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JP6870015B2 - 遺伝子産物の発現を変更するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および方法 - Google Patents

遺伝子産物の発現を変更するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および方法 Download PDF

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JP6870015B2
JP6870015B2 JP2019035911A JP2019035911A JP6870015B2 JP 6870015 B2 JP6870015 B2 JP 6870015B2 JP 2019035911 A JP2019035911 A JP 2019035911A JP 2019035911 A JP2019035911 A JP 2019035911A JP 6870015 B2 JP6870015 B2 JP 6870015B2
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Description

関連出願および参照による組み込み
本出願は、それぞれ２０１３年７月２日および２０１３年１０月１５日に出願された、それぞれＢｒｏａｄ参照ＢＩ−２０１１／００８Ａを有する、標題ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＡＬＴＥＲＩＮＧ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＧＥＮＥ ＰＲＯＤＵＣＴＳの米国仮特許出願第６１／８４２，３２２号明細書および米国特許出願第１４／０５４，４１４号明細書の優先権を主張する。それぞれＢｒｏａｄ参照ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０１、ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０２、Ｂｒｏａｄ参照ＢＩ−２０１１／００８／ＶＰ整理番号４４７９０．０２．２００３およびＢＩ−２０１１／００８／ＶＰ整理番号４４７９０．０３．２００３を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書、同第６１／７４８，４２７号明細書、同第６１／７９１，４０９号明細書および同第６１／８３５，９３１号明細書の優先権も主張され、これらは全て標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ２０１２年１２月１２日、２０１３年１月２日、２０１３年３月１５日および２０１３年６月１７日に出願されたものである。
米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／７６９，０４６号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書および同第６１／８２８，１３０号明細書が参照され、それぞれ、標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ、２０１３年１月３０日；２０１３年２月２５日；２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日；２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日および２０１３年５月２８日に出願されたものである。それぞれ２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、および同第６１／８３５，９７３号明細書も参照される。
上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるような程度で参照により組み込まれる。
本発明は、一般に、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）およびその成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティング、例えば、ゲノム摂動または遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法および組成物に関する。
連邦政府により資金提供された研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により助成されたＮＩＨパイオニアアワードＤＰ１ＭＨ１００７０６のもと政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
ゲノムシーケンシング技術および分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノムターゲティング技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより因果的遺伝子変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、ならびに合成生物学、バイオテクノロジーおよび医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼがターゲティングされるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数位置をターゲティングしやすい新たなゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。
米国特許第４，８７３，３１６号明細書
多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術が差し迫って必要とされている。本発明は、この必要性に対処し、関連する利点を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（両方の用語は、本出願全体にわたり互換的に使用される）は特異的配列をターゲティングするためにカスタム化タンパク質の生成を要求しないが、単一Ｃａｓ酵素を短鎖ＲＮＡ分子によりプログラミングして特異的ＤＮＡ標的を認識させることができ、換言すると、Ｃａｓ酵素は、前記短鎖ＲＮＡ分子を使用して特異的ＤＮＡ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術および分析法のレパートリーへのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の付加により方法論が顕著に簡易化され、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が加速される。有害効果を有さずにゲノム編集にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有効に利用するため、特許請求される本発明の態様であるそれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリングおよび最適化の態様を理解することが重要である。
一態様において、本発明は、１つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変する方法であって、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し、発現する細胞中に、Ｃａｓタンパク質およびＤＮＡ分子をターゲティングする１つ以上のガイドＲＮＡを含み得るエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入し、それにより１つ以上のガイドＲＮＡが、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座をターゲティングし、Ｃａｓタンパク質が、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座を開裂し、それにより１つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することを含み得；Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、一緒に天然に存在しない方法を提供する。本発明は、２つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することができることを包含する。本発明は、ガイドＲＮＡが、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含むことをさらに包含する。好ましい実施形態において、細胞は、真核細胞であり、より好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であり、さらにより好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。本発明は、Ｃａｓタンパク質が１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得ることも包含する。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。タンパク質は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の局在における１または２つの鎖の開裂を指向する。本発明のさらなる態様において、遺伝子産物の発現を減少させ、遺伝子産物はタンパク質である。本発明は、細胞中への導入が、ウイルス粒子、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはコンジュゲーションを含み得る送達系によることを包含する。
別の態様において、本発明は、１つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変する方法であって、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し、発現する細胞中に、ａ）１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座中の標的配列とハイブリダイズする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡに作動可能に結合している第１の調節エレメント、ｂ）Ｃａｓタンパク質に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含み、成分（ａ）および（ｂ）は、系の同一または異なるベクター上にあり、それによりガイドＲＮＡは、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座をターゲティングし、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座を開裂し、それにより１つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変し；Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、一緒に天然に存在しない１つ以上のベクターを含み得るエンジニアリングされた天然に存在しないベクター系を導入することを含む方法を提供する。本発明は、２つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することができることを包含する。本発明は、ガイドＲＮＡが、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含むことをさらに包含する。好ましい実施形態において、細胞は、真核細胞であり、より好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であり、さらにより好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。本発明は、系のベクターが１つ以上のＮＬＳをさらに含み得ることも包含する。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。タンパク質は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の局在における１または２つの鎖の開裂を指向する。本発明のさらなる態様において、遺伝子産物の発現を減少させ、遺伝子産物はタンパク質である。本発明は、細胞中への導入が、ウイルス粒子、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはコンジュゲーションを含み得る送達系によることを包含する。
本発明はまた、ａ）１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座中の標的配列とハイブリダイズする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡに作動可能に結合している第１の調節エレメント、ｂ）Ｃａｓタンパク質に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含み、成分（ａ）および（ｂ）は、系の同一または異なるベクター上にあり、それによりガイドＲＮＡは、細胞中の１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座をターゲティングし、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座を開裂し、それにより１つ以上の遺伝子産物の発現が変更または改変され；Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、一緒に天然に存在しない１つ以上のベクターを含み得るエンジニアリングされた天然に存在しないベクター系を提供する。本発明は、２つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することができることを包含する。本発明は、ガイドＲＮＡが、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含むことをさらに包含する。好ましい実施形態において、細胞は、真核細胞であり、より好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であり、さらにより好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。本発明は、系のベクターが１つ以上のＮＬＳをさらに含み得ることも包含する。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。タンパク質は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の局在における１または２つの鎖の開裂を指向する。本発明のさらなる態様において、遺伝子産物の発現を減少させ、遺伝子産物はタンパク質である。本発明は、細胞中への導入が、ウイルス粒子、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはコンジュゲーションを含み得る送達系によることを包含する。
さらに別の態様において、本発明は、Ｃａｓタンパク質および細胞中の１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座をターゲティングする１つ以上のガイドＲＮＡを含み得、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座を開裂し、それにより１つ以上の遺伝子産物の発現が変更または改変され；Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、一緒に天然に存在しないエンジニアリングされたプログラマブルな天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。本発明は、２つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することができることを包含する。本発明は、ガイドＲＮＡが、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含むことをさらに包含する。好ましい実施形態において、細胞は、真核細胞であり、より好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であり、さらにより好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が１つ以上のＮＬＳをさらに含み得ることも包含する。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。タンパク質は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の局在における１または２つの鎖の開裂を指向する。本発明のさらなる態様において、遺伝子産物の発現を減少させ、遺伝子産物はタンパク質である。本発明は、細胞中への導入が、ウイルス粒子、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはコンジュゲーションを含み得る送達系によることを包含する。
一態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一部の実施形態において、系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含み；成分（ａ）および（ｂ）は、系の同一または異なるベクター上にある。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、系は、第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下でｔｒａｃｒ配列を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。最適アラインメントの決定は、当業者の技能の範囲内である。例えば、公開および市販のアラインメントアルゴリズムおよびプログラム、例えば、限定されるものではないが、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ｍａｔｌａｂにおけるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、ＢｉｏｐｙｔｈｏｎおよびＳｅｑＭａｎが存在する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。理論により拘束されるものではないが、核局在化配列は、真核生物中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性に必要でないが、そのような配列を含めることにより、特に核中の核酸分子のターゲティングに関して系の活性が向上すると考えられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。一般に、および本明細書全体で、用語「ベクター」は、それが結合した別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、または部分二本鎖の核酸分子；１つ以上の自由末端を含み、自由末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および当技術分野において公知の他の種々のポリヌクレオチドが挙げられる。あるタイプのベクターは、「プラスミド」であり、それは、付加ＤＮＡセグメントを例えば標準分子クローニング技術により挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、それにおいてウイルス由来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター中に存在する。ウイルスベクターとしては、宿主細胞中への形質移入のためにウイルスにより担持されるポリヌクレオチドも挙げられる。あるベクターは、それが導入された宿主細胞中で自己複製し得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中にインテグレートされ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、それが作動的に結合している遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得、そのことは、組換え発現ベクターが、発現に使用すべき宿主細胞に基づき選択することができ、発現させるべき核酸配列に作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクターのうち、「作動可能に結合している」は、目的ヌクレオチド配列が調節エレメントに、そのヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系またはベクターが宿主細胞中に導入された場合、宿主細胞中で）を可能とするように結合していることを意味するものとする。
用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントとしては、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を指向するものおよびある宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的組織、例えば、筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特異的臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞タイプ（例えば、リンパ球）中で発現を指向し得る。調節エレメントは、時間依存的様式、例えば、細胞周期依存的または発生段階依存的様式の発現も指向し得、それは、組織または細胞タイプ特異的であってもなくてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩプロモーター）、またはそれらの組合せを含む。ｐｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」により、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ中のＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエキソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが当業者により認識される。ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより本明細書に記載の核酸によりコードされる転写物、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質、またはペプチド（例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異体、それらの融合タンパク質など）を産生することができる。
有利なベクターとしては、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられ、そのようなベクターのタイプは、特定のタイプの細胞のターゲティングのために選択することもできる。
一態様において、本発明は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む真核宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、宿主細胞は、成分（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態において、成分（ａ）、成分（ｂ）、または成分（ａ）および（ｂ）は、宿主真核細胞のゲノム中に安定的にインテグレートされている。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、真核宿主細胞は、前記ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。一態様において、本発明は、記載の実施形態のいずれかによる真核宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは、多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載の実施形態のいずれかによる真核宿主細胞を含む真核生物；好ましくは、多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば、哺乳動物であり得る。また、生物は、節足動物、例えば、昆虫であり得る。生物は、植物でもあり得る。さらに、生物は、真菌であり得る。
一態様において、本発明は、本明細書に記載の成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ベクター系およびキットの使用指示書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む。一部の実施形態において、キットは、系の同一または異なるベクター上にある成分（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、系は、前記ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。
一態様において、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。一部の実施形態において、前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、方法は、外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターを対象中の真核細胞中に送達する。一部の実施形態において、前記改変を、細胞培養物中の前記真核細胞中で行う。一部の実施形態において、方法は、前記改変前に前記真核細胞を対象から単離することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、前記真核細胞および／またはそれに由来する細胞を前記対象に戻すことをさらに含む。
一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。一部の実施形態において、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする。
一態様において、本発明は、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患を有し、または発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする）および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）、それにより、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、方法は、外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。
一態様において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナリングイベントをモジュレートする生物活性剤を開発する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患を有し、または発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）試験化合物を、記載の実施形態のいずれか１つのモデル細胞と接触させること；および（ｂ）前記疾患遺伝子中の前記突然変異に関連する細胞シグナリングイベントの低減または増大を示すリードアウトの変化を検出し、それにより、前記疾患遺伝子に関連する前記細胞シグナリングイベントをモジュレートする前記生物活性剤を開発することを含む。
一態様において、本発明は、ｔｒａｃｒメイト配列の上流のガイド配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中に存在する対応する標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞中に存在するウイルス配列である。一部の実施形態において、標的配列は、原癌遺伝子または癌遺伝子である。
一態様において、本発明は、１つ以上の細胞中の遺伝子中の１つ以上の突然変異を導入することにより１つ以上の細胞を選択する方法であって、１つ以上のベクターを細胞中に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、および編集テンプレートの１つ以上の発現をドライブし；編集テンプレートは、ＣＲＩＳＰＲ酵素開裂を停止させる１つ以上の突然変異を含む）；編集テンプレートと、選択すべき細胞中の標的ポリヌクレオチドとを相同組換えさせること；ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、標的ポリヌクレオチドへのＣＲＩＳＰＲ複合体の結合は、細胞死を誘導する）、それにより、１つ以上の突然変異が導入された１つ以上の細胞の選択を可能とすることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、酵素は、標的配列の局在における１または２つの鎖の開裂を指向する。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９である。本発明の別の好ましい実施形態において、選択すべき細胞は、真核細胞であり得る。本発明の態様により、選択マーカーもカウンターセレクション系を含み得る２ステッププロセスも要求せずに規定の細胞の選択が可能となる。
本発明の態様は、内因性ゲノム中の部位特異的遺伝子ノックアウトを包含した：本発明は、亜鉛フィンガーおよびＴＡＬエフェクターをベースとする部位特異的ヌクレアーゼ技術の使用と比べて有利である。それというのも、これは複雑な設計を要求せず、これを使用して同一ゲノム内の複数の遺伝子を同時にノックアウトすることができるためである。さらなる態様において、本発明は、部位特異的ゲノム編集を包含する。本発明は、天然または人工部位特異的ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼの使用と比べて有利である。それというのも、これは部位特異的二本鎖切断を導入してターゲティングされるゲノム遺伝子座における相同組換えを促進し得るためである。別の態様において、本発明は、ＤＮＡ配列特異的干渉を包含する。本発明を使用して有害ＤＮＡベース生物、例えば、微生物、ウイルス、またはさらには癌性細胞のゲノムを、これらの生物のゲノム中の特異的部位における切断の直接的な導入により不活性化することができる。本発明は、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を複数の配列特異的ＣＲＩＳＰＲスペーサーエレメントまたはガイド配列の使用を通してゲノム中の複数の部位に容易にターゲティングさせることができるため、多重化ゲノムエンジニアリングのための方法および組成物を提供する。
したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に公知の生成物、作製方法、または使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条、第１段落）またはＥＰＯ（欧州特許条約第８３条）の記載要件および実施可能要件を満たさない任意の生成物、方法、または生成物の作製または生成物の使用方法を、本発明の範囲に包含しないものとし、したがって、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に記載の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法の放棄を本明細書に開示することがさらに留意される。
本開示および特に特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に記述されない構成要素を許容するが、先行技術に見出され、または本発明の基本もしくは新規特徴に影響する構成要素を排除することが留意される。これらのおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明により開示され、またはそれから明らかであり、それにより包含される。
本発明の新規特徴を、特に添付の特許請求の範囲を用いて記載する。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される説明的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付属の図面を参照することにより得られる。
ＣＲＩＳＰＲ系の模式的モデルを示す。化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼ（黄色）を、２０ｎｔガイド配列（青色）および足場（赤色）からなる合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によりゲノムＤＮＡにターゲティングする。必要な５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；マゼンタ）のすぐ上流のＤＮＡ標的（青色）とのガイド配列塩基対、およびＣａｓ９は、ＰＡＭの約３ｂｐ上流の二本鎖切断（ＤＳＢ）（赤色三角）を媒介する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図２Ｃは、配列番号２３〜２４をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｅは、配列番号２５〜２７をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｆは、配列番号２８〜３２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図２Ｃは、配列番号２３〜２４をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｅは、配列番号２５〜２７をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｆは、配列番号２８〜３２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図２Ｃは、配列番号２３〜２４をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｅは、配列番号２５〜２７をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｆは、配列番号２８〜３２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図２Ｃは、配列番号２３〜２４をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｅは、配列番号２５〜２７をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｆは、配列番号２８〜３２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図２Ｃは、配列番号２３〜２４をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｅは、配列番号２５〜２７をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｆは、配列番号２８〜３２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現のための例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図２Ｃは、配列番号２３〜２４をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｅは、配列番号２５〜２７をそれぞれ出現の順に開示する。図２Ｆは、配列番号２８〜３２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。図３Ａは、配列番号３３、２６および３４〜４４をそれぞれ出現の順に開示する。図３Ｃは、配列番号３３を開示する。 例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。図３Ａは、配列番号３３、２６および３４〜４４をそれぞれ出現の順に開示する。図３Ｃは、配列番号３３を開示する。 例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。図３Ａは、配列番号３３、２６および３４〜４４をそれぞれ出現の順に開示する。図３Ｃは、配列番号３３を開示する。 例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。図３Ａは、配列番号３３、２６および３４〜４４をそれぞれ出現の順に開示する。図３Ｃは、配列番号３３を開示する。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。図４Ｅは、配列番号４５を開示する。図４Ｆは、配列番号４６〜４７をそれぞれ出現の順に開示する。図４Ｇは、配列番号４８〜５２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。図４Ｅは、配列番号４５を開示する。図４Ｆは、配列番号４６〜４７をそれぞれ出現の順に開示する。図４Ｇは、配列番号４８〜５２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。図４Ｅは、配列番号４５を開示する。図４Ｆは、配列番号４６〜４７をそれぞれ出現の順に開示する。図４Ｇは、配列番号４８〜５２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。図４Ｅは、配列番号４５を開示する。図４Ｆは、配列番号４６〜４７をそれぞれ出現の順に開示する。図４Ｇは、配列番号４８〜５２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。図４Ｅは、配列番号４５を開示する。図４Ｆは、配列番号４６〜４７をそれぞれ出現の順に開示する。図４Ｇは、配列番号４８〜５２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。図４Ｅは、配列番号４５を開示する。図４Ｆは、配列番号４６〜４７をそれぞれ出現の順に開示する。図４Ｇは、配列番号４８〜５２をそれぞれ出現の順に開示する。 例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。図４Ｅは、配列番号４５を開示する。図４Ｆは、配列番号４６〜４７をそれぞれ出現の順に開示する。図４Ｇは、配列番号４８〜５２をそれぞれ出現の順に開示する。 プロトスペーサー配列（それぞれ、出現の順に配列番号１６、１５、１４、５３〜５８、１８、１７および５９〜６３）の表を提供し、ヒトおよびマウスゲノム中の遺伝子座に対する例示的な化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系をベースに設計されたプロトスペーサー標的についての改変効率結果を対応するＰＡＭとともにまとめる。細胞を、Ｃａｓ９およびプレｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡまたはキメラＲＮＡのいずれかにより形質移入し、形質移入から７２時間後に分析した。インデルパーセントを、示される細胞系からのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果に基づき算出した（全てのプロトスペーサー標的についてＮ＝３、誤差は標準誤差、Ｎ．Ｄ．は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して検出不可能を示し、Ｎ．Ｔ．は、本試験において試験しなかったことを示す）。 Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。図６Ａは、配列番号６４〜６５をそれぞれ出現の順に開示する。 Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。図６Ａは、配列番号６４〜６５をそれぞれ出現の順に開示する。 Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。図６Ａは、配列番号６４〜６５をそれぞれ出現の順に開示する。 二本鎖切断誘導微小挿入および欠失の検出のためのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの模式図を示す。 真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的バイシストロニック発現ベクターを示す。図８Ａは、配列番号６６〜６８をそれぞれ出現の順に開示する。図８Ｂは、配列番号６９〜７１をそれぞれ出現の順に開示する。 ヒトゲノム中の隣接化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０遺伝子座１ＰＡＭ（ＮＧＧ）（図９Ａ）と、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ９遺伝子座２ＰＡＭ（ＮＮＡＧＡＡＷ）（図９Ｂ）との間の距離のヒストグラム；および染色体（Ｃｈｒ）ごとのそれぞれのＰＡＭについての距離（図９Ｃ）を示す。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図１０Ｂは、配列番号７２〜７３をそれぞれ出現の順に開示する。図１０Ｃは、配列番号７４を開示する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図１０Ｂは、配列番号７２〜７３をそれぞれ出現の順に開示する。図１０Ｃは、配列番号７４を開示する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図１０Ｂは、配列番号７２〜７３をそれぞれ出現の順に開示する。図１０Ｃは、配列番号７４を開示する。 例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。図１０Ｂは、配列番号７２〜７３をそれぞれ出現の順に開示する。図１０Ｃは、配列番号７４を開示する。 哺乳動物細胞中のゲノム遺伝子座のターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作を示す。図１１Ａは、配列番号７５を開示する。図１１Ｂは、配列番号７６〜７８をそれぞれ出現の順に開示する。 哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングのノザンブロット分析の結果を示す。図１２Ａは、配列番号７９を開示する。 ヒトＰＶＡＬＢおよびマウスＴｈ遺伝子座中のプロトスペーサーの例示的選択を示す。図１３Ａは、配列番号８０を開示する。図１３Ｂは、配列番号８１を開示する。 ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の例示的プロトスペーサーおよび対応するＰＡＭ配列標的を示す。図１４は、配列番号７４を開示する。 Ｓｕｒｖｅｙｏｒ、ＲＦＬＰ、ゲノムシーケンシング、およびノザンブロットアッセイに使用されたプライマーおよびプローブについての配列（それぞれ出現の順に配列番号８２〜９３）の表を提供する。 キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。図１６Ａは、配列番号９４を開示する。 キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。図１６Ａは、配列番号９４を開示する。 キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。図１６Ａは、配列番号９４を開示する。 真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果のグラフ表示を示す。 ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用するヒトゲノム中の一部の化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位の例示的可視化を示す。図１８は、配列番号９５〜１７３をそれぞれ出現の順に開示する。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。図２１Ｃは、配列番号１７４〜１７６、１７４、１７７および１７６をそれぞれ出現の順に開示する。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ１標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。 相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。図２１Ｃは、配列番号１７４〜１７６、１７４、１７７および１７６をそれぞれ出現の順に開示する。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ１標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。 相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。図２１Ｃは、配列番号１７４〜１７６、１７４、１７７および１７６をそれぞれ出現の順に開示する。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ１標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。 相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。図２１Ｃは、配列番号１７４〜１７６、１７４、１７７および１７６をそれぞれ出現の順に開示する。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ１標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。 ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。図２２Ａは、配列番号１７８〜１８０をそれぞれ出現の順に開示する。図２２Ｂは、配列番号１８１を開示する。 ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。図２２Ａは、配列番号１７８〜１８０をそれぞれ出現の順に開示する。図２２Ｂは、配列番号１８１を開示する。
本明細書における図面は、説明目的のためのものにすぎず、必ずしも一定の縮尺で描画されるものではない。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を遂行し得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座（遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチド構造の改変は、存在する場合、ポリマーの集合前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後に例えば標識成分とのコンジュゲーションによりさらに改変することができる。
本発明の態様において、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」は、標的部位を規定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐ配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用することができる。用語「ｔｒａｃｒメイト配列」も、用語「ダイレクトリピート」と互換的に使用することができる。例示的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を図１に示す。
本明細書において使用される用語「野生型」は、当業者により理解される当技術分野の用語であり、突然変異体またはバリアント形態から区別される天然状態で生じるままの生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
本明細書において使用される用語「バリアント」は、天然状態で生じるものから逸脱するパターンを有する品質の提示を意味すると解釈すべきである。
用語「天然に存在しない」または「エンジニアリングされた」は、互換的に使用され、人工の関与を示す。この用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、核酸分子またはポリペプチドが、それらが天然状態で天然に会合し、または天然状態で見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
「相補性」は、古典的ワトソン−クリックまたは他の非古典的タイプのいずれかによる別の核酸配列との水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列との水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の残基の割合を示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続残基が第２の核酸配列中の同一数の連続残基と水素結合することを意味する。本明細書において使用される「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれよりも多いヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
本明細書において使用されるハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列に対する相補性を有する核酸が、標的配列と優位にハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存的であり、多数の因子に応じて変動する。一般に、配列が長ければ、配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度が高い。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。
「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの開裂におけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補鎖」と称される。
本明細書において使用される「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称することができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中のｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得、それは、改変アミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸により中断されていてよい。この用語は、改変、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションを受けたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用される用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含む。
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを指すために互換的に使用される。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ネズミ、サル、ヒト、家畜、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。インビボで得られ、またはインビトロで培養される生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。
用語「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」、「治療可能薬剤」または「治療剤（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）」は、互換的に使用され、対象への投与時にいくつかの利益効果を付与する分子または化合物を指す。利益効果としては、診断測定の使用可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の改善；疾患、症状、障害または病態の軽減またはその発症の予防；および一般には疾患、症状、障害または病的状態の中和が挙げられる。
本明細書において使用される「治療」もしくは「治療する」または「緩和する」または「改善する」は、互換的に使用される。これらの用語は、利益または所望の結果、例として、限定されるものではないが、治療利益および／または予防利益を得るためのアプローチを指す。治療利益は、治療中の１つ以上の疾患、病態、または症状の任意の治療関連改善またはそれらに対する効果を意味する。予防利益については、疾患も、病態も、症状もこれまで顕在化し得なかった場合であっても、組成物を特定の疾患、病態、もしくは症状の発症リスクのある対象に、または疾患の生理学的症状の１つ以上を報告する対象に投与することができる。
用語「有効量」または「治療有効量」は、利益または所望の結果を生じさせるために十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与様式などの１つ以上に応じて変動し得、それらは当業者が容易に決定することができる。この用語は、本明細書に記載のイメージング法のいずれか１つによる検出のための画像を提供する用量にも当てはまる。規定の用量は、選択される特定の薬剤、遵守すべき投与レジメン、他の化合物との組合せで投与するか否か、投与のタイミング、イメージングすべき組織、およびそれが担持される物理的送達系の１つ以上に応じて変動し得る。
本発明の実施は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの慣用の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））参照。
本発明のいくつかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系、またはベクター自体に関する。ベクターは、原核または真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターをインビトロで、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して転写および翻訳させることができる。
ベクターは、原核細胞中に導入し、その中で増殖させることができる。一部の実施形態において、原核生物を使用して真核細胞中に導入すべきベクターのコピーを増幅し、または真核細胞中に導入すべきベクターの産生における中間ベクターとして使用される（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅）。一部の実施形態において、原核生物を使用してベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させ、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つ以上のタンパク質の資源を提供する。原核生物中のタンパク質の発現は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的または誘導的プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；および（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の支援を果たし得る。融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解開裂部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能とすることが多い。このような酵素、およびそのコグネート認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。例示的融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する。
好適な誘導的非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）中の発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中のタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中のタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中の１つ以上の配列の発現をドライブし得る。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクター制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示の他のものおよび当技術分野において公知のものに由来する。原核および真核細胞の両方のために他の好適な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照。
一部の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ中の核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生制御プロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。
一部の実施形態において、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするようにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに作動可能に結合している。一般に、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）は、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ））としても公知であり、通常、特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で認識された区別されるクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；およびＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中で同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には他のＳＳＲとリピートの構造が異なり、それは短鎖等間隔リピート（ＳＲＳＲ）と称されている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、リピートは、実質的に一定の長さを有するユニーク介入配列により等間隔とされているクラスターで生じる短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、株ごとに異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０を超える原核生物中で同定されており（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］参照）、例として、限定されるものではないが、アエロパイラム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、パイロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロバス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロバス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロカーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アキフェックス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポーフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アザーカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミクソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）である。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物および他のエレメント、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分ダイレクトリピートを包含）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を指す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全相補性は必ずしも要求されず、但し、ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するために十分な相補性が存在することを条件とする。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質中に局在している。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたはクロロプラスト内に存在し得る。標的配列を含むターゲティングされる遺伝子座中への組換えに使用することができる配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。本発明の態様において、外因性テンプレートポリヌクレオチドを編集テンプレートと称することができる。本発明の一態様において、組換えは、相同組換えである。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成しているガイド配列を含む）は、標的配列中または付近（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多い塩基対内）の一方または両方の鎖の開裂をもたらす。理論により拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約または約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド）を含み得、またはそれからなっていてよく、例えば、ガイド配列に作動可能に結合しているｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部とのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿うハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するためにｔｒａｃｒメイト配列に対する十分な相補性を有する。標的配列と同様に、完全相補性は必要とされず、但し、機能的であるために十分な相補性が存在することを条件とすることが考えられる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターを宿主細胞中に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指向する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に結合させることができる。あるいは、同一または異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上を単一ベクター中で合わせることができ、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の成分を提供する１つ以上の追加のベクターは第１のベクター中に含まれない。単一ベクター中で合わせるＣＲＩＳＰＲ系エレメントは、任意の好適な配向で配置することができ、例えば、あるエレメントを第２のエレメントに対して５’側（の上流）にまたは３’側（の下流）に局在化することができる。あるエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列の同一または逆鎖上で局在化し、同一または逆向きで配向させることができる。一部の実施形態において、単一のプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、ならびに１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれているガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（場合により、ガイド配列に作動可能に結合している）、およびｔｒａｃｒ配列（例えば、それぞれが異なるイントロン中に、２つ以上が少なくとも１つのイントロン中に、または全部が単一のイントロン中に存在する）の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同一のプロモーターに作動可能に結合しており、それから発現される。ＳｐＣａｓ９の単一ベクター構築物を図２２に示す。
一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超える挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に局在している。一部の実施形態において、ベクターは、ｔｒａｃｒメイト配列の上流、および場合によりｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に結合している調節エレメントの下流の挿入部位を含み、その結果、挿入部位中へのガイド配列の挿入後および発現時にガイド配列が真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含み、それぞれの挿入部位は、それぞれの部位におけるガイド配列の挿入を可能とするために２つのｔｒａｃｒメイト配列間に局在している。このような配置において、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、またはそれらの組合せを含み得る。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一発現構築物を使用して細胞内の複数の異なる対応する標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ活性をターゲティングすることができる。例えば、単一ベクターは、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれよりも多い数を超えるガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるそのようなガイド配列含有ベクターを提供し、場合により細胞に送達することができる。
一部の実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中にアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２のもと見出すことができる。一部の実施形態において、非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ開裂活性を有し、例えば、Ｃａｓ９である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であり、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのＣａｓ９であり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれよりも多い塩基対内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素に対して突然変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、その結果、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を欠く。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を開裂する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変える突然変異の他の例としては、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。本発明の態様において、ニッカーゼは、相同組換えを介するゲノム編集に使用することができる。例えば、図２１は、相同組換えを介するゲノム編集を示す。図２１（ａ）は、ＲｕｖＣＩ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図を示す。（ｂ）修復テンプレートとしてのセンスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ１標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、ＤＮＡ標的のセンスおよびアンチセンス鎖をそれぞれターゲティングする２つのガイド配列との組合せで使用することができる。この組合せにより、両方の鎖をニック形成し、それを使用してＮＨＥＪを誘導することが可能となる。本出願人らは、突然変異原性ＮＨＥＪの誘導における２つのニッカーゼ標的（すなわち、同一局在であるがＤＮＡの異なる鎖にターゲティングされるｓｇＲＮＡ）の効力を実証した（データ示さず）。単一ニッカーゼ（単一ｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９−Ｄ１０Ａ）は、ＮＨＥＪを誘導し、インデルを創成し得ないが、本出願人らは、二重ニッカーゼ（同一局在における異なる鎖にターゲティングされるＣａｓ９−Ｄ１０Ａおよび２つのｓｇＲＮＡ）がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）中でそれを行い得ることを示した。効率は、ｈＥＳＣ中でヌクレアーゼ（すなわち、Ｄ１０突然変異を有さない通常のＣａｓ９）の約５０％である。
さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、およびＲｕｖＣ ＩＩＩ）を突然変異させて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠く突然変異Ｃａｓ９を産生することができる。一部の実施形態において、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素を産生する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ開裂活性がその非突然変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、またはそれよりも小さい数未満である場合、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くとみなす。他の突然変異は有用であり得；Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ酵素は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の種からのものである場合、対応するアミノ酸の突然変異は、類似効果を達成するように作製することができる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物、例えば、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類のものまたはそれに由来し得る。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い数を超えるコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度または最も高頻度のコドンにより置き換える一方、天然アミノ酸配列を維持することにより目的宿主細胞中の発現の向上のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、このことは、次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存的であると考えられる。細胞中で選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき所与の生物中の最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の手法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）参照。特定の宿主細胞中の発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も高頻度で使用されるコドンに対応する。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍをベースとするアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、またはそれよりも小さい数未満のヌクレオチド長である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分、例として、試験すべきガイド配列は、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターによる形質移入により提供することができ、次いで標的配列内の優先的開裂を例えば本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の開裂は、試験管中で標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分、例として、試験すべきガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、試験および対照ガイド配列反応間の標的配列における結合または開裂の比率を比較することにより評価することができる。他のアッセイが考えられ、当業者はそれを認識する。
ガイド配列は、任意の標的配列をターゲティングするように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列としては、標的ゲノム中でユニークなものが挙げられる。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれでもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号１）のＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号２）（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、ＡまたはＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号３）のＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号４）（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、ＡまたはＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり得、配列をユニークと同定するにあたり考慮する必要はない。
一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムにより決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの算出をベースとする。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されている。別の例示的フォールディングアルゴリズムは、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用するＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにより開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えばＡ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；およびＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。さらなるアルゴリズムは、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／８３６，０８０号明細書（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ａ）に見出すことができる。
一般に、ｔｒａｃｒメイト配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞中でｔｒａｃｒメイト配列によりフランキングされているガイド配列の切り出し；および（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列を含む）の１つ以上を促進するためにｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列の短い方の長さに沿うｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに準拠する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、二次構造、例えばｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列内の自己相補性をさらに説明し得る。一部の実施形態において、２つの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の相補性の程度は、最適にアラインされた場合、約または約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の最適なアラインメントの例示的説明を図１０Ｂおよび１１Ｂに提供する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、約または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｔメイト配列は、単一転写物内に含有され、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションが二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を産生する。ヘアピン構造において使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替配列であり得るようにより長いまたは短いループ配列を使用することができる。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、および追加のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。本発明の一実施形態において、転写物または転写されるポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態において、転写物は、２、３、４または５つのヘアピンを有する。本発明の別のさらなる実施形態において、転写物は、多くとも５つのヘアピンを有する。一部の実施形態において、単一転写物は、転写終結配列をさらに含み；好ましくは、これはポリＴ配列、例えば、６つのＴヌクレオチドである。このようなヘアピン構造の例示的説明を、図１１Ｂの下方位置に提供し、最後の「Ｎ」およびループの上流の５’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒメイト配列に対応し、ループの３’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に列記）、「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、第１の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒメイト配列を表し、第２の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：
Figure 0006870015
 一部の実施形態において、配列（１）から（３）は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、配列（４）から（６）は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列を含む転写物と別個の転写物である（例えば、図１１Ｂの上図に説明されるもの）。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の他の約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および場合により任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができるタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性および核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合し、または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片、例として、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態において、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。
本発明の一態様において、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられるレポーター遺伝子を、細胞中に導入して遺伝子産物の発現の変更または改変を計測するマーカーとして機能する遺伝子産物をコードすることができる。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を、ベクターを介して細胞中に導入することができる。本発明の好ましい実施形態において、遺伝子産物は、ルシフェラーゼである。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子産物の発現を減少させる。
一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、または本明細書に記載の１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、および／またはそれから転写された１つもしくはタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。本発明は、ＤＮＡベースのゲノムのターゲティングされる改変を可能とするための基本的なプラットフォームとして機能する。これは、多くの送達系、例として、限定されるものではないが、ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびコンジュゲーションと調和し得る。一部の態様において、本発明は、そのような細胞により産生された細胞、およびそのような細胞を含み、またはそれから産生された生物（例えば、動物、植物、または真菌）をさらに提供する。一部の実施形態において、ガイド配列との組合せの（および場合によりそれと複合体形成している）ＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞に送達する。慣用のウイルスおよび非ウイルスベース遺伝子移入法を使用して核酸を哺乳動物細胞または標的組織中に導入することができる。このような方法を使用してＣＲＩＳＰＲ系の成分をコードする核酸を培養物中の細胞に、または宿主生物中に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性またはインテグレートされるゲノムを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）参照。
核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により向上されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；および同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオンおよび中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞（例えば、インビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
脂質：核酸複合体、例として、ターゲティングされるリポソーム、例えば、免疫脂質複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、および同第４，９４６，７８７号明細書参照）。
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系の使用は、ウイルスを体内の規定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（インビボ）、またはそれらを使用してインビトロで細胞を治療することができ、場合により、改変された細胞を患者に投与することができる（エクスビボ）。慣用のウイルスベース系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノム中のインテグレーションは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法について考えられ、挿入されたトランス遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプおよび標的組織において観察されている。
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むことにより変え、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的には、高ウイルス力価を産生し得るレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のためのパッケージング能を有するシス作用長鎖末端リピートを含む。最小シス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでそれを使用して治療遺伝子を標的細胞中にインテグレートして恒久的なトランス遺伝子発現を提供する。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするもの、またはそれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書参照）。一過的発現が好ましい用途においては、アデノウイルスベース系を使用することができる。アデノウイルスベースベクターは、多くの細胞タイプにおいて極めて高い形質導入効率を示し得、細胞分裂を要求しない。このようなベクターについて、高い力価および発現のレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。
典型的には、パッケージング細胞を使用して宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成する。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することにより生成する。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび後続の宿主中へのインテグレーションに要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるべきポリヌクレオチドのための発現カセットにより置き換えられている。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によりトランスで供給する。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム中へのパッケージングおよびインテグレーションに要求されるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系中にパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにより感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により低減させることができる。核酸を細胞に送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書参照。
一部の実施形態において、宿主細胞を、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入する。一部の実施形態において、細胞を、それが対象中で天然に生じるままで形質移入する。一部の実施形態において、形質移入される細胞を対象から採取する。一部の実施形態において、細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞系に由来する。組織培養のための広範な細胞系は、当技術分野において公知である。細胞系の例としては、限定されるものではないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞系、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞系は、当業者に公知の種々の資源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより形質移入された細胞を使用して１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系の成分により一過的に形質移入され（例えば、１つ以上のベクターの一過的形質移入、またはＲＮＡによる形質移入により）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して改変を含有するがあらゆる他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入された細胞、またはそのような細胞に由来する細胞系を、１つ以上の試験化合物の評価において使用する。
本発明の態様は、疾患の遺伝子変動の研究のための哺乳動物細胞の同質遺伝子系統の生成に関する。本発明のさらなる態様は、トランスジェニックまたはウイルス媒介送達のいずれかの遺伝子改変動物モデルの生成に関する。本発明はまた、生物医学的、農業的、および工業的に有用な産物の生成のための微生物、細胞、植物、動物または合成生物のゲノム改変を包含する。さらに別の態様において、本発明は、遺伝子療法を包含する。本発明は、ゲノムの理解、例えば、遺伝子ノックアウト研究のための生物学的研究ツールとして使用することができる。本発明は、ゲノムのＤＮＡ内容物を編集および書き換える基本的能力、ならびにＤＮＡベース生物のターゲティングされる不活性化に依存する多くの他の方法および組成物に関する。本発明はまた、細菌感染、ウイルス感染などの規定の株をターゲティングする治療剤として使用することができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターを使用して非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を産生する。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはウサギである。ある実施形態において、生物または対象は、植物である。ある実施形態において、生物または対象または植物は、藻類である。トランスジェニック植物および動物を産生する方法は、当技術分野において公知であり、一般に、例えば、本明細書に記載の細胞形質移入の方法から出発する。トランスジェニック植物、特に作物および藻類と同様にトランスジェニック動物も提供される。トランスジェニック動物または植物は、疾患モデルの提供を除く用途において有用であり得る。これらとしては、例えば、野生型において通常見られるよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素またはビタミンレベルの発現を通す食物または飼料生産を挙げることができる。これに関して、トランスジェニック植物、特に豆類および塊茎、ならびに動物、特に哺乳動物、例えば家畜（ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタ）、さらには家禽および食用昆虫が好ましい。
トランスジェニック藻類または他の植物、例えば、セイヨウアブラナは、例えば、植物油またはバイオ燃料、例えば、アルコール（特にメタノールおよびエタノール）の産生において特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業において使用される高レベルの油またはアルコールを発現または過剰発現するようにエンジニアリングすることができる。
一態様において、本発明は、インビボ、エクスビボまたはインビトロであり得る真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ヒトまたは非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）から細胞または細胞の集団をサンプリングし、１つまたは複数の細胞を改変することを含む。培養は、任意の段階においてエクスビボで行うことができる。１つまたは複数の細胞は、非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）中に再導入することもできる。
一態様において、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより、標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
作物ゲノミクスの近年の進歩とともに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して効率的でコスト効率の良い遺伝子編集および操作を実施する技能により、産生の改善および形質の向上のためにそのようなゲノムを形質転換するための単一および多重化遺伝子操作の迅速な選択および比較が可能となる。これに関して、米国特許および刊行物：米国特許第６，６０３，０６１号明細書−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；米国特許第７，８６８，１４９号明細書−Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆおよび米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書−Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓが参照され、これらのそれぞれの全ての内容および開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の実施において、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５−９６の内容および開示も参照により全体として本明細書に組み込まれる。
植物において、病原体は宿主特異的であることが多い。例えば、トマト萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）は、トマト萎凋病を引き起こすが、トマトのみを攻撃し、カーネーション萎凋病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｄｉａｎｔｈｉｉ）コムギ黒さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）はコムギのみを攻撃する。植物は、ほとんどの病原体に抵抗するための既存および誘導的防御を有する。植物生成にわたる突然変異および組換えイベントは、特に病原体が植物よりも高頻度で繁殖する場合に感受性を生じさせる遺伝子変異をもたらす。植物において、非宿主耐性が存在し得、例えば、宿主および病原体は不適合性である。水平耐性、例えば、典型的には、多くの遺伝子により制御される病原体の全ての種に対する部分耐性および垂直耐性、例えば、典型的には、少数の遺伝子により制御される病原体の一部の種に対するが他の種に対するものでない完全耐性も存在し得る。遺伝子対遺伝子レベルにおいて、植物および病原体は、一緒に進化し、あるものの遺伝子変化は他の変化と均衡を保つ。したがって、自然変動を使用して、育種者は、収穫高、品質、均一性、耐寒性、耐性に最も有用な遺伝子を組み合わせる。耐性遺伝子の資源としては、天然または外来種、在来種、野生植物類縁種、および誘導突然変異、例えば、植物材料を突然変異誘発剤により処理することが挙げられる。本発明を使用して、植物育種者に、突然変異を誘導するための新たなツールを提供する。したがって、当業者は、耐性遺伝子の資源のゲノムを分析し、所望の特徴または形質を有する品種において本発明を用いて耐性遺伝子の出現を従来の突然変異誘発剤よりも正確に誘導し、したがって、植物育種プログラムを加速および改善することができる。
一態様において、本発明は、上記方法および組成物に開示のエレメントのいずれか１つ以上を含有するキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ベクター系およびキットの使用指示書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列およびガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む。エレメントは、個々にまたは組合せで提供することができ、任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、またはチューブ中で提供することができる。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の言語の、例えば、２つ以上の言語の指示書を含む。
一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載のエレメントの１つ以上を利用するプロセスにおいて使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器中で提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応または貯蔵緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態で、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を要求する形態（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、任意の緩衝液、例として、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組合せであり得る。一部の実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は、約７から約１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、キットは、ガイド配列および調節エレメントを作動可能に結合させるためのベクター中への挿入のためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、広範な有用性、例として、非常に多数の細胞タイプ中の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を有する。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後における幅広い用途範囲を有する。例示的ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、次いでｔｒａｃｔ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性または外因性である任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核中に残留するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。理論により拘束されるものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される短い配列と会合するはずであることが考えられる。ＰＡＭについての正確な配列および長さの条件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対配列である。ＰＡＭ配列の例を以下の実施例セクションに挙げ、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素について使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０１およびＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０２を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書（両方とも、標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ、それぞれ２０１２年１２月１２日および２０１３年１月２日に出願、これらの全ての内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）に列記の多数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドならびにシグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドを挙げることができる。
標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナリング生化学経路に関連する配列、例えば、シグナリング生化学経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織または細胞と比較して患部組織に由来する細胞中で異常なレベルにおいてまたは異常な形態で転写または翻訳産物を生じさせている任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得；これは、異常に低いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得、発現の変化は、疾患の発生および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の病因を直接担い、または疾患の病因を担う遺伝子と連鎖不平衡をなす突然変異または遺伝子変異を有する遺伝子も指す。転写または翻訳される産物は、既知または未知のものであり得、正常または異常レベルにおけるものであり得る。
疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。
疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表ＡおよびＢに列記する。疾患特異的情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。シグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表Ｃに列記する。
これらの遺伝子および経路中の突然変異は、不適切なタンパク質の産生または機能に影響する不適切な量のタンパク質をもたらし得る。遺伝子、疾患およびタンパク質のさらなる例は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および２０１３年１月２日に出願された同第６１／７４８，４２７号明細書から参照により本明細書に組み込まれる。このような遺伝子、タンパク質および経路は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドであり得る。
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本発明の実施形態は、遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅ならびにＤＮＡリピート不安定性および神経学的疾患に関連する特定の突然変異の修復に関連する方法および組成物にも関する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｃｔ １３，２０１１−Ｍｅｄｉｃａｌ）。規定の態様のタンデムリピート配列が２０を超えるヒト疾患を担うことが見出されている（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ・ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ．ＭｃＩｖｏｒ ＥＩ，Ｐｏｌａｋ Ｕ，Ｎａｐｉｅｒａｌａ Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：５５１−８）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してゲノム不安定性のこれらの異常を補正することができる。
本発明のさらなる態様は、ラフォラ病に関連することが同定されているＥＭＰ２ＡおよびＥＭＰ２Ｂ遺伝子の異常の補正のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の利用に関する。ラフォラ病は、青年期において癲癇性発作として始まり得る進行性ミオクローヌス癲癇を特徴とする常染色体劣性病態である。この疾患の数例は、未だ同定されていない遺伝子の突然変異により引き起こされ得る。この疾患は、発作、筋痙攣、歩行困難、認知症、および最終的に死亡を引き起こす。現在、疾患進行に対して有効であることが証明されている治療は存在しない。癲癇に関連する他の遺伝子異常を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によりターゲティングすることもでき、基礎となる遺伝学は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ，Ｇｉｕｌｉａｎｏ Ａｖａｎｚｉｎｉ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌ．Ｎｏｅｂｅｌｓにより編集，Ｍａｒｉａｎｉ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ：２０；２００９）にさらに記載されている。
本発明のさらに別の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用し、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｉａｓ Ｉ．Ｔｒａｂｏｕｌｓｉにより編集，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２にさらに記載されているいくつかの遺伝子突然変異から生じる眼の異常を補正することができる。
本発明のいくつかのさらなる態様は、米国国立衛生研究所のウェブサイト（ｈｅａｌｔｈ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃ／ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓにおけるウェブサイト）上にトピックサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている広範な遺伝子疾患に関連する異常の補正に関する。遺伝子脳疾患としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病および他のトリプレットリピート病、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチーならびにＮＩＮＤＳコルポセファリーが挙げられる。これらの疾患は、米国国立衛生研究所のウェブサイト上にサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている。
一部の実施形態において、病態は、新形成である。病態が新形成であり得る一部の実施形態において、ターゲティングすべき遺伝子は、表Ａに列記のもののいずれかであり得る（この場合、ＰＴＥＮなど）。一部の実施形態において、病態は、加齢黄斑変性症であり得る。一部の実施形態において、病態は、統合失調症であり得る。一部の実施形態において、病態は、トリヌクレオチドリピート障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、脆弱性Ｘ症候群であり得る。一部の実施形態において、病態は、セクレターゼ関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、プリオン関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、ＡＬＳであり得る。一部の実施形態において、病態は、薬物嗜好であり得る。一部の実施形態において、病態は、自閉症であり得る。一部の実施形態において、病態は、アルツハイマー病であり得る。一部の実施形態において、病態は、炎症であり得る。一部の実施形態において、病態は、パーキンソン病であり得る。
パーキンソン病に関連するタンパク質の例としては、限定されるものではないが、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１、およびＮＵＲＲ１が挙げられる。
嗜好関連タンパク質の例としては、例えば、ＡＢＡＴを挙げることができる。
炎症関連タンパク質の例としては、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によりコードされる単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によりコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によりコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも称される）、またはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によりコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質を挙げることができる。
心血管疾患関連タンパク質の例としては、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、またはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）を挙げることができる。
アルツハイマー病関連タンパク質の例としては、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、またはＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）を挙げることができる。
自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン受容体（末梢性）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、またはＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）を挙げることができる。
黄斑変性症に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、またはＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）を挙げることができる。
統合失調症に関連するタンパク質の例としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、およびそれらの組合せを挙げることができる。
腫瘍抑制に関与するタンパク質の例としては、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、またはＮｏｔｃｈ４を挙げることができる。
セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（咽頭前部欠損１ホモログＢ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、またはＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ開裂酵素１）を挙げることができる。
筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。
プリオン疾患に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。
プリオン障害における神経変性病態に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗転写因子）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンアルファ２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、またはＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体についてのアルファ−１Ｄアドレナリン作動性受容体）を挙げることができる。
免疫不全症に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］；またはＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］を挙げることができる。
トリヌクレオチドリピート障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチントン）、またはＤＭＰＫ（筋緊張性異栄養症タンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）が挙げられる。
神経伝達障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経型））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性アルファ−２Ａ受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性アルファ−２Ｃ受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、またはＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）が挙げられる。
神経発達関連配列の例としては、例えば、Ａ２ＢＰ１［アタキシン２結合タンパク質１］、ＡＡＤＡＴ［アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＡＴ［４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１］、またはＡＢＣＡ１３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１３］が挙げられる。
本発明の系により治療可能な好ましい病態のさらなる例は、以下のものから選択することができる：アルカルディ−グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン−ハーンドン−ダッドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩおよびＩＩＩ型）；アルストレム症候群；アンジェルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−セラサミア；両側性視神経委縮症および（幼児型）視神経委縮症１型；網膜芽腫（両側性）；カナバン病；脳・眼・顔・骨格症候群１［ＣＯＦＳ１］；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ラング症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早期発症型家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン−ギルフォード早老症候群；ムコリピドーシスＩＩ型；幼児遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性症；ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群；接合型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（幼児型）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群およびＮＡＲＰ；レッシュ−ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連滑脳症；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型；ペルオキシソーム形成異常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム；脳の鉄蓄積症を伴う神経変性症；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン−ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン−マクダーモット症候群；グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）（幼児型）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバーツ症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス−レムリ−オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；幼児期発症型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；致死性異形成１型；コラーゲンＶＩ型関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ−ヒルシュホーン症候群；リソソーム酸リパーゼ欠損症；ならびに色素性乾皮症。
明らかなとおり、本発明の系を使用して任意の目的ポリヌクレオチド配列をターゲティングすることができることが想定される。本発明の系を使用して有用に治療することができる病態または疾患の一部の例を上記表に含め、それらの病態に現在関連する遺伝子の例もその表に提供する。しかしながら、例示される遺伝子は排他的なものではない。
以下の実施例を、本発明の種々の実施形態を説明する目的のために挙げ、それらは本発明をいかなる様式にも限定することを意味しない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、目下好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の趣旨に包含されるその変更および他の使用は、当業者が行う。
実施例１：真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性
例示的なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣｓｎ１のクラスター、ならびに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび非反復配列の短いストレッチ（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）により間隔が空いている反復配列の特徴的アレイ（ダイレクトリピート）を含有する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座である。この系において、ターゲティングされるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を４つの連続ステップにおいて生成する（図２Ａ）。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのダイレクトリピートにハイブリダイズし、次いでそれが個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成を介してプロトスペーサーおよび対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に指向する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの開裂を媒介してプロトスペーサー内でＤＳＢを創成する（図２Ａ）。この例は、このＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ系を適応させて真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性を指向する例示プロセスを記載する。
細胞培養および形質移入
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞系ＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ２インキュベーションで維持した。マウスｎｅｕｒｏ２Ａ（Ｎ２Ａ）細胞系（ＡＴＣＣ）を、５％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭにより、３７℃、５％のＣＯ２で維持した。
ＨＥＫ２９３ＦＴまたはＮ２Ａ細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に、形質移入１日前に１ウェル当たり２００，０００個の細胞の密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞を形質移入した。２４ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計８００ｎｇのプラスミドを使用した。
ゲノム改変についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびシーケンシング分析
ＨＥＫ２９３ＦＴまたはＮ２Ａ細胞を、上記プラスミドＤＮＡにより形質移入した。形質移入後、細胞を３７℃において７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＤＮＡ抽出キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間および９８℃において１０分間インキュベートした。抽出されたゲノムＤＮＡを直ちに処理または−２０℃において貯蔵した。
それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位周囲のゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２μｌの１０×ＴａｑポリメラーゼＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、および２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、開裂したＤＮＡの率の尺度としての相対バンド強度に基づくものであった。図７は、このＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの模式的説明を提供する。
相同組換えの検出のための制限断片長多型アッセイ
ＨＥＫ２９３ＦＴおよびＮ２Ａ細胞を、プラスミドＤＮＡにより形質移入し、３７℃において７２時間インキュベートしてから上記のとおりゲノムＤＮＡを抽出した。相同組換え（ＨＲ）テンプレートのホモロジーアーム外側のプライマーを使用して標的ゲノム領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出した。精製産物をＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により消化し、６％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。
ＲＮＡ二次構造予測および分析
ＲＮＡ二次構造予測は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにおいて開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄを使用し、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用して実施した（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；およびＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。
ＲＮＡ精製
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を上記のとおり維持および形質移入した。細胞をトリプシン処理により回収し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。トータル細胞ＲＮＡをＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）により製造業者のプロトコルに従って抽出した。抽出されたトータルＲＮＡをＮａｏｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、同一濃度に正規化した。
哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ発現のノザンブロット分析
ＲＮＡを等容量の２×ローディング緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）と混合し、９５℃に５分間加熱し、氷上で１分間冷蔵し、次いで８％の変性ポリアクリルアミドゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上に、少なくとも３０分間のゲルのプレラン後にロードした。試料を４０Ｗ限界において１．５時間電気泳動した。その後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３００ｍＡにおいてセミドライ転写装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）中で室温において１．５時間転写した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ ＣｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒのＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上のオートクロスリンクボタンを使用してＲＮＡをメンブレンに架橋させた。メンブレンをＵＬＴＲＡｈｙｂ−オリゴハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中で回転させながら４２℃において３０分間プレハイブリダイズさせ、次いでプローブを添加し、一晩ハイブリダイズさせた。プローブはＩＤＴに発注し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により標識した。メンブレンを予備加温（４２℃）された２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより１分間１回洗浄し、次いで４２℃において３０分間２回洗浄した。メンブレンを蛍光スクリーンに室温において１時間または一晩曝露させ、次いでｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ）によりスキャンした。
細菌ＣＲＩＳＰＲ系構築および評価
ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９、およびリーダーを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座エレメントを、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０ゲノムＤＮＡから、ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）のためのフランキングホモロジーアームを用いてＰＣＲ増幅した。２つのＢｓａＩ ＩＩＳ型部位を２つのダイレクトリピート間に導入してスペーサーの容易な挿入を促進した（図８）。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化ｐＡＣＹＣ１８４中にｔｅｔプロモーターの下流でクローニングした。Ｃｓｎ２の最後の５０ｂｐは除き、他の内因性ＣＲＩＳＰＲ系エレメントは除外した。相補的オーバーハングを有するスペーサーをコードするオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＢｓａＩ消化ベクターｐＤＣ０００（ＮＥＢ）中にクローニングし、次いでＴ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）によりライゲートしてｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを生成した。哺乳動物細胞中のＰＡＭ発現を有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミド（図６Ａに説明される発現構築物、図６Ｂに示されるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果により決定された機能性を有する）。転写開始部位を＋１として標識し、転写ターミネーターおよびノザンブロットによりプロ―ビングされる配列も示す。プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡの発現もノザンブロットにより確認した。図６Ｃは、長鎖または短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ、ならびにＳｐＣａｓ９およびＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物により形質移入された２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノザンブロット分析の結果を示す。左および右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮアーゼＩＩＩを用いず、または用いて形質移入された２９３ＦＴ細胞からのものである。Ｕ６は、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡをターゲティングするプローブによりブロットされたローディング対照を示す。短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ発現構築物の形質移入は、十分なレベルのプロセシング形態のｔｒａｃｒＲＮＡ（約７５ｂｐ）をもたらした。極めて少量の長鎖ｔｒａｃｒＲＮＡがノザンブロット上で検出される。
正確な転写開始を促進するため、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースＵ６プロモーターを選択してｔｒａｃｒＲＮＡの発現をドライブした（図２Ｃ）。同様に、Ｕ６プロモーターベース構築物を開発して２つのダイレクトリピート（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒメイト配列」にも包含される；図２Ｃ）によりフランキングされている単一スペーサーからなるプレｃｒＲＮＡアレイを発現させた。最初のスペーサーは、大脳皮質の発達におけるキー遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座中の３３塩基対（ｂｐ）標的部位（３０ｂｐのプロトスペーサーと、Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐのＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計した（図２Ｃ）。
哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ系（ＳｐＣａｓ９、ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびプレｃｒＲＮＡ）の異種発現がターゲティングされる哺乳動物染色体の開裂を達成し得るか否かを試験するため、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＣＲＩＳＰＲ成分の組合せにより形質移入した。哺乳動物核中のＤＳＢは部分的には、インデルの形成をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により修復されるため、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して標的ＥＭＸ１遺伝子座における潜在的な開裂活性を検出した（図７）（例えば、Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７参照）。４つ全てのＣＲＩＳＰＲ成分の同時形質移入は、プロトスペーサーの最大５．０％の開裂を誘導し得た（図２Ｄ参照）。ＳｐＲＮアーゼＩＩＩを除く全てのＣＲＩＳＰＲ成分の同時形質移入も、プロトスペーサーの最大４．７％のインデルを誘導し、このことはｃｒＲＮＡ成熟を支援し得る内因性哺乳動物ＲＮアーゼ、例えば、関連ＤｉｃｅｒおよびＤｒｏｓｈａ酵素などが存在し得ることを示唆した。残り３つの成分のいずれかを除去すると、ＣＲＩＳＰＲ系のゲノム開裂活性は停止する（図２Ｄ）。標的遺伝子座を含有するアンプリコンのサンガーシーケンシングにより開裂活性を確認し；４３個のシーケンシングされたクローンのうち５つの突然変異アレル（１１．６％）が見出された。種々のガイド配列を使用する同様の実験は、２９％と高いインデル割合を生じさせた（図３〜６、１０、および１１参照）。これらの結果は、哺乳動物細胞中の効率的なＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム改変のための３成分系を定義する。開裂効率を最適化するため、本出願人らは、ｔｒａｃｒＲＮＡの異なるアイソフォームが開裂効率に影響するか否かも試験し、この例示的系において、短鎖（８９ｂｐ）転写物形態のみがヒトＥＭＸ１ゲノム遺伝子座の開裂を媒介し得ることを見出した（図６Ｂ）。
図１２は、哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングの追加のノザンブロット分析を提供する。図１２Ａは、２つのダイレクトリピートによりフランキングされている単一スペーサー（ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲ）についての発現ベクターを示す模式図を説明する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座プロトスペーサー１をターゲティングする３０ｂｐのスペーサー（図６参照）およびダイレクトリピート配列を、図１２Ａの下方の配列中に示す。線は、逆相補配列を使用してＥＭＸ１（１）ｃｒＲＮＡ検出のためのノザンブロットプローブを生成する領域を示す。図１２Ｂは、ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物により形質移入された２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノザンブロット分析を示す。左および右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮアーゼＩＩＩを用いず、または用いて形質移入された２９３ＦＴ細胞からのものである。ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲは、ＳｐＣａｓ９が存在する場合のみ成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡはＳｐＲＮアーゼＩＩＩの存在に依存的でなかった。形質移入２９３ＦＴトータルＲＮＡから検出された成熟ｃｒＲＮＡは、約３３ｂｐであり、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの３９〜４２ｂｐの成熟ｃｒＲＮＡよりも短かった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ系を真核細胞中に移植し、リプログラミングして内因性哺乳動物標的ポリヌクレオチドの開裂を促進することができることを実証する。
図２は、本実施例に記載の細菌ＣＲＩＳＰＲ系を説明する。図２Ａは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１およびこの系によるＣＲＩＳＰＲ媒介ＤＮＡ開裂の提案される機序を示す模式図を説明する。ダイレクトリピート−スペーサーアレイからプロセシングされた成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を、相補的プロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）からなるゲノム標的に指向する。標的−スペーサー塩基対形成時、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡ中の二本鎖切断を媒介する。図２Ｂは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）およびＲＮアーゼＩＩＩ（ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ）の、哺乳動物核中への輸送を可能とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）によるエンジニアリングを説明する。図２Ｃは、構成的ＥＦ１ａプロモーターによりドライブされるＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩならびに正確な転写開始および終結を促進するためのＲＮＡＰｏｌ３プロモーターＵ６によりドライブされるｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイ（ＤＲ−スペーサー−ＤＲ）の哺乳動物発現を説明する。十分なＰＡＭ配列を有するヒトＥＭＸ１遺伝子座からのプロトスペーサーを、プレｃｒＲＮＡアレイ中のスペーサーとして使用する。図２Ｄは、ＳｐＣａｓ９媒介少数挿入および欠失についてのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを説明する。ＳｐＣａｓ９を、ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＥＭＸ１標的スペーサーを担持するプレｃｒＲＮＡアレイを用いてまたは用いずに発現させた。図２Ｅは、標的遺伝子座とＥＭＸ１ターゲティングｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成の模式的表示、ならびにＳｐＣａｓ９開裂部位に隣接する微小欠失を示す例示的クロマトグラムを説明する。図２Ｆは、種々の微小挿入および欠失を示す４３個のクローンアンプリコンのシーケンシング分析から同定された突然変異アレルを説明する。点線は、欠失塩基を示し、アラインされず、またはミスマッチの塩基は挿入または突然変異を示す。スケールバー＝１０μｍ。
３成分系をさらに簡略化するため、ステム−ループを介して成熟ｃｒＲＮＡ（ガイド配列を含む）を部分ｔｒａｃｒＲＮＡに融合させて天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣するキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド設計を適応させ得る。同時送達効率を増加させるため、形質移入細胞中のキメラＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９の同時発現をドライブするバイシストロニック発現ベクターを創成した。並行して、バイシストロニックベクターを使用してプレｃｒＲＮＡ（ＤＲ−ガイド配列−ＤＲ）をＳｐＣａｓ９とともに発現させてｃｒＲＮＡへのプロセシングを誘導し、ｔｒａｃｒＲＮＡを別個に発現させた（図１１Ｂの上図および下図を比較）。図８は、ｈＳｐＣａｓ９を有するプレｃｒＲＮＡアレイ（図８Ａ）またはキメラｃｒＲＮＡ（図８Ｂ中のガイド配列挿入部位の下流およびＥＦ１αプロモーターの上流の短い線により表わされる）のためのバイシストロニック発現ベクターの模式的説明を提供し、種々のエレメントの局在およびガイド配列挿入の場所を示す。図８Ｂ中のガイド配列挿入部位の局在周囲の拡大された配列は、部分ＤＲ配列（ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ）（配列番号１１）および部分ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴ）（配列番号１２）も示す。ガイド配列は、アニールされたオリゴヌクレオチドを使用してＢｂｓＩ部位間に挿入することができる。オリゴヌクレオチドについての配列設計を図８の模式的説明の下方に示し、適切なライゲーションアダプターを示す。ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを表す。キメラＲＮＡ媒介開裂の効率を、上記の同一のＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびアンプリコンのサンガーシーケンシングの両方を使用して、本出願人らは、キメラＲＮＡ設計がヒトＥＭＸ１遺伝子座の開裂を約４．７％の改変比率で促進することを確認した（図３）。
真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介開裂の一般化可能性を、ヒトＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ、ならびにマウスＴｈ遺伝子座中の複数部位をターゲティングするキメラＲＮＡを設計することによりヒトおよびマウス細胞の両方において追加のゲノム遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。図１３は、いくつかの追加のターゲティングされるヒトＰＶＡＬＢ（図１３Ａ）およびマウスＴｈ（図１３Ｂ）遺伝子座中のプロトスペーサーの選択を説明する。遺伝子座およびそれぞれの最後のエキソン内の３つのプロトスペーサーの局在の模式図を提供する。下線付き配列は、３０ｂｐのプロトスペーサー配列およびＰＡＭ配列に対応する３’末端における３ｂｐを含む。センスおよびアンチセンス鎖上のプロトスペーサーを、それぞれＤＮＡ配列の上方および下方に示す。ヒトＰＶＡＬＢおよびマウスＴｈ遺伝子座についてそれぞれ６．３％および０．７５％の改変比率が達成され、このことは複数の生物にわたる異なる遺伝子座の改変におけるＣＲＩＳＰＲ系の幅広い適用可能性を実証した（図５）。開裂はキメラ構築物を使用してそれぞれの遺伝子座について３つのスペーサーのうち１つについてのみ検出された一方、同時発現されるプレｃｒＲＮＡ配置を使用した場合、全ての標的配列が２７％に達するインデル生成の効率で開裂された（図６および１３）。
図１１は、ＳｐＣａｓ９をリプログラミングして哺乳動物細胞中の複数のゲノム遺伝子座をターゲティングすることができることのさらなる説明を提供する。図１１Ａは、下線付き配列により示される５つのプロトスペーサーの局在を示すヒトＥＭＸ１遺伝子座の模式図を提供する。図１１Ｂは、プレｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのダイレクトリピート領域間のハイブリダイゼーションを示すプレｃｒＲＮＡ／ｔｒｃｒＲＮＡ複合体の模式図（上図）および２０ｂｐのガイド配列、ならびにヘアピン構造にハイブリダイズしている部分ダイレクトリピートおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列からなるｔｒａｃｒメイトおよびｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡ設計の模式図（下図）を提供する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座中の５つのプロトスペーサーにおけるＣａｓ９媒介開裂の効力を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を、図１１Ｃに説明する。プロセシングされたプレｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ）またはキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）のいずれかを使用してそれぞれのプロトスペーサーをターゲティングする。
ＲＮＡの二次構造は分子間相互作用に重要であり得るため、最小自由エネルギーおよびボルツマン加重構造アンサンブルに基づく構造予測アルゴリズムを使用してゲノムターゲティング実験に使用される全てのガイド配列の推定二次構造を比較した（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：Ｗ７０参照）。分析により、ほとんどの場合、キメラｃｒＲＮＡコンテクスト中の有効なガイド配列は二次構造モチーフを実質的に含まない一方、無効なガイド配列は標的プロトスペーサーＤＮＡとの塩基対形成を妨害し得る内部二次構造を形成する可能性がより高いことが明らかになった。したがって、スペーサー二次構造の変動性は、キメラｃｒＲＮＡを使用する場合にＣＲＩＳＰＲ媒介干渉の効率に影響し得ることが考えられる。
ＳｐＣａｓ９のためのさらなるベクター設計を図２２に示し、それはガイドオリゴのための挿入部位に結合しているＵ６プロモーター、およびＳｐＣａｓ９コード配列に結合しているＣｂｈプロモーターを取り込む単一発現ベクターを説明する。図２２ｂに示されるベクターは、Ｈ１プロモーターに結合しているｔｒａｃｒＲＮＡコード配列を含む。
細菌アッセイにおいて、全てのスペーサーが効率的なＣＲＩＳＰＲ干渉を促進した（図３Ｃ）。これらの結果は、哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ活性の効率に影響する追加の因子が存在し得ることを示唆する。
ＣＲＩＳＰＲ媒介開裂の特異性を調査するため、哺乳動物ゲノム中のプロトスペーサー開裂に対するガイド配列中の単一ヌクレオチド突然変異の効果を、単一点突然変異を有する一連のＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡを使用して分析した（図３Ａ）。図３Ｂは、異なる突然変異体キメラＲＮＡと対形成した場合のＣａｓ９の開裂効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの結果を説明する。ＰＡＭの５’側の最大１２ｂｐの単一塩基ミスマッチは、ＳｐＣａｓ９によるゲノム開裂を実質的に停止させた一方、さらなる上流位置に突然変異を有するスペーサーは元のプロトスペーサー標的に対する活性を保持した（図３Ｂ）。ＰＡＭの他、ＳｐＣａｓ９は、スペーサーの最後の１２ｂｐ内の単一塩基特異性を有する。さらに、ＣＲＩＳＰＲは、同一ＥＭＸ１プロトスペーサーをターゲティングするＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のペアと同程度に効率的にゲノム開裂を媒介し得る。図３Ｃは、ＥＭＸ１をターゲティングするＴＡＬＥＮの設計を示す模式図を提供し、図３Ｄは、ＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９の効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒゲルを示す（ｎ＝３）。
エラープローンＮＨＥＪ機序を通した哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を達成するための成分のセットを樹立したため、相同組換え（ＨＲ）、ゲノム中の正確な編集を作製するための高フィデリティ遺伝子修復経路を刺激するＣＲＩＳＰＲの能力を試験した。野生型ＳｐＣａｓ９は、ＮＨＥＪおよびＨＲの両方を通して修復され得る部位特異的ＤＳＢを媒介し得る。さらに、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（ＳｐＣａｓ９ｎ；図４Ａに説明）（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓａｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９参照）、その結果、ニック形成されたゲノムＤＮＡが高フィデリティ相同性組換え修復（ＨＤＲ）を受ける。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎはＥＭＸ１プロトスペーサー標的におけるインデルを生成しないことを確認した。図４Ｂに説明されるとおり、ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡとＳｐＣａｓ９との同時発現は標的部位中のインデルを生じさせた一方、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現は生じさせなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシーケンシングは、ＳｐＣａｓ９ｎにより誘導されるいかなるインデルも検出しなかった。同一の遺伝子座を選択し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＥＭＸ１をターゲティングするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９またはｈＳｐＣａｓ９ｎ、およびプロトスペーサー付近に制限部位のペア（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ）を導入するためのＨＲテンプレートにより同時形質移入することによりＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＲを試験した。図４Ｃは、ＨＲ方針の模式的説明を、組換え場所の相対局在およびプライマーアニーリング配列（矢印）とともに提供する。ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは、実際、ＥＭＸ１遺伝子中へのＨＲテンプレートのインテグレーションを触媒した。標的領域のＰＣＲ増幅とそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により、予測断片サイズ（図４Ｄに示される制限断片長多型ゲル分析中の矢印）に対応する開裂産物が明らかになり、ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは類似レベルのＨＲ効率を媒介した。本出願人らは、ゲノムアンプリコンのサンガーシーケンシングを使用してＨＲをさらに確認した（図４Ｅ）。これらの結果は、哺乳動物ゲノム中のターゲティングされる遺伝子挿入を促進するためのＣＲＩＳＰＲの有用性を実証する。野生型ＳｐＣａｓ９の１４ｂｐ（スペーサーからの１２ｂｐおよびＰＡＭからの２ｂｐ）の標的特異性を考慮すると、ニッカーゼの利用可能性は、一本鎖分解物がエラープローンＮＨＥＪ経路のための基質でないため、オフターゲット改変の可能性を顕著に低減させ得る。
アレイスペーサーを有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の天然アーキテクチャーを模倣する発現構築物（図２Ａ）を構築して多重化配列ターゲティングの可能性を試験した。ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢターゲティングスペーサーのペアをコードする単一のＣＲＩＳＰＲアレイを使用して、両方の遺伝子座における効率的な開裂が検出された（図４Ｆ、ｃｒＲＮＡアレイの模式的設計および開裂の効率的な媒介を示すＳｕｒｖｅｙｏｒブロットの両方を示す）。１１９ｂｐにより間隔が空いているＥＭＸ１内の２つの標的に対するスペーサーを使用する同時ＤＳＢを通したより大きいゲノム領域のターゲティングされる欠失も試験し、１．６％の欠失効力（１８２個のアンプリコンのうち３つ；図４Ｇ）が検出された。このことは、ＣＲＩＳＰＲ系が単一ゲノム内の多重化編集を媒介し得ることを実証する。
実施例２：ＣＲＩＳＰＲ系改変および代替例
配列特異的ＤＮＡ開裂をプログラミングするためにＲＮＡを使用する技能は、種々の研究および産業用途のための新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義する。ＣＲＩＳＰＲ系のいくつかの態様は、ＣＲＩＳＰＲターゲティングの効率および多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なＣａｓ９活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーＭｇ２＋の利用可能性に依存し得（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６参照）、プロトスペーサーのすぐ下流のＮＧＧモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均１２ｂｐごとでターゲティング能を制限する（図９、ヒト染色体配列のプラスおよびマイナス鎖の両方を評価）。これらの拘束の一部は、微生物メタゲノムにわたるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の多様性を利用することにより克服することができる（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９：４６７参照）。他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、実施例１に記載のものと同様の方法により哺乳動物細胞環境中に移植することができる。例えば、図１０は、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集を達成するための哺乳動物細胞中の異種発現のためのストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の適応を説明する。図１０Ａは、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１の模式的説明を提供する。図１０Ｂは、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系のための発現系の設計を説明する。ヒトコドン最適化ｈＳｔＣａｓ９を、構成的ＥＦ１αプロモーターを使用して発現させる。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの成熟バージョンを、Ｕ６プロモーターを使用して発現させて正確な転写開始を促進する。成熟ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡからの配列を説明する。ｃｒＲＮＡ配列中の小文字「ａ」により示される単一塩基を使用してＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写ターミネーターとして機能するポリＵ配列を除去する。図１０Ｃは、ヒトＥＭＸ１遺伝子座ターゲティングするガイド配列を示す模式図を提供する。図１０Ｄは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用する標的遺伝子座中のｈＳｔＣａｓ９媒介開裂の結果を示す。ＲＮＡガイドスペーサー１および２は、それぞれ１４％および６．４％を誘導した。これらの２つのプロトスペーサー部位における生物学的複製物にわたる開裂活性の統計分析も図５に提供する。図１４は、ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の追加のプロトスペーサーおよび対応するＰＡＭ配列標的の模式図を提供する。２つのプロトスペーサー配列を強調し、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフを満たすそれらの対応するＰＡＭ配列を対応する強調配列に対して３’側で下線を付けることにより示す。両方のプロトスペーサーは、アンチセンス鎖をターゲティングする。
実施例３：試料標的配列選択アルゴリズム
規定のＣＲＩＳＰＲ酵素についての所望のガイド配列長およびＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ）に基づきインプットＤＮＡ配列の両方の鎖上の候補ＣＲＩＳＰＲ標的配列を同定するためのソフトウェアプログラムを設計する。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎｘ−ＮＧＧ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎｘ−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧＮＧを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎｘ−ＮＧＧＮＧ−３’を探索することにより同定することができる。Ｎｘ中の値「ｘ」は、プログラムにより固定し、または使用者により規定することができ、例えば、２０である。
ＤＮＡ標的部位のゲノム中の複数の発生は、非特異的ゲノム編集をもたらし得るため、全ての潜在的な部位を同定した後、プログラムは配列が関連参照ゲノム中で出現する回数に基づき配列をフィルタリング除去する。配列特異性が「シード」配列、例えば、ＰＡＭ配列自体を含め、ＰＡＭ配列から５’側の１１〜１２ｂｐにより決定されるそれらのＣＲＩＳＰＲ酵素について、フィルタリングステップはシード配列に基づき得る。したがって、追加のゲノム遺伝子座における編集を回避するため、結果を関連ゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数に基づきフィルタリングする。使用者に、シード配列の長さを選択させることができる。使用者に、フィルタ通過の目的のためにゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数を規定させることもできる。デフォルトは、ユニーク配列をスクリーニングすることである。フィルトレーションレベルは、シード配列の長さおよびゲノム中の配列の発生数の両方を変えることにより変更する。プログラムは、さらにまたは代替的に、同定された標的配列の逆相補鎖を提供することにより、報告された標的配列に相補的なガイド配列の配列を提供し得る。ヒトゲノム中の一部の標的部位の例示的可視化を図１８に提供する。
配列選択を最適化する方法およびアルゴリズムのさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／０６４，７９８号明細書（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１２／０８４）に見出すことができる。
実施例４：複数のキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドの評価
本実施例は、異なる長さの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を取り込むｔｒａｃｒ配列を有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ；ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を単一転写物中で含む）について得られた結果を記載する。図１６ａは、キメラＲＮＡおよびＣａｓ９のためのバイシストロニック発現ベクターの模式図を説明する。Ｃａｓ９はＣＢｈプロモーターによりドライブされ、キメラＲＮＡはＵ６プロモーターによりドライブされる。キメラガイドＲＮＡは、からなる。示される種々の位置においてトランケートされたｔｒａｃｒ配列（下方の鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端に及ぶ）に結合している２０ｂｐのガイド配列（Ｎ）からなる。ガイドおよびｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号１３）と、それに続くループ配列ＧＡＡＡにより離隔している。ヒト遺伝子座ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を、それぞれ図１６ｂおよび１６ｃに説明する。矢印は、予測ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示す。ｃｈｉＲＮＡをそれらの「＋ｎ」表記により示し、ｃｒＲＮＡは、ガイドおよびｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。トリプリケートで実施されたこれらの結果の定量を、図１７ａおよび１７ｂにヒストグラムにより示し、それぞれ図１６ｂおよび１６ｃに対応する（「Ｎ．Ｄ．」は、インデルが検出されなかったことを示す）。プロトスペーサーＩＤおよびそれらの対応するゲノム標的、プロトスペーサー配列、ＰＡＭ配列、および鎖局在を表Ｄに提供する。ガイド配列は、ハイブリッド系における別個の転写物の場合、プロトスペーサー配列全体に相補的であるように、またはキメラＲＮＡの場合、下線部にのみ相補的であるように設計した。
Figure 0006870015
ガイド配列を最適化するためのさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／８３６，１２７号明細書（代理人整理番号４４７９０．０８．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照ＢＩ−２０１３／００４Ｇ）に見出すことができる。
最初に、ヒトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のＥＭＸ１遺伝子座内の３つの部位をターゲティングした。それぞれのｃｈｉＲＮＡのゲノム改変効率は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ損傷修復経路によるその後続の修復から生じる突然変異を検出するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを使用して評価した。ｃｈｉＲＮＡ（＋ｎ）と表記される構築物は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎ個のヌクレオチドがキメラＲＮＡ構築物中に含まれることを示し、ｎについては４８、５４、６７、および８５の値が使用される。野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのより長い断片を含有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）およびｃｈｉＲＮＡ（＋８５））は、３つ全てのＥＭＸ１標的部位におけるＤＮＡ開裂を媒介し、特にｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、ガイドおよびｔｒａｃｒ配列を別個の転写物中で発現する対応するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドよりも顕著に高いレベルのＤＮＡ開裂を実証した（図１６ｂおよび１７ａ）。ハイブリッド系（別個の転写物として発現されるガイド配列およびｔｒａｃｒ配列）を検出可能な開裂を生じなかったＰＶＡＬＢ遺伝子座中の２つの部位も、ｃｈｉＲＮＡを使用してターゲティングした。ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）およびｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、２つのＰＶＡＬＢプロトスペーサーにおける顕著な開裂を媒介し得た（図１６ｃおよび１７ｂ）。ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座中の５つ全ての標的について、ｔｒａｃｒ配列長さの増加に伴うゲノム改変効率の一貫した増加が観察された。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端により形成される二次構造は、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の比率の向上における役割を担い得る。
実施例５：Ｃａｓ９多様性
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌から古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外因性ＤＮＡに対する適応免疫機序である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中への外来ＤＮＡの「獲得」を担うタンパク質をコードする遺伝子のセット、およびＤＮＡ開裂機序の「実行」をコードする遺伝子のセットからなり；これらは、ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、非コードトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、およびダイレクトリピートによりフランキングされている外来ＤＮＡ由来スペーサーのアレイ（ｃｒＲＮＡ）を含む。Ｃａｓ９による成熟時、ｔｒａｃＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをスペーサーガイド配列により規定される標的ＤＮＡ配列にガイドし、開裂に要求され、それぞれのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的な標的ＤＮＡ中の短鎖配列モチーフ付近のＤＮＡの二本鎖切断を媒介する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌界全体にわたり見出されており、Ｃａｓ９タンパク質配列およびサイズ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡダイレクトリピート配列、それらのエレメントのゲノム構成、および標的開裂のためのモチーフ要件は高度に多様である。ある種は、複数の区別されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有し得る。
本出願人らは、公知のＣａｓ９との配列相同性および公知のサブドメイン、例として、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン［Ｅｕｇｅｎｅ ＫｏｏｎｉｎおよびＫｉｒａ Ｍａｋａｒｏｖａからの情報］とオルソロガスな構造に基づき同定された細菌種から２０７個の推定Ｃａｓ９を評価した。このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生分析により、大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーが明らかになった（図１９および２０Ａ〜Ｆ参照）。
Ｃａｓ９のさらなる詳細およびニッカーゼまたはＤＮＡ結合タンパク質に変換するためのＣａｓ９酵素の突然変異および変更された機能性を有するＣａｓ９の使用は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／８３６，１０１号明細書および同第６１／８３５，９３６号明細書（それぞれ代理人整理番号４４７９０．０９．２０２２および４７９０．０７．２０２２ならびにＢｒｏａｄ参照ＢＩ−２０１３／００４ＥおよびＢＩ−２０１３／００４Ｆ）に見出すことができる。
実施例６：Ｃａｓ９オルソログ
本出願人らは、Ｃａｓ９オルソログを分析して関連ＰＡＭ配列および対応するキメラガイドＲＮＡを同定した。ＰＡＭの拡大セットを有することは、ゲノムにわたるより広いターゲティングを提供し、ユニーク標的部位の数も顕著に増加させ、ゲノム中の特異性の増加レベルを有する新規Ｃａｓ９を同定する潜在性を提供する。
Ｃａｓ９オルソログの特異性は、ガイドＲＮＡとそのＤＮＡ標的との間のミスマッチを許容するそれぞれのＣａｓ９の能力を試験することにより評価することができる。例えば、ＳｐＣａｓ９の特異性は、開裂効率に対するガイドＲＮＡ中の突然変異の効果を試験することにより特性決定された。ガイド配列と標的ＤＮＡとの間の単一または複数のミスマッチを用いてガイドＲＮＡのライブラリーを作製した。これらの知見に基づき、ＳｐＣａｓ９についての標的部位を以下の指針に基づき選択することができる。
特定の遺伝子を編集するためのＳｐＣａｓ９特異性を最大化するため、潜在的な「オフターゲット」ゲノム配列が以下の４つの拘束に従うように目的遺伝子座内の標的部位を選択すべきである：第１に、これらに、５’−ＮＧＧまたはＮＡＧ配列のいずれかを有するＰＡＭが続くべきでない。第２に、標的配列とのこれらの全配列類似性は、最小化されるべきである。第３に、最大数のミスマッチが、オフターゲット部位のＰＡＭ近位領域内に存在すべきである。最後に、最大数のミスマッチが連続的であり、または４塩基未満で離れているべきである。
類似の方法を使用して他のＣａｓ９オルソログの特異性を評価し、標的種のゲノム内の特異的標的部位の選択のための基準を確立することができる。上記のとおり、このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生分析により、大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーが明らかになった（図１９および２０Ａ〜Ｆ参照）。Ｃａｓオルソログに関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／８３６，１０１号明細書および同第６１／８３５，９３６号明細書（それぞれ、代理人整理番号４４７９０．０９．２０２２および４７９０．０７．２０２２ならびにＢｒｏａｄ参照ＢＩ−２０１３／００４ＥおよびＢＩ−２０１３／００４Ｆ）に見出すことができる。
実施例７：植物遺伝子をターゲティングおよび操作するためのＣａｓ９を使用する植物（微細藻類）のエンジニアリング
Ｃａｓ９を送達する方法
方法１：本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２−チューブリンの制御下でＣａｓ９を発現するベクターを使用してＣａｓ９およびガイドＲＮＡを送達する。
方法２：本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２−チューブリンの制御下でＣａｓ９およびＴ７ポリメラーゼを発現するベクターを使用してＣａｓ９およびＴ７ポリメラーゼを送達する。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをドライブするＴ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達する。
方法３：本出願人らは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびインビトロで転写されたガイドＲＮＡを藻類細胞に送達する。ＲＮＡは、インビトロで転写させることができる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９についてのコード領域およびＣａｓ９ｍＲＮＡの安定化を確保するためのＣｏｐ１からの３’ＵＴＲからなる。
相同組換えのため、本出願人らは、追加の相同組換え修復テンプレートを提供する。
ベータ−２チューブリンプロモーターの制御下でＣａｓ９の発現をドライブするカセットと、それに続くＣｏｐ１の３’ＵＴＲについての配列。
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ベータ−２チューブリンプロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼの発現をドライブするカセットと、それに続くＣｏｐ１の３’ＵＴＲについての配列：
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Ｔ７プロモーターによりドライブされるガイドＲＮＡの配列（Ｔ７プロモーター、Ｎは、ターゲティング配列を表す）：
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遺伝子送達：
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒからのコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）株ＣＣ−１２４およびＣＣ−１２５を、エレクトロポレーションに使用する。エレクトロポレーションプロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇキットからの標準的な推奨プロトコルに従う。
また、本出願人らは、Ｃａｓ９を構成的に発現するコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の系統を生成する。このことは、ｐＣｈｌａｍｙ１（ＰｖｕＩを使用して線形化）を使用し、ハイグロマイシン耐性コロニーを選択することにより行うことができる。Ｃａｓ９を含有するｐＣｈｌａｍｙ１についての配列を以下に示す。遺伝子ノックアウトを達成するためのこの手法において、ガイドＲＮＡのためのＲＮＡを送達することが必要なだけである。相同組換えのため、本出願人らは、ガイドＲＮＡおよび線形化相同組換えテンプレートを送達する。
ｐＣｈｌａｍｙ１−Ｃａｓ９：
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全ての改変コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞について、本出願人らは、ＰＣＲ、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ、およびＤＮＡシーケンシングを使用して良好な改変を確認した。
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。当業者は目下、多数のバリエーション、変更、および置換を本発明から逸脱せずに行う。本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替例を本発明の実施において用いることができることを理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、それらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物は、特許請求の範囲により包含されるものとする。
参考文献：
１．Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｒｅｂａｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｓ．＆Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｐ．Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１，６３６−６４６（２０１０）．
２．Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．＆Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，１８４３−１８４６（２０１１）．
３．Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｂ．Ｌ．Ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８，４９−９５（２００５）．
４．Ｂａｅ，Ｔ．＆Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，Ｏ．Ａｌｌｅｌｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ ５５，５８−６３（２００６）．
５．Ｓｕｎｇ，Ｃ．Ｋ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｃｌａｖｅｒｙｓ，Ｊ．Ｐ．＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ａｎ ｒｐｓＬ ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｊａｎｕｓ，ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，５１９０−５１９６（２００１）．
６．Ｓｈａｒａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｌ．Ｃ．，Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ，Ｓ．Ｇ．＆Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４，２０６−２２３（２００９）．
７．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）．
８．Ｄｅｖｅａｕ，Ｈ．，Ｇａｒｎｅａｕ，Ｊ．Ｅ．＆Ｍｏｉｎｅａｕ，Ｓ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｈａｇｅ−ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，４７５−４９３（２０１０）．
９．Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．＆Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ，ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７，１６７−１７０（２０１０）．
１０．Ｔｅｒｎｓ，Ｍ．Ｐ．＆Ｔｅｒｎｓ，Ｒ．Ｍ．ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４，３２１−３２７（２０１１）．
１１．ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ，Ｊ．，Ｊｏｒｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｗｅｓｔｒａ，Ｅ．Ｒ．，Ｌｕｎｄｇｒｅｎ，Ｍ．＆Ｂｒｏｕｎｓ，Ｓ．Ｊ．ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ａｎｄ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３４，４０１−４０７（２００９）．
１２．Ｂｒｏｕｎｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，９６０−９６４（２００８）．
１３．Ｃａｒｔｅ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｔｅｒｎｓ，Ｒ．Ｍ．＆Ｔｅｒｎｓ，Ｍ．Ｐ．Ｃａｓ６ ｉｓ ａｎ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｈａｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｆｏｒ ｉｎｖａｄｅｒ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２２，３４８９−３４９６（２００８）．
１４．Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ．Ｎａｔｕｒｅ ４７１，６０２−６０７（２０１１）．
１５．Ｈａｔｏｕｍ−Ａｓｌａｎ，Ａ．，Ｍａｎｉｖ，Ｉ．＆Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．Ｍａｔｕｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ｌｅｎｇｔｈ ｉｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｕｌｅｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｃｈｏｒｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８，２１２１８−２１２２２（２０１１）．
１６．Ｈａｕｒｗｉｔｚ，Ｒ．Ｅ．，Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．，Ｚｈｏｕ，Ｋ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ ａ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９，１３５５−１３５８（２０１０）．
１７．Ｄｅｖｅａｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＲＩＳＰＲ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０，１３９０−１４００（２００８）．
１８．Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．，Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．＆Ｓｉｋｓｎｙｓ，Ｖ．Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０１２）．
１９．Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．，Ａｒａｖｉｎｄ，Ｌ．，Ｗｏｌｆ，Ｙ．Ｉ．＆Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．Ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｓｃｅｎａｒｉｏ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ．６，３８（２０１１）．
２０．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，８３６−８３８（２０１２）．
２１．Ｂｒｏｕｎｓ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａ Ｓｗｉｓｓ ａｒｍｙ ｋｎｉｆｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８０８−８０９（２０１２）．
２２．Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｄ．Ａ ＣＲＩＳＰＲ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０，１６５８−１６６０（２０１２）．
２３．Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．，Ｈａｔｏｕｍ−Ａｓｌａｎ，Ａ．，Ｍｕｃｉｄａ，Ｄ．＆Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃａｎ ｐｒｅｖｅｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １２，１７７−１８６（２０１２）．
２４．Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１１）．
２５．Ｓｅｍｅｎｏｖａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ ｉｓ ｇｏｖｅｒｎｅｄ ｂｙ ａ ｓｅｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０１１）．
２６．Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０１１）．
２７．Ｚａｈｎｅｒ，Ｄ．＆Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ，Ｒ．Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｓ ａ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２，５９１９−５９２１（２０００）．
２８．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，Ｄｅｄｅｎｔ，Ａ．Ｃ．＆Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，Ｏ．Ｓｏｒｔａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ ｏｆ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７０，１９２−２２１（２００６）．
２９．Ｍｏｔａｍｅｄｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｚｉｇｅｔｙ，Ｓ．Ｋ．＆Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ−ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｐｈｙｓｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，２８８９−２９０３（１９９９）．
３０．Ｈｏｓａｋａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｋ８７Ｅ ｉｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１２ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７１，３１７−３２４（２００４）．
３１．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｎ．＆Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｌａｍｂｄａ Ｒｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１５７４８−１５７５３（２００３）．
３２．Ｅｄｇａｒ，Ｒ．＆Ｑｉｍｒｏｎ，Ｕ．Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｍｂｄａ ｌｙｓｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ，ｌｙｓｏｇｅｎｓ，ａｎｄ ｐｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９２，６２９１−６２９４（２０１０）．
３３．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．＆Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｓｅｌｆ ｖｅｒｓｕｓ ｎｏｎ−ｓｅｌｆ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４６３，５６８−５７１（２０１０）．
３４．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ａｒｃｈａｅａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆｓ（ＰＡＭｓ）ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｖａｄｅｒ ＤＮＡ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，３３３５１−３３３６３（２０１２）．
３５．Ｇｕｄｂｅｒｇｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｍｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｈｅｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ ｖｅｃｔｏｒ−ｂｏｒｎｅ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９，３５−４９（２０１１）．
３６．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＭＡＧＥ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，５９１−５９３（２０１２）．
３７．Ｃｏｎｇ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２０１３）．
３８．Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２０１３）．
３９．Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｔｒａｉｎ Ｒ６．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７０９−５７１７（２００１）．
４０．Ｈａｖａｒｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｃｏｏｍａｒａｓｗａｍｙ，Ｇ．＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ａｎ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｅｐｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，１１１４０−１１１４４（１９９５）．
４１．Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓ．＆Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，Ｂ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｐ ｏｆ ｐＣ１９４，ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０，８１５−８２５（１９８２）．
４２．Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ：ＳＯＥｉｎｇ Ｔｏｇｅｔｈｅｒ Ｔａｉｌｏｒ−Ｍａｄｅ Ｇｅｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２５１−２６１（１９９３）．
４３．Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉ，Ａ．，Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ，Ｂ．，Ｗｏｉｓｃｈｎｉｋ，Ｍ．，Ｐｏｈｌ，Ｂ．＆Ｌｕｔｔｉｃｋｅｎ，Ｒ．Ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（ＧＡＳ）．Ｇｅｎｅ １７７，１３７−１４７（１９９６）．
４４．Ｈｕｓｍａｎｎ，Ｌ．Ｋ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｇ．＆Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ，ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３，３４５−３４８（１９９５）．
４５．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３４３−３４５（２００９）．
４６．Ｇａｒｎｅａｕ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｃｌｅａｖｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，６７−７１（０４ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１０）
４７．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７ Ｍａｒ ２３；３１５（５８１９）：１７０９−１２．
４８．Ｉｓｈｉｎｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉａｐ ｇｅｎｅ，ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８７ Ｄｅｃ；１６９（１２）：５４２９−３３．
４９．Ｍｏｊｉｃａ Ｆ．Ｊ．Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ Ａｒｃｈａｅａ，Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）３６（１），２４４−２４６．
５０．Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）４３（６），１５６５−１５７５．

Claims (18)

  1. エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、
    （ａ）少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＣａｓ９、又は前記Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド；
    （ｂ）真核細胞のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接するゲノムの標的配列にハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の標的配列への配列特異的結合を指向することができるガイド配列と、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができるｔｒａｃｒメイト配列と、ｔｒａｃｒ配列とを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ；
    を含み、
    前記ｔｒａｃｒ配列が３０以上のヌクレオチド長である、系。
  2. 前記ｔｒａｃｒ配列が少なくとも４０のヌクレオチド長である、請求項１に記載の系。
  3. 前記ｔｒａｃｒ配列が少なくとも５０のヌクレオチド長である、請求項１に記載の系。
  4. Ｃａｓ９が、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の系。
  5. Ｃａｓ９が、２つ以上のＮＬＳを含む、請求項１〜４いずれか一項に記載の系。
  6. 少なくとも１つのＮＬＳが、Ｃａｓ９のアミノ末端またはその近傍にあり、少なくとも１つのＮＬＳが、Ｃａｓ９のカルボキシ末端またはその近傍にある、請求項５に記載の系。
  7. Ｃａｓ９がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９であり、ＰＡＭがＮＧＧである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の系。
  8. Ｃａｓ９がＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９であり、ＰＡＭがＮＡＧＡＡＷである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の系。
  9. Ｃａｓ９が、哺乳動物細胞またはヒト細胞での発現用にコドン最適化されたヌクレオチド配列にコードされている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の系。
  10. Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の系。
  11. Ｃａｓ９が、対応する野生型Ｃａｓ９に対して変異しており、変異したタンパク質が、標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を切断する能力を欠くニッカーゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の系。
  12. Ｃａｓ９が、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、またはＲｕｖＣ ＩＩＩの触媒ドメイン中に１つ以上の変異を含む、請求項１１に記載の系。
  13. Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の位置番号を基準にして、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａからなる群から選択される変異を含む、請求項１２に記載の系。
  14. 相同性組換え修復のための修復テンプレートをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の系。
  15. 前記修復テンプレートが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の系。
  16. ゲノムエンジニアリングのための請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系の使用であって、人間の生殖系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセスを含まず、ヒトを処置するための方法ではない、使用。
  17. 非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系の使用。
  18. 哺乳動物細胞中の１つ以上の遺伝子産物の発現をエクスビボで改変するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系の使用。



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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11859168B2 (en) * 2007-05-29 2024-01-02 Christopher B. REID Electroporation, developmentally-activated cells, pluripotent-like cells, cell reprogramming and regenerative medicine
WO2011002988A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (scid)
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
SG185703A1 (en) 2010-06-11 2013-01-30 Regeneron Pharma Production of fertile xy female animals from xy es cells
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US11191665B2 (en) 2011-02-04 2021-12-07 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US10842834B2 (en) 2016-01-06 2020-11-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US11273187B2 (en) 2015-11-30 2022-03-15 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US10583033B2 (en) 2011-02-04 2020-03-10 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US10512661B2 (en) 2011-02-04 2019-12-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10920242B2 (en) 2011-02-25 2021-02-16 Recombinetics, Inc. Non-meiotic allele introgression
US9528124B2 (en) 2013-08-27 2016-12-27 Recombinetics, Inc. Efficient non-meiotic allele introgression
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
KR102058568B1 (ko) 2011-10-17 2020-01-22 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 세포 내 전달
PH12014501360B1 (en) 2011-12-16 2022-05-20 Targetgene Biotechnologies Ltd Compositions and methods for modifying a predetermined target nucleic acid sequence
ES2991004T3 (es) 2011-12-22 2024-12-02 Harvard College Métodos para la detección de analitos
WO2014163886A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
WO2013138351A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Separatome-based protein expression and purification platform
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
DK2847335T3 (en) 2012-04-25 2018-08-13 Regeneron Pharma NUCLEASED MEDIUM TARGETING WITH LARGE TARGET VECTORS
EP3597741A1 (en) 2012-04-27 2020-01-22 Duke University Genetic correction of mutated genes
LT2800811T (lt) 2012-05-25 2017-09-11 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinės dnr modifikavimui, panaudojant adresuotą rnr, ir transkripcijos moduliavimui, panaudojant adresuotą rnr
US20150225734A1 (en) * 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
ES2813080T3 (es) 2012-07-11 2021-03-22 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades por almacenamiento lisosomal
EP3808844A1 (en) * 2012-07-25 2021-04-21 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
CN110669758A (zh) * 2012-10-23 2020-01-10 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna 的组合物及其用途
WO2014066830A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 Department Of Veterans Affairs Composition and methods for the prevention and treatment of diet-induced obesity
PT3138912T (pt) 2012-12-06 2018-12-28 Sigma Aldrich Co Llc Modificação e regulação de genoma baseado em crispr
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
PT2931898E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para manipulação de sequências com domínios funcionais
US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
ES2542015T3 (es) 2012-12-12 2015-07-29 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
SG11201504523UA (en) 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
ES2786193T3 (es) 2012-12-12 2020-10-09 Broad Inst Inc Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
CN105121641A (zh) 2012-12-17 2015-12-02 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-引导的人类基因组工程化
AU2014207618A1 (en) 2013-01-16 2015-08-06 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
JP5954808B2 (ja) * 2013-02-14 2016-07-20 国立大学法人大阪大学 内在性ｄｎａ配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法
JP6475172B2 (ja) 2013-02-20 2019-02-27 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ラットの遺伝子組換え
EP3620534B1 (en) 2013-03-14 2021-10-13 Caribou Biosciences, Inc. Crispr-cas compositions of nucleic acid-targeting nucleic acids
US20160138027A1 (en) * 2013-03-14 2016-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of diseases and conditions associated with dysregulation of mammalian target of rapamycin complex 1 (mtorc1)
US20140273235A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
WO2014152432A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
CN115261411A (zh) 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
LT2986729T (lt) 2013-04-16 2018-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Žiurkės genomo tikslinė modifikacija
US20160186208A1 (en) * 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
EP2997146A4 (en) 2013-05-15 2017-04-26 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
US20140349405A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
WO2014194190A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
IL302205A (en) * 2013-06-04 2023-06-01 Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
EP3539573B1 (en) * 2013-06-05 2024-02-14 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
EP3008181B1 (en) 2013-06-11 2019-11-06 The Regents of The University of California Methods and compositions for target dna modification
WO2014204727A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CA2915795C (en) * 2013-06-17 2021-07-13 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
ES2777217T3 (es) 2013-06-17 2020-08-04 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas de guía en tándem, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias
KR20240172759A (ko) 2013-06-17 2024-12-10 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 간의 표적화 및 치료를 위한 ＣＲＩＳＰＲ­Ｃａｓ 시스템, 벡터 및 조성물의 전달 및 용도
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
WO2015006498A2 (en) 2013-07-09 2015-01-15 President And Fellows Of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
SG11201600060VA (en) 2013-07-10 2016-02-26 Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
US11060083B2 (en) 2013-07-19 2021-07-13 Larix Bioscience Llc Methods and compositions for producing double allele knock outs
CN105392885B (zh) 2013-07-19 2020-11-03 赖瑞克斯生物科技公司 用于产生双等位基因敲除的方法和组合物
US11306328B2 (en) 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US9163284B2 (en) * 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
KR102304167B1 (ko) 2013-08-16 2021-09-24 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 세포로의 선택적 물질 전달
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
BR112016003561B8 (pt) 2013-08-22 2022-11-01 Du Pont Método para a produção de uma modificação genética, método para a introdução de um polinucleotídeo de interesse no genoma de uma planta, método para a edição de um segundo gene em um genoma de planta e método para gerar uma planta de milho resistente ao glifosato
US9567609B2 (en) 2013-08-28 2017-02-14 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
US20160251410A1 (en) 2013-09-03 2016-09-01 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for expressing recombinant polypeptides
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
EP3049512A4 (en) 2013-09-17 2017-04-05 Board of Trustees of the University of Arkansas E. coli separatome-based protein expression and purification platform
TW201542816A (zh) * 2013-09-18 2015-11-16 Kymab Ltd 方法、細胞與生物體
WO2015048690A1 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Optimized small guide rnas and methods of use
JP6646573B2 (ja) 2013-10-17 2020-02-14 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介ゲノム遺伝子操作のための送達方法および組成物
WO2015057976A1 (en) 2013-10-17 2015-04-23 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
WO2015059690A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Polynucleotides encoding brex system polypeptides and methods of using s ame
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
US10584358B2 (en) * 2013-10-30 2020-03-10 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-II CRISPR-Cas system in Lactobacillus buchneri
DK3066201T3 (en) 2013-11-07 2018-06-06 Editas Medicine Inc CRISPR-RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS WITH LEADING GRADES
US11326209B2 (en) * 2013-11-07 2022-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Cell-based genomic recorded accumulative memory
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
CN105980568B (zh) 2013-12-11 2019-12-03 瑞泽恩制药公司 用于靶向修饰基因组的方法和组合物
US9994831B2 (en) * 2013-12-12 2018-06-12 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
EP3080260B1 (en) 2013-12-12 2019-03-06 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
EP4219699A1 (en) 2013-12-12 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
EP3653229A1 (en) 2013-12-12 2020-05-20 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
SG10201804975PA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders
MX2016007327A (es) 2013-12-12 2017-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapeuticas de sistemas y composiciones crispr-cas para dirigirlos a trastornos y enfermedades usando componentes para suministro de particulas.
BR112016013520A2 (pt) 2013-12-12 2017-10-03 Broad Inst Inc Composições e métodos de uso de sistemas crispr-cas em distúrbios de repetições de nucleotídeos
CN106030310B (zh) 2013-12-13 2019-01-04 通用医疗公司 可溶性高分子量(hmw)tau种类及其应用
SG11201604815RA (en) 2013-12-19 2016-07-28 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
RU2729463C2 (ru) 2013-12-20 2020-08-06 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Меченые химерные эффекторные молекулы и их рецепторы
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US10188650B2 (en) 2014-01-03 2019-01-29 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of neurological disorders
US9850525B2 (en) * 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
GB201401707D0 (en) * 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
MX375420B (es) 2014-02-11 2025-03-06 The Regents Of The Univ Of Colorado A Body Corporate Ingenieria genetica multiplexada habilitada por crispr.
US20180142307A1 (en) * 2014-02-11 2018-05-24 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
US10287590B2 (en) * 2014-02-12 2019-05-14 Dna2.0, Inc. Methods for generating libraries with co-varying regions of polynuleotides for genome modification
RU2016136977A (ru) 2014-02-18 2018-03-20 Дьюк Юниверсити Композиции для инактивации репликации вируса и способы их получения и применения
ES2898460T3 (es) 2014-02-27 2022-03-07 Monsanto Technology Llc Composiciones y procedimientos para la modificación genómica dirigida al sitio
CA2940653A1 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Vijay Kuchroo T cell balance gene expression, compositions of matters and methods of use thereof
PL3115457T3 (pl) * 2014-03-05 2020-01-31 National University Corporation Kobe University Sposób modyfikacji sekwencji genomowej do specyficznego przekształcania zasad kwasu nukleinowego docelowej sekwencji dna oraz kompleks molekularny do zastosowania w nim
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US20170106055A1 (en) * 2014-03-12 2017-04-20 Precision Biosciences, Inc. Dystrophin Gene Exon Deletion Using Engineered Nucleases
CN106455514A (zh) 2014-03-14 2017-02-22 希博斯美国有限公司 采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
JP2017514513A (ja) * 2014-03-20 2017-06-08 ユニベルシテ ラバル フラタキシンレベルを増加させるためのｃｒｉｓｐｒ系の方法及び生成物、ならびにそれらの使用
US11242525B2 (en) * 2014-03-26 2022-02-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease
PL3888674T3 (pl) 2014-04-07 2024-09-23 Novartis Ag Leczenie nowotworu złośliwego z zastosowaniem chimerycznego receptora antygenowego anty-CD19
JP2017512481A (ja) 2014-04-08 2017-05-25 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ関連遺伝子を用いた、ｒｎａ依存性の転写抑制のための方法および組成物
US20170175128A1 (en) * 2014-04-18 2017-06-22 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
US20150301028A1 (en) * 2014-04-22 2015-10-22 Q-State Biosciences, Inc. Analysis of compounds for pain and sensory disorders
EP3136850A1 (en) 2014-04-28 2017-03-08 Recombinetics, Inc. Multiplex gene editing in swine
WO2015168404A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Toehold-gated guide rna for programmable cas9 circuitry with rna input
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
EP3142707A4 (en) 2014-05-13 2018-02-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
CN113249297A (zh) 2014-05-28 2021-08-13 儿童医院医疗中心 用于经由定向分化将前体细胞转化为胃组织的方法和系统
EP3149169A1 (en) * 2014-05-30 2017-04-05 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections
EP3152319A4 (en) 2014-06-05 2017-12-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
KR102374379B1 (ko) * 2014-06-06 2022-03-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 표적화된 좌를 변형시키는 방법 및 조성물
WO2015191693A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
CN106536056B (zh) 2014-06-13 2021-07-16 儿童医学中心公司 分离线粒体的产品和方法
ES2788426T3 (es) * 2014-06-16 2020-10-21 Univ Johns Hopkins Composiciones y métodos para la expresión de ARNs de guía de CRISPR utilizando el promotor de H1
AU2015280069B2 (en) 2014-06-23 2021-08-12 The General Hospital Corporation Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq)
WO2015200334A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
CA3172866A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use
US20180187172A1 (en) * 2014-07-01 2018-07-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Regulated gene expression from viral vectors
WO2016005985A2 (en) 2014-07-09 2016-01-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Method for reprogramming cells
AU2015288157A1 (en) 2014-07-11 2017-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
US11254933B2 (en) * 2014-07-14 2022-02-22 The Regents Of The University Of California CRISPR/Cas transcriptional modulation
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
WO2016014565A2 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
EP3172234B1 (en) 2014-07-21 2020-04-08 Novartis AG Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
WO2016014794A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
WO2016014837A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2016019144A2 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
EP3660042B1 (en) 2014-07-31 2023-01-11 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
US9932566B2 (en) 2014-08-07 2018-04-03 Agilent Technologies, Inc. CIS-blocked guide RNA
US11299732B2 (en) * 2014-08-07 2022-04-12 The Rockefeller University Compositions and methods for transcription-based CRISPR-Cas DNA editing
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
US11071289B2 (en) 2014-08-14 2021-07-27 Biocytogen Boston Corp DNA knock-in system
JP6919118B2 (ja) 2014-08-14 2021-08-18 ノバルティス アーゲー ＧＦＲα−４キメラ抗原受容体を用いる癌の治療
DK3180426T3 (da) 2014-08-17 2020-03-30 Broad Inst Inc Genomredigering ved anvendelse af cas9-nickaser
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
CN107075546B (zh) 2014-08-19 2021-08-31 哈佛学院董事及会员团体 用于对核酸探测并作图的rna-引导的系统
RU2020117196A (ru) 2014-08-19 2020-10-15 Новартис Аг Химерный антигенный рецептор (car) против cd123 для использования в лечении злокачественных опухолей
US9970030B2 (en) 2014-08-27 2018-05-15 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing CAS9-mediated engineering efficiency
EP3633032A3 (en) 2014-08-28 2020-07-29 North Carolina State University Novel cas9 proteins and guiding features for dna targeting and genome editing
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
CN108064129A (zh) 2014-09-12 2018-05-22 纳幕尔杜邦公司 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法
US11261453B2 (en) 2014-09-12 2022-03-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Cells expressing apolipoprotein E and uses thereof
IL234638A0 (en) 2014-09-14 2014-12-02 Yeda Res & Dev NMDA receptor antagonists for the treatment of Gaucher disease
HUE055583T2 (hu) 2014-09-16 2021-12-28 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények nukleáz által közvetített genommódosításhoz és -javításhoz hematopoetikus õssejtekben
US10577417B2 (en) 2014-09-17 2020-03-03 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
CN113016623A (zh) 2014-09-26 2021-06-25 谱赛科美国股份有限公司 用于甜菊的单核苷酸多态性(snp)标志物
CN107002098A (zh) 2014-09-29 2017-08-01 杰克逊实验室 通过电穿孔高效率、高通量产生遗传修饰哺乳动物
AU2015324935B2 (en) 2014-10-01 2021-04-08 The General Hospital Corporation Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair
CA2963693A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
EP3561052A1 (en) 2014-10-15 2019-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells
CN107208086A (zh) 2014-10-17 2017-09-26 霍华德休斯医学研究所 基因组探针
GB201418965D0 (ja) 2014-10-24 2014-12-10 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon
AU2015335618B2 (en) 2014-10-24 2018-02-01 Avectas Limited Delivery across cell plasma membranes
WO2016069591A2 (en) 2014-10-27 2016-05-06 The Broad Institute Inc. Compositions, methods and use of synthetic lethal screening
US20190100769A1 (en) 2014-10-31 2019-04-04 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics for crispr
AU2015339743C1 (en) * 2014-10-31 2021-04-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Altering gene expression in modified T cells and uses thereof
US11111472B2 (en) 2014-10-31 2021-09-07 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of biomolecules to immune cells
EP3215623A4 (en) 2014-11-06 2018-09-26 President and Fellows of Harvard College Cells lacking b2m surface expression and methods for allogeneic administration of such cells
KR102424721B1 (ko) 2014-11-06 2022-07-25 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 Rna-유도 엔도뉴클레아제의 세포 내로의 펩티드 매개성 전달
WO2016073990A2 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
UA124449C2 (uk) 2014-11-12 2021-09-22 Нмк, Інк. Трансгенна рослина з модифікованою редокс-залежною модуляцією пігментів фотосинтетичних антенних комплексів та спосіб її одержання
US11470826B2 (en) 2014-11-17 2022-10-18 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Method of conveniently producing genetically modified non-human mammal with high efficiency
ES2731437T3 (es) 2014-11-21 2019-11-15 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida mediante el uso de pares de ARN guías
KR101833433B1 (ko) 2014-11-25 2018-02-28 한국생명공학연구원 돼지 t 세포 및 b 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법
US11168369B2 (en) 2014-11-25 2021-11-09 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Method of identifying and treating a person having a predisposition to or afflicted with a cardiometabolic disease
WO2016086227A2 (en) 2014-11-26 2016-06-02 The Regents Of The University Of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
CN116059378A (zh) 2014-12-10 2023-05-05 明尼苏达大学董事会 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
US20170327834A1 (en) 2014-12-15 2017-11-16 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
CN107223157B (zh) 2014-12-16 2021-01-08 丹尼斯科美国公司 用于辅助菌株介导的真菌基因组修饰的组合物和方法
CA2971187C (en) * 2014-12-16 2023-10-24 Danisco Us Inc. Fungal genome modification systems and methods of use
EP4484556A2 (en) 2014-12-16 2025-01-01 C3J Therapeutics, Inc. Compositions of and methods for in vitro viral genome engineering
US9840702B2 (en) * 2014-12-18 2017-12-12 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR-based compositions and methods of use
US20190054117A1 (en) 2014-12-19 2019-02-21 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
WO2016100857A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
US11326184B2 (en) 2014-12-19 2022-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting
EP3234192B1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 The Broad Institute, Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
WO2016106121A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications
WO2016106244A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Crispr having or associated with destabilization domains
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
CA2972454A1 (en) 2014-12-31 2016-07-07 Synthetic Genomics, Inc. Compositions and methods for high efficiency in vivo genome editing
US11208638B2 (en) * 2015-01-12 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Heterodimeric Cas9 and methods of use thereof
US11125739B2 (en) * 2015-01-12 2021-09-21 Massachusetts Institute Of Technology Gene editing through microfluidic delivery
WO2016112963A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 Riboxx Gmbh Delivery of biomolecules into cells
AR103446A1 (es) * 2015-01-19 2017-05-10 Inst Genetics & Dev Biolog Cas Método para modificar con precisión una planta a través de la expresión transitoria de genes
US20180002379A1 (en) 2015-01-21 2018-01-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
US11421241B2 (en) 2015-01-27 2022-08-23 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for conducting site-specific modification on entire plant via gene transient expression
US11180792B2 (en) 2015-01-28 2021-11-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
IL288263B (en) 2015-01-28 2022-07-01 Caribou Biosciences Inc Crispr hybrid dna/rna polynucleotides and methods of use
US11248240B2 (en) 2015-01-29 2022-02-15 Meiogenix Method for inducing targeted meiotic recombinations
WO2016124918A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 The Institute Of Genetics And Developmental Biology Plants with increased seed size
US10485196B2 (en) 2015-02-03 2019-11-26 The Institute Of Genetics And Developmental Biology Chinese Academy Of Scinces Rice plants with altered seed phenotype and quality
CN115029362A (zh) 2015-02-06 2022-09-09 新加坡国立大学 核酸、包含其的工程免疫细胞及其生产方法和用途
EP3256487A4 (en) 2015-02-09 2018-07-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
EP3262193A2 (en) 2015-02-26 2018-01-03 The Broad Institute Inc. T cell balance gene expression, compositions of matters and methods of use thereof
TW201702380A (zh) * 2015-02-27 2017-01-16 再生元醫藥公司 宿主細胞蛋白質修飾
WO2016138574A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Sinai Health System Homologous recombination factors
CA2977271A1 (en) * 2015-03-02 2016-09-09 Synthetic Genomics, Inc. Regulatory elements from labyrinthulomycetes microorganisms
US10202589B2 (en) 2015-03-03 2019-02-12 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificity
WO2016142427A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method ank kit for reprogramming somatic cells
WO2016145516A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Deep Genomics Incorporated System and method for training neural networks
CN105985943B (zh) 2015-03-16 2021-07-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法
CN107430646B (zh) 2015-03-17 2021-10-22 生物辐射实验室股份有限公司 检测基因组编辑
EP4218771A1 (en) 2015-03-27 2023-08-02 Yeda Research and Development Co. Ltd Methods of treating motor neuron diseases
EP3274460A1 (en) 2015-03-27 2018-01-31 E. I. du Pont de Nemours and Company Soybean u6 small nuclear rna gene promoters and their use in constitutive expression of small rna genes in plants
KR20250002825A (ko) 2015-03-31 2025-01-07 소흠, 인코포레이티드 세포 또는 유기체의 게놈으로의 ＤＮＡ 서열의 표적화 혼입을 위한 Ｃａｓ 9 레트로바이러스 인테그라제 시스템 및 Ｃａｓ 9 재조합효소 시스템
KR102648489B1 (ko) 2015-04-06 2024-03-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
US11214779B2 (en) 2015-04-08 2022-01-04 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Activatable CRISPR/CAS9 for spatial and temporal control of genome editing
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
US12128069B2 (en) 2015-04-23 2024-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
CN107690480B (zh) 2015-04-24 2022-03-22 爱迪塔斯医药公司 Cas9分子/指导rna分子复合物的评价
EP3288570A4 (en) 2015-04-29 2018-11-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
WO2016179038A1 (en) * 2015-05-01 2016-11-10 Spark Therapeutics, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRUS-MEDIATED CRISPR-Cas9 TREATMENT OF OCULAR DISEASE
ES2905525T3 (es) 2015-05-06 2022-04-11 Snipr Tech Ltd Alteración de poblaciones microbianas y modificación de la microbiota
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
WO2016182893A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Teh Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof
AU2016261600B2 (en) 2015-05-08 2021-09-23 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
US11390884B2 (en) 2015-05-11 2022-07-19 Editas Medicine, Inc. Optimized CRISPR/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
CN115043943A (zh) 2015-05-15 2022-09-13 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
EP3298134B8 (en) 2015-05-16 2023-06-21 Genzyme Corporation Gene editing of deep intronic mutations
BR112017024757A2 (pt) 2015-05-18 2018-11-13 TCR2 Therapeutics Inc. composições e métodos para reprogramação de tcr utilizando proteínas de fusão
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
DE102015014252A1 (de) 2015-11-05 2017-05-11 Kws Saat Se Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
DE102015006335A1 (de) 2015-05-19 2016-11-24 Kws Saat Se Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
ES2755747T3 (es) 2015-05-22 2020-04-23 Stcube & Co Inc Métodos de rastreo para dianas para la terapia contra el cáncer
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
ES2784360T3 (es) 2015-05-29 2020-09-24 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72
KR20230110368A (ko) 2015-06-01 2023-07-21 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 Hiv 감염의 rna-가이드된 치료를 위한 방법 및 조성물
WO2016196655A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The Regents Of The University Of California Cas9 variants and methods of use thereof
CN108368502B (zh) 2015-06-03 2022-03-18 内布拉斯加大学董事委员会 使用单链dna的dna编辑
US20180296537A1 (en) 2015-06-05 2018-10-18 Novartis Ag Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
CA2986262A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation
US10185803B2 (en) 2015-06-15 2019-01-22 Deep Genomics Incorporated Systems and methods for classifying, prioritizing and interpreting genetic variants and therapies using a deep neural network
WO2016205680A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for introducing a functional polypeptide into cells of blood cell lineage
WO2016205728A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr mediated recording of cellular events
AU2016278982A1 (en) 2015-06-17 2018-01-18 The Uab Research Foundation CRISPR/Cas9 complex for genomic editing
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
CA3012631A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
CA3012607A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Crispr enzymes and systems
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
WO2016205745A2 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
KR102575342B1 (ko) 2015-06-18 2023-09-05 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적외 효과를 감소시키는 crispr 효소 돌연변이
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
US10669528B2 (en) 2015-06-25 2020-06-02 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
CA2990699A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
EP3320082B1 (en) 2015-07-09 2023-05-24 Massachusetts Institute of Technology Delivery of materials to anucleate cells
AU2016291778B2 (en) 2015-07-13 2021-05-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3957731A1 (en) 2015-07-15 2022-02-23 Rutgers, The State University of New Jersey Nuclease-independent targeted gene editing platform and uses thereof
IL274572B2 (en) 2015-07-16 2024-01-01 Biolinerx Ltd Compositions and methods for treating cancer
EP3325629A2 (en) 2015-07-17 2018-05-30 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Wheat plants resistant to powdery mildew
WO2017015101A1 (en) * 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
JP6937740B2 (ja) 2015-07-28 2021-09-22 ダニスコ・ユーエス・インク ゲノム編集システムおよび使用方法
GB2595063B (en) 2015-07-31 2022-03-09 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy
WO2017024317A2 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to induce targeted protein degradation through bifunctional molecules
EP3331905B1 (en) 2015-08-06 2022-10-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeted protein degradation to attenuate adoptive t-cell therapy associated adverse inflammatory responses
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
US10882894B2 (en) 2015-08-11 2021-01-05 Anie Philip Peptidic TGF-beta antagonists
WO2017027810A2 (en) 2015-08-12 2017-02-16 The General Hospital Corporation Compositions and methods that promote hypoxia or the hypoxia response for treatment and prevention of mitochondrial dysfunction and oxidative stress disorders
WO2017027910A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
EP3334832A4 (en) 2015-08-14 2019-06-26 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences PROCESS FOR THE PREPARATION OF GLYPHOSATE-RESISTANT RICE BY TARGETED NUCLEOTIDE SUBSTITUTION
WO2017031370A1 (en) 2015-08-18 2017-02-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains
CA2995582A1 (en) 2015-08-19 2017-02-23 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Compositions and methods for treating graft versus host disease
EP4345455A3 (en) 2015-08-25 2024-07-17 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
WO2017040348A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US11613759B2 (en) 2015-09-04 2023-03-28 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
DK3348638T3 (da) 2015-09-09 2023-02-13 Univ Kobe Nat Univ Corp Fremgangsmåde til at konvertere genomsekvens fra gram-positiv bakterie ved specifikt at konvertere nukleinsyrebase i tilsigtet dna-sekvens, og molekylkompleks anvendt dertil
IL241462A0 (en) 2015-09-10 2015-11-30 Yeda Res & Dev Heterologous engineering of betalain pigments in plants
CA3000816A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
CN105132427B (zh) * 2015-09-21 2019-01-08 新疆畜牧科学院生物技术研究所 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA
CA2999500A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
US9850484B2 (en) 2015-09-30 2017-12-26 The General Hospital Corporation Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (Circle-seq)
WO2017059241A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lentiviral protein delivery system for rna-guided genome editing
EP3940070A1 (en) 2015-10-05 2022-01-19 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human t cell receptor alpha constant region gene
EP4108255A1 (en) 2015-10-05 2022-12-28 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified cells comprising a modified human t cell receptor alpha constant region gene
US12241053B2 (en) 2015-10-09 2025-03-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
KR102628801B1 (ko) 2015-10-12 2024-01-25 이아이디피, 인크. 세포내 유전자 변형 및 증가된 상동 재조합을 위한 보호 dna 주형 및 이용 방법
EP3362571A4 (en) 2015-10-13 2019-07-10 Duke University GENOM ENGINEERING WITH TYPE I CRISPR SYSTEMS IN EUKARYOTIC CELLS
EP3362102A1 (en) * 2015-10-14 2018-08-22 Life Technologies Corporation Ribonucleoprotein transfection agents
US11207393B2 (en) 2015-10-16 2021-12-28 President And Fellows Of Harvard College Regulatory T cell PD-1 modulation for regulating T cell effector immune responses
IL300420B2 (en) 2015-10-16 2024-09-01 Univ Columbia Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens
US20180312873A1 (en) * 2015-10-20 2018-11-01 10X Genomics, Inc. Method and systems for high throughput single cell genetic manipulation
KR102761827B1 (ko) 2015-10-22 2025-02-03 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 타입 vi-b crispr 효소 및 시스템
ES2840648T3 (es) * 2015-10-22 2021-07-07 Inst Nat Sante Rech Med Generación de código de barras de endonucleasa
EP3159407A1 (en) 2015-10-23 2017-04-26 Silence Therapeutics (London) Ltd Guide rnas, methods and uses
JP7067793B2 (ja) 2015-10-23 2022-05-16 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基編集因子およびその使用
US9677090B2 (en) 2015-10-23 2017-06-13 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic-acid targeting nucleic acids
WO2017074788A1 (en) 2015-10-27 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for targeting cancer-specific sequence variations
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
WO2017075478A2 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by use of immune cell gene signatures
WO2017075451A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1
WO2017075465A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3
US11092607B2 (en) 2015-10-28 2021-08-17 The Board Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017075329A2 (en) 2015-10-29 2017-05-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using pm20d1 and n-lipidated amino acids
JP6882282B2 (ja) 2015-11-03 2021-06-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 三次元核酸含有マトリックスの立体撮像のための方法と装置
WO2017083852A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 MOORE, Tara Methods for the treatment of corneal dystrophies
US10669320B2 (en) 2015-11-18 2020-06-02 The Regents Of The University Of Michigan Mps1 and KNL1 phosphorylation system
CN109072178B (zh) 2015-11-18 2022-08-02 先正达参股股份有限公司 单倍体诱导组合物及其使用方法
US11001622B2 (en) 2015-11-19 2021-05-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Method of treating autoimmune disease with lymphocyte antigen CD5-like (CD5L) protein
JP6976249B2 (ja) 2015-11-23 2021-12-08 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫を工学操作するための方法および組成物
SG11201804372PA (en) * 2015-11-23 2018-06-28 Univ California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
US11220693B2 (en) 2015-11-27 2022-01-11 National University Corporation Kobe University Method for converting monocot plant genome sequence in which nucleic acid base in targeted DNA sequence is specifically converted, and molecular complex used therein
US11903975B2 (en) 2015-11-30 2024-02-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes from blood products
CN105296518A (zh) * 2015-12-01 2016-02-03 中国农业大学 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法
JP6707133B2 (ja) 2015-12-04 2020-06-10 カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 操作された核酸標的化核酸
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
KR20180084756A (ko) 2015-12-07 2018-07-25 지머젠 인코포레이티드 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터
US11345931B2 (en) 2015-12-14 2022-05-31 President And Fellows Of Harvard College Cas discrimination using tuned guide RNA
WO2017106657A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
EA201891212A1 (ru) 2015-12-18 2019-01-31 Сангамо Терапьютикс, Инк. Адресная дезорганизация клеточного рецептора гкгс
EP3390624A4 (en) * 2015-12-18 2019-07-10 The Regents of The University of California Modified site-directed modifying polypeptides and methods of use thereof
EP3389677B1 (en) 2015-12-18 2024-06-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor
US11542466B2 (en) 2015-12-22 2023-01-03 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of CRISPR based antimicrobials
EP3394092A1 (en) 2015-12-23 2018-10-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity t cell receptors and uses thereof
IL260257B2 (en) * 2015-12-28 2024-05-01 Novartis Ag Preparations and methods for the treatment of hemoglobinopathies
AU2016380836A1 (en) 2015-12-30 2018-07-12 Avectas Limited Vector-free delivery of gene editing proteins and compositions to cells and tissues
US20190000880A1 (en) 2015-12-30 2019-01-03 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
CN114699558B (zh) 2016-01-04 2023-07-28 小利兰·斯坦福大学托管委员会 使用经遗传矫正的自体角质形成细胞进行的隐性营养不良型大疱性表皮松解症的基因疗法
WO2017118985A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating malignant, autoimmune and inflammatory diseases
EP3402885A4 (en) 2016-01-11 2019-07-03 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University CHIMERIC PROTEINS AND METHOD FOR REGULATING GENE EXPRESSION
MY194127A (en) 2016-01-11 2022-11-14 Univ Leland Stanford Junior Chimeric proteins and methods of immunotherapy
ES2927427T3 (es) 2016-01-15 2022-11-04 Childrens Medical Ct Corp Uso terapéutico de mitocondrias y agentes mitocondriales combinados
SG11201805993UA (en) 2016-01-15 2018-08-30 Jackson Lab Genetically modified non-human mammals by multi-cycle electroporation of cas9 protein
US11839195B2 (en) 2016-01-21 2023-12-12 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Parthenocarpic tomato plants with loss of function mutation in an AGL6 gene and methods of producing same
EP3408376A1 (en) 2016-01-31 2018-12-05 Hadasit Medical Research Services and Development Ltd. Autosomal-identical pluripotent stem cell populations having non-identical sex chromosomal composition and uses thereof
CA3011049A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
BR112018016278A2 (pt) 2016-02-09 2019-01-02 Cibus Europe Bv métodos e composições para aumentar a eficiência da modificação do gene direcionada usando reparação de gene mediada por oligonucleotídeo
WO2017139309A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of mutagenized allele combinations
WO2017138008A2 (en) 2016-02-14 2017-08-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of modulating protein exocytosis and uses of same in therapy
EP3416663B1 (en) 2016-02-18 2021-04-14 The Penn State Research Foundation Generating gabaergic neurons in brains
WO2017143071A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
EP3420102B1 (en) 2016-02-22 2024-04-03 Massachusetts Institute of Technology Methods for identifying and modulating immune phenotypes
US11530253B2 (en) 2016-02-25 2022-12-20 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by CRISPR/CAS9 technology
CA3015665C (en) 2016-02-26 2020-09-22 Lanzatech New Zealand Limited Crispr/cas systems for c1-fixing bacteria
EP3423083A4 (en) 2016-03-04 2019-10-02 Indoor Biotechnologies Inc. FEL D 1 INACTIVATIONS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS BASED ON GENOMIC EDITION OF CRISPR-CAS9
WO2017153982A1 (en) 2016-03-06 2017-09-14 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for modulating myelination
AU2017235461B2 (en) 2016-03-15 2023-02-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
CN109414414A (zh) 2016-03-16 2019-03-01 戴维·格拉德斯通研究所 用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物
EP3430035A4 (en) 2016-03-16 2020-02-19 Conagen Inc. PRODUCTION OF PROTEINS IN LABYRINE THULOMYCETES
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11427861B2 (en) 2016-03-17 2022-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
AU2017238054B2 (en) 2016-03-21 2023-10-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. T-cell exhaustion state-specific gene expression regulators and uses thereof
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
WO2017165862A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
WO2017180694A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules gene editing systems, and methods of use thereof
US11377637B2 (en) 2016-04-15 2022-07-05 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic T cell and chimeric antigen receptor T cell compositions and related methods
EP3443096B1 (en) 2016-04-15 2023-03-01 Novartis AG Compositions and methods for selective expression of chimeric antigen receptors
AU2017253107B2 (en) 2016-04-19 2023-07-20 Massachusetts Institute Of Technology CPF1 complexes with reduced indel activity
KR101896243B1 (ko) * 2016-04-22 2018-09-11 한양대학교 산학협력단 Ｒｇｅｎ ｒｎｐ를 이용하여 개발된 클라미도모나스 변이주 및 이를 이용한 색소 생산방법
JP7259182B2 (ja) 2016-04-25 2023-04-18 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ｉｎ ｓｉｔｕ分子検出のためのハイブリダイゼーション連鎖反応法
EP3448996A1 (en) 2016-04-26 2019-03-06 Massachusetts Institute of Technology Extensible recombinase cascades
WO2017192544A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Massachusetts Institute Of Technology AMPHIPHILIC NANOPARTICLES FOR CODELIVERY OF WATER-INSOLUBLE SMALL MOLECULES AND RNAi
WO2017197301A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Hanley Brian P Safe delivery of crispr and other gene therapies to large fractions of somatic cells in humans and animals
JP7324583B2 (ja) 2016-05-20 2023-08-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 複数のガイドｒｎａを使用して免疫寛容を破綻させるための方法
WO2017205503A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Indiana University Research And Technology Corporation Ku inhibitors and their use
KR20240103039A (ko) 2016-05-25 2024-07-03 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) 암 치료 방법 및 조성물
US10266851B2 (en) 2016-06-02 2019-04-23 Sigma-Aldrich Co. Llc Using programmable DNA binding proteins to enhance targeted genome modification
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US11708588B2 (en) * 2016-06-16 2023-07-25 Adam Brian Robertson Gene editing
WO2017219027A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 The Broad Institute Inc. Type vi crispr orthologs and systems
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
CN109688820B (zh) 2016-06-24 2023-01-10 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） 用于生成条形码化组合文库的方法
US11471462B2 (en) 2016-06-27 2022-10-18 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
EP3478833A4 (en) 2016-06-30 2019-10-02 Zymergen, Inc. METHODS OF GENERATING A BACTERIAL HEMOGLOBIN LIBRARY AND USES THEREOF
EP3478845A4 (en) 2016-06-30 2019-07-31 Zymergen, Inc. METHODS OF PRODUCING A GLUCOSE PERMEASE BANK AND USES THEREOF
JP7033583B2 (ja) 2016-07-13 2022-03-10 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ゲノム編集効率を高めるための方法、組成物及びキット
WO2018013918A2 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
CN106191061B (zh) * 2016-07-18 2019-06-18 暨南大学 一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列及其应用
EP4275747A3 (en) 2016-07-19 2024-01-24 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
JP7004651B2 (ja) * 2016-07-19 2022-02-04 株式会社バイオダイナミクス研究所 長鎖一本鎖ｄｎａを調製する方法
CA3031206A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fibrillin-1 mutations for modeling neonatal progeroid syndrome with congenital lipodystrophy
US11566263B2 (en) 2016-08-02 2023-01-31 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
WO2018026953A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
GB2568182A (en) 2016-08-03 2019-05-08 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11905549B2 (en) 2016-08-10 2024-02-20 Genahead Bio, Inc. Method for modifying target site in genome of eukaryotic cell, and method for detecting presence or absence of nucleic acid sequence to be detected at target site
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
JP6899564B2 (ja) 2016-08-12 2021-07-07 Ｎｅｘｕｓｐｉｒａｌ株式会社 ゲノム編集方法
US11352647B2 (en) 2016-08-17 2022-06-07 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems
US11630103B2 (en) 2016-08-17 2023-04-18 The Broad Institute, Inc. Product and methods useful for modulating and evaluating immune responses
EP3500967A1 (en) 2016-08-17 2019-06-26 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying class 2 crispr-cas systems
IL247368A0 (en) 2016-08-18 2016-11-30 Yeda Res & Dev Diagnostic and therapeutic uses of exosomes
AU2017313616B2 (en) 2016-08-19 2022-12-08 Institute For Basic Science Artificially engineered angiogenesis regulatory system
US20190185850A1 (en) * 2016-08-20 2019-06-20 Avellino Lab Usa, Inc. Single guide rna/crispr/cas9 systems, and methods of use thereof
WO2020225754A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Mcmullen Tara Crispr gene editing for autosomal dominant diseases
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR20220145913A (ko) 2016-08-24 2022-10-31 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 가공된 표적 특이적 뉴클레아제
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
WO2018049025A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
EP3509645A4 (en) 2016-09-07 2020-06-17 Sangamo Therapeutics, Inc. MODULATION OF LIVER GENES
WO2018046610A1 (en) 2016-09-08 2018-03-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing and treating nephrotic syndrome
IL247752A0 (en) 2016-09-11 2016-11-30 Yeda Res & Dev Compositions and methods for modulating gene expression for site-directed mutagenesis
CA3036854A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 Labcyte Inc. High-efficiency transfection of biological cells using sonoporation
JP7466308B2 (ja) 2016-09-20 2024-04-12 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｕｓｐ１０バイオマーカーおよびモジュレーターを用いたａｍｌの同定、評価、予防および処置のための組成物および方法
MX2019003176A (es) 2016-09-23 2019-07-04 Hutchinson Fred Cancer Res Receptores de linfocitos t (tcr) especificos del antigeno menor de histocompatibilidad (h) ah-1 y sus usos.
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
US20190203230A1 (en) 2016-09-28 2019-07-04 Novartis Ag Porous membrane-based macromolecule delivery system
KR20190049887A (ko) 2016-09-29 2019-05-09 난트케이웨스트, 인크. 감소된 면역원성을 갖는 hla 클래스 i-결핍 nk-92 세포
RU2760877C2 (ru) * 2016-09-30 2021-12-01 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Животные, отличные от человека, характеризующиеся экспансией гексануклеотидных повторов в локусе c9orf72
EA201990861A1 (ru) 2016-09-30 2019-09-30 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Рнк-направляемые модифицирующие нуклеиновые кислоты ферменты и способы их применения
DK3757120T3 (da) 2016-10-04 2022-07-25 Prec Biosciences Inc Co-stimulerende domæner til anvendelse i genetisk modificerede celler
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
KR20230164759A (ko) 2016-10-07 2023-12-04 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스 아이엔씨. Ｓ. 피오게네스 ｃａｓ９ 돌연변이 유전자 및 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드
EP3445787B1 (en) 2016-10-07 2020-12-02 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for t-cell receptors reprogramming using fusion proteins
US11242542B2 (en) 2016-10-07 2022-02-08 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
US20200016202A1 (en) 2016-10-07 2020-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
WO2018069232A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of having cardiac hypertrophy
CN110290813A (zh) 2016-10-14 2019-09-27 通用医疗公司 表观遗传学调控的位点特异性核酸酶
GB2573062A (en) 2016-10-14 2019-10-23 Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
GB2605883B (en) 2016-10-18 2023-03-15 Univ Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
CN110022904B (zh) 2016-10-20 2024-04-19 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗法布里病的方法和组合物
WO2018081531A2 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Methods for human t-cell activation
CN106637421B (zh) * 2016-10-28 2019-12-27 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 双sgRNA文库的构建及其应用于高通量功能性筛选研究的方法
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
EP3532106A4 (en) 2016-10-31 2020-06-24 Sangamo Therapeutics, Inc. GENE CORRECTION OF SCID-RELATED GENES IN HEMATOPOIETIC AND PROGENITANT STEM CELLS
WO2018083606A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing
US10633454B2 (en) 2016-11-01 2020-04-28 Conagen Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
EP3535416A4 (en) 2016-11-04 2020-05-13 Flagship Pioneering Innovations V. Inc. NEW PLANT CELLS, PLANTS AND SEEDS
CN109906030B (zh) 2016-11-04 2022-03-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
US12227578B2 (en) 2016-11-11 2025-02-18 The Broad Institute, Inc. Modulation of intestinal epithelial cell differentiation, maintenance and/or function through T cell action
WO2018087391A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating stem cells proliferation or differentiation
EP3541408B1 (en) 2016-11-15 2024-11-13 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Compositions and methods for the treatment of aberrant angiogenesis
WO2018098383A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr/cpf1 systems and methods
JP7291396B2 (ja) 2016-11-22 2023-06-15 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
CN118581046A (zh) 2016-11-22 2024-09-03 新加坡国立大学 用于t细胞恶性肿瘤免疫疗法的cd7表达阻滞剂和嵌合抗原受体
CN110234765A (zh) 2016-11-28 2019-09-13 耶达研究及发展有限公司 分离的多核苷酸和多肽及使用它们来表达感兴趣的表达产物的方法
EP3548894B1 (en) 2016-12-02 2021-10-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for diagnosing renal cell carcinoma
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
JP7416406B2 (ja) 2016-12-08 2024-01-17 ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ 機能的ミエリン産生を増進させるための方法および組成物
WO2018111947A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
KR20240172763A (ko) 2016-12-14 2024-12-10 리간달 인코포레이티드 핵산 및/또는 단백질 적재물 전달을 위한 조성물 및 방법
CN110234343A (zh) 2016-12-21 2019-09-13 T细胞受体治疗公司 用于治疗癌症的经工程改造t细胞
JP7465090B2 (ja) 2016-12-22 2024-04-10 アヴェクタス リミテッド 可逆的透過処理によるベクターフリー細胞内送達法
CN110213961A (zh) 2016-12-22 2019-09-06 孟山都技术公司 基于基因组编辑的作物工程化和生产矮秆植物
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
WO2018126087A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Applied Stemcell, Inc. Gene editing method using virus
WO2018122771A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Ukko Inc. Methods for identifying and de-epitoping allergenic polypeptides
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
EP3565608A4 (en) 2017-01-05 2020-12-16 Rutgers, The State University of New Jersey TARGETED GENE EDITING PLATFORM INDEPENDENT OF BICATENARY DNA BREAKAGE AND ITS USES
EP3346001A1 (en) 2017-01-06 2018-07-11 TXCell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
WO2018127585A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Txcell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
EP3565889B1 (en) 2017-01-06 2025-03-26 ImmunityBio, Inc. Genetically modified nk-92 cells with decreased cd96/tigit expression
EP4095263A1 (en) 2017-01-06 2022-11-30 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
CN106636204B (zh) * 2017-01-09 2019-08-23 华中农业大学 一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法
WO2018129440A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 University Of Massachusetts Complexes for gene deletion and editing
US11873496B2 (en) 2017-01-09 2024-01-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of altering gene expression by perturbing transcription factor multimers that structure regulatory loops
GB201700380D0 (en) 2017-01-10 2017-02-22 Plant Bioscience Ltd Methods of increasing seed yield
EP3569708A4 (en) 2017-01-13 2020-09-09 Jichi Medical University AAV VECTOR FOR THE DISRUPTION OF THE COAGULATION-RELATED FACTOR GENE ON THE LIVER GENOME
BR112019014841A2 (pt) 2017-01-23 2020-04-28 Regeneron Pharma rna guia, uso do rna guia, rna antissentido, sirna ou shrna, uso do rna antissentido, do sirna ou do shrna, ácido nucleico isolado, vetor, composição, célula, e, métodos para modificar um gene hsd17b13 em uma célula, para diminuir a expressão de um gene hsd17b13 em uma célula, para modificar uma célula e para tratar um indivíduo que não é portador da variante de hsd17b13
WO2018140725A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Novartis Ag Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
CA3051585A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
US20190375815A1 (en) 2017-01-31 2019-12-12 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
IL250479A0 (en) 2017-02-06 2017-03-30 Sorek Rotem Genetically engineered cells expressing a disarm system that confers resistance to phages and methods for their production
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
WO2018148246A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for rna-guided genetic circuits
CN111386263A (zh) 2017-02-08 2020-07-07 达纳-法伯癌症研究所有限公司 调节嵌合抗原受体
WO2018146481A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Fujian Agriculture And Forestry University Expression of a phosphate transporter for improving plant yield
US11471538B2 (en) 2017-02-10 2022-10-18 INSERM (Institut National de la Santéet de la Recherche Medicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cancers associated with activation of the MAPK pathway
CN110312797A (zh) 2017-02-10 2019-10-08 齐默尔根公司 组装和编辑用于多个宿主的多个dna构建体的模块化通用质粒设计策略
AU2018221704B2 (en) 2017-02-17 2021-08-19 Denali Therapeutics Inc. Transferrin receptor transgenic models
WO2018154418A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
US20200048359A1 (en) 2017-02-28 2020-02-13 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP3595645A1 (en) 2017-03-15 2020-01-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions for the treatment of thrombosis in patients suffering from a myeloproliferative neoplasm
CA3055983A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity mage-a1-specific tcrs and uses thereof
AU2018234825B2 (en) 2017-03-15 2020-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Novel CAS13B orthologues CRISPR enzymes and systems
US11771703B2 (en) 2017-03-17 2023-10-03 The Johns Hopkins University Targeted epigenetic therapy against distal regulatory element of TGFβ2 expression
US12180546B2 (en) 2017-03-17 2024-12-31 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US12161694B2 (en) 2017-03-24 2024-12-10 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for regulating innate lymphoid cell inflammatory responses
EP3601320A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Methods for increasing grain yield
US10980779B2 (en) 2017-03-24 2021-04-20 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) GFI1 inhibitors for the treatment of hyperglycemia
WO2018172508A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2018183580A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 The Broad Institute, Inc Compositions and methods for treatment of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (pparg) activated cancer
BR112019017705A2 (pt) 2017-03-30 2020-03-31 Monsanto Technology Llc Sistemas e métodos para uso em identificação de múltiplas edições de genoma e prevenção dos efeitos agregados das edições do genoma identificado
WO2018178237A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of mitochondrial genetic diseases
US11963966B2 (en) 2017-03-31 2024-04-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
US11913075B2 (en) 2017-04-01 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
WO2018127611A1 (en) * 2017-04-06 2018-07-12 Dsm Ip Assets B.V. Self-guiding integration construct (sgic)
WO2018191520A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 The Broad Institute, Inc. Respiratory and sweat gland ionocytes
EP3610009A1 (en) 2017-04-12 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Novel type vi crispr orthologs and systems
US20200071773A1 (en) 2017-04-12 2020-03-05 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Tumor signature for metastasis, compositions of matter methods of use thereof
WO2018191476A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 Magenta Therapeutics, Inc. Aryl hydrocarbon receptor antagonists and uses thereof
WO2018191750A2 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The Broad Institute Inc. Novel delivery of large payloads
US11913015B2 (en) 2017-04-17 2024-02-27 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
EP3612629A1 (en) 2017-04-18 2020-02-26 The Broad Institute, Inc. Compositions for detecting secretion and methods of use
US11834670B2 (en) * 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
AU2018254547B2 (en) 2017-04-20 2024-06-13 Egenesis, Inc. Methods for generating genetically modified animals
US11591589B2 (en) 2017-04-21 2023-02-28 The General Hospital Corporation Variants of Cpf1 (Cas12a) with altered PAM specificity
US11458118B2 (en) 2017-04-21 2022-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of diseases associated with reduced CFTR function
WO2018195486A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The Broad Institute, Inc. Targeted delivery to beta cells
ES2981244T3 (es) 2017-04-28 2024-10-07 Acuitas Therapeutics Inc Novedosas formulaciones de nanopartículas de lípidos de carbonilo y lípidos para la administración de ácidos nucleicos
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
AU2018261366A1 (en) 2017-05-03 2019-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CTFR) gene
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
IL252151A0 (en) 2017-05-07 2017-07-31 Fainzilber Michael Treatment of stress disorders
JP7170666B2 (ja) 2017-05-08 2022-11-14 プレシジョン バイオサイエンシズ，インク． 操作された抗原受容体をコードする核酸分子及び阻害性核酸分子、並びにそれらの使用方法
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
EP3622062A4 (en) 2017-05-10 2020-10-14 The Regents of the University of California DIRECTED EDITING OF CELLULAR RNA BY NUCLEAR ADMINISTRATION OF CRISPR / CAS9
WO2018209324A2 (en) 2017-05-11 2018-11-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions of use of cd8+ tumor infiltrating lymphocyte subtypes and gene signatures thereof
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CA3062981A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Flt3 inhibitors for improving pain treatments by opioids
CN111417727A (zh) 2017-05-18 2020-07-14 博德研究所 用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物
CA3064000A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
AU2018272067B2 (en) 2017-05-25 2024-07-18 The General Hospital Corporation Base editors with improved precision and specificity
CA3064817A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Institute Of Genetics And Developmental Biology Chinese Academy Of Sciences Methods for increasing grain productivity
EP3633034A4 (en) 2017-05-31 2021-03-24 The University Of Tokyo MODIFIED Cas9 PROTEIN, AND RELATED APPLICATION
EP3409104A1 (en) 2017-05-31 2018-12-05 Vilmorin et Cie Tomato plant resistant to tomato yellow leaf curl virus, powdery mildew, and nematodes
EP3409106A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 Vilmorin et Cie Tolerance in plants of solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus (tbrfv)
WO2020249996A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Vilmorin & Cie Resistance in plants of solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus
WO2018224508A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) -Delegación Andalucía Targeting of gluten by genome editing
US11603544B2 (en) 2017-06-05 2023-03-14 Fred Hutchinson Cancer Center Genomic safe harbors for genetic therapies in human stem cells and engineered nanoparticles to provide targeted genetic therapies
JP7227162B2 (ja) 2017-06-06 2023-02-21 ザイマージェン インコーポレイテッド 真菌株を改良するためのｈｔｐゲノム操作プラットフォーム
EP3878961A1 (en) 2017-06-06 2021-09-15 Zymergen, Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
EP3634496A4 (en) 2017-06-06 2021-09-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHODS FOR SENSITIZING CANCER CELLS TO T-LYMPHOCYTES-MEDIA DESTRUCTION BY MODULATION OF MOLECULAR PATHWAYS
EP3634582A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating hyperpigmentation disorders
CN110997908A (zh) 2017-06-09 2020-04-10 爱迪塔斯医药公司 工程化的cas9核酸酶
WO2018226972A2 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Vilmorin & Cie Compositions and methods for genome editing
KR20250028508A (ko) 2017-06-13 2025-02-28 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 큐론을 포함하는 조성물 및 그의 용도
EP3638776A1 (en) 2017-06-14 2020-04-22 Technische Universität Dresden Methods and means for genetic alteration of genomes utilizing designer dna recombining enzymes
WO2018232195A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
CN111344020A (zh) 2017-06-15 2020-06-26 加利福尼亚大学董事会 靶向非病毒dna插入
US11512287B2 (en) 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
SG11201912455VA (en) 2017-06-20 2020-01-30 Inst Curie Immune cells defective for suv39h1
KR102771727B1 (ko) 2017-06-21 2025-02-26 티모시 에이. 버트람 신장 질환의 치료를 위한 면역특권화 생체활성 신장 세포
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
ES2971549T3 (es) 2017-06-23 2024-06-05 Inscripta Inc Nucleasas guiadas por ácidos nucleicos
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
WO2019005884A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-ADENINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION
CN111511375A (zh) 2017-06-30 2020-08-07 因提玛生物科学公司 用于基因治疗的腺相关病毒载体
WO2019003193A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Novartis Ag METHODS FOR TREATING DISEASES USING GENE EDITING SYSTEMS
US20190002874A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Inscripta, Inc. Cell libraries created using rationally designed nucleic acids
CA3068465A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified t cells comprising a modified intron in the t cell receptor alpha gene
WO2019014328A2 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Compass Therapeutics Llc AGONISTIC ANTIBODIES THAT BIND HUMAN CD137 AND USES THEREOF
US20210130817A1 (en) 2017-07-14 2021-05-06 Cure Genetics Co., Ltd. Gene Editing System and Gene Editing Method
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
US20200149042A1 (en) * 2017-07-14 2020-05-14 William N. Haining Modulating biomarkers to increase tumor immunity and improve the efficacy of cancer immunotherapy
US12049643B2 (en) 2017-07-14 2024-07-30 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for modulating cytotoxic lymphocyte activity
US12105089B2 (en) 2017-07-17 2024-10-01 The Broad Institute, Inc. Cell atlas of the healthy and ulcerative colitis human colon
WO2019018551A2 (en) 2017-07-18 2019-01-24 Lee Tzumin METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENETICALLY GENETIC HANDLING OF GENES AND CELLS
US12239646B2 (en) 2017-07-19 2025-03-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cancer diagnostic and treatment
WO2019016310A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCERS
IL253642A0 (en) 2017-07-24 2017-09-28 Seger Rony Combined treatment for cancer
WO2019023291A2 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCTION AND DECODING OF GUIDE RNA LIBRARIES AND USES THEREOF
US11926664B2 (en) 2017-07-25 2024-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating monocytopoiesis
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
EP3585160A2 (en) 2017-07-31 2020-01-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr reporter non-human animals and uses thereof
JP7359753B2 (ja) 2017-07-31 2023-10-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃａｓトランスジェニックマウスの胚性幹細胞およびマウスならびにその使用
TW202428875A (zh) 2017-07-31 2024-07-16 香港商映像生物有限公司 用於靶向ｃｙｐ４ｖ２基因及治療結晶樣視網膜色素變性之核酸分子
CN110891419A (zh) 2017-07-31 2020-03-17 瑞泽恩制药公司 评价crispr/cas-诱导的与外源供体核酸的体内重组
CN111278848B (zh) 2017-08-04 2023-06-27 北京大学 特异性识别甲基化修饰dna碱基的tale rvd及其应用
WO2019028686A1 (zh) 2017-08-08 2019-02-14 北京大学 基因敲除方法
CN111263810A (zh) * 2017-08-22 2020-06-09 纳匹基因公司 使用多核苷酸指导的核酸内切酶的细胞器基因组修饰
US11692166B2 (en) 2017-08-23 2023-07-04 Technion Research & Development Foundation Limited Compositions and methods for improving alcohol tolerance in yeast
BR112020003596A2 (pt) 2017-08-23 2020-09-01 The General Hospital Corporation nucleases de crispr-cas9 engenheiradas com especificidade de pam alterada
WO2019040744A1 (en) 2017-08-24 2019-02-28 Board Of Regents Of University Of Nebraska METHODS AND COMPOSITIONS FOR IN SITU GERMINAL GENOMIC GENE ENGINEERING
WO2019038417A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences METHODS FOR INCREASING GRAIN YIELD
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
ES2947336T3 (es) 2017-09-01 2023-08-07 Univ Johns Hopkins Terapia epigenética dirigida para el aneurisma aórtico hereditario
CN107446859B (zh) * 2017-09-02 2020-12-18 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 一株鸡毒支原体及其应用
US11530396B2 (en) 2017-09-05 2022-12-20 The University Of Tokyo Modified CAS9 protein, and use thereof
JP2020533289A (ja) 2017-09-06 2020-11-19 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 養子細胞治療を改善するための方法
US20210023132A1 (en) 2017-09-06 2021-01-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Strep-tag specific chimeric receptors and uses thereof
US20200262879A1 (en) 2017-09-11 2020-08-20 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions to enhance the immunogenicity of tumors
WO2019055862A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGH AFFINITY T CELL RECEPTORS AND USES THEREOF
ES2983336T3 (es) 2017-09-18 2024-10-22 Futuragene Israel Ltd Control de la expresión de polipéptidos DELLA en tejidos específicos
JP7190096B2 (ja) 2017-09-18 2022-12-15 博雅▲緝▼因（北京）生物科技有限公司 遺伝子編集ｔ細胞及びその使用
EP3684821A4 (en) 2017-09-19 2021-06-16 The University Of British Columbia ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEREOF
WO2019057649A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA
AU2018338423A1 (en) 2017-09-20 2020-04-09 Sangamo Therapeutics France Novel anti-HLA-A2 antibodies and uses thereof
US20200268837A1 (en) 2017-09-20 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating autophagy
US11534471B2 (en) 2017-09-21 2022-12-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Isolation, preservation, compositions and uses of extracts from justicia plants
KR102338449B1 (ko) 2017-09-21 2021-12-10 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법, 및 조성물
KR101896847B1 (ko) 2017-09-22 2018-09-07 한국생명공학연구원 DNA 절단 활성이 불활성화된 Cpf1을 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물 및 그 용도
US11603536B2 (en) * 2017-09-29 2023-03-14 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient maize genome editing
CN111163633B (zh) 2017-09-29 2022-09-09 瑞泽恩制药公司 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法
US10435713B2 (en) 2017-09-30 2019-10-08 Inscripta, Inc. Flow through electroporation instrumentation
CA3076020A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
EP3695408A4 (en) 2017-10-02 2021-12-15 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND MODULATING A GENETIC SIGNATURE OF IMMUNOTHERAPY RESISTANCE IN CANCER
US20200239544A1 (en) 2017-10-03 2020-07-30 Precision Biosciences, Inc. Modified epidermal growth factor receptor peptides for use in genetically-modified cells
EP3692152A4 (en) 2017-10-04 2021-12-01 The Broad Institute, Inc. PROCESSES AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF CHROMATIN LOOPS AND / OR DOMAINS
CA3076740A1 (en) * 2017-10-06 2019-04-11 Oregon Health & Science University Compositions and methods for editing rna
US11725228B2 (en) 2017-10-11 2023-08-15 The General Hospital Corporation Methods for detecting site-specific and spurious genomic deamination induced by base editing technologies
US10709085B2 (en) 2017-10-13 2020-07-14 Bejo Zaden Bv Lettuce variety ‘80020-0911-007’
EP3697906A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11680296B2 (en) 2017-10-16 2023-06-20 Massachusetts Institute Of Technology Mycobacterium tuberculosis host-pathogen interaction
EP3697435A1 (en) 2017-10-20 2020-08-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
CN119265240A (zh) 2017-10-20 2025-01-07 弗莱德哈钦森癌症中心 用以产生被遗传修饰来表达所选抗体的b细胞的系统和方法
WO2019135816A2 (en) 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
WO2019081428A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF CMV RELATED DISEASES
US11701391B2 (en) 2017-10-24 2023-07-18 Dalia ELANI Methods of treating an ischemic disease
CN109722414A (zh) 2017-10-27 2019-05-07 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种高效制备成熟红细胞的方法以及用于制备成熟红细胞的培养基
MX2020004325A (es) 2017-10-27 2020-11-09 Univ California Reemplazo dirigido de receptores de células t endógenos.
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
JP2021503008A (ja) 2017-10-31 2021-02-04 マジェンタ セラピューティクス インコーポレイテッドＭａｇｅｎｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 造血幹細胞および前駆細胞移植療法のための組成物および方法
US11547614B2 (en) 2017-10-31 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for studying cell evolution
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
AU2018358241A1 (en) 2017-10-31 2020-05-07 Edigene Biotechnology, Inc. Compositions and methods for the expansion of hematopoietic stem and progenitor cells
US20210180053A1 (en) 2017-11-01 2021-06-17 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
EP3704238B1 (en) 2017-11-01 2024-01-03 Precision Biosciences, Inc. Engineered nucleases that target human and canine factor viii genes as a treatment for hemophilia a
CN111565730B (zh) 2017-11-09 2024-09-17 桑格摩生物治疗股份有限公司 细胞因子诱导型含sh2蛋白（cish）基因的遗传修饰
US12171783B2 (en) 2017-11-13 2024-12-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for targeting developmental and oncogenic programs in H3K27M gliomas
US12221720B2 (en) 2017-11-13 2025-02-11 The Broad Institute, Inc. Methods for determining spatial and temporal gene expression dynamics during adult neurogenesis in single cells
US12018080B2 (en) 2017-11-13 2024-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for treating cancer by targeting the CLEC2D-KLRB1 pathway
EP3710008A4 (en) 2017-11-14 2021-08-25 The Schepens Eye Research Institute, Inc. INHIBITION OF RUNX1 FOR THE TREATMENT OF PROLIFERATIVE VITREORETINOPATHY AND CONDITIONS ASSOCIATED WITH EPITHELIAL TO MESENCHYMATIC TRANSITION
IL255664A0 (en) 2017-11-14 2017-12-31 Shachar Idit Hematopoietic stem cells with enhanced properties
US20200353010A1 (en) * 2017-11-17 2020-11-12 Stc.Unm Therapy For Myotonic Dystrophy Type 1 Via Genome Editing of the DMPK Gene
EP4501408A2 (en) 2017-11-17 2025-02-05 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion from fine needle aspirates and small biopsies
WO2019100052A2 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
CA3083118A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
WO2019101956A1 (en) 2017-11-24 2019-05-31 Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale (Inserm) Methods and compositions for treating cancers
WO2019101995A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for cardiac regeneration
CA3083601A1 (en) 2017-11-28 2019-06-06 Mirimus, Inc. Methods of genetic mediated engineering of rnai models
US20220267403A1 (en) 2017-12-01 2022-08-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
GB201720351D0 (en) 2017-12-06 2018-01-17 Iontas Ltd Selecting for developability in drug discovery
EP3720494A2 (en) 2017-12-06 2020-10-14 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells
US11332736B2 (en) 2017-12-07 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
CA3082956A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Synthetic Genomics, Inc. Improving algal lipid productivity via genetic modification of a tpr domain containing protein
WO2019118463A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Danisco Us Inc Cas9 variants and methods of use
CN107868123B (zh) 2017-12-25 2020-05-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种同时提高植物产量和抗性的基因及其应用
WO2019133881A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Rubius Therapeutics, Inc. Gene editing and targeted transcriptional modulation for enginerering erythroid cells
AU2019205262A1 (en) 2018-01-03 2020-07-23 Magenta Therapeutics Inc. Compositions and methods for the expansion of hematopoietic stem and progenitor cells and treatment of inherited metabolic disorders
US11994512B2 (en) 2018-01-04 2024-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
WO2019134946A1 (en) 2018-01-04 2019-07-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma resistant
CN118834883A (zh) 2018-01-09 2024-10-25 希博斯美国有限公司 防碎基因和突变
WO2019140278A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting core binding factor antigens
US20200362366A1 (en) 2018-01-12 2020-11-19 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
AU2019209292B2 (en) 2018-01-17 2023-10-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Quinoxalinone compounds, compositions, methods, and kits for increasing genome editing efficiency
EA202091708A1 (ru) 2018-01-17 2020-11-10 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Ингибиторы днк-пк
KR20200109358A (ko) 2018-01-17 2020-09-22 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 Dna-pk 억제제
US12145984B2 (en) 2018-01-24 2024-11-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods for preventing ischemia reperfusion injury in an organ with antibody antagonists of IL-33
WO2019147743A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
US11802288B1 (en) * 2018-01-29 2023-10-31 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient soybean genome editing
IL257225A (en) 2018-01-29 2018-04-09 Yeda Res & Dev Treatment of sarcoma
US11220694B1 (en) 2018-01-29 2022-01-11 Inari Agriculture, Inc. Rice cells and rice plants
US11926835B1 (en) * 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
WO2019153067A1 (en) * 2018-02-06 2019-08-15 Valorbec, Société en commandite Microfluidic devices, systems, infrastructures, uses thereof and methods for genetic engineering using same
JP2021512617A (ja) 2018-02-08 2021-05-20 ザイマージェン インコーポレイテッド ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいてＣＲＩＳＰＲを使用するゲノム編集
US11873499B2 (en) 2018-02-14 2024-01-16 Institute Of Genetics And Developmental Biology Chinese Academy Of Sciences Methods of increasing nutrient use efficiency
CA3091311A1 (en) 2018-02-16 2019-08-22 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Use of antagonists of cxcr3b for treating vitiligo
KR20200124702A (ko) 2018-02-23 2020-11-03 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 신규한 cas9 오르소로그
WO2019165116A1 (en) 2018-02-26 2019-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2019178426A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP3765094A4 (en) 2018-03-15 2021-12-22 KSQ Therapeutics, Inc. GENE REGULATION COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING IMMUNOTHERAPY
EP3592140A1 (en) 2018-03-19 2020-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
CN112204131A (zh) 2018-03-29 2021-01-08 因思科瑞普特公司 用于诱导和转化的细胞生长速率的自动化控制
WO2019193375A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of fzd7 inhibitors for the treatment of retinal neovascularization
IT201800004253A1 (it) 2018-04-05 2019-10-05 Composizioni e metodi per il trattamento della tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica dominante ereditaria.
US20210155959A1 (en) 2018-04-06 2021-05-27 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
MX2020010795A (es) 2018-04-12 2021-01-08 Prec Biosciences Inc Nucleasas modificadas genéticamente optimizadas que tienen especificidad para el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos t humanos.
US10376889B1 (en) 2018-04-13 2019-08-13 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
EP3774907A1 (en) 2018-04-13 2021-02-17 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
WO2019204378A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 The General Hospital Corporation Sensitive in vitro assays for substrate preferences and sites of nucleic acid binding, modifying, and cleaving agents
US20210071240A1 (en) 2018-04-19 2021-03-11 Massachusetts Institute Of Technology Single-stranded break detection in double-stranded dna
MX2020010974A (es) 2018-04-19 2021-01-20 Univ California Composiciones y métodos para la edición de genes.
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
EP3560330B1 (en) 2018-04-24 2022-06-15 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plants with improved digestibility and marker haplotypes
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
CN108707621B (zh) 2018-04-26 2021-02-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法
WO2019210268A2 (en) 2018-04-27 2019-10-31 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
AU2019257749A1 (en) 2018-04-27 2020-10-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JP2021521838A (ja) * 2018-04-27 2021-08-30 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） ブルトン型チロシンキナーゼに対するｔａｌｅｎベースのおよびｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓベースのゲノム編集
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
CA3098127A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Genedit Inc. Cationic polymer and use for biomolecule delivery
CN110184301B (zh) * 2018-04-28 2023-02-24 辉大(上海)生物科技有限公司 通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合
WO2019213660A2 (en) 2018-05-04 2019-11-07 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
JP7055469B2 (ja) 2018-05-08 2022-04-18 国立大学法人大阪大学 ホモ接合型細胞の作製方法
EP4252759A3 (en) 2018-05-11 2023-11-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center T cell receptors targeting pik3ca mutations and uses thereof
CN112654710A (zh) 2018-05-16 2021-04-13 辛瑟高公司 用于指导rna设计和使用的方法和系统
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
EP3797160A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 The Broad Institute Inc. Base editors and uses thereof
GB201808424D0 (en) 2018-05-23 2018-07-11 Lucite Int Uk Ltd Methods for producing BMA and MMA using genetically modified microorganisms
CA3100386A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 National University Of Singapore Blockade of cd2 surface expression and expression of chimeric antigen receptors for immunotherapy of t-cell malignancies
EP3802779A1 (en) 2018-06-01 2021-04-14 Avectas Limited Cell engineering platform
WO2019232542A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
WO2019236943A2 (en) 2018-06-07 2019-12-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods for generating hematopoietic stem cells
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
SG11202011830SA (en) 2018-06-13 2020-12-30 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
US12036240B2 (en) 2018-06-14 2024-07-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
WO2019237386A1 (zh) * 2018-06-16 2019-12-19 深圳市博奥康生物科技有限公司 一种敲除人ct1.1基因的方法
JP2021528090A (ja) 2018-06-26 2021-10-21 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｃｒｉｓｐｒエフェクター系に基づく増幅法、システム、及び診断法
AU2019294690A1 (en) 2018-06-26 2020-12-03 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR/Cas and transposase based amplification compositions, systems and methods
WO2020005341A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anc80 encoding sphingolipid-metabolizing proteins
US11629179B2 (en) 2018-06-29 2023-04-18 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut—Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis TWEAK-receptor agonists for use in combination with immunotherapy of a cancer
WO2020005383A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
EP3818075A1 (en) 2018-07-04 2021-05-12 Ukko Inc. Methods of de-epitoping wheat proteins and use of same for the treatment of celiac disease
EP3820488A4 (en) 2018-07-09 2022-07-13 The Regents Of The University Of California TARGETS FOR T-CELL-BASED IMMUNOTHERAPY
BR112021000408A2 (pt) * 2018-07-10 2021-06-29 Alia Therapeutics S.R.L. vesículas para dispensação sem traço de moléculas de rna guia e/ou complexo(s) de nuclease guiada por rna/molécula de rna guia e método de produção das mesmas
CA3105658A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 The Regents Of The University Of California Retrotransposon-based delivery vehicle and methods of use thereof
WO2020018142A1 (en) * 2018-07-16 2020-01-23 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr dna targeting enzymes and systems
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
WO2020028555A2 (en) 2018-07-31 2020-02-06 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2020028686A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 New York University Targeting piezo1 for treatment of cancer and infectious diseases
US20210236633A1 (en) 2018-08-06 2021-08-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers
WO2020033601A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 The Broad Institute, Inc. Novel cas12b enzymes and systems
CA3109253A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Sangamo Therapeutics France New car constructs comprising tnfr2 domains
EP3607819A1 (en) 2018-08-10 2020-02-12 Vilmorin et Cie Resistance to xanthomonas campestris pv. campestris (xcc) in cauliflower
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
KR20210044795A (ko) 2018-08-15 2021-04-23 지머젠 인코포레이티드 고 처리량 대사 공학에서 CRISPRi의 응용
US20210355522A1 (en) 2018-08-20 2021-11-18 The Broad Institute, Inc. Inhibitors of rna-guided nuclease activity and uses thereof
WO2020041380A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
WO2020041387A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Degradation domain modifications for spatio-temporal control of rna-guided nucleases
JP2021534752A (ja) 2018-08-22 2021-12-16 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター Ｋｒａｓ抗原またはｈｅｒ２抗原を標的とする免疫療法
IL280951B2 (en) 2018-08-23 2024-08-01 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific base editors
JP2022520138A (ja) 2018-08-28 2022-03-29 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド 遺伝子操作された造血幹細胞およびそれらの使用
WO2020047099A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for adoptive t cell therapy incorporating induced notch signaling
EP3844263A4 (en) 2018-08-30 2022-05-25 Inscripta, Inc. ENHANCED DETECTION OF NUCLEASE-EDITED SEQUENCES IN AUTOMATED MODULES AND INSTRUMENTS
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
SG11202102208WA (en) 2018-09-04 2021-04-29 Magenta Therapeutics Inc Aryl hydrocarbon receptor antagonists and methods of use
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
US20210348177A1 (en) * 2018-09-05 2021-11-11 The Regents Of The University Of California Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture
US12253528B2 (en) 2018-09-05 2025-03-18 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating asthma and allergic diseases
WO2020051507A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery
WO2020051452A2 (en) * 2018-09-07 2020-03-12 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Hiv or hcv detection with crispr-cas13a
US20220047567A1 (en) 2018-09-10 2022-02-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of neurofibromatosis
WO2020056170A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
JP2022500052A (ja) 2018-09-18 2022-01-04 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド プログラム細胞死１（ｐｄ１）特異的ヌクレアーゼ
JP7344300B2 (ja) 2018-09-18 2023-09-13 ブイエヌブイ ニューコ インク． Ａｒｃベースのカプシドおよびその使用
WO2020061391A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inhibiting tumor cells using inhibitors of foxo3a antagonists
US12097239B2 (en) 2018-09-21 2024-09-24 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching MRNA coding for secreted proteins
WO2020068702A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric receptor proteins and uses thereof
EP3856772A1 (en) 2018-09-25 2021-08-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of antagonists of th17 cytokines for the treatment of bronchial remodeling in patients suffering from allergic asthma
GB201815672D0 (en) 2018-09-26 2018-11-07 Innes John Centre Methods for altering starch granule size profile
WO2020069524A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 Board Of Trustees Of Southern Illinois University Anti-crispr nucleic acid inhibitors of crispr-cas effector enzymes
EP3861120A4 (en) 2018-10-01 2023-08-16 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system
US12203123B2 (en) 2018-10-01 2025-01-21 North Carolina State University Recombinant type I CRISPR-Cas system and uses thereof for screening for variant cells
WO2020070062A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tim-3 inhibitors for the treatment of exacerbations in patients suffering from severe asthma
CN112867794B (zh) 2018-10-04 2025-02-18 株式会社钟化 用于植物的基因组编辑的dna构建物
US20210347898A1 (en) 2018-10-09 2021-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of alpha-v-integrin (cd51) inhibitors for the treatment of cardiac fibrosis
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
WO2020077236A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 The Broad Institute, Inc. Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
US11851663B2 (en) 2018-10-14 2023-12-26 Snipr Biome Aps Single-vector type I vectors
US20210379057A1 (en) 2018-10-16 2021-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Nutlin-3a for use in treating a mycobacterium tuberculosis infection
WO2020079162A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for inducing full ablation of hematopoiesis
CN114207130A (zh) * 2018-10-18 2022-03-18 英特利亚治疗股份有限公司 用于从白蛋白基因座进行转基因表达的组合物和方法
CN113260701A (zh) 2018-10-18 2021-08-13 英特利亚治疗股份有限公司 用于表达因子ix的组合物和方法
WO2020086475A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Inscripta, Inc. Engineered enzymes
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
EP3870628B1 (en) 2018-10-24 2024-04-03 Genedit Inc. Cationic polymer with alkyl side chains and use for biomolecule delivery
WO2020086742A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
IL262658A (en) 2018-10-28 2020-04-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Prevention of age related clonal hematopoiesis and diseases associated therewith
WO2020092704A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Zymergen Inc. Multiplexed deterministic assembly of dna libraries
US11970733B2 (en) * 2018-11-01 2024-04-30 Synthego Corporation Methods for analyzing nucleic acid sequences
WO2020092140A2 (en) 2018-11-02 2020-05-07 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions to induce or suppress immune responses through the use of membrane bound complement split products
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
EP3873525B1 (en) 2018-11-02 2024-12-25 Annexon, Inc. Compositions and methods for treating brain injury
KR20210091212A (ko) 2018-11-05 2021-07-21 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료
CA3118616A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
JP2022506508A (ja) 2018-11-05 2022-01-17 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ａｋｔ経路阻害剤を利用したｔｉｌの拡大培養
CN113272421B (zh) 2018-11-05 2025-02-18 艾欧凡斯生物治疗公司 用于产生肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在免疫疗法中的用途
KR102699023B1 (ko) 2018-11-08 2024-08-27 서트로 바이오파마, 인크. 산화성 세포질을 갖는 대장균 균주
CA3119188A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center T cell receptors specific for mesothelin and their use in immunotherapy
US12165743B2 (en) 2018-11-09 2024-12-10 The Broad Institute, Inc. Compressed sensing for screening and tissue imaging
TW202430572A (zh) 2018-11-13 2024-08-01 美商坎伯斯治療有限責任公司 對抗檢查點分子之多特異性結合構築體及其用途
EP3653708A1 (en) 2018-11-14 2020-05-20 Evonik Operations GmbH Isomaltulose production
US20220282275A1 (en) 2018-11-15 2022-09-08 The Broad Institute, Inc. G-to-t base editors and uses thereof
RU2712492C1 (ru) * 2018-11-26 2020-01-29 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания днк на основе cas9 белка из defluviimonas sp.
WO2020109316A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Asociación Centro De Investigación Cooperativa En Biociencias-Cic Biogune Methods for diagnosing and/or treating acute or chronic liver, kidney or lung disease
RU2712497C1 (ru) * 2018-11-26 2020-01-29 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания ДНК на основе Cas9 белка из биотехнологически значимой бактерии Clostridium cellulolyticum
CN113423823A (zh) 2018-12-12 2021-09-21 国立大学法人九州大学 经基因组编辑的细胞的制造方法
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
EP3893898B1 (en) 2018-12-13 2024-04-03 Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. Method of treating autoimmune and inflammatory diseases using b cells
CA3117228A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel crispr-cas systems for genome editing
US11384344B2 (en) 2018-12-17 2022-07-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR-associated transposase systems and methods of use thereof
US20220062394A1 (en) 2018-12-17 2022-03-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
CA3123392A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
EP3732291A1 (en) 2018-12-20 2020-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
WO2020128163A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Itä-Suomen Yliopisto Synthetic microrna mimics
US20220090047A1 (en) 2018-12-21 2022-03-24 Precision Biosciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
WO2020136216A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of identifying subjects having or at risk of having a coagulation related disorder
CA3125476A1 (en) 2019-01-03 2020-07-09 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cd8+ t cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
IL284535B2 (en) 2019-01-11 2025-03-01 Acuitas Therapeutics Inc Lipids for lipid nanoparticle delivery of active ingredients
CA3145881A1 (en) 2019-01-15 2020-07-23 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved resistance to sclerotinia sclerotiorum and genetic markers therefor
EP3911669A1 (en) 2019-01-16 2021-11-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Variants of erythroferrone and their use
CN113557036A (zh) 2019-01-18 2021-10-26 奥泽生物疗法公司 基因编辑以改善关节功能
US12188081B2 (en) 2019-01-24 2025-01-07 The Translational Genomics Research Institute Bioinformatics methods of in silico validation and selection of circRNAs
WO2020163396A1 (en) 2019-02-04 2020-08-13 The General Hospital Corporation Adenine dna base editor variants with reduced off-target rna editing
WO2020161083A1 (en) 2019-02-04 2020-08-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating blood-brain barrier
US20220098621A1 (en) * 2019-02-05 2022-03-31 Emendobio Inc. Crispr compositions and methods for promoting gene editing of ribosomal protein s19 (rps19) gene
US11857641B2 (en) 2019-02-06 2024-01-02 Sangamo Therapeutics, Inc. Method for the treatment of mucopolysaccharidosis type I
WO2020163856A1 (en) 2019-02-10 2020-08-13 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Modified mitochondrion and methods of use thereof
CN113439118A (zh) 2019-02-15 2021-09-24 济世易为生物有限公司 自动化生物制造系统、设备和方法
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
JP2022521513A (ja) 2019-02-20 2022-04-08 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター Ｒａｓネオ抗原に特異的な結合タンパク質およびその使用
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
CN113748202B (zh) 2019-03-01 2024-07-16 艾欧凡斯生物治疗公司 由液体肿瘤扩增肿瘤浸润淋巴细胞及其治疗用途
CA3128360A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Yuval CINNAMON Genome-edited birds
KR20210149060A (ko) 2019-03-07 2021-12-08 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 Tn7-유사 트랜스포존을 사용한 rna-유도된 dna 통합
AU2020231380A1 (en) 2019-03-07 2021-09-23 The Regents Of The University Of California CRISPR-Cas effector polypeptides and methods of use thereof
US20230026259A1 (en) 2019-03-08 2023-01-26 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
CA3129871A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Zymergen Inc. Iterative genome editing in microbes
US11053515B2 (en) 2019-03-08 2021-07-06 Zymergen Inc. Pooled genome editing in microbes
US20220160764A1 (en) 2019-03-11 2022-05-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center High avidity wt1 t cell receptors and uses thereof
US20220145333A1 (en) 2019-03-11 2022-05-12 Sorrento Therapeutics, Inc. Improved process for integration of dna constructs using rna-guided endonucleases
IL286357B2 (en) 2019-03-18 2024-10-01 Regeneron Pharma Crispr/cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
CA3127814C (en) 2019-03-18 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
WO2020191102A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
WO2020191248A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Method and compositions for editing nucleotide sequences
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
WO2020193740A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
WO2020201073A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of keloid, hypertrophic scars and/or hyperpigmentation disorders
WO2020206046A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for cell therapy
WO2020206036A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifier
WO2020201362A2 (en) 2019-04-02 2020-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
PH12021552499A1 (en) 2019-04-02 2022-09-19 Sangamo Therapeutics Inc Methods for the treatment of beta-thalassemia
AU2020256225B2 (en) 2019-04-03 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
EP3947682B1 (en) 2019-04-03 2023-10-11 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified immune cells comprising a microrna-adapted shrna (shrnamir)
AU2020253532B2 (en) 2019-04-04 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
CA3133359C (en) 2019-04-04 2023-04-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
EP3947656A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Danisco US Inc. Methods for polynucleotide integration into the genome of bacillus using dual circular recombinant dna constructs and compositions thereof
WO2020206231A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Precision Biosciences, Inc. Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells
EP3947662A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Danisco US Inc. Methods for integrating a donor dna sequence into the genome of bacillus using linear recombinant dna constructs and compositions thereof
WO2020208082A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for treating cmv related diseases
BR112021021095A2 (pt) 2019-04-23 2022-02-08 Genedit Inc Polímero catiônico com cadeias laterais alquila
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
EP3963109A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
CR20210591A (es) 2019-04-30 2022-03-11 Edigene Inc Método para la predicción de eficacia del tratamiento de hemoglobinopatía
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
UA128175C2 (uk) 2019-05-13 2024-04-24 Квс Саат Се Енд Ко. Кгаа Посухостійкість у кукурудзи
US20220220169A1 (en) 2019-05-15 2022-07-14 Insideoutbio, Inc. Modular Therapeutics for the Treatment of Inflammatory Diseases and Cancer
WO2020236645A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for homology directed repair
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
US20220235340A1 (en) 2019-05-20 2022-07-28 The Broad Institute, Inc. Novel crispr-cas systems and uses thereof
PH12021553009A1 (en) 2019-05-23 2022-11-07 Univ Nanjing Agricultural Methods for improving rice grain yield
WO2020239623A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of ngal inhibitors for the treating chronic wound
AR118995A1 (es) 2019-05-25 2021-11-17 Kws Saat Se & Co Kgaa Mejorador de la inducción de haploides
WO2020243370A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Genedit Inc. Polymer comprising multiple functionalized sidechains for biomolecule delivery
WO2020243661A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 The Broad Institute, Inc. Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5
WO2020245208A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of cd9 as a biomarker and as a biotarget in glomerulonephritis or glomerulosclerosis
CN113874510A (zh) 2019-06-04 2021-12-31 瑞泽恩制药公司 包括具有β滑移突变的人源化TTR基因座的非人动物和使用方法
US20220307021A1 (en) 2019-06-04 2022-09-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) A neuropilin antagonist in combination with a p38alpha-kinase inhibitor for the treatment of cancer
WO2020244759A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Klemm & Sohn Gmbh & Co. Kg New plants having a white foliage phenotype
EP3953477A4 (en) 2019-06-06 2022-06-22 Inscripta, Inc. HARDENING FOR RECURSIVE NUCLEIC ACID-DRIVEN CELL EDITING
BR112021022722A2 (pt) 2019-06-07 2022-01-04 Regeneron Pharma Animal não humano, célula de animal não humana, genoma de animal não humano, gene de albumina animal não humana humanizada, vetor de alvejamento, método de avaliação da atividade de um reagente, e, método de otimização da atividade de um reagente
RU2722933C1 (ru) * 2019-06-11 2020-06-05 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания днк на основе cas9 белка из бактерии demequina sediminicola
WO2020249769A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating ocular diseases related to mitochondrial dna maintenance
CA3137765A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
AU2020297499A1 (en) 2019-06-21 2022-02-03 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli
WO2020254850A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Vilmorin & Cie Improvement of quality and permanence of green color of peppers at maturity and over-maturity
JP7650829B2 (ja) 2019-06-24 2025-03-25 プロメガ コーポレイション 細胞中に生体分子を送達するための修飾ポリアミンポリマー
MX2021014861A (es) 2019-06-25 2022-06-22 Inari Agriculture Tech Inc Edicion genomica de reparacion dependiente de homologia mejorada.
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
WO2021001431A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of pi3ka-selective inhibitors for treating metastatic disease in patients suffering from pancreatic cancer
WO2021001427A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the prophylactic treatment of cancer in patients suffering from pancreatitis
US20220257796A1 (en) 2019-07-02 2022-08-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements
CA3145972A1 (en) 2019-07-04 2021-01-07 Ukko Inc. De-epitoped alpha gliadin and use of same for the management of celiac disease and gluten sensitivity
US10801042B1 (en) 2019-07-15 2020-10-13 Vigene Biosciences, Inc. Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
US10557149B1 (en) 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
IL268111A (en) 2019-07-16 2021-01-31 Fainzilber Michael Methods of treating pain
WO2021009299A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bcl-xl:fkbp12 fusion proteins suitable for screening agents capable of slowing down the aging process
US20220251572A1 (en) 2019-07-23 2022-08-11 Mnemo Therapeutics Immune cells defective for suv39h1
US20220249426A1 (en) 2019-07-24 2022-08-11 Inserm (Institut National De La Santé Et De La Recherch Médicale) Inhibitors of the sting pathway for the treatment of hidradenitis suppurativa
WO2021016608A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus
WO2021019272A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Vilmorin & Cie Tolerance to tolcndv in cucumber
US20220275105A1 (en) 2019-08-02 2022-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Neutralizing granzyme b for providing cardioprotection in a subject who experienced a myocardial infarction
EP3772542A1 (en) 2019-08-07 2021-02-10 KWS SAAT SE & Co. KGaA Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
CA3147717A1 (en) 2019-08-20 2021-02-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center T-cell immunotherapy specific for wt-1
WO2021035054A1 (en) 2019-08-20 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Lymphodepletion dosing regimens for cellular immunotherapies
WO2021035170A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2021041922A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
WO2021043278A1 (zh) 2019-09-04 2021-03-11 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 基于脱靶评估评价基因编辑治疗的方法
AR119898A1 (es) 2019-09-05 2022-01-19 Inst Genetics & Developmental Biology Cas Métodos para mejorar el tamaño y la calidad de las semillas
WO2021044012A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method of treatment and pronostic of acute myeloid leukemia
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
GB201913060D0 (en) 2019-09-10 2019-10-23 Innes John Centre Methods of increasing biotic stress resistance in plants
WO2021047775A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of tgfb/activinb signaling pathway for the treatment of patients suffering from medulloblastoma group 3
EP4028063A1 (en) 2019-09-13 2022-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
EP4031660A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 The Broad Institute, Inc. Novel type vi crispr enzymes and systems
AU2020355000A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein B (APOB) gene expression
CA3147643A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (hnf4.alpha.) gene expression
SG10202008262UA (en) 2019-09-26 2021-04-29 Seminis Vegetable Seeds Inc Lettuce plants having resistance to nasonovia ribisnigri biotype nr:1
WO2021063968A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and composition for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease
GB201914137D0 (en) 2019-10-01 2019-11-13 Univ Leeds Innovations Ltd Modified Plants
WO2021067788A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Artisan Development Labs, Inc. Crispr systems with engineered dual guide nucleic acids
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
EP4037714A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating macrophages polarization
CA3152623A1 (en) 2019-10-11 2021-04-15 Richard D. Cummings Anti-tn antibodies and uses thereof
WO2021072031A1 (en) 2019-10-11 2021-04-15 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions for the manufacture and use of circular dna encoded therapeutics for genetic disorders and other diseases
EP3808766A1 (en) 2019-10-15 2021-04-21 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
CN114846022A (zh) 2019-10-17 2022-08-02 科沃施种子欧洲股份两合公司 通过阻抑基因的下调增强作物的疾病抗性
WO2021078359A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of cubilin for the treatment of chronic kidney diseases
US20220411790A1 (en) * 2019-10-25 2022-12-29 The Johns Hopkins University A crispr-cas9 platform with an intrinsic off-switch and enhanced specificity
JP2022553389A (ja) 2019-10-25 2022-12-22 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の遺伝子編集及び免疫療法におけるその使用
WO2021083959A1 (en) 2019-10-29 2021-05-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating uveal melanoma
IL270306A (en) 2019-10-30 2021-05-31 Yeda Res & Dev Prevention and treatment of pre-myeloid and myeloid malignancies
WO2021087305A1 (en) 2019-10-30 2021-05-06 Precision Biosciences, Inc. Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy
EP4051298A1 (en) 2019-11-01 2022-09-07 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progentor cells
GB201916020D0 (en) 2019-11-04 2019-12-18 Univ Of Essex Enterprise Limited Crispr-mediated identification of biotinylated proteins and chromatin regions
KR20220097414A (ko) 2019-11-08 2022-07-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 X-연관 연소 망막층간분리 치료법을 위한 crispr 및 aav 전략
MX2022005817A (es) * 2019-11-13 2022-06-08 Crispr Therapeutics Ag Metodos de fabricacion de linfocitos t-car.
AU2020382219A1 (en) * 2019-11-13 2022-05-12 Crispr Therapeutics Ag Manufacturing process for making T cells expressing chimeric antigen receptors
EP4057802A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Vilmorin & Cie Resistance to acidovorax valerianellae in corn salad
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
KR20220104766A (ko) 2019-11-22 2022-07-26 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 약물 전달을 위한 이온성 액체
EP4061944A1 (en) 2019-11-22 2022-09-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Inhibitors of adrenomedullin for the treatment of acute myeloid leukemia by eradicating leukemic stem cells
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
JP2023503635A (ja) 2019-11-27 2023-01-31 クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフト Ｒｎａ分子を合成する方法
WO2021108324A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Technical University Of Denmark Constructs, compositions and methods thereof having improved genome editing efficiency and specificity
EP4065699A1 (en) 2019-11-27 2022-10-05 Promega Corporation Multipartite luciferase peptides and polypeptides
EP4065224A1 (en) 2019-11-27 2022-10-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of neuropilin antagonists for the treatment of endometriosis
WO2021113543A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy, using lymphodepletion regimens and cd19, cd20 or bcma allogeneic car t cells
CA3157131A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Inscripta, Inc. Novel mad nucleases
CA3161104A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Cecile Chartier-Courtaud Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same
WO2021118927A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions for targeted delivery of nucleic acid therapeutics
JPWO2021117874A1 (ja) 2019-12-13 2021-06-17
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CN114829607A (zh) 2019-12-18 2022-07-29 因思科瑞普特公司 用于体内检测核酸引导的核酸酶编辑的细胞的Cascade/dCas3互补测定
GB201918902D0 (en) 2019-12-19 2020-02-05 Genome Res Ltd Cell differentiation
IL271656A (en) 2019-12-22 2021-06-30 Yeda Res & Dev System and methods for identifying cells that have undergone genome editing
US11060141B1 (en) 2019-12-23 2021-07-13 Stilla Technologies Multiplex drop-off digital polymerase chain reaction methods
JP2023509058A (ja) 2019-12-30 2023-03-06 博雅▲緝▼因（北京）生物科技有限公司 Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルｃａｒ－ｔならびにその調製方法及び使用
WO2021136415A1 (zh) 2019-12-30 2021-07-08 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种纯化ucart细胞的方法与应用
US11859172B2 (en) 2020-01-02 2024-01-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Programmable and portable CRISPR-Cas transcriptional activation in bacteria
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
US20230272429A1 (en) 2020-01-13 2023-08-31 Sana Biotechnology, Inc. Modification of blood type antigens
US20230076415A1 (en) 2020-01-17 2023-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
US20230073514A1 (en) 2020-01-21 2023-03-09 Limagrain Europe Wheat haploid inducer plant and uses
MX2022008648A (es) 2020-01-23 2022-12-15 The Children´S Medical Center Corp Diferenciacion de celulas t sin estroma a partir de celulas madre pluripotentes humanas.
KR20220133257A (ko) 2020-01-27 2022-10-04 인스크립타 인코포레이티드 전기천공 모듈 및 기구
WO2021152587A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treating acute liver disease with tlr-mik inhibitors
AU2021216126A1 (en) 2020-02-07 2022-07-07 Institute Of Genetics And Developmental Biology Chinese Academy Of Sciences Methods of controlling grain size and weight
US20230357784A1 (en) 2020-02-21 2023-11-09 Limagrain Europe Prime editing technology for plant genome engineering
EP4110817A1 (en) 2020-02-26 2023-01-04 Sorrento Therapeutics, Inc. Activatable antigen binding proteins with universal masking moieties
EP3872190A1 (en) 2020-02-26 2021-09-01 Antibodies-Online GmbH A method of using cut&run or cut&tag to validate crispr-cas targeting
EP4114946A1 (en) 2020-03-04 2023-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for sensitization of tumor cells to immune therapy
CN116096886A (zh) 2020-03-11 2023-05-09 欧米茄治疗公司 用于调节叉头框p3(foxp3)基因表达的组合物和方法
WO2021186056A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Chimeric antigen receptor specific for human cd45rc and uses thereof
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
US20210290757A1 (en) 2020-03-23 2021-09-23 Avectas Limited Engineering of dendritic cells for generation of vaccines against sars-cov-2
JPWO2021193865A1 (ja) 2020-03-26 2021-09-30
US20230263121A1 (en) 2020-03-31 2023-08-24 Elo Life Systems Modulation of endogenous mogroside pathway genes in watermelon and other cucurbits
US12057197B2 (en) 2020-04-03 2024-08-06 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
WO2021206054A1 (ja) 2020-04-06 2021-10-14 株式会社Ｌｏｇｏｍｉｘ ゲノム改変方法及びゲノム改変キット
EP4132954A1 (en) 2020-04-08 2023-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of cdon inhibitors for the treatment of endothelial dysfunction
CN115427566A (zh) 2020-04-08 2022-12-02 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于改善的位点特异性修饰的组合物和方法
NL2025344B1 (en) 2020-04-14 2021-10-26 Academisch Ziekenhuis Leiden Methods for induction of endogenous tandem duplication events
EP4135511A1 (en) 2020-04-14 2023-02-22 Academisch Ziekenhuis Leiden (h.o.d.n. LUMC) Methods for induction of endogenous tandem duplication events
WO2021216622A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
US20230165909A1 (en) 2020-04-21 2023-06-01 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
EP4138805A1 (en) 2020-04-23 2023-03-01 Genedit Inc. Polymer with cationic and hydrophobic side chains
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
WO2021217083A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sorrento Therapeutics, Inc. Memory dimeric antigen receptors
AU2021263754A1 (en) 2020-04-27 2022-12-01 Ensoma, Inc. Methods and compositions for transducing hematopoietic stem and progenitor cells in vivo
US20210340586A1 (en) 2020-04-30 2021-11-04 Sutro Biopharma, Inc. Methods of Producing Full-Length Antibodies Using E. coli
GB202006463D0 (en) 2020-05-01 2020-06-17 Innes John Centre Metabolic engineering of plants enriched in L-DOPA
TW202208617A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途
WO2021224633A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
WO2021224401A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for determining a reference range of β-galactose exposure platelet
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2021231259A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
GB202007943D0 (en) 2020-05-27 2020-07-08 Snipr Biome Aps Products & methods
CN116782762B (zh) 2020-05-29 2024-11-19 科沃施种子欧洲股份两合公司 植物单倍体诱导
WO2021245435A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Vilmorin & Cie Melon plants resistant to scab disease, aphids and powdery mildew
EP4162039A4 (en) * 2020-06-04 2024-12-11 Emendobio Inc. NEW OMNI-59,61,67,76,79,80,81 AND 82 CRISPR NUCLEASES
JP2023530234A (ja) 2020-06-05 2023-07-14 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新生物を治療するための組成物および方法
WO2021245224A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for treating ocular diseases
AU2021285274A1 (en) 2020-06-05 2023-02-02 Vilmorin & Cie Resistance in plants of solanum lycopersicum to the TOBRFV
WO2021252375A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 The Broad Institute, Inc. Single cell combinatorial indexing from amplified nucleic acids
KR20230024967A (ko) 2020-06-11 2023-02-21 노파르티스 아게 Zbtb32 억제제 및 이의 용도
EP4168006A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) New strategy for treating pancreatic cancer
WO2022008597A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
AU2021308681A1 (en) 2020-07-16 2023-03-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
US20230303974A1 (en) 2020-07-30 2023-09-28 Institut Curie Immune Cells Defective for SOCS1
US20230323299A1 (en) 2020-08-03 2023-10-12 Inserm (Institut National De La Santé Et De La Recherch Médicale) Population of treg cells functionally committed to exert a regulatory activity and their use for adoptive therapy
WO2022035793A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Precision Biosciences, Inc. Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof
US20240011030A1 (en) 2020-08-10 2024-01-11 Novartis Ag Treatments for retinal degenerative diseases
WO2022034374A2 (en) 2020-08-11 2022-02-17 University Of Oslo Improved gene editing
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
RS65802B1 (sr) 2020-08-20 2024-08-30 A2 Biotherapeutics Inc Kompozicije i postupci za lečenje egfr pozitivnih kancera
MX2023002017A (es) 2020-08-20 2023-04-28 A2 Biotherapeutics Inc Composiciones y métodos para tratar cánceres positivos para ceacam.
AU2021329371A1 (en) 2020-08-20 2023-04-20 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
EP4501951A2 (en) 2020-08-25 2025-02-05 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
TW202227624A (zh) 2020-09-11 2022-07-16 美商生命編輯治療學公司 Ｄｎａ修飾酶及活性片段，及其變異體與使用方法
WO2022060749A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Inscripta, Inc. Crispr editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
EP4214311A2 (en) 2020-09-18 2023-07-26 Artisan Development Labs, Inc. Constructs and uses thereof for efficient and specific genome editing
CN116724053A (zh) 2020-09-24 2023-09-08 弗雷德哈钦森癌症中心 靶向sox2抗原的免疫治疗
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
JP2023545403A (ja) 2020-10-02 2023-10-30 リマグレン、ヨーロッパ Ｃｒｉｓｐｒを介した指令コドン書換え
MX2023003724A (es) 2020-10-02 2023-06-28 Vilmorin & Cie Melón con vida útil prolongada.
JP2023544387A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 虚血後の心臓リモデリングにおけるバイオマーカー及びバイオターゲットとしてのｇｄｆ３
EP4225902A1 (en) 2020-10-05 2023-08-16 Protalix Ltd. Dicer-like knock-out plant cells
TW202222841A (zh) 2020-10-06 2022-06-16 福瑞德哈金森腫瘤研究中心 用於治療表現mage-a1之疾病的組成物及方法
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
EP4225330A1 (en) 2020-10-06 2023-08-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US20230365995A1 (en) 2020-10-07 2023-11-16 Precision Biosciences, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP4228637A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 Yeda Research and Development Co. Ltd Method of treating myeloid malignancies
KR20230088833A (ko) 2020-10-23 2023-06-20 루트패스 제노믹스, 인크. T-세포 수용체 식별을 위한 조성물 및 방법
WO2022084531A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating glioma
EP4232461A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 ELO Life Systems, Inc. Methods for producing vanilla plants with improved flavor and agronomic production
RU2762831C1 (ru) * 2020-10-26 2021-12-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИСБ) Молекула рнк-проводника для геномного редактирования протомоторной области гена vrn-a1 однодольных зерновых с применением системы crispr/cas9
US11332744B1 (en) 2020-10-26 2022-05-17 Arsenal Biosciences, Inc. Safe harbor loci
RU2749307C1 (ru) * 2020-10-30 2021-06-08 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИСБ) Новая компактная нуклеаза CAS9 II типа из Anoxybacillus flavithermus
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
AU2021378316A1 (en) 2020-11-13 2023-06-01 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
EP4001429A1 (en) 2020-11-16 2022-05-25 Antibodies-Online GmbH Analysis of crispr-cas binding and cleavage sites followed by high-throughput sequencing (abc-seq)
EP4244391A1 (en) 2020-11-16 2023-09-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
IL302707A (en) 2020-11-26 2023-07-01 Ukko Inc Modified high molecular weight glutenin subunit and uses thereof
EP4256052A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
US20240049668A1 (en) 2020-12-03 2024-02-15 Vilmorin & Cie Tomato plants resistant to tobrfv, tmv, tomv and tommv and corresponding resistance genes
EP4259651A2 (en) 2020-12-14 2023-10-18 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
IL279559A (en) 2020-12-17 2022-07-01 Yeda Res & Dev Controlling ubiquitination of mlkl for treatment of disease
EP4262811A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
EP4262827A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
EP4263832A2 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Yeda Research and Development Co. Ltd Compositions for use in the treatment of chd2 haploinsufficiency and methods of identifying same
EP4263837A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Rothamsted Research Limited Increasing the accumulation of epa and dha in recombinant camelina
CN116709908A (zh) 2020-12-23 2023-09-05 中国科学院遗传与发育生物学研究所 控制谷粒大小的方法
JP2024501287A (ja) 2020-12-23 2024-01-11 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド ＲＮＡを閉じ込めたアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）キャプシドのインビトロアセンブリ
JPWO2022137760A1 (ja) 2020-12-25 2022-06-30
AU2021415461A1 (en) 2021-01-04 2023-08-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US20240376451A1 (en) 2021-01-07 2024-11-14 Inscripta, Inc. Mad nucleases
WO2022165111A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Precision Biosciences, Inc. Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells
US20240307437A1 (en) 2021-01-29 2024-09-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
CN117043194A (zh) 2021-01-29 2023-11-10 默沙东有限责任公司 程序性死亡受体1（pd-1）抗体的组合物以及获得所述组合物的方法
WO2022162646A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Avectas Limited Delivery platform
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
JP2024507129A (ja) 2021-02-16 2024-02-16 エー２ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド Ｈｅｒ２陽性がんを治療するための組成物及び方法
WO2022187278A1 (en) * 2021-03-01 2022-09-09 The Johns Hopkins University Nucleic acid detection and analysis systems
JP6944226B1 (ja) 2021-03-03 2021-10-06 株式会社Ｌｏｇｏｍｉｘ ゲノムｄｎａを改変する方法および改変を検出する方法
CA3212642A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In vivo dna assembly and analysis
WO2022197776A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for hematopoietic stem cell mobilization for stem cell transplants in multiple myeloma patients
US20240165094A1 (en) 2021-03-17 2024-05-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating melanoma
JP2024510505A (ja) 2021-03-19 2024-03-07 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｄ３９／ｃｄ６９選択に関連した腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）拡張及びｔｉｌにおける遺伝子ノックアウトのための方法
CA3173950A1 (en) 2021-03-22 2022-09-22 Tyson D. BOWEN Dna modifyng enzymes and active fragments and variants thereof and methods of use
IL307298A (en) 2021-03-31 2023-11-01 Entrada Therapeutics Inc Cell-penetrating circular peptides
WO2022208489A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Vilmorin & Cie Semi-determinate or determinate growth habit trait in cucurbita
JP2024513087A (ja) 2021-04-07 2024-03-21 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 部位特異的改変のための組成物及び方法
US20240382592A1 (en) 2021-04-09 2024-11-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of anaplastic large cell lymphoma
CN117580942A (zh) 2021-04-16 2024-02-20 比姆医疗股份有限公司 肝细胞的基因修饰
IL307800A (en) 2021-04-19 2023-12-01 Iovance Biotherapeutics Inc Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors and their use in cellular immunotherapy
WO2022225978A1 (en) 2021-04-21 2022-10-27 The Regents Of The University Of California Use of a split dcas fusion protein system for epigenetic editing
US20240141311A1 (en) 2021-04-22 2024-05-02 North Carolina State University Compositions and methods for generating male sterile plants
WO2022223791A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
CA3217862A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Radius Pharmaceuticals, Inc. Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor
US20220356264A1 (en) * 2021-05-06 2022-11-10 New York University Inhibition of atf7ip and setdb1 for cancer treatment
WO2022240721A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating interferon regulatory factor-5 (irf-5) activity
JP2024517903A (ja) 2021-05-10 2024-04-23 イッサム リサーチ ディベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブライ ユニバーシティー オブ エルサレム リミテッド 神経学的状態を治療するための薬学的組成物
CA3218805A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Ziqing QIAN Compositions and methods for intracellular therapeutics
WO2022240760A2 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Entrada Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING mRNA SPLICING
US20220372486A1 (en) * 2021-05-11 2022-11-24 Yekaterina Galat Methods of cancer treatment by inhibition of vasculogenesis and gli1
US20240352456A1 (en) 2021-05-13 2024-10-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Compositions and methods for treating sickle cell diseases
US20240269180A1 (en) 2021-05-17 2024-08-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
US20240285781A1 (en) 2021-06-11 2024-08-29 GenEdit, Inc. Biodegradable polymer comprising side chains with polyamine and polyalkylene oxide groups
CA3230677A1 (en) 2021-06-13 2022-12-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Method for reprogramming human cells
WO2022266287A1 (en) * 2021-06-16 2022-12-22 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods to transfect, test, and treat skin cells
WO2022266538A2 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
IL309001A (en) 2021-06-23 2024-02-01 Entrada Therapeutics Inc Antisense compounds and methods for targeting cug repeats
FR3124522B1 (fr) 2021-06-25 2025-02-28 Cherbonneau Francois Composition et méthode permettant l’édition génomique
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
WO2023287707A1 (en) 2021-07-15 2023-01-19 Just-Evotec Biologics, Inc. Bidirectional tangential flow filtration (tff) perfusion system
WO2023288281A2 (en) 2021-07-15 2023-01-19 Fred Hutchinson Cancer Center Chimeric polypeptides
EP4373270A2 (en) 2021-07-22 2024-05-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
EP4377446A1 (en) 2021-07-28 2024-06-05 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
EP4376596A1 (en) 2021-07-30 2024-06-05 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plants with improved digestibility and marker haplotypes
AU2022318664A1 (en) 2021-07-30 2024-02-29 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
EP4377459A2 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
US20250066447A1 (en) 2021-08-03 2025-02-27 Genicity Limited Engineered tcr complex and methods of using game
EP4130028A1 (en) 2021-08-03 2023-02-08 Rhazes Therapeutics Ltd Engineered tcr complex and methods of using same
WO2023012342A1 (en) 2021-08-06 2023-02-09 Kws Vegetables B.V. Durable downy mildew resistance in spinach
IL310564A (en) 2021-08-06 2024-03-01 Vilmorin & Cie Resistance to Leveillula Taurica in pepper plant
WO2023031885A1 (en) 2021-09-02 2023-03-09 SESVanderHave NV Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
JP7125727B1 (ja) 2021-09-07 2022-08-25 国立大学法人千葉大学 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
GB202113075D0 (en) 2021-09-14 2021-10-27 Innes John Centre Methods of improving vitamin d levels in plants
CN118284701A (zh) 2021-09-27 2024-07-02 孟山都技术公司 用于转化从单子叶植物种子切除的胚外植体的组合物和方法
GB202113933D0 (en) 2021-09-29 2021-11-10 Genome Res Ltd Methods for gene editing
JP2024536135A (ja) 2021-09-30 2024-10-04 アストラゼネカ・アクチエボラーグ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ挿入の効率を増大させるための阻害剤の使用
US20250102522A1 (en) 2021-10-07 2025-03-27 Hepatx Corporation Methods of tracking donor cells in a recipient
KR20240082406A (ko) 2021-10-08 2024-06-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 약물 전달을 위한 이온성 액체
WO2023064872A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Precision Biosciences, Inc. Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors
JP2024537991A (ja) 2021-10-14 2024-10-18 アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 共発現されるｓｈＲＮＡと論理ゲートシステムとを有する免疫細胞
CA3234612A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Weedout Ltd. Methods of weed control
WO2023070003A1 (en) 2021-10-19 2023-04-27 Precision Biosciences, Inc. Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
CA3235824A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Frederick G. Vogt Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
WO2023077053A2 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
MX2024005318A (es) 2021-11-01 2024-09-23 Tome Biosciences Inc Plataforma de construccion unica para el suministro simultaneo de maquinaria de edicion de genes y carga de acido nucleico.
WO2023078900A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating triple negative breast cancer (tnbc)
EP4426832A1 (en) 2021-11-03 2024-09-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established under The Will of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
EP4430167A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023086847A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Encodia, Inc. Methods for barcoding macromolecules in individual cells
WO2023091910A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
EP4437092A1 (en) 2021-11-26 2024-10-02 Epigenic Therapeutics Inc. Method of modulating pcsk9 and uses thereof
IL312971A (en) 2021-12-08 2024-07-01 Regeneron Pharma Mutant myocilin disease model and uses thereof
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
KR20240123832A (ko) 2021-12-16 2024-08-14 아퀴타스 테라퓨틱스 인크. 지질 나노입자 제형에 사용하기 위한 지질
WO2023111173A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) An ezh2 degrader or inhibitor for use in the treatment of resistant acute myeloid leukemia
BE1030047B1 (nl) 2021-12-17 2023-07-17 Anheuser Busch Inbev Sa Werkwijzen voor het voorkomen van remming van de smaakproductie in gist
EP4448549A2 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
CN114107253B (zh) * 2021-12-17 2024-03-15 复旦大学附属华山医院 一种利用工程细胞进行基因编辑的系统及方法
WO2023122805A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vestaron Corporation Sorbitol driven selection pressure method
EP4452257A1 (en) 2021-12-21 2024-10-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP4452335A1 (en) 2021-12-22 2024-10-30 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
AU2022417615A1 (en) 2021-12-23 2024-06-27 University Of Massachusetts Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder
WO2023126458A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Mnemo Therapeutics Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4463548A1 (en) 2022-01-14 2024-11-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
EP4463549A2 (en) 2022-01-14 2024-11-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023144235A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for monitoring and treating warburg effect in patients with pi3k-related disorders
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
EP4472646A1 (en) 2022-02-01 2024-12-11 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
KR20240135629A (ko) 2022-02-02 2024-09-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 폼페병의 치료를 위한 항-TfR:GAA 및 항-CD63:GAA 삽입
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
AR128474A1 (es) 2022-02-08 2024-05-15 Univ Glasgow Canales ionicos modificados
IL314747A (en) 2022-02-15 2024-10-01 Futuragene Israel Ltd A bacillus thuringiensis pesticidal protein (bt pp) combination useful for plant protection
WO2023158732A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for decreasing pathologic alpha-synuclein using agents that modulate fndc5 or biologically active fragments thereof
EP4479143A1 (en) 2022-02-18 2024-12-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
WO2023167882A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Artisan Development Labs, Inc. Composition and methods for transgene insertion
CN119677842A (zh) 2022-03-17 2025-03-21 科士华(南京)生物技术有限公司 人工合成肿瘤浸润淋巴细胞
CN119072544A (zh) 2022-04-01 2024-12-03 株式会社标志融合 适合于基因工程、细胞工程和细胞药物的细胞及其制造方法
EP4504220A1 (en) 2022-04-06 2025-02-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
EP4256950A1 (en) 2022-04-06 2023-10-11 Vilmorin et Cie Tolerance to cgmmv in cucumber
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
CN119487200A (zh) 2022-04-29 2025-02-18 瑞泽恩制药公司 用于基因治疗方法的组织特异性基因外安全港的鉴定
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023215498A2 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Modernatx, Inc. Compositions and methods for cd28 antagonism
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023219933A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acid therapeutics
WO2023220043A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified genome for gene therapy
WO2023220040A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified capsid for gene therapy
EP4522201A1 (en) 2022-05-09 2025-03-19 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus compositions and methods for gene therapy
EP4522202A1 (en) 2022-05-10 2025-03-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2023225410A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Artisan Development Labs, Inc. Systems and methods for assessing risk of genome editing events
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
EP4279085A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 Mnemo Therapeutics Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
WO2023230566A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating cytokines
AU2023276715A1 (en) 2022-05-25 2025-01-09 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating circulating factors
CN119563038A (zh) 2022-05-25 2025-03-04 旗舰创业创新七公司 用于调节免疫应答的组合物和方法
KR20250019772A (ko) 2022-05-25 2025-02-11 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 종양 억제인자 및 발암유전자를 조절하기 위한 조성물 및 방법
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
CN119421951A (zh) 2022-05-31 2025-02-11 瑞泽恩制药公司 用于c9orf72重复序列扩增疾病的crispr干扰疗法
KR20250022800A (ko) 2022-06-10 2025-02-17 우모자 바이오파마 인코포레이티드 조작된 줄기 세포 및 그의 용도
US20230404003A1 (en) 2022-06-21 2023-12-21 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus
IL317874A (en) 2022-06-24 2025-02-01 Tune Therapeutics Inc Compounds, systems and methods for reducing low density lipoproteins through targeted gene suppression
GB202209518D0 (en) 2022-06-29 2022-08-10 Snipr Biome Aps Treating & preventing E coli infections
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
JP7152094B1 (ja) 2022-06-30 2022-10-12 リージョナルフィッシュ株式会社 ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法
WO2024008752A1 (en) 2022-07-05 2024-01-11 John Innes Centre Methods to increase iron content in plants
WO2024008799A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of proliferative glomerulonephritis
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
AU2023311964A1 (en) 2022-07-18 2025-01-30 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024026406A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Vestaron Corporation Next Generation ACTX Peptides
LU502613B1 (en) 2022-08-01 2024-02-01 Plant Bioscience Ltd Methods of altering the starch granule profile in plants
WO2024028433A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of lymphoproliferative disorders
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
US12221608B2 (en) 2022-08-19 2025-02-11 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for regulation of hepatitis b virus through targeted gene repression
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024042489A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Chemical modification of guide rnas with locked nucleic acid for rna guided nuclease-mediated gene editing
WO2024042199A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of paired genes in hybrid breeding
WO2024047110A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024050544A2 (en) 2022-09-01 2024-03-07 J.R. Simplot Company Enhanced targeted knock-in frequency in host genomes through crispr exonuclease processing
WO2024047605A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 SESVanderHave NV Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
WO2024052318A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel dual split car-t cells for the treatment of cd38-positive hematological malignancies
WO2024228717A2 (en) 2022-09-07 2024-11-07 Quantitative Biosciences, Inc. Fentanyl-specific single variable-domain antibodies and use in a continuous agglutination assay
WO2024056659A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method for treating prostate cancer and other epithelial cancers
WO2024059618A2 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
AU2023342285A1 (en) 2022-09-16 2025-03-27 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations
WO2024056902A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Christopher Shaw Compositions and methods for treating neurological diseases
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
GB202214410D0 (en) 2022-09-30 2022-11-16 Ivy Farm Tech Limited genetically modified cells
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024084034A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of osteoarthritis
WO2024097639A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Modernatx, Inc. Hsa-binding antibodies and binding proteins and uses thereof
US20240182561A1 (en) 2022-11-04 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
TW202434726A (zh) 2022-11-04 2024-09-01 美商生命編輯治療學公司 具內部插入位進化腺嘌呤去胺及rna引導之核酸酶融合蛋白及其使用方法
WO2024098027A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
US20240173426A1 (en) 2022-11-14 2024-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024107670A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers
WO2024105633A1 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Kyoto Prefectural Public University Corporation Compositions for mitophagy induction and uses thereof
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
US12152238B2 (en) * 2022-11-30 2024-11-26 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Gene editing system for editing the arylsulfatase A (ARSA) gene
WO2024118882A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Genencor International Bv Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a selection marker swapping system
WO2024118866A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Modernatx, Inc. Gpc3-specific antibodies, binding domains, and related proteins and uses thereof
WO2024118876A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Genencor International Bv Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a recombinant self-excisable selection marker system
WO2024118881A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Genencor International Bv Iterative muliplex genome engineering in microbial cells using a bidirectional selection marker system
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
WO2024126696A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 King's College London Compositions and methods for treating neurological diseases
WO2024127370A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Guide rnas that target trac gene and methods of use
WO2024127369A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Guide rnas that target foxp3 gene and methods of use
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
WO2024133723A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for decreasing therapeutic acquired resistance to chemotherapy and/or radiotherapy
WO2024141599A1 (en) 2022-12-29 2024-07-04 Vilmorin & Cie Tomato plants resistant to resistance-breaking tswv strains and corresponding resistance genes
GB202219829D0 (en) 2022-12-29 2023-02-15 Ivy Farm Tech Limited Genetically manipulated cells
WO2024148206A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Bristol-Myers Squibb Company Methods and systems for engineering cells and for target validation
WO2024151633A2 (en) * 2023-01-10 2024-07-18 Robigo, Inc. Plant microbes and uses thereof
WO2024151213A2 (en) 2023-01-12 2024-07-18 National University Of Singapore Blockade of cd8 expression and chimeric antigen receptors for immunotherapy of t-cell and nk-cell malignancies
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
WO2024161358A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Dlf Seeds A/S Beet yellows virus resistance
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024161022A2 (en) 2023-02-03 2024-08-08 King's College London Compositions and methods for treating neurological diseases
WO2024168265A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Possible Medicines Llc Aav delivery of rna guided recombination system
WO2024168253A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Possible Medicines Llc Delivery of an rna guided recombination system
WO2024180095A1 (en) 2023-02-27 2024-09-06 John Innes Centre Methods of enhancing production of metabolites in bacteria
TW202442689A (zh) 2023-03-03 2024-11-01 美商亞森諾生物科學公司 靶向ｐｓｍａ及ｃａ９之系統
WO2024189098A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Iomx Therapeutics Ag Platform technology for the identification of modulators of immune effector cell function
WO2024192100A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Arsenal Biosciences, Inc. Synthetic pathway activators
US12225874B2 (en) 2023-03-27 2025-02-18 Redsea Science And Technology Inc. Tomato plant designated ‘X22-31’
WO2024201368A1 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Astrazeneca Ab Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2024206911A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Children's Hospital Medical Center Clinical-grade organoids
WO2024211306A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Sutro Biopharma, Inc. Rf1 ko e. coli strains
WO2024211287A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Seagen Inc. Production cell lines with targeted integration sites
WO2024208896A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Plant Bioscience Limited Methods for altering starch granule size profile
TW202444388A (zh) * 2023-04-07 2024-11-16 美商建南德克公司 經修飾的引導ｒｎａ
WO2024216118A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Precision Biosciences, Inc. Muscle-specific expression cassettes
WO2024216116A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Precision Biosciences, Inc. Muscle-specific expression cassettes
WO2024215744A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for peronospora resistance in spinach
WO2024220574A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
WO2024220560A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
TW202449159A (zh) 2023-04-19 2024-12-16 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於產生文庫之組合物及方法
WO2024218295A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Vib Vzw Allelic combinations in crops for yield increase
WO2024226499A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modifying fertility
WO2024226827A2 (en) 2023-04-25 2024-10-31 Arsenal Biosciences, Inc. Novel receptors for transcription regulation
WO2024223900A1 (en) 2023-04-28 2024-10-31 Vilmorin & Cie Genetic determinants conferring improved tobrfv resistance
WO2024234006A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Tome Biosciences, Inc. Systems, compositions, and methods for targeting liver sinusodial endothelial cells (lsecs)
WO2024236336A1 (en) 2023-05-17 2024-11-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lipc variant in the treatment of hypercholesterolemia and atherosclerotic cardiovascular disease
WO2024238977A2 (en) 2023-05-18 2024-11-21 Children's Hospital Medical Center Liver organoids with intrahepatic sympathetic nerves, and methods of use thereof
WO2024236547A1 (en) 2023-05-18 2024-11-21 Inceptor Bio, Llc Modified phagocytic cells expressing chimeric antigen receptors comprising a herpes virus entry mediator (hvem) co-stimulatory domain and uses thereof
WO2024243438A2 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
WO2024243340A1 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Tandem fusogens and related lipid particles
WO2024245951A1 (en) 2023-05-26 2024-12-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Combination of slc8a1 inhibitor and mitochondria-targeted antioxidant for treating melanoma
WO2024246162A1 (en) 2023-05-30 2024-12-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method and pharmaceutical composition for use in the treatment of focal cortical dysplasia
WO2024259376A2 (en) 2023-06-14 2024-12-19 Arsenal Biosciences, Inc. Non-viral cell engineering
WO2024256635A1 (en) 2023-06-15 2024-12-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dpm1 inhibitor for treating cancer
WO2024261302A1 (en) 2023-06-22 2024-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Nlrp3 inhibitors, pak1/2 inhibitors and/or caspase 1 inhibitors for use in the treatment of rac2 monogenic disorders
WO2024263961A2 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Children's Hospital Medical Center Methods of matrix-free suspension culture
WO2025006419A1 (en) 2023-06-26 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Engineered plasmodia and related methods
WO2025003305A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Vilmorin & Cie Pepper resistance to meloidogyne enterolobii
WO2025006963A1 (en) 2023-06-30 2025-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for increasing homology-directed repair
WO2025017156A1 (en) 2023-07-18 2025-01-23 University Of Glasgow Ion channels with improved properties
WO2025021702A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 Alia Therapeutics S.R.L. Cas9 orthologue nuclease and uses thereof
WO2025021893A1 (en) 2023-07-24 2025-01-30 Vilmorin & Cie Resistance to cysdv in melons
US20250092426A1 (en) 2023-07-25 2025-03-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas endonucleases and related methods
WO2025021839A1 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to treat metabolic disorders
WO2025029657A2 (en) 2023-07-28 2025-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertion for treatment of pompe disease
WO2025029654A2 (en) 2023-07-28 2025-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bgh-sv40l tandem polya to enhance transgene expression during unidirectional gene insertion
WO2025029662A1 (en) 2023-07-28 2025-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr: acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency
WO2025029840A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for multiplexed activation and repression of t cell gene expression
WO2025029835A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating il-2 gene expression
US20250043304A1 (en) 2023-08-03 2025-02-06 J.R. Simplot Company Fusarium wilt resistance genes
WO2025032112A1 (en) 2023-08-08 2025-02-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of type 2-mediated diseases
WO2025038494A1 (en) 2023-08-11 2025-02-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for lymphoid cell differentiation using targeted gene activation
WO2025049524A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cxcr4 antibody-resistant modified receptors
WO2025046513A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Inceptor Bio, Llc Methods of manufacturing myeloid-derived cells from hematopoietic stem cells and compositions and uses thereof
WO2025049959A2 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome
WO2025050069A1 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion using engineered integration enzymes
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
WO2025052001A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Mnemo Therapeutics Methods and compositions for improving immune response
EP4520334A1 (en) 2023-09-07 2025-03-12 Mnemo Therapeutics Methods and compositions for improving immune response
WO2025054540A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of gene-editing using programmable nucleases
WO2025059073A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Tune Therapeutics, Inc. Epigenetic editing methods and systems for differentiating stem cells
WO2025059533A1 (en) 2023-09-13 2025-03-20 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
DE122007000007I2 (de) 1986-04-09 2010-12-30 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7868149B2 (en) 1999-07-20 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Plant genome sequence and uses thereof
US6479808B1 (en) 1999-07-07 2002-11-12 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Method and systems for collecting data from multiple fields of view
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
JP3454818B1 (ja) * 2001-03-16 2003-10-06 直哉 小林 肝臓細胞の増殖方法、該方法により得られる肝臓細胞、およびその用途
US20090100536A1 (en) 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
JP2009502170A (ja) * 2005-07-26 2009-01-29 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 外来核酸配列の標的化された組込み及び発現
US20110002889A1 (en) * 2007-03-02 2011-01-06 Rodolphe Barrangou Cultures with Improved Phage Resistance
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
EP3156494B8 (en) * 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
US8889394B2 (en) 2009-09-07 2014-11-18 Empire Technology Development Llc Multiple domain proteins
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
EP2569425B1 (en) 2010-05-10 2016-07-06 The Regents of The University of California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
CN103025344B (zh) 2010-05-17 2016-06-29 桑格摩生物科学股份有限公司 新型dna-结合蛋白及其用途
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
JP5607827B2 (ja) 2011-05-30 2014-10-15 トヨタ自動車株式会社 高強度ポリプロピレン繊維及びその製造方法
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
LT2800811T (lt) * 2012-05-25 2017-09-11 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinės dnr modifikavimui, panaudojant adresuotą rnr, ir transkripcijos moduliavimui, panaudojant adresuotą rnr
CN110669758A (zh) 2012-10-23 2020-01-10 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna 的组合物及其用途
PT3138912T (pt) * 2012-12-06 2018-12-28 Sigma Aldrich Co Llc Modificação e regulação de genoma baseado em crispr
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
ES2786193T3 (es) 2012-12-12 2020-10-09 Broad Inst Inc Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
PT2931898E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para manipulação de sequências com domínios funcionais
SG11201504523UA (en) 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
ES2542015T3 (es) 2012-12-12 2015-07-29 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
CN105121641A (zh) 2012-12-17 2015-12-02 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-引导的人类基因组工程化
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