(范围自7.0至0.0007nM)上比较所有4种型式(图27)。全部两种2+1分子在0.7nM的浓度具有最高凋亡活性，而3+1分子在低10倍的浓度就显示最大凋亡诱导。然而，新的型式无一看来优于常规2+2型式。
实施例14：共培养测定法系统中1+1双特异性型式的功能性活性的测试
在实施例12中描述的不同型式和效价变体以外，已经生成1+1型式的另一种构建体(如图25D中所示)，其中DR5结合物0011(＝克隆174)在未交换Fab中且FAP结合物4B9在交换Fab中(SEQIDNO.:280-282)。在有或无二级交联的情况下将1+1型式的功能活性与2+2型式(如图28A中所示，含有0011作为DR5结合物和28H1作为FAP结合物；SEQIDNO.:287-289)和0011的嵌合IgG(SEQIDNO.:90-93)比较。
在由肿瘤细胞(MDA-MB-231)和成纤维细胞(GM05389)组成的共培养系统中在交联性二抗存在或缺失下在用抗DR5和抗DR5-FAP双特异性抗体处理细胞后通过细胞死亡检测ELISA(CDDE，Roche，#11774425001)测量凋亡诱导。
第1天：制备细胞。在补充有10％胎牛血清(Gibco)和2mML-谷氨酰胺(PAA)的DMEM培养基(PAN)中培养贴壁MDA-MB-231细胞系(人乳腺腺癌)，并每周两次1:20正常分瓶。在补充有15％胎牛血清(Gibco)，1xNEAS(PAN)和2mML-谷氨酰胺(PAA)的MEM+Earle培养基(Gibco)中培养GM05389成纤维细胞，并每周两次1:3正常分瓶。
对于共培养测定法，在第1天以1x104个细胞/100μl/孔的密度在96孔板中接种成纤维细胞，并于37℃，5％CO2温育过夜。在第2天添加肿瘤细胞和抗体。
对于单培养测定法，在不同板上以相同密度接种细胞系，温育过夜，并在次日用抗体处理。
第2天：诱导凋亡。吸出培养基，并单独地或以1:1比率与交联性抗体(山羊抗人IgG，Sigma，#I2136)一起以不同终浓度(见图)在100μl培养基中将抗体(抗DR5IgG或抗DR5-FAP双特异性抗体)添加至细胞。
对于共培养测定法，在抗体后立即添加肿瘤细胞(1x104个细胞/100μl/孔)到成纤维细胞上达到100μl的终体积。
将培养物于37℃温育24小时。
第3天：细胞死亡检测ELISA(CDDE)。依照制造商的说明书(Roche)略有变化实施免疫测定法。简言之，将细胞用100μl/孔2x裂解缓冲液于室温裂解15分钟。依照制造商的说明书制备由抗组蛋白和抗DNA抗体组成的大师级混合物，并在96孔链霉亲合素包被平底微量滴定板(Roche)上与1:4稀释的裂解物混合。于室温温育2小时后，清洗孔，添加ABTS底物，并于室温温育直至显色足以进行光度法分析(10-30分钟)。用TecanSpectraRainbowReader读取405nm吸光度。
图46和47中显示结果。
虽然单特异性抗DR5抗体(嵌合0011和Drozitumab二者)自身没有诱导显著的凋亡，但是二抗对细胞表面上的DR5分子的超聚簇在0.7mM左右的浓度引起细胞死亡。然而，当将抗DR5-FAP双特异性抗体(1+1或2+2型式任一)添加至共培养物，引起肿瘤细胞上经结合成纤维细胞表面上存在的FAP的二级模块的DR5超聚簇时，实现最好的凋亡诱导(图46)。
虽然单特异性抗DR5抗体在交联后诱导MDA-MB-231细胞凋亡，但是针对DR5和FAP的双特异性分子只在DR5表达性肿瘤细胞和FAP表达性肿瘤相关成纤维细胞存在下有功能。另外，分子无一显示对成纤维细胞的存活力的任何作用(与内部测定法阳性对照相比的相对凋亡见图47)。
这种活性数据证明对每种靶物有一个效价的1+1型式的DR5-FAP双特异性抗体也能实现FAP特异性凋亡诱导，功效与2+2型式相当。
实施例15：2+2双特异性型式作为通用平台技术
28H1VHCL融合至5E11重链的C末端的2+2型式的双特异性DR5-FAPCrossFab分子已经证明是一种很好的型式。对于不同DR5结合物，它已经显示以合理的产物滴度可生产，它是稳定的，只展现少量的缺失或错误配对的轻链，且可再现地显示较好的活性。无论如何，为了扩展型式平台，已经生成在交叉点的种类和位置方面不同的别的双特异性5E11-28H1分子。图28中描绘评估的5种别的型式和亲本分子。5种别的分子中的4种不再含有交换28H1Fab，而是将标准Fab域融合至DR5(5E11)重链的C末端(VHCH1或VLCL任一，通过(G4S)4连接头融合)。
表16：别的DR5-FAPCrossFab分子的描述
图28草图 B C D E F
交叉的类别 N末端Fab N末端VHVL N末端CH1CL C末端Fab C末端VHVL
5E11 IgG VLCL-Fc VLCH1-Fc VHCL-Fc VHCH1-Fc VHCH1-Fc
28G1 Fab(融合至重链C末端) VHCH1 VHCH1 VHCH1 VLCL VLCH1
表17：别的DR5-FAPCrossFab分子的例示性序列
以200ml规模在HEK293EBNA细胞中瞬时生成所有分子，通过标准蛋白A和大小排阻层析纯化，并最终分析和表征，与初始型式(C末端28H1CH1CL交叉融合至5E11重链，(分子A，图28))比较。
如表16中汇总的，所述五种分子可分成两组：一个含有两种型式，其中整个Fab是交叉的(B+E)。这两种分子给出很低的产物滴度，而且甚至在纯化后，它们仍然含有大量的聚集体。因此，没有进一步评估这两种分子。其它三种(5E11VHVL或CH1CL的交叉和C末端28H1作为VHVL的交叉)展现就产量和聚集体含量而言好得多的产物品质。还通过FACS在MDA-MB-231细胞上对分子C和D测试靶物结合，与分子A比较，如图29中所示。而且，将分子C，D，和F在凋亡诱导方面的功能活性，同时和不依赖性靶物结合，稳定性和聚集趋势以及副产物样式与型式A比较(实施例22至25)。
实施例16：共培养测定法系统中2+2双特异性型式变体的功能活性的测试
对四种不同2+2型式变体(图28的型式A，C，D，F)比较它们在由肿瘤细胞(MDA-MB-231)和成纤维细胞(GM05389)组成的共培养系统中用构建体处理细胞后诱导凋亡的功能活性，如通过细胞死亡检测ELISA(CDDE，Roche，#11774425001)测量的。
第1天：制备细胞。在补充有10％胎牛血清(Gibco)和2mML-谷氨酰胺(PAA)的DMEM培养基(PAN)中培养贴壁MDA-MB-231细胞系(人乳腺腺癌)，并每周两次1:20正常分瓶。在补充有15％胎牛血清(Gibco)，1xNEAS(PAN)和2mML-谷氨酰胺(PAA)的MEM+Earle培养基(Gibco)中培养GM05389成纤维细胞，并每周两次1:3正常分瓶。
对于共培养测定法，在同一天以1x104个细胞/100μl/孔的密度在96孔板中接种成纤维细胞和肿瘤细胞，并于37℃，5％CO2温育过夜。对于单培养测定法，在不同板上以相同密度接种细胞系。
第2天：诱导凋亡。吸出培养基，并以不同终浓度(见图)在100μl培养基中将双特异性抗体添加至细胞。
将培养物于37℃温育24小时。
第3天：细胞死亡检测ELISA(CDDE)。依照制造商的说明书(Roche)略有变化实施免疫测定法。简言之，将细胞用100μl/孔2x裂解缓冲液于室温裂解15分钟。依照制造商的说明书制备由抗组蛋白和抗DNA抗体组成的预混合物，并在96孔链霉亲合素包被平底微量滴定板(Roche)上与1:4稀释的裂解物混合。于室温温育2小时后，清洗孔，添加ABTS底物，并于室温温育直至显色足以进行光度法分析(10-30分钟)。用TecanSpectraRainbowReader读取405nm处的吸光度。
图30中显示结果。4种不同CrossMab变体在共培养(a)和单培养(b，c)设置中的凋亡诱导，如通过DNA片段化检测的。所有4种不同变体在共培养设置中以相当的剂量依赖性方式在肿瘤细胞中诱导凋亡。在单培养设置中，在MDA-MB231肿瘤细胞系中或在GM05389成纤维细胞细胞系中均没有诱导凋亡，指出所有4种变体的凋亡诱导的特异性和FAP依赖性。这种功能活性数据证明可以以就交叉的类型和位点而言不同的构造使用双特异性2+2型式。
实施例17：2+2双特异性型式变体的不依赖性和同时靶物结合的测试
另外通过SPR测定法对四种不同2+2型式变体(图28的型式A，C，D，F)比较它们不依赖性和同时结合全部两种靶物的能力。
对不同Crossmab变体的不依赖性DR5和FAP结合的评估
通过使用GEHealthcare的胺偶联试剂盒于pH5.0在CM5芯片(GEHealthcare，BR-1005-30)上偶联3000个共振单位(RU)左右的捕捉系统(5μg/ml抗人IgG(Fc)；GEHealthcare，BR-1008-39)。样品和系统缓冲液为PBS-T(包括0.05％Tween20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH7.4。将流动室的温度设定为25℃，将样品块的温度设定为12℃。在捕捉之前，将流动室用运行缓冲液引发两次。
通过以5μl/min流注射5μg/ml溶液60秒来捕捉双特异性抗体。通过测定序贯或同时添加(10μl/min流)的每种配体的主动结合能力来分析每种配体对双特异性抗体的不依赖性结合：
1.以5μg/ml的浓度注射人DR5达180秒(鉴定抗原的单一结合)。
2.以5μg/ml的浓度注射人FAP达180秒(鉴定抗原的单一结合)。
3.以5μg/ml的浓度注射人DR5及以5μg/ml的浓度注射人FAP达180秒(鉴定DR5和FAP的同时结合)。
通过用3mMgCl2溶液以30μl/min的流速清洗60秒来再生表面。通过减去自抗人IgG表面获得的响应来修正散装(bulk)折射率差异。
如果办法3的所得最终信号等于办法1和2各自的最终信号的总和，那么双特异性抗体能够互相不依赖性地结合全部两种抗原。
表18：4种不同Crossmab变体的不依赖性DR5和FAP结合的定量评估
所有4种不同Crossmab变体均能够互相不依赖性结合DR5和FAP。
对Crossmab的同时DR5和FAP结合的评估
第一，通过使用GEHealthcare的胺偶联试剂盒于pH5.0在CM5芯片(GEHealthcare，BR-1005-30)上偶联600个共振单位(RU)左右的DR5(20μg/ml)。样品和系统缓冲液为PBS-T(包括0.05％Tween20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH7.4。将流动室设定为25℃，将样品块设定为12℃，并用运行缓冲液引发两次。第二，以30μl/min流注射10μg/ml双特异性抗体溶液30秒。第三，以30μl/min流注射hFAP(10μg/ml)达30秒。hFAP的结合响应依赖于结合至hDR5的双特异性抗体的量且显示同时结合。通过以30μl/min的流速用甘氨酸pH2溶液(GEHealthcare，BR-1003-55)清洗70秒来再生表面。同时结合通过hFAP对先前结合了DR5的Crossmab的另外的特异性结合信号来显示。
四种Crossmab型式(DR5TAA-0057，DR5TAA-0078，DR5TAA-0077和DR5TAA-0081)的同时DR5和FAP结合的评估显示所有4种不同Crossmab变体均能够同时结合FAP和DR5。
实施例18：2+2双特异性型式变体的热稳定性和聚集趋势的测试
进一步对四种不同2+2型式变体(图28的型式A，C，D，F)分析它们的热稳定性和它们形成聚集体的趋势。
热稳定性
聚集启动温度：在20mM组氨酸/盐酸组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中以1mg/mL的浓度制备样品，经由0.4μm滤板通过离心转移入光学384孔板中，并覆盖石蜡油。在以0.05℃/min的速率自25℃至80℃加热样品时通过动态光散射重复测量流体力学半径。聚集启动温度定义为流体力学半径开始增大时的温度。
聚集趋势
将样品透析入配制缓冲液(20mMHis/HisCl，240mM海藻糖，pH6.0)中，并调节至1mg/mL的浓度。在0.22μm离心过滤装置(Millipore)上无菌过滤后，将样品于40℃保存2周，而将对照样品维持于-80℃。使用TSK3000SWXL柱(Tosoh)通过SE-HPLC监测聚集体形成，并以40℃和-80℃样品之间的差异报告。
表19：4种不同Crossmab型式的热稳定性和聚集趋势的评估
型式C，D和F中的热稳定性与亲本型式A相比略微降低，但是在61℃和60℃仍在较好的范围中。
型式A，C和F的聚集趋势很低，而型式D略微升高。
实施例19：通过质谱术评估2+2双特异性型式变体的副产物概况
最后，通过质谱术进一步对四种不同2+2型式变体(图28的型式A，C，D，F)分析它们的副产物概况。
经电喷射离子化质谱术(ESI-MS)测定和确认不同构建体的去糖基化总质量。此外，检测并相对量化潜在副产物诸如LC过呈现。简言之，将100μg经过纯化的抗体以直至3mg/ml的蛋白质浓度在100mMNaH2PO4/Na2HPO4，pH7中用14UN-糖苷酶F(Roche)于37℃去糖基化2小时，随后在SephadexG25柱(GEHealthcare)上经HPLC脱盐。在配备TriVersaNanoMate(Advion)源的maXisUHR-TOF(Bruker)MS系统上经ESI-MS测定去糖基化总质量。
以它们的去糖基化形式通过质谱术分析不同DR5-FAP双特异性抗体构建体以评估产物身份和完整性。能对所有评估的构建体确认身份。此外，不同构建体显示数种副产物，例如过呈现一种LC类型或丧失一条或两条LC。所有构建体具有定性和定量相似的副产物概况。
来自实施例13和30-33的所有结果清楚地显示可以以就交叉的类型和位点而言不同的构造使用双特异性2+2型式。这使得2+2CrossFab型式成为一种可广泛应用的平台技术。
实施例20：Drozitumab-FAP双特异性分子展现胜过非靶向Drozitumab的卓越体内功效
已经在体外活性测定法证明双特异性Drozitumab-FAP展现与未交联的单独的Drozitumab相比卓越的凋亡诱导活性。为了在有关小鼠肿瘤模型中评估这是否还转变成体内功效，已经建立不同异种移植物模型。标准小鼠肿瘤模型的一个问题是FAP表达通常很低，根本不反映人的情况。为了建立更加密切类似人肿瘤基质中的FAP表达的模型，与相应肿瘤细胞系(在裸小鼠中的结肠直肠癌细胞系DLD-1和在SCID小鼠中的乳腺癌症系MDA-MB-231)共注射重组表达小鼠FAP的工程化鼠成纤维细胞(3T3细胞)。为了这个目的，用携带在MPSV启动子控制下的全长鼠FAP基因的表达盒的质粒稳定转染3T3成纤维细胞。为了选择稳定克隆，载体进一步携带赋予嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素乙酰基转移酶的另一个表达盒。选择了根据FACS结合实验判断，表达不同水平的鼠FAP的数个克隆。与肿瘤细胞系DLD-1共注射一种选定muFAP-3T3细胞系，导致与在没有muFAP表达性3T3细胞的情况下注射DLD-1细胞相比显著增强的肿瘤生长。还有，使用人/小鼠交叉反应性抗FAP抗体的IHC分析已经对全部两种细胞系证明肿瘤周围基质中高水平的FAP表达，正如预期的。因此，使用这种共移植皮下异种移植物模型来评估双特异性Drozitumab-FAP分子与初始非靶向Drozitumab抗体相比的体内功效。与20％表达鼠FAP的3T3成纤维细胞共植入2x106个肿瘤细胞。肿瘤细胞植入后12天(DLD-1)和10天(MDA-MB-231)开始疗法。给动物注射(i.v.)缓冲液，Drozitumab(10mg/kg)或Drozitumab-FAP(10mg/kg)。为了补偿Drozitumab较之双特异性Drozitumab(Drozitumab只是双特异性分子的分子量的60％)的分子量差异，后者每周两次施用，而Drozitumab只一周一次给予。在图31中汇总了以mm3计的均值肿瘤体积随时间的增大。图31A显示DLD-1/muFAP-3T3共注射模型中Drozitumab-FAP与Drozitumab和缓冲液对照相比的体内功效。虽然Drozitumab只展现适度抗肿瘤功效，导致与对照相比36％的肿瘤生长抑制(TGI)，但是双特异性分子在研究结束时(第33天)展现99％的肿瘤生长抑制。在MDA-MB-231/muFAP-3T3共注射模型中，这种差异甚至更加突出，因为在这种模型中单独的Drozitumab没有显示比缓冲液对照好的任何功效，而Drozitumab-FAP双特异性抗体在研究结束时(第32天)展现77％的肿瘤生长抑制(图31B)。这种结果可能指示MDA-MB-231细胞系比DLD-1细胞系对凋亡诱导更有抗性。
实施例21：使用新分离的DR5结合物与28H1FAPCrossFab的组合的DR5-FAP双特异性分子的抗肿瘤活性的评估。
在各自与表达鼠FAP的3T3成纤维细胞共注射的DLD-1和MDA-MB-231异种移植物模型中并肩比较在双特异性型式中融合至作为CrossFab的抗FAP抗体28H1的三种不同DR5结合物(5E11，174和422)的体内功效。包括由具有Fc区中完全消除对Fcγ受体的结合(而对FcRn的亲和力不变)的突变的5E11-28H1CrossFab组成的第四种分子。为了这个目的，在HEK细胞中进行大规模瞬时转染和生产以生成足够材料。
表20：用于体内实验的双特异性抗体的生成。所有材料展现<0.23EU/mg的可接受的内毒素含量。
*L234A；L235A；P329G
所有分子均以较好的产量生成，就聚集体和内毒素含量而言具有杰出品质。通过不同方法(SPR和FRET)分析对有关抗原的结合，如表21中汇总的。
表21a：DR5-FAP双特异性分子对人和猕猴抗原的亲和力/亲合力
*Biacore测量+TagLite
在启动体内实验之前，首先对材料测试体外凋亡诱导活性。图32汇总细胞死亡检测ELISA的结果，其中在7.0，0.7和0.07nM的浓度比较四种不同DR5-FAP双特异性分子。作为共培养测定法建立测定法，其中使用DLD-1细胞作为靶细胞和3T3或表达用于交联的鼠FAP的重组3T3细胞充当效应细胞。在DLD-1–3T3共培养实验中，在DLD-1细胞中几乎检测不到任何凋亡诱导，而在FAP表达性3T3细胞的设置中，观察到凋亡诱导的10倍升高，指示这种活性是由于经重组3T3细胞表面上FAP的交联。实施了一项类似实验，其中使用相同双特异性分子，靶细胞和效应细胞来测定用双特异性激动性DR5-FAP抗体处理后的细胞存活力。图33中汇总这项实验的结果。在这里，只在FAP表达性3T3细胞存在下观察到DLD-1细胞的细胞存活力的显著降低，而对未修饰的3T3细胞(不表达鼠FAP)没有看到存活力降低。
在两种不同肿瘤模型(均与20％鼠FAP表达性3T3成纤维细胞共注射)中使用所有四种双特异性DR5-FAP分子来评估体内功效。图34中显示这些体内功效实验的结果。在移植肿瘤和成纤维细胞细胞后，以静脉内(i.v.)每周两次施用的10mg/kg开始处理。明确地，所有四种分子均能够在全部两种模型中控制肿瘤生长，如通过与媒介对照相比显著的肿瘤生长抑制(TGI)证明的。研究结束时的绝对肿瘤生长抑制百分比对所有四种分子在相似的范围中。对DLD-1和MDA-MB-231模型分别获得下述结果：5E11_28H1(wtFc)：75％/95％；5E11_28H1(PGLALA)：83％/99％；克隆174：66％/87％和克隆422：73％/89％。所有分子均在MDA-MB-231模型中比在DLD-1实验中略微更加有力。
表21b)：优选DR5-FAP双特异性抗体的特征的表征
实施例22至25：通过免疫接种生成和表征新的DR5结合模块
在自噬菌体展示文库选择具有改良特性的新的DR5抗体(如上所述)以外，还通过免疫接种家兔生成新的DR5抗体(实施例22-25)，接着深入表征(实施例26-28)。
实施例22：家兔的免疫接种
在第0天通过皮内应用给一组家兔免疫接种400μg用完全弗氏佐剂乳化的重组人DR5(单体Fc融合物)，并在第7，14，35，63和91天通过交替肌肉内和皮下应用免疫接种200μg用完全弗氏佐剂乳化的每种DR5-huFc。在第21，41，69和97天采集血液(估算总血液体积的10％)。制备血清，其用于通过ELISA的滴度测定(见下文)，并分离外周单个核细胞，其用作B细胞克隆规程中的抗原特异性B细胞源(实施例17)。
使用编码缺少胞内死亡域的人DR5的质粒表达载体，通过皮内应用400μg载体DNA，接着电穿孔(5次750V/cm正方形脉冲，持续时间10ms，间隔1s)，给另一组家兔进行基因免疫接种。家兔在第0，14，28，49，77和105天接受6次连续免疫接种。在第35，56，84和112天采集血液(估算总血液体积的10％)。制备血清，其用于通过ELISA的滴度测定(见下文)，并分离外周单个核细胞，其用作B细胞克隆规程中的抗原特异性B细胞源(实施例23)。
血清滴度的测定
在96孔NUNCMaxisorp板上以0.3125μg/ml，100μl/孔，在PBS中固定化人DR5(单体Fc融合物)，接着用200μl/孔含2％CroteinC的PBS封闭板；一式两份应用100μl/孔抗血清在含0.5％CroteinC的PBS中的连续稀释液；用100μl/孔在含0.5％CroteinC的PBS中1:16000稀释的缀合有HRP的驴抗家兔IgG抗体(JacksonImmunoresearch)检测。对于所有步骤，将板于37℃温育1小时。在所有步骤之间，将板用含0.05％Tween20的PBS清洗3次。通过添加100μl/孔可溶性BMBluePOD底物(Roche)来形成信号；并通过添加100μl/孔1MHCl来终止。在450nm(针对作为参照的690nm)读取吸光度。滴度定义为产生半最大信号的抗血清的稀释度。
实施例23：自家兔克隆B细胞
分离家兔外周血单个核细胞(PBMC)
使用三只家兔(实施例“家兔的免疫接种”中记载的)作为血液来源。将含有EDTA的全血用1xPBS(PAA，Pasching，Austria)稀释2倍，之后使用lympholytemammal(CedarlaneLaboratories，Burlington，Ontario，Canada)依照制造商的说明书进行密度离心。将PBMC用1xPBS清洗两次。
EL-4B5培养基
补充有10％FCS(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，Austria)，2mM丙酮酸钠，10mMHEPES(PANBiotech，Aidenbach，Germany)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco，Paisley，Scotland)的RPMI1640(PanBiotech，Aidenbach，Germany)。
消减巨噬细胞/单核细胞
使用无菌6孔板(细胞培养级)经由非特异性贴壁来消减巨噬细胞和单核细胞。给每个孔填充最多4ml培养基和多至6x106个来自经免疫家兔的PBMC，并容许在温箱中于37℃结合1小时。将上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘选步骤。
包被板
为了蛋白质淘选，将无菌链霉亲合素包被的6孔板(Microcoat，Bernried，Germany)用PBS中的2μg/ml生物素化重组人DR5(单体Fc融合物)于室温包被3小时。对于人表面DR5阳性细胞淘选，在无菌细胞培养6孔板中接种G401细胞，并培养以生成汇合细胞单层。在淘选之前，将这些6孔板用无菌PBS清洗三次。
在人DR5蛋白质上富集B细胞
给用人DR5蛋白质包被或用人DR5阳性G401细胞覆盖的6孔组织培养板接种每4ml培养基多至6x106个PBL，并容许在温箱中于37℃结合1小时。在DR5抗原上的富集步骤后，通过将孔用1xPBS小心清洗1-2次，去除非贴壁细胞。剩余粘着细胞在温箱中于37℃用胰蛋白酶解离10分钟。用EL-4B5培养基终止胰蛋白酶处理。将细胞置于冰上，直至免疫荧光染色。
免疫荧光染色和流式细胞术
使用抗IgGFITC(AbDSerotec，Germany)进行单细胞分选。对表面染色，将来自消减和富集步骤的细胞与PBS中的抗IgGFITC抗体一起温育，在黑暗中于4℃温育45分钟。染色后，将PBMC用冰冷的PBS清洗两次。最后，在冰冷的PBS中重悬浮PBMC，并立即进行FACS分析。在FACS分析之前添加浓度为5μg/ml的碘化丙啶(BDPharmingen，SanDiego，CA，USA)以区分死的和活的细胞。使用配备计算机和FACSDiva软件(BDBiosciences，USA)的BectonDickinsonFACSAria进行单细胞分选。
B细胞培养
通过与Zubler等人(1985)描述的方法类似的方法来制备家兔B细胞的培养。简言之，将单分选的家兔B细胞在96孔板中与200μl/孔含有Pansorbin细胞(1:100000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，Deutschland)，5％家兔胸腺细胞上清液(chargeTSN-M13(10242)，MicroCoat，Bernried，Germany)和经伽马照射的鼠EL-4-B5胸腺瘤细胞(2.5x104/孔)的EL-4B5培养基一起在温箱中在5％CO2的气氛中于37℃温育7天。取出B细胞培养的上清液进行筛选，立即收获剩余细胞并在100μlRLT缓冲液(Qiagen，Hilden，Germany)中于-80℃冷冻。
实施例24：B细胞PCR和重组表达
分离核糖核酸(RNA)
首先通过离心使要分离RNA的细胞形成团粒。通过添加100μl含10μl/mlβ-巯基乙基的RLT缓冲液来裂解细胞团粒。通过用移液器混合多次来重悬浮细胞，并转移至多孔板。将板以200xg短暂离心，并于-20℃冷冻。使用96RNA试剂盒(Macherey&Nagel)依照制造商的说明书实施RNA的分离。
逆转录聚合酶链式反应
使用SuperScriptIII第一链合成SuperMix(Invitrogen)依照制造商的说明书进行逆转录。
聚合酶链式反应
使用AccuPrimePfxSuperMix(Invitrogen)依照制造商的说明书进行聚合酶链式反应。在分开的反应中扩增轻链和重链可变区。使用与靶抗体表达载体有25bp交叠的PCR引物。使用96ExtractII试剂盒(Macherey&Nagel)纯化PCR产物。
测序和SLIC克隆
对PCR产物测序以测定重和轻链可变区DNA序列。通过所谓的SLIC克隆方法将PCR产物克隆入表达载体中，所述方法记载于Haun，R.S.，etal.，inBioTechniques13(1992)pp.515-518和Li，M.Z.，etal.，inNatureMethods4(2007)pp.251-256。通过限制酶消化将用于抗体表达的质粒线性化。通过制备性琼脂糖电泳纯化并自凝胶提取(Qiaquick凝胶提取试剂盒/Qiagen)线性化质粒。将经过纯化的质粒添加至使用交叠引物(bay25bp)的PCR方案以克隆PCR产物。在dNTP缺失下用T4DNA聚合酶(RocheAppliedSciences)处理载体和插入物二者以生成悬垂，然后将载体和插入物与RecA(NewEnglandBiolabs)蛋白质和ATP一起温育以促进重组。将产物转化入大肠杆菌中。分离轻链和重链的质粒DNA，并组合每一对进行瞬时转染。
HEK293细胞中为了抗体表达的瞬时转染
让HEK293细胞(Invitrogen)在F17培养基(Gibco)生长至1x106个细胞/ml。用在293-free(Novagen)和(Gibco)中悬浮的1μgHC+LC质粒转染2x106个HEK293细胞。温育7天后，收获上清液，经蛋白A纯化，并分析。
实施例25：自免疫接种衍生的DR5抗体的筛选
在384孔微量滴定板中通过多重平行基于ELISA的结合测定法筛选B细胞培养上清液。选择结合DR5表达性细胞G401和生物素化重组人DR5(单体Fc融合物)和猕猴DR5(二聚体Fc融合物)，但不结合人DR4(TNFRSF10A；R&DSystems产品目录号347-DR-100)和人IgG1的抗体作为主要命中。在二级筛选中，再次对经过微量纯化的在HEK细胞中重组表达的抗体测试对人和猕猴DR5的结合和另外对人DR4，人DcR1(内部)，人DcR2(内部)或人护骨蛋白(OPG；R&DSystems产品目录号805-05-100)的结合的缺失。另外，在功能性凋亡测定法(细胞死亡检测ELISA)中在G401细胞上在交联性抗人Fc抗体存在或缺失下测试抗体。只选择那些能够在Fc介导的交联后(但在其缺失下不)诱导凋亡的抗体进行进一步表征和开发。
通过可变轻和可变重链的亚克隆和重测序验证了在二级筛选后选择的和通过SLIC克隆规程在表达质粒中克隆的抗体的序列。
然后将这些亚克隆且经过序列验证的表达质粒用于更大规模的HEK293F细胞瞬时转染，接着是蛋白A纯化，容许进一步的更加加强的表征步骤。
实施例26：自免疫接种衍生的DR5抗体结合特性的表征
通过结合ELISA和SPR分析对选定的来自家兔免疫接种的DR5抗体表征它们的结合特性，物种交叉反应性和特异性。
单克隆抗体对TRAIL结合受体的结合(免疫测定法)
于室温在384孔链霉亲合素包被微量滴定板(MicroCoatBiotechnologieGmbH)上用补充有0.05％-20和0.5％BSA(RocheDiagnosticsGmbH)的PBS缓冲液实施抗原结合免疫测定法。将125ng/ml生物素化人DR5(单体Fc融合物)蛋白质(内部)或63ng/ml生物素化hFc猕猴DR5蛋白质(内部)或63ng/ml生物素化DcR2(TNFRSF10D)蛋白质(内部)添加至装有1:3000稀释的抗家兔Fc-HRP缀合物(GEHealthcare)和1:50稀释的B细胞上清液的混合物的孔。温育90分钟后，将板用PBST(含0.2％-20的磷酸盐缓冲盐水)清洗6次，并用BMHRP底物溶液(BM3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，RocheDiagnosticsGmbH)于室温显色30分钟。测量370nm处的吸光度。不添加上清液定义空白值。
对于针对免疫原的hFc标签的负选择，使用用来自JacksonImmunoResearch(产品目录号109-066-006)的生物素化抗人IgG(对Fab特异性的)，人IgG1(内部)和抗家兔Fc-HRP缀合物的混合物进行的免疫测定法，并如描述的那样加工。为了测试对相关Trail结合性受体像人DR4(TNFRSF10A；R&DSystems产品目录号347-DR-100)，人护骨蛋白(OPG；R&DSystems产品目录号805-05-100)和人DcR1(TNFRSF10C；R&DSystems产品目录号630-TR-100)的结合，通过在MaxiSorp384孔微量滴定板(Sigma-Aldrich，Nunc)上用抗人Fc抗体(JacksonImmunoResearch，产品目录号109-006-098)捕捉相应蛋白质–hFc嵌合物，建立了免疫测定法。
表22：通过免疫接种衍生的DR5抗体(家兔IgG)对人DR5(单体Fc融合物)和猕猴DR5的结合，如通过生化ELISA检测的(EC50[ng/ml])。没有检测到显著的对小鼠DR5，人DR4，DcR1，DcR2，和护骨蛋白的结合(数据未显示)
选定的来自家兔免疫接种的DR5抗体在ELISA中显示较好的且相当的对人和猕猴DR5的结合特性，同时它们不识别鼠DR5。所有选定抗体是对DR5高度特异性的，它们在对人DR4，DcR1，DcR2，和护骨蛋白的结合ELISA中没有给出显著信号。
DR5动力学亲和力
通过使用GEHealthcare的胺偶联试剂盒于pH5.0在CM5芯片(GEHealthcare，BR-1005-30)上偶联3000-5000个共振单位(RU)左右的捕捉系统(10μg/ml山羊抗家兔；定购代码JIR111-005-046；JacksonImmunoResearch)。样品和系统缓冲液为PBS-T(包括0.05％Tween20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH7.4。将流动室设定为25℃，将样品块设定为12℃，用运行缓冲液引发两次。
通过以10μl/min的流速注射1μg/ml溶液30秒来捕捉DR5抗体。通过以溶液中的多种浓度以30μl/min的流速注射重组人DR5(单体His-Avi融合蛋白，内部)120秒来测量结合，始于100nM，以1:3稀释，降至0.41nM。监测解离阶段多至300秒，并通过自样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过用100mMH3PO4(磷酸)溶液以30μl/min的流速清洗60秒来再生表面。通过减去自空白表面获得的响应来修正散装折射率差异。还减去缓冲液注射(＝双重参照)。为了计算KD和其它动力学参数，使用Langmuir1:1模型。
表23：通过免疫接种衍生的DR5抗体(家兔IgG)的动力学亲和力
实施例27：自免疫接种衍生的DR5抗体的功能表征
DNA片段化和细胞存活力
通过评估在交联性抗体存在或缺失下用抗DR5抗体处理后的凋亡和细胞存活力来功能表征DR5抗体，分别如通过细胞死亡检测ELISA(CDDE，Roche，#11774425001)和CellTiterGlo(CTG，Promega，#G7573)测量的。
制备细胞：在补充有10％胎牛血清(Gibco)和2mML-谷氨酰胺(PAA)的DMEM培养基(PAN)中培养贴壁MDA-MB-231细胞系(人乳腺腺癌)，并每周两次1:10正常分瓶。对于测定法，用PBS清洗细胞，用Accutase(PAA)自烧瓶解离，以50μl以1x104个细胞/孔(CDDE)或0.25x104个细胞/孔(CTG)的密度在96孔平底微量滴定板(Costar)中接种，并于37℃，5％CO2温育过夜。
家兔抗DR5抗体诱导凋亡：在PBS中以50μl以不同浓度单独地或以1:1比率与交联性抗体(山羊抗家兔IgG，JacksonImmunoresearch)一起将样品(家兔抗DR5IgG，DR5-TAA-#)添加至细胞，用于诱导DR5受体交联，导致凋亡。将细胞于37℃温育24小时(CDDE)或48小时(CTG)。
A)细胞死亡检测ELISA(CDDE)：依照制造商的说明书(Roche)实施免疫测定法。简言之，小心吸出上清液，并于室温用200μl/孔裂解缓冲液裂解细胞30分钟。依照制造商的说明书制备由抗组蛋白和抗DNA抗体组成的预混合物，并在96孔链霉亲合素包被平底微量滴定板(Roche)上与1:4稀释的裂解物混合。于室温温育2小时后，清洗孔，添加ABTS底物，并于室温温育直至显色足以进行光度法分析(10-30分钟)。用TecanSpectraRainbowReader读取405nm处的吸光度。
图35显示这项实验的结果：生成的家兔抗DR5抗体能够以不同效力诱导MDA-MB231细胞凋亡，但是总是以剂量依赖性方式且只在Fc介导的DR5分子交联之后。在抗家兔Fc特异性二抗缺失下，没有检测到显著的细胞死亡。
B)CellTiterGlo(CTG)：依照制造商的说明书(Promega)实施免疫测定法。简言之，首先在含有发光底物的缓冲液(100μl)中裂解细胞。在摇床上的10分钟温育期后，用TECANInfinitePlusreader测量发光。
图36显示这项实验的结果：抗DR5抗体在受体超聚簇后以剂量依赖性方式降低细胞存活力。生成的家兔抗DR5抗体能够以不同效力降低MDA-MB231细胞的存活力，但是总是以剂量依赖性方式且只在Fc介导的DR5分子交联之后。在抗家兔Fc特异性二抗缺失下，细胞存活力在任何抗体浓度不受影响。
细胞存活力和胱天蛋白酶8活化
依照制造商的说明书进行胱天蛋白酶8-Glo胱天蛋白酶8活化测定法(Promega，产品目录号G8202)和CellTiter-Glo细胞存活力测定法(Promega，产品目录号TB288)。
对于胱天蛋白酶8活化测定法，在不透明白色96孔板(BDFalcon产品目录号BD353296)中以75μl每孔接种10,000个癌细胞，并于37℃及5％CO2温育过夜。然后以6个连续稀释度与抗家兔Fc抗体一起添加抗DR5抗体(等摩尔浓度的DR5和家兔Fc抗体，以25μl)。于37℃及5％CO2在细胞上温育抗体3小时。然后将100μl裂解缓冲液中的胱天蛋白酶8底物添加至每个孔并混合孔。于37℃温育另30分钟后，在SpectraMaxM5板读数仪中读取发光信号。
对于细胞存活力测定法，在黑色/透明底96孔板(BDFalcon产品目录号BD353220)中每孔接种4,000个癌细胞，并于37℃及5％CO2温育过夜。然后以6个连续稀释度与抗家兔Fc抗体一起添加抗DR5抗体(等摩尔浓度的DR5和家兔Fc抗体，以25μl)。于37℃及5％CO2在细胞上温育抗体48小时。然后将100μlCellTiter-Glo试剂添加至每个孔并混合孔。于室温温育另10分钟后，在SpectraMaxM5板读数仪中读取发光信号。
图37显示用浓度为7nM的不同的交联的DR5抗体处理后三种不同人肿瘤细胞(DLD-1，NCIH460和MDA-MB-231)的细胞增殖抑制(CellTiterGlo测定法)的分析。图38显示用浓度为7nM的交联的DR5抗体处理后三种人肿瘤细胞系(DLD-1，NCIH460和MDA-MB-231)中通过胱天蛋白酶8活化测量的凋亡诱导。所有测试的DR5抗体在所有测试的肿瘤细胞系中均诱导高胱天蛋白酶8活化。DR5抗体能够以不同效力降低所有测试的细胞系的存活力。
实施例28：通过噬菌体展示和免疫接种衍生的DR5抗体的化学稳定性的评估
生成加压DR5抗体样品
为了测试DR5抗体的化学稳定性，生成了加压样品并就DR5结合而言进行功能表征。高pH压力诱导反应性Asn热点的脱酰胺等等，而在pH6.0例如可诱导自反应性Asn和Asp残基形成琥珀酰亚胺。对于高pH压力，将样品转移入20mM磷酸Na盐，pH8.0，并于40℃温育5天。对于低pH压力，将样品转移入20mMHis/HisCl，140mMNaCl，pH6.0，并于40℃温育3周。将对照样品保持于-80℃。
加压DR5抗体样品的相对活性浓度的测定
通过使用GEHealthcare的胺偶联试剂盒于pH5.0在CM5芯片(GEHealthcare，BR-1005-30)上偶联5000个共振单位(RU)左右的捕捉系统(20μg/ml山羊抗家兔；定购代码JIR111-005-046；JacksonImmunoResearch)。样品和系统缓冲液为PBS-T(包括0.05％Tween20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH7.4。将流动室的温度设定为25℃，将样品块的温度设定为12℃。在捕捉之前，将流动室用运行缓冲液引发两次。
通过以10μl/min的流速注射50nM溶液60秒来捕捉双特异性抗体。通过以30μl/min的流速注射溶液中浓度为200nM的人DR590秒来测量结合。监测解离阶段多至90秒，并通过自样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过用0.85％H3PO4(磷酸)溶液以30μl/min的流速清洗60秒来再生表面。通过减去自空白表面获得的响应来修正散装折射率差异。
加压抗体的相对活性浓度为自捕捉水平和结合水平计算的比率(RU结合除以RU捕捉，与未加压参照样品比较)。
图39显示用于测定加压DR5抗体样品的相对活性浓度的一条例示性响应曲线。图40和41显示自免疫接种和自噬菌体展示衍生的初始和加压DR5抗体的相对活性浓度。在分别于pH6和pH8加压后显示略微降低的相对活性浓度的抗体DR5TAA-0013和DR5TAA-0010以外，所有其它DR5抗体在pH加压后均没有显示相对活性浓度的任何有关降低。
实施例29：共培养测定法中2+2双特异性型式的通过免疫接种和噬菌体展示衍生的DR5结合物的功能表征
为了评估通过免疫接种衍生的新颖的DR5结合物是否可用于生成通过DR5超交联靶向诱导肿瘤细胞凋亡的双特异性抗体，将一组DR5抗体与FAP抗体28H1组合转变成2+2双特异性分子(如图18A中所示)。在共培养测定法中对双特异性构建体测试它们的凋亡诱导活性。
在96孔板中接种DLD-1或H460肿瘤细胞(10,000个细胞/孔)，以150μl的总体积与3T3细胞或经转染而表达鼠FAP的3T3细胞(2,500个细胞/孔)共培养，容许每种处理一式三份样品。24小时后，将细胞用50μl抗体(4X浓度)处理24小时(未处理对照：50μl培养基)。
细胞死亡检测ELISA(RocheAppliedScience产品目录号11774425001)：完全如制造商的方案所述遵循规程。自10分钟里每分钟的405nm处吸光度的测量(减去490nm处的参照波长值)外推Vmax值。自所有样品减去一式三份背景值(单独的裂解缓冲液)的平均值。数据表述成超出未处理样品中的凋亡的倍数升高。
图43显示在共培养测定法中DLD-1和H460肿瘤细胞系中2+2双特异性构建体所致的凋亡诱导，如通过DNA片段化检测的。虽然含有Drozitumab作为DR5结合构件的双特异性构建体在FAP缺失下就诱导凋亡，但是所有含有通过免疫接种衍生的新的DR5结合物的构建体均只在FAP存在下诱导凋亡。具有新开发的DR5结合物，诸如0011-28H1和0016-28H1的构建体能够以与含有Drozitumab的双特异性构建体相比更高的程度诱导凋亡，尤其在低浓度。
实施例30：2+2双特异性型式的通过免疫接种和噬菌体展示衍生的DR5结合物的细胞结合的表征
将细胞用染色缓冲液(PBS+5％FCS)中的24μg/ml每一种DR5-FAP构建体或Drozitumab在冰上染色1小时(5x104/50μl)。清洗两次后，以10μg/ml添加二抗山羊抗人IgG-AF488(Invitrogen，#A11013)，并再次将细胞在冰上避免直射光温育1小时。另两个清洗步骤后，在FACSCanto上测量细胞。
所有测试的构建体显示不同强度的对MDA-MB-231的结合(见图44)。
实施例31：通过免疫接种衍生的DR5抗体的VH和VL域的人源化
使用与人种系序列相同的框架人源化家兔DR5结合性抗体DR5TAA-0011。人种系序列hVH_3_64(GenBank登录号M99682)和hVH3_16(GenBank登录号P01767)是用于VH人源化变体的2种受体，而人种系序列hVK1_93(登录号P04431)和hVK1_5(GenBank登录号P01602)是用于VL人源化的受体。获得了八种包含选自SEQIDNO.:23和26的重链可变区构建体和选自SEQIDNO24，29，30，31，和32的轻链可变区构建体的人源化DR5抗体，用于进一步表征(实施例27至29)。
表24：通过免疫接种衍生的人源化DR5结合物
变体 HC变体 SEQ ID NO. LC变体 SEQ ID NO.
DR5TAA-0066 VH7 23 VL3 30
DR5TAA-0067 VH7 23 VL15 24
DR5TAA-0068 VH17 26 VL10 31
DR5TAA-0071 VH17 26 VL15 24
DR5TAA-0072 VH17 26 VL2 32
DR5TAA-0073 VH17 26 VL3 30
DR5TAA-0074 VH7 23 VL10 31
DR5TAA-0075 VH7 23 VL11 29
实施例32：通过免疫接种衍生的人源化DR5结合物的功能表征
通过评估在交联性抗体存在或缺失下用人源化抗DR5抗体处理后的凋亡来功能表征人源化DR5抗体，如通过细胞死亡检测ELISA测量的(CDDE，Roche，#11774425001)。
制备细胞：在补充有10％胎牛血清(Gibco)和2mML-谷氨酰胺(PAA)的DMEM培养基(PAN)中培养贴壁MDA-MB-231细胞系(人乳腺腺癌)，并每周两次1:10正常分瓶。对于测定法，用PBS清洗细胞，用Accutase(PAA)自烧瓶解离，以50μl以1x104个细胞/孔(CDDE)的密度在96孔平底微量滴定板(Costar)中接种，并于37℃，5％CO2温育过夜。
人源化抗DR5抗体诱导凋亡：在PBS中以50μl以不同浓度单独地或以1:1比率与交联性抗体(山羊抗人IgG，Sigma，#I2136)一起将样品(人源化抗DR5IgG，DR5-TAA-#)添加至细胞，用于诱导DR5受体交联，导致凋亡。将细胞于37℃温育24小时(CDDE)。
细胞死亡检测ELISA(CDDE)：依照制造商的说明书(Roche)实施免疫测定法。简言之，小心吸出上清液，并于室温用200μl/孔裂解缓冲液裂解细胞30分钟。依照制造商的说明书制备由抗组蛋白和抗DNA抗体组成的预混合物，并在96孔链霉亲合素包被平底微量滴定板(Roche)上与1:4稀释的裂解物混合。于室温温育2小时后，清洗孔，添加ABTS底物，并于室温温育直至显色足以进行光度法分析(10-30分钟)。用TecanSpectraRainbowReader读取405nm处的吸光度。将凋亡信号针对浓度为2μg/ml的嵌合抗DR5抗体的凋亡标准化。
图45中显示结果：A.DR5TAA-0011的人源化变体(DR5TAA-0066–DR5TAA-0075，黑色线)在用二抗交联后以剂量依赖性方式诱导凋亡。数种人源化变体，诸如DR5TAA-0067，DR5TAA-0071，DR5TAA-0074和DR5TAA-0075，能够以关于最大诱导和剂量依赖性与嵌合变体(DR5TAA-0052，灰色线)相比相似的方式诱导凋亡。B.DR5TAA-0011的人源化变体(DR5TAA-0066至DR5TAA-0075)在没有通过二抗交联的情况下不诱导凋亡。如此，人源化变体也适合以双特异性型式用于只在FAP存在下特异性诱导凋亡。
经(G4S)4连接头将选定人源化变体的Fab融合至人Fc区的C末端。在HEK293EBNA细胞中瞬时生成这些分子，经蛋白A珠纯化，并在凋亡诱导测定法中测试。在图22b)中汇总了使用这些Fc-DR5融合物分子，用二级抗FcIgG交联后，MDA-MB-231细胞中的DNA片段化测定法的结果。所有测试的分子均能够诱导靶细胞系凋亡，指示选择的DR5结合物的N末端没有被封闭，这打开了广泛的型式能用于这些结合物。
实施例33：通过免疫接种衍生的人源化DR5结合物的结合亲和力的表征
通过SPR分析对人源化DR5结合物表征它们的结合亲和力。BIAcore表征：与封固入系统中的CM5传感器一起使用BIAcore3000仪器(GEHealthcare)。通过以100μl/min注射0.1％SDS，50mMNaOH，10mMHCl和100mMH3PO4达1分钟，将传感器预条件化。系统缓冲液为10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，0.05％TWEEN20。样品缓冲液为补充有1mg/mL羧甲基右旋糖苷(Sigma)的系统缓冲液。在生物传感器表面上建立了抗人抗体捕捉系统。依照制造商的说明书使用EDC/NHS化学固定化8000个相对响应单位的山羊抗人Fcγ片段特异性多克隆抗体(JacksonLaboratories)。使用1M乙醇胺将传感器解活化。
以10μl/min的流速捕捉20nM相应抗体样品1分钟。作为参照，在参照流动室1上捕捉20nM多克隆人正常IgG(Roche，Ident.11717570)，并监测减去的信号。
在一个实施方案中，以浓度系列0nM，3.3nM，11nM，2x33nM，100nM和300nM以30μl/min注射23.3kDa分析物DR53分钟结合时间。监测复合物解离5分钟。
通过以30μl/min注射10mM甘氨酸缓冲液pH1.5达1分钟，继以连续两次注射10mM甘氨酸缓冲液pH1.7达1分钟来再生系统。使用Biacore评估软件依照制造商的说明书评估动力学参数。
依照Langmuir模型用RMAXglobal计算结合速率常数ka(1/Ms)，解离速率常数kd(1/s)和解离常数KD。
表25：DR5TAA-0011的人源化变体(DR5TAA-0067至DR5TAA-0075)的对单体人DR5的动力学亲和力，与DR5TAA-0011的嵌合形式(DR5TAA-0052)比较
构建体 SEQ ID No VH/VL ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
DR5TAA-0067 23/24 2.6E05 5.2E-03 20
DR5TAA-0074 23/31 2.7E05 5.6E-03 21
DR5TAA-0071 26/24 3.0E05 4.6E-03 15
DR5TAA-0075 23/29 3.2E05 5.6E-03 17
DR5TAA-0052 90/92 3.5E05 2.4E-03 7
与嵌合变体相比，人源化变体的动力学结合特性对于KD和kd维持在大约3的因数内，对ka维持在大约2的因数内。
实施例34：通过免疫接种衍生的人源化DR5结合物的热和化学稳定性的表征
对人源化DR5结合物表征它们的热和化学稳定性。在20mM组氨酸/盐酸组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中以1mg/mL的浓度制备样品，经由0.4μm滤板通过离心转移入光学384孔板中，并覆盖石蜡油。在以0.05℃/min的速率自25℃至80℃加热样品时通过动态光散射重复测量流体力学半径。聚集启动温度定义为流体力学半径开始增大时的温度。
表26：DR5TAA-0011的人源化变体(DR5TAA-0066-DR5TAA-0075)的聚集启动温度，作为抗体的热稳定性的测量。
构建体 SEQ ID No VH/VL Tagg[℃]
DR5TAA-0071 26/24 71
DR5TAA-0067 23/24 70
DR5TAA-0074 23/31 68
DR5TAA-0073 26/30 72
DR5TAA-0068 26/31 69
DR5TAA-0072 26/32 71
DR5TAA-0066 23/30 71
DR5TAA-0075 23/29 68
DR5TAA-0011的人源化变体揭示高热稳定性，聚集温度为68℃和更高。
化学稳定性
生成加压DR5抗体样品：为了测试DR5抗体的化学稳定性，生成了加压样品并就DR5结合而言进行功能表征。高pH压力诱导反应性Asn热点的脱酰胺等等，而在pH6.0例如可诱导自反应性Asn和Asp残基形成琥珀酰亚胺。对于高pH压力，将样品转移入20mM磷酸Na盐，pH8.0，并于40℃温育5天。对于低pH压力，将样品转移入20mMHis/HisCl，140mMNaCl，pH6.0，并于40℃温育3周。将对照样品保持于-80℃。
加压DR5抗体样品的分析：与封固入系统中的CM5传感器一起使用BIAcore3000仪器(GEHealthcare)。通过以100μl/min注射0.1％SDS，50mMNaOH，10mMHCl和100mMH3PO4达1分钟，将传感器预条件化。系统缓冲液为10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，0.05％TWEEN20。样品缓冲液为补充有1mg/mL羧甲基右旋糖苷(Sigma)的系统缓冲液。在生物传感器表面上建立了抗人抗体捕捉系统。依照制造商的说明书使用EDC/NHS化学固定化8000个相对响应单位的山羊抗人Fcγ片段特异性多克隆抗体(JacksonLaboratories)。使用1M乙醇胺将传感器解活化。
以10μl/min的流速捕捉20nM相应抗体样品1分钟。作为参照，在参照流动室1上捕捉20nM多克隆人正常IgG(Roche，Ident.11717570)，并监测减去的信号。
在另一个实施方案中，以0nM和500nM以100μl/min注射分析物2分钟结合时间。监测复合物解离5分钟。
表27：压力测试之前和之后DR5TAA-0011的人源化变体的相对活性浓度
通过以30μl/min注射10mM甘氨酸缓冲液pH1.5达1分钟，继以连续两次注射10mM甘氨酸缓冲液pH1.7达1分钟来再生系统。使用Biacore评估软件依照制造商的说明书评估动力学参数。
依照公式ln(2)/(60*kd)以分钟计算抗体/抗原复合物半衰期。计算摩尔比：MW(抗体)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗体)。
抗体注射结束前不久(抗体捕捉水平，CL)以及分析物注射前不久(结合晚，BL)记录数据报告点。使用捕捉水平(CL)和结合晚(BL)响应信号高度来表征抗体结合性能。计算相对结合商BL/CL。自抗体样品较之非压力影响抗体样品的相对结合商(相对活性结合)形成商。
表27中显示结果。对DR5TAA-0011的人源化变体进行压力测试。人源化变体无一显示与非加压初始材料相比受损的对人DR5的结合。
实施例35：材料和方法
除非另外提及，上文所述实验中使用下述材料和方法。
重组DNA技术
如Sambrook，J.etal.，Molecularcloning：Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989中所述使用标准重组DNA技术生成所有抗体和抗原表达载体。依照制造商的推荐使用分子生物学试剂。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增或在GeneartAG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成自合成寡核苷酸生成基因或基因片段。通过DNA测序(SynergeneGmbH，Switzerland)确认PCR扩增的或亚克隆的DNA片段。将质粒DNA转化入合适的大肠杆菌宿主菌株并在其中扩增，用于使用标准Maxiprep试剂盒(Qiagen)制备转染级质粒DNA。为了生成双特异性分子，使用标准的基于聚乙烯亚胺(PEI)的方法用编码相应基因的质粒转染HEK293EBNA细胞。所使用的三种表达载体的质粒比为1:1:1。培养经过转染的细胞7天，之后收获上清液进行纯化。
转染HEK293EBNA细胞
在HEK293EBNA细胞中瞬时生成本文中使用的所有(双特异性)抗体和抗原(如果不是自商业来源获得的话)，对于下文所述要求的载体使用PEI介导的转染规程。
在CDCHO培养基中无血清悬浮培养HEK293-EBNA细胞。对于500ml摇瓶中的生成，转染前24小时接种400x106个HEK293-EBNA细胞。对于转染，将细胞以210xg离心5分钟，用预温热的20mlCDCHO培养基替换上清液。在20mlCDCHO培养基中混合表达载体至200μgDNA的最终量。添加540μlPEI后，将溶液漩涡震动15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育时间后，添加160mlF17培养基，并培养细胞24小时。转染后1天，添加1mM丙戊酸和7％补料1。7天后，通过以210xg离心15分钟来收集培养上清液进行纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，添加终浓度为0.01％w/v的叠氮化钠，并保存于4℃。生成后，收获上清液，经由0.22μm无菌滤器过滤含有抗体的上清液，并贮藏于4℃直至纯化。
纯化：标准+蛋白A珠
通过HEK293EBNA细胞中的瞬时表达来生成蛋白质。使用标准规程以两个步骤纯化所有本文所述双特异性分子，诸如蛋白A亲和层析(Explorer)和大小排阻层析(Superdex200)。
将上清液调节至pH8.0(使用2MTRISpH8.0)并应用至在TricornTM5/50柱(GEHealthcare，柱体积(cv)＝1ml)中装填的，用缓冲液A(50mM磷酸钠，pH7.0，250mMNaCl)平衡的MabselectSure树脂(GEHealthcare)。通过用至少5个柱体积(CV)的缓冲液A清洗来去除未结合的蛋白质。以12个CV上0-100％缓冲液B(50mM磷酸钠，pH7.0，1MNaCl)的线性pH梯度洗脱感兴趣蛋白质。最后，包括10个CV的缓冲液B的另一个步骤，继以5个CV的缓冲液A的平衡步骤。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并将pH逐渐调节至pH6.0(使用2MTRISpH8.0)。使用Ultra-Concentrator(Vivaspin15R30.000MWCOHY，Sartorius)将样品浓缩至0.5-2ml，随后应用至用20mM组氨酸，pH6.0，140mMNaCl，0.01％Tween-20平衡的HiLoadTM16/60SuperdexTM200制备级柱(GEHealthcare)。于25℃使用在25mMK2HPO4，125mMNaCl，200mML-一盐酸精氨酸，0.02％(w/v)NaN3，pH6.7中平衡的TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析洗脱级分的聚集体含量。合并含有少于2％寡聚物的级分，并使用ultraconcentrator(Vivaspin15R30.000MWCOHY，Sartorius)浓缩至1-1.5mg/ml的终浓度。将经过纯化的蛋白质在液氮中冷冻并贮藏于-80℃。
对于快速且高通量纯化，使用1/40个柱的2MTris-HClpH8中和上清液，并与蛋白ASepharose快流珠(GEHealthcare产品目录号17-5138-01)一起于4℃颠倒(endoverend)温育19小时。然后通过重力流让上清液/珠混合物通过空的经过平衡的PD-10柱(GEHealthcare产品目录号17-0435-01)。将保留的珠用结合缓冲液(10mMTris，50mM甘氨酸，100mMNaCl，pH8.0)清洗两次，并以低pH步骤(10mMTris，50mM甘氨酸，100mMNaCl，pH2.5)洗脱抗体。最后，通过添加1/40体积的2MTris-HClpH8.0来中和洗脱的蛋白质。自于280nm测量的吸光度和自氨基酸序列计算的摩尔消光系数计算经过纯化的抗体的蛋白质浓度。于25℃使用在运行缓冲液(200mM磷酸钠，0.02％叠氮化钠pH7.0)中平衡的ZorbaxGF-250分析性大小排阻柱(Agilent产品目录号PSMO845006)分析抗体样品的聚集体含量。
FACS结合分析
在实施凋亡测定法之前对所有使用的靶细胞系分析肿瘤相关抗原和DR5死亡受体的相对表达水平。
测定细胞的数目和存活力。为此，用细胞解离缓冲液(Gibco-Invitrogen，#13151-014)解离贴壁生长的细胞。通过离心(4min，400xg)来收获细胞，用FACS缓冲液(PBS/0.1％BSA)清洗，并在FACS缓冲液将细胞数目调节至1.111x106个细胞/ml。96孔圆底板的每个孔使用180μl此细胞悬浮液，导致2x105个细胞每孔。将细胞与适宜稀释度的一抗一起于4℃温育30分钟。然后通过离心(4min，400xg)来收获细胞，完全去除上清液，并将细胞用150μlFACS缓冲液清洗一次。将细胞在12μl稀释的二抗(在使用未标记一抗的情况中)或FACS缓冲液中在黑暗中于4℃重悬浮30分钟。两个FACS缓冲液的清洗步骤之后，在200μlFACS缓冲液中重悬浮细胞，并在HTSFACSCantoII(BD，SoftwareFACSDiva)中分析。或者，可以将细胞用200μl含2％PFA(低聚甲醛)的FACS缓冲液于4℃固定20分钟，稍后分析。一式三份实施所有测定法。
表28：用于FACS结合分析的抗体和浓度
Biacore分析(表面等离振子共振，SPR)
通过表面等离振子共振(SPR)评估多种抗DR5结合物作为IgG或以双特异性型式的结合。于25℃用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)在BiacoreT100上实施所有SPR实验。
为了测定DR5结合物的物种交叉反应性，以各大约300RU的固定化水平将生物素化的来自小鼠，人和猕猴的DR5直接偶联至链霉亲合素(SA)传感器芯片的不同流动室。以30μl/min的流速以500，100和25nM的浓度将多种DR5结合物作为IgG注射60秒，接着是90秒解离期。通过减去在未固定化蛋白质的参照流动室上获得的响应来修正散装折射率差异。
在第二项实验中，通过胺偶联将huDR4Fc，huDcR1Fc，huDcR2Fc和rhuOPGFc固定化至CM5传感器芯片，由此测定DR5结合物的特异性。固定化水平介于100和400RU之间。以30μl/min的流速以500，100和25nM的浓度使每种结合物通过不同流动室60秒，并监测解离期90秒。通过减去在未固定化蛋白质的参照流动室上获得的响应来修正散装折射率差异。
并且，在固定化有人和猕猴DR5ECD(固定化水平在100RU左右)的CM5芯片上测量IgG以及2+2型式的亲合力。以30μl/min以1:2稀释步骤的500-0.97nM的浓度使每种构建体或IgG通过不同流动室90秒。分析解离120秒。通过减去在未固定化蛋白质的参照流动室上获得的响应来修正散装折射率差异。使用BiacoreT100评估软件(vAA，BiacoreAB，Uppsala/Sweden)计算动力学常数，用于作为动力学分析或稳态分析通过数值积分来拟合1:1Langmuir结合的速率方程。
使用捕捉型式评估亲和力，其中使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/Germany)于pH5.0在CM5芯片上直接偶联抗人Fab或抗人Fc抗体(Biacore，Freiburg/Germany)。固定化水平为约8,000-10,000RU。以30μl/min的流速分别以50或30nM的浓度捕捉IgG或2+2型式的DR5结合物60秒。对2+2型式以30μl/min以1:2稀释步骤以500-0.975nM(猕猴DR5)或1000-0.975nM(huDR5)的浓度范围进行120秒注射人或猕猴DR5。IgG的亲和力只对huDR5以1:3稀释步骤在2000-20nM的浓度测量。在120秒的时段上评估解离。通过减去在未固定化蛋白质的参照流动室上获得的响应来修正散装折射率差异。使用BiacoreT100评估软件(vAA，BiacoreAB，Uppsala/Sweden)计算动力学常数，用于作为动力学分析或稳态分析通过数值积分来拟合1:1Langmuir结合的速率方程。
以两种不同型式(一种经典的三明治式测定法或一种串联办法)测量表位结合。在经典三明治式测定法中，通过胺偶联每种DR5结合物以500RU左右的靶物固定化水平直接固定化至CM5芯片表面上的一个流动室。随后，以500nM的浓度使huDR5通过每个流动室60秒(流速30μl/min)，接着以30nM的浓度注射另一种DR5结合物60秒(流速30μl/min)。以相同的流速在60秒的时段上监测解离。使用注射与固定化的DR5结合物相同的DR5结合物作为对照，因为如果所有DR5得到固定化的结合物结合，那么这不应导致响应升高。
在串联办法中，以250RU的终响应在CM5芯片上固定化huDR5ECD。然后以20nM的浓度使第一种DR5结合物通过流动室90秒，接着注射第二种DR5结合物90秒。在90秒的时段上监测解离。所有步骤的流速为30μl/min。如果两种结合物识别不同表位，那么能观察到响应单位的升高。使用注射相同DR5结合物作为对照来确认所有DR5分子通过第一次注射得到饱和且不会发生对相同表位的额外结合。
为了进一步确定任何结合物是否是配体阻断性的，通过胺偶联以2000RU的固定化水平在CM5芯片上固定化rhuTRAIL(Peprotech产品目录号310-04)。使huDR5Fc或huDR5ECD与每种要测试的DR5结合物复合(100nMDR5与500nMIgG)，并以50μl/min的流速使复合物通过流动室90秒。在120秒的时段上评估解离。另外，使用一种经典的三明治式测定法，其中首先以100nM注射huDR5Fc或huDR5ECD，接着以500nM注射每种DR5结合物。接触时间为60秒(对于DR5)和90秒(对于IgG)，流速30μl/min。解离步骤进行90秒。认为能在DR5以外结合TRAIL的结合物是非配体阻断性的，而没有显示任何额外结合的结合物是配体阻断性的。
在含有固定化的huDR5Fc生物素(固定化水平1000RU左右)的SA芯片上确认2+2型式的多种DR5结合物的同时结合。第一步，将2+2构建体注射90秒，接着以500或100nM的浓度将人或鼠FAP注射90秒。监测解离60秒。所有步骤的流速为30μl/min。如果在注射人或鼠FAP后观察到响应单位的额外升高，那么认为同时结合是真实的。
以两种不同型式(一种经典的三明治式测定法或一种串联办法)测量表位结合。在经典三明治式测定法中，通过胺偶联每种DR5结合物以500RU左右的靶物固定化水平直接固定化至CM5芯片表面上的一个流动室。然后，以500nM的浓度使huDR5通过每个流动室60秒(流速30μl/min)，接着以30nM的浓度注射另一种DR5结合物60秒(流速30μl/min)。以相同的流速在60秒的时段上监测解离。使用注射与固定化的DR5结合物相同的DR5结合物作为对照，因为如果所有DR5得到固定化的结合物结合，那么这不应导致响应升高。
在串联办法中，以250RU的终响应在CM5芯片上固定化huDR5ECD。然后以20nM的浓度使第一种DR5结合物通过流动室90秒，接着注射第二种DR5结合物90秒。在90秒的时段上监测解离。所有步骤的流速为30μl/min。如果两种结合物识别不同表位，那么能观察到响应单位的升高。使用注射相同DR5结合物作为对照来确认所有DR5分子通过第一次注射得到饱和且不会发生对相同表位的额外结合。
为了进一步确定任何结合物是否是配体阻断性的，通过胺偶联以2000RU的固定化水平在CM5芯片上固定化rhuTRAIL(Peprotech产品目录号310-04)。使huDR5Fc或huDR5ECD与每种要测试的DR5结合物复合(100nMDR5与500nMIgG)，并以50μl/min的流速使复合物通过流动室90秒。在120秒的时段上评估解离。另外，使用一种经典的三明治式测定法，其中首先以100nM注射huDR5Fc或huDR5ECD，接着以500nM注射每种DR5结合物。接触时间为60秒(对于DR5)和90秒(对于IgG)，流速30μl/min。解离步骤进行90秒。认为能在DR5以外结合TRAIL的结合物是非配体阻断性的，而没有显示任何额外结合的结合物是配体阻断性的。
在含有固定化的huDR5Fc生物素(固定化水平1000RU左右)的SA芯片上确认2+2型式的多种DR5结合物的同时结合。第一步，将2+2构建体注射90秒，接着以500或100nM的浓度将人或鼠FAP注射90秒。监测解离60秒。所有步骤的流速为30μl/min。如果在注射人或鼠FAP后观察到响应单位的额外升高，那么认为同时结合是真实的。
DNA片段化ELISA
为了测定诱导的凋亡，使用来自Roche的细胞死亡检测ELISAPLUS试剂盒。简言之，在96孔板的每个孔中在200μl适宜培养基中接种104个FAP表达性GM05389细胞(解离，并测定细胞数目和存活力后)，并于37℃在5％CO2气氛中温育过夜。次日，用100μl含有适宜浓度的凋亡诱导性抗体，对照抗体和其它对照的新鲜培养基更换培养基：
以0.7和7nM或指示的终浓度使用双特异性抗体和IgG；以与一抗相同的摩尔浓度使用交联性抗体。添加抗体后，将104个凋亡敏感性肿瘤细胞添加至每个孔。
将细胞于37℃和5％CO2温育24小时以容许诱导凋亡。通过离心(10min，200xg)来收获细胞，并在200μl裂解缓冲液(由试剂盒提供)中于室温温育1小时。通过离心(10min，200xg)来沉降完整DNA和裂解细胞，并依照制造商的推荐对20μl含有片段化DNA的上清液分析凋亡诱导。
抑制增殖(CellTiterGlo)
对于细胞存活力测定法，在黑色透明底96孔板(BDFalcon产品目录号BD353220)中接种4,000个肿瘤细胞/孔(以75μl体积)，并在增湿的5％CO2气氛中于37℃温育过夜。然后，以2.5倍连续稀释的6种浓度添加25μl4xDR5结合物±家兔Fc(等纳摩尔的DR5结合物和Fc)。于37℃和5％CO2温育48小时后，将100μlCellTiter-Glo试剂添加至每个孔并混合孔。于室温另温育10分钟后，用SpectraMaxM5读板仪在发光设置下测定细胞存活力的结果。
诱导胱天蛋白酶8(胱天蛋白酶Glo)
对于胱天蛋白酶8活化测定法，在不透明白色96孔板(BDFalcon产品目录号BD353296)中以75μl接种10,000个癌细胞/孔，并在具有5％CO2的增湿温箱中于37℃温育过夜。然后以2.5倍连续稀释的6种浓度添加25μl4xDR5结合物±抗Fc(等摩尔比的DR5结合物和抗Fc)。于37℃和5％CO2温育3小时后，将100μl裂解缓冲液中的胱天蛋白酶8底物添加至每个孔。于37℃另温育30分钟后，在SpectraMaxM5读板仪中在发光设置下读取结果。
FRET测定法
使用时间解析荧光共振能量转移(TR-FRET)测定法(称作TagLite)测定双特异性分子在细胞上的结合。让HEKEBNA细胞生长至60-80％汇合，并用编码融合至SNAP标签和MalETM的DR5ECD的质粒DNA转染。简言之，将2μgDNA与4mlOptiMEM培养基和30μlLipofectamine2000(Invitrogen产品目录号11668-019)混合。将混合物于室温温育20分钟。同时，用5mlD-PBS清洗在T75烧瓶中生长的贴壁HEKEBNA细胞，之后添加转染混合物和培养基(6ml)(DMEM，10％FCS，glutamax，非必需氨基酸)。然后将细胞在增湿温箱(5％CO2)中于37℃温育过夜。用5mlD-PBS清洗细胞，接着添加5ml含有100nMSNAP-Lumi4-Tb(Cisbio产品目录号)的TagLite缓冲液(Cisbio产品目录号)的混合物。这导致荧光染料附着至融合至DR5的SNAP标签。于37℃温育1小时后，用TagLite缓冲液清洗细胞以去除未结合的染料。随后，通过以384孔型式(Reader，Victor，PerkinElmer)测量10000个细胞在620nm处的荧光信号(激发343nm)来检查标记效率。然后在补充有10％DMSO的培养基中冷冻细胞并贮藏于-80℃。
为了进行结合测定法，融化，清洗预标记的细胞，并将1000个细胞每孔与5μl构建体(终浓度范围为50-0.097nM，1:2稀释步骤)和5μl经标记抗huFc-d2(终浓度150nM)混合。于室温温育0小时，1小时和3小时后在620nm(用于荧光供体)(Terbium)和665nm(用于荧光受体染料)处测量荧光信号。计算比率665/620*1000，并减去参照(细胞及150nM抗huFc-d2)。对于KD测定，在GraphPadPrism中以一位点拟合-特异性结合分析结果。
通过动态光散射(DLS)测定热稳定性
通过动态光散射(DLS)监测蛋白质的热稳定性。一式两份以1mg/ml的蛋白质浓度将30μg经过过滤的蛋白质样品应用至Dynapro读板仪(WyattTechnologyCorporation；USA)。温度以0.05℃/min自25斜升至75℃，收集半径和总散射强度。
表29：DR5克隆和双特异性构建体的名称和Aliases
DR5抗体克隆名称 DR5抗体克隆Alias
DR5TAA-0005 “0005”或“039”
DR5TAA-0006 “0006”或“058”
DR5TAA-0010 “0010”或“481”
DR5TAA-0013 “0013”或“298”
DR5TAA-0019 “0019”或“461”
DR5TAA-0016 “0016”或“422”
DR5TAA-0011 “0011”或“174”
实施例36：包含新分离的DR5结合物5E11与28H1FAPCrossFab的组合的DR5-FAP双特异性抗体的体内抗肿瘤功效
在裸小鼠上移植的多种肿瘤起源(例如CRC和胰腺癌)的细胞和基于碎片的患者衍生(PDX)模型中证明了双特异性抗体DR5-FAP(VHSEQIDNO.:7，VLSEQIDNO.:8)的体内抗肿瘤功效。例如，显示了CRC异种移植物模型DLD-1(基于细胞系的，共注射模型)和Co5896(基于碎片的)的数据。
测试药剂
作为来自Roche(Penzberg，Germany)的储液提供双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VHSEQIDNO.:7，VLSEQIDNO.:8，FAP结合物：VHSEQIDNO.:15，VLSEQIDNO.:16)。抗体缓冲液包括组氨酸。注射前在缓冲液中自储液适当稀释抗体溶液。
细胞系和培养条件
DLD-1人CRC细胞最初是自ATCC获得的。例行地在水饱和气氛中于37℃和5％CO2在含1.0mM丙酮酸钠，补充有10％胎牛血清，2.0mML-谷氨酰胺，10mMHEPES的DMEM高葡萄糖培养基中培养肿瘤细胞系。每三天用胰蛋白酶/EDTA1x分瓶实施培养物传代。另外，鼠成纤维细胞NIH3T3购自ATCC，并在含1.0mM丙酮酸钠，FCS10％和L-谷氨酰胺2.0mM的DMEM高葡萄糖中培养。
患者衍生异种移植物模型(PDX)
CRC肿瘤异种移植物Co5896最初是自患者获得的，并传代大约三至五次，直至建立稳定生长样式。为了后续体内研究，自在裸小鼠中连续传代的异种移植物获得Co5896肿瘤碎片。自供体小鼠取出后，将肿瘤切除碎片(4-5mm直径)并放置在PBS中，直至皮下植入。异氟烷麻醉下的小鼠在体侧中接受单侧皮下肿瘤植入物。
动物
裸小鼠购自育种公司(例如CharlesRiver，Sulzfeld，Germany)，并依照提交的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光照/12小时黑暗的日周期在无特定病原体的条件下维持。实验性研究方案得到当地政府的审查和批准。到达后，将动物在动物房的检疫部分中维持一周适应新环境和进行观察。定期进行连续健康监测。随意提供饮食食物(ProvimiKliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。
监测
每天对动物管理临床症状和不利作用检测。对于贯穿实验的监测，记录动物的体重。
对动物的处理
在细胞或碎片移植后当中值肿瘤大小为约100-200mm3时进行动物随机化，此后开始动物处理。作为单一药剂以10或30mg/kg静脉内施用抗体，一周一次或两次，持续数周，取决于模型。在同一天施用相应媒介。
抗体功效
基于DLD-1CRC共注射细胞系的异种移植物模型
研究第9至20天以10和1.0mg/kg的剂量用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VHSEQIDNO.:7，VLSEQIDNO.:8，FAP结合物：VHSEQIDNO.:15，VLSEQIDNO.:16)处理携带DLD-1CRC异种移植物的小鼠。结果是，双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VHSEQIDNO.:7，VLSEQIDNO.:8，FAP结合物：VHSEQIDNO.:15，VLSEQIDNO.:16)处理显示剂量相关的显著的抗肿瘤功效，具有较强的针对皮下DLD-1异种移植物的抗肿瘤功效。肿瘤生长抑制(TGI)分别计算为89％(10mg/kg)和79％(1.0mg/kg)。相反，用DR5Fc突变体抗体DrozitumabPG，LALA(10mg/kg，一周一次)处理后没有注意到抗肿瘤功效(见图48)。以高FAP含量(用DLD-1/NIH3T3成纤维细胞进行的共注射研究；比率80/20，图48)和低FAP含量(用DLD-1/MRC5成纤维细胞进行的共注射研究；比率30/70，数据未显示)获得了类似的结果。
基于Co5896CRC碎片的患者衍生异种移植物模型(PDX)
研究第18至34天以30mg/kg的剂量用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VHSEQIDNO.:7，VLSEQIDNO.:8，FAP结合物：VHSEQIDNO.:15，VLSEQIDNO.:16)处理携带Co5896CRC异种移植物的小鼠6次。结果是，双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VHSEQIDNO.:7，VLSEQIDNO.:8，FAP结合物：VHSEQIDNO.:15，VLSEQIDNO.:16)处理显示显著的抗肿瘤功效，具有较强的针对皮下Co5896患者衍生异种移植物的抗肿瘤功效。肿瘤生长抑制(TGI)计算为76％(见图49)。在其它CRC细胞模型中获得了类似的结果(数据未显示)。
实施例36：人肿瘤中的FAP流行性
通过IHC评估人肿瘤中FAP的流行性以了解双特异性DR5-FAP抗体的可能临床用途。
在VentanaBenchmarkXT上使用来自Vitatex(MABS1001)的大鼠抗人Seprase抗体(IgG2a，克隆D8)免疫染色来自多种肿瘤适应症的2.5μmFFPET切片。对切片进行标准CC1处理，接着是于37℃在Dako抗体稀释液(S3022)中以5μg/mL的浓度的抗体温育60分钟，并使用UltraviewDAB检测系统(Ventana，#760-4456)检测阳性染色。使用匹配的来自Abcam的同种型抗体(ab18450)作为阴性对照。
FAP+基质浸润物存在于不同适应症的人肿瘤中，包括头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)，乳腺癌，结肠直肠癌(CRC)，胰腺癌(PAC)，胃癌，非小细胞肺癌(NSCLC)和间皮瘤，标志着双特异性DR5-FAP抗体的潜在感兴趣临床适应症(表30)。
表30：人肿瘤中的FAP流行性
序列
1.噬菌体展示衍生的DR5结合物的氨基酸序列
2.非功能性噬菌体展示衍生的DR5结合物的氨基酸序列
(CDRH1＝SEQIDNO.:1，CDRH2＝SEQIDNO.:2，CDRL1＝SEQIDNO.:4和CDRL2＝SEQIDNO.:5)
3.FAP结合物的氨基酸序列
4.包含常规DR5结合物的双特异性分子的氨基酸序列
5.包含噬菌体展示衍生的DR5结合物的双特异性分子的氨基酸序列
6.Fc域和恒定轻链的氨基酸序列
7.自家兔免疫接种衍生的DR5结合物的氨基酸序列
克隆DR5TAA-0005(Alias：克隆039)
重链
VH
qsleesggrlvtpgtpltltctasgfslssaymswvrqapgkglewigyiysgsgstwyaswvkgrftisktsttvdlkitspttedtatyfcargystmgdlwgpgtlvtvss(SEQIDNO.：41)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(SEQIDNO.：42)
CDR1＝sayms(SEQIDNO.：43)
CDR2＝yiysgsgstwyaswvkg(SEQIDNO.：44)
CDR3＝gystmgdl(SEQIDNO.：45)
轻链
VL
qvltqtpspvsaavggtvtincqasqsvynnrlawyqqkpgqppklliylastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlqcddaatyycaggysgninafgggtevvvk(SEQIDNO.：46)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc(SEQIDNO.：47)
CDR1＝qasqsvynnrla(SEQIDNO.：48)
CDR2＝lastlas(SEQIDNO.：49)
CDR3＝aggysgnina(SEQIDNO.：50)
克隆DR5TAA-0006(Alias：克隆058)
重链
VH
qsleesggrlvtpgtpltltctasgfslssnhmswvrqapgkglewigyiyagsgsayyaswakgrftisrtsttvdlkmtslttedtatyfcagdagssywefnlwgpgtlvtvss(SEQIDNO.：51)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(SEQIDNO.：42)
CDR1＝snhms(SEQIDNO.：52)
CDR2＝yiyagsgsayyaswakg(SEQIDNO.：53)
CDR3＝dagssywefnl(SEQIDNO.：54)
轻链
VL
lvmtqtpsstsepvggtvtikcqasqsigsslswyqqkpgqppklliyhastlasgvpsrfsgsrsgiqttltisgvqcddaatyyclgvadarrddgfafgggtevvvk(SEQIDNO.：55)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc(SEQIDNO.：56)
CDR1＝qasqsigssls(SEQIDNO.：57)
CDR2＝hastlas(SEQIDNO.：58)
CDR3＝lgvadarrddgfa(SEQIDNO.：59)
克隆DR5TAA-0010(Alias：克隆481)
重链
VH
qsleesggrlvkpdetltltctvsgfslssnaiswvrqapgmglewigiigssgytyyaswakgrftvsktsttvdleiaspttedtatyfcargysgasdysfnlwgpgtlvtvss(SEQIDNO.：60)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(SEQIDNO.：42)
CDR1＝snais(SEQIDNO.：61)
CDR2＝iigssgytyyaswakg(SEQIDNO.：62)
CDR3＝gysgasdysfnl(SEQIDNO.：63)
轻链
VL
aydmtqtpdsvevavggtvtikcqasqtigdalawyqqkpgqrpnlliyrtstlasgvpsrfsgsgsgthftltisgvecadaatyycqqgatynnvlntfgggtevvvk(SEQIDNO.：64)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc(SEQIDNO.：47)
CDR1＝qasqtigdala(SEQIDNO.：65)
CDR2＝rtstlas(SEQIDNO.：66)
CDR3＝qqgatynnvlnt(SEQIDNO.：67)
克隆DR5TAA-0013(Alias：克隆298)
重链
VH
Qsleesggrlvtpgtpltltctasgftissyhmswvrqapgkglewigyiyagsastwyaswvkgrftisktsttvdlkmtslttedtatyfcardagssywefnlwgpgtlvtvss(SEQIDNO.：68)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(SEQIDNO.：42)
CDR1＝syhms(SEQIDNO.：69)
CDR2＝yiyagsastwyaswvkg(SEQIDNO.：70)
CDR3＝dagssywefnl(SEQIDNO.：54)
轻链
VL
Lvmtqtpsstsepvggtvtikcqasqsigsslswyqqtpgqppklliytasslassvpkrfsgsrsgtqftltisgvqcadaatyyclgiddvrrddgfafgggtevvvk(SEQIDNO.：71)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc(SEQIDNO.：47)
CDR1＝qasqsigssls(SEQIDNO.：57)
CDR2＝tasslas(SEQIDNO.：72)
CDR3＝lgiddvrrddgfa(SEQIDNO.：73)
克隆DR5TAA-0019(Alias：克隆461)
重链
VH
Qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslsnyamswvrqapgkglewigiisssgttyyaswakgrftisktsttvdlkvtspttedtatyfcaretyygysyaaglwgpgtlvtvss(SEQIDNO.：74)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(SEQIDNO.：42)
CDR1＝nyams(SEQIDNO.：75)
CDR2＝iisssgttyyaswakg(SEQIDNO.：76)
CDR3＝etyygysyaagl(SEQIDNO.：77)
轻链
VL
Alvmtqtpssvsaavggtvtincqasqniysnlawfqqkpgqppklliyetsklasgvpsrfsgsgsgteftltisdlecddaatyycqsswhsistdcafgggtevvvk(SEQIDNO.：78)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc(SEQIDNO.：47)
CDR1＝qasqniysnla(SEQIDNO.：79)
CDR2＝etsklas(SEQIDNO.：80)
CDR3＝qsswhsistdca(SEQIDNO.：81)
克隆DR5TAA-0016(Alias：克隆422)
重链
VH
Qsleesggrlvkpdetltltctvsgfslnnyamswvrqapgkglewigminkygtkyyatwtkgratisktsttldleitspttedtatyfcarvryagddyaewldvwgqgilvtvss(SEQIDNO.：82)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(SEQIDNO.：42)
CDR1＝nyams(SEQIDNO.：75)
CDR2＝minkygtkyyatwtkg(SEQIDNO.：83)
CDR3＝vryagddyaewldv(SEQIDNO.：84)
轻链
VL
Adivmtqtaspvsaavggtvtincqasqsisssyvswyqqkpgqppklliykastlasgvpsrfsgsgsgtqlsltirgvqcddaatyyclygysdvssseyvfgggtevvvr(SEQIDNO.：85)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc(SEQIDNO.：47)
CDR1＝qasqsisssyvs(SEQIDNO.：86)
CDR2＝kastlas(SEQIDNO.：28)
CDR3＝lygysdvssseyv(SEQIDNO.：87)
克隆DR5TAA-0011(Alias：克隆174)
重链
VH
Qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsisryamiwvrqapgegleyigfitsdssayyaswakgrftisktsttvdlkmtspttedtatyfcarytysdgtdlwgpgtlvtvss(SEQIDNO.：88)
CH1-3
Gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(SEQIDNO.：42)
CDR1＝ryami(SEQIDNO.：17)
CDR2＝fitsdssayyaswakg(SEQIDNO.：25)
CDR3＝ytysdgtdl(SEQIDNO.：19)
轻链
VL
Adivmtqtpasvsepvggtvtikcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfkgsgsgtdftltirdlecadaatyycqpnsgiatygaafgggtevvvk(SEQIDNO.：89)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc(SEQIDNO.：47)
CDR1＝qasqsistyls(SEQIDNO.：27)
CDR2＝kastlas(SEQIDNO.：28)
CDR3＝qpnsgiatygaa(SEQIDNO.：22)
8.家兔MabDR5TAA-0011的嵌合化变体的氨基酸序列
克隆DR5TAA-0052(嵌合变体)
重链
VH
Qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsisryamiwvrqapgegleyigfitsdssayyaswakgrftisktsttvdlkmtspttedtatyfcarytysdgtdlwgpgtlvtvss(SEQIDNO.：90)
CH1-3
Astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQIDNO.：91)
CDR1＝ryami(SEQIDNO.：17)
CDR2＝fitsdssayyaswakg(SEQIDNO.：25)
CDR3＝ytysdgtdl(SEQIDNO.：19)
轻链
VH
Adivmtqtpasvsepvggtvtikcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfkgsgsgtdftltirdlesadaatyycqpnsgiatygaafgggtevvvk(SEQIDNO.：92)
Ckappa
Rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：93)
CDR1＝qasqsistyls(SEQIDNO.：27)
CDR2＝kastlas(SEQIDNO.：28)
CDR3＝qpnsgiatygaa(SEQIDNO.：22)
9.家兔MabDR5TAA-0011的人源化变体的序列
人源化变体重链
VH7
VH
Evqlvetgggliqpggslrlscaasgftvsryamiwvrqapgkgleyigfitsdgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgrgtlvtvss(SEQIDNO.：23)
CH1-3
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkconstantchain(SEQIDNO.：91)
CDR1＝ryami(SEQIDNO.：17)
CDR2＝fitsdgstyyadsakg(SEQIDNO.：18)
CDR3＝ytysdgtdl(SEQIDNO.：19)
VH17
VH
qvqlvesggglvqpggslrlscsasgfsisryamiwvrqapgkgleyvgfitsdssayyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgqgtlvtvss(SEQIDNO.：26)
CH1-3
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQIDNO.：91)
CDR1＝ryami(SEQIDNO.：17)
CDR2＝fitsdssayyaswakg(SEQIDNO.：25)
CDR3＝ytysdgtdl(SEQIDNO.：19)
人源化变体轻链
VL2
VL
Diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykasslasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddaatyycqpnsgiatygaafgggtkveik(SEQIDNO.：32)
Ckappa
Rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：93)
CDR1＝rasqsistyls(SEQIDNO.：20)
CDR2＝kasslas(SEQIDNO.：21)
CDR3＝qpnsgiatygaa(SEQIDNO.：22)
VL3
VL
Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedaatyycqpnsgiatygaafgggtkveik(SEQIDNO.：30)
Ckappa
Rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：93)
CDR1＝rasqsistyls(SEQIDNO.：20)
CDR2＝kastlas(SEQIDNO.：28)
CDR3＝qpnsgiatygaa(SEQIDNO.：22)
VL10
VL
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqpnsgiatygaafgggtkveik(SEQIDNO.：31)
Ckappa
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：93)
CDR1＝rasqsistyls(SEQIDNO.：20)
CDR2＝kastlas(SEQIDNO.：28)
CDR3＝qpnsgiatygaa(SEQIDNO.：22)
VL11
VL
diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqpnsgiatygaafgggtkveik(SEQIDNO.：29)
Ckappa
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：93)
CDR1＝qasqsistyls(SEQIDNO.：27)
CDR2＝kastlas(SEQIDNO.：28)
CDR3＝qpnsgiatygaa(SEQIDNO.：22)
VL15
VL
Adiqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykasslasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddaatyycqpnsgiatygaafgggtkveik(SEQIDNO.：24)
Ckappa
Rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：93)
CDR1＝rasqsistyls(SEQIDNO.：20)
CDR2＝kasslas(SEQIDNO.：21)
CDR3＝qpnsgiatygaa(SEQIDNO.：22)
10.含有家兔衍生的DR5结合物的嵌合双特异性构建体的氨基酸序列
构建体DR5TAA-0061(含有4B9和DR5TAA-0011的1+1嵌合Crossmab)
LC(DR5)
adivmtqtpasvsepvggtvtikcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfkgsgsgtdftltirdlecadaatyycqpnsgiatygaafgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsgesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：280)
交叉的LC(FAP)
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvtssylawyqqkpqqaprllinvgsrratqipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgimlpptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：281)
HC(DR5)
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsisryamiwvrqapgegleyigfitsdssayyaswakgrftisktsttvdlkmtspttedtatyfcarytysdgtdlwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn
hkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreegynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepgvctlppsrdeltkngvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgs
fflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQIDNO.：282)
交叉的HC(FAP)
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaiigsgastyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwfggfnywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhk
vyacevthqglsspvtksfnrgecdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttpp
vldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQIDNO.：283)
构建体DR5TAA-0032(含有28H1和DR5TAA-0005的2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
aqvltqtpspvsaavggtvtincqasqsvynnrlawyqqkpgqppklliylastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlqcddaatyycaggysgninafgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevth
qglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：284)
交叉的LC(FAP)
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：285)
HC(DR5-交叉的FAP)
qsleesggrlvtpgtpltltctasgfslssaymswvrqapgkglewigyiysgsgstwyaswvkgrftisktsttvdlkitspttedtatyfcargystmgdlwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
(SEQIDNO.：286)
构建体DR5TAA-0033(含有28H1和DR5TAA-0011的2+2嵌合CrossMarb)
LC(DR5)
adivmtqtpasvsepvggtvtikcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasqvpsrfkqsgsgtdftltirdlecadaatyycqpnsqiatyqaafqgqtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksqtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：287)
交叉的LC(FAP)
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqqqvipptfqqqtkveikssastkqpsvfplapsskstsqqtaalqclvkdyfpepvtvswnsqaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：288)
HC(DR5-交叉的FAP)
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsisryamiwvrqapgegleyigfitsdssayyaswakgrftisktsttvdlkmtspttedtatyfcarytysdgtdlwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlgssglyslssvvtvpssslgtgtyicnvn
hkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakggprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgs
fflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgggtlvtvssasvaapsvfifppsdeglk
sgtasvvcllnnfypreakvgwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthgglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：289)
构建体DR5TAA-0034(含有28H1和DR5TAA-0013的2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
alvmtqtpsstsepvggtvtikcqasqsigsslswyqqtpgqppklliytasslassvpkrfsgsrsgtqftltisgvqcadaatyyclgiddvrrddgfafggqtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：290)
交叉的LC(FAP)
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：291)
HC(DR5-交叉的FAP)
qsleesggrlvtpgtpltltctasgftissyhmswvrqapgkglewigyiyagsastwyaswvkgrftisktsttvdlkmtslttedtatyfcardagssywefnlwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsde
qlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：292)
构建体DR5TAA-0035(含有28H1和DR5TAA-0016的2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
adivmtqtaspvsaavggtvtincqasqsisssyvswyqqkpgqppklliykastlasgvpsrfsgsgsgtqlsltirgvqcddaatyyclygysdvssseyvfgggtevvvrrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsgesvtegdskdstyslsstltlskadyekhkvyac
evthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：293)
交叉的LC(FAP)
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqqqvipptfqqqtkveikssastkqpsvfplapsskstsqqtaalqclvkdyfpepvtvswnsqaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：294)
HC(DR5-交叉的FAP)
qsleesggrlvkpdetltltctvsgfslnnyamswvrqapgkglewigminkygtkyyatwtkgratisktsttldleitspttedtatyfcarvryagddyaewldvwgqgilvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsqaltsqvhtfpavlqssqlyslssvvtvpssslqtqty
icnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdqvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlnqkeykckvsnkalpapiektiskakqqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkqfypsdiavewesnqqpennykttppvl
dsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifpps
deqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：295)
构建体DR5TAA-0036(含有28H1和DR5TAA-0019的2+2嵌合CrossMab)
LC(DR5)
alvmtqtpssvsaavgqtvtincqasqniysnlawfqqkpgqppklliyetsklasgvpsrfsgsgsgteftltisdlecddaatyycqsswhsistdcafgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevt
hqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：296)
交叉的LC(FAP)
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhttpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：297)
HC(DR5-交叉的FAP)
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslsnyamswvrqapgkglewigiisssgttyyaswakgrftisktsttvdlkvtspttedtatyfcaretyygysyaaglwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsde
qlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：298)
11.含有人源化家兔衍生的DR5结合物的双特异性构建体的氨基酸序列
构建体DR5TAA-0117(含有28H1和DR5TAA-0067的2+2人源化CrossMab)
LC(DR5)
adiqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykasslasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddaatyycqpnsgiatygaafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：299)
交叉的LC(FAP)
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：300)
HC(DR5-交叉的FAP)
evqlvetgggliqpggslrlscaasgftvsryamiwvrqapgkgleyigfitsdqstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeql
ksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：301)
构建体DR5TAA-0118(含有28H1和DR5TAA-0071的2+2人源化CrossMab)
LC(DR5)
adiqmtqspstlsasvqdrvtitcrasqsistylswyqqkpqkapkrliykasslasqvpsrfsqsqsqteftltisslqpddaatyycqpnsgiatygaafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：302)
交叉的LC(FAP)
eivltqspqtlslspqeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliiqastratqipdrfsqsqsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：303)
HC(DR5-交叉的FAP)
qvqlvesggglvqpggslrlscsasgfsisryamiwvrqapgkgleyvgfitsdssayyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsqaltsqvhtfpavlqssqlyslssvvtvpssslqtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaagqpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdqvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlnqkeykckvsnkalgapiektiskakqqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeql
ksqtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsqnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqqlsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：304)
构建体DR5TAA-0119(含有28H1和DR5TAA-0075的2+2人源化CrossMab)
LC(DR5)
diqmtqspsslsasvqdrvtitcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqpnsgiatygaafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevt
hqglsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：305)
交叉的LC(FAP)
eivltqspqtlslspqeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliiqastratqipdrfsgsqsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd(SEQIDNO.：306)
HC(DR5-交叉的FAP)
evqlvetgggliqpggslrlscaasgftvsryamiwvrqapgkgleyigfitsdgstyyadsakgrftisrdnskntlylgmnslraedtavyycarytysdgtdlwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlgssglyslssvvtvpssslgtgtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrgapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeql
ksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqqlsspvtksfnrgec(SEQIDNO.：307)
12.人源化家兔衍生的DR5结合物的C端融合物的氨基酸序列
13.DR5结合物和包含它们的双特异性分子的核酸序列
14.DR5序列
15.FAP序列
虽然显示和描述了本发明当前优选的实施方案，但是要清楚地理解，本发明不限于此而是可以在所述权利要求书的范围内以其它方式多种多样地体现和实施。

Claims (42)

1.一种结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体，其包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，
所述对DR5特异性的抗原结合位点包含
(a)选自下组的重链互补决定区1(CDR1)：SEQIDNO.:1，SEQIDNO.:17和SEQIDNO.:75；
(b)选自下组的重链互补决定区2(CDR2)：SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:18，SEQIDNO.:25和SEQIDNO.:83；
(c)选自下组的重链互补决定区3(CDR3)：SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:19，SEQIDNO.:84，SEQIDNO.:96，SEQIDNO.:98，SEQIDNO.:104和SEQIDNO.:108；
(d)选自下组的轻链CDR1：SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:20，SEQIDNO.:27和SEQIDNO.:86；
(e)选自下组的轻链CDR2：SEQIDNO.:5，SEQIDNO.:21和SEQIDNO.:28；和
(f)选自下组的轻链CDR3：SEQIDNO.:6，SEQIDNO.:22，SEQIDNO.:87，SEQIDNO.:99，SEQIDNO.:105，SEQIDNO.:109和SEQIDNO.:97，
所述对FAP特异性的抗原结合位点包含
(a)选自下组的重链CDR1：SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:33；
(b)选自下组的重链CDR2：SEQIDNO.:10和SEQIDNO.:34；
(c)选自下组的重链CDR3：SEQIDNO.:11和SEQIDNO.:35；
(d)选自下组的轻链CDR1：SEQIDNO.:12和SEQIDNO.:36；
(e)选自下组的轻链CDR2：SEQIDNO.:13和SEQIDNO.:37；
(f)选自下组的轻链CDR3：SEQIDNO.:14和SEQIDNO.:38。
2.权利要求1的双特异性抗体，其中所述对DR5特异性的抗原结合位点包含包含选自下组的氨基酸序列的可变重链和可变轻链：SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:29；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:32；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:82和SEQIDNO.:85；SEQIDNO.:100和SEQIDNO.:101；SEQIDNO.:102和SEQIDNO.:103；SEQIDNO.:106和SEQIDNO.:107；SEQIDNO.:94和SEQIDNO.:95，
且其中所述对FAP特异性的抗原结合位点包含包含选自下组的氨基酸序列的可变重链：SEQIDNO.:15和SEQIDNO.:39；和包含选自下组的氨基酸序列的可变轻链：SEQIDNO.:16和SEQIDNO.:40。
3.权利要求1或2的双特异性抗体，其中所述对DR5特异性的抗原结合位点包含：
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:6的轻链CDR3，
且所述对FAP特异性的抗原结合位点包含：
(a)SEQIDNO.:9的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:10的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:11的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:12的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:13的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:14的轻链CDR3。
4.权利要求1至3任一项的双特异性抗体，其中所述对DR5特异性的抗原结合位点包含包含SEQIDNO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:8的氨基酸序列的可变轻链，且所述对FAP特异性的抗原结合位点包含包含SEQIDNO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。
5.权利要求1至4任一项的双特异性抗体，其中所述抗体为人抗体。
6.权利要求1至3任一项的双特异性抗体，其中所述抗体为人源化抗体。
7.权利要求1至6任一项的双特异性抗体，其包含Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。
8.权利要求7的双特异性抗体，其中至少一个Fab片段经轻链(VLCL)连接至Fc域的第一或第二亚基且至少一个Fab片段经重链(VHCH1)连接至Fc域的第一或第二亚基。
9.权利要求7或8的双特异性抗体，其包含：
a)一个Fc域，
b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定轻链(CL)的C末端处连接至Fc域的第一或第二亚基，
c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述两个Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至Fc域的第一或第二亚基。
10.权利要求7或8的双特异性抗体，其包含：
a)一个Fc域，
b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至Fc域的第一或第二亚基，
c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述两个Fab片段在恒定轻链(CL)的C末端处连接至Fc域的第一或第二亚基。
11.权利要求1至7任一项的双特异性抗体，其包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
12.权利要求11的双特异性抗体，其包含两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。
13.权利要求12的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对DR5和FAP二者是二价的。
14.权利要求11的双特异性抗体，其包含两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。
15.权利要求14的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对DR5是二价的且对FAP是单价的。
16.权利要求14的双特异性抗体，其另外包含一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段。
17.权利要求16的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对DR5是三价的且对FAP是单价的。
18.权利要求11的双特异性抗体，其包含一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。
19.权利要求18的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对DR5是单价的且对FAP是单价的。
20.权利要求11至19任一项的双特异性抗体，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
21.权利要求7至20任一项的双特异性抗体，其中至少一个所述Fab片段经肽接头连接至所述Fc域。
22.权利要求7至21任一项的双特异性抗体，其中所述Fc域包含一处或多处降低结合Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代。
23.权利要求22的双特异性抗体，其中所述一处或多处氨基酸替代位于一个或多个选自下组的位置：L234，L235，和P329。
24.权利要求23的双特异性抗体，其中所述Fc域的每个亚基包含三处降低结合活化性或抑制性Fc受体和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G。
25.权利要求7至24任一项的双特异性抗体，其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的Fc部分包含第二二聚化模块，容许第一抗体的两条重链异二聚化。
26.权利要求25的双特异性抗体，其中依照节入穴策略，所述第一二聚化模块包含节且所述第二二聚化模块包含穴。
27.一种特异性结合DR5的抗体，其包含：
(a)选自下组的重链互补决定区1(CDR1)：SEQIDNO.:1，SEQIDNO.:17和SEQIDNO.:75；
(b)选自下组的重链互补决定区2(CDR2)：SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:18，SEQIDNO.:25和SEQIDNO.:83；
(c)选自下组的重链互补决定区3(CDR3)：SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:19，SEQIDNO.:84，SEQIDNO.:96，SEQIDNO.:98，SEQIDNO.:104和SEQIDNO.:108；
(d)选自下组的轻链CDR1：SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:20，SEQIDNO.:27和SEQIDNO.:86；
(e)选自下组的轻链CDR2：SEQIDNO.:5，SEQIDNO.:21和SEQIDNO.:28；和
(f)选自下组的轻链CDR3：SEQIDNO.:6，SEQIDNO.:22，SEQIDNO.:87，SEQIDNO.:99，SEQIDNO.:105，SEQIDNO.:109和SEQIDNO.:97。
28.权利要求27的抗体，其包含：
(a)SEQIDNO.:1的重链CDR1；
(b)SEQIDNO.:2的重链CDR2；
(c)SEQIDNO.:3的重链CDR3；
(d)SEQIDNO.:4的轻链CDR1；
(e)SEQIDNO.:5的轻链CDR2；
(f)SEQIDNO.:6的轻链CDR3。
29.权利要求27的抗体，其包含包含选自下组的氨基酸序列的可变重链和可变轻链：SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:24；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:29；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:32；SEQIDNO.:26和SEQIDNO.:30；SEQIDNO.:23和SEQIDNO.:31；SEQIDNO.:82和SEQIDNO.:85；SEQIDNO.:100和SEQIDNO.:101；SEQIDNO.:102和SEQIDNO.:103；SEQIDNO.:106和SEQIDNO.:107；SEQIDNO.:94和SEQIDNO.:95。
30.权利要求27至29任一项的抗体，其包含包含SEQIDNO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQIDNO.:8的氨基酸序列的可变轻链。
31.一种药物组合物，其包含权利要求1至26的双特异性抗体或权利要求27至30的抗体。
32.权利要求1至26的双特异性抗体或权利要求27至30的抗体，其用于治疗癌症。
33.权利要求1至26的双特异性抗体或权利要求27至30的抗体，其用作药物。
34.权利要求1至26的双特异性抗体或权利要求27至30的抗体在制备药物中的用途。
35.权利要求34的用途，其中所述药物用于治疗癌症。
36.权利要求34的用途，其中所述药物用于治疗胰腺癌或结肠直肠癌。
37.一种核酸序列，其包含编码权利要求1至26的双特异性抗体的重链或权利要求27至30的抗体的重链的序列。
38.一种核酸序列，其包含编码权利要求1至26的双特异性抗体的轻链或权利要求27至30的抗体的轻链的序列。
39.一种表达载体，其包含权利要求37和/或权利要求38的核酸序列。
40.一种原核或真核宿主细胞，其包含权利要求39的载体。
41.一种生成抗体的方法，其包括培养权利要求40的宿主细胞，使得该抗体生成。
42.本文中描述的发明，尤其参见实施例。
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