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JP2023553323A - 腫瘍特異的に切断可能なリンカー - Google Patents

腫瘍特異的に切断可能なリンカー Download PDF

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JP2023553323A JP2023531600A JP2023531600A JP2023553323A JP 2023553323 A JP2023553323 A JP 2023553323A JP 2023531600 A JP2023531600 A JP 2023531600A JP 2023531600 A JP2023531600 A JP 2023531600A JP 2023553323 A JP2023553323 A JP 2023553323A
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Abstract

Figure 2023553323000001
本開示は、腫瘍特異的に切断可能なリンカー、ならびに腫瘍細胞環境に治療剤を送達するための薬物およびプロドラッグにおけるそれらの使用を提供する。本開示はまた、該薬物およびプロドラッグの切断産物、ならびにその使用に関する方法を提供する。
【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１８，５８５号、および２０２１年１０月６日に出願された第６３／２５３，０９０号の優先権の利益を主張するものであり、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７３７７６２００３０４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年１１月２２日、サイズ：９６１ＫＢ）。
本発明は、腫瘍特異的に切断可能なリンカー、ならびに腫瘍細胞環境に治療剤を送達するための薬物およびプロドラッグにおけるそれらの使用に関する。本発明はまた、該薬物およびプロドラッグの切断産物、ならびにその使用に関連する方法に関する。
癌は米国で二番目に多い死因であり、次の五つの主要な原因（慢性呼吸器疾患、脳卒中、事故、アルツハイマー病、および糖尿病）よりも多くの死因を占めている。標的療法では特に大きな進歩が遂げられたが、この分野ではまだ多くの研究が残されている。免疫療法およびこの分野の分科である免疫腫瘍学は、悪性腫瘍を治療するための実行可能で刺激的な治療選択肢を生み出している。特に、癌の一つの特徴は免疫回避であり、顕著な努力が、癌を認識および治療するために免疫系を再活性化するための標的を特定し、これらの標的に対する療法を開発してきたことが現在では認識されている。
サイトカイン療法は、免疫系を刺激して抗腫瘍細胞傷害性を誘発するための有効な戦略である。特に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の組み換え型であるアルデスロイキンは、転移性腎細胞癌および黒色腫の治療のためにＦＤＡにより承認されている。残念なことに、患者に投与されるサイトカインは一般的に非常に短い半減期を有し、したがって頻繁な投与を必要とする。例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎというブランド名で市販されているアルデスロイキンの製品ラベルには、該薬物が、５分間の静脈内（ＩＶ）投与を受けた患者において、８５分間の半減期を有することが示されたと記載されている。さらに、高用量のサイトカインの投与は、全身免疫活性化により、血管漏出などの健康被害を引き起こす可能性がある。これらの所見は、全身免疫活性化に関連する副作用のない腫瘍を効果的に標的化するサイトカイン治療剤などの治療剤の開発の必要性を説明している。
サイトカイン治療剤がマスキング部分によってマスクされ、腫瘍細胞環境におけるマスキング部分の切断後にのみ治療剤が活性化されるプロドラッグは、この必要性に対処するために想定される方法の一つである。
本発明は、腫瘍特異的タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含む新規の腫瘍特異的タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカー、および腫瘍細胞環境に治療部分を送達するためのポリペプチド薬物構築物におけるそれらの使用を提供する。治療部分以外の構築物の部分は、担体部分とみなすことができる。
腫瘍特異的タンパク質分解的に切断可能なペプチドは、腫瘍細胞環境中に存在するプロテアーゼの基質として作用する。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、ポリペプチド薬物構築物内に配置され、その結果、リンカーは、腫瘍細胞環境でのプロテアーゼ作用によって切断され、ポリペプチド薬物構築物は分離して切断産物を形成し、その一つは、治療部分を含む。本発明はまた、該薬物構築物の切断産物、ならびにその使用に関連する方法に関する。
本明細書に提供されるのは、（ｉ）治療部分、（ｉｉ）担体部分、および（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳを有する腫瘍特異的タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含むタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーを含むポリペプチド薬物構築物である。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）は、以下の式に示すようにスペーサードメイン（ＳＤ１およびＳＤ２）が両側に隣接している。
Figure 2023553323000002
一部の実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、１０～２５アミノ酸長である。
一部の実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、ＳおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
一部の実施形態では、第一のスペーサードメイン（ＳＤ１）は、３～６アミノ酸長である。
一部の実施形態では、第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）は、３～６アミノ酸長である。
一部の実施形態では、ＳＤ２は、アミノ酸配列ＳＧＰを含む。
一部の実施形態では、ＳＤ２は、アミノ酸配列ＳＧＰを有する。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、
Figure 2023553323000003
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、
Figure 2023553323000004
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、
Figure 2023553323000005
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、
Figure 2023553323000006
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解切断可能ペプチドリンカーは、
Figure 2023553323000007
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、
Figure 2023553323000008
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000009
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000010
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000011
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000012
を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的にタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、治療部分に直接共有結合している。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、治療部分と担体部分との間の薬物構築物内に位置する。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、担体部分内に位置する。
一部の実施形態では、ポリペプチド薬物構築物は、単一のポリペプチド鎖を含む。これは、治療部分、担体部分、およびタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、同じポリペプチド鎖に存在することを意味する。
一部の実施形態では、ポリペプチド薬物構築物は、二つ以上のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、治療部分と同じポリペプチド鎖に存在する。一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、治療部分とは異なるポリペプチド鎖に存在する。
一部の実施形態では、ポリペプチド薬物構築物は、プロドラッグである。一部の実施形態では、ポリペプチド薬物構築物がプロドラッグであり、分子の残りの部分（タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーの切断後に治療部分が分離する）は、マスキング部分を含み、治療部分が腫瘍細胞環境でタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーの切断後にのみ生物学的に活性となるように、プロドラッグの治療部分の生物学的活性を阻害する。一部の実施形態では、マスキング部分が、治療部分と同じポリペプチド鎖に存在する。一部の実施形態では、マスキング部分は、治療部分とは異なるポリペプチド鎖に存在する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、治療部分と同じポリペプチド鎖に存在する。
一部の実施形態では、マスキング部分は第一のポリペプチド鎖に存在し、治療部分は第二のポリペプチド鎖に存在する。
一部の実施形態では、薬物構築物は半減期延長部分を含む。
一部の実施形態では、半減期延長部分は、抗体またはその断片を含む。
一部の実施形態では、半減期延長部分は、第一および第二の半減期延長部分を含む。
一部の実施形態では、プロドラッグはサイトカインプロドラッグであり、治療部分はサイトカイン部分である。
一部の実施形態では、マスキング部分は、サイトカイン受容体の細胞外ドメインのドメインを含む。
治療部分がサイトカイン部分であり、マスキング部分がサイトカイン受容体の細胞外ドメインのドメインを含む、本明細書に記載されるサイトカインプロドラッグは、本明細書では「マスクされたサイトカイン」と称される。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖にマスキング部分を含み、第二のポリペプチド鎖にそのサイトカイン部分を含む、マスクされたサイトカインが本明細書に提供される。こうしたマスクされたサイトカインは、「ヘテロ二量体の」マスクされたサイトカインと呼んでもよい。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、タンパク質ヘテロ二量体であって、
a) 第一のリンカーを介して第一の半減期延長部分に連結されたマスキング部分を含む第一のポリペプチド鎖と、
b) 第二のリンカーを介して第二の半減期延長部分に連結されたそのサイトカイン部分を含む第二のポリペプチド鎖とを含み、
第一の半減期延長部分が第二の半減期延長部分と会合し、
少なくとも第一のリンカーまたは第二のリンカーが、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである、タンパク質ヘテロ二量体を含む。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖では、第一の半減期延長ドメインは、第一のリンカーのアミノ末端に連結され、第一のリンカーのカルボキシ末端は、マスキング部分のアミノ末端に連結され、第二のポリペプチド鎖では、第二の半減期延長ドメインは、第二のリンカーのアミノ末端に連結され、第二のリンカーのカルボキシ末端は、そのサイトカイン部分のアミノ末端に連結される。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000013
を含み、
第二のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000014
を含み、
式中、ＨＬ１は第一の半減期延長ドメインであり、Ｌ１は第一のリンカーであり、ＭＭはマスキング部分であり、ＨＬ２は第二の半減期延長ドメインであり、Ｌ２は第二のリンカーであり、Ｃはサイトカイン部分であり、
第一の半減期延長部分が第二の半減期延長部分と会合し、
少なくとも第一のリンカーまたは第二のリンカーが、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。
一部の実施形態では、第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第一のリンカーは、切断不可能なリンカーである。この配置は、本明細書では「構造Ａ」として記載される。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000015
を含み、
第二のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000016
を含む。
一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能なリンカーである。この配置は、本明細書では「構造Ｂ」として記載される。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000017
を含み、
第二のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000018
を含む。
一部の実施形態では、単一のポリペプチド鎖で連結されたマスキング部分と、そのサイトカイン部分とを含む、マスクされたサイトカインが本明細書に提供される。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、以下の式：
Figure 2023553323000019
を含むポリペプチド鎖を含み、
式中、ＨＬは半減期延長ドメインであり、Ｌ１は第一のリンカーであり、ＭＭはマスキング部分であり、Ｌ２は第二のリンカーであり、Ｃはサイトカイン部分であり、少なくとも第一のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含むタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーを含む。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。一部の実施形態では、第一のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。一部の実施形態では、第一のリンカーは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能である。切断不可能なリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、以下の式：
Figure 2023553323000020
を含む、ポリペプチド鎖を含み、
式中、ＨＬは半減期延長ドメインであり、Ｌ１は第一のリンカーであり、ＭＭはマスキング部分であり、Ｌ２は第二のリンカーであり、Ｃはそのサイトカイン部分であり、少なくとも第一のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含むタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーを含む。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。一部の実施形態では、第一のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。一部の実施形態では、第一のリンカーは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能である。切断不可能なリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、３～２５アミノ酸長である。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、配列番号 １４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、配列番号 ２３のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、半減期延長ドメインは、第一の半減期延長ドメインと第二の半減期延長ドメインとを含む。
一部の実施形態では、第一の半減期延長ドメインは、第一のＦｃドメインまたはその断片を含み、第二のＦｃドメインは、Ｆｃドメインまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、第一のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその断片を含み、第二のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片である。
一部の実施形態では、第一および／または第二のＦｃドメインはそれぞれ、第一および第二の半減期延長ドメインの非共有結合を促進する一つまたは複数の修飾を含有する。
一部の実施形態では、第一の半減期延長ドメインは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、変異Ｙ３４９Ｃ；Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３８ＡおよびＹ４０７Ｖを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片を含んで、第一の半減期延長ドメインに「ホール」を形成し、第二の半減期延長ドメインは、変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片を含んで、第二の半減期延長ドメインに「ノブ」を形成する。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、それぞれは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた位置２９７のアミノ置換を含む。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、それぞれは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＮ２９７Ａのアミノ置換を含む。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、それぞれは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた位置２５３のアミノ置換を含む。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、それぞれは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＩ２５３Ａのアミノ置換を含む。
一部の実施形態では、第一の半減期延長ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、その第二の半減期延長ドメインは、配列番号 １２のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一の半減期延長ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、その第二の半減期延長ドメインは、配列番号 １３のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、半減期延長ドメイン（ＨＬ）は、抗体のＦｃ領域（すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域）または二量体化Ｆｃドメイン（ＨＬ１－ＨＬ２）を含むその断片を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端に及ぶと画定される。一部の実施形態では、抗体（ＨＬ１－ＨＬ２）の二量体化Ｆｃドメインは、本明細書のどこかに記載されるとおり、第一の半減期延長ドメインと第二の半減期延長ドメインとを含み、第一の半減期延長部分は、第一のＦｃドメインまたはその断片を含み、第二の半減期延長部分は、第二のＦｃドメインまたはその断片を含む。一部の実施形態では、ＨＬ２はポリペプチド鎖の構成要素であり、ＨＬ１はＨＬ２に二量体化される。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片である。
一部の実施形態では、第一の半減期延長部分は、変異Ｉ２５３Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片を含み、第二の半減期延長部分は、変異Ｉ２５３Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片を含む。一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、配列番号６（「親配列」）を有するヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖定常ガンマ１の配列から誘導され、その結果、第一および第二の半減期延長部分はそれぞれ、一つまたは複数のアミノ酸修飾を有する配列番号７またはその断片を含む。一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、アミノ置換を有する配列番号７を含み、「ノブ・イントゥ・ホール」アプローチに従って第一および第二の半減期延長部分の会合を促進する。一部の実施形態では、配列配列番号７は、変異Ｙ３４９Ｃ；Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付け）を含有して、第一の半減期延長部分に「ホール」を形成し、変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付け）を含有して、第二の半減期延長部分に「ノブ」を形成する。一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＮ２９７Ａのアミノ置換をさらに含む。一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＩ２５３Ａのアミノ置換をさらに含む。一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたアミノ置換Ｎ２９７ＡおよびＩ２５３Ａの両方をさらに含む。一部の実施形態では、第一の半減期延長部分は、配列番号７、８、９、および１０のいずれか一つのアミノ酸配列のいずれか一つと、約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第二の半減期延長部分は、配列番号７、１１、１２、および１３のいずれか一つのアミノ酸配列のいずれか一つと、約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、サイトカイン部分は、野生型サイトカイン部分またはバリアントサイトカイン部分を含む。
一部の実施形態では、サイトカイン部分は、本明細書のどこかに記載されるＩＬ－２サイトカイン部分である。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカイン部分は、野生型ＩＬ－２サイトカイン部分またはそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカイン部分は、ＩＬ－２サイトカインまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２を有する成熟ＩＬ－２の配列と比較して修飾されている。
一部の実施形態では、修飾ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２を有する成熟ＩＬ－２の配列に対して、修飾Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａを含む。
一部の実施形態では、修飾ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２を有する成熟ＩＬ－２の配列に対して、修飾Ｃ１２５Ａを含む。
一部の実施形態では、修飾ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２を有する成熟ＩＬ－２の配列に対して、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、およびＣ１２５Ａを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１２２に変異を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１６８に変異を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１２２およびＣ１６８に変異を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、変異Ｃ１２２ＳおよびＣ１６８Ｓを有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、サイトカイン部分は、本明細書のどこかに記載されるＩＬ－１２サイトカイン部分である。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン部分は、野生型ＩＬ－１２サイトカイン部分またはそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン部分は、ＩＬ－１２サイトカインまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドまたはその機能的断片に共有結合したＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドまたはその機能的断片を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、５～２０アミノ酸長である。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、アミノ酸残基ＧおよびＳが豊富である。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、配列番号 １１６（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号２０４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）、または配列番号２０４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号２０４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号２０４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、ＧＡＧ結合ドメイン（ＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶ）に対する少なくとも一つのアミノ酸修飾を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号２０５（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号２０６（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号２０４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のシステイン置換変異を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号２０７（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号２０８（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドは、配列番号２０９（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）、または配列番号２０９（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドは、配列番号２０９（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２１０（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２１１（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２１２（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２１３（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２１４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２サイトカイン受容体、またはそのサブユニットもしくはその機能的断片を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２との親和性を保持するか、またはそうでなければ示す、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の細胞外ドメイン、またはその断片、部分、もしくはバリアントを含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～２３７、すなわち配列番号２１５（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を有する配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～５４５、すなわち配列番号２１６（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を有する配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２との親和性を保持するか、またはそうでなければ示す、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の細胞外ドメイン、またはその断片、部分、もしくはバリアントを含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２１２、すなわち配列番号２１７（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を有する配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２２、すなわち、配列番号２１８（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を有する配列を含むか、またはマスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２７、すなわち配列番号２２２（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を有する配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち配列番号２１９（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を有する配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、配列番号２１９（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）の配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を含み、任意選択的に、当該修飾は、システイン置換変異である。
一部の実施形態では、マスキング部分は、配列番号２２０（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～６２２、すなわち配列番号２２１（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を有する配列を含む。
一部の実施形態では、サイトカイン部分は、本明細書のどこかに記載されるＩＬ－１５サイトカイン部分である。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカイン部分は、野生型ＩＬ－１５サイトカイン部分またはそのバリアントを含む。
一部の実施形態では、サイトカイン部分は、ＩＬ－１５サイトカイン部分であり、マスクされたサイトカインは、ＩＬ－１５Ｒαサブユニットまたはその機能的断片（「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」）を含むドメインをさらに含む。一部の実施形態では、サイトカイン部分は、ＩＬ－１５サイトカイン部分であり、マスクされたサイトカインは、ＩＬ－１５Ｒαサブユニットまたはその機能的断片（「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」）を含むドメインをさらに含み、ＩＬ－１５ＲαドメインとＩＬ－１５サイトカイン部分は、構築物中の異なるポリペプチド鎖に存在し、ＩＬ－１５ＲαドメインはＩＬ－１５サイトカイン部分に非共有結合している。
本明細書の「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」は、一つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列など、野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列またはそのバリアントからなり得る。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、位置Ｒ２６にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ２６Ｎを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ２６Ｓを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、位置Ｒ３５にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ３５Ｑを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ３５Ｓを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、位置Ｒ２６およびＲ３５にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ２６ＳまたはＲ２６Ｎ、およびＲ３５ＱまたはＲ３５Ｓを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ２６ＮおよびＲ３５Ｑを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカイン部分は、ＩＬ－１５サイトカインまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）またはその機能的断片を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｄ２２、Ｅ４６、Ｅ５３に一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｄ２２、Ｅ４６、Ｅ５３、Ｎ７１、Ｎ７９、またはＮ１１２に一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１およびＮ７９にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７９およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１、Ｎ７９およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２５（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２６（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２７（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２８（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２２９（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２３０（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２３３（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２３４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２３５（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２３６（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２３７（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２３８（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２３９（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、位置Ｎ７１に追加の変異を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、位置Ｓ７３に追加の変異を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、一つまたは複数のアミノ酸位置Ｎ７２、Ｎ７９、Ｖ８０、Ｔ８１、およびＮ１１２に追加の変異を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１５Ｒβまたはその断片もしくはバリアントを含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、配列番号２４０（本明細書のＩＬ－１５マスキング部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、位置Ｃ１２２にアミノ酸置換を有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、アミノ酸置換Ｃ１２２Ｓを有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、位置Ｃ１６８にアミノ酸置換を有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、アミノ酸置換Ｃ１６８Ｓを有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、位置Ｃ１２２およびＣ１６８にアミノ酸置換を有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む。
本明細書のどこかに記載されるポリペプチド薬物構築物中のタンパク質分解的に切断可能なリンカーのタンパク質分解的切断によって調製可能な、活性治療部分を含む切断産物が、本明細書に提供される。
本明細書のどこかに記載されたポリペプチド薬物構築物のいずれか一つをコードする核酸が本明細書に提供される。
本明細書のどこかに記載されたポリペプチド薬物構築物のいずれか一つの鎖の一つをコードする核酸が本明細書に提供される。
本明細書に記載される核酸を含むベクターが本明細書に提供される。
本明細書のどこかに記載されたポリペプチド薬物構築物をコードする核酸を含むベクターが本明細書に提供される。
本明細書のどこかに記載されたポリペプチド薬物構築物の鎖の一つをコードする核酸を含むベクターが本明細書に提供される。
本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。
一実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ細胞である。別の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
本明細書のどこかに記載されたポリペプチド薬物構築物のいずれか一つを含む組成物が本明細書に提供される。
本明細書のどこかに記載されたポリペプチド薬物構築物のいずれか一つ、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
本明細書のどこかに記載されたポリペプチド薬物構築物のいずれか一つ、または本明細書に記載された組成物、もしくは医薬組成物を含むキットが本明細書に提供される。
ポリペプチド薬物構築物を生成する条件下で、本明細書に記載された宿主細胞を培養することを含む、本明細書のどこかに記載されたポリペプチド薬物構築物のいずれか一つを作製する方法が本明細書に提供される。
本明細書に記載される切断産物のいずれか一つをコードする核酸が本明細書に提供される。
本明細書に記載される切断産物のいずれか一つを含む組成物が本明細書に提供される。
本明細書に記載された切断産物のいずれか一つ、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
医療で使用するための本明細書に記載のポリペプチド薬物構築物が本明細書に提供される。
医療で使用するための本明細書に記載の切断産物が本明細書に提供される。
本明細書では、対象において癌を治療または予防する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載のポリペプチド薬物構築物の有効量を対象に投与することを含む。
本明細書では、対象において癌を治療または予防する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む。
本明細書では、対象において癌を治療または予防する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
本明細書では、対象において癌を治療または予防する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載されるポリペプチド薬物構築物の有効量を対象に投与することを含み、それによりポリペプチド薬物構築物は、インビボでタンパク質分解的に切断されて、本明細書に記載される切断産物を産生する。
本明細書では、対象において癌を治療または予防する方法が提供され、本方法は、その標的タンパク質に結合することができる切断産物をインビボで作製する工程を含み、当該切断産物は、本明細書に記載されるとおりである。
癌の治療または予防で使用するための本明細書に記載のポリペプチド薬物構築物が本明細書に提供される。
本明細書では、癌を治療または予防する方法において使用するための本明細書に記載のポリペプチド薬物構築物が提供され、本方法は、ポリペプチド薬物構築物の有効量を対象に投与することを含み、それによりポリペプチド薬物構築物は、インビボでタンパク質分解的に切断されて、本明細書に記載される切断産物を産生する。
癌の治療または予防で使用するための本明細書に記載の切断産物が本明細書に提供される。
本明細書では、癌の治療または予防で使用するための本明細書に記載される切断産物が提供され、本方法は、本明細書に記載されるポリペプチド薬物構築物を患者に投与し、それによって、インビボでマスクされたサイトカインのタンパク質分解的切断によって切断産物を産生する工程を含む。
本明細書では、対象における癌を治療または予防する方法で使用するための本明細書に記載される切断産物が提供され、本方法は、対象に投与された本明細書に記載されるポリペプチド薬物構築物からインビボタンパク質分解的切断によって切断産物を産生する工程を含む。
図１は、マスキング部分、サイトカインまたはその機能的断片（「サイトカイン」）、半減期延長部分、および第一の切断可能なペプチド（「１ＣＰ」）を含む第一のリンカー、第一のＮ末端スペーサードメイン（「１ＮＳＤ」）、および第一のＣ末端スペーサードメイン（「１ＣＳＤ」）を含む、マスクされたサイトカインの例示的な実施形態の構造を示す。これらの例示的な実施形態はまた、第二の切断可能なペプチド（「２ＣＰ」）、第二のＮ末端スペーサードメイン（「２ＮＳＤ」）、および第二のＣ末端スペーサードメイン（「２ＣＳＤ」）を含む、第二のリンカーを含む。矢印によって示されるように、例示的な実施形態は、マスキング部分が第一のリンカーに連結され、サイトカインまたはその機能的断片が、第一のリンカーおよび第二のリンカーに連結されているが、サイトカインまたはその機能的断片が第一のリンカーに連結され、マスキング部分が第一のリンカーおよび第二のリンカーに連結されるように、マスキング部分およびサイトカインまたはその機能的断片を交換することができることを示す。図１は、単量体としてのマスクされたサイトカインの例示的な実施形態の構造を示す。 図２は、マスキング部分、サイトカインまたはその機能的断片（「サイトカイン」）、第一の半減期延長部分、および第二の半減期延長部分を含む、マスクされたサイトカインの例示的な実施形態の構造を示す。図２に示す例示的な実施形態はまた、第一の切断可能なペプチドを含む第一のリンカー（「１ＣＰ」）、第一のＮ末端スペーサードメイン（「１ＮＳＤ」）、および第一のＣ末端スペーサードメイン（「１ＣＳＤ」）、ならびに第二の切断可能なペプチドを含む第二のリンカー（「２ＣＰ」）、第二のＮ末端スペーサードメイン（「２ＮＳＤ」）、および第二のＣ末端スペーサードメイン（「２ＣＳＤ」）も含む。例示的な第一および第二の半減期延長部分は、第一の半減期延長部分の「ホール」および第二の半減期延長部分の「ノブ」によって示されるように、第一の半減期延長部分の第二の半減期延長部分との会合を促進する「ノブ・イントゥ・ホール」修飾を含む。第一の半減期延長部分および第二の半減期延長部分はまた、少なくとも部分的にジスルフィド結合の形成により会合することが示されている。「ホール」は第一の半減期延長部分（マスキング部分に連結）の一部として、「ノブ」は第二の半減期延長部分（サイトカインに連結）の一部として示されているが、「ホール」および「ノブ」は、代替的に、第二の半減期延長部分および第一の半減期延長部分にそれぞれ含まれ、その結果、「ホール」が第二の半減期延長部分の一部（サイトカインに連結）であり、「ノブ」が第一の半減期延長部分の一部（マスキング部分に連結）であることが理解されよう。 図３Ａ～図３Ｂは、腫瘍微小環境などでのプロテアーゼによる切断前（左）および切断後（右）のマスクされたサイトカインの例示的な実施形態を示す。図３Ａ～図３Ｂは、マスクされたＩＬ－２サイトカインの例示的実施形態を示す。プロテアーゼによる切断は、マスキング部分（例えば、図３Ｂに示すＩＬ－２Ｒβ）を放出し、またはＩＬ－２（図３Ａ）を放出する。 同上。 図４は、ＩＬ－２構築物（ＡＫ３０４、ＡＫ３０５、ＡＫ３０７、ＡＫ３０８、ＡＫ３０９、ＡＫ３１０、ＡＫ３１１、ＡＫ３１２、ＡＫ３１３、ＡＫ３１４、およびＡＫ３１５）の製造および精製後のフロースルー（ＦＴ）サンプル（すなわち、タンパク質Ａカラムに結合しなかったタンパク質）および溶出（Ｅ）サンプル（すなわち、タンパク質Ａカラムに結合し、そこから溶出されたタンパク質）に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 図５Ａ～図５Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１６８）、またはｒｈＩＬ－２対照のＣＤ２５－Ｆｃへの結合を試験したＳＰＲ分析の結果を示す。図５Ａは、ＡＫ１６８とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図５Ｂは、ＭＭＰで活性化されたＡＫ１６８とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図５Ｃは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ２）対照とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示す。図５Ｄは、各相互作用について、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、ならびにＣｈｉ２値およびＵ値について取得されたデータを要約した表を提供する。 同上。 同上。 同上。 図６Ａ～図６Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１１１）、またはｒｈＩＬ２対照のＣＤ１２２－Ｆｃへの結合を試験したＳＰＲ分析の結果を示す。図６Ａは、ＡＫ１１１とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図６Ｂは、プロテアーゼで活性化されたＡＫ１１１とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図６Ｃは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）対照とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示す。図６Ｄは、各相互作用について、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、ならびにＣｈｉ２値およびＵ値について取得されたデータを要約した表を提供する。 同上。 同上。 同上。 図７Ａは、腫瘍微小環境などでのプロテアーゼによる切断前（左）および切断後（右）のマスクされたサイトカインの例示的な実施形態を示す。図７Ｂは、ＭＭＰ１０プロテアーゼの非存在下（左レーン）または存在下（右レーン）でインキュベートされた例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示し、Ｆｃ部分からのＩＬ－２の放出を実証する。 同上。 図８Ａ～図８Ｄは、構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０３５、ＡＫ０４１、または対照としてｒｈＩＬ－２で処置されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）は、ｒｈＩＬ－２（図８Ａ）、ＡＫ０３２（図８Ｂ）、ＡＫ０３５（図８Ｃ）、またはＡＫ０４１（図８Ｄ）とのインキュベーション後に決定した、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）について示されている。 同上。 同上。 同上。 図９Ａ～図９Ｃは、構築物ＡＫ０８１またはＡＫ０３２で処理されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。ＭＭＰ１０への曝露歴の有無に関わらず、ＡＫ０８１構築物を試験した。アイソタイプ対照ならびにＩＬ－２陰性対照も試験した。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）は、ＮＫ細胞（図９Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ｃ）、およびＣＤ４＋ Ｔ細胞（図９Ｂ）について示されている。 同上。 同上。 図１０Ａ～図１０Ｄは、構築物ＡＫ０８１およびＡＫ１１１、ならびにｒｈＩＬ－２および抗ＲＳＶ抗体を含む対照を使用したＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。無処置対照も試験した。ＥＣ５０（ｐＭ）は、ｒｈＩＬ－２、ＡＫ０８１、およびＡＫ１１１処置についても示されている。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞（図１０Ａ）、ＣＤ８＋細胞（図１０Ｂ）、およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１０Ｃ）について示されている。図１０Ｄは、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１構築物、およびｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０（ｐＭ）および倍率変化データを提供する。 同上。 同上。 同上。 図１１Ａ～図１１Ｄは、構築物ＡＫ１６７およびＡＫ１６８、ならびにｒｈＩＬ－２および抗ＲＳＶ抗体を含む対照を使用したＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。無処置対照も試験した。ＥＣ５０（ｐＭ）は、ｒｈＩＬ－２、ＡＫ１６７、およびＡＫ１６８処置についても示されている。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞（図１１Ａ）、ＣＤ８＋細胞（図１１Ｂ）、およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１１Ｃ）について示されている。図１１Ｄは、ＡＫ１６７およびＡＫ１６８構築物、ならびにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０（ｐＭ）および倍率変化データを提供する。 同上。 同上。 同上。 図１２Ａ～図１２Ｄは、（＋ＭＭＰ１０）であったか、または以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、構築物ＡＫ１６５もしくはＡＫ１６６、またはアイソタイプ対照もしくはＩＬ－２－Ｆｃ対照で処置されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。図１２Ａに示すキーは図１２Ｂにも適用され、図１２Ｃに示すキーは図１２Ｄにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ制御性細胞（図１２Ａ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔヘルパー細胞（図１２Ｂ）、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（図１２Ｃ）、およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図１２Ｄ）について示している。 同上。 同上。 同上。 図１３Ａ～図１３Ｃは、（＋ＭＭＰ１０）であったか、または以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、構築物ＡＫ１０９もしくはＡＫ１１０、またはアイソタイプ対照もしくはＩＬ－２－Ｆｃ対照で処置されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。図１２Ｂに示すキーは図１３Ａにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、ＮＫ細胞（図１３Ａ）、ＣＤ８細胞（図１３Ｂ）、およびＣＤ４細胞（図１７Ｃ）について示されている。 同上。 同上。 図１４Ａ～図１４Ｄは、構築物ＡＫ２１１、ＡＫ２３５、ＡＫ２５３、ＡＫ３０６、ＡＫ３１０、ＡＫ３１４、およびＡＫ３１６、ならびにｒｈＩＬ－２対照を使用したＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞（図１４Ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－細胞（図１４Ｂ）、およびＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（図１４Ｃ）について示されている。図１４Ｄは、試験された構築物の各々、およびｒｈＩＬ－２対照についてのＥＣ５０データを提供する。 同上。 同上。 同上。 図１５Ａ～図１５Ｄは、プロテアーゼによって活性化された構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１６７、ＡＫ２１６、ＡＫ２１８、ＡＫ２１９、ＡＫ２２０、およびＡＫ２２３、ならびにｒｈＩＬ－２対照を使用したＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（図１５Ａ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１５Ｂ）、およびＣＤ８＋細胞（図１５Ｃ）について示されている。図１５Ｄは、試験された構築物の各々、およびｒｈＩＬ－２対照についてのＥＣ５０データを提供する。 同上。 同上。 同上。 図１６Ａ～図１６Ｃは、構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、もしくはＡＫ２１０、または抗ＲＳＶ対照で処置されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。図１６Ａに示すキーは図１６Ｂおよび図１６Ｃにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、制御性Ｔ細胞（図１６Ａ）、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞（図１６Ｂ）、およびＣＤ８細胞（図１６Ｃ）について示されている。 同上。 同上。 図１７Ａ～図１７Ｃは、構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、もしくはＡＫ１９３、または抗ＲＳＶ対照で処置されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。図１７Ａに示すキーは図１７Ｂおよび図１７Ｃにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、制御性Ｔ細胞（図１７Ａ）、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞（図１７Ｂ）、およびＣＤ８細胞（図１７Ｃ）について示されている。 同上。 同上。 図１８Ａ～図１８Ｄは、構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、もしくはＡＫ１６８、または抗ＲＳＶ対照を使用して腫瘍担持マウスで実施された薬物動態研究の結果を示す。図１８Ａは、試験された各構築物の構造の単純な描写を提供する。図１８Ｂは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１８Ｃは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって、血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１８Ｄは、ヒトＩＬ－２を検出することによって、血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。検出ステップの前に、抗ヒトＩＧを捕捉抗体として使用した。 同上。 同上。 同上。 図１９Ａ～図１９Ｄは、構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、もしくはＡＫ２１１、または抗ＲＳＶ対照を使用して腫瘍担持マウスで実施された薬物動態研究の結果を示す。図１９Ａは、試験された各構築物の構造の単純な描写を提供する。図１９Ｂは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｃは、ヒトＩＬ－２を検出することによって、血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｄは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって、血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。検出ステップの前に、抗ヒトＩＧを捕捉抗体として使用した。 同上。 同上。 同上。 図２０Ａ～図２０Ｌは、ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、もしくはＡＫ１６８構築物、または抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、および腫瘍におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、およびＴｒｅｇの割合のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｃ）、ＣＤ４細胞の ＦｏｘＰ３％（図２０Ｄ）を示す。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｇ）、ＣＤ４細胞の ＦｏｘＰ３％（図２０Ｈ）を示す。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｋ）、ＣＤ４細胞の ＦｏｘＰ３％（図２０Ｌ）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２１Ａ～図２１Ｌは、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、もしくはＡＫ２１１構築物、または抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、および腫瘍におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、およびＴｒｅｇの割合のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｃ）、ＣＤ４細胞の ＦｏｘＰ３％（図２１Ｄ）を示す。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｇ）、ＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％ （図２１Ｈ）を示す。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｋ）、ＣＤ４細胞の ＦｏｘＰ３％（図２１Ｌ）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２２Ａ～図２２Ｌは、ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、もしくはＡＫ２１１構築物、または抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、および腫瘍におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、およびＴｒｅｇの割合のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｃ）、ＣＤ４細胞の ＦｏｘＰ３％（図２２Ｄ）を示す。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｇ）、ＣＤ４細胞の ＦｏｘＰ３％（図２２Ｈ）を示す。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｋ）、ＣＤ４細胞の ＦｏｘＰ３％（図２２Ｌ）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２３Ａ～図２３Ｉは、ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、またはＡＫ２１１構築物を使用した、脾臓、血液、および腫瘍におけるインビボＴ細胞活性化の結果を示す。Ｔ細胞活性化を、脾臓、血液、および腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞（図２３Ａ；図２３Ｄ；図２３Ｇ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２３Ｂ；図２３Ｅ；図２３Ｈ）、またはＦｏｘｐ３＋細胞（図２３Ｃ；図２３Ｆ；図２３Ｉ）におけるＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。切断不可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して統計解析を実施した。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２４Ａ～図２４Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１６８（切断可能なペプチド配列：ＭＰＹＤＬＹＨＰ、配列番号２４）およびＡＫ２０９（切断可能なペプチド配列：ＶＰＬＳＬＹ、配列番号２８）のインビボ切断を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 図２４Ｅは、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、およびＡＫ２０９構築物の合計レベル、ならびに各構築物の非切断形態のレベルについて、総血漿ＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）の薬物動態研究の結果を示す。 図２５Ａ～図２５Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１１１もしくはＡＫ１６８、またはマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ０８１もしくはＡＫ１６７、または抗ＲＳＶ対照を使用して血管漏出を評価したインビボ研究の結果を示す。 同上。 同上。 同上。図２５Ａは、体重減少の割合（％）を示し、図２５Ｂ、図２５Ｃおよび図２５Ｄはそれぞれ、肝臓、肺、および脾臓の重量をグラムでそれぞれ示す。 図２６Ａおよび図２６Ｂは、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７もしくはＡＫ１６８構築物、または抗ＲＳＶ対照の投与後の肝臓および肺組織への色素漏出の程度を測定することによって示される血管漏出を評価したインビボ研究の結果を示す。肝臓（図２６Ａ）および肺（図２６Ｂ）への色素漏出の程度を、６５０ｎｍでの吸光度に基づいて測定した。 同上。 図２７Ａおよび図２７Ｂは、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７もしくはＡＫ１６８構築物、または抗ＲＳＶ対照の投与後の肝臓および肺組織への単核球の血管周囲浸潤の程度を測定することによって示される血管漏出を評価したインビボ研究の結果を示す。肝臓の単核球の平均数（図２７Ａ）、および肺の単核球の平均数（図２７Ｂ）をそれぞれ図示した。 同上。 図２８Ａおよび図２８Ｂは、ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、もしくはＡＫ１６８構築物、または抗ＲＳＶ対照による治療過程にわたって、腫瘍体積および体重を評価した同系腫瘍モデル研究の結果を示す。図２８Ａは、治療過程にわたる腫瘍体積に関するデータを示し、図２８Ｂは、治療過程にわたる体重の変化率（％）に関するデータを示す。 同上。 図２９Ａおよび図２９Ｂは、Ｉ２５３Ａ ＦｃＲｎ変異を有するＡＫ４７１が、末梢では不活性なまま、ＴＭＥにおいて強固なＣＤ８ Ｔ細胞拡大を誘導することを示している。 同上。 図３０Ａ～図３０Ｃは、ＡＫ４７１がａｇｌｙｃｏ－ｈＩｇＧ１と比較して、半減期がわずかに短いことを示している。 同上。 同上。 図３１Ａ～図３１Ｃは、血漿中のＡＫ４７１による切断または断頭の証拠がないことを示す。 同上。 同上。 図３２Ａおよび図３２Ｂは、実施例５の結果を示す。 同上。 図３３Ａ～図３３Ｄは、実施例５の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 図３４Ａおよび図３４Ｂは、実施例６ｉの結果を示す。 同上。 図３５Ａおよび図３５Ｂは、実施例６ｉｉの結果を示す。 同上。 図３６Ａおよび図３６Ｂは、実施例６ｉｉｉの結果を示す。 同上。 図３７Ａおよび図３７Ｂは、実施例６ｉｖの結果を示す。 同上。 図３８Ａおよび図３８Ｂは、実施例６ｖの結果を示す。 同上。 図３９Ａおよび図３９Ｂは、実施例６ｖｉの結果を示す。 同上。 図４０Ａ～図４０Ｄは、実施例６ｖｉｉの結果を示す。 同上。 同上。 同上。 図４１Ａおよび図４１Ｂは、実施例６ｖｉｉｉの結果を示す。 同上。 図４２Ａおよび図４２Ｂは、実施例６ｉｘの結果を示す。 同上。 図４３Ａおよび図４３Ｂは、実施例６ｘの結果を示す。 同上。 図４４Ａ～図４４Ｄおよび図４５Ａ～図４５Ｆは、ペプチド基質を含まない例示的なＩＬ－１５構築物ＡＫ９０４およびＡＫ９１０、ならびにペプチド基質を含む構築物ＡＫ９３２、ＡＫ９３８、ＡＫ９３０およびＡＫ９３６を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイの結果を示す。図４４Ａ～図４４Ｄは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す。図４５Ａ～図４５Ｆは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイの結果を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図４６～図５４は、実施例９の結果を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図５５～図６５は、実施例１０の結果を示す。図５５Ａ～図５５Ｄは、構築物ＡＫ９０４、ＡＫ９１０、ＡＫ９３０、またはＡＫ９３６を使用してＣＴ２６腫瘍担持マウスで実施された薬物動態研究の結果を示す。図５５Ａは、体重減少の割合（％）を示し、図５５Ｂは、腫瘍の体積をｍｍ３で示し、図５５Ｃおよび図５５Ｄは、それぞれ治療５日後の肺および脾臓の重量をグラムで示す。ビヒクル群と比較して、一元配置分散分析を使用して統計解析を実施した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 同上。 同上。 同上。 図５６Ａ～図５６Ｃは、血液、脾臓、および腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の割合として、ＮＫ細胞のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 図５７Ａ～図５７Ｃは、血液、脾臓、および腫瘍中のＫｉ６７のＭＦＩとして、ＮＫ細胞増殖のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 図５８Ａ～図５８Ｃは、血液、脾臓、および腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の割合として、ＣＤ８ Ｔ細胞のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 図５９Ａ～図５９Ｃは、血液、脾臓、および腫瘍中のＫｉ６７のＭＦＩとして、ＣＤ８ Ｔ細胞増殖のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 図６０Ａ～図６０Ｃは、血液、脾臓、および腫瘍中のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 図６１Ａ～図６１Ｄは、構築物ＡＫ９０４、ＡＫ９１０、ＡＫ９３０、およびＡＫ９３６を使用してＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスで実施された薬物動態研究の結果を示す。図６１Ａは、体重減少の割合（％）を示し、図６０Ｂは、腫瘍の体積をｍｍ３で示し、図６１Ｃおよび図６１Ｄは、それぞれ治療５日後の肺および脾臓の重量をグラムで示す。ビヒクル群と比較して、一元配置分散分析を使用して統計解析を実施した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 同上。 同上。 同上。 図６２Ａ～図６２Ｄは、構築物ＡＫ９０４、ＡＫ９１０、ＡＫ９３０、およびＡＫ９３６を使用してＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスで、実施例１０に記載の通り、実施された薬物動態研究の結果を示す。図６２Ａは、ヒトＩｇＧを検出することによって、血漿中のＦｃレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。図６２Ｂ～図６２Ｄは、図６２Ａの結果から、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアによって計算された半減期、Ｃｍａｘ、およびＡＵＣ（０～ｌａｓｔ）を示す。 同上。 同上。 同上。 図６３Ａ～図６３Ｃは、血液、脾臓、および腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の割合として、ＮＫ細胞のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 図６４Ａ～図６４Ｃは、血液、脾臓、および腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の割合として、ＣＤ８ Ｔ細胞のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 図６５Ａ～図６５Ｃは、血液、脾臓、および腫瘍中のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比のインビボ応答を試験した研究の結果を示す。 同上。 同上。 図６６および図６７は、実施例１１の結果を示す。 同上。
１．ポリペプチド薬物構築物
本発明は、新規の腫瘍特異的タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカー、および腫瘍細胞環境に治療部分を送達するためのポリペプチド薬物構築物におけるそれらの使用を提供する。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、ポリペプチド薬物構築物内に配置され、その結果、リンカーが腫瘍細胞環境でのプロテアーゼ作用によって切断されると、ポリペプチド薬物構築物が分離する。本発明はまた、該薬物構築物の切断産物、ならびにその使用に関連する方法に関する。
プロテアーゼ基質アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳおよびＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳは、非腫瘍細胞環境と比較して、腫瘍細胞環境で非常に特異的な切断を示すことが判明している。したがって、これらのタンパク質分解的に切断可能なペプチドは、ポリペプチド薬物構築物中のタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーに有利に使用されてもよく、投与されたタンパク質治療剤の任意の全身性副作用が低減され得る。
タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、ポリペプチド薬物構築物内の治療部分に直接的または間接的に結合されてもよい。ポリペプチド薬物構築物が複数のポリペプチド鎖を含む場合、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、治療部分と同じポリペプチド鎖内または異なるポリペプチド鎖内に存在し得る。
治療部分以外の構築物の部分は、担体部分とみなすことができる。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが治療部分に直接共有結合される場合、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、治療部分と担体部分との間の薬物構築物内に位置する。あるいは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、切断後に分離する分子が治療部分および担体部分の一部を含むように、担体部分内に位置してもよい。
腫瘍特異的タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーを含むポリペプチド薬物構築物は、プロドラッグであってもよい。腫瘍特異的に切断可能なリンカーが、治療部分を腫瘍細胞環境に送達するためにプロドラッグ中で使用される場合、治療部分が切断後に分離する残りの分子は、マスキング部分を含んでもよく、マスキング部分は、治療部分が、腫瘍細胞環境でのタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーの切断後にのみ生物学的に活性であるように、プロドラッグ中の治療部分の生物学的活性を阻害する。マスキング部分は、治療部分と同じポリペプチド鎖に存在し得る。あるいは、マスキング部分は第一のポリペプチド鎖に存在し、治療部分は第二のポリペプチド鎖に存在し得る。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、第一または第二のポリペプチド鎖に存在してもよい。
マスキング部分を使用することにより、投与されたタンパク質治療剤の全身的副作用は、治療剤の結合能力を干渉することによって低減され得る。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーを使用して治療剤をマスキングすることによって、マスキング部分を使用することで干渉される結合能力を、腫瘍微小環境でのタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーの切断によって復元することができる。したがって、本明細書に提供されるプロドラッグは、癌の特徴のうちの一つである高局所濃度の活性プロテアーゼを利用することによって、腫瘍微小環境に対する薬理学的活性を正確に標的化するように操作される。腫瘍微小環境のこの特徴は、全身的に不活性な分子を、切断産物の形態で局所的に活性な分子へと形質転換するために使用される。腫瘍微小環境での治療部分の活性化は、活性形態で対象に投与される薬物と関連付けられ得る全身毒性を有意に低減させる。
一部の実施形態では、本明細書に提供される薬物構築物は半減期延長部分を含む。インビボでの長い半減期は、治療用タンパク質にとって重要である。残念なことに、対象に投与される治療剤は、腎臓によるクリアランスおよびエンドサイトーシス分解を含む機構によって、通常、対象から急速に除去されるため、短い半減期を有することができる。したがって、本明細書に提供される薬物構築物では、インビボで治療部分の半減期を延長する目的で半減期延長部分を含んでもよい。
タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカー
本明細書に記載のタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、９～２５アミノ酸長である。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、１０～２５アミノ酸長である。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、１２～１８アミノ酸長である。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、以下に示すようにスペーサードメイン（ＳＤ１およびＳＤ２）が両側に隣接している、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む。
Figure 2023553323000021
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）は、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳからなる。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）は、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなる。
スペーサードメインは、一つまたは複数のアミノ酸からなってもよい。スペーサードメインの機能は、存在する場合、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を本明細書に記載の構築物中の他の機能的構成要素に連結することである。
スペーサードメインは、腫瘍細胞環境または非腫瘍細胞環境中のプロテアーゼと、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの生物学的相互作用を変化させないことが理解されよう。言い換えれば、スペーサードメインの存在下であっても、本明細書に開示される本発明のタンパク質分解的に切断可能なペプチドは、その有利な腫瘍特異性を保持する。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドに隣接するスペーサードメインは異なっている。
一部の実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である。
一部の実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、ＳおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
一部の実施形態では、第一のスペーサードメイン（ＳＤ１）は、３～１０アミノ酸長である。一部の実施形態では、第一のスペーサードメイン（ＳＤ１）は、４～９アミノ酸長である。一部の実施形態では、第一のスペーサードメイン（ＳＤ１）は、３～６アミノ酸長である。
例示的なＳＤ１配列を以下に示す。
Figure 2023553323000022
一部の実施形態では、第一のスペーサードメイン（ＳＤ１）は、上の表に示される配列を有する。
一部の実施形態では、ＳＤ２のＣ末端配列は、－ＧＰ Ｃ’である。
一部の実施形態では、ＳＤ２のＣ末端配列は、配列番号２９である。
一部の実施形態では、第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）は、３～６アミノ酸長である。
一部の実施形態では、ＳＤ２は、アミノ酸配列ＳＧＰを含む。
一部の実施形態では、ＳＤ２は、アミノ酸配列ＳＧＰを有する。
切断可能なリンカーにおけるＳＤ１とＳＤ２の例示的な組み合わせを以下に示す：
Figure 2023553323000023
一部の実施形態では、第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）は、上の表に示される配列を有する。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、式中、ＳＤ１は、第一のスペーサードメインであり、ＣＰは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳを有する切断可能なペプチドであり、ＳＤ２は、第二のスペーサードメインである。一部の実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である。一部の実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、ＳおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。一部の実施形態では、ＳＤ２は、アミノ酸配列ＳＧＰを有する。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、式中、ＳＤ１は、第一のスペーサードメインであり、ＣＰは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳを有する切断可能なペプチドであり、ＳＤ２は、第二のスペーサードメインである。一部の実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である。一部の実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、ＳおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。一部の実施形態では、ＳＤ２は、アミノ酸配列ＳＧＰを有する。
Figure 2023553323000024
を使用する例示的な切断可能なリンカーを以下に示す。
Figure 2023553323000025
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000026
を含む。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000027
を含む。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000028
を含む。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000029
を含む。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000030
を含む。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000031
を含む。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000032
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000033
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000034
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000035
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000036
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000037
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000038
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000039
を有する。
Figure 2023553323000040
を使用する例示的な切断可能なリンカーを以下に示す。
Figure 2023553323000041
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000042
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000043
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000044
を有する。
一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023553323000045
を有する。
例示的なＡＫ分子に開示されたリンカーの組み合わせは、本明細書に開示される任意のサイトカイン部分と共に使用されてもよい。例示的なＡＫ分子に開示されたリンカーの組み合わせは、本明細書に開示される任意のマスキング部分と共に使用されてもよい。例示的なＡＫ分子に開示されたリンカーの組み合わせは、任意の半減期延長部分と共に使用されてもよい。言い換えれば、例示的なＡＫ分子に開示されるリンカーは、本明細書に開示される任意のサイトカイン部分、本明細書に開示されるマスキング部分、および／または本明細書に開示される半減期延長部分の組み合わせで使用され得る。
半減期延長部分
インビボでの長い半減期は、治療用タンパク質にとって重要である。
用語「半減期延長部分」は、例えば、ＰＥＧ、アルブミン、抗体および抗体断片を包含する。
半減期延長部分は、抗体またはその断片を含み得る。
ＦｃＲｎ介在性リサイクルが可能な抗体またはその断片は、対象からの薬物構築物のクリアランスを低減するか、または他の方法で遅延させてもよく、それによって、投与された薬物構築物の半減期を延長する。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、ＦｃＲｎ介在性リサイクルが可能な任意の重鎖ポリペプチドまたはその部分（例えば、Ｆｃドメインまたはその断片）など、ＦｃＲｎ介在性リサイクルが可能な任意の抗体またはその断片である。
抗体またはその断片は、任意の抗体またはその断片であってもよい。しかしながら、第一の半減期延長部分および第二の半減期延長部分を含む薬物構築物の一部の実施形態では、第一の半減期延長部分または第二の半減期延長部分のいずれかは、軽鎖ポリペプチドなどのＦｃＲｎ受容体に結合しない抗体またはその断片を含んでもよい。例えば、薬物構築物の一部の実施形態では、第一の半減期延長部分は、ＦｃＲｎ受容体と直接相互作用しない軽鎖ポリペプチドまたはその部分を含む抗体またはその断片を含むが、それにもかかわらず、薬物構築物は、例えば重鎖ポリペプチドを含むなど、ＦｃＲｎ受容体と相互作用することができる第二の半減期延長部分を含むため、延長された半減期を有する。ＦｃＲｎ介在性リサイクルは、ＦｃＲｎ受容体の抗体またはその断片のＦｃ領域への結合を必要とすることが当該技術分野で認識されている。例えば、研究は、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、およびＹ４３６（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムに従った番号付け）が、ヒトＦｃ領域とヒトＦｃＲｎ複合体との間の相互作用に重要であることを示している。例えば、Ｆｉｒａｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ （２００１） ９９３－１００２；Ｓｈｉｅｌｄｓ， Ｒ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （２００１） ６５９１－６６０４を参照されたい。残基２４８～２５９、３０１～３１７、３７６～３８２、および４２４～４３７（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステムによる番号付け）の様々な変異体も調査され、報告されている。Ｙｅｕｎｇ， Ｙ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８２ （２００９） ７６６７－７６７１。
一部の実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドのいずれかを含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドのいずれかの一部を含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、Ｆｃドメインまたはその断片を含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはその断片を含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖ポリペプチドの定常ドメインを含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、軽鎖ポリペプチドの定常ドメインを含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖ポリペプチドまたはその断片（例えば、Ｆｃドメインまたはその断片）を含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、軽鎖ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、第一の半減期延長部分は、第一のＦｃドメインまたはその断片を含み、第二の半減期延長部分は、第二のＦｃドメインまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、第一および／または第二のＦｃドメインはそれぞれ、第一および第二の半減期延長部分の非共有結合を促進する一つまたは複数の修飾を含有する。一部の実施形態では、第一の半減期延長部分は、変異Ｙ３４９Ｃ；Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３８ＡおよびＹ４０７Ｖを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片を含んで、第一の半減期延長部分に「ホール」を形成し、第二の半減期延長部分は、変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片を含んで、第二の半減期延長部分に「ノブ」を形成する。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃドメインまたはその断片である。一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片である。ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖定常ガンマ１は、以下の配列を有する：
Figure 2023553323000046
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、配列番号６（「親配列」）を有するヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖定常ガンマ１の配列から誘導され、その結果、第一および第二の半減期延長部分はそれぞれ、一つまたは複数のアミノ酸修飾を有する配列番号６またはその断片を含む。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分はそれぞれ、上記で太字で示される配列番号６の部分を含み、任意で一つまたは複数のアミノ酸修飾、すなわち、以下を有する。
DKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
（配列番号７）
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、アミノ置換を有する配列番号７を含み、「ノブ・イントゥ・ホール」アプローチに従って第一および第二の半減期延長部分の会合を促進する。一部の実施形態では、配列配列番号７は、変異Ｙ３４９Ｃ；Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付け）を含有して、第一の半減期延長部分に「ホール」を形成し、変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付け）を含有して、第二の半減期延長部分に「ノブ」を形成する。これらの修飾配列は、以下に示される配列番号８および１１を有する：
第一の半減期延長部分（Ｙ３４９Ｃ；Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３８Ａ；およびＹ４０７Ｖ）配列番号８：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ
VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
第二の半減期延長部分（Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）配列番号１１：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW
LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK
NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＮ２９７Ａのアミノ置換をさらに含む。
第一の半減期延長部分（Ｙ３４９Ｃ；Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３８Ａ；Ｙ４０７ＶおよびＮ２９７Ａ）配列番号９：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ
VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
第二の半減期延長部分（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６ＷおよびＮ２９７Ａ）配列番号１２：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW
LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK
NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＩ２５３Ａのアミノ置換をさらに含む。
一部の実施形態では、第一および第二の半減期延長部分は、それぞれ、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたアミノ置換Ｎ２９７ＡおよびＩ２５３Ａの両方をさらに含む。
第一の半減期延長部分（Ｙ３４９Ｃ；Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３８Ａ；Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７ＡおよびＩ２５３Ａ）配列番号１０：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE
YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
第二の半減期延長部分（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７ＡおよびＩ２５３Ａ）配列番号１３：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY
KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
一部の実施形態では、第一の半減期延長部分は、配列番号７、８、９、および１０のいずれか一つのアミノ酸配列のいずれか一つと、約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第二の半減期延長部分は、配列番号７、１１、１２、および１３のいずれか一つのアミノ酸配列のいずれか一つと、約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一の半減期延長部分は、配列番号７、８、９、および１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失などの一つまたは複数の修飾を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第二の半減期延長部分は、配列番号７、１１、１２、および１３のうちのいずれか一つのアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失などの一つまたは複数の修飾を有するアミノ酸配列を含む。一つまたは複数の修飾は、本明細書に記述される任意の修飾または改変であってもよく、一部の実施形態では、ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進し、および／またはポリペプチド鎖のホモ二量体化を抑制し、エフェクター機能を変化させ、またはエフェクター機能を強化する任意の修飾または改変を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインまたはその断片は、エフェクター機能を変化させる一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｄ２６５Ａ、およびＰ３２９Ｇからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインまたはその断片であり、以下のアミノ置換を含む：Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ；Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、およびＡ３３１Ｓ；および／またはＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、およびＡ３３０Ｓ。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインまたはその断片であり、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、およびＶ３０９Ｌからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインまたはその断片であり、以下のアミノ置換を含む：Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、およびＥ３１８Ａ；Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａ；Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ、および／またはＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ａ。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインまたはその断片であり、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、半減期延長部分は、エフェクター機能を強化する一つまたは複数のアミノ酸置換含むＦｃドメインまたはその断片を含む。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、以下のアミノ酸置換を含む：Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑ；Ｄ２８０ＨおよびＫ２９０Ｓ；Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、およびＳ２９８ＤまたはＳ２９８Ｖのいずれか；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ；Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓ；Ｋ２９０Ｅ、Ｓ２９８Ｇ、およびＴ２９９Ａ；Ｋ２９０Ｅ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、およびＫ３２６Ｅ；Ｋ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、およびＴ２９９Ａ；Ｋ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、およびＫ３２６Ｅ；Ｋ３３４Ｖ；Ｌ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、およびＫ３３４Ｖ；Ｋ３３４ＶおよびＱ３３１Ｍ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｖ、Ｅ２９４Ｌ、またはＳ２９８Ｔ；Ｅ２３３Ｌ、Ｑ３１１Ｍ、およびＫ３３４Ｖ；Ｌ２３４Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、およびＫ３３４Ｖ；Ｋ３３４ＶおよびＳ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｍ、またはＡ３３０Ｆ；Ｋ３３４Ｖ、Ｑ３１１Ｍ、およびＡ３３０ＭまたはＡ３３０Ｆのいずれか；Ｋ３３４Ｖ、Ｓ２９８Ｔ、およびＡ３３０ＭまたはＡ３３０Ｆのいずれか；Ｋ３３４Ｖ、Ｓ２３９Ｄ、およびＡ３３０ＭまたはＳ２９８Ｔのいずれか；Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＫ２９０Ｙ、Ｆ２４３Ｖ、またはＥ２９４Ｌ；Ｙ２９６ＷおよびＬ２３４ＹまたはＫ２９０Ｙのいずれか；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｓ、およびＩ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ；Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｉ；Ｌ３２８Ｍ；Ｉ３３２Ｅ；Ｌ３２８ＭおよびＩ３３２Ｅ；Ｖ２６４ＩおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９ＥおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９ＱおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｅ；Ａ３３０Ｙ；Ｉ３３２Ｄ；Ｌ３２８ＩおよびＩ３３２Ｅ；Ｌ３２８ＱおよびＩ３３２Ｅ；Ｖ２６４Ｔ；Ｖ２４０Ｉ；Ｖ２６６Ｉ；Ｓ２３９Ｄ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｄ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｎ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｑ；Ｓ２３９ＥおよびＩ３３２Ｄ；Ｓ２３９ＥおよびＩ３３２Ｎ；Ｓ２３９ＥおよびＩ３３２Ｑ；Ｓ２３９ＮおよびＩ３３２Ｄ；Ｓ２３９ＮおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９ＱおよびＩ３３２Ｄ；Ａ３３０ＹおよびＩ３３２Ｅ；Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｙ、およびＩ３３２Ｅ；Ａ３３０ＬおよびＩ３３２Ｅ；Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、またはＬ２３４Ｉ；Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、またはＬ２３５Ｉ；Ｓ２３９Ｔ；Ｖ２４０Ｍ；Ｖ２６４Ｙ；Ａ３３０Ｉ；Ｎ３２５Ｔ；Ｉ３３２ＥおよびＬ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、またはＬ３２８Ｉ；Ｖ２６４Ｉ、Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９ＥまたはＳ２３９Ｑのいずれか；Ｓ２３９Ｅ、Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｙ、およびＩ３３２Ｅ；Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９ＤまたはＳ２３９Ｎのいずれか；Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９ＤまたはＳ２３９Ｎのいずれか；Ｖ２６４Ｉ、Ｓ２９８Ａ、およびＩ３３２Ｅ；Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９ＤまたはＳ２３９Ｎのいずれか；Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｉ、およびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｉ、Ｓ２９８Ａ、およびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｉ；Ｐ２３０Ａ；Ｐ２３０Ａ、Ｅ２３３Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；Ｅ２７２Ｙ；Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、またはＫ２７４Ｙ；Ｆ２７５Ｗ；Ｎ２７６Ｌ；Ｙ２７８Ｔ；Ｖ３０２Ｉ；Ｅ３１８Ｒ；Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４ＩまたはＳ３２４Ｖ；Ｋ３２６ＩまたはＫ３２６Ｔ；Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、またはＴ３３５Ｙ；Ｖ２４０ＩおよびＶ２６６Ｉ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、およびＬ２３４Ｉ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、およびＬ２３５Ｄ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、およびＶ２４０Ｉ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、およびＶ２６４Ｔ；および／またはＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、およびＫ３２６ＥまたはＫ３２６Ｔのいずれか。一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、以下からなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む：Ｐ２３０Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｎ３２５Ｔ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、およびＴ３３５Ｙ。
一部の実施形態では、半減期延長部分は、ＦｃＲｎへの半減期延長部分の結合を強化する一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数のアミノ酸置換は、酸性ｐＨで、Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチドまたはＦｃドメインもしくはその断片）のＦｃＲｎへの結合親和性を増加させる。一部の実施形態では、半減期延長部分は、 Ｍ４２８Ｆ；Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｆ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ；Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ；Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ；Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１１；Ｎ４３４Ａ；Ｎ４３４Ｗ；Ｍ４２８ＦおよびＮ４３４Ｓ；Ｖ２５９ＩおよびＶ３０８Ｆ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ；Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８ＦおよびＭ４２８Ｆ；Ｔ３０７ＱおよびＮ４３４Ａ；Ｔ３０７ＱおよびＮ４３４Ｓ；Ｔ３０７Ｑ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａ；Ｖ３０８ＰおよびＮ４３４Ａ；Ｎ４３４Ｈ；およびＶ３０８Ｐからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
製造目的のために、シグナルペプチドは、半減期ドメインの上流で操作されて、タンパク質の分泌を改善することができる。シグナルペプチドは、当該技術分野で公知の細胞株の要件に従って選択される。当然のことながら、シグナルペプチドは、精製され、医薬品として製剤化されるタンパク質の一部としては発現されない。
１．１．１ ヘテロ二量体化修飾
本明細書に記載される半減期延長部分は、二つの異なる半減期延長部分のヘテロ二量体化を促進する一つまたは複数の修飾を含み得る。一部の実施形態では、その正しいヘテロ二量体の形態での薬物構築物の生産が効率的に生産されるように、第一および第二の半減期延長部分のヘテロ二量体化を促進することが望ましい。このように、以下に記載される任意の戦略を含む、当技術分野で利用可能な任意の戦略を使用して、一つまたは複数のアミノ酸修飾を、第一の半減期延長部分に対して行い、一つまたは複数のアミノ酸修飾を、第二の半減期延長部分に対して行うことができる。Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）、ＭＡｂｓ、４（６）：６５３－６６３。例示的な戦略および修飾を以下に詳細に説明する。
1.1.2 ノブ・イントゥ・ホールアプローチ
二つの異なる半減期延長部分のヘテロ二量体化を促進するための一つの戦略は、「ノブ・イントゥ・ホール」と呼ばれるアプローチである。
一部の実施形態では、薬物構築物は、第一の半減期延長部分および第二の半減期延長部分を含み、それら各々がＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインを含む半減期延長部分は、重鎖ポリペプチドまたはその断片（例えば、Ｆｃドメインまたはその断片）である。二つの半減期延長部分のＣＨ３ドメインは、「ノブ・イントゥ・ホール」技術によって変えることができ、これは例えば、以下に記載のいくつかの例で詳細に説明される。ＷＯ１９９６／０２７０１１；Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（１９９６）９（７）：６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６（７）：６７７－６８１。Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）、ＭＡｂｓ、４（６）：６５３－６６３も参照のこと。ノブ・イントゥ・ホール法を使用して、二つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、二つの改変されたＣＨ３ドメインを含有する二つの半減期延長部分のヘテロ二量体化を増加させる。これは、半減期延長部分の一つのＣＨ３ドメイン内に嵩高い残基を導入し、「ノブ」として作用させることによって起こる。次に、嵩高い残基を収容するために、ノブを収容できる他の半減期延長部分に「ホール」が形成される。改変されたＣＨ３ドメインのいずれかが「ノブ」で、他方が「ホール」であってもよい。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９８） １６（７）；Ａｔｗｅｌｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７０（１）：２６－３５）、収率も増加させる。
重鎖にＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を導入して「ノブ」を作製し、重鎖にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を導入して「ホール」を作製することによって、９７％を超えるヘテロ二量体化収率を達成できることが報告されている（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムによる残基の番号付け）。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２４８： ７－１５；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１２）、ＭＡｂｓ、４（６）： ６５３－６６３。
第一の半減期延長部分および第二の半減期延長部分を含む一部の実施形態では、第一の半減期延長部分が、アミノ酸変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付け）を含む、重鎖ポリペプチドまたはその部分（例えば、Ｆｃドメインまたはその断片）を含み、第二の半減期延長部分が、アミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、 Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付け）を含む、重鎖ポリペプチドまたはその部分（例えば、Ｆｃドメインまたはその断片）を含む。第一の半減期延長部分および第二の半減期延長部分を含む一部の実施形態では、第一の半減期延長部分が、アミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付け）を含む、重鎖ポリペプチドまたはその部分（例えば、Ｆｃドメインまたはその断片）を含み、第二の半減期延長部分が、アミノ酸変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付け）を含む、重鎖ポリペプチドまたはその部分（例えば、Ｆｃドメインまたはその断片）を含む。
ノブおよびホールを形成するために作製され得る置換のさらなる例には、ＵＳ２０１４０３０２０３７Ａ１に記載されるものが含まれ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。例えば、一部の実施形態では、以下のアミノ酸置換のいずれかを、それぞれがＦｃドメインを含有する第一の半減期延長部分（以下、第一のドメイン）および対の第二の半減期延長部分（以下、第二のドメイン）に対して行うことができる：Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、（ａ）第一のドメインのＹ４０７Ｔと第二のドメインのＴ３６６Ｙ、（ｂ）第一のドメインのＹ４０７Ａと第二のドメインのＴ３６６Ｗ、（ｃ）第一のドメインのＦ４０５Ａと第二のドメインのＴ３９４Ｗ、（ｄ）第一のドメインのＦ４０５Ｗと第二のドメインのＴ３９４Ｓ、（ｅ）第一のドメインのＹ４０７Ｔと第二のドメインのＴ３６６Ｙ、（ｆ）第一のドメインのＴ３６６ＹとＦ４０５Ａ、および第二のドメインのＴ３９４ＷとＹ４０７Ｔ、（ｇ）第一のドメインのＴ３６６ＷとＦ４０５Ｗ、および第二のドメインのＴ３９４ＳとＹ４０７Ａ、（ｈ）第一のドメインのＦ４０５ＷとＹ４０７Ａ、および第二のドメインのＴ３６６ＷとＴ３９４Ｓ、または（ｉ）第一のドメインのＴ３６６Ｗ、および第二ドメインのＴ３６６Ｓ、 Ｌ３６８Ａ、とＹ４０７Ｖ。
一部の実施形態では、以下のアミノ酸置換のいずれかを、それぞれがＦｃドメインを含有する第一の半減期延長部分（以下、第一のドメイン）および対の第二の半減期延長部分（以下、第二のドメイン）に対して行うことができる：Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、（ａ）第二のドメインのＹ４０７Ｔと第一のドメインのＴ３６６Ｙ、（ｂ）第二のドメインのＹ４０７Ａと第一のドメインのＴ３６６Ｗ、（ｃ）第二のドメインのＦ４０５Ａと第一のドメインのＴ３９４Ｗ、（ｄ）第二のドメインのＦ４０５Ｗと第一のドメインのＴ３９４Ｓ、（ｅ）第二のドメインのＹ４０７Ｔと第一のドメインのＴ３６６Ｙ、（ｆ）第二のドメインのＴ３６６ＹとＦ４０５Ａ、および第一のドメインのＴ３９４ＷとＹ４０７Ｔ、（ｇ）第二のドメインのＴ３６６ＷとＦ４０５Ｗ、および第一のドメインのＴ３９４ＳとＹ４０７Ａ、（ｈ）第二のドメインのＦ４０５ＷとＹ４０７Ａ、および第一のドメインのＴ３６６ＷとＴ３９４Ｓ、または（ｉ）第二のドメインのＴ３６６Ｗ、および第一ドメインのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、とＹ４０７Ｖ。
各々がＦｃドメインを含む第一の半減期延長部分および第二の半減期延長部分を含む実施形態では、本明細書に記載のヘテロ二量体化改変のいずれかをＦｃドメインで使用して、本明細書に記載の薬物構築物のいずれかのヘテロ二量体化を促進することができる。
治療部分
一部の実施形態では、治療部分がサイトカイン部分である、サイトカインプロドラッグが本明細書に提供されている。サイトカインプロドラッグのマスキング部分は、サイトカイン受容体の細胞外ドメインのドメインを含み得る。したがって、サイトカインプロドラッグは、マスクされたサイトカインとみなされ得る。
サイトカイン部分は、野生型サイトカイン部分またはバリアントサイトカイン部分を含み得る。
本明細書に例示されるサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１５である。
サイトカインプロドラッグ
サイトカインは、細胞シグナル伝達、特に免疫系の細胞において役割を果たす。本明細書において、マスクされたサイトカインまたはその切断産物で使用するためのサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５またはＩＬ－１２サイトカイン）またはその機能的断片を含むサイトカイン部分が提供される。
１．１ 「ヘテロ二量体」マスクされたサイトカイン
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖にマスキング部分を含み、第二のポリペプチド鎖にそのサイトカイン部分を含む、マスクされたサイトカインが本明細書に提供される。こうしたマスクされたサイトカインは、「ヘテロ二量体の」マスクされたサイトカインと呼んでもよい。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、タンパク質ヘテロ二量体であって、
ｃ）第一のリンカーを介して第一の半減期延長部分に連結されたマスキング部分を含む第一のポリペプチド鎖と、
ｄ）第二のリンカーを介して第二の半減期延長部分に連結されたそのサイトカイン部分を含む第二のポリペプチド鎖とを含み、
第一の半減期延長部分が第二の半減期延長部分と会合し、
少なくとも第一のリンカーまたは第二のリンカーが、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである、タンパク質ヘテロ二量体を含む。
一部の実施形態では、第一のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。一部の実施形態では、第一のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。一部の実施形態では、第一のリンカーは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能なリンカーである。切断不可能なリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。
一部の実施形態では、第二のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。一部の実施形態では、第二のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。一部の実施形態では、第二のリンカーは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである。一部の実施形態では、第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーであり、第一のリンカーは、切断不可能である。切断不可能なリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。
タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。
半減期延長部分は、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。
マスキング部分およびサイトカイン部分の組み合わせは、本明細書のどこかに記載されるとおりであってもよい。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖では、第一の半減期延長ドメインは、第一のリンカーのアミノ末端に連結され、第一のリンカーのカルボキシ末端は、マスキング部分のアミノ末端に連結され、第二のポリペプチド鎖では、第二の半減期延長ドメインは、第二のリンカーのアミノ末端に連結され、第二のリンカーのカルボキシ末端は、そのサイトカイン部分のアミノ末端に連結される。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000047
を含み、
第二のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000048
を含み、
式中、ＨＬ１は第一の半減期延長ドメインであり、Ｌ１は第一のリンカーであり、ＭＭはマスキング部分であり、ＨＬ２は第二の半減期延長ドメインであり、Ｌ２は第二のリンカーであり、Ｃはそのサイトカイン部分であり、
一部の実施形態では、第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第一のリンカーは、切断不可能なリンカーである。この配置は、本明細書では「構造Ａ」として記載される。一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000049
を含み、
第二のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000050
を含む。
一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能なリンカーである。この配置は、本明細書では「構造Ｂ」として記載される。一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000051
を含み、
第二のポリペプチド鎖は、
Figure 2023553323000052
を含む。
１．２ 「線形」マスクされたサイトカイン
一部の実施形態では、単一のポリペプチド鎖で連結されたマスキング部分と、そのサイトカイン部分とを含む、マスクされたサイトカインが本明細書に提供される。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、以下の式：
Figure 2023553323000053
を含むポリペプチド鎖を含み、
式中、ＨＬは半減期延長ドメインであり、Ｌ１は第一のリンカーであり、ＭＭはマスキング部分であり、Ｌ２は第二のリンカーであり、Ｃはそのサイトカイン部分であり、少なくとも第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含む。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、以下の式：
Figure 2023553323000054
を含む、ポリペプチド鎖を含み、
式中、ＨＬは半減期延長ドメインであり、Ｌ１は第一のリンカーであり、ＭＭはマスキング部分であり、Ｌ２は第二のリンカーであり、Ｃはそのサイトカイン部分であり、少なくとも第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含む。一部の実施形態では、第一のリンカーは、本明細書のどこかに記載される切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、第二のリンカーは、本明細書のどこかに記載される切断不可能なリンカーである。一部の実施形態では、そのサイトカイン部分は、本明細書のどこかに記載されるとおりである。一部の実施形態では、半減期延長ドメイン（ＨＬ）は、抗体のＦｃ領域（すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域）または二量体化Ｆｃドメイン（ＨＬ１－ＨＬ２）を含むその断片を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端に及ぶと画定される。一部の実施形態では、抗体（ＨＬ１－ＨＬ２）の二量体化Ｆｃドメインは、本明細書のどこかに記載されるとおり、第一の半減期延長ドメインと第二の半減期延長ドメインとを含み、第一の半減期延長部分は、第一のＦｃドメインまたはその断片を含み、第二の半減期延長部分は、第二のＦｃドメインまたはその断片を含む。一部の実施形態では、ＨＬ２はポリペプチド鎖の構成要素であり、ＨＬ１はＨＬ２に二量体化される。
１．１ サイトカイン部分およびマスキング部分
本明細書に開示されるサイトカイン部分およびマスキング部分（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、およびＩｌ－１５サイトカイン部分およびマスキング部分）は、本明細書に開示される任意のポリペプチド薬物構築物で使用され得る。
本明細書に開示されるサイトカイン部分およびマスキング部分は、本明細書に開示される構造Ａのヘテロ二量体のマスクされたサイトカインで使用され得る。
本明細書に開示されるサイトカイン部分およびマスキング部分は、本明細書に開示される構造Ｂのヘテロ二量体のマスクされたサイトカインで使用され得る。
本明細書に開示されるサイトカイン部分およびマスキング部分は、本明細書に開示される線形マスクされたサイトカインで使用され得る。
１．１．１ ＩＬ－２サイトカイン部分およびＩＬ－２マスキング部分
（ａ）ＩＬ－２サイトカイン部分
一部の実施形態では、治療部分は、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片を含む。
ＩＬ－２はインターロイキンであり、白血球の活性を調節する免疫系のサイトカインシグナル伝達分子の一種である。
真核細胞では、天然に存在するＩＬ－２は、配列番号１を有する１５３個のアミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成される。次いで、アミノ酸残基１～２０を除去することによって、これを成熟ＩＬ－２にプロセシングする。これにより、配列番号２を有する１３３個のアミノ酸（アミノ酸残基２１～１５３）からなるＩＬ－２の成熟形態を得られる。ＩＬ－２サイトカインの「機能的断片」は、サイトカイン受容体結合能力（例えば、完全長サイトカインタンパク質と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性以内）を保持または修飾した、完全長サイトカインタンパク質の一部を含む。サイトカイン受容体結合能は、例えば、サイトカインの同族受容体またはその成分（例えば、ヘテロ三量体受容体複合体の一つまたは複数の鎖）に結合するサイトカインの能力によって示され得る。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、インターロイキン－２受容体、特にＩＬ－２Ｒα鎖に結合することができる任意の天然インターロイキン－２（ＩＬ－２）タンパク質またはその修飾バリアントである。ＩＬ－２サイトカイン結合の文脈では、標的タンパク質は、ＩＬ－２Ｒ（ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、およびＩＬ－２Ｒγ鎖を含む）、ＩＬ－２Ｒα鎖、ＩＬ－２Ｒβ鎖、またはＩＬ－２Ｒα／β二量体複合体であり得る。一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号１のアミノ酸残基２１～１５３のアミノ酸配列を含む。 一部の実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片は、成熟ＩＬ－２のアミノ酸配列、配列番号２を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。 少なくとも一つのアミノ酸修飾の各々は、置換、挿入、または欠失などの任意のアミノ酸修飾であってもよい。一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。 一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも５のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）に対するＩＬ－２ペプチドまたはその機能的断片の親和性を減少させる、配列番号２の野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、一つまたは複数のアミノ酸残基３８、４２、４５、および６２がアラニン（Ａ）であるように、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、アミノ酸残基３８、４２、４５、および６２がアラニン（Ａ）であるように、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列置換Ｃ１２５Ａを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、アミノ酸残基３８、４２、４５、および６２がアラニン（Ａ）であり、アミノ酸残基１２５がアラニン（Ａ）であるように、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列においてアラニンに置換されたアミノ酸残基Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、およびＥ６２を有するアミノ酸配列を含む。 一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列においてアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸残基Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、およびＥ６２、ならびにアラニン（Ａ）に置換されたアミノ酸残基Ｃ１２５を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。 一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号３のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、Ｏ－グリコシル化部位を除去する目的で、配列番号２の成熟ＩＬ－２のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、残基１～３が除去されている。一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、Ｏ－グリコシル化部位を除去する目的で、配列番号２の成熟ＩＬ－２のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸残基が置換されている。一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、Ｏ－グリコシル化部位を除去する目的で、配列番号２の成熟ＩＬ－２のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、残基１～３の領域に挿入されている。一部の実施形態では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片は、残基１～３内にＯ－グリコシル化部位を有しない。
（ｂ）ＩＬ－２マスキング部分
本明細書では、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片を含む治療部分をマスキングする際に使用するためのマスキング部分が提供される。
マスキング部分は、マスクされたサイトカインから切断されて、その切断産物を形成することが理解されよう。マスキング部分は、マスクされたサイトカイン中のＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片をマスクし、それによってＩＬ－サイトカインまたはその機能的断片のその同族受容体への結合を低減または防止する。一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片のＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）への結合を低減または防止する。一部の実施形態では、本明細書に提供されるマスキング部分は、抗ＩＬ－２抗体またはＩＬ－２同族受容体タンパク質などのＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片に結合することができるか、またはそうでなければ親和性を呈することができる部分を指す。タンパク質（例えば、サイトカイン）の同族タンパク質（例えば、サイトカイン受容体）への結合の程度を決定する方法は、当該技術分野で周知である。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２サイトカイン受容体、またはそのサブユニットもしくはその機能的断片を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－２との親和性を保持するか、またはそうでなければ示す、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２とも呼ばれる）またはその断片、部分、もしくはバリアントを含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、配列番号４のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１２２に変異を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置１２２に変異Ｃ１２２Ｓを有する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、Ｃ１２２変異を有する配列番号４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、Ｃ１２２Ｓ変異を有する配列番号４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１６８に変異を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置１６８に変異Ｃ１６８Ｓを有する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、Ｃ１６８変異を有する配列番号４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、Ｃ１６８Ｓ変異を有する配列番号４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１２２およびＣ１６８に変異を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、配列番号４のＩＬ－２Ｒβと比較して、変異Ｃ１２２ＳおよびＣ１６８Ｓを有する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、（ｉ）マスクされたサイトカインが、構造Ａのヘテロ二量体のマスクされたサイトカインであり、（ｉｉ）サイトカイン部分がＩＬ－２サイトカイン部分である場合、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＳＳＧＰまたはＧＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＳＳＧＰを有しない。
１．１．２ ＩＬ－１２サイトカイン部分およびＩＬ－１２マスキング部分
（ａ）ＩＬ－１２サイトカイン部分
一部の実施形態では、治療部分は、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片を含む。
ＩＬ－１２はインターロイキンであり、白血球の活性を調節する免疫系のサイトカインシグナル伝達分子の一種である。
内因性ＩＬ－１２は、生合成中に細胞内で二量体化する二つの異なる分子ＩＬ－１２ ｐ４０およびＩＬ－１２ ｐ３５として存在する。
ＩＬ－１２ ｐ４０およびＩＬ－１２ ｐ３５の全配列は、以下のとおりである（生合成中に切断されたプロペプチドが太字で示されている）：
ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット：
Figure 2023553323000055
ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット：
Figure 2023553323000056
成熟形態は以下のとおりである。
ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット：
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQ
KEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERV
RGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKN
LQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVIC
RKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット：
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMM
ALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQK
SSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
これらは、二つのサブユニット間のジスルフィド結合を介して生合成中に共有結合的に二量体化する二つの鎖として発現される：ｐ４０サブユニットのシステインＣ１９９は、ｐ３５サブユニットのシステインＣ９６と会合している。
ＩＬ－１２サイトカインの「機能的断片」は、サイトカイン受容体結合能力（例えば、完全長サイトカインタンパク質と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性以内）を保持または修飾した、完全長サイトカインタンパク質の一部を含む。サイトカイン受容体結合能は、例えば、サイトカインの同族受容体またはその成分に結合するサイトカインの能力によって示され得る。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、インターロイキン－２受容体に結合することができる任意の天然インターロイキン－２（ＩＬ－１２）タンパク質またはその修飾バリアントである。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドまたはその機能的断片は、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドまたはその機能的断片に共有結合したＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドまたはその機能的断片を含む。
ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドまたはその機能的断片は、第一のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000057
を含み、
第二のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000058
を含むように、第一の半減期延長ドメインに結合されてもよく、
式中、「ＩＬ－１２ｐ４０」はＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドまたはその機能的断片であり、「ＩＬ－１２ｐ３５」はＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドまたはその機能的断片である。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。少なくとも一つのアミノ酸修飾の各々は、置換、挿入、または欠失などの任意のアミノ酸修飾であってもよい。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４のアミノ酸配列と比較して、少なくとも５のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメイン（ＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶ）を含む。ヘパリンおよびヘパラン硫酸などのＧＡＧは、ＩＬ－１２を含む多数の成長因子およびサイトカインに結合することが示されている。この結合の生理学的有意性は二倍である。第一に、ＧＡＧは細胞表面上の共受容体として機能し、サイトカインの局所的高濃度を維持することができる。第二に、ＧＡＧは、二量体化およびタンパク質分解からの保護を含む複数のメカニズムを介して、成長因子およびサイトカインの生物活性を調節することができる。
ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットの成熟形態のＧＡＧ結合ドメインを太字で下に示す。
Figure 2023553323000059
ＧＡＧ結合ドメイン（ＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶ）に対する修飾は、サイトカイン活性の低下を伴わずに、変異したＧＡＧ結合ドメインを有するＩＬ－１２サイトカインを含む構築物のＰＫプロファイルを増加させることが本明細書に示されている。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、ＧＡＧ結合ドメインに対する少なくとも一つのアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインへの修飾は、欠失変異である。一部の実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインへの修飾は、欠失変異および少なくとも一つの置換変異である。
一部の実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＲＶを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示されるアミノ酸配列、配列番号２０５を含む。一部の実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＧＲＶを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示されるアミノ酸配列、配列番号２０６を含む。
一部の実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＲＶからなる。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示されるアミノ酸配列、配列番号２０５を含む。一部の実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＧＲＶからなる。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示されるアミノ酸配列、配列番号２０６を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のシステイン置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｃ２５２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、位置Ｃ２５２でのアミノ酸置換は、Ｃ２５２Ｓである。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０７のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０７のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のシステイン置換を有するアミノ酸配列、およびＧＡＧ結合ドメインに対して少なくとも一つのアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｃ２５２Ｓにアミノ酸置換を含み、ＧＡＧ結合ドメインはアミノ酸配列ＫＤＮＴＥＲＶを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｃ２５２Ｓにアミノ酸置換を含み、ＧＡＧ結合ドメインはアミノ酸配列ＫＤＮＴＥＧＲＶを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０８のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０８のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０９を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドは、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０９のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。少なくとも一つのアミノ酸修飾の各々は、置換、挿入、または欠失などの任意のアミノ酸修飾であってもよい。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０９のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０９のアミノ酸配列と比較して、少なくとも５のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、５～２０アミノ酸長である。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、アミノ酸残基ＧおよびＳが豊富である。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、ＧおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、［（Ｇ）ｎＳ］を含み、式中、ｎ＝４または５である。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）リピートを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、配列番号１１６（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１０を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４および２０９のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。少なくとも一つのアミノ酸修飾の各々は、置換、挿入、または欠失などの任意のアミノ酸修飾であってもよい。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４および２０９のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２０４および２０９のアミノ酸配列と比較して、少なくとも５のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１０のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１１のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１２のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１３のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される配列番号２１４のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2023553323000060
Figure 2023553323000061
Figure 2023553323000062
Figure 2023553323000063
一部の実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン部分は、上の表の配列の一つによって示されるアミノ酸配列を有する。
（ｂ） ＩＬ－１２マスキング部分
本明細書では、ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片を含む治療部分をマスキングする際に使用するためのマスキング部分が提供される。
マスキング部分は、マスクされたサイトカインから切断されて、その切断産物を形成することが理解されよう。マスキング部分は、マスクされたサイトカイン中のＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片をマスクし、それによってＩＬ－サイトカインまたはその機能的断片のその同族受容体への結合を低減または防止する。
ＩＬ－１２受容体、ベータ１、またはＩＬ－１２Ｒβ１は、ＩＬ－１２受容体複合体のサブユニットである。ＩＬ－１２Ｒβ１は、ＣＤ２１２としても知られる。このタンパク質は、低親和性でインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）に結合する。このタンパク質はジスルフィド結合オリゴマーを形成し、これはＩＬ－１２結合活性に必要である。ＩＬ－１２受容体、ベータ２、またはＩＬ－１２Ｒβ２は、ＩＬ－１２受容体複合体のサブユニットである。ＩＬ－１２Ｒβ１およびＩＬ－１２Ｒβ２タンパク質の共発現は、高親和性ＩＬ－１２結合部位の形成につながることが示されている。
タンパク質（例えば、サイトカイン）の同族タンパク質（例えば、サイトカイン受容体）への結合の程度を決定する方法は、当該技術分野で周知である。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２サイトカイン受容体の細胞外ドメイン、またはそのサブユニットもしくはその機能的断片を含む。
ＣＤ２１２とも呼ばれるインターロイキン－１２受容体サブユニットベータ－１は、以下の配列を有する。
Figure 2023553323000064
インターロイキン-12受容体サブユニットベータ-2は、以下の配列を有する。
Figure 2023553323000065
太字はプロペプチドを示し、下線のある斜体は細胞外ドメインを示し、斜体は膜貫通ドメインを示し、下線のある太字は細胞質ドメインを示す。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２との親和性を保持するか、またはそうでなければ示す、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の細胞外ドメイン、またはその断片、部分、もしくはバリアントを含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有するヒトＩＬ－１２Ｒβ１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有するヒトＩＬ－１２Ｒβ１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～２３７、すなわち、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示される配列番号２１５を有する配列、またはＩＬ－１２との親和性を保持するか、またはそうでなければ示すその断片、部分、もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示される配列番号２１５を有するＩＬ－１２Ｒβ１を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１５のアミノ酸配列のいずれか一つと約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１５のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１５のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～５４５、すなわち、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示される配列番号２１６を有する配列、またはＩＬ－１２との親和性を保持するか、またはそうでなければ示すその断片、部分、もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示される配列番号２１６を有するＩＬ－１２Ｒβ１を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１６のアミノ酸配列のいずれか一つと約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２との親和性を保持するか、またはそうでなければ示す、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の細胞外ドメイン、またはその断片、部分、もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有するヒトＩＬ－１２Ｒβ２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有するヒトＩＬ－１２Ｒβ２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２１２、すなわち以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１７を有する配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１７のアミノ酸配列のいずれか一つと約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２２、すなわち以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１８を有する配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１８のアミノ酸配列のいずれか一つと約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１９を有する配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１９のアミノ酸配列のいずれか一つと約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１９のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１９のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１９を有する配列を含み、一つまたは複数のシステイン置換を有する。一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２１９を有する配列を含み、位置Ｃ２４２にアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、位置Ｃ２４２でのアミノ酸置換は、Ｃ２４２Ｓである。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示される配列番号２２０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２０のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示される配列番号２２０のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～６２２、すなわち以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２１を有する配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２１のアミノ酸配列のいずれか一つと約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２７、すなわち以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２２を有する配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２２のアミノ酸配列のいずれか一つと約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１２マスキング部分表に示されるとおり、配列番号２２２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2023553323000066
Figure 2023553323000067
一部の実施形態では、ＩＬ－１２マスキング部分は、上の表の配列の一つによって示されるアミノ酸配列を有する。
１．１．３ ＩＬ－１５サイトカイン部分およびＩＬ－１５マスキング部分
（ａ） ＩＬ－１５サイトカイン部分
一部の実施形態では、治療部分は、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片を含む。
ＩＬ－１５はインターロイキンであり、白血球の活性を調節する免疫系のサイトカインシグナル伝達分子の一種である。
真核細胞では、ＩＬ－１５は１６２アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、次いでアミノ酸残基１～４８の除去によって成熟ＩＬ－１５に処理される。これは、成熟した活性形態で分泌される１１４アミノ酸（アミノ酸残基４９～１６２）からなるＩＬ－１５の成熟形態をもたらす。
ＩＬ－１５前駆体ポリペプチド：
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
ＩＬ－１５成熟ポリペプチド：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１５」または「ＩＬ－１５ポリペプチド」は、任意のインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質、またはその機能的断片もしくはバリアントを指す。この用語は、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、ラットおよびマウス）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＩＬ－１５を包含する。この用語は、未処理ＩＬ－１５（例えば、アミノ酸残基１～１６２からなるＩＬ－１５の全長の前駆体形態）、ならびに細胞内の処理から生じる任意の形態のＩＬ－１５（例えば、アミノ酸残基４９～１６２からなるＩＬ－１５の成熟形態）を包含する。したがって、この用語は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質、ならびにその配列バリアントを包含する。この用語はまた、ＩＬ－１５の天然バリアントを包含する。この用語はまた、切断、欠失、ＩＬ－１５が別の分子に連結される形態、およびアミノ酸配列への少なくとも一つのアミノ酸変化（例えば、置換、付加、または欠失による）によって引き起こされるバリアントなど、ＩＬ－１５の非天然発生型バリアントも包含する。いくつかの態様では、バリアントまたは相同体は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される、配列番号２２３または２２４のアミノ酸配列によってコードされるＩＬ－１５ポリペプチドなど、天然発生型ＩＬ－１５ポリペプチドと比較して、配列全体または配列の一部（例えば、５０、１００、または１１４の連続アミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。そのため、用語「ＩＬ－１５」または「ＩＬ－１５ポリペプチド」は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２３または２２４のアミノ酸配列を含む、ＩＬ－１５タンパク質を含み、そのバリアント、例えば以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２３または２２４のアミノ酸配列に対して一つまたは複数のアミノ酸置換によって生成されたバリアントなどを含む。
ＩＬ－１５サイトカインの「機能的断片」は、サイトカイン受容体結合能力（例えば、完全長サイトカインタンパク質と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性以内）を保持または修飾した、完全長サイトカインタンパク質の一部を含む。サイトカイン受容体結合能は、例えば、サイトカインの同族受容体またはその成分（例えば、ヘテロ三量体受容体複合体の一つまたは複数の鎖）に結合するサイトカインの能力によって示され得る。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、インターロイキン－２受容体、特にＩＬ－１５Ｒα鎖に結合することができる任意の天然インターロイキン－２（ＩＬ－１５）タンパク質またはその修飾バリアントである。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４またはその機能的断片を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。少なくとも一つのアミノ酸修飾の各々は、置換、挿入、または欠失などの任意のアミノ酸修飾であってもよい。一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、少なくとも５のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｄ２２、Ｅ４６、Ｅ５３に一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｄ２２、Ｅ４６、Ｅ５３、Ｎ７１、Ｎ７９、Ｎ１１２に一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｄ２２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｅ４６にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｅ５３にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７９にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｅ４６およびＥ５３にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１およびＮ７９にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７９およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１、Ｎ７９およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、位置Ｄ２２でのアミノ酸置換は、Ｄ２２Ａである。
一部の実施形態では、位置Ｅ４６でのアミノ酸置換は、Ｅ４６Ａである。
一部の実施形態では、位置Ｅ４６でのアミノ酸置換は、Ｅ４６Ｒである。
一部の実施形態では、位置Ｅ４６でのアミノ酸置換は、Ｅ４６Ｓである。
一部の実施形態では、位置Ｅ５３でのアミノ酸置換は、Ｅ５３Ａである。
一部の実施形態では、位置Ｅ５３でのアミノ酸置換は、Ｅ５３Ｒである。
一部の実施形態では、位置Ｅ５３でのアミノ酸置換は、Ｅ５３Ｓである。
一部の実施形態では、位置Ｎ７１でのアミノ酸置換は、Ｎ７１Ｑである。
一部の実施形態では、位置Ｎ７９でのアミノ酸置換は、Ｎ７９Ｑである。
一部の実施形態では、位置Ｎ１１２でのアミノ酸置換は、Ｎ１１２Ｑである。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｄ２２Ａを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｅ４６Ａを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｅ４６ＡおよびＥ５３Ａを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｅ４６ＲおよびＥ５３Ｒを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｅ４６ＳおよびＥ５３Ｓを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｅ５３Ａを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｎ７９Ｑを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｎ１１２Ｑを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｎ７１ＱおよびＮ７９Ｑを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｎ７１ＱおよびＮ１１２Ｑを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｎ７９ＱおよびＮ１１２Ｑを有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、以下のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９ＱおよびＮ１１２Ｑを有するアミノ酸配列を含む。
Figure 2023553323000068
Figure 2023553323000069
Figure 2023553323000070
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカイン部分は、上の表の配列の一つによって示されるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、追加の変異は、位置Ｎ７１で、上記の配列のいずれかに含まれてもよい。一部の実施形態では、変異は、Ｎ７１Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｎ７１Ｗ、Ｎ７１Ｆ、Ｎ７１Ｐ、Ｎ７１Ｍ、Ｎ７１Ｌ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ７１Ｓ、またはＮ７１Ｙである。
一部の実施形態では、追加の変異は、位置Ｓ７３で、上記の配列のいずれかに含まれてもよい。一部の実施形態では、変異は、Ｓ７３Ａ、Ｓ７３Ｗ、Ｓ７３Ｖ、またはＳ７３Ｍである。
一部の実施形態では、追加の変異は、一つまたは複数のアミノ酸位置Ｎ７２、Ｎ７９、Ｖ８０、Ｔ８１およびＮ１１２で、上記の配列のいずれかに含まれてもよい。一部の実施形態では、Ｎ７２Ａ、Ｎ７９Ａ、Ｖ８０Ａ、Ｔ８１ＡおよびＮ１１２Ｒから選択される一つまたは複数の追加の変異が、上記の配列のいずれかに含まれてもよい。
一部の実施形態では、追加の変異は、一つまたは複数のアミノ酸位置Ｎ７２、Ｓ７３ 、Ｎ７９、Ｖ８０、Ｔ８１、およびＮ１１２で、上記の配列のいずれかに含まれてもよい。一部の実施形態では、一つまたは複数の追加の変異Ｎ７２Ａ、Ｓ７３Ａ、Ｎ７９Ａ、Ｖ８０Ａ、Ｔ８１Ａ、およびＮ１１２が、上記の配列のいずれかに含まれてもよい。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、Ｏ－グリコシル化部位を除去する目的で、上記のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４の成熟ＩＬ－１５のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、残基１～３が除去されている。一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、Ｏ－グリコシル化部位を除去する目的で、上記のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４の成熟ＩＬ－１５のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸残基が置換されている。一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、Ｏ－グリコシル化部位を除去する目的で、上記のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される配列番号２２４の成熟ＩＬ－１５のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、残基１～３の領域に挿入されている。一部の実施形態では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片は、残基１～３内にＯ－グリコシル化部位を有しない。
一部の実施形態では、マスクされたＩＬ－１５サイトカインは、ＩＬ－１５Ｒαサブユニットまたはその機能的断片（「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」）を含むドメインをさらに含む。マスクされたＩＬ－１５サイトカイン構築物に「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」を組み込むことは、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化する当該サイトカインの効力を増加させることが実証されている。
ＩＬ－１５Ｒαサブユニット（ＣＤ２１５とも呼ばれる）は、ＩＬ－２Ｒαと構造的に類似しており、ＩＬ－１５Ｒαの外部ドメインは、単一のタンパク質結合スシドメイン、膜近位プロリントレオニンリッチ（ＰＴ）領域、およびスシドメインとＰＴ領域を接続するリンカー／ヒンジ領域からなる。ＩＬ－１５Ｒαサブユニットは、非常に高い親和性でＩＬ－１５に特異的に結合し、βおよびγサブユニットとは独立して、ＩＬ－１５に結合することができる。
インターロイキン（ＩＬ）－１５は、幅広い細胞の種類に作用するサイトカインだが、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＣＤ８αα上皮内リンパ球を含む、特定の免疫細胞群の発生、恒常性、および機能に最も重要である。ＩＬ－１５シグナルは、ＩＬ－２／１５Ｒβおよび共通γ（γＣ）鎖を介して伝達されるが、これらのシグナル伝達成分へのＩＬ－１５の送達は、非常にユニークである。分泌される他のサイトカインとは対照的に、ＩＬ－１５は主に高親和性ＩＬ－１５Ｒαに結合して存在する。ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体が細胞表面に移動すると、β／γＣ受容体複合体を介して対向する細胞を刺激することができる。ＩＬ－１５送達のこの新規のメカニズムは、トランスプレゼンテーションと呼ばれている（Ｓ． Ｗ． Ｓｔｏｎｉｅｒ ａｎｄ Ｋ． Ｓ． Ｓｃｈｌｕｎｓ， ‘Ｔｒａｎｓ－ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ： ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＩＬ－１５ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ’， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ Ｊａｎ ４ ２０１０；１２７（２）： ８５－９２、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
ＩＬ－１５Ｒαサブユニットは、スシドメインと呼ばれる保存されたタンパク質結合モチーフを含む。ＩＬ－１５Ｒαサブユニットのアミノ酸３１～９５を含むスシドメインｓＩＬ－１５Ｒαは、ＩＬ－１５と相互作用する役割があり、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα機能に必須である（Ｗｅｉ Ｘ ｅｔ ａｌ． ‘Ｔｈｅ Ｓｕｓｈｉ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ－１５ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ α Ｉｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＩＬ－１５ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ’， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｊｕｌｙ １ ２００１；１６７（１） ２７７－２８２、その内容物は参照により本明細書に組み込まれる）。
野生型ＩＬ－１５Ｒαサブユニットの配列を、主要ドメインの内訳と共に以下に示す。
本明細書の「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」は、一つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する野生型ＩＬ－１５Ｒαサブユニットの細胞外ドメインの配列など、野生型ＩＬ－１５Ｒαサブユニットまたはそのバリアントの細胞外ドメインの配列を含むことができる。
本明細書の「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」は、一つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列など、野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列またはそのバリアントを含むことができる。
本明細書の「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」は、一つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列など、野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列またはそのバリアントからなり得る。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、位置Ｒ２６にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ２６Ｎを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ２６Ｓを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、位置Ｒ３５にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ３５Ｑを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ３５Ｓを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、位置Ｒ２６およびＲ３５にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ２６ＳまたはＲ２６Ｎ、およびＲ３５ＱまたはＲ３５Ｓを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、アミノ酸置換Ｒ２６ＮおよびＲ３５Ｑを含む。
ＩＬ－１５Ｒαドメインの例示的な配列を以下に示す。
Figure 2023553323000072
一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαドメインは、上の表の配列の一つによって示されるアミノ酸配列を有する。
（ｂ）ＩＬ－１５マスキング部分
本明細書では、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片を含む治療部分をマスキングする際に使用するためのマスキング部分が提供される。
マスキング部分は、マスクされたサイトカインから切断されて、その切断産物を形成することが理解されよう。マスキング部分は、マスクされたサイトカイン中のＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片をマスクし、それによってＩＬ－サイトカインまたはその機能的断片のその同族受容体への結合を低減または防止する。一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片のＩＬ－１５Ｒαへの結合を低減または防止する。一部の実施形態では、本明細書に提供されるマスキング部分は、抗ＩＬ－１５抗体またはＩＬ－１５同族受容体タンパク質などのＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片に結合することができるか、またはそうでなければ親和性を呈することができる部分を指す。タンパク質（例えば、サイトカイン）の同族タンパク質（例えば、サイトカイン受容体）への結合の程度を決定する方法は、当該技術分野で周知である。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１５サイトカイン受容体、またはそのサブユニットもしくはその機能的断片を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１５との親和性を保持するか、またはそうでなければ示す、ＩＬ－１５Ｒβ（ＣＤ１２２とも呼ばれる）またはその断片、部分、もしくはバリアントを含む。
ＩＬ－１５Ｒβの野生型配列は、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０に示される。
一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１５マスキング部分表に示される配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のアミノ酸配列と約または少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、１または２個のアミノ酸置換を有する、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１５Ｒβ（またはその機能的断片、部分、もしくはバリアント）を含み、ＩＬ－１５Ｒβは位置Ｃ１２２にアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１５Ｒβ（またはその機能的断片、部分、もしくはバリアント）を含み、ＩＬ－１５Ｒβはアミノ酸置換Ｃ１２２Ｓを有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のＩＬ－１５βと比較して、位置Ｃ１２２にアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のＩＬ－１５βと比較して、アミノ酸位置１２２に変異Ｃ１２２Ｓを有する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、Ｃ１２２変異を有する、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、Ｃ１２２Ｓ変異を有する、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１５Ｒβ（またはその機能的断片、部分、もしくはバリアント）を含み、ＩＬ－１５Ｒβは位置Ｃ１６８にアミノ酸置換を有する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１５Ｒβ（またはその機能的断片、部分、もしくはバリアント）を含み、ＩＬ－１５Ｒβはアミノ酸置換Ｃ１６８Ｓを有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のＩＬ－１５βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１６８に変異を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のＩＬ－１５βと比較して、アミノ酸位置１６８に変異Ｃ１６８Ｓを有する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、Ｃ１６８変異を有する、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、マスキング部分は、Ｃ１６８Ｓ変異を有する、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のＩＬ－１５βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１２２およびＣ１６８に変異を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒβまたはその断片、部分、またはバリアントは、以下のＩＬ－１５マスキング部分表の配列番号２４０のＩＬ－１５βと比較して、変異Ｃ１２２ＳおよびＣ１６８Ｓを有する。
一部の実施形態では、マスキング部分は、以下のＩＬ－１５マスキング部分表に示される配列番号２４１のアミノ酸配列を含む。
Figure 2023553323000073
Figure 2023553323000074
一部の実施形態では、ＩＬ－１５マスキング部分は、上の表の配列の一つによって示されるアミノ酸配列を有する。
１．２ 切断不可能なペプチドリンカー
本明細書に記載される薬物構築物またはその切断産物で使用するための切断不可能なペプチドリンカーが本明細書に提供される。本明細書に提供される切断不可能なリンカーは、本明細書に記述されたマスクされたサイトカインにおいて二つの機能的成分を一緒に連結するために使用される、さらに二つのアミノ酸のペプチドを指す。
マスクされたサイトカインは、第一のリンカーおよび第二のリンカーを含み、少なくとも第一のリンカーまたは第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含む。
一部の実施形態では、第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（本明細書において、「タンパク質分解的に切断可能なリンカー」と称されるリンカー）を含み、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（本明細書において、「切断不可能なリンカー」と称されるリンカー）を含まない。この配置は、本明細書では「構造Ａ」として記載される。一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000075
を含み、
第二のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000076
を含む。
一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（本明細書において、「タンパク質分解的に切断可能なリンカー」または「切断可能なリンカー」と称されるリンカー）を含み、第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（本明細書において、「切断不可能なリンカー」と称されるリンカー）を含まない。この配置は、本明細書では「構造Ｂ」として記載される。一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000077
を含み、
第二のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000078
を含む。
一部の実施形態の切断不可能なリンカーおよび切断可能なリンカーは、以下でより詳細に説明される。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、３～２５アミノ酸長である。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、３～１８アミノ酸長である。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、３～８アミノ酸長である。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、４～６アミノ酸長である。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、Ｇ、ＳおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、「ＧＳ」リピートを含む。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、Ｎ’末端の「Ｐ」残基を含む。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、アミノ酸配列ＰＧＳＧＳ（配列番号１４）を含む。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、アミノ酸配列ＰＧＳＧＳからなる。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＳＰＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＰ（配列番号２３）を含む。
一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＳＰＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＰからなる。
一部の実施形態では、第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第一のリンカーは、切断不可能なリンカーであり、切断不可能なリンカーは、ＰＧＳＧＳを含む。一部の実施形態では、第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第一のリンカーは、切断不可能なリンカーであり、切断不可能なリンカーは、アミノ酸配列ＰＧＳＧＳからなる。
一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能なリンカーであり、切断不可能なリンカーは、ＧＧＳＳＰＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＰを含む。一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能なリンカーであり、切断不可能なリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＳＰＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＰからなる。
一部の実施形態では、第二のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第一のリンカーは、切断不可能なリンカーであり、切断不可能なリンカーは、３～８アミノ酸長である。一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、４～６アミノ酸長である。一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、配列番号 １４（ＰＧＳＧＳ）に示すアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能なリンカーであり、切断不可能なリンカーは、３～１８アミノ酸長である。一部の実施形態では、第一のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、第二のリンカーは、切断不可能なリンカーであり、切断不可能なリンカーは、１０～１８アミノ酸長である。一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、配列番号 ２３（ＧＧＳＳＰＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＰ）に示すアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第一および第二のポリペプチド鎖は、組み立てられた構築物において、第一の半減期延長ドメインが第二の半減期延長ドメインと会合すること、およびマスキング部分がサイトカインまたはその機能的断片をマスキングすることを容易にするため、同じまたは類似の長さであることが望ましい。このように、マスキング部分がサイトカインまたはその機能的断片よりも短いアミノ酸配列である場合、長さの差は、より長いリンカーＬ１を使用することによって、完全にまたは部分的に補償され得る。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000079
を含み、
第二のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000080
を含む。
一部の実施形態では、第一のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000081
を含み、
第二のポリペプチド鎖が式：
Figure 2023553323000082
を含む。
例示的なＡＫ分子に開示されたリンカーの組み合わせは、本明細書に開示される任意のサイトカイン部分と共に使用されてもよい。例示的なＡＫ分子に開示されたリンカーの組み合わせは、本明細書に開示される任意のマスキング部分と共に使用されてもよい。例示的なＡＫ分子に開示されたリンカーの組み合わせは、任意の半減期延長部分と共に使用されてもよい。言い換えれば、例示的なＡＫ分子に開示されるリンカーは、本明細書に開示される任意のサイトカイン部分、本明細書に開示されるマスキング部分、および／または本明細書に開示される半減期延長部分の組み合わせで使用され得る。
２． 切断産物
本明細書のどこかに記載されるポリペプチド薬物構築物中のタンパク質分解的に切断可能なリンカーのタンパク質分解的切断によって調製可能な、活性治療部分を含む切断産物が、本明細書に提供される。
本明細書のどこかに記載される「ヘテロ二量体の」マスクされたサイトカインの切断産物が本明細書に提供される。
本明細書に記載されるマスクされたサイトカインは、切断可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーの切断部位でのタンパク質切断時に、サイトカイン部分を含む切断産物が形成される。切断産物中のサイトカイン部分は、もはやマスキング部分によってマスクされていないため、活性化される。したがって、切断産物中のサイトカイン部分は、標的タンパク質に結合することができる。
腫瘍細胞環境は複雑であり、複数の異なるプロテアーゼを含むことができる。そのため、マスクされたサイトカイン内の所与の切断可能なペプチドが腫瘍細胞環境で切断される正確な部位は、腫瘍タイプ間、同じ腫瘍タイプを有する患者間、および同じ腫瘍内で形成された切断産物間でさえも異なる場合がある。さらに、切断後も、例えば、一つまたは二つの末端アミノ酸の除去による、初期の切断産物のさらなる修飾は、腫瘍細胞環境中のプロテアーゼのさらなる作用によって生じ得る。したがって、切断産物の分布は、本明細書に記載されるようにマスクされたサイトカインの投与後に、患者の腫瘍細胞環境内に形成されると予想され得る。
本明細書で言及されるように、切断部位は、腫瘍細胞環境に関連することが知られているプロテアーゼの標的である、切断可能なペプチド内の二つの特定のアミノ酸残基間の部位を指すことが理解されよう。この意味では、異なるプロテアーゼが、異なる切断部位で切断可能なペプチドを切断する、本明細書に記載の切断可能なペプチド中に複数の切断部位が存在し得る。また、複数のプロテアーゼが、切断可能なペプチド内の同じ切断部位に作用する可能性もある。プロテアーゼ切断部位についての考察は、当該技術分野で見出すことができる。
したがって、本明細書に開示される切断可能なペプチドは、一つまたは複数のプロテアーゼによって切断されてもよい。
本明細書において、本明細書のどこかに記載されるように、マスクされたサイトカイン中のタンパク質分解的に切断可能なリンカーのタンパク質切断によって調製可能な、同族受容体に結合することができるサイトカイン部分を含む切断産物が本明細書に提供される。
また、本明細書では、マスクされたサイトカインの単一構造から取得されたまたは取得可能な切断産物の分布が提供され、切断産物の分布内の各切断産物は、（ｉ）標的タンパク質に結合することができ、（ｉｉ）本明細書のどこかに定義されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５またはＩＬ－１２サイトカイン）部分を含む。
また、本明細書では、マスクされたサイトカインの切断産物が提供され、切断産物は標的タンパク質に結合することができ、切断産物は、以下の式：
Figure 2023553323000083
を含むポリペプチドを含み、
式中、ＰＣＰはタンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部であり、ＳＤはスペーサードメインであり、Ｃはサイトカイン部分である。
さらに、本明細書では、マスクされたサイトカインの切断産物が提供され、切断産物は標的タンパク質に結合することができ、切断産物は、以下：
ａ） 第一の半減期延長部分を含む第一のポリペプチド鎖と、
ｂ） 式：
Figure 2023553323000084
を含むポリペプチドを含む第二のポリペプチド鎖であって、
式中、ＨＬ２は第二の半減期延長部分であり、Ｌ２は切断不可能なリンカーであり、Ｃはサイトカイン部分であり、第一の半減期延長部分は第二の半減期延長部分と関連している、第二のポリペプチド鎖と、を含むタンパク質ヘテロ二量体を含む。また、本明細書では、マスクされたサイトカインの単一構造から取得されたまたは取得可能な切断産物の分布が提供され、切断産物の分布内の各切断産物は、（ｉ）標的タンパク質に結合することができ、（ｉｉ）以下：
ａ） 第一の半減期延長部分を含む第一のポリペプチド鎖と、
ｂ） 式：
Figure 2023553323000085
を含むポリペプチドを含む第二のポリペプチド鎖であって、
式中、ＨＬ２は第二の半減期延長部分であり、Ｌ２は切断不可能なリンカーであり、Ｃはサイトカイン部分であり、第一の半減期延長部分は第二の半減期延長部分と関連している、第二のポリペプチド鎖と、を含むタンパク質ヘテロ二量体を含む。
さらに、本明細書では、マスクされたサイトカインの切断産物が提供され、切断産物は標的タンパク質に結合することができ、切断産物は、以下：
ａ） 式：
Figure 2023553323000086
を含むポリペプチドを含む第一のポリペプチド鎖であって、
式中、ＨＬ１は、第一の半減期延長部分であり、ＳＤは、スペーサードメインであり、ＰＣＰは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部である、第一のポリペプチド鎖と、
ｂ） 式：
Figure 2023553323000087
を含むポリペプチドを含む第二のポリペプチド鎖であって、
式中、ＨＬ２は第二の半減期延長部分であり、Ｌ２は切断不可能なリンカーであり、Ｃはサイトカイン部分であり、第一の半減期延長部分は第二の半減期延長部分と関連している、第二のポリペプチド鎖と、を含むタンパク質ヘテロ二量体を含む。
切断産物内で、マスキング部分、半減期延長部分、サイトカイン部分、リンカー、スペースドメインは、本明細書に記載されるもののいずれか一つ、および本明細書に記載されるもののいずれかの組み合わせであってもよい。
切断可能なペプチドの位置は、サイトカイン部分を含む結果として生じる切断産物の構造を決定する。
「タンパク質分解的に切断可能なペプチドの部分」は、切断部位での切断が起こった後に、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の一部を指す。切断後、例えば、一つまたは二つの末端アミノ酸の除去による、初期の切断産物のさらなる修飾は、腫瘍細胞環境中のプロテアーゼのさらなる作用によっても生じ得る。このように、マスクされたサイトカインの投与後に患者の腫瘍細胞環境に形成され得る切断産物の分布内の切断産物は、タンパク質分解的に切断可能なペプチドのいかなる部分も含有しない場合がある。
一部の実施形態では、「部分」は、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、または６アミノ酸を指す。一部の実施形態では、「部分」は、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の２アミノ酸を指す。一部の実施形態では、「部分」は、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の３アミノ酸を指す。一部の実施形態では、「部分」は、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の４アミノ酸を指す。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの「部分」は、３～６アミノ酸長である。一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの「部分」は、３または４アミノ酸長である。
本明細書に開示される切断可能なリンカーの例示的な切断部位は、以下に開示されている（＊は、切断可能なペプチド内の公知のまたは観察されたプロテアーゼ切断部位を示す）：
Figure 2023553323000088
したがって、本明細書に開示されるポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカインのいずれか一つの切断産物が本明細書に開示される。
３．結合アッセイ
サイトカインまたはその機能的断片と、サイトカインまたはその機能的断片が特異的である結合パートナー（例えば、サイトカイン受容体などの標的タンパク質）との間などの免疫学的結合相互作用の強度、または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表すことができ、Ｋｄが小さいほど親和性が高いことを表す。サイトカイン受容体へのサイトカインの結合は、Ｋｄの観点から表され得る。一部の実施形態では、免疫学的結合相互作用は、マスクされたサイトカイン（プロテアーゼの存在下または非存在下）と、サイトカイン受容体などの標的タンパク質との間である。ＩＬ－２サイトカイン結合の文脈では、標的タンパク質は、ＩＬ－２Ｒ（ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、およびＩＬ－２Ｒγ鎖を含む）、ＩＬ－２Ｒα鎖、ＩＬ－２Ｒβ鎖、またはＩＬ－２Ｒα／β二量体複合体であり得る。タンパク質の免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を使用して定量化することができる。例えば、一つの方法は、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒ）／サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）複合体形成および解離の速度を測定することを含み、この速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。「オンレート定数」（Ｋｏｎ）および「オフレート定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの速度は、親和性に関連しないすべてのパラメータの削除を可能にし、解離定数Ｋｄと等しい。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９：４３９－４７３，（１９９０）を参照されたい。
一部の態様では、本明細書に記載のマスクされたサイトカインは、マスキング部分を含むが切断可能なペプチドを含まない親サイトカインと比較して、プロテアーゼによる切断時に、ほぼ同じまたはより高い親和性で標的タンパク質に結合する。標的タンパク質は、任意のサイトカイン受容体であってもよい。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＩＬ－２Ｒ（ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、およびＩＬ－２Ｒγ鎖を含む）である。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＩＬ－２Ｒαである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＩＬ－２Ｒα／β２二量体複合体である。
一部の実施形態では、リンカー中に切断可能なペプチドを含まない本明細書に提供されるマスクされたサイトカインは、標的タンパク質との解離定数（Ｋｄ）が≦１Ｍ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０～８Ｍ以下、例えば、１０～８Ｍから１０～１３Ｍまで、例えば、１０～９Ｍから１０～１３Ｍまで）である。一部の実施形態では、リンカー中に切断可能なペプチドを含む本明細書に提供されるマスクされたサイトカインは、プロテアーゼで切断される前の標的タンパク質との解離定数（Ｋｄ）が≦１Ｍ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または０．００１ｎＭ（例えば、１０～８Ｍ以下、例えば、１０～８Ｍから１０～１３Ｍまで、例えば、１０～９Ｍから１０～１３Ｍまで）である。一部の実施形態では、リンカー中に切断可能なペプチドを含む本明細書に提供されるマスクされたサイトカインは、プロテアーゼで切断される際の標的タンパク質との解離定数（Ｋｄ）が≦１Ｍ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または０．００１ｎＭ（例えば、１０～８Ｍ以下、例えば、１０～８Ｍから１０～１３Ｍまで、例えば、１０～９Ｍから１０～１３Ｍまで）である。一部の実施形態では、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインのサイトカインまたはその機能的断片は、マスクされたサイトカインのマスキング部分との解離定数（Ｋｄ）が≧５００Ｍ、≧２５０Ｍ、≧２００Ｍ、≧１５０Ｍ、≧１００Ｍ、≧５０Ｍ、≧１０Ｍ、≧１Ｍ、≧５００ｎＭ、≧２５０ｎＭ、≧１５０ｎＭ、≧１００ｎＭ、≧５０ｎＭ、≧１０ｎＭ、≧１ｎＭ、≧０．１ｎＭ、≧０．０１ｎＭ、または≧０．００１ｎＭである。一部の実施形態では、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインのサイトカインまたはその機能的断片は、約２００Ｍ～約５０ｎＭ、例えば、約または少なくとも約１７５Ｍ、約または少なくとも約１５０Ｍ、約または少なくとも約１２５Ｍ、約または少なくとも約１００Ｍ、約または少なくとも約７５Ｍ、約または少なくとも約５０Ｍ、約または少なくとも約２５Ｍ、約または少なくとも約５Ｍ、約または少なくとも約１Ｍ、約または少なくとも約７５０ｎＭ、約または少なくとも約５００ｎＭ、約または少なくとも約２５０ｎＭ、約または少なくとも約１５０ｎＭ、約または少なくとも約１００ｎＭ、約または少なくとも約７５ｎＭ、または約または少なくとも約５０ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。結合親和性を評価するためのアッセイは、当該技術分野で周知である。
一部の態様では、所望の閉塞比を呈するマスクされたサイトカインが提供される。本明細書で使用される場合、「閉塞比」という用語は、（ａ）第一の条件セットの下でのパラメータの最大検出レベルと、（ｂ）第二の条件セットの下でのそのパラメータの最小検出値との比を指す。マスクされたＩＬ－２ポリペプチドの文脈において、例えば、閉塞比は、（ａ）マスクされたＩＬ－２ポリペプチドの切断可能なペプチドを切断することができる少なくとも一つのプロテアーゼの存在下で、マスクされたＩＬ－２ポリペプチドに結合する標的タンパク質（例えば、ＩＬ－２Ｒタンパク質）の最大検出レベル対（ｂ）プロテアーゼの存在下で、マスクされたＩＬ－２ポリペプチドに結合する標的タンパク質（例えば、ＩＬ－２Ｒタンパク質）の最小検出レベルの比を指す。したがって、マスクされたサイトカインの閉塞比は、マスクされたサイトカインの切断前のＥＣ５０を、マスクされたサイトカインの切断後のＥＣ５０で割ることによって計算することができる。マスクされたサイトカインの閉塞比は、プロテアーゼによる切断前のマスクされたサイトカインの解離定数と、プロテアーゼによる切断後のマスクされたサイトカインの解離定数との比として計算することもできる。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインに対するより大きな閉塞比は、マスクされたサイトカインによって結合された標的タンパク質が、マスクされたサイトカインの切断可能なペプチドを切断することができるプロテアーゼの存在下で、プロテアーゼの非存在下よりも、より多く発生する（例えば、主に発生する）ことを示す。
一部の実施形態では、最適な閉塞比を有するマスクされたサイトカインが本明細書に提供される。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインの最適な閉塞比は、マスクされたサイトカインが、本明細書で企図される方法または組成物に有用な望ましい特性を有することを示す。一部の実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、約２対約１０，０００、例えば、約８０対約１００の最適な閉塞比を呈する。本明細書に提供されるマスクされたサイトカインのいずれかのさらなる実施形態では、閉塞比は、約２対約７，５００、約２対約５，０００、約２対約２，５００、約２対約２，０００、約２対約１，０００、約２対約９００、約２対約８００、約２対約７００、約２対約６００、約２対約５００、約２対約４００、約２対約３００、約２対約２００、約２対約１００、約２対約５０、約２対約２５、約２対約１５、約２対約１０、約５対約１０、約５対約１５、約５対約２０、約１０対約１００、約２０対約１００、約３０対約１００、約４０対約１００、約５０対約１００、約６０対約１００、約７０対約１００、約８０対約１００、または約１００対約１，０００である。一部の実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、約２対約１，０００の最適な閉塞比を呈する。プロテアーゼによる切断前および／または切断後の、マスクされたサイトカインの標的タンパク質への結合は、ＥＬＩＳＡなど当該技術分野で周知の技術を使用して決定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるマスキング部分は、サイトカインまたはその機能的断片と標的タンパク質（例えば、サイトカイン受容体）との間の親和性よりも低い親和性で、本明細書に記載されるサイトカインまたはその機能的断片に結合する。特定の実施形態では、本明細書に提供されるマスキング部分は、本明細書に記載されるサイトカインまたはその機能的断片に、
≧５００Ｍ、≧２５０Ｍ、≧２００Ｍ、≧１５０Ｍ、≧１００Ｍ、≧５０Ｍ、≧１０Ｍ、≧１Ｍ、≧５００ｎＭ、≧２５０ｎＭ、≧１５０ｎＭ、≧１００ｎＭ、≧５０ｎＭ、≧１０ｎＭ、≧１ｎＭ、≧０．１ｎＭ、≧０．０１ｎＭ、または≧０．００１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で結合する。
４． マスクされたサイトカイン産生
本明細書に記載されるマスクされたサイトカインは、当該技術分野で利用可能な技術を使用して調製され、その例示的な方法が記載される。
４．１ 抗体産生
マスクされたサイトカインの一部の実施形態は、抗体またはその断片を含む。以下のセクションでは、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインの一部の実施形態で使用され得る、抗体およびその抗体断片、バリアント、ならびに誘導体の産生についてさらに詳細を提供する。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、ジスルフィド結合を介して結合するマスクされたサイトカインの二つのコピーによって産生される二量体の形態である。
１． 抗体断片
本発明は、一部の実施形態では、抗体断片を包含する。抗体断片は、Ｆｃドメイン、重鎖の一部、軽鎖の一部、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖなどの任意の抗体断片であってもよい。抗体断片は、酵素消化などの従来の手段によって、または組換え技術によって生成され得る。ある特定の状況では、抗体全体ではなく、抗体断片を、本明細書に記載のマスクされたサイトカインに連結する利点がある。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００３）Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４を参照されたい。
抗体断片の生成のために様々な技術が開発されてきた。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接的に生成され得る。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、ＨＥＫ２９３およびＣＨＯ細胞などのＥ．ｃｏｌｉおよび他の細胞型で発現され、それから分泌されてもよく、したがって、大量のこれらの断片の容易な生成を可能にする。あるいは、Ｆａｂ－ＳＨ断片は、培養培地から直接回収され、Ｆ（ａｂ）２断片を形成するように化学的に結合され得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。ＦｃＲＮ／サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期の増加を伴うＦａｂおよびＦ（ａｂ）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。マスクされたサイトカインで使用するための抗体断片の生成のための他の技術は、当業者に明らかであろう。ある特定の実施形態では、マスクされたサイトカインは、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含む。ＷＯ ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、および第５，５８７，４５８号を参照されたい。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築されてもよい。上記のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照されたい。また、一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーを介して連結された二つのｓｃＦｖを含むｂｉ－ｓｃＦｖを、マスクされたサイトカインと共に使用することができる。
本発明は、一部の実施形態では、線形抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような）、または適切なリンカーを介して連結された抗体の重鎖配列および軽鎖配列を含む一本鎖免疫グロブリンを含む。かかる線形抗体または免疫グロブリンは、単一特異性または二重特異性であってもよい。かかる一本鎖免疫グロブリンは、二量体化されて、それにより元々四量体である抗体のものと類似の構造および活性を維持することができる。また、一部の実施形態では、抗体またはその断片は、単一の重鎖可変領域を有し、かつ軽鎖の配列を有さない抗体であってもよい。かかる抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディと呼ばれる。これらの抗体はまた、本発明による抗体の機能性断片の意味に包含される。抗体断片は、本明細書に提供されるガイダンスに従って、本明細書に記述されるマスクされたサイトカインに連結され得る。
２． ヒト化抗体
本発明は、一部の実施形態では、ヒト化抗体またはその抗体断片を包含する。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、任意の抗体断片を含む任意の抗体であってもよい。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入される一つまたは複数のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「輸入」可変ドメインから取り込まれる「輸入」残基と称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に超可変領域の配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）の後に本質的に行われ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、より実質的に少ないインタクトなヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基および場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従って、本明細書に記述されるマスクされたサイトカインに連結され得る。
３． ヒト抗体
本発明の一部の実施形態のヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を、公知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本発明の一部の実施形態のヒトモノクローナル抗体は、例えば、マウス、ラット、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）（例えば、ウシ（ｃｏｗ））、またはウサギ細胞を使用して、例えばヒトモノクローナル抗体を産生するためにハイブリドーマ法によって作製することができる。一部の実施形態では、ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体は、任意の抗原に結合する抗体であってもよい。一部の実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒト動物を標的抗原で免疫し、抗体を免疫された動物または免疫された動物から誘導された細胞から単離することによって作製することができる。好適な非ヒト動物の例としては、ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ， Ｉｎｃ．）、ＫＭ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）、「ＴＣマウス」、およびＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）などのトランスジェニックまたはトランスクロモソミック動物が挙げられる。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６－８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ８４５－８５１、ＷＯ２００２／４３４７８、米国特許第 ５，９３９，５９８号、６，０７５，１８１号、６，１１４，５９８号、６，１５０，５８４号、６，１６２，９６３号、およびＴｏｍｉｚｕｋａら （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：７２２－７２７を参照のこと。
［０４２０］ ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３： ３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７： ８６（１９９１）によって記載されている。ヒト抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従って、本明細書に記述されるマスクされたサイトカインに連結され得る。
４． 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、結合特異性のうちの一つは、第一の抗原に対するものであり、他方の結合特異性は、第二の抗原に対するものであり、これは、同じ標的タンパク質上の二つの異なるエピトープ、または二つの異なる標的タンパク質上の二つの異なるエピトープのいずれかであってもよい。二重特異性抗体は、第一の抗原および／または第二の抗原を発現する細胞に細胞障害性薬剤を局在化するためにも使用され得る。二重特異性抗体は、例えば、癌細胞などの特定の細胞を殺すために、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞などの細胞をリクルートするためにも使用され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。二重特異性抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従って、本明細書に記述されるマスクされたサイトカインに連結され得る。
二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野で公知である。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５： ５３７（１９８３）、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０： ３６５５（１９９１）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，２０（７）：８３８－８４７を参照されたい。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロ複合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ複合体内の抗体の一方は、アビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。ヘテロ複合体抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は、当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
５． 単一ドメイン抗体
一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従ってマスクされたサイトカインに連結する。単一ドメイン抗体は、任意の抗体とすることができる。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む単一ポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１を参照されたい）。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてまたは一部からなる。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、標的抗原でラクダを免疫化することによって得られたラクダ由来の抗体である。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、標的抗原でサメを免疫化することによって得られたサメ由来の抗体である。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ナノボディである（例えば、ＷＯ２００４０４１８６５Ａ２およびＵＳ２００７０２６９４２２Ａ１を参照のこと）。
６． 抗体バリアント
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、抗体のＦｃＲｎ結合親和性および／またはｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合親和性を改善することが望ましい場合がある。また、特定のアミノ酸修飾を導入することによって、抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進することが望ましい場合がある。抗体鎖のヘテロ二量体化を促進するための方法は、ヘテロ二量体化を促進するために作製され得る特定の修飾を含めて、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１２）、ＭＡｂｓ、４（６）： ６５３－６６３に記載されている。
抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行い、最終構築物を得ることができるが、ただし、最終構築物は、所望の特徴を保有していることを条件とする。アミノ酸変化は、配列が作製されたときに対象の抗体アミノ酸配列に導入されてもよい。
変異誘発に好ましい位置である抗体のある特定の残基または領域を特定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５により記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基または群が識別され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置換されて、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、置換部位に、または置換部位のために、さらなるまたは他のバリアントを導入することによって精製される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は、予め決められているが、変異自体の性質は予め決められる必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するために、標的コドンまたは領域においてａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が実施され、発現された免疫グロブリンが所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列挿入には、１残基から数百以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合を含み、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入バリアントには、酵素またはポリペプチドに対する、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれ、それにより抗体の血清半減期が延長される。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、ヒンジ領域近くのプロテアーゼ切断を除去、低減、またはそうでなければ阻害するように修飾される。ＩｇＧの「ヒンジ領域」は、一般に、ＫａｂａｔにあるようにＥＵ指数に従って、ヒトＩｇＧ１のＥ２１６を含み、Ｐ２３０で終結すると定義されるが、機能的には、鎖の可撓性部分は、Ｅ２１６からＧ２３７まで（Ｒｏｕｘら、１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：４０８３）など、上部ヒンジ領域と下部ヒンジ領域と称する追加の残基を含むと考えられてもよく、下部ヒンジは、ＦｃｙＲ結合が概して帰属するＦｃ領域の残基２３３～２３９と呼ばれている。本明細書に記載されるマスクされたサイトカインのいずれかに対する修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ ２０１５０１３９９８４Ａ１に記載される方法に従って、ならびに本明細書に記述される修飾のいずれかを組み込むことによって、実施することができる。
一部の実施形態では、薬物動態を改善するＦｃＲｎ変異には、これらに限定されないが、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１１、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｖ３０８Ｐが含まれる。一部の実施形態では、かかる変異は、低いｐＨでＦｃＲｎへの抗体結合を強化するが、中性ｐＨでは抗体親和性を変化させない。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、これらトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的にグリコシル化部位が生じる。Ｏ結合型のグリコシル化とは、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリシンもまた使用されてもよい。
マスクされたサイトカインへのグリコシル化部位の付加または欠失は、上述のトリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位の）のうちの一つまたは複数が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより好都合に達成される。改変はまた、元の抗体の配列（Ｏ結合型グリコシル化部位の）に対して、一つまたは複数のセリン残基またはスレオニン残基の付加、欠失、または置換により行われてもよい。
抗体またはその断片がＦｃ領域を含む場合、それに結合された炭水化物は改変され得る。例えば、抗体のＦｃ領域に結合されたフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体は、米国出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）もまた参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合された炭水化物中のバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は、ＷＯ２００３／０１１８７８、Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．、および米国特許Ｎｏ． ６，６０２，６８４号、Ｕｍａｎａらに言及されている。抗体のＦｃ領域に結合されたオリゴ糖中に少なくとも一つのガラクトース残基を有する抗体は、ＷＯ１９９７／３００８７、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．に報告されている。また、そのＦｃ領域に結合された改変炭水化物を有する抗体に関するＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）もまた参照されたい。修飾グリコシル化を有する抗原結合分子に関するＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）もまた参照されたい。
ある特定の実施形態では、グリコシル化バリアントは、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合された炭水化物構造は、フコースを欠くか、または低減されたフコースを有する。そのようなバリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。任意に、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する、その中に一つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４での置換（残基のＥｕナンバリング）をさらに含む。「脱フコシル化」抗体または「フコース欠損」抗体に関連する刊行物の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を生成する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損したＬｅｅ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａｌ、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ２００４／０５６３１２Ａｌ、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、およびアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））などのノックアウト細胞株、およびβ１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ （ＧｎＴ－ＩＩＩ）とゴルジｐ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）とを過剰発現する細胞が挙げられる。
本明細書の実施形態のうちのいずれかでは、マスクされたサイトカインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するために操作され得る。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株で生成されてもよい。一部の実施形態では、宿主細胞は、低下された固有アルファ１，６－フコシル化活性を有するように修飾されている。哺乳類宿主細胞におけるフコシル化経路を修飾する方法の例は、例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ａｎｄ Ｓａｔｏｈ， ＭＡｂｓ， １（３）： ２３０－２３６ （２００９）に見出すことができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＦＵＴ８遺伝子の発現を部分的または完全に不活化するための方法および組成物の例は、例えば、米国公開 第２０１６０１９４６６５Ａ １号、ＷＯ２００６１３３１４８Ａ２に見ることができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、ＣＨＯ細胞のＬｅｃｌ３バリアント（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７（３０）：２６７３３－４０（２００２）を参照のこと）、またはＦＵＴ８活性が低下したＹＢ２／０細胞株（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８（５）： ３４６６－７３ （２００３）を参照のこと）で産生される。一部の実施形態では、アルファ１，６－フコシル化に関連する遺伝子に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が導入され得る（例えば、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８８（７）： ９０１－９０８ （２００４）；Ｉｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７： ８４ （２００７）；Ｏｍａｓａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １０６（２）： １６８－１７３ （２００８）を参照されたい）。一部のさらなる実施形態では、マスクされたサイトカインは、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株で生成されてもよい。さらなる実施形態では、細胞株は、さらに、ゴルジｐ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する。本明細書の一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域に少なくとも一つのアミノ酸置換を含み得る。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、その血清半減期を改善するために改変される。サイトカインの血清半減期を増加させるために、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、ＦｃＲＮ／サルベージ受容体結合エピトープを連結抗体（特に抗体断片）へ組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加する要因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（ＵＳ２００３／０１９０３１１、米国特許第６，８２１，５０５号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，８３４，５９７号）。
バリアントの別のタイプは、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、異なる残基により置き換えられた抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発についての目的の部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの改変もまた企図される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで、表２に示されている。そのような置換により生物学的活性に望ましい変化が生じる場合、より大きな置換変化は、表２において「例示的な置換」で表示され、またはアミノ酸のクラスに関して以下に詳述されるように、そうした置換変化が導入され、生成物はスクリーニングされ得る。
Figure 2023553323000089
抗体の生物学的特性における置換修飾は、（ａ）置換領域中のポリペプチド主鎖の例えばシート立体構造またはヘリカル立体構造としての構造、（ｂ）標的部位の分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の体積、の維持に対する効果において、大きく異なる置換を選択することにより実現される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１） 非極性： Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｉｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２） 非荷電極性： Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｉｎ（Ｑ）
（３） 酸性： Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４） 塩基性： Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然発生型残基は、以下の一般的な側鎖の特性に基づいてグループに分けられ得る：
（１） 疎水性： ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｈｅ；
（２） 中性親水性： Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３） 酸性： Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４） 塩基性： Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５） 鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６） 芳香族： Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスのものに交換することを伴う。かかる置換残基はまた、保存的置換部位、または残りの（非保存的）部位に導入されてもよい。
別のタイプの置換バリアントは、天然のアミノ酸残基を非天然のアミノ酸残基に置換することを含む。非天然のアミノ酸残基は、例えば、ｔＲＮＡ再コードを介して、または例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６１５４６７５Ａ１に記載される方法のいずれかを介して組み込まれてもよい。
置換バリアントの一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む。概して、さらなる開発のために選択された得られたバリアントは、それらが生成される親抗体に対して、修飾された（例えば、改善された）生物学的特性を有する。かかる置換バリアントを生成するための好都合な方法は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、または哺乳類ディスプレイを使用する親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７部位）を変異させて、各部位ですべての可能なアミノ酸置換を生成する。したがって、生成された抗体は、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物）の少なくとも一部への融合として、繊維状ファージ粒子からディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイバリアントを、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための超可変領域部位候補を特定するために、スキャニング変異誘発（例えば、アラニンスキャニング）を行い、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を特定することができる。あるいは、または追加的に、抗体と抗原の間の接触点を特定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。かかる接触残基および隣接残基は、本明細書に詳述されるものを含む、当該技術分野で公知の技術による置換の候補である。かかるバリアントが生成されると、バリアントのパネルは、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で公知の技術を使用してスクリーニングされ、一つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体は、さらなる開発のために選択され得る。
マスクされたサイトカインのアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当該技術分野で公知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、これらに限定されないが、例えば、天然源からの単離（天然発生型アミノ酸配列バリアントの場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向型）変異誘発による調製、ＰＣＲ変異誘発、および以前に調製された抗体のバリアントもしくは非バリアントバージョンのカセット変異誘発が含まれる。
本発明の抗体のＦｃ領域に一つまたは複数のアミノ酸修飾を導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域バリアントは、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む一つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒト ＩｇＧ１ 、 ＩｇＧ２ 、 ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインは、エフェクター機能が強化されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体またはその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインは、エフェクター機能が強化されたＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体またはその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインは、エフェクター機能が強化されたＩｇＧ１アイソタイプを有する。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、非フコシル化される。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、マンノース部分のレベルが増加している。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、バイセクティンググリカン部分のレベルが増加している。一部の実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインは、ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する抗体を含む。一部の実施形態では、ＩｇＧ１は、エフェクター機能を強化する一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８Ｄを有するかもしくは有さないＫ２９０Ｓ、またはＳ２９８Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、Ｋ３２６Ｅを有するまたは有さないアミノ酸置換Ｋ２９０Ｅ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、Ｋ３２６Ｅを有するまたは有さないアミノ酸置換Ｋ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、およびＫ３３４Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４ＶおよびＱ３３１Ｍ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｖ、Ｅ２９４Ｌ、またはＳ２９８Ｔを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｌ、Ｑ３１１Ｍ、およびＫ３３４Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、およびＫ３３４Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４ＶおよびＳ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｍ、またはＡ３３０Ｆを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖ、Ｑ３１１Ｍ、およびＡ３３０ＭまたはＡ３３０Ｆのいずれかを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖ、Ｓ２９８Ｔ、およびＡ３３０ＭまたはＡ３３０Ｆのいずれかを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖ、Ｓ２３９Ｄ、およびＡ３３０ＭまたはＳ２９８Ｔのいずれかを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＫ２９０Ｙ、Ｆ２４３Ｖ、またはＥ２９４Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｙ２９６ＷおよびＬ２３４ＹまたはＫ２９０Ｙのいずれかを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｓ、およびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。
一部の実施形態では、ＩｇＧ１は、エフェクター機能を低減または阻害する一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、またはＮ２９７Ｑを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡまたはＬ２３５Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、およびＰ２３８Ｓを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、およびＬ２３５Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵ指数に従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。
この説明および当該技術分野の教示によれば、一部の実施形態では、マスクされたサイトカインの抗体またはその断片は、例えば、Ｆｃ領域において、野生型の対応する抗体と比較して、一つまたは複数の改変を含み得ることが企図される。例えば、ある特定の改変は、例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されるように、改変された（すなわち、改善されたまたは減少されたのいずれか）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらすであろうＦｃ領域において行われ得る。Ｆｃ領域バリアントの他の例については、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０ （１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＷＯ９４／２９３５１を参照のこと。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）およびＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲへの結合が改善されたまたは減少した抗体バリアントを説明する。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ９（２）： ６５９１－６６０４（２００１）もまた参照されたい。増加された半減期と、母体のＩｇＧの胎児への移入の要因となる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合とを有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する、その中の一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。改変Ｆｃ領域アミノ酸配列を有し、Ｃ１ｑ結合能が増加または減少したポリペプチドバリアントは、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載される。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４： ４１７８－４１８４（２０００）もまた参照されたい。
４．２ マスクされたサイトカイン－薬物コンジュゲート
本発明はまた、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインを含むマスクされたサイトカイン－薬物コンジュゲート（ＭＣＤＣ）も提供し、これは、一つまたは複数の薬剤にコンジュゲートされた、本明細書に開示される任意のマスクされたサイトカインであり得る。一部の実施形態では、一つまたは複数の薬剤は、化学療法剤または薬物などの細胞傷害剤、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、
細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位元素である。一部の実施形態では、一つまたは複数の薬剤は免疫刺激剤である。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカインに複合体化された一つまたは複数の薬物には、これらに限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂｌを参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および第５，７８０，５８８号、および第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリチアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、および第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｋ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）、およびＬｏｄｅ ｅｔ ａｋ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｋ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｋ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｋ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｋ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）、および米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；およびＣＣ１０６５が含まれる。
別の実施形態では、マスクされたサイトカインに複合体化された一つまたは複数の薬物は、これらに限定されないが、チューブリン重合の阻害剤（例えば、メイタンシノイドおよびオーリスタチン）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアミシン、デュオカルマイシン、およびインド－リノベンゾジアゼピン二量体）、およびＤＮＡ合成阻害剤（例えば、エキサテカン誘導体Ｄｘｄ）が含まれる。
別の実施形態では、マスクされたサイトカイン－薬物複合体は、酵素的に活性な毒素またはその断片に複合体化された本明細書に記載されるマスクされたサイトカインを含み、これらに限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、 Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、 ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ジェロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。
別の実施形態では、マスクされたサイトカイン－薬物複合体は、放射性原子に複合体化された本明細書に記載されるマスクされたサイトカインを含み、放射性複合体を形成する。放射性複合体の生成には、様々な放射性同位元素が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、１１３１、１１２５、Ｙ９０、Ｒｅｌ８６、Ｒｅｌ８８、Ｓｍｌ５３、Ｂ１２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性複合体が検出に使用される場合、放射性複合体は、例えば、ｔｃ９９ｍもしくは１１２３などのシンチグラフィー研究用の放射性原子、または再びヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）用のスピン標識を含み得る。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカイン－薬物複合体は、一つまたは複数の免疫刺激剤に複合体化された本明細書に記載のマスクされたサイトカインを含む。一部の実施形態では、免疫刺激剤は、インターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストまたはトール様受容体（ＴＥＲ）アゴニストの刺激剤である。
ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＳＴＩＮＧの任意のアゴニストであってもよい。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。ＣＤＮは、任意のＣＤＮまたはその誘導体もしくはバリアントであってもよい。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃＡＩＭＰ、およびｃ－ｄｉ－ＩＭＰからなる群から選択されるＣＤＮである。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃＡＩＭＰ、およびｃ－ｄｉ－ＩＭＰからなる群から選択されるＣＤＮの誘導体またはバリアントである。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、４－（２－クロロ－６－フルオロベンジル）－Ｎ－（フラン－２－イルメチル）－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［ｌ，４］チアジン－６－カルボキサミド、またはその誘導体もしくはバリアントである。例えば、Ｓａｌｉ ｅｔ ａｌ． （２０１５） ＰｌｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．， １１（１２）： ｅ！００５３２４を参照のこと。
ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、またはＴＬＲ１０などの任意のＴＬＲのアゴニストであってもよい。一部の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＴＬＲ５などの細胞表面上に発現するＴＬＲのアゴニストである。一部の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、またはＴＬＲ１０などの細胞内に発現するＴＬＲのアゴニストである。
マスクされたサイトカインおよび細胞傷害性薬剤の複合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミジン酸塩ＨＣ１など）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（ｌ，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素－１４－標識ｌ－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合体化するための例示的なキレート剤である。Ｗ０９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｈ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書のＭＣＤＣは、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ．， Ｕ．Ｓ．Ａより）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、
ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）安息香酸塩）を含むがこれらに限定されない、架橋剤試薬で調整したかかる複合体について明確に企図しているが、これに限定されない。
４．３ ベクター、宿主細胞、および組換え法
本発明のマスクされたサイトカインの組換え生成のために、それをコードする一つまたは複数の核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクター内に挿入する。
マスクされたサイトカインをコードするＤＮＡは、その成分を含み、従来の手順を使用して容易に単離および配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。概して、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞（概して哺乳動物）起源のいずれかである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、抗体またはその断片の任意のアイソタイプの定常領域が、該当する場合、この目的に使用することができること、ならびにかかる定常領域を任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解されよう。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインをコードするために一つのベクターが使用される。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインをコードするために、複数のベクターが使用される。
１．原核宿主細胞を使用してマスクされたサイトカインを生成する
ａ．ベクター構築
本発明のマスクされたサイトカインのポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得ることができる。抗体またはその抗体断片の所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体生成細胞から単離され、配列決定されてもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器またはＰＧＲ技術を使用して合成することができ、または他の供給源から得ることができる。得られると、マスクされたサイトカインの成分をコードする配列は、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製および発現することができる組換えベクターに挿入される。当該技術分野で利用可能かつ公知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方）、およびそれが常駐する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、様々な構成要素を含む。ベクター構成要素には、概して、これらに限定されないが、複製の起源、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、および転写終結配列が含まれる。
概して、レプリコンを含むプラスミドベクターおよび宿主細胞と適合する種に由来する対照配列は、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を担持する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、遺伝子コードアンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性を含み、したがって形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージもまた、内因性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含み得るか、または含むように修飾され得る。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｈ、米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載される。
さらに、レプリコンを含むファージベクターおよび宿主微生物と適合する制御配列を、これらの宿主と関連した形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用することができる組換えベクターを作製する際に、７ＧＥＭ．ＴＭ．－１１などのバクテリオファージが利用されてもよい。
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコードする二つ以上のプロモーター－シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核プロモーターは、典型的には、誘導性および恒常性の二つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化に応答して、その制御下でシストロンの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介してプロモーターをソースＤＮＡから除去し、単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、マスクされたサイトカインのいずれかの鎖をコードするシストロンＤＮＡに動作可能に連結することができる。天然プロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅および／または発現を配向することができる。
一部の実施形態では、異種プロモーターは、それらが、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きな転写量およびより高い収率を一般的に許容するため、利用される。
原核宿主との使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、β－ガラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌において機能する他のプロモーター（他の公知の細菌またはファージプロモーターなど）も同様に好適である。それらのヌクレオチド配列が公開されており、それによって、当業者が、任意の必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して、例えば、軽鎖および重鎖を含むマスクされたサイトカインの標的軽鎖および重鎖をコードするシストロンにそれらを動作可能にライゲーションすることが可能になっている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたって発現ポリペプチドの転座を配向する分泌シグナル配列構成要素を含む。概して、シグナル配列は、ベクターの構成要素であってもよく、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに対して天然のシグナル配列を認識および処理しない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態では、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはそのバリアントである。
別の態様では、本発明によるポリペプチド構成要素の生成は、宿主細胞の細胞質内で発生し得るため、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。この点において、免疫グロブリン軽鎖および重鎖を含む実施形態については、例えば、重鎖および軽鎖は、マスキング部分、リンカー配列などの配列ありまたはなしで発現され、フォールディングされ、アセンブリされて、細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、それにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切なフォールディングおよびアセンブリを可能にする。Ｐｒｏｂａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
本発明のマスクされたサイトカインはまた、本発明の分泌および適切にアセンブリされた抗体の収率を最大化するために、発現ポリペプチド構成要素の定量的比を調節することができる発現系を使用することによって生成することができる。かかる調節は、ポリペプチド構成要素の翻訳強度を同時に調節することによって少なくとも部分的に達成される。
本発明のマスクされたサイトカインを発現するのに好適な原核宿主細胞には、例えば、グラム陰性またはグラム陽性の生物などの古細菌および真正細菌が含まれる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、本発明の宿主として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、遺伝子型Ｗ３１１０ ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ＡｏｍｐＴＡ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含む、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０－１２１９；ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．２７，３２５）、およびその誘導体が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉｋ １７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）などの他の株およびその誘導体もまた好適である。これらの例は、限定するものではなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体を構築するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｈ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌を選択することが一般的に必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種を宿主として好適に使用することができる。典型的には、宿主細胞は、最小限の量のタンパク質分解酵素を分泌するべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤は、細胞培養に組み込まれ得ることが望ましい。
ｂ．マスクされたサイトカイン産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適切な場合に修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外要素として、または染色体統合体によってのいずれかで複製可能となるように、原核宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適切な標準的な技術を使用して行われる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞に一般的に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、電気穿孔法である。
本発明のマスクされたサイトカインを生成するために使用される原核細胞は、当該技術分野で公知の培地中で増殖され、選択された宿主細胞の培養に好適である。好適な培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）に加えて、必要な栄養?補助剤が挙げられる。一部の実施形態では、培地はまた、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤を含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に許容する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のために、アンピシリンが培地に添加される。
炭素、窒素、および無機リン酸源以外の任意の必要な補助剤もまた、単独で、または別の補助剤もしくは複合窒素源などの培地との混合物として、適切な濃度で導入されてもよい。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタアミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、およびジチオスレイトールからなる群から選択される一つまたは複数の還元剤を含み得る。
原核宿主細胞は、好適な温度で培養される。ある特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖については、増殖温度は、約２０℃～約３９℃、約２５℃～約３７℃、または約３０℃の範囲である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５～約９の範囲の任意のｐＨであってもよい。ある特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉについては、ｐＨは約６．８～約７．４、または約７．０である。
誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターで使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地中で培養される。ある特定の実施形態では、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｈ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３－１４７を参照されたい）。当該技術分野で公知であるように、用いられるベクター構築物に従って、様々な他の誘導剤が使用されてもよい。
一実施形態では、本発明の発現されたマスクされたサイトカインは、宿主細胞の周辺質に分泌され、宿主細胞の周辺質から回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などのかかる手段によって微生物を破壊することを伴う。細胞が破壊されると、細胞片または細胞全体が、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、その中で単離され得る。細胞を培養物から除去され得、培養上清は、生成されたタンパク質のさらなる精製のために濾過され、濃縮される。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットアッセイなどの一般的に公知である方法を使用して、さらに単離および特定することができる。
本発明の一態様では、マスクされたサイトカイン生成は、発酵プロセスによって大量に実施される。組換えタンパク質の生成には、様々な大規模な流加発酵手順が利用可能である。大規模な発酵は、少なくとも１０００リットルの容量を有し、ある特定の実施形態では、約１，０００～１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵剤は、酸素および栄養素、特にグルコースを分配するために撹拌器インペラーを使用する。小規模の発酵とは、一般的に、体積容量が約１００リットル以下であり、かつ約１リットル～約１００リットルの範囲であり得る発酵機での発酵を指す。
発酵プロセスでは、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が好適な条件下で、所望の密度、約１８０～２２０のＯＤ５５０へと成長した後に開始され、その段階では細胞は、初期静止期である。様々な誘導剤が、当該技術分野で公知であり、上述されるように、用いられるベクター構築物に従って使用されてもよい。細胞は、誘導の前により短い期間にわたって成長し得る。細胞は通常、約１２～５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間が使用されてもよい。
本発明のポリペプチドの生成収率および品質を改善するために、様々な発酵条件を修飾することができる。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切なアセンブリおよびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（カペロン活性を有するペプチジルプロリルシス，トランス－イソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現する追加のベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞中で生成される異種タンパク質の適切なフォールディングおよび溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１９６０１－１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｋ，米国特許第６，０８３，７１５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｋ、米国特許第６，０２７，８８８号、Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１００－１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１０６－１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｋ （２００１） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９：１９９－２１０。
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のタンパク質）のタンパク質分解を最小化するために、タンパク質分解酵素を欠損したある特定の宿主株を本発明に使用することができる。例えば、宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、およびそれらの組み合わせなどの公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内の遺伝的変異に影響するように修飾され得る。いくつかのＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株は入手可能であり、例えば、上記のＪｏｌｙ ｅｔ ａｋ（１９９８）；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｋ、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｋ， 米国特許第５，５０８，１９２号、Ｋａｒａ ｅｔ ａｋ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２：６３－７２（１９９６）に記載されている。
一部の実施形態では、タンパク質分解酵素を欠損し、かつ一つまたは複数のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株は、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。
ｃ．マスクされたサイトカイン精製
一部の実施形態では、本明細書の生成されるマスクされたサイトカインは、さらなるアッセイおよび使用のために、実質的に均質な調製物を得るためにさらに精製される。当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順は、好適な精製手順の例である：免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過。
一部の実施形態では、固相上に固定されたプロテインＡは、本発明のマスクされたサイトカインの免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤ細胞壁タンパク質であり、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６２：１－１３。プロテインＡが固定される固相は、ガラスもしくはシリカ表面、または制御された細孔ガラスカラムもしくはケイ酸カラムを含むカラムであり得る。いくつかの用途では、カラムは、グリセロールなどの試薬でコーティングされ、汚染物質の非特異的な付着を防止する可能性がある。
精製の第一のステップとして、上述の細胞培養に由来する調製物を、プロテインＡ固定化固相に適用して、プロテインＡへの目的のマスクされたサイトカインの特異的結合を可能にすることができる。次いで、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合された汚染物質を除去する。最後に、目的のマスクされたサイトカインは、溶出によって固相から回収される。
マスクされたサイトカインの成分への高親和性結合を提供する他の精製方法は、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法に従って使用することができる。
２．真核宿主細胞を使用してマスクされたサイトカインを生成する
真核宿主細胞で使用するためのベクターには、概して、以下の非限定的な構成要素：シグナル配列、複製の起源、一つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの一つまたは複数が含まれる。
ａ． シグナル配列構成要素
真核宿主細胞で使用するためのベクターはまた、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくは目的のポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドを含み得る。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
かかる前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームで、マスクされたサイトカインをコードするＤＮＡにライゲーションされる。
ｂ． 複製の起源
概して、複製構成要素の起源は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起源は、典型的には、早期プロモーターを含むためにのみ使用され得る。
ｃ． 選択遺伝子構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択遺伝子を含んでもよく、選択マーカーとも称される。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）関連する場合、栄養要求性欠損を相補するタンパク質、または（ｃ）複合培地から利用可能ではない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの一つの例は、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用する。異種遺伝子で正常に形質転換すること成功したそれらの細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を生成し、したがって選択レジメンを生き延びる。かかる優性の選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンの薬物を使用する。
哺乳動物細胞に好適な選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉおよび－ＩＩ、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの核酸をコードするマスクされたサイトカインを取り出す能力を有する細胞の識別を可能にするものである。
例えば、一部の実施形態では、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中ですべての形質転換体を培養することによって特定される。一部の実施形態では、野生型ＤＨＦＲを用いる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）である。
あるいは、マスクされたサイトカイン、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能マーカーをコードするＤＮＡ配列と形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またＧ４１８などの選択可能マーカーの選択剤を含む培地中の細胞増殖によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。宿主細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）を欠損した細胞株を含むＮＳ０を含んでもよい。哺乳動物細胞用の選択マーカーとしてのＧＳの使用方法は、米国特許第５，１２２，４６４号および米国特許第５，８９１，６９３号に記載されている。
ｄ． プロモーター構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、かつ目的のマスクされたサイトカインをコードする核酸に動作可能に連結されるプロモーターを含み、これは本明細書に記載の任意のマスクされたサイトカインであり得る。プロモーター配列は、真核生物について公知である。例えば、ほぼすべての真核遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは任意のヌクレオチドであってもよい。ほとんどの真核遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。ある特定の実施形態では、これらの配列のうちのいずれかまたはすべては、真核生物発現ベクターに好適に挿入されてもよい。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、ファウルポックスウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーター得られるプロモーターによって制御され、かかるプロモーターが、ただし、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起源も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時早期プロモーターは、Ｈｉｎｄｌｌｌ Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾については、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ－インターフェロンｃＤＮＡの発現について記載している、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｈ， Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８－６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
ｅ． エンハンサー要素構成要素
より高い真核生物による本発明のマスクされたサイトカインをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによってしばしば増加される。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ－フェトプロテイン、およびインスリン）から公知である。しかしながら、典型的には、一つは真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起源の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、ヒトサイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい（真核生物プロモーターの活性化のエンハンサー要素について記載している）。エンハンサーは、
マスクされたサイトカインコード配列に対して５’または３’の位置でベクターにスプライシングされてもよいが、概してプロモーターから５’の部位に位置する。
ｆ． 転写終結構成要素
真核宿主細胞で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含み得る。かかる配列は、真核またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合により３’の非翻訳領域から一般的に利用可能である。これらの領域は、マスクされたサイトカインをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびその中に開示される発現ベクターを参照されたい。
ｇ． 宿主細胞の選択および形質転換
本明細書のベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するための好適な宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載されるより高い真核細胞を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｈ， Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｈ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＥＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｈ， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
宿主細胞は、マスクされたサイトカイン産生のための上述の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適切な場合に修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
ｈ． 宿主細胞の培養
本発明のマスクされたサイトカインを生成するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養されてもよい。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｈ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｈ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５（１９８０）、米国特許４，７６７，７０４号、４，６５７，８６６号、
第Ａ，９２１，１６２＼号第４，５６０，６５５号、または第５，１２２，４６９号、ＷＯ ９０／０３４３０、ＷＯ ８７／００１９５、または米国特許第Ｒｅ． ３０，９８５号に記載されるいずれかの培地は、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれも、必要な場合、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源で補充されてもよい。任意の他のサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、通常の当業者には明らかであろう。
ｉ． マスクされたサイトカインの精製
組換え技術を使用する場合、マスクされたサイトカインは、細胞内で生成され得るか、または培地中に直接分泌され得る。マスクされたサイトカインが第一のステップとして細胞内で生成される場合、宿主細胞または溶解断片のいずれかである微粒子状破片は、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去され得る。マスクされたサイトカインが培地中に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、最初に、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮されてもよい。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するための前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、抗生物質は、外来性汚染物質の成長を防止するために含まれてもよい。
細胞から調製されたマスクされたサイトカイン組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーは簡便な技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、もしあれば、マスクされたサイトカイン中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｋ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２：１－１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ、およびヒトｙ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｋ， ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、アガロースであってもよいが、他のマトリックスが利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成され得るよりも速い流量および短い処理時間を可能にする。マスクされたサイトカインがＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）は精製に有用である。
イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた、回収されるマスクされたサイトカインに応じて利用可能である。
任意の予備的精製ステップに続いて、目的のマスクされたサイトカインおよび汚染物質を含む混合物は、例えば、低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩）で行われる、約２．５～４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、さらなる精製に晒されてもよい。
概して、研究、試験、および臨床使用における使用のためのマスクされたサイトカインを調製するための様々な方法論は、上述の方法論と一致し、かつ／または特定の目的のマスクされたサイトカイについて当業者によって適切であるとみなされるように、当該技術分野で定着している。
５． 組成物
一部の態様では、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインのいずれかを含む組成物も本明細書に提供される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のマスクされたサイトカインの例示的な実施形態のいずれかを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のマスクされたサイトカインのいずれかの二量体を含む。一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物である。一部の実施形態では、組成物は、マスクされたサイトカインを含み、以下に詳細に記載される構成要素のうちの一つまたは複数をさらに含む。例えば、一部の実施形態では、組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤もしくは洗剤、または他の治療剤もしくは活性化合物、またはそれらの組み合わせを含む。組成物の様々な実施形態は、本明細書では製剤と呼ばれることがある。
治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって保管のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｋｌｉｎｓ，Ｐｕｂ．，Ｇｅｎｎａｒｏ Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．２０００）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、緩衝剤；アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、ピロ亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化物質；防腐剤、等張剤、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；ＥＤＴＡおよび／または非イオン性界面活性剤などのキレート剤を含む。
緩衝剤を使用して、特に安定性がｐＨ依存性である場合に、治療有効性を最適化する範囲内でｐＨを調整することができる。緩衝剤は、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。本発明とともに使用するための好適な緩衝剤は、有機酸および無機酸ならびにその塩の両方を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。さらに、緩衝剤は、トリスなどの、ヒスチジン塩およびトリメチルアミン塩からなってもよい。
防腐剤は、微生物の成長を防止するために添加することができ、典型的には、約０．２％～１．０％（ｗ／ｖ）の範囲内に存在する。治療剤と一般的に使用される適切な保存剤の例としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール、ｍ－クレゾール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、 ｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピル、２－フェノキシエタノール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸ブチル、２－フェニルエタノール、エタノール、クロロブタノール、チオメロサル、 ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチル、およびクロルフェネシン（３ｐ－クロルフェノキシプロパン－ｌ，２－ジオール）が挙げられる。
等張剤は、時には「安定剤」として知られ、組成物中の液体の等張性を調整または維持するために存在し得る。タンパク質および抗体などの大きな荷電生体分子とともに使用された場合、それらはアミノ酸側鎖の荷電群と相互作用し、それによって分子間相互作用および分子内相互作用の可能性を低減することができるため、しばしば「安定剤」と称される。
等張剤は、他の成分の相対量を考慮に入れて、約０．１重量％～約２５重量％または約１～約５重量％の任意の量で存在し得る。一部の実施形態では、等張剤としては、多価糖アルコール、三価または価数がより多い糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールが挙げられる。
追加の賦形剤には、（１）増量剤、（２）溶解性エンハンサー、（３）安定剤、および（４）ならびに容器壁への変性または付着を防止する薬剤のうちの一つまたは複数として作用し得る薬剤が含まれる。かかる賦形剤には、多価糖アルコール（上記に列挙）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖または糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、ａ－モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖類；ならびにデキストリンまたはデキストランなどの多糖類が含まれる。
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤を可溶化させるのを助け、ならびに撹拌誘導凝集から治療用タンパク質を保護するために存在することができ、これはまた、活性治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤がせん断表面応力に曝露されることを可能にする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌまたは約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲内で存在する。一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、約０．００１％～約０．１％ｗ／ｖ、または約０．０１％～約０．１％ｗ／ｖ、または約０．０１％～約０．０２５％ｗ／ｖの範囲内で存在する。
適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが含まれる。使用され得る陰イオン性洗剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、およびジオクチルスルホン酸ナトリウムが含まれる。陽イオン性洗剤には、ベンザルコ?ニウム塩化物またはベンゼトニウム塩化物が含まれる。
製剤をインビボでの投与に使用するためには、製剤は滅菌でなければならない。製剤は、滅菌濾過膜を介する濾過によって滅菌され得る。本明細書の治療用組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静注液バッグ、または皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。
投与経路は、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病変内、もしくは関節内経路、局所投与、吸入による、または徐放性もしくは持続放出手段による、注射または注入などの好適な様式で、単回もしくは複数回のボーラス、または長期間にわたる注入など、公知の許容された方法に従う。
本明細書に記載されるマスクされたサイトカインのいずれかは、単独で、または本明細書に記載される方法にあるような他の治療剤と組み合わせて使用することができる。「と組み合わせて」という用語は、同一または別個の製剤に含まれる二つ以上の治療剤（例えば、マスクされたサイトカインおよび治療剤）を包含する。一部の実施形態では、「と組み合わせて」とは、「同時」投与を指し、その場合、本発明のマスクされたサイトカインの投与は、一つまたは複数の追加の治療剤の投与に同時に発生する（例えば、マスクされたサイトカインの投与と、一つまたは複数の追加の治療剤の投与との間と同時または１時間以内）。一部の実施形態では、「と組み合わせて」とは、逐次的投与を指し、その場合、本発明のマスクされたサイトカインの投与は、一つまたは複数の追加の治療剤の投与の前および／または後に発生する（例えば、マスクされたサイトカインの投与と、一つまたは複数の追加の治療剤の投与との間の１時間超）。本明細書で意図される薬剤には、これらに限定されないが、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、免疫チェックポイント分子を標的とする薬剤、免疫刺激分子を標的とする薬剤、成長阻害剤、免疫刺激剤、抗炎症剤、または抗癌剤が含まれる。
本明細書の製剤はまた、治療されている特定の適応症、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する適応症に必要な場合に、複数の活性化合物を含み得る。あるいは、または追加的に、組成物は、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、免疫チェックポイント分子もしくは刺激分子を標的とする薬剤、成長阻害剤、免疫刺激剤、抗炎症剤、または抗癌剤を含んでもよい。かかる分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせて好適に存在する。
製剤は、液体製剤、固体（凍結乾燥）製剤、または凍結製剤などの任意の適切な状態で提示されてもよい。これらのタイプのそれぞれの製剤を治療用に調製するためのアプローチは、当該技術分野で周知である。
６． 治療方法
本明細書では、対象において疾患を治療または予防する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載のいずれかのマスクされたサイトカインまたはその組成物の有効量を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象において疾患を治療または予防する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載のいずれかの組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象（例えば、ヒト患者）は、癌と診断されたか、またはかかる障害を発症するリスクがある。一部の実施形態では、対象において疾患を治療または予防する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載のいずれかのマスクされたサイトカインまたはその組成物の有効量を対象に投与することを含み、マスクされたサイトカインは、酵素で切断されると活性化する。一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、腫瘍微小環境で活性化される。マスクされたサイトカインは、切断された後、治療的に活性である。したがって、一部の実施形態では、活性薬剤は、切断産物である。
疾患の予防または治療について、活性薬剤の適切な投与量は、本明細書に定義されるような治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、予防または治療目的のために薬剤が投与されるかどうか、以前の治療、対象の臨床歴および薬剤に対する応答、ならびに担当医師の裁量に依存する。薬剤は、一度に、または一連の治療にわたって、対象に好適に投与される。
一部の実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを切断する働きをするプロテアーゼは、ＭＭＰである。
本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、マスクされたサイトカインの投与間隔は約１週間以上である。本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされたサイトカインの投与間隔は、約２日以上、約３日以上、約４日以上、約５日以上、または約６日以上である。本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされたサイトカインの投与間隔は、約１週間以上、約２週間以上、約３週間以上、または約４週間以上である。本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされたサイトカインの投与間隔は、約１ヶ月以上、約２ヶ月以上、または約３ヶ月以上である。本明細書で使用される場合、投与間隔は、マスクされたサイトカインの一つの投与とマスクされたサイトカインの次の投与との間の期間を指す。本明細書で使用される場合、約１ヶ月の間隔は、４週間を含む。一部の実施形態では、治療は、マスクされたサイトカインの複数回投与を含み、投与の間の間隔は、変化し得る。例えば、一部の実施形態では、第一の投与と第二の投与との間隔は、約１週間であり、その後の投与の間の間隔は、約２週間である。一部の実施形態では、第一の投与と第二の投与との間隔は、約２日、３日、４日、または５日、または６日であり、その後の投与間隔は、約１週間である。
一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、ある期間にわたって複数回投与される。対象に複数回投与される用量は、一部の実施形態では、各投与に対して同じ用量であってもよく、または一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、二つ以上の異なる用量で対象に投与されてもよい。例えば、一部の実施形態では、マスクされたサイトカインは、最初は一つの用量で一回または複数回、その後、後の時点から二つの用量で一回または複数回投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされたポリペプチドは、一定の用量で投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされたポリペプチドは、一用量当たり約２５ｍｇ～約５００ｍｇの用量で対象に投与される。一部の実施形態では、マスクされたポリペプチドは、約２５ｍｇ～約５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約７５ｍｇ、約７５ｍｇ～約ｌ００ｍｇ、約ｌ００ｍｇ～約１２５ｍｇ、約１２５ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約１７５ｍｇ、約１７５ｍｇ～約２００ｍｇ、約２００ｍｇ～約２２５ｍｇ、約２２５ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約２７５ｍｇ、約２７５ｍｇ～約３００ｍｇ、約３００ｍｇ～約３２５ｍｇ、約３２５ｍｇ～約３５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約３７５ｍｇ、約３７５ｍｇ～約４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約４２５ｍｇ、約４２５ｍｔ～約４５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約４７５ｍｇ、または約４７５ｍｇ～約５００ｍｇ／用量の用量で対象に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされたポリペプチドは、対象の体重または体表面積（ＢＳＡ）に基づいた投与量で対象に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）のマスクされたポリペプチドは、例えば、一つまたは複数の別個の投与によって、または連続注入によってかかわらず、患者への投与のための初期候補投与量であり得る。一つの典型的な１日投与量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が発生するまで治療が概して維持されるであろう。マスクされたポリペプチドの一つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）のうちの一つまたは複数の用量が患者に投与されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされたポリペプチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたポリペプチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０．０ｍｇ／ｋｇのうちのいずれかの投与量で対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたポリペプチドは、約もしくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約２．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約３．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約４．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは 少なくとも約４．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約５．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約５．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約６．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約６．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約７．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約７．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約８．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約８．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約９．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約９．５ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約１０．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約１５．０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約６０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約７０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約８０ｍｇ／ｋｇ、約もしくは少なくとも約９０ｍｇ／ｋｇ、または約もしくは少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。上述の投与頻度のうちのいずれかを使用してもよい。
本明細書で意図される治療方法は、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインまたは組成物のいずれかを用いた、癌などの障害または疾患の治療である。本発明の製剤により治療可能な障害または疾患には、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌（例えば、メルケル細胞癌）、または精巣癌が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のマスクされたサイトカインまたは組成物の投与による癌の治療または予防方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のマスクされたサイトカインまたは組成物を抗癌剤と組み合わせて投与することによる癌の治療または予防方法が本明細書に提供される。抗癌剤は、癌増殖を低減する、癌細胞複製を阻害する、癌細胞を直接的または間接的に死滅させる、転移を低減する、腫瘍血液供給を低減する、または細胞生存を低減することができる任意の薬剤であり得る。一部の実施形態では、抗癌剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、Ｂ７Ｈ４阻害剤、Ｂ７Ｈ３阻害剤、ＣＳＦＩＲ阻害剤、ＨＶＥＭ阻害剤、ＣＤ２７阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＮＫＧ２Ａ阻害剤、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、ＴＷＥＡＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＣＤ５２標的化抗体、ＣＣＲ４標的化抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＫＩＴ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＢＡＦＦ阻害剤、ＨＤ ＡＣ阻害剤、ＶＥＧＦリガンド阻害剤、ＣＤ１９標的化分子、ＦＯＦＲ１標的化分子、ＤＦＦ３標的化分子、ＤＫＫ１標的化分子、ＭＵＣ１標的化分子、ＭＵＧ１６標的化分子、ＰＳＭＡ標的化分子、ＭＳＦＮ標的化分子、ＮＹ－ＥＳ０－１標的化分子、Ｂ７Ｈ３標的化分子、Ｂ７Ｈ４標的化分子、ＢＣＭＡ標的化分子、ＣＤ２９標的化分子、ＣＤ１５１標的化分子、ＣＤ１２３標的化分子、ＣＤ３３標的化分子、ＣＤ３７標的化分子、 ＣＤＨ１９標的化分子、ＣＥＡ標的化分子、クローディン１８．２標的化分子、ＣＦＥＣ１２Ａ標的化分子、ＥＧＦＲＶＩＩＩ標的化分子、ＥＰＣＡＭ標的化分子、ＥＰＨＡ２標的化分子、ＦＣＲＨ５標的化分子、 ＦＬＴ３標的化分子、ＧＤ２標的化分子、グリピカン３標的化分子、ｇｐＡ３３標的化分子、ＧＰＲＣ５Ｄ標的化分子、ＩＬ－２３Ｒ標的化分子、ＩＬ－１ＲＡＰ標的化分子、ＭＣＳＰ標的化分子、ＲＯＮ標的化分子、ＲＯＲ１標的化分子、ＳＴＥＡＰ２標的化分子、ＴｆＲ標的化分子、ＣＤ１６６標的化分子、ＴＰＢＧ標的化分子、ＴＲＯＰ２標的化分子、プロテアソーム阻害剤、ＡＢＥ阻害剤、ＣＤ３０阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＭＥＴ阻害剤、ＲＥＴ阻害剤、ＩＬ－１β阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＲＯＳ１阻害剤、ＢＲＡＥ阻害剤、ＣＤ３８阻害剤、ＲＡＮＫＥ阻害剤、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１阻害剤、ＳＬＡＭＦ７阻害剤、ＩＤＨ２阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＣＤ２０標的化抗体、ＢＴＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＲＡＦ阻害剤、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、ＪＡＫ３阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤、平滑化阻害剤、ＩＬ－６Ｒ阻害剤、ＢＣＬ２阻害剤、ＰＴＣＨ阻害剤、ＰＩＧＦ阻害剤、ＴＧＦＢ阻害剤、ＣＤ２８アゴニスト、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＧＩＴＲアゴニスト、０Ｘ４０アゴニスト、ＶＩＳＴＡアゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、およびＩＬ－２Ｒ阻害剤からなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のマスクされたサイトカインを抗炎症剤と組み合わせて投与することによる癌の治療または予防方法が本明細書に提供される。抗炎症剤は、炎症を予防、拮抗、阻害、またはその他の方法で低減することができる任意の薬剤とすることができる。
一部の実施形態では、抗炎症剤はシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤である。ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－１および／またはＣＯＸ－２の活性を阻害する任意の薬剤であり得る。一部の実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－１を選択的に阻害する（すなわち、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－２の活性を阻害するよりも、ＣＯＸ－１の活性を阻害する）。一部の実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－２を選択的に阻害する（すなわち、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－１の活性を阻害するよりも、ＣＯＸ－２の活性を阻害する）。一部の実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－１およびＣＯＸ－２の両方を阻害する。
一部の実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、選択的ＣＯＸ－１阻害剤であり、ＳＣ－５６０、ＦＲ１２２０４７、Ｐ６、モフェゾラク、ＴＦＡＰ、フルルビプロフェン、およびケトプロフェンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＯＸ阻害剤が、選択的ＣＯＸ－２阻害剤であり、セレコキシブ、ロフェコキシブ、メロキシカム、ピロキシカム、デラコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ、エトリコキシブ、クロメン誘導体、クロマン誘導体、Ｎ－（２－シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド、パレコキシブ、ルミラコキシブ、 ＲＳ ５７０６７、Ｔ－６１４、ＢＭＳ－３４７０７０、ＪＴＥ－５２２、Ｓ－２４７４、ＳＶＴ－２０１６、ＣＴ－３、ＡＢＴ－９６３、ＳＣ－５８１２５、ニメスリド、フロスリド、ＮＳ－３９８、Ｌ－７４５３３７、ＲＷＪ－６３５５６、Ｌ－７８４５１２、ダルブフェロン、ＣＳ－５０２、ＬＡＳ－３４４７５、ＬＡＳ－ ３４５５５、Ｓ－３３５１６、ジクロフェナク、メフェナム酸、およびＳＤ－８３８１からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトロラク、インドメタシン、アスピリン、ナプロキセン、トルメチン、ピロキシカム、およびメクロフェナム酸からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＳＣ－５６０、ＦＲ１２２０４７、Ｐ６、モフェゾラク、ＴＦＡＰ、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、メロキシカム、ピロキシカム、デラコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ、エトリコキシブ、クロメン誘導体、クロマン誘導体、Ｎ－（２－シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド、パレコキシブ、ルミラコキシブ、 ＲＳ ５７０６７、Ｔ－６１４、ＢＭＳ－３４７０７０、ＪＴＥ－５２２、Ｓ－２４７４、ＳＶＴ－２０１６、ＣＴ－３、ＡＢＴ－９６３、ＳＣ－５８１２５、ニメスリド、フロスリド、ＮＳ－３９８、Ｌ－７４５３３７、ＲＷＪ－６３５５６、Ｌ－７８４５１２、ダルブフェロン、ＣＳ－５０２、ＬＡＳ－３４４７５、ＬＡＳ－ ３４５５５、Ｓ－３３５１６、ジクロフェナク、メフェナム酸、ＳＤ－８３８１、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトロラク、インドメタシン、アスピリン、ナプロキセン、トルメチン、ピロキシカム、およびメクロフェナム酸からなる群から選択される。
一部の実施形態では、抗炎症剤はＮＦ－ｋＢ阻害剤である。ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＮＦ－ｋＢ経路の活性を阻害する任意の薬剤であり得る。一部の実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＩＫＫ複合体阻害剤、ＩｋＢ分解阻害剤、ＮＦ－ｋＢ核移行阻害剤、ｐ６５アセチル化阻害剤、ＮＦ－ｋＢ ＤＮＡ結合阻害剤、ＮＦ－ｋＢトランス活性化阻害剤、およびｐ５３誘導阻害剤からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＩＫＫ複合体阻害剤は、ＴＰＣＡ－１、ＮＦ－ｋＢ活性化阻害剤ＶＩ（ＢＯＴ－６４）、ＢＭＳ－３４５５４１、アンレキサノクス、ＳＣ－５１４（ＧＫ－０１１４０）、ＩＭＤ－０３５４、およびＩＫＫ－１６からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＩｋＢ分解阻害剤は、ＢＡＹ－１１－７０８２、ＭＧ－１１５、ＭＧ－１３２、ラクタシスチン、エポキソミシン、パルテノライド、カルフィルゾミブ、およびＭＬＮ－４９２４（ペボネジスタット）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＮＦ－ｋＢ核移行阻害剤は、ＪＳＨ－２３およびロリプラムからなる群から選択される。一部の実施形態では、ｐ６５アセチル化阻害剤は、没食子酸およびアナカルジン酸からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＮＦ－ｋＢ ＤＮＡ結合阻害剤は、ＧＹＹ－４１３７、ｐ－ＸＳＣ、ＣＶ－３９８８、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＮＦ－ｋＢトランス活性化阻害剤は、ＬＹ－２９４００２、ワートマニン、およびメサラミンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ｐ５３誘導阻害剤は、キナクリンおよびフラボピリドールからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＴＰＣＡ－１、ＮＦ－ｋＢ活性化阻害剤ＶＩ（ＢＯＴ－６４）、ＢＭＳ－３４５５４１、アンレキサノクス、ＳＣ－５１４（ＧＫ－０１１４０）、ＩＭＤ－０３５４、ＩＫＫ－１６、ＢＡＹ－１１－７０８２、ＭＧ－１１５、ＭＧ－ １３２、ラクタシスチン、エポキソミシン、パルテノライド、カルフィルゾミブ、ＭＬＮ－４９２４（ペボネジスタット）、ＪＳＨ－２３ロリプラム、没食子酸、アナカルジン酸、ＧＹＹ－４１３７、ｐ－ＸＳＣ、ＣＶ－３９８８、プロスタグランジンＥ２ （ＰＧＥ２）、ＬＹ－２９４００２、ワートマニン、メサラミン、キナクリン、およびフラボピリドールからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のマスクされたサイトカインまたは組成物を抗癌治療用タンパク質と組み合わせて投与することによる癌の治療または予防方法が本明細書に提供される。抗癌治療用タンパク質は、癌増殖を低減する、癌細胞複製を阻害する、癌細胞を直接的または間接的に死滅させる、転移を低減する、腫瘍血液供給を低減する、または細胞生存を低減することができる任意の治療用タンパク質であり得る。例示的な抗癌治療用タンパク質は、抗体またはその断片、抗体誘導体、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、融合タンパク質、または二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）の形態で生じ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のマスクされたサイトカインまたは組成物をＣＡＲ－ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞と組み合わせて投与することによる癌の治療または予防方法が本明細書に提供される。
７．製造物品またはキット
別の態様では、本明細書に記載の任意のマスクされたサイトカインを含む、製造品またはキットが提供される。製造物品またはキットは、本発明の方法におけるサイトカインの使用のための説明書をさらに含み得る。したがって、特定の実施形態では、製造物品またはキットは、有効量のマスクされたサイトカインを個体に投与することを含む、個体における障害（例えば、癌）を治療または予防する方法におけるマスクされたサイトカインの使用に関する指示を含む。例えば、特定の実施形態では、製造物品またはキットは、有効量のマスクされたポリペプチドを個体に投与することを含む、個体における障害（例えば、癌）を治療または予防する方法におけるマスクされたポリペプチドの使用に関する指示を含む。ある特定の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、個体は、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、または精巣癌からなる群から選択される疾患を有する。
製造物品またはキットは、容器をさらに含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、シリンジ（シングルチャンバーシリンジまたはデュアルチャンバーシリンジなど）、試験管、および静脈内（ＩＶ）バッグが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は製剤を保持する。一部の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤である。一部の実施形態では、製剤は、凍結製剤である。一部の実施形態では、製剤は、液体製剤である。
製造物品またはキットは、容器上のまたは容器と関連付けられるラベルまたは添付文書をさらに含んでもよく、製剤の再構成および／または使用の指示を示してもよい。ラベルまたは添付文書は、製剤が、個体における障害（例えば、癌）を治療または予防するための、皮下、静脈内、または他の投与様式に有用であるか、または意図されていることをさらに示し得る。製剤を保持する容器は、単回使用バイアルまたは複数回使用バイアルであってもよく、これは再構成された製剤の反復投与を可能にする。製造物品またはキットは、好適な希釈剤を含む第二の容器をさらに含み得る。製造物品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書を含む、商業的、治療的、およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
特定の実施形態では、本発明は、単回用量投与ユニット用のキットを提供する。かかるキットは、治療用サイトカインの水性製剤の容器を含み、シングルまたはマルチチャンバープレフィルドシリンジの両方を含む。例示的なプレフィルドシリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ ＧｍｂＨ（ Ｒａｖｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である。
本明細書の製造物品またはキットは、任意に、第二の薬剤を含む容器をさらに含み、マスクされたサイトカインは、第一の薬剤であり、その物品またはキットは、有効量で、第二の薬剤で対象を治療するためのラベルまたは添付文書上の説明書をさらに含む。
別の実施形態では、自動注射器での投与のための本明細書に記載される製剤を含む製造物品またはキットが本明細書に提供される。自動注射器は、起動時に、患者または投与者からの追加の必要な措置なしにその内容物を送達する、注射装置として説明され得る。これらは、送達速度が一定でなければならず、かつ送達時間が数瞬よりも長い場合、治療用製剤のセルフメディケーションに特に好適である。
８．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、および他の技術用語および科学用語または専門用語は、請求される主題が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。一部の事例では、一般的に理解される意味を有する用語は、明確にするため、および／またはすぐに参照できるように本明細書に定義され、本明細書にこうした定義を含めることは、当該技術分野で一般的に理解されるものとの実質的な差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
本発明は、当然のことながら変化し得る特定の組成物または生物学系に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであるに過ぎず、制限を意図するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「一つ（ａ）」、「一つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書の「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータを本質的に対象とする実施形態を含む（および記載する）。
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「および／または」は、用語が関連付けられている項目のいずれか一つ、項目の任意の組み合わせ、または項目の全てを指す。例えば、語句「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、以下の実施形態の各々を包含することが意図されている。Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；ＡおよびＢまたはＣ；ＢおよびＡまたはＣ；ＣおよびＡまたはＢ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、および単鎖分子、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。「免疫グロブリン（Ｉｇ）」という用語は、本明細書でにおいて「抗体」と互換的に使用される。
用語「二重特異性抗体」は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）中の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインに接続された重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指す。
塩基性４鎖抗体ユニットは、二つの同一の軽（Ｌ）鎖と二つの同一の重（Ｈ）鎖とから構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとともに、５個の塩基性ヘテロ四量体ユニットからなり、１０個の抗原結合部位を含むが、一方でＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と組み合わせた多価集合体を形成するように重合することができる２～５個の塩基性４鎖ユニットからなる。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、概して、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、一つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されるが、一方で二つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、一つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ鎖およびＬ鎖はまた、規則的な間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて各ａ鎖およびｙ鎖に対して三つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにｐおよびｓアイソタイプに対して四つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いてその他方の末端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨと整列し、ＣＬは、重鎖（ＣＨＩ）の第一の定常ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。ＶＨおよびＶＬの対合は一緒に単一の抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ ７１ ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる、二つの明確に異なるタイプのうちの一つに割り当てることができる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには五つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それぞれ、指定された、ａ、８、ｙおよびｐの重鎖を有する。ｙおよびａのクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的小さな差異に基づいてサブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２を発現する。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと称される複数の多型バリアント（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ ４ １－７）に存在してもよく、そのいずれも本発明での使用に好適である。ヒト集団における一般的なアロタイプバリアントは、ａ、ｆ、ｎ、ｚという文字で示されるものである。
「単離された」抗体は、その生成環境（例えば、天然または組換え）の構成要素から識別され、分離され、および／または回収された抗体である。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、その生成環境から他のすべての構成要素と無関連である。組換えトランスフェクト細胞から生じるものなどのその生成環境の汚染成分は、抗体の研究、診断、または治療用途に典型的には干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法によって決定される抗体の９５重量％超まで、および一部の実施形態では、９９重量％超まで、（１）回転カップシークエンサーの使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーまたは銀染色を使用した非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均質性まで精製される。抗体の天然環境の少なくとも一つの構成要素が存在しないため、単離された抗体は、組換え細胞内でｉｎ ｓｉｔｕで抗体を含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドまたは抗体は、少なくとも一つの精製ステップによって調製される。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能な天然発生型変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖でＣ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基は、重鎖および／または軽鎖のＣ末端で切断される。一部の実施形態では、Ｃ末端切断は、重鎖からＣ末端リジンを除去する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖でＮ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基は、重鎖および／または軽鎖のＮ末端で切断される。一部の実施形態では、モノクローナル抗体の短縮型形態は、組換え技術によって作製され得る。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に配向されている。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、複数の抗原部位（例えば、二重特異性抗体または多重特異性抗体など）に配向されている。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体群から取得されたときの抗体の特徴を示すが、任意の特定の方法による抗体の生成が必要とはみなされないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ提示技術、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部もしくはすべてまたはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を生成するための技術を含む、様々な技術によって作製され得る。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「全抗体」という用語は、抗体断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すように互換的に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。一部の場合では、インタクトな抗体は、一つまたは複数のエフェクター機能を有してもよい。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、例えば、抗原結合領域および／またはインタクトな抗体の可変領域、および／またはインタクトな抗体の定常領域を含む。抗体断片の例としては、抗体のＦｃ領域、Ｆｃ領域の一部、またはＦｃ領域を含む抗体の一部が挙げられる。抗原結合抗体断片の例としては、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；線形抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｈ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２［１９９５］を参照されたい）；一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。単一の重鎖抗体または単一の軽鎖抗体は、操作することができ、または重鎖の場合には、単一の重鎖分子を生成するように操作されたラクダ、サメ、ライブラリ、またはマウスから単離することができる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残留「Ｆｃ」断片とを生成した。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖（ＶＨ）の可変領域ドメイン、および一つの重鎖（ＣＨＩ）の第一の定常ドメインとともに、Ｌ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、異なる抗原結合活性を有する二つのジスルフィド結合したＦａｂ断片にほぼ対応する単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片を産出し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一つまたは複数のシステインを含むＣＨＩドメインのカルボキシ末端に数個の追加の残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学結合もまた公知である。Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持される両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域内の配列およびグリカンによって決定され、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域は、ある特定の細胞型上に見られる。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、それらの配列を整列させ、必要であればギャップを導入して配列同一性の最大パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮していない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内にある種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されている入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較する配列の完全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、ある一定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと代替的に称され得る）は、以下のように計算される。
１００×画分Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、そのプログラムのＡおよびＢの整列における配列によって同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ａ対Ｂのアミノ酸配列同一性％は、Ｂ対Ａのアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されよう。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃｌｑ結合および補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、分子（例えば、サイトカイン）およびその結合パートナー（例えば、サイトカイン受容体）の単一結合部位間の非共有結合相互作用の強度を指す。一部の実施形態では、結合タンパク質（例えば、サイトカイン）の親和性は、概して、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。
本明細書のサイトカインポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、それが生成された環境で通常関連する少なくとも一つの汚染核酸分子から識別および分離される核酸分子である。一部の実施形態では、単離された核酸は、生成環境と関連付けられたすべての構成要素と無関連である。本明細書のポリペプチドおよびサイトカインポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態または環境以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書のポリペプチドおよびサイトカインポリペプチドをコードする核酸と区別される。
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が効果的であることを可能にするような形態であり、かつ製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の構成要素を含まない、調製物を指す。
かかる製剤は滅菌されている。
本明細書で使用される場合、「担体」は、用いられる用量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に非毒性である薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を含む。生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化物質；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、臨床病理の経過中に治療されている個体または細胞の自然経過を変えるように設計された臨床介入を指す。治療の望ましい効果には、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善または緩和、ならびに寛解または予後の改善が含まれる。個体は、例えば、障害（例えば、新生物性疾患）に関連する一つまたは複数の症状が軽減または除去される場合、首尾よく「治療される」。例えば、治療が、疾患を患う個体の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の減少、疾患の再発頻度の低減、疾患の重症度の低減、疾患の発症もしくは進行の遅延、および／または個体の生存の延長をもたらす場合、個体は、首尾よく「治療される」。
本明細書で使用される場合、「と併用して」または「と組み合わせて」は、別の治療モダリティに加えて、一つの治療モダリティの投与を指す。したがって、「と併用して」または「と組み合わせて」は、個体への他の治療モダリティの投与の前、その間、またはその後の、一つの治療モダリティの投与を指す。
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、個体における疾患の発生または再発に関して予防を提供することを含む。個体は、障害の素因がある、障害にかかりやすい、または障害を発症するリスクがあるが、障害と診断されていない。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインを使用して、障害の発症を遅らせる。
本明細書で使用される場合、障害を発症する「リスクがある」個体は、検出可能な疾患または疾患の症状を有してもよく、または有さなくてもよく、本明細書に記載される治療方法の前に、検出可能な疾患または疾患の症状を示していても、または示さなくてもよい。「リスクがある」とは、当該技術分野で公知であるように、個体が、疾患の発症と相関する測定可能なパラメータである一つまたは複数のリスク因子を有することを示す。これらのリスク因子のうちの一つまたは複数を有する個体は、これらのリスク因子のうちの一つまたは複数を有しない個体よりも、障害を発症する確率が高い。
「有効量」は、少なくとも、治療結果または予防的結果を含む、所望のまたは示された効果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を指す。
有効量は、一つまたは複数の投与で提供され得る。「治療有効量」は、少なくとも、特定の障害の測定可能な改善をもたらすために必要な最小濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力に応じて変化し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果がマスクされたサイトカインの任意の毒性または有害な効果を上回る量であり得る。「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を指す。典型的には、必ずしもではないが、予防用量は、疾患の前または早期の段階の対象において使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少なくてもよい。
「慢性的」投与は、長期間にわたる初期治療効果（活性）を主流にするように、急性モードとは対照的に、連続での薬剤の投与を指す。「断続的」投与は、中断することなく連続的に行われるのではなく、むしろ本質的に周期的である治療である。
本明細書で使用される場合、「個体」または「対象」は、哺乳動物である。治療の目的のための「哺乳動物」には、ヒト、家畜および農場動物、ならびにイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどの動物園、スポーツ、またはペット動物が含まれる。一部の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
９．実施例
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のためのみであり、それを考量したその様々な修飾または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および目的、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが理解されるべきである。
一部の実施例は、ポリペプチド構築物の「マスクされた」バージョンの工学、生産、および／または試験を記載するが、一部の実施例は、比較のためなどのポリペプチド構築物の親の「マスクされていない」バージョン、または比較のための対照として試験される本明細書に記載の構成要素の一つまたは複数を含む他の構築物も採用する。したがって、例えば、マスクされたポリペプチド構築物に対して行われた試験の説明は、構築物のマスクされていないバージョンも試験されなかったことを必ずしも意味するものではない。
実施例１：マスクされたＩＬ－２ポリペプチドの操作
マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、本明細書の教示に従って生成される。その後の実施例では、一部の実験は、単量体形態のマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の使用を含み、一部の実験は、例えば、同じマスクされたポリペプチド構築物の二つのコピーを連結するジスルフィド結合を介して形成される二量体（ホモ二量体）、または二つの異なるポリペプチドによって形成されるヘテロ二量体などの、二量体形態のマスクされたＩＬ－２構築物の使用を含む（例えば、表５を参照）。
ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片、マスキング部分、および抗体またはその断片（例えば、Ｆｃ領域、重鎖、および／または軽鎖）などの半減期延長部分を含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物が生成される。一部のＩＬ－２ポリペプチド構築物はまた、マスキング部分も含まない半減期延長部分に連結されたＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片を含むものも生成される。構築物の一部はまた、切断可能なペプチドを含み、マスキング部分をＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片に連結し、それによって活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物をもたらすリンカーを含む。構築物の一部はまた、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片を半減期延長ドメインに連結するリンカーを含む。構築物の一部はまた、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片をマスキング部分に連結するリンカーを含む。ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片をマスキング部分に連結するリンカー内に切断可能なペプチドを含まないマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、切断可能なペプチドを含まないため、活性化不可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物または活性化不可能なＩＬ－２ポリペプチド構築物とも呼称される。例示的なＩＬ－２ポリペプチド構築物の構造および組成物を表３に提供する。
Figure 2023553323000090
また、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片、第一のマスキング部分、第二のマスキング部分、およびアルブミン、抗体またはその断片（例えば、Ｆｃ領域、重鎖、および／または軽鎖）、アルブミン結合ペプチド、ＩｇＧ結合ペプチド、またはポリアミノ酸配列などの半減期延長部分を含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物が生成される。構築物の一部はまた、第一のマスキング部分をＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片に連結するリンカーを含む。構築物の一部はまた、第二のマスキング部分をＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片に連結するリンカーを含む。構築物の一部は、第一のマスキング部分をＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片に連結するリンカー、および／または第二のマスキング部分をＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片に連結するリンカー内に切断可能なペプチドを含み、それによって活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物をもたらす。構築物の一部はまた、第二のマスキング部分を半減期延長部分に連結するリンカーを含む。ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片を第一のマスキング部分または第二のマスキング部分に連結するリンカーのいずれにも切断可能なペプチドを含まないマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、切断可能なペプチドを含まないため、活性化不可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物または活性化不可能なＩＬ－２ポリペプチド構築物とも呼称される。例示的なＩＬ－２ポリペプチド構築物の構造および組成物を表４に提供する。
Figure 2023553323000091
また、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片、マスキング部分、第一の半減期延長部分、および第二の半減期延長部分、抗体またはその断片（例えば、Ｆｃ領域、重鎖、および／または軽鎖）を含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物が生成される。マスキング部分は、第一の半減期延長部分に連結され、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片は、第二の半減期延長部分に連結され、第一の半減期延長部分および第二の半減期延長部分は、第一および第二の半減期延長部分の会合を促進する修飾を含有する。一つの例示的な実施形態では、マスキング部分は、第一の半減期延長部分に連結され、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片は、第二の半減期延長部分に連結され、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、第一の半減期延長部分および第二の半減期延長部分は、第一および第二の半減期延長部分の会合を促進する修飾を含有する。マスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物の一つの例示的な実施形態では、実施形態は、第一の半減期延長部分に連結されたＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片を含み、第二の半減期延長部分を含み、ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片は、第一の半減期延長部分に連結され、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、第二の半減期延長部分は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。構築物の一部はまた、マスキング部分を第一の半減期延長部分に連結するリンカー、および／またはＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片を第二の半減期延長部分に連結するリンカーを含む。一部の構築物の第一および第二の半減期延長部分も連結されている。一部の構築物では、一部の構築物の第一および第二の半減期延長部分はリンカーによって連結されている。構築物の一部は、マスキング部分を第一の半減期延長部分に連結するリンカー、および／またはＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片を第二の半減期延長部分に連結するリンカー内に切断可能なペプチドを含み、それによって活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物をもたらす。ＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片を第二の半減期延長部分に連結するリンカー、またはマスキング部分を第一の半減期延長部分に連結するリンカーのいずれかに切断可能なペプチドを含まないマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、切断可能なペプチドを含まないため、活性化不可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物または活性化不可能なＩＬ－２ポリペプチド構築物とも呼称される。例示的なＩＬ－２ポリペプチド構築物の構造および組成物を表５に提供する。
Figure 2023553323000092
Figure 2023553323000093
Figure 2023553323000094
実施例２：マスクされたＩＬ－２ポリペプチドのインビトロ特性評価
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、インビトロでいくつかの細胞アッセイおよび機能アッセイを使用して特徴付けられる。
産生
構築物（例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物）をコードするプラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１４５２７）またはＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、ＮＲＣ）のいずれかにトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、１１５－１００）を使用して、全ＤＮＡと１：１の比率で、１ｍｇの全ＤＮＡを用いて実施した。ＤＮＡおよびＰＥＩをそれぞれ５０ｍＬのＯｐｔｉＭｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３１９８５０８８）培地に添加し、滅菌濾過した。ＤＮＡおよびＰＥＩを１０分間合わせて、Ｅｘｐｉ２９３細胞またはＨＥＫ２９３細胞の細胞密度がそれぞれ、１．８～２．８ ｘ １０６細胞／ｍＬまたは０．８５～１．２０ ｘ １０６細胞／ｍで、生存率が少なくとも９５％になるようにＥｘｐｉ２９３細胞に添加した。ＨＥＫ２９３－６Ｅトランスフェクションは、Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクションに使用されたのと同じプロトコルに従って、細胞密度および生存率が少なくとも９５％で実施された。５～７日後、細胞を、３０００×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を０．２μｍの膜を通して濾過した。タンパク質Ａ樹脂（ＣａｐｔｉｖＡ、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ ＣＡ－ＰＲＩ－０００５）を、濾過された上清に加え、振とうしながら４℃で少なくとも２時間インキュベートした。樹脂をカラムに充填し、１５カラム体積の２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．５で洗浄し、次いで１５カラム体積の２０ｍＭクエン酸塩、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で洗浄した。結合タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．９でカラムから溶出した。
親（例えば、マスクされていない）およびマスクされた構築物を含む、生成された例示的構築物の力価（ｍｇ／Ｌ）を、以下の表６に提供する。
Figure 2023553323000095
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、タンパク質サンプルを４ｘＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１６１０７４７）で作製した。還元されたサンプルについては、０．１ＭのＢｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ７７７２０）を加え、サンプルを６５°Ｃで５分間加熱した。１２ウェルのＮｕＰａｇｅ ４～１２ ％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０３２２ＢＯＸ）に、ウェル当たり４μｇのタンパク質を装填した。ゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ６０６５）を使用して染色した。
図４に示すように、例示的な構築物（ＡＫ３０４、ＡＫ３０５、ＡＫ３０７、ＡＫ３０８、ＡＫ３０９、ＡＫ３１０、ＡＫ３１１、ＡＫ３１２、ＡＫ３１３、ＡＫ３１４、およびＡＫ３１５）の製造および精製後のフロースルー（ＦＴ）サンプル（すなわち、タンパク質Ａカラムに結合しなかったタンパク質）および溶出（Ｅ）サンプル（すなわち、タンパク質Ａカラムに結合し、そこから溶出されたタンパク質）に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を実施した。この例示的なデータは、本明細書に記載される構築物が、正常に生成および精製され得ることを示す。
レポーターバイオアッセイ
レポーターバイオアッセイは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物、ならびにマスクされていない親構築物または他の対照で実施され、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路などの下流経路の活性化を監視する。
一部の研究では、以下の方法に従って、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の活性化を試験した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２細胞継代６（ｐ６）（９７％生存）を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％の熱不活化ＦＢＳ）で２回洗浄し、１５０ｕＬのアッセイ培地中に５ｅ４細胞／ウェルで３回播種し、アッセイ培地中で約２時間静置して、プレートに付着させた。試験された各構築物を、アッセイ培地中で３００ｐＭに希釈し、次いでプレートを１：２に希釈した。各希釈を５０ｕＬ添加し、最終開始濃度７５ｐＭとした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２細胞上清を２４時間後に回収し、Ｑｕａｎｔｉｂｌｕｅ（１８０ｕＬ ＋ ２０ｕＬ上清）に、３ウェル／プレートのアッセイ培地を加えて３７°Ｃで１時間インキュベートした。Ｂｉｏｔｅｋ Ｎｅｏ２を使用して、６２５ｎｍで吸光度を読み取った。
一部の研究では、以下の方法に従って、ＣＴＬＬ２細胞を使用して、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の活性化を試験した。ＣＴＬＬ２細胞を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩにウェル当たり４０，０００細胞で播種した。対象構築物の希釈を加え、３７度でインキュベートした。６時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を加え、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダーで発光を測定した。
受容体結合
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合が評価される。ＥＬＩＳＡプレートは、受容体サブユニット、例えばＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５とも呼ばれる）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２とも呼ばれる）、またはＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２とも呼ばれる）、またはそれらの組み合わせで被覆される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の希釈は、受容体サブユニットに結合することができ、抗ｈｕＦｃ－ＨＲＰ検出抗体を使用して検出される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合は、プロテアーゼ切断を伴う、または伴わない条件下で決定される。
オンセル受容体結合
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のオンセル受容体結合が評価される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の希釈は、ＣＴＬＬ２細胞などの末梢血リンパ球または組織培養細胞に結合することができ、抗ｈｕＦｃ－ＦＩＴＣまたは抗アルブミン－ＦＩＴＣ検出抗体を使用した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって検出される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合は、プロテアーゼ切断を伴う、または伴わない条件下で決定される。
受容体結合親和性
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合親和性が評価される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合親和性は、プロテアーゼ切断を伴う、または伴わない条件下で決定される。
マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物およびマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合を試験するＳＰＲ研究のために、ライヘルトカルボキシメチルデキストランハイドロゲル表面センサーチップを、ＥＤＣおよびＮＨＳによるアミンカップリングを介して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で３０ｕｇ／ｍｌの対象構築物（例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物またはマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物）で被覆し、固定した。ＰＢＳＴ中のＣＤ２５－ＦｃまたはＦｃ－ＣＤ１２２の希釈（ＣＤ２５：１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭおよびＣＤ１２２：５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭ）を調製した。ライヘルト４チャネルＳＰＲを使用して、ＣＤ２５またはＣＤ１２２の希釈液を、構築物を固定したクリップ上に流し、２５°Ｃでのオンレートを決定した。平衡状態（約３分）でフロー緩衝液をＰＢＳＴに変更し、６分間にわたってオフレートを決定した。各実行の間に、チップを１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０で再生した。
図５Ａ～図５Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１６８）のＣＤ２５－Ｆｃへの結合を試験したＳＰＲ分析を使用して、そのアルファ受容体への結合を防止するＩＬ－２上の変異の有効性を示す。図５Ａは、ＡＫ１６８とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図５Ｂは、ＭＭＰで活性化されたＡＫ１６８とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図５Ｃは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）対照とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示す。図５Ｄは、各相互作用について、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、ならびにＣｈｉ２値およびＵ値について取得されたデータを要約した表を提供する。これらの結果は、この例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１６８）が、ＣＤ２５－Ｆｃへの検出可能な結合を示さなかった一方で、野生型ｒｈＩＬ－２対照は、検出可能な結合を示したことを実証している。
図６Ａ～図６Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１１１）のＣＤ１２２－Ｆｃへの結合を試験したＳＰＲ分析を使用して、そのベータ受容体に対するＩＬ－２のマスキング、ならびにプロテアーゼによる活性化後の結合の回復を示す。図６Ａは、ＡＫ１１１とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図６Ｂは、ＭＭＰで活性化されたＡＫ１１１とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図６Ｃは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）対照とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示す。図６Ｄは、各相互作用について、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、ならびにＣｈｉ２値およびＵ値について取得されたデータを要約した表を提供する。これらの結果は、この例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１１１）が、プロテアーゼで活性化されない限り、ＣＤ１２２－Ｆｃへの検出可能な結合を示さなかった一方で、ｒｈＩＬ－２対照は、検出可能な結合を示したことを実証している。追加的な例示的なＳＰＲデータは、マスクされた構築物およびマスクされていない構築物を含む、試験された様々な構築物について、以下の表７に提供される。一部の構造については、該当する場合、ＫＤは、プロテアーゼによって以前に切断されている、または切断されていない構築物について決定した。
Figure 2023553323000096
切断
マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の切断率は、プロテアーゼの存在下または非存在下で、および存在する場合、プロテアーゼと共に、マスクされたＩＬ－２ペプチド構築物のインキュベーション後、ＥＤＴＡの添加などにより様々な時点で不活化した状態で、上述のように、受容体結合アッセイを実施することによって評価される。切断率はまた、還元および非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、および質量分析による全質量およびペプチドマップ分析を用いて評価される。切断率はまた、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物が、ヒト、マウス、またはカニクイザルの末梢血リンパ球、または正常なヒト組織もしくはヒト腫瘍組織に曝露されるエクスビボアッセイを使用して評価される。
一部のプロテアーゼ活性化研究では、ＭＭＰ１０をＭＭＰ切断緩衝液で５０ｎｇ／ｕＬに希釈し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７°Ｃで２時間活性化した。活性化プロテアーゼ５μＬ（合計２５０ｎｇ）を、１ｕＭのマスクされたサイトカイン構築物とインキュベートし、３７度で２時間インキュベートした。切断は、ＡｎｙｋＤ（商標）Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）タンパク質ゲルを使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価された。他のプロテアーゼによる切断を試験するために、同様の方法を取る。
図７Ａは、腫瘍環境に関連するプロテアーゼなど、プロテアーゼによる切断前（左）および切断後（右）のマスクされたＩＬ－２ポリペプチドの例示的な構造を示す。図７Ｂは、ＭＭＰ１０プロテアーゼの非存在下（左レーン）または存在下（右レーン）でインキュベートされた例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
増殖
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を用いた処理後の、ＣＴＬＬ２、ＹＴ、ＴＦ１Ｂ、ＬＧＬ、ＨＨ、およびＣＴ６などのＩＬ－２応答性組織培養細胞株の増殖が評価される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物が関与する実験では、細胞を、ＩＬ－２を欠く培地中で９６ウェルの組織培養プレートに２～４時間播種し、次いで様々な濃度のマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物で処理する。３７度で２４～４８時間インキュベーションした後、細胞数は、ＭＴＳ、アラマーブルー、ルシフェラーゼ、または類似の代謝検出試薬の添加、およびプレート分光光度計リーダーによって検出された比色、蛍光、またはルシフェラーゼの読み取り値によって決定される。
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を用いた処理後の免疫細胞の増殖も評価される。ヒト、マウス、またはカニクイザルの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、様々な濃度の構築物で処理され、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、および／またはＴｒｅｇ細胞などの細胞タイプの増殖は、特定の細胞タイプの染色、および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）による分析で決定される。一部の実験では、一部のＰＢＭＣは比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のＰＢＭＣは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。一部の実験では、ＮＫ細胞はＣＤ４５＋ ＣＤ３－ＣＤ５６＋として染色され、ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ８＋として染色され、ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５－として染色され、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦＯＸＰ３＋として染色される。一部の実験では、ＰＢＭＣは５日間処理される。一部の実験では、ＰＢＭＣはまた、細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７で染色される。一部の実験では、処理前にＰＢＭＣをＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、ＣＦＳＥ希釈の程度を決定することによって増殖を測定する。一部の実験では、各構築物、ならびにアルデスロイキンおよび／または他の対照は、０．０００１ｎＭ～５００ｎＭの範囲の一つまたは複数の濃度など、一つまたは複数の濃度で投与される。
ＳＴＡＴ５の活性化
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物による処理後のシグナル伝達性転写因子５（ＳＴＡＴ５）の活性化も評価される。ＰＢＭＣは、指定の期間、構築物で処理され、その後直ちに固定されて、ＳＴＡＴ５などのタンパク質のリン酸化状態を維持する。一部の実験では、一部のＰＢＭＣは比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のＰＢＭＣは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。一部の実験では、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を、プロテアーゼ切断（例えば、活性化）を伴う、または伴わない条件下で試験する。一部の実験では、ＰＢＭＣは、１０分、１５分、２０分、または２５分間、処理される。一部の実験では、各構築物、ならびにアルデスロイキンおよび／または他の対照は、０．０００１ｎＭ～５００ｎＭの範囲の一つまたは複数の濃度など、一つまたは複数の濃度で投与される。一部の実験では、固定および透過化ＰＢＭＣは、次いで、リン酸化ＳＴＡＴ５（ホスホ－ＳＴＡＴ５）に特異的な抗体で染色され、フローサイトメトリーによって分析される。一部の実験では、ＳＴＡＴ５の総レベルおよびリン酸化レベルが測定される。ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および／またはＴｒｅｇ細胞などの特定の細胞タイプのホスホ－ＳＴＡＴ５状態は、特定の細胞タイプの染色によって決定される。一部の実験では、ＮＫ細胞はＣＤ４５＋ ＣＤ３－ＣＤ５６＋として染色され、ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ８＋として染色され、ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５－として染色され、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦＯＸＰ３＋として染色される。
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物で処理後、ＣＴＬＬ－２細胞などのマウス細胞株におけるＳＴＡＴ５の活性化も評価される。一部の実験では、一部のＣＴＬＬ－２細胞は比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のＣＴＬＬ－２細胞は、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。一部の実験では、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を、プロテアーゼ切断（例えば、活性化）を伴う、または伴わない条件下で試験する。一部の実験では、ＣＴＬＬ－２細胞を１０分、１５分、２０分、または２５分間処理し、次いでＳＴＡＴ５などのタンパク質のリン酸化状態を保存するために固定する。一部の実験では、各構築物、ならびにアルデスロイキンおよび／または他の対照は、一つまたは複数の濃度で投与される。一部の実験では、ＳＴＡＴ５の総レベルおよびリン酸化レベルが測定される。
一部の研究では、ＩＬ－２によって誘導される細胞内ＳＴＡＴ５活性化（ｐＳＴＡＴ５シグナル）のレベルは、以下の方法によって決定された。凍結したヒトＰＢＭＣを水浴中で解凍し、３９ｍＬの予熱した培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％ ＮＥＡ）に添加し、回転させ、１０Ｅ６細胞／ｍＬの培地で再構成した。細胞を、９６ウェルプレート中のウェル細胞当たり５Ｅ５で播種した。培地中で希釈したＩＬ－２（例えば、ｒｈＩＬ－２または例示的なＩＬ－２含有ポリペプチド構築物）を各ウェルに添加し、３７ｏＣで２０分間インキュベートした。次いで細胞を、２００ｕｌ／ウェルの固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、４ｏＣで一晩固定した。遠心分離後、固定細胞を、２００ｕｌの冷たいＢＤ ＰｈｏｓＦｌｏｗ緩衝液中に再懸濁し、４°Ｃで３０分間インキュベートした。細胞を二回洗浄した後、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（染色緩衝液中のサンプル当たり合計５０ｕＬ中２．５ｕＬ）によって氷上で５分間処理した。染色抗体を添加し、５ｕｌ ｐＳＴＡＴ５－ＡＰＣ（ｐＹ６９４、ＢＤ）、１０ｕｌ ＣＤ５６－ＢＶ４２１（５．１Ｈ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、１０ｕｌ ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ａ１６１Ａ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および１０ｕｌ ＣＤ３－ＦＩＴＣ（ＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、氷上で３０分間、光から保護してインキュベートした。細胞を２回洗浄し、再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。
図８Ａ～図８Ｄは、例示的な構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０３５、ＡＫ０４１、または対照としてｒｈＩＬ－２を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化研究の結果を示す。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）は、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）について示されている。ＡＫ０３２およびＡＫ０３５構築物は、Ｆｃドメインに連結されたＩＬ－２ポリペプチドを含み、ＡＫ０４１構築物は、ＣＤ２５ドメインおよびＣＤ１２２ドメインに連結されたＩＬ－２ポリペプチドを含む。示されるように、操作されたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞の活性化を減少させ、一方でＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化を保持または強化することができる。
図９Ａ～図９Ｃは、例示的な構築物ＡＫ０８１およびＡＫ０３２を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化研究の結果を示す。ＭＭＰ１０への曝露歴の有無に関わらず、ＡＫ０８１構築物を試験した。アイソタイプ対照ならびにＩＬ－２陰性対照も試験した。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）は、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋ Ｔ細胞について示されている。ＡＫ０３２およびＡＫ０８１構築物は、Ｆｃドメインに連結されたＩＬ－２ポリペプチドを含み、ＡＫ０８１構築物は、ＩＬ－２ポリペプチドをＦｃドメインに接続するリンカーに切断可能なペプチド含む。示されるように、マスクされていない単量体ＡＫ０８１ ＩＬ－２ポリペプチド構築物は、マスクされていない二量体ＡＫ０３２ ＩＬ－２ポリペプチド構築物と同様に、プロテアーゼ活性化を伴う、または伴わないＰＢＭＣのＳＴＡＴ５活性化を刺激する。
図１０Ａ～図１０Ｄは、例示的な構築物ＡＫ０８１およびＡＫ１１１、ならびにｒｈＩＬ－２および抗ＲＳＶ抗体を含む対照を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。無処置対照も試験した。ＡＫ１１１構築物は、ＩＬ－２ポリペプチドの野生型を含むマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例である（Ｃ１２５Ａ変異を除く）。図１０Ａ～図１０Ｄに示すように、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１１１は、マスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ０８１と比較して、ＳＴＡＴ５活性化の減少を示した。図１０Ｄは、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１構築物、およびｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０（ｐＭ）および倍率変化データを提供する。
図１１Ａ～図１１Ｄは、例示的な構築物ＡＫ１６７およびＡＫ１６８、ならびにｒｈＩＬ－２および抗ＲＳＶ抗体を含む対照を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。無処置対照も試験した。ＡＫ１６８構築物は、ＣＤ２５結合を除去または低減するＩＬ－２ポリペプチドの変異型形態を含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例である。ＡＫ１６７構築物は、同じ変異型ＩＬ－２ポリペプチドを含むＡＫ１６８構築物の親のマスクされていない形態である。図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、マスクされていないＡＫ１６７構築物は、ｒｈｌＬ－２対照と比較してＳＴＡＴ５活性化の減少を示し、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１６８は、検出可能なＳＴＡＴ５活性化を誘導しなかった。図１１Ｄは、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８構築物、およびｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０（ｐＭ）および倍率変化データを提供する。ＡＫ１６８構築物のＥＣ５０は検出不可能であった（ｎ．ｄ．）。
図１２Ａ～図１２Ｄは、（＋ＭＭＰ１０）であったか、または以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、例示的な構築物ＡＫ１６５およびＡＫ１６６、ならびにアイソタイプ対照およびＩＬ－２－Ｆｃ対照を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化研究の結果を示す。ＡＫ１６６構築物は、ＩＬ－２ポリペプチドの野生型を含むマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例である（Ｃ１２５Ａ変異を除く）。ＡＫ１６５構築物は、同じＩＬ－２ポリペプチドを含むＡＫ１６６構築物の親のマスクされていない形態である。図１２Ａに示すキーは図１２Ｂにも適用され、図１２Ｃに示すキーは図１２Ｄにも適用される。図１２Ａ～図１２Ｄに示すように、ＳＴＡＴ５活性化は、マスクされたＡＫ１６６構築物（プロテアーゼ切断なし）では大幅に減少したが、活性化プロテアーゼＭＭＰ１０への曝露後にＩＬ２－Ｆｃ対照に似たレベルまで回復した。
図１３Ａ～図１３Ｃは、（＋ＭＭＰ１０）であったか、または以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、例示的な構築物ＡＫ１０９およびＡＫ１１０、ならびにアイソタイプ対照およびＩＬ－２－Ｆｃ対照を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化研究の結果を示す。ＡＫ１０９およびＡＫ１１０構築物は、異なるヘテロ二量体化変異を有する半減期延長部分を含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例である。図１３Ｂに示すキーは図１３Ａにも適用される。図１３Ａ～図１３Ｃに示すように、ＳＴＡＴ５活性化は、マスクされたＡＫ１０９およびＡＫ１１０構築物（プロテアーゼ切断なし）では大幅に減少したが、活性化プロテアーゼＭＭＰ１０への曝露後にＩＬ２－Ｆｃ対照に近づくレベルまで大幅に増加した。
図１４Ａ～図１４Ｄは、構築物ＡＫ２１１、ＡＫ２３５、ＡＫ２５３、ＡＫ３０６、ＡＫ３１０、ＡＫ３１４、およびＡＫ３１６、ならびにｒｈＩＬ－２対照を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。これには、ＣＤ２５結合を調節する様々な変異を含む、親のマスクされていない構築物（ＡＫ２３５、ＡＫ２５３、ＡＫ３０６、ＡＫ３１０、ＡＫ３１４）である構築物が含まれる。図１４Ｄは、試験された構築物の各々、およびｒｈＩＬ－２対照についてのＥＣ５０データを提供する。
図１５Ａ～図１５Ｄは、プロテアーゼによって活性化された構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１６７、ＡＫ２１６、ＡＫ２１８、ＡＫ２１９、ＡＫ２２０、およびＡＫ２２３、ならびにｒｈＩＬ－２対照を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。無処置対照も試験した。これには、ＣＤ２５結合を調節する様々な変異を含むマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ２１６、ＡＫ２１８、ＡＫ２１９、ＡＫ２２０、およびＡＫ２２３）が含まれる。構築物は、ＳＴＡＴ５を活性化する能力を試験する前に、活性化プロテアーゼに事前に曝露された。図１５Ｄは、試験された構築物の各々、およびｒｈＩＬ－２対照についてのＥＣ５０データを提供する。
図１６Ａ～図１６Ｃは、構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、およびＡＫ２１０、ならびに抗ＲＳＶ対照を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。これには、Ｃ１２５Ａ変異を有するＩＬ－２ポリペプチドを含み、同じ切断可能なペプチド配列（ＲＡＡＡＶＫＳＰ；配列番号２７）を含むが、プロテアーゼ切断配列のＮ末端上のアミノ酸残基の違いにより異なるリンカー配列を有する、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、ＡＫ２１０）が含まれる。図１６Ａに示すキーは図１６Ｂおよび図１６Ｃにも適用される。
図１７Ａ～図１７Ｃは、構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、およびＡＫ１９３、ならびに抗ＲＳＶ対照を使用した、上述のＳＴＡＴ５活性化試験の結果を示す。これには、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、およびＣ１２５Ａ変異を有するＩＬ－２ポリペプチドを含み、同じ切断可能なペプチド配列（ＲＡＡＡＶＫＳＰ；配列番号２７）を含むが、プロテアーゼ切断配列のＮ末端上のアミノ酸残基の違いにより異なるリンカー配列を有する、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、ＡＫ２１０）が含まれる。図１７Ａに示すキーは図１７Ｂおよび図１７Ｃにも適用される。
実施例３： マスクされたＩＬ－２のインビボ特性評価
薬物動態
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の薬物動態が、マウスモデルを使用してインビボで評価される。
マウスは、構築物で静脈内、腹腔内または皮下処置され、血漿中の構築物の濃度が経時的に測定される。一部の実験では、一部のマウスは比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のマウスは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。一部の実験では、治療されるマウスは腫瘍を有する。一部の実験では、治療されるマウスは腫瘍を有さない。一部の実験では、マウスを構築物で処理し、治療過程にわたって様々な時点で血液を採取するが、これには、治療開始前に血液を採取し、血漿を得るためにそれを処理することが含まれ得る。一部の実験では、血液は、二週間、三週間、または四週間またはそれ以上の治療の過程にわたって、様々な時点で採取される。一部の実験では、投与された構築物、ならびにアルデスロイキンおよび／または他の対照の平均血漿濃度が測定される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、ＩＬ－２－およびヒトＦｃ特異的ＥＬＩＳＡを用いてＰＢＳ Ｔｗｅｅｎに希釈された後、血漿サンプルで検出され、各構築物に対して生成された標準曲線を使用して定量化される。完全長および切断された構築物の割合は、抗ｈｕＦｃ－ＨＲＰおよび抗ｈｕＩＬ－２－ＨＲＰを用いたウェスタンブロット、ならびに全質量およびペプチド質量分析によって決定される。
腫瘍内のマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の薬物動態も、マウスモデルを使用してインビボで評価される。腫瘍を有するマウスを、構築物で静脈内または皮下処置し、マウスの腫瘍における構築物の濃度を評価する。一部の実験では、一部のマウスは比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のマウスは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。腫瘍は、構築物の存在ならびに特定のプロテアーゼの存在について分析される。一部の実験では、腫瘍は、完全長および切断された構築物の存在および割合について分析される。
一部の薬物動態試験は、以下の方法に従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスは、ＰＢＳ中の対象構築物（例えば、マスクされていない親ＩＬ－２ポリペプチド構築物、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物、または切断不可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物）の２ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与を受けた。試験された構築物としては、例えば、ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、およびＡＫ２１１が挙げられる。投与後５分、１日目、２日目、および５日目に血漿を採取した。薬物レベルは、捕捉抗体および様々な検出抗体として、抗ヒトＩｇＧ（クローンＭ１３１０Ｇ０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を利用したＥＬＩＳＡを使用して決定された。ヒトＩｇＧ（ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ）またはＣＤ１２２（クローン９Ａ２、Ａｎｃｅｌｌ）およびＩＬ－２（Ｐｏｌｙ５１７６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するＨＲＰまたはビオチン結合検出抗体を利用して、それぞれ総薬物レベルおよび非切断薬物レベルを検出した。
図１８Ａ～図１８Ｄは、構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、およびＡＫ１６８、ならびに抗ＲＳＶ対照を使用して腫瘍担持マウスで、上述のように実施された薬物動態研究の結果を表す。図１８Ａは、試験された各構築物の構造の単純な描写を提供する。示されるように、ＡＫ１１１およびＡＫ１６８は、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例である。ＡＫ１６７およびＡＫ１６８構築物は、ＣＤ２５への結合を排除または低減する変異（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａ）を含む。図１８Ａは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１８Ｃは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって、血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１８Ｄは、ヒトＩＬ－２を検出することによって、血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
図１９Ａ～図１９Ｄは、構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、およびＡＫ２１１、ならびに抗ＲＳＶ対照を使用して腫瘍担持マウスで、上述のように実施された薬物動態研究の結果を表す。図１９Ａは、試験された各構築物の構造の単純な描写を提供する。示されるように、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、およびＡＫ２０９は、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例であり、各々が、ＩＬ－２ポリペプチドを半減期延長部分に接続するリンカー中に異なる切断可能なペプチド配列を含む。図１９Ｂは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｃは、ヒトＩＬ－２を検出することによって、血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｄは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって、血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。図１９Ｂ、図１９Ｃおよび図１９Ｄに示すように、血漿中のＦｃレベル、Ｆｃ－ＩＬ２レベル、およびＦｃ－ＣＤ１２２レベルは、試験されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物間で類似している。
マウスにおける生物活性
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のインビボでの生物活性が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスなどのマウスモデルを使用してインビボで評価される。マウスを構築物で処理し、インビボでの生物活性を評価する。一部の実験では、一部のマウスは比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のマウスは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。一部の実験では、治療されるマウスは腫瘍を有する。一部の実験では、治療されるマウスは腫瘍を有さない。一部の実験では、免疫細胞の用量依存性拡大がマウスで評価される。一部の実験では、マウスは、構築物、アルデスロイキン、または他の対照の様々な用量で処置される。一部の実験では、マウスは二週間にわたって処置される。様々な時点でマウスから血液を採取し、次いで対象の免疫細胞マーカーに対する抗体を使用して染色する。一部の実験では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞などの特定の循環細胞タイプの増殖および拡大の縦断的動態、ならびにＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞とＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ細胞との比率も決定される。一部の実験では、マウスは、器官の湿重量および組織学によって決定される肺および肝臓などの特定の器官における浮腫およびリンパ球浸潤を評価することによって、血管漏出について評価される。
一部の研究では、ＩＬ－２ベースの療法によって媒介される潜在的な毒性関連効果を評価するために、以下の方法を実施することによって血管漏出を評価した。反復投与毒性試験は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したＣ５７ＢＬ／６メスマウスを使用して実施し、試験開始時に８～１０週齢で１８～２２グラムの体重であった。５匹のマウスの群は、ＰＢＳ中のマスクされたＩＬ－２構築物およびマスクされていないＩＬ－２構築物を毎日腹腔内注射で４日間または５日間受けた。試験された構築物は、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、およびＡＫ１６８であった。対照抗体も、対照として投与された。最終投与の二時間後、すべてのマウスは、ＰＢＳ中、０．１ｍｌの１％エバンスブルー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ２１２９）の静脈内注射を受けた。エバンスブルー投与の二時間後、マウスを麻酔し、ＰＢＳ中１０Ｕ／ｍｌのヘパリンで灌流した。脾臓、肺、および肝臓を採取し、３ｍｌの４％ＰＦＡに４°Ｃで２日間固定した後、エバンスブルーの血管漏出の指標としてＮａｎｏＤｒｏｐ ＯｎｅＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて６５０ｎｍでの上清の吸光度を測定した。固定された器官をパラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。病理組織学的研究および定量化は、ＮｏｖｏＶｉｔａ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＬＬＣ （マサチューセッツ州、オールストン）によって、標準手順に従って実施された。図２５Ａ～図５０Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１１１およびＡＫ１６８、ならびにマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ０８１およびＡＫ１６７、ならびに抗ＲＳＶ対照を使用して血管漏出を評価するために上述のインビボ研究の結果を示す。図２５Ａは、体重減少の割合（％）を示し、図２５Ｂ、図２５Ｃおよび図２５Ｄはそれぞれ、肝臓、肺、および脾臓の重量をグラムでそれぞれ示す。
組織への色素漏出の程度を測定することによって示されるような血管漏出も、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、およびＡＫ１６８構築物について、抗ＲＳＶ対照と共に評価し、結果を肝臓および肺についてそれぞれ、図２６Ａおよび図２６Ｂに示す。色素漏出の程度を、６５０ｎｍでの吸光度に基づいて測定した。
肝臓および肺への単核球血管周囲浸潤の程度を測定することによって示されるような血管漏出も、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、およびＡＫ１６８構築物について、抗ＲＳＶ対照と共に評価し、結果を肝臓および肺についてそれぞれ、図２７Ａおよび図２７Ｂに示す。肝臓の単核球の平均数（図２７Ａ）、および肺の単核球の平均数（図２７Ｂ）をそれぞれ図示した。図２７Ｂに示すように、例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１１１およびＡＫ１６８は、マスクされていない構築物ＡＫ０８１およびＡＫ１６７とは異なり、肺における検出可能な数の単核球をもたらさなかった。
浸潤免疫細胞表現型
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物で処置されたマウスモデルにおいて、インビボで腫瘍を浸潤する免疫細胞の表現型が評価される。マウスを構築物で処理し、腫瘍浸潤性免疫細胞の表現型を評価する。一部の実験では、一部のマウスは比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のマウスは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。腫瘍担持マウスは、構築物、アルデスロイキン、または別の対照で治療され、腫瘍、肝臓、肺、および脾臓などの組織、ならびに血液は、初回投与の５日後、７日後、または１０日後など、初回投与後の様々な時点で採取される。一部の実験では、免疫細胞は、腫瘍、組織、および血液から単離され、フローサイトメトリーを使用して表現型評価の対象となる。一部の実験では、単離された免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞などの対象マーカーを使用して評価される。
一部の研究では、インビボでの免疫細胞浸潤性腫瘍の表現型を、以下の方法を用いて評価した。Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスは、ＰＢＳ中の対象構築物（例えば、マスクされていない親ＩＬ－２ポリペプチド構築物、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物、または切断不可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物）の２ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与を受けた。５日目に、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、腫瘍、肝臓、脾臓、および血液を採取した。細胞懸濁液を、機械的破砕と４０μｍの細胞ストレーナーを通過させることにより脾臓から調製した。腫瘍組織を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ カタログ番号１３０－０９６－７３０）を使用して酵素的に消化し、機械的解離ステップにｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した。脾臓中の赤血球、ならびに腫瘍細胞懸濁液および血液を、ＡＣＫ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号Ａ１０４９２）を使用して溶解した。細胞懸濁液を、以下の抗体で染色した：ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＭ－４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＦＯＸＰ３（ＭＦ－１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５（３Ｃ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４４（クローンＩＭ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＮＫｐ４６（２９Ａ１．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメーター（Ｍｉｌｅｎｙｉ）でデータ取得を行い、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。
ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、およびＡＫ１６８構築物、ならびに抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、上述のように実施された、脾臓、血液、および腫瘍におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、およびＴｒｅｇの割合のインビボ応答を試験した研究の結果を、図２０Ａ～図２０Ｌに示す。ＡＫ１１１およびＡＫ１６８は、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例である。
ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、およびＡＫ２１１構築物、ならびに抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、上述のように実施された、脾臓、血液、および腫瘍におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、およびＴｒｅｇの割合のインビボ応答を試験した研究の結果を、図２１Ａ～図２１Ｌに示す。ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、およびＡＫ２０９は、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例であり、各々が、ＩＬ－２ポリペプチドを半減期延長部分に接続するリンカー中に異なる切断可能なペプチド配列を含む。切断不可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して統計解析を実施した。
ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、およびＡＫ２１１構築物を使用して、上述のように実施された、脾臓、血液、および腫瘍におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、およびＴｒｅｇの割合のインビボ応答を試験した研究の結果を、図２２Ａ～図２２Ｌに示す。ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、およびＡＫ１９０は、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の例であり、各々が、ＩＬ－２ポリペプチドを半減期延長部分に接続するリンカー中に切断可能なペプチド配列を含む。リンカー配列はまた、利用されるリンカー配列に応じて、これらの構築物間で異なる。ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、およびＡＫ２１０は、Ｃ１２５Ａ変異を有するＩＬ－２ポリペプチドを含み、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、およびＡＫ１９３は、Ｃ１２５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａ変異を有するＩＬ－２ポリペプチドを含む。ＡＫ２３５構築物はマスクされていない構築物であり、ＡＫ２１１構築物は切断不可能なリンカー配列を含む。切断不可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して統計解析を実施した。
上述のように、ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、およびＡＫ２１１構築物を使用して、上述のように実施された、脾臓、血液、および腫瘍におけるインビボでのＴ細胞活性化を試験した研究の結果を、図２３Ａ～図２３Ｉに示す。Ｔ細胞活性化は、脾臓、血液、および腫瘍のＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、またはＦｏｘｐ３＋細胞におけるＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定された。切断不可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して統計解析を実施した。
インビボ切断
マスクされたＩＬ－２サイトカイン構築物のインビボでの切断が評価される。一部の研究では、対照抗体が比較のために投与される。一部の研究では、インビボでの切断は、マウスにおいて対象の構築物を投与し、一定期間後、ヒトＩｇＧを捕捉し、次いで例えば、ヒトＩｇＧ、ＣＤ１２２、およびＩＬ－２のレベルを測定することによって評価される。
マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のインビボでの切断を試験するいくつかの研究では、薬物レベル（すなわち、切断副産物を含む、投与された構築物のレベル）を、抗ヒトＩｇＧ（クローンＭ１３１０Ｇ０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を捕捉抗体とし、様々な検出抗体を利用するＥＬＩＳＡを使用して決定した。ヒトＩｇＧ（ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ）またはＣＤ１２２（クローン９Ａ２、Ａｎｃｅｌｌ）およびＩＬ－２（Ｐｏｌｙ５１７６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するＨＲＰまたはビオチン結合検出抗体を利用して、それぞれ総薬物レベルおよび非切断薬物レベルを検出した。切断および放出されたＩＬ－２の濃度を、総薬物濃度から切断されていないもの（すなわち、インタクト）を差し引くことによって計算する。図２４Ａ～図２４Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１６８（切断可能なペプチド配列：ＭＰＹＤＬＹＨＰ、配列番号２４）およびＡＫ２０９（切断可能なペプチド配列：ＶＰＬＳＬＹ、配列番号２８）のインビボ切断を試験した研究の結果を示す。ＡＫ１６７構築物は、マスクされたＡＫ１６８構築物と同じＩＬ－２ポリペプチドを含む切断可能なマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物である。図２４Ａ～図２４Ｄに示すように、マスクされた（ＡＫ１６８およびＡＫ２０９）構築物およびマスクされていない（ＡＫ１６７）構築物の両方を効果的に切断し、両方の切断可能なペプチド配列を切断した。図２４Ｅは、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、およびＡＫ２０９構築物の合計レベル、ならびに各構築物の非切断形態のレベルについて、総血漿ＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）の薬物動態研究の結果を示す。
腫瘍の根絶および転移の阻害
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物が、腫瘍根絶を促進し、転移を阻害する能力は、同系ＭＣ３８、ＣＴ２６およびＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルなどのマウスモデルを使用してインビボで評価される。
マウスは腫瘍細胞を皮下に移植され、腫瘍は触知可能なサイズまで成長させられる。腫瘍担持マウスを、マスクされたＩＬ－２構築物またはマスクされたＩＬ－１５ポリペプチド構築物で治療し、腫瘍体積を治療過程にわたって測定する。一部の実験では、一部のマウスは比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のマウスは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。腫瘍体積は、治療過程にわたって定期的に測定される。一部の実験では、体重はまた、治療過程にわたって定期的に測定される。一部の実験では、血漿サンプルが治療過程にわたって産生され、薬物動態、薬力学、切断、および血液マーカー、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞などについて分析される。
肺転移を評価するための同系ＣＴ２６腫瘍モデルなど、転移研究に適したマウスモデルを使用して、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の転移を阻害する能力もインビボで評価される。マウスに腫瘍細胞を皮下に移植する。一部の実験では、腫瘍は、治療前に触知可能なサイズまで成長させられる。一部の実験では、治療は、腫瘍が触知可能なサイズに成長する前に開始される。腫瘍担持マウスを、マスクされたＩＬ－２構築物を用いて治療し、肺、肝臓、およびリンパ節などの組織への腫瘍細胞の転移について評価する。
一部の研究では、同系腫瘍モデルを使用して、以下の方法に従って腫瘍体積を減少させるマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の能力を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１２５ｍｍ３のサイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスは、ＰＢＳ中、２ｍｇ／ｋｇ用量のＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、もしくはＡＫ１６８、または対照としての抗ＲＳＶ抗体を投与されるように無作為化された。マウスに腹腔内投与し、週に三回、六回投与した。ダイヤルキャリパーを使用して腫瘍体積を計算し（長さ＊（幅＾２）／２）、体重を週に二回記録した。図２８Ａおよび図２８Ｂは、治療過程にわたって、腫瘍体積および体重を評価した同系腫瘍モデル研究の結果を示す。図２８Ａに示すように、マスクされた構築物ＡＫ１１１およびＡＫ１６８を含む例示的なＩＬ－２ポリペプチド構築物を使用した治療は、抗ＲＳＶ対照と比較して、経時的な腫瘍成長阻害をもたらした。図２８Ｂに示すように、マウスをマスクされた構築物ＡＫ１１１およびＡＫ１６８で処置したときに、一般的に体重減少が観察されなかった。
カニクイザルにおける生物活性
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のインビボでの生物活性が、カニクイザルにおいてインビボで評価される。カニクイザルを構築物で処理し、インビボでの生物活性、薬物動態、および切断を評価する。一部の実験では、一部のサルは比較のために対照で処理される。一部の実験では、一部のサルは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド処理の対照としてアルデスロイキンで処理される。一部の実験では、サルは、構築物、アルデスロイキン、または他の対照の様々な用量で処置される。血液は、様々な時点でサルから採取され、次いで、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、およびＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞などの特定の細胞タイプ、および／または総リンパ球、Ｋｉ６７＋、および可溶性ＣＤ２５の用量反応などの対象マーカーについて評価される。一部の実験では、特定の循環Ｔ細胞型およびＮＫ細胞型の増殖および拡大の縦断的動態が評価される。一部の実験では、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の薬物動態および切断は、ＥＬＩＳＡ、ＰＡＧＥ、および質量分析によって決定される。
非ヒト霊長類における例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の安全性プロファイルを試験するために、用量範囲試験を以下の方法に従って実施する。３匹の健康なオスカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の群を、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で、１０、３０および１００ｎｍｏｌ／ｋｇの活性化可能な（すなわち、切断可能な）マスクされたＩＬ－２ポリペプチドタンパク質または切断不可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチドタンパク質の２ｍＬ／ｋｇの単回静脈内ボーラス投与に無作為に割り当てる。第三の群は、陽性対照として、３、１０および３０ｎｍｏｌ／ｋｇで親のマスクされていない切断可能なタンパク質を受ける。この第三の群は、親のマスクされていない分子の高い効力を考慮して、より低い範囲で投与される。投与量は、分子量の差を考慮して、モルで計算される。血液サンプルは、投与前、および投与後１、２４、４８、７２、９６、１６８、２６４、および３３６時間で採取される。自動血液分析器を使用して、リンパ球サブセットおよび血清化学の変化を監視する。総薬物レベルおよびインタクト（すなわち、切断されていない）薬物レベルは、上述のようにカスタムＥＬＩＳＡを使用して血漿から測定される。可溶性ＣＤ２５レベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号ＤＲ２Ａ００）で測定し、免疫刺激を監視する。炎症性サイトカインの血漿レベルは、カスタム多重化電気化学発光アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して定量化される。血管漏出症候群の指標として血圧がモニタリングされる。ＰＫは、ＩＬ－２を捕捉し、ヒトＦｃを検出するＥＬＩＳＡ、およびヒトＦｃを捕捉し、ヒトＦｃを検出するＥＬＩＳＡを用いて分析される。
実施例４：
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスは、ＰＢＳ中の様々なＦｃ－ＩＬ－２構築物の高用量腹腔内投与を一回受けた。投与後５分、３日目、５日目、および７日目に血漿を採取した。
免疫表現型解析は、ＦＡＣＳベースの方法を使用して行った。５日目に、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、腫瘍、肝臓、脾臓、および血液を採取した。細胞懸濁液を、機械的破損により脾臓から調製し、４０μｍの細胞ストレーナーを通過させた。腫瘍組織を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ カタログ番号１３０－０９６－７３０）を使用して酵素的に消化し、機械的解離ステップにｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した。脾臓中の赤血球、ならびに腫瘍細胞懸濁液および血液を、ＡＣＫ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号Ａ１０４９２）を使用して溶解した。
細胞懸濁液を、以下の抗体で染色した：ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＭ－４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメーター（Ｍｉｌｅｎｙｉ）でデータ取得を行い、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。
薬物レベルは、捕捉抗体および様々な検出抗体として、抗ヒトＩｇＧ（クローンＭ１３１０Ｇ０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を利用したＥＬＩＳＡを使用して決定された。ヒトＩｇＧ（ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ）またはＣＤ１２２（クローン９Ａ２、Ａｎｃｅｌｌ）およびＩＬ－２（Ｐｏｌｙ５１７６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するＨＲＰまたはビオチン結合検出抗体を利用して、それぞれ総薬物レベルおよび非切断薬物レベルを検出した。
Ｉ２５３Ａ ＦｃＲｎ変異を有するＡＫ４７１は、図２９Ａおよび図２９Ｂに示すように、末梢では不活性なまま、ＴＭＥにおいて強固なＣＤ８ Ｔ細胞拡大を誘導する。
ＡＫ４７１は、図３０Ａ、ＢおよびＣに示すように、ａｇｌｙｃｏ－ｈＩｇＧ１と比較して、半減期がわずかに短い。
血漿中のＡＫ４７１による切断または断頭の証拠はない（図３１Ａ、図３１Ｂ、および図３１Ｃ）。
実施例５：
ＣＤ１２２のＣｙｓからＳｅｒへの変異の概要
ＣＤ１２２マスキングドメイン上の二つの遊離システインをセリンに変異させて、タンパク質の安定性を高め、理論、凝集、酸化、および免疫原性を含むがこれらに限定されない開発可能性のリスクを軽減した。変異体は、対照およびＣｙｓからＳｅｒへの変異体を、長時間（３週間）、高温（４０℃）、複数のｐＨでインキュベートする加速安定性試験で評価した。システイン変異の影響を評価するために、様々な解析を実施した。結果は、ＣｙｓからＳｅｒへの変異体が、ストレス下での凝集の有意な減少によって示されるように、タンパク質の安定性を明らかに高めたことを実証する。ｐＨ８．０で３週間インキュベーションした後、システイン変異を有する構築物は、システイン変異を含有しない対照構築物が、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより測定された場合、５０パーセント超の凝集を有するのと比較して、低い凝集レベルを呈する。ＣＥ－ＳＤＳでは、変異システインを有する構築物が、ｐＨ６．０およびｐＨ８．０のインキュベーションで非凝集のままであること（＞９９％）を示し、対照構築物は、最大１５パーセントｌの凝集レベルを含有した。
さらに、ＣＤ１２２マスキングタンパク質中に変異システインを有する構築物は、野生型ＣＤ１２２マスキングタンパク質を含有する（すなわち、システイン残基の変異を伴わない）対照構築物と同様の方法で、ＩＬ－２タンパク質と相互作用する。さらに、ＣＤ１２２マスキングタンパク質中に変異システインを有する構築物は、システイン変異を伴わないＣＤ１２２マスキングタンパク質を含有する対照構築物と機能的アッセイおよび薬力学研究の両方において類似している。
実験プロトコル
安定性試験
サンプルを、４０℃に設定したＧａｌａｘｙ １７０ Ｓ空気インキュベーター中でインキュベートした。２０ｍＭクエン酸塩ｐＨ５．０、２０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０、および２０ｍＭトリスｐＨ８．０の三つの緩衝系を試験した。各々のｐＨを、室温で（約２７Ｃ）較正し、緩衝液を、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いて０．０５ｐＨ単位内で調整した。緩衝液を０．２２ｕｍのボトルトップフィルターで濾過した。サンプルを、スピン濃度を介して開始緩衝液におよそ３０００倍緩衝液交換した。サンプルアリコートを、０、１、３、７、１４、および２１日目に滅菌条件下で除去し、－８０℃で保存した後、以下の分析試験で評価した。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣシステムを使用して、インキュベートされたサンプル中の凝集レベルを評価した。システムは、分子量標準と共に較正された。高分子量種（「ＨＭＷＳ」）のレベルを各サンプルで測定した。ＨＭＷＳの増加は、凝集のレベルの増加を示した。
これらの研究の結果を、図３２Ａおよび図３２Ｂに示す。キーは、「ＡＫ」分子番号を表し、ＡＫ３４１はＣｙｓからＳｅｒへの変異体であり、ＡＫ２０９は対照である。
ＣＥ－ＳＤＳ
ＣＥ－ＳＤＳは、ｌａｂｃｈｉｐマシンで実行した。一般に、還元剤は、還元条件下での実験に使用された。サンプルを高熱にかけた後、９６ウェルＰＣＲプレートにサンプルをロードした。組換えヒトＩＬ－２を低分子量タンパク質対照として使用した。ＨＭＷＳのレベルは、各サンプルで測定された。ＨＭＷＳの増加は、凝集のレベルの増加を示した。
これらの研究の結果を、図３３Ａ～図３３Ｄに示す。キーは、「ＡＫ」分子番号を表し、ＡＫ３４１はＣｙｓからＳｅｒへの変異体であり、ＡＫ２０９は対照である。
実施例６：
使用される構築物は以下の通りである：
ｉ．抗腫瘍活性－ＡＫ４３８およびＡＫ４４２
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中のＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。ダイヤルキャリパーを使用して腫瘍体積を計算し（長さ＊（幅＾２）／２）、体重を週に二回記録した。腫瘍量（２０００ｍｍ３）または毒性による体重減少（２０％）の人道的エンドポイントに到達したときにマウスを犠牲にした。
結果を図３４Ａおよび図３４Ｂに示す。
ｉｉ．末梢（脾臓）対腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞拡大－ＡＫ４３８およびＡＫ４４２
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。
７日目の免疫表現型解析は、末梢血からＦＡＣＳベースの方法を使用して実施された。赤血球を、ＡＣＫ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号Ａ１０４９２）を使用して溶解した。細胞懸濁液を、以下の抗体で染色した：ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＭ－４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＫｉ－６７（クローンＳＯＬＡ１５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメーター（Ｍｉｌｅｎｙｉ）でデータ取得を行い、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉの事後検定を用いた一元配置分散分析を実施して、治療対対照ＡＫ２１１の統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
結果を図３５Ａおよび図３５Ｂに示す。
ｉｉｉ．抗腫瘍活性－ＡＫ２５２、ＡＫ４３８、ＡＫ２０９、およびＡＫ４７１
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。ダイヤルキャリパーを使用して腫瘍体積を計算し（長さ＊（幅＾２）／２）、体重を週に二回記録した。腫瘍量（２０００ｍｍ３）または毒性による体重減少（２０％）の人道的エンドポイントに到達したときにマウスを犠牲にした。
結果を図３６Ａおよび図３６Ｂに示す。
ｉｖ．末梢（脾臓）対腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞拡大－ＡＫ２５２、ＡＫ４３８、ＡＫ２０９、ＡＫ４７１
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。
７日目の免疫表現型解析は、末梢血からＦＡＣＳベースの方法を使用して実施された。赤血球を、ＡＣＫ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号Ａ１０４９２）を使用して溶解した。細胞懸濁液を、以下の抗体で染色した：ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＭ－４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＫｉ－６７（クローンＳＯＬＡ１５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメーター（Ｍｉｌｅｎｙｉ）でデータ取得を行い、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉの事後検定を用いた一元配置分散分析を実施して、治療対対照ＡＫ２１１の統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
結果を図３７Ａおよび図３７Ｂに示す。
ｖ．抗腫瘍活性－ＡＫ２５２、ＡＫ４４２、ＡＫ２０３、ＡＫ５０８およびＡＫ５１０
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。ダイヤルキャリパーを使用して腫瘍体積を計算し（長さ＊（幅＾２）／２）、体重を週に二回記録した。腫瘍量（２０００ｍｍ３）または毒性による体重減少（２０％）の人道的エンドポイントに到達したときにマウスを犠牲にした。
結果を図３８Ａおよび図３８Ｂに示す。
ｖｉ．末梢（脾臓）対腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞拡大－ＡＫ２５２、ＡＫ４４２、ＡＫ２０３、ＡＫ５０８、およびＡＫ５１０
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。
７日目の免疫表現型解析は、末梢血からＦＡＣＳベースの方法を使用して実施された。赤血球を、ＡＣＫ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号Ａ１０４９２）を使用して溶解した。細胞懸濁液を、以下の抗体で染色した：ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＭ－４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＫｉ－６７（クローンＳＯＬＡ１５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメーター（Ｍｉｌｅｎｙｉ）でデータ取得を行い、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉの事後検定を用いた一元配置分散分析を実施して、治療対対照ＡＫ２１１の統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
結果を図３９Ａおよび図３９Ｂに示す。
ｖｉｉ．抗腫瘍活性－ＡＫ２５２、ＡＫ５０８、ＡＫ５０９、ＡＫ５１０、ＡＫ５１１
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。ダイヤルキャリパーを使用して腫瘍体積を計算し（長さ＊（幅＾２）／２）、体重を週に二回記録した。腫瘍量（２０００ｍｍ３）または毒性による体重減少（２０％）の人道的エンドポイントに到達したときにマウスを犠牲にした。
結果を図４０Ａ～図４０Ｄに示す。
ｖｉｉｉ．末梢（脾臓）対腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞拡大－ＡＫ２５２、ＡＫ５０８、ＡＫ５０９、ＡＫ５１０、ＡＫ５１１
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。
７日目の免疫表現型解析は、末梢血からＦＡＣＳベースの方法を使用して実施された。赤血球を、ＡＣＫ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号Ａ１０４９２）を使用して溶解した。細胞懸濁液を、以下の抗体で染色した：ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＭ－４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＫｉ－６７（クローンＳＯＬＡ１５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメーター（Ｍｉｌｅｎｙｉ）でデータ取得を行い、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉの事後検定を用いた一元配置分散分析を実施して、治療対対照ＡＫ２１１の統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
ＡＫ２５２＋＋は、自社製ロット番号ＡＫ２５２－０６Ｂ、ＡＫ２５２は、ＡＴＵＭ製ロット番号ＡＫ２５２－Ａ－０１Ａである。
結果を図４１Ａおよび図４１Ｂに示す。
ｉｘ．抗腫瘍活性－ＡＫ２５２、ＡＫ４３８、ＡＫ４４２、ＡＫ２０９、ＡＫ３４１
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。ダイヤルキャリパーを使用して腫瘍体積を計算し（長さ＊（幅＾２）／２）、体重を週に二回記録した。腫瘍量（２０００ｍｍ３）または毒性による体重減少（２０％）の人道的エンドポイントに到達したときにマウスを犠牲にした。
結果を図４２Ａおよび図４２Ｂに示す。
ｘ．脾腫および肺水腫－ＡＫ２５２、ＡＫ４３８、ＡＫ４４２、ＡＫ２０９、ＡＫ３４１
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスを無作為化して、ＰＢＳ中の非常に低用量レベルのＡＫ２５３、および高用量レベルの他のすべてのＦｃ－ＩＬ－２構築物を投与した。０日目、３日目、および６日目にマウスに静脈内投与した。組織を採取し、６日目に計量した。
結果を図４３Ａおよび図４３Ｂに示す。
実施例７：
ｉ．ＮＡＴ対ＲＣＣ培養上清によるペプチドの切断
切断ペプチドを含む配列（以下に太字で示される）を、各ペプチドの切断の特異性を試験するために、「ＮＡＴ」（正常隣接組織）または「ＲＣＣ」（腎細胞癌）培養上清のいずれかでインキュベートした。
この目的のために、質量分析によるペプチド配列を使用して、質量分析による多重化基質プロファイリング（ＭＳＰ－ＭＳ）と呼ばれる公開された手法を用いて、以下の表に示す合成ペプチドに対して生成された切断された断片を同定した（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ Ａ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２ Ｎｏｖ；９（１１）：１０９５－１００）。切断は、これらの反応において経時的にモニターされ、最も早い時点で切断されたことが見出されたペプチドは、コンディショニングされた培地サンプル中のタンパク質分解活性に対して最も感受性があるとみなされた。
結果は以下のとおりである。
Figure 2023553323000099
切断ペプチドＤＬＬＡＶＶＡ＊ＡＳおよびＩＳＳＧＬＬ＊ＳＧ＊ＲＳが最も特異的であることが分かった。これらのペプチドを含む配列は、ＮＡＴ培養では切断されなかったが、ＲＣＣ培養では毎回切断された。
実施例８：
この例では、以下の構築物を使用した。
各ＡＫ分子のドメイン特徴および配列の詳細は以下のとおりである。
Figure 2023553323000101
Figure 2023553323000102
Figure 2023553323000103
重要なことに、ＡＫ９３２およびＡＫ９３０、ならびにそれらの「反転した」対応物ＡＫ９３８およびＡＫ９３６は、ペプチド基質を含む（その配列は、各分子の上のボックスに示され、配列表に太字で示されている）。ＡＫ９０４は切断可不能なマスクされていない構築物であり、ＡＫ９１０は切断不可能なマスクされた構築物であり、両方とも陰性対照として作用する。
上記のＡＫ分子はＩＬ－１５ドメインを含むが、しかし、このデータの結果および結論はＩＬ－２構築物に等しく関連することが理解されるであろう。
ペプチド基質を含むマスクされた構築物について切断が達成された。
構築物を、ＭＭＰ７、９および１０とインキュベートした。各構築物の切断を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイにより確認した。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイを以下のように実施した：
条件：細胞プレート：９６ウェルプレート。細胞密度：５０Ｋ ｃｌｓ／ウェル。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ検出の時点を試験した：１時間。構築物番号：試験した構築物の合計１４個。
アッセイフローチャート：
結果を以下の表に示し、「Ｘ」は完全に切断されていないことを、「√」は切断を示す。
Figure 2023553323000105
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイからの特定のＥＣ５０読み出し結果を以下の表に示す。
Figure 2023553323000106
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を図４４Ａ～図４４Ｄに示す。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイ結果を図４５Ａ～図４５Ｆに示す。
実施例９：
本実施例は、例示的なＩＬ－１２構築物のマスキングおよび切断を示す。
この例では、以下の構築物を使用した。
ＡＫ６７１はマスクされていない分子であり、ＡＫ６６３はサイトカインを含まず、ＡＫ６６４は切断不可能である。これら三つの分子は、対照としての役目を果たす。
各構築物の切断ペプチドを、各カラムの最上部に示す。
ＡＫ６６６、ＡＫ６６７、ＡＫ９１８、ＡＫ９２０およびＡＫ６６９は、「バージョン１」構築物である。ＡＫ６６５、ＡＫ６６８、ＡＫ９１９、ＡＫ９２１、ＡＫ６７０は、「バージョン２」構築物である。ＡＫ９２４、ＡＫ９２２、ＡＫ９２５およびＡＫ９２３は、「バージョン３」構築物である。
各バージョンにおけるＨＬ２とＩＬ－１２ドメインとの間の切断可能なリンカー（プロテアーゼ部位リンカー）、およびＨＬ１とマスキング部分との間の切断不可能なリンカー（ｂ２受容体リンカー）を以下に示す。
該当する場合、これらの構築物のすべては、ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットのＧＡＧ結合ドメインに対するＫＤＮＴＥＧＲＶ変異、Ｉｌ－１２ｐ４０サブユニットのＣ２５２Ｓ変異、およびＩＬ－１２ＲＢ２ドメインのＣ２４２Ｓ変異を含む。各構築物の配列を以下の表に示す。
Figure 2023553323000109
Figure 2023553323000110
Figure 2023553323000111
Figure 2023553323000112
Figure 2023553323000113
Figure 2023553323000114
Figure 2023553323000115
Figure 2023553323000116
Figure 2023553323000117
Figure 2023553323000118
ｉ）エクスビボ切断アッセイ（ＷＢ／ＩＬ－１２シグナル伝達）
ＩＬ－１２構築物の１ｕＭを、９０ｕｌのコンディショニング培地で一晩、または９０ｕｌの血漿と、３７Ｃで、以下の時間（ｄ１－ｄ２－ｄ４－ｄ７－ｄ９－ｄ１１）インキュベートした。切断率は、ウェスタンブロット抗ヒトＩＬ－１２および抗ヒトＩＬ－１２Ｒｂを使用して、切断構築物／（切断構築物＋インタクト構築物）の比率として計算される。ヒト組織条件培地によるこれらの構築物の活性化は、０．０５ｘ１０６ ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞を３７．５ｎＭの構築物と共に２４時間インキュベートした後、ＩＬ－１２受容体シグナル伝達アッセイを使用して評価される。
結果を図４６および以下の表に示す。
以下の切断部位を有する分子は、腫瘍上清において容易に検出可能な切断を呈した：
－ＲＡＡＡＶＫＳＰ
－ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳ
－ＭＰＹＤＬＹＨＰ
切断部位の感受性は、以下の順序で観察された：
ＲＡＡＡＶＫＳＰ＞ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳ＞ＭＰＹＤＬＹＨＰ
したがって、これらの切断部位を担持するＩＬ－１２構築物は、ＲＣＣおよび他のタイプの癌における腫瘍選択的活性化の良好な候補となる。
ｉｉ）インビトロ切断解析：ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を用いたＩＬ－１２分子の試験：
Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎにより開発されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーター細胞は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の活性化を監視するために特別に設計されている。これらの細胞は、ＨＥＫ２９３細胞にヒトＩＬ－１２Ｒβ１およびＩＬ－１２Ｒβ２遺伝子、ならびにヒトＴｙＫ２、ＪＡＫ２、およびＳＴＡＴ４遺伝子を安定的トランスフェクションすることによって生成され、完全に機能的なＩＬ－１２シグナル伝達経路を得た。さらに、ＳＴＡＴ４誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子も導入された。刺激を受けると、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２細胞はＳＴＡＴ４の活性化とその後のＳＥＡＰの分泌をトリガする。ＳＴＡＴ４誘導性ＳＥＡＰのレベルは、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）を使用して容易に監視することができる。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞は、ヒトまたはマウスＩＬ－１２の機能性、毒性、および可変用量効果を検証するために使用することができる。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を、約８０％のコンフルエントまで継代培地中で増殖させた。アッセイ培地中の洗浄された単一細胞懸濁液を播種し、アッセイ培地中のＩＬ－１２分子の段階希釈物を細胞に添加した。プレートを、３７°Ｃで２４時間インキュベートした。２４時間後、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を調製し、細胞上清をＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液に加え、３７°Ｃで１～２時間インキュベートした。６２５ｎｍでの吸光度を測定した。データ解析はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン８．３で行った。生データからバックグラウンドを減算し、データは非線形にフィットさせた。［アゴニスト］対応答－可変勾配（四つのパラメータ）。各ＩＬ－１２構築物のＥＣ５０値が報告された。
マスキング：
結果を以下の表、ならびに図４７、図４８Ａ、および図４８Ｂに示す。
親ＡＫ６７１は、ｒｈＩＬ－１２よりも強力ではない（ただし、有意ではない、すなわち３倍）。すべてのマスクされた構築物は、ＡＫ３８６よりも多くアクルード（ａｋｌｕｄｅｄ）される。ＡＫ６６７およびＡＫ９１８は両方とも、＞１００倍にアクルード（ａｋｌｕｄｅｄ）されている。
ＡＫ３８６と比較して、ＧＡＧ結合ドメイン変異、システインからセリンへの変異、新しい最適化されたリンカー、および異なる切断部位を有する新しい分子はすべて、改善されたマスキングを示す。
切断：
構築物の切断は、例示的なプロテアーゼＭＭＰ７、９および１０を使用して試験した。
バッチ１
結果を図４９Ａ～図４９Ｂおよび図５０Ａ～図５０Ｋに示す。
バッチ２
結果を図５１Ａ～図５１Ｂおよび図５２Ａ～図５２Ｇに示す。
バッチ３
結果を図５３および図５４Ａ～図５４Ｅに示す。
全体として、異なる切断部位を有する新しい分子はすべて、インビトロでＭＭＰ切断に影響を受ける。すべての分子について、切断後の活性の回復がある。これらの化合物は、腫瘍選択的に活性化可能なＩＬ－１２分子の良好な候補となる。
実施例１０：
この例では、以下の構築物を使用した。
対照分子
－陽性対照：マスクされていないＡＫ９０４
－切断対照：マスクされた、切断不可能ＡＫ９１０
マスクされた切断可能な分子：
－ サイトカイン基質構築物：ＡＫ９３０
－ マスク－サブステート構築物：ＡＫ９３６
各ＡＫ分子のドメイン特徴および配列の詳細は実施例８に述べている。
ＣＴ２６マウス腫瘍モデル－ＣＴ２６腫瘍担持マウスの治療における被験物質のＰＤのインビボ評価
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６細胞を皮下注射し、腫瘍増殖を監視した。腫瘍サイズが１７５～２２５ｍｍ３に達すると、動物を無作為化した（群当たりｎ＝４）。被験物質の単回静脈内注射を、表に従って用量レベルで投与した。体重を０日目および５日目に測定した。５日目に、動物を犠牲にし、免疫表現型解析のために組織を採取した。
結果は以下のとおりである。
ｉ）５日目の組織重量、腫瘍重量、および体重変化（％）
図５５Ａ：高用量のＡＫ９０４およびＡＫ９３１で処置されたマウス、ならびに低用量および高用量のＡＫ９３６で処置されたマウスは、体重の有意な減少を示した。
図５５Ｂ：処置されたマウスすべてにわたって、腫瘍体積に有意な差は観察されなかった。
図５５Ｃ：高用量のＡＫ９０４およびＡＫ９３６で処置されたマウスは、肺重量の有意な増加を示した。
図５５Ｄ：脾臓重量の有意な増加は、低用量、高用量、または両方の投与レジメンのいずれかで、被験物質で処置されたすべてのマウスで示された。
ｉｉ）ＮＫ細胞頻度
図５６Ａおよび図５６Ｂ：マウスは、血液および脾臓中のＮＫ細胞％における用量依存的な増加を示した。
図５６Ｃ：すべての治療群のマウスは、腫瘍におけるＮＫ％の増加を示した。
ｉｉｉ）ＮＫ Ｋｉ６７ ＭＦＩ
図５７Ａ、図５７Ｂ、および図５７Ｃ： マウスは、血液、脾臓、および腫瘍中のＮＫ細胞において、増殖マーカーＫｉ６７の用量依存的な増加を示した。
ｉｖ）ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度
図５８Ａ：マスクされていないＡＫ９０４で処置されたマウスは、血液中のＣＤ８ Ｔ細胞％の用量依存的な増加を示した。
図５８Ｂ：マウスは、脾臓中のＣＤ８ Ｔ細胞％における用量依存的な増加を示した。
図５８Ｃ：すべての治療群のマウスは、腫瘍内のＣＤ８ Ｔ細胞％の増加を示さなかった（決定的でない証拠）。
ｖ）ＣＤ８＋Ｔ Ｋｉ６７ ＭＦＩ
図５９Ａおよび図５９Ｂ：マウスは、血液および脾臓中のＣＤ８ Ｔ細胞において、増殖マーカーＫｉ６７の用量依存的な増加を示した。
図５９Ｃ：すべての治療群のマウスは、腫瘍内のＣＤ８ Ｔ細胞におけるＫｉ６７の増加を示さなかった。
ｖｉ）ＣＤ８＋Ｔ：Ｔｒｅｇ比
図６０Ａおよび図６０Ｂ：ＡＫ９０４およびＡＫ９３６で処置されたマウスは、血液および脾臓において用量依存的なＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加を示した。
図６０Ｃ：ＡＫ９０４、ＡＫ９３０、およびＡＫ９３６で処置されたマウスは、腫瘍において用量依存的なＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加を示した。
Ｂ１６Ｆ１０マウス腫瘍モデル－Ｂ１６－Ｆ１０モデルにおけるＩＬ－１５ ＰＫＰＤ試験
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＭＣ３８細胞を皮下注射し、腫瘍増殖を監視した。腫瘍サイズが１７５～２２５ｍｍ３に達すると、動物は無作為化された（群当たりｎ＝４、ＡＫ９０４および群当たりｎ＝８を含有するビヒクル群を除く）。被験物質の単回静脈内注射を、表に従って用量レベルで投与した。ＰＫ解析のため、５分、２時間、６時間、および５日目に血漿を採取した。体重を０日目および５日目に測定した。５日目に、動物を犠牲にし、免疫表現型解析のために組織を採取した。
結果は以下のとおりである。
ｉ）５日目の組織重量、腫瘍重量、および体重変化（％）
図６１Ａ：高用量のＡＫ９０４およびＡＫ９３６で処置されたマウスは、体重の有意な減少を示した。
図６１Ｂ：処置されたマウスすべてにわたって、腫瘍体積に有意な差は観察されなかった。
図６１Ｃ：低用量および高用量のＡＫ９０４およびＡＫ９３６で処置されたマウスは、肺重量の有意な増加を示した。
図６１Ｄ：被験物質で処置したマウスのいずれにおいても、脾臓重量の有意な増加は示されなかった。
ｉｉ）マスクされたＩＬ－１５は、マスクされていない対照よりも長い半減期を示した
図６２Ａ：分子ＡＫ９１０、ＡＫ９３０、およびＡＫ９３６の間に類似のＰＫプロファイルが観察される。
図６２Ｂ：ＡＫ９１０、ＡＫ９３０、およびＡＫ９３６は、ＡＫ９０４と比較して、２～３倍長い半減期を有する。
図６２Ｃおよび図６２Ｄ：ＡＫ９１０、ＡＫ９３０、およびＡＫ９３６は、予想されたように、類似の、および用量依存性のＣｍａｘおよびＡＵＣ（０～ｌａｓｔ）を有する。
ｉｉｉ）ＮＫ
図６３Ａ～図６３Ｃ：マウスは、血液、脾臓、および腫瘍中のＮＫ細胞％における用量依存的な増加を示した。
ｉｖ）ＣＤ８＋Ｔ細胞
図６４Ａおよび図６４Ｂ：ＡＫ９０４およびＡＫ９３６で処置されたマウスは、血液および脾臓においてＣＤ８ Ｔ細胞％の増加を示した。
図６４Ｃ：すべての治療群のマウスは、腫瘍内のＣＤ８ Ｔ細胞％の増加を示した。
ｖ）ＣＤ８＋Ｔ：Ｔｒｅｇ比
図６５Ａおよび図６５Ｂ：ＡＫ９０およびＡＫ９３６で処置されたマウスは、血液および脾臓においてＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加を示した。
図６５Ｃ：ＡＫ９０４、ＡＫ９３０、およびＡＫ９３６で処置されたマウスは、腫瘍において用量依存的なＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加を示した。
実施例１１
この実施例では、以下の構築物を使用した。
ＡＫ９２３（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳ）ＩＬ－１２：ヒト腫瘍によるエクスビボ切断
ヒト原発腫瘍組織を穏やかに解離し、１、２または３日間培養した（３０ｍｌのＲＰＭＩ中５００ｍｇ）。腫瘍およびその微小環境によって分泌されるプロテアーゼを含有する条件培地（９０μｌ）を収集し、ＡＫ９２３分子（１μＭ）と共に２４時間、３７Ｃでインキュベーションした。切断した分子の割合を、蛍光トリプレックスウェスタンブロットを使用して定量した。切断頻度は、薬物を切断できた腫瘍サンプルの割合を表す。結果を図６６に示す。
ＡＫ９２３薬物（１μＭ）を、健康なヒト対照ドナー（１０人のドナー）、黒色腫患者（８人のドナー）、および頭頸部患者（１０人のドナー）からの９０μＬの血漿中で、１日、２日、４日、７日、９日、および１１日間、３７°Ｃでインキュベートした。切断した分子の割合を、蛍光トリプレックスウェスタンブロットを使用して定量した。データ点は、８人または１０人のドナーの中央値を表す。結果を図６７に示す。
本発明は、例えば、本発明の様々な態様を説明するために提供される、特定の開示された実施形態の範囲に限定されることを意図していない。記載される組成物および方法に対する様々な修正は、本明細書の記載および教示から明らかになるであろう。こうした変形は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内に入ることが意図される。
Figure 2023553323000132
Figure 2023553323000133
Figure 2023553323000134
Figure 2023553323000135
Figure 2023553323000136
Figure 2023553323000137
Figure 2023553323000138
Figure 2023553323000139
Figure 2023553323000140
Figure 2023553323000141
Figure 2023553323000142
Figure 2023553323000143
Figure 2023553323000144
Figure 2023553323000145
Figure 2023553323000146
Figure 2023553323000147
Figure 2023553323000148
Figure 2023553323000149
１０．２ 構築物のリスト
以下の表は、「ＡＫ」参照番号で標識された分子の完全な配列を示す。配列の構成要素部分、ならびにそれらが分子の鎖内で組み立てられる順番も示されている。個々の鎖は、「ＤＮＡ」参照番号で標識されている：

Claims (203)

  1. （ｉ）治療部分、（ｉｉ）担体部分、および（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含むタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーを含む、ポリペプチド薬物構築物。
  2. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）が、式：
    Figure 2023553323000259
    に示すように、スペーサードメイン（ＳＤ１およびＳＤ２）によって両側を挟まれている、請求項１に記載のポリペプチド薬物構築物。
  3. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、９～２５アミノ酸長である、請求項２に記載のポリペプチド薬物構築物。
  4. 前記スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である、請求項２または請求項３に記載のポリペプチド薬物構築物。
  5. 前記スペーサードメインは、Ｇ、ＳおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む、請求項４に記載のポリペプチド薬物構築物。
  6. 前記第一のスペーサードメイン（ＳＤ１）が、３～６アミノ酸長である、請求項２～５のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  7. 前記第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）が、３～６アミノ酸長である、請求項２～６のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  8. 前記第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）が、前記アミノ酸配列ＳＧＰを含む、請求項２～７のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  9. 前記第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）ＳＤ２が、前記アミノ酸配列ＳＧＰを有する、請求項２～８のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  10. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000260
    を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  11. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000261
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  12. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000262
    を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  13. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000263
    を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  14. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000264
    を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  15. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000265
    を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  16. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、前記治療部分に直接共有結合している、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  17. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、前記治療部分と前記担体部分との間の前記薬物構築物内に位置する、請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  18. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、前記担体部分内に位置する、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  19. 前記ポリペプチド薬物構築物が、単一のポリペプチド鎖を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  20. 前記ポリペプチド薬物構築物が、二つ以上のポリペプチド鎖を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  21. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、前記治療部分と同じポリペプチド鎖に存在する、請求項２０に記載のポリペプチド薬物構築物。
  22. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、前記治療部分とは異なるポリペプチド鎖に存在する、請求項２０に記載のポリペプチド薬物構築物。
  23. 前記ポリペプチド薬物構築物が、プロドラッグである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  24. マスキング部分をさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  25. 前記マスキング部分が、前記治療部分と同じポリペプチド鎖に存在する、請求項２４に記載のポリペプチド薬物構築物。
  26. 前記マスキング部分が、前記治療部分とは異なるポリペプチド鎖に存在する、請求項２４に記載のポリペプチド薬物構築物。
  27. 前記ポリペプチド薬物構築物が、半減期延長部分を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  28. 前記半減期延長部分が、抗体またはその断片を含む、請求項２７に記載のポリペプチド薬物構築物。
  29. 前記半減期延長部分が、第一および第二の半減期延長部分を含む、請求項２７に記載のポリペプチド薬物構築物。
  30. 前記プロドラッグがサイトカインプロドラッグであり、前記治療部分がサイトカイン部分である、請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物。
  31. 前記サイトカインプロドラッグがマスキング部分を含み、前記マスキング部分がサイトカイン受容体の細胞外ドメインのドメインを含む、請求項３０に記載のサイトカインプロドラッグ。
  32. マスクされたサイトカインであって、
    ａ）第一のリンカーを介して第一の半減期延長部分に連結されたマスキング部分を含む第一のポリペプチド鎖と、
    ｂ）第二のリンカーを介して第二の半減期延長部分に連結されたそのサイトカイン部分を含む第二のポリペプチド鎖とを含み、
    前記第一の半減期延長部分が前記第二の半減期延長部分と会合し、
    少なくとも前記第一のリンカーまたは前記第二のリンカーが、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである、マスクされたサイトカイン。
  33. 前記第一のポリペプチド鎖が、
    Figure 2023553323000266
    を含み、
    前記第二のポリペプチド鎖が、
    Figure 2023553323000267
    を含み、
    式中、ＨＬ１は前記第一の半減期延長ドメインであり、Ｌ１は前記第一のリンカーであり、ＭＭは前記マスキング部分であり、ＨＬ２は前記第二の半減期延長ドメインであり、Ｌ２は前記第二のリンカーであり、Ｃは前記サイトカイン部分であり、
    前記第一の半減期延長部分が前記第二の半減期延長部分と会合し、
    少なくとも前記第一のリンカーまたは前記第二のリンカーが、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む、タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーである、請求項３２に記載のマスクされたサイトカイン。
  34. 前記第二のリンカーが、前記タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、前記第一のリンカーが切断不可能なリンカーである、請求項３３に記載のマスクされたサイトカイン。
  35. 前記第一のリンカーが、前記タンパク質分解的に切断可能なリンカーであり、前記第二のリンカーが切断不可能なリンカーである、請求項３３に記載のマスクされたサイトカイン。
  36. 式：
    Figure 2023553323000268
    を含むポリペプチド鎖を含み、
    式中、ＨＬは前記半減期延長ドメインであり、Ｌ１は前記第一のリンカーであり、ＭＭは前記マスキング部分であり、Ｌ２は前記第二のリンカーであり、Ｃは前記サイトカイン部分であり、少なくとも前記第一のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含むタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーを含む、マスクされたサイトカイン。
  37. 式：
    Figure 2023553323000269
    を含む、ポリペプチド鎖を含み、
    式中、ＨＬは前記半減期延長ドメインであり、Ｌ１は前記第一のリンカーであり、ＭＭは前記マスキング部分であり、Ｌ２は前記第二のリンカーであり、Ｃはその前記サイトカイン部分であり、少なくとも前記第一のリンカーは、アミノ酸配列ＤＬＬＡＶＶＡＡＳまたはＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳからなるタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含むタンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーを含む、マスクされたサイトカイン。
  38. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）が、式：
    Figure 2023553323000270
    に示すように、スペーサードメイン（ＳＤ１およびＳＤ２）によって両側を挟まれている、請求項３２～３７のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  39. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、９～２５アミノ酸長である、請求項３８に記載のマスクされたサイトカイン。
  40. 前記スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である、請求項３８または請求項３９に記載のマスクされたサイトカイン。
  41. 前記スペーサードメインは、Ｇ、ＳおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む、請求項４０に記載のマスクされたサイトカイン。
  42. 前記第一のスペーサードメイン（ＳＤ１）が、３～６アミノ酸長である、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  43. 前記第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）が、３～６アミノ酸長である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  44. 前記第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）が、前記アミノ酸配列ＳＧＰを含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  45. 前記第二のスペーサードメイン（ＳＤ２）が、前記アミノ酸配列ＳＧＰを有する、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  46. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000271
    を含む、請求項３２～４５のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  47. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000272
    を含む、請求項３２～４５のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  48. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000273
    を含む、請求項３２～４４のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  49. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000274
    を含む、請求項３２～４５のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  50. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000275
    を含む、請求項３２～４５のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  51. 前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーが、
    Figure 2023553323000276
    を含む、請求項３２～４５のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  52. 前記第二のリンカーが切断不可能なリンカーである、請求項３６または請求項３７に記載のマスクされたサイトカイン。
  53. 前記切断不可能なリンカーが、３～２５アミノ酸長である、請求項３４、請求項３５、または請求項５２に記載のマスクされたサイトカイン。
  54. 前記切断不可能なリンカーは、アミノ酸残基Ｇ、ＳおよびＰが豊富である、請求項５３に記載のマスクされたサイトカイン。
  55. 切断不可能なリンカーが、ＰＧＳＧＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む、請求項５３または請求項５４に記載のマスクされたサイトカイン。
  56. 前記切断不可能なリンカーが、ＧＧＳＳＰＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＰ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含む、請求項５３または請求項５４に記載のマスクされたサイトカイン。
  57. 前記半減期延長ドメインが、第一の半減期延長ドメインおよび第二の半減期延長ドメインを含む、請求項３６または請求項３７に記載のマスクされたサイトカイン。
  58. 前記第一の半減期延長ドメインは、第一のＦｃドメインもしくはその断片を含み、前記第二のＦｃドメインは、Ｆｃドメインもしくはその断片を含む、請求項２９に記載のポリペプチド薬物構築物、または請求項３３～３５または請求項５７に記載のマスクされたサイトカイン。
  59. 前記第一のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその断片を含み、前記第二のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその断片を含む、請求項５８に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  60. 前記第一および第二の半減期延長ドメインが、それぞれＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片である、請求項５８に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  61. 前記第一および／または第二のＦｃドメインがそれぞれ、前記第一および前記第二の半減期延長ドメインの非共有結合を促進する一つまたは複数の修飾を含有する、請求項５８～６０のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  62. 前記第一の半減期延長ドメインは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた、変異Ｙ３４９Ｃ；Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３８ＡおよびＹ４０７Ｖを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片を含んで、前記第一の半減期延長ドメインに「ホール」を形成し、前記第二の半減期延長ドメインは、変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片を含んで、前記第二の半減期延長ドメインに「ノブ」を形成する、請求項６１に記載のプリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  63. 前記第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、それぞれは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた位置２９７にアミノ置換を含む、請求項６１または請求項６２に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  64. 前記第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、それぞれは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＮ２９７Ａのアミノ置換を含む、請求項６３に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  65. 前記第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、それぞれは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされた位置２５３にアミノ置換を含む、請求項６１～６４のいずれか一項に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  66. 前記第一および第二の半減期延長ドメインは、それぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片であり、それぞれは、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされたＩ２５３Ａのアミノ置換を含む、請求項６５に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  67. 前記第一の半減期延長ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、その前記第二の半減期延長ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  68. 前記第一の半減期延長ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、その前記第二の半減期延長ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載のポリペプチド薬物構築物またはマスクされたサイトカイン。
  69. 前記サイトカイン部分が、野生型サイトカイン部分またはバリアントサイトカイン部分を含む、請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～６８のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  70. 前記サイトカイン部分がＩＬ－２サイトカイン部分である、請求項６９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  71. 前記ＩＬ－２サイトカイン部分がＩＬ－２サイトカインまたはその断片を含む、請求項７０に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  72. 前記ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２を有する成熟ＩＬ－２の配列と比較して修飾されている、請求項７０または請求項７１に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  73. 前記修飾されたＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２を有する成熟ＩＬ－２の配列に対して、修飾Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａを含む、請求項７２に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  74. 前記修飾されたＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２を有する成熟ＩＬ－２の配列に対して、修飾Ｃ１２５Ａを含む、請求項７２または請求項７３に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  75. 前記修飾されたＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２を有する成熟ＩＬ－２の配列に対して、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２ＡおよびＣ１２５Ａを含む、請求項７２に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  76. 前記ＩＬ－２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  77. 前記マスキング部分が、ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、もしくはバリアントを含む、請求項７２～７６のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  78. 前記ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、もしくはバリアントが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  79. 前記ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、もしくはバリアントが、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１２２に変異を有する、請求項７７に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  80. 前記ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、もしくはバリアントが、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１６８に変異を有する、請求項７７または請求項７９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  81. 前記ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、もしくはバリアントが、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、アミノ酸位置Ｃ１２２およびＣ１６８に変異を有する、請求項８０に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  82. 前記ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、もしくはバリアントが、配列番号４のＩＬ－２βと比較して、変異Ｃ１２２ＳおよびＣ１６８Ｓを有する、請求項８１に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  83. 前記ＩＬ－２Ｒβまたはその断片、部分、もしくはバリアントが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  84. 前記サイトカイン部分がＩＬ－１２サイトカイン部分である、請求項６９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  85. 前記ＩＬ－２サイトカイン部分がＩＬ－２サイトカインまたはその断片を含む、請求項８４に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  86. 前記ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片が、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドまたはその機能的断片に共有結合したＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドまたはその機能的断片を含む、請求項８５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  87. 前記ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーが、５～２０アミノ酸長である、請求項８６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  88. 前記ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、アミノ酸残基ＧおよびＳが豊富である、請求項８６または請求項８７に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  89. 前記ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーが、配列番号 １１６（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む、請求項８６～８８のいずれかに記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  90. 前記ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号２０４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）、または配列番号１（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む、請求項８６～８９のいずれかに記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  91. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号１（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項９０に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  92. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号２０４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、ＧＡＧ結合ドメイン（ＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶ）に対する少なくとも一つのアミノ酸修飾を含む、請求項９０に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  93. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号２０５（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項９２に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  94. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号２０６（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項９２に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  95. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号２０４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、一つまたは複数のシステイン置換変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項９０～９４のいずれかに記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  96. 前記ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号２０７（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項９５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  97. 前記ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号２０８（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項９５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  98. 前記ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドが、配列番号２０９、または配列番号２０９（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む、請求項８６～９８のいずれかに記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  99. 前記ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドが、配列番号２０９（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項９８に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  100. 前記ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２１０（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項８６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  101. 前記ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２１１（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項８６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  102. 前記ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２１２（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項８６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  103. 前記ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２１３（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項８６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  104. 前記ＩＬ－１２サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２１４（本明細書のＩＬ－１２サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項８６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  105. 前記マスキング部分がＩＬ－1２サイトカイン受容体、またはそのサブユニットもしくは機能的断片を含む、請求項８４～１０４のいずれかに記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  106. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の細胞外ドメイン、またはＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、そうでなければ実証するその断片、部分、もしくはバリアントを含む、請求項８４～１０５のいずれかに記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  107. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～２３７、すなわち配列番号２１５を有する配列（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を含む、請求項１０６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  108. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～５４５、すなわち配列番号２１６を有する配列（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を含む、請求項１０６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  109. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の細胞外ドメイン、またはＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、そうでなければ実証するその断片、部分、もしくはバリアントを含む、請求項８４～１０５のいずれかに記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  110. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２１２、すなわち配列番号２１７を有する配列（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を含む、請求項１０９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  111. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２２、すなわち配列番号２１８を有する配列を含むか、または前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２７、すなわち配列番号２２２を有する配列（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を含む、請求項１０９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  112. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち配列番号２１９を有する配列（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を含む、請求項１０９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  113. 前記マスキング部分が、配列番号２１９の配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を含み、任意選択的に、前記修飾が、システイン置換変異（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）である、請求項１０９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  114. 前記マスキング部分が、配列番号２２０（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を含む、請求項１０９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  115. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～６２２、すなわち配列番号２２１を有する配列（本明細書のＩＬ－１２マスキング部分表に示される通り）を含む、請求項１０９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  116. 前記サイトカイン部分がＩＬ－１５サイトカイン部分である、請求項６９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  117. 前記ＩＬ－２サイトカイン部分がＩＬ－１５サイトカインまたはその断片を含む、請求項１１６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  118. 前記マスクされたサイトカインが、ＩＬ－１５Ｒαサブユニットまたはその機能的断片（「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」）を含むドメインをさらに含む、請求項１１６または請求項１１７に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  119. 前記サイトカイン部分が、ＩＬ－１５サイトカイン部分であり、前記マスクされたサイトカインが、ＩＬ－１５Ｒαサブユニットまたはその機能的断片（「ＩＬ－１５Ｒαドメイン」）を含むドメインをさらに含み、前記ＩＬ－１５Ｒαドメインと前記ＩＬ－１５サイトカイン部分は、前記構築物中の異なるポリペプチド鎖に存在し、前記ＩＬ－１５Ｒαドメインは前記ＩＬ－１５サイトカイン部分に非共有結合している、請求項１１８に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  120. 前記ＩＬ－１５Ｒαドメインが、前記野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列と比較して、位置Ｒ２６にアミノ酸置換を含む、請求項１１８または請求項１１９に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  121. 前記ＩＬ－１５Ｒαドメインが、前記野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列と比較して、位置Ｒ３５にアミノ酸置換を含む、請求項１１８～１２０のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  122. 前記ＩＬ－１５Ｒαドメインが、前記野生型スシドメインｓＩＬ－１５Ｒαの配列と比較して、位置Ｒ２６およびＲ３５にアミノ酸置換を含む、請求項１１８～１２１のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  123. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその断片が、配列番号２またはその機能的断片（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）を含む、請求項１１７～１２０のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  124. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２３に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  125. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１７～１２０のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  126. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｄ２２、Ｅ４６、Ｅ５３に一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  127. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｄ２２、Ｅ４６、Ｅ５３、Ｎ７１、Ｎ７９、またはＮ１１２に一つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２６に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  128. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１およびＮ７９にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  129. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２５～１２８のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  130. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７９およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２５～１２９のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  131. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列と比較して、位置Ｎ７１、Ｎ７９およびＮ１１２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２５～１３０のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  132. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２５（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  133. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２６（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  134. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２７（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  135. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２８（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  136. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２２９（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  137. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２３０（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  138. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２３３（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  139. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２３４（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  140. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２３５（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  141. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２３６（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  142. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２３７（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  143. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２３８（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  144. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、配列番号２３９（本明細書のＩＬ－１５サイトカイン部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１２５に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  145. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、位置Ｎ７１に追加の変異を含む、請求項１２５～１３１のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  146. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、位置Ｓ７３に追加の変異を含む、請求項１２５～１３１または請求項１４５のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  147. 前記ＩＬ－１５サイトカインまたはその機能的断片が、一つまたは複数のアミノ酸位置Ｎ７２、Ｎ７９、Ｖ８０、Ｔ８１、およびＮ１１２に追加の変異を含む、請求項１２５～１３１または請求項１４５または請求項１４６のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  148. 前記マスキング部分が、ＩＬ－１５Ｒβまたはその断片もしくはバリアントを含む、請求項１１６～１４７のいずれか一項に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  149. 前記マスキング部分が、配列番号２４０（本明細書のＩＬ－１５マスキング部分表に示される通り）のアミノ酸配列を含む、請求項１４８に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  150. 前記マスキング部分が、位置Ｃ１２２にアミノ酸置換を有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む、請求項１４８に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  151. 前記マスキング部分が、アミノ酸置換Ｃ１２２Ｓを有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む、請求項１５０に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  152. 前記マスキング部分が、位置Ｃ１６８にアミノ酸置換を有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む、請求項１４８または請求項１５０に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  153. 前記マスキング部分が、アミノ酸置換Ｃ１６８Ｓを有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む、請求項１５２に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  154. 前記マスキング部分が、位置Ｃ１２２およびＣ１６８にアミノ酸置換を有するＩＬ－１５Ｒβバリアントまたはその断片を含む、請求項１４８に記載のサイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカイン。
  155. 請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物、請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカイン中の前記タンパク質分解的に切断可能なリンカーのタンパク質分解切断によって調製可能な活性治療部分を含むことが可能な、切断産物。
  156. 請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物をコードする核酸。
  157. 請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカインをコードする核酸。
  158. 請求項１５５に記載の切断産物をコードする核酸。
  159. 請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物のポリペプチド鎖の一つをコードする核酸。
  160. 請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグのポリペプチド鎖の一つ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカインのポリペプチド鎖の一つをコードする核酸。
  161. 請求項１５５に記載の切断産物のポリペプチド鎖の一つをコードする核酸。
  162. 請求項１５６～１６１のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  163. 請求項１５６～１６１のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
  164. 前記宿主細胞が、ＨＥＫ細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１６３に記載の宿主細胞。
  165. 請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物を含む、組成物。
  166. 請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカインを含む、組成物。
  167. 請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  168. 請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカイン、および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  169. 前記医薬組成物が、単一単位剤形である、請求項１６７または請求項１６８に記載の医薬組成物。
  170. 前記医薬組成物が、静脈内投与用に製剤化され、単一単位剤形である、請求項１６９に記載の医薬組成物。
  171. 前記医薬組成物が、注射用に製剤化され、単一単位剤形である、請求項１６９に記載の医薬組成物。
  172. 前記医薬組成物が、液体であり、単一単位剤形である、請求項１６９に記載の医薬組成物。
  173. 請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物、または請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカイン、または請求項１６５もしくは請求項１６６に記載の組成物、または請求項１６７～１７２に記載の医薬組成物を含む、キット。
  174. 前記マスクされたＩＬ－１２サイトカインを産生する条件下で、請求項８２に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項３２～１５４のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカインを産生する方法。
  175. 請求項１５５に記載の切断産物を含む、組成物。
  176. 請求項１５５に記載の切断産物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
  177. 医療で使用するための、請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物。
  178. 医療で使用するための、請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ。
  179. 医療で使用するための、請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカイン。
  180. 医療で使用するための、請求項１６５または請求項１６６に記載の組成物。
  181. 医療で使用するための、請求項１６７～１７２に記載の医薬組成物。
  182. 医療で使用するための、請求項１５５に記載の切断産物。
  183. 対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  184. 対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグの有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  185. 対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカインの有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  186. 対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項１６５または請求項１６６に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  187. 対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項１６７～１７２に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  188. 対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項１５５に記載の切断産物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  189. 対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカインの有効量を前記対象に投与することを含み、それによって、前記サイトカインプロドラッグまたはマスクされたサイトカインが、インビボでタンパク質分解的に切断されて、請求項１５５に定義される切断産物を生成する、方法。
  190. 対象において癌を治療または予防する方法であって、その同族受容体に結合することができる切断産物をインビボで作製する工程を含み、前記切断産物は、請求項１５５に定義されるとおりである、方法。
  191. 前記癌が固形腫瘍である、請求項１８３～１９０のいずれか一項に記載の方法。
  192. 癌の治療または予防に使用するための、請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン。
  193. 癌を治療または予防する方法で使用するための、請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカインであって、前記方法は、有効量の前記マスクされたＩＬ－１２サイトカインを前記対象に投与することを含み、それによって、前記マスクされたサイトカインが、インビボでタンパク質分解的に切断され、請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物を生成する、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン。
  194. 前記癌が固形腫瘍である、請求項１０３に記載の使用のためのマスクされたＩＬ－１２サイトカイン。
  195. 癌の治療または予防に使用するための、請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物。
  196. 癌の治療または予防に使用するための、請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ。
  197. 癌の治療または予防に使用するための、請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカイン。
  198. 癌の治療または予防に使用するための、請求項１６５または請求項１６６に記載の組成物。
  199. 癌の治療または予防に使用するための、請求項１６７～１７２に記載の医薬組成物。
  200. 癌の治療または予防に使用するための、請求項１５５に記載の切断産物。
  201. 前記癌が固形腫瘍である、請求項１９５に記載のポリペプチド薬物構築物、請求項１９６に記載の使用のためのサイトカインプロドラッグ、請求項１９７に記載の使用のためのマスクされたサイトカイン、請求項１９８に記載の使用のための組成物、請求項１９９に記載の使用のための医薬組成物、または請求項２００に記載の使用のための切断産物。
  202. 癌を治療または予防する方法で使用するための、請求項１５５に記載の切断産物であって、前記方法は、請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物、請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカインを患者に投与し、それによって、インビボで前記タンパク質分解的に切断可能なペプチドリンカーのタンパク質切断によって前記切断産物を産生する工程を含む、切断産物。
  203. 対象において癌を治療または予防する方法で使用するための請求項１５５に記載の切断産物であって、前記方法が、前記対象に投与された請求項１～３０のいずれかに記載のポリペプチド薬物構築物、請求項３１に記載のサイトカインプロドラッグ、または請求項３２～１５４のいずれかに記載のマスクされたサイトカインのインビボでのタンパク質切断によって前記切断産物を産生する工程を含む、切断産物。
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