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CN119013300A - 抗cd20/抗cd3双特异性抗体的药物组合物和使用方法 - Google Patents

抗cd20/抗cd3双特异性抗体的药物组合物和使用方法 Download PDF

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CN119013300A
CN119013300A CN202380033318.7A CN202380033318A CN119013300A CN 119013300 A CN119013300 A CN 119013300A CN 202380033318 A CN202380033318 A CN 202380033318A CN 119013300 A CN119013300 A CN 119013300A
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amino acid
domain
seq
fab
antibody
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CN202380033318.7A
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J·J-P·杜博夫
E·D·缪克斯
S·K·K·拉武里
K·勋哈默
I·E·沃尔拉特
L·J·法斯特
M·英加廷格
M·普林茨
尼 博伊永 A·V·奎维特
A·V·奎维特尼博伊永
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Abstract

本发明涉及抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物组合物及其使用方法。

Description

抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物组合物和使用方法
技术领域
本发明涉及抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物组合物及其使用方法。
背景技术
生物技术治疗剂开发的主要挑战之一是蛋白质稳定性，在治疗剂进入市场所涉及的多个过程步骤中必须保持蛋白质稳定性。此外，在储存期间以及在向患者施用期间必须保持蛋白质稳定性。治疗性抗体可以配制在水性载体中以例如通过静脉内或皮下施用向受试者施用。在此类药物组合物的储存、处理和施用期间，有必要减轻治疗性抗体的损失，这可能通过降解和表面吸附而发生，诸如蛋白质吸附到过滤器、储存罐、管道、注射器、静脉注射液袋和其他容器的表面。低浓度和高浓度制剂两者均在研究和开发以及制造过程中都面临着各自的挑战。例如，低浓度受表面吸附的影响很大，而高浓度可能表现出高粘度。
在药物组合物含有相对低浓度的治疗性蛋白质的情况下，蛋白质损失可通过这些因素显著增加，导致药物组合物的治疗功效降低
因此，本领域需要开发药物制剂，其中抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，低剂量抗CD20/抗CD3双特异性抗体，例如低剂量抗CD20/抗CD3 T细胞接合双特异性抗体，例如格菲妥单抗(glofitamab))是稳定的并且被保护免于由于吸附而损失。
发明内容
本发明涉及抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 T细胞接合双特异性抗体(TCB)，例如格菲妥单抗、RO7082859或RG6026)的药物组合物及其使用方法。所公开的组合物和相关方法解决了递送以低浓度配制的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)的问题，确保患者接受预期剂量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)，而在储存和施用期间几乎没有或没有蛋白质损失。
在一个方面，本发明的特征在于一种液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml至25mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体；
约10mM至50mM的缓冲剂；
约≥200mM的张度剂；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约≥0.2mg/ml的表面活性剂；
pH在约5.0至约6.0的范围内，
其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)的浓度在约1mg/ml至5mg/ml的范围内。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)的浓度在约0.9mg/ml至1.1mg/ml的范围内。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)的浓度为约1mg/ml。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
a)第一Fab分子，其与CD3、特别是CD3ε特异性结合；并且
其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
b)第二Fab分子和第三Fab分子，其与CD20特异性结合，其中在第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)、特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)；以及
c)Fc结构域，其由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是格菲妥单抗。
在一个实施例中，缓冲剂为组氨酸缓冲液，任选地为组氨酸HCl缓冲液。在一个实施例中，缓冲剂的浓度为约15mM至25mM。在一个实施例中，缓冲剂的浓度为约20mM。在一个实施例中，缓冲剂提供约5.2至约5.8的pH。
在一个实施例中，张度剂选自由盐、糖和氨基酸组成的组。在一个实施例中，张度剂为蔗糖或氯化钠。在一个实施例中，张度剂是浓度为约200mM或更高的蔗糖。在一个实施例中，张度剂是浓度为约200mM至280mM的蔗糖。在一个实施例中，张度剂是浓度为约240mM的蔗糖。
在一个实施例中，甲硫氨酸的浓度为约5mM至15mM。
在一个实施例中，甲硫氨酸的浓度为约10mM。在一个实施例中，表面活性剂的浓度为约0.2mg/ml至0.8mg/ml。在一个实施例中，表面活性剂为聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188。在一个实施例中，表面活性剂是浓度为0.2mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨醇酯20。在一个实施例中，表面活性剂是浓度为约0.5mg/ml的聚山梨醇酯20
在一个实施例中，液体药物组合物包含：
约1mg/ml至5mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
以及
轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5至约6。
在一个实施例中，液体药物组合物包含：
约1mg/ml的格菲妥单抗；
约20mM的组氨酸缓冲液；
约240mM蔗糖；
约10mM甲硫氨酸；和
约0.5mg/ml的PS20，
pH为约5.5。
在一个实施例中，本发明提供前述方面和实施例中任一项的液体药物组合物用于制备药物的用途，该药物对治疗细胞增殖性疾患有用。
另一方面，本发明的特征在于前述方面和实施例中任一项的药物组合物，其使用于治疗有此需要的受试者的细胞增殖性疾患或延迟其进展。
另一方面，本发明的特征在于前述方面和实施例中任一项的药物组合物，其使用于治疗有此需要的受试者的细胞增殖性疾患或延迟其进展，其包括向受试者施用有效量的前述方面和实施例中任一项的药物组合物。
在特定实施例中，细胞增殖性疾患为癌症。
本发明的另一方面涉及如本文所述的发明。
除非上下文另有明确暗示，否则每一个实施例都可以组合。每一个实施例都可以应用于本发明的每一个方面，除非上下文另有明确暗示。
从下面对某些优选实施例和权利要求的更详细的描述，本发明的具体实施例将变得显而易见。
附图说明
本申请文件含有至少一幅彩色绘图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请的拷贝。
图1A至图1N：显示示例性抗CD20/抗CD3双特异性抗体的构型的示意图。
图2：显示格菲妥单抗的结构的示意图。
图3：制剂开发GLP Tox并进入人体研究。制剂F1至F5的表面活性剂含量，初始对比在5℃、25℃或40℃下储存6周后。
图4A至图4C：制剂开发GLP Tox并进入人体研究，制剂F1至F5的尺寸排阻色谱(SEC)，初始对比在5℃、25℃或40℃下储存6周后。图4A：主峰，图4B：高分子量(HMW)；图4C。低分子量(LMW)。
图5A至图5C：制剂开发GLP Tox并进入人体研究，制剂F1至F5的离子交换色谱(IEC)，初始对比在5℃、25℃或40℃下储存6周后。图5A：主峰，图5B。HMW；图5C。LMW。
图6：制剂开发-制剂F1长达84周的分析结果。F1＝5mg/ml RO7022859(即，格菲妥单抗)、20mM组氨酸HCl pH 5.5、240mM蔗糖、10mM甲硫氨酸、0.05％(w/v)聚山梨醇酯20。
图7A至图7B：制剂开发GLP Tox并进入人体研究，制剂F1至F5的huCD20结合，初始对比在5℃、25℃或40℃下储存3周和6周后(图7A)以及制剂F1至F5的huCD3结合，初始对比在5℃、25℃或40℃下储存3周和6周后(图7B)。
图8A至图8B：III期和商业制剂的开发研究。在5℃下储存104周后，格菲妥单抗尺寸排阻(SE)-HPLC％HMWS(图8A)和离子交换(IE)-HPLC％酸性区(图8B)作为蛋白质浓度的函数。
图9A至图9B：III期和商业制剂的开发研究。在40℃下储存6周后，格菲妥单抗SE-HPLC％HMWS(图9A)和％酸性区(图9B)作为pH和稳定剂(甲硫氨酸)添加的函数。
图10：III期和商业制剂的开发研究。在25℃下储存26周后，格菲妥单抗SE-HPLC％HMWS(包括可见颗粒形成)和IE-HPLC％酸性区作为张度剂的函数。
图11A至图11B：III期和商业制剂的开发研究。在25℃下振荡7天后，格菲妥单抗SE-HPLC％HMWS(包括可见颗粒形成)(图11A)和IE-HPLC％酸性区(图11B)作为表面活性剂的函数。
图12：III期和商业制剂的开发研究。格菲妥单抗PS20含量[mg/ml]和可见颗粒形成作为最初和在5℃下储存104周后的蛋白质浓度的函数。
图13：长期稳定性数据：示例格菲妥单抗DP批次的PS20含量对稳定性的影响(在2℃-8℃下储存)。
具体实施方式
本发明涉及抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物组合物及其使用方法。所公开的组合物和相关方法解决了递送以低浓度配制的抗CD20/抗CD3双特异性抗体的问题，确保患者接受预期剂量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体，而在储存和施用期间几乎没有或没有双特异性抗体损失。
I.一般技术
除非另外指出，否则本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。以下文献中充分解释了此类技术，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第2版(Sambrook等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编，1987，以及定期更新)；“PCR:ThePolymerase Chain Reaction”(Mullis等人编，1994)；“A Practical Guide to MolecularCloning”(Perbal Bernard V.,1988)；“Phage Display:A Laboratory Manual”(Barbas等人，2001)。
II.定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
除非另有指明，否则如本文所用的术语“分化簇20”或“CD20”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD20，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。CD20(也称为B淋巴细胞抗原CD20、B淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16、Bp35、BM5和LF5；UniProt数据库条目P11836中表征了人蛋白质)是一种在前B和成熟B淋巴细胞上表达的分子量为大约35kD的疏水性跨膜蛋白(Valentine,M.A.等人，J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287；Tedder,T.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212；Stamenkovic,I.等人，J.Exp.Med.167(1988)1975-1980；Einfeld,D.A.等人，EMBO J.7(1988)711-717；Tedder,T.F.等人，J.Immunol.142(1989)2560-2568)。对应的人类基因为跨膜4结构域、亚家族A成员1，也称为MS4A1。该基因编码跨膜4A基因家族的成员。该新生蛋白家族的成员的特征在于共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界，并且在造血细胞和非淋巴组织中表现出独特的表达模式。该基因编码B淋巴细胞表面分子，该分子在B细胞发育和分化为浆细胞的过程中起作用。该家族成员在家族成员的簇中定位于11q12。该术语涵盖“全长”的未加工CD20，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD20。该术语还涵盖CD20的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。该基因的替代性的剪接产生两种编码相同蛋白质的转录物变体。在一个实施例中，CD20为人CD20。
术语“抗CD20抗体”和“结合CD20的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合CD20，使得所述抗体可用作靶向CD20的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，抗CD20抗体与不相关的非CD20蛋白的结合程度小于该抗体与CD20的结合程度的约10％。在某些实施例中，与CD20结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。在某些实施例中，抗CD20抗体与CD20的表位结合，该表位在来自不同物种的CD20中是保守的。
“II型抗CD20抗体”是指具有II型抗CD20抗体的结合特性和生物活性的抗CD20抗体，如Cragg等人，Blood 103(2004)2738-2743；Cragg等人，Blood 101(2003)1045-1052，Klein等人，mAbs 5(2013)，22-33中所描述的，并总结于下表1中。
表1.I型和II型抗CD20抗体
I型抗CD20抗体 II型抗CD20抗体
结合I类CD20表位 结合II类CD20表位
将CD20定位至脂筏 不将CD20定位至脂筏
高CDC* 低CDC*
ADCC活性* ADCC活性*
与B细胞的完全结合能力 约对B细胞的半结合能力
弱同型聚合 同型聚合
低细胞死亡诱导 强细胞死亡诱导
*如果IgG1同种型
II型抗CD20抗体的实例包括，例如，奥妥珠单抗(GA101)、托西莫单抗(B1)、人源化B-Ly1抗体IgG1(如WO 2005/044859中公开的嵌合的人源化IgG1抗体)、11B8 IgG1(如WO2004/035607中所公开)和AT80IgG1。
I型抗CD20抗体的实例包括例如利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、维妥组单抗(veltuzumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥克立珠单抗(ocrelizumab)、PRO131921、乌妥昔单抗(ublituximab)、HI47 IgG3(ECACC，杂交瘤)、2C6IgG1(如WO 2005/103081中所公开)、2F2 IgG1(如WO 2004/035607和WO 2005/103081中所公开)和2H7 IgG1(如WO 2004/056312中所公开)。
除非另外指明，否则“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)、非人灵长类动物(例如，食蟹猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD3，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列以UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(144版)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1示出。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列示出于NCBI GenBank号BAB71849.1中。
术语“抗CD20/抗CD3抗体”、“抗CD20/抗CD3双特异性抗体”和“与CD20和CD3结合的双特异性抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD20和CD3两者的双特异性抗体，使得该抗体可用作靶向CD20和/或CD3的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施例中，与CD20和CD3结合的双特异性抗体与不相关的非CD3蛋白和/或非CD20蛋白的结合程度小于抗体与CD3和/或CD20结合的约10％，如通过例如放射免疫测定(RIA)所测量的。在某些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10- 8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)与CD20和/或CD3中的每一个结合。在某些实施例中，与CD20和CD3结合的双特异性抗体与在来自不同物种的CD3中保守的CD3表位和/或在来自不同物种的CD20中保守的CD20表位结合。抗CD20/抗CD3双特异性抗体的一个实例为格菲妥单抗(WHO药物信息(国际药用物质非专利名称)，推荐INN：List83，2020，第34卷，第1号，第39页，也称为抗CD20/抗CD3 T细胞接合双特异性抗体(TCB)、CD20-TCB、RO7082859或RG6026；CAS编号：2229047-91-8)。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如减少的与Fc受体的结合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如Fc区的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用天然存在的二十种标准氨基酸的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如，将Fc区的位置329处的脯氨酸取代为甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，受体与配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的成熟方法来测量。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
“亲和力成熟的”的抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施例中，抗原结合部分能够将其所连接的实体(例如，细胞因子或第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至带有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。优选的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施例中，抗原结合部分可包括如本文进一步定义且在本领域中已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种：κ和λ。
“结合”、“特异性结合”或“特异于”意为结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术(在仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J.17,323-329(2000)))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res.28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，抗原结合部分与不相关蛋白质的结合程度小于该抗原结合部分与抗原的结合程度的约10％，如例如通过SPR所测得的。在某些实施例中，与抗原结合的抗原结合部分，或包含该抗原结合部分的抗原结合分子具有以下解离常数(KD)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如，从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)。
“降低的结合”，例如降低的与Fc受体的结合，是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指与抗原决定簇特异性结合的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物，例如其片段。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如，一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与该位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中称为抗原的蛋白质(例如，CD3)可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一个特定实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白变体，例如剪接变体或等位基因变体。可用作抗原的示例性人蛋白质是CD3，特别是CD3的ε亚基(对于人序列，参见UniProt编号P07766(版本130)、NCBI RefSeq编号NP_000724.1；或对于食蟹猴[Macacafascicularis]序列，UniProt编号Q95LI5(版本49)，NCBI GenBank编号BAB71849.1)。在某些实施例中，本文所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子与在来自不同物种的CD3或靶细胞抗原中保守的CD3或靶细胞抗原的表位结合。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任一者使用，或与这些术语中的任一者可互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
“经分离的”多肽或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可以从多肽的天然或自然环境中移出经分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或实质上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性值％。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South SanFrancisco,California)公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在操作系统上使用，该操作系统包括数字V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以替代性地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与或针对给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性值％是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的术语“抗体片段”还涵盖单结构域抗体。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，之后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类别中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历过人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的抗体可变结构域的区域每一种。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26至32(L1)、50至
52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)
(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处发生的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health
Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触点(MacCallum等
人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、
47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65
(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1至3卷中的亚组。在一个实施例中，对于VL，该亚组是如Kabat等人(出处同上)中的亚组κI。在一个实施例中，对于VH，该亚组是如Kabat等人(出处同上)中的亚组III。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少，或2个或更少。在一些实施例中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语IgG“同种型”或“亚类”是指由免疫球蛋白恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何亚类。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C末端的一个或多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后裂解。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“经切割的变体重链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，EU编号)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991(也参见上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，促进缔合的修饰特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即，Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中该修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不一致的意义上可能是不同的。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
“活化性Fc受体”是如下Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
当关于抗体使用时，术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，这些生物学活性随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞激活。
如本文所用，术语“效应细胞”是指在其表面上展示效应部分受体(例如，细胞因子受体)和/或Fc受体的淋巴细胞群体，通过这些受体，它们结合抗体的效应部分(例如，细胞因子)和/或Fc区，并有助于靶细胞(例如，肿瘤细胞)的破坏。效应细胞可以例如介导细胞毒性或吞噬作用。效应细胞包括但不限于效应T细胞，诸如CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞、γδT细胞、NK细胞、淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。
如本文所用，术语“工程化”、“工程化的”和“工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操作，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。“工程改造”，特别是带有前缀“糖-(glyco-)”，以及术语“糖基化工程改造”，包括细胞的糖基化机制的代谢工程改造，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现在细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程改造包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施例中，糖基化工程改造为糖基转移酶活性的改变。在一个特定的实施例中，工程改造导致改变的葡糖氨基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。糖基化工程改造可用于获得“具有增加的GnTIII活性的宿主细胞”(例如，已被操作以表达增加水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽的宿主细胞)、“具有增加的ManII活性的宿主细胞”(例如，已被操作以表达增加水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽的宿主细胞)，或“具有降低的α(1,6)岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞”(例如，已被操作以表达降低水平的α(1,6)岩藻糖基转移酶的宿主细胞)。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于生成用于本发明的蛋白质的任何类型的细胞系统。在一个实施例中，宿主细胞被工程化以允许产生具有修饰的寡糖的抗体。在某些实施例中，宿主细胞已被操作以表达增加水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些实施例中，宿主细胞已被进一步操作以表达增加水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，仅举几例，还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
如本文所用，术语“具有GnTIII活性的多肽”是指能够催化将β-1,4键中的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基添加至N-连接寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽。根据国际生物化学和分子生物学联盟(NC-IUBMB)命名委员会，这包括表现出与β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(也称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基-转移酶(EC2.4.1.144))的活性相似但不一定相同的酶活性的融合多肽，如在特定的生物测定中测量的，具有或不具有剂量依赖性。在确实存在剂量依赖性的情况下，其不需要与GnTIII相同，而是与GnTIII相比在给定活性中的剂量依赖性基本相似(即，候选多肽相对于GnTIII将表现出更高的活性或不超过约25倍的活性，优选地不超过约十倍的活性，并且最优选地不超过约三倍的活性)。在某些实施例中，具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII的催化结构域和异源高尔基体驻留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。特别地，高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位结构域，最特别是甘露糖苷酶II的定位结构域。替代性地，高尔基体定位结构域选自由以下项组成的组：甘露糖苷酶I的定位结构域、GnTII的定位结构域和α1,6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。用于生成此类融合多肽并使用它们产生具有增加的效应子功能的抗体的方法公开于WO2004/065540、美国临时专利申请号60/495,142和美国专利申请公开号2004/0241817，其全部内容通过引用明确并入本文。
如本文所用，术语“高尔基体定位结构域”是指高尔基体驻留多肽的氨基酸序列，其负责将多肽锚定至高尔基复合体内的某个位置。一般而言，定位结构域包含酶的氨基末端“尾部”。
如本文所用，术语“具有ManII活性的多肽”是指能够催化N-连接的寡糖的支链GlcNAcMan5GlcNAc2甘露糖中间体中末端1,3-和1,6-连接的α-D-甘露糖残基的水解的多肽。根据国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB)，这包括表现出与高尔基体α-甘露糖苷酶II(也称为甘露糖基寡糖1,3-1,6-α-甘露糖苷酶II(EC 3.2.1.114))的活性相似但不一定相同的酶活性的多肽。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其片段通常经由Fc区的N末端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文所用，术语“增加的/降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量的增加/减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度减少/增加。ADCC的增加/降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由通过本文所述的方法工程化为具有改变的糖基化模式(例如，表达糖基转移酶、GnTIII或其他糖基转移酶)的宿主细胞产生的抗体介导的ADCC的增加，是相对于由相同类型的非工程化宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。
“具有增加/降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体”意指具有增加/降低的ADCC的抗体，如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的。一种公认的体外ADCC测定如下：
1)该测定使用已知表达由抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定使用从随机选择的健康供体的血液中分离的人外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞；
3)该测定根据以下方案进行：
i)PBMC使用标准密度离心程序分离，并且以5×106个细胞/ml的密度悬浮于RPMI细胞培养基中；
ii)靶细胞通过标准组织培养方法生长，从指数生长期收获，细胞活力高于90％，在RPMI细胞培养基中洗涤，用100微居里的51Cr标记，用细胞培养基洗涤两次，并且以105个细胞/ml的密度重悬于细胞培养基中；
iii)将100微升上述最终靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴
定板的各个孔中；
iv)将抗体用细胞培养基中从4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml，然后将50微升所得抗体溶液加入96孔微量滴定板中的靶细胞中，一式三份检测涵盖上述整个浓度范围的各种抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，在含有标记靶细胞的板中的另外3个孔中接受50微升2％(v/v)非离子型洗涤剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的水溶液代替抗体溶液(上文第iv点)；
vi)对于自发释放(SR)对照，在包含标记靶细胞的板中的另外3个孔中接受50微升RPMI细胞培养基代替抗体溶液(上文
第iv点)；
vii)然后将96孔微量滴定板以50×g离心1分钟并且在4℃孵育1小时；
viii)将50微升PBMC悬液(上文第i点)加入各个孔中，以得到25:1的效应物:靶细胞比，并且将板置于5％ CO2气氛和37℃的培养箱中培养4小时；
ix)收获来自每个孔的无细胞上清液，并且使用γ计数器定量实验释放的放射性(ER)；
x)根据公式(ER-MR)/(MR-SR)×100计算各抗体浓度下的特异性裂解百分比，其中ER为该抗体浓度的平均定量放射性(见上文第ix点)，MR为MR对照(见上文第v点)的平均定量放射性(见上文第ix点)，并且SR为SR对照(见上文第vi点)的平均定量放射性(见上文第ix点)；
4)“增加的/降低的ADCC”被定义为在上述检测的抗体浓度范围内观察到的特异性裂解的最大百分比的增加/降低，和/或达到在上述检测的抗体浓度范围内所观察到的特异性裂解的最大百分比的一半所需的抗体浓度的降低/增加。ADCC的增加/降低是相对于使用本领域技术人员已知的相同标准生产、纯化、配制和储存方法，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的用上述测定测量的ADCC。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间产生，此类变体通常以少量形式存在)之外，包含该群体的个别抗体具有同一性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本发明的供使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于医药制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N末端至C末端，每条重链均具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
如本文所用，关于抗原结合部分或结构域的术语“第一”、“第二”、“第三”等用于当存在多于一个的每种类型的部分或结构域时便于区分。除非明确说明，否则这些术语的使用并非旨在赋予特定次序或取向。
术语“多特异性”和“双特异性”是指抗原结合分子能够与至少两种不同的抗原决定簇特异性结合。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同细胞上表达的两种抗原决定簇。
如本文所用的术语“价”或“效价”表示抗原结合分子中存在特定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用的“活化性T细胞抗原”是指通过T淋巴细胞、特别是细胞毒性T淋巴细胞表达的抗原决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导或增强T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。示例性的活化性T细胞抗原是CD3。在特定实施例中，活化性T细胞抗原是CD3，特别是CD3的ε亚基(对于人序列，参见UniProt编号P07766(版本130)、NCBIRefSeq编号NP_000724.1；或对于食蟹猴[Macaca fascicularis]序列，UniProt编号Q95LI5(版本49)，NCBI GenBank编号BAB71849.1)。
如本文所用，“T细胞活化”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。用于本发明的T细胞活化治疗剂能够诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定法是本文中描述的本领域已知的。
如本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。在特定实施例中，靶细胞抗原是CD20，特别是人CD20(参见UniProt编号P11836)。
如本文所用的“B细胞抗原”是指存在于B淋巴细胞、特别是恶性B淋巴细胞的表面的抗原决定簇(在这种情况下，该抗原也被称为“恶性B细胞抗原”)。
如本文所用的“T细胞抗原”是指存在于T淋巴细胞、特别是细胞毒性T淋巴细胞表面的抗原决定簇。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
“融合”意指组分(例如，Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或多个肽接头通过肽键链接。
药剂的“有效量”是指在药剂所施用至的细胞或组织中导致生理变化所必需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“治疗剂”意指例如药物组合物的活性成分，其被施用于受试者以试图改变正在治疗的受试者的疾病的自然进程，并且可以用于预防或在临床病理学过程中进行。“免疫治疗剂”是指施用于受试者以试图恢复或增强受试者对例如肿瘤的免疫反应的治疗剂。
术语“药物组合物”是指一种制备物，该制备物的形式允许该制备物中所含的活性成分的生物活性有效，并且该制备物不含对组合物将施用至的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
术语“包装插页”或“使用说明书”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有关于涉及此类治疗产品的使用的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
本文指出的术语“组合治疗”涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本文报道的抗体的施用可以在施用一种或多种另外的治疗剂(优选地一种或多种抗体)之前、同时和/或之后进行。
所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域发生交换(即，彼此替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1构成的肽链(VL-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL构成的肽链(VH-CL，在N末端至C末端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链的恒定结构域和Fab重链的恒定结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。
与此相反，所谓“常规”Fab分子，意指处于其天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变结构域和恒定结构域构成的重链(VH-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由轻链可变结构域和恒定结构域构成的轻链(VL-CL，在N末端至C末端方向)。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(messenger RNA，mRNA)、病毒来源的RNA，或质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“经分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境中移除的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为经分离的。经分离的多核苷酸的另外的实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。经分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子含有在通常含有多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式和双链形式。根据本发明的经分离的多核苷酸或核酸进一步包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，其是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点的突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，可以使用已知的计算机程序诸如下文针对多肽所讨论的程序(例如，ALIGN-2)常规地确定。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，以及允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义并且是指用于将具体基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导该基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的实施例。
“B细胞增殖性疾患”意指一种疾病，其中患者中B细胞数量与健康受试者的B细胞数量相比有所增加，特别是其中B细胞数量的增加是疾病的原因或标志。“CD20阳性B细胞增殖性病症”是B细胞增殖性病症，其中B细胞，特别是恶性B细胞(除正常B细胞外)表达CD20。
示例性B细胞增殖性疾患包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL；例如未另外指明(NOS)的复发性或难治性DLBCL、高级B细胞淋巴瘤(HGBCL；例如，HGBCL NOS、双重打击HGBCL和三重打击HGBCL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)和FL引起的DLBCL(转化的FL；trFL))；滤泡性淋巴瘤(FL)，包括1-3b级FL；套细胞淋巴瘤(MCL)；以及边缘区淋巴瘤(MZL)，包括脾、淋巴结或结外MZL。在一个实施例中，CD20阳性B细胞增殖性疾患是复发性或难治性NHL(例如，复发性或难治性DLBCL、复发性或难治性FL或复发性或难治性MCL)。
“难治性疾病”被定义为对一线疗法未完全缓解。在一个实施例中，难治性疾病定义为对先前疗法没有反应或在6个月内复发。在一个实施例中，难治性疾病的特征在于以下一项或多项：进行性疾病(PD)为一线疗法的最佳反应，稳定疾病(SD)为至少4个周期的一线疗法(例如，4个周期的利妥昔单抗、环磷酰胺、盐酸阿霉素(羟基柔红霉素)、硫酸长春新碱(Oncovin)和泼尼松(也缩写为R-CHOP))后的最佳反应，或部分缓解(PR)为至少6个周期后的最佳反应，以及部分反应后经活检证实的残留疾病或疾病进展。“复发性疾病”被定义为对一线疗法完全缓解。在一个实施例中，通过活检证实疾病复发。在一个实施例中，患者在至少两种先前全身治疗方案(包括至少一种含有蒽环类药物的先前方案和至少一种含有抗CD20定向疗法)后复发或对其无反应。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，个体或受试者是人。在一种情况下，受试者群体中的每个受试者都是人。在一种情况下，受试者的参考群体中的每个受试者都是人。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体诸如治疗(treat)或治疗(treating))是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的方法用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文所用，疾患或疾病的“延迟进展”意指延缓、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推迟疾病或疾患(例如，CD20阳性B细胞增殖性疾患，例如，NHL，例如，DLBCL)的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或待治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，充分或显著延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患该病。例如，在晚期癌症中，中枢神经系统(CNS)转移的发展可能会延缓。
“减少或抑制”意指引起整体降低例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的能力。为清楚起见，该术语还包括减少到零(或低于分析方法的检测极限)，即完全去除或消除。在某些实施例中，减少或抑制可以指在用抗CD20/抗CD3双特异性抗体使用本发明的递增剂量方案治疗后，相对于不变的用双特异性抗体的目标剂量预设给药，减少或抑制不期望的事件，诸如细胞因子驱动的毒性(例如，细胞因子释放综合征(CRS))、输注相关反应(IRR)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、神经毒性、严重肿瘤溶解综合征(TLS)、中性粒细胞减少症、血小板减少症、肝酶升高和/或中枢神经系统(CNS)毒性。在其他实施例中，减少或抑制可以指由抗体Fc区介导的抗体的效应子功能，此类效应子功能具体包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在其他实施例中，减少或抑制可以指正在治疗的CD20阳性B细胞增殖性疾患(例如，NHL(例如，DLBCL)、FL(例如，复发性和/或难治性FL或转化性FL)、MCL、高级B细胞淋巴瘤或PMLBCL)的症状、转移瘤的存在或大小或原发肿瘤的大小。
如本文所用，“施用”意为向受试者给予一定剂量的抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物组合物的方法。本文所述的药物组合物可以静脉内施用(例如，通过静脉内输注)。
如本文所用，“缓冲液”是指通过其酸-碱缀合组分(本文也称为“缓冲剂”)的作用而抵抗pH变化的缓冲溶液。在一些实施例中，本发明的缓冲液具有在约5至约6的范围内的pH。用于本发明的示例性缓冲剂包括但不限于组氨酸(例如，组氨酸HCl)、乙酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐或其组合。在一些实施例中，组氨酸是组氨酸盐酸盐(组氨酸HCl)、组氨酸乙酸盐、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾或其混合物。
根据本发明的药物组合物还可以包含一种或多种张度剂。术语“张度剂”表示用于调节制剂的张度的药用赋形剂。制剂可以是低渗、等渗或高渗制剂。等渗性通常与溶液的渗透压相关，其通常相对于人血清的渗透压(约250mOsmol/kg至350mOsmol/kg)而言。根据本发明所述的制剂可以是低渗、等渗或高渗制剂，但优选为等渗制剂。等渗制剂为液体或由固体形式(例如从冻干形式)重构得到的液体，并且表示与之相比的某种其他溶液诸如生理盐溶液和血清具有相同张度的溶液。合适的张度剂包括但不限于盐类如氯化钠或氯化钾、甘油以及选自氨基酸或糖类的组中的任何组分，特别是葡萄糖。张度剂通常以约≥200mM的量使用。
在稳定剂和张度剂中，存在一组可以两种方式起作用的化合物，即它们可以同时是稳定剂和张度剂。该化合物的实例可参见由糖类、氨基酸、多元醇、环糊精、聚乙二醇和盐组成的组。可同时用作稳定剂和张度剂的糖的一个实例为海藻糖。
如本文所用，“表面活性剂”是指表面活化剂，优选非离子型表面活性剂。本文的表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；辛基糖苷钠；月桂基、肉豆蔻基、亚油基或硬脂酰磺基甜菜碱；月桂基、肉豆蔻基、亚油基或硬脂酰肌氨酸；亚油基、肉豆蔻基或十六烷基甜菜碱；月桂酰氨基丙基、椰油酰胺丙基、亚油酰胺丙基、肉豆蔻基丙基、棕榈酰氨基丙基或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如，月桂酰胺丙基)；肉豆蔻基胺丙基、棕榈酰丙基或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基钠或甲基油基-牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)；聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇与丙二醇的共聚物(例如，型嵌段共聚物，例如F-68)；等等。在一个实施例中，本文的表面活性剂为聚山梨醇酯20(PS20)。在又一实施例中，本文的表面活性剂为泊洛沙姆188(P188)。
“防腐剂”是可以任选地包含在制剂中以基本上减少其中的细菌作用，从而促进例如多用途制剂的生产的化合物。潜在的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲基氯化铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳族醇，诸如苯酚、丁醇和苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚。在一个实施例中，本文的防腐剂为苯甲醇。在一些实施例中，制剂不包括防腐剂。
“稳定的”药物组合物是其中的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)在储存时基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的药物制剂。优选地，制剂在储存(例如，冷冻储存)时基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物活性。储存期通常基于制剂的预期有效期进行选择。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域中现有的，并且综述于例如以下文献中：《肽和蛋白质药物递送》(Peptide and Protein Drug Delivery)，247-301，Vincent Lee主编，Marcel Dekker,Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。可在选定的曝光量和/或温度下测量选定时间段内的稳定性。可以以多种不同的方式定性和/或定量地评估稳定性，包括评估聚集体形成(例如，使用尺寸排阻色谱法、通过测量浊度和/或通过目视检查)；评估ROS形成(例如，通过使用光应激测定或2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)应激测定)；抗CD20/抗CD3双特异性抗体的特定氨基酸残基(例如，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的Met残基(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗))的氧化；通过使用阳离子交换色谱、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评定电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原的和完整的抗CD20/抗CD3双特异性抗体；肽图(例如，胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗CD20/抗CD3双特异性抗体的生物活性或靶标结合功能(例如，与T细胞和/或B细胞的结合)；等等。不稳定性可能涉及以下中任一项或多项：聚集、脱酰胺(例如，Asn脱酰胺)、氧化(例如，Met氧化和/或Trp氧化)、异构化(例如，Asp异构化)、剪切/水解/断裂(例如，铰链区碎裂)、琥珀酰亚胺形成、未配对的半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。
如本文中与根据本发明的制剂结合使用的术语“液体”表示在大气压下在至少约2℃至约8℃的温度下为液体的制剂。
在本申请中，除非另有说明，否则所使用的技术可以在几个众所周知的参考文献中找到，诸如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人，1989,ColdSpring Harbor Laboratory Press)，PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications(Innis等人1990.Academic Press,San Diego,CA)以及Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)。
适当地，除非另有说明，否则通常根据制造商定义的方案和/或参数进行涉及使用市售试剂盒和试剂的程序。因此，在描述本发明的方法和用途之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属、构建体和试剂，因为这些当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
III.药物组合物
本发明提供了包括低浓度的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)的药物组合物及其用途，例如用于治疗B细胞增殖性疾患(例如，非霍奇金淋巴瘤NHL)。本发明的药物组合物可以配制为支持低浓度的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)，并且在储存和临床施用过程中是稳定的，不会因吸附而损失蛋白质。对于在临床施用之前需要进一步稀释和处理的低抗体浓度，吸附可能是重要的问题，并且可能导致低效力值。格菲妥单抗的给药剂量为2.5mg和10mg(分步分次剂量)和30mg维持剂量(目标剂量，固定剂量)。格菲妥单抗旨在经由IV袋输注在0.9％或0.45％氯化钠中稀释后进行IV施用。IV袋中的剂量是通过剂量溶液浓度从0.05mg/ml到0.6mg/ml来实现的。
在一个实施例中，提供了一种液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml至25mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)；
约10mM至50mM的缓冲剂；
约≥200mM的张度剂；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约≥0.2mg/ml的表面活性剂；
pH在约5.0至约6.0的范围内。
在一个实施例中，提供了一种液体药物组合物，其包含：
约5mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)；
约10mM至50mM的缓冲剂；
约≥200mM的张度剂；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约≥0.2mg/ml的表面活性剂；
pH在约5.0至约6.0的范围内。
在一个实施例中，提供了一种液体药物组合物，其包含：
约0.9mg/ml至1.1mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)；
约10mM至50mM的缓冲剂；
约≥200mM的张度剂；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约≥0.2mg/ml的表面活性剂；
pH在约5.0至约6.0的范围内。
在一个实施例中，提供了一种液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)；
约10mM至50mM的缓冲剂；
约≥200mM的张度剂；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约≥0.2mg/ml的表面活性剂；
pH在约5.0至约6.0的范围内。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度在约1mg/ml至5mg/ml的范围内。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度为约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1mg/ml、约1.1mg/ml、约1.5mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml或约5mg/ml。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度为约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml，约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml、约26mg/ml、约27mg/ml、约28mg/ml、约29mg/ml或约30mg/ml。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度在约0.9mg/ml至1.1mg/ml的范围内。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度为约1mg/ml。
在一个实施例中，液体药物组合物包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)，其包含与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:8的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区序列。在又一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ IDNO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含与SEQ ID NO:15至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:16的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区序列。在又一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
(i)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID
NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
(ii)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:
15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列。
在一个实施例中，与抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)的CD3特异性结合的抗原结合结构域是抗体片段，特别是Fab分子或scFv分子，更特别是Fab分子。在特定实施例中，与抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)的CD3特异性结合的抗原结合结构域是交叉Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换(即，彼此替换)。
在一个实施例中，与抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)的CD20特异性结合的抗原结合结构域是抗体片段，特别是Fab分子或scFv分子，更特别是Fab分子。在特定实施例中，与抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)的CD20特异性结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域和与CD3特异性结合的一个抗原结合结构域。在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第一抗原结合结构域和与CD20特异性结合的第二和第三抗原结合结构域。在一个实施例中，第一抗原结合结构域是交叉Fab分子，并且第二和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)进一步包含Fc结构域。液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)可以包含如本文所述的Fc区和/或抗原结合结构域中的修饰。在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含IgG1 Fc结构域，其包含降低对Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含IgG1 Fc结构域，其包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(EU编号)。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
(i)与CD3特异性结合的抗原结合结构域，其在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基的N末端；
(ii)与CD20特异性结合的第一抗原结合结构域，其在Fab重链的C末端处融合至特异性结合CD3的抗原结合结构域的Fab重链的N末端；和
(iii)与CD20特异性结合的第二抗原结合结构域，其在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。
在特定实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
a)第一Fab分子，其与CD3、特别是CD3ε特异性结合；并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
b)第二Fab分子和第三Fab分子，其与CD20特异性结合，其中在第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)、特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)；以及
c)Fc结构域，其由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的两个抗原结合结构域和与CD3特异性结合的一个抗原结合结构域。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)对于CD20是二价的并且对于CD3是单价的。
在一个实施例中，a)下的第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至c)下的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，b)下的第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至a)下的第一Fab分子的重链的N末端，并且b)下的第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至c)下的Fc结构域的另一个亚基的N末端。在一个实施例中，a)下的第一Fab分子包含与SEQ ID NO:15的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区，以及与SEQ ID NO:16的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区。
在又一实施例中，a)下的第一Fab分子包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQID NO:16的轻链可变区序列。
在一个实施例中，b)下的第二Fab分子和第三Fab分子各自包含与SEQ ID NO:7的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区，以及与SEQ ID NO:8的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区。
在一个实施例中，b)下的第二Fab分子和第三Fab分子各自包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列。
在特定实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与SEQ ID NO:17的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与SEQ ID NO:18的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与SEQ ID NO:19的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，以及与SEQ ID NO:20的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一特定的实施例中，双特异性抗体包含SEQ ID NO:17的多肽序列、SEQ ID NO:18的多肽序列、SEQ ID NO:19的多肽序列和SEQ ID NO:20的多肽序列。在又一特定的实施例中，双特异性抗体包含一条包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列的多肽链、一条包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽链、一条包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽链和两条各自包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽链。
PCT公开号WO 2016/020309以及欧洲专利申请号EP15188093和EP16169160中描述了特定的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(各自通过引用以其整体并入本文)。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)与CD3ε特异性结合。
在一个实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以与抗体H2C(PCT公开号WO2008/119567)、抗体V9(Rodrigues等人，Int J Cancer Suppl.7,45-50(1992)和美国专利号6,054,297)、抗体FN18(Nooij等人，Eur J Immunol.19,981-984(1986))、抗体SP34(Pessano等人，EMBO J.4,337-340(1985))、抗体OKT3(Kung等人，Science 206,347-349(1979))、抗体WT31(Spits等人，J Immunol.135,1922(1985))、抗体UCHT1(Burns等人，J Immunol.129,1451-1457(1982))、抗体7D6(Coulie等人，Eur JImmunol.21,1703-1709(1991))或抗体Leu-4竞争结合。在一些实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体还可包含与CD3特异性结合的抗原结合部分，如WO 2005/040220、WO 2005/118635、WO 2007/042261、WO 2008/119567、WO 2008/119565、WO 2012/162067、WO 2013/158856、WO 2013/188693、WO 2013/186613、WO 2014/110601、WO 2014/145806、WO 2014/191113、WO 2014/047231、WO 2015/095392、WO 2015/181098、WO 2015/001085、WO 2015/104346、WO 2015/172800、WO 2016/020444或WO 2016/014974中所述。
在一些实施例中，液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含来自利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥卡妥珠单抗、维妥珠单抗和乌利妥昔单抗的抗体或抗原结合部分。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是格菲妥单抗。
在一些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含本文命名的抗体的通用、生物相似或不可比的生物版本。
在一个实施例中，本文提供的液体药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体是格菲妥单抗。格菲妥单抗(WHO药物信息(药物的国际非专利名称)，推荐INN：List 83,2020,第34卷，第1期，第39页，也称为CD20-TCB、RO7082859或RG6026；CAS编号：2229047-91-8)是一种新型T细胞结合双特异性(TCB)全长抗体，具有2:1分子构型，可与B细胞上的CD20二价结合，并与T细胞上的CD3、特别是CD3ε链(CD3e)单价结合。其CD3结合区域通过灵活的接头融合到头到尾形式的CD20结合区域之一。这种结构赋予格菲妥单抗相对于具有其他1:1构型的CD20-CD3双特异性抗体的优异的体外效力，并在临床前DLBCL模型中产生重要的抗肿瘤功效。CD20双价在存在竞争性抗CD20抗体的情况下保留了这种效力，提供了与这些药物进行预治疗或组合治疗的机会。格菲妥单抗包含一个工程化的异二聚体Fc区，完全去除了与FcgR和C1q的结合。通过同时结合人表达CD20的肿瘤细胞和T细胞上T细胞受体(TCR)复合物的CD3e，除了T细胞活化、增殖和细胞因子释放外，它还诱导肿瘤细胞裂解。格菲妥单抗介导的B细胞裂解是CD20特异性的，在没有CD20表达或T细胞与表达CD20的细胞没有同时结合(交联)的情况下不会发生。除了杀伤之外，T细胞还因CD3交联而被活化，这可通过T细胞活化标记物(CD25和CD69)的增加、细胞因子释放(IFNγ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-10)、细胞毒性颗粒释放(颗粒酶B)和T细胞增殖来检测。格菲妥单抗的分子结构的示意图如图2所示。格菲妥单抗的序列总结在表2中。
表2.格菲妥单抗的序列ID
在一些实施例中，缓冲剂是组氨酸、乙酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐或其组合。在一些实施例中，组氨酸是组氨酸乙酸盐。替代的缓冲剂包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾或其混合物。在特定实施例中，液体药物组合物包含组氨酸缓冲液，即具有组氨酸(通常为L-组氨酸)作为缓冲剂的缓冲液。在特定实施例中，缓冲剂包含L-组氨酸HCl，即包含L-组氨酸或L-组氨酸与L-组氨酸HCl的混合物的缓冲液，并且用盐酸实现pH调节。L-组氨酸HCl缓冲液可以通过将适量的L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐溶解在水中，或者将适量的L-组氨酸溶解在水中并通过添加盐酸将pH调节至所需值来制备。
在某些情况下，缓冲剂(例如，组氨酸，例如L-组氨酸HCl)的浓度为10mM至50mM。例如，缓冲剂可以是10mM至15mM或15mM至20mM，例如6mM至18mM、7mM至16mM、8mM至15mM，或9mM至12mM，例如约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM。在特定情况下，缓冲剂(例如，组氨酸，例如L-组氨酸HCl)的浓度为约15mM至25mM。在一个实施例中，缓冲剂(例如，组氨酸，例如L-组氨酸HCl)的浓度为约20mM。
无论使用何种缓冲液，可以用本领域已知的酸或碱，例如盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾，将pH调节至在约5.0至约6.0的范围内的值，特别是pH约5.2至约5.8。
本发明的发明人发现，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，在pH为约5.2至约5.8的组合物中是特别稳定的。在一个实施例中，缓冲剂提供约5.2至约5.8的pH，特别是约5.5的pH。
在一些实施例中，药物组合物包括张度剂，诸如糖、氨基酸或盐。在张度剂是糖的实施例中，糖可以是例如蔗糖、葡萄糖、甘油或海藻糖。在特定实施例中，糖是蔗糖，任选地是D-蔗糖。在一些实施例中，张度剂是蔗糖或氯化钠。张度剂(例如，糖，例如蔗糖)的浓度可以为至少约≥200mM。例如，张度剂(例如，糖，例如蔗糖)的浓度可诸如200mM至220mM、220mM至240mM、240mM至260mM、260mM至280mM、280mM至300mM、300mM至320mM、320mM至340mM、340mM至360mM、360mM至380mM、380mM至400mM、400mM至420mM、420mM至440mM、440mM至460mM、460mM至480mM或480mM至500mM，例如200mM至300mM，例如约200mM、约210mM、约220mM、约230mM、约240mM、约250mM、约260mM、约270mM、约280mM、约290mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM。在一些实施例中，张度剂的浓度为约200mM至280mM。在一些实施例中，张度剂的浓度为约240mM。在一个特定的实施例中，张度剂是蔗糖并且以至少约200mM的浓度存在，即以约≥200mM的浓度存在。在其他特定的实施例中，张度剂是蔗糖(例如，D-蔗糖)并且以约200mM至280mM的浓度存在。在一个特定的实施例中，张度剂是蔗糖(例如，D-蔗糖)并且以约240mM的浓度存在。
在一些实施例中，液体药物组合物包含甲硫氨酸作为稳定剂。
可以使用任何合适浓度的稳定剂甲硫氨酸。例如，在任何前述药物组合物的一些实施例中，稳定剂(例如，甲硫氨酸)的浓度为约0.01mM至约15mM，例如约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM或约15mM。
在特定实施例中，甲硫氨酸的浓度为约5mM至15mM。在特定实施例中，甲硫氨酸的浓度为约10mM。
本文所述的任何药物组合物可包括表面活性剂。可以使用任何合适的表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂是非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯(聚氧乙烯(n)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚或其组合)。在一些实施例中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(PS20)、TWEEN 例如超精制PS20(已经过专有快速色谱工艺以获得更高纯度的PS20且可从Avantor Performance Materials,LLC(Center Valley,PA,US)获得))或聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(PS80)，例如TWEEN ；例如超精制PS80(Avantor)))。在特定实施例中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。在其他实施例中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188、聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇))。
药物表面活性剂的浓度可以为至少约≥0.2mg/ml，即，浓度为至少约≥0.02％(w/v)。
在本文所述的任何药物组合物的一些实施例中，表面活性剂(例如，PS20或P188)的浓度为约0.01％(w/v)至约2％(w/v)，例如约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％或约2％(w/v)。
在一些实施例中，表面活性剂(例如，PS20或P188)的浓度为约0.1mg/ml至1mg/ml，即0.01％(w/v)至约0.1％(w/v)。在一些实施例中，表面活性剂(例如，PS20或P188)的浓度为约0.2mg/ml至1mg/ml，即0.02％(w/v)至约0.1％(w/v)。在一些实施例中，表面活性剂(例如，PS20或P188)的浓度为约0.2mg/ml至0.8mg/ml，即0.02％(w/v)至约0.08％(w/v)。在一些实施例中，表面活性剂(例如，PS20或P188)的浓度为约0.5mg/ml，即0.05％(w/v)。
在某些实施例中，表面活性剂是P188，并且P188的浓度为约0.05％(w/v)、0.07％(w/v)或0.1％(w/v)。
在特定实施例中，表面活性剂是PS20，并且PS20的浓度为至少约≥0.2mg/ml，即至少约≥0.02％(w/v)PS20的浓度。
在特定实施例中，表面活性剂是PS20，并且PS20的浓度为约0.2mg/ml至0.8mg/ml，即约0.02％(w/v)至约0.08％(w/v)。在特定实施例中，表面活性剂是PS20，并且PS20的浓度为约0.5mg/ml，即0.05％(w/v)。在特定实施例中，表面活性剂是PS20，并且PS20的浓度为至少约≥0.02％(w/v)PS20。在特定实施例中，表面活性剂是PS20，并且PS20的浓度为约0.02％(w/v)至约0.08％(w/v)。在特定实施例中，表面活性剂是PS20，并且PS20的浓度为约0.05％(w/v)。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约1mg/ml至5mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5至约6。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约1mg/ml至5mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约0.9mg/ml至1.1mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，液体药物组合物包含：
约1mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，液体药物组合物包含：
约1mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，
其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
约20mM的组氨酸缓冲液；
约240mM蔗糖；
约10mM甲硫氨酸；和
约0.5mg/ml的PS20，
pH为约5.5。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约1mg/ml至5mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
(i)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
(ii)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约0.9mg/ml至约1.1mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体，其包含：
(i)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
(ii)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约1mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
(i)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
(ii)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约1mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)，其包含：
(i)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
(ii)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列；
约20mM的组氨酸缓冲液；
约240mM蔗糖；
约10mM甲硫氨酸；和
约0.5mg/ml的PS20，
pH为约5.5。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约1mg/ml至5mg/ml的格菲妥单抗，
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约0.9mg/ml至1.1mg/ml的格菲妥单抗，
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约1mg/ml的格菲妥单抗；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5.2至约5.8。
在一个实施例中，根据本发明的液体药物组合物包含：
约1mg/ml的格菲妥单抗；
约20mM的组氨酸缓冲液；
约240mM蔗糖；
约10mM甲硫氨酸；和
约0.5mg/ml的PS20，
pH为约5.5。
制剂还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌程序和通过加入各种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物的存在。防腐剂通常以约0.001％(w/v)至约2％(w/v)的量使用。防腐剂包括但不限于乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和苯扎氯铵。
IV.用于本发明的药物组合物中的治疗剂
A.抗CD20/抗CD3双特异性抗体
本发明提供了抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3T细胞接合双特异性抗体(TCB)，例如格菲妥单抗)的新药物组合物。在一个实施例中，抗体为单克隆抗体。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是多克隆抗体。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是人抗体。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)是人源化抗体。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是嵌合抗体。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是全长抗体。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)是IgG类抗体，特别是IgG1亚类抗体。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)是重组抗体。
在某些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段，以及下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参阅美国专利号5,869,046。在一个实施例中，抗体片段是Fab片段或scFv片段。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。
单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
在某些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于，例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在某些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替换内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870，以及描述技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
包含在抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)中的结合结构域可以通过筛选具有所需活性的结合部分的组合文库来分离。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法在，例如，Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人，编，Human Press,Totowa,NJ,2001)中综述并且进一步描述于以下文献中：例如，McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)中；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)；12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从该噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。替代性地，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)所描述的。最后，还可通过以下方式来制得天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
制备双特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵臼”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过以下技术来制备：工程化静电操纵效应以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；将两种或更多种抗体或片段交联(参见例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science 229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如，Gruber等人，J.Immunol.152:5368(1994))；以及按照例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中的描述制备三特异性抗体。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”，也包括在本文中(参见，例如，US2006/0025576A1)。
本文的抗CD20/抗CD3双特异性抗体还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含结合两个不同抗原的抗原结合位点(参见，例如，US2008/0069820)。
“Crossmab”抗体也包括在本文中(参见例如，WO2009080251、WO2009080252、WO2009080253、WO2009080254)。
用于制备双特异性抗体片段的另一种技术是“双特异性T细胞衔接子”或方法(参见，例如，WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261和WO2008/119567)。该方法利用排列在单个多肽上的两个抗体可变结构域。例如，单条多肽链包括两个单链Fv(scFv)片段，每个片段均具有被多肽接头隔开的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域，多肽接头的长度足以允许两个结构域之间的分子内缔合。该单个多肽进一步包括两个scFv片段之间的多肽间隔区序列。每个scFv识别不同的表位，并且这些表位可以对不同的细胞类型具有特异性，使得当每个scFv与其同源表位接合时，两种不同细胞类型的细胞会接近或束缚在一起。该方法的一个特定实施例包括识别由免疫细胞表达的细胞表面抗原(例如，T细胞上的CD3多肽)的scFv，该scFv与另一个识别靶细胞(诸如恶性或肿瘤细胞)表达的细胞表面抗原的scFv连接。
由于其是单一多肽，因此双特异性T细胞衔接子可以使用本领域已知的任何原核或真核细胞表达系统(例如，CHO细胞系)来表达。然而，可能需要特定的纯化技术(参见，例如，EP1691833)将单体双特异性T细胞衔接子与其他多聚体物种分离，这些多聚体物种可能具有不同于单体的预期活性的生物活性。在一个示例性纯化方案中，首先使含有分泌多肽的溶液经受金属亲和色谱法，并且用咪唑浓度梯度洗脱多肽。使用阴离子交换色谱法进一步纯化该洗脱液，并且使用氯化钠浓度梯度洗脱多肽。最后，使该洗脱液经受尺寸排阻色谱法，以将单体与多聚体分离。
在某些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以被进一步修饰以包含本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)的衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。连接至抗体的聚合物的数目可变化，并且如果连接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
抗CD20/抗CD3双特异性抗体也可与一种或多种细胞毒性剂缀合，诸如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登素类生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0425235 B1)；奥瑞他汀(auristatin)，诸如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588以及7,498,298)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类药物，诸如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地碱；紫杉烷，诸如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替塞他赛和奥他他赛；单端孢菌素；以及CC1065。
在另一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体缀合至酶活性毒素或其片段，其包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(Saponaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白(gelonin)、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecene)。
在另一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体缀合至放射性原子以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如Tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)来制备抗CD20/抗CD3双特异性抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO94/11026。接头可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，CancerRes.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)被指示用于治疗细胞增殖性疾患(例如，癌症)。在一个实施例中，细胞增殖性疾患为癌症。在一个实施例中，癌症为B细胞增殖性疾患。在一个实施例中，癌症为CD20阳性B细胞增殖性疾患。在一个实施例中，癌症为非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一个实施例中，NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级B细胞淋巴瘤(HGBCL)、由滤泡性淋巴瘤(FL)[转化的FL；trFL]引起的DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)或边缘区淋巴瘤(MZL)。MZL可分为脾MZL、淋巴结MZL和结外MZL。在一个实施例中，NHL是套细胞淋巴瘤(MCL)。在一个实施例中，NHL是1-3a级滤泡性淋巴瘤(FL)。在一个实施例中，CD20阳性B细胞增殖性疾患是复发性或难治性B细胞增殖性疾患。在一个实施例中，复发性或难治性B细胞增殖性疾患是复发性或难治性NHL(例如，复发性或难治性DLBCL、复发性或难治性FL或复发性或难治性MCL)。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)与CD3ε特异性结合。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以与抗体H2C(PCT公开号WO2008/119567)、抗体V9(Rodrigues等人，Int J Cancer Suppl.7,45-50(1992)和美国专利号6,054,297)、抗体FN18(Nooij等人，Eur J Immunol.19,981-984(1986))、抗体SP34(Pessano等人，EMBO J.4,337-340(1985))、抗体OKT3(Kung等人，Science 206,347-349(1979))、抗体WT31(Spits等人，J Immunol.135,1922(1985))、抗体UCHT1(Burns等人，JImmunol.129,1451-1457(1982))、抗体7D6(Coulie等人，Eur J Immunol.21,1703-1709(1991))或抗体Leu-4竞争结合。在一些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体还可包含与CD3特异性结合的抗原结合部分，如WO 2005/040220、WO 2005/118635、WO 2007/042261、WO2008/119567、WO 2008/119565、WO 2012/162067、WO 2013/158856、WO 2013/188693、WO2013/186613、WO 2014/110601、WO 2014/145806、WO 2014/191113、WO 2014/047231、WO2015/095392、WO 2015/181098、WO 2015/001085、WO 2015/104346、WO 2015/172800、WO2016/020444或WO 2016/014974中所述。
在一些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含来自利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥卡妥珠单抗、维妥珠单抗和乌利妥昔单抗的抗体或抗原结合部分。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体是格菲妥单抗。
在一些实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含本文命名的抗体的通用、生物相似或不可比的生物版本。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:8的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区序列。在又一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含与SEQ ID NO:15至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:16的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区序列。在又一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
(i)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
(ii)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列。
在一个实施例中，与抗CD20/抗CD3双特异性抗体的CD3特异性结合的抗原结合结构域是抗体片段，特别是Fab分子或scFv分子，更特别是Fab分子。在特定实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)的与CD3特异性结合的抗原结合结构域是交叉Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换(即，彼此替换)。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域和与CD3特异性结合的一个抗原结合结构域。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD3特异性结合的第一抗原结合结构域，以及与CD20特异性结合的第二和第三抗原结合结构域。在一个实施例中，第一抗原结合结构域是交叉Fab分子，并且第二和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)进一步包含Fc结构域。抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含如本文所述的Fc区和/或抗原结合结构域中的修饰。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)包含IgG1 Fc结构域，其包含降低对Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含IgG1 Fc结构域，其包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(EU编号)。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
(i)与CD3特异性结合的抗原结合结构域，其在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基的N末端；
(ii)与CD20特异性结合的第一抗原结合结构域，其在Fab重链的C末端处融合至特异性结合CD3的抗原结合结构域的Fab重链的N末端；和
(iii)与CD20特异性结合的第二抗原结合结构域，其在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。
在特定实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含：
a)第一Fab分子，其与CD3、特别是CD3ε特异性结合；并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
b)第二Fab分子和第三Fab分子，其与CD20特异性结合，其中在第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)、特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)；以及
c)Fc结构域，其由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)包含与CD20特异性结合的两个抗原结合结构域和与CD3特异性结合的一个抗原结合结构域。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)对于CD20是二价的并且对于CD3是单价的。
在一个实施例中，a)下的第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至c)下的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，b)下的第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至a)下的第一Fab分子的重链的N末端，并且b)下的第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至c)下的Fc结构域的另一个亚基的N末端。在一个实施例中，a)下的第一Fab分子包含与SEQ ID NO:15的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区，以及与SEQ ID NO:16的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区。
在又一实施例中，a)下的第一Fab分子包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列和SEQID NO:16的轻链可变区序列。
在一个实施例中，b)下的第二Fab分子和第三Fab分子各自包含与SEQ ID NO:7的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区，以及与SEQ ID NO:8的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变区。
在一个实施例中，b)下的第三Fab分子下的第二Fab分子各自包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列。
在特定实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含与SEQ ID NO:17的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与SEQ ID NO:18的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，与SEQ ID NO:19的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，以及与SEQ ID NO:20的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一特定的实施例中，双特异性抗体包含SEQ ID NO:17的多肽序列、SEQ ID NO:18的多肽序列、SEQ ID NO:19的多肽序列和SEQ ID NO:20的多肽序列。在又一特定的实施例中，双特异性抗体包含一条包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的多肽链、一条包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽链、一条包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽链和两条各自包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽链。
PCT公开号WO 2016/020309以及欧洲专利申请号EP15188093和EP16169160中描述了特定的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(各自通过引用以其整体并入本文)。在一个实施例中，本发明的药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体是格菲妥单抗。
B.抗体格式
1.抗CD20/抗CD3双特异性抗体的构型
抗CD20/抗CD3双特异性抗体的组分可以以多种构型彼此融合。示例性构型在图1中描述。
在特定实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体中包含的抗原结合部分是Fab分子。在此类实施例中，第一、第二、第三抗原结合部分等在本文中可分别称为第一、第二、第三Fab分子等。此外，在特定实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含Fc结构域，其由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成。
在一些实施例中，第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在一个这样的实施例中，第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。在具体的此类实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体基本上由第一Fab分子和第二Fab分子、由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。此构型在图1G和1K中示意性地描绘。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一个实施例中，第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端。在具体的此类实施例中，抗体基本上由第一Fab分子和第二Fab分子、由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子和第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的亚基中的一者的N末端。此构型在图1A和1D中示意性地描绘。第一Fab分子和第二Fab分子可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合。在一个特定实施例中，所述第一Fab分子和所述第二Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。
在其他实施例中，第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端。在一个这样的实施例中，第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。在具体的此类实施例中，抗体基本上由第一Fab分子和第二Fab分子、由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端。此构型在图1H和1L中示意性地描绘。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
Fab分子可以直接或通过肽接连接基与Fc结构域融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括，例如，(G4S)n(SEQ ID NO:21)、(SG4)n(SEQ ID NO:22)或G4(SG4)n(SEQID NO:23)肽接头。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个实施例中，所述肽接头的长度为至少5个氨基酸，在一个实施例中长度为5至100个氨基酸，在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个实施例中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)(SEQID NO:27-58)，在一个实施例中，x＝4并且n＝2或3，在另一实施例中，x＝4并且n＝2。在一个实施例中，所述肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:24)。用于使第一Fab分子和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:24)。适于连接第一Fab片段和第二Fab片段的Fab重链的示例性肽接头包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25)。另一种合适的此类接头包含序列(G4S)4(SEQ ID NO:26)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
具有能够特异性结合靶细胞抗原(例如如图1A、1D、1G、1H、1K或1L中所示)的单个抗原结合部分(诸如Fab分子)的抗体是有用的，特别是在高亲和力抗原结合部分的结合之后预期靶细胞抗原的内在化的情况下。在这种情况下，存在一个以上对靶细胞抗原特异的抗原结合部分可能会增强靶细胞抗原的内化，从而降低其可用性。
然而，在许多其他情况下，具有包含对靶细胞抗原特异的两个或多个抗原结合部分(诸如Fab分子)的抗体将是有利的(参见图1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N中所示的实例)，例如以优化靶向靶位点或允许靶细胞抗原交联。
因此，在特定实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含两个抗CD20结合部分，例如靶向CD20的两个Fab分子。在一个实施例中，靶向CD20的两个Fab分子是常规Fab分子。在一个实施例中，靶向CD20的两个Fab分子包含相同的重链和轻链氨基酸序列，并且具有相同的结构域排列(即，常规或交叉)。
在替代实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含两个抗CD3结合部分，例如靶向CD3的两个Fab分子。在一个此类实施例中，靶向CD3的两个Fab分子均为交叉Fab分子(其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换的Fab分子)。在一个此类实施例中，靶向CD3的两个Fab分子包含相同的重链和轻链氨基酸序列，并且具有相同的结构域排列(即，常规或交叉)。
在一个实施例中，第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在特定实施例中，第二和第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。在具体的此类实施例中，抗体基本上由第一Fab分子、第二Fab分子和第三Fab分子、由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基的N末端，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。此构型在图1B和图1E(实施例，其中第三Fab分子是常规Fab分子并且与第二Fab分子相同)和图1I和图1M(实施例，其中第三Fab分子是交叉Fab分子并且优选地与第一Fab分子相同)中示意性地描绘。第二和第三Fab分子可以直接或通过肽接头融合至Fc结构域。在一个具体实施例中，第二和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一个实施例中，第二Fab分子和第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的亚基中的一者的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。在具体的此类实施例中，抗体基本上由第一Fab分子、第二Fab分子和第三Fab分子、由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基的N末端，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。此构型在图1C和图1F(实施例，其中第三Fab分子是常规Fab分子并且与第二Fab分子相同)和图1J和图1N(实施例，其中第三Fab分子是交叉Fab分子并且与第一Fab分子相同)中示意性地描绘。第一和第三Fab分子可以直接或通过肽接头融合至Fc结构域。在一个具体实施例中，第二和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在抗体的构型中，其中Fab分子在Fab重链的C末端处通过免疫球蛋白铰链区融合至Fc结构域的亚基中的每个亚基的N末端，两个Fab分子、铰链区和Fc结构域基本上形成免疫球蛋白分子。在特定实施例中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在甚至更特定的实施例中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施例中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一个特定的实施例中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他实施例中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
在一些抗体中，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合，任选地经由肽接头融合。根据第一Fab分子和第二Fab分子的构型，第一Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第二个Fab分子的Fab轻链的N末端，或第二Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N末端。第一Fab分子和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步减少了未匹配的Fab重链和轻链的错配，并且还减少了表达一些抗体所需的质粒数量。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))，以及这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该Fab轻链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))，以及这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，抗体进一步包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab轻链可变区继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。
在这些实施例的一些中，抗体进一步包含第一Fab分子的交叉Fab轻链多肽，其中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在这些实施例的其他实施例中，抗体进一步包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2))，或这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链多肽与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))，视情况而定。
根据这些实施例的抗体可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))。
在这些实施例的一些中，抗体进一步包含第一Fab分子的交叉Fab轻链多肽，其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在这些实施例的其他实施例中，抗体进一步包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2))，或这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链多肽与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))，视情况而定。
根据这些实施例的抗体可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第二Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第三Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第三Fab分子的Fab轻链可变区继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，抗体进一步包含这样的多肽，其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第三Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第三Fab分子的Fab重链可变区继而与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-VH(3)-CL(3))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，抗体进一步包含这样的多肽，其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第三Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，抗体进一步包含这样的多肽，其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施例中，抗体包含这样的多肽，其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第三Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即，第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3)-VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，抗体还包含这样的多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，抗体进一步包含这样的多肽，其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
根据上述任一实施例，抗体的组分(例如，Fab分子、Fc结构域)可以直接或通过各种接头融合，特别是包含一个或多个氨基酸、通常约2至20个氨基酸的肽接头融合，这些接头在本文中描述或在本领域中是已知的。合适的非免疫原性肽接头包括，例如，(G4S)n(SEQID NO:21)、(SG4)n(SEQ ID NO:22)或G4(SG4)n(SEQ ID NO:23)肽接头，其中n通常为1至10的整数，通常为2至4。
2.Fc结构域
抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含由一对包含抗体分子的重链结构域的多肽链组成的Fc结构域。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。
在一个实施例中，Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个特定实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在更具体的实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域，其包含位置S228处的氨基酸取代(Kabat编号)，特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，DrugMetabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定实施例中，Fc结构域是人的。
(i)促进异源二聚化的Fc结构域修饰
抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含融合至Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个的不同组分(例如，抗原结合结构域)，因此Fc结构域的两个亚基通常包含在两条不同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了提高此类抗体在重组生产中的产率和纯度，因此将有利的是在抗体的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在特定实施例中，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。
在Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异源二聚化的几种方法在例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO2013096291中充分描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于改善的重链异源二聚化的不同方法被认为是与重-轻链修饰(例如，Fab臂中的可变或恒定区交换/替换，或在CH1/CL界面中引入带相反电荷的带电荷氨基酸的取代)相结合的不同替换方案，其减少了轻链错配和Bence Jones型副产物。
在一个具体实施例中，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“突出物入孔”修饰，该修饰包含在Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中进行“突出物”修饰并且在Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中进行“孔”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，ProtEng.9,617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth.248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在特定实施例中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内生成突起，该突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内生成空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在该空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。
在具体实施例中，在Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)的CH3结构域中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，并且在Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)的CH3结构域中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。在一个实施例中，另外在Fc结构域的第二亚基中，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(EU编号)。
在又进一步的实施例中，另外在Fc结构域的第一亚基中，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(EU编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在特定实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)。
在特定实施例中，本文所述的CD3抗原结合部分融合至Fc结构域的第一亚基(包含“杵”修饰)。不希望受理论束缚，CD3抗原结合部分与Fc结构域的含杵的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个CD3抗原结合部分的双特异性抗体的生成(两个含杵的多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为替代方案，描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO2013/096291中。
在一个实施例中，替代性地使用EP 1870459 A1中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。一个优选的实施例是(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一者中的氨基酸突变R409D和K370E以及Fc结构域的CH3结构域中的另一者中的氨基酸突变D399K和E357K(EU编号)。
在另一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A和Y407V，以及另外地Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变R409D和K370E以及Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变D399K和E357K(EU编号)。
在另一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体可包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C和T366W以及Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A和Y407V，或者抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C和T366W以及Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A和Y407V，以及另外地Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变R409D和K370E，以及Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变D399K和E357K(所有EU编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(EU编号)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一实施例中，第二CH3结构域进一步包含选自Y349E、Y349D和L368E(优选地L368E)的氨基酸突变(EU编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A和K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域包含在位置T411、D399、S400、F405、N390或K392处的进一步氨基酸突变，例如选自：(a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；(b)D399R、D399W、D399Y或D399K；(c)S400E、S400D、S400R或S400K；(d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W；(e)N390R、N390K或N390D；或(f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(EU编号)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y和Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V和K409F。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A和K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域进一步包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(EU编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(EU编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述突出物入孔技术。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(EU编号)。
在一个实施例中，抗CD20/抗CD3双特异性抗体或抗CD20/抗CD3双特异性抗体的Fc结构域属于IgG2亚类并且使用WO 2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在替代的实施例中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基替换两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个此类实施例中，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选地K392D或N392D)对K392或N392进行的氨基酸取代，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选地D399K、E356K、D356K或E357K，并且更优选地D399K和E356K)对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步包含用带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选地K409D或R409D)对K409或R409进行的氨基酸取代。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步或替代地包含用带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K439和/或K370进行的氨基酸取代(EU编号)。
在又一实施例中，替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(EU编号)。
在又一实施例中，使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(EU编号)。
(ii)降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予抗体诸如抗CD20/抗CD3双特异性抗体有利的药代动力学特性，包括有助于在靶组织中良好累积的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，同时，它可能导致抗体不希望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导途径的共活化可导致细胞因子释放，其与抗体可具有的其他免疫刺激特性和抗体的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。
因此，在特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，抗CD20/抗CD3双特异性抗体的Fc结构域表现出对Fc受体的结合亲和力降低和/或效应子功能降低。在一个此类实施例中，与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的相应分子)相比，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的分子，例如抗体)表现出对Fc受体的结合亲和力小于50％，优选地小于20％，更优选地小于10％，并且最优选地小于5％，和/或与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的相应分子)相比小于50％，优选地小于20％，更优选地小于10％，并且最优选地小于5％的效应子功能。在一个实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的分子，例如抗体)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。在一个实施例中，效应子功能为选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种效应子功能。在一个特定实施例中，效应子功能是ADCC。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的分子，例如抗体)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的相应分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施例中，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中，Fc结构域包含降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个实施例中，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施例中，与包含非工程化的Fc结构域的相应分子相比，包含工程化的Fc结构域的分子(例如，抗体)表现出对Fc受体的结合亲和力小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些实施例中，对补体组分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的分子，例如抗体)表现出非工程化形式的Fc结构域(或包含所述非工程化形式的Fc结构域的相应分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的对FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的分子(例如，抗体)可表现出大于约80％，并且甚至大于约90％的此类亲和力。在某些实施例中，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个实施例中，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种降低的效应子功能。在一个特定实施例中，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个实施例中，降低的ADCC小于由非工程化的Fc结构域(或包含非工程化的Fc结构域的相应分子)诱导的ADCC的20％。
在一个实施例中，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代(EU编号)。在更具体的实施例中，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代(EU编号)。在一些实施例中，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(EU编号)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域包含在P329位的氨基酸取代。在更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(EU编号)。在一个实施例中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，以及在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步氨基酸取代(EU编号)。在更具体的实施例中，该进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代(EU编号)。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329GLALA”)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在通过引用而整体并入本文的PCT公开号WO 2012/130831中所述。WO2012/130831还描述了制备此类突变型Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域，特别是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸取代，具体是氨基酸取代S228P(EU编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4Fc结构域包含在位置L235处的氨基酸取代，具体是氨基酸取代L235E(EU编号)。在另一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代P329G(EU编号)。在特定实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(EU编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合特性描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开通过引用以其整体并入本文。
在特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc结构域(EU编号)。
在某些实施例中，已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个此类实施例中，Fc结构域包含位置N297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)或甘氨酸(N297G)替换天冬酰胺的氨基酸取代(EU编号)。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外，具有降低的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(EU编号)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两者或多者处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变型Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
对Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。替代性地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的分子对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域或包含Fc结构域的分子(例如，抗体)的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。本文描述了用于测量ADCC的合适测定。评定目的分子的ADCC活性的体外测定的其他实例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人Proc Natl Acad Sci USA.83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA.82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。替代性地，可使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA95,652-656(1998)中公开的动物模型I体内评定目标分子的ADCC活性。
在一些实施例中，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含Fc结构域的分子(例如，抗体)是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评定补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，JImmunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
3.取代、插入和缺失
在某些情况下，本文提供的药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体变体具有一个或多个氨基酸取代。用于取代突变的目的位点包括HVR和FR。保守置换在表3中的“优选置换”标题下示出。更多实质性改变提供于表3的“示例性置换”标题下，并且在下文参考氨基酸侧链类别进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目的抗体中，并且对产物进行所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表3.示例性和优选的氨基酸取代
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高可变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
例如，可改变(例如，取代)HVR，以改善抗体亲和力。此类改变可在HVR“热点”中进行，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的一些实例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向突变)中的任一者将多样性引入出于成熟目的而挑选的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中将若干HVR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。参与抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴定。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实例中，置换、插入或缺失可出现在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文所述的保守性取代)。此类改变可以在HVR的抗原接触残基之外。在上文所述的变体VH和VL序列的某些情况下，每个HVR保持不变，或包括不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。可替代地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽的抗体的N末端或C末端的融合。
4.糖基化
在某些情况下，可以改变本发明的药物组合物中包含的抗CD20/抗CD3双特异性抗体，以增加或降低抗体糖基化的程度。抗CD20/抗CD3双特异性抗体的糖基化位点的添加或缺失可以通过改变氨基酸序列使得产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键合连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些情况下，对抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改进特性的抗体变体。
在一种情况下，抗CD20/抗CD3双特异性抗体变体具有缺少与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。例如，如WO 2008/077546中所述，通过计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量，相对于通过MALDI-TOF质谱法测量的连接到Asn297的所有糖结构(例如，复合物、杂合物和高甘露糖结构)的总和，来确定岩藻糖的量。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。有关“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是在实例11中)，以及敲除基因的细胞系，诸如敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
鉴于上文所述，在一些情况下，本发明的药物组合物包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体变体，其包含非糖基化位点突变。在一些情况下，去糖基化位点突变降低了抗体的效应子功能。在一些情况下，去糖基化突变是一种取代突变。在一些情况下，抗体包含在Fc区中的取代突变，其降低了效应子功能。在一些情况下，取代突变在氨基酸残基N297、L234、L235和/或D265(EU编号)处。在一些情况下，取代突变选自由以下项组成的组：N297G、N297A、L234A、L235A、D265A和P329G。在一些情况下，取代突变在氨基酸残基N297处。在一种优选情况下，取代突变为N297A。
抗CD20/抗CD3双特异性抗体变体可包含二等分的寡糖，例如，其中连接到抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和U.S.2005/0123546中。其他抗体变体在连接至Fc区的寡糖中包含至少一个半乳糖残基。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO1998/58964和WO 1999/22764中。
5.抗体衍生物
在某些情况下，本文提供的药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体被进一步修饰，以包含本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
在另一种情况下，抗体和非蛋白质部分的缀合物可以通过暴露于辐射而选择性地加热。在一个实例中，非蛋白质性部分为碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害、但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分近端的细胞被杀死的温度的波长。
C.重组生产方法
本发明的药物组合物的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)可以使用重组方法和组合物来产生，例如，如美国专利号4,816,567中所述，其通过引用以其整体并入本文。
为了重组生产抗CD20/抗CD3双特异性抗体，分离编码抗体的核酸并将其插入一个或多个载体中，以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(另请参见Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可以在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，该真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株：其糖基化途径已经“人源化”，从而使得产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如在Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR–CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo,编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
V.治疗方法和用途
包含本文所述的抗CD20/抗CD3双特异性抗体的药物组合物可以配制用作治疗各种疾病和疾患的药物。因此，本发明的特征在于涉及向有此需要的受试者(例如，患有疾病或疾患(诸如癌症)的受试者)静脉内施用药物组合物的方法。本发明的药物组合物可用于治疗有此需要的受试者(例如，有此需要的人受试者)的细胞增殖性疾患或延迟其进展，或增强患有细胞增殖性疾患(例如，癌症)的受试者的免疫功能。
在一个方面，本发明提供了一种如本文所述的药物组合物，其使用于治疗细胞增殖性疾患或延迟其进展。在一个方面，本发明提供了如本文所述的药物组合物在制造用于治疗细胞增殖性疾患或延迟其进展的药物中的用途。在一个方面，本发明提供了一种治疗有此需要的受试者的细胞增殖性疾患或延迟其进展的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的药物组合物。
在一些实施例中，细胞增殖性疾患是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的癌症。在一些实施例中，NHL选自由以下项组成的组：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之间的B细胞淋巴瘤、具有11q畸变的伯基特样淋巴瘤、特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤之间的B细胞淋巴瘤、生发中心B细胞样(GCB)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞样(ABC)DLBCL、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、中枢神经系统的原发性DLBCL、原发性皮肤DLBCL(腿部型)、老年人的爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)阳性DLBCL、与慢性炎症相关的DLBCL、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯特莱曼病引起的大B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)、原位滤泡性瘤形成、套细胞淋巴瘤(MCL)、原位套细胞瘤形成、急性髓性白血病(AML)、边缘区淋巴瘤(MZL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LL)、中枢神经系统淋巴瘤(CNSL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、脾边缘区淋巴瘤、毛细胞性白血病、脾淋巴瘤/白血病、变异型毛细胞白血病、α重链病、γ重链病、μ重链病、浆细胞骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、结节性边缘区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘区淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、浆母细胞性淋巴瘤和原发性渗出性淋巴瘤。在特定实施例中，癌症是生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化B细胞样(ABC)DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴样白血病(CLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LL)、华氏巨球蛋白血症(WM)、中枢神经系统淋巴瘤(CNSL)或伯基特淋巴瘤(BL)。
在一些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、多发性骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤和胶质母细胞瘤。
抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以配制用于以0.5mg、2.5mg、10mg或30mg的剂量施用于受试者。
对于本文所述的所有方法和药物制剂，抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)不必是目前用于预防或治疗所讨论疾患的一种或多种药剂，但任选地与这些药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)可以在一系列治疗中适当施用于患者。
VI.制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。该容器容纳药物组合物，该药物组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地治疗、预防和/或诊断病症，并且该容器可以具有无菌进入口(例如该容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。如本文所述，组合物中的至少一种活性剂是抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)。标记或包装插页指示组合物用于治疗选择的病症(例如，癌症)，并且进一步包括与本文所述的给药方案中的至少一种相关的信息。
药物组合物可以在具有1ml至100ml(例如，1ml至5ml、5ml至10ml、10ml至15ml、15ml至20ml、20ml至25ml、25ml至30ml、30ml至40ml、40ml至50ml、50ml至60ml、60ml至70ml、70ml至80ml、80ml至90ml或90ml至100ml，例如约5ml、约10ml、约15ml、约20ml、约25ml、约30ml、约40ml、约50ml、约60ml、约70ml、约80ml、约90ml或约100ml)的体积的容器中供应。
在一些实施例中，容器是不锈钢容器或镍钢合金容器(例如，)，诸如箱、小型箱、罐、罐子等。在一些情况下，这种容器中的药物组合物是药物物质(DS)，其可以在使用前进一步稀释，例如稀释成药品(DP)(例如，在最终的小瓶配置中)。替代性地，容器中的药物组合物是DP。在一些实施例中，DP在容器中，诸如IV袋或注射器(例如，用于经由注射泵递送)。
在一些实施例中，制品包括具有约1ml或更大，例如约1ml、约2ml、约3ml、约4ml、约5ml、约6ml、约7ml、约8ml、约9ml、约10ml、约11ml、约12ml、约13ml、约14ml、约15ml、约16ml、约17ml、约18ml、约19ml、约20ml、约25ml、约30ml、约35ml、约40ml、约50ml或更大的体积的小瓶。在一些实施例中，容器是具有约10ml的体积的小瓶。在一些实施例中，小瓶是一次性使用的。在一些实施例中，小瓶含有约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg或更多的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3 TCB，例如格菲妥单抗)。在一些实施例中，容器封闭系统包括玻璃瓶、塞子和盖中的一个或多个或全部。
此外，制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该药物组合物包含本文所述的抗CD20/抗CD3双特异性抗体(例如，抗CD20/抗CD3TCB，例如格菲妥单抗)；和(b)其中含有药物组合物的第二容器，其中该药物组合物包含进一步的细胞毒性剂或其他治疗剂。替代性地或除此之外，所述制品可以还包括第二(或第三)容器，该二(或第三)容器包含药用缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户的角度所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
本发明的另一方面涉及如上文所述的发明。
实施例
可以根据以下编号的实施例中的任一项来定义本文描述的技术的一些实施例：
I.一种液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml至25mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体；
约10mM至50mM的缓冲剂；
约≥200mM的张度剂；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约≥0.2mg/ml的表面活性剂
pH在约5.0至约6.0的范围内，
其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
II.根据实施例I所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度在约1mg/ml至5mg/ml的范围内。
III.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度在约0.9mg/ml至1.1mg/ml的范围内。
IV.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度为约1mg/ml。
V.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/
抗CD3双特异性抗体包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列。
VI.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：
a)第一Fab分子，其与CD3、特别是CD3ε特异性结合；并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
b)第二Fab分子和第三Fab分子，其与CD20特异性结合，其中在第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)、特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)；以及
c)c)Fc结构域，其由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成。VII.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体为格菲妥单抗。
VIII.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂为组氨酸缓冲液，任选地为组氨酸HCl缓冲液。
IX.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约15mM至25mM。
X.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约20mM。
XI.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂提供约5.2至约5.8的pH。
XII.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述张度剂选自由盐、糖和氨基酸组成的组。
XIII.根据实施例XII所述的液体药物组合物，其中所述张度剂为蔗糖或氯化钠。
XIV.根据实施例XIII所述的液体药物组合物，其中所述张度剂是浓度为约200mM或更高的蔗糖。
XV.根据实施例XIII或XIV所述的液体药物组合物，其中所述张度剂是浓度为约200mM至280mM的蔗糖。
XVI.根据实施例XIII至XV中任一项所述的液体药物组合物，其中所述张度剂是浓度为约240mM的蔗糖。
XVII.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述甲硫氨酸的浓度为约5mM至15mM。
XVIII.根据实施例XVII所述的液体药物组合物，其中所述甲硫氨酸的浓度为约10mM。
XIX.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为约0.2mg/ml至0.8mg/ml。
XX.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188。
XXI.根据实施例XX所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂是浓度为0.2mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨醇酯20。
XXII.根据实施例XXI所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂是浓度为约0.5mg/ml的聚山梨醇酯20。
XXIII.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml至5mg/ml的所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5至约6。
XXIV.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml的格菲妥单抗；
约20mM的组氨酸缓冲液；
约240mM蔗糖；
约10mM甲硫氨酸；和
约0.5mg/ml的PS20，
pH为约5.5。
XXV.根据前述实施例中任一项所述的液体药物组合物用于制备药物的用途，所述药物对治疗细胞增殖性疾患有用。
XXVI.根据实施例I至XXIV中任一项所述的药物组合物，其使用于治疗有此需要的受试者的细胞增殖性疾患或延迟其进展。
XXVII.一种治疗有此需要的受试者的细胞增殖性疾患或延迟其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施例I至XXIV中任一项所述的药物组合物。
XXVIII.根据实施例XXV至XXVII中任一项所述的用途、使用的液体药物组合物或方法，其中所述细胞增殖性疾患为癌症。
XXIX.如前所述的本发明。
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
实例1：格菲妥单抗计算机分析
RO7082859/格菲妥单抗是一种T细胞双特异性人源化单克隆抗体(TCB)，其与肿瘤细胞上的人CD20以及T细胞上T细胞受体复合物(TCR)的人CD3ε亚基(CD3ε)结合。它由两条不同的重链和两条不同的轻链构成。CH3结构域中的点突变(“杵臼结构”)促进两条不同重链的组装。CD3结合Fab中VH和VL结构域的交换(“CrossMab方法”)以及CD20结合Fab中CH和CL结构域的点突变(“带电荷变体”)促进两条不同轻链与相应重链的正确组装。“杵臼结构”突变由重链HC1中的氨基酸交换Y349C、T366S、L368A和Y407V以及重链HC2中的氨基酸交换S354C和T366W组成(Kabat EU索引编号)。“带电荷变体”突变由轻链LC2中的氨基酸交换E123R和Q124K(Kabat编号)以及重链HC1和HC2中的K147E和K213E(Kabat EU索引编号)组成。
与人CD20的结合以高亲和力且以二价结合模式发生，而与CD3ε的结合为单价且低亲和力。RO7082859是一种人IgG1，其Fc区带有修饰(“PG LALA”突变)，该修饰消除了其在体外与Fcγ受体(FcγR)的结合，并防止FcγR介导的先天免疫效应细胞(包括自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞)的共活化而不改变其与FcRn(新生儿Fc受体)的功能性结合。“PG LALA”突变由重链HC1和重链HC2中的氨基酸交换P329G、L234A和L235A组成(“PG LALA”，Kabat EU索引编号)。
重组抗体在CHO细胞中产生，并由两条重链(分别为449和674个氨基酸残基)和三条轻链(分别为232和219(两个拷贝)个氨基酸残基)组成，以不对称构型排列，如图2所示。
活动热点汇总
对于分子的CD3结合部分，计算机预测表明重链CDR3中存在两个易于降解的Asn残基和一个暴露的Trp残基。在超过14天的应激实验中，在pH 6.0下孵育后，未观察到靶标结合活性的重大变化，但在生理pH值(PBS pH 7.4，数据未显示)下孵育后，观察到靶标结合活性的强烈损失。
实例2：格菲妥单抗制剂开发GLP Tox并进入人体研究
根据表4中显示的方案进行筛选。在筛选期间，将制剂暴露于以下条件：3周和6周储存(在5℃、25℃和40℃下)，在5℃和25℃下振荡1周以及冷冻/解冻(F/T)应激(5个循环)。然后跟踪指定的制剂长达52周。
表4：具有制剂代码的适应性平台筛选研究设计
在5℃、25℃和40℃下储存6周后，所有制剂保持在大多数测试的物理特性(即可见和在显微镜下才可见的颗粒、颜色、浊度、pH和蛋白质含量)方面无显著变化。CE-SDS(毛细管电泳十二烷基硫酸钠)数据未显示，因为它对于指定并不重要。
通过Seidenader方法进行的可见颗粒分析表明，在所有储存条件下，任一制剂均未形成可见颗粒。在显微镜下才可见的颗粒计数低(未显示)。在机械应力条件下，F2-F5在5℃和25℃下均显示出许多颗粒。F1在两种情况下均不含颗粒。使用EP和Optima，除了F3和F4(均含有P188)显示颗粒但低于极限(未显示)外，所有组合物实际上都不含颗粒(0个颗粒)。在5℃振荡下，F3(P188+Met)中的在显微镜下才可见的颗粒明显比F4(P188)中的差，所有其他制剂在每种条件下都有相似的计数(未显示)。
6周后，在所有条件下，所有制剂的浊度和颜色均未显示出显著变化。表面活性剂含量在5℃和25℃下稳定，并且对于两种含有P188的制剂(F3、F4)而言，在40℃下也稳定。对于所有含有PS20的活性制剂(F1、F2和F5)，无论制剂是否含有甲硫氨酸，在40℃时都观察到表面活性剂含量的损失。
甲硫氨酸的有益作用只能在含有PS20的安慰剂制剂中可见，其中在40℃下仅P2的PS含量下降(图3)。生物化学表征揭示了仅在40℃下储存后制剂的差异。
在尺寸排阻色谱(SEC)中，F2和F5的单体损失更为明显，与HMW(高分子量)面积的增加相关。可以看到一种新的HMW物种出现，在F3和F4中仅较小，在F1中较强，并且在F2和F5中占优势。发现LMW(低分子量)物质在所有制剂中以大致相同的速率增加(图4)。在离子交换色谱(IEC)中可以观察到类似的趋势，碱性峰面积整体增加，并且酸性峰面积的增加在F2和F5中更为明显(图5)。
综上所述，数据明确排除了F2和F5，并显示F1、F3和F4同样稳定，对这三者中的任一者没有明显的偏好。指定F1(5mg/ml格菲妥单抗、20mM组氨酸/组氨酸HCl、pH 5.5、240mM蔗糖、10mM甲硫氨酸、0.05％(w/v)PS20)。F1的所有分析结果的总结可以在图6中找到。
实例3：GLP Tox/进入人体研究
通过结合
上述纯度结果还反映在F2和F5在40℃时CD20结合的损失，以及这些制剂中CD3结合的强烈损失高达50％，相比之下，其余制剂的损失在10％至20％之间(图7A和图7B)。
实例4：III期和商业制剂的开发研究
本实例提供了格菲妥单抗制剂的药物开发的概述。这一开发的结果是，格菲妥单抗药品作为用于IV输注的溶液的无菌液体浓缩物的形式提供。该药品由溶于20mM L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐(HCl)缓冲液、240mM蔗糖、10mM L-甲硫氨酸、0.5mg/ml聚山梨醇酯20(pH 5.5)的1mg/ml格菲妥单抗构成。格菲妥单抗是药物物质和药品中唯一的活性成分。制剂开发研究证实，剂型和制剂适用于预期用途。该制剂足够坚固以确保药品在制造、储存、运输和施用期间是稳定的。
测试了具有较高蛋白质浓度(例如，5、25或50mg/ml格菲妥单抗)的制剂，但由于PS20降解导致在显微镜下才可见的颗粒和可见颗粒形成，因此没有继续进行。游离脂肪酸(月桂酸和肉豆蔻酸)的释放水平随着蛋白质浓度的增加而增加，证实了在显微镜下才可见的颗粒和可见颗粒形成的根本原因是由于水解PS20降解。
选择液体剂型，使得能够进行很少的处理步骤，同时确保在制造期间和药品保质期结束时的产品质量。
格菲妥单抗药品将以两种小瓶配置提供的两种强度市售：2.5mg/小瓶装在6-ml一次性玻璃小瓶中以及10mg/小瓶装在15-ml一次性玻璃小瓶中，以匹配所需的2.5mg、10mg和30mg的临床剂量，同时最大限度地减少产品浪费。对于商业药品制剂，将格菲妥单抗的浓度降低至1mg/ml，同时保持赋形剂组成不变。
制剂开发研究为选择适当的剂型、蛋白质浓度、表面活性剂浓度、缓冲液种类、溶液pH、稳定剂、张度剂和药品的小瓶配置提供了依据。对药物物质制剂进行了优化，以考虑设施配合、稀释和储存方面的考虑。
剂型的选择
选择液体剂型以提供用于输注的溶液的浓缩物，其需要很少的处理步骤，同时确保在制造期间和药品保质期结束时的产品质量。
蛋白质浓度的选择
选择5mg/ml的蛋白质浓度用于I期并保留至III期。随后基于制剂开发研究和更新的临床剂量要求，选择1mg/ml的蛋白质浓度作为商业制剂。
含有20mM L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐、10mM L-甲硫氨酸、240mM D-蔗糖和0.5mg/ml聚山梨醇酯20(PS20)的制剂(pH 5.5)在1mg/ml、5mg/ml和25mg/ml的格菲妥单抗浓度下进行稳定性测试，以便制备以适应临床需要的蛋白质浓度。在初始时间点(T0)、几个中间时间点以及在2℃-8℃下储存104周后的研究结束时，通过SE-HPLC和IE-HPLC评定格菲妥单抗的纯度、PS20含量和可见/在显微镜下才可见的颗粒形成对这些制剂进行了评估。
通过SE-HPLC和IE-HPLC的纯度在整个研究中1mg/ml与5mg/ml制剂之间是相当的(图8A和图8B)。在显微镜下才可见的颗粒计数也是相当的。此外，与5mg/ml和25mg/ml制剂相比，1mg/ml制剂没有表现出超出方法变异性的PS20降解(图12，也参见下文，聚山梨醇酯20降解的评定)。基于这些结果和更新的2.5mg、10mg和30mg的临床剂量方案，选择1mg/ml制剂作为商业制剂。
在随后的多变量制剂稳健性研究中进一步评定0.9mg/ml至1.1mg/ml蛋白质的浓度范围(参见实例5，制剂稳健性研究)。该研究证实了在该浓度范围内的可接受的稳定性行为。
pH、缓冲液、稳定剂和张度剂的选择
基于制剂开发研究，选择pH 5.5的20mM L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐溶液作为缓冲液，并结合10mM L-甲硫氨酸作为稳定剂和240mM D-蔗糖作为张度剂，用于I期并保留用于III期和商业制剂。
在5mg/ml格菲妥单抗进行研究以测试pH范围为5.5至6.0的20mM L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐缓冲液，以及0mM和10mM的L-甲硫氨酸水平。另外，进行了240mM D-蔗糖和130mM氯化钠之间的比较。
在初始时间点(T0)和在40℃下储存6周后，通过SE-HPLC和IE-HPLC评定格菲妥单抗的纯度以及可见/在显微镜下才可见的颗粒形成来评估pH和稳定剂的影响。在初始时间点(T0)和25℃储存26周后，通过测量SE-HPLC、IE-HPLC评定张度剂的选择，并确定可见/在显微镜下才可见的颗粒形成。与未添加稳定剂的相应制剂或pH 6的20mM L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐缓冲液/10mM L-甲硫氨酸组合相比，pH 5.5的20mM L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐缓冲液与10mM L-甲硫氨酸的组合显示出最低的高分子量物质(HMWS)形成(图9A)和电荷变体的变化(图9B)。20mM的L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐一水合物浓度被证明足以在药品的制造期间以及药物物质和药品的储存期间维持制剂pH。
基于240mM D-蔗糖和130mM氯化钠之间的比较，选择了240mM D-蔗糖。制剂之间的在显微镜下才可见的颗粒计数相当。对于含有D-蔗糖的制剂，在25℃储存26周后没有观察到可见的颗粒形成，而对于含有NaCl的制剂观察到可见的颗粒(图10)。
表面活性剂的选择
基于稳定性研究的结果，选择浓度为0.5mg/ml的PS20用于I期，并保留至商业制剂。在含有10mM L-甲硫氨酸和240mM D-蔗糖的pH 5.5的20mM L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐缓冲液中以50mg/ml格菲妥单抗进行研究，以研究泊洛沙姆188(P188)相对于PS20的稳定作用。以0.5mg/ml、0.7mg/ml和1.0mg/ml的水平测试P188；以0.1mg/ml、0.3mg/ml和0.5mg/ml的水平测试PS20。
在初始时间点(T0)和在25℃下振荡7天后，通过SE-HPLC和IE-HPLC评定格菲妥单抗的纯度以及可见/在显微镜下才可见的颗粒形成来评估添加的表面活性剂的效果。
对于所有P188浓度均观察到可见颗粒形成。因此排除其作为格菲妥单抗的合适表面活性剂(图11)。在25℃下振荡7天后，在含有PS20的制剂中未检测到可见颗粒(图11)。对于含有0.1mg/ml PS20的制剂，观察到HMWS和电荷变体的显著增加，而对于含有0.3mg/mlPS20的制剂，在25℃下振荡7天后，与含有0.5mg/ml PS20的制剂相比，观察到HMWS和电荷变体的水平略微增加(图11)。在不同的PS20浓度下，在显微镜下才可见的颗粒计数是相当的。对于含有0.1mg/ml PS20的制剂，观察到HMWS和电荷变体的显著增加，而对于含有0.3mg/mlPS20的制剂，在25℃下振荡7天后，与含有0.5mg/ml PS20的制剂相比，观察到HMWS和电荷变体的水平略微增加(图11)。因此，选择含有0.5mg/ml PS20的制剂。0.5mg/ml的聚山梨醇酯20水平被证明足以保护格菲妥单抗免受加工(例如，搅拌、冷冻和解冻或剪切应力)、处理、储存和运输期间可能发生的应力。在随后的多变量制剂稳健性研究中进一步评定0.2mg/ml至0.8mg/ml PS20的浓度范围(参见实例5，制剂稳健性研究)。该研究证实了在该浓度范围内的可接受的稳定性行为。
实例5：制剂稳健性研究
药物物质和药品的组成可以在基于制造因素(诸如缓冲液组分的称重公差)的范围内变化。进行了多变量制剂稳健性研究，并且其表明格菲妥单抗的相关质量属性(QA)在这些组成范围的边缘是可接受的。针对已确定对药品储存期间关键质量属性(CQA)具有潜在影响的三个因素进行了两个水平的多变量稳定性研究。评定了以下三个制剂参数：
1.蛋白质浓度
2.pH
3.PS20浓度
另外，在单变量稳定性研究中单独评定了三个制剂参数：
4.缓冲强度
5.L-甲硫氨酸浓度
6.D-蔗糖浓度
多变量制剂稳健性研究表明，格菲妥单抗的相关CQA在整个要求保护的制剂组成范围内是可接受的。
研究设计
进行风险评定以鉴定药物物质和药品中的制剂参数，这些参数对于在保质期内保持产品质量非常重要。据此建立了多变量研究和单变量研究。
多变量研究(F6至F12)
使用三个鉴定的制剂参数蛋白质浓度、pH和PS20浓度作为输入因子，进行了两个水平的分数阶乘设计(分辨率III)稳定性研究。
单变量研究(F13至F20)
测试了L-甲硫氨酸和D-蔗糖浓度(低水平和高水平)以及缓冲强度(低水平和高水平)。
评定具有低蛋白质浓度、低pH和低PS20浓度的一种制剂，作为与高pH、高蛋白质浓度和高PS20浓度的相应制剂的直接比较。
包括具有0.3mg/ml PS20浓度的一种制剂以支持验收标准设置。
所测试的制剂参数范围被定义为涵盖药品规格验收标准和/或制造可接受范围，如表5中所述。表6显示了包括15个实验的设计计划，包括3个中心点，其中3个中心点对应于目标商业制剂组合物。
表5：制剂稳健性研究：目标制剂以及多变量和单变量研究范围
目标 下层 上层
格菲妥单抗浓度(mg/ml) Mab 1 0.9 1.1
L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐(mM) His 20 15 25
pH pH 5.5 5.0 6.0
PS20浓度(mg/ml) PS20 0.5 0.2(0.3) 0.8
D-蔗糖浓度(mM) 蔗糖 240 200 280
L-甲硫氨酸浓度(mM) Met 10 5 15
表6：制剂稳健性研究设计计划：评估的格菲妥单抗制剂
表6中描述的制剂组合物中格菲妥单抗的稳定性评估如下：
·稳定性研究：
o储存条件：实时(2℃-8℃)和加速(25℃)
o测试频率：在上述储存条件下储存0、4、13、26(25℃储存结束)、39、52、78和104周
·应激测试：
o 5次冷冻-解冻循环，
o在2℃-8℃振荡一周，并在25℃振荡一周
·支持DS的稳定性：在-40℃下储存0、26、52和104周评定的QA：
o HMWS(高分子量物质)和SE-HPLC的主峰
o LMWS(低分子量物质)和非还原CE-SDS的主峰，
o通过IE-HPLC的酸性峰2和3、酸性区、碱性区和主峰
o通过紫外-可见光谱的蛋白质含量
o通过HPLC-ELSD的聚山梨醇酯20含量
o通过RP-HPLC的L-甲硫氨酸和L-组氨酸浓度
ο通过肽图(LC-MS)的氧化和异构化
ο生物测定效力
ο可见颗粒
ο在显微镜下才可见的颗粒
ο颜色、净度/乳光
οpH
ο渗透压
ο密度
整体数据分析流程
随时间收集每种制剂的所有质量属性的数据。评估每个QA随时间的相对变化。
多变量研究：
随时间对每个质量属性和每个制剂拟合简单的线性回归。因此，计算每个质量属性和每种制剂的降解速率。如果未明确提及，则将降解速率报告为每周降解。在实验设计(DoE)研究中将这些降解速率评估为响应，并且研究了蛋白质浓度、pH和PS20浓度这对三个参数这些降解的影响。如果与目标制剂相比，质量属性随时间没有显示出有意义的变化，则不进行回归分析和效果估计。对于随时间显示有意义变化的质量属性，使用线性回归来估计三个因素对降解速率的主要影响。另外，还显示了主效应图，以图形方式说明这些效应。
单变量研究：
对于单变量研究中测试的参数，在2℃-8℃下储存39周后的结果与T0相比进行评估，以鉴定潜在的变化。如果鉴定出变化，则计算降解速率并将其与目标制剂的降解进行比较，以便估计所研究的制剂参数在边缘处的影响。在一些情况下，通过将每周的降解速率乘以104因子，将其转化为在104周内观察到的降解。使用软件(SAS Institute，Cary，NC，版本10.0或更高)进行回归分析。
稳健制剂在推荐储存条件(2℃-8℃)下的稳定性：
表7中提供了在2℃-8℃下储存39周后与目标制剂相比的相对变化的评估的概述。对于在pH 6下配制的所有制剂(F8、F9、F20)，观察到增加的酸性变体水平(通过IE-HPLC的酸性区和酸性峰2)。受影响制剂中IE-HPLC主峰的相应减少反映了观察到的酸性变体的增加。在2℃-8℃储存39周后，对于所有其他制剂的所有其他CQA均未观察到变化。总之，pH被鉴定为关键的制剂参数。所有其他制剂参数蛋白质含量、PS20、L-甲硫氨酸和D-蔗糖浓度以及缓冲强度均未显示出对研究范围内测试的CQA的影响。
稳健制剂在加速储存条件(25℃)下的稳定性：
与2℃-8℃数据相比，对于在pH 6配制的所有制剂(F8、F9、F20)均观察到由于脱酰胺作用(通过IE-HPLC的酸性区和酸性峰2)而增加的酸性变异水平，这反映在受影响的制剂中IE-HPLC主峰的减少。另外，对于在pH 5配制的F1和F2，通过CE-SDS的LMWS增加，观察到增加的碎裂水平。这种增加反映在CE-SDS主峰的减少。在25℃储存26周后，对于所有其他制剂的任何其他CQA均未观察到变化。
总之，25℃数据证实pH是关键的制剂参数。所有其他制剂参数均未显示出对CQA的影响。
表7：相关CQA在2℃-8℃储存39周后的相对变化
a在t＝0和104周后研究结束时进行测量。
b仅在t＝0以及在2℃-8℃储存52周和104周后进行测量。
稳健制剂在推荐的药物物质储存条件(-40℃)下的稳定性：
为了支持药物物质在整个要求保护的制剂组合物范围内的稳定性，对储存于-40℃的药品稳健制剂进行了稳定性研究。研究结果证实，当制剂在-40℃的推荐的药物物质储存条件下储存26周时，未观察到测试的质量属性的显著变化。
振荡和冷冻/解冻应激后稳健制剂的稳定性：
将制剂在2℃-8℃或25℃下振荡一周。另外，在-40℃和5℃之间经历五次冷冻/解冻循环后，对制剂进行评估。所有样品在振荡或冷冻/解冻应激下几乎不含可见颗粒。
对于所有制剂，在振荡和冷冻/解冻应激时，在显微镜下才可见的颗粒没有变化。与含有0.3mg/ml至0.8mg/ml PS20水平的所有其他制剂相比，低PS20含量的制剂(0.2mg/ml，F7、F8、F13)在振荡和冷冻/解冻应激后没有显示出任何产品质量影响。
该结果证实，≥0.2mg/ml的聚山梨醇酯20水平足以保护蛋白质免受振荡和冷冻/解冻应激。相比之下，与含有240-280mM D-蔗糖水平的所有其他制剂相比，具有低D-蔗糖含量(200mM，F19)的制剂在振荡和冷冻/解冻应激后没有显示出任何产品质量影响。该结果证实，≥200mM D-蔗糖的水平足以保护蛋白质免受冷冻/解冻应激。与对照样品相比，在振荡或冷冻/解冻应激下没有观察到任何其他质量属性的实质性变化。
基于推荐存储条件(2℃-8℃)下的数据对已鉴定的CQA进行线性回归分析：
对受影响的CQA进行简单的线性回归分析：溶液pH、蛋白质浓度和PS20浓度。pH被鉴定具有主要影响。通过乘以104周(＝24个月)，将每周计算的降解速率外推至保质期结束(EoS)。外推的结果总结在表8中。
线性回归分析表明，测试的pH范围对鉴定的CQA没有有意义的影响，因为所有CQA都在稳定性验收标准内。然而，为了控制酸性区的增加，药品释放时的pH可接受标准收紧至5.2-5.8。
表8：基于2℃-8℃数据的线性回归分析结果
a所有其他参数均设置为线性回归分析的目标。
b按104周后t＝0+降解速率计算(使用所有制剂的平均t＝0)。
结论：
外推数据表明，6.0的高pH对24个月(声称的药品保质期)后酸性变体水平的影响。因此，药品释放时的pH可接受标准收紧至5.2-5.8，以限制药品稳定期间酸性形式的形成。
该制剂在保质期结束前被认为是稳定的，因为：
·对于处于制剂范围边缘的所有制剂，CQA在t＝0时以及在2℃-8℃储存9个月后均满足释放验收标准
·对于处于制剂范围边缘的所有制剂，使用降解速率外推至EoS时，CQA满足稳定性验收标准。
实例6：聚山梨醇酯20降解的评定
聚山梨醇酯20可经由氧化或水解机制降解。聚山梨醇酯20的水解降解导致游离脂肪酸(FFA)的形成，诸如月桂酸。在某些高浓度下，FFA可形成在显微镜下才可见的或可见颗粒。此外，如果聚山梨醇酯20降解导致制剂中的聚山梨醇酯少于保护蛋白质免受搅拌应激所需的量，则聚山梨醇酯20的降解也是一个问题。
由于这些问题，在制剂开发过程中对聚山梨醇酯20的降解进行了监测。在制剂开发期间，在格菲妥单抗制剂中观察到PS20降解，且降解程度取决于蛋白质浓度。通过在2℃-8℃观察可见颗粒，观察到25mg/ml制剂的显著PS20降解(图12)。对于5mg/ml制剂，PS20降解不太明显，在20个月后观察到可见颗粒。在显微镜下才可见的颗粒计数不受影响。分离出可见颗粒并通过傅里叶变换红外(FTIR)分析进行表征，结果发现为FFA。1mg/ml制剂在整个24个月的研究时间内没有显示PS20降解(超出方法精度)，也没有可见颗粒形成。在显微镜下才可见的颗粒计数始终较低。来自四种不同药物物质(DS)批次的九种药品(DP)批次的长期稳定性数据证实不存在可见颗粒。图13提供了示例DP批次的长期稳定性数据的可视化。
实例7：物理化学使用稳定性研究
格菲妥单抗药品作为用于IV输注的溶液的无菌液体浓缩物的形式提供。该药品由溶于20mM L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐缓冲液、240mM蔗糖、10mM L-甲硫氨酸、0.5mg/ml聚山梨醇酯20(pH 5.5)的1mg/ml格菲妥单抗构成。格菲妥单抗是一种-不含防腐剂的药品，以单-剂量2.5-ml和10-ml玻璃小瓶供应。格菲妥单抗旨在经由IV袋输注在0.9％或0.45％氯化钠中稀释后进行IV施用。基于-递增剂量方案的建议注册剂量和方案为2.5/10/30mg。IV袋中的剂量是通过剂量溶液浓度从0.05mg/ml到0.6mg/ml来实现的。在分组方法中，测试了0.05mg/ml、0.1mg/ml和0.6mg/ml剂量溶液的兼容性，以覆盖整个剂量范围(表9)。
进行稳定性和相容性研究，以确认在推荐的-使用条件下输注溶液的物理化学稳定性。研究表明，用于输注的格菲妥单抗溶液在典型的制备和施用期间是稳定的，并且可以在2℃-8℃下保持72小时并在环境室内光条件下于30℃再保持24小时，随后在≤25℃输注不超过16小时。证明输注溶液稳定的标称蛋白质浓度范围为0.05至0.6mg/ml。
研究材料和设置：
在稀释到含有0.9％氯化钠溶液和0.45％氯化钠溶液的100ml或250ml IV袋中后对格菲妥单抗的物理化学稳定性进行评估，模拟商业环境中使用的处理程序。对于每种稀释剂，格菲妥单抗的产品质量在大约0.05mg/ml(低剂量，仅在0.9％氯化钠中测试)、0.1mg/ml(低剂量)和0.6mg/ml(高剂量)的稀释浓度下进行评估，其中包含表9中概述的产品的预期浓度范围，
对于0.9％氯化钠，测试了两种不同类型的袋，其药品接触表面由聚氯乙烯(PVC)或聚烯烃-聚乙烯-聚丙烯(PO-PE-PP)制成。对于0.45％氯化钠，对其药品接触表面由PVC制成的袋进行测试。对于每种稀释剂，在矩阵方法中设置了三个药品批次以进行稳定性评定。该药品批次已在2℃-8℃下储存了20个月或7个月。
表9：模拟-使用研究设置(PVC或PO-PE-PP IV袋中的0.9％氯化钠溶液和PVC IV袋中的0.45％氯化钠溶液)
*仅在0.9％ NaCl中进行测试
通过使稀释的格菲妥单抗溶液通过以下装置来模拟给药溶液的输注：
1.具有PVC、聚乙烯(PE)、聚丁二烯(PBD)、聚氨酯(PUR)、硅树脂和丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)的产品接触表面的输注套装，带有/不带有由聚砜或聚醚砜(PES)制成的0.2μm在线过滤器。
2.由聚碳酸酯(PC)制成的三通旋塞阀输液辅助装置。
3.由聚醚聚氨酯(PEU)或聚四氟乙烯(PTFE)制成的导管
在16小时的时间段内进行模拟输注，这比4-8小时的预期输注持续时间更长，以确保给药溶液在与输注套装和辅助装置的构造材料长期接触期间的相容性。
在稀释后和累积保持时间后，以及在模拟输注结束时，从每个IV袋收集样品用于分析。
使用适当的稳定性-指示方法对样品进行测试，包括通过SE-HPLC、IE-HPLC和CE-SDS检测纯度，通过UV检测蛋白质含量，通过遮光检测在显微镜下才可见的颗粒，通过生物测定检测颜色、净度/乳光、pH和效力。CE-SDS的LMW仅针对高剂量(0.6mg/ml)进行测量，因为在≤0.1mg/ml的样品浓度下，信号强度太低，无法对数据进行有意义的解释。然而，所提供的效力数据保证了产品质量。
结果：
使用-研究表明，格菲妥单抗在稀释到0.9％或0.45％氯化钠溶液中后，并在2℃-8℃下保持72小时，并在环境室内光照条件下于30℃再保持24小时，然后在≤25℃下进行模拟输注不超过16小时后，具有物理化学稳定性。对于0.5mg/ml剂量溶液，不应使用在线过滤器。
在这些相容性研究中使用的药品批次之前已在推荐的储存温度(2℃-8℃)下储存了7-20个月，这表明药品年龄不会影响使用中-的处理和给药过程中的稳定性。
实例8：微生物稳定性
施用前必须使用无菌技术稀释药品。通过将药品稀释到含有0.9％氯化钠或0.45％氯化钠的输液袋中来制备用于IV施用的格菲妥单抗溶液。应立即使用制备的输注溶液。该药品不含任何抗菌防腐剂；因此，在-使用过程中必须通过保持适当的无菌条件来确保溶液的无菌性。
在发生意外污染的情况下，进行微生物攻击研究以评估溶液支持微生物增殖的倾向。评定了七种不同的测试微生物(USP<51>中列出)在2℃-8℃下长达96小时和在20℃-25℃下长达48小时的增殖情况。当测量到的差异不超过初始值0.5log10单位时，结果满足“无生长”的接受标准。
其他实施例
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实例相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。

Claims (32)

1.一种液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml至25mg/ml的抗CD20/抗CD3双特异性抗体；
约10mM至50mM的缓冲剂；
约≥200mM的张度剂；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约≥0.2mg/ml的表面活性剂；
pH在约5.0至约6.0的范围内，
其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
以及轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含：
重链可变区，其包含：
(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及
轻链可变区，其包含：
(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度在约1mg/ml至5mg/ml的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度在约0.9mg/ml至1.1mg/ml的范围内。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的浓度为约1mg/ml。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：
a)与CD20特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列；以及
b)与CD3特异性结合的至少一个抗原结合结构域，其包含SEQID NO:15的重链可变区序列和SEQ ID NO:16的轻链可变区序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含：
a)第一Fab分子，其与CD3、特别是CD3ε特异性结合；并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
b)第二Fab分子和第三Fab分子，其与CD20特异性结合，其中在所述第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)、特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第二Fab分子和第三Fab分子的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)，且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(EU编号)；以及
c)Fc结构域，其由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的液体药物组合物，其中所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体为格菲妥单抗。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂为组氨酸缓冲液，任选地为组氨酸HCl缓冲液。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约15mM至25mM。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约20mM。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的液体药物组合物，其中所述缓冲剂提供约5.2至约5.8的pH。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的液体药物组合物，其中所述张度剂选自由盐、糖和氨基酸组成的组。
13.根据权利要求12所述的液体药物组合物，其中所述张度剂为蔗糖或氯化钠。
14.根据权利要求13所述的液体药物组合物，其中所述张度剂是浓度为约200mM或更高的蔗糖。
15.根据权利要求13或14所述的液体药物组合物，其中所述张度剂是浓度为约200mM至280mM的蔗糖。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的液体药物组合物，其中所述张度剂是浓度为约240mM的蔗糖。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的液体药物组合物，其中所述甲硫氨酸的浓度为约5mM至15mM。
18.根据权利要求17所述的液体药物组合物，其中所述甲硫氨酸的浓度为约10mM。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为约0.2mg/ml至0.8mg/ml。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188。
21.根据权利要求20所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂是浓度为0.2mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨醇酯20。
22.根据权利要求21所述的液体药物组合物，其中所述表面活性剂是浓度为约0.5mg/ml的聚山梨醇酯20。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml至5mg/ml的所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体；
约15mM至25mM的组氨酸缓冲液；
约200mM至280mM蔗糖；
约0mM至15mM甲硫氨酸；和
约0.2mg/ml至0.8mg/ml的PS20，
pH为约5至约6。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的液体药物组合物，其包含：
约1mg/ml的格菲妥单抗；
约20mM的组氨酸缓冲液；
约240mM蔗糖；
约10mM甲硫氨酸；和
约0.5mg/ml的PS20，
pH为约5.5。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的液体药物组合物，其中PS20与所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的摩尔比小于100。
26.根据权利要求25所述的液体药物组合物，其中所述PS20与所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的所述摩尔比在50与100之间。
27.根据权利要求26所述的液体药物组合物，其中所述PS20与所述抗CD20/抗CD3双特异性抗体的所述摩尔比为约79。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的液体药物组合物在制备药物中的用途，所述药物对治疗细胞增殖性疾患有用。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的液体药物组合物，其用于治疗有此需要的受试者的细胞增殖性疾患或延迟其进展。
30.一种治疗有此需要的受试者的细胞增殖性疾患或延迟其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的液体药物组合物。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的用途、使用的液体药物组合物或方法，其中所述细胞增殖性疾患为癌症。
32.如前所述的本发明。
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