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KR20070100346A - 크립토 결합 분자 - Google Patents

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KR20070100346A
KR20070100346A KR1020077017992A KR20077017992A KR20070100346A KR 20070100346 A KR20070100346 A KR 20070100346A KR 1020077017992 A KR1020077017992 A KR 1020077017992A KR 20077017992 A KR20077017992 A KR 20077017992A KR 20070100346 A KR20070100346 A KR 20070100346A
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KR
South Korea
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binding molecule
seq
sequence
amino acid
heavy chain
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020077017992A
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English (en)
Inventor
스콧 글레이저
블리지멘 헤르만 반
알렉세이 알렉산드로비치 루고브스코이
미셀 새니콜라-나델
시우펭 우
엘렌 가버
조세 윌리엄 살다나
Original Assignee
바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 filed Critical 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 항-크립토 항체의 인간화 형태 및 이의 일부에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서 이들을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드의 가변 영역(예를 들어, 전장 항체 또는 도메인 결실 항체 등)은 질환 예컨대 암을 치료하는데 사용할 수 있다.
크립토, 암, 항체, 가변, 불변

Description

크립토 결합 분자{CRIPTO BINDING MOLECULES}
관련 출원들
본 출원은 2005년 1월 5일 출원된, 발명의 명칭이 "결합 분자의 정제 및 우선적 합성(Purification and Preferential Synthesis of Binding Molecules)"인 USSN 60/641691의 잇점을 주장한다. 본 출원은 2003년 6월 27일 출원된, 발명의 명칭이 "폴리펩티드의 정제 및 우선적 합성(Purification and Preferential Synthesis of Polypeptides)"인 USSN 60/483877과, 2003년 10월 3일 출원된, 발명의 명칭이 "항원 결합 폴리펩티드의 정제 및 우선적 합성(Purification and Preferential Synthesis of Antigen Binding Polypeptides)"인 USSN 60/508,810과 관련된다. 본 출원은 또한 2004년 6월 28일 출원된, 발명의 명칭이 "결합 분자의 정제 및 우선적 합성(Purification and Preferential Synthesis of Binding Molecules)"인 USSN 10/880,320과 관련된다. 본 출원은 또한 2004년 9월 20일 출원된 발명의 명칭이 "크립토-특이 항체(Cripto-Specific Antibodies)"인 USSN 10/945,853, 2003년 10월 23일 출원된, 발명의 명칭이 "크립토 차단 항체 및 그의 용도(Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof)"인 USSN 10/693,538, 및 2002년 3월 22일 출원된 발명의 명칭이 "크립토의 리간드 결합 도메인에 대한 항체(Antibodies Directed to the Ligand Binding Domain of Cripto)"인 미국 출원번 호 제60/367,002호; 2001년 6월 26일 출원된, 발명의 명칭이 "크립토 차단 항체 및 그의 용도(Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof)"인 미국 출원번호 제60/301,091호; 2001년 5월 17일 출원된, 발명의 명칭이 "크립토의 리간드 결합 도메인에 대한 항체(Antibodies Directed to the Ligand Binding Domain of Cripto)"인 미국 출원번호 제60/293,020호; 및 2001년 4월 26일 출원된, 발명의 명칭이 "크립토의 리간드 결합 도메인에 대한 항체(Antibodies Directed to the Ligand Binding Domain of Cripto)"인 미국 출원번호 제60/286,782호와 관련된다. 본 출원들의 전문이 참고로 인용된다.
항체, 및 다양한 그의 조작된 형태는 다양한 질병으로 고생하는 환자를 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 유효한 치료제이다. 이들 항체중 일부는 종양 세포 표면상에 존재하는 항원을 인식한다. 크립토(Cripto)는 다수의 종양 세포에 의해 과발현되는 188개의 아미노산 세포 표면 단백질이다. 크립토는 인간의 배아 암종 라이브러리의 cDNA 선별에서 분리되었다[Ciccodicola et al., 1989, EMBO J. 8:1987-91]. 크립토는 본래 EGF 계의 일원으로 분류되었으나[Ciccodicola et al., 상기 참조], 계속적인 분석 결과, 크립토는 공지의 EGF 수용기(receptor)중 어디에도 결합하지 않으며, 그의 EGF-양(like) 도메인이 실제로는 EGF 계로부터 분기되었다는 것이 밝혀졌다[Bianco et al., 1999, J. Biol . Chem., 274:8624-8629].
크립토 단백질의 과발현은 다수 조직(제한하는 것은 아니지만, 뇌, 유방, 고환, 결장, 폐, 난소, 방광, 자궁, 자궁 경부, 췌장 및 위를 포함한다)에서의 종 양과 관련된다([Panico et al., 1996, Int . J. Cancer 65:51-56]; [Byrne et al., 1998, J. Pathology 185:108-11]; [De Angelis et al., 1999, Int . J. Oncology 14:437-40]).
크립토에 결합하는 뮤린 항체가 기술되었다. 그러나, 뮤린 항체는 인간에서 치료제로서의 적용성은 갖지만, 인간 기원이 아니기 때문에 면역원성일 수 있다. 그러한 항체를 투여함으로써 항체 반응(인간 항-뮤린 항체(HAMA: human anti-murine antibody) 반응)을 중화시킬 수는 있지만, 예를 들면, 만성 또는 재발성 질환 용태의 치료에서와 같이 상기 항체를 반복적으로 투여하는 것이 바람직할 경우에는 특히 문제가 된다. 또한, 상기 항체는 뮤린 불변 도메인를 포함하고 있기 때문에 인간 효과기 기능을 나타내지 않을 수 있다.
면역원성에 대한 우려를 완화시키기 위한 노력으로, "인간화된" 항체가 주로 생산된다. 하나의 프로토콜에서는, 마우스 기원의 항체로부터 유도된 CDRs를 인간 프레임워크 영역상에 이식시켜 "CDR 이식" 항체를 수득한다. 종종, 프레임워크 영역중의, 잠재적으로 항원 결합에 영향을 줄 수 있는 아미노산 잔기는 상응하는 마우스 잔기로 복귀 돌연변이화(backmuated)된다.
그러나, 인간화된 항체는 인간에서 잠재된 면역원성이 낮기 때문에 바람직할 수 있지만, 그의 생산은 예측불가능하다. 예를 들면, 항체의 서열 변형을 통해 항원 결합 친화성은 상당부 또는 전체적으로도 손실될 수 있거나, 결합 특이성이 손실될 수 있다. 또한, 서열 변형에도 불구하고 "인간화된 항체"는 여전히 인간에서 면역원성을 나타낼 수 있다. 인간화된 항-크립토 항체를 개발하는 것이 환자의 세 포에서 크립토 발현에 따른 결과를 저해시키는데 매우 유익할 것이다. 또한, 그러한 항체를 개발하는 것은 항-종양제를 전달하기 위하여 크립토 양성 종양 세포를 표적하는 수단, 예로서, 독소, 방사선 표지 등을 제공할 것이다.
도 1A(서열 번호 1)은 각각 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [GlySer] 힌지 연결 펩티드를 포함하는, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 융합된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 구성된, 중쇄 CH2 도메인이 결실된 키메라 항-크립토 단일클론 항체(chB3F6)의 DNA 서열을 나타낸다. 도 1B(서열 번호 2)는 경쇄 CH2 도메인이 결실된 chB3F6의 DNA 서열을 나타낸다.
도 2A(서열 번호 3)는 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [GlySer] 힌지 연결 펩티드를 포함하는 중쇄 CH2 도메인이 결실된 chB3F6의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2B(서열 번호 4)는 경쇄 CH2 도메인이 결실된 chB3F6의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] 연결 펩티드(서열 번호 5)를, CH2 도메인이 결실된 chB3F6 항체내로 포함시킴으로써, B형은 거의 검출되지 않거나 전혀 검출되지 않고, 본질적으로 모두 A형 항체만을 생산할 수 있음을 나타낸다(레인 4 참조).
도 4는 키메라 B3F6(chB3F6), 및 연결 펩티드를 포함하는 도메인이 결실된 키메라 B3F6 항체(B3F6ΔCH2 G1/G3/Pro243Ala244Pro245)는 GEO 종양 세포와의 결합에 대하여 동등하게 경쟁한다는 것을 나타낸다.
도 5는 제조된 공여체 뮤린 B3F6 경쇄 가변 영역, 인간 수용체, 및 다양한 인간화된 형태의 경쇄 정렬을 나타낸다. CDR 서열은 음영표시되어 있다. 공여체와 수용체 사이의 FR 아미노산 잔기상의 차이는 굵은체로 표시되어 있다. 제조된 복귀 돌연변이는 소문자 굵은체로 표시되어 있다. 카뱃 번호는 정렬 상단을 따라 표시되어 있다.
도 6은 제조된 공여체 뮤린 B3F6 중쇄 영역, 인간 수용체, 및 다양한 인간화된 형태의 중쇄 정렬을 나타낸다. CDR 서열은 음영표시되어 있다. 공여체와 수용체 사이의 FR 아미노산 잔기상의 차이는 굵은체로 표시되어 있다. 제조된 복귀 돌연변이는 소문자 굵은체로 표시되어 있다. 카뱃 번호는 정렬 상단을 따라 표시되어 있다.
도 7은 도메인이 결실된 항체(힌지 연결 펩티드(HCP: hinge connecting peptide) 포함)를 제조하기 위하여 사용된 불변 영역 서열, 및 전장의 항체를 제조하기 위하여 사용된 전장의 IgG1 불변 영역 서열을 나타낸다.
도 8은 도메인이 결실된 키메라 B3F6과, 도메인이 결실된 인간화된 B3F6 버전 1의 및 버전 2의 결합에 대한 비교를 나타낸다.
도 9는 도메인이 결실된 키메라 B3F6과, 도메인이 결실된 인간화된 B3F6 버전 3, 버전 4, 버전 5, 및 버전 6의 결합에 대한 비교를 나타낸다.
도 10은 종양 중량의 변화로서 측정되는 바, DM4에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 확립된 BT-474 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 15mg/kg의 B3F6.1-DM4 접합체를 IV로 3개월동안 매 7일마다(q7dx3) 그리고 43일째 투여하거나(n=8), q7dx3 그리고 43일째 25mg/kg를 투여하거나(n=8), 35mg/kg의 B3F6.1- DM4를 IV로 q7dx3(n=8), 또는 15일, 22일, 33일, 및 36일째 투여하거나(n=8), 비히클을 IV로 q7dx3으로 투여하고(n=16), 탁솔은 15일째를 시작으로 IP로 q4dx3으로 투여하였다(n=7). 세로선(vertical bar)은 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 11의 패널 A 및 B는 DM4에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 BT-474 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 확립된 BT-474 인간 유방 종양을 갖는 마우스는 15mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 3개월동안 매 7일마다(q7dx3) 그리고 43일째(n=8) 처리하거나, q7dx3 그리고 43일째 25mg/kg로 처리하거나(n=8), 35mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 q7dx3(n=8)로 또는 15일, 22일, 33일, 및 36일째(n=8) 처리하거나, 비히클을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고(n=16), 탁솔 처리는 15일째를 시작으로 IP로 q4dx3으로 하였다(n=7). 패널 A는 58일째 개체의 종양 중량을 나타낸다. 패널 B는 76일째 남아있는 처리군의 개체의 종양 중량을 나타낸다. 각각의 점은 마우스 1마리의 종양 중량을 나타내고, 가로선은 각 군의 평균 종양 중량을 나타낸다.
도 12는 DM4 및 탁솔에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 확립된 BT-474 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 도면은 비히클 대조군의 평균 종양 크기의 퍼센트로서 시험군의 평균 종양 크기 비교를 나타낸다. 확립된 BT-474 인간 유방 종양을 갖는 누드 마우스는 15mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 3개월동안 매 7일마다(q7dx3) 그리고 43일째(n=8) 처리하거나, q7dx3 그리고 43일째 25mg/kg로 처리하거나(n=8), 35mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 q7dx3(n=8)로 또는 15일, 22일, 33일, 및 36일째(n=8) 처리하거나, 비히클을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고(n=16), 탁솔 처리는 15일째를 시작으로 IP로 q4dx3으로 하였다(n=7). 가로선은 활성에 대한 미 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 기준(42%)을 나타낸다.
도 13은 BT-474 인간 유방 종양을 삽입받고, DM4 또는 탁솔에 접합된 전장의 B3F6으로 처리된 누드 마우스의 평균 체중을 나타낸다. 마우스는 15mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 3개월동안 매 7일마다(q7dx3) 그리고 43일째(n=8) 처리하거나, q7dx3 그리고 43일째 25mg/kg로 처리하거나(n=8), 35mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 q7dx3(n=8)로 또는 15일, 22일, 33일, 및 36일째(n=8) 처리하거나, 비히클을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고(n=16), 탁솔 처리는 15일째를 시작으로 IP로 q4dx3으로 하였다(n=7). 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 14는 종양 중량의 변화로서 측정되는 바, 도메인이 결실된(dd) huB3F6-DM4가 BT-474 유방암 세포에 미치는 효과를 나타낸다. 18mg/kg의 DM-4 접합된 항체, 5회분을 투여시 10mg/kg의 DM-4 접합된 항체, 및 25mg/kg의 탁솔을 사용하였을 때 유의적인 효과가 관찰되었다.
도 15는 종양 중량의 변화로서 측정되는 바, 도메인이 결실된(dd) huB3F6-DM4가 BT-474 암 세포에 미치는 효과를 나타낸다. 퇴행/정체시 3주후 동물에 재투여하였다. 10mg/kg의 DM-4 접합된 항체, 및 25mg/kg의 탁솔을 사용하였을 때 유의적인 효과가 관찰되었다.
도 16은 도메인이 결실된(dd) huB3F6-DM4가 BT-474 암 세포에 미치는 효과를 나타낸다. 종양 중량은 시험군의 종양 중량/비히클 대조군의 종양 중량의 퍼센트로서 나타낸다. 탁솔 및 10mg/kg의 huB3F6-DM4 양자 모두 종양 중량을 50% 초과로 감 소시켰다.
도 17은 종양 중량의 변화로서 측정되는 바, 도메인이 결실된(dd) huB3F6-DM4가 BT-474 암 세포에 미치는 효과를 나타낸다. 월요일, 수요일, 금요일, 및 월요일날 동물에 투여하였다. 8마리중 7마리는 7군에 남아있었다.
도 18은 종양 중량의 변화로서 나타내는 바, DM4 또는 시스-플라티넘(Cis-platinum)에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 확립된 NCCIT 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 6(n=8), 10(n=8), 15(n=8) 및 25(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 q7dx3(화살표로 표시)로 투여하고, 비히클(n=16)을 IV로 q7dx3로 투여하고, 시스-플라티넘(n=8)은 15일째를 시작으로 SC로 2mg/kg 3x/wk x 6로 투여하였다. 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 19의 패널 A 및 B는 전장의 B3F6.1-DM4가 누드 마우스의 종양에 미치는 효과를 산점도로 나타낸다. 확립된 NCCIT 인간 고환 종양을 갖는 누드 마우스는 6(n=8), 10(n=8), 15(n=8), 및 25(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고, 비히클(n=16)을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고, 시스-플라티넘(n=8) 처리는 15일째를 시작으로 SC로 3x/wk x 4로 하였다. 패널 A는 70일째 개체의 종양 중량을 나타낸다. 패널 B는 107일째 남아있는 처리군의 개체의 종양 중량을 나타낸다. 각각의 점은 마우스 1마리의 종양 중량을 나타내고, 선은 각 군의 평균 종양 중량을 나타낸다.
도 20은 DM4 또는 시스-플라티넘에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 확립된 NCCIT 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 도면은 비히클 대조군의 평균 종양 크기의 퍼센트로서 시험군의 평균 종양 크기 비교를 나타낸다. 확립된 NCCIT 인간 고환 종양을 갖는 누드 마우스는 6(n=8), 10(n=8), 15(n=8), 및 25(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고, 비히클(n=16)을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고, 시스-플라티넘(n=8) 처리는 15일째를 시작으로 SC로 3x/wk x 4로 하였다. 선은 활성에 대한 미 국립 암 연구소의 기준(42%)을 나타낸다.
도 21은 NCCIT 이종 이식 종양을 삽입받고, DM4 또는 시스 플라티넘에 접합된 전장의 B3F6으로 처리된 누드 마우스의 평균 체중을 나타낸다. 마우스는 6(n=8), 10(n=8), 15(n=8), 및 25(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고, 비히클(n=16)을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고, 시스-플라티넘(n=8) 처리는 15일째를 시작으로 SC로 3x/wk x 4로 하였다. 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 22의 패널 A 및 B는 종양 중량의 변화로서 입증되는 바, 15일째 및 재성장시 투여된 DM4에 접합된 전장의 B3F6, 및 시스-플라티넘에 접합된 전장의 B3F6가 누드 마우스에서 확립된 NCCIT 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 25(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 15일째 한번, 10(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 15일, 37일, 및 44a일째 투여하고, 비히클(n=16)을 IV로 q7dx3으로 투여하고, 시스-플라티넘(n=8)은 15일째를 시작으로 SC로 2mg/kg 3x/wk으로 투여하였다. 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다. 패널 A는 10mg/kg를 투여받은 마우스 모두에 대 한 조합된 데이타를 나타낸다. 패널 B는 15일, 37일, 및 44a일째 10mg/kg을 투여받은 마우스(n=3)에 대한 데이터로부터 분리된, 15일 및 37일째 10mg/kg을 투여받은 마우스(n=5)에 대한 데이터를 나타낸다. (a44일째에는 마우스의 종양이 진행성 성장을 나타내는 3마리의 마우스에만 투여하였다).
도 23의 패널 A 및 B는 종양 중량의 변화로서 측정되는 바, 전장의 B3F6.1-DM4가 누드 마우스에서 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 확립된 NCCIT 인간 고환 종양을 갖는 누드 마우스는 25(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하여 IV로 15일째 한번 처리하고, 10(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하여 IV로 15일, 37일, 및 44a일째 처리하고, 비히클(n=16)을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고, 시스-플라티넘(n=8) 처리는 15일째를 시작으로 SC로 2mg/kg 3x/wk으로 하였다. 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다. 패널 A는 70일째 개체의 종양 중량을 나타낸다. 패널 B는 107일째 남아있는 처리군의 개체의 종양 중량을 나타낸다. 각각의 점은 마우스 1마리의 종양 중량을 나타내고, 선은 각 군의 평균 종양 중량을 나타낸다.
도 24 패널 A 및 B는 DM4 또는 시스-플라티넘에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 확립된 NCCIT 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 도면은 비히클 대조군의 평균 종양 크기의 퍼센트로서 시험군의 평균 종양 크기 비교를 나타낸다. 확립된 NCCIT 인간 고환 종양을 갖는 누드 마우스는 25(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하여 IV로 15일째 한번 처리하고, 10(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하 여 IV로 15일, 37일, 및 44a일째 처리하고, 비히클(n=16)을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리하고, 시스-플라티넘(n=8) 처리는 15일째를 시작으로 SC로 2mg/kg 3x/wk으로 하였다. 패널 A는 10mg/kg를 투여받은 마우스 모두에 대한 조합된 데이타를 나타낸다. 패널 B는 15일, 37일, 및 44a일째 10m/kg/inj을 투여받은 마우스(n=3)에 대한 데이터로부터 분리된, 15일 및 37일째 10m/kg/inj을 투여받은 마우스(n=5)에 대한 데이터를 나타낸다. 가로선은 활성에 대한 미 국립 암 연구소의 기준(42%)을 나타낸다. (a44일째에는 마우스의 종양이 진행성 성장을 나타내는 3마리의 마우스에만 투여하였다).
도 25의 패널 A 및 B는 확립된 NCCIT 인간 고환 종양을 갖고, 25(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하여 IV로 15일째 한번 처리되고, 10(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 사용하여 IV로 15일, 37일, 및 44a일째 처리되고, 비히클(n=16)을 사용하여 IV로 q7dx3으로 처리되고, 시스-플라티넘(n=8) 처리는 15일째를 시작으로 SC로 2mg/kg 3x/wk으로 되어진 누드 마우스의 평균 체중을 나타낸다. 패널 A는 10mg/kg를 투여받은 마우스 모두에 대한 조합된 데이타를 나타낸다. 패널 B는 15일, 37일, 및 44a일째 10mg/kg을 투여받은 마우스(n=3)에 대한 데이터로부터 분리된, 15일 및 37일째 10mg/kg을 투여받은 마우스(n=5)에 대한 데이터를 나타낸다. (a 44일째에는 마우스의 종양이 진행성 성장을 나타내는 3마리의 마우스에만 10mg/kg을 투여하였다).
도 26은 13일, 17일 및 21일째 IV로 투여된 10(n=8) 및 20(n=8)mg/kg의 전장의 B3F6.1-DM4(화살표로 표시), 14일째를 시작으로 IV로 3x/wk x 4으로 투여된 비히클(n=16), 및 13-14일, 17-21일, 24-26일째 SC로 투여된 10mg/kg의 캄프토사(Camptosar)(n=8)가 누드 마우스에서 확립된 Calu-6 이종 이식 종양의 종양 중량 변화에 미치는 효과를 나타낸다. 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 27은 DM4에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 확립된 Calu-6 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 마우스를 13일, 17일 및 21일째 IV로 10(n=8) 및 20(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4로 처리하고, 비히클(n=16)은 14일째를 시작으로 IV로 3x/wk x 4로 처리하고, 13-14일, 17-21일, 24-26일째 SC로 10mg/kg의 캄프토사(n=8)로 처리하였다. 각각의 점은 마우스 1마리의 종양 중량을 나타내고, 선은 각 군의 평균 종양 중량을 나타낸다.
도 28은 DM4 또는 캄프토사에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 확립된 Calu-6 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 도면은 비히클 대조군의 평균 종양 크기의 퍼센트로서 시험군의 평균 종양 크기 비교를 나타낸다. 확립된 Calu-6 이종 이식 종양을 갖는 누드 마우스를 13일, 17일 및 21일째 IV로 10(n=8) 및 20(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4로 처리하고, 비히클(n=16)은 14일째를 시작으로 IV로 3x/wk x 4로 처리하고, 13-14일, 17-21일, 24-26일째 SC로 10mg/kg의 캄프토사(n=8)로 처리하였다. 선은 활성에 대한 미 국립 암 연구소의 기준(42%)을 나타낸다.
도 29는 확립된 Calu-6 이종 이식 종양을 갖고, DM4에 접합된 전장의 B3F6으 로 처리된 누드 마우스의 평균 체중을 나타낸다. 13일, 17일 및 21일째 IV로 10(n=8) 및 20(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4로 처리하고(화살표로 표시), 비히클(n=16)은 14일째를 시작으로 IV로 3x/wk x 4로 처리하고, 13-14일, 17-21일, 24-26일째 SC로 10mg/kg의 캄프토사(n=8)로 처리하였다. 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 30은 DM4 또는 캄프토사에 접합된 전장의 B3F6이 누드 마우스에서 확립된 Calu-6 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 15(n=8) 및 30(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4를 IV로 q7dx3(화살표로 표시)로 투여하고, 비히클(n=16)은 14일째를 시작으로 IV로 3x/wk x 4로 투여하고, 10mg/kg의 캄프토사(n=8)는 13-14일, 17-21일, 24-26일째 SC로 투여하였다. 확립된 Calu-6 이종 이식 종양의 종양 중량 변화를 나타낸다. 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 31은 전장의 B3F6.1-DM4가 누드 마우스에서 확립된 Calu-6 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 확립된 Calu-6 이종 이식 종양을 갖는 누드 마우스를 IV로 q7dx3으로 15(n=8) 및 30(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4로 처리하고, 비히클(n=16)은 14일째를 시작으로 IV로 3x/wk x 4로 처리하고, 13-14일, 17-21일, 24-26일째 SC로 10mg/kg의 캄프토사(n=8)로 처리하였다. 각각의 점은 마우스 1마리의 종양 중량을 나타내고, 선은 각 군의 평균 종양 중량을 나타낸다.
도 32는 DM4 또는 캄프토사에 접합된 전장의 B3F6이 마우스에서 확립된 Calu-6 이종 이식 종양에 미치는 효과를 나타낸다. 데이타는 비히클 대조군의 평균 종양 크기의 퍼센트로서 시험군의 평균 종양 크기 비교로 나타낸다. 확립된 Calu-6 이종 이식 종양을 갖는 누드 마우스를 IV로 q7dx3으로 15(n=8) 및 30(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4로 처리하고, 비히클(n=16)은 14일째를 시작으로 IV 3x/wk x 4로 처리하고, 13-14일, 17-21일, 24-26일째 SC로 10mg/kg의 캄프토사(n=8)로 처리하였다. 선은 활성에 대한 미 국립 암 연구소의 기준(42%)을 나타낸다.
도 33은 확립된 Calu-6 인간 폐 역형성 종양을 갖고, IV로 q7dx3으로 15(n=8) 및 30(n=8)mg/kg의 B3F6.1-DM4로 처리되고(화살표로 표시), 비히클(n=16)는 14일째를 시작으로 IV로 3x/wk x 4로 처리되고, 13-14일, 17-21일, 24-26일째 SC로 10mg/kg의 이리노테칸(n=8)으로 처리된 누드 마우스의 체중을 나타낸다. 세로선은 평균의 표준 오차를 나타낸다.
본 발명의 요약
본 발명은 적어도 부분적으로 CDR이 이식된 항체 및 다른 인간화된 항-크립토 항체의 개발에 기초한다. 하기에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 다중 형태의 인간화된 항-크립토 항체가 개발되었고, 이는 동물 모델에서 종양 성장에 대해 시험하기 위하여 마이탄시노이드에 접합되었다. 본 실시예에서 제시하는 결과를 통해 생체내에서 종양 세포 성장을 저해하는 이들 항체의 유용성이 입증되었다. 인간 대상에서 사용하기에는 이들 인간화된 항-크립토 항체가 마우스 항체보다 더욱 적합하다.
인간화된 전장의 항체 및 CH2 도메인이 결실된 인간화된 항체, 양자 모두가 제조되었다. CH2 도메인이 결실된 항체 조성물은 상이한 이소폼(분자중 일부는 적어도 하나의 쇄내 이황화 결합에 의해 연결되어 있는 2개의 중쇄 부위을 포함하고(A형), 분자중 일부는 적어도 하나의 쇄내 이황화 결합에 의해 연결되어 있지 않은 2개의 중쇄 부위을 포함하는(B형), 2개의 중쇄 부위을 포함하는 분자들)을 포함하는 이량체 결합 분자의 혼합물을 포함한다. 예를 들면, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 분리시키거나, A형 또는 B형중 어느 것을 우선적으로(preferentially) 생합성시키는 합성 연결 펩티드를 포함시킴으로써 하나의 형태 또는 나머지 하나의 형태를 우선적으로 수득할 수 있다. 본 발명의 연결 펩티드는 A형 및 B형, 양자 모두를 형성하는 경향을 있는 임의의 이량체 분자, 예를 들면, 항체 분자, 도메인이 결실된 항체 분자(예를 들면, CH2 도메인 모두가 또는 그의 일부가 결실된 것), 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 융합 단백질 등에 포함될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, A형의 형성이 증진된다. A형 폴리펩티드 이량체는 시험관내에서는 증진된 안정성을, 생체내에서는 증진된 생물학적 분포를 나타낸다.
따라서, 하나의 일면에서 본 발명은
CDR L1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열 번호 9),
CDR L2: KVSNRFS(서열 번호 10),
CDR L3 : FQGSHVPLT(서열 번호 11),
CDR H1: SYWIH(서열 번호 12),
CDR H2: ENDPSNGRTNYNEKFKN(서열 번호 13), 및
CDR H3: GPNYFYSMDY(서열 번호 14)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열, 및 인간 수용체 면역글로불린 서열로부터의 가변 프레임워크 영역 서열을 포함하되, 인간 크립토 항원에 특이적으로 결합하는 결합 분자에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 CDR H3 서열 GPNYFYSMDY(서열 번호 14)를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 결합 분자는 CDR H2 서열 ENDPSNGRTNYNEKFKN(서열 번호 13)을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 CDR H1 서열 SYWIH(서열 번호 12)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 CDR L3 서열 FQGSHVPLT(서열 번호 11)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 CDR L2 서열 KVSNRFS(서열 번호 10)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 CDR L1 서열 RSSQSIVHSNGNTYLE(서열 번호 9)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 가변 프레임워크 영역 서열중 적어도 하나의 프레임워크 잔기는 상응하는 마우스 B3F6 가변 영역 서열로부터의 상응하는 아미노산 잔기로 치환된다.
또다른 일면에서, 본 발명은 서열 번호 39의 CDRs 1-3 및 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 40의 CDRs 1-3 및 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하되, 인간 크립토 항원에 특이적으로 결합하는 결합 분자에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 중쇄로부터의 가변 프레임워크 영역은 서열 번호 40의 프레임워크 및 CDR 영역과 적어도 약 50% 일치한다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 중쇄로부터의 가변 프레임워크 영역은 인간 1 서브그룹(subgroup) 서열, 인간 1 아군 공통서열, 또는 인간 배선 서열로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 중쇄로부터의 가변 프레임워크 영역은 서열 번호 46에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열로부터의 가변 프레임워크 영역은 서열 번호 39의 프레임워크 및 CDR 영역과 적어도 약 60% 일치한다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열로부터의 가변 프레임워크 영역은 인간 아군 카파(Kappa) 2 서열, 인간 아군 카파 2 공통서열, 또는 인간 배선 서열로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열로부터의 가변 프레임워크 영역은 서열 번호 45에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 중쇄로부터의 가변 프레임워크 영역중 적어도 하나의 프레임워크 잔기는 서열 번호 40에 나타낸 마우스 아미노산 서열로부터의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되되, 여기에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기는
a) 정규(canonical) 잔기,
b) 계면 패킹(interface packing) 잔기,
c) 결합 부위 가까이에 있는 드문(unusual) 또는 희귀(rare) 잔기,
d) CDR중 몇몇 원자와 약 3 Å 단위이내에 측쇄 원자를 갖는 잔기이다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 프레임워크 잔기는 H1, H48, H67, H71, H73, H81, H82b, H93, 및 H112(카뱃(Kabat) 번호화 체계)로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 프레임워크 잔기는 H48, H67, H71, H73, H93, 및 H112를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 프레임워크 잔기는 H71 및 H112이다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 프레임워크 잔기는 H1, H48, H71, H81, H82b, 및 H112를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열로부터의 가변 프레임워크 영역중 적어도 하나의 프레임워크 잔기는 서열 번호 39에 나타낸 마우스 서열로부터의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되되, 여기에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기는
a) 정규 잔기,
b) 계면 패킹 잔기,
c) 결합 부위 가까이에 있는 드문 또는 희귀 잔기,
d) CDR중 몇몇 원자와 약 3 Å 단위이내에 측쇄 원자를 갖는 잔기이다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열로부터의 가변 프레임워크 영역은 L2 또는 L1OO(카뱃 번호 체계)이다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열로부터의 가변 프레임워크 영역은 L2이다.
하나의 실시태양에서, 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열로부터의 가변 프레임워크 영역은 L2 및 L1OO을 포함한다.
또다른 일면에서, 본 발명은 서열 번호 47, 서열 번호 50, 및 서열 번호 52의 아미노산 잔기 1-112로 구성된 군으로부터 선택되는 VL 서열로 나타낸 CDR 및 프레임워크 아미노산 서열; 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 및 서열 번호 55의 아미노산 잔기 1-121로 구성된 군으로부터 선택되는 VH 서열로 나타낸 CDR 및 프레임워크 아미노산 서열; 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 중쇄를 포함하되, 인간 크립토 항원에 특이적으로 결합하는 결합 분자에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 52의 아미노산 잔기 1-112로 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 55의 아미노산 잔기 1-121로 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 47에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 48에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 47에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 49에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 47에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 51에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 50에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 48에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 50에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 49에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 50에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 51에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열, 및 임의로, 신호 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자 중쇄는 합성 연결 펩티드를 통해 유전적으로 VH, VL, 또는 CH1 도메인에 융합된 CH3 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자 중쇄에는 CH2 도메인 모두가 또는 그의 일부가 결실되어 있다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 이소타입의 항체로부터 유도된 불변 영역를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 γ1 힌지, γ2 힌지 γ3 힌지, 및 γ4 힌지로 구성된 군으로부터 선택되는 힌지 영역으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 키메라 힌지를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 IgG1 힌지 도메인의 적어도 일부분, IgG3 힌지 도메인의 적어도 일부분을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 239번 또는 242번 위치의(카뱃 번호 체계) 시스테인 잔기를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 야생형 Fc 영역과 비교할 때, 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 변형은, 변이체가 포유동물 세포에서 발현될 때 실질적으로 비글리코실화(aglycosylated) 되도록 하는 EU 297-299번 위치중 임의의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 야생형 Fc 영역을 갖는 결합 분자와 비교할 때, 저하된 효과기 기능을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 저하된 항원-의존 세포독성을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 증진된 반감기를 갖는다.
하나의 실시태양에서, 변형된 Fc 영역은 적어도 하나의 조작된 시스테인 잔기를 갖는다. 하나의 실시태양에서, 조작된 시스테인 잔기는 Fc 영역의 CH3 도메인내에 존재한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 효과기 부위(moiety)에 접합된 결합 분자에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 효과기 부위는 세포독소, 프로드러그, 생물학적 독소, 및 방사성 동위원소로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서, 효과기 부위는 아미드 결합을 통해 접합된다.
하나의 실시태양에서, 효과기 부위는 마이탄시노이드이다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 53에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열 번호 56에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 53에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄는 서열 번호 57로서 제시된 서열에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자가 γ1 이소타입의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자가 서열 번호 71에 나타낸 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
또다른 일면에서, 본 발명은 기탁 번호 ______하에 ATCC에 기탁된 세포주에 의해 생산된 인간화된 항-크립토 단일클론 항체에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 53으로서 제시된 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 58으로서 제시된 중쇄 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 54로서 제시된 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 56으로서 제시된 중쇄 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 54로서 제시된 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 57으로서 제시된 중쇄 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 54로서 제시된 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 58으로서 제시된 중쇄 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 52로서 제시된 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호 55로서 제시된 서열을 포함하는 중쇄을 포함한다.
또다른 일면에서, 본 발명은 서열 번호 52, 서열 번호 53, 및 서열 번호 54로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 포함하는 경쇄; 서열 번호 55; 서열 번호 56, 서열 번호 57, 및 서열 번호 58로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 포함하는 중쇄를 포함하되, 인간 크립토 항원에 특이적으로 결합하는, CH2 도메인이 결실된 결합 분자에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 53으로서 제시된 서열을 갖고, 중쇄는 경쇄는 서열 번호 60으로서 제시된 서열을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 53으로서 제시된 서열을 갖고, 중쇄는 경쇄는 서열 번호 61로서 제시된 서열을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 53으로서 제시된 서열을 갖고, 중쇄는 경쇄는 서열 번호 62로서 제시된 서열을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 54으로서 제시된 서열을 갖고, 중쇄는 경쇄는 서열 번호 60로서 제시된 서열을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 54으로서 제시된 서열을 갖고, 중쇄는 경쇄는 서열 번호 61로서 제시된 서열을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 54으로서 제시된 서열을 갖고, 중쇄는 경쇄는 서열 번호 62로서 제시된 서열을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 경쇄는 서열 번호 52으로서 제시된 서열을 갖고, 중쇄는 경쇄는 서열 번호 59로서 제시된 서열을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 결합 분자중 적어도 하나의 CDR에서 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 포함하도록 변경된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 이특이성이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 4가이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 전장의 항체이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 단편이다.
또다른 일면에서, 본 발명은 적어도 2개의 결합 부위 및 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 폴리펩티드 이량체를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 적어도 2개의 결합 부위중 적어도 하나는 인간화된 B3F6 가변 영역을 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄는 적어도 하나의 중쇄 부위 및 합성 연결 펩티드를 포함하며, 폴리펩티드 이량체중 약 70% 초과는 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결된 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 연결 펩티드는 카뱃 번호 체계에 따른 243번 위치에 프롤린 잔기를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 폴리펩티드 이량체중 90% 초과는 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결된다.
하나의 실시태양에서, 합성 연결 펩티드는 추가로 카뱃 번호 체계에 따른 239번 또는 242번 위치에 시스테인 잔기를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄는 연결 펩티드를 통해 VL, VH 또는 CH1 도메인에 연결된 CH3 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 합성 연결 펩티드는 추가로 카뱃 번호 체계에 따른 244번 위치에 알라닌 잔기, 및 245번 위치에 프롤린 잔기를 포함한다.
또다른 일면에서, 본 발명은 서열 번호 53에 나타낸 경쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 나타낸 중쇄 아미노산 서열을 포함하되, 마이탄시노이드에 접합되어 있는 인간화된 항-크립토 항체에 관한 것이다.
또다른 일면에서, 본 발명은 결합 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 서열 번호 53에 나타낸 경쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 나타낸 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 항-크립토 항체의 변이체로서, 여기에서, 상기 변이체는 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 포함하고, 상기 변이체는 인간 크립토에 특이적으로 결합하는 능력을 유지한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 결합 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자, 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그의 상보체와 혼성화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 핵산 분자는 벡터내에 존재한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 결합 분자가 생산되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포 또는 배양물로부터 결합 분자를 분리시키는 단계를 포함하는, 결합 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 결합 분자를 대상에게 투여하여 치료시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 결합 분자를 사용하는 치료법으로부터 이익을 얻도록 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 결합 분자가 발현되는 조건하에서 제1항 내지 제80항중 어느 한 항의 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자를 악성 종양을 앓는 환자에게 투여하여 환자에서 악성 종양이 치료되도록 하는 단계를 포함하는, 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 대상은 암으로 고생한다.
하나의 실시태양에서, 방법은 추가로 추가의 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 추가의 제제는 화학요법제이다.
하나의 실시태양에서, 추가의 제제는 나탈리주맵, 트라스투주맵, 베바시주맵, 인플릭시맵, 리툭시맵, 이브리투모맵 튜세탄, 세툭시맵, 레바미솔 하이드로클로라이드, 토시투모맵, 알렘투주맵, IMC-C225, 이메티닙 메실레이트, 풀베스트랜트, 아나스트로졸, 엑스메스탄 , 레트로졸, 타목시펜, 인터페론 알파, 데니류킨 디프티톡스, 오블리머센, 엘로티닙 HCl, 보르테조밉, 탈리도마이드, 및 엔도스타틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 일면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 결합 분자를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 세포에서의 크립토 발현에 따른 효과를 저해하는 방법에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자의 유효량은 적어도 약 5mg/kg이다.
또다른 실시태양에서, 결합 분자의 유효량은 적어도 약 10mg/kg이다
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 복강내, 경구, 비강내, 피하, 근육내, 국소, 또는 정맥내로 투여된다.
하나의 실시태양에서, 환자는 뇌, 유방, 고환, 결장, 폐, 난소, 방광, 자궁, 자궁 경부, 췌장 및 위로 구성된 군으로부터 선택되는 기관에서의 암으로 고생한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로 CDR이 이식된 항체 및 다른 인간화된 항-크립토 항체의 개발에 기초한다. 더욱 특히, 이들 항체는 마우스 항체 B3F6으로부터 유도된 것이다. 본 원에서 기술되는 바와 같이, 다중 형태의 인간화된 항-크립토 항체가 개발되었고, 이는 동물 모델에서 시험하기 위하여 마이탄시노이드에 접합되었다. 그 결과를 통해 생체내에서 종양 세포 성장을 저해하는 이들 항체의 유용성이 입증되었다. 인간 대상에서 사용하기에는 이들 인간화된 항-크립토 항체가 마우스 항체보다 적합하다.
인간화된 전장의 항체 및 CH2 도메인이 결실된 인간화된 항체, 양자 모두가 제조되었다. 전형적으로, 세포 배양물에서 생산된 CH2 도메인이 결실된 재조합 항체는 힌지 이종성을 초래하고, 이로써, 용액내 2가지 형태의 항체가 존재하게 된다. 천연(native) 용액내의 2가지 형태, 양자 모두는 이량체 단백질로서 존재한다(각각의 단량체는 하나의 중쇄와 하나의 경쇄를 포함한다). 하나의 면역글로불린 분자는, 이량체가 쇄간 중쇄 이황화 결합에 의해 결합되어 있는 대략 150-160kDa의, 안정적인 4개의 쇄 작제물(A형)을 포함하고, 하나는, 이량체가 쇄간 중쇄 이황화 결합에 의해 결합되어 있지 않는 형태(B형)를 포함한다. B형 또한 천연 조건하에서 안정적인 이량체를 형성하지만, 변성, 비환원 조건하에서 중쇄는 해리되고, 이로써 75-80kDa 분자가 수득됨으로써 B형이 동정될 수 있다. 이러한 형태들은 MAb 친화성 정제 후에도 분리시키기가 극도로 어려웠다.
여러 가지의 온전한(intact) IgG 이소타입중 B형이 빈번하게 출현하는 것은 제한하는 것은 아니지만, MAb 분자의 힌지 영역 이소타입과 관련된 구조상의 차이에 기인하는 것이다. 실제로 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역중 1개의 아미노산 치환이 B형의 출현을, 인간 IgG1 힌지를 사용할 때 전형적으로 관찰되는 수준까지 현저히 감소시킬 수 있다[Angal et al. 1993. 분자 Immunology 30:105]. 그러나, 동일한 아미노산 치환을 CH2 도메인이 결실된 항체에 적용시킬 경우, 제제로부터 B형을 제거하지 못한다.
본 원에서 기술되는 바와 같이, 본 발명의 인간화된 크립토 결합 분자내 특정 연결 펩티드를 포함시킴으로써 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결된 폴리펩티드 이량체 또는 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되지 않은 폴리펩티드 이량체를 선택적으로 생합성시킬 수 있다.
본 발명을 추가로 설명하기 앞서, 편의상 특정 용어를 하기에 설명한다:
I. 정의
본 발명의 결합 분자는, 인간 크립토 분자에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자이다. 인간 크립토의 예시적인 서열을 서열 번호 6(CR-1) 및 서열 번호 7(CR-3)로 나타낸다. CR-1은, 미분화된 인간 기형암종 세포에서 발현되는 인간 크립토 단백질을 코딩하는 구조 유전자에 상응하고, CR-3은, 침묵성(silent) 및 대체성 치환 양자 모두를 나타내는, 코딩 영역내 7개의 염기 치환을 포함하고 있는 완전 카피 mRNA에 상응한다. CR-1은 염색체 3으로 지도화되고, CR-3은 Xq21-q22로 지도화된다[Dono et al. 1991. Am J Hum Genet. 1991 49:555].
본 발명의 결합 분자는 뮤린 B3F6 항체로부터 유도된 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 뮤린 B3F6 항체는 크립토의 아미노산 잔기 46-62에 이르는(spanning) 도메인내의 에피토프에 결합한다. 뮤린 B3F6 항체(B3F6.17로도 언급됨)를 제조하는 하이브리도마는 기탁 번호 PTA-3319하에 ATCC에 기탁되었다. CHO 세포에서 발현되는 크립토 융합 단백질로 마우스를 면역화시켜 항체를 제조하였다. 면역화에 사용되는 융합 단백질은, 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된, 크립토의 아미노산 잔기 1 내지 169[서열 번호 6의 아미노산 1-169]를 포함하였다(상기 작제물은 CR(delC)-FC로 언급됨). B3F6 항체 제조 방법은 예를 들면, WO 02/088170에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 지정된 단백질"로부터 유도(또는 유래)되었다는 것"은 폴리펩티드의 기원을 언급하는 것이다. 하나의 실시태양에서, 특정의 출발 폴리펩티드로부터 유도된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 CDR 서열 또는 그와 관련된 서열이다. 하나의 실시태양에서, 특정의 출발 폴리펩티드로부터 유도된 아미노산 서열은 비인접성이다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDRs는 출발 항체로부터 유도된다. 하나의 실시태양에서, 특정의 출발 폴리펩티드 또는 아미노산 서열로부터 유도된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 본질적으로 출발 서열, 또는 그의 일부분의 것과 일치하는 아미노산을 갖되, 여기에서, 상기 일부분이란 적어도, 적어도 3-5개의 아미노산, 5-10개의 아미노산, 적어도 10-20개의 아미노산, 적어도 20-30개의 아미노산, 또는 적어도 30-50개의 아미노산으로 구성되거나, 다르게는, 본 분야의 당업자에게 출발 서열내 그의 기원을 갖는 것으로 식별될 수 있는 것이다. 하나의 실시태양에서, 출발 항체로부터 유도된 하나 이상의 CDR 서열은 변이체 CDR 서열을 생산하도록 변경되되, 여기에서, 변이체 CDR 서열은 크립토 결합 활성은 유지한다.
본 발명의 결합 분자는, 아미노산 서열에 있어 그들이 유도되어진 B3F6 분자와 상이하도록 변형될 수 있다는 것도 본 분야의 당업자들은 이해할 것이다. 예를 들면, "비필수" 아미노산 잔기(예를 들면, CDR 및/또는 프레임워크 잔기)에서 보존적 치환 또는 변화를 이끄는 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환이 이루어질 수 있다(예로서, CDR 및/또는 프레임워크 잔기에서). 본 발명의 결합 분자는 크립토에 결합하는 능력을 유지한다.
하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 코딩되는 단백질내로 도입되도록 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열내로 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 도입함으로써 폴리펩티드의 비자연적 변이체를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 생산할 수 있다. 돌연변이는 예로서, 부위-지향성 돌연변이 유발법(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이 유발법(PCR-mediated mutagenesis)과 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 이루어진다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 비롯한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 군들이 본 분야에 정의되어 있다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩티드내 비필수 아미노산 잔기는 동일 측쇄 군으로부터의 또다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 일련의 아미노산은 측쇄 군 일원의 순서 및/또는 조성에서 차이가 나는, 구조적으로 유사한 일련의 것으로 대체될 수 있다.
다르게는, 또다른 실시태양에서, 돌연변이는 면역글로불린 코딩 서열 모두 또는 그의 일부를 따라 무작위적으로 도입될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 결합 분자는 하나의 결합 부위를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 결합 분자는 적어도 2개의 결합 부위를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 결합 분자는 2개의 결합 부위를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 결합 분자는 3개의 결합 부위를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 결합 분자는 4개의 결합 부위를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 단량체이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 다량체이다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 이량체이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 일치하는 단일 서브유니트 2개를 포함하는 동종이량체이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 일치하지 않는 단일 서브유니트 2개를 포함하는 이종이량체이다. 이량체의 서브유니트는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 이량체는 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 이량체는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 이량체는 4개의 폴리펩티드 쇄(예를 들면, 항체 분자의 경우에서와 같음)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 결합 분자는 인간 아미노산 서열로부터 유도된 프레임워크 및 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 결합 폴리펩티드는 또다른 포유동물 종으로부터 유도된 프레임워크 및/또는 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 영장류의 프레임워크 영역(예를 들면, 비인간형(non-human) 영장류), 중쇄 부위, 및/또는 힌지 부분이 본 결합 분자에 포함될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 하나 이상의 뮤린 아미노산은 결합 폴리펩티드의 프레임워크 영역에 존재할 수 있고, 예를 들면, 인간 또는 비인간형 영장류의 프레임워크 아미노산 서열은, 상응하는 뮤린 아미노산 잔기가 존재하는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 결합 분자는 출발 B3F6 뮤린 항체보다 면역원성이 낮다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "중쇄 부위"은 면역글로불린 중쇄로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 부위을 포함하는 폴리펩티드는 CH1 도메인, 힌지(예를 들면, 상부, 중앙부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 단편중 적어도 하나를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드에는 CH2 도메인의 적어도 일부분(예를 들면, CH2 도메인 모두 또는 그의 일부)이 결실되어 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 완전 Ig 중쇄를 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 이러한 도메인들(예를 들면, 중쇄 부위)은 아미노산 서열에 있어 자연적으로 발생된 면역글로불린 분자와는 상이하도록 변형될 수 있다는 것을 본 분야의 당업자들은 이해할 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄는 항체 또는 면역글로불린 분자로부터 유도된 적어도 하나의 중쇄 부위을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드의 적어도 2개의 중쇄 부위는 상이한 폴리펩티드 쇄상에 존재하고, 예를 들면, 적어도 하나의 이황화 결합(A형)을 통해, 또는 비공유 상호작용(B형)을 통해 상호작용함으로써 이량체 폴리펩티드를 형성하되, 상기 이량체의 각각의 단량체는 적어도 하나의 중쇄 부위를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 이량체중 하나의 폴리펩티드 쇄의 중쇄 부위는 이량체중 또하나의 폴리펩티드 쇄의 것과 일치한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 이량체중 단량체들(또는 반량체(half-mers))은 서로서로 일치한다. 또다른 실시태양에서, 상기들은 일치하지 않는다. 예를 들면, 각각의 단량체는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 예를 들면, 이황화 결합과 같은 공유 상호작용에 의해 결합한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 2개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 3개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 4개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 5개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 6개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 7개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 8개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 9개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 하나 이상의, 바람직하게, 10개의 이황화 결합에 의해 결합한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 이량체는 이황화 결합에 의해 결합하지 않고, 비공유 상호작용에 의해 결합한다.
폴리펩티드의 중쇄 부위는 상이한 면역글로불린 분자로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 중쇄 부위는 IgG1 분자로부터 유도된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유도된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또다른 일례로, 중쇄 부위는 부분적으로 IgG1 분자로부터, 및 부분적으로 IgG3 분자로부터 유도된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또다른 일례로, 중쇄 부위는 부분적으로 IgG1 분자로부터, 및 부분적으로 IgG4 분자로부터 유도된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "경쇄 부위"는 면역글로불린 경쇄로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 경쇄 부위는 VL 또는 CL 도메인중 적어도 하나를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 Ig 분자로부터 유도되지 않은 아미노산 서열 또는 하나 이상의 부위를 포함한다. 예시적인 변형에 대해서는 하기에 보다 상세히 기술한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 가요성 링커(flexible linker) 서열을 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 관능성 부위(예를 들면, PEG, 약물, 프로드러그, 및/또는 검출가능한 표지)을 첨가하기 위하여 변형될 수 있다.
"키메라" 단백질은 성질상 제2 아미노산 서열과 자연적으로는 연결되지 않는, 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열은 보통 융합 폴리펩티드로 접합되는(brought together) 개별 단백질에 존재할 수 있거나, 보통 동일 단백질에 존재할 수 있지만, 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치된다. 키메라 단백질은 예를 들면, 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 원하는 관계로 코딩되는 폴리펩티드를 생성하고 해독시킴으로써 키메라 단백질을 생산할 수 있다. 예시적인 키메라 폴리펩티드는 본 발명의 융합 단백질 및 키메라 힌지 연결 펩티드를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 융합 단백질이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 결합 도메인(적어도 하나의 결합 부위를 포함) 및 이량체화 도메인(적어도 하나의 중쇄 부위를 포함하는)을 포함하는 키메라 분자이다. 중쇄 부위는 임의의 면역글로불린, 예로서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형(subtypes), IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터의 것일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 융합 단백질은 추가로 합성 연결 펩티드를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 결합 분자는 "항체-융합 단백질 키메라"이다. 그러한 분자는 항체의 적어도 하나의 결합 도메인과 적어도 하나의 융합 단백질을 결합시키는 분자를 포함한다. 바람직하게, 2개의 폴리펩티드 사이의 계면은 면역글로불린 분자의 CH3 도메인이다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 적용되는 용어 "이종성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 유전자형에 있어 그와 비교되는 나머지 실재(entity)의 것과 상이한 실재로부터 유도되었음을 의미한다. 예를 들면, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 항원은 상이한 종, 상이한 세포 종류, 또는 상이한 개체의 동일한 세포 종류로부터 유도될 수 있다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "리간드 결합 도메인" 또는 "리간드 결합 부위"는 임의의 천연 수용기(예를 들면, 세포 표면 수용기), 또는 상응하는 천연 수용기의 적어도 정성(qualitative) 리간드 결합 능력, 및 바람직하게, 생물학적 활성을 유지하는, 그의 임의의 영역 또는 유도체를 언급한다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "수용기 결합 도메인" 또는 "수용기 결합 부위"는 임의의 천연 리간드, 또는 상응하는 천연 리간드의 적어도 정성 수용기 결합 능력, 및 바람직하게, 생물학적 활성을 유지하는, 그의 임의의 영역 또는 유도체를 언급한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 "항체" 또는 "면역글로불린" 분자, 예를 들면, 자연적으로 발생된 항체 또는 면역글로불린 분자(또는 그의 항원 결합 단편) 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 유전자 조작된 항체 분자를 언급한다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "면역글로불린"은, 그가 임의의 관련된 특이 면역반응성을 갖는지 여부와는 상관없이, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 결합물(combination)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "항체"는 관심의 대상이 되는 항원(예를 들면, 종양과 관련된 항원)에 대하여 현저히 공지된 특이적인 면역반응 활성을 갖는 어셈블리를 언급한다. 항체 및 면역글로불린는 경쇄 및 중쇄를 포함하는데, 이들 사이의 쇄간 공유 결합 여부와는 상관없이 포함한다. 척추동물계에서의 기본 면역글로불린 구조는 상대적으로 잘 이해되고 있다.
하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바, "면역글로불린" 이라는 일반 용어는 생화학적으로 식별가능한 5개의 상이한 부류의 항체를 포함한다. 5개 부류의 항체 모두 본 발명의 범주 내에 있고, 하기에서는 일반적으로 IgG 부류의 면역글로불린 분자에 대하여 논의될 것이다. IgG와 관련하여, 면역글로불린은 분자량이 대략 23,000 돌턴인 2개의 일치하는 경쇄 폴리펩티드와 분자량이 53,000-70,000인 2개의 일치하는 중쇄를 포함한다. 상기 4개의 쇄는 이황화 결합에 의해 "Y" 구조로 연결되어 있으며, 여기에서, 경쇄는, "Y"의 입구 부분에서 시작하여 가변 영역까지 이어져 있는 중쇄를 일괄한다(bracket).
경쇄 및 중쇄 양자 모두는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 부위의 가변 도메인(VL) 및 중쇄 부위의 가변 도메인(VH), 양자 모두가 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것이 이해될 것이다. 반대로, 중쇄 부위의 불변 도메인(CL) 및 중쇄 부위의 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3)은 중요한 생물학적 특성, 예로서, 분비, 태반경유 이동성, Fc 수용기 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관례상, 불변 영역 도메인의 번호화는 불변 영역이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단(terminus)으로부터 멀어질수록 증가한다. N-말단은 가변 부위이고, C-말단 부분은 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단을 포함한다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "가변 영역 CDR 아미노산 잔기"는 서열 또는 구조 기반 방법을 사용하여 확인된, CDR 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region)내 아미노산을 포함한다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 양자 모두의 가변 영역내에서 발견되는, 비인접성 항원 결합 부위를 의미한다. 이들 특정 영역은 ([Kabat et al., J. Biol. Cliem. 252, 6609-6616(1977)] 및 [Kabat et al., Sequences of Protein of immunological interest.(1991)], 및 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)] 및 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745(1996)])에 기재되어 있되, 상기 문헌에서는 서로서로에 대하여 비교할 때, 아미노산 잔기가 중첩하거나, 아미노산 잔기의 서브세트(subset)인 것으로 정의된다. 상기 인용되는 각각의 참고문헌에 의해 정의되는 바와 같은 CDRs를 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해 기재한다. 바람직하게, 용어 "CDR"은 서열 비교에 기초한 카뱃에 의해 정의된 CDR이다.
CDR 정의
카뱃1 코티아(Chothia)2 맥컬럼(McCallum)3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
1잔기 번호화는 [Kabat et al., 상기 동일]의 명명법에 따른다. 2잔기 번호화는 [Chothia et al., 상기 동일]의 명명법에 따른다. 3잔기 번호화는 [MacCallum et al., 상기 동일]의 명명법에 따른다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "가변 영역 프레임워크(FR: framework) 아미노산 잔기"는 Ig 쇄의 프레임워크 영역내의 아미노산을 언급한다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR 영역"은 가변 영역의 일부이지만, CDRs의 일부는 아닌 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들면, CDRs의 카뱃 정의 사용). 따라서, 가변 영역 프레임워크의 길이는 약 100-120개의 아미노산으로 이루어지지만, CDRs를 제외한 아미노산만을 포함한다. 중쇄 가변 영역의 특정 일례 및 CDRS에 대해에 카뱃에 의해 정의된 바에 따르면, 프레임워크 영역 1은 아미노산 1-30을 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 프레임워크 영역 2는 아미노산 36-49를 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하며; 프레임워크 영역 3은 아미노산 66-94를 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 프레임워크 영역 4는 아미노산 103번부터 가변 영역의 종단(end)까지의 가변 영역의 도메인에 상응한다. 경쇄의 프레임워크 영역은 경쇄의 가변 영역 CDRs 각각에 의해 유사하게 분리된다. 유사하게, 코티아 등 또는 맥컬럼 등에 의한 CDRs 정의의 사용으로 상기 기술된 바와 같이 프레임워크 영역 경계는 각개의 CDR 말단에 의해 분리된다. 바람직한 실시태양에서 CDRs는 카뱃에 의해 정의된 바와 같다.
자연적으로 발생된 항체에서, 각각의 단량체 항체상에 존재하는 6개의 CDRs는, 항체가 수성 환경에서 삼차원 구조를 취할 때 항원 결합 부위를 형성하도록 특이적으로 배치되는 짧은 비인접성 아미노산 서열이다. 나머지 중쇄 및 경쇄 가변 도메인중 나머지는 아미노산 서열상의 분자간 변이는 적게 나타나고, 이것이 프레임워크 영역로 명명되는 것이다. 프레임워크 영역은 대개 β-시트 구조를 취하고, CDRs는 β-시트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 이러한 프레임워크 영역은, 쇄간, 비공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 6개의 CDRs를 배치시키는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDRs에 의해 형성된 항원 결합 부위가 면역반응성 항원상의 에피토프에 상보적인 표면을 한정짓는다. CDRs의 위치는 본 분야의 당업자에 의해 용이하게 동정될 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 다양한 면역글로불린 부류의 불변 부위의 서브유니트 구조 및 3차원 구조는 잘 공지되어 있다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄 맨 앞(대체로 아미노 말단)의 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인과 인접해 있고, 아미노 말단은 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 인접해 있다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "CH2 도메인"은 예를 들면, 통상의 번호화 체계(카뱃 번호 체계 사용시 잔기 244번부터 360번; EU 번호 체계 사용시 잔기 231번부터 340번)[Kabat EA et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH. 1991)를 사용할 때 항체의 잔기 244번부터 잔기 360번에 이르는 중쇄 분자 부위를 포함한다. CH2 도메인은 또다른 도메인과는 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특한 것이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 당쇄는 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. CH3 도메인은 CH2 도메인부터 IgG 분자의 C-말단까지 이어지고, 대략 108개의 잔기를 포함하는 것으로도 잘 보고되어 있다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결시키는 중쇄 분자 부위를 포함한다. 이러한 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하며, 가용성인 바, 2개의 N-말단 항원 결합 영역은 독립적으로 움직일 수 있다. 힌지 영역은 3개의 상이한 도메인: 상부, 중앙부, 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다[Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083].
경쇄는 카파 또는 람다(κ,λ)로 분류된다. 각 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합할 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로서로 공유 결합하고, 2개의 중쇄의 "후단(tail)" 부위는, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때, 공유 이황화 결합 또는 비공유 결합에 의해 서로서로 결합한다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구조의 포크형 종단의 N-말단으로부터 각 쇄 기저의 C-말단까지 이어진다. 본 분야의 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)로 분류되며, 이증 몇몇은 하부부류(예를 들면, γ1-γ 4)를 갖는다는 것을 이해할 것이다. 항체의 "부류"를 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 각각 결정짓는 것은 쇄의 성질이다. 면역글로불린의 하위부류(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 특징화되어 있고, 기능상의 분화를 부여하는 것으로 공지되어 있다. 이들 부류 및 이소타입 각각의 변형된 버전은 본 개시와 관련하여 본 분야의 당업자에게 용이하게 분별될 수 있고, 따라서, 이는 본 발명의 범주내에 있다.
상기 언급한 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원상의 에피토프를 인식하고 그에 특이적으로 결합할 수 있도록 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인은 결합하여 항원 결합 부위를 한정짓는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 구조의 항체는 Y 각각 팔(arm) 종단에 위치하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더욱 특히, 항원 결합 부위는 각 VH 및 VL 쇄상의 3개의 상보성 결정 영역(CDRs)에 의해 한정지어 진다.
용어 "단편"은 온전한 또는 완전 항체 또는 항체 쇄보다 적은 아미노산 잔기를 포함하고 있는 항체 또는 항체 쇄의 일부분 또는 부위를 언급한다. 용어 "항원-결합 단편"은 항원과 결합하거나 항원 결합(즉, 특이 결합)을 위해 온전한 항체(즉, 그들이 유도된 온전한 항체)와 경쟁하는, 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 언급한다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 항체 분자의 "단편"은 항체의 항원-결합 단편, 예를 들면, 항체 경쇄(VL), 항체 중쇄(VH), 단일쇄 항체(scFv), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 및 단일 도메인 항체 단편(DAb)을 포함한다. 단편은 예를 들면, 온전한 또는 완전 항체 또는 항체 쇄를 화학적으로 또는 효소적으로 처리하거나, 재조합 수단에 의해 수득할 수 있다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "결합 부위"는 관심의 대상이 되는 표적 분자(예를 들면, 항원, 리간드, 수용기, 기질 또는 저해제)와의 선택적 결합을 담당하는 폴리펩티드 영역을 포함한다. 결합 도메인은 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 예시적인 결합 도메인은 항체 가변 도메인, 리간드의 수용기 결합 도메인, 수용기의 리간드 결합 도메인 또는 효소 도메인을 포함한다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "결합가(valency)"는 폴리펩티드에서 잠재적인 표적 결합 부위의 갯수를 언급한다. 각각의 표적 결합 부위는 하나의 표적 또는 표적 분자상의 특정 부위와 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드가 하나 이상의 표적 결합 부위를 포함하는 경우, 각각의 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들면, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다). 본 결합 분자는 인간 크립토 분자에 특이적인 결합 부위를 적어도 하나 갖는다.
용어 "특이성"은 주어진 표적에 특이적으로 결합(예를 들면, 주어진 표적과 의 면역반응)할 수 있는 능력을 언급한다. 폴리펩티드는 단특이성일 수 있고 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있거나, 폴리펩티드는 다특이성일 수 있고 동일하거나 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 표적에 대하여 특이적이다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 다특이성 결합 분자는 종양 세포상에서 발현되는 크립토 및 제2의 분자에 결합한다. 종양 세포상에서 발현되는 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 예시적인 항체는 본 분야에 공지되어 있고, 그러한 항체로부터의 하나 이상의 CDRs는 본 발명의 결합 분자에 포함될 수 있다. 예시적인 항체로는 2B8, Lym 1, Lym 2, LL2, Her2, B1, MB1, BH3, B4, B72.3, 5E8, 및 5E10을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CD20에 결합하는 C2B8 항체이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 TAG72를 인식하는 CC49 항체이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 연결 펩티드를 포함한다. 본 발명의 연결 펩티드는 합성된 것이다. 본 원에서 사용되는 바, 폴리펩티드와 관련하여 용어 "합성된 것"은 자연발생적으로 발생되지 않은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 자연발생적으로 발생되지 않은 폴리펩티드는 예를 들면, 자연적으로 발생된 폴리펩티드의 변형된 형태(예를 들면, 돌연변이, 예로서, 첨가, 치환 또는 결실 포함)이거나, 성질상 자연적으로는 제2 아미노산 서열(자연적으로 발생될 수 있거나 발생되지 않을 수 있는 것)에 연결되지 않되, 선형의 아미노산 서열에서 제2 아미노산 서열에 연결되어 있는 제1 아미노산 서열(자연적으로 발생될 수 있거나 발생되지 않을 수 있는 것)을 포함한다.
본 발명의 연결 펩티드는 본 발명의 결합 분자의 2개의 도메인(예를 들면, 결합 도메인 및 이량체화 도메인)을 연결시킨다. 예를 들면, 연결 펩티드는 결합 부위를 포함하는 결합 도메인에 중쇄 부위를 연결시킨다. 하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 폴리펩티드 쇄의 선형 아미노산 서열에서 2개의 중쇄 불변 영역 도메인, 예로서, CH1 및 CH2 도메인; CH1 및 CH3 도메인; 힌지 및 CH1 도메인; 힌지 및 CH3 도메인; VH 및 힌지 도메인, 또는 CH3 도메인 및 비면역글로불린 폴리펩티드를 연결시킨다. 바람직하게, 그러한 연결 펩티드는 결합 분자에 가요성을 제공하고, 이황화 결합을 통한 이량체화를 촉진시킨다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드를 사용하여 하나 이상의 중쇄 도메인(예를 들면, 도메인이 결실된 작제물에서 불변 영역 도메인의 적어도 일부분(예를 들면, CH2 도메인의 적어도 일부분) 및/또는 힌지 영역의 적어도 일부분(예를 들면, 하부 힌지 영역 도메인중 적어도 일부분))을 대체시킨다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, VH 도메인은 연결 펩티드를 통해 CH3 도메인에 융합된다(연결 펩티드의 C-말단이 CH3 도메인의 N-말단에 결합하고, 연결 펩티드의 N-말단은 VH 도메인의 C-말단에 결합한다). 또다른 실시태양에서, VL 도메인은 연결 펩티드를 통해 CH3 도메인에 융합된다(연결 펩티드의 C-말단이 CH3 도메인의 N-말단에 결합하고, 연결 펩티드의 N-말단은 VL 도메인의 C-말단에 결합한다). 또다른 실시태양에서, CH1 도메인은 연결 펩티드를 통해 CH3 도메인에 융합된다(연결 펩티드의 C-말단이 CH3 도메인의 N-말단에 결합하고, 연결 펩티드의 N-말단은 CH1 도메인의 C-말단에 결합한다).
하나의 실시태양에서, 합성 연결 펩티드는 불변 영역 도메인 부위를 포함한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, CH2 도메인을 대체하는 연결 펩티드는 CH2 도메인 부위를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 gly-ser 링커를 포함하거나, 그로 구성된다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "gly-ser 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 구성된 펩티드를 언급한다. 예시적인 gly/ser 링커는 아미노산 서열 GGGSSGGGSG(서열 번호 8)을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드는 상부 힌지 영역의 적어도 일부분(예를 들면, IgG1, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유도), 중앙부 힌지 영역의 적어도 일부분(예를 들면, IgG1, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유도) 및 일련의 gly/ser 아미노산 잔기(예를 들면, gly/ser 링커 예로서, GGGSSGGGSG(서열 번호 8))를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 자연적으로 발생된 IgG1 또는 IgG3 힌지 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 연결 펩티드는 예로서, WO 02/060955에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 연결 펩티드는 하기에 더욱 상세히 기술한다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "이황화 결합"은 2개의 환 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 이황화 결합을 형성할 수 있거나, 제2 티올기과 가교결합할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 자연적으로 발생된 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 연결되고, 2개의 중쇄는 카뱃 번호 체계 사용시 239번 및 242번에 상응하는 위치(EU 번호 체계로는 위치 226번 또는 229번)에서 2개의 이황화 결합에 의해 연결된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 결합 부위를 포함한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 전장의 항체 분자이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 분자의 단편이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 변형된 항체 분자이거나 합성 항체 분자이다.
본 발명의 결합 분자는 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 "재조합적으로 생산된", 즉, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된 항체 분자이다. 항체 분자를 제조하는 예시적인 기술은 하기에 더욱 상세히 논의한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 변형된 항체이다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "변형된 항체"는 자연적으로 발생되지 않도록 변경된 합성 형태의 항체, 예를 들면, 적어도 2개의 중쇄 부위를 포함하되, 단, 2개의 완전 중쇄는 포함하지 않는 항체(예로서, 도메인이 결실된 항체 또는 미니바디); 2개 이상의 상이한 항원들 또는 단일 항원상의 상이한 에피토프들에 결합하도록 변경된 다특이성 형태의 항체(예를 들면, 이특이성, 삼특이성 등); scFv 분자에 연결된 중쇄 분자등을 포함한다. scFv 분자는 본 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어 있다. 또한, 용어 "변형된 항체"는 다가 형태의 항체(예를 들면, 3가, 4가 등의, 동일한 항원의 3개 이상의 카피에 결합하는 항체)를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 CH2 도메인이 결실된 적어도 하나의 중쇄 부위, 및 수용기 리간드쌍의 하나의 일원의 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
하나의 실시태양에서, 용어 본 발명에 따른 "변형된 항체"는, 면역원성이 거의 동일한 전체, 변경되지 않은 항체와 비교하였을 때, 예로서, 비공유적으로 이량화시키는 능력, 종양 부위를 국소화시키는 능력의 증가, 또는 혈청 반감기 감소와 같은 원하는 생화학적 특징을 제공하기 위하여 불변 영역 도메인중 적어도 한 분획이 결실되거나, 다르게는 변경되어진, 면역글로불린, 항체, 또는 그의 면역반응성 단편 또는 재조합체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄에 유사한 폴리펩티드 쇄를 포함하되, 하나 이상의 중쇄 도메인중 적어도 일부분이 결실된, 도메인이 결실된 항체이다. 더욱 바람직하게, 변형된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 결실되거나, 더욱더 바람직하게는 CH2 도메인 모두 또는 일부가 결실될 것이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 인간에서 유해한 면역 반응은 유도하지 않을 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 야생형 불변 영역과 비교하였을 때 변형된 불변 영역, 예를 들면, 중쇄 불변 영역을 포함한다. 즉, 본 원에 개시된 본 발명의 폴리펩티드는 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3)중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 영역 도메인(CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 변형으로는 하나 이상의 도메인내 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함한다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "악성 종양"은 양성이 아닌 종양 또는 암을 언급한다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "암"은 조절되지 않거나(deregulated), 비조절되는(uncontrolled) 세포의 성장을 특징으로 하는 악성 종양을 포함한다. 예시적인 암으로서 암종, 육종, 백혈병, 및 림프종을 포함한다. 용어 "암"은 1차 악성 종양(예를 들면, 세포가 본래의 종양 부위 이외의 다른 대상의 체내 부위로 유주하지 않는 것) 및 2차 악성 종양(예를 들면, 본래의 종양 부위와는 다른 2차 부위로 종양 세포가 유주되는 전이로부터 유발된 것)을 포함한다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "소수성 상호작용에 기초하여 폴리펩티드를 분리하는 배지"는 기질에 공유 결합된 소수성 리간드(예를 들면, 알킬기 또는 아릴기)를 포함하는 배지를 포함한다. 그러한 배지를 사용하여 용매 및 폴리펩티드 표면상의 접근가능한 무극성기 사이의 상호작용 및 배지중의 소수성 리간드에 기초하여 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다. 예시적인 배지는 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)로부터 입수한 페닐 5PW-HR이다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "전도도"는 microSiemens/cm(이전의 micromhos/cm)로 측정되는 용액의 전기 전도도를 포함한다. 용액의 이온 함량이 클수록, 용액의 전도도는 커진다. 전도도는 본 분야에 잘 공지된 기술(예를 들면, 2개의 전극 사이에 흐르는 전류을 측정함으로써)을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다.
본 발명의 분리 방법은 산성 범위부터 중성 범위까지의 pH, 예를 들면, 약 pH 3.5부터 대략 중성 범위까지의 pH를 갖는 용액을 함께 사용할 수 있다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "대략 중성 pH"는 대략 7의 pH 값을 포함한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 분리 방법은 pH가 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8인 용액(예를 들면, 완충액)을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직하게, 용액의 pH는 약 6 또는 약 7이다. 하나의 실시태양에서, 용액의 pH는 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 또는 약 8.0이다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "친화성 기질"은 친화성 리간드가 결합되어 있는, 예로서, 아가로스, 조절 공극 유리(controlled pore glass), 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기질을 포함한다. 친화성 리간드는 원하는 폴리펩티드에 결합하고, 오염 폴리펩티드는 친화성 리간드에 결합하지 못한다. 원하는 폴리펩티드는 공지된 프로토콜을 사용하여 친화성 기질로부터 용출시킬 수 있다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "조작된다는 것"은 합성 방법(예를 들면, 재조합 기술, 시험관내 펩티드 합성법, 펩티드의 효소적 또는 화학적 결합법, 또는 이들 기술들의 몇몇 조합에 의해)에 의해 핵산 또는 폴리펩티드 분자를 조작하는 것을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 결합 분자는 예를 들면, 본 발명의 연결 펩티드를 발현시키기 위하여 조작된다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "연결(linked)," "융합되는 것(fused)" 또는 "융합(fusion)"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 2개 이상의 요소 또는 성분들이, 화학적 접합 또는 재조합 방법을 비롯한 어떠한 수단에 의해서든지, 함께 결합되는 것을 의미한다. "인-프레임(in-frame) 융합" 은 2개 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)이 결합되어, 본래의 ORF의 정확한 리딩 프레임을 유지하는 방식으로, 더 긴 연속 ORF를 형성하는 것을 의미한다. 따라서, 생성되는 재조합 융합 단백질은 본래의 ORF로 코딩되는 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 절편(그 절편들은 성질상 보통은 그렇게 연결되지 않음)을 포함하는 단일 단백질이다. 비록 리딩 프레임이 융합 절편에 걸쳐 연속되게 제조되지만, 그 절편들은 예를 들어, 인-프레임 링커 서열에 의해서 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다.
폴리펩티드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 아미노 말단에서 카르복실 말단 방향으로의 폴리펩티드내 아미노산의 순서인데, 여기에서, 서열내에서 서로 이웃하는 잔기는 폴리펩티드의 1차 구조에서 인접하고 있다.
본 원에서 사용되는 바, 어구 "결합 분자의 투여로부터 이익을 얻게 되는 대상"은 예를 들면, 결합 분자에 의해 인식되는 항원의 검출(예를 들면, 진단 방법용)을 위해 사용되는 결합 분자의 투여로부터 이익을 얻게 되는 대상, 예로서, 포유동물 대상, 및/또는 결합 분자에 의해 인식되는 표적을 감소시키거나 제거하기 위해 결합 분자를 사용하는 치료법으로부터 이익을 얻게 되는 대상을 포함한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 대상은 순환 또는 혈청으로부터 가용성 분자 또는 미립자 분자(예를 들면, 독소 또는 병원체)를 감소시키거나 제거함으로써 이익을 얻을 수 있거나, 표적을 발현시키는 세포(예를 들면, 종양 세포) 군집을 감소시키거나 제거함으로써 이익을 얻을 수 있다. 본 원에서 더욱 상세히 기술되는 바, 결합 분자는 비접합 형태로 사용될 수 있거나, 예를 들면, 약물, 프로드러그, 또는 동위원소에 접합될 수 있다.
II. 인간 화
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 하나의 인간화된 B3F6 항체 가변 영역, 예를 들면, 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 그로부터 유도된다.
용어 "인간화된 항체"는 실질적으로는 인간 항체 쇄("수용체 항체"로서도 언급됨)로부터의 가변 영역 프레임워크 잔기, 및 실질적으로는 비인간형 항체("공여체 항체"로서도 언급됨)로부터의 적어도 하나의 상보성 결정 영역("CDR")을 포함하는 적어도 하나의 쇄를 포함하는 항체를 언급한다. 존재하는 경우, 불변 영역(들) 또한 실질적 또는 전적으로 인간 면역글로불린으로부터의 것이다.
하기 표 1에 뮤린 B3F6의 CDRs를 기재한다:
표 1: B3F6 CDR 서열( 카뱃 정의)
Figure 112007056744018-PCT00001
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 B3F6 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 B3F6 항체 분자의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 B3F6 항체 분자의 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 B3F6 항체 분자로부터의 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 B3F6 항체 분자로부터의 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 B3F6 항체 분자로부터의 적어도 6개의 CDR을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 CDR(또는 결합 분자내 존재하는 B3F6 CDRs보다 큰 것으로부터의 적어도 하나의 적어도 하나의 CDR)은 자연적으로 발생된 B3F6 분자의 CDR과 서열이 상이하도록 변형되지만, B3F6에 결합하는 능력은 유지된다.
인간화된 항체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산될 수 있고, 예를 들면, ([Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(1989), 86:10029-10033]; [Jones et al, Nature, (1986), 321:522-25]; [Riechmann et al, Nature, (1988), 332:323-27]; [Yerhoeyen et al, Science, (1988), 239:1534-36]; [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(1989), 86:3833-37]; 미국 특허번호 US 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제6,180,370호)를 참조한다
인간화를 위해 바람직한, 비인간형 공여체 항체를 선택할 때, 예를 들면, 발현된 인간 항체 유전자의 서열 데이타베이스, 배선 Ig 서열 또는 수개의 인간 항체의 공통서열로부터 적절한 인간 수용체 항체를 수득할 수 있다. CDRs이 기원되어진 비인간형 가변 프레임워크와 동일하거나 유사한 구조를 인간 가변 도메인 프레임워크가 취할 경우, 인간 가변 도메인 프레임워크내로 비인간형 CDRs를 치환하는 것이 그들의 공간적 배향을 유지시킬 가능성이 크다. 인간 수용체 항체의 프레임워크서열이, CDRs이 기원되어진 비인간형 가변 프레임워크와 고도한 서열 일치도를 보이는 인간 수용체 항체로부터 인간 가변 도메인을 수득함으로써 상기를 구현시킨다. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유도될 수 있다. 바람직하게, 인간 수용체 항체는 공여체 항체의 정규 잔기 및 계면 잔기를 유지한다. 추가로, 인간 수용체 항체의 길이는 바람직하게, CDR 루프와 상당 유사하다([Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773(1991)]; [Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971(1993)] 및 WO 92/22653(Carter et al.,) 참조).
공여체 항체 및 적절한 인간 수용체 항체의 CDRs를 동정한 후의 다음 단계는 만약 있다면, 이들 성분들로부터의 어떤 잔기가 생성된 인간환된 항체의 성질을 최적화하기 위해서 치환되어져야 하는지를 결정하는 것이다. 전형적으로, 항원 결합을 위해 요구되는, 비인간형의 공여체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 아미노산중 일부 또는 모두(예를 들면, 하나 이상의 CDRs)를 사용하여 인간 수용체 항체의 경쇄 또는 중쇄로부터의 상응하는 아미노산을 치환한다. 인간 수용체 항체는 항원 결합을 위해 요구되지 않는 아미노산중 일부 또는 모두를 유지한다. 일반적으로, 뮤린 잔기를 도입하는 것은 인간에서 인간-항-마우스-항체(HAMA: human-anti-mouse-antibody) 반응을 유도하는 항체의 위험성을 증가시키기 때문에 인간 아미노산 잔기를 뮤린으로 치환하는 것은 최소화되어야 한다. 본 분야에서 공인된 인식면역 반응을 측정하는 방법을 사용하여 특정 환자에서 또는 임상 시험시 HAMA 반응을 모니터할 수 있다. 인간화된 항체를 투여받은 환자는 상기 요법 투여 개시점부터 끝까지 면역원성에 대하여 평가받을 수 있다. HAMA 반응은 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기술(BIACORE) 및/또는 고체-상 ELISA 분석법을 비롯한 본 분야의 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 환자로부터의 혈청 샘플줄 인간화된 치료학적 시약에 대한 항체를 검출함으로써 측정된다.
필요한 경우, 인간화된 항체의 항원에 대한 결합 친화성을 보존시키기 위하여 인간 프레임워크 영역내 하나 이상의 잔기는 뮤린 항체내 상응하는 위치의 잔기로 변이될 수 있다. 이러한 변이는 종종 "복귀 돌연변이"로 명명된다. 인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 특정 아미노산은 그들이 CDR 구조 및/또는 항원과의 결합에 미칠 수 있는 영향력에 기초하여 복귀 돌연변이에 대해 선택된다. 뮤린 CDR 영역을 인간 가변 프레임워크 영역에 배치할 경우 구조상의 제한이 따를 수 있고, 이는 특정 아미노산 잔기의 치환을 통해 보정되지 않는 한, 결합 친화성은 손실될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 복귀 돌연변이를 위해 아미노산 잔기를 선택하는 것은 본 분야에 공인된 기술을 사용함으로써 부분적으로는 컴퓨터 모델링에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린 쇄 또는 그의 도메인에 대한 구조적 해석으로부터 출발하여 분자 모델이 생성된다. 모델링된 쇄를 해석된 3차원 구조(예를 들면, X-선 구조)의 쇄 또는 도메인과의 아미노산 유사성에 대하여 비교하고, 서열 유사성이 가장 큰 쇄 또는 도메인(들)을 분자 모델 작제를 위한 출발점으로서 선택한다(is/are selected). 모델링된 면역글로불린 쇄 또는 도메인내 실제 아미노산과 출발 구조에서의 것 사이의 차이가 허용되도록 해석된 출발 구조를 변형시킨다. 이어서, 변형된 구조를 복합 면역글로불린으로 어셈블린시킨다. 최종적으로, 에너지 최소화에 의해, 그리고, 모든 원자들이 서로로부터 적절한 거리내에 있는지, 및 결합 길이 및 각이 화학적으로 허용가능한 범위내에 있는지를 확인함으로써 모델을 세밀히 구별한다.
또다른 실시태양에서, 인간화를 위해 지식에 기초한 접근법 또는 데이타베이트 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 그러한 인간화 전략법은 가시적 관찰과, [Rosok MJ, et al, 1996. J. Biol. Chem. 271 : 22611-22618](Rosok MJ, et al.)에 기재된 방법에 따른 V 영역 서열의 분석에 기초할 수 있다. 정규 결정기, 표면 잔기, 및 잠재성 접촉 잔기는 동정된다. 잠재성 접촉 잔기는 주시되고 있고, [Chothia C and Lesk AM. 1987. J. Mol. Biol. 196: 901-917](Chothia et al.)에서 정의된 CDR 로프의 구조적 정의, [Kabat EA, Wu TT, Reid-Miller M, Parry HM, and Gottesman KS. 1987. Sequences of Protein of Immunological Interest, U.S. department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD](Kabat et al.)에서 정의된 서열 과변이, 및 [MacCallum RM, Martin ACR, and Thorton JM. 1996. J. Mol. Biol. 262: 732-745](MacCallum et al.)에서 정의된 잠재성 항원 접촉 잔기에 따라 광범위하게 분류되어 있다. 카뱃 번호화 및 정의에 따라 뮤린 CDR 루프를 전체적으로 수용기 인간 프레임워크상에 이식시킨다. [Padlan EA. 1991. Mol Immunol. 28: 489-498](Padlan et al.)에서 정의된 패킹 잔기를 동정하고, [Singer II et al. 1993. J. Immunol. 150: 2844-2857](Singer et al.)에 기재된 전략법에 따라 패킹 잔기를 보존하기 위해 시도한다. [Harris L and Bajorath J. 1995. Protein Science 4: 306-310](Harris L and Bajorath)에 기재된 바와 같이, 프레임워크서열내 각각의 잔기는 항체 인간화에 대하여 저, 중, 또는 고 "위험 위치"로 지정된다.
일반적으로, 저위험 위치는 인간에 유지된다. 다수의 상이한 중위험 아미노산 위치 및 고위험 아미노산 위치에 대해서는 공중의 또는 사유의 인간화된 항체 서열 수집물을 참조할 수 있다. 상기의 인간화된 항체 서열과 관련하여, 인간 또는 뮤린(복귀 돌연변이) 아미노산 잔기를 포함함으로써 기능상의 결합 활성이 형성되는지 여부가 주시되었다. 치환을 고려하는 경우, 잔기의 기능적 호환성(interchangeability)을 확인하기 위하여 아미노산 치환 지도[D. Bordo and P. Argos. 1991. J. Mol. Biol. 217: 721-729]를 참조할 수 있다.
부분적으로는 특정 위치에 있는 아미노산의 특징을 조사하거나, 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이의 효과에 대하여 실험적으로 관찰함으로써 치환을 위해 아미노산 잔기를 선택하는 것 또한 결정할 수 있다. 예를 들면, 비인간형 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이의 아미노산이 상이할 때, 정규 잔기, 계면 패킹 잔기, 또는 결합 부위 가까이에 있는 드문 또는 희귀 잔기일 경우에는 인간 프레임워크 아미노산이 일반적으로 비인간형 인간 공여체 항체로부터의 동등한 프레임워크 아미노산에 의해 치환되어져야 한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 추가로 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 적어도 하나의 복귀 돌연변이를 포함하되, 여기에서, 아미노산 잔기는 계면 패킹 잔기이다. "계면 패킹 잔기"는 예를 들면, [Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66(1985)]에 정의된 바와 같이, VL 및 VH 사이의 계면에 존재하는 잔기를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 추가로 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 적어도 하나의 복귀 돌연변이를 포함하되, 여기에서, 아미노산 잔기는 정규 잔기이다. "정규 잔기"는 CDR 입체 형태에 중요한 것으로 공지되어 있는 정규 또는 구조적 부류내의 보존 프레임워크 잔기이다([Tramontano et al, J. Mol Biol. 215:175(1990)], 상기 문헌의 전문이 본 원에서 참고로 인용된다). 정규 잔기는 경쇄중 잔기 2번, 25번, 27B번, 28번, 29번, 30번, 33번, 48번, 51번, 52번, 64번, 71번, 90번, 94번 및 95번, 및 중쇄중 잔기 24번, 26번, 27번, 29번, 34번, 54번, 55번, 71번 및 94번을 포함한다. 추가의 잔기(예를 들면, CDR 구조-결정 잔기)는 [Martin and Thorton(1996) J. Mol. Biol. 263:800]의 방법론에 따라 확인할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 추가로 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 적어도 하나의 복귀 돌연변이를 포함하되, 여기에서, 아미노산 잔기는 CDR과 상호작용할 수 있는 위치에 존재한다. 특히, 경쇄의 2번, 48번, 64번 위치에 있는 아미노산 및 중쇄의 26-30번, 71번 및 94번 위치에 있는 아미노산(카뱃에 따른 번호화)이 다수의 항체와 상호작용할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 경쇄에서 35번 위치 및 중쇄에서 93번 및 103번 위치에 있는 아미노산 또한 CDRs와 상호작용할 수 있다.
치환을 위해 프레임워크 잔기를 선택하는 기술에 대한 일례는 예를 들면, 미국 특허 제5,585,089호에 기재되어 있다. 상기 특허에는 변경될 수 있는, 수개의 인간 프레임워크 아미노산 카테고리가 기재되어 있다. 하나의 실시태양에서, 카테고리 2의 아미노산은 상응하는 뮤린 잔기로 복귀 돌연변이화된다. 특히, 카테고리 2의 아미노산은 인간 수용체 면역글로불린의 프레임워크내의 드문 아미노산이며(즉, 본 원에서 사용되는 바, "드문 것(rare)"은 그 위치에서 발생하는 아미노산은 약 20% 미만이라는 것, 그러나, 대표적인 데이타 은행에서의 인간 중쇄(각각 경쇄) V 영역 서열에서는 일반적으로 약 10% 미만이라는 것을 나타낸다), 그 위치에서의 공여체 아미노산이 인간 서열에 대해 정형적(typical)인 경우에는(즉, 본 원에서 사용되는 바, "공통적인(common) 것"은 아미노산이 약 25% 초과로 발생되지만, 대표적인 데이타 은행에서는 50% 초과의 서열이 발생한다는 것을 나타낸다), 인간 수용체 아미노산보다는 비인간형 공여체 아미노산(예를 들면, 뮤린 아미노산)가 선택될 수 있다. 이러한 기준은, 인간 프레임워크내 비정형 아미노산이 항체 구조를 파괴시키지 않는다는 것을 확인하는데 도움이 된다. 또한, 인간 항체에 대하여 정형적으로 발생하는 공여체 항체로부터의 아미노산을 사용하여 드문 아미노산을 대체함으로써 면역원성이 보다 낮은 인간화된 항체를 제조할 수 있다.
인간의 경쇄 중쇄 가변 영역 서열 모두는 각각 서로서로에 대하여 특히 동종성이고, 특정의 중요 위치에 동일한 아미노산을 갖는 서열 "아군"으로 분류된다[Kabat et al., op. cit]. 인간 수용체 서열내 아미노산이 아미노산 서열중 "드문 것"인지 또는 "공통적인 것"인지를 결정할 때는 주로 동일한 아군내의 인간 서열만을 수용체 서열로서 간주하는 것이 바람직할 수 있을 것이다.
하나의 실시태양에서, 카테고리 3의 아미노산은 상응하는 뮤린 잔기로 복귀 돌연변이화된다. 카테고리 3의 잔기는 인간화된 면역글로불린 쇄의 1차 서열내 하나 이상의 3 CDR'에 인접하게 존재하고, 수용기 아미노산보다는 공여체 아미노산(들)이 선택될 수 있다. 이러한 아미노산은 특히 CDR's중의 아미노산과 상호작용할 수 있고, 수용체로부터 선택될 경우에는 공여체 CDR's을 변형시키고 친화성을 감소킬 가능성이 있다. 또한, 인접한 아미노산은 항원과 간접적으로 상호작용할 수 있고[Amit et al., Science, 233, 747-753(1986)], 공여체로부터 이러한 아미노산을 선택하는 것은 본래의 항체에서의 친화성을 제공하는 모든 항원 접촉을 유지시키는데 바람직할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 카테고리 4의 아미노산은 상응하는 뮤린 잔기로 복귀 돌연변이화된다. 카테고리 4의 아미노산은, 전형적으로 본래의 공여체 항체의 3차원 모델에서, CDR's 바깥쪽의 특정 아미노산은 CDR's에 근접해 있고, 수소 결합, 반 데르 발스의 힘, 소수성 상호작용 등에 의해 CDR's중의 아미노산과 상호작용할 수 있는 가능성이 높다는 것을 보여주는 것이다. 그러한 아미노산 위치에서, 수용체 면역글로불린 아미노산보다는 공여체 면역글로불린 아미노산을 선택할 수 있다. 이러한 기준에 따른 아미노산은 일반적으로 CDRs'중 몇몇 원자와 약 3 Å 단위이내에 측쇄 원자를 가질 것이고, 예로서, 상기 열거된 것과 같은 확립된 화학적 힘에 따라 CDR 원자와 상호작용할 수 있는 원자를 포함하여야 한다.
수소 결합을 형성할 수 있는 원자의 경우, 그들 핵 사이에서는 3 Å이 측정되지만, 결합을 형성하지 못하는 원자의 경우에는 반 데르 발스 표면 사이에서 3 Å이 측정된다. 그러므로, 후자의 경우에는 원자가 상호작용할 수 있을 것으로 간주되는 약 6 Å(3 + 반 데르 발스 지름의 합) 이내에 핵이 존재하여야 한다. 다수의 경우에 핵은 4 또는 5 내지 6Å 떨어져서 존재할 것이다. 아미노산이 CDRs와 상호작용할 수 있는지 여부를 결정할 때는 CDRs의 일부분으로서 중쇄 CDR2중 마지막 8개의 아미노산은 고려하지 않는 것이 바람직한데, 이는 구조적 관점에 볼 때, 상기 8개의 아미노산은 프레임워크의 일부분으로서 더욱 많이 작용하기 때문이다.
CDR's내 아미노산과 상호작용할 수 있고, 이로써, 카테고리 4의 일원이 되는 프레임워크내 아미노산은 또다른 방식으로 식별될 수 있다. 하기 2개의 방식으로, (1) 온전한 항체에서, (2) 그의 CDRs가 제거된 항체로 구성되어진 가상의 분자에서 각 프레임워크 아미노산의 용매 접근성 표면적을 산출한다. 약 10 제곱 Å 이상의 수량 사이에 현저한 차이는 프레임워크 아미노산의 용매로의 접근성이 적어도 부분적으로 CDRs에 의해 차단되고, 따라서, 아미노산은 CDRs와 접촉하고 있음을 나타낸다. 아미노산의 용매 접근성 표면적은 본 분야에 공지되어 있는 알고리즘을 사용하여 3차 구조의 항체 모델에 기초하여 산출할 수 있다(예를 들면, [Connolly, J. Appl. Cryst. 16, 548(1983)] 및 [Lee and Richards, J. Mol. Biol. 55, 379(1971)]). 프레임워크 아미노산은 또한 또다른 프레임워크 아미노산의 구조에 영향을 주어 결국에는 CDR's와 접촉함으로써 종종 간접적으로 CDR's와 상호작용할 수 있다.
프레임워크내 수개의 위치, 특히, 경쇄 2번, 48번, 64번 및 71번 위치 및 중쇄 26-30번, 71번 및 94번 위치(카뱃에 따른 번호화, op. cit)에 있는 아미노산은 다수의 항체내의 CDRs와 상호작용할 수 있는 것으로 공지되어 있고([Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901(1987)], [Chothia et al, Nature 342, 877(1989)], 및 [Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215, 175(1990)], 이들 모두는 본 원에서 참고로 인용된다), 따라서, 이들 아미노산은 일반적으로 카테고리 4에 있을 것이다. 전형적으로, 본 발명의 인간화된 면역글로불린은 이들 이외에도 카테고리 4의 공여체 아미노산(상이한 것)을 포함할 것이다. 경쇄 35번 중쇄 93 및 103번 위치에 있는 아미노산은 또한 CDRs와 상호작용할 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 수용체 아미노산(상이한 경우)보다는 하나 이상의 공여체 아미노산이 인간화된 면역글로불린에 포함될 수 있다. 한편, 카테고리 4에 존재할 수 있는 특정 위치, 예로서, 경쇄중 처음 5개의 아미노산은 때때로 인간화된 면역글로불린의 친화성은 손실시키지 않으면서 수용체 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다.
기술한 상기 카테고리 이외에도, 인간화된 면역글로불린내 아미노산이 카테고리 5에 포함될 경우, 인간화된 면역글로불린내 아미노산을 공여체로부터 취할 수 있을 때 인간화된 면역글로불린내의 특정 아미노산을 공여체로부터도 수용체로부터도 취할 수 없다. 상기 정의된 바와 같이, 공여체 면역글로불린내 지정 위치에 존재하는 아미노산이 인간 서열에 대하여 "드문 것"인 경우, 수용체 면역글로불린내 상기 위치에 존재하는 아미노산 또한 인간 서열에 대하여 "드문 것"인 경우, 인간화된 면역글로불린내 상기 위치에 존재하는 아미노산은 인간 서열의 "정형적인" 일부 아미노산인 것을 선택할 수 있다. 바람직한 선택은 수용체 서열과 동일한 아군에 속하는 공지 인간 서열내 상기 위치에서 자주 발생하는 아미노산을 선택하는 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 3개의 B3F6 경쇄 CDRs(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 인간 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 추가로 2번 및 100번으로 구성된 군으로 선택되는 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 추가로 2번 및 100번으로 구성된 군으로 선택되는 하나의 위치에서 하나의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 결합 분자는 인간화된 B3F6 경쇄의 2번 및 100번 위치에서 복귀 돌연변이를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 인간화된 B3F6 경쇄의 2번 위치에서 복귀 돌연변이, 및 적어도 하나의 추가의 복귀 돌연변이를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 인간화된 B3F6 경쇄의 100번 위치에서 복귀 돌연변이, 및 적어도 하나의 추가의 복귀 돌연변이를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 3개의 B3F6 중쇄 CDRs(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3) 및 인간 중쇄 프레임워크 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 적어도 하나의 위치에서 적어도 하나의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 하나의 위치에서 하나의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 2개의 위치에서 2개의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 3개의 위치에서 3개의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 4개의 위치에서 4개의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 5개의 위치에서 5개의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 6개의 위치에서 6개의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 7개의 위치에서 7개의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 8개의 위치에서 8개의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 1번, 48번, 67번, 71번, 73번, 81번, 82b번, 93번, 및 112번으로 구성된 군으로 선택되는 9개의 위치에서 9개의 인간 아미노산 잔기의 상응하는 마우스 아미노산 잔기로의 복귀 돌연변이를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 B3F6 항체의 인간화된 가변 영역, 및 그러한 인간화된 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 52의 아미노산 1-112번에 나타낸 CDR이 이식된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 55의 아미노산 1-121번에 나타낸 CDR이 이식된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 47에 나타낸 경쇄 버전 1의 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 48에 나타낸 중쇄 버전 1의 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 49에 나타낸 중쇄 버전 2의 가변 영역 서열을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 50에 나타낸 경쇄 버전 2의 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 51에 나타낸 중쇄 버전 3의 가변 영역 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 52에 나타낸 CDR이 이식된 경쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 53에 나타낸 버전 1의 경쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 54에 나타낸 버전 2의 경쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 55에 나타낸 CDR이 이식된 중쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 56에 나타낸 버전 1의 중쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 57에 나타낸 버전 2의 중쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 58에 나타낸 버전 3의 중쇄를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 59에 나타낸 CDR이 이식된, 도메인이 결실된 중쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 60에 나타낸 버전 1의 도메인이 결실된 중쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 61에 나타낸 버전 2의 도메인이 결실된 중쇄를 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 62에 나타낸 버전 3의 도메인이 결실된 중쇄를 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 63에 나타낸 CDR이 이식된 경쇄 서열을 포함하며, 이는 임의의 신호 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 64에 나타낸 버전 1의 경쇄 서열을 포함하며, 이는 임의의 신호 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 65에 나타낸 버전 2의 경쇄 서열을 포함하며, 이는 임의의 신호 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 66에 나타낸 CDR이 이식된 중쇄 서열을 포함하며, 이는 임의의 신호 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 67에 나타낸 버전 1의 중쇄 서열을 포함하며, 이는 임의의 신호 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 68에 나타낸 버전 2의 중쇄 서열을 포함하며, 이는 임의의 신호 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 69에 나타낸 버전 3의 중쇄 서열을 포함하며, 이는 임의의 신호 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 뮤린 B3F6 CDRs 및 인간 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄는 뮤린 B3F6 CDRs 및 인간 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄와 결합한다. 하나의 실시태양에서, 뮤린 B3F6 CDRs 및 인간 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄는, 상응하는 뮤린 아미노산 잔기로의 적어도 하나의 인간 프레임워크 아미노산 잔기의 복귀 돌연변이를 포함하는 인간화된 버전의 B3F6 중쇄와 결합한다. 또다른 실시태양에서, 상응하는 뮤린 아미노산 잔기로의 적어도 하나의 인간 프레임워크 아미노산 잔기의 복귀 돌연변이를 포함하는 인간화된 버전의 B3F6 경쇄는 상응하는 뮤린 아미노산 잔기로의 적어도 하나의 인간 프레임워크 아미노산 잔기의 복귀 돌연변이를 포함하는 인간화된 버전의 B3F6 중쇄와 결합한다. 또다른 실시태양에서, 뮤린 B3F6 CDRs 및 인간 프레임워크 영역, 및 상응하는 뮤린 아미노산 잔기로의 적어도 하나의 인간 프레임워크 아미노산 잔기의 복귀 돌연변이를 포함하는 경쇄는 인간화된 버전의 B3F6 중쇄와 결합한다. 예시적인 결합은 본 실시예에서 더욱 상세히 기술한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 실시예의 인간화된 L1 경쇄는 본 실시예의 H1 중쇄와 결합하여 버전 1의 인간화된 B3F6 항체를 형성한다. 또다른 실시태양에서, 본 실시예의 인간화된 L1 경쇄는 본 실시예의 H2 중쇄와 결합하여 버전 2의 인간화된 B3F6 항체를 형성한다. 또다른 실시태양에서, 본 실시예의 인간화된 L1 경쇄는 본 실시예의 H3 중쇄와 결합하여 버전 3의 인간화된 B3F6 항체를 형성한다. 본 실시예의 인간화된 L2 경쇄는 본 실시예의 H1 중쇄와 결합하여 버전 4의 인간화된 B3F6 항체를 형성한다. 본 실시예의 인간화된 L2 경쇄는 본 실시예의 H2 중쇄와 결합하여 버전 5의 인간화된 B3F6 항체를 형성한다. 본 실시예의 인간화된 L2 경쇄는 본 실시예의 H3 중쇄와 결합하여 버전 6의 인간화된 B3F6 항체를 형성한다. 그러한 결합 또한 본 발명의 범주내에 있다는 것이 본 분야의 당업자에게는 자명할 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 부다페스트 조약의 요건하에 ATCC 기탁 번호 ______로 버지니아주 20110 마나싸스 유니버시티 불르바드 10801 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection)에 기탁된 세포주에 의해 제조된 항체이다.
II. 결합 분자의 형태
A. 항체 또는 그의 일부분
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 분자이다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 크립토에 결합하는 인간화된 항체 또는 그의 일부분이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 크립토에 결합하는 인간화된 항체의 항원 결합 단편 및 항체의 제2 항원 결합 단편을 포함한다.
본 분야에 공인된 프로토콜을 사용하여, 예를 들면, 관련 항원(예로서, 정제된 종양과 관련된 항원 또는 그러한 항원을 포함하는 세포 또는 세포 추출물) 및 애주번트를 피하 또는 복막내 다중 주입하여 포유동물에서 항체를 바람직하게 유발시킨다. 이러한 면역화는 전형적으로 활성화된 지라 특이세포(splenocyte) 또는 림프구로부터의 항원-반응성 항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 유도한다. 생성된 항체를 동물 혈청으로부터 수거하여 다중클론성 제제를 얻을 수 있지만, 종종 비장, 림프절 또는 말초 혈액으로부터 개별 림프구를 분리하여, 단일클론 항체(MAb: monoclonal antibodies)의 균질 제제를 얻는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 림프구는 지라로부터 수득된다.
이러한 공지된 방법[Kohler et al., Nature 256:495(1975)]으로, 항원 주사를 맞은 포유동물로부터의 비교적 수명이 짧거나 필멸의 림프구를 불멸 종양 세포주(예로서, 골수종 세포주)와 융합시켜 불멸이고 B세포의 유전적으로 코딩된 항체를 생성할 수 있는 하이브리드 세포 즉 "하이브리도마"를 생산한다. 생성된 하이브리드를, 단일 항체 형성을 위한 특이 유전자를 포함하는 각각의 개별 계통으로 선택, 희석, 및 재생장시켜, 단일 유전자 계통으로 분리시킨다. 그들은 원하는 항원에 대항하는 균질한 항체를 생산하며, 그들의 순수한 유전자 혈통과 관련하여, "단일클론성"이라 명명한다.
그렇게 제조한 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 비융합 모체 골수종 세포의 생장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지내에서 시딩하고 배양한다. 본 분야의 당업자는 하이브리도마의 형성, 선택 및 생장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 다수의 공급원으로부터 상업적으로 구입가능하며, 표준화된 프로토콜은 잘 확립되어 있다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 원하는 항원에 대항하는 단일클론 항체 생산에 대해서 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해서 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성을 면역침전, 방사면역측정법(RIA: radioimmunoassay) 또는 효소-결합 면역흡착 측정법(ELISA: enzyme-linked immunoabsorbent assay)과 같은 생체외 분석법으로 측정한다. 하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화력 및/또는 활성의 항체를 생산한다는 것을 확인한 후, 클론을 한계 희석 방법으로 서브클로닝시키고, 표준 방법으로 배양한다[Goding , Monoclonal Antibodies ; Principles and Practice, pp 59-103(Academic Press, 1986)]. 서브클론에 의해서 분비된 단일클론 항체를 예로서, 단백질-A, 하이드록실라파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 정제 방법으로 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리할 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다.
또다른 실시태양에서, 종래의 방법을 사용하여(예로서, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용), 원하는 단일클론 항체를 코딩하는 DNA를 용이하게 분리 및 서열화할 수 있다. 분리 및 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 분리되면, DNA를 발현 벡터내로 넣을 수 있고, 이어서, 이것을 다르게는 면역글로불린을 생산하지 않는 E. 콜라이(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포 또는 골수종 세포와 같은 원핵생물성 또는 진핵생물성 숙주 세포내로 형질감염시킨다. 더욱 특히, 분리된 DNA(본 원에 기술하는 바와 같이 합성일 수 있음)를 사용하여, 1995년 1월 25일에 출원된 미국 특허 제5,658,570호(Newman et al.)(본 원에서 참고로 인용됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 항체의 제조를 위한 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝할 수 있다. 본질적으로, 이것은 선택한 세포로부터의 RNA 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 이러한 목적에 적합한 프라이머는 또한 미국 특허 제5,658,570호에 기재되어 있다. 하기에 더욱 상세하게 논의되는 바, 원하는 항체를 발현시키는 형질전환된 세포를 비교적 대량으로 배양하여 면역글로불린을 임상적 및 상업적 공급량으로 공급할 수 있다.
본 분야의 당업자는 또한, 항체 또는 항체 단편(예로서, 항원 결합 부위)을 코딩하는 DNA는 예를 들면, pd 파지 또는 Fd 파지미드 기술을 사용함으로써 항체 파지 라이브러리로부터 유도될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예시적인 방법은 예를 들면, (EP 368 684 B1; 미국 특허 제5,969,108호, [Hoogenboom, H.R. and Chames. 2000. Immunol . Today 21:371]; [Nagy et al. 2002. Nat . Med. 8:801]; [Huie et al. 2001. Proc . Natl . Acad . Sci USA 98:2682]; [Lui et al. 2002. J. Mol. Biol. 315:1063](이들 각각 본 원에서 참고로 인용된다))에 기재되어 있다. 예를 들면, [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783(1992)]와 같은 수개의 간행물은 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서, 쇄 셔플링(shuffling), 뿐만 아니라 복합 감염 및 생체내 재조합에 의한 고친화성 인간 항체의 생산을 기술한다. 또다른 실시태양에서, 리보솜 디스플레이를 사용하여 디스플레이 플랫폼으로서 박테리오파지를 대체할 수 있다(예로서, [Hanes el al., Nat . Biotechnol. 18:1287(2000)]; [Wilson el al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:3750(2001)]; 또는 [Irving el al, J. Immunol . Method 248:31(2001)] 참조). 추가의 또다른 실시태양에서, 항체에 대하여 세포 표면 라이브러리를 선별할 수 있다([Boder el al, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 97:10701(2000)]; [Daugherty el al, J. Immunol . Method 243:211(2000)]). 그러한 방법은 단일클론 항체의 분리 및 그 후의 클로닝에 있어서 전통적인 하이브리도마 기술에 대한 대안을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자의 결합 부위는 인간 또는 실질적 인간 항체에 의해 제공받을 수 있다. 인간 또는 실질적 인간 항체는 내인성 면역글로불린을 생산할 수 없는 트랜스제닉(transgenic) 동물(예로서, 마우스)에서 제조될 수 있다(예를 들면, 미국 특허번호 제6,075,181호, 제5,939,598호, 제5,591,669호 및 제5,589,369호(이들 각각은 본 원에서 참고로 인용된다)). 예를 들면, 키메라 및 배선 뮤턴트 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역의 동종접합 결실은 내인성 항체 생산을 완전히 저해한다고 기재되어 있다. 인간 면역글로불린 유전자 배열을 그러한 배선 뮤턴트 마우스로 전이시킬 경우, 항원 접종(challenge)시 인간 항체를 생산할 것이다. SCID 마우스를 사용하여 인간 항체를 생산하는 또다른 바람직한 수단은 미국 특허번호 제5,811,524호(이는 본 원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 이러한 인간 항체와 관련된 유전 물질 또한 본 원에 기재한 바와 같이 분리 및 조작할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
재조합 항체를 생산하는 수단으로서 매우 효율적인 추가적인 것이 [Newman, Biotechnology 10: 1455-1460(1992)]에 개시되어 있다. 특히, 이 기술은 원숭이 가변 도메인 및 인간 불변 서열을 포함하는 영장류화된 항체를 생산한다. 이 참조문헌의 전문이 본 원에 참조로 인용된다. 또한, 이 기술은 또한 공동 양도된 미국 특허번호 제5,658,570호, 제5,693,780호 및 제5,756,096호(이들 각각은 본 원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
또다른 실시태양에서, 미세조작에 의해서 림프구를 선택하고, 가변 영역을 분리할 수 있다. 예로서, 말초 혈액 단핵 세포를 면역화된 포유동물로부터 분리하고, 생체외에서 약 7일동안 배양할 수 있다. 선별 기준을 충족시키는 특이적 IgG에 대하여 상기 배양물을 선별할 수 있다. 양성 웰로부터 세포를 분리할 수 있다. 개별 Ig-생산 B 세포는 FACS에 의해서 또는 보체-매개 용혈판 분석법으로 그들을 동정하여 분리할 수 있다. Ig-생산 B 세포를 튜브 속으로 미세조작시킬 수 있고, 예를 들면, RT-PCR을 사용하여 VH 및 VL 유전자를 증폭시킬 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터로 클로닝될 수 있고, 발현시키기 위해서 세포(예로서, 진핵 세포 또는 원핵 세포)내로 형질감염시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 결합 분자 생산에 유용한 유전자 서열은 다수의 상이한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 상기에서 광범위하게 논의된 바와 같이, 다양한 인간 항체 유전자는 공공연하게 사용될 수 있는 기탁물 형태로 이용가능하다. 항체 및 항체-코딩 유전자의 서열 다수가 공개되어 있고, 적합한 항체 유전자는 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 상기의 서열로부터 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명의 이러한 일면과 상화성(compatible)인 올리고뉴클레오티드 합성 기술은 본 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있고, 이는 수개의 상업적으로 구입가능한 자동 합성기들중 임의의 것을 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 본 원에 기재된 여러 유형의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열은 상업상의 DNA 합성 업체의 서비스를 통해 수득할 수 있다. 이어서, 상기 방법중 임의의 것을 사용하여 수득한 유전 물질은 본 발명의 폴리펩티드를 제공하고 수득하기 위해서 변경되거나 합성될 수 있다.
다르게는, 본 분야의 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 항체-생산 세포주를 선택 및 배양할 수 있다. 그러한 기술은 다양한 실험실용 메뉴얼 및 예비 문헌에 기재되어 있다. 이와 관련하여, 하기 기재하는 바와 같이 본 발명에 사용하기 적합한 기술이 [Current Protocols in Immunology, Coligan et al, Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York(1991)](부록 포함)(이는 본 원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
본 발명의 범주내 항원 결합 DNA 서열의 모든 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포함된다는 것도 추가로 이해될 것이다.
공지된 바와 같이, RNA는 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출 및 침전에 이은 원심분리 또는 크로마토그래피와 같은 표준 기술에 의해서 본래의 하이브리도마 세포로부터 또는 다른 형질전환 세포로부터 분리될 수 있다. 원하는 경우, 올리고 dT 셀룰로오스에서의 크로마토그래피와 같은 표준 기술에 의해서 전체 RNA로부터 mRNA를 분리할 수 있다. 적합한 기술은 본 분야에 잘 알려져 있다.
하나의 실시태양에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 잘 공지되어 있는 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 중합효소를 사용하여 동시에 또는 별도로 제조될 수 있다. 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초한 더욱 특정의 프라이머에 의해 PCR을 개시할 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 클론을 분리하는데 사용할 수 있다. 이러한 경우, 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 탐침, 예로서, 마우스 불변 영역 탐침으로 라이브러리를 선별할 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 세포로부터 분리하고, 예로서, 재조합 DNA 기술과 관련된 상기 참조문헌에 상세하게 나타나 있는 공지의 표준 기술에 따라서, 제한 지도화 및 서열화할 수 있다. 물론, DNA는 분리 공정 과정 또는 후속하는 분석시의 임의의 시점에서 본 발명에 따른 합성의 것일 수 있다. 본 발명의 결합 분자로 사용하기 위한 예시적인 항체 또는 그의 단편은 본 원에 기재된 표적을 인식하는 항체를 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체의 항원 결합 단편은 본 분야에 잘 공지되어 있는 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
B. 변형된 항체
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 변형된 항체, 즉, 항체로부터 유도되지만, 야생형 항체는 아닌 분자, 예를 들면, 미니바디(미니바디는 본 분야에서 기술하는 방법으로 제조할 수 있다(예로서, 미국 특허 제5,837,821호 또는 WO 94/09817A1 참조)) 등을 포함하거나 그로 구성된다.
1. 도메인이 결실된 항체
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실되어 있는 합성 불변 영역을 포함한다("도메인이 결실된 항체"). 특히 바람직한 실시태양에서, 상화성인 변형된 항체는, 전체 CH2 도메인이 소거되어 있는 도메인이 결실된 작제물 또는 변이체(ΔCH2 작제물)를 포함할 것이다. 다른 바람직한 실시태양의 경우, 결실된 도메인이 짧은 연결 펩티드로 치환됨으로써 가변 영역의 가요성 및 자유로운 운동성을 제공받을 수 있다. 항체의 대사율을 조절하는 CH2 도메인의 성질에 기인할 때 그러한 작제물이 특히 바람직하다는 것을 본 분야의 당업자는 이해할 것이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 변형된 항체는 CH2 도메인이 결실된 항체이다. 도메인이 결실된 작제물은 IgG1 인간 불변 도메인을 코딩하는 벡터(예로서, IDEC Pharmaceuticals, 샌디에고 소재)를 사용하여 유도할 수 있다(예로서, WO 02/060955A2 및 WO02/096948A2 참조). 이러한 예시적 벡터를 조작하여 CH2 도메인을 결실시키고, 도메인이 결실된 IgG1 불변 영역을 발현시키는 합성 벡터를 수득하였다. 이어서, C2B8 항체, 5E8 항체, B3F6 항체의 뮤린 가변 영역, 또는 인간화된 CC49 항체의 가변 영역을 코딩하는 유전자를 합성 벡터에 삽입하고 클로닝시켰다. 형질전환된 세포에서 발현시켰을 때, 이들 벡터들은 각각 C2B8.ΔCH2, 5E8.ΔCH2, B3F6.ΔCH2 또는 huCC49.ΔCH2를 제공하였다. 이들 작제물은 특히 관심의 대상이 되는 단량체 서브유니트 후보물질들이 갖게 되는 다수의 성질을 나타낸다. 인간화된, 도메인이 결실된 B3F6 항체 또한 생산하였고, 이는 본 실시예에서 더욱 상세히 기술된다.
본 발명의 각각의 폴리펩티드의 힌지 영역에 직접 CH3 도메인을 융합시키기 위해서 이들 예시적인 작제물을 조작하였음에 주목할 것이다. 다른 작제물에서는 힌지 영역과 합성 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, CH2 도메인은 결실되어 있고, 남아있는 CH3 도메인(합성 또는 비합성)은 5-20개의 아미노산 스페이서를 사용하여 힌지 영역에 연결되어져 있는, 상화성 작제물이 발현될 수 있다. 그러한 스페이서를 첨가함으로써, 예를 들면, 불변 도메인의 조절 요소가 여전히 유리한 상태로, 접근가능한 상태로 유지되도록 하거나, 힌지 영역이 여전히 가요성인 상태로 유지되도록 할 수 있다. 예를 들면, CH2 도메인이 짧은 아미노산 스페이서 GGSSGGGGSG(서열 번호 8)로 치환되어 있고 하부 힌지 영역을 갖는, 도메인이 결실된 B3F6 작제물(B3F6.ΔCH2 [gly/ser])을 사용할 수 있다. 다른 예시적인 연결 펩티드는 표 2에 제시한다. 이들 연결 펩티드를 임의의 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용할 수 있다. 바람직하게, 연결 펩티드를 CH2 중쇄 도메인이 결실된 폴리펩티드와 함께 사용한다. 바람직하게, 본 발명과 상화성인 임의의 링커는 상대적으로 비면역원성이고, 본 발명의 폴리펩티드의 비공유 결합을 저해하지 못할 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 단량체 서브유니트 사이의 원하는 공유 또는 비공유 결합을 허용하는 한, 소수의 또는 심지어는 1개의 아미노산의 결실 또는 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 예를 들면, CH2 도메인중 선택된 영역에서 1개의 아미노산의 돌연변이도 실질적으로는 Fc 결합을 감소시켜서 종양 국소화를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게는, 조정하고자 하는 효과기 기능(예로서, 보체 결합)을 조절하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 간단히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 불변 영역의 그러한 부분적인 결실은 항체의 선택된 특징(혈청 반감기)을 향상시키면서, 온전한 대상 불변 영역 도메인과 관련된 다른 바람직한 기능은 남겨둔다. 또한, 상기에 언급한 바와 같이, 개시한 항체의 불변 영역은 생산된 작제물의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 돌연변이를 통한 합성일 수 있다. 이와 관련하여, 변형된 항체의 구조 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지하면서, 보존된 결합 부위(예로서, Fc 결합)에 의해서 제공되는 활성은 파괴시킬 수 있다. 추가의 다른 실시태양은, 효과기 기능과 같은 바람직한 특징을 증진시키거나 더 많은 세포독소 또는 당 결합을 제공하기 위해서, 불변 영역에 대한 하나 이상의 아미노산 첨가를 포함한다. 그러한 실시태양에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유도된 특이적 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
불변 영역이 수개의 효과기 기능을 매개한다는 것이 본 분야에는 공지되어 있다. 예를 들면, 보체의 C1 성분이 항체와 결합하면 보체계는 활성화된다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극시키고, 자가면역 과민증에도 관여할 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하고, 항체 Fc 영역상의 Fc 수용기 부위는 세포상의 Fc 수용기(FcR)에 결합한다. IgG(감마 수용기), IgE(입실론 수용기), IgA(알파 수용기) 및 IgM(뮤 수용기)를 비롯한, 상이한 부류의 항체에 특이적인 Fc 수용기가 다수 존재한다. 세포 표면상의 Fc 수용기와 항체의 결합은 항체-피복된 입자의 탐식(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 살해 세포에 의한 항체-피복된 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)로 명명됨), 염증성 매개체의 방출, 면역글로불린 생산의 태반 이동 및 제어를 비롯한 중요하면서도 다양한 생물학적 반응을 다수 유발한다.
하나의 실시태양에서, 표적 세포를 결실시킬 수 없다고 여겨지는 IgG4 항체의 불변 영역을 사용하거나, Fc 변이체(여기에서, 효과기 기능(들)에 중요한 Fc 영역중의 잔기가 예를 들면, 미국 특허번호 제5,585,097호와 같이 본 분야에 공지된 기술의 사용으로 돌연변이화된다)를 제조함으로써 효과기 기능은 제거되거나 저하될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해 이루어짐)는 혈중(circulating) 변형된 항체의 Fc 수용기 결합을 저하시킴으로써 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에는, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시킴으로써 혈청 반감기를 저하시키고, 접합된 세포독소와의 비특이적 결합을 저하시킬 수 있다. 불변 영역에 대한 추가의 다른 변형을 사용함으로써, 항원 특이성 또는 항체 가요성의 증가에 기인하여 국소화를 증진시킬 수 있는 이황화 결합 또는 올리고당 부위를 변형시킬 수 있다. 더욱 일반적으로, 본 원에 기술된 바와 같이 변형된 항체는 용이하게 인식될 수 있거나 인식될 수 없는 미묘한 영향력을 다수 발휘할 수 있다는 것을 본 분야의 당업자는 이해할 것이다. 그러나, 변형에 따른 생성된 생리학적 프로파일, 생체이용성 및 다른 생화학적 효과, 예로서, 종양 국소화, 생체분포 및 혈청 반감기는 잘 공지된 면역학적 기술을 사용하되, 부적당한 실험은 하지 않고, 용이하게 측정되고 측량될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 변형된 형태의 항체는 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 전(whole) 전구체 또는 모체(parent) 항체로부터 제조될 수 있다. 예시적인 기술은 하기에 더욱 상세히 논의된다.
중쇄 부위를 포함하는 폴리펩티드는 면역글로불린 분자로부터 유도되지 않는 다른 아미노산 서열 또는 부분을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 그러한 변형은 하기에 더욱 상세히 기술된다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 가요성 링커 서열을 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 예로서, 약물 또는 PEG와 같은 관능성 부위를 첨가하기 위하여 변형될 수 있다.
2. 이특이성 결합 분자
하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 이특이성이다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 결합 분자는 크립토 및 또다른 분자에 결합한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 이특이성 결합 분자는 하나 이상의 종양 분자 또는 종양 세포 성장과 관련된 분자에 결합하는 추가의 결합 부위를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 신생물성 질병의 경우, 개시한 폴리펩티드의 항원 결합 부위(즉, 가변 영역 또는 그의 면역반응성 단편 또는 재조합체)는 악성 종양 부위에서 선택된 종양과 관련된 분자와 결합한다. 신생물 종양 세포 성장과 관련하여 보고된 분자의 수, 및 관련 항체의 수가 주어진다면, 청구하는 결합 분자의 결합 부위는 다수의 전 항체들중 어느 하나로부터 유도될 수 있다는 것을 본 분야의 당업자는 이해할 것이다. 더욱 일반적으로, 본 발명에 유용한 결합 부위는 선택된 조건과 관련된 표적 또는 마커와 반응하는 임의의 항체(앞서 문헌을 통해 보고된 것 포함)로부터 수득할 수 있거나 그로부터 유도될 수 있다. 추가로, 개시된 폴리펩티드를 생산하기 위하여 사용되는 모 또는 전구체 항체, 또는 그의 단편은 뮤린의 것, 인간의 것, 키메라성인 것, 인간화된 것, 비인간형 영장류의 것 또는 영장류화된 것일 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 원에 기술된 바와 같이 변경된 불변 도메인을 갖는 단일 쇄 항체 작제물(예로서, 미국 특허번호 제5,892,019호(본 원에서 참고로 인용된다)에 개시된 것)을 포함할 수 있다. 그 결과, 이러한 유형의 항체중 임의의 것을 사용하여 본 발명의 이특이성 분자내로 혼입될 수 있는 결합 부위를 수득할 수 있다.
본 원에서 사용되는 바, "종양과 관련된 분자"는 일반적으로 종양 세포와 관련된, 즉, 정상 세포와 비교할 때, 그와 동일하거나 그보다 더 많게 발현되는 임의의 항원 또는 표적 분자를 의미한다. 더욱 일반적으로, 종양과 관련된 분자는 비-악성 세포상에서 그의 발현과는 상관없이, 신생물성 세포에서의 면역반응성 항체의 국소화를 제공하는 임의의 분자를 포함한다. 그러한 분자는 상대적으로 종양 특이성일 수 있고, 그의 발현에 있어 악성 세포의 표면에만 제한될 수 있다. 다르게, 그러한 분자는 악성 및 비-악성 세포 양자 모두에서 발견될 수 있다. 예를 들면, CD20은 비호지킨 림프종 치료용의 면역요법적 항체에 대하여 극도로 유효한 표적이라고 입증되어진, 악성 및 비-악성 세포 양자 모두에서 발견되는 pan B 항원이다.
이와 관련하여, pan T 세포 항원, 예로서, CD2, CD3, CD5, CD6 및 CD7은 또한 본 발명이 의미하는 범위내에서 종양과 관련된 분자를 포함한다. 추가의 다른 예시적인 종양과 관련된 분자로는, 제한하는 것은 아니지만, 루이스 Y(Lewis Y), MAGE-I, MAGE-3, MUC-I, HPV 16, HPV E6 & E7, TAG-72, CEA, L6-항원, CD 19, CD22, CD37, CD52, HLA-DR, EGF 수용기 및 HER2 수용기를 포함한다. 다수의 경우에 있어, 이들 항원들 각각에 대한 면역반응성 항체는 문헌에 보고되어 있다. 이들 항원들 각각이 본 발명에 따라 본 발명의 폴리펩티드에 대한 전구체로서의 역할을 할 수 있다는 것을 본 분야의 당업자는 이해할 것이다.
따라서, 본 발명의 결합 부위는 종양과 관련된 분자와 반응하는 다수의 항체들중 어느 하나로부터 유도되거나, 생산되거나, 제조될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 결합 부위는 보편적인 유전자 조작 기술을 사용하여 유도되는 합성 또는 도메인이 결실된 항체로서, 상기 기술을 통해 하나 이상의 불변 영역 도메인중 적어도 일부분이 결실되거나 변경됨으로써 혈청 반감기 감소와 같은 원하는 생화학적 특징을 제공하게 된다. 더욱 특히, 하기 예시되는 바와 같이, 본 분야의 기술자는 용이하게 대상 항체의 가변 및/또는 불변 영역에 상응하는 유전자 서열을 분리시킬 수 있고, 적절한 뉴클레오티드를 결실시키거나 변경시켜 본 발명에 따라 단량체 서브유니트로서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 본 발명의 상화성 폴리펩티드는 잘-확립된 프로토콜을 사용함으로써 임상적 규모 또는 상업적 규모로 발현되고 생산될 수 있다는 것도 이해할 것이다.
앞서 보고된 바 있는, 종양과 관련된 분자와 반응하는 항체는 본 발명의 폴리펩드에 하나 이상의 결합 부위를 제공하기 위하여 본 원에 기술된 바와 같이 변경될 수 있다. 본 폴리펩티드에 결합 부위를 제공하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 항체(또는 결합 부위가 그로부터 유도될 수 있는 항체)로는 제한하는 것은 아니지만, 2B8 및 C2B8(제발린(Zevalin)® 및 리툭산(Rituxan)®, IDEC Pharmaceuticals Corp., 샌디에고 소재), Lym 1 및 Lym 2(Techniclone), LL2(Immunomedics Corp., 뉴저지 소재), HER2(허셉틴(Herceptin)®, Genentech Inc., 사우스 샌프란시스코 소재), B1(벡사르(Bexxar)®, Coulter Pharm., 샌프란시스코 소재), 캠페스(Campath)®(Millennium Pharmaceuticals, 케임브리지 소재) MB1, BH3, B4, B72.3(Cytogen Corp.), CC49(National Cancer Institute) 및 5E10(University of Iowa)을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 바로 앞에서 열거된 항체와 동일한, 종양과 관련된 항원에 결합할 것이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 2B8, C2B8, CC49 및 C5E10과 동일한 항원으로부터 유도되거나 그에 결합할 것이고, 더욱더 바람직하게는 도메인이 결실된 항체(즉, ΔCH2 항체)를 포함할 것이다.
제1의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 리툭산®과 동일한, 종양과 관련된 항원에 결합할 것이다. 리툭산®(리툭스맵, IDEC-C2B8 및 C2B8로도 공지되어 있음)은 인간 B-세포 림프종 치료용으로서 FDA로부터 최초로 승인받은 단일클론 항체였다(미국 특허번호 제5,843,439호; 제5,776,456호 및 제5,736,137호(이들 각각은 본 원에서 참고로 인용된다) 참조). Y2B8(9OY 표지된 2B8; 제발린®; 이브리투모맵 튜세탄)은 C2B8의 뮤린 모체이다. 리툭산®는 성장 저해성이면서, 보고에 따르면, 시험관내에서 화학요법제에 의해 아포프토시스시키기 위해 특정 림프종 세포주를 감작시키는 키메라성의, 항-CD20 단일클론 항체이다. 항체는 인간 보체에 효율적으로 결합하고, 강력한 FcR 결합성을 갖고, 보체 의존(CDC: complement dependent) 및 항체-의존(ADCC: antibody-dependent) 메카니즘, 양자 모두를 통해 시험관내에서 인간 림프구를 효과적으로 살해할 수 있다[Reff et al,, Blood 83: 435-445(1994)]. 본 개시에 따라 크립토 및 CD20+에 결합하는 이특이성 결합 분자가 CD20+ 악성 종양을 나타내는 환자를 효과적으로 치료하기 위해 접합된 형태 또는 비접합 형태로 사용될 수 있다는 것을 본 분야의 당업자는 이해할 것이다. 더욱 일반적으로, 본 원에 개시된 폴리펩티다는 다수의 질병중 어느 하나를 효과적으로 치료하기 위해 "네이키드(naked)" 또는 비접합 상태로 사용될 수 있거나, 세포독성제에 접합되어 사용될 수 있다는 것은 반복적으로 언급되어야 한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 이특이성 폴리펩티드는 CC49 항체로부터의(또는 CC49 항체로부터 유도된) 결합 부위를 포함할 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, CC49는 인간 기원의 특정 종양 세포, 특히, LS174T 종양 세포주의 표면에 결합하는 인간 종양과 관련된 항원 TAG-72에 결합한다. LS174T [American Type Culture Collection(본 원에서 ATCC) 번호 CL 188]는 LS180(ATCC 번호 CL 187) 결장 샘암종 계열의 변이체이다.
TAG-72에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 뮤린 단일클론 항체가 개발되었다는 것을 추가로 이해할 것이다. 이들 단일클론 항체중 하나인 지정된 B72.3은 하이브리도마 B72.3(ATCC No. HB-8108)에 의해 생산된 뮤린 IgG1이다. B72.3은 면역원으로서 인간 유방 암종 추출물을 사용하여 개발된 제1 세대 단일클론 항체이다([Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 78:3199-3203(1981)]; 및 미국 특허번호 제4,522,918호 및 제4,612,282호(이들 각각 본 원에서 참고로 인용된다) 참조). TAG-72에 대하여 지정된 다른 단일클론 항체는 지정된 "CC"(결장암용(colon cancer))이다. 미국 특허번호 제5,512,443호(Schlom et al.)(본 원에서 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이, CC 단일클론 항체는 B72.3로 정제된 TAG-72를 사용하여 제조된 제2 세대 뮤린 단일클론 항체 군이다. 이들은 TAG-72에 대한 결합 친화성이 우수하기 때문에, 하기의 CC 항체들이 ATCC에 기탁되었고, 이에 대한 사용은 제한될 것을 요청받았다: CC49(ATCC No. HB 9459); CC 83(ATCC No. HB 9453); CC46(ATCC No. HB 9458); CC92(ATTCC No. HB 9454); CC30(ATCC No. HB 9457); CCIl(ATCC No. 9455); 및 CC15(ATCC No. HB 9460). 미국 특허번호 제5,512,443호는 추가로 예를 들면, 재조합 DNA 본 분야에 공지된 기술에 의해 마우스 불변 영역을 인간 불변 영역(Fc) 도메인으로 치환함으로써 개시된 항체는 그의 키메라로 변경될 수 있다는 것을 교시한다. 뮤린 및 키메라 항-TAG-72 항체를 개시하는 것외에도, (Schlom et al.)는 또한 PCT/US99/25552(이는 역시 본 원에서 참고로 인용된다)에서 개시된 바 있는 인간화된 CC49 항체의 변이체, 및 미국 특허번호 제5,892,019호(이는 역시 본 원에서 참고로 인용된다)에 개시된 단일 쇄 작제물을 생산하였다. 상기 항체, 작제물 또는 재조합체, 및 그의 변이체들 각각은 본 발명의 이특이성 분자를 제조할 때 합성될 수 있고 사용될 수 있다는 것을 본 분야의 당업자는 이해할 것이다.
상기 논의된 항-TAG-72 항체외에도, 다양한 단체들이 도메인이 결실된 CC49 및 B72.3 항체의 작제 및 부분적인 특징화를 보고하였다(예를 들면, [Calvo et al. Cancer Biotherapy, 8(1):95-109(1993)], [Slavin-Chiorini et al. Int . J. Cancer 53:97-103(1993)] 및 [Slavin-Chiorini et al. Cancer . Res. 55:5957-5967(1995)]). 그러한 작제물 또한 본 발명의 이특이성 결합 분자에 포함될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이특이성 결합 분자는 CD23에 결합한다(미국 특허 제6,011,138호). 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 이특이성 결합 분자는 5E8 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 결합 부위를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 예를 들면, 5E8 항체와 같은 항-CD23 항체로부터의 적어도 하나의 CDR을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 이특이성 분자는 C5E10 항체로부터 유도된 결합 부위(또는 C5E10 항체와 동일한, 종양과 관련된 항원에 결합하는 결합 부위)를 포함한다. 동시 계속 출원 09/104,717에 기재된 바와 같이, C5E10은 전립선 종양 세포주(예를 들면, DU145, PC3, 또는 ND1)에 특이적인 것으로 보이는, 대략 115kDa의 당단백질 결정기를 인식하는 항체이다. 따라서, 본 발명과 관련하여, C5E10 항체에 의해 인식되는 동일한, 종양과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 이특이성 폴리펩티드(예를 들면, CH2 도메인이 결실된 항체)는 신생물성 질병의 치료를 위해 접합된 형태 또는 비접합된 형태로 생산되고 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 결합 분자는 ATCC 기탁 번호 PTA-865를 갖는 하이브리도마 세포주로부터 분비된 것과 같은 C5E10 항체의 항원 결합 영역 전체 또는 그의 일부분으로부터 유도되거나, 그를 포함할 것이다. 이어서, 본 원의 방법에 따라 하기 기술하는 바와 같이, 생성된 결합 분자를 방사성 핵종에 접합시킬 수 있고, 전립선 암으로 고생하는 환자에게 투여할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 예를 들면, 특정 수용기에 결합하는 특성을 부여하기 위해 리간드가 본 발명의 결합 분자에 포함될 수 있거나, 예를 들면, 순환으로부터 리간드를 제거하기 위해 수용기가 결합 분자내로 혼입될 수 있다. 본 이특이성 결합 분자에 포함될 수 있는, 예시적인 리간드 및 그의 수용기로서 하기를 포함한다:
a. 사이토카인 또는 사이토카인 수용기
사이토카인은 림프구의 증식, 분화, 및 작용 활성화에 다면발현성 효과를 미친다. 다양한 사이토카인, 또는 그의 수용기 결합 부분은 본 발명의 융합 단백질에서 사용될 수 있다. 예시적인 사이토카인은 인터루킨(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, 및 IL-18), 집락 자극 인자(CSFs: colony stimulating factors)(예를 들면, 과립구 CSF(G-CSF: granulocyte-CSF), 과립구 큰포식 CSF(GM-CSF: granulocyte macrophage-CSF), 및 단핵구 큰포식 CSF(M-CSF: monocyte macrophage-CSF)), 종양 괴사 인자(TNF: tumor necrosis factor) 알파 및 베타, 및 인터페론, 예로서, 인터페론-α, β, 또는 γ를 포함한다(미국 특허번호 제4,925,793호 및 제4,929,554호).
사이토카인 수용기는 전형적으로 리간드-특이 알파 쇄 및 공통 베타 쇄로 구성된다. 예시적인 사이토카인 수용기로는 GM-CSF, IL-3(미국 특허번호 제5,639,605호), IL-4(미국 특허번호 제5,599,905호), IL-5(미국 특허번호 제5,453,491호), IFNγ(EP0240975)에 대한 것, 및 TNF 계의 수용기(예를 들면, TNFα(예를 들면, TNFR-1(EP 417,563), TNFR-2(EP 417,014) 림프독소 베타 수용기)를 포함한다.
b. 부착 단백질 또는 그의 수용기
부착 분자는 세포가 서로서로 상호작용할 수 있도록 하는 막-결합된 단백질이다. 백혈구 귀소(homing) 수용기 및 세포 부착 분자를 비롯한, 또는 그의 수용기 결합 부분의 다양한 부착 단백질은 본 발명의 결합 분자내 혼입될 수 있다. 백혈구 귀소 수용기는 염증시 백혈구 세포 표면상에서 발현되고, 세포외 기질 성분과의 결합을 매개하는 β1- 인테그린(예를 들면, VLA-1, 2, 3, 4, 5, 및 6), 및 혈관 내피상의 세포 결합 분자(CAMs: cell adhesion molecule)에 결합하는 β2-인테그린(예를 들면, LFA-1, LPAM-1, CR3, 및 CR4)을 포함한다. 예시적인 CAMs로는 ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, 및 MAdCAM-1을 포함한다. 다른 CAMs로는 E-셀렉틴, 1-셀렉틴, 및 P-셀렉틴을 비롯한 셀렉틴 계의 것들을 포함한다.
c. 케모카인 또는 그의 수용기
감염 부위로 백혈구가 유주하도록 자극시키는 화학 주성 단백질인 케모카인 또한 본 발명의 결합 분자내로 혼입될 수 있다. 예시적인 케모카인은 대식세포 염증성 단백질(MIP: macrophage inflammatory protein)(MIP-1-α 및 MIP-1-β), 호중구 주성 인자, 및 RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)를 포함한다.
d. 성장 인자 또는 성장 인자 수용기
성장 인자 또는 그의 수용기(그의 수용기 결합 부분 또는 리간드 결합 부분) 또는 그와 결합하는 분자는 본 발명의 결합 분자내로 혼입될 수 있다. 예시적인 성장 인자로는 안지오포이에틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor) 및 그의 이소폼(미국 특허번호 제5,194,596호); 표피 성장 인자(EGFs: epidermal growth factor); 섬유모 세포 성장 인자(FGF: Epidermal Growth Factors)(aFGF 및 bFGF 포함); 심방 나트륨 이뇨 인자(ANF: atrial natriuretic factor); 간 성장 인자(HGFs: hepatic growth factors)(미국 특허번호 제 5,227,158호 및 제6,099,841호), 신경영양 인자, 예로서, 골-유래 신경영양 인자(BDNF: bone-derived neurotrophic factor), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT(neurotrophin)-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예로서, NGF-β 혈소판-유래 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor)(미국 특허번호 제4,889,919호, 제 4,845,075호, 제5,910,574호, 및 제5,877,016호); 전환 성장 인자(TGF: transforming growth factor), 예로서, TGF-알파 및 TGF-베타(WO 90/14359), 골 형태형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein)을 포함하는 골유도 인자; 인슐린-양 성장 인자-I 및 -II(IGF(insulin-like growth factor)-I 및 IGF-II; 미국 특허번호 제 6,403,764호 및 제6,506,874호); 에리트로포에틴(EPO: Erythropoietin); 줄기-세포 인자(SCF: stem-cell factor), 트롬보포이에틴(c-Mpl 리간드), 및 Wnt 폴리펩티드(미국 특허번호 제6,159,462호)를 포함한다.
사용될 수 있는 예시적인 성장 인자 수용기로는 EGF 수용기(EGFRs); VEGF 수용기(예를 들면, Flt1 또는 Flk1/KDR), PDGF 수용기(WO 90/14425); HGF 수용기(미국 특허번호 제 5,648,273호, 및 제5,686,292호); IGF 수용기(예를 들면, IGFR1 및 IGFR2), 및 NGF, BDNF, 및 NT-3에 결합하며, p75NTR 또는 p75로도 명명되는 저친화성 수용기(LNGFR), 및 수용기 티로신 키나제의 trk 계의 일원인(예를 들면, trkA, trkB(EP 455,460), trkC(EP 522,530)) 고친화성 수용기를 비롯한 신경영양 수용기를 포함한다. 또다른 실시태양에서, IGFR1 및 VEGF가 표적화된다. 추가의 또다른 실시태양에서, VLA4 및 VEGF가 표적화된다.
다른 세포 표면 수용기 및/또는 그의 리간드 또한 표적화될 수 있다(예를 들면, TNF 계의 수용기 또는 그의 리간드(본 원에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같음)).
e. 호르몬
본 발명의 결합 분자에서 표적화제로서 사용하기 위해 그에 결합하는 성장 호르몬 또는 분자의 예로서, 레닌, 인간 성장 호르몬(HGH; Human growth hormone)(미국 특허번호 제5,834,598호), N-메티오닐 인간 성장 호르몬; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬(PTH: parathyroid hormone); 갑상샘 자극 호르몬(TSH: thyroid stimulating hormone); 티록신; 프로인슐린 및 인슐린(미국 특허번호 제 5,157,021호 및 제6,576,608호); 난포 자극 호르몬(FSH: follicle stimulating hormone), 칼시토닌, 황체 형성 호르몬(LH: luteinizing hormone), 렙틴, 글루카곤; 봄베신; 소마트로핀; 물러관 억제물질; 릴랙신 및 프로릴랙신; 생식샘자극호르몬-관련 펩티드; 프로락틴; 태반 젖샘자극호르몬; OB 단백질; 또는 물러관 억제물질을 포함한다.
f. 응고 인자
본 발명의 결합 분자에서 표적화제로서 사용하기 위한 혈액응고 인자의 예로서 응고 인자(예를 들면, V, VII, VIII, X, LX, XI, XII 및 XIII형 인자, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)); 조직 인자(미국 특허번호 제5,346,991호, 제5,349,991호, 제5,726,147호, 및 제6,596,84호); 트로빈 및 프로트롬빈; 섬유소 및 섬유소원; 플라스민 및 플라스미노겐; 플라스미노겐 활성제, 예로서, 우로키나아제 또는 인간 뇨 또는 조직형 플라스미노겐 활성제(t-PA: tissue-type plasminogen activator)를 포함한다.
C. 융합 단백질
본 발명은 또한 하나 이상의 면역글로불린 도메인을 포함하는 결합 분자에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 결합 도메인(적어도 하나의 결합 부위를 포함) 및 이량체화 도메인(적어도 하나의 중쇄 부위를 포함)을 포함한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 하나의 인간화된 B3F6 결합 부위 및 이량체화 도메인을 포함할 수 있다. 본 융합 단백질 은 이특이성(제1 표적에 대한 하나의 결합 부위 및 제2 표적에 대한 제2 결합 부위 포함)이다. 하나의 실시태양에서, 본 융합 단백질은 다가(동일 표적에 대하여 2개의 결합 부위 포함)이다.
하나의 실시태양에서, 융합 단백질은 B3F6 결합 부위, 적어도 하나의 중쇄 도메인 및 합성 연결 펩티드를 포함한다.
문헌에 보고된 예시적인 융합 단백질로는 T 세포 수용기[Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940(1987)]; CD4([Capon et al., Nature 337:525-531(1989)]; [Traunecker et al., Nature 339:68-70(1989)]; [Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353(1990)]; 및 [Byrn et al., Nature 344:667-670(1990)]); 1-셀렉틴(귀소 수용기)([Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229(1990]; 및 [Watson et al., Nature 349:164-167(1991)]); CD44[Aruffo et al., Cell 61:1303-1313(1990)]; CD28 및 B7[Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730(1991)]; CTLA-4[Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569(1991)]; CD22[Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144(1991)]; TNF 수용기([Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539(1991)]; [Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886(1991)]; 및 [Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489(1991)]); 및 IgE 수용기[Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448(1991)]의 융합물을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질을 제조할 때, 결합 도메인(예를 들면, 인간화된 B3F6 결합 도메인)을 코딩하는 핵산의 C-말단이 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 융합될 것이다. N-말단 융합 또한 가능하다. 하나의 실시태양에서, 융합 단백질은 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 또한, 불변 도메인의 Fc 부위의 C-말단에 융합될 수 있거나, 중쇄의 CH1 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대한 N-말단에 인접하게 융합될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 리간드 또는 수용기 도메인의 서열은 면역글로불린 분자의 Fc 도메인 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 리간드 또는 수용기 도메인의 서열에 융합시키는 것도 가능하다. 하나의 실시태양에서, 화학적으로 IgG Fc를 한정짓는 파파인 절단 부위(즉, 216번 잔기, 중쇄 불변 영역의 첫번째 잔기가 114번이 된다), 또는 다른 면역글로불린의 유사 부위의 상류의 힌지 영역에서 시작되는 서열이 융합에 사용된다. 융합되는 곳의 정확한 위치는 중요하지 않고; 특정 위치는 잘 공지되어 있고, 분자의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해서는 선택될 수 있다. 융합 단백질을 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다.
이특이성 융합 단백질의 경우, 융합 단백질은 다량체, 및 특히, 이종이량체 또는 이종4량체로서 어셈블린다. 이들 어셈블리된 면역글로불린은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 4개의 기본 쇄 구조 단위 형태로 IgG, IgD, 및 IgE가 존재한다. 고분자 면역글로불린에서는 4개의 쇄 단위가 반복된다; IgM은 일반적으로 이황화 결합에 의해 결합된 4개의 기본 단위가 5량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 종종 IgG 글로불린 또한 혈청내에서 다량체 형태로 존재할 수 있다. 다량체의 경우, 각각의 4개의 단위들은 동일하거나 상이할 수 있다.
융합 단백질은 예를 들면, WO0069913A1 및 WO0040615A2에 교시되어 있다. 융합 단백질은 본 분야에 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여 제조할 수 있다(예를 들면, 미국 특허번호 제5,116,964호 및 제5,225,538호 참조). 통상, 리간드 또는 수용기 도메인의 C-말단은 가변 영역 대신 중쇄(또는 중쇄 부위)의 불변 영역의 N-말단에 융합된다. 리간드 결합 수용기의 임의의 막횡단 영역 또는 지질 또는 인지실 부착 인식 서열은 바람직하게 융합 이전에 불활성화되거나 결실된다. 리간드 또는 수용기 도메인을 코딩하는 DNA는 원하는 ORF 절편을 코딩하는 DNA의 5' 및 3' 종단에서 또는 그에 인접한 위치에서 제한 효소에 의해 절단된다. 이어서, 생성된 DNA 단편을 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA내로 용이하게 삽입시킨다. 가용성 융합 단백질의 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해서 융합이 이루어지는 정확한 위치는 실험적으로 선택할 수 있다. 이어서, 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 발현시키기 위해 숙주 세포내로 형질감염시킨다.
III. 합성 연결 펩티드
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이량체중 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄는 합성 연결 펩티드를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 이량체중 적어도 2개의 쇄는 연결 펩티드를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이량체의 2개의 쇄는 연결 펩티드를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 연결 펩티드를 사용하여 단일 폴리펩티드 쇄내의 프레임에서 2개의 중쇄 부위를 연결시킬 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드를 사용하여 CH3 도메인(또는 합성 CH3 도메인)을 힌지 영역(또는 합성 힌지 영역)에 융합시킬 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드를 사용하여 CH3 도메인(또는 합성 CH3 도메인)을 CH1 도메인(또는 합성 CH1 도메인)에 융합시킬 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, 연결 펩티드는 힌지 영역(또는 합성 힌지 영역)과 CH2 도메인(또는 합성 CH2 도메인) 사이의 펩티드 스페이스로서 작용할 수 있다.
또다른 실시태양에서, CH3 도메인은 세포외 단백질 도메인(예를 들면, VL 도메인(또는 합성 도메인), VH 도메인(또는 합성 도메인), CH1 도메인(또는 합성 도메인), 힌지 도메인(또는 합성 힌지), 또는 수용기의 리간드 결합 부위 또는 리간드의 수용기 결합 부위)에 융합될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, VH 또는 VL 도메인은 연결 펩티드를 통해 CH3 도메인에 융합된다(연결 펩티드의 C-말단은 CH3 도메인의 N-말단에 결합하고, 연결 펩티드의 N-말단은 VH 또는 VL 도메인의 C-말단에 결합한다). 또다른 실시태양에서, CH1 도메인은 연결 펩티드를 통해 CH3 도메인에 융합된다(연결 펩티드의 C-말단은 CH3 도메인의 N-말단에 결합하고, 연결 펩티드의 N-말단은 CH1 도메인의 C-말단에 결합한다). 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드를 사용하여 CH3 도메인(또는 합성 CH3 도메인)을 힌지 영역(또는 합성 힌지 영역) 또는 그의 일부분에 융합시킬 수 있다. 추가의 또다른 실시태양에서, 연결 펩티드는 힌지 영역(또는 합성 힌지 영역)과 CH2 도메인(또는 합성 CH2 도메인) 사이의 펩티드 스페이서로서 작용할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 gly/ser 스페이서를 포함하거나, 그로 구성될 수 있다. 예를 들면, CH2 도메인이 짧은 아미노산 스페이서 GGSSGGGGSG(서열 번호 8)로 치환되어 있고 하부 힌지 영역을 갖는, 도메인이 결실된 작제물이 사용될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 연결 펩티드는 아미노산 서열 IGKTISKKAK(서열 번호 15)를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 연결 펩티드는 면역글로불린 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상이한 항체 이소타입으로부터 유도된 힌지 요소와 조합된 키메라 힌지 도메인이 작제될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 IgG1 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 연결 펩티드는 IgG3 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 연결 펩티드은 IgG1 힌지 영역의 적어도 일부분 및 IgG3 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 IgG1의 상부 및 중앙부 힌지 및 단일 IgG3의 중앙부 힌지 반복 모티프를 포함할 수 있다.
면역글로불린 힌지 영역으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 연결 펩티드에서 개체 아미노산의 번호화는 연결 펩티드의 길이에 따라 달라질 수 있기 때문에 이들 분자내 아미노산 위치의 번호화는 카뱃 번호화를 사용함으로써 주어진다(참조, 표 2). 표 3은 IgG1, IgG3, 및 IgG4 분자에 대한 자연적으로 발생된 힌지 서열을 나타낸다. 표 2는 이들 힌지 분자의 부위에 대한 카뱃 번호화를 나타내고, 표에 제시한 연결 펩티드 아미노산 잔기에 대한 카뱃 번호화를 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드는 비자연적으로 발생된 면역글로불린 힌지 영역 도메인, 예를 들면, 상기 힌지 영역 도메인, 및/또는 자연적으로 발생된 면역글로불린 힌지 영역 도메인과 아미노산 서열이 상이하도록 변경된 힌지 영역 도메인을 포함하는 폴리펩티드에서는 자연적으로 발견되지 않는 힌지 영역 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드를 제조하기 위해 힌지 영역 도메인을 돌연변이화할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드는 자연적으로 발생되어진 갯수만큼의 시스테인을 포함하지 않는 힌지 도메인을 포함하고, 즉, 연결 펩티드는 자연적으로 발생된 힌지 분자보다 더 적은 갯수의 또는 더 많은 갯수의 시스템을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드내로 연결 펩티드를 혼입시킴으로써 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 이량체 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합에 의해 연결된 형태로 존재하는 조성이 이루어진다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 카뱃 번호 체계에서 아미노산 위치 243번(EU 번호 체계로는 위치 230번)에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린 잔기를 포함하는 힌지 영역 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 카뱃 번호 체계에서 아미노산 위치 244번(EU 번호 체계로는 위치 246번)에 상응하는 아미노산 위치에 알라닌 잔기를 포함하는 힌지 영역 도메인을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드는 위치 245번(카뱃 번호 체계에서; EU 번호 체계로는 위치 247번)에 상응하는 아미노산 위치에 프롤린 잔기를 포함하는 힌지 영역 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 카뱃 번호 체계에서 아미노산 위치 239번(EU 번호 체계로는 위치 226번)에 상응하는 아미노산 위치에 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 연결 펩티드는 카뱃 번호 체계에서 아미노산 위치 242번(EU 번호 체계로는 위치 229번)에 상응하는 아미노산 위치에 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 연결 펩티드를 선택함으로써 예를 들면, 2개의 중쇄 부위가 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 것 또는 이황화 결합을 통해 연결되어 있지 않는 것과 같은 폴리펩티드의 특정 이소폼이 우선적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 본 실시예에서 기술되는 바와 같이, G1/G3/Pro243 + [gly/ser] 링커(서열 번호 26), G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [gly/ser] 링커(서열 번호 5), Pro243 + [gly/ser] 링커(서열 번호 33), 및 Pro243Ala244Pro245 + [gly/ser] 링커(서열 번호 32)의 연결 펩티드를 통해 검출되는 B형은 없이 오직 A형의 CH2 도메인이 결실된 항체만이 생산되었다. 반대로, CH2 도메인이 결실된 Cys242Ser:Pro243(서열 번호 31), 및 CH2 도메인이 결실된 Cys242Ser:Pro243Ala244Pro245(서열 번호 32), 양자 모두는 B형 이소폼을 우선적으로 생산하였다. 따라서, 이러한 합성 힌지 영역 연결 펩티드는 A형 또는 B형 이소폼의 선호적인 합성에 유용할 것이다. 4개의 인간 이소타입 모두에 대한 CH3 도메인 사이의 고도한 상동성에 기초하여 임의의 항체 이소타입(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)에도 상기는 적용된다(일치하고 보존적인 아미노산 잔기를 비롯하여, IgG1 CH3 도메인은 IgG2 CH3과 98.13% 상동성이고, IgG3 CH3에 대하여 97.20% 상동성이며, IgG4 CH3에 대하여 96.26% 상동성이다). 본 발명의 연결 펩티드 및 다양한 결합 분자에 대하여 언급하는 삽입구들은 달리 언급하지 않는 한 동등한 용어를 의미한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드는 가용성 gly/ser 링커가 이어지는 힌지 영역 도메인을 포함한다. 예시적인 연결 펩티드는 표 2에, 서열 번호 5, 25-34로 나타낸다. 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 연결 펩티드내로 도입되도록 연결 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열내로 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 도입시킴으로써 이들 예시적인 연결 펩티드의 변이체 형태를 제조할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 돌연변이는 예로서, 부위-지향성 돌연변이 유발법 및 PCR-매개 돌연변이 유발법과 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게, 보존적 아미노산 치환은, A형 또는 B형의 합성을 우선적으로 증진시키는 연결 펩티드의 능력은 변경되지 않도록 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 이루어진다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩티드내 비필수 아미노산 잔기는 동일 측쇄 군으로부터의 또다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 일련의 아미노산은 측쇄 군 일원의 순서 및/또는 조성에서 차이가 나는, 구조적으로 유사한 일련의 것으로 대체될 수 있다.
본 발명의 연결 펩티드의 길이는 다양할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드의 길이는 약 15개 내지 약 50개의 아미노산이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드의 길이는 약 20개 내지 약 45개의 아미노산이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드의 길이는 약 2개 내지 약 40개의 아미노산이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드의 길이는 약 30개 내지 약 35개의 아미노산이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드의 길이는 약 24개 내지 약 27개의 아미노산이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연결 펩티드의 길이는 약 40개 내지 약 42개의 아미노산이다.
연결 펩티드는 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 폴리펩티드 서열내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 중첩 연장에 의한 스플라이싱(SOE: Splicing by Overlap Extension) 방법[Horton, R.M. 1993 Methods in Molecular Biology, VoI 15:PCR Protocols: Current Methods and applications. Ed. B. A. White]이 사용될 수 있다. 변형은 DNA 서열 분석에 의해 확인할 수 있다. 폴리펩티드의 안정적인 생산을 위해 플라스미드 DNA를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 폴리펩티드내로 본 연결 펩티드중 하나를 혼입시킴으로써 적어도 2개의 결합 부위 및 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 결합 분자를 포함하느 조성물을 수득하되, 여기에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄는 합성 연결 펩티드를 포함하고, 50% 초과의 분자는, 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또다른 실시태양에서, 60% 초과의 분자는, 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또다른 실시태양에서, 70% 초과의 분자는, 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또다른 실시태양에서, 80% 초과의 분자는, 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또다른 실시태양에서, 90% 초과의 분자는, 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다.
IV. 결합 분자의 발현
상기 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 제공하기 위해 분리된 유전 물질을 조작한 후, 전형적으로 원하는 정량으로 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포내로 도입시키기 위해 발현 벡터에 유전자를 삽입하여, 최종적으로는 청구하는 결합 분자를 수득한다.
명세서 및 청구 범위를 위해 본 원에서 사용되는 용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본 발명에 따라 사용되는 벡터가 원하는 유전자를 세포내로 도입하고 세포에서 발현시키기 위한 비히클임을 의미한다. 본 분야의 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 그러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 상화성인 벡터는 선별 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 촉진시키는 적절한 제한 부위 및 진핵 또는 원핵 세포에서 진입하고/거나 복제하는 능력을 포함할 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 다수의 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들면, 한 부류의 벡터는 예로서, 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 우두 바이러스, 베큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 사용한다. 다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 포함하는 폴리시스트론 시스템의 사용을 포함한다. 추가로, 형질감염된 숙주 세포를 선별할 수 있도록 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 DNA가 그들의 염색체내로 통합되어져 있는 세포를 선별할 수 있다. 상기 마커는 영양 요구성 숙주에 원영양성을 제공할 수 있거나, 살생제(예를 들면, 항생제)에 대한 내성, 또는 중금속, 예로서, 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 발현시키고자 하는 DNA 서열에 직접 연결될 수 있거나, 공형질전환에 의해 동일 세포내로 도입될 수 있다. 최적의 mRNA 합성을 위해 추가의 요소 또한 필요할 수 있다. 이러한 요소로는 신호 서열, 스플라이스 신호 뿐만 아니라 전사 프로모터, 인해서, 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 논의된 바와 같이 합성의 것인 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(바람직하게, 인간)와 함께 발현 벡터내로 삽입된다. 바람직하게, 상품명이 NEOSPLA(미국 특허 제6,159,730호)인 IDEC 인코포레이티드(IDEC, Inc.)의 발현 벡터 상품을 사용하여 수행한다. 상기 벡터는 거대세포바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, SV40 복제기점, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 리더 서열을 포함한다. 하기 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이러한 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자를 혼입시키고, CHO 세포에 형질감염시킨 후, G418을 함유하는 배지에서 선별하고, 메토트렉세이트 증폭시켰을 때 항체를 매우 고도한 수준으로 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 벡터 시스템은 또한 미국 특허번호 제5,736,137호 및 제5,658,570호(각각은 전문이 본 원에서 참고로 인용된다)에 교시되어 있다. 이러한 시스템은 고도의 발현 수준, 예를 들면, > 30 pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적인 벡터 시스템은 예를 들면, 미국 특허 제6,413,777호에 개시되어 있다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예로서, 2001년 11월 16일 출원된 동시계속 출원 미국 가출원 번호 제60/331,481호(본 원에서 전문이 인용된다)에 개시된 것과 같은 폴리시스트론 작제물을 사용함으로써 발현될 수 있다. 이러한 신규 발현 시스템에서, 관심의 대상이 되는 다중 유전자 산물, 예로서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 단일 폴리시스트론 작제물로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩티드를 상대적으로 고수준으로 제공하기 위하여 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)를 사용한다. 상화성 IRES 서열은 미국 특허번호 제6,193,980호(이 또한 본 원에서 인용된다)에 개시되어 있다. 본 분야의 당업자는 그러한 발현 시스템을 사용함으로써 본 출원에 개시된 전장의 범위의 폴리펩티드를 효과적으로 생산할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
더욱 일반적으로, 폴리펩티드(예를 들면, 변형된 항체)의 단량체 서브유니트를 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 일단 제조되면, 발현 벡터를 적절한 숙주 세포내로 도입시킬 수 있다. 즉, 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 플라스미드를 숙주 세포내로 도입시키는 것은 본 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있는 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 이는 제한하는 것은 아니지만, 형질감염(전기영동 및 전기 천공), 원형질체 융합, 인산칼슘 침착, 외피 보유 DNA와의 세포 융합, 미세 주사, 및 온전한 바이러스에 의한 감염을 포함한다([Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds.(Butterworths, Boston, Mass. 1988] 참조). 가장 바람직하게, 숙주내로의 플라스미드 도입은 전기 천공을 통해 이루어진다. 경쇄 및 중쇄 생산에 적절한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대하여 분석한다. 예시적인 분석 기술은 효소 면역 측정법(ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 또는 형광 표지 세포 분리기(FACS: flourescence-activated cell sorter analysis), 면역 조직 화학법 등을 포함한다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "형질전환"은 광범위한 의미로 사용되어야 하며, 이는 DNA를 수용체 숙주 세포에 도입시킴으로써 유전자형을 변화시키고, 그 결과 수용체의 세포도 변화시키는 것을 언급한다.
동일 계열을 따라, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제되고, 적어도 하나의 이종성 유전자를 코딩하는 벡터로 형질전환된 세포를 언급한다. 재조합 숙주로부터 항체를 분리하는 공정에 대한 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 이는 달리 명확하게 기술되지 않는 한, 항체의 공급원을 언급한다. 다시말해, "세포"로부터 폴리펩티드의 회수는 원심분리된(spun down) 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 양자 모두를 함유하는 세포 배양물로부터의 것일 수 있다.
단백질 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 가장 바람직하게, 포유동물 기원이고; 본 분야의 당업자는 그 안에서 발현되는 원하는 유전자 산물에 가장 적합한 특정의 숙주 세포를 우선적으로 결정할 수 있는 능력을 갖고 있다고 본다. 예시적인 숙주 세포주는 제한하는 것은 아니지만, DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR 없음), HELA(인간 자궁경부 암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 상피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)을 포함한다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스업체, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 또는 공개 문헌으로부터 이용가능하다.
시험관내 생산을 확장시킴으로써 다량의 원하는 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 조직 배양 조건하에서 포유동물 세포를 배양하는 기술은 본 분야에 공지되어 있고, 이는 예를 들면, 공수 반응기에서의 또는 연속 교반식 반응기에서의 동종 현탁액 배양, 또는 예를 들면, 중공사에서의, 마이크로캡슐에서의, 또는 아가로스 마이크로비드 또는 세락믹 카트리지상에서의 고정화 세포 배양 또는 포획(entrappe) 세포 배양을 포함한다. 필요하고/거나 원하는 경우, 폴리펩티드 용액을 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스상에서의 크로마토그래피 또는 (면역-)친화성 크로마토그래피, 예를 들면, 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 우선적 생합성 후에 또는 본 원에 기술된 HIC 크로마토그래피 이전 또는 그 후의 것을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 또한 비-포유동물 세포, 예로서, 세균 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 다양한 단세포의 비-포유동물 미생물, 예로서, 세균 또한 형질전환될 수 있고; 즉, 배양 또는 발효시 배양될 수 있는 것임을 이해할 것이다. 형질전환되기 쉬운 세균은 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae)의 일원들, 예로서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella) 균주; 바실라세아에(Bacillaceae), 예로서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus), 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 세균에서 발현될 때 폴리펩티드는 전형적으로 봉입체의 일부가 된다는 것도 이해할 것이다. 폴리펩티드는 분리되고, 정제되된 후, 관능성 분자로 어셈블리되어야 한다. 4가 형태의 항체가 요구되는 경우, 서브유니트는 이어서 4가 항체로 자가-어셈블리될 것이다(WO 02/096948 A2).
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물도 사용될 수 있다. 다수의 다른 균주들도 보편적으로 사용될 수 있지만, 진핵 미생물중에서 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 빵 효모가 가장 보편적으로 사용되고 있다. 사카로마이세스에서의 발현인 경우, 예를 들면, 플라스미드 YRp7([Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7:141(1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157(1980)])이 보편적으로 사용된다. 이러한 플라스미드는, 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 부족한 뮤턴트 효모 균주, 예를 들면, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 이미 포함하고 있다[Jones, Genetics, 85:12(1977)]. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1 손상이 존재하는 것은 트립토판 부재에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 유효 환경을 제공한다.
V. 쇄간 이황화 결합을 포함하지 않는 결합 분자로부터 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 포함하는 결합 분자의 분리
하나의 일면에서, 본 발명은 분자 분획이 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재하고, 분자 분획이 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있지 않은 중쇄 부위를 포함하는 혼합물로부터 2개의 중쇄 부위를 갖는 분자를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리하는 것에 관한 것이다.
탄화수소 스페이서 암(arms)은 포함하지만 친화성 리간드는 결여되어 있는 친화성 겔상에서 단백질이 유지될 수 있다는 관찰에 따라 소수성 상호작용 크로마토그래피가 최초로 개발되었다. HIC 기판으로부터의 용출은 용매, pH, 이온 강도의 변화, 또는 카오트로픽제(chaotropic agent) 또는 유기 개질제, 예로서, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜의 첨가에 의해 영향을 받을 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 일반 원리에 대한 설명은 예를 들면, 미국 특허 제3,917,527호 및 미국 특허 제4,000,098호에서 찾아볼 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 관련하여 HIC는 단단계 프로토콜로 중쇄 부위(예를 들면, F(ab')2)가 결여되어 있는 항체 단편을 온전한 항체 분자로부터 분리시키기 위하여 사용되어 왔다[Morimoto, K. et al, L Biochem. Biophvs. Meth. 24: 107(1992)].
본 발명의 분리 방법은 정제되지 않은 폴리펩티드 군집(예를 들면, 배양 상등액 또는 제제, 또는 원핵 봉입체로부터 분리된 폴리펩티드 제제)상에서 실시될 수 있다. 다르게, 본 분리 방법은 하나 이상의 초기 정제 단계 후, 예를 들면, A형 및 B형을 포함하는 제제를 친화성 기질로부터 용출시킨 후 수득된 폴리펩티드 혼합물상에서 사용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, HIC 크로마토그래피된 결합 분자는 본 발명의 연결 펩티드를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, HIC를 다른 단백질 정제 방법에 의해 부분적으로 정제된 혼합물에 적용시킬 수 있다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "부분적으로 정제된다는 것"은, 관심의 대상이 되는 단백질이 적어도 5중량%, 더욱 바람직하게, 적어도 10% 및 가장 바람직하게, 적어도 45%로 존재하는 단백질 제제를 포함한다. 초기 또는 차후에 정제 단계를 사용하여 예를 들면, 면역글로불린 응집체, 미스폴딩된(misfolded) 종, 숙주 세포 단백질, 선행 크로마토그래프 단계로부터의 잔기 물질(예로서, 사용시 단백질 A)을 제거할 수 있다. 하나의 실시태양에서, HIC는 본 발명의 연결 펩티드를 포함하는 폴리펩티드상에서 실시할 수 있다. 따라서, HIC 적용은 또한 전반적인 정제 프로토콜과 관련하여 이해될 수 있다. HIC 이전, 또는 이후에 사용될 수 있는 예시적인 정제 단계는 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 조절 공극 유리에 공유 결합된 단백질 A로 구성된 PROSEP-A®(BioProcessing Ltd., 영국 소재) 또는 단백질 A 세파로스® 패스트 플로우(SEPHAROSE® Fast Flow)(Pharmacia) 또는 토요펄(TOYOPEARL) 650M 단백질 A(TosoHaas))를 포함한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ 2, 또는 γ 4 중쇄에 바람직하고, 단백질 G는 마우스 이소타입에 바람직하다. 분자가 CH3 도메인을 포함한다면 베이커본드(Bakerbond) ABXtm 수지를 사용할 수 있다. 그외에 또는 다르게는, 이온 교환 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 이와 관련하여 크로마토그래피에 대한 음이온 또는 양이온 기판을 형성하기 위해서 다양한 음이온 또는 양이온 치환체가 기질에 결합될 수 있다. 음이온 교환 치환체는 디에틸아미노에틸(DEAE: diethylaminoethyl), 4급 아미노에틸(QAE: quaternary aminoethyl) 및 4급 아민(Q) 기를 포함한다. 양이온 교환 치환체는 카복시메틸(CM: carboxymethyl), 설포에틸(SE: sulfoethyl), 설포프로필(SP: sulfopropyl), 포스페이트(P: 인산염) 및 설포네이트(S: sulfonate)를 포함한다. 셀룰로오스 이온 교환 수지, 예로서, DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52는 영국 켄트 메이드스톤에 소재하는 와트맨 리미티드(Whatman Ltd.)로부터 입수가능하다. 세파덱스(SEPHADEX)®-기반 및 -교차 결합된(locross-linked) 이온 교환 또한 공지되어 있다. 예를 들면, DEAE-, QAE-, CM-, 및 SP-세파덱스® 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-세파로스® 및 세파로스® 패스트 플로우 모두 파머시아 AB(Pharmacia AB)로부터 입수가능하다. 추가로, DEAE 및 CM 유도화된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 예로서, 토요펄 DEAE-650S 또는 M 및 토요펄 CM-650S 또는 M은 펜실베이니아주 필라델피아에 소재하는 토소 하스 컴파니(Toso Haas Co.)로부터 입수가능하다. 이온 교환 기판으로부터의 용출은 일반적으로 염 첨가를 포함하고, HIC는 염 농도의 증가시에 증진되기 때문에, 이온 교환 크로마토그래피 단계 또는 다른 염 매개 정제 단계에 이어서 HIC 단계를 도입하는 것이 바람직하다. 추가로 정제 프로토콜이 추가될 수 있고, 필수적으로 제한되는 것은 아니지만, 추가의 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 농축 및 냉동 건조, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 에탄올 침점, 역상 HPLC, 실리카상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEQHAROSE™상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 또는 황산암모늄 침전을 포함한다.
본 방법을 사용하여 정제하기 이전에, 분리하고자 하는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 조성물은 바람직하게 산성 또는 대략적으로 중성 pH의 완충액에 놓여질 것이다. 이는 예를 들면, 진한 완충액을 가하고, 완충액중 샘플을 재현탁시키고, 완충액을 교환시킴으로써(예를 들면, 투석 또는 한외여과 사용) 수행될 수 있다. 다르게는, 간단하게 샘플 완충액의 pH를 원하는 범위내로 조절할 수 있다.
소수성 상호작용은 이온 강도가 높을 때 가장 강하고, 따라서, 이러한 형태의 분리는 염 침전 또는 이온 교환 방법 후에 용이하게 실시된다. HIC 칼럼에 대한 단백질의 흡착에 고농도의 염이 도움이 되지만, 실제 농도는 단백질의 성질 및 선택된 특정 HIC 리간드에 따라 광범위한 범위로 다양할 수 있다. 소수성 상호작용(염석 효과)을 촉진시키는지 여부, 또는 물의 구조를 파괴하는지 여부(카오트록픽(chaotropic) 효과) 및 소수성 상호작용을 약화시키는지 여부에 따라 다양한 이온들이 소위 가용성이 약한 시리즈(solupliobic series)로 배열될 수 있다. 양이온은 염석 효과가 증가하는 방식으로 Ba++<; Ca++<; Mg++ <; Li+ <; Cs+ <; Na+ <; K+ <; Rb+ <; NH4+으로서 순서가 매겨지는 반면, 음이온은 카오트록 효과가 증가하는 방식으로 PO- <; SO4- <; CH3COOO- <; Cl- <; Br- <; NO3- <; ClO4- <; I- <; SCN-으로서 순서가 매겨질 수 있다.
일반적으로, 황산나트륨, 황산칼륨 또는 황산암모늄은 HIC에서 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 촉진시킨다. 염은 하기 관계로 주어지는 바와 같이 상호작용의 강도에 영향을 미치도록 제형화될 수 있다: NH4SO4 >; Na2SO4 >; NaCl >;NH4Cl >; NaBr >; NaSCN. 일반적으로, 염 농도는 약 0.75 내지 약 2M 사이의 황산암모늄 또는 약 1 내지 4M 사이의 NaCl이 유용하다.
다수의 크로마토그래피 기판이 HIC 칼럼 제조시에 사용될 수 있고, 가장 광범위하게 사용되는 것은 아가로스, 실리카 및 유기 중합체 또는 공-중합체 수지이다. 소수성 상호작용 물질은 일반적으로, 소수성 리간드(예를 들면, 알킬기 또는 아릴기)가 결합되는 기본 기질(예를 들면, 친수성 탄수화물(예로서, 가교 아가로스) 또는 합성 공중합체 물질)이다. 바람직한 HIC 물질은 페닐기로 치환된 아가로스 수지를 포함한다. 예시적인 HIC 물질은: 페닐 세파로스™, 치환성이 낮거나 높은 패스트 플로우(Pharmacia LKB Biotechnology, 스웨덴 AB 소재); 페닐 세파로스™ 고성능 칼럼; 페닐 또는 부틸-세파로스® CL-4B, 부틸-세파로스® FF, 옥틸-세파로스® FF 및 페닐-세파로스® FF(Pharmacia LKB Biotechnology, 스웨덴 AB 소재); 프락토겔™ EMD 프로필 또는 프락토겔™ EMC 페닐 칼럼(E. Merck, 독일 소재); MACROPREP™ 메틸 또는 MACRO-PREP™ t-부틸 서포트(Bio-Rad, 캘리포니아 소재); WP HI-프로필(C3)™ 칼럼(J.T. Baker, 뉴저지 소재)을 포함한다. 예시적인 HIC 물질은 또한 제품명 토요펄 에테르 650, 페닐 650, 부틸 650(프락토겔), 에테르-5PW-HR, 또는 페닐-5PW-HR하에, 일본 도쿄에 소재하는 도소 가부시키가이샤(Tosoh Corporation)로부터; 제품명 알킬-아가로스(여기에서, 알킬기는 2-10개의 탄소 원자를 함유한다)하에 이스라엘에 소재하는 마일즈-예다(Miles-Yeda)로부터; 및 제품명 베이커본드 WP-HI-프로필하에 뉴저지주, 피츠버그에 소재하는 J. T. 베이커(J.T. Baker)로부터도 구입가능하다. 통상의 화학 물질을 사용하여 원하는 HIC 칼럼을 제조할 수도 있다(예를 들면, [Er-el. Z. gl all , Biochem. Biophys. Res. Comm. 49:383(1972)] 또는 [Ulbrich,V. rd gL Coll. Czech. Chem. Commum. 9:1466(1964)] 참조).
특정의 겔을 선택하는 것은 본 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 단백질과 HIC 리간드와의 상호작용의 강도는 알킬 리간드의 쇄 길이가 길어짐에 따라 증가하지만, 대개의 분리법에서는 약 4 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 리간드가 적합한다. 단백질상의 방향족기와의 pi-pi 오비탈 상호작용의 가능성에 기인하여 선택성이 상이할 수 있지만, 페닐기는 펜틸기와 거의 동일한 소수성을 갖는다. 선택성은 또한 수지를 지지하는 화학 물질에 의해 영향을 받을 수 있다.
리간드 밀도는 상호작용의 강도 뿐만 아니라 칼럼의 수용능에도 영향을 준다는 점에서 중요한 파라미터가 된다. 상업적으로 구입가능한 페닐 또는 옥틸 페닐 겔의 리간드 밀도는 대략(on the order of) 40pmoles/ml 겔 베드이다. 겔 수용능은 본 특정 단백질 뿐만 아니라, pH, 온도 및 염 종류 및 농도의 함수이지만, 일반적으로는 3-20mg/ml의 겔 범위에 포함된다고 기대할 수 있다.
일반적으로, 온도가 감소함에 따라 HIC 물질과의 상호작용은 감소한다. 그러나, 온도를 증가시킴으로써 얻어지는 임의의 잇점을, 온도 증가가 단백질의 안정성에 대하여 미칠 수 있는 부작용에 대하여 함께 비교검토해야 한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 등용매적으로(isocratically) 용출될 수 있다. 등용매 용출에서, 모든 화합물은 시작점에서 칼럼을 통과하여 이동하기 시작한다. 그러나, 각각은 상이한 속도로 이동하기 때문에 빠른 용출 속도 또는 느린 용출 속도가 형성된다. 예를 들면, 본 실시예에서 기술되는 바와 같이, A형은 유체 통과형 칼럼으로 용출될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드는 칼럼에 결합할 수 있고, 예를 들면, 단계식 용출 또는 구배식 용출을 사용하여 용출될 수 있다. 단계식 또는 구배 형태든지 간에 용출은 다양한 방식으로: (a) 염 농도를 변화시킴으로써,(b) 용매의 극성을 변화시킴으로써, 또는 (c) 세제를 가함으로써 수행될 수 있다. 염 농도의 감소에 의해 흡착된 단백질은 소수성이 증가하는 순서로 용출된다. 용매, 예로서, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜 또는 (이소)프로판올을 첨가하여 소수성 상호작용의 강도를 감소시킴으로써 극성의 변화에 영향을 줄 수 있다. 세제는 단백질의 대치제(displacer)로서 작용하고, 대체로는 막 단백질의 정제와 관련하여 사용되어 왔다.
분리를 실시할 때, 폴리펩티드 혼합물은 예를 들면, 회분식 정제 기술을 사용하거나 칼럼을 사용하여 HIC 물질과 접촉할 수 있다. HIC 정제 이전에 혼합물을 전치 칼럼(precolumn)을 통해 통과시킴으로써 임의의 카오트록픽제 또는 극소수성 물질을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들면, 회분식 정제의 경우, HIC 물질은 원하는 출발 완충액에서 제조되거나 그로 평형화된다. HIC 물질의 슬러리가 수득된다. 폴리펩티드 용액을 슬러리와 접촉시켜 분리시키고자 하는, 적어도 하나의 폴리펩티드를 HIC 물질에 흡착시킨다. 예를 들면, 슬러리를 정치시키고 상등액을 제거함으로써 HIC 물질에 결합하지 않은 폴리펩티드를 함유하는 용액을 슬러리로부터 분리한다. 슬러리를 1회 이상의 세척 단계에 사용할 수 있다. 원하는 경우, 슬러리를 전도도가 더 낮은 용액과 접촉시켜 HIC 물질에 결합하고 있는 폴리펩티드를 탈착시킬 수 있다. 결합된 폴리펩티드를 용출시키기 위해 염 농도를 감소시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, HIC 물질은 칼럼내 패킹될 수 있다. 분리시키고자 하는 폴리펩티드를 포함하는 혼합물을 칼럼에 적용시켜 적어도 하나의, 분리시키고자 하는 폴리펩티드가 칼럼에 흡착될 수 있도록 할 수 있다. 칼럼에 흡착되지 않는 폴리펩티드는 통과하고 수집될 수 있다. 결합된 폴리펩티드를 용출시키기 위해 예를 들면, 단계식으로, 또는 염 구배를 사용하여, 염 농도를 감소시킬 수 있다.
B형이 A형보다 소수성이기 때문에, 이는 유동상으로서 대략 0.7M(예를 들면, 0.73M) 황산암모늄/20mM 인산나트륨, pH 4.0 내지 pH 8.0을 사용하여 비가역적으로 고정상에 흡착된다. A형은 이러한 조건하에서 더 적은 범위로 고정상에 결합하고, 따라서, 등용매적으로 용출되며, 즉, 유체통과형 분획과 함께 칼럼을 떠나게 된다. A형의 등용매성 용출에 이어서, 유동상으로부터 황산암모늄을 소거하는 것이 B형을 탈착시킨다.
예시적인 정제 방법에서, HIC 물질은 약 160 내지 약 110 사이, 바람직하게, 약 140 내지 약 115 사이, 더욱더 바람직하게, 약 130 또는 약 120 내지 약 117mS/cm의 전도도를 초래하는 염 농도를 포함하는 완충액에서 평형화된다. 예를 들면, 예시적인 출발 용액은 염 농축가 대략 1M 내지 0.7M, 예를 들면, 1M 내지 0.7M인 황산암모늄을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 분리시키고자 하는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 용액은 또한 동일하거나, 거의 동일한 전도도를 초래한다(예를 들면, 진한 염 저장액 사용). 이러한 조건하에서, A형은 약 120mS/cm의 전도도에서 칼럼으로부터 용출된다. B형을 용출시키기 위해서, 황산암모늄 함량이 감소하는 단계식 또는 선형 구배를 칼럼에 적용시킬 수 있다. B형은 대략 115 내지 대략 1OOmS/cm의 전도도에서 용출된다.
하나의 실시태양에서, 본 정제 방법을 통해 적어도 2개의 결합 부위 및 2개의 중쇄 부위를 갖는 결합 분자를 포함하는 조성물을 수득하되, 여기에서, 중쇄 부위에는 CH2 도메인이 결여되어 있고, 50% 초과의 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또다른 실시태양에서, 60% 초과의 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또다른 실시태양에서, 70% 초과의 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또다른 실시태양에서, 80% 초과의 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또다른 실시태양에서, 90% 초과의 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다.
하나의 실시태양에서, 본 정제 방법을 통해 적어도 2개의 결합 부위 및 2개의 중쇄 부위를 갖는 재조합 결합 분자를 포함하는 조성물을 수득하되, 여기에서, 99% 초과의 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재한다.
하나의 실시태양에서, 본 정제 방법을 통해 적어도 2개의 결합 부위 및 2개의 중쇄 부위를 갖는 재조합 결합 분자를 포함하는 조성물을 수득하되, 여기에서, 99% 초과의 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 형태로 존재하고, 폴리펩티드의 중쇄 부위는 IgG4 이소타입의 항체로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서, 본 정제 방법을 통해 2개의 경쇄 부위 및 2개의 중쇄 부위를 갖는 결합 분자를 포함하는 조성물을 수득하되, 여기에서, 중쇄 부위에는 CH2 도메인이 결여되어 있고, 80% 초과의 분자는 2개의 중쇄 부위가 적어도 하나의 쇄간 이황화 결합을 통해 연결되어 있지 않은 형태로 존재한다.
또다른 일면에서, 본 발명은 또한 조성물중 A형 및 B형의 상대적 양을 측정하는 것을 포함하는, 정제 결과 및/또는 우선적 생합성을 모니터하는 방법을 제공한다. A형 및 B형은 예를 들면, 본 원에 기술된 바와 같이, 비-환원적 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 질량 분광분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
VI . 결합 분자의 표지화 또는 접합화
본 발명의 결합 분자를 비-접합된 형태로 사용할 수 있거나, 예를 들면, 표적 검출을 촉진시키기 위해, 또는 영상화 또는 환자의 요법을 위해 적어도 하나의 다양한 효과기, 즉, 관능성 부위에 접합시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 정제 이전 또는 정제 이후에, 정제를 실시할 때, 표지화되거나 접합화될 수 있고, 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 세포독소(예로서, 방사성 동위원소, 세포독성 약물, 또는 독소) 치료제, 세포 증식 억제제, 생물학적 독소, 프로드러그, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약제학적 제제, 면역학적 활성 리간드(예를 들면, 림포카인, 또는 생성된 분자가 신생물성 세포 및 효과기 세포, 예로서, T 세포에 결합하는 다른 항체), PEG, 또는 영상화에 유용한 검출가능 부위에 접합될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 종양의 혈관화를 감소시키는 분자에 접합될 수 있다. 다른 실시태양에서, 개시된 조성물은 약물 또는 프로드러그에 결합되는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 다른 실시태양은 특이 생체독소 또는 그의 세포독소 단편, 예로서, 리신, 겔로닌, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 내독소에 접합된 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 접합된 폴리펩티드를 사용할지 또는 비접합된 폴리펩티드를 사용할지에 대한 선택은 암의 종류 및 단계, 애주번트 치료법의 용도(예를 들면, 화학요법 또는 외부 방사선 조사) 및 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 본 분야의 당업자는 본 원의 교시를 고려하여 용이하게 선택할 수 있을 것으로 이해될 것이다.
이전 연구에서 동위원소로 표지된 항-종양 항체가 동물 모델의 경우에는 고형 종양 뿐만 아니라 림프종/백혈병에서, 인간의 경우에는 몇몇 사례에서 세포를 성공적으로 파괴시키는데 사용되어 왔다는 것이 이해될 것이다. 예시적인 방사성 동위원소는 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re를 포함한다. 방사성 핵종은, 핵 DNA에서 다중 스트랜드를 손상시켜 세포 사멸시키는 전리 방사선을 생산함으로써 작용한다. 치료적 접합체를 생산하기 위하여 사용되는 동위원소는 전형적으로, 경로 길이(path length)가 짧은 고에너지의 α- 또는 β-입자를 생산한다. 그러한 방사성 핵종은 핵종과 밀접해 있는 세포, 예를 들면, 접합체가 결합하고 있거나 접합체가 진입한 신생물성 세포를 사멸시킨다. 비-국한성 세포에는 영향이 없거나 거의 없다. 방사성 핵종은 본질적으로 비-면역원성이다.
본 발명과 함께 방사성 표지된 접합체의 용도와 관련하여, 본 발명의 폴리펩티드는 직접 표지될 수 있거나(예로서, 요오드화를 통해), 킬레이트제의 사용을 통해 간접적으로 표지될 수 있다. 본 원에서 사용되는 바, 어구 "간접 표지화" 및 "간접 표지 접근법" 양자 모두는 킬레이트제가 결합 분자와 공유 결합하고, 적어도 하나의 방사성 핵종이 킬레이트제와 결합하는 것을 의미한다. 그러한 킬레이트제는, 그들이 폴리펩티드 및 방사성 동위원소 양자 모두에 결합하기 때문에 전형적으로 2관능성 킬레이트제로서 언급된다. 특히 바람직한 킬레이트제는 1-이소티오시아네이토-3-메틸디오텔렌 트리아민펜타아세트산("MX-DTPA: 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiothelene triaminepentaacetic acid ") 및 사이클로헥실 디에틸렌트리아민 펜타아세트산("CHX-DTPA: cyclohexyl diethylenetriamine pentaacetic acid") 유도체를 포함한다. 다른 킬레이트제는 P-DOTA 및 EDTA 유도체를 포함한다. 간접 표지화를 위해 특히 바람직한 방사성 핵종은 111In 및 90Y를 포함한다.
본 원에서 사용되는 바, 어구 "직접 표지화" 및 "직접 표지 접근법" 양자 모두는 방사성 핵종이 폴리펩티드에 직접 공유 결합하는 것(전형적으로 아미노산 잔기를 통해)을 의미한다. 더욱 특히, 이러한 결합 기술은 무작위 표지화 및 부위-지향성(site-directed) 표지화를 포함한다. 후자의 경우, 표지화는 폴리펩티드상의 특정 부위, 예로서, 접합체의 Fc 부분에만 존재하는 N-연결된 당 잔기로 지향된다. 추가로, 다양한 직접 표지화 기술 및 프로토콜이 본 발명과 상화성이다. 예를 들면, 테크네튬-99m 표지된 폴리펩티드는 리간드 교환 공정에 의해 제조할 수 있거나, 주석 이온 용액(stannous ion solution)을 사용하여 퍼테크네이트(TcO4-)를 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼상에서 킬레이팅시키고, 폴리펩티드를 칼럼에 가함으로써 제조할 수 있거나, 회분식 표지화 기술에 의해, 예를 들면, 퍼테크네이트, 환원제, 예로서, SnCl2, 완충액, 예로서, 나트륨-칼륨 프탈레이트-용액, 항체를 인큐베이션시켜 제조할 수 있다. 임의의 경우, 항체를 직접적으로 표지화하기 위한 바람직한 방사성 핵종은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 특히 직접 표지화를 위해 바람직한 방사성 핵종은 티로신 잔기에 의해 공유 결합된 131I이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들면, 방사성 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨 및 화학적 산화제, 예로서, 하이포아염소산나트륨, 클로라민 T 등, 또는 효소 산화제, 예로서, 락토페록시다제, 글루코스 산화 효소 및 글루코스의 사용으로 유도될 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서는 간접 표지 접근법이 특히 바람직하다. 킬레이터 및 킬레이터 접합체와 관련된 특허는 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허번호 제4,831,175호(Gansow)는 다치환된 디에틸렌트리아민펜타아세트산 킬레이트 및 상기를 포함하는 단백질 접합체, 그의 제조 방법에 관한 것이다. 미국 특허번호 제5,099,069호, 제5,246,692호, 제5,286,850호, 제5,434,287호 및 제 5,124,471호(Gansow) 또한 다치환된 DTPA 킬레이트에 관한 것이다. 이들 특허들의 전문이 본 원에서 인용된다. 상화성 금속 킬레이터의 다른 일례는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DPTA: diethylenetriaminepentaacetic acid), 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸, 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산, 1-옥사-4,7,12,15-테트라아자헵타데칸-4,7,12,15-테트라아세트산 등이다. 사이클로헥실-DTPA 또는 CHX-DTPA가 특히 바람직하고, 하기에 광범위하게 예시된다. 발견되어질 추가의 것도 포함하여, 추가의 다른 상화성 킬레이터는 본 분야의 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있고, 이는 명확하게 본 발명의 범주내에 있다.
동시 계속 출원 시리얼 번호 제08/475,813호, 제08/475,815호 및 제08/478,967호에서 킬레이트화를 촉진시키기 위하여 사용되는 특이적인 2관능성 킬레이터를 비롯하여, 상화성 킬레이터는, 3가 금속에 고친화성을 제공하고, 종양-대-비종양 비의 증가 및 골 흡수 감소 뿐만 아니라, 표적 부위, 즉, B-세포 림프종 종양 부위에서 방사성 핵종의 더 많은 생체내 잔류를 나타내도록 바람직하게 선택된다. 그러나, 이러한 특징들 모두를 갖거나 갖지 않는 다른 2관능성 킬레이터는 본 분야에 공지되어 있고, 이는 또한 종양 요법에 이로울 수 있다. 본 원의 교시에 따라 폴리펩티드는 진단 및 치료 용도로 상이한 방사선 표지에 접합화될 수 있다는 것도 이해될 것이다. 이러한 이유에서, 본 원에서 참고문헌으로 인용되고 있는, 상기 언급된 동시 계속 출원은 치료적 항체를 투여하기 전에 종양을 진단 "영상화"하기 위하여 방사성 표지된 치료적 접합체를 개시한다. "In2B8" 접합체는 2관능성 킬레이터, 즉, 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸-DTPA 및 1-메틸-3-이소티오시아네이토벤질-DTPA의 1:1 혼합물을 포함하는 MX-DTPA(디에틸렌트리아민펜타아세트산)를 통해 111In에 결합된, 인간 CD20 항원에 특이적인 뮤린 단일클론 항체, 2B8을 포함한다. 111In은 진단용 방사성 핵종으로서 특히 바람직한데, 이는 검출되는 독성없이 약 1 내지 약 10mCi 사이가 안전하게 투여될 수 있기 때문이고; 영상화 데이타는 일반적으로 차후의 90Y-표지된 항체 분포의 전조가 된다. 대개의 영상화 연구는 5mCi의 111In-표지된 항체를 사용하는데, 이는 더 낮은 방사선량과 비교해 볼 때 상기 방사선량이 안전하고, 영상화 효율을 증가시키기 때문이며, 최적의 영상화는 항체 투여 후 3 내지 6일째 형성된다. 예를 들면, [Murray, J. Nuc . Med . 26: 3328(1985)] 및 [Carraguillo et al, J. Nuc . Med. 26: 67(1985)]을 참조한다.
상기 나타낸 바와 같이, 다양한 방사성 핵종들이 본 발명에 적용될 수 있고, 본 분야의 당업자는 어떤 방사성 핵종이 다양한 환경하에서 가장 적절한지를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 131I이 표적된 면역요법에 사용되는 것으로서 잘 공지되어 있는 방사성 핵종이다. 그러나, 131I의 임상적 용도는, 8일간의 물리적 반감기; 혈액 및 종양 부위 양자 모두에서 요오드화된 항체의 탈할로겐화; 및 종양내 국소화된 방사선량의 침전에 대하여 차선(suboptimal)일 수 있는 방출 특징(예를 들면, 큰 감마 성분)을 비롯한 수개의 요인에 의해 제한될 수 있다. 우수한 킬레이트제의 출현과 함께, 금속 킬레이팅 기가 단백질에 결합할 수 있는 기회는 다른 방사성 핵종, 예로서, 111Li 및 90Y를 사용할 수 있는 기회를 증가시켰다. 90Y는 방사성면역요법 적용에서의 사용에 대한 수개의 잇점을 제공한다: 90Y의 64시간의 반감기는 종양에 의해 항체가 축적될 수 있도록 하는데 충분히 길고, 예를 들면, 131I와는 달리, 90Y는 그의 붕괴시 감마 방사선 조사는 수반하지 않는, 고에너지의 순수한 베타 방출기로서, 그 범위는 100 내지 1000개의 세포 지름의 조직에서이다. 추가로, 최소량의 관통 방사선을 통해 90Y-표지된 항체를 외래 환자에 투여할 수 있다. 추가로, 세포 사멸을 위해서 표지된 항체를 내재화할 필요는 없고, 표적 분자가 결여된 인접 종양 세포에 대해서는 전리 방사선의 국소 방출이 치명적이어야 한다.
본 분야의 당업자는, 접합시키고자 선택된 제제에 따라 다양한 기술을 사용함으로써 이러한 비-방사성 접합체 또한 어셈블리시킬 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 바이오틴을 포함하는 접합체는 예를 들면, 활성화된 바이오틴 에스테르, 예로서, 바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스테르와 폴리펩티드를 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커를 포함하는 접합체는 예를 들면, 상기 열거된 것과 같은 커플링제의 존재하에서 제조될 수 있거나, 이소티오시아네이트, 바람직하게, 플루오레세인-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조할 수 있다. 세포 증식 억제 물질/세포독소 물질 및 금속 킬레이트를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 접합체는 유사한 방식으로 제조된다.
다수의 효과기 부위에는, 항체가 연결될 수 있는 적합한 관능기가 결여되어 있다. 하나의 실시태양에서, 효과기 부위, 예를 들면, 약물 또는 프로드러그는 연결 부위를 통해 항체에 결합된다. 하나의 실시태양에서, 연결 부위는 특정 위치에서 세포독성을 활성화시킬 수 있는 화학 결합을 포함한다. 적합한 화학 결합이 본 분야에 잘 공지되어 있고, 이황화 결합, 산에 불안정한(acid labile) 결합, 광불안정성(photolabile) 결합, 펩티드 분해효소에 불안정한(peptidase labile) 결합, 설프하이드릴기 및 말레이미드기 사이에 형성된 티오에테르 결합, 및 에스테르 분해효소에 불안정한(esterase labile) 결합을 포함한다. 가장 바람직하게, 연결 부위는 이황화 결합 또는 티오에테르 결합을 포함한다. 본 발명에 따라, 연결 부위는 바람직하게, 반응성 화학기를 포함한다. 특히 바람직한 반응성 화학기는 N-숙신이미딜 에스테르 및 N-설포숙신이미딜 에스테르이다. 바람직한 실시태양에서, 반응성 화학기는 티올기 사이의 이황화 결합을 통해 효과기에 공유 결합할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 효과기 분자는 티올기를 포함하도록 개질된다. 본 분야의 당업자는, 티올기가 수소 원자에 결합된 황 원자를 포함하고, 이는 또한 본 분야에서 설프하이드릴기로 언급되고, 이는 "-SH" 또는 "RSH"로서 표시될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 연결 부위를 사용하여 효과기 부위를 결합 분자와 연결시킬 수 있다. 본 발명의 연결 부위는 절단가능하거나 절단가능하지 않을 수 있다. 하나의 실시태양에서, 절단가능한 연결 부위는 산화환원-절단가능한 연결 부위로서, 연결 부위는 산화환원 전위가 낮은 환경, 예로서, 세포질 및 유리 설프하이드릴기를 갖는 분자의 농도가 높은 다른 영역에서 절단가능하다. 산화환원 전위의 변화에 기인하여 절단될 수 있는 연결 부위의 일례로는 이황화물을 포함하는 것을 포함한다. 본 발명의 결합 단백질이 세포내 흡수시 세포질의 낮은 산화환원 전위가 연결 부위의 절단을 촉진시킬 경우, 절단은 자극받을 수 있다. 또다른 실시태양에서, pH 감소는 마이탄시노이드 카고(cargo)를 표적 세포내로 방출시킨다. pH 감소는 예로서, 엔도좀 트래피킹(endosome trafficking), 종양 성장, 염증, 및 심근 허혈과 같은 다수의 생리학적 및 병리학적 과정에 관여한다. pH는 생리학적 7.4에서부터 엔도좀에서는 5-6으로, 또는 리소좀에서는 4-5로 감소한다. 암 세포의 리소좀 또는 엔도좀을 표적하기 위하여 사용될 수 있는 산감응성 연결 부위의 일례로는 산-절단가능한 결합, 예로서, 아세탈, 케탈, 오르토에스테르, 하이드라존, 트리틸, 시스-아코니틸, 또는 티오카바모일에서 발견되는 것을 포함한다(예를 들면, [Willner et al,(1993), Bioconj . Chem ., 4: 521-7]; 미국 특허번호 제4,569,789호, 제4,631,190호, 제5,306,809호, 및 제5,665,358호 참조). 다른 예시적인 산감응성 연결 부위는 디펩티드 서열 Phe-Lys 및 Val-Lys를 포함한다[King et al,(2002), J. Med . Chem., 45: 4336-43]. pH가 낮은 엔도좀 구획(예를 들면, 리소좀)으로의 세포내 흡수 트래피킹시 절단은 자극받을 수 있다. 다른 예시적인 산-절단가능한 연결 부위는 2개 이상의 마이탄시노이드의 결합에 대한 2개 이상의 산-절단가능한 결합을 포함하는 부위이다[King et al,(1999), Bioconj . Chem ., 10: 279-88; WO 98/19705).
절단가능한 연결 부위는 예를 들면, 리소좀 또는 종양-관련 효소와 같이, 특정 표적 세포와 관련된, 생물학적으로 공급되는 절단제에 감수성일 수 있다. 효소적으로 절단될 수 있는 연결 부위의 일례로는 제한하는 것은 아니지만, 펩티드 및 에스테르를 포함한다. 예시적인 효소적으로 절단가능한 연결 부위는 종양-관련 단백질 분해효소, 예로서, 카텝신 B 또는 플라스민에 감수성인 것을 포함한다([Dubowchik et al,(1999), Pharm . Ther., 83: 67-123]; [Dubowchik et al,(1998), Bioorg . Med . Chem . Lett , 8: 3341-52]; [de Groot et al,(2000), J. Med. Chem., 43: 3093-102]; [de Groot et al,(1999)m 42: 5277-83]). 카텝신 B- 절단가능한 위치는 디펩티드 서열 발린-시트룰린 및 페닐알라닌-리신을 포함한다([Doronina et al,(2003), Nat . Biotech., 21(7): 778-84]; [Dubowchik et al,(2002), Bioconjug . Chem., 13: 855-69]). 다른 예시적인 효소-절단가능한 위치는 트라우스 단백질 분해효소, 예로서, 호중구, 포식세포, 및 다른 과립구에 의해 우선적으로 방출되는 효소인 예로서, 티멧 올리고펩티다제(TOP: Oliogopeptidase)에 의해 인식되는 4 내지 16개의 아미노산의 올리고펩티드 서열 (예를 들면, Suc-β-Ala-Leu-Ala-Leu)에 의해 형성되는 것을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 연결 부위는 본 발명의 결합 분자를 하기 식의 연결 분자와 반응시킴으로써 형성된다:
X-Y-Z
(여기에서, X 는 결합 부위이고;
Y는 스페이서 부위이고;
Z는 효과기 결합 부위이다).
용어 "결합 분자 결합 부위"는 링커가 본 발명의 결합 분자에 공유 결합할 수 있도록 하는 부위를 포함한다.
결합 부위는, 예를 들면, 임의로 수소 원자 또는 결합 분자가 그의 의도된 작용을 수행할 수 있도록 하는 다른 치환체로 치환된, 1-60개의 탄소, 산소, 질소, 황 원자의 공유 쇄를 포함할 수 있다. 결합 부위는 펩티드 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 에테르, 티오에테르 등의 관능기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 결합 부위는, 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드상의 반응성 관능기와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성할 수 있도록 선택된다. 결합 부위의 일례로 예를 들면, 아미노, 카복실레이트, 및 티올 결합 부위를 포함한다.
아미노 결합 부위는 폴리펩티드상의 아미노기와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성하는 부위를 포함한다. 아미노 결합 부위는 본 분야에 공지되어 있다. 아미노 결합 부위의 일례로 활성화된 카바마이드(예를 들면, 결합 분자상의 아미노기와 반응하여 우레아기를 포함하는 연결 부위를 형성할 수 있다), 알데히드(예를 들면, 결합 분자상의 아미노기와 반응할 수 있다), 및 활성화된 이소시아네이트(결합 분자상의 아미노기와 반응하여 우레아기를 포함하는 연결 부위를 형성할 수 있다)를 포함한다. 아미노 결합 부위의 일례로는 제한하는 것은 아니지만, N-숙신이미딜, N-설포숙신이미딜, N-프탈이미딜, N-설포프탈이미딜, 2-니트로페닐, 4-니트로페닐, 2,4-디니트로페닐, 3-설포닐-4-니트로페닐, 또는 3-카복시-4-니트로페닐 부위를 포함한다.
카복실레이트 결합 부위는 폴리펩티드상의 카복실레이트기와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성하는 부위를 포함한다. 카복실레이트 결합 부위는 본 분야에 공지되어 있다. 카복실레이트 결합 부위의 일례로는 제한하는 것은 아니지만, 활성화된 에스테르 중간체 및 활성화된 카보닐 중간체를 포함하고, 이는 결합 분자상의 COOH기와 반응하여 에스테르기, 티오에스테르기, 또는 아미드기를 포함하는 연결 부위를 형성할 수 있다.
티올 결합 부위는 폴리펩티드상에 존재하는 티올기와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성하는 부위를 포함한다. 티올 결합 부위는 본 분야에 공지되어 있다. 티올 결합 부위의 일례로는 활성화된 아실기(결합 분자상의 설프하이드릴과 반응하여 티오에스테르를 포함하는 연결 부위를 형성할 수 있다), 활성화된 알킬기(결합 분자상의 설프하이드릴과 반응하여 티오에스테르 부위를 포함하는 연결 부위를 형성할 수 있다), 마이클(Michael) 수용체, 예로서, 말레이미드기 또는 아크릴기(결합 분자상의 설프하이드릴과 반응하여 마이클-형의 추가 산물을 형성할 수 있다), 산화환원 반응을 통해 설프하이드릴기와 반응하는 기, 활성화된 이황화기(결합 분자상의 설프하이드릴기와 반응하여 예를 들면, 이황화 부위를 포함하는 연결 부위를 형성할 수 있다)를 포함한다. 다른 티올 결합 부위는 아크릴아미드, 알파-요오도아세트아미드, 및 사이클로프로판-1,1-디카보닐 화합물을 포함한다. 또한, 티올 결합 부위는 결합 분자상의 티올을 개질시켜 또다른 반응종을 형성하되, 상기 반응종에 연결 분자가 결합함으로써 본 발명의 결합 분자를 형성할 수 있는 부위를 포함할 수 있다.
스페이서 부위, Y는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있는 공유 결합 또는 원자의 공유 쇄이다. 임의로 수소 원자 또는 생성된 결합 분자가 그의 의도된 작용을 수행할 수 있도록 하는 다른 치환체로 치환된, 0-60개의 탄소, 산소, 황 또는 질소 원자를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, Y는 알킬, 알케닐, 알키닐, 에스테르, 에테르, 카보닐, 또는 아미드 부위를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 결합 분자상의 티올기는 반응기, 예로서, 반응성 카보닐기, 예로서, 케톤 또는 알데히드로 전환된다. 이어서, 결합 부위는 케톤 또는 알데히드와 반응하여 본 발명의 원하는 화합물을 형성한다. 카보닐 반응성 결합 부위의 일례로 제한하는 것은 아니지만, 히드라진, 히드라지드, O-치환된 하이드록실아민, 알파-베타-불포화 케톤, 및 H2C=CH-CO-NH-NH2를 포함한다. 결합 부위의 다른 일례 및 본 발명의 결합 분자를 형성하기 위하여 사용될 수 있는 티올 부위를 개질시키는 방법은 ([Pratt, M. L. et al. J Am Chem Soc. 2003 May 21;125(20):6149-59]; 및 [Saxon, E. Science. 2000 Mar 17;287(5460):2007-10])에 기재되어 있다.
연결 분자는 효과기 부위 또는 그의 유도체와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성할 수 있는 임의의 분자이다. 예를 들면, 효과기 부위는 이황화 결합을 통해 분자의 잔여 부분에 연결될 수 있다. 그러한 경우, 적절한 효과기 부위 유도체와 반응함으로써 효과기 부위가 본 발명의 결합 분자에 결합하도록 연결 부위는 선택된다. 상기 기술한 바와 같이, 전체로서 연결 부위 및/또는 링커는, 링커가 적절한 환경하에서 절단되도록 선택될 수 있다.
특히 바람직한 링커 분자는, 예를 들면, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP: N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)(예를 들면, [Carlsson et al., Biochem. J., 173, 723-737(1978)] 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB: N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)butanoate)(예를 들면, 미국 특허번호 제4,563,304호 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP: N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate)(예를 들면, CAS 등록 번호 341498-08-6 참조), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC: N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)(예를 들면, [Yoshitake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399(1979)] 참조), 및 N-숙신이미딜 4-메틸-4-[2-(5-니트로-피리딜)-디티오]펜타노에이트(SMNP: N-succinimidyl 4-methyl-4-[2-(5-nitro-pyridyl)-dithio]pentanoate)(예를 들면, 미국 특허번호 제4,563,304호 참조)를 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용하기에 가장 바람직한 링커 분자는SPP, SMCC, 및 SPDB이다. 바람직한 실시태양에서, SPDB는 본 발명의 결합 분자에 효과기 부위를 연결시키기 위하여 사용된다.
본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 세포독소 효과기 부위는 세포독성 약물, 특히, 암 요법에 사용되는 것이다. 본 원에서 사용되는 바, "세포독소 또는 세포독성제"는 세포의 성장 및 증식에 유해하고, 세포 또는 악성 종양을 감소시키거나, 저해하거나, 파괴시킬 수 있는 임의의 제제를 의미한다. 예시적인 세포독소는 제한하는 것은 아니지만, 방사성 핵종, 생체독소, 효소적으로 활성인 독소, 세포 증식 억제제 또는 세포독소 치료제, 프로드러그, 면역학적으로 활성인 리간드 및 생물학적 반응 개질제 예로서, 사이토카인을 포함한다. 면역반응성 세포 또는 악성 종양의 성장을 지연시키거나 저속화시키는 작용을 하는 임의의 세포독소는 본 발명의 범주내에 있다.
예시적인 세포독소는 일반적으로, 세포 증식 억제제, 알킬화제, 항대사물질, 항-증식제, 튜블린 결합제, 호르몬 및 호르몬 길항제 등을 포함한다. 본 발명과 상화성인 예시적인 세포 증식 억제제는 알킬화 물질, 예로서, 메클로레타민, 트리에틸렌포스포르아미드, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부설판, 멜팔랜 또는 트리아지퀴온, 및 니트로스우레아 화합물, 예로서, 카무스틴, 로무스틴, 또는 세무스틴을 포함한다.
접합에 특히 바람직한 부위는 마이탄시노이드이다. 마이탄시노이드는 원래 메이테누스(Maytenus) 속에 속하는 동아프리카 관목으로부터 분리되었지만, 이후 악티노신네마 프레티오숨(Actinosynnema pretiosum)의 대사물질인 것이 밝혀졌다(예를 들면, 미국 특허번호 제3,896,111호 참조). 마이탄시노이드는 마이탄신, 마이탄시놀, 마이탄시놀의 C-3 에스테르, 및 다른 마이탄시놀 유사체 및 유도체를 포함하는 것으로 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허번호 제5,208,020호 및 제 6,441,163호 참조). 마이탄시놀의 C-3 에스테르는 자연적으로 발생되거나, 합성적으로 유도될 수 있다. 또한, 자연적으로 발생된 C-3 마이탄시놀 에스테르 및 합성 C-3 마이탄시놀 에스테르는 단순 카복실산과의 C-3 에스테르, 또는 N-메틸-1-알라닌의 유도체와의 C-3 에스테르로 분류될 수 있고, 후자가 전자보다 더욱 세포독성을 지니고 있다. 합성 마이탄시노이드 유사체는 또한 본 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, [Kupchan et al., J. Med. Chem., 21, 31-37(1978)]에 기재되어 있다. 따라서, 마이탄시놀 및 그의 유사체 및 유도체를 생성하는 방법은 예를 들면, 미국 특허번호 제4,151,042호에 기재되어 있다.
항체 접합체로서 사용하기에 적합한 마이탄시노이드는 천연 공급원으로부터 분리될 수 있거나, 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 합성적으로 생산될 수 있거나, 반-합성적으로 생산될 수 있다. 최종 접합체 분자에서도 충분한 세포독성이 보존되는 한, 마이탄시노이드는 임의의 적합한 방식으로 개질될 수 있다.
반응성 화학기를 포함하는 연결 부위를 포함하는, 특히 바람직한 마이탄시노이드는 C-3 마이탄시놀 에스테르 및 그의 유사체이되, 연결 부위는 이황화 결합을 포함하고, 결합 부위는 N-숙신이미딜 또는 N-설포숙신이미딜 에스테르를 포함한다. 마이탄시노이드상의 다수의 위치는 예를 들면, 효과기 결합 부위를 통해 연결 부위를 화학적으로 연결시키는 위치로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들면, 하이드록실기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-15 위치 및 하이드록실기를 갖는 C-20 위치 모두가 유용하다. 연결 부위는 가장 바람직하게 마이탄시놀의 C-3 위치에 연결된다. 가장 바람직하게, 본 발명의 조성물과 관련하여 사용되는 마이탄시노이드는 N2'-데아세틸-N2'-(-3-머캅토- 1-옥소프로필)-마이탄신(DM1) 또는 N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-마이탄신(DM4)이다.
다른 화학 결합을 포함하는 연결 부위 또한 다른 마이탄시노이드와 같이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 연결 부위에 혼입될 수 있는 다른 화학 결합의 특정 일례로 상기 기술된 것, 예를 들면, 산에 불안정한 결합, 티오에테르 결합, 광불안정성 결합, 펩티드 분해효소에 불안정한 결합 및 에스테르 분해효소에 불안정한 결합을 포함한다. 연결 부위 및/또는 효과기 결합 부위를 갖는 마이탄시노이드 생산 방법은 예를 들면, 미국 특허번호 제5,208,020호, 제5,416,064호, 및 제6,333,410호에 기재되어 있다.
마이탄시노이드의 연결 부위(및/또는 효과기 결합 부위)는 전형적으로, 그리고 바람직하게, 항체를 마이탄시노이드에 연결시키기 위하여 사용되는 거대 링커 분자의 일부분이다. 연결 분자가 마이탄시노이드 및 항체 각각의 특징이 되는 세포독성 및 표적을 유지시키는 한, 임의의 적합한 링커 분자는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 연결 분자는 화학 결합(상기 기술된 바와 같음)을 통해 마이탄시노이드를 항체에 연결시킴으로써 마이탄시노이드 및 항체는 서로서로와 화학적으로 결합한다(예를 들면, 공유 결합). 바람직하게, 연결 분자는 이황화 결합 또는 티오에테르 결합을 통해 마이탄시노이드를 항체에 화학적으로 결합시킨다. 가장 바람직하게, 항체는 이황화 결합을 통해 마이탄시노이드에 화학적으로 결합한다.
다른 부류의 바람직한 세포독성제는 예를 들면, 안트라사이클린계 약물, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독소 뉴클레오시드, 프테리딘계 약물, 디이넨 및 포도필로톡신을 포함한다. 특히, 그러한 부류의 유용한 일원으로서 예를 들면, 아드리아마이신, 카미노마이신, 다우노루비신(다우노마이신), 독소루비신, 아미노프테린, 메토트렉사트, 메토프테린, 미스라마이신, 스트렙토니그린, 디클로로메토트렉사트, 미토마이신 C, 악티노마이신-D, 포르피로마이신, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 프토라푸르, 6-머캅토퓨린, 사이타라빈, 시토신 아라비노시드, 포도필로톡신, 또는 포도필로톡신 유도체, 예로서, 에토포시드 또는 에토포시드 인산염, 멜팔랜, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 류노시딘, 빈데신, 류로신 등을 포함한다. 본 원의 교시와 상화성인 추가의 다른 세포독소는 탁솔, 탁산, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬산 에티디움, 에메틴, 테노포시드, 콜히친, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신, 및 그의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 호르몬 및 호르몬 길항제, 예로서, 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니손, 프로게스틴, 예를 들면, 하이드록시프로게스테론 또는 메드로프로게스테론, 에스트로겐, 예를 들면, 디에틸스틸베스트롤, 항에스트로겐, 예를 들면, 타목시펜, 안드로겐, 예를 들면, 테스토스테론, 아로마타제 저해제, 예를 들면, 아미노글루테티미드 또한 본 원의 교시와 상화성이다. 앞서 언급한 바와 같이, 본 분야의 당업자는 본 발명의 접합체를 제조하기 위한 목적으로 화합물의 반응을 보다 용이하게 하기 위하여 원하는 화합물을 화학적으로 개질시킬 수 있다.
특히 바람직한 세포독소의 일례로서 칼리케아미신, 에스페라미신 또는 디네마이신을 비롯한, 항-종양 항생제의 엔다이인계 일원 또는 유도체를 포함한다. 이들 독소는 극도로 효능이 있고, 이는 핵 DNA를 절단함으로써 세포를 사멸시키는 작용을 한다. 생체내에서 절단됨으로써 불활성이지만 면역원성인 다수의 폴리펩티드 단편을 제공할 수 있는 단백질 독소와 달리, 독소 예로서, 칼리케아미신, 에스페라미신 및 다른 엔다이인은 본질적으로 비-면역원성인 소분자이다. 이들 비-펩티드성 독소는, 앞서 단일클론 항체 및 다른 분자를 표지하기 위하여 사용되었던 기술에 의해 이량체 또는 4량체에 화학적으로 연결된다. 이러한 연결 기술은 작제물의 Fc 부분상에만 존재하는 N-연결된 당 잔기를 통한 부위-지향성 결합을 포함한다. 그러한 부위-지향성 결합 방법은 작제물의 결합 성질에 대한 가능한 결합 효과를 감소시킨다는 잇점을 갖는다.
폴리펩티드는 또한 다른 세포독소중 생체독소 예로서, 리신 서브유니트 A, 아브린, 디프테리아 독소, 보툴리눔, 시안기노신, 색시톡신, 시가톡신, 파상풍 독소, 테트로도톡신, 트리코테센, 베르루콜로겐 또는 독성 효소와 결합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 바람직하게, 그러한 작제물은 항체-독소 작제물을 직접 발현시킬 수 있는 유전 조작 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 다른 생물학적 반응 개질제는 사이토카인 예로서, 림포카인 및 인터페론을 포함한다. 본 개시와 관련하여, 본 분야의 당업자는 통상의 기술을 사용하여 그러한 작제물을 용이하게 형성할 수 있다는 것이 제시된다.
개시된 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 또다른 부류의 상화성 세포독소는 종양 또는 면역반응성 세포에 효과적으로 지향될 수 있는 방사선 감작성 약물이다. 그러한 약물은 전리 방사선에 대한 감수성을 증진시켜 방사선요법의 효능을 증가시킨다. 종양 세포에 의해 내재화된 항체 접합체는 방사선 감작성이 최대인 핵에 보다 더 근접하게 방사선 감작제를 전달할 것이다. 표적 종양내 남아있는 방사선 감작제는 국소화시키고 정상 조직내에서 최소로 흡수시키면서, 결합하지 않은, 방사선 감작제에 연결된 본 발명의 폴리펩티드는 혈액으로부터 신속하게 제거될 것이다. 혈액으로부터 신속하게 제거된 후, 보조 방사선요법이 3가지 방식: 1.) 종양에 특이적으로 지향되는 외부 빔 방사선 조사, 2.) 종양내 직접적으로 삽입된 방사성 또는 3.) 동일한 표적 항체를 사용하는 전신 방사선면역요법중 하나로 투여될 수 있다. 본 접근법중 잠재적으로 관심의 대상이 되는 변형은, 치료학적 방사성 동위원소와 방사성 감작된 면역접합체의 결합을 통해 환자자 단일 약물을 용이하게 투여받을 수 있도록 편의를 제공하는 것이다.
하나의 실시태양에서, 폴리펩티드의 안정성 또는 효능을 증진시키는 부위가 접합될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, PEG는 본 발명의 폴리펩티드에 접합되어 그의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다([Leong, S.R., et al. 2001. Cytokine 16:106; 2002; Adv. in Drug Deliv . Rev. 54:531]; 또는 [Weir et al. 2002. Biochem. Soc. Transactions 30:512]).
앞서 언급한 바와 같이, 상화성 세포독소는 프로드러그를 포함할 수 있다. 본 원에서 사용되는 바, 용어 "프로드러그"는 모 약물과 비교하여 종양 세포에 대하여 세포독성이 적고, 효소적으로 활성화되거나 더욱 활성인 모 형태로 전환될 수 있는 약제학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 언급한다. 본 발명과 상화성인 프로드러그는 제한하는 것은 아니지만, 인산염-함유 프로드러그, 티오인산염-함유 프로드러그, 황산염 함유 프로드러그, 펩티드 함유 프로드러그, β-락탐-함유 프로드러그, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드러그 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드러그, 5-플루오로시토신, 및 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로우리딘 프로드러그를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 세포독성제, 예로서, 마이탄시노이드는 이황화 결합의 가수분해를 통해 유리되는 프로드러그로서 투여된다. 추가로, 본 발명에서 사용하기 위한 프로드러그 형태로 유도화될 수 있는 세포독성제의 일례로 상기 기술된 화학요법제를 포함한다.
V. 폴리펩티드의 투여
본 발명의 폴리펩티드를 제조하고 투여 대상(환자)에게 투여하는 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 당업자에 의해 용이하게 결정되는 것이다. 본 발명의 폴리펩티드의 투여 경로는 경구 투여, 비경구 투여, 흡입 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 본원에 사용한 용어 '비경구'는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질내 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내, 동맥내, 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다. 이들 모든 투여 형태가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것임은 명백하지만, 투여를 위한 형태는 주사용 용액, 구체적으로 정맥 내 또는 동맥 내 주사를 위한 용액 또는 점적액이다. 일반적으로, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 완충액(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 필요에 따라 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시와 양립할 수 있는 다른 방법에서, 상기 폴리펩티드는 유해한 세포 군집 부위에 직접 전달되어 치료제에 대한 병든 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여용 제제의 예로는 멸균 수성 용액 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀션을 들 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기름, 예를 들어 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레이트를 들 수 있다. 수성 담체의 예로는 물, 알콜/수성 용액, 에멀션 또는 서스펜션을 들 수 있는데, 염수 및 완충 처리된 매질을 포함한다. 본 발명에서, 약학적으로 허용 가능한 담체의 예로는 0.01-0.1 M 및 바람직하게는 0.05 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 염수를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 다른 통상적인 비경구 비히클의 예로는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 락테이트 링거 또는 고정유를 들 수 있다. 정맥 내 비히클의 예로는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예를 들어 링거 덱스트로즈를 주성분으로 하는 것 등을 들 수 있다. 또한, 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 비활성 기체 등도 존재할 수 있다. 더 구체적으로, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제제용 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우에 있어서, 상기 조성물은 멸균되어야 하며, 용이하게 주사할 수 있을 정도의 유동성이 있어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 미생물, 예를 들어 박테리아 및 균류의 오염 작용에 대해 보존되는 것이 바람직할 것이다. 상기 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항바이러스제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메르살 등에 의해 달성할 수 있다. 다수의 경우, 등장제, 예를 들어 슈가, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 상기 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
어떤 경우에, 멸균 주사 가능한 용액은 본원에 개시한 성분 중 하나 또는 이의 조합물과 함께 필요한 양의 활성 화합물(예를 들어, 폴리펩티드 자체 또는 다른 활성 제제와 병용)을 적합한 용매 내에 혼입하고, 필요에 따라 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본적인 분산 매질 및 본원에 기재한 것 들로부터 선택되는 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에 있어서, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이들 방법은 이의 이미 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 소정의 성분의 분말을 생성한다. 주사용 제제는 처리하고, 용기, 예를 들어 앰플, 백, 병, 주사기 또는 비알 내로 충전하고, 당업계에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에서 밀봉한다. 또한, 상기 제제들은 본원에 참고 인용하는 동시 계류중인 U.S.S.N. 09/259,337 및U.S.S.N. 09/259,338에 개시된 것과 같은 키트의 형태로 포장되고 판매될 수 있다. 이러한 제품은, 관련 조성물이 자가면역질환 또는 신생물 질환으로 고통받는 환자 또는 그러한 소인이 있는 환자를 치료하는데 유용하다는 라벨이나 포장 삽입물이 포함하는 것이 바람직할 것이다.
상기한 병적 상태의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 투여량은 다수의 상이한 요인에 따라 달라진다. 그 요인으로는 투여 수단, 표적 위치, 치료 대상의 생리적인 상태, 치료 대상이 인간인가 동물인가 여부, 투여되고 있는 다른 약물 및 예방 목적의 처치인가 치료 목적의 처치인가 여부를 들 수 있다. 일반적으로, 치료 대상은 인간이지만, 트랜스게닉 포유동물을 포함하는 비인간 포유동물도 치료할 수 있다. 치료 투여량은 안정성과 효용성을 최적화하기 위해 당업자에게 공지된 일반적인 방법을 이용하여 적정할 수 있다.
항체를 이용하는 수동 면역에 있어서, 투여량은 예를 들어 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더 일반적으로는 0.01 내지 5 mg/kg (예를 들어, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg 등) 범위 일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg 범위 내, 바람직하게는 1 mg/kg 이상일 수 있다. 상기 범위의 중간 투여량도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
치료 대상에게 매일, 격일, 주 단위 또는 실험적인 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케쥴에 따라 투여할 수 있다. 예시적인 치료 방법에서는 장기간, 예를 들어 6개월 이상 동안의 다중 투여를 필요로 한다. 추가의 예시적인 치료 방법에서는 2주마다 1회 또는 월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 투여를 필요로 한다. 예시적인 투여 스케쥴의 예로는 매일 1-10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일로 30 mg/kg 또는 매주 60 mg/kg를 들 수 있다. 다른 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가진 2개 이상의 단일클론 항체를 동시에 투여하는데, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 예시한 투여량 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 다중 투여할 수 있다. 단일 투여 사이의 간격은 예를 들어, 일 단위, 주 단위, 월 단위 또는 년 단위일 수 있다. 또한, 투여 대상에서 폴리펩티드의 혈중 농도 또는 표적 분자의 혈중 농도를 측정함으로써 나타나는 바와 같이 불규칙적일 수도 있다. 몇몇 방법에서, 투여량은 어떤 혈장 결합 분자 또는 독소 농도, 예를 들어 1-1000 ㎍/ml 또는 25-300 ㎍/ml를 획득하기 위해 조정된다. 대안으로, 결합 분자는 서방형 제제로 투여될 수 있는데, 이 경우 투여 빈도는 줄어든다. 투여량과 투여 빈도는 투여 대상 내에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화된 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 키메라 항체 및 비인간 항체 순으로 반감기가 짧아진다. 한 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 접합된 형태로 다수 회 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 접합되지 않은 형태 그 후 접합된 형태로 투여할 수 있고, 그 반대의 순서로 투여할 수도 있다.
투여량 및 투여 빈도는 처치가 예방적 처치인지 치료적 처치인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 처치의 경우, 본 발명의 항체 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 아직 질병 상태에 있지 않은 투여 대상에게 투여하여 투여 대상의 내성을 증강시킬 수 있다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의한다. 이러한 용도의 경우, 정확한 양은 투여 대상의 건강 상태 및 일반적인 면역성에 따라 달라지나, 일반적으로 1회 투여 당 0.1 내지 25 mg, 구체적으로 1회 투여 당 0.5 내지 2.5 mg 범위이다. 상대적으로 낮은 투여량은 장기간 동안 상대적으로 빈번하지 않은 간격으로 투여된다. 몇몇 투여 대상은 그들의 남은 삶 동안 계속 치료받기도 한다.
치료적 처치의 경우, 질병의 진행이 둔화되거나 정지될 때까지 및 바람직하게는 투여 대상이 질병 징후의 부분적인 완화 또는 완전한 완화를 나타낼 때까지 종종 상대적으로 높은 투여량(예를 들어, 방사능면역접합체를 위해 더 일반적으로 사용되는 5 내지 25 mg의 투여량 및 사이토톡신-약물 접합 분자를 위한 더 높은 투여량과 함께 1회 투여 당 약 1 내지 400 mg/kg 결합분자, 예를 들어 항체)을 상대적으로 짧은 간격으로 투여하는 것이 필요하다. 그 후, 투여 대상은 예방적 처치의 투여 방법으로 투여할 수 있다.
한 구체예에서, 투여 대상은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 벡터 내의)로 치료할 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 경우 투여량은 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 mg, 1 ㎍ 내지 10 mg, 또는 30-300 ㎍ DNA/투여 대상일 수 있다. 감염 바이러스 벡터의 경우 투여량은 1회 투여 당 10-100 또는 그 이상의 비리온일 수 있다.
치료제는 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 비경구, 국소, 정맥 내, 경구, 피하, 동맥 내, 두개골 내, 복강 내, 비 내 또는 근육 내 투여할 수 있다. 근육 내 주사 또는 정맥 내 주입이 항체의 투여를 위해 바람직하다. 몇몇 방법에서, 특별한 치료 항체는 두개골 내로 직접 주입된다. 몇몇 방법에서, 항체는 서방형 조성물 또는 디바이스, 예를 들어 메디패드(상표명) 디바이스로 투여된다.
본 발명의 제제는 필요에 따라 처치(예를 들어, 예방적 처치 또는 치료적 처치)가 필요한 질환 또는 상태를 처치하는데 효과적인 다른 제제와 함께 투여할 수 있다. 바람직한 추가 제제는 당업계에 공지된 제제 및 특별한 질환을 위해 대표적으로 투여되는 제제이다.
본 발명의 90Y-표지된 폴리펩티드의 효과적인 단일 처치 투여량(즉, 치료적 유효량)은 약 5 내지 약 75 mCi, 더 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi 범위이다. 131I-표지된 항체의 효과적인 단일 처치 비골수 상해 투여량(non-marrow ablative dosage)은 약 5 내지 약 70 mCi, 더 바람직하게는 약 5 내지 약 40 mCi 범위이다. 131I-표지된 항체의 효과적인 단일 처치 상해 투여량(즉, 자가 골수 이식이 필요할 수 있음)은 약 30 내지 약 600 mCi, 더 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mCi 범위이다. 키메라 항체의 경우, 뮤린 항체에 대해 더 긴 순환 반감기로 인해, 131I-표지된 키메라 항체의 효과적인 단일 처치 비골수 상해 투여량은 약 5 내지 약 40 mCi, 더 바람직하게는 약 30 mCi 미만의 범위이다. 예를 들어, 111I 표지를 위한 조영 기준(imaging criteria)은 약 5 mCi 미만이 일반적이다.
131I 및 90Y를 이용하여 괄목할만한 임상적인 경험이 얻어져 왔으나, 다른 방사능표지도 당업계에 공지되어 있으며 유사한 목적을 위해 사용되어 왔다. 다른 방사성 동위원소도 조영을 위해 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 범위와 양립할 수 있는 추가의 방사성 동위원소의 예로는 123I, 125I, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211At, 및 213Bi를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 관점에서, 알파, 감마 및 베타 에미터는 모두 본 발명의 범위 내에서 양립가능하다. 또한, 본 발명의 관점에서, 당업자는 어떤 방사능핵종이 선택된 치료 과정과 양립할 수 있는지를 과도한 실험 없이 용이하게 결정할 수 있을 것으로 생각된다. 이를 위해, 임상적 진단을 위해 이미 사용되고 있는 방사능핵종의 예로는 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga 뿐만 아니라 111In을 들 수 있다. 또한, 항체는 표적화 면역요법에서의 잠재적인 용도를 위해 다양한 방사능핵종으로 표지되어 왔다(Peirersz 등, Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)). 이들 방사능핵종의 예로는 188Re 및 186Re 뿐만 아니라 더 적은 양으로 199Au 및 67Cu를 들 수 있다. 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제5,460,785호는 이러한 방사능핵종에 관한 추가 정보를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드가 접합된 형태로 사용되건 접합되지 않은 형태로 사용되건, 본 발명의 중요한 이점은 골수억제 환자에서, 특히 방사능요법 또는 화학요법과 같은 보조 치료법을 받는 중이거나 받은 환자에서 이들 폴리펩티드를 사용할 수 있다는 것일 것이다. 다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드(접합된 형태이거나 접합되지 않은 형태)는 화학치료제를 이용하는 병용 치료법에서 사용할 수 있다. 당업자는 이러한 치료 방법이 본원에 개시된 항체 및 하나 이상의 화학치료제의 순차 투여, 동시 투여, 병행 투여 또는 공존 투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 구체예에서 특히 바람직한 구체예는 독소 접합된 결합 분자, 예를 들어 D4 마이탄시노이드와 같은 마이탄시노이드에 접합된 결합 분자의 투여를 포함할 것이다.
상기 폴리펩티드는 바로 전에 기재한 바와 같이 투여할 수 있는 반면, 다른 구체예에서 접합된 폴리펩티드 및 접합되지 않은 폴리펩티드는 제1 라인 치료제로서 건강한 환자에게 투여될 수 있다는 점에 주목하여야 한다. 이러한 구체예에서, 폴리펩티드는 정상적인 또는 평균적인 적색 골수 잔여물을 보유하는 환자 및/또는 외부 빔 조사 또는 화학요법과 같은 보조 요법을 받고 있지 않은 환자에게 투여할 수 있다.
그러나, 상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 선택된 구체예는 골수억제 환자에게 폴리펩티드의 투여를 포함하거나, 또는 방사능요법 또는 화학요법과 같은 보조 요법과의 병행(즉, 병용 요법)을 포함한다. 본원에서 사용한 바와 같이, 보조 요법과 병용하여 폴리펩티드를 투여한다는 의미는 병용 요법과 본 발명의 폴리펩티드를 순차적으로, 동시에, 공존하도록, 병행하여, 동시에 작용하도록, 또는 동시에 발생하도록 투여 또는 적용한다는 것이다. 당업자는 병용 치료법의 여러 다양한 성분의 투여 또는 적용의 시간을 어떻게 조절하여야 전체적인 치료의 유효성이 증가되는지 이해하고 있을 것이다. 예를 들어, 화학치료제는 널리 공지된 표준 절차에 따라 투여하고, 이어서 수주 내에 본 발명의 방사능면역복합체를 투여할 수 있다. 반대로, 사이토톡신 결합된 폴리펩티드는 정맥 내로 투여하고, 이어서 종양 국부화된 외부 빔 조사를 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 1회의 병원 방문으로 1종 이상의 선택된 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 당업자(예를 들어, 숙련된 종양학자)는 선택된 보조 요법 및 본 발명의 개시 내용에 기초하여 과도한 실험 없이 효과적인 치료법을 인식할 수 있을 것이다.
이러한 관점에서, 폴리펩티드(접합된 폴리펩티드 또는 접합되지 않은 폴리펩티드) 및 화학치료제의 조합은 환자에게 치료적 이점을 제공하는 임의의 시간 계획 안에서 임의의 순서로 투여할 수 있다. 즉, 화학치료제 및 폴리펩티드는 임의의 순서 또는 동시에 투여할 수 있다. 선택된 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 화학요법을 수행하기 이전에 투여될 것이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드 및 화학치료제는 실질적으로 동시에 또는 병행하여 투여될 것이다. 예를 들어, 환자는 화학요법을 받는 중에 본 발명의 결합 분자를 투여받을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 결합 분자는 임의의 화학치료제를 투여하거나 또는 화학치료를 수행하는 1년 내에 투여될 것이다. 다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 임의의 화학치료제를 투여하거나 화학치료를 수행하는 10개월, 8개월, 6개월, 4개월 또는 2개월 내에 투여될 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 임의의 화학치료제를 투여하거나 화학치료를 수행하는 4주, 3주, 2주 또는 1주 내에 투여될 것이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 선택된 화학치료제를 투여하거나 화학치료를 수행하는 5주, 4주, 3주, 2주 또는 1주 내에 투여될 것이다. 2개 제제의 투여 또는 2개 처치의 수행은 약간의 시간 또는 분 내에 투여되거나 수행되는 것(즉, 실질적으로 동시에)으로 이해될 것이다.
더구나, 본 발명에 따라, 골수억제 환자는 감소된 혈구수를 나타내는 임의의 환자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 골수억제의 임상 징후로서 통상적으로 사용되는 몇몇 혈구수 파라미터가 존재하는 것을 이해할 것이고, 또한 골수억제가 환자에게서 발생하는 정도를 용이하게 측정할 수 있다. 당업계에서 인정되는 골수억제 측정치의 예로는 절대 호중구 수(ANC; Absolute Neutrophil Count) 또는 혈소판 수이다. 이러한 골수억제 또는 부분 골수상해는 여러 가지 생화학적 질환 또는 질병의 결과일 수 있거나, 이전의 화학요법 또는 방사능요법의 결과일 수 있다. 이러한 관점에서, 당업자는 전형적인 화학요법으로 치료받은 환자는 일반적으로 감소된 적색 골수 잔여물을 나타낸다는 것을 이해할 것이다. 상기 논의한 바와 같이, 이러한 환자는 종종 허용할 수 없는 부작용, 예를 들어 증가된 사망률과 이환율로 귀착되는 면역억제 및 빈혈과 같은 허용할 수 없는 부작용으로 인해 최적 수준의 사이토톡신(즉, 방사능핵종)을 이용하여 치료할 수 없다.
더 구체적으로, 본 발명의 접합되거나 또는 접합되지 않은 폴리펩티드를 이용하여 약 2000/mm3 보다 낮은 ANC를 나타내거나, 또는 약 150,000/mm3 보다 낮은 혈소판 수를 나타내는 환자를 효과적으로 치료할 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 약 1500/mm3 미만, 약 1000/mm3 미만 또는 더욱 더 바람직하게는 약 500/mm3 미만의 ANC를 나타내는 환자를 치료할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 약 75,000/mm3 미만, 약 50,000/mm3 미만 또는 약 10,000/mm3 훨씬 미만의 혈소판 수를 나타내는 환자를 치료할 수 있다. 더 일반적인 의미에서, 당업자는 정부 시행 가이드라인이나 절차를 이용하여 언제 환자가 골수억제되는 가를 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
상기한 바와 같이, 다수의 골수억제 환자는 화학요법, 이식 방사능용법 또는 외부 빔 방사능요법을 포함하는 치료 과정을 경험하였다. 후자의 경우에서, 외부 조사원은 악성 종양의 국소 조사를 위한 것이다. 이식 방사능요법에서, 방사능활성 시약은 수술을 통해 악성 종양 내에 위치시킴으로써 질병 부위를 선택적으로 조사한다. 다른 경우, 본원에 개시된 폴리펩티드를 이용하여 원인과는 무관하게 골수억제를 나타내는 환자의 질환을 치료할 수 있다.
이 관점에서, 본 발명의 폴리펩티드는 생체 내에서 신생물 세포의 성장을 제거, 감소, 억제 또는 조절하는 임의의 화학치료제(들)와 함께 또는 연합하여(예를 들어, 병용 요법을 제공하기 위해) 사용할 수 있다. 논의한 바와 같이, 이러한 제제는 종종 적색 골수 잔여물의 감소를 초래한다. 이러한 감소는 그러한 환자에서 종양 형성의 적극적인 치료를 유리하게 허용하는 본 발명의 화합물의 감소된 골소독성에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 상쇄된다. 다른 바람직한 구체예에서, 본원에 개시된 방사능표지된 면역복합제는 방사능핵종에 대한 신생물 세포의 취약성을 증가시키는 방사능감작제와 함께 효과적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 방사능 표지된 결합 분자가 혈류로부터 거의 제거되었으나 종양(들) 부위에서는 여전히 치료적으로 유효한 수준으로 존재하는 다음에 방사능감작 화합물이 투여된다.
본 발명의 이러한 관점에 있어서, 본 발명과 양립할 수 있는 예시적인 화학치료제의 예로는 알킬화제, 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴), 프로카르바진, 메토트렉세이트 및 프레드니손을 들 수 있다. 4-약물 배합물 MOPP(메클레타민(질소 머스타드), 빈크리스틴(온코빈), 프로카르바진 및 프레드니손)가 여러 가지 유형의 림프종을 치료하는데 매우 효과적이고, 본 발명의 바람직한 구체예를 구성한다. MOPP 내성 환자에서, ABVD(예를 들어, 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), ChlVPP(클로람부실, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손), CABS (로무스틴, 독소루비신, 블레오마이신 및 스트렙토조토신), MOPP + ABVD, MOPP + ABV(독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴) 또는 BCVPP(카르무스틴, 시클로포스파미드, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손) 조합을 사용할 수 있다. Arnold S. Freedman 및 Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher 등, eds., 13th ed. 1994) 및 V. T. DeVita 등 (1997) 및 본원에 인용한 문헌들은 표준 투여 및 스케쥴링을 위한 것이다. 이들 치료법은 특정 환자의 필요에 따라 변화 또는 변경하여 사용할 수 있으며, 본원에 개시한 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드와 병용할 수도 있다.
본 발명의 기술 사상에 유용한 추가적인 방법(섭생법)의 예로는 시클로포스파미드 또는 클로람부실과 같은 단일 알킬화제의 이용, 또는 CVP(시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), CHOP(CVP 및 독소루비신), C-MOPP(시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진), CAP-BOP(CHOP + 프로카르바진 및 블레오마이신), m-BAC0D(CHOP + 메톡트렉세이트, 블레오마이신 및 루코보린), ProMACE-MOPP (프레드니손, 메톡트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에포토사이드 및 루코보린 + 표준 MOPP), ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에포토사이드, 시타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메톡트렉세이트 및 루코보린) 및 MACOP-B(메톡트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 고정 투여량의 프레드니손, 블레오마이신 및 루코보린)과 같은 조합약의 이용을 들 수 있다. 당업자는 이들 각각의 방법을 위한 표준 투여량 및 투여 스케쥴링을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 또한, CHOP는 블레오마이신, 메톡트렉세이트, 프로카르바진, 질소 머스타드, 시토신 아라비노사이드 및 에포토사이드와 병용할 수도 있다. 다른 양립 가능한 화학치료제의 예로는 2- 클로로데옥시아데노신(2-CDA), 2'-데옥시코포르마이신 및 플루다라빈을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
병세가 완화되지 않거나 병이 재발한, 중간 등급 또는 높은 등급의 NHL을 가진 환자의 경우, 구조 요법(salvage therapy)를 사용한다. 구조 요법은 시토신 아라비노사이드, 시스플라틴, 에포토사이드 및 이포스파미드와 같은 약물을 단독으로 또는 조합하여 사용한다. 어떤 신생물 질환의 재발 형태 또는 활동적인 형태의 경우, 다음과 같은 프로토콜이 종종 사용된다: IMVP- 16(이포스파미드, 메톡트렉세이트 및 에포토사이드), MIME(메틸-개그, 이포스파미드, 메톡트렉세이트 및 에포토사이드), DHAP(덱사메타손, 고 투여량의 시타라빈 및 시스플라틴), ESHAP(에포토사이드, 메틸프레디솔론, HD 시타라빈, 시스플라틴), CEPP(B)(시클로포스파미드, 에포토사이드, 프로카르바진, 프레드니손 및 블레오마이신) 및 CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈 및 프레드니손), 이들 각각은 공지된 투여 속도와 투여 스케쥴로 이용된다.
본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 화학치료제의 양은 환자에 따라 달라질 수 있으며, 당업계에 공지된 방법에 따라 투여될 수 있다. 문헌[Bruce A Chabner 등, Antineoplastic Agents, in GOODMAN & GlLMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 (Joel G. Hardman 등, eds., 9th ed. 1996)]을 참조할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어 예방적 요법으로 초기 종양, 전이 또는 전암 성장 또는 조직을 제거하기 위한 수술을 받았거나, 그러한 수술을 받고 있거나, 그러한 수술을 받을 예정으로 있는 환자에게 투여할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 생물학적 물질과 함께 투여된다. 암 치료에 유용한 생물학적 물질은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어 그러한 공지된 생물학적 물질과 함께 투여할 수 있다.
예를 들어, FDA는 유방암 치료를 위해 다음과 같은 생물학적 물질을 승인하였다: 헤르셉틴(등록상표)(trastuzumab, Genentech Inc., South San Francisco, CA; HER2-양성 유방암에서 항종양 활성을 보유하는 인간화된 단일클론 항체); 파스로덱스(등록상표)(풀베스트란드, AstraZeneca Pharmaceuticals, LP, Wilmington, DE; 유방암 치료에 사용되는 에스트로겐 수용체 안타고니스트); 아리미덱스(등록상표)(아나스트로졸, AstraZeneca Pharmaceuticals, LP; a nonsteroidal aromatase inhibitor which blocks aromatase, 세스트로겐 제조에 필요한 효소); 아로마신(등록상표)(익스메스탄, Pfizer Inc., New York, NY; 유방암 치료에 사용되는 비가역적인 스테로이드성 아로마타제); 페마라(등록상표)(레트로졸, Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ; 유방암을 치료하기 위해 FDA에서 승인한 비스테로이드성 아로마타제); 및 놀바덱스(등록상표)(타목시펜, AstraZeneca Pharmaceuticals, LP; 유방암을 치료하기 위해 FDA에서 승인한 비스테로이드성 항에스트로겐). 본 발명의 결합 분자와 병용할 수 있는 다른 생물학적 물질의 예로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: 아바스틴(상표명)(베바시즈맙, Genentech Inc.; 혈관신생을 억제하기 위해 디자인된 FDA에서 최초 승인된 요법); 및 제발린(등록상표)(이브리투모맙 티욱세탄, Biogen Idec, Cambridge, MA; B-세포 림프종의 치료를 위해 현재 승인된 방사능 표지된 단일클론 항체).
추가적으로, FDA는 결장직장암 치료를 위해 다음과 같은 생물학적 물질을 승인하였다: 아바스틴(상표명); 에르비툭스(상표명)(세툭시맙, ImClone Systems Inc., New York, NY, 및 Bristol-Myers Squibb, New York, NY; 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR)에 대해 유도된 단일클론 항체); 글리벡(등록상표)(이마티닙 메실레이트; 단백질 키나제 억제제); 및 에르가미솔(등록상표)(레바미솔 히드로클로라이드, Janssen Pharmaceutica Products, LP, Titusville, NJ; 듀크 C 단계 결장암 환자의 절제술 후 5-플루오로우라실과 함께 보조 치료제로서 1990년에 FDA에서 승인된 면역조절제).
비호지킨 림프종의 치료를 위해 현재 승인된 치료법으로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: 벡사르(등록상표)(토시투모맙 및 요오드 I-131 토시투모맙, GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC; 방사능활성 분자(요오드 I-131)에 결합된 마우스 단일클론 항체(토시투모맙)를 이용하는 다단 치료; 인트론(등록상표) A(인터페론 알파-2b, Schering Corporation, Kenilworth, NJ; 안트라사이클린 함유 병용 화학요법(예를 들어, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손 [CHOP])을 병용하는 여포성 비호지킨 림프종의 치료를 위해 승인된 인터페론 유형); 리툭산(등록상표)(리툭시맙, Genentech Inc., South San Francisco, CA, 및 Biogen Idec, Cambridge, MA; 비호지킨 림프종의 치료를 위해 승인된 단일클론 항체; 온탁(등록상표)(데니루킨 디프티톡스, Ligand Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA; 인터루킨-2에 유전적으로 융합된 디프테리아 독소의 단편으로 이루어진 융합 단백질); 및 제발린(등록상표)(이브리투모맙 티욱세탄, Biogen Idec; B-세포 비호지킨 림프종의 치료를 위해 승인된 방사능 표지된 단일클론 항체).
백혈병의 치료를 위해, 본 발명의 결합 분자와 함께 사용할 수 있는 예시적인 생물학적 물질로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: 글리벡(등록상표); 캄패스(등록상표)-1H(알렘투즈맙, Berlex Laboratories, Richmond, CA; 만성 림프구성 백혈병의 치료를 위해 사용된 단일클론 항체 유형). 추가적으로, 게나센스(오블리메르센, Genta Corporation, Berkley Heights, NJ; 백혈병의 치료를 위해 개발 중인 BCL-2 안티센스 요법을 사용할 수 있음(예를 들어, 플루다라빈 및 시클로포스파미드와 같은 하나 이상의 화학요법 약물을 단독으로 또는 병용하여 사용함))를 본 발명의 결합 분자와 함께 투여할 수 있다.
폐암 치료를 위해 사용할 수 있는 예시적인 생물학적 물질의 예로는 타르세바(상표명)(에를로티닙 HCL, OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY; 인간 상피피세포 성장 인자 수용체 1(HER1) 경로를 표적으로 디자인한 작은 분자)를 들 수 있다.
다발성 골수종의 치료를 위해 사용할 수 있는 예시적인 생물학적 물질의 예로는 벨라카드(등록상표) 벨라카데(보르테조밉, Millennium Pharmaceuticals, Cambridge MA; 프로테오좀 억제제)를 들 수 있다. 추가의 생물학적 물질의 예로는 탈리도미드(등록상표)(탈리도미드, Clegene Corporation, Warren, NJ; 골수종 세포의 성장 및 생존을 억제하고 신생혈관생성을 방지할 수 있는 능력을 포함하는 다수의 작용을 보유하는 면역조절제)를 들 수 있다.
다른 예시적인 생물학적 물질의 예로는 ImClone Systems, Inc., New York, NY에서 개발된 MOAB IMC-C225를 들 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 결합 분자는 항암 면역 반응을 조절하는 백신 또는 다른 제제(예를 들어, 시토킨)과 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 멜라신(등록상표)(Corixa Corporation, Seattle, WA)은 T3N0M0 절제된 흑색종의 치료에 효과가 있는 것으로 보고된 동종이계 종양 백신이다. GMK(등록상표)(Progenies Pharmaceutical, Inc., Tarrytown, NY)는 흑색종 재발의 고 위험성을 가진 환자에서 III기 보조제로서 투여되는 강글리오사이드 항원이다. 항가스트린 치료 백신(등록상표)(Aphton Corporation, Miami, FL)은 호르몬 G17 및 글리엑스테네드를 중화하며, 결장직장암, 췌장암 및 위암 환자에 대해 3상 임상 시험이 진행되고 있다. 세아박(등록상표)(Titan Pharmaceuticals, Inc., South San Francisco, CA)은 결장직장암에서 연구되는 항이디오타입 항체 백신이다. 마지막으로, 테라토프(등록상표)(Biomira Inc., Edmonton, Alberta, Canada)는 전이성 유방암 환자에서 III기 제제로서 연구중인 합성 탄수화물 치료 백신이다(Pharmaceutical Research 및 Manufacturers of America, 2000).
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 항 혈관신생제, 예를 들어 덴도스타틴(내인성 종양 유래의 내피세포 특이성 억제제로서 미세혈관 내피 세포 생성을 중지시킴); 항 VEGF 항체; 탈리도마이드; 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제(혈관 기저막의 합성 및 분해를 억제함)과 함께 투여할 수 있다.
이미 논의한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드, 이의 면역반응성 단편 또는 재조합체는 포유류 질환의 생체 내 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여할 수 있다. 이러한 관점에서, 개시된 항체는 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하기 위해 제형화되는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 비독성 멸균 담체, 예를 들어 생리적 염수, 비독성 완충액, 보존제 등을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 치료제와 접합되거나 접합되지 않은, 본 발명의 폴리펩티드, 이의 면역반응성 단편 또는 재조합체의 약학적 유효량은 예를 들어, 질병 또는 질환의 징후를 경감하거나, 또는 어떤 물질이나 세포를 검출하는 이점을 얻고, 표적에 대한 효과적인 결합을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 종양 세포의 경우, 상기 폴리펩티드는 신생물 세포 또는 면역반응성 세포에 대해 선택된 면역반응성 항원과 면역반응하여 이들 세포의 사멸을 증가시킬 수 있는 것이 바람직하다. 물론, 본 발명의 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여량으로 투여하여 상기 폴리펩티드의 약학적 유효량을 제공할 수도 있다.
본 발명의 범위를 유지하면서, 본 발명의 폴리펩티드는 치료적 효과 또는 예방적 효과를 발현하기에 충분한 양을 상기한 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 공지된 기법에 따라 본 발명의 항체와 약학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 희석제와 조합하여 제조된 통상적인 투여 제형으로 인간 또는 다른 동물에게 투여할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 또는 특성은 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 잘 알려진 다른 변수에 의해 결정됨을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 본 발명의 폴리펩티드의 1종 이상을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있음을 이해할 것이다.
VI. 사용 방법
본 발명의 분자는 진단 목적이나 치료 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 그러한 진단이나 치료적 처치가 필요한 포유류 처치 대상에서 질환, 예를 들어 신생물 질환의 진단 및/또는 치료를 위한 화합물, 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 다수의 상이한 적용이 가능할 것이다. 예를 들어, 한 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 시험관 내에서 크립토를 검출하기 위한 분석법, 예를 들어 ELISA 분석법에 사용할 수 있다. 예시적인 분석법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 출원 20040077025을 참조할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 조영 기술을 이용하여 크립토 함유 세포의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 이러한 적용을 위해서는, 본 발명의 결합 분자를 검출 가능한 부위, 예를 들어 이하 후술하는 바와 같은 방사능표지에 접합시키는 것이 바람직할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 본 발명의 결합 분자에 의해 인식된 표적(예를 들어, 크립토의 에피토프)을 보유하는 세포를 감소 또는 제거하는데 유용하다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 순환에서 가용한 표적 분자의 농도를 감소시키거나 상기 표적 분자를 제거하는데 효과적이다.
한 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 억제하고/하거나, 종양을 보유하는 개체의 생존 시간을 연장시킨다. 따라서, 본 발명은 또한 폴리펩티드의 효과적인 비독성 양을 종양의 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 투여함으로써 인간 또는 동물에서 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당업자는 어느 정도의 양이 악성 종양을 치료하기 위해 필요한 폴리펩티드의 효과적인 비독성 양인지를 통상적인 실험을 통해 결정할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 치료적 유효량은 질병의 상태(예를 들어 I 기 대 IV 기), 환자의 연령, 성별, 의학적 문제(예를 들어, 면역억제된 상태 또는 질병) 및 체중 및 환자에서 원하는 반응을 유발할 수 있는 항체의 능력과 같은 요인에 의해 달라질 수 있다. 투여 방법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 수회 분할하여 매일 투여할 수도 있고, 또는 투여량은 치료 상황의 본질적인 요구에 의해 나타나는 바와 같이 비례적으로 감소할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 유효 투여량은 1일 당 체중 1 kg 당 약 0.05 내지 100 mg의 범위 내인 것으로 생각된다. 바람직한 유효 투여량은 1일 당 체중 1 kg 당 약 0.5 내지 10 mg이다.
본원에 사용한 용어 "포유동물(포유류)"는 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠용 동물 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유 동물로 분류된 임의의 동물을 의미한다. 바람직한 포유동물은 인간이다. 본원에 사용한 용어 "처치(treatment)"는 치료적 처치 및 예방적(prophylactic 또는 preventative) 처치 둘 다를 의미한다. 처치가 필요한 동물은 질병 또는 질환을 이미 갖고 있는 동물뿐만 아니라 질병 또는 질환의 예방이 요구되는 동물을 의미한다. 따라서, 포유동물은 질병 또는 질환을 보유하는 것으로 진단할 수도 있거나, 또는 질병에 걸리기 쉽거나 질병에 취약한 것은 진단할 수도 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 발명은 결합 분자에 의한 암 세포의 표적화를 가능하게 하는 마커를 포함하는 임의의 신생물을 예방적으로 또는 치료적으로 처치하는 데 사용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 고형 종양을 처치하기 위해 사용할 수 있다. 처치할 수 있는 암의 예로는 전립선암, 위 암종, 예를 들어 결장 암, 피부암, 유방암, 난소암, 폐암 및 췌장암을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 카포시 육종, CNS 종양(모세혈관 아세포종, 수막종 및 뇌 전이), 흑색종, 위장관 및 신장 암종, 횡문근암종, 신경아세포종(바람직하게는, 다형 신경아세포종), 평활근암종, 망막아종, 난소의 유두 포낭 아데노암종, 윌름 종양 또는 소세포 폐 암종을 처치하기 위해 사용할 수 있다. 적합한 폴리펩티드는 본원의 개시 내용에 기초하여 고도한 실험 없이 상기 신생물 각각과 관련된 종양 회합 분자에 대해 유도될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명을 이용하여 처치할 수 있는 예시적인 혈액 악성 종양의 예로는 호지킨 및 비호지킨 림프종을 들 수 있는데, 이는 ALL-L3(버킷 림프종), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 단구세포 백혈병을 포함한다. 본 발명의 화합물 및 방법은 낮은 등급/낭포성 비호지킨 림프종(NHL), 세포 림프종(FCC), 맨틀 세포 림프종(MCL), 확산 거대 세포 림프종(DLCL), 소 림프구성(SL) NHL, 중간 등급/낭포성 NHL, 중간 등급확산 NHL, 높은 등급 림프구모세포성 NHL, 높은 등급 림프구아세포성 NHL, 높은 등급 소 비절단 세포 NHL, 비대 질병(bulky disease) NHL 및 발덴스트롬 매크로글로불린혈증를 포함하는 다양한 B-세포 림프종을 치료하는데 특히 효과적이다. 이들 림프종은 종종 분류 시스템의 변화에 따라 다른 이름으로 명명될 것이며, 상이한 이름으로 분류된 림프종을 가진 환자도 본 발명의 병용 치료법의 이익을 받을 것이라는 점은 당업자에게 명백하다. 상기한 신생물 질환 이외에, 본 발명은 양립 가능한 종양 회합 분자를 보유하는 추가의 악성 종양을 치료하는데 효과적으로 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 한 구체예에서, 특히 종양 성장이 액티빈 B 신호전달의 상실 또는 감소에 의해 매개되는 경우, 크립토에 특이적으로 결합할 수 있고 환자에서 종양 세포의 성장을 억제하는 분자가 제공된다. 특정 구체예에서, 종양 세포는 뇌, 두부, 목, 전립선, 유방, 고환, 결장, 폐, 난소, 방광, 자궁, 자궁경부, 췌장 및 위 종양 세포이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 크립토에 특이적으로 결합하는 크립토를 과발현하는 종양 세포의 성장을 억제시킨다. 한 구체예에서, 종양 세포는 크립토를 과발현하는 세포주, 예를 들어 노, 유방, 고환, 결장, 폐, 방광, 자궁, 자궁경부, 췌장 및 위암으로부터 유래한 세포주이다.
본 발명은 후술하는 비제한적인 실시예에 의해 추가 기술된다. 실시예에서 인용한 모든 문헌, 특허문헌 및 공개된 특허출원의 내용은 전적으로 참고를 위해 인용한 것임을 밝혀둔다.
실시예
실시예 1 : A 및 B 이소폼의 동정
항체 분자의 용액은 2개의 상이한 이소폼을 포함한다. 한 형태인 A형은 하나 이상의 이황화 결합으로 연결된 중쇄 분자를 포함한다. 다른 형태인 B형은 하나 이상의 이황화 결합으로 연결되지 않은 중쇄 분자를 포함한다. B형은 나타나지 않거나, 리툭산(등록상표)과 같은 원형(intact) 감마 1 MAb와 함께 매우 낮은 빈도로 나타난다. 그러나, 유사한 힌지를 보유하는 도메인 결실된(dd; domain deleted) 구성물의 경우, B형의 빈도는 훨씬 높아진다. 이들 형태는 변성, 비환원 SDS PAGE를 이용하여 구별할 수 있다. 도메인 결실된 항체 제제에서, A형은 120 kDa 이량체로서 나타나는 반면, B형은 60 kDa 단량체로서 나타난다.
실시예 2 : CH2 도메인 결손된 MAb 단편 내 힌지 영역 이종성의 동정
힌지 도메인은 3개의 구별되는 영역, 즉 상부, 중앙 및 하부 힌지 영역으로 세분할 수 있다(Roux 등, J. Immunol. 1998 161:4083). IgG1 및 IgG3의 경우 이들 영역을 포괄하는 폴리펩티드 서열은 하기 표 3에 나타냈다. IgG3 중앙 영역은 2개의 보존된 시스테인 잔기 이외에 3회 반복되는 15개 아미노산 모티프를 함유한다. 이들 영역 유래의 아미노산 서열을 이용하여 합성 IgG1/IgG3 연결 펩티드를 디자인하였다. 이들은 226 내지 238번 위치에 상응하는 IgG1 상부 힌지 잔기, 239 내지 241번 위치에 상응하는 IgG1 중앙 힌지 및 243번 위치에 첨가된 프롤린 또는 각각 243번 위치, 244번 위치 및 245번 위치에 첨가된 프롤린, 알라닌, 프롤린과 연합된 241EE 내지 242번 위치(카뱃 번호화 체계)에 상응하는 단일 IgG3 중앙 힌지 반복 모티프, 이어서 가요성 Gly/Ser 스페이서(표 2)로 구성된다. 또한, 신규 연결 펩티드는 243번 위치에 첨가된 프롤린 또는 각각 243번 위치, 244번 위치 및 245번 위치(카뱃 번호화 체계)에 첨가된 프롤린, 알라닌, 프롤린과 연합된 239번 위치 또는 242번 위치에서 시스테인 대신의 세린 아미노산 잔기로 구성하였다. 또한, Pro243Ala244Pro245 및 Pro 243 연결 펩티드도 제조하였다. IgG1 힌지의 최초 잔기(226번 위치, 카뱃 번호화 체계)로부터 시작하여 힌지/GlySer 연결 펩티드의 최종 잔기에 이르는 모 CH2 도메인 결실된 인간화된 CC49 연결 펩티드의 아미노산 서열은 표 2에 나타냈다. 또한, 카뱃 번호화 체계에서 나타낸 시스테인 잔기의 위치를 이용하여 CC49에 대한 배열에 의한 여러 가지 펩티드 디자인도 나타낸다.
[표 2]
힌지 영역 연결 펩티드 서열
Figure 112007056744018-PCT00002
[표 3]
IgG1, IgG3 및 IgG4 힌지 영역
Figure 112007056744018-PCT00003
실시예 3 : 연결 폴리펩티드의 구성 및 이소폼의 우선 합성
스플라이싱 바이 오버랩 익스텐션(SOE) 법(Horton, R.M. 1993 Methods in Molecular Biology, VoI 15:PCR Protocols: Current Methods and applications. Ed. B. A. White)을 이용하여 표 2에 나타낸 힌지 영역 연결 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 CH2 도메인 결실된 huCC49 유전자 서열에 도입하였다. 힌지 영역에 대한 올바른 변경은 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 항체 단백질의 안정한 생성을 위해 플라스미드 DNA를 이용하여 CHO DG44 세포를 형질전환시켰다.
표 2에 나타낸 8개의 디자인된 합성 연결 펩티드를 함유하는 CH2 도메인 결실된 huCC49 항체를 구성하였고, 항체는 CHO DG44 세포 내에서 생성하였다. 분리된 세포주로부터 상청액을 수집하고, 배양 상청액 내의 항체 농도는 면역분석법으로 측정하였다. 각각의 세포주로부터 전체 항체 단백질 0 내지 30 ng 범위의 항체를 함유하는 상청액은 비환원 SDS-PAGE 전기영동 후 항 인간 카파 HRP 접합된 항체를 이용하는 웨스턴 블롯으로 분석하여 CH2 도메인 결실된 huCC49 A형 및 B형 이소폼을 검출하였다. 이들 조건 하에서, A형은 단일 120 kDa 단독이량체로서 이동하였고, B형은 60 kDa 이중체으로서 이동하였다. 또한, 카파 쇄 단량체 및 이량체도 보였다. 서열 번호 5, 26, 32 및 33에 나타낸 연결 펩티드는 모두 생성된 A형의 비율을 증가시키는 것으로 확인되었다. 이들 결과는 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser](서열 번호 5) 및 G1/G3/Pro243 + [Gly/Ser](서열 번호 26) 힌지 둘 다가 전적으로는 아니지만 검출 가능한 B형이 거의 없거나 없는 A형 CH2 도메인 결실된 huCC49 항체를 주로 생성함을 나타내는 것이다. 대조적으로, CH2 도메인 결실된 huCC49 Cys242Ser:Pro243(서열 번호 30) 및 CH2 도메인 결실된 huCC49 Cys242Ser:Pro243Ala244Pro245(서열 번호 32)은 각각 B형 이소폼에 대한 중간 정도 내지 현저한 선호도를 나타냈다.
항체 생성을 위해 huCC49 항체 서열에 도입된 Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser](서열 번호 32) 및 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser](서열 번호 5) 연결 펩티드를 함유하는 세포주를 이용하였다. 또한, Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] 및 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] 연결 펩티드도 huCC49 V2 항체 서열 및 생성된 세포주 내로 도입하였다(인간화된 CC49 버젼 2 서열은 당업계에 공지되어 있다). 항체는 하기 실시예 4에 기재된 방법을 이용하여 CHO DG44 세포로부터 생성하고 정제하였다. 단백질 G 및 HIC 단계 후의 A형 이소폼의 수율은 표 4에 기록하였다. 이들 결과로부터, CH2 도메인 결실된 항체 내의 힌지 영역에 도입된 변경은 A 이소폼의 우선적인 합성을 유도하는 것이 명백하다. 실시예 4에 기재된 HIC 정제 기법에 따라 정제된 HuCC49 Pro230Ala231Pro232 및 HuCC49 V2 Pro230Ala231Pro232 A형 물질은 98%를 초과하는 값으로 달성되었다. 단백질 G 컬럼만을 이용하여 정제된 HuCC49 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 및 HuCC49 V2 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 A형 물질은 둘 다 추가의 HIC 정제 없이 본질적으로 ≥96% 순도로 단일 피크로 용출되었다. 모든 항체는 크기 배제 크로마토그래피로 조사하였고, 단일 피크로 용출됨을 확인하였는데, 이는 항체 생성물의 유의적인 집합 또는 분해가 없었음을 의미한다.
펩티드 맵핑을 이용하여 CH2 도메인 결실된 HuCC49, HuCC49 PAP 및 HuCC49 G1/G3/PAP 항체의 중쇄 힌지 영역 내에서 이황화 결합 형성의 보전성을 측정하였다. CH2 도메인 결실된 CC49 항체의 샘플은 다음과 같이 변성시키고, 환원하고, 트립신으로 분해하였다: 150 ㎍의 액적은 HPLC 수 내에서 100 ml로 희석하고, 6 M 구아니딘 히드로클로라이드, 5O mM 트리스 pH 8.0 중에서 변성시켰다. 상기 샘플은 20 mM DTT를 첨가하여 환원시키고, 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 환원된 샘플은 37℃에서 30분 동안 50 mM 요오도아세트산으로 알킬화하였다. 상기 알킬화 반응은 과량의 DTT를 첨가하여 켄칭하였다. 환원되고 알킬화된 샘플은 PD-10 컬럼을 이용하여 25 mM TRIS, 20 mM CaCl2, pH 7.5 내로 완충액 교환하였다. 트립신을 각각의 샘플에 1:15(w/w)로 첨가하고 37℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. 분해는 최종 농도 0.1%로 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하여 중단시켰다. 이어서, 트립신 분해된 샘플(15 ㎍)은 다음과 같은 크로마토그래피 조건에 따라 분석하였다.
CH2 도메인 결실된 CC49 항체의 샘플은 엔도프로테인아제 Lys-C 분해를 이용하여 분석하였다. 변성되고 환원된 샘플은 샘플 1.5 mg/ml에 최종 농도의 4 M 구아니딘 HCl 및 25 mM DTT를 첨가하여 제조하였다. 비환원된 샘플은 샘플 1.5 mg/ml에 최종 농도의 4 M 구아니딘 HCl을 첨가하여 제조하였다. 샘플은 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 분해 완충액(50 mM 트리스, pH 7.0 및 0.062 AU/ml 엔도프로테이나제 Lys-C)를 샘플에 1:1 (v/v)로 첨가하고, 샘플은 37℃에서 15 시간 동안 항온처리하였다. 15 시간에, 효소의 제2 액적(0.29 mAU:㎍ 항체)을 첨가하고, 샘플은 37℃에서 추가로 6 시간 동안 항온처리하였다. 반응을 켄칭하기 위해, TFA를 0.1% 최종 농도로 첨가하였다. 이어서, 비환원된 및 환원된 엔도프로테아니제 Lys-C 분해된 샘플(12 ㎍)은 다음과 같은 절차에 따라 분석하였다.
HPLC/질량 분광광도법 분석. 샘플은 애질런트 MSD 단일 사중극자 질량 분광광도계에 연결된 애질런트 1100 HPLC 시스템에서 분석하였다. 역상 C18 컬럼(Vydac 카탈로그 넘버 218TP52)은 0.2 ml/분의 유속으로 물/0.1% TFA (v/v) (완충액 A) 및 아세토니트릴/0.1% TFA (v/v) (완충액 B)의 용출 시스템과 함께 사용하였다. 0.1 ml/분으로 아세토니트릴과 아세트산(1:1 v/v)의 후 컬럼 "TFA 고정" 용액을 첨가하여 이온화를 강화하였다. 상기 컬럼 온도는 45℃로 조절하였고, 용출 프로파일은 215 및 280 nm에서 모니터링하였다. 전체 이온 크로마토그램은 포지티브 이온 모드로 모니터링하였다. 샘플은 컬럼에 주입하고 구배는 5분 동안 0% 완충액 B로 유지하였다. 용출은 125분에 걸쳐 0 내지 50% 완충액 B의 선형 구배, 이어서 10분에 걸쳐 75% 완충액 B 및 30분에 걸쳐 0% 완충액 B 재평형으로 수행하였다.
엔도 Lys-C 환원된 분석에서, 단편(L52-109)은 모든 샘플에서 검출되지 않았다. 이 단편은 매우 소수성이고, 강한 상호작용으로 인해 컬럼 매트릭스로부터 용출되지 않을 수 있다. 상응하는 트립신 분해 단편(L68-109) 또한 모든 샘플에서 검출되지 않았다. 이들 단편은 다수의 아마노산을 함유하기 때문에, 본 발명의 아미노산 동일성은 ~89% 동일성으로 낮아졌다. 또한, 단편(L68-119)은 동일성을 ~79%로 감소시키는 G1/G3/PAP의 엔도 Lys-C 분석에서 검출되지 않았다.
엔도 Lys-C 비환원 분석은 더 좋은 결과를 제공하였다. 단편(L52-109)은 모든 샘플에서 단편(L1-24)과의 이황화 결합으로서 검출되었다. 다른 모든 이황화 결합이 검출되었고, 모든 샘플에서 전체 아미노산 동일성%은 ~99%였다. G1/G3/ PAP 샘플은 오리지널(H224-227) CPPC 힌지 영역 아래에 단편(H235-275) 내에 추가의 중쇄-중쇄 이황화 결합을 나타냈다. 조작된 힌지 영역 펩티드에 대한 이론적인 질량 값과 실측된 질량 값을 측정하였다. HuCC49ΔCH2 힌지 엔도 Lys-C 비환원 펩티드(잔기 H221-257)는 실측된 MW가 7419.4이었는데, 이는 2개의 쇄 간 이황화 브리지를 함유하는 결합된 힌지에 대한 계산된 분자량 7419.4와 잘 일치하는 것이었다. HuCC49ΔCH2 PAP 힌지 엔도 Lys-C 비환원 펩티드(잔기 H221-257)는 실측된 MW가 7949.7이었는데, 이는 쇄 간 이황화 브리지를 함유하는 결합된 힌지에 대한 계산된 분자량 7949.8과 잘 일치하는 것이었다. 2개의 비환원 펩티드 단편은 15 아미노산 γ3 모티프 내의 카뱃 위치 241 II에서 라이신 잔기의 존재로 인해 Lys-C에 의한 HuCC49ΔCH2 G1/G3/ PAP의 분해에 기인한 것이었다. 잔기 H221-231 및 H232-275의 펩티드 단편은 실측된 MW가 각각 2414.3 및 8782.6이었으며, 이는 계산된 질량 2413.0 및 8782.0 g/mol과 현저히 일치하였다. 상기 질량 데이타는 HuCC49ΔCH2 G1/G3/PAP로부터 유도된 THTCPPCPEPK 펩티드(잔기 H221-231)가 2개의 쇄 간 이황화 브리지를 함유하는 것을 입증하는 것이다. 중요한 것은 잔기 H232-275를 포함하는 펩티드는 하나 이상의 쇄 간 이황화 브리지를 함유하며, 이는 키메라 G1/G3/PAP 힌지가 2개 이상의 이황화 브리지의 형성에 참여한다는 개념과 일치하는 것이다. 이들 분석은 HuCC49ΔCH2 G1/G3/PAP 힌지가 2개의 중쇄 쇄 간 이황화 결합을 형성한다는 것을 보여준다. HuCC49ΔCH2 G1/G3/PAP 힌지는 3개 이상의 중쇄 쇄 간 이황화 결합을 형성하나 5개도 가능하다. 단편 HuCC49ΔCH2 G1/G3/PAP 잔기 H232-275는 최소 하나의 쇄 간 이황화 결합을 함유하지만, 3개의 쇄 간 이황화 결합을 함유하는 힌지 영역과 단일 쇄 간 및 2개의 쇄 간 이황화 결합을 함유하는 것과의 질량 차이를 구별하는 것은 불가능하다.
[표 4]
친화성 크로마토그래피(단백질 G) 및 HIC 정제 후 A형 항체의 백분율
Figure 112007056744018-PCT00004
이들 데이타는 신규한 조작된 합성 힌지 영역 연결 펩티드는 A 또는 B 이소폼의 형성을 우선적으로 유도하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 이들 연구는 CH2 도메인 결실된 항체 A형 이소폼을 합성하는데 242번 위치(카뱃 번호화 체계)의 시스테인 잔기의 중요성을 보여준다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 연결 펩티드는 239번 위치 또는 242번 위치의 적어도 하나에서 시스테인을 포함한다. 239번 위치 또는 242번 위치의 시스테인을 세린으로 치환(예를 들어, 서열 번호 28, 29, 30 또는 31에서 나타낸 연결 펩티드를 이용함)하는 것은 CH2 도메인 결실된 항체 생합성을 B형 이소폼으로 이동시킨다. A형의 비율을 증가시키는 연결 펩티드의 이용은 과정, 수율 및/또는 안정성에서 이로운 개선을 유도할 것이다. 이들 합성 힌지 영역 연결 펩티드는 모두 4개의 인간 이소타입을 위한 CH3 도메인 중 매우 높은 정도의 상동성에 기초한 임의의 항체 이소타입, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 위한 CH2 도메인 결실된 항체 A형 이소폼의 합성을 유도하는데 유용하다. 동일하고 보존된 아미노산 잔기를 포함하기 때문에, IgG1 CH3 도메인은 IgG2 CH3에 98.13% 상동성을 나타내고, IgG3 CH3에 97.20% 상동성을 나타내며, IgG4 CH3에 96.26% 상동성을 나타낸다.
실시예 4 : A 및 B 이소폼 둘 다를 함유하는 단일클론 항체 혼합물로부터 A형 및 B형의 정제
ddCC49 상청액 10 ml는 1 M 트리스 pH 9.0을 이용하여 최종 pH 7.5로 적정하였다. 이 물질은 Sol-Vac 0.8 μ 및 0.4 μ 멤브레인 시리즈를 통해 여과하였다. 100 ml XK50 단백질 G 컬럼은 유속 80 ml/분으로 1 x PBS를 이용하여 예비평형처리하였다. 적정되고 여과된 상청액을 컬럼에 80 ml/분으로 로딩하였다. 결합된 단백질은 2 컬럼 부피의 평형 완충액으로 세척하고, pH 3.0에서 100 mM 글리신으로 용출시켰다. ddCC49 피크를 함유하는 분획을 수집하고, 1 M 트리스 pH 9.0을 이용하여 최종 pH 7.0으로 적정하였다.
Toso Biosep 페닐 5PW-HR 컬럼은 20 mM 포스페이트 pH 7.2; 1 M 암모늄 설페이트를 이용하여 예비평형처리하였다. 단백질 G 용출물은 3.5 M 암모늄 설페이트 pH 7.2 스톡을 이용하여 1 M 암모늄 설페이트로 적정하고, 겔 베드 2 ml/mg의 농도로 로딩하였다. 결합된 단백질은 20 mM 포스페이트 pH 4 또는 7.2 암모늄 설페이트로 세척하여 전도도를 116.4 mS/cm로 조정하였다. 상기 조건에서 용출된 물질은 비환원 SDS-PAGE에서 겉보기 분자량이 약 120 kDa(A형)이었다. 잔류하는 결합된 항체는 포스페이트 완충액 내의 환원 암모늄 설페이트 내용물의 선형 구배를 이용하여 추가로 용출시켰다. 후자의 용출된 항체는 중쇄 사이에 이황화 결합이 명백히 없었으며 그의 겉보기 분자량은 약 60 kDa(B형)이었다.
상기 정제된 물질 둘 다는 암모늄 설페이트 농도를 1 M로 하고, 세정된 페닐 5PW-HR 컬럼에 재로딩함으로써 다시포획할 수 있다. 결합된 단백질은 20 mM 포스페이트 pH 7.2를 이용하여 용출시키고, 1 x PBS 내로 투석하였다.
실시예 5. A형 및 B형의 안정성 비교
A형 및 B형의 생물학적 활성(예비 실험, 예를 들어 직접 결합 또는 경쟁 연구를 이용하는 예비 실험을 통해 측정된 것)은 A형 및 B형이 유사한 생물학적 활성을 보유함을 나타냈다.
또한, A형과 B형의 안정성도 비교하였다. 정제된 ddCC49 분자는 YM30 멤브레인(Millipore)이 장착된 아미콘 농축기로 약 5 mg/ml로 농축하였다. 농축된 물질은 각각의 이소폼에 대해 4개의 부분으로 균분하였고, 각각의 분획은 다음과 같은 완충액 내에서 16 시간 투석하기 위해 10K 투석 카세트(Pierce, cat# 66410)에 투입하였다: 1) 10 mM 나트륨 포스페이트, pH3; 2) 10 mM 나트륨 아세티이트, pH 5; 3) 10 mM 나트륨 포스페이트, pH 7; 및 4) 10 mM 나트륨 보레이트, pH 9. 투석 후, 각 용액의 단백질 농도는 3 mg/ml로 조정하였다. 순수한 A 이소폼 및 B 이소폼 용액 이외에, 각각의 pH로부터 A 용액 및 B 용액의 일부를 혼합하여 50% 각각의 이소폼을 함유하는 혼합물을 생성하였다. 총 12개의 조제물을 생성하였다(4개의 pH 레벨 x 3개의 항체 용액). 상기 용액들은 여과하고, 그레이 부틸 스토퍼가 구비된 3 ml Type-1 유리 혈청 바이알(West Pharmaceuticals)에 충전하였다.
3개의 온도, 즉 2-8℃, 20-25℃ 및 38-42℃를 선택하여 안정성 테스트를 위해 상기 단백질 용액을 저장하였다. 저장 이전에, 물리적 및 화학적 분석을 위해 각각의 조제물로부터 500 ㎕의 샘플을 추출하고, 이들 0(제로) 시간 데이타를 대조를 위한 데이타로 사용하였다. 저장 중 1회, 다음 스케쥴, 즉 2주, 1개월, 2개월 및 3개월에 따라 샘플을 추출하고, 즉시 테스트를 위해 제출하였다.
상기 두 이소폼의 물리적 및 화학적 안정성을 평가하기 위해, 다음과 같은 방법을 사용하였다: OD320에서 측정한 탁도, 비환원 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피.
비환원 SDS-PAGE는 다양한 시점에 대해 2-8℃, 20-25℃ 및 38-42℃에서 저장된 샘플에 대해 수행하였다. A형 및 B형 둘 다 2-8℃에서 저장하는 경우 pH 5에서 상대적으로 안정하였다. 그러나, pH 7 및 pH 9에서 조제하는 경우, A형 및 B형 둘 다 원래의 주 밴드(A형의 경우 120 kDa 및 B형의 경우 60 kDa) 보다 더 적은 밴드의 수가 증가하는 것으로 보아 분해를 나타냈다. 주목해야 할 것은 특히 저온 및 중온에서 저장된 pH 7 및 pH 9 샘플의 경우 55 kDa 미만인 밴드의 수 및 강도가 A 이소폼에서 보다 B 이소폼에서 더 높았다는 점이다. 이는 이들 조건 하에서 A 이소폼이 B 이소폼 보다 더 안정하다는 것을 나타내는 것이다. 그러나, 이는 20-25℃에서 저장된 pH 5에서의 A 이소폼에 대해서는 동일하게 나타나지 않는 것으로 보인다. 이 샘플은 B 이소폼 보다는 단편을 보유하고 있을 것으로 생각된다. 이는 미생물 오염(이하 상세히 기술함)으로 인한 인공물인 것으로 생각된다. 높은 저장 온도에서, pH 9 샘플 둘 다는 상당히 분해되었고, 샘플들 사이의 겔 패턴에서 거의 차이가 없었다. 이 조건 하에서, 미량의 오염된 밴드가 겔의 상부에서 확인되었는데, 이는 집합체의 형성을 의미하는 것이다. 집합체는 SDS에 의해 분해될 수 있기 때문에, 집합은 다음 섹션에 기술한 방법을 이용하여 조사하였다.
하기 표 5A 내지 표 5C는 3개의 상이한 온도에서 저장된 ddCC49에 대한 탁도 데이타를 나타낸 것이다. 탁도는 가용성 집합체 및 불용성 집합체 둘 다를 측정하였고, 이들 입자에 의해 산란된 빛의 양에 기초한 것이다. 집합체가 존재하는 경우, 집합체는 빛을 산란시킬 것이고 결과적으로 A320은 증가하게 된다. 표 5A 내지 5C에서 확인할 수 있는 바와 같이, 2-8℃에서 저장된 ddCC49 분자의 탁도는 A 이소폼 및 B 이소폼에 대한 pH가 증가함에 따라 증가하였는데, A 이소폼이 B 이소폼보다 덜 탁했다. 이러한 경향은 더 높은 온도(20-25℃ 및 38-40℃)에서 1개월 미만의 기간 동안 저장된 샘플에 대해서 동일하게 나타났다. 저장 기간이 3개월에 다다름에 따라 탁도는 높은 pH 및 온도에서의 샘플에 대해 상당히 증가하였고, A형 및 B형 사이의 차이는 감소하였다. 이들 결과는 SDS-PAGE의 결과와 일치하는 것이며, 이소폼 둘 다는 pH 3 및 pH 5에서 상대적으로 안정하고, A 이소폼은 B 이소폼 보다 집합에 대해 덜 민감하다 것을 의미하는 것이다.
[표 5A]
2-8℃에서 저장된 ddCC49 샘플에 대한 A320에서 측정한 탁도
Figure 112007056744018-PCT00005
[표 5B]
20-25℃에서 저장된 ddCC49 샘플에 대한 A320에서 측정한 탁도
Figure 112007056744018-PCT00006
[표 5C]
38-42℃에서 저장된 ddCC49 샘플에 대한 A320에서 측정한 탁도
Figure 112007056744018-PCT00007
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 원형 분자 및 분해된 생성물(단편 및 가용성 집합체 둘 다)의 백분율을 나타내주는 강력한 방법이며, 재현가능성이 상당히 높다. 표 5A 내지 5C에서, 상이한 온도에서 저장된 A 이소폼, B 이소폼 및 혼합의 원형 단량체의 백분율을 나타냈다. 2-8℃에서 저장된 샘플의 경우, A형이 B형에 비해 더 높은 단량체 백분율을 보유하고, A형과 B형의 혼합물은 A형과 B형의 사이에 해당하는 백분율을 보유함은 명백하다. 이 저장 온도에서, A형 및 B형 둘 다는 약 3개월 동안 pH 3, pH 5 및 pH 7(pH 5가 가장 안정한 조건임)에서 상대적으로 안정하였다. 그러나, pH 9에서, B형의 경우 단량체 백분율이 크게 감소하였으나, A형의 경우에 약간의 감소가 있을 뿐이었다. 상승된 온도에서, 모든 샘플은 저장 시간이 증가함에 따라 단량체 백분율의 상당한 감소를 나타냈고; A 이소폼은 B 이소폼을 능가하였다. 그러나, 예외가 존재하는데, 실온에서 저장된 pH 5의 A 이소폼 샘플은 유사한 저장 조건 하의 B 이소폼 또는 혼합물보다 훨씬 더 많은 분해를 나타냈다. 상기 특별한 A 이소폼 바이알의 정밀 조사, 상기 샘플에 대한 SDS-PAGE 및 SEC로부터 얻은 데이타는 미생물 오염이 이런 예상치 못한 결과의 원인일 수 있음을 암시하고 있다. 먼저, SEC 및 SDS-PAGE 결과는 상기 샘플에 대한 분해가 일차적으로 단편화의 증가, 아마도 미생물 분해에 기인한 단편화의 증가에 기인하는 것이거나, 그렇지 않으면 어느 정도는 집합의 증가가 예상되는 것을 나타내고 있다. 둘째, A 이소폼 및 B 이소폼 각각을 50%씩 함유하는 혼합물 샘플은 B 이소폼 보다 더 양호한 안정성 프로파일을 나타냈는데, 이는 더 안정한 A 이소폼이 단량체의 더 높은 백분율에 기여함을 의미하는 것이다. 마지막으로, 2-8℃ 및 38-42℃에서 저장된 pH 5의 A 이소폼은 둘 다 유사한 조건 하에서 B 이소폼보다 더 높은 단량체 백분율을 나타냈다. 따라서, 중간 정도의 저장 온도는 유사한 결과를 나타냈어야만 했다. 제한된 양의 샘플로 인해, 미생물 오염에 대한 분석은 수행할 수 없었다.
또한, 주목해야 할 것은 높은 pH(9) 및 40℃에서 저장된 IDEC-159의 이소폼 둘 다의 경우, 단량체 백분율은 약 30%로 감소하였다는 점이다. 이들 혹독한 조건 하에서, 두 이소폼 사이의 안정성 차이는 없어졌다. 이 SEC 결과는 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과를 그대로 보여주는 것이다. 이들 두 결과는, 일부 화학적 및 물리적 특성은 두 이소폼 사이에 존재하지만, 이들 두 이소폼에 대한 분해 메카니즘 및 부산물은 동일하지는 않지만 유사하다는 것을 나타낸다.
요약하면, SEC 결과로부터 확인할 수 있는 것은 A 이소폼 및 B 이소폼이 약 pH 5가 최적 pH이며, A 이소폼은, 유사한 저장 조건에서 원형 단량체의 더 높은 백분율을 유지한다는 관점에서, 더 안정하다는 것이다.
[표 6A]
2-8℃에서 저장된 ddCC49 샘플에서 단량체의 백분율
Figure 112007056744018-PCT00008
[표 6B]
20-25℃에서 저장된 ddCC49 샘플에서 단량체의 백분율
Figure 112007056744018-PCT00009
[표 6C]
38-42℃에서 저장된 ddCC49 샘플에서 단량체의 백분율
Figure 112007056744018-PCT00010
실시예 6 : A형 및 B형의 분취 정제
IDEC-159(ddCC49)는 종양의 표면상에서 발현된 TAG-72 항원에 대해 유도된 CH2 도메인 결실된 단일클론 항체이다. IDEC-159는 A형 및 B형이라 칭하는 항체의 2가지 이소폼을 함유한다. IDEC-159를 위한 현재의 세포 배양 방법은 A형 대 B형의 비율을 거의 50:50의 비율으로 생성한다. A형 이소폼은 중쇄의 FC 부분에서 결실된 CH2 영역을 가진 항체이다. 결실된 CH2 영역을 가지는 것 이외에, B형은 또한 FC 영역을 가로지르는 이황화 결합이 결여되어 있고 단지 소수성 상호작용 및 염 브리지에 의해 함게 유지된다.
IDEC-159 정제 공정에서 제3 단계 및 최종 크로마토그래피 단계는 IDEC-159의 두 가지 이소폼을 분리하기 위해 개발되었다. 상기 분리는 페닐 TSK 겔 5PW-HR 흡착제를 이용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 이용하여 수행하였다. B형은 A형 보다 더 소수성이기 때문에, B형은 이동상으로서 거의 0.1 M 암모늄 설페이트 / 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 4.0 - pH 7.0을 이용하여 고정상에 비가역적으로 흡착된다. A형은 이들 조건 하에서 고정상에 더 적은 양으로 결합하며, 따라서 균등하게 용출된다. 즉, 유통 분획과 함께 컬럼을 이탈한다. A형의 균등한 용출 이후에, 이동상으로부터 암모늄 설페이트를 생략하면 B형이 탈착된다. 하기 방법을 이용하여 IDEC-159의 2개의 이소폼을 분리하였다.
· 컬럼은 ≤150 cm/hr에서 0.5 N NaOH의 ≥3 CV를 이용하여 살균하였다.
· 컬럼은 ≤150 cm/hr에서 0.73 M 암모늄 설페이트 / 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 4.0의 ≥5 CV를 이용하여 평형처리하였다.
· 컬럼은 수지 1 ml 당 5 mg으로 2.5 M 암모늄 설페이트 / 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 4.0 액체 스톡 용액 0.43 부피를 포함하도록 조정된 실온의 TMAE 유통으로 로딩하였다. 상기 항체는 ≤100 cm/hr로 pH 4.0에서 컬럼에 로딩하였다. 280 nm에서 배출구 O.D.가 10 mAU에 다다르면, 항체의 수집을 개시하였다.
· 컬럼은 ≤100 cm/hr에서 0.73 M 암모늄 설페이트 / 20 mM나트륨 포스페이트 pH 4.0의 15 CV를 이용하여 세척하였다. 15 CV 세척 내내 항체 수집을 계속하였으며, 이어서 배출구는 폐기 쪽으로 우회시켰다.
· 컬럼은 ≤100 cm/hr에서 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 4.0의 ≥5 CV를 이용하여 스트립핑하였다. 6. 컬럼은 ≤150 cm/hr에서 0.5 N NaOH의 ≥3 CV를 이용하여 세정하였다.
· 컬럼은 ≤150 cm/hr에서 0.73 M 암모늄 설페이트 / 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 4.0의 ≥3 CV를 이용하여 평형처리하였다.
· 컬럼은 ≤150 cm/hr에서 20% 에탄올의 ≥3 CV 내에 저장하였다.
분취 스케일(5 L 컬럼 부피, 총 IDEC-159 로드 거의 20 g)에서 상기 두 형태를 분리하였다. 두 개의 제1 피크는 A형의 균등한 용출을 포함하였고, 제2 피크는 용출된 B형을 나타낸 반면, 제3 피크는 세정 중 정지상으로부터 제거된 불순물을 함유하였다.
또한, 분취 스케일에서 A형 및 B형을 분리하는 상기 방법의 용량은 SDS PAGE로 입증하였다. 0.73 M 암모늄 설페이트 / 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 4.0(레인 6 내지 8)을 이용하여 균등하게 용출된 분획은 A형(순도 >90%)을 주로 함유하였다.
실시예 7 : 단일클론 항체 CC49의 인간화
CC49 항체에 대해 몇몇 변경을 가하여 인간화된 CC49 버젼 2(huCC49 V2)를 제조하였다. 인간화된 CC49 MAb의 잠재적인 면역원성을 추가로 감소시키기 위해, 상기 항체 내에 존재하는 뮤린 잔기를 조사하고, 경쇄 치환을 위한 인간 수용체 서열 LEN 및 중쇄 치환을 위한 21/28'CL로부터 유래한 인간 프레임워크 잔기로의 치환을 고려하였다(Singer II 등, 1993. Optimal Humanization of 1B4, an Anti-CD18 Murine Monoclonal Antibody, is Achieved by Correct Choice of Human V-Region Framework Sequences. J. Immunol. 150:2844-2857. Padlan E A, 1991. Possible Procedure For Reducing the Immunogenicity of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties. Molecular Immunol. 28:489-498).
연합 부위의 특이성 및 친화성을 보존하기 위해 중요한 것으로 생각되는 프레임워크 잔기는 사소한 차이만을 나타냈다. 중쇄 서열에서, 69번 위치(루신) 및 93번 위치(트레오닌)에서 예상된 매립 잔기는 둘 다 각각 인간 잔기 이소루신 및 알라닌으로 치환하였다. 경쇄 서열에서, 43번 위치(세린)에서 거의 매립된 것으로 예상되는 하나의 잔기는 인간 잔기 프롤린으로 치환하였다.
V2 CC49 항체의 도메인 결실된 형태를 제조하고, 연결 펩티드를 huCC49 V2 서열 내로 삽입하였다. G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] 힌지 연결 펩티드를 함유하는 CH2 도메인 결실된 huCC49 V2를 CH2 도메인 결실된 huCC49 V2와 같이 제조하였다.
실시예 8 : 신규 연결 펩티드를 포함하는 항체의 증강된 생분포 프로파일
도메인 결실된 항체(연결 펩티드를 보유하거나 보유하지 않음)의 여러 가지 형태는 Wallac 1420 Multilabel Counter Victor V (PerkinElmer)를 이용하는 시간 분석형 형광 면역 분석에 의해 소 하악 뮤신에 결합하는 그들의 능력, TAG-72 항체의 기원에 대해 경쟁 결합 분석에서 테스트하였다. HuCC49 PAP (서열 번호 32에 나타낸 연결 펩티드를 함유함), HuCC49 V2 PAP (서열 번호 32에 나타낸 연결 펩티드를 함유함), HuCC49 Gl/ G3:PAP (서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드를 함유함), HuCC49 V2 G1/G3/PAP (서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드를 함유함) 및 대조군 모 HuCC49 항체를 평가하였다. 모든 3개의 힌지 조작된 항체에 대한 상대적인 결합 활성은 구별이 불가능하였거나, 대조군 모 CC49 항체의 2-3배 내였다.
90Y-2-(p-이소티오시아나토벤질)(p-SCN-Bz)-시클로헥실디에틸렌트리아민펜타아세트산 리간드(CHx-DTPA) 접합된 HuCC49 V2 PAP (서열 번호 32에 나타낸 연결 펩티드를 함유함) 및 대조군 모 HuCC49 항체의 생분포를 LS-174T 인간 종양 이종이식편을 함유하는 무흉선 마우스에서 평가하고 비교하였다. 종양 또는 정상 조직 1 g당 90Y 방사능 표지된 항체의 주입 투여량 백분율(%ID)는 3 시간 및 24 시간에서 측정하였으며, 측정 결과는 하기 표 7에 나타냈다.
[표 7]
Figure 112007056744018-PCT00011
수치는 평균값 ± 표준 편차를 나타낸다.
* p<0.05 종양에서 24 시간 시점 HuCC49와 비교한 언페어드 티 테스트(unparied t test)
** p<O.OOl 신장에서 24 시간 시점 HuCC49와 비교한 언페어드 티 테스트
놀랍게도, 24 시간에서, HuCC49 V2 PAP 흡수는 종양에서 유의적으로 더 높았으며(p<0.05 언페어드 t 테스트), 반대로, 대조군 HuCC49 항체보다 신장에서 더 낮았다(p<0.01). 이들 항체에 대한 종양 대 장기 비율을 비교하는 경우, HuCC49 V2 PAP는 혈액을 제외하고 모든 장기의 경우 더 높은 종양 대 장기 비율을 나타냈다.
이들 결과는, 이들 신규한 힌지가 종양 국소화를 긍정적으로 수행하고 정상 장기, 예를 들어 신장에 의한 흡수를 감소시키는 항체에 대한 구조적인 변화를 부여함을 의미한다. 따라서, 이들 신규 힌지는 치료 항체에 혼입되는 경우 특히 유용하다.
실시예 9 : 신규 연결 펩티드를 포함하는 항체의 증강된 생분포 프로파일: 상세 타임 코스
본 실시예는 실시예 8에서 제시된 결과를 확인하고 확장하기 위한 것이다. 항체 인간 CC49 V2 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser](서열 번호 5) 및 HuCC49 (gly/ser)를 정용여과하고 미리 세정된 아미콘 센트리콘 30을 이용하여 저 금속 5 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 5(LMB)으로 농축하였다. 상기 센트리콘의 원심분리는 2-8℃의 온도에서 유지되는 5000 x g에서 고정각 로터로 수행하였다. 각각의 항체는 샘플 용기에 LMB 50 ㎕를 첨가하고, 약식 볼텍싱하고, 1000 x g에서 10분 동안 역스피닝하여 회수하였다. 단백질 농축은 감광 계수 1.48을 이용하는 280 nm에서 UV Spec 분석으로 측정하였다. 이어서, 각각의 항체는 LMB를 이용하여 10.5 mg/ml로 하향 조정하였다.
항체는 1.0 M 붕산(pH 8.6 킬렉스 처리함 및 0.2 ㎛ 여과함)을 이용하여 ~pH 8.6으로 조정하였다. 이어서, CHx-DTPA(1.0 M 붕산에 용해함)를 3 킬레이트 대 1 몰 항체의 몰비로 첨가하였다. 첨가된 붕산의 양은 항체 부피의 1/10이었다. 이어서, 이 혼합물을 볼텍싱하고, 실온에서 16-18 시간 동안 항온처리하였다. 반응은 상기 혼합물을 새로운 미리 세정된 센트리콘 30에 첨가함으로써 정지시키고, 상기 정용여과와 같은 방법으로 저 금속 5 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM 염화나트륨 pH로 정용여과하였다. 각각의 항체의 농도는 3 mg/ml로 조정하였다.
암컷 누드 마우스는 우측 대퇴부 내에 HBSS(Biowhittaker, Cat# 10-547F) 내에 현탁된 LS174T 세포를 피하(s.c.) 접종하였다. 종양 크기는 연구를 개시하기 하루 전에 측정하였다. 종양 부피는 길이(L) x 폭(W)의 제곱의 1/2[L x ((W2)/2)]와 같은 수학식으로 계산하였다. 마우스는 평균 종양 부피가 ~200 mm3을 갖도록 분류하였다.
0시에, 42 마리의 누드 마우스에게 111In-표지된 CH2 도메인 결실된 항체를 주사하였다. 본 연구는 7개의 시점으로 이루어진 코스에 걸쳐 항체의 분포를 추적하는 것인데, 각각의 시점은 6마리의 마우스로 구성되어 있다. 찢은 웨이 페이퍼 상에 마우스가 위치하도록 마우스를 잡고 방광에 압력을 가하여 각각의 마우스로부터 오줌을 수집하였다. 혈액은 "아이 블리드(eye bleed)" (마우스 당 거의 200 ㎕)로 채취하였다. 각각의 개별 마우스에서, 혈액 및 오줌 샘플링 중 배설된 임의의 배설물을 수집하였다. 혈액 수집 후, 마우스는 경추를 탈골시켜 희생시켰다. 일단 6 마리의 마우스 각각을 희생시키고, 다른 샘플은 절개하여 수집하였다. 각각의 샘플(피부는 제외함)은 3% 포르말린으로 세정하고, 종이 타월 상에서 건조시키고, 중량을 측정하였다. 모든 샘플은 찢은 웨이 페이퍼를 이용하여 중량을 측정하였다.
샘플 수집 후, 샘플을 보로실리케이트 테스트 튜브 내에 위치시키고, 표지된 항체의 1:10 희석액으로 이루어진 붕괴 대조군과 함께 감마 계수기 상에서 계수하였다. 붕괴 대조군에 대해 각각의 장기 또는 조직과 관련된 %방사능활성(%주입 투여량/g 조직 또는 장기)을 계산하였다. 본 실시예를 통해 상기 신규한 결합 펩티드를 포함하는 항체 분자가 신장에서 감소된 축적을 나타내고, 혈액에서 약간 증가된 축적을 나타내며, 종양에서 현저하게 증가된 축적을 나타내는 것으로 확인되었다. 이 프로파일은, 이들 분자가 생체 내에서 증가된 안정성을 보유하며, 증강된 효용성과 안전성을 보유하는 것과 일치하는 것이다.
실시예 10 : 환원제에 대한 감소된 민감성을 갖는 연결 펩티드를 포함하는 항체
본 실시예는 도메인 결실된 CC49 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호 5)가 Gly-Ser 힌지 링커를 가진 도메인 결실된 CC49보다 모 CC49에서와 같이 더 안정한 순방향 글루타치온(GSH) 환원을 나타냄을 입증한다.
개략적으로, ddCC49(Gly-Ser), ddCC49 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호 5) 또는 모 CC49 50 ㎍은 실온에서 1 시간 동안 0, 1, 5 또는 10 mM GSH와 함께 항온처리하였다. 사용된 반응 완충액은 100 mM PBS, pH 7.2 또는 100 mM 나트륨 아세테이트, 100 mM NaCl, pH 4.5를 포함하였다. GSH-처리된 항체는 SDS와 함께 가열하고, 4-20% 구배의 SDS-PAGE, 비환원 겔 내에 적용하였다. 적용된 샘플은 실온에서 90분 동안 일정한 120 볼트에서 상기 겔을 통해 이동하도록 하였다. 단백질은 쿠마지 염색하고 겔은 건조하였다.
도메인 결실된 CC49 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호5)은 Gly-Ser 힌지 링커를 가진 도메인 결실된 CC49보다 모 CC49에서와 같이 더 안정한 순방향 글루타치온(GSH) 환원을 나타냈다. 추가로, pH 4.5에서 100 mM 나트륨 아세테이트는 pH 7.2에서 100 mM PBS에 비해 GSH 환원으로부터 도메인 결실된 CC49 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser](서열 번호 5)를 추가로 보호하였다. 환원제에 대한 감소된 민감성에 대한 이 예상치 못한 관찰은, G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호 5) 힌지 디자인이 약물 접합체(예를 들어, SPDP 링커) 또는 항체에 방사성 동위원소를 부착하기 위한 기법(예를 들어, 99MTc)과 같은 환원제를 이용하는 화학기법의 사용을 가능하게 하는 한편, 항체의 물리적 완전성을 유지시킬 수 있음을 의미하는 것이다. 환원제 민감성에 대한 이러한 이점이 CH2 도메인 결실된 구성물의 약동학적 이점을 변경시킬 것으로는 생각되지 않는다(실시예 9의 마우스 생분포 데이타를 참조할 것). 또한, 환원제에 대한 상기한 바와 같은 감소된 민감성은 증가된 생체내 안정성의 전조일 수 있다.
실시예 11 : 연결 펩티드를 포함하는 항 CD20 항체
힌지 영역 연결 펩티드 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호 5)는 실시예 3에 기재된 바와 같은 CH2 도메인 결실된 C2B8 항체 내로 도입하였다. C2B8은 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 각각에 융합된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 키메라 항 CD20 단일클론 항체이다. 상기 힌지 영역에 대한 올바른 변경은 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 플라스미드 DNA를 이용하여 항체 단백질의 일시적인 생성을 위해 CHO DG44 세포를 형질전환하였다.
G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] 연결 펩티드를 함유하는 CH2 도메인 결실된 C2B8 항체를 생성하는 세포로부터 상청액을 수집하고, 배양 상청액 내의 항체 농도를 면역 분석법으로 측정하였다. 일시적인 세포 배양물 유래의 총 항체 단백질 약 3 ng 은 비환원 SDS-PAGE 전기영동에 의해 CH2 도메인 결실된 huCC49 MAb와 비교하였고, 이어서 항 인간 IgG HRP 접합된 항체와의 웨스턴 블롯으로 CH2 도메인 결실된 huCC49 A형 및 B형 이소폼을 검출하였다. 이들 조건 하에서, A형은 단일 120 kDa 단독이량체로서 이동하였고, B형은 60 kDa 이중체로서 이동하였다. 서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드의 혼입은 생성된 A형의 비율을 실질적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] hinge (서열 번호 5)가 검출 가능한 B형이 없거나 거의 없이 본질적으로 모든 A형 CH2 도메인 결실된 C2B8 항체의 생성을 유도하였으며, 이는 A형 이소폼을 생성하기 위한 상기 힌지의 유용성은 여러 가지 특이성의 항체에 일반적으로 적용될 수 있음을 입증하는 것이다.
실시예 12 : 연결 펩티드를 포함하는 항 CD23 항체
힌지 영역 연결 펩티드 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호 5)를 이용하여 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같은 CH2 도메인 결실된 5E8 (5E8ΔCH2) 항체를 구성하였다. 5E8은 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 각각 융합된 영장류 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 구성된 키메라 항 CD23 단일클론 항체이다. 힌지 영역에 대한 올바른 변경은 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 5E8 경쇄 및 중쇄의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 플라스미드 DNA를 이용하여 항체 단백질의 생성을 위해 CHO DG44 세포를 형질전환하였다.
5E8ΔCH2 항체 서열 내에 도입된 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호5) 연결 펩티드를 함유하는 세포주(1A7)를 이용하여 항체를 생성하였다. 항체는 상기 실시예 4에 기재된 방법을 이용하여 생성하고 정제하였다. 단지 단백질 G 컬럼만을 이용하여 정제된 5E8ΔCH2 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 항체는 추가의 HIC 정제 없이 ≥97% 순도에서 본질적으로 단일 피크로 용출되었다. 환원 및 비환원되고 정제된 단백질 샘플은 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다. 비환원 조건 하에서, A형은 단일 120 kDa 단독이량체로 이동할 것으로 예상되고, B형은 60 kDa 이중체로 이동할 것으로 예상된다. 서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드는 생성된 A형의 비율을 실질적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. 이 결과로부터, G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] 힌지 (서열 번호 5)는 검출 가능한 B형 없이 또는 거의 없이 본질적으로 모든 A형 5E8ΔCH2 항체의 생성을 유도하였는데, 이는 A형 이소폼을 생성하기 위한 상기 힌지의 유용성이 여러 가지 특이성의 항체에 일반적으로 적용될 수 있음을 입증하는 것이다. 5E8ΔCH2 G1/G3/Pro243 Ala244Pro245 항체는 크기 배제 크로마토그래피로 조사하여 단일 피크로 용출됨을 확인하였는데, 이는 항체 생성물의 유의적인 집합이나 분해가 없음을 의미하는 것이다. 5E8ΔCH2 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 항체는 델피아 형광계(Wallac 1420 Multilabel Counter Victor V, PerkinElmer)를 이용하여 Eu-표지된 5E8 IgG에 결합하는 Cy5 표지된 가용성 CD23에 대한 FRET(형광 공명 에너지 전달) 경쟁 결합 분석으로 테스트하였다. 5E8ΔCH2 G1/G3/Pro243Ala244Pro245(서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드를 함유함) 및 대조군 모 5E8 IgG 항체는 경쟁 결합 분석으로 평가하였다. 상기 힌지 조작된 항체의 상대적인 결합 활성은 대조군 모 5E8 IgG 항체와 구별할 수 없었다. 이들 결과로부터, 5E8ΔCH2 항체 내 힌지 영역(서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드를 함유함)의 도입은 완전한 결합 활성을 유지하면서 A 이소폼의 우선적인 합성을 유도하였는데, 이는 상기 조작된 힌지의 일반적인 유용성을 지지하는 것이다.
실시예 13 : 연결 펩티드를 포함하는 chB3F6 항체
힌지 영역 연결 펩티드 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호 5)를 이용하여 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같은 CH2 도메인 결실된 키메라 B3F6 (chB3F6ΔCH2) 항체를 구성하였다. "chB3F6"은 각각 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 융합된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 구성된 키메라 항크립토 단일클론 항체이다. 상기 힌지 영역에 대한 올바른 변경은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. chB3F6 경쇄 및 중쇄의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 도 1 및 도 2에 도시한 아크 내에 나타냈다. 플라스미드 DNA를 이용하여 항체 단백질의 생성을 위한 CHO DG44 세포를 형질전환시켰다.
chB3F6ΔCH2 항체 서열 내에 도입된 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] (서열 번호 5) 연결 펩티드를 함유하는 세포주(3C7)를 이용하여 항체를 생성하였다. 항체는 상기 실시예 4에 기재된 방법을 이용하여 생성하고 정제하였다. 단지 단백질 G 컬럼을 이용하여 정제된 chB3F6ΔCH2 G1/G3/Pro243Ala244Pro245 항체는 추가의 HIC 정제 없이 97% 순도에서 본질적으로 단일 피크로 용출되었다. 환원 및 비환원되고 정제된 단백질 샘플은 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다. 비환원 조건 하에서, A형은 단일 120 kDa 단독이량체로 이동할 것으로 예상되고, B형은 60 kDa 이중체로 이동할 것으로 예상된다. 서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드는 생성된 A형의 비율을 실질적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. 이 결과로부터, G1/G3/Pro243Ala244Pro245 + [Gly/Ser] 힌지 (서열 번호 5)는 검출 가능한 B형 없이 또는 거의 없이 본질적으로 모든 A형 chB3F6ΔCH2 항체의 생성을 유도하였는데, 이는 A형 이소폼을 생성하기 위한 상기 힌지의 유용성이 여러 가지 특이성의 항체에 일반적으로 적용될 수 있음을 입증하는 것이다. chB3F6ΔCH2 G1/G3/Pro243 Ala244Pro245 항체는 크기 배제 크로마토그래피로 조사하여 93%-98% 범위의 단일 피크로 용출됨을 확인하였는데, 이는 항체 생성물의 유의적인 집합이나 분해가 없음을 의미하는 것이다. chB3F6ΔCH2 G1/G3/Pro243 Ala244Pro245 항체는 GEO 종양 세포, 크립토 항원의 기원에 결합하는 FITC-표지된 B3F6 IgG를 이용하여 유동 혈구계측 경쟁 결합 분석법으로 추가로 테스트하였다. chB3F6ΔCH2 G1/G3/Pro243 Ala244Pro245(서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드를 함유함) 및 chB3F6 IgG 항체의 2개의 대조군 샘플의 경쟁 결합을 평가하였다. 힌지 조작된 항체의 상대적인 결합 활성은 대조군 모 chB3F6 IgG 항체와 구별할 수 없었다. 이들 결과로부터 명백한 것은, chB3F6ΔCH2 항체 내 힌지 영역(서열 번호 5에 나타낸 연결 펩티드를 함유함)의 도입은 완전한 결합 활성을 유지하면서 A 이소폼의 우선적인 합성을 유도하였고, 이는 추가로 조작된 힌지의 일반적인 유용성을 지지하는 것이다.
실시예 14 : B3F6 항크립토 항체의 인간화 형의 제조
B3F6 항체의 가변 영역의 서열을 결정하였다. 뮤린 B3F6 항체의 경쇄 가변 영역의 서열은 다음과 같다:
(서열 번호 39)
Figure 112007056744018-PCT00012
뮤린 B3F6 항체의 중쇄 가변 영역의 서열은 다음과 같다:
(서열 번호 40)
Figure 112007056744018-PCT00013
이들 각각의 서열에 있어서, CDR 잔기는 밑줄로 나타냈고, 정규 잔기는 소문자로 표기하였으며, 드문 정규 잔기는 굵은 이탤릭 소문자로 표기하였다.
상보성 결정 영역(CDR)은 정규 클래스로 분류하였다. CDR은 대부분(가장) 항원을 결합할 것으로 생각되는 잔기를 함유하고 재형성된 항체 내에 보유되어야 한다. CDR은 Kabat 등에 따른 서열에 의해 정해진다(Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S. 및 Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5 Edition, U.S. Dept. Health 및 Human Services. U.S. Govt. Printing Office). CDR은 정규 클래스에 속한다(Chothia, C, Lesk, A.M., Tramontano, A., Levitt, M., Smith-Gill, S.J., Air, G., Sheriff, S., Padlan, E.A., Davies, D., Tulip, W.R., Colman, P.M., Spinelli, S., Alzari, P.M. 및 Poljak, RJ. (1989) Nature 342:877-883). 중요 잔기들이 CDR 루프의 구조적인 형태의 큰 범위를 결정하는 경우, 상기 잔기들은 거의 항상 재형성된 항체 내에 존재한다. 중쇄 및 경쇄의 CDR은 다음과 같이 정규 클래스로 분류하였다.
경쇄 중쇄
L1: 16 잔기 클래스 4 H1: 5 잔기 클래스 1
L2: 7 잔기 클래스 1 H2: 17 잔기 클래스 2
L3: 9 잔기 클래스 1 H3: 10 잔기 정규 클래스 없음
이들 클래스에 있어서 중요한 정규 잔기는 하기 표 8에 나타냈다. 루프 L1은 2 위치에서 F를 보유하는 반면, 정규 잔기는 V/I이다. 루프 H2는 71 위치에서 V를 보유하는 반면, 정규 잔기는 A/T/L이다(V는 H2 클래스 1에 있어서 정규 잔기임).
[표 8]
L1 클래스 4 2(V,I) 25(S) 27b(I,L) 33(L) 71(F)
L2 클래스 1 48(I) 51(A,T) 52(S,T) 64(G)
L3 클래스 1 90(Q,N,H) 95(P)
H1 클래스 1 24(A,V,G), 26(G), 27(F,Y), 29(F), 34(M,W,I), 94(R,K)
H2 클래스 2 52a(P,T,A) 55(G,S) 71(A,T,L)
H3 정규 클래스 없음
가변 경쇄 및 중쇄는 FASTA 프로그램 및 공통 서열 데이타베이스를 이용하여 마우스 및 인간 서브그룹(Kabat 등, 1991)에 대해 공통 서열을 비교하였다. 가변 경쇄는 113 aa 오버랩에서 92.9% 동일성을 가진 마우스 카파 2의 멤버로 확인되었다. 배열은 다음과 같다:
마우스 서브그룹 카파 2 공통 서열에 대한 B3F6 경쇄의 배열
Figure 112007056744018-PCT00014
가변 중쇄는 128 aa 오버랩에서 80.5% 동일성을 가진 마우스 서브그룹 2B의 멤버인 것으로 확인되었다. 배열은 다음과 같다:
마우스 서브그룹 2B 공통 서열에 대한 B3F6 중쇄의 배열
Figure 112007056744018-PCT00015
가변 경쇄는 114 aa 오버랩에서 76.3% 동일성을 가진 인간 서브그룹 카파 2에 상응한다. 배열은 다음과 같다:
인간 서브그룹 카파 2 공통 서열에 대한 B3F6 경쇄의 배열
Figure 112007056744018-PCT00016
가변 중쇄는 129 aa 오버랩에서 65.1% 동일성을 가진 인간 서브그룹 1에 상응한다. 배열은 다음과 같다:
인간 서브그룹 1 공통 서열에 대한 B3F6 중쇄의 배열
Figure 112007056744018-PCT00017
한 인간화 디자인에서, 항원 유래의 결합 펩티드와 복합체를 형성한 B3F6의 x레이 구조를 사용하였다. 가장 유사한 인간 발현 항체 서열은 항체 프레임워크로서 이용하기 위해 선택하였다. 가장 가까운 발현 서열을 확인하기 위해, NCBI NR 데이타베이스 및 카뱃 데이타베이스에서 가장 상동성인 발현된 인간 프레임워크를 조사하였다. 중쇄 및 경쇄 서열을 위해 2회의 조사(CDR 차폐 및 비차폐)를 수행하였다. 가장 적합한 발현된 서열의 선택은 정규 잔기 및 계면 잔기의 서열 동일성에 대한 조사뿐만 아니라 CDR 루프 길이에 있어서의 유사성에 대한 조사를 포함한다. 또한, 상기 항체의 기원은 결정 인자이다. 이전에 인간화된 항체는 배제하였다. NCBI NR 데이타베이스 조사를 위해, 본 발명자들은 BLAST를 이용하였고, 카뱃 데이타베이스 조사를 위해 FASTA를 사용하였다.
가장 적합한 발현된 경쇄는 nr 데이타베이스(gi-21669417 (BAC01733); Akahori 등 (비공개, NCBI 웹사이트 참조))에서 확인하였는데, 조직, 편도, 탯줄, 말초 혈액 및 골수의 혼합물 유래의 분리된 항체로부터 유래하였다. 배열은 다음과 같다:
B3F6 경쇄와 인간 gi-21669417(BAC01733) 사이의 배열
Figure 112007056744018-PCT00018
가장 적합한 중쇄는 nr 데이타베이스(gi-14289106 (AAK57792); Salcedo 등 (2002))에서 확인하였는데, 양성 림프증식에서 B 림프구의 폴리클로날 세트로부터 유래하였다. 배열은 다음과 같다:
B3F6 중쇄와 인간 gi-14289106 사이의 배열
Figure 112007056744018-PCT00019
인간 발현된 서열 둘 다는 NCBI에서 배선 서열의 데이타베이스에 대해 조사하였고, 이는 다음과 같은 선택된 배선에서의 결과였다: 경쇄(BAC01733)의 경우 A3*/A19* 및 중쇄(AAK57792)의 경우 VH1-2*.
선택된 인간 프레임워크 잔기는 상응하는 마우스 잔기로의 역돌연변이를 위해 선택하였다. 결합 부위에 가까운 드문 뮤린 잔기, 계면 팩킹 잔기 및 유지 정규 잔기가 바람직하다. 또한, CDR 잔기 중 임의 잔기의 6Å 내의 잔기는 CDR의 형태에 대한 잠재적인 영향에 대해 심층 분석하였다.
인간화된 B3F6 경쇄의 한 버젼에서, 2 위치에서의 V는 F로 변경하였다. 이 위치에서의 아미노산은 중요한 것으로 확인되었는데, 그 이유는 상기 위치의 아미노산이 L93(CDR-L3)과 반응하기 때문이다. 이 CDR은 항원 유래의 펩티드를 결합하는데 관여한다.
상기 방법을 이용하여 경쇄의 한 버젼을 제조하였다:
경쇄 버젼 L1(1 역돌연변이)
(서열 번호 47)
Figure 112007056744018-PCT00020
하기 아미노산 잔기는 인간화된 B3F6 중쇄 내에서 잠재적인 역돌연변이를 위해 선택하였다: 48번 위치의 M, 67번 위치의 V, 71번 위치의 R, 73번 위치의 T, 93번 위치의 A 및 112번 위치의 C.
48번 위치의 M은 CDR-H2에 근접하나, 펩티드 항원에는 근접하지 않는 것으로 결정되었다. 이는 인간화된 중쇄의 한 버젼 내에 유지되었고, 다른 버젼에서 I로 역돌연변이되었다.
67번 위치의 V는 CDR-H2에 근접하나, 펩티드 항원에는 근접하지 않는 것으로 결정되었다. 이는 인간화된 중쇄의 한 버젼 내에 유지되었고, 다른 버젼에서 A로 역돌연변이되었다.
71번 위치의 T는 정규 잔기로 결정되었다. 이는 버젼 둘 다에서 V로 역돌연변이되었다.
73번 위치의 T는 CDR-H2에 근접하나, 펩티드 항원에는 근접하지 않는 것으로 결정되었다. 이는 인간화된 중쇄의 한 버젼 내에 유지되었고, 다른 버젼에서 K로 역돌연변이되었다.
93번 위치의 A는 명백한 측쇄 접촉이 없는 계면 잔기로 결정되었다. 이는 인간화된 중쇄의 한 버젼 내에 유지되었고, 다른 버젼에서 S로 역돌연변이되었다.
112번 위치의 C는 드문 인간 잔기로 결정되었다. 이는 버젼 둘 다에서 S로 역돌연변이되었다.
상기 방법을 이용하여 중쇄의 두 버젼을 제조하였다:
중쇄 V 버젼 H1(6 역돌연변이)
(서열 번호 48)
Figure 112007056744018-PCT00021
버젼 H2(2 역돌연변이)
(서열 번호 49)
Figure 112007056744018-PCT00022
실시예 15 : B3F6 항크립토 항체의 추가의 인간화된 형태의 제조
지식 기반 방법(다른 인간화된 항체의 데이타베이스를 서치하여 용인되는 서열 변화를 결정하는 방법)을 이용하여, 2번 위치 및 100번 위치의 역돌연변이를 포함하는 경쇄의 다른 버젼을 제조하였다.
인간화 전략은 문헌(Rosok MJ 등, 1996. J. Biol. Chem. 271 : 22611-22618)에 기재되어 있는 방법에 따라 V 영역 서열의 육안 검사 및 분석에 기초하였다. 정규 결정기, 표면 잔기 및 잠재적인 접촉 잔기를 확인하였다. 잠재적인 접촉 잔기는 표시하였고, 문헌(Chothia C 및 Lesk AM. 1987. J. MoI. Biol. 196: 901-917)에 정의된 바와 같이 CDR 루프의 구조 한정, 문헌(Kabat EA, Wu TT, Reid-Miller M, Parry HM, 및 Gottesman KS. 1987. Sequences of Protein of Immunological Interest, U.S. department of Health 및 Human Services, NIH, Bethesda, MD)에 정의된 바와 같은 서열 초가변성 및 문헌(MacCallum RM, Martin ACR, 및 Thorton JM. 1996. J. MoI. Biol. 262: 732-745)에 정의된 바와 같은 잠재적인 항원 접촉 잔기의 구조 한정에 따라 광범위하게 분류하였다. 카뱃 번호화 및 정의에 따라 뮤린 CDR 루프는 온전한 상태로 수용체 인간 프레임워크 상에 그라프팅하였다. 문헌(Padlan EA. 1991. MoI Immunol. 28: 489-498)에 정의된 바와 같은 팩킹 잔기를 확인하였는데, 이 시도는 문헌(Singer II 등, 1993. J. Immunol. 150: 2844-2857)에 기재된 전략과 일치하는 팩킹 잔기를 보존하게 위해 이루어진 것이다. 프레임워크 서열 내 각각의 잔기는 문헌(Harris L 및 Bajorath J. 1995. Protein Science 4: 306-310)에 기재된 바와 같이 항체 인간화에 대해 저, 중 또는 고 "위험 위치"에 할당하였다.
일반적으로, 저 위험 위치는 인간에서 유지되었다. 다수의 동일하지 않은 중간 및 고 위험 아미노산 위치의 경우, 인간화된 항체의 수집을 참조하였고, 인간 또는 뮤린 (역돌연변이) 아미노산 잔기의 포함이 기능적인 반응 활성으로 귀착되는지 여부를 고려하였다. 치환이 고려되는 이들 경우에 있어서, 아미노산 치환 지도(D. Bordo 및 P. Argos. 1991. J. MoI. Biol. 217: 721-729)로 상기 잔기의 기능적인 상호교환가능성을 확인하였다.
상기 방법을 이용하여, 경쇄의 한 버젼을 제조하였다. 상기 경쇄의 서열은 다음과 같다:
경쇄 버젼 L2:
(서열 번호 50)
Figure 112007056744018-PCT00023
그리고, 1번, 48번, 71번, 81번, 82b번 및 112번 위치에 역돌연변이를 포함하는 중쇄의 다른 버젼을 제조하였다.
상기 방법을 이용하여 중쇄의 다른 버젼을 제조하였다. 상기 중쇄의 서열은 다음과 같다:
중쇄 버젼 H3:
(서열 번호 51)
Figure 112007056744018-PCT00024
CDR 그라프팅된 인간화 B3F6 서열의 주석이 기록된 버젼 및 역돌연변이를 포함하는 주석이 기록된 버젼은 경쇄의 경우 도 5에 나타냈으며, 중쇄의 도 6에 나타냈다. 또한, 역돌연변이가 이루어진 위치의 카뱃 번호화도 나타냈다.
실시예 16 : 전장 인간화 B3F6 항크립토 항체의 제조
6개의 인간화 전장 B3F6 항체 및 6개의 인간화 도메인 결실된 B3F6 항체는 다음과 같은 인간화 중쇄 및 경쇄 조합으로 제조하였다:
전장 버젼 1 - 인간화(hu) B3F6 경쇄 버젼 L1/중쇄 버젼 H1(L1/H1)
전장 버젼 2 - huB3F6 L1/H2
전장 버젼 3 - huB3F6 L1/H3
전장 버젼 4 - huB3F6 L2/H1
전장 버젼 5 - huB3F6 L2/H2
전장 버젼 6 - huB3F6 L2/H3
전장 항체 분자를 제조하기 위해 사용한 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 도 7에 나타냈다.
CDR 그라프팅된 B3F6 경쇄 및 버젼 L1 및 L2의 완전 아미노산 서열은 다음과 같다:
CDR 그라프팅된 B3F6 경쇄
(서열 번호 52)
Figure 112007056744018-PCT00025
huB3F6 L1
(서열 번호 53)
Figure 112007056744018-PCT00026
huB3F6 L2
(서열 번호 54)
Figure 112007056744018-PCT00027
제조된 전장 항체를 위한 CDR 그라프팅된 B3F6 중쇄 및 버젼 H1, H2 및 H3의 완전 아미노산 서열은 다음과 같다:
CDR 그라프팅된 전장 B3F6 중쇄
(서열 번호 55)
Figure 112007056744018-PCT00028
huB3F6 H1
(서열 번호 56)
Figure 112007056744018-PCT00029
huB3F6 H2
(서열 번호 57)
Figure 112007056744018-PCT00030
huB3F6 H3
(서열 번호 58)
Figure 112007056744018-PCT00031
안정한 벌크 배양물로부터, 전장 버젼 2 인간화된 항체(버젼 1 경쇄 및 버젼 2 중쇄를 포함함)는 최고량의 항체를 생성하였고, 모 마우스 항체에 필적할만한 결합 친화성을 보유하였다.
실시예 17 : 도메인 결실된 인간화된 B3F6 항크립토 항체의 제조
6개의 인간화 CH2 도메인 결실된 B3F6 항체는 다음과 같은 인간화 중쇄 및 경쇄 조합을 보유하도록 제조하였다:
도메인 결실된(dd) 버젼 1 - 인간화된 도메인 결실된 B3F6 경쇄 버젼 1/중쇄 버젼 1(L1/H1)
dd 버젼 2 - huddB3F6L1/H2
dd 버젼 3 - huddB3F6L1/H3
dd 버젼 4 - huddB3F6L1/H1
dd 버젼 5 - huddB3F6L1/H2
dd 버젼 6 - huddB3F6L1/H3
상기 도메인 결실된 항체 분자를 제조하기 위해 사용한 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 도 7에 나타냈다.
도메인 결실된 항체를 제조하기 위해 사용된 CDR 그라프팅된 B3F6 경쇄 및 경쇄 버젼 L1 및 L2의 완전 아미노산 서열은 다음과 같다:
CDR 그라프팅된 B3F6 경쇄
(서열 번호 52)
Figure 112007056744018-PCT00032
huB3F6 Ll
(서열 번호 53)
Figure 112007056744018-PCT00033
huB3F6 L2
(서열 번호 54)
Figure 112007056744018-PCT00034
도메인 결실된 항체를 제조하기 위해 사용된 CDR 그라프팅된 B3F6 중쇄 및 버젼 Hl, H2 및 H3의 완전 아미노산 서열은 다음과 같다:
CDR 그라프팅된 CH2 도메인 결실된 B3F6 중쇄
(서열 번호 59)
Figure 112007056744018-PCT00035
huB3F6 Hl
(서열 번호 60)
Figure 112007056744018-PCT00036
huB3F6 H2
(서열 번호 61)
Figure 112007056744018-PCT00037
huB3F6 H3
(서열 번호 62)
Figure 112007056744018-PCT00038
상기 도메인 결실된 항체(CDR 그라프팅된 항체는 포함하지 않음)의 6개의 버젼의 결합 활성을 테스트하였다. 개략적으로, GEO 인간 결장 아데노암종 세포를 DMEM, 2 mM 글루타민이 첨가된 10% FBS, 0.5 mM 나트륨 피루베이트, 페니실린/스트렙토마이신 및 비필수 아미노산 중에서 성장시켰다. 세포는 PBS, 20 mM EDTA를 이용하여 플라스크로부터 제거하고, 1200 rpm에서 3분 동안 원심분리하고, PBS, 0.02% 아지드, 0.1% BSA 중에 재현탁시켰다. 폴리프로필렌 V-바닥 플라스크 내에서 여러 가지 농도의 인간화된 항체 또는 키메라 항체와 최종 농도 5 nM 뮤린 B3F6과 혼합하였다. 1백만개의 GEO 세포를 각각의 플레이트에 첨가하고, 상기 세포는 4℃에서 2 시간 동안 항체와 함께 항온처리하였다. 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하고, 항 뮤린 IgG 피코에리트린 접합체의 1:500 희석액과 함께 4℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 한번 더 세척하고, 3% 포름알데히드 내에 고정하고, FACS칼리버 기구를 이용하여 측정하였다. 평균 형광 세기(MFI)는 인간화된 항체 농도 또는 키메라 항체 농도에 대해 플롯하였다. IC50은 4 파라미터 고정으로 결정하였다. 각각의 실험에서, 각각의 인간화된 항체에 대한 IC50은 그 실험에서의 키메라 항체와 비교하였다. 결과는 하기 표 9에 나타냈다.
[표 9]
항체 IC50(nM)
키메라 dd-B3F6(실험 1) 23
dd-B3F6 버젼 1 21
dd-B3F6 버젼 2 26
키메라 dd-B3F6(실험 2) 15
dd-B3F6 버젼 3 63
dd-B3F6 버젼 4 18
dd-B3F6 버젼 5 32
dd-B3F6 버젼 6 43
실시예 18 : 생체내 모델에서 독소에 접합된 인간화된 B3F6 항체는 인간 유방암 세포의 정상을 억제하는데 효과적이다.
본 실시예에서는 다음과 같은 실험 재료 및 방법을 이용하였다:
마우스
백사십(140) 마리의 10주령 무흉선 암컷 누드 마우스(Harlan Sprague Dawley, Madison, WI)를 본 연구에 이용하였다. 동물들은 종양을 이식하기 이전의 적어도 5일 동안 실험실 환경에 순응시켰다. 동물들은 통풍이 잘 되는 케이지 랙에서 유지하였으며, 사료와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
종양 모델
BT-474 종양은 Biogen Idec에서 확립한 정기적으로 계대배양한 생체 내 공여주(cryo reg #0141, 미국 모식균 배양 수집소(ATCC; Manassas, VA)에서 최초로 확립함)에서 유래한 냉동보존된 고형 종양 단편으로부터 얻었다. 종양 단편은 냉동보존으로부터 제거하고, 본 연구를 위한 이식 이전에 무흉선 암컷 누드 마우스에서 3세대 동안 정기적으로 피하 계대배양하였다. 박테리아 배양은 상기 마우스 내로 이식한 종양 조직의 샘플에 대해 수행하였다. 박테리아 배양물은 이식 24 시간 및 48 시간 후에 박테리아 감염에 대해 음성이었다.
1일째, 상기 마우스는 좌측 옆구리에 바이오메딕스 동물 ID 칩(모델 IMI-1000; Seaford, DE)을 피하 이식하였다. 0일째, 8마리의 공여 동물 유래의 종양을 수거하고, 괴사 조직을 제거하고, 잘게 썰어 다지고, BT-474 종양의 3 mm3 단편을 각각의 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하 이식하였다. 5일째부터 적어도 주 2회 이상 종양 크기 및 체중을 측정하여 기록하였다. 종양이 최소 100 mg이 된 경우(15일), 비진행성으로 성장하는 종양을 배제하고 종양 크기에 기초하여 마우스를 처리군과 대조군으로 무작위 분류하였다(표 10 참조).
[표 10]
대조군 및 테스트 처리 군
Figure 112007056744018-PCT00039
a 정맥 내, b 복강 내
테스트 물질 및 양성 화학치료제
마이탄신 DM4 접합물(2000-79 3.5 D/A, 6 mg/ml 및 2000-79, 3.3 D/A, 5.5 mg/ml)은 ImmunoGen의 종양 활성화된 프로드러그(TAP) 기술을 이용하여 ImmunoGen, Inc(Cambridge, MA)에서 제조하였다. 모든 실험에서, B3F6 항체는 항체 당 평균 3-4 DM4 분자와 접합시켰다. DM4 전달된 양의 예로서, 평균 3 DM4/mAb인 B3F6-DM4 복합체 항체 23 mg/kg은 약 350 ㎍/kg DM4에 상응하였다. 임상 등급의 탁솔(상표명)(파클리탁셀 주사, NDC 0015-3476-30)는 Bristol-Myers Squibb(Lot No 4L83460, exp. Nov. 2007)에서 얻었다.
연구 군 및 처치 방법
연구 군 및 처치 방법은 하기 표 10에 기재하였다. 비히클 대조군(10 mM 시트레이트 완충액, pH 5.5, 135 mM 염화나트륨)를 3회 투여 동안 주 1회 정맥 내 투여하고(q7dx3), 탁솔(상표명)은 3회 투여 동안 4일 마다 복강 내 투여하였다(q4dx3). 15 mg/kg의 B3F6.1-DM4는 정맥 내 q7dx3 플러스 및 43일째의 추가 투여 또는 43일째 q7dx3 플러스 25 mg/kg의 투여량으로 정맥 내 투여하였다. 35 mg/kg의 B3F6.1-DM4는 q7dx3 또는 15일, 22일, 33일 및 36일째에 정맥 내 투여하였다. 모든 처치는 15일째에 개시하였다.
항암 활성의 평가
종양 크기는 디지털 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 측정된 종양 크기는 0일째에 기록하였고, 같은 작업을 연구 종료 시점까지 주 2회 계속하였다. 장형 타원체의 부피를 계산하는 공식을 이용하여 2차원 종양 크기로부터 종양 부피(mm3)를 예측하였다: 종양 부피(mm3) = (길이 x 너비2)÷2. 단위 밀도를 고려하면, 부피는 질량으로 환산할 수 있다(즉, 1 mm3 = 1 g).
58일째에, 비히클 대조군, 탁솔 및 15 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4로 처치한 군들은 안락사시켰다. 종양 중량 및 체중은 계속하여 잔류 군들로부터 매주 측정하였다. 35 mg/kg/inj q7dx3의 B3F6.1-DM4로 처치한 군은 76일째에 안락사시켰다. 15일, 22일, 33일 및 36일째에 35 mg/kg/inj q7dx3의 B3F6.1-DM4로 처치한 군은 연구가 종료하는 때인 83일째에 안락사시켰다.
통계학적 분석
각각의 연구의 말미에 평균 종양 중량에 대해 스튜던트 티 테스트(student's t test)를 수행하여 각각의 처치군과 비히클 대조군 사이에 어떤 통계학적으로 유의적인 차이점이 존재하는지 여부를 결정하였다.
이식 후 98%의 종양 성장률(tumor take-rate)이 확인되었고, 좁은 크기 범위 내의 마우스를 선택하여 처치를 개시하였다. 비히클 대조군 내의 종양 성장은 이 모델에서 관찰된 전형적인 범위 내에 있었다. 탁솔은 본 모델에 부합되는 반응을 나타냈는데, 이는 26일부터 50일까지 종양 성장의 유의적인(P<0.05) 억제였다. 58일째에, 비히클 대조군, 탁솔 및 15 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4로 처치한 군들은 안락사시켰다. 잔류 군들로부터 종양 중량 및 체중을 주단위로 계속 측정하였다. 35 mg/kg/inj q7dx3의 B3F6.1-DM4로 처치한 군은 76일째에 안락사시켰다. 15일, 22일, 33일 및 36일째에 35 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4로 처치한 군은 본 연구가 종료되는 83일째에 안락사시켰다.
도 10 내지 13은 확립된 BT-474 이종이식편 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 종양 중량의 변화, %테스트/대조군(%T/C) 및 체중의 변화에 대한, 여러 가지 방법으로 정맥 내 투여된 B3F6.1-DM4의 2가지 투여량(15 및 35 mg/kg/inj)의 효과를 나타낸다. q7dx3으로 정맥 내 투여한 15 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4 + 43일째의 추가 투여는 33일부터 47일까지 종양 성장을 유의적으로(P<0.05) 억제하였으나, 이 군에 대해 58일째에 연구를 종료할 때까지 더 이상의 유의적인 억제는 없었다. q7dx3으로 정맥 내 투여한 15 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4 + 43일째의 25 mg/kg/inj의 추가 투여로 처치한 다른 집단은 본 연구 내내 종양 성장의 유의적인 억제를 나타내지 않았다. 35 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4를 투여하는 방법 둘 다는 29일부터 비히클 대조군이 종료되는 58일까지 종양 성장의 통계학적으로 유의적인(P<0.001) 억제를 나타냈다.
35 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4로 처치한 두 개의 집단 둘 다에 대한 %T/C는 29일째에 42%로 NCI 기준 이하로 감소하였고, 본 연구 내내 이 수준 이하를 유지하였다. 15 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4로 처치한 집단의 %T/C는 절대 42% 이하로 감소하지 않았다.
임상 관찰
B3F6.1-DM4로 처치한 몇몇 마우스는 경미한 코리네형 박테리아 피부 감염을 경험하였는데, 이 감염은 실험 개시 후 수일 내에 해소되었다. 이 박테리아는 피부에 존재하였고, 동물이 스트레스를 받을 때 발생할 수 있는 기회 감염으로 생각된다. 35 mg/kg/inj, q7dx3의 B3F6.1-DM4으로 처치한 대부분의 마우스는 29일까지 감염이 진행하였고, 모든 감염은 43일까지는 해소되었다(33번은 예외).
탁솔로 처치한 한 마리의 마우스는 탁솔을 투여하는 중의 기술적인 문제로 인해 체중 손실이 있었다. 탁솔은 GI 독성을 유발하는 것으로 공지되어 있으며, 이러한 세포독성제를 복강 내 투여할 때는 주의를 기울여야만 한다. 유체의 피하 투여로 마우스의 상태는 개선되지 않았고, 탁솔을 최종 투여한 지 3일 후인 26일째에 상기 마우스는 체중 손실에 관한 IACUC 가이드라인(체중 손실이 20%를 초과하는 경우 안락사)에 따라 안락사시켰다. 상기 동물에 대한 데이타는 그래프 및 통계학적 분석에서 제외하였다.
35 mg/kg/inj q7dx3의 B3F6.1-DM4로 처치한 한 마리의 마우스는 26일째부터 체중 손실을 경험하였다. 상기 체중 손실은, B3F6.1-DM4를 최종 투여한 지 14일 후인 43일째에 상기 마우스를 IACUC 가이드라인에 따라 안락사시켜야될 때까지 계속되었다. 검시 결과 흉부 내에 명백한 피하 유체가 확인되었다. 체중 손실이 처치와 관련된 것인지 여부는 알지 못했는데, 그 이유는 이 군 내의 단지 다른 한 마리의 마우스만 경미한 체중 손실을 경험하였기 때문이다. 그러나, 35번도 경미한 체중 손실을 초래할 수 있는 코리네형 박테리아 감염을 경험하였다.
50일째에, 비히클 대조군 내의 한 마리의 마우스는, 그의 종양이 그의 체중의 20%를 초과하게 된 경우, IAUCU 가이드라인에 따라 안락사시켰다. 비히클 대조군 내의 다른 마우스는 종양의 심한 궤양과 체중 손실로 인해 50일째에 안락사시켰다. 이들 마우스에 대한 종양 중량은 본 연구의 잔여분에 대한 데이타에 이월하였다.
실시예 19 : 생체 내 모델에서 독소에 접합된 인간화된 도메인 결실된 B3F6 항체는 유방암 세포의 성장을 억제하는 데 효과적이다.
본 실시예에서는 다음과 같은 실험 재료 및 방법을 이용하였다.
동물
백삼십오(135) 마리의 6주령 내지 7주령 무흉선 암컷 누드 마우스(Harlan Sprague Dawley, Madison, WI)를 본 연구에 이용하였다. 동물들은 종양을 이식하기 이전의 적어도 5일 동안 실험실 환경에 순응시켰다. 동물들은 종양을 이식하기 이전에 동물 ID 칩을 개별적으로 이식하였다. 8마리는 테스트 군에 포함시켰고 20 마리는 비히클 대조군에 포함시켰다.
종양
BT-474 시험관 내 세포주는 NCI 종양 저장소로부터 얻었다. 일련의 이식된 생체 내 공여주(Biogen Idec cryo reg # 0141, 에스트로겐 보충물을 함유하지 않음))는 Biogen Idec에서 확립하였으며, 본 연구를 위해 이식하기 이전에 무흉선 암컷 누드 마우스에서 4 세대 동안 이식하였다. 마우스 1 마리당 조직 단편 3 mm3을 상기 동물의 우측 옆구리 부분에 이식하였다.
종양이 최소 크기 100 mg이 되는 경우, 처치를 개시하였다. 동물은 다음과 같은 처치군과 대조군으로 무작위 분류하였다.
[표 11]
군# 처치** 마우스 마리수
1 비히클 대조군, 0.2 ml/마우스, i.v., 5회 투여 동안 2x/일 (20 mM 시트레이트 완충액, pH 5.5, 135 mM 염화나트륨) 16
2 양성 화학치료제, 탁솔, 25.0 mg/kg/inj.i.p. q4dx3 8
3 ddB3F6.1-DM4, 18.0 mg/kg/inj, i.v., 5회 투여 동안 2x/일 (3.5 DM4/mAb) 8
4 ddB3F6.1-DM4, 10.0 mg/kg/inj, i.v., 5회 투여 동안 2x/일 (3.5 DM4/mAb) 8
5 ddB3F6.1-DM4, 3.0 mg/kg/inj, i.v., 5회 투여 동안 2x/일 (3.5 DM4/mAb) 8
6 ddB3F6.1 네이키드 mAb, 18.0 mg/kg/inj, i.v., 5회 투여 동안 2x/일 (3.5 DM4/mAb) 8
주: ** 투여량은 동물에게 350 ug/kg의 마이탄신(MTD)을 제공하는 3 드럭/항체 = 23 mg/kg 투여량에 기초한다.
테스트 스케쥴은 다음과 같다:
-1일: 동물 ID 칩을 이식하고, 초기 체중을 기록하였다.
0일: 종양을 수거하고, 이식하고, 마우스를 무작위 분류하였다. 박테리아 배양을 종양 위에서 수행하였다.
4일: 스테이징 종양(staging tumor)에 대해 종양 크기 측정치를 기록하고, 스테이징 일(staging day)까지 매일 또는 격일로 측정치 기록을 계속하였다.
최소 크기 100 mg으로 측정된 종양을 가진 마우스를 선택하였다. 마우스는 무작위 분류하고 체중을 기록하였다. 처치는 단일 정맥 내 투여로 수행하였다. 양성 대조군 제제는 q4dx3 스케쥴로 복강 내 투여하였다.
체중 및 종양 측정치는 스테이징 일에 기록하였고, 측정치 기록은 연구를 종료할 때까지 주 2회 계속하였다.
도 14 내지 도 17의 데이타로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 도메인 결실된 B3F6은 어떤 농도의 상기 도메인 결실된 분자를 이용하여 처치한 마우스에서 종양 중량의 감소에 효과적이었다.
실시예 20: 생체 내 모델에서 독소에 접합된 인간화된 B3F6 항체는 인간 고환암 세포의 성장을 억제하는 데 효과적이다.
후술하는 실시예에서, 항크립토 인간화된 IgG1 단일클론 항체(mAb) B3F6 (B3F6.1이라고도 칭함)은 세포독성제 마이탄신의 유도체인 DM4에 접합시켰다(B3F6.1-DM4). 이 접합체는 확립된 NCCIT 인간 고환 암종의 피하(SC) 이식된 이종이식편을 보유하는 무흉선 숫컷 누드 마우스에서 항암 활성의 증거에 대해 평가하였다. 동물 집단은 3회 투여 동안 주 1회 6, 10, 15 및 25 mg/kg/inj (q7dx3) (각각 100, 178, 266 및 444 ㎍/kg 마이탄신과 동일함)의 B3F6.1-DM4 mAb 또는 15일째 및 종양 재성장에 따른 후일에 25 및 10 mg/kg/inj의 정맥 내(IV) 투여, 6회 투여 동안 주 3회 2 mg/kg/inj SC(3x/wk x6)의 시스-백금(양성 화학치료 대조군)을 투여하여 처치하였다. 처치는, 종양이 100 mg의 크기에서 최소 변화에 이른 15일째에 개시하였다.
상기 결과는 비히클 대조군에서의 종양 성장이 상기 모델을 위한 허용 한계치 내에 있음을 보여준다. 시스-백금은 종양 성장의 유의적인(P<0.05) 억제를 나타냈는데, 이는 20일부터 66일까지 상기 모델에 부합되는 것이다. q7dx3으로 투여된 B3F6.1-DM4는 20일째부터 시작하여 10 (P<O.001), 15 (P<O.001) 및 25 mg/kg/inj (P<O.001)로 종양의 퇴행을 나타냈으며, 종양은 107일에 본 연구를 종료할 때까지 퇴행된 상태를 유지하였다. 6 mg/kg/inj q7dx3의 B3F6.1-DM4는 20일부터 44일까지 종양의 성장을 억제하였고, 상기 군에 대한 연구가 70일째에 종료될 때까지 종양의 성장을 유의적으로(P<0.001) 억제하였다. 15일째에 25 mg/kg으로 1회 투여된 B3F6.1-DM4는 본 연구 전체를 통해 종양을 퇴행시켰다(P<O.001). 15일째에 10 mg/kg으로 1회 투여된 B3F6.1-DM4는 종양의 초기 퇴행을 유도하였다(P<O.001). 37일째 및 44일째의 10 mg/kg의 추가 투여는 다시 성장하기 시작한 종양의 퇴행을 초래하였다(P<O.Ol). 결론적으로, 테스트한 투여 방법으로 투여한 B3F6.1-DM4는 고환 암종의 확립된 이종이식편에 대해 매우 효과적이었다.
본 실시예에서는 다음과 같은 실험 재료 및 방법을 이용하였다.
마우스
백오십(150) 마리의 7주령 내지 8주령의 무흉선 수컷 누드 마우스(Harlan Sprague Dawley, Madison, WI)를 본 연구에 이용하였다. 동물들은 종양을 이식하기 이전의 적어도 5일 동안 실험실 환경에 순응시켰다. 동물들은 통풍이 잘 되는 케이지 랙에서 유지하였으며, 사료와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
종양 모델
NCCIT 세포는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC; Manassas, VA)로부터 얻었다. 상기 세포주는 이식 이전에 시험관 내에서 4회 계대배양하였다. 세포들은 항생제가 포함되지 않은 RPMI-1640 + 10% 태아 소 혈청(FBS) 배지에서 시험관내 성장시켰다(5% CO2). 박테리아 배양은 상기 마우스 내로 이식된 종양 균질물 제제의 액적 상에서 수행하였다. 박테리아 배양물은 이식 후 24 시간 및 48 시간 둘 다에서 박테라아 오염에 대해 음성이었다.
-1일째, 상기 마우스는 좌측 옆구리의 피하에 바이오메딕스 동물 ID 칩(모델 IMI-1000; Seaford, DE)을 피하 이식하였다. 혈청을 함유하지 않는 200 ㎕ RPMI-1640 + 마트리겔(75%) 내의 5 x 10` NCCIT 세포의 접종물은 0일째에 우측 옆구리 부위에 피하 이식하였다. 6일째부터 적어도 주 2회 종양 크기 및 체중을 측정하여 기록하였다. 15일째에, 종양 중량 100 mg의 최소 증가 및 244 mg의 최대 증가를 나타내는 종양을 가진 마우스는 처리군과 대조군으로 무작위 분류하였고, 비진행성으로 성장하는 종양은 제외시켰다(표 12 참조). 첫 번째 종양 측정(6일째) 이래 종양 중량의 변화를 이용하고 접종물 내의 마트리겔의 부피를 고려하여 실제 종양 중량보다는 종양 성장을 평가하였다.
테스트 물질 및 양성 화학치료제
DM4 접합물(2000-67 6.0 mg/ml)은 ImmunoGen의 종양 활성화된 프로드러그(TAP) 기술을 이용하여 ImmunoGen, Inc(Cambridge, MA)에서 제조하였다. 비히클 대조군 및 B3F6.1-DM4 mAb 투여 용액(Lot# 11155-104, 제제, 노트북: AC 10878-49)은 Biogen Idec의 Ling Ling Chen으로부터 제공받았다. 임상 등급의 플라티놀-AQ(상표명)(시스플라틴 주사액, NDC 0015-3221-22)은 Bristol-Myers Squibb으로부터 얻었다(Lot No. 72C65556, exp. Mar. 2003).
연구 군 및 처치 방법
연구 군 및 처치 방법은 하기 표 12에 기재하였다. 무흉선 누드 마우스에서 B3F6.1-DM4의 반감기는 3.9일이었다. B3F6.1-DM4 mAb는 3회 투여 동안 주 1회(q7dx3) 또는 15일째 및 종양 재성장에 따른 후일에 정맥 내 투여하였다. 비히클 대조군(1O mM 시트레이트 완충액, pH 5.5, 135 mM 염화나트륨)은 q7dx3로 정맥 내 투여하였고, 시스-백금은 6회 투여 동안 주 3회 피하 투여하였다(3x/wk x 6). 모든 처치는 15일째에 개시하였다.
하기 표 12는 대조군과 처리군을 나타낸다.
[표 12]
대조군 및 처리군
Figure 112007056744018-PCT00040
모든 처치는 15일에 시작하였다.
a 정맥내, b 피하
항암 활성의 평가
종양 크기는 디지털 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 측정된 체중 및 종양 크기는 6일째에 기록하였고, 같은 작업을 연구 종료 시점까지 주 2회 계속하였다. 장형 타원체의 부피를 계산하는 공식을 이용하여 2차원 종양 크기로부터 종양 부피(mm3)를 예측하였다: 종양 부피(mm3) = (길이 x 너비2)÷2. 단위 밀도를 고려하면, 부피는 질량으로 환산할 수 있다(즉, 1 mm3 = 1 g).
첫 번째 종양 측정(6일째) 이래 종양 중량의 변화를 이용하고 접종물 내의 마트리겔의 부피를 고려하여 실제 종양 중량보다는 종양 성장을 평가하였다.
70일째에, 비히클 대조군, 시스-백금 및 6 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4로 처치한 군들은 안락사시켰다. 잔류 군들은 본 연구가 종료되는 107일까지 생존시켰다.
통계학적 분석
각각의 연구의 말미에 평균 종양 중량에 대해 스튜던트 티 테스트(student's t test)를 수행하여 각각의 처치군과 비히클 대조군 사이에 어떤 통계학적으로 유의적인 차이점이 존재하는지 여부를 결정하였다.
본 연구의 말미에, 비히클 대조군의 일부 마우스는, 그들의 종양이 그들 체중의 20%를 초과한 경우, IACUC 가이드라인에 따라 안락사시켰다. 이들 마우스 유래의 최종 종양 중량은 연구 종료시의 데이타로 이월하였다.
이식 후 95%의 종양 성장률이 확인되었고, 15일째에 종양 중량의 좁은 범위의 변화가 있는 종양을 가진 마우스를 선택하여 처치를 개시하였다. 비히클 대조군 내의 종양 성장은 이 모델에서 관찰된 전형적인 범위 내에 있었다. 시스-백금은 본 모델에 부합되는 반응은 나타냈는데, 이는 20일부터 66일까지 종양 성장의 유의적인(P<0.05) 억제였다. 70일째에, 비히클 대조군, 시스-백금 및 6 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4로 처치한 군들은 안락사시켰다. 잔류 군들은 본 연구가 종료되는 107일까지 생존시켰다.
도 18 내지 21은 확립된 NCCIT 이종이식편 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 종양 중량의 변화, %테스트/대조군 및 체중의 변화에 대한, q7dx3으로 투여한 B3F6.1-DM4 또는 3x/wk x 6으로 투여한 시스-백금의 4가지 투여량(6, 10, 15 및 25 mg/kg/inj)의 효과를 나타낸다. q7dx3으로 투여한 B3F6.1-DM4는 20일부터 70일(비히클 대조군이 종료된 날)까지 10(P<O.01), 15(P<O.001) 및 25 mg/kg (P<O.001)으로 종양의 퇴행을 나타냈다. 이들 군 내의 종양은 107일째에 본 연구의 종료시까지 퇴행을 계속하였다. q7dx3으로 투여한 6 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4는 20일부터 44일까지 종양을 퇴행시켰다. 44일째 이후, 이 군내의 다수의 종양은 재성장을 시작했으나, 종양 성장은 상기 군이 종료되는 70일째를 통해 유의적으로(P<0.01) 억제되었다.
6 및 10 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4에 대한 %T/C는 23일째에 42%로 NCI 기준 이하로 감소하였고, 본 연구 내내 이 수준 이하를 유지하였다. 25 mg/kg/inj 군의 %T/C는 20일에 42% 이하로 감소하였고, 23일부터 본 연구 내내 10% 미만을 유지하였다.
도 22 내지 도 25는 확립된 NCCIT 이종이식편 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 종양 크기, %테스트/대조군 및 체중의 변화에 대한, 15일째에 1회 투여한 25 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4, 15일째 및 후속 종양 재성장시(37일 및 44일) 투여한 1, 10 mg/kg/inj의 B3F6, 또는 3x/wk x 6으로 투여한 시스-백금의 효과를 나타낸다. 15일째에 1회 투여한 25 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4는 20일부터 70일(비히클 대조군이 종료된 날)까지 종양의 퇴행을 나타냈다(P<0.001). 이들 군 내의 종양은 107일째에 본 연구의 종료시까지 퇴행을 계속하였다. 15일째에 1회 투여한 10 mg/kg의 B3F6.1-DM4는 종양의 초기 퇴행을 유발하였다(P<0.001). 37일 및 44일째의 10 mg/kg의 추가 투여는 재성장을 시작한 종양의 퇴행(P<0.01)을 유발하였다.
10 및 25 mg/kg/inj의 B3F6.1-DM4에 대한 %T/C는 20일째에 42%로 NCI 기준 이하로 감소하였고, 본 연구 내내 이 수준 이하를 유지하였다.
B3F6.1-DM4로 처치한 몇몇 마우스는 경미하거나 중간 정도의 코리네형 박테리아 피부 감염을 경험하였는데, 이 감염은 실험 개시 후 수일 내에 해소되었다. 이 박테리아는 피부에 존재하였고, 동물이 스트레스를 받을 때 발생할 수 있는 기회 감염으로 생각된다. 25 mg/kg/inj, q7dx3의 B3F6.1-DM4으로 처치한 2마리의 마우스, 단지 15일째에 25 mg/kg/inj로 처치한 2마리의 마우스 및 15 mg/kg/inj, q7dx3로 처치한 한 마리의 마우스는 20일부터 23일까지 감염의 징후를 나타냈다. 25 mg/kg/inj, q7dx3로 처치한 한 마리의 마우스는 30일째에 경미한 감염의 징후를 나타냈다.
52일째에, 15일째에 1회 25 mg/kg/inj의 B3F6.1-M4로 처치한 한 마리의 마우스는 복부가 부풀었고, 방광은 표현할 수 없는 정도였다. 이 마우스는 안락사시켰고, 검시 결과 방광 결석을 확인하였다.
실시예 21 : 생체 내 모델에서 인간화된 B3F6은 인간 폐암 세포의 성장을 억제한다.
본 연구의 목적은, 확립되고 미리형성된 종양 덩어리에 대한 치료가 개시된 경우, Calu-6 이종이식편 종양의 성장에 대한 B3F6.1-DM4 접합된 mAb의 효과를 결정하기 위한 것이었다.
본 실시예에서는 다음과 같은 실험 재료 및 방법을 이용하였다:
마우스
백육십(160) 마리의 8주령 내지 9주령 무흉선 암컷 누드 마우스(Harlan Sprague Dawley, Madison, WI)를 본 연구에 이용하였다. 동물들은 종양을 이식하기 이전의 적어도 5일 동안 실험실 환경에 순응시켰다. 동물들은 통풍이 잘 되는 케이지 랙에서 유지하였으며, 사료와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
종양 모델
Calu-6 세포는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC; Manassas, VA)로부터 얻었다. 상기 세포주는 이식 이전에 시험관 내에서 11회 계대배양하였다. 세포들은 항생제가 포함되지 않은 RPMI-1640 + 10% 태아 소 혈청(FBS) 배지에서 성장시켰다. 박테리아 배양은 상기 마우스 내로 이식된 종양 균질물 제제의 액적 상에서 수행하였다. 박테리아 배양물은 이식 후 24 시간 및 48 시간 둘 다에서 박테라아 오염에 대해 음성이었다.
-1일째, 상기 마우스는 좌측 옆구리의 피하에 바이오메딕스 동물 ID 칩(모델 IMI-1000; Seaford, DE)을 피하 이식하였다. 혈청을 함유하지 않는 200 ㎕ RPMI-1640 내의 5 x 10` Calu-6 세포의 접종물은 0일째에 우측 옆구리 부위에 피하 이식하였다. 4일째부터 적어도 주 2회 종양 크기 및 체중을 측정하여 기록하였다. 종양이 최소 100 mg이 된 경우, 마우스를 처리군과 대조군으로 무작위 분류하였다(표 13 참조).
테스트 물질 및 양성 화학치료제
DM4 접합체(2000-79 3.3 D/A, 5.5 mg/ml)는 ImmunoGen의 종양 활성화된 프로드러그(TAP) 기술을 이용하여 ImmunoGen, Inc(Cambridge, MA)에서 제조하였다. 비히클 대조군 및 B3F6.1-DM4 mAb 투여 용액(Lot# 10878-49, 제제, 노트북: AC 10878-49)은 Biogen Idec의 Anne Cheung로부터 제공받았다. 임상 등급의 캠프토사르(상표명)(이리노테칸 주사액, NDC 0009-7529-01)은 Pharmacia & Upjohn으로부터 얻었다(Lot No. 76KDP, 최초 7회 투여분, 2006년 7월 만료 및 Lot No. 46MFH, 최종 3회 투여분, 2007년 8월 만료).
연구 군 및 처치 방법
연구 군 및 처치 방법은 하기 표 13에 기재하였다. 무흉선 누드 마우스에서 B3F6.1-DM4의 반감기는 3.9일이었고, 모든 B3F6.1-DM4 mAb는 13일째, 17일째 및 21일째에 정맥 내(IV) 투여하거나, 3회 투여 동안 주 1회 투여하였다(q7dx3). 비히클 대조군(1O mM 시트레이트 완충액, pH 5.5, 135 mM 염화나트륨)은 13-14일째, 17-21일째 및 24-26일째에 복강 내(IP) 투여하였다. 처치군의 투여와 병행하는 비히클 대조군의 투여 방법은 본 연구와는 무관하고, 최초 처치는 14일째에 수행하였다. B3F6.1-DM4 및 이리노테칸의 처치는 13일째에 개시하였다.
[표 13]
대조군 및 처치군
Figure 112007056744018-PCT00041
a 정맥 내, b 복강 내
항암 활성의 평가
종양 크기는 디지털 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 측정된 종양 크기는 4일째에 기록하였고, 같은 작업을 연구 종료 시점까지 주 2회 계속하였다. 장형 타원체의 부피를 계산하는 공식을 이용하여 2차원 종양 크기로부터 종양 부피(mm3)를 예측하였다: 종양 부피(mm3) = (길이 x 너비2)÷2. 단위 밀도를 고려하면, 부피는 질량으로 환산할 수 있다(즉, 1 mm3 = 1 g).
통계학적 분석
각각의 연구의 말미에 평균 종양 중량에 대해 스튜던트 티 테스트(student's t test)를 수행하여 각각의 처치군과 비히클 대조군 사이에 어떤 통계학적으로 유의적인 차이점이 존재하는지 여부를 결정하였다.
항종양 활성
이식 후, 90% 종양 성장률이 확인되었고, 좁은 크기 범위 내의 마우스를 선택하여 처치를 개시하였다. 이리노테칸은 20일째로부터 상기 군이 종료되는 45일째까지 종양 성장의 유의적인(p < 0.001) 억제를 나타냈는데, 이는 본 모델과 일치하는 것이었다.
도 26 내지 도 29는 확립된 Calu-6 이종이식편 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스 내에서 종양 중량, 최종 종양 중량, %테스트/대조 및 체중의 변화에 대한 13일째, 17일째 및 21일째에 투여된 B3F6.1-DM4의 2회 투여(10 및 20 mg/kg/inj) 또는 13-14일째, 17-21일째 및 24-26일째에 투여된 이리노테칸의 효과를 나타낸다. B3F6.1- DM4는 하기 지속 기간 동안 투여 둘 다에서 종양 성장의 유의적인 억제를 나타냈다:
- 24-45일째 10 mg/kg(P<0.01 24일째, 35-38일째 및 45일째; P<O.001 27-32일째 및 41일째)
- 24-45일째 20 mg/kg (P<O.001)
%T/C는 32-45일째에 20 mg/kg/inj에서 42% 이하의 NCI 활성 기준에 도달하였다.
도 30-33은 확립된 Calu-6 이종이식편 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스 내에서 종양 중량, 최종 종양 중량, %테스트/대조 및 체중의 변화에 대한 q7dx3으로 정맥 내 투여된 B3F6.1-DM4의 2회 투여(15 및 30 mg/kg/inj) 또는 13-14일째, 17-21일째 및 24-26일째에 투여된 이리노테칸의 효과를 나타낸다. B3F6.1-DM4는 하기 지속 기간 동안 투여 둘 다에서 종양 성장의 유의적인 억제를 나타냈다:
- 32-45일째 15 mg/kg(P<0.01 32-35일째 및 45일째; P<O.001 38-41일째)
- 24-45일째 30 mg/kg (P<O.001 24일째, P<0.001 27-45일째)
%T/C는 32-45일째에 30 mg/kg/inj에서 42% 이하의 NCI 활성 기준에 도달하였다.
10 mg/kg/inj으로 B3F6.1-DM4를 투여한 한 마리의 마우스는 이식 후 32일째, B3F6.1-DM4의 최종 투여 후 11일 후 죽은 것으로 확인되었다. 상기 동물은 투여 후 독성에 대한 징후는 나타내지 않았고, 상기 군 내의 다른 동물들 중에서 건강이 좋지 않은 어떤 징후도 없었다.
B3F6.1-DM4 군, 30 mg/kg/inj 군 내의 모든 마우스는 B3F6.1-DM4의 최종 투여 후 수일에 해소되는 피부의 코리네형 박테리아 감염을 경험하였다. 이 박테리아는 피부 상에 잔류하였으며, 상기 동물이 스트레스를 받을 경우 발생할 수 있는 기회 감염으로 생각된다. 이 군 내의 모든 마우스는 투여 중 5-15%의 중량 손실을 경험하였으나, 중량 손실 및 감염은 투여를 중단하자마자 해소되었다. 또한, 상기 군 내의 한 마우스는 수일 내에 해소되는 우측 귀의 귓바퀴의 이차 스타필로코쿠스 감염을 경험하였다.
균등물
당업자들은 본 명세서에 기재된 특정 구체예에 대한 다수의 균등물들을 일반적인 실험을 통해 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물도 후술하는 청구의 범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Biogen IDEC MA, Inc. et al. <120> PURIFICATION AND PREFERENTIAL SYNTHESES OF BINDING MOLECULES <130> BGNA019CPPC <150> 60/641691 <151> 2005-01-05 <160> 71 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 caggtccaac tgcagcaggt tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tacactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggagag aatgatccta gcaacggtcg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcatctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aaggggccct 300 aattacttct attctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagct 360 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct 720 cccccatgcc cacggtgccc agcacctgga ggtggctcga gtggaggcgg ttccggaggg 780 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 840 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 960 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1020 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1080 tccctgtctc cgggt 1095 <210> 2 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 gattttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatcaagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctcatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657 <210> 3 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Gln Val Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 85 90 95 Ala Ser Pro Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 100 105 110 Cys Pro Pro Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys 115 120 125 Pro Arg Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 145 150 155 160 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 165 170 175 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 180 185 190 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 195 200 205 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 245 250 <210> 71 <211> 913 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 71 Ala Leu Ala Ser Glu Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Pro 1 5 10 15 Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro His Glu Pro Arg Leu Glu Ala Leu 20 25 30 Ala Pro Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr 35 40 45 His Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Leu 50 55 60 Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Leu Glu Val Ala 65 70 75 80 Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Pro His Glu Pro Arg Gly 85 90 95 Leu Pro Arg Val Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Thr 100 105 110 Arg Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Glu 115 120 125 Thr His Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Val Ala Leu His Ile Ser Thr 130 135 140 His Arg Pro His Glu Pro Arg Ala Leu Ala Val Ala Leu Leu Glu Gly 145 150 155 160 Leu Asn Ser Glu Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Tyr Arg 165 170 175 Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Val Ala 180 185 190 Leu Thr His Arg Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser 195 200 205 Glu Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Asn Thr His Arg 210 215 220 Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Leu Ala 225 230 235 240 Ser Asn His Ile Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn 245 250 255 Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Leu 260 265 270 Tyr Ser Val Ala Leu Gly Leu Pro Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Cys 275 280 285 Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Thr His Arg His Ile Ser Thr His 290 295 300 Arg Cys Tyr Ser Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Pro Arg Ala Leu Ala 305 310 315 320 Pro Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg 325 330 335 Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro His Glu Leu Glu Pro His Glu Pro Arg 340 345 350 Pro Arg Leu Tyr Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr His Arg 355 360 365 Leu Glu Met Glu Thr Ile Leu Glu Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His 370 375 380 Arg Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Val Ala 385 390 395 400 Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser Glu Arg 405 410 415 His Ile Ser Gly Leu Ala Ser Pro Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Leu 420 425 430 Tyr Ser Pro His Glu Ala Ser Asn Thr Arg Pro Thr Tyr Arg Val Ala 435 440 445 Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu His 450 455 460 Ile Ser Ala Ser Asn Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr His Arg Leu Tyr 465 470 475 480 Ser Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu Asn Thr Tyr Arg 485 490 495 Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr His Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Val 500 505 510 Ala Leu Val Ala Leu Ser Glu Arg Val Ala Leu Leu Glu Thr His Arg 515 520 525 Val Ala Leu Leu Glu His Ile Ser Gly Leu Asn Ala Ser Pro Thr Arg 530 535 540 Pro Leu Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Gly Leu Thr Tyr 545 550 555 560 Arg Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ser Glu Arg 565 570 575 Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala 580 585 590 Pro Arg Ile Leu Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Thr His Arg Ile Leu Glu 595 600 605 Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly 610 615 620 Leu Asn Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Pro Arg Gly Leu Asn Val Ala 625 630 635 640 Leu Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg 645 650 655 Ala Arg Gly Ala Ser Pro Gly Leu Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser 660 665 670 Ala Ser Asn Gly Leu Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Leu Glu Thr His 675 680 685 Arg Cys Tyr Ser Leu Glu Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Pro 690 695 700 His Glu Thr Tyr Arg Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu 705 710 715 720 Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu Ser Glu Arg 725 730 735 Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Pro Arg Gly Leu Ala Ser Asn 740 745 750 Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Thr His Arg Pro 755 760 765 Arg Pro Arg Val Ala Leu Leu Glu Ala Ser Pro Ser Glu Arg Ala Ser 770 775 780 Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Pro His Glu Leu Glu Thr 785 790 795 800 Tyr Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu 805 810 815 Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr Arg Pro Gly 820 825 830 Leu Asn Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Val Ala Leu Pro His 835 840 845 Glu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Met Glu Thr 850 855 860 His Ile Ser Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu His Ile Ser Ala Ser Asn 865 870 875 880 His Ile Ser Thr Tyr Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ser 885 890 895 Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Pro Arg Gly Leu 900 905 910 Tyr

Claims (96)

  1. (i) CDR Ll : RSSQSIVHSNGNTYLE (서열 번호 9)
    CDR L2 : KVSNRFS (서열 번호 10),
    CDR L3 : FQGSHVPLT (서열 번호 11),
    CDR Hl : SYWIH (서열 번호 12),
    CDR H2 : ENDPSNGRTNYNEKFKN (서열 번호 13) 및
    CDR H3 : GPNYFYSMDY (서열 번호 14)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 서열; 및
    (ii) 인간 수용체 면역글로불린 서열 유래의 가변 프레임워크 영역 서열을 포함하고, 인간 크립토(Cripto) 항원에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, CDR H3 서열 GPNYFYSMDY (서열 번호 14)를 포함하는 것인 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CDR H2 서열 ENDPSNGRTNYNEKFKN (서열 번호 13)을 포함하는 것인 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CDR H1 서열 SYWIH (서열 번호 12)를 포함하는 것인 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CDR L3 서열 FQGSHVPLT(서열 번호 11)을 포함하는 것인 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CDR L2 서열 KVSNRFS (서열 번호 10)을 포함하는 것인 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CDR L1 서열 RSSQSIVHSNGNTYLE (서열 번호 9)를 포함하는 것인 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가변 프레임워크 영역 서열의 하나 이상의 프레임워크 잔기는 상응하는 마우스 B3F6 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 결합 분자.
  9. (a) 서열 번호 39의 CDR 1-3 및 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열 번호 40의 CDR 1-3 및 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하고, 인간 크립토 항원에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역은 서열 번호 40의 CDR 영역 및 프레임워크와 약 50% 이상 동일한 것인 결합 분자.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역은 인간 서브그룹 1 서열, 인간 서브그룹 1 공통 서열 또는 인간 배선 서열로부터 유래된 것인 결합 분자.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역은 서열 번호 46에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 분자.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역은 서열 번호 39의 CDR 영역 및 프레임워크 와 약 60% 이상 동일한 것인 결합 분자.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역은 인간 서브그룹 카파 2 서열, 인간 서브그룹 카파 2 공통 서열 또는 인간 배선 서열로부터 유래된 것인 결합 분자.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역은 서열 번호 45에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 분자.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역의 하나 이상의 프레임워크 잔기는 서열 번호 40에 나타낸 마우스 아미노산 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는
    (a) 정규(canonical) 잔기,
    (b) 계면 팩킹(interface packing) 잔기,
    (c) 결합 부위에 인접한 드물거나 희귀한 잔기,
    (d) CDR 내 일부 원자의 약 3 Å 단위 내의 측쇄 원자를 보유하는 잔기
    인 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 프레임워크 잔기는 H1, H48, H67, H71, H73, H81, H82b, H93 및 H112(카뱃 번호화 체계)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인 결합 분자.
  18. 제16항 또는 제17항 에 있어서, 상기 하나 이상의 프레임워크 잔기는 H48, H67, H71, H73, H93, 및 H112를 포함하는 것인 결합 분자.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 프레임워크 잔기는 H71 및 H112인 결합 분자.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 프레임워크 잔기는 H1, H48, H71, H81, H82b 및 H112를 포함하는 것인 결합 분자.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역의 하나 이상의 프레임워크 잔기는 서열 번호 39에 나타낸 마우스 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는
    (a) 정규 잔기,
    (b) 계면 팩킹 잔기,
    (c) 결합 부위에 인접한 드물거나 희귀한 잔기,
    (d) CDR 내 일부 원자의 약 3 Å 단위 내의 측쇄 원자를 보유하는 잔기
    인 결합 분자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역은 L2 또는 L1OO(카뱃 번호화 체계)인 결합 분자.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역은 L2인 결합 분자.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역은 L2 및 L100을 포함하는 것인 결합 분자.
  25. (a) 서열 번호 47, 서열 번호 50, 및 서열 번호 52의 아미노산 잔기 1-112로 이루어지는 군으로부터 선택된 VL 서열에 나타낸 CDR 및 프레임워크 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 및 서열 번호 55의 아미노산 잔기 1-121로 이루어지는 군으로부터 선택되는 VH 서열에 나타낸 CDR 및 프레임워크 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하고, 인간 크립토 항원에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
  26. 제25항에 있어서,
    (a) 서열 번호 52의 아미노산 1-112에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 서열 번호 55의 아미노산 1-121에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 결합 분자.
  27. 제25항에 있어서,
    (a) 서열 번호 47에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 서열 번호 48에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 결합 분자.
  28. 제25항에 있어서,
    (a) 서열 번호 47에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 서열 번호 49에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 결합 분자.
  29. 제25항에 있어서,
    (a) 서열 번호 47에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 서열 번호 51에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신 호 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 결합 분자.
  30. 제25항에 있어서,
    (a) 서열 번호 50에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 서열 번호 48에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 결합 분자.
  31. 제25항에 있어서,
    (a) 서열 번호 50에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 서열 번호 49에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 결합 분자.
  32. 제25항에 있어서,
    (a) 서열 번호 50에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 경쇄; 및
    (b) 서열 번호 51에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열 및, 임의로 신호 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하는 결합 분자.
  33. 제9항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자 중쇄가 합성 연결 펩티드에 의해 VH, VL 또는 CH1 도메인에 유전자적으로 융합된 CH3 도메인을 포함하는 것인 결합 분자.
  34. 제9항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자 중쇄는 CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결실된 것인 결합 분자.
  35. 제9항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이소타입의 항체로부터 유래한 불변 영역을 포함하는 것인 결합 분자.
  36. 제9항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 γ1 힌지, γ2 힌지, γ3 힌지 및 γ4 힌지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 힌지 영역으로부터 유래한 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 분자.
  37. 제9항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 키메라 힌지 를 포함하는 것인 결합 분자.
  38. 제9항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 IgG1 힌지 도메인의 적어도 일부분, IgG3 힌지 도메인의 적어도 일부분을 포함하는 것인 결합 분자.
  39. 제9항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 카뱃 번호화 체계의 239번 또는 242번 위치에 시스테인 잔기를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 결합 분자.
  40. 제9항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 야생형 Fc 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 결합 분자.
  41. 제40항에 있어서, 상기 변형은 EU 297번 내지 299번 위치 중 임의의 위치에서 아미노산 치환을 포함하여 변이체가 포유류 세포 내에서 발현 시 실질적으로 비글리코실화되도록 하는 것인 결합 분자.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 결합 분자는 야생형 Fc 영역을 가진 결합 분자와 비교하여 저하된 효과기 기능을 갖는 것인 결합 분자.
  43. 제42항에 있어서, 상기 결합 분자는 저하된 항원 의존성 세포독성을 갖는 것인 결합 분자.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 결합 분자는 증강된 반감기를 갖는 것인 결합 분자.
  45. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 Fc 영역은 하나 이상의 조작된 시스테인 잔기를 갖는 것인 결합 분자.
  46. 제45항에 있어서, 상기 조작된 시스테인 잔기는 Fc 영역의 CH3 도메인 내에 존재하는 것인 결합 분자.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 부위에 접합된 것인 결합 분자.
  48. 제47항에 있어서, 상기 효과기 부위는 세포독소, 프로드러그, 생물학적 독소 및 방사성 동위원소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 결합 분자.
  49. 제47항에 있어서, 상기 효과기 부위는 아미드 결합에 의해 접합된 것인 결합 분자.
  50. 제48항에 있어서, 상기 효과기 부위는 마이탄시노이드인 결합 분자.
  51. 제25항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 53에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄는 서열 번호 56에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 분자.
  52. 제25항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 53에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄는 서열 번호 57에 나타낸 프레임워크 및 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 분자.
  53. 제52항에 있어서, γ1 이소타입의 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 결합 분자.
  54. 제52항에 있어서, 서열 번호 71에 나타낸 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 것인 결합 분자.
  55. 기탁번호 로 ATCC에 기탁된 세포주에 의해 생성된 인간화된 항크립토 단일클론 항체.
  56. 제25항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 53의 서열을 가지며, 상기 중쇄는 서열 번호 58의 서열을 갖는 것인 결합 분자.
  57. 제25항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 54의 서열을 가지며, 상기 중쇄는 서열 번호 56의 서열을 갖는 것인 결합 분자.
  58. 제25항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 54의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 57의 서열을 갖는 것인 결합 분자.
  59. 제25항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 54의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 58의 서열을 갖는 것인 결합 분자.
  60. 제25항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 52의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 55의 서열을 갖는 것인 결합 분자.
  61. (a) 서열 번호 52, 서열 번호 53 및 서열 번호 54로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 포함하는 경쇄;
    (b) 서열 번호 55; 서열 번호 56, 서열 번호 57 및 서열 번호 58로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 포함하는 중쇄
    를 포함하고, 인간 크립토 항원에 특이적으로 결합하는 CH2 도메인 결실된 결합 분자.
  62. 제57항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 53의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 60의 서열을 갖는 것인 도메인 결실된 결합 분자.
  63. 제57항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 53의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 61의 서열을 갖는 것인 도메인 결실된 결합 분자.
  64. 제57항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 53의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 62의 서열을 갖는 것인 도메인 결실된 결합 분자.
  65. 제57항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 54의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 60의 서열을 갖는 것인 도메인 결실된 결합 분자.
  66. 제57항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 54의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 61의 서열을 갖는 것인 도메인 결실된 결합 분자.
  67. 제57항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 54의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 62의 서열을 갖는 것인 인간화된 B3F6 결합 분자.
  68. 제57항에 있어서, 상기 경쇄는 서열 번호 52의 서열을 가지고, 상기 중쇄는 서열 번호 59의 서열을 갖는 것인 인간화된 B3F6 결합 분자.
  69. 제9항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 결합 분자의 하나 이상의 CDR내 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하도록 변경된 것인 결합 분자.
  70. 제9항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 특이성인 결합 분자.
  71. 제9항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 4가인 결합 분자.
  72. 제9항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체인 결합 분자.
    [청구항 72]
    제9항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편인 결합 분자.
  73. 2개 이상의 결합 부위와 2개 이상의 폴리펩티드 쇄를 갖는 폴리펩티드 이량체를 포함하는 조성물로서, 상기 2개 이상의 결합 부위 중 하나 이상은 인간화된 B3F6 가변 영역을 포함하고, 상기 2개 이상의 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 중쇄 부분 및 합성 연결 펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드 이량체의 약 70% 이상은 하나 이상의 쇄간 이황화 결합에 의해 연결된 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 상기 연결 펩티드는 카뱃 번호화 체계의 243번 위치에 프롤린 잔기를 포함하는 것인 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 상기 폴리펩티드 이량체의 90% 이상은 하나 이상의 쇄간 이황화 결합에 의해 연결되어 있는 것인 조성물.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 합성 연결 펩티드는 카뱃 번호화 체계의 239번 위치 또는 242번 위치에 시스테인 잔기를 더 포함하는 것인 조성물.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 쇄의 하나 이상은 상기 연결 펩티드에 의해 VL, VH 또는 CH1 도메인에 연결된 CH3 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 연결 펩티드는 카뱃 번호화 체계의 244번 위치에 알라닌 잔기 및 245번 위치에 프롤린 잔기를 더 포함하는 것인 조성물.
  78. 서열 번호 53에 나타낸 경쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 57에 나타낸 중쇄 아미노산 서열을 포함하며, 마이탄소이드에 접합된 인간화된 항크립토 항체.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 결합 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  80. 제78항의 항체의 변이체로서, 상기 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하고, 상기 변이체는 인간 크립토에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 것인 변이체.
  81. 제9항 내지 제55항 중 어느 한 항의 결합 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  82. 고도로 엄격한 조건 하에서 제81항의 핵산 분자의 상보체와 혼성화하는 핵산 분자.
  83. 제82항에 있어서, 벡터 내에 존재하는 것인 핵산 분자.
  84. 제83항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  85. 결합 분자가 생성되는 조건 하에서 제9항 내지 제55항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포 또는 배양물로부터 결합 분자를 분리하 는 단계를 포함하는 결합 분자의 제조 방법.
  86. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 결합 분자를 이용한 처치를 통해 이익을 얻게되는 대상을 치료하는 방법으로서, 상기 대상이 치료되도록 상기 결합 분자를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  87. 악성 종양을 가진 환자에게 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 결합 분자가 발현되는 조건 하에서 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자를 투여하여 환자 내에서 악성 종양이 치료되도록 하는 단계를 포함하는 악성 종양의 치료 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 대상은 암을 앓고 있는 것인 방법.
  89. 제86항 또는 제87항에 있어서, 추가 제제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 추가 제제는 화학 치료제인 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 추가 제제는 나탈리주맵, 트라스투주맵, 베바시주맵, 인플릭시맵, 리툭시맵, 이브리투모맵 튜세탄, 세툭시맵, 레바미솔 하이드로클로라이드, 토시투모맵, 알렘투주맵, IMC-C225, 이메티닙 메실레이트, 풀베스트랜트, 아 나스트로졸, 엑스메스탄 , 레트로졸, 타목시펜, 인터페론 알파, 데니류킨 디프티톡스, 오블리머센, 엘로티닙 HCl, 보르테조밉, 탈리도마이드, 및 엔도스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  92. 제78항의 결합 분자의 유효 투여량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자의 세포 내에서 크립토 발현의 효과를 억제하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 결합 분자의 유효 투여량은 약 5 mg/kg 이상인 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 결합 분자의 유효 투여량은 약 10 mg/kg 이상인 방법.
  95. 제92항에 있어서, 상기 결합 분자는 복막내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 국소 투여 또는 정맥내 투여하는 것인 방법.
  96. 제92항에 있어서, 상기 환자는 뇌, 유방, 고환, 결장, 폐, 난소, 방광, 자궁, 자궁경부, 췌장 및 위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 장기의 암 환자인 방법.
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