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KR20240172763A - 핵산 및/또는 단백질 적재물 전달을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

핵산 및/또는 단백질 적재물 전달을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20240172763A
KR20240172763A KR1020247039185A KR20247039185A KR20240172763A KR 20240172763 A KR20240172763 A KR 20240172763A KR 1020247039185 A KR1020247039185 A KR 1020247039185A KR 20247039185 A KR20247039185 A KR 20247039185A KR 20240172763 A KR20240172763 A KR 20240172763A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polymer
cationic
isomer
seq
cases
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020247039185A
Other languages
English (en)
Inventor
안드레 로날드 왓슨
크리스티안 포스터
Original Assignee
리간달 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리간달 인코포레이티드 filed Critical 리간달 인코포레이티드
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Abstract

세포에의 적재물 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 적재물)의 나노입자 전달을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 대상체 나노입자는 코어 및 코어를 캡슐화하는 탈피할 수 있는 층을 포함하고, 상기 코어는 (i) 음이온성 폴리머 조성물; (ii) 양이온성 폴리머 조성물; (iii) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및(iv) 핵산 및/또는 단백질 적재물을 포함하고; 여기서: (a) 상기 음이온성 폴리머 조성물은 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고, 및/또는 (b) 상기 양이온성 폴리머 조성물은 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 및/또는 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 L-이성질체의 폴리머에 비하여 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다.

Description

핵산 및/또는 단백질 적재물 전달을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID AND/OR PROTEIN PAYLOAD DELIVERY}
교차-참조
본원은 2017년 6월 9일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/517,346, 2017년 1월 6일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/443,567, 2017년 1월 6일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/443,522 및 2016년 12월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/434,344의 이점을 주장하며, 이들 출원의 모두는 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된다.
텍스트 파일로 제공된 서열목록의 참고에 의한 편입
2017년 12월 14일 만들어지고 128 KB의 크기를 갖는 텍스트 파일인 "LGDL-004_SeqList_ST25.txt"로 서열목록이 본 명세서와 함께 제공된다. 본 텍스트 파일의 내용은 전체적으로 참고로 본 명세서에 편입된다.
예를 들어, 유전자 발현을 편집 및/또는 변형하는 게놈에 대해, 세포 안으로 핵산 및/또는 단백질 적재물의 효과적인 도입은 치료적 전략 및 연구 방법론에 대해 중요한 목표이다. 적재물의 효과적인 도입을 달성하기 위해, 세포 도입 전에 적재물을 열화로부터 보호하기 위해 적절하게 포장하고, 세포 안으로 도입을 허용하고, 적재물이 리소좀 열화 경로로부터 떨어지게 하고, 그리고 적절한 세포하 구획으로 전달하도록 하는 것이 중요하다. 또한, 세포 도입에 이어서 포장으로부터 적재물의 방출 타이밍이 적재물의 유효성에 영향을 미칠 수 있다.
적재물 전달을 위한 많은 나노 입자-기반 기술은 낮은 수준의 세포 형질감염 및 형질감염에 의해 제한된 유효성을 제공한다. 세포로 적재물 전달의 유효성을 개선하는 조성물 및 방법이 필요하다.
세포로 적재물 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 적재물)의 전달 (예를 들어, 세포로 적재물의 나노입자, 바이러스, 및 비-바이러스 전달)을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 혈청 안정성을 위해 설계된 나노입자, 특이적 세포 유형으로 표적화된 전달, 히스톤 및 뉴클레오솜-유사 분지형 폴리머를 통한 내인성 핵산 패키징의 천연물모방술, 핵 내의 구획-특이적 비포장, 가변성 적기 방출 동력학, 및 이들의 사용 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 대상체 나노입자는 코어 및 코어를 캡슐화하는 탈피할 수 있는 층 (예를 들어, 세포 전달 동안 코어의 일시적 안정화를 위해 제공됨)을 포함하고, 상기 코어는 (i) 음이온성 폴리머 조성물; (ii) 양이온성 폴리머 조성물; (iii) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및(iv) 핵산 및/또는 단백질 적재물을 포함하고; 그리고 여기서: (a) 음이온성 폴리머 조성물은 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고, 및/또는 (b) 양이온성 폴리머 조성물은 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 비하여, 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 상기 폴리머에 비하여, 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 나노입자는 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 표면 코트(surface coat; 이하에서는 "표면 도포"라고도 함)를 포함한다. 표면 도포는 표적 세포의 표면 분자에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는, 예를 들어, 나노입자의 탈피할 수 있는 층에 대해 표적화 리간드를 고착하기 위한 고착 도메인에 (링커로 또는 없이) 접합된다.
또한 코어의 일부로서 제1 적재물 (예를 들어, DNA 공여체 템플레이트)를 포함하는 다중-층상 나노입자가 제공되고, 여기서 코어는 제1 탈피할 수 있는 층에 의해 둘러싸이고, 제1 탈피할 수 있는 층은 제2 적재물 (예를 들어, 유전자 편집 도구)을 포함하는 중간층에 의해 둘러싸이고, 그리고 중간층은 제2 탈피할 수 있는 층에 의해 둘러싸인다. 일부 경우에 제2 탈피할 수 있는 층은 표면 도포 (예를 들어, 표적화 리간드를 포함하는 표면 도포로 코팅된다.
또한 제1 나노입자의 적재물이 공여체 DNA 템플레이트를 포함하고 제2 나노입자의 적재물이 유전자 편집 도구 (예를 들어, (i)　CRISPR/Cas 가이드 RNA; (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA; (iii) 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질을 인코딩하는 DNA 및/또는 RNA; 및/또는 (iv) 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질)를 포함하는 둘 또는 그 초과의 나노입자를 포함하는 나노입자 제형이 제공된다.
동일한 패키지의 일부로서 다중적재물 (예를 들어, 둘 또는 그 초과의 적재물)의 공동-전달 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 표적 세포에 핵산 및/또는 단백질 적재물을 전달하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 유전자 편집 도구; 및 (b) 표적 세포의 증식 및/또는 편향 분화를 유도하는 핵산 또는 단백질 제제를 포함하는 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클과 진핵 표적 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명은 수반되는 도면과 함께 읽을 때 하기 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해되어 진다. 통상의 실시에 따라 도면의 다양한 특징은 일정 비율로 되지 않는다는 것이 강조되어야 한다. 반면에, 다양한 특징들의 치수는 명확성을 위해 임의로 확대 또는 축소된다. 도면에는 하기 도들이 포함되었다.
도 1은 핵산 적재물의 축합을 위한 다양한 파라미터 (예를 들어, 양이온:음이온 전하 비)를 시험하는 형광측정 검정으로부터의 결과를 묘사한다. 결과는, 예를 들어, 가이드 RNA 분자와 Cas9를 인코딩하는 플라스미드의 축합에 대해 2의 전하 비가 잘 작동한다는 것을 나타냈다.
도 2는 생성된 나노입자 코어에 대한 입자 크기 및 제타 전위 분포를 묘사한다. 데이터는 Particle Metrix ZetaView NTA 기기를 사용하여 수득되었다. 나노입자 크기 (피크)는 128.8 nm였고, 제타 전위 (피크)는 +10.5 mV (100%)였다.
도 3은 안정화된 나노입자 코어 (탈피할 수 있는 층에 의해 캡슐화된 코어)에 대한 입자 크기 및 제타 전위 분포를 묘사한다. 데이터는 Particle Metrix ZetaView NTA 기기를 사용하여 수득되었다. 안정화된 코어는 110.6 nm의 크기와 -42.1 mV (95%)의 제타전위를 가졌다.
도 4는 (양이온성 고착 도메인으로) 9-Arg 펩타이드 서열에 융합된 광견병 바이러스 당단백질 (RVG)인 RVG9R을 포함한 외부 쉘 (외부 도포)을 갖는 나노입자가 115.8 nm의 특징적인 입자 크기 및 -3.1 mV (100%)의 제타 전위를 갖는다는 것을 나타내는 데이터를 묘사한다. 최적의 외부 코팅은 -50mV (실리카 도포된 코어 에 대해)으로부터 0 내지 -10mV (외부 쉘을 부가한 후)의 제타 전위의 전이를 생성한다.
도 5는 상이한 나노입자가 핵산 적재물을 전달하기 위해 사용된 세포 배양 실험으로부터의 결과를 묘사한다. 본 도면은 (폴리(L-아르기닌)에 부가하여) 코어의 일부로서 폴리(D-글루탐산)을 포함하는 나노입자를 이를 포함하지 않는 것에 비교한다. 3개 행은 복제물을 나타낸다.
도 6 (패널 A-D)은 핵산 적재물로서 CRISPR/Cas9 발현 벡터를 포함한 나노입자와 접촉된 신경 줄기 세포의 현미경검사 이미지를 묘사한다. 나노입자의 코어는 형광단 (FITC)으로 태깅된 폴리(L-아르기닌)(양이온성 폴리머)를 포함했다. 엔도솜 및 핵은 각각 Lysotracker (적색) 및 Hoescht 3342 (청색)를 사용하여 염색되었다. 나노입자 (및 대조군으로 리포펙타민 3000)는 씨딩 16 시간 후 세포에 도입되었다. 세포는 이미지형성에 앞서 Hoescht 3342 및 Lysotracker Red로 인큐베이션되었다. 패널 C-D는 핵 및 엔도솜으로 나노입자 코어의 공국재화를 정량화하는 막대 그래프를 나타낸다.
도7 (패널 A-B)은 핵산 적재물로서 GFP를 인코딩하는 mRNA를 포함한 나노입자로 형질감염된 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)의 현미경검사 이미지를 묘사한다. 본 이미지는 mRNA 발현이 정의된 비로 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 갖는 코어를 포함하는 나노입자로 16일까지 연장될 수 있다는 것을 입증한다. 이 경우에, 폴리(D-글루탐산) 대 폴리(L-글루탐산)의 2:1 비를 갖는 나노입자 코어의 사용은 16일에서 최대 발현을 초래했다 (패널 A = 4일; 패널 B = 16일).
도8은 대상체 나노입자의 예시적인 구현예의 도식적 표현을 묘사한다.
도9는 대상체 나노입자의 예시적인 구현예의 도식적 표현을 묘사한다. 이 경우에, 나노입자는 표면 코팅된 (즉, 외부 쉘을 포함함) 제2 탈피할 수 있는 층에 의해 둘러싸인 (추가의 적재물을 포함하는) 중간층에 의해 둘러싸인 제1 탈피할 수 있는 층에 의해 둘러싸인 (제1 적재물을 포함하는) 코어를 갖는 다중-층상이다.
도10 (패널 A-B)은 대상체 나노입자의 표면 도포의 전달 분자의 실시예 배치형태의 도식적 표현을 묘사한다. 묘사된 전달 분자는 나노입자의 탈피할 수 있는 층과 정전기적으로 상호작용하는 고착 도메인에 접합된 표적화 리간드를 포함한다. 표적화 리간드는 N- 또는 C-말단 (각각의패널의 좌측)과 접합될 수 있지만, 또한 내부위치 (각각의 패널의 우측)에서 접합될 수 있다는 것에 주의한다. 패널 A에서의 분자는 링커를 포함하는 반면 패널 B에서의 것을 그렇지 않다.
도 11은, 예를 들어, 알로스테릭/친화성 N-말단 도메인 및 오쏘스테릭 엔도조말-분류/신호전달 도메인에 대한 결합에 대해, 표적화 리간드를 평가할 때 고려되어지는 별개의 도메인을 강조하는, 계열 B GPCR의 잔기 170-432 (서열번호: 313)의 개략도를 제공한다. (도면은 문헌 [Siu, Fai Yiu, et al., Nature 499.7459 (2013): 444-449]으로부터 적응됨).
도 12는 친화성이 유지되고 표적화 리간드가 핵산 방출을 증진하고 핵산 열화를 제한하는 긴 엔도조말 재순환 경로를 이용하도록 표적화 리간드에 대한 삽입 및/또는 치환 (예를 들어, 시스테인 잔기로)을 위한 내부 아미노산 위치를 확인하는 실시예를 제공한다. 이 경우에, 표적화 리간드는 엑센딘-4이고 아미노산 위치 10, 11, 및 12가 가능한 삽입 및/또는 치환 (예를 들어, 시스테인 잔기로, 예를 들어, S11C 돌연변이)에 대한 부위로 확인되었다. 본 도면은 글루카곤-GCGR (4ERS) 및 GLP1-GLP1R-ECD 복합체 (PDB: 3IOL)의 결정 구조로 알려진 모의실험된 엑센딘-4 S11C (서열번호: 2)와, 3-차원 공간에서 회전된 PDB 표현의 정렬을 도시한다.
도 13은 3원 FGF2-FGFR1-헤파린 복합체 (PDB 상의 1fq9)의 일부로서 tbFGF 단편 (서열번호: 314)을 도시한다. CKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS (강조됨) (서열번호: 43)는 FGFR1에 대한 친화성에 중요한 것으로 결정되었다.
도 14는 FGF (서열번호: 315) 유래의 HFKDPK (서열번호: 5)가 리간드-수용체 오쏘스테릭 활성 및 친화성에 대해 사용될 수 있는 펩타이드이다는 것을 결정하기 위해 사용된 정렬 및 PDB 3D 표현을 제공한다.
도 15는 FGF 단편 (서열번호: 316) 유래의 LESNNYNT (서열번호: 6)가 리간드-수용체 오쏘스테릭 활성 및 친화성에 대해 사용될 수 있는 펩타이드이다는 것을 결정하기 위해 사용된 정렬 및 PDB 3D 표현을 제공한다.
도 16은 대상체 나노입자 일부 (예를 들어, NLS-함유 펩타이드로서; NLS-함유 펩타이드의 일부/접합된 것으로, 음이온성 폴리머, 양이온성 폴리머, 및/또는 양이온성 폴리펩타이드; 및 기타)로서 사용될 수 있는 비-제한적인 예 핵 국재화신호 (NLS)를 제공한다. 본 도면은 문헌 [Kosugi al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85]으로부터 적응된다. [부류 1, 최상부 내지 바닥 (서열번호: 201-221); 부류 2, 최상부 내지 바닥 (서열번호: 222-224); 부류 4, 최상부 내지 바닥 (서열번호: 225-230); 부류 3, 최상부 내지 바닥 (서열번호: 231-245); 부류 5, 최상부 내지 바닥 (서열번호: 246-264)].
도 17 (패널 A-B)은 마우스 (패널 A) 및 인간 (패널 B) 조혈 세포 계통, 및 계열 내의 다양한 세포에 대해 확인된 마커의 도식적 표현을 묘사한다.
도 18 (패널 A-B)은 세포분화 및/또는 증식에 영향을 주기 위해 사용될 수 있는 miRNA (패널 A) 및 단백질 (패널 B) 인자의 도식적 표현을 묘사한다
도 19는 펩타이드핵산 (PNA) 결합 부위를 갖는 적재물: VWF-EGFP pDNA를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 20은 HBB gRNA에 대해 복합체화된 적재물: NLS-CAS9-NLS RNP를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 21은 적재물: HBB gRNA를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 22는 적재물: HBB gRNA를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 23은 HBB gRNA에 복합체화된 적재물: NLS-CAS9-NLS RNP를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 24는 펩타이드 핵산 (PNA) 결합 부위를 갖는 적재물: VWF-EGFP pDNA를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 25는 펩타이드 핵산 (PNA) 결합 부위를 갖는 적재물: VWF-EGFP pDNA를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 26은 HBB gRNA를 갖는 NLS-CAS9-NLS의 적재물: RNP를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 27은 펩타이드 핵산 (PNA) 결합 부위를 갖는 적재물: VWF-EGFP pDNA를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 28은 적재물: Cy5_EGFP mRNA를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 29는 적재물: BLOCK-iT Alexa Fluor 555 siRNA를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 30은 HBB gRNA에 복합체화된 적재물: NLS-Cas9-EGFP RNP를 갖는 나노입자 상의 축합 곡선을 제공한다.
도 31은 적재물로서 Alexa 555 Block-IT siRNA를 갖는 나노입자를 사용할 때 수집된 데이터를 제공한다.
도 32는 적재물로서 NLS-Cas9-GFP 및 HBB 가이드 RNA에 의해 형성된 리보핵 단백질 (RNP)을 갖는 나노입자를 사용할 때 수집된 데이터를 제공한다.
도 33은 적재물로서 Cy5 EGFP mRNA를 갖는 나노입자를 사용할 때 수집된 데이터를 제공한다.
도 34는 Cy5 태깅된 펩타이드 핵산 (PNA) 결합 부위를 갖는 적재물: VWF-EGFP pDNA를 갖는 나노입자를 사용할 때 수집된 데이터를 제공한다.
도 35는 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C와 이어서 PLE100의 첨가 및 RNP에 양이온성 폴리펩타이드의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 36은 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C와 이어서 PLE100의 첨가 및 siRNA 및 SYBR 골드에 양이온성 폴리펩타이드의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 37은 양이온성 폴리펩타이드 히스톤 펩타이드 H2A와 이어서 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C의 첨가 및 HBB gRNA 및 SYBR 골드를 갖는 NLS-Cas9-EGFP의 RNP에 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 38은 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C와 함께 양이온성 폴리펩타이드 히스톤 펩타이드 H4의 첨가 및 HBB gRNA 및 SYBR 골드를 갖는 NLS-Cas9-EGFP의 RNP에 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 39는 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C f의 첨가 및 mRNA에 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 40은 히스톤 H4의 첨가 및 mRNA에 CD45-mSiglec-(4GS)2_9R_c 및 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 41은 히스톤 H2A의 첨가 및 mRNA에 CD45-mSiglec-(4GS)2_9R_c 및 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 42는 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C와 이어서 PLE100의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 VWF_EGFP pDNA를 갖는 삽입으로부터 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 43은 히스톤 H4, 이어서 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C와 이어서 PLE100의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 VWF_EGFP pDNA를 갖는 삽입으로부터 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 44는 히스톤 H4, 이어서 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C와 이어서 PLE100의 첨가에 의한 형광 강도 변이를 나타내는 VWF_EGFP pDNA를 갖는 삽입으로부터 SYBR 골드 배제 검정으로부터의 데이터를 제공한다.
도 45 (패널 A-C)는 폴리플렉스 크기 분포, 실리카 도포된 크기 및 제타 전위 분포, 및 리간드 코팅된/작용화된 입자 크기 및 제타 전위 분포에 관련된 데이터를 제공한다.
도 46은 분지형 히스톤 펩타이드 콘주게이트 파일롯트 입자에 관련된 데이터를 제공한다.
도 47은 프로젝트 HSC.001.001에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 48은 프로젝트 HSC.001.002에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 49는 프로젝트 HSC.002.01 (표적화 리간드 - ESELLg_mESEL_(4GS)2_9R_N)에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 50은 프로젝트 HSC.002.02 (표적화 리간드 - ESELLg_mESEL_(4GS)2_9R_C)에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 51은 프로젝트 HSC.002.03 (표적화 리간드 - CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C)에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 52는 프로젝트 HSC.002.04 (표적화 리간드 - Cy5mRNA-SiO2-PEG)에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 53은 프로젝트 BLOOD.002.88 (표적화 리간드 - CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C)에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 54는 프로젝트 BLOOD.002.89 (표적화 리간드 - CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C)에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 55는 프로젝트 BLOOD.002.90에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 56은 프로젝트 BLOOD.002.91 (PLR50)에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 57은 프로젝트 BLOOD.002.92 (표적화 리간드 - CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C) 에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 58은 프로젝트 TCELL.001.1에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 59는 프로젝트 TCELL.001.3에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 60은 프로젝트 TCELL.001.13에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 61은 프로젝트 TCELL.001.14에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 62는 프로젝트 TCELL.001.16에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 63은 프로젝트 TCELL.001.18에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 64는 프로젝트 TCELL.001.28에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 65는 프로젝트 TCELL.001.29에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 66은 프로젝트 TCELL.001.31에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 67은 프로젝트 TCELL.001.33에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 68은 프로젝트 TCELL.001.43에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 69는 프로젝트 TCELL.001.44에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 70은 프로젝트 TCELL.001.46에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 71은 프로젝트 TCELL.001.48에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 72는 프로젝트 TCELL.001.58에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 73은 프로젝트 TCELL.001.59에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 74는 프로젝트 CYNOBM.002.82에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 75는 프로젝트 CYNOBM.002.83에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 76은 프로젝트 CYNOBM.002.84에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 77은 프로젝트 CYNOBM.002.85에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 78은 프로젝트 CYNOBM.002.86에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 79는 프로젝트 CYNOBM.002.76에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 80은 프로젝트 CYNOBM.002.77에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 81은 프로젝트 CYNOBM.002.78에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 82는 프로젝트 CYNOBM.002.79에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 83은 프로젝트 CYNOBM.002.80에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 84는 CynoBM.002 샘플에 대한 형질감염되지 않은 대조군에 관련된 데이터를 제공한다.
도 85는 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNPs의 리포펙타민 CRISPRMAX 전달에 관련된 데이터를 제공한다.
도 86은 프로젝트 CynoBM.002 RNP-Only 대조군에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 87은 프로젝트 CynoBM.002.82에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 88은 프로젝트 CynoBM.002.83에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 89는 프로젝트 CYNOBM.002.84에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 90은 프로젝트 CynoBM.002.85에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 91은 프로젝트 CynoBM.002.86에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 92는 프로젝트 CynoBM.002.75에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 93은 프로젝트 CynoBM.002.76에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 94는 프로젝트 CynoBM.002.77에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 95는 프로젝트 CynoBM.002.78에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 96은 프로젝트 CynoBM.002.79에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 97은 프로젝트 CynoBM.002.80에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 98은 프로젝트 CynoBM.002.81에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 99는 CynoBM.002 RNP-Only 대조군의 정성적 이미지를 제공한다.
도 100은 프로젝트 HSC.004 (표 5 참고) 고-함량 스크리닝에 관련된 데이터를 제공한다.
도 101은 프로젝트 TCELL.001 (표 5 참고) 고-함량 스크리닝에 관련된 데이터를 제공한다.
도 102는 프로젝트 TCELL.001 (표 5 참고) 리포펙타민 CRISPRMAX 대조군에 관련된 데이터를 제공한다.
도 103은 프로젝트 TCell.001.1에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 104는 프로젝트 TCell.001.2에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 105는 프로젝트 TCell.001.3에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 106은 프로젝트 TCell.001.4에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 107은 프로젝트 TCell.001.5에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 108은 프로젝트 TCell.001.6에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 109는 프로젝트 TCell.001.7에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 110은 프로젝트 TCell.001.8에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 111은 프로젝트 TCell.001.9에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 112는 프로젝트 TCell.001.10에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 113은 프로젝트 TCell.001.11에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 114는 프로젝트 TCell.001.12에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 115는 프로젝트 TCell.001.13에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 116은 프로젝트 TCell.001.14에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 117은 프로젝트 TCell.001.15에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 118은 프로젝트 TCell.001에 대한 음성 대조군에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 119는 프로젝트 BLOOD.002에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 120은 프로젝트 TCell.001.27에 관련된 데이터를 제공한다 (표 5 참고).
도 121은 단백질 표면 상에 안정한 하전된 층을 형성하기 위해 음이온성 또는 양이온성 펩타이드/물질이 첨가되어야 하는지 여부를 결정하도록 하는 CRISPR RNP (가능한 적재물)의 전하 밀도 플롯을 묘사한다.
도 122는 단백질 표면 상에 안정한 하전된 층을 형성하기 위해 음이온성 또는 양이온성 펩타이드/물질이 첨가되어야 하는지 여부를 결정하도록 하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 (가능한 적재물)의 전하 밀도 플롯을 묘사한다.
도 123은 다중 핵산 또는 하전된 치료제의 공동-전달, 또는 가교 결합을 통한 층 안정화 이전에 (1) CRISPR RNP 표면 상의 양이온성 부위에 고착하는 예시적인 음이온성 펩타이드 (9-10 아미노산 길이, 대략 10nm 직경 CRISPR RNP으로의 척도) (2) (2a) 앵커-링커-리간드 또는 독립형 양이온성 앵커로서, (2b) 후속적인 다층화 화학물질의 첨가와 함께 또는 첨가 없이, 양이온성 앵커의 첨가를 묘사한다.
도 124는 Cas9 RNP 또는 임의의 균질하게 또는 쯔비터이온성으로 하전된 표면을 포함할 수 있는, 코어 템플레이트 상에 기반한 정전 매트릭스 조성물과 첨가 순서의 예를 묘사한다.
도 125는 IL2R에 결합된 IL2의 모델링된 구조를 제공한다.
도 126은 단일 사슬 CD3 항체 단편의 모델링된 구조를 제공한다.
도 127은 N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac)과 복합체로 시알로아드헤신 N-말단의 모델링된 구조를 제공한다.
도 128은 줄기 세포 인자 (SCF)의 모델링된 구조를 제공한다.
도 129는 cKit 수용체 단편의 합리적인 디자인 동안 생성된 실시예 이미지를 제공한다.
도 130은 cKit 수용체 단편의 합리적인 디자인 동안 생성된 실시예 이미지를 제공한다.
도 131은 cKit 수용체 단편의 합리적인 디자인 동안 생성된 실시예 이미지를 제공한다.
도 132는 합리적으로 설계된 cKit 수용체 단편을 분석하는 것으로부터의 원형 2색성 데이터를 제공한다.
도 133은 합리적으로 설계된 cKit 수용체 단편의 안정화된 형태의 모델링을 묘사한다.
도 134는 HTP가 양이온성 폴리머 백본의 측쇄에 접합된 분지형 히스톤 구조의 예를 묘사한다. 우측 상의 폴리머는 전구체 백본 분자를 나타내고 좌측 상의 분자는 분지형 구조의 분절의 예이다.
상기에 요약된 바와 같이, 세포에 적재물 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 적재물)의 나노입자 전달을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 대상체 나노입자는 코어 및 코어를 캡슐화하는 탈피할 수 있는 층 (예를 들어, 세포 전달 동안 코어의 일시적 안정화를 제공함)을 포함하고, 상기 코어는 (i) 음이온성 폴리머 조성물; (ii) 양이온성 폴리머 조성물; (iii) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및 (iv) 핵산 및/또는 단백질 적재물을 포함하고; 그리고 여기서: (a) 음이온성 폴리머 조성물은 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고, 및/또는 (b) 양이온성 폴리머 조성물은 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 비하여 10:1 내지 1:10의 범위의 비로 존재한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 상기 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 비하여 10:1 내지 1:10의 범위의 비로 존재한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 나노입자는 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 표면 도포를 포함한다. 본 표면 도포는 표적 세포의 표면 분자에 대해 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는, 예를 들어, 나노입자의 탈피할 수 있는 층에 표적화 리간드를 고착하기 위한 고착 도메인에 (링커로 또는 없이) 접합된다.
코어의 일부로서 제1 적재물 (예를 들어, DNA 공여체 템플레이트)를 포함하는 다중-층상 나노입자가 또한 제공되고, 여기서 본 코어는 제1 탈피할 수 있는 층에 의해 둘러싸이고, 제1 탈피할 수 있는 층은 제2 적재물 (예를 들어, 유전자 편집 도구)을 포함하는 중간층에 의해 둘러싸이고, 그리고 중간층은 제2 탈피할 수 있는 층에 의해 둘러싸인다. 일부 경우에 제2 탈피할 수 있는 층은 표면 도포 (예를 들어, 표적화 리간드를 포함하는 표면 도포로 코팅된다.
제1 나노입자의 적재물이 공여체 DNA 템플레이트를 포함하고 제2 나노입자의 적재물이 유전자 편집 도구 (예를 들어, (i)　CRISPR/Cas 가이드 RNA; (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA; (iii) 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질을 인코딩하는 DNA 및/또는 RNA; 및/또는 (iv) 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질)를 포함하는 둘 또는 그 초과의 나노입자를 포함하는 나노입자 제형이 또한 제공된다.
본 방법 및 조성물이 기재되기 전에, 본 발명 기재된 바와 같은 특정한 방법 또는 조성물에 제한되지 않고, 물론, 다양할 수 있다고 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항들에 의해서만 제한될 것이므로, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 구현예를 기술하기 위한 것이고 제한하기 위한 것은 아니다는 것이 또한 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공될 때, 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한 해당 범위의 상한과 하한선 사이, 하한선 단위의 십분의 일까지, 각각의 개재하는 값이 또한 구체적으로 개시된다고 이해해야 한다. 언급된 범위 내에서 임의의 언급된 값 또는 개재하는 값 사이의 각각의 더 작은 범위 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재하는 값은 본 발명 내에 포괄된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그 범위에 포함 또는 배제될 수 있고, 어느 하나, 어느 것도 또는 양자의 한계가 더 작은 범위에 포함될 수 있는 각각의 범위는 언급된 범위 내에서 임의의 특별히 배제된 한계를 조건으로 하여 본 발명 내에 또한 포괄된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 또한 본 발명 내에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되어 지는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에서 기재된 것에 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 일부 가능하고 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보는 공보들이 인용하는 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위해 본 명세서에 참고로 편입된다. 본 개시내용은 모순이 존재하는 정도까지 편입된 공보의 임의의 개시내용을 대체하는 것으로 이해된다.
본 개시내용을 판독함에 의해 당해 분야의 숙련가에게 분명한 바와 같이, 본 명세서에서 기술되고 설명된 개별 구현예 각각은 본 발명의 범위 또는 사상으로부터 벗어남이 없이 임의의 다른 몇 개의 구현예의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 개별적 성분 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 사건의 언급된 순서대로 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "엔도뉴클레아제"에 대한 언급은 당해 분야의 숙련가, 등에게 알려진 하나 이상의 엔도뉴클레아제 및 이들의 등가물에 대한 언급을 포함한다. 또한 청구범위는 임의의 요소, 예를 들어, 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음이 주목된다. 이와 같이, 이 서술은 청구항 구성성분의 재인용 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "단지" 및 기타 동종의 것과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 기준으로서의 역할을 하려는 것이다.
본 명세서에서 논의된 공보들은 본원의 출원일 이전에 그것의 개시내용에 대해서만 단독으로 제공된다. 본 명세서의 어떤 내용도 본 발명이 이러한 공보에 앞설 자격이 없는 점의 인정으로 해석되어서는 안된다. 또한 제공되는 공보의 날짜는 실제 공개 날짜와 상이할 수 있으며, 이는 독자적으로 확인해야 할 수도 있다.
방법 및 조성물
세포에 핵산, 단백질, 및/또는 리보핵단백질 적재물을 전달하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서 대상체 나노입자는 (ii) 탈피할 수 있는 층에 의해 캡슐화된 (i) 코어를 포함하고, 본 탈피할 수 있는 층은 일부 경우에 표적화 리간드를 포함할 수 있는 (iii) 표면 도포에 의해 둘러싸인다. 하기 설명에 부가하여, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2015042585는 전체적으로 본 명세서에 참고로 통합된다.
i. 나노입자 코어
대상체 나노입자의 코어는 음이온성 폴리머 조성물 (예를 들어, 폴리(글루탐산)), 양이온성 폴리머 조성물 (예를 들어, 폴리(아르기닌), 양이온성 폴리펩타이드 조성물 (예를 들어, 히스톤 꼬리 펩타이드), 및 적재물 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 적재물)을 포함한다. 일부 경우에 코어는 음이온성 아미노산 폴리머의 존재에서 (그리고 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드의 존재에서) 양이온성 아미노산 폴리머 및 적재물의 축합에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 코어를 구성하는 성분의 축합은 적재물과 양이온성 폴리머의 콘주게이트에 비교하여 증가된 형질감염 효율을 매개할 수 있다. 나노입자 코어에 음이온성 폴리머의 봉입은 나노입자의 세포내 체류 및 적재물의 방출의 기간을 연장할 수 있다.
코어의 양이온성 및 음이온성 폴리머 조성물에 대해, D-이성질체 폴리머 대 L-이성질체 폴리머의 비는 적재물의 적기 방출을 조절하기 위해 제어될 수 있고, 여기서 D-이성질체 폴리머 대 L-이성질체 폴리머의 증가된 비율은 증가된 안정성 (감소된 적재물 방출 속도)을 유발시키며, 예를 들어 대상체 나노입자에 의해 전달된 적재물로부터 유전자 발현을 더 길게 지속할 수 있다. 일부 경우에 나노입자 코어 내의 D-대-L 이성질체 폴리펩타이드의 비를 변형시키는 것은 유전자 발현 프로파일 (예를 들어, 적재물 분자에 의해 인코딩된 단백질의 발현)이 1-90일 (예를 들어 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 3-90, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50, 3-40, 3-30, 3-25, 3-20, 3-15, 3-10, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 또는 5-10일)의 정도로 되도록 유발할 수 있다. 적재물 방출의 조절 (예를 들어, 유전자 편집 도구를 전달할 때)은, 예를 들어, 일부 경우에 상동 지정 복구가 요구되는 경우 게놈 편집을 수행하는데 특히 효과적일 수 있다.
일부 구현예에서, 나노입자는 코어 및 코어를 캡슐화하는 탈피할 수 있는 층을 포함하고, 여기서 본 코어는: (a) 음이온성 폴리머 조성물; (b) 양이온성 폴리머 조성물; (c) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및 (d) 핵산 및/또는 단백질 적재물을 포함하고, 여기서 (a) 및 (b) 중 하나는 아미노산의 D-이성질체 폴리머를 포함하고, 그리고 (a) 및 (b) 중 다른 것은 아미노산의 L-이성질체 폴리머를 포함하고, 여기서 D-이성질체 폴리머 대 L-이성질체 폴리머의 비는 10:1 내지 1.5:1 (예를 들어, 8:1 내지 1.5:1, 6:1 내지 1.5:1, 5:1 내지 1.5:1, 4:1 내지 1.5:1, 3:1 내지 1.5:1, 2:1 내지 1.5:1, 10:1 내지 2:1; 8:1 내지 2:1, 6:1 내지 2:1, 5:1 내지 2:1, 10:1 내지 3:1; 8:1 내지 3:1, 6:1 내지 3:1, 5:1 내지 3:1, 10:1 내지 4:1; 4:1 내지 2:1, 6:1 내지 4:1, 또는 10:1 내지 5:1), 또는 1:1.5 내지 1:10 (예를 들어, 1:1.5 내지 1:8, 1:1.5 내지 1:6, 1:1.5 내지 1:5, 1:1.5 내지 1:4, 1:1.5 내지 1:3, 1:1.5 내지 1:2, 1:2 내지 1:10, 1:2 내지 1:8, 1:2 내지 1:6, 1:2 내지 1:5, 1:2 내지 1:4, 1:2 내지 1:3, 1:3 내지 1:10, 1:3 내지 1:8, 1:3 내지 1:6, 1:3 내지 1:5, 1:4 내지 1:10, 1:4 내지 1:8, 1:4 내지 1:6, 또는 1:5 내지 1:10)의 범위이다. 일부 이러한 사례에서, D-이성질체 폴리머 대 L-이성질체 폴리머의 비는 1:1이 아니다. 일부 이러한 사례에서, 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된 음이온성 폴리머를 포함하고, 여기서 (선택적으로) 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-라이신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 폴리머를 포함할 수 있다. 일부 경우에 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 폴리머를 포함하고, 여기서 (선택적으로) 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된 음이온성 폴리머를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 나노입자는 코어 및 코어를 캡슐화하는 탈피할 수 있는 층을 포함하고, 여기서 본 코어는 : (i) 음이온성 폴리머 조성물; (ii) 양이온성 폴리머 조성물; (iii) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및(iv) 핵산 및/또는 단백질 적재물을 포함하고, 여기서 (a) 상기 음이온성 폴리머 조성물은 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고; 및/또는 (b) 상기 양이온성 폴리머 조성물은 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함한다. 일부 이러한 사례에서, 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된 제1 음이온성 폴리머를 포함하고; 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된 제2 음이온성 폴리머를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된 제1 양이온성 폴리머를 포함하고; 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-라이신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된 제2 양이온성 폴리머를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 상기 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 대비하여 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 상기 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 대비하여 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다.
나노입자 성분의 감수성
일부 구현예에서, 적재물 방출의 타이밍은, 예를 들어, 코어의 일부 (예를 들어, 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 일부, 양이온성 폴리머 조성물의 일부, 및/또는 음이온성 폴리머 조성물의 일부)로서 단백질의 특정 유형을 선택함에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 특정 범위의 시간 동안, 또는 적재물이 특정 세포 위치 (예를 들어, 사이토졸, 핵, 리소좀, 엔도솜)에 존재하거나 또는 특정 조건 (예를 들어, 낮은 pH, 높은 pH, 등) 하에 있을 때까지 적재물 방출을 늦추는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같이, 일부 경우에 특이 단백질 활성 (예를 들어, 효소적 활성)에 민감한, 예를 들어 특이 단백질 활성 (예를 들어, 효소적 활성)에 대해 기질인 단백질이 (예를 들어, 코어의 일부로서) 사용되고 이것은 일반적인 도처에 존재하는 세포 기구, 예를 들어, 일반적인 열화 기구에 민감한 것에 대조적으로 된다. 특이 단백질 활성에 민감한 단백질은 본 명세서에서 '효소적으로 민감한 단백질' (ESP)로 언급된다. ESP의 예시는 비제한적으로 하기를 포함한다: (i) 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 활성 (세포외활성의 예)에 대해 기질인 단백질, 예를 들어, MMP에 의해 인식된 모티프를 포함하는 단백질; (ii) 카텝신 활성 (세포내 엔도조말 활성의 예)에 대해 기질인 단백질, 예를 들어, 카텝신에 의해 인식된 모티프를 포함하는 단백질; 및 (iii)　메틸전달효소 및/또는 아세틸전달효소 활성 (세포내 핵 활성의 예)에 대해 기질인 단백질 예컨대 히스톤 꼬리 펩타이드 (HTP), 예를 들어, 효소적으로 메틸화/탈-메틸화될 수 있는 모티프 및/또는 효소적으로 아세틸화/탈-아세틸화될 수 있는 모티프를 포함하는 단백질. 예를 들어, 일부 경우에 핵산 적재물은 아세틸전달효소 활성에 대해 기질인 단백질 (예컨대 히스톤 꼬리 펩타이드)로 응축되고 단백질의 아세틸화는 단백질이 적재물을 방출하도록 하고 - 이와 같이, 아세틸화에 다소간 민감한 단백질을 사용하는 것을 선택함에 의해 적재물 방출에 대한 조절을 실행할 수 있다.
일부 경우에, 대상체 나노입자의 코어는 폴리펩타이드가 특정 활성을 가지지 않고 중성인 폴리펩타이드 단일 중합체 (즉, 반복 서열을 갖는 단백질)인, 효소적으로 중성 폴리펩타이드 (ENP)를 포함한다. 예를 들어, NLS 서열 및 HTP와 달리, 이 둘 모두는 특정 활성을 가지고, ENP는 그럴지 않다.
일부 경우에, 대상체 나노입자의 코어는 효소적 활성에 저항성인 단백질인 효소적으로 보호된 폴리펩타이드 (EPP)를 포함한다. PP의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: (i) 단백질 분해 열화에 내성일 수 있는 D-이성질체 아미노산 (예를 들어, D-이성질체 폴리머)을 포함하는 폴리펩타이드; 및 (ii) 자기-은신 도메인 예컨대 폴리글루타민 반복 도메인 (예를 들어, QQQQQQQQQQ) (서열번호: 170).
대상체 나노입자의 일부 (예를 들어, 나노입자 코어의 일부)인, 민감한 단백질 (ESP), 중성 단백질 (ENP), 및 보호된 단백질 (EPP)의 상대적인 양을 제어함에 의해, 적재물의 방출을 조절할 수 있다. 예를 들어, 보다 많은 ESP의 사용은 보다 많은 EPP의 사용보다 적재물의 보다 빠른 방출로 일반적으로로 이어질 수 있다. 또한, 보다 많은 ESP의 사용은 특정 세트의 조건/상황, 예를 들어, ESP가 민감한 단백질 (예를 들어, 효소)의 활성으로 이어지는 조건/상황에 의존한 적재물 의방출로 일반적으로로 이어질 수 있다.
음이온성 폴리머 조성물
음이온성 폴리머 조성물은 하나 이상의 음이온성 아미노산 폴리머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 대상체 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(글루탐산)(PEA), 폴리(아스파르트산)(PDA), 및 이들의 조합으로부터 선택된 폴리머를 포함한다. 일부 경우에 주어진 음이온성 아미노산 폴리머는 아스파르트산과 글루탐산 잔기의 혼합물을 포함할 수 있다. 각각의 폴리머는 L-이성질체 또는 D-이성질체의 폴리머로서 조성물 안에 존재할 수 있고, 여기서 D-이성질체는 이들이 분해하는데 더 오래 걸리기 때문에 표적 세포에서 보다 안정하다. 따라서, 나노입자 코어 내에 D-이성질체 폴리(아미노산)의 봉입은 코어의 열화 및 후속적인 적재물 방출을 늦춘다. 적재물 방출 속도는 따라서 제어될 수 있고 D-이성질체의 폴리머 대 L-이성질체의 폴리머의 비에 비례하고, 여기서 D-이성질체 대 L-이성질체의 더 높은 비는 적재물 방출의 기간을 증가시킨다 (즉, 방출 속도를 감소시킨다). 환언하면, D- 및 L- 이성질체의 상대적인 양은 나노입자 코어의 적기 방출 동력학 및 열화에 대한 효소적 감수성과 적재물 방출을 조절할 수 있다.
일부 경우에 대상체 나노입자의 음이온성 폴리머 조성물은 음이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(글루탐산)(PEA) 및 폴리(아스파르트산)(PDA))의 D-이성질체의 폴리머 및 L-이성질체의 폴리머를 포함한다. 일부 경우에 D- 대 L- 이성질체 비는 10:1-1:10 (예를 들어, 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
따라서, 일부 경우에 음이온성 폴리머 조성물은 (예를 들어, 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된) D-이성질체의 폴리머인 제1 음이온성 폴리머 (예를 들어, 아미노산 폴리머)를 포함하고; 그리고 (예를 들어, 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된) L-이성질체의 폴리머인 제2 음이온성 폴리머 (예를 들어, 아미노산 폴리머)를 포함한다. 일부 경우에 제1 음이온성 폴리머 (D-이성질체) 대 제2 음이온성 폴리머 (L-이성질체)의 비는 10:1-1:10 (예를 들어, 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
일부 구현예에서, 대상체 나노입자의 코어의 음이온성 폴리머 조성물은 (예를 들어, 임의의 전술한 예의 음이온성 폴리머에 부가하여 또는 그 대신에) 글리코사미노글리칸, 당단백질, 다당류, 폴리(만누론산), 폴리(글루론산), 헤파린, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄, 케라탄 설페이트, 아그레칸, 폴리(글루코사민), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 음이온성 폴리머를 포함한다.
일부 구현예에서, 코어 내의 음이온성 폴리머는 1-200 kDa (예를 들어, 1-150, 1-100, 1-50, 5-200, 5-150, 5-100, 5-50, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 15-200, 15-150, 15-100, 또는 15-50 kDa)의 범위인 분자량을 가질 수 있다. 예로서, 일부 경우에 음이온성 폴리머는 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 폴리(글루탐산)을 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 아미노산 폴리머는 예를 들어, 링커, NLS, 및/또는 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP)에 콘주게이션을 촉진할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학반응을 통한 가교결합 (콘주게이션)을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 음이온성 폴리머 조성물의 음이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA), 폴리(D-글루탐산) (PDEA), 폴리(D-아스파르트산) (PDDA), 폴리(L-글루탐산) (PLEA), 폴리(L-아스파르트산) (PLDA))는 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에 음이온성 아미노산 폴리머는 N- 및/또는 C- 말단 상에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에 음이온성 아미노산 폴리머는 내부 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 아미노산 폴리머는 (아래에 더 상세히 기재된) 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함한다 (및/또는 여기에 접합된다). 따라서, 일부 구현예에서 음이온성 폴리머 조성물의 음이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA), 폴리(D-글루탐산) (PDEA), 폴리(D-아스파르트산) (PDDA), 폴리(L-글루탐산) (PLEA), 폴리(L-아스파르트산) (PLDA))는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 또는 그 초과) NLS를 포함한다 (및/또는 여기에 접합된다). 일부 경우에 음이온성 아미노산 폴리머는 N- 및/또는 C- 말단 상에 NLS를 포함한다. 일부 경우에 음이온성 아미노산 폴리머는 내부 NLS를 포함한다.
일부 경우에, 음이온성 폴리머는 대상체 나노입자 코어를 생성할 때 양이온성 폴리머에 앞서 첨가된다.
양이온성 폴리머 조성물
양이온성 폴리머 조성물은 하나 이상의 양이온성 아미노산 폴리머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 대상체 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(아르기닌)(PR), 폴리(라이신)(PK), 폴리(히스티딘)(PH), 폴리(오르니틴), 폴리(시트룰린), 및 이들의 조합으로부터 선택된 폴리머를 포함한다. 일부 경우에 주어진 양이온성 아미노산 폴리머는 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 오르니틴, 및 시트룰린 잔기의 혼합물을 (임의의 편리한 조합으로) 포함할 수 있다. 각각의 폴리머는 L-이성질체 또는 D-이성질체의 폴리머로서 조성물에 존재할 수 있고, 여기서 D-이성질체는 이들이 분해하는데 더 오래 걸리기 때문에 표적 세포에서 보다 안정하다. 따라서, 나노입자 코어 내에 D-이성질체 폴리(아미노산)의 봉입은 코어의 열화 및 후속적인 적재물 방출을 늦춘다. 적재물 방출 속도는 따라서 제어될 수 있고 D-이성질체의 폴리머 대 L-이성질체의 폴리머의 비에 비례하고, 여기서 D-이성질체 대 L-이성질체의 더 높은 비는 적재물 방출의 기간을 증가시킨다 (즉, 방출 속도를 감소시킨다). 환언하면, D- 및 L- 이성질체의 상대적인 양은 나노입자 코어의 적기 방출 동력학 및 열화에 대한 효소적 감수성과 적재물 방출을 조절할 수 있다.
일부 경우에 대상체 나노입자의 양이온성 폴리머 조성물은 양이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(아르기닌)(PR), 폴리(라이신)(PK), 폴리(히스티딘)(PH), 폴리(오르니틴), 폴리(시트룰린))의 D-이성질체의 폴리머 및 L-이성질체의 폴리머를 포함한다. 일부 경우에 D- 대 L- 이성질체 비 10:1-1:10 (예를 들어, 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
따라서, 일부 경우에 양이온성 폴리머 조성물은 (예를 들어, 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된) D-이성질체의 폴리머인 제1 양이온성 폴리머 (예를 들어, 아미노산 폴리머)를 포함하고; 그리고 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-라이신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된) L-이성질체의 폴리머인 제2 양이온성 폴리머 (예를 들어, 아미노산 폴리머)를 포함한다. 일부 경우에 제1 양이온성 폴리머 (D-이성질체) 대 제2 양이온성 폴리머 (L-이성질체)의 비는 10:1-1:10 (예를 들어, 8:1-1:10, 6:1-1:10, 4:1-1:10, 3:1-1:10, 2:1-1:10, 1:1-1:10, 10:1-1:8, 8:1-1:8, 6:1-1:8, 4:1-1:8, 3:1-1:8, 2:1-1:8, 1:1-1:8, 10:1-1:6, 8:1-1:6, 6:1-1:6, 4:1-1:6, 3:1-1:6, 2:1-1:6, 1:1-1:6, 10:1-1:4, 8:1-1:4, 6:1-1:4, 4:1-1:4, 3:1-1:4, 2:1-1:4, 1:1-1:4, 10:1-1:3, 8:1-1:3, 6:1-1:3, 4:1-1:3, 3:1-1:3, 2:1-1:3, 1:1-1:3, 10:1-1:2, 8:1-1:2, 6:1-1:2, 4:1-1:2, 3:1-1:2, 2:1-1:2, 1:1-1:2, 10:1-1:1, 8:1-1:1, 6:1-1:1, 4:1-1:1, 3:1-1:1, 또는 2:1-1:1)의 범위이다.
일부 구현예에서, 대상체 나노입자의 코어의 양이온성 폴리머 조성물은 (예를 들어, 임의의 전술한 예의 양이온성 폴리머에 부가하여 또는 그 대신에) 폴리(에틸렌이민), 폴리(아미도아민) (PAMAM), 폴리(아스파르트아미드), 폴리펩토이드 (예를 들어, 코어 축합을 위한 "스파이더웹"-유사 분지를 형성하기 위한 것), 전하-작용화된 폴리에스테르, 양이온성 다당류, 아세틸화된 아미노 당, 키토산, 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 선형 또는 분지형 형태)을 포함하는 양이온성 폴리머를 포함한다.
일부 구현예에서, 코어 내의 양이온성 폴리머는 1-200 kDa (예를 들어, 1-150, 1-100, 1-50, 5-200, 5-150, 5-100, 5-50, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 15-200, 15-150, 15-100, 또는 15-50 kDa)의 범위인 분자량을 가질 수 있다. 예로서, 일부 경우에 양이온성 폴리머는, 예를 들어, 대략 29 kDa의 분자량을 갖는 폴리(L-아르기닌)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 폴리머는 대략 25 kDa의 분자량을 갖는 선형 폴리(에틸렌이민) (PEI)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 폴리머는 대략 10 kDa의 분자량을 갖는 분지형 폴리(에틸렌이민)을 포함한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 양이온성 폴리머는 대략 70 kDa의 분자량을 갖는 분지형 폴리(에틸렌이민)을 포함한다. 일부 경우에 양이온성 폴리머는 PAMAM을 포함한다.
일부 경우에, 양이온성 아미노산 폴리머는, 예를 들어, 링커, NLS, 및/또는 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP)에 콘주게이션을 촉진할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학반응을 통한 가교결합 (콘주게이션)을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 양이온성 폴리머 조성물의 양이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(아르기닌)(PR), 폴리(라이신)(PK), 폴리(히스티딘)(PH), 폴리(오르니틴), 및 폴리(시트룰린), 폴리(D-아르기닌)(PDR), 폴리(D-라이신)(PDK), 폴리(D-히스티딘)(PDH), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린), 폴리(L-아르기닌)(PLR), 폴리(L-라이신)(PLK), 폴리(L-히스티딘)(PLH), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린))는 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에 양이온성 아미노산 폴리머는 N- 및/또는 C- 말단 상에 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에 양이온성 아미노산 폴리머는 내부 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 양이온성 아미노산 폴리머는 (아래에 더 상세히 기재된) 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함한다 (및/또는 여기에 접합된다). 따라서, 일부 구현예에서 양이온성 폴리머 조성물의 양이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(아르기닌)(PR), 폴리(라이신)(PK), 폴리(히스티딘)(PH), 폴리(오르니틴), 및 폴리(시트룰린), 폴리(D-아르기닌)(PDR), 폴리(D-라이신)(PDK), 폴리(D-히스티딘)(PDH), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린), 폴리(L-아르기닌)(PLR), 폴리(L-라이신)(PLK), 폴리(L-히스티딘)(PLH), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린))는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 또는 그 초과) NLS를 포함한다 (및/또는 여기에 접합된다). 일부 경우에 양이온성 아미노산 폴리머는 N- 및/또는 C- 말단 상에 NLS를 포함한다. 일부 경우에 양이온성 아미노산 폴리머는 내부 NLS를 포함한다.
양이온성 폴리펩타이드 조성물
일부 구현예에서 나노입자의 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 안정성, 세포하 구획화, 및/또는 적재물 방출을 매개할 수 있다. 일 예로서, 대상체 나노입자 코어 내에서 일반적으로 히스톤 꼬리 펩타이드로 언급된, 히스톤 단백질의 N-말단의 단편은 일부 경우에 히스톤 아세틸전달효소-매개된 아세틸화의 경우에서와 같이 다양한 히스톤 변형에 의해 탈양성자화될 수 있을 뿐만 아니라, 나노입자 코어의 성분 (예를 들어, 적재물)의 효과적인 핵-특이적 포장풀림을 매개할 수 있다. 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 히스톤 및/또는 히스톤 꼬리 펩타이드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩타이드는 히스톤 및/또는 히스톤 꼬리 펩타이드일 수 있다). 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 NLS-함유 펩타이드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩타이드는 NLS-함유 펩타이드일 수 있다). 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 미토콘드리아 국재화신호를 포함하는 펩타이드를 포함한다 (예를 들어, 양이온성 폴리펩타이드는 미토콘드리아 국재화신호를 포함하는 펩타이드일 수 있다).
히스톤 꼬리 펩타이드(HTP)
일부 구현예에서 대상체 나노입자의 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 히스톤 펩타이드 또는 히스톤 펩타이드의 단편, 예컨대 N-말단 히스톤 꼬리 (예를 들어, H1, H2 (예를 들어, H2A, H2AX, H2B), H3, 또는 H4 히스톤 단백질의 히스톤 꼬리)를 포함한다. 히스톤 단백질의 꼬리 단편은 본 명세서에서 히스톤 꼬리 펩타이드 (HTP)로 언급된다. 그와 같은 단백질 (히스톤 및/또는 HTP)은 대상체 나노입자의 코어의 일부로서 핵산 적재물과 응축할 수 있기 때문에, (예를 들어, 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 일부로서) 하나 이상의 히스톤 또는 HTP를 포함하는 코어는 때때로 본 명세서에서 뉴클레오솜-모방체 코어로 언급된다. 히스톤 및/또는 HTP는 나노입자 코어 안으로 핵산 적재물을 응축할 때 단량체로, 그리고 일부 경우에 이량체, 삼량체, 사량체 및/또는 팔량체 형태로 포함될 수 있다. 일부 경우에 HTP는 히스톤 아세틸전달효소-매개된 아세틸화의 경우에서와 같이 다양한 히스톤 변형에 의해 탈양성자화될 수 있을 뿐만 아니라, 코어의 성분의 효과적인 핵-특이적 포장풀림 (예를 들어, 적재물의 방출)을 매개할 수 있다. 히스톤 및/또는 HTP를 포함하는 코어의 이동조절은 골지 및 내형질망을 통한 역행 수송을 이용하는 대안적인 세포질이물흡수의 경로에 의존할 수 있다. 게다가, 일부 히스톤은 선천적인 핵 국재화 서열을 포함하고, 코어 내 NLS의 봉입은 (적재물을 포함하는) 코어를 표적 세포의 핵으로 향하게 할 수 있다.
일부 구현예에서 대상체 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 경우에 대상체 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 히스톤 단백질의 N-말단 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 단편 (HTP)은 히스톤 단백질의 제1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 N-말단 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상체 HTP는 히스톤 단백질의 N-말단 영역으로부터 5-50 아미노산 (예를 들어, 5-45, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 8-50, 8-45, 8-40, 8-35, 8-30, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35, 또는 10-30 아미노산)을 포함한다. 일부 경우에 대상체 양이온성 폴리펩타이드는 5-150 아미노산 (예를 들어, 5-100, 5-50, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 8-150, 8-100, 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 10-150, 10-100, 10-50, 10-40, 10-35, 또는 10-30 아미노산)을 포함한다.
일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 (예를 들어, 일부 경우에 하나 이상의 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 또는 다른 상보적 잔기 상에) 번역후 변형 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드는 메틸화되거나 (및/또는 메틸화 / 탈메틸화에 민감함), 아세틸화되거나 (및/또는 아세틸화 / 탈아세틸화에 민감함), 크로토닐화되거나 (및/또는 크로토닐화/ 탈크로토닐화에 민감함), 유비퀴티닐화되거나 (및/또는 유비퀴티닐화 / 탈유비퀴티닐화에 민감함), 인산화되거나 (및/또는 인산화 / 탈인산화에 민감함), 수모일화되거나 (및/또는 수모일화 / 탈수모일화에 민감함), 파르네실화되거나 (및/또는 파르네실화 / 탈파르네실화에 민감함), 황산화되거나 (및/또는 황산화 / 탈황산화에 민감함) 또는 달리는 번역후에 변형된다. 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 p300/CBP 기질 (예를 들어, 하기 HTP 예를 들어, 예를 들어, 서열번호: 129-130 참고)이다. 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 (예를 들어, 티오설페이트 황전달효소 기질과 같이) 황산화되거나 또는 황산화에 민감한 하나 이상의 티올 잔기를 포함한다 (예를 들어, 시스테인 및/또는 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다). 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 C-말단 상에서 아미드화된다. 히스톤 H2A, H2B, H3, 및 H4 (및/또는 HTP)는 전사 활성을 증진하거나 억제하고 핵-특정 방출 동력학을 변형하도록 임의의 그것의 라이신에서 모노메틸화, 디메틸화, 또는 트리메틸화될 수 있다.
양이온성 폴리펩타이드는 원하는 변형으로 합성될 수 있거나 또는 시험관내 반응에서 변형될 수 있다. 대안적으로, 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP)는 세포 모집단에서 발현될 수 있고 원하는 변형된 단백질이 단리/정제될 수 있다. 일부 경우에 대상체 나노입자의 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 메틸화된 HTP를 포함하고, 예를 들어, H3K4(Me3)의 HTP 서열을 포함하고 - 서열번호: 75 또는 88로 제시된 아미노산 서열을 포함한다). 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 C-말단 아미드를 포함한다.
히스톤 및 HTP의 예
그 예는 비제한적으로 하기 서열을 포함한다:
H2A
SGRGKQGGKARAKAKTRSSR (서열번호: 62) [1-20]
SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGGG (서열번호: 63) [1-39]
MSGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYAERVGAGAPVYLAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGKVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTESHHKAKGK(서열번호: 64) [1-130]
H2AX
CKATQASQEY (서열번호: 65) [134 - 143]
KKTSATVGPKAPSGGKKATQASQEY(서열번호: 66) [KK 120-129]
MSGRGKTGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGHYAERVGAGAPVYLAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGGVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTSATVGPKAPSGGKKATQASQEY(서열번호: 67) [1-143]
H2B
PEPA - K(cr) - SAPAPK (서열번호: 68)[1-11 H2BK5(cr)]
[cr: 크로토닐화됨 (크로토닐화)]
PEPAKSAPAPK (서열번호: 69)[1-11]
AQKKDGKKRKRSRKE (서열번호: 70) [21-35]
MPEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSIYVYKVLKQVHPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRSTITSREIQTAVRLLLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK (서열번호: 71) [1-126]
H3
ARTKQTAR (서열번호: 72)[1-8]
ART - K(Me1) - QTARKS (서열번호: 73) [1-8 H3K4(Me1)]
ART - K(Me2) - QTARKS (서열번호: 74) [1-8 H3K4(Me2)]
ART - K(Me3) - QTARKS (서열번호: 75) [1-8 H3K4(Me3)]
ARTKQTARK - pS - TGGKA (서열번호:76) [1-15 H3pS10]
ARTKQTARKSTGGKAPRKWC - NH2 (서열번호:77) [1-18 WC, 아미드]
ARTKQTARKSTGG - K(Ac) - APRKQ (서열번호:78) [1-19 H3K14(Ac)]
ARTKQTARKSTGGKAPRKQL (서열번호:79) [1-20]
ARTKQTAR - K(Ac) - STGGKAPRKQL (서열번호:80) [1-20 H3K9(Ac)]
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA (서열번호:81) [1-21]
ARTKQTAR - K(Ac) - STGGKAPRKQLA (서열번호:82) [1-21 H3K9(Ac)]
ARTKQTAR - K(Me2) - STGGKAPRKQLA (서열번호:83) [1-21 H3K9(Me1)]
ARTKQTAR - K(Me2) - STGGKAPRKQLA (서열번호:84) [1-21 H3K9(Me2)]
ARTKQTAR - K(Me2) - STGGKAPRKQLA (서열번호:85) [1-21 H3K9(Me3)]
ART - K(Me1) - QTARKSTGGKAPRKQLA (서열번호:86) [1-21 H3K4(Me1)]
ART - K(Me2) - QTARKSTGGKAPRKQLA (서열번호:87) [1-21 H3K4(Me2)]
ART - K(Me3) - QTARKSTGGKAPRKQLA (서열번호:88) [1-21 H3K4(Me3)]
ARTKQTAR - K(Ac) - pS - TGGKAPRKQLA (서열번호:89) [1-21 H3K9(Ac), pS10]
ART - K(Me3) - QTAR - K(Ac) - pS - TGGKAPRKQLA (서열번호: 90) [1-21 H3K4(Me3), K9(Ac), pS10]
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLAC (서열번호:91) [1-21 Cys]
ARTKQTAR - K(Ac) - STGGKAPRKQLATKA (서열번호: 92) [1-24 H3K9(Ac)]
ARTKQTAR - K(Me3) - STGGKAPRKQLATKA (서열번호: 93) [1-24 H3K9(Me3)]
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAA (서열번호: 94) [1-25]
ART - K(Me3) - QTARKSTGGKAPRKQLATKAA (서열번호: 95) [1-25 H3K4(Me3)]
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TKQTAR - K(Me3) - STGGKAPR (서열번호: 98) [3-17 H3K9(Me3)]
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KAAR - K(Me1) - SAPATGG (서열번호: 107) [H3K27(Me1)]
KAAR - K(Me2) - SAPATGG (서열번호: 108) [H3K27(Me2)]
KAAR - K(Me3) - SAPATGG (서열번호: 109) [H3K27(Me3)]
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ATKAARK - pS - APATGGVKKPHRYRPG (서열번호: 111) [21-44 pS28]
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGV (서열번호: 112) [1-35]
STGGV - K(Me1) - KPHRY (서열번호: 113) [31-41 H3K36(Me1)]
STGGV - K(Me2) - KPHRY (서열번호: 114) [31-41 H3K36(Me2)]
STGGV - K(Me3) - KPHRY (서열번호: 115) [31-41 H3K36(Me3)]
GTVALREIRRYQ - K(Ac) - STELLIR (서열번호: 116) [44-63 H3K56(Ac)]
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALRE (서열번호: 117) [1-50]
TELLIRKLPFQRLVREIAQDF - K(Me1) - TDLRFQSAAI (서열번호: 118) [H3K79(Me1)]
EIAQDFKTDLR (서열번호:119) [73-83]
EIAQDF - K(Ac) - TDLR (서열번호: 120) [73-83 H3K79(Ac)]
EIAQDF - K(Me3) - TDLR (서열번호: 121) [73-83 H3K79(Me3)]
RLVREIAQDFKTDLRFQSSAV (서열번호: 122) [69-89]
RLVREIAQDFK - (Me1) - TDLRFQSSAV (서열번호: 123) [69-89 H3K79 (Me1), 아미드]
RLVREIAQDFK - (Me2) - TDLRFQSSAV (서열번호: 124) [69-89 H3K79 (Me2), 아미드]
RLVREIAQDFK - (Me3) - TDLRFQSSAV (서열번호: 125) [69-89 H3K79 (Me3), 아미드]
KRVTIMPKDIQLARRIRGERA (서열번호: 126) [116-136]
MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKVARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLMREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEACESYLVGLFEDTNLCVIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA(서열번호: 127) [1-136]
H4
SGRGKGG (서열번호:128) [1-7]
RGKGGKGLGKGA (서열번호: 129) [4-12]
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV (서열번호: 130) [1-21]
KGLGKGGAKRHRKVLRDNWC - NH2 (서열번호: 131) [8-25 WC, 아미드]
SGRG - K(Ac) - GG - K(Ac) - GLG - K(Ac) - GGA - K(Ac) - RHRKVLRDNGSGSK (서열번호: 132) [1-25 H4K5,8,12,16(Ac)]
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK - NH2 (서열번호: 133) [1-20 H4 PRMT7 (단백질 아르기닌 메틸전달효소 7) 기질, M1]
SGRG - K(Ac) - GGKGLGKGGAKRHRK (서열번호: 134) [1-20 H4K5 (Ac)]
SGRGKGG - K(Ac) - GLGKGGAKRHRK (서열번호: 135) [1-20 H4K8 (Ac)]
SGRGKGGKGLG - K(Ac) - GGAKRHRK (서열번호: 136) [1-20 H4K12 (Ac)]
SGRGKGGKGLGKGGA - K(Ac) - RHRK (서열번호: 137) [1-20 H4K16 (Ac)]
KGLGKGGAKRHRKVLRDNWC - NH2 (서열번호: 138) [1-25 WC, 아미드]
MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKVFLENVIRDAVTYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG (서열번호: 139) [1-103]
이와 같이, 대상체 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 임의의 서열번호: 62-139에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에 대상체 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 임의의 서열번호: 62-139에서 제시된 아미노산 서열과 80% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에 대상체 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 임의의 서열번호: 62-139에서 제시된 아미노산 서열과 90% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 양이온성 폴리펩타이드는 임의의 편리한 변형을 포함할 수 있고, 수많은 이러한 고려된 변형은 상기에 논의되어 있고, 예를 들어, 메틸화되거나, 아세틸화되거나, 크로토닐되거나, 유비퀴티닐되거나, 인산화되거나, 수모일화되거나, 파르네실화되거나, 황산화되거나, 기타 동종의 것이다.
일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 서열번호: 94에 제시된 아미노산 서열과 80% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 서열번호: 94에 제시된 아미노산 서열과 95% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 서열번호: 94에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 인간 히스톤 3 단백질의 제1 25 아미노산을 포함하고, 라이신 4 상에서 트리-메틸화된 (예를 들어, 일부 경우에 C-말단 상에서 아미드화된) H3K4(Me3) (서열번호: 95)에 의해 표시되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 양이온성 (또는 일부 경우에 음이온성) 아미노산 폴리머, 링커, NLS, 및/또는 다른 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 일부 경우에 분지형 히스톤 구조를 형성하기 위함)에 대해 콘주게이션을 촉진할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학반응을 통한 가교결합 (콘주게이션)을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에 시스테인 잔기는 내부에 있다. 일부 경우에 시스테인 잔기는 N-말단 및/또는 C-말단에 배치된다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 시스테인 잔기를 부가하는 돌연변이 (예를 들어, 삽입 또는 치환)을 포함한다. 시스테인을 포함하는 HTP의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다:
CKATQASQEY (서열번호:140) - H2AX 유래
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLAC (서열번호:141) - H3 유래
ARTKQTARKSTGGKAPRKWC (서열번호:142)
KAARKSAPATGGC (서열번호:143) - H3 유래
KGLGKGGAKRHRKVLRDNWC (서열번호:144) - H4 유래
MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKVARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLMREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEACESYLVGLFEDTNLCVIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA (서열번호:145) - H3 유래
일부 구현예에서 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 대상체 나노입자의 코어의 양이온성 (및/또는 음이온성) 아미노산 폴리머에 접합된다. 예로서, 히스톤 또는 HTP는 시스테인 잔기를 통해 양이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(라이신)을 포함하는 것)에 접합될 수 있고, 예를 들어, 여기서 폴리머의 라이신(들)의 피리딜 디설파이드기(들)는 히스톤 또는 HTP의 시스테인에 대해 결합된 디설파이드로 치환된다.
변형된 / 분지화 구조
일부 구현예에서 대상체 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 선형 구조를 갖는다. 일부 구현예에서 대상체 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 분지형 구조를 갖는다.
예를 들어, 일부 경우에, 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, HTP, 예를 들어, 시스테인 잔기를 갖는 HTP)는 양이온성 폴리머 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(L-라이신), 폴리(D-라이신))의 말단에 (예를 들어, 그것의 C-말단에서) 접합되고, 따라서 연장된 선형 폴리펩타이드를 형성한다. 일부 경우에, 하나 이상의 (둘 이상, 셋 이상, 등) 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, HTP, 예를 들어, 시스테인 잔기를 갖는 HTP)는 양이온성 폴리머 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(L-라이신), 폴리(D-라이신))의 말단(들)에 (예를 들어, 그것의 C-말단들에서) 접합되고, 따라서 연장된 선형 폴리펩타이드를 형성한다. 일부 경우에 양이온성 폴리머는 4,500 - 150,000 Da의 범위인 분자량을 갖는다).
또 다른 예로서, 일부 경우에, 하나 이상의 (둘 이상, 셋 이상, 등) 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, HTP, 예를 들어, 시스테인 잔기를 갖는 HTP)는 양이온성 폴리머 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(L-라이신), 폴리(D-라이신))의 측쇄에 (예를 들어, 그것의 C-말단들에서) 접합되고, 따라서 분지형 구조 (분지형 폴리펩타이드)를 형성한다. 나노입자 코어의 성분 (예를 들어, 대상체 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 성분)에 의한 분지형 구조의 형성은 일부 경우에 달성될 수 있는 코어 축합의 (예를 들어, 핵산 적재물의) 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 경우에 분지형 구조를 형성하는 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 다양한 유형의 분지 구조가 관심 대상이고, 그리고 (예를 들어, 대상체 양이온성 폴리펩타이드 예컨대 HTP, 예를 들어, 시스테인 잔기; 펩토이드, 폴리아미드, 및 기타 동종의 것을 갖는 HTP를 사용하여) 생성될 수 있는 분지 구조의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 브러쉬 중합체, 웹 (예를 들어, 스파이더 웹), 그라프트 중합체, 별모양의 폴리머, 빗살모양 중합체, 폴리머 네트워크, 덴드리머, 및 기타 동종의 것.
예로서, 도 134는 분지형 구조의 브러쉬 유형을 묘사한다. 일부 경우에, 분지형 구조는 2-30 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, HTP) (예를 들어, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 4-30, 4-25, 4-20, 4-15, 또는 4-10 양이온성 폴리펩타이드)를 포함하고, 여기서 각각은 분지형 구조의 다른 양이온성 폴리펩타이드와 동일하거나 또는 상이할 수 있다 (예를 들어, 도 134 참고). 일부 경우에 양이온성 폴리머는 4,500 - 150,000 Da의 범위인 분자량을 갖는다). 일부 경우에, 양이온성 폴리머 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(L-라이신), 폴리(D-라이신))의 측쇄 중 5% 또는 그 초과 (예를 들어, 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 또는 그 초과)가 대상체 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, HTP, 예를 들어, 시스테인 잔기를 갖는 HTP)에 접합된다. 일부 경우에, 양이온성 폴리머 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(L-라이신), 폴리(D-라이신))의 측쇄 중 최대 50% (예를 들어, 최대 40%, 최대 30%, 최대 25%, 최대 20%, 최대 15%, 최대 10%, 또는 최대 5%)가 대상체 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, HTP, 예를 들어, 시스테인 잔기를 갖는 HTP)에 접합된다. 따라서, HTP는 양이온성 아미노산 폴리머와 같은 폴리머의 백본에서 분지될 수 있다.
일부 경우에 분지형 구조의 형성은 성분 예컨대 펩토이드 (폴리펩토이드), 폴리아미드, 덴드리머, 및 기타 동종의 것을 사용하여 촉진될 수 있다. 예를 들어,일부 경우에 펩토이드 (예를 들어, 폴리펩토이드)가, 예를 들어, 일부 경우에 나노입자 코어의 축합을 촉진할 수 있는, 웹 (예를 들어, 스파이더 웹) 구조를 생성하기 위해 나노입자 코어의 성분으로 사용된다.
본 명세서에서 천연 또는 변형된 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상은 말단 또는 간헐적 아르기닌, 라이신, 또는 히스티딘 서열로 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 각각의 폴리펩타이드는 나노입자 코어 내에 동등한 아민 몰량으로 포함된다. 이 구현예에서, 각각의 폴리펩타이드의 C-말단은 5R (5 아르기닌)로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩타이드의 C-말단은 9R (9 아르기닌)로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩타이드의 N-말단은 5R (5 아르기닌)로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩타이드의 N-말단은 9R (9 아르기닌)로 변형될 수 있다. 일부 경우에, H2A, H2B, H3 및/또는 H4 히스톤 단편 (예를 들어, HTP) 각각은 FKFL 카텝신 B 단백질분해 절단 도메인 (서열번호: 306) 또는 RGFFP 카텝신 D 단백질분해 절단 도메인 (서열번호: 307)으로 직렬식으로 브릿징된다. 일부 경우에, H2A, H2B, H3 및/또는 H4 히스톤 단편 (예를 들어, HTP)은 5R (5 아르기닌), 9R (9 아르기닌), 5K (5 라이신), 9K (9 라이신), 5H (5 히스티딘), 또는 9H (9 히스티딘) 양이온성 스페이서 도메인에 의해 직렬식으로 브릿징될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 H2A, H2B, H3 및/또는 H4 히스톤 단편 (예를 들어, HTP)은 그것의 N-말단에서 프로타민에 디설파이드-결합된다.
분지형 히스톤 구조를 생성하는 방법을 설명하기 위해 제조 방법 실시예가 제공된다. 그와 같은 방법의 실시예는 하기를 포함한다: 등몰비의 히스톤 H2AX [134-143], 히스톤 H3 [1-21 Cys], 히스톤 H3 [23-34 Cys], 히스톤 H4 [8-25 WC]의 공유 변형 및 SV40 T-Ag-유래된 NLS는 10% 피리딜 디설파이드 변형된 폴리(L-라이신) [MW = 5400, 18000, 또는 45000 Da; n = 30, 100, 또는 250]과 반응에서 수행될 수 있다. 전형적인 반응에서, 29 μL 수용액의 700 μM Cys-변형된 히스톤/NLS (20 nmol)은 57 μL의 0.2 M 인산염 버퍼 (pH 8.0)에 첨가될 수 있다. 둘째로, 14 μL의 100 μM 피리딜 디설파이드 보호된 폴리(라이신) 용액이 그런 다음 1:2 비의 피리딜 디설파이드기 대 시스테인 잔기로 100 μL로 최종 용적이 되는 히스톤 용액에 첨가될 수 있다. 이 반응은 실온에서 3시간 동안 수행될 수 있다. 반응은 4회 반복될 수 있고 콘주게이션의 정도는 343nm에서 피리딘-2-티온의 흡광도를 통해 결정될 수 있다.
또 다른 예로서, 0:1, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 또는 1:0 몰비의 히스톤 H3 [1-21 Cys] 펩타이드 및 히스톤 H3 [23-34 Cys] 펩타이드의 공유 변형이 10% 피리딜 디설파이드 변형된 폴리(L-라이신) 또는 폴리(L-아르기닌) [MW = 5400, 18000, 또는 45000 Da; n = 30, 100, 또는 250]과 반응에서 수행될 수 있다. 전형적인 반응에서, 29 μL 수용액의 700 μM Cys-변형된 히스톤 (20 nmol)은 57 μL의 0.2 M 인산염 버퍼 (pH 8.0)에 첨가될 수 있다. 둘째로, 14 μL의 100 μM 피리딜 디설파이드 보호된 폴리(라이신) 용액이 그런 다음 1:2 비의 피리딜 디설파이드기 대 시스테인 잔기로 100 μL로 최종 용적이 되는 히스톤 용액에 첨가될 수 있다. 이 반응은 실온에서 3시간 동안 수행될 수 있다. 반응은 4회 반복될 수 있고 콘주게이션의 정도는 343nm에서 피리딘-2-티온의 흡광도를 통해 결정될 수 있다.
일부 경우에, 음이온성 폴리머가 표적화 리간드에 접합된다.
핵국재화 서열 (NLS)
일부 구현예에서 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4)는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 또는 그 초과) 핵국재화 서열 (NLS)을 포함한다 (및/또는 여기에 접합된다). 따라서 일부 경우에 대상체 나노입자의 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 NLS를 포함하는 펩타이드를 포함한다. 일부 경우에 대상체 나노입자의 히스톤 단백질 (또는 HTP)은 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 또는 그 초과) 천연 핵국재화 신호 (NLS)를 포함한다. 일부 경우에 대상체 나노입자의 히스톤 단백질 (또는 HTP)은 히스톤 단백질에 이종성인 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 또는 그 초과) NLS를 포함한다 (즉, 히스톤/HTP의 일부로서 자연적으로 발생하지 않는 NLS, 예를 들어, NLS는 인간에 의해 첨가될 수 있음). 일부 경우에 HTP는 N- 및/또는 C- 말단 상에 NLS를 포함한다.
일부 구현예에서 양이온성 폴리머 조성물의 양이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(아르기닌)(PR), 폴리(라이신)(PK), 폴리(히스티딘)(PH), 폴리(오르니틴), 폴리(시트룰린), 폴리(D-아르기닌)(PDR), 폴리(D-라이신)(PDK), 폴리(D-히스티딘)(PDH), 폴리(D-오르니틴), 폴리(D-시트룰린), 폴리(L-아르기닌)(PLR), 폴리(L-라이신)(PLK), 폴리(L-히스티딘)(PLH), 폴리(L-오르니틴), 또는 폴리(L-시트룰린))는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 또는 그 초과) NLS를 포함한다 (및/또는 여기에 접합된다). 일부 경우에 양이온성 아미노산 폴리머는 N- 및/또는 C- 말단 상에 NLS를 포함한다. 일부 경우에 양이온성 아미노산 폴리머는 내부 NLS를 포함한다.
일부 구현예에서 음이온성 폴리머 조성물의 음이온성 아미노산 폴리머 (예를 들어, 폴리(글루탐산) (PEA), 폴리(아스파르트산) (PDA), 폴리(D-글루탐산) (PDEA), 폴리(D-아스파르트산) (PDDA), 폴리(L-글루탐산) (PLEA), 또는 폴리(L-아스파르트산) (PLDA))는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 또는 그 초과) NLS를 포함한다 (및/또는 여기에 접합된다). 일부 경우에 음이온성 아미노산 폴리머는 N- 및/또는 C- 말단 상에 NLS를 포함한다. 일부 경우에 음이온성 아미노산 폴리머는 내부 NLS를 포함한다.
임의의 편리한 NLS가 사용될 수 있다 (예를 들어, 히스톤, HTP, 양이온성 아미노산 폴리머, 음이온성 아미노산 폴리머, 및 기타 동종의 것에 접합됨). 그 예는 비제한적으로 부류 1 및 부류 2 '단일부분 NLS'뿐만 아니라 부류 3-5의 NLS를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kosugi al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85]으로부터 적응된, 도 16 참고). 일부 경우에, NLS는 식: (K/R) (K/R) X10-12(K/R)3-5을 갖는다. 일부 경우에, NLS는 식:K(K/R)X(K/R)을 갖는다.
일부 구현예에서 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 또는 그 초과) NLS를 포함한다. 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드는 히스톤 단백질 또는 히스톤 단편이 아니다 (예를 들어, HTP가 아님). 따라서, 일부 경우에 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 양이온성 폴리펩타이드는 NLS-함유 펩타이드이다.
일부 경우에, NLS-함유 펩타이드는 양이온성 (또는 일부 경우에 음이온성) 아미노산 폴리머, 링커, HTP에 대한 히스톤 단백질, 및/또는 다른 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 일부 경우에 분지형 히스톤 구조의 일부로서)에 대한 콘주게이션을 촉진할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학반응을 통해 가교결합 (콘주게이션)을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에 시스테인 잔기는 내부에 있다. 일부 경우에 시스테인 잔기는 N-말단 및/또는 C-말단에 배치된다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩타이드 조성물의 NLS-함유 펩타이드는 시스테인 잔기를 부가하는 돌연변이 (예를 들어, 야생형 아미노산 서열에 비교하여) (예를 들어, 삽입 또는 치환)를 포함한다.
NLS-함유 펩타이드로서 사용될 수 있는 (또는 임의의 편리한 양이온성 폴리펩타이드 예컨대 HTP 또는 양이온성 폴리머 또는 양이온성 아미노산 폴리머 또는 음이온성 아미노산 폴리머에 접합된) NLS의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다 (그의 일부는 시스테인 잔기를 포함한다):
PKKKRKV (서열번호:151) (T-ag NLS)
PKKKRKVEDPYC (서열번호:152) - SV40 T-Ag-유래된 NLS
PKKKRKVGPKKKRKVGPKKKRKVGPKKKRKVGC (서열번호:153) (NLS SV40)
CYGRKKRRQRRR (서열번호:154) - 시스테인-TAT의 N-말단 시스테인
CSIPPEVKFNKPFVYLI (서열번호:155)
DRQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호:156)
PKKKRKVEDPYC (서열번호:157) - SV40 T-Ag-유래된 NLS의 C-말단 시스테인
PAAKRVKLD (서열번호:158) [cMyc NLS]
사용될 수 있는 NLS의 비-제한적인 예에 대해, 예를 들어, 문헌 [Kosugi al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85]을 참고하고, 예를 들어, 본 개시내용의 도 16을 참고한다.
미토콘드리아 국재화 신호
일부 구현예에서 대상체 나노입자의 양이온성 폴리펩타이드 (예를 들어, 히스톤 또는 HTP, 예를 들어, H1, H2, H2A, H2AX, H2B, H3, 또는 H4), 음이온성 폴리머, 및/또는 양이온성 폴리머는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 또는 그 초과) 미토콘드리아 국재화 서열을 포함한다 (및/또는 여기에 접합된다). 임의의 편리한 미토콘드리아 국재화 서열이 사용될 수 있다. 미토콘드리아 국재화 서열의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: PEDEIWLPEPESVDVPAKPISTSSMMMP (서열번호: 149), SDHB의 미토콘드리아 국재화 서열, 모노/디/트리페닐포스포늄 또는 다른 포스포늄, VAMP 1A, VAMP 1B, DGAT2의 67 N-말단 아미노산, 및 Bax의 20 N-말단 아미노산.
적재물
본 개시내용의 나노입자는 핵산 및/또는 단백질로 구성될 수 있는 적재물을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 대상체 나노입자는 핵산 적재물 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA)을 전달하기 위해 사용된다. 핵산 적재물은 관심 있는 임의의 핵산일 수 있고, 예를 들어, 핵산 적재물은 선형 또는 원형일 수 있고, 그리고 플라스미드, 바이러스 게놈, RNA (예를 들어, 코딩 RNA 예컨대 mRNA 또는 비-코딩 RNA 예컨대 가이드 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 및 기타 동종의 것), DNA, 등일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 적재물은 RNAi 제제(예를 들어, shRNA, siRNA, miRNA, 등) 또는 RNAi 제제를 인코딩하는 DNA 템플레이트이다. 일부 경우에, 핵산 적재물은 siRNA 분자 (예를 들어, mRNA를 표적화하는 것, miRNA를 표적화하는 것)이다. 일부 경우에, 핵산 적재물은 LNA 분자 (예를 들어, miRNA를 표적화하는 것)이다. 일부 경우에, 핵산 적재물은 miRNA이다. 일부 경우에 핵산 적재물은 관심 있는 단백질 (예를 들어, 하나 이상의 재프로그래밍 및/또는 전환분화 인자 예컨대 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, 및 Lin28, 예를 들어, 단독으로 또는 임의의 원하는 조합으로 예컨대 (i) Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc; (ii) Oct4, Sox2, Nanog, 및 Lin28; 등; 유전자 편집 엔도뉴클레아제; 치료적 단백질; 등)을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 경우에 핵산 적재물은 비-코딩 RNA (예를 들어, RNAi 제제, CRISPR/Cas 가이드 RNA, 등) 및/또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 DNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서 핵산 적재물은 IL2Rα 및 IL12Rγ (예를 들어, 표적 세포의 행동 또는 생존을 조정하기 위함)를 인코딩하는 핵산 (DNA 및/또는 mRNA)을 포함하고, 일부 경우에 적재물은 7-90일 (예를 들어, 7-80, 7-60, 7-50, 7-40, 7-35, 또는 7-30일)의 과정에 걸쳐서 대상체 나노입자로부터 세포내에서 방출된다. 일부 구현예에서 핵산 적재물은 (예를 들어, Fas 또는 TNFα 수용체의 참여에 기인하여 표적 세포의 세포자멸사를 예방하기 위해) BCL-XL을 인코딩하는 핵산 (DNA 및/또는 mRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서 핵산 적재물은 (예를 들어, 표적화된 T-세포에서 면역 효과기 표현형을 증진하기 위해) Foxp3을 인코딩하는 핵산 (DNA 및/또는 mRNA)을 포함한다. 일부 구현예에서 핵산 적재물은 SCF를 인코딩하는 핵산 (DNA 및/또는 mRNA)을 포함한다. 일부 구현예에서 핵산 적재물은 HoxB4를 인코딩하는 핵산 (DNA 및/또는 mRNA)을 포함한다. 일부 구현예에서 핵산 적재물은 SIRT6을 인코딩하는 핵산 (DNA 및/또는 mRNA)을 포함한다. 일부 구현예에서 핵산 적재물은 마이크로RNA 예컨대 miR-155 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000681 및 MI0000177 참고)를 표적화하는 (의 발현을 감소시키는) 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, LNA, 등)를 포함한다. 일부 구현예에서 핵산 적재물은 ku70을 표적화하는 siRNA 및/또는 ku80을 표적화하는 siRNA를 포함한다.
용어 "핵산 적재물"은 변형된 핵산을 포괄한다. 마찬가지로, 용어들 "RNAi 제제" 및 "siRNA"는 변형된 핵산을 포괄한다. 예를 들어, 핵산 분자는 모방체일 수 있고, 변형된 당 백본, 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드간 연결기 (예를 들어, 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 헤테로원자 뉴클레오사이드간 연결기), 하나 이상의 변형된 염기, 및 기타 동종의 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체 적재물은 삼중-형성 펩타이드 핵산 (PNA)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [McNeer et al., Gene Ther. 2013 Jun;20(6):658-69] 참고). 따라서, 일부 경우에 대상체 코어는 PNA를 포함한다. 일부 경우에 대상체 코어는 PNA 및 DNA를 포함한다.
대상체 핵산 적재물 (예를 들어, siRNA)은 모폴리노 백본 구조를 가질 수 있다. 일부 경우에, 대상체 핵산 적재물 (예를 들어, siRNA)은 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA)을 가질 수 있다. 적합한 당 치환체 군은 메톡시 (-O-CH3), 아미노프로폭시 (--O CH2 CH2 CH2NH2), 알릴 (-CH2-CH=CH2), -O-알릴 (--O-- CH2―CH=CH2) 및 플루오로 (F)를 포함한다. 2'-당 치환체 군은 아라비노 (업) 위치 또는 리보 (다운) 위치에 있을 수 있다. 적합한 염기 변형은 합성 및 천연 핵 염기 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 피리미딘 염기의 5-프로피닐 (-C=C-CH3) 우라실 및 시토신 및 다른 알키닐 유도체, 6-아조우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 변형된 핵 염기는 삼환형 피리미딘 예컨대 펜옥사진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프 예컨대 치환된 펜옥사진 시티딘 (예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-(b) (1,4)벤즈옥사진-2(3H)-온), 카바졸 시티딘 (2H-피리미도(4,5-b)인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도(3',2':4,5)피롤로(2,3-d)피리미딘-2-온)을 포함한다.
일부 경우에, 핵산 적재물은 콘주게이트 모이어티 (예를 들어, 핵산 적재물의 활성, 안정성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 고양하는 것)를 포함할 수 있다. 이들 모이어티 또는 콘주게이트는 작용기 예컨대 일차 또는 이차 하이드록실기에 공유결합된 콘주게이트 기를 포함할 수 있다. 콘주게이트기는, 비제한적으로, 삽입제, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학적 특성을 고양하는 기, 및 올리고머의 약동학적 특성을 고양하는 기를 포함한다. 적합한 콘주게이트기는, 비제한적으로, 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 펜아진, 폴레이트, 펜안트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료를 포함한다. 약력학적 특성을 고양하는 기는 흡수를 개선하고, 열화에 대한 저항을 고양하고, 및/또는 표적 핵산과 서열-특이적 하이브리드화를 강화하는 기를 포함한다. 약동학적 특성을 고양하는 기는 대상체 핵산의 흡수, 분포, 대사 또는 배출을 개선하는 기를 포함한다.
임의의 편리한 폴리뉴클레오타이드가 대상체 핵산 적재물로서 사용될 수 있다. 그 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: mRNA, m1A 변형된 mRNA (아데노신의 위치 1에서 모노메틸화), siRNA, miRNA, 압타머, shRNA, AAV-유래된 핵산 및 스캐폴드, 모폴리노 RNA, 펩토이드 및 펩타이드 핵산, cDNA, DNA 오리가미를 포함한 RNA 및 DNA의 종, 합성 뉴클레오타이드를 갖는 DNA 및 RNA, 사전 규정된 이차 구조를 갖는 DNA 및 RNA, 상기 언급된 것의 다량체 및 올리고머, 및 그 서열이 다른 생성물 예컨대 임의의 단백질을 인코딩할 수 있는 적재물 또는 그 발현이 요구되는 폴리펩타이드.
일부 경우에 대상체 나노입자의 적재물은 단백질을 포함한다. 단백질 적재물의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질 (예를 들어, 전사 활성제-유사 (TAL) 효과기 (TALE), TALE 뉴클레아제 (TALEN), 아연-핑거 단백질 (ZFP), 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), DNA-유도된 폴리펩타이드 예컨대 나트로노박테리움 그레고리　아르고노트 (NgAgo), CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 예컨대 Cas9, CasX, CasY, Cpf1, 및 기타 동종의 것); 트랜스포존 (예를 들어, 부류 I 또는 부류 II 트랜스포존 - 예를 들어, 피기백, 슬리핑 뷰티, Tc1/매리너, Tol2, PIF/하빙거, hAT, 뮤테이터, 트랜십, 헬리트론, 매버릭, 프로그 프린스, 미노스, Himar1 및 기타 동종의 것); 메가뉴클레아제 (예를 들어, I-SceI, I-CeuI, I-CreI, I-DmoI, I-ChuI, I-DirI, I-FlmuI, I-FlmuII, I-Anil, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII,　I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-MsoI, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, PI-MleI, PI-MtuI, PI-PspI, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-SceV, 및 기타 동종의 것); megaTAL (예를 들어, 문헌 [Boissel et al., Nucleic Acids Res. 2014 Feb; 42(4): 2591-2601] 참고); SCF; BCL-XL; Foxp3; HoxB4; 및 SiRT6. 임의의 상기 단백질에 대해, 대상체 나노입자의 적재물은 단백질을 인코딩하는 핵산 (DNA 및/또는 mRNA)을 포함할 수 있고, 및/또는 실제 단백질을 포함할 수 있다.
유전자 편집 도구
일부 경우에, 핵산 적재물은 유전자 편집 도구 (즉, 유전자 편집 시스템, 예를 들어, 부위 특이적 유전자 편집 시스템 예컨대 프로그래밍가능한 유전자 편집 시스템의 성분)를 포함하거나 또는 인코딩한다. 예를 들어, 핵산 적재물은 하기의 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i)　CRISPR/Cas 가이드 RNA, (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA, (iii) 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질 예컨대 아연 핑거 단백질 (ZFP) (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 - ZFN), 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제에 융합된 것 - TALEN), DNA-유도된 폴리펩타이드 예컨대 나트로노박테리움 그레고리　아르고노트 (NgAgo), 및/또는 CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, 및 기타 동종의 것)를 인코딩하는 DNA 및/또는 RNA; (iv) DNA 공여체 템플레이트; (v) 부위-특이적인 재조합효소 (예를 들어, Cre 재조합효소, Dre 재조합효소, Flp 재조합효소, KD 재조합효소, B2 재조합효소, B3 재조합효소, R 재조합효소, Hin 재조합효소, Tre 재조합효소, PhiC31 인테그라제, Bxb1 인테그라제, R4 인테그라제, 람다 인테그라제, HK022 인테그라제, HP1 인테그라제, 및 기타 동종의 것)을 인코딩하는 핵산 분자 (DNA, RNA); (vi) 레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta, 및 기타 동종의 것)를 인코딩하는 DNA; 및 (vii) 트랜스포존 및/또는 트랜스포존으로부터 유래된 DNA (예를 들어, 박테리아 트랜스포존 예컨대 Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, Tn10, Tn903, Tn1681, 및 기타 동종의 것; 진핵 트랜스포존 예컨대 Tc1/마리너 수퍼패밀리 트랜스포존, 피기백 상과 트랜스포존, hAT 상과 트랜스포존, 피기백, 슬리핑 뷰티, 프로그 프린스, 미노스, Himar1, 및 기타 동종의 것). 일부 경우에 대상체 나노입자는 단백질 적재물, 예를 들어, 유전자 편집 단백질 예컨대 ZFP (예를 들어, ZFN), TALE (예를 들어, TALEN), DNA-유도된 폴리펩타이드 예컨대 나트로노박테리움 그레고리　아르고노트 (NgAgo), CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, 및 기타 동종의 것), 부위-특이적인 재조합효소 (예를 들어, Cre 재조합효소, Dre 재조합효소, Flp 재조합효소, KD 재조합효소, B2 재조합효소, B3 재조합효소, R 재조합효소, Hin 재조합효소, Tre 재조합효소, PhiC31 인테그라제, Bxb1 인테그라제, R4 인테그라제, 람다 인테그라제, HK022 인테그라제, HP1 인테그라제, 및 기타 동종의 것), 레솔바제 / 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta, 및 기타 동종의 것); 및/또는 전위효소 (예를 들어, 트랜스포존 예컨대 박테리아 트랜스포존에 관련된 전위효소 예컨대 Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, Tn10, Tn903, Tn1681, 및 기타 동종의 것; 또는 진핵 트랜스포존 예컨대 Tc1/마리너 수퍼패밀리 트랜스포존, 피기백 상과 트랜스포존, hAT 상과 트랜스포존, 피기백, 슬리핑 뷰티, 프로그 프린스, 미노스, Himar1, 및 기타 동종의 것)를 전달하기 위해 사용된다. 일부 경우에, 나노입자는 핵산 적재물 및 단백질 적재물을 전달하기 위해 사용되고, 그리고 일부 이러한 사례에서 본 적재물은 리보핵단백질 복합체 (RNP)를 포함한다.
시스템의 특성과 원하는 결과에 의존하여, 유전자 편집 시스템 (예를 들어 부위 특이적 유전자 편집 시스템 예컨대 프로그래밍가능한 유전자 편집 시스템)은 단일 성분 (예를 들어, ZFP, ZFN, TALE, TALEN, 부위-특이적인 재조합효소, 레솔바제 / 인테그라제, 트랜스포스, 트랜스포존, 및 기타 동종의 것)을 포함할 수 있거나 또는 다중 성분을 포함할 수 있다. 일부 경우에 유전자 편집 시스템은 적어도 2가지 성분을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그래밍가능한 유전자 편집 시스템)은 하기를 포함한다: (i) 공여체 템플레이트 핵산; 및 (ii) 유전자 편집 단백질 (예를 들어, 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질 예컨대 ZFP, ZFN, TALE, TALEN, DNA-유도된 폴리펩타이드 예컨대 나트로노박테리움 그레고리　아르고노트 (NgAgo), CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 예컨대 Cas9, CasX, CasY, 또는 Cpf1, 및 기타 동종의 것), 또는 유전자 편집 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 예컨대 플라스미드 또는 mRNA). 또 다른 예로서, 일부 경우에 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그래밍가능한 유전자 편집 시스템)은 하기를 포함한다: (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA, 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA; 및 (ii) CRISPR/CAS RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, 및 기타 동종의 것), 또는 RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 예컨대 플라스미드 또는 mRNA). 또 다른 예로서, 일부 경우에 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그래밍가능한 유전자 편집 시스템)은 하기를 포함한다: (i) NgAgo-유사 가이드 DNA; 및 (ii) DNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, NgAgo), 또는 DNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 예컨대 플라스미드 또는 mRNA). 일부 경우에 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그래밍가능한 유전자 편집 시스템)은 하기의 적어도 세 성분을 포함한다: (i) 공여체 DNA 템플레이트; (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA, 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA; 및 (iii) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, 또는 Cpf1), 또는 RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 예컨대 플라스미드 또는 mRNA). 일부 경우에 유전자 편집 시스템 (예를 들어 프로그래밍가능한 유전자 편집 시스템)은 하기의 적어도 세 성분을 포함한다: (i) 공여체 DNA 템플레이트; (ii) NgAgo-유사 가이드 DNA, 또는 NgAgo-유사 가이드 DNA를 인코딩하는 DNA; 및 (iii) DNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, NgAgo), 또는 DNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 예컨대 플라스미드 또는 mRNA).
일부 구현예에서, 대상체 나노입자는 유전자 편집 도구를 전달하기 위해 사용된다. 환언하면 일부 경우에 적재물은 하나 이상의 유전자 편집 도구를 포함한다. 용어 "유전자 편집 도구"는 본 명세서에서 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 지칭하기 위해 사용된다. 따라서, 일부 경우에 적재물은 유전자 편집 시스템을 포함하고 일부 경우에 적재물은 유전자 편집 시스템 중 하나 이상의 성분 (즉, 하나 이상의 유전자 편집 도구)을 포함한다. 예를 들어, 표적 세포는 유전자 편집 시스템의 성분 중 하나를 이미 포함할 수 있고 사용자는 단지 나머지 성분을 부가할 필요가 있다. 그와 같은 경우에 대상체 나노입자의 적재물은 주어진 유전자 편집 시스템의 모든 성분을 반드시 포함하지는 않는다. 이와 같이, 일부 경우에 적재물은 하나 이상의 유전자 편집 도구를 포함한다.
예시로서, 표적 세포는 유전자 편집 단백질 (예를 들어, ZFP, TALE, DNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, NgAgo), CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 예컨대 Cas9, CasX, CasY, Cpf1, 및 동종의 것, 부위-특이적인 재조합효소 예컨대 Cre 재조합효소, Dre 재조합효소, Flp 재조합효소, KD 재조합효소, B2 재조합효소, B3 재조합효소, R 재조합효소, Hin 재조합효소, Tre 재조합효소, PhiC31 인테그라제, Bxb1 인테그라제, R4 인테그라제, 람다 인테그라제, HK022 인테그라제, HP1 인테그라제, 및 동종의 것, 레솔바제 / 인버타제 예컨대 Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta, 및 동종의 것, 전위효소, 등) 및/또는 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA를 이미 포함할 수 있고, 따라서 적재물은 하기의 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 공여체 템플레이트; 및 (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA, 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA; 또는 NgAgo-유사 가이드 DNA. 마찬가지로, 표적 세포는 CRISPR/Cas 가이드 RNA 및/또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 또는 NgAgo-유사 가이드 DNA를 이미 포함할 수 있고 그리고 적재물은 하기의 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 공여체 템플레이트; 및 (ii) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1, 및 기타 동종의 것), 또는 RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 예컨대 플라스미드 또는 mRNA); 또는 DNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, NgAgo), 또는 DNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되어 지는 바와 같이, 유전자 편집 시스템은 핵산을 '편집하는' 시스템일 필요는 없다. 예를 들어, 유전자 편집 시스템은 표적 DNA 내에 이중 가닥 절단 (DSB)을 생성함이 없이 다양한 방식으로 표적 핵산 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA)을 변형하기 위해 사용될 수 있다는 것이 잘 인식된다. 예를 들어, 일부 경우에 이중 가닥 표적 DNA는 새김 눈 표시되고 (하나의 가닥이 절단되고), 그리고 일부 경우에 (예를 들어, 유전자 편집 단백질이 뉴클레아제 활성을 결여하는 경우, 예를 들어, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드가 촉매적 뉴클레아제도메인에서 돌연변이를 품을 수 있는 일부 경우에), 표적 핵산은 전혀 절단되지 않는다. 예를 들어, 일부 경우에 뉴클레아제 활성이 있거나 또는 없는 CRISPR/Cas 단백질 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)은 이종성 단백질 도메인에 융합된다. 이종성 단백질 도메인은 융합 단백질에 하기와 같은 활성을 제공할 수 있다: (i) DNA-변형시키는 활성 (예를 들어, 뉴클레아제 활성, 메틸전달효소 활성, 탈메틸효소 활성, DNA 회복 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 전위효소 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 포토리아제 활성 또는 글리코실라제 활성), (ii) 전사 조절 활성 (예를 들어, 전사 억제 인자 또는 활성제에 융합),또는 (iii) 표적 DNA와 연관된 단백질 (예를 들어, 히스톤)을 변형하는 활성 (예를 들어, 메틸전달효소 활성, 탈메틸효소 활성, 아세틸전달효소 활성, 탈아세틸화효소 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화 활성, 탈수모일화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성). 이와 같이, 유전자 편집 시스템은 표적 핵산을 단리하지 않는 방식으로 표적 핵산을 변형하는 적용에 사용될 수 있고, 또한 표적 DNA로부터 전사를 조정하는 적용에 사용될 수 있다.
프로그래밍가능한 유전자 편집 도구 (예를 들어, CRISPR/Cas RNa-유도된 단백질 예컨대 Cas9, CasX, CasY, 및 Cpf1, 아연 핑거 단백질 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제, TALE 단백질 예컨대 TALEN, CRISPR/Cas 가이드 RNA, 및 기타 동종의 것)에 관련된 추가의 정보에 대해서, 예를 들어, 하기 문헌들 [Dreier, et al., (2001) J Biol Chem 276:29466-78; Dreier, et al., (2000) J Mol Biol 303:489-502; Liu, et al., (2002) J Biol Chem 277:3850-6); Dreier, et al., (2005) J Biol Chem 280:35588-97; Jamieson, et al., (2003) Nature Rev Drug Discov 2:361-8; Durai, et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:5978-90; Segal, (2002) Methods 26:76-83; Porteus and Carroll, (2005) Nat Biotechnol 23:967-73; Pabo, et al., (2001) Ann Rev Biochem 70:313-40; Wolfe, et al., (2000) Ann Rev Biophys Biomol Struct 29:183-212; Segal and Barbas, (2001) Curr Opin Biotechnol 12:632-7; Segal, et al., (2003) Biochemistry 42:2137-48; Beerli and Barbas, (2002) Nat Biotechnol 20:135-41; Carroll, et al., (2006) Nature Protocols 1:1329; Ordiz, et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13290-5; Guan, et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13296-301; Sanjana et al., Nature Protocols, 7:171-192 (2012); Zetsche et al, Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71; Makarova et al, Nat Rev Microbiol. 2015 Nov;13(11):722-36; Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97; Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Chylinski et al., RNA Biol. 2013 May;10(5):726-37; Ma et al., Biomed Res Int. 2013;2013:270805; Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Jinek et al., Elife. 2013;2:e00471; Pattanayak et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):839-43; Qi et al, Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83; Wang et al., Cell. 2013 May 9;153(4):910-8; Auer et. al., Genome Res. 2013 Oct 31; Chen et. al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e19; Cheng et. al., Cell Res. 2013 Oct;23(10):1163-71; Cho et. al., Genetics. 2013 Nov; 195(3):1177-80; DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(7):4336-43; Dickinson et. al., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1028-34; Ebina et. al., Sci Rep. 2013;3:2510; Fujii et. al, Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e187; Hu et. al., Cell Res. 2013 Nov;23(11):1322-5; Jiang et. al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e188; Larson et. al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2180-96; Mali et. at., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63; Nakayama et. al., Genesis.　2013　Dec;51(12):835-43; Ran et. al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2281-308; Ran et. al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9; Upadhyay et. al., G3 (Bethesda).　2013 Dec 9;3(12):2233-8; Walsh et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15514-5; Xie et. al., Mol Plant. 2013 Oct 9; Yang et. al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1370-9; Briner et al., Mol Cell. 2014 Oct 23;56(2):333-9; Burstein et al., Nature. 2016 Dec 22 - Epub ahead of print; Gao et al., Nat Biotechnol. 2016 Jul 34(7):768-73]뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호 WO2002099084; WO00/42219; WO02/42459; WO2003062455; WO03/080809; WO05/014791; WO05/084190; WO08/021207; WO09/042186; WO09/054985; 및 WO10/065123; 미국 특허 출원 공개 번호 20030059767, 20030108880, 20140068797; 20140170753; 20140179006; 20140179770; 20140186843; 20140186919; 20140186958; 20140189896; 20140227787; 20140234972; 20140242664; 20140242699; 20140242700; 20140242702; 20140248702; 20140256046; 20140273037; 20140273226; 20140273230; 20140273231; 20140273232; 20140273233; 20140273234; 20140273235; 20140287938; 20140295556; 20140295557; 20140298547; 20140304853; 20140309487; 20140310828; 20140310830; 20140315985; 20140335063; 20140335620; 20140342456; 20140342457; 20140342458; 20140349400; 20140349405; 20140356867; 20140356956; 20140356958; 20140356959; 20140357523; 20140357530; 20140364333; 20140377868; 20150166983; 및 20160208243; 및 미국 특허 번호 6,140,466; 6,511,808; 6,453,242 8,685,737; 8,906,616; 8,895,308; 8,889,418; 8,889,356; 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 및 8,697,359를 언급하고; 이들 모두는 이로써 전체적으로 참고로 편입된다.
일부 구현예에서, 1 초과 적재물이 동일한 패키지 (예를 들어, 나노입자)의 일부로서 전달되고, 예를 들어, 일부 경우에 상이한 적재물은 상이한 코어의 일부이다. 동일한 패키지 (예를 들어, 나노입자)의 일부로서 다중 적재물을 전달하는 하나의 이점은 각각의 적재물의 효율이 희석되지 않는다는 것이다. 예시로서, 적재물 A 및 적재물 B가 2개의 별개의 패키지 (각각 패키지 A 및 패키지 B)에 전달되는 경우, 효율성은 배가되고, 예를 들어, 패키지 A 및 패키지 B 각각이 1% 형질감염 효율을 가지는 경우, 동일한 세포에 적재물 A 및 적재물 B를 전달할 기회는 0.01% (1% X 1%)이다. 그러나, 적재물 A 및 적재물 B 둘 모두가 동일한 패키지의 일부로 전달되는 경우 (예를 들어, 동일한 나노입자의 일부 - 패키지 A), 동일한 세포에 적재물 A 및 적재물 B를 전달할 기회는 0.01%보다 100-배 개선인 1%이다.
마찬가지로, 패키지 A 및 패키지 B 각각이 0.1% 형질감염 효율을 갖는 시나리오에서, 동일한 세포에 적재물 A 및 적재물 B를 전달할 기회는 0.0001% (0.1% X 0.1%)이다. 그러나, 적재물 A 및 적재물 B 둘 모두가 이 시나리오에서 동일한 패키지의 일부로 전달되는 경우 (예를 들어, 동일한 나노입자의 일부 - 패키지 A), 동일한 세포에 적재물 A 및 적재물 B를 전달할 기회는 0.0001%보다 1000-배 개선인 0.1%이다.
이와 같이, 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 것)는 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 게놈 편집 효율을 증가시키는 비-코딩 RNA와 조합하여 (예를 들어, 동일한 나노입자의 일부로) 전달된다. 일부 경우에, 하나 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 것)는 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 세포 분열 및/또는 분화를 조절하는 비-코딩 RNA와 조합하여 (예를 들어, 동일한 나노입자의 일부로) 전달된다. 일부 경우에, 하나 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 것)는 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 또는 상동성 지향된 회복 (HDR)을 향해 세포 DNA 회복 기구를 편향시키는 비-코딩 RNA와 조합하여 (예를 들어, 동일한 나노입자의 일부로) 전달된다.
상기의 비-제한적인 예로서, 일부 구현예에서 하나 이상의 유전자 편집 도구는 하기의 것 중 하나 이상과 조합하여 전달될 수 있다: SCF (및/또는 SCF를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA), HoxB4 (및/또는 HoxB4를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA), BCL-XL (및/또는 BCL-XL을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA), SIRT6 (및/또는 SIRT6을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA), miR-155를 억제하는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA 및/또는 LNA), ku70 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA), 및 ku80 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA).
유전자 편집 도구와 조합하여 전달될 수 있는 마이크로RNA의 예에 대해, 도 18A를 참고한다. 예를 들어, 하기 목적을 위해 하기 마이크로RNA가 사용될 수 있다: 외배엽 계열을 향한 만능 줄기 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-430/427/302 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000738, MI0000772, MI0000773, MI0000774, MI0006417, MI0006418, MI0000402, MI0003716, MI0003717, 및 MI0003718 참고); 내배엽 계열을 향한 만능 줄기 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-109 및/또는 miR-24 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000080, MI0000081, MI0000231, 및 MI0000572 참고); 내배엽 계열을 향한 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-122 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000442 및 MI0000256 참고) 및/또는 miR-192 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000234 및 MI0000551 참고); 각질형성 세포 운명을 향한 외배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-203 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000283, MI0017343,및 MI0000246 참고); 평활근 운명을 향한 신경능 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-145 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000461, MI0000169, 및 MI0021890 참고); 신경교세포 운명 및/또는 뉴런 운명을 향한 신경 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-9 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000466, MI0000467, MI0000468, MI0000157, MI0000720, 및 MI0000721 참고) 및/또는 miR-124a (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000443, MI0000444, MI0000445, MI0000150, MI0000716, 및 MI0000717 참고); 연골 세포 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-199a (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000242, MI0000281, MI0000241, 및 MI0000713 참고); 골아세포 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-296 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000747 및 MI0000394 참고) 및/또는 miR-2861 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0013006 및 MI0013007 참고); 심장근육 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-1 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000437, MI0000651, MI0000139, MI0000652, MI0006283 참고); 심장근육 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-133 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000450, MI0000451, MI0000822, MI0000159, MI0000820, MI0000821, 및 MI0021863 참고); 골격근육 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-214 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000290 및 MI0000698 참고), miR-206 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000490 및 MI0000249 참고), miR-1 및/또는 miR-26a (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000083, MI0000750, MI0000573, 및 MI0000706 참고); 골격근육 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-133 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000450, MI0000451, MI0000822, MI0000159, MI0000820, MI0000821, 및 MI0021863 참고), miR-221 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000298 및 MI0000709 참고), 및/또는 miR-222 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000299 및 MI0000710 참고); 분화를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-223 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000300 및 MI0000703 참고); 분화를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-128a (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000447 및 MI0000155 참고) 및/또는 miR-181a (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000269, MI0000289, MI0000223, 및 MI0000697 참고); 림프양 선조세포를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-181 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000269, MI0000270, MI0000271, MI0000289, MI0000683, MI0003139, MI0000223, MI0000723, MI0000697, MI0000724, MI0000823, 및 MI0005450 참고); 림프양 선조세포를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-146 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000477, MI0003129, MI0003782, MI0000170, 및 MI0004665 참고); 골수전구세포를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-155, miR-24a, 및/또는 miR-17 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000071 및 MI0000687 참고); T 세포 운명을 향한 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-150 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000479 및 MI0000172 참고); 과립구 운명을 향한 골수전구세포의 분화를 차단하기 위해: miR-223 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000300 및 MI0000703 참고); 단핵구 운명을 향한 골수전구세포의 분화를 차단하기 위해: miR-17-5p (예를 들어, MiR 염기 기탁: MIMAT0000070 및 MIMAT0000649 참고), miR-20a (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000076 및 MI0000568 참고), 및/또는 miR-106a (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000113 및 MI0000406 참고); 적혈구 운명을 향한 골수전구세포의 분화를 차단하기 위해: miR-150 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000479 및 MI0000172 참고), miR-155, miR-221 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000298 및 MI0000709 참고), 및/또는 miR-222 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000299 및 MI0000710 참고); 및 적혈구 운명을 향한 골수전구세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-451 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0001729, MI0017360, MI0001730, 및 MI0021960 참고) 및/또는 miR-16 (예를 들어, MiR 염기 기탁: MI0000070, MI0000115, MI0000565, 및 MI0000566 참고).
유전자 편집 도구와 조합하여 (예를 들어, 단백질로 또는 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA로) 전달될 수 있는 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)의 예에 대해 도 18B를 참고로 한다. 동일한 단백질이, 예를 들어, 나노입자를 수용하는 표적 세포에서 분화를 편향되게 할 목적으로, 표적화 리간드와 유사한 방식으로 대상체 나노입자의 외부 쉘의 일부로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 목적을 위해 하기 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)이 사용될 수 있다: 공통 림프양 선조세포 계통을 향한 조혈 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-7 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3574 참고); 공통 골수전구세포 계통을 향한 조혈 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-3 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3562 참고), GM-CSF (예를 들어, NCBI 유전자 ID1437 참고), 및/또는 M-CSF (예를 들어, NCBI 유전자 ID1435 참고); B-세포 운명을 향한 공통 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-3, IL-4 (예를 들어, NCBI 유전자 ID: 3565 참고), 및/또는 IL-7; 천연 살해 세포 운명을 향한 공통 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-15 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3600 참고); T-세포 운명을 향한 공통 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-2 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3558 참고), IL-7, 및/또는 Notch (예를 들어, NCBI 유전자 IDs 4851, 4853, 4854, 4855 참고); 수지상 세포 운명을 향한 공통 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: Flt-3 리간드 (예를 들어, NCBI 유전자 ID2323 참고); 수지상 세포 운명을 향한 공통 골수전구세포의 분화를 촉진하기 위해: Flt-3 리간드, GM-CSF, 및/또는 TNF-알파 (예를 들어, NCBI 유전자 ID7124 참고); 과립구-대식세포 선조 세포 계통을 향한 공통 골수전구세포의 분화를 촉진하기 위해: GM-CSF; 거핵구-적혈구 선조 세포 계통을 향한 공통 골수전구세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-3, SCF (예를 들어, NCBI 유전자 ID4254 참고), 및/또는 Tpo (예를 들어, NCBI 유전자 ID7173 참고); 거핵구 운명을 향한 거핵구-적혈구 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-3, IL-6 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3569 참고), SCF, 및/또는 Tpo; 적혈구 운명을 향한 거핵구-적혈구 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: 에리트로포이에틴 (예를 들어, NCBI 유전자 ID2056 참고); 혈소판 운명을 향한 거핵구의 분화를 촉진하기 위해: IL-11 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3589 참고) 및/또는 Tpo; 단핵구 계열을 향한 과립구-대식세포 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: GM-CSF 및/또는 M-CSF; 골수아세포 계열을 향한 과립구-대식세포 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: GM-CSF; 단핵구-유래된 수지상 세포 운명을 향한 단핵구의 분화를 촉진하기 위해: Flt-3 리간드, GM-CSF, IFN-알파 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3439 참고), 및/또는 IL-4; 대식세포 운명을 향한 단핵구의 분화를 촉진하기 위해: IFN-감마, IL-6, IL-10 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3586 참고), 및/또는 M-CSF; 중성구 운명을 향한 골수아세포의 분화를 촉진하기 위해: G-CSF (예를 들어, NCBI 유전자 ID1440 참고), GM-CSF, IL-6, 및/또는 SCF; 호산구 운명을 향한 골수아세포의 분화를 촉진하기 위해: GM-CSF, IL-3, 및/또는 IL-5 (예를 들어, NCBI 유전자 ID3567 참고); 및 호염기구 운명을 향한 골수아세포의 분화를 촉진하기 위해: G-CSF, GM-CSF, 및/또는 IL-3.
유전자 편집 도구와 조합하여 (예를 들어, 단백질로 또는 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA로) 전달될 수 있는 단백질의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: SOX17, HEX, OSKM (Oct4/Sox2/Klf4/c-myc), 및/또는 bFGF (예를 들어, 간줄기 세포 계통을 향한 분화를 촉진하기 위함); HNF4a (예를 들어, 간세포 운명을 향한 분화를 촉진하기 위함); Poly (I:C), BMP-4, bFGF, 및/또는 8-Br-cAMP (예를 들어, 내피 줄기 세포/선조 계열을 향한 분화를 촉진하기 위함); VEGF (예를 들어, 동맥 내피 운명을 향한 분화를 촉진하기 위함); Sox-2, Brn4, Myt1l, Neurod2, Ascl1 (예를 들어, 신경 줄기 세포/선조 계열을 향한 분화를 촉진하기 위함); 및 BDNF, FCS, 포르스콜린, 및/또는 SHH (예를 들어, 분화 뉴런, 별아교세포, 및/또는 희소돌기교세포 운명을 촉진하기 위함).
유전자 편집 도구와 조합하여 (예를 들어, 단백질 및/또는 핵산 예컨대 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA로) 전달될 수 있는 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 사이토카인 (예를 들어, IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, CD8+ T-세포를 활성화하기 위함); Notch, Wnt, 및/또는 Smad 신호전달 경로 중 하나 이상을 조정하는 리간드 및 또는 신호전달 단백질; SCF; 줄기세포 분화하는 인자 (예를 들어 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, c-Myc, 및 기타 동종의 것); 및 후속적인 단리/정제/농도를 위한 일시적 표면 마커 "태그" 및/또는 형광 리포터. 예를 들어, 섬유모세포는 Sox2의 전달을 통해 신경 줄기 세포로 전환될 수 있는 반면, 이것은 Oct3/4 및 소분자 "후성유전적 재설정 인자"의 존재에서 심근 세포로 전환할 것이다. 헌팅턴병 또는 CXCR4 돌연변이가 있는 환자에 있어서, 이들 섬유모세포는 각각 뉴런 및 심장 세포와 연관된 이환 표현형 특성을 인코딩할 수 있다. 단일 패키지에 유전자 편집 정정 및 이들 인자를 전달함에 의해, 도입되어 지는 모든 인자/적재물이 아닌 하나 이상에 기인한 유해한 효과의 위험이 상당히 감소될 수 있다.
적재물 방출의 타이밍 및/또는 위치가 제어될 수 있기 때문에 (본 개시내용에서 다른 곳에 더 상세히 기재됨), 동일한 패키지 (예를 들어, 동일한 나노입자)에 다중 적재물의 패키징은 상이한 적재물에 대해 상이한 방출 시간 및/또는 위치를 달성하는 것을 방해하지 않는다. 예를 들어 상기 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-코딩 RNA의 방출은 동일한 패키지의 일부인 하나 이상의 유전자 편집 도구의 방출과 별도로 제어될 수 있다. 예를 들어, 세포 증식 및/또는 분화를 조절하거나, 또는 NHEJ 또는 HDR을 향한 편향을 조절하는 단백질 및/또는 핵산 (예를 들어, DNA, mRNA, 비-코딩 RNA, miRNA)은 하나 이상의 유전자 편집 도구 보다 조기에 방출될 수 있거나, 또는 하나 이상의 유전자 편집 도구보다 후에 방출될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 1 초과 탈피할 수 있는 층을 사용함에 의해 및/또는 1 초과 코어 (예를 들어, 여기서 일 코어는 다른 것과 상이한 방출 프로파일을 가지고, 예를 들어, 상이한 D- 대 L- 이성질체 비를 사용하고, 상이한 ESP:ENP:EPP 프로파일, 및 기타 동종의 것을 사용함)를 사용함에 의해 달성될 수 있다.
ii. 탈피할 수 있는 층 (탈피할 수 있는 도포)
일부 구현예에서, 대상체 나노입자는 코어를 둘러싸는 (캡슐화하는) 탈피할 수 있는 층 (또한 본 명세서에서는 "일시적 안정화 층"으로 언급됨)을 포함한다. 일부 경우에 대상체 탈피할 수 있는 층은 초기 세포 흡수 전 및 도중 적재물을 보호할 수 있다. 예를 들어, 탈피할 수 있는 층이 없으면, 보다 많은 적재물이 세포내재화 도중 손실될 수 있다. 일단 세포 환경에서, 탈피할 수 있는 층은 '탈피하여' (예를 들어, 본 층은 pH- 및/또는 또는 글루타티온-감수성일 수 있음), 코어의 성분을 노출한다.
일부 경우에 대상체 탈피할 수 있는 층은 실리카를 포함한다. 일부 경우에, 대상체 나노입자가 (예를 들어, 실리카의) 탈피할 수 있는 층을 포함하는 경우, 보다 큰 세포내 전달효율이 세포 흡수의 줄어든 개연성에도 불구하고 관측될 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바람이 없이, 탈피할 수 있는 층으로 나노입자 코어를 코딩하는 것 (예를 들어, 실리카 도포)은 코어를 밀봉할 수 있어, (예를 들어, 의도된 세포하 구획에서 처리됨에 의해) 적재물의 방출을 유발시키는 층의 탈피가 일어날 때까지 안정화시킨다. 수용체-매개된 세포내이입을 통한 세포 도입에 이어서, 나노입자는 그것의 최외 층을 탈피하고, 본 탈피할 수 있는 층은 엔도솜의 산성화 환경 또는 사이토졸의 환원적 환경에서 분해되고 코어를 노출하여, 일부 경우에 국재화 신호 예컨대 핵국재화 신호 (NLS) 및/또는 미토콘드리아 국재화 신호를 노출한다. 또한, 탈피할 수 있는 층에 의해 캡슐화된 나노입자 코어는 혈청에서 안정할 수 있고 생체내 투여에 대해 적합할 수 있다.
임의의 원하는 탈피할 수 있는 층이 사용될 수 있고, 당해 분야의 숙련가는 (예를 들어, 어떤 조건, 예컨대 낮은 pH 하에서) 표적 세포에서 이들은 적재물이 방출되기를 원하는 장소 (예를 들어, 엔도솜, 사이토졸, 핵, 리소좀, 및 기타 동종의 것)를 고려할 수 있다. 탈피할 수 있는 층이 탈피 (그리고 따라서 적재물이 방출)하기에 바람직할 수 있는 때, 장소 및/또는 어떤 조건에 의존하여 상이한 탈피할 수 있는 층이 더 바람직할 수 있다. 예를 들어, 탈피할 수 있는 층은 산 불안정성일 수 있다. 일부 경우에 탈피할 수 있는 층은 음이온성 탈피할 수 있는 층 (음이온성 도포)이다. 일부 경우에 탈피할 수 있는 층은 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 및/또는 세라믹 (예를 들어, 바이오세라믹)을 포함한다. 일부 경우에 탈피할 수 있는 것은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 칼슘, 망간, 마그네슘, 철 (예를 들어, 탈피할 수 있는 층은 자성, 예를 들어, Fe3MnO2일 수 있다), 및 리튬. 각각의 이들은 포스페이트 또는 설페이트를 포함할 수 있다. 이와 같이, 일부 경우에 탈피할 수 있는 것은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 인산 칼슘, 황산 칼슘, 망간포스페이트, 망간설페이트, 마그네슘포스페이트, 황산마그네슘, 철 포스페이트, 철 설페이트, 리튬포스페이트, 및 리튬설페이트; 이들 각각은 탈피할 수 있는 층이 '탈피하는' 방법 및/또는 어떤 조건 하에서 하는지에 대해 특정 효과를 가질 수 있다. 따라서, 일부 경우에 탈피할 수 있는 층은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 세라믹 (예를 들어, 바이오세라믹), 칼슘, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 망간, 망간 포스페이트, 망간 설페이트, 마그네슘, 마그네슘 포스페이트, 황산 마그네슘, 철, 철 포스페이트, 철 설페이트, 리튬, 리튬포스페이트, 및 리튬설페이트 (이들의 임의의 조합으로) (예를 들어, 탈피할 수 있는 층은 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 세라믹 (예를 들어, 바이오세라믹), 인산 칼슘, 황산 칼슘, 망간포스페이트, 망간설페이트, 마그네슘포스페이트, 황산마그네슘, 철 포스페이트, 철 설페이트, 리튬포스페이트, 리튬설페이트, 또는 이들의 조합의 코팅물일 수 있다). 일부 경우에 탈피할 수 있는 층은 실리카를 포함한다 (예를 들어, 탈피할 수 있는 층은 실리카 도포일 수 있다). 일부 경우에 탈피할 수 있는 층은 알기네이트 겔을 포함한다.
일부 경우에 상이한 적재물에 대해 상이한 방출 시간이 바람직하다. 예를 들어, 일부 경우에 적재물을 조기에 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 0.5 - 7일 이내) 방출하는 것이 바람직하고 일부 경우에 적재물 나중에 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 6일-30일 이내) 방출하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 일부 경우에 표적 세포와 접촉 0.5-7일 이내 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 0.5-5일, 0.5-3일, 1-7일, 1-5일, 또는 1-3일 이내)에 적재물 (예를 들어, 유전자 편집 도구 예컨대 CRISPR/Cas 가이드 RNA, 상기 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드, 및/또는 상기 CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자)을 방출하는 것이 바람직하다. 일부 경우에 표적 세포와 접촉 6-40일 이내 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 6-30, 6-20, 6-15, 7-40, 7-30, 7-20, 7-15, 9-40, 9-30, 9-20, 또는 9-15일 이내)에 적재물 (예를 들어, DNA 공여체 템플레이트, 예를 들어, 상동성 지향된 회복 - HDR을 위한 것)을 방출하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에 방출 시간은 상이한 시간에 상이한 적재물을 갖는 나노입자를 전달함에 의해 제어될 수 있다. 일부 경우에 방출 시간은 동시에 (상이한 제형의 일부로 또는 동일한 제형의 일부로) 나노입자를 전달함에 의해 제어될 수 있고, 여기서 나노입자의 성분은 원하는 방출 시간을 달성하도록 설계된다. 예를 들어, 하나는 더 빠르게 또는 더 늦게 분해하는 탈피할 수 있는 층을 사용할 수 있고, 열화에 대해 다소간 저항성인 코어 성분, 탈-축합에 대해 다소간 민감한 코어 성분 등 - 및 임의의 또는 모든 성분이 원하는 타이밍을 달성하기 위해 임의의 편리한 조합으로 선택될 수 있다.
일부 경우에 적재물 (예를 들어, DNA 공여체 템플레이트)을 또 다른 적재물 (예를 들어, 하나 이상의 유전자 편집 도구)에 비하여 방출을 지연시키는 것이 바람직하다. 예로서, 일부 경우에 적재물로서 공여체 DNA 템플레이트를 포함한 제1 나노입자는 본 적재물이 표적 세포와 접촉 6-40일 이내 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 6-30, 6-20, 6-15, 7-40, 7-30, 7-20, 7-15, 9-40, 9-30, 9-20, 또는 9-15일 이내)에 방출되도록 설계되고, 반면에 적재물로 하나 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, ZFP 또는 ZFP를 인코딩하는 핵산, TALE 또는 TALE를 인코딩하는 핵산, ZFN 또는 ZFN을 인코딩하는 핵산, TALEN 또는 TALEN을 인코딩하는 핵산, CRISPR/Cas 가이드 RNA 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 또는 CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 및 기타 동종의 것)를 포함하는 제2 나노입자는 본 적재물이 표적 세포와 접촉 0.5-7일 이내 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 0.5-5일, 0.5-3일, 1-7일, 1-5일, 또는 1-3일 이내)에 방출되도록 설계된다. 제2 나노입자는 제1 나노입자와 동일한 제형의 일부 또는 상이한 제형의 일부일 수 있다.
일부 경우에, 나노입자는 1 초과 적재물을 포함하고, 여기서 적재물은 상이한 시간에 방출되는 것이 바람직하다. 이것은 수많은 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 1 초과 코어를 가질 수 있고, 여기서 일 코어는 적재물을 조기에 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 0.5-7일 이내, 예를 들어, 표적 세포와 접촉 0.5-5일, 0.5-3일, 1-7일, 1-5일, 또는 1-3일 이내) 방출할 수 있는 성분 (예를 들어, siRNA, mRNA, 및/또는 게놈 편집 도구 예컨대 ZFP 또는 ZFP를 인코딩하는 핵산, TALE 또는 TALE를 인코딩하는 핵산, ZFN 또는 ZFN을 인코딩하는 핵산, TALEN 또는 TALEN을 인코딩하는 핵산, CRISPR/Cas 가이드 RNA 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 또는 CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 및 기타 동종의 것)으로 될 수 있고, 그리고 다른 것은 늦게 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 6-40일 이내, 예를 들어, 표적 세포와 접촉 6-30, 6-20, 6-15, 7-40, 7-30, 7-20, 7-15, 9-40, 9-30, 9-20, 또는 9-15일 이내) 적재물 (예를 들어, DNA 공여체 템플레이트)을 방출할 수 있는 성분으로 된다.
또 다른 예로서, 나노입자는 외부 탈피할 수 있는 층은 내부 탈피할 수 있는 층이 탈피 (또 다른 적재물을 방출)하기 전 탈피 (적재물을 방출)하는, 1 초과의 탈피할 수 있는 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 내부 적재물은 DNA 공여체 템플레이트 (예를 들어, 상동성 지향된 회복 - HDR을 위함)이고 외부 적재물은 하나 이상의 유전자 편집 도구 (예를 들어, ZFP 또는 ZFP를 인코딩하는 핵산, TALE 또는 TALE를 인코딩하는 핵산, ZFN 또는 ZFN을 인코딩하는 핵산, TALEN 또는 TALEN을 인코딩하는 핵산, CRISPR/Cas 가이드 RNA 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 또는 CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 및 기타 동종의 것)이다. 내부 및 외부 적재물은 임의의 원하는 적재물일 수 있고 둘 중 하나 또는 모두는, 예를 들어, 하나 이상의 siRNAs 및/또는 하나 이상의 mRNA를 포함할 수 있다. 이와 같이, 일부 경우에 나노입자는 1 초과의 탈피할 수 있는 층을 가질 수 있고 하나의 적재물을 조기에 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 0.5-7일 이내, 예를 들어, 표적 세포와 접촉 0.5-5일, 0.5-3일, 1-7일, 1-5일, 또는 1-3일 이내) 방출하고 (예를 들어, siRNA, mRNA, 게놈 편집 도구 예컨대 ZFP 또는 ZFP를 인코딩하는 핵산, TALE 또는 TALE를 인코딩하는 핵산, ZFN 또는 ZFN을 인코딩하는 핵산, TALEN 또는 TALEN을 인코딩하는 핵산, CRISPR/Cas 가이드 RNA 또는 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 또는 CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 및 기타 동종의 것), 그리고 또 다른 적재물 (예를 들어, siRNA, mRNA, DNA 공여체템 플레이트)은 늦게 (예를 들어, 표적 세포와 접촉 6-40일 이내, 예를 들어, 표적 세포와 접촉 6-30, 6-20, 6-15, 7-40, 7-30, 7-20, 7-15, 9-40, 9-30, 9-20, 또는 9-15일 이내) 방출하도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서 (예를 들어, 상기에 기재된 구현예에서), 적재물 방출의 시간에 대해 대리로서 변경된 유전자 발현의 시간이 사용될 수 있다. 예시로서, 적재물이 12일째까지 방출되는지를 결정하기를 원하는 경우, 12일째에 나노입자 전달의 원하는 결과에 대해 검정할 수 있다. 예를 들어, 원하는 결과가, 예를 들어, siRNA을 전달함에 의해 표적 세포의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 것인 경우, 표적 유전자의 발현이 분석/모니터링되어 siRNA가 방출되었는지를 결정할 수 있다. 또 다른 예로서, 원하는 결과가, 예를 들어, 관심 있는 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA를 전달함에 의해 관심 있는 단백질을 발현시키는 것인 경우, 관심 있는 단백질의 발현이 분석/모니터링되어 적재물이 방출되었는지를 결정할 수 있다. 또 다른 예로서, 원하는 결과가, 예를 들어, 게놈 DNA를 단리 및/또는 공여체 DNA 템플레이트의 서열을 삽입하는 것을 통해 표적 세포의 게놈을 변형시키는 것인 경우, 표적화된 유전자좌로부터의 발현 및/또는 게놈 변경의 존재가 분석/모니터링되어 적재물이 방출되었는지를 결정할 수 있다.
이와 같이, 일부 경우에 탈피할 수 있는 층은 나노입자 성분의 단계적 방출을 위해 제공한다. 예를 들어, 일부 경우에, 나노입자는 1 초과 (예를 들어, 둘, 셋, 또는 넷)의 탈피할 수 있는 층을 갖는다. 예를 들어, 2개의 탈피할 수 있는 층을 갖는 나노입자에 대해, 그와 같은 나노입자는 가장 내부에서부터 가장 외부로: 코어, 예를 들어, 제1 적재물을 갖는 코어; 제1 탈피할 수 있는 층으로, 예를 들어, 제2 적재물을 갖는 중간층; 및 중간층을 둘러싸는 제2 탈피할 수 있는 층을 가질 수 있다 (예를 들어, 도 9 참고). 그와 같은 배치형태 (다중 탈피할 수 있는 층)은 다양한 원하는 적재물의 단계적 방출을 용이하게 한다. 추가의 예시로서, (상기에 기재된 바와 같이) 2개의 탈피할 수 있는 층을 갖는 나노입자는 코어에 하나 이상의 원하는 유전자 편집 도구 (예를 들어, DNA 공여체 템플레이트, CRISPR/Cas 가이드 RNA, CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA, 및 기타 동종의 것 중 하나 이상), 및 중간층에 또 다른 원하는 유전자 편집 도구 (예를 들어, 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질 예컨대 CRISPR/Cas 단백질, ZFP, ZFN, TALE, TALEN, 등; 프로그래밍가능한 유전자 편집 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA; CRISPR/Cas 가이드 RNA; CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA; 및 동종의 것 중 하나 이상)를 - 임의의 원하는 조합으로 포함할 수 있다.
탈피할 수 있는 층을 부가하는 실시예 (예를 들어, 적절한 체류 시간 (유속)으로 미세유체 혼합 칩을 통과한 두 용액)은 실시예 섹션에 찾아볼 수 있다.
대안적인 패키징 (예를 들어, 지질 제형)
일부 구현예에서, 대상체 코어 (예를 들어, 상기에 기재된 성분 및/또는 배치형태의 임의의 조합을 포함함)는 지질-계 전달 시스템, 예를 들어, 양이온성 지질 전달 시스템의 일부이다 (예를 들어, 문헌 [Chesnoy and Huang, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2000, 29:27-47]; [Hirko et al., Curr Med Chem. 2003 Jul 10(14):1185-93]; 및 [Liu et al., Curr Med Chem. 2003 Jul 10(14):1307-15] 참고). 일부 경우에 대상체 코어 (예를 들어, 상기에 기재된 성분 및/또는 배치형태의 임의의 조합을 포함함)는 탈피할 수 있는 층에 의해 둘러싸이지 않는다. 전술한 바와 같이 코어는 음이온성 폴리머 조성물 (예를 들어, 폴리(글루탐산)), 양이온성 폴리머 조성물 (예를 들어, 폴리(아르기닌), 양이온성 폴리펩타이드 조성물 (예를 들어, 히스톤 꼬리 펩타이드), 및 적재물 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 적재물)을 포함할 수 있다.
코어가 지질-계 전달시스템의 일부인 일부 경우에, 코어는 적시 방출 및/또는 위치상 방출을 고려하여 설계되었다. 예를 들어, 일부 경우에 코어는 ESP, ENP, 및/또는 EPP를 포함하고, 일부 이러한 사례에서, 이들 성분은 (예를 들어, 상기에 기재된) 코어가 원하는 조건 (예를 들어, 세포 위치, 세포 조건 예컨대 pH, 특정 효소의 존재, 및 기타 동종의 것)과 마주칠 때까지 적재물 방출이 지연되도록 되는 비로 존재한다. 일부 그와 같은 구현예에서 코어는 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고, 일부 경우에 D- 및 L- 이성질체의 폴리머는 (예를 들어, 상기에 기재된) 특정 범위의 비 내로 서로에 대해 존재한다. 일부 경우에 코어는 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고, 일부 경우에 D- 및 L- 이성질체의 폴리머는 (예를 들어, 상기에 기재된) 특정 범위의 비 내로 서로에 대해 존재한다. 일부 경우에 코어는 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고, 일부 경우에 D- 및 L- 이성질체의 폴리머는 (예를 들어, 상기에 기재된) 특정 범위의 비 내로 서로에 대해 존재한다. 일부 경우에 코어는 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머를 포함하고, 일부 경우에 D- 및 L- 이성질체의 폴리머는 (예를 들어, 상기에 기재된) 특정 범위의 비 내로 서로에 대해 존재한다. 일부 경우에 코어는 (예를 들어, 상기에 기재된) NLS를 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 경우에 코어는 (예를 들어, 상기에 기재된) HTP를 포함한다.
양이온성 지질은 유전자 전달을 위해 사용될 수 있고 플라스미드 DNA를 응축하는 능력을 갖는 비바이러스 벡터이다. 리포펙션을 위해 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 염화물의 합성 후, 양이온성 지질의 분자 구조를 개선하는 것은 헤드 그룹, 링커, 및 소수성 도메인 변형을 포함한 활성 영역이었다. 변형은 DNA 결합 및 향상된 표면 전하 밀도를 통한 전달을 개선할 수 있는 다가 폴리아민의 사용, 및 독성을 제한할 수 있는 스테롤-계 소수성기 예컨대 3B-[N-(N,N'-디메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤의 사용을 포함했다. 엔도조말 탈출을 용이하게 하기 위해 향상된 리포좀 소수성 및 육각형 역전된-상 전이를 통한 이식유전자 발현을 개선하기 위해 헬퍼 지질 예컨대 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)이 사용될 수 있다. 일부 경우에 지질 제형은 하기의 것 중 하나 이상을 포함한다: DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, 98N12-5, C12-200, 콜레스테롤 PEG-지질, 리피오폴리아민, 덱사메타손-스페르민 (DS), 및 이치환된 스페르민 (D2S) (예를 들어, 폴리아민 스페르민에 대해 덱사메타손의 콘주게이션으로부터 유래됨). DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200 및 DLin-MC3-DMA는 당 업계에서 설명된 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Heyes et. al, J. Control Release, 2005, 107, 276-287; Semple et. al, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176; Akinc et. al, Nature Biotechnology, 2008, 26, 561-569; Love et. al, PNAS, 2010, 107, 1864-1869]; 국제 특허 출원 공개 WO2010054401을 참고하고; 이들 모두는 이로써 전체적으로 참고로 편입된다.
다양한 지질-계 전달 시스템의 예는, 비제한적으로 하기 공보들에 기재된 것들을 포함한다: 국제 특허 공개 번호 WO2016081029; 미국 특허 출원 공개 번호 US20160263047 및 US20160237455; 및 미국 특허 번호 9,533,047; 9,504,747; 9,504,651; 9,486,538; 9,393,200; 9,326,940; 9,315,828; 및 9,308,267; 이들 모두는 이로써 전체적으로 참고로 편입된다.
이와 같이, 일부 경우에 대상체 코어는 지질 (예를 들어, 양이온성 지질 예컨대 리포펙타민 형질감염 시약)에 의해 둘러싸인다. 일부 경우에 대상체 코어는 지질 제형 (예를 들어, 지질 나노입자 제형)에 존재한다. 지질 제형은 리포좀 및/또는 리포플렉스를 포함할 수 있다. 지질 제형은 에탄올 희석에 의한 자발적인 소포 형성(SNALP) 리포좀을 포함할 수 있다 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및/또는 프로타민으로 코팅될 수 있는 중성 헬퍼 지질과 함께 양이온성 지질을 포함하는 것).
지질 제형은 리피도이드-계 제형일 수 있다. 리피도이드의 합성은 광범위하게 기재되어 있고 이들 화합물을 함유하는 제형은 대상체 지질 제형에 포함될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21]; [Akinc al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569]; [Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869]; 및 [Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2011 108:12996-3001]을 참고하고; 이들 모두는 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된다). 일부 경우에 대상체 지질 제형은 (임의의 원하는 조합으로) 하기의 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민 (DOPE); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]N,N,N-트리메틸암모늄염화물 (DOTMA); 1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP); 디옥타데실아미도글라이실스페르민 (DOGS); N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(도데실옥시)-1 (GAP-DLRIE);프로판아미늄브로마이드; 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB); 6-라우르옥시헥실 오르니티네이트 (LHON); 1-(2,3-디올레오일옥시프로필)-2,4,6-트리메틸피리디늄 (2Oc); 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사미도-에틸]-N,N-디메틸-1 (DOSPA); 프로판아미늄트리플루오로아세테이트; 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOPA); N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1 (MDRIE); 프로판아미늄브로마이드; 디미리스토옥시프로필디메틸하이드록시에틸암모늄브로마이드 (DMRI); 3.베타.-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 DC-Chol; 비스-구아니듐-트렌-콜레스테롤 (BGTC); 1,3-디오데옥시-2-(6-카복시-스페르밀)-프로필아미드 (DOSPER); 디메틸옥타데실암모늄브로마이드(DDAB); 디옥타데실아미도글리실스페르미딘 (DSL); rac-[(2,3-디옥타데실옥시프로필)(2-하이드록시에틸)]-디메틸암모늄 (CLIP-1); 염화물 rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필 (CLIP-6); 옥시메틸옥시)에틸]트리메틸암모늄브로마이드; 에틸디미리스토일포스파티딜콜린(EDMPC); 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DSDMA); 1,2-디미리스토일-트리메틸암모늄프로판 (DMTAP); O,O'-디미리스틸-N-라이실아스파르테이트 (DMKE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DSEPC); N-팔미토일 D-에리트로-스핑고일 카바모일-스페르민 (CCS); N-t-부틸-N0-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘; 디C14-아미딘; 옥타데세노일옥시[에틸-2-헵타데세닐-3 하이드록시에틸] 이미다졸리늄 (DOTIM); 염화물 N1-콜레스테릴옥시카보닐-3,7-디아자노난-1,9-디아민 (CDAN); 2-[3-[비스(3-아미노프로필)아미노]프로필아미노]-N-[2-[디(테트라데실)아미노]-2-옥소에틸]아세트아미드 (RPR209120); 디테트라데실카바모일메-에틸-아세트아미드; 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLinDMA); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란; DLin-KC2-DMA; 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트; DLin-MC3-DMA; DLin-K-DMA; 98N12-5; C12-200; 콜레스테롤; PEG-지질; 리피오폴리아민; 덱사메타손-스페르민 (DS); 및 이치환된 스페르민 (D2S).
iii. 표면 도포 (외부 쉘)
일부 경우에, 탈피할 수 있는 층 (도포)은 본 명세서에서 "외부 쉘", "외부 도포" 또는 "표면 도포"로 언급된 추가의 층에 의해 자체 코팅된다. 표면 도포는 다수의 상이한 기능으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 표면 도포는 전달 효율을 증가시킬 수 있고 및/또는 대상체 나노입자가 특정 세포 유형을 표적화할 수 있다. 표면 도포는 펩타이드, 폴리머, 또는 리간드-폴리머 콘주게이트를 포함할 수 있다. 표면 도포는 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, (링커 도메인이 있거나 없이) 하나 이상의 표적화 리간드의 수용액은 코팅된 나노입자 현탁액 (탈피할 수 있는 층으로 코팅된 나노입자의 현탁액)에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 (고착 도메인의) 양성자화된 고착 잔사의 최종 농도는 25 내지 300 μM이다. 일부 경우에, 표면 도포을 부가하는 공정은 50 내지 150 nm 사이의 평균 입자 크기 및 제타 전위 0 내지 -10 mV를 갖는 단분산된 현탁액을 생성한다.
일부 경우에, 표면 도포는 최외부 탈피할 수 있는 층과 정전기적으로 상호작용한다. 예를 들어, 일부 경우에, 나노입자는 2개의 탈피할 수 있는 층 (예를 들어, 가장 내부로부터 가장 외부로: 코어, 예를 들어, 제1 적재물을 갖는 코어; 제1 탈피할 수 있는 층으로, 예를 들어, 제2 적재물을 갖는 중간층; 및 중간층을 둘러싸는 제2 탈피할 수 있는 층)을 가지고, 그리고 외부 쉘 (표면 도포)은 제2 탈피할 수 있는 층과 (예를 들어, 정전기적으로) 상호작용할 수 있다. 일부 경우에, 나노입자는 단 하나의 탈피할 수 있는 층 (예를 들어, 음이온성 실리카 층)을 가지고, 외부 쉘은 일부 경우에 정전기적으로 탈피할 수 있는 층과 상호작용할 수 있다.
따라서, 탈피할 수 있는 층 (예를 들어, 최외부 탈피할 수 있는 층)이 음이온성인 사례에서, (예를 들어, 탈피할 수 있는 층이 실리카 도포인 일부 경우에), 표면 도포는 표면 도포가 양이온성 성분을 포함하는 경우 탈피할 수 있는 층과 정전기적으로 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 표면 도포는 표적화 리간드가 양이온성 고착 도메인에 접합된 전달 분자를 포함한다. 양이온성 고착 도메인은 탈피할 수 있는 층과 정전기적으로 상호작용하고 나노입자에 전달 분자를 고착한다. 마찬가지로, 탈피할 수 있는 층 (예를 들어, 최외부 탈피할 수 있는 층)이 양이온성인 사례에서, 표면 도포는 표면 도포가 음이온성 성분을 포함하는 경우 탈피할 수 있는 층과 정전기적으로 상호작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 표면 도포는 세포 침투 펩타이드 (CPP)를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 아미노산의 폴리머는 지질 이중층, 교질입자, 세포막, 소기관막, 또는 소포막을 가로지르는 것을 용이하게 하는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 탄수화물, 또는 유기 또는 무기 화합물을 지칭하기 위해 사용된 용어인 CPP (또한 일명 '단백질 형질도입 도메인' - PTD)로서 기능할 수 있다. 작은 극성 분자에서 큰 거대 분자 및/또는 나노입자의 범위일 수 있는 또 다른 분자에 부착된 PTD (예를 들어, 대상체 나노입자의 탈피할 수 있는 층에 포매된 및/또는 이들과 상호작용하는 것)는 분자가 막을 가로지르는 것, 예를 들어 세포외 공간으로부터 소기관 (예를 들어, 핵) 내로 세포내 공간, 또는 사이토졸로 이동하는 것을 용이하게 한다.
CPP의 예는 비제한적으로 최소 운데카펩타이드 단백질 형질도입 도메인 (YGRKKRRQRRR (서열번호:160)을 포함하는 HIV-1 TAT의 잔기 47-57에 상응함; 세포 안으로 직접적인 도입을 위해 충분한 아르기닌의 수 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10-50 아르기닌)를 포함하는 폴리아르기닌 서열; VP22 도메인 (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); 드로소필라 안테나페디아 단백질 형질도입 도메인 (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); 절단된 인간 칼시토닌 펩타이드 (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); 폴리라이신 (Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (서열번호:161); 트랜스포르탄 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열번호:162); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열번호:163); 및RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호:164)를 포함한다. CPP 예는 하기를 비제한적으로 포함한다: YGRKKRRQRRR (서열번호:160), RKKRRQRRR (서열번호:165), 3 아르기닌 잔기 내지 50 아르기닌 잔기의 아르기닌 단일 중합체, RKKRRQRR (서열번호:166), YARAAARQARA (서열번호:167), THRLPRRRRRR (서열번호:168), 및 GGRRARRRRRR (서열번호:169). 일부 구현예에서, CPP는 활성화 CPP (ACPP)이다 (Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381). ACPP는 매칭하는 다수의 음이온 (예를 들어, Glu9 또는 "E9")에 절단가능한 링커를 통해 연결된 다수의 양이온성 CPP (예를 들어, Arg9 또는 "R9")를 포함하여, 순전하를 거의 제로로 감소시키고 그것에 의해 세포 안으로 접착 및 흡수를 억제한다. 링커의 절단에 의해, 다중음이온이 방출되어, 폴리아르기닌 및 그것의 고유한 부착성을 국소적으로 마스킹 해제하고, 따라서 ACPP가 막을 가로지르도록 "활성화한다".
일부 경우에 CPP는 코팅된 코어 (탈피할 수 있는 층에 의해 둘러싸인 코어)를 CPP를 포함하는 조성물 (예를 들어, 용액)과 접촉시킴에 의해 나노입자에 첨가될 수 있다. CPP는 그런 다음 탈피할 수 있는 층과 (예를 들어, 정전기적으로) 상호작용할 수 있다.
일부 경우에, 표면 도포는 양이온성 아미노산의 폴리머 (예를 들어, 폴리(아르기닌) 예컨대폴리(L-아르기닌) 및/또는 폴리(D-아르기닌), 폴리(라이신) 예컨대 폴리(L-라이신) 및/또는 폴리(D-라이신), 폴리(히스티딘) 예컨대 폴리(L- 히스티딘) 및/또는 폴리(D- 히스티딘), 폴리(오르니틴) 예컨대 폴리(L-오르니틴) 및/또는 폴리(D-오르니틴), 폴리(시트룰린) 예컨대 폴리(L-시트룰린) 및/또는 폴리(D-시트룰린), 및 기타 동종의 것)를 포함한다. 이와 같이, 일부 경우에 표면 도포는 폴리(아르기닌), 예를 들어, 폴리(L-아르기닌)을 포함한다.
일부 구현예에서, 표면 도포는 헵타펩타이드 예컨대 셀랭크 (TKPRPGP - 서열번호:147) (예를 들어, N-아세틸 셀랭크) 및/또는 세맥스 (MEHFPGP　- 서열번호:148) (예를 들어, N-아세틸 세맥스)를 포함한다. 이와 같이, 일부 경우에 표면 도포는 셀랭크 (예를 들어, N-아세틸 셀랭크)를 포함한다. 일부 경우에 표면 도포는 세맥스 (예를 들어, N-아세틸 세맥스)를 포함한다.
일부 구현예에서 표면 도포는 전달 분자를 포함한다. 전달 분자는 표적화 리간드를 포함하고 일부 경우에 표적화 리간드는 고착 도메인 (예를 들어 양이온성 고착 도메인)에 접합된다. 일부 경우에 표적화 리간드는 개재하는 링커를 통해 고착 도메인 (예를 들어 양이온성 고착 도메인)에 접합된다.
표적화 리간드
다양한 표적화 리간드 (예를 들어, 대상체 전달 분자의 일부로)는 표면 도포의 일부로서 사용될 수 있고, 수많은 상이한 표적화 리간드가 구상된다. 일부 구현예에서 표적화 리간드는 야생형 단백질의 단편 (예를 들어, 결합 도메인)이다. 예를 들어, 일부 경우에 대상체 전달 분자의 펩타이드 표적화 리간드는 4-50 아미노산의 길이 (예를 들어, 4-40, 4-35, 4-30, 4-25, 4-20, 4-15, 5-50, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 7-50, 7-40, 7-35, 7-30, 7-25, 7-20, 7-15, 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20, 또는 8-15 아미노산)를 가질 수 있다. 표적화 리간드는 야생형 단백질의 단편일 수 있지만, 일부 경우에 야생형 아미노산 서열에 비하여 돌연변이 (예를 들어, 삽입, 결실, 치환) (즉, 상응하는 야생형 단백질 서열에 비하여 돌연변이)를 가질 수 있다. 예를 들어, 표적화 리간드는 표적 세포 표면 단백질과 결합 친화도를 감소시키거나 또는 증가시키는 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 경우에 표적화 리간드는 항체의 항원-결합 영역이다 (예를 들어, ScFv). "Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-사슬 Fv 종에서, 이 영역은 단단하게 비-공유결합한 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일-사슬 Fv 종 (scFv)에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄와 중쇄가 2-사슬 Fv 종에서의 것에 유사한 "이량체성" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유결합될 수 있다. scFv의 검토에 대해서는 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
일부 경우에 표적화 리간드는 바이러스 당단백질을 포함하고, 이것은 일부 경우에 도처의 표면 마커 예컨대 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 결합하고, 막 파상운동 연관된 과정을 통해 일부 세포 모집단에서 미세포음작용을 유도할 수 있다. 폴리(L-아르기닌)은 표면 마커 예컨대 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 결합하기 위해 또한 사용될 수 있는 또 다른 실시예 표적화 리간드이다.
일부 경우에, 표적화 리간드는 링커 및/또는 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 대한 콘주게이션을 용이하게 할 수 있는 시스테인 잔기를 부가하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 및/또는 아민-반응성 화학반응을 통한 가교결합 (콘주게이션)을 위해 시스테인이 사용될 수 있다.
일부 경우에, 표적화 리간드는 내부 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 N- 및/또는 C- 말단에서 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 시스테인 잔기를 포함하기 위해, 표적화 리간드는, 예를 들어, 상응하는 야생형 서열에 비하여 돌연변이 (예를 들어, 삽입 또는 치환)된다. 이와 같이, 본 명세서에서 기재된 임의의 표적화 리간드는 시스테인 잔기에서 삽입 및/또는 치환 (예를 들어, 시스테인 잔기의 내부, N-말단, C-말단 삽입 또는 치환)에 의해 변형될 수 있다.
"상응하는" 야생형 서열은 대상체 서열 유래되거나 유래할 수 있는 야생형 서열 (예를 들어, 관심 있는 서열에 높은 서열 동일성을 갖는 야생형 단백질 서열)을 의미한다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 치환, 삽입)를 가지지만 달리는 야생형 서열에 고도로 유사한 표적화 리간드에 대해, 가장 유사한 아미노산 서열은 상응하는 야생형 아미노산 서열인 것으로 간주될 수 있다.
상응하는 야생형 단백질/서열은 100% 동일하지 않은 것 (예를 들어, 85% 또는 그 초과 동일한, 90% 또는 그 초과 동일한, 95% 또는 그 초과 동일한, 98% 또는 그 초과 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한, 등일 수 있음)(변형된 위치(들)의 외측)이지만, 표적화 리간드 및 상응하는 야생형 단백질 (예를 들어, 야생 단백질의 단편)은 의도된 세포 표면 단백질에 결합할 수 있고, 그리고 이들이 상동성으로 고려될 수 있는 충분한 서열 동일성 (변형된 위치(들)의 외측)을 보유할 수 있다. "상응하는" 야생형 단백질 서열의 아미노산 서열은 임의의 편리한 방법 (예를 들어, 임의의 편리한 서열 비교/정렬 소프트웨어 예컨대 BLAST, MUSCLE, T-COFFEE, 등을 사용함)을 사용하여 확인/평가될 수 있다.
표면 도포의 일부 (예를 들어, 표면 도포의 전달 분자의 일부)로서 사용될 수 있는 표적화 리간드의 예는, 비제한적으로, 표 1에 열거된 것들을 포함한다. 대상체 전달 분자의 일부로서 사용될 수 있는 표적화 리간드의 예는, 비제한적으로, 표 3에 열거된 것들을 포함한다 (표 3에 열거된 많은 서열은 링커 (예를 들어, GGGGSGGGGS (서열번호: 298))를 통해 양이온성 폴리펩타이드 도메인, 예를 들어, 9R, 6R, 등에 접합된 표적화 리간드 (예를 들어, 열 2에 대해 SNRWLDVK (서열번호: 305))를 포함한다. 표적화 리간드에 포함될 수 있는 아미노산 서열의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: NPKLTRMLTFKFY (서열번호: 303) (IL2), TSVGKYPNTGYYGD (서열번호: 304) (CD3), SNRWLDVK (Siglec) (서열번호: 305), EKFILKVRPAFKAV (서열번호: 302) (SCF), SNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENS (서열번호: 300) (cKit), 및 Ac-SNYSAibADKAibANAibADDAibAEAibAKENS (서열번호: 299) (cKit). 따라서 일부 경우에 표적화 리간드는 NPKLTRMLTFKFY (서열번호: 303) (IL2), TSVGKYPNTGYYGD (서열번호: 304) (CD3), SNRWLDVK (Siglec) (서열번호: 305), EKFILKVRPAFKAV (서열번호: 302) (SCF), 또는 SNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENS (서열번호: 300) (cKit)와 85% 또는 그 초과 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
(예를 들어, 전달 분자의) 표적화 리간드는 서열번호: 1-12 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 1-12 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단, 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열번호: 1-12 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함할 수 있다.
(예를 들어, 전달 분자의) 표적화 리간드는 서열번호: 1-12 및 181-187 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 1-12 및 181-187 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단, 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열번호: 1-12 및 181-187 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함할 수 있다.
(예를 들어, 전달 분자의) 표적화 리간드는 서열번호: 1-12, 181-187, 및 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 1-12, 181-187, 및 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단, 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열번호: 1-12, 181-187, 및 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열 및/또는 아미노산 서열 RGD를 포함할 수 있다.
일부 경우에, (예를 들어, 전달 분자의) 표적화 리간드는 서열번호: 181-187, 및 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 181-187, 및 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단, 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열번호: 181-187, 및 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, (예를 들어, 전달 분자의) 표적화 리간드는 서열번호: 181-187 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 181-187 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단, 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열번호: 181-187 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, (예를 들어, 전달 분자의) 표적화 리간드는 서열번호: 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 시스테인 (내부, C-말단, 또는 N-말단)을 포함할 수 있고, 또한 서열번호: 271-277 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
용어들 "표적화하다" 및 "표적화된 결합"은 본 명세서에서 특이적 결합을 지칭하기 위해 사용된다. 용어들 "특이적 결합", "특이적으로 결합하다", 및 동종의 것은 용액 또는 반응 혼합물에서 다른 분자 또는 모이어티에 비하여 분자에 대해 비-공유 또는 공유 우선적인 결합을 지칭한다 (예를 들어, 항체는 다른 이용가능한 폴리펩타이드에 비해 특정 폴리펩타이드 또는 에피토프에 대해 특이적으로 결합하고, 리간드는 다른 이용가능한 수용체에 비해 특정 수용체에 대해 특이적으로 결합한다). 일부 구현예에서, 특이적으로 결합하는 또 다른 분자에 대한 일 분자의 친화성은 10-5 M 또는 그 미만 (예를 들어, 10-6 M 또는 그 미만, 10-7 M 또는 그 미만, 10-8 M 또는 그 미만, 10-9　M 또는 그 미만, 10-10 M 또는 그 미만, 10-11 M 또는 그 미만, 10-12 M 또는 그 미만, 10-13 M 또는 그 미만, 10-14 M 또는 그 미만, 10-15　M 또는 그 미만, 또는 10-16 M 또는 그 미만)의 Kd (해리 상수)임을 특징으로 한다. "친화성"은 결합의 강도를 지칭하고, 증가된 결합 친화성은 낮은 Kd와 상관관계가 있다.
일부 경우에, 표적화 리간드는 계열 B G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), 수용체 티로신 키나제 (RTK), 세포 표면 당단백질, 및 세포-세포 유착 분자로부터 선택된 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 수용체 결합에 의한 리간드의 공간적 배열의 고려가, 예를 들어, 리간드와 표적 사이의 구조 기능 관계가 적재물 또는 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 대한 표적화 리간드의 콘주게이션에 기인하여 파괴되지 않도록, 원하는 기능적 선택성 및 엔도조말 분류 편향을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산, 단백질, 리보핵단백질, 또는 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 대한 콘주게이션은 결합 틈(들)으로 잠재적으로 방해받을 수 있다.
따라서, 그것의 리간드에 결합된 원하는 표적 (세포 표면 단백질)의 결정 구조가 이용가능한 일부 경우에 (또는 그와 같은 구조가 관련된 단백질에 대해 이용가능한 경우), 리간드와 표적 사이의 상호작용의 부위를 시각화하기 위해 3D 구조 모델링 및 서열 스레딩을 사용할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 치환 및/또는 삽입 (예를 들어, 시스테인 잔기의 것)의 배치를 위한 내부 부위의 선택을 용이하게 할 수 있다.
예로서, 일부 경우에, 표적화 리간드는 계열 B G 단백질 커플링된 수용체 (GPCR) ('세크레틴-계열'로도 알려짐)에 대한 결합을 제공한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 각각 표적화된 결합 및 긴 엔도조말 재순환 경로의 참여를 제공하도록 계열 B GPCR의 오쏘스테릭 도메인과 알로스테릭-친화성 도메인 둘 모두에 대한 결합을 제공한다 (예를 들어, 하기 실시예 섹션뿐만 아니라 도 11 및 도 12 참고).
G-단백질-커플링된 수용체 (GPCR)는 (7개 추정 막관통 분절로) 공통 분자 구조 및, 세포내 2차 메신저 예컨대 환형AMP, 이노시톨 포스페이트, 디아실글리세롤 및 칼슘 이온의 합성을 조절하기 위해 이들이 G 단백질 (이종삼합성 GTPases)과 상호작용한다는 점에서 공통 신호전달 기전을 공유한다. GPCR의 계열 B (세크레틴-수용체 계열 또는 '계열 2')는 작지만 원형질막에서 세포간 상호작용을 매개하는 것으로 고려되는 폴리펩타이드 호르몬 및 분자에 대한 수용체를 포함하는 단백질의 구조적으로 그리고 기능적으로 다양한 그룹이다 (예를 들어, 문헌 [Harmar et al., Genome Biol. 2001;2(12):REVIEWS3013] 참고). 연구가 리간드 결합의 이해로 확장되고 구조-기반 리간드 디자인에 대한 유용한 플랫폼을 제공하는, 결합된 리간드로 또는 없이, 그것의 N-말단의 몇개의 결정 구조의 공보를 포함하여, 세크레틴-수용체 계열의 구성원에 관한 것으로 구조적 생물학에서의 중요한 진보가 있었다 (예를 들어, 문헌 [Poyner et al., Br J Pharmacol. 2012 May;166(1):1-3] 참고).
예를 들어, 엑센딘-4 리간드, 또는 이들의 유도체 (예를 들어, 서열번호:2로 제시된 바와 같은 시스테인 치환된 엑센딘-4 표적화 리간드)를 사용하여 췌장 세포 표면 단백질 GLP1R을 표적화하는 (예를 들어, β-섬을 표적화하는) 대상체 전달 분자를 사용하는 것을 희망할 수 있다. GLP1R은 뇌 및 췌장 내에 풍부하기 때문에, GLP1R에 대한 결합을 표적화하기 위해 제공되는 표적화 리간드는 뇌 및 췌장을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, GLP1R을 표적화하는 것은 (예를 들어, 하나 이상의 유전자 편집 도구의 전달을 통해) 질환 예컨대 헌팅턴병 (CAG 반복확장 돌연변이), 파킨슨병 (LRRK2 돌연변이), ALS (SOD1 돌연변이), 및 다른 CNS 질환을 치료하는데 초점이 맞추어진 방법 (예를 들어, 치료방법)을 용이하게 한다. GLP1R을 표적화하는 것은 또한 (예를 들어, 하나 이상의 유전자 편집 도구의 전달을 통해) 질환 예컨대 진성당뇨병 유형 I, 진성당뇨병 유형 II, 및 췌장암의 치료를 위해 췌장 β-섬에 적재물을 전달하는데 초점이 맞추어진 방법 (예를 들어, 치료방법)을 용이하게 한다.
엑센딘-4의 변형된 버전을 사용하여 GLP1R을 표적화할 때. (예를 들어, 핵산 적재물에 콘주게이션을 위해) 시스테인 치환 및/또는 삽입을 위한 아미노산은 두 결합 틈을 파괴하지 않도록 가교결합된 복합체가 반드시 향하는 방향을 예측하기 위해 3D 공간으로 회전될 수 있는 PDB 3차원 표현을 사용하여 글루카곤-GCGR (4ERS) 및 GLP1-GLP1R-ECD 복합체 (PDB: 3IOL)의 결정 구조에 대해, HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (서열번호 1)인 엑센딘-4 아미노산 서열을 정렬함에 의해 확인될 수 있다 (예를 들어, 하기 실시예 섹션뿐만 아니라 도 11 및 도 12 참고). (계열 B GPCR을 표적화하는) 표적화 리간드의 바람직한 가교결합 부위 (예를 들어, 시스테인 잔기의 치환/삽입을 위한 부위)가 상응하는 수용체의 두 결합 틈들에 충분히 직교하는 경우, 고-친화성 결합뿐만 아니라 수반되는 긴 엔도조말 재순환 경로 격리 (예를 들어, 최적의 적재물 방출을 위함)가 일어날 수 있다. 서열번호: 1의 아미노산 위치 10, 11, 및/또는 12에서의 시스테인 치환은 Gs-편향된 신호전달 캐스케이드의 양봉형 결합 및 특이적 개시, 베타 아레스틴의 참여, 및 액틴 세포골격으로부터 수용체 해리를 부여한다. 일부 경우에, 이 표적화 리간드는 (친화성 가닥인, 엑센딘-4 [31-39]의 단순한 결합을 갖는 경우에서와 같이) 수반되는 오쏘스테릭 부위 참여없이 GPCR의 N-말단 도메인에 단순한 결합을 통해 계합하지 않는 기전인, 수용체-매개된 세포내이입을 통해 나노입자의 내재화를 촉발한다.
일부 경우에, 대상체 표적화 리간드는 엑센딘-4 아미노산 서열 (서열번호: 1)에 85% 또는 그 초과 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열의 L10, S11, 및 K12에 상응하는 위치 중 하나 이상에서 시스테인 치환 또는 삽입을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열의 S11에 상응하는 위치에서 시스테인 치환 또는 삽입을 포함한다. 일부 경우에, 대상체 표적화 리간드는 엑센딘-4 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 (링커로 또는 없이) 접합된다.
또 다른 예로서, 일부 경우에 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 수용체 티로신 키나제 (RTK) 예컨대 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체 (FGFR)에 대한 결합을 제공한다. 따라서 일부 경우에 표적화 리간드는 FGF의 단편이다 (즉, FGF의 아미노산 서열을 포함한다). 일부 경우에, 표적화 리간드는 오쏘스테릭 결합 동안 점유된 RTK의 분절에 결합한다 (예를 들어, 하기 실시예 섹션 참고). 일부 경우에, 표적화 리간드는 RTK의 헤파린-친화성 도메인에 결합한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 FGF 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공하고 아미노산 서열 KNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS (서열번호: 4)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 FGF 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공하고 서열번호: 4로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, RTK의 오쏘스테릭 부위를 점하는 작은 도메인 (예를 들어, 5-40개 길이의 아미노산)은 천연 성장 인자 리간드에 대한 풍토병성일 수 있는, 세포-증식성 및 프로토-종양 발생 신호전달 캐스케이드의 참여 없이 RTK (예를 들어, FGFR)의 핵 분류에 관한 세포내이입 경로를 계합하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 절단된 bFGF (tbFGF) 펩타이드 (a.a.30-115)는 bFGF 수용체 결합 부위 및 헤파린-결합 부위의 일부를 함유하고, 이 펩타이드는 세포 증식을 자극함이 없이 세포 표면 상의 FGFR에 효과적으로 결합할 수 있다. tbFGF의 서열은 KRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTY (서열번호: 13)이다 (예를 들어, 문헌 [Cai et al., Int J Pharm. 2011 Apr 15;408(1-2):173-82] 참고).
일부 경우에, 표적화 리간드는 FGF 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공하고 아미노산 서열 HFKDPK (서열번호: 5)을 포함한다 (예를 들어, 하기 실시예 섹션 참고). 일부 경우에, 표적화 리간드는 FGF 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공하고 아미노산 서열 LESNNYNT (서열번호: 6)을 포함한다 (예를 들어, 하기 실시예 섹션 참고).
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 세포 표면 당단백질에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 세포-세포 유착 분자에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, 일부 경우에, 표적화 리간드는, 세포-세포 유착 인자로 작용하는 세포 표면 당단백질이고, (예를 들어, 골수의) 조혈 줄기 세포 상에서 발견되는 단백질인, CD34에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 셀렉틴 예컨대 E-셀렉틴, L-셀렉틴, 또는 P-셀렉틴의 단편 (예를 들어, 셀렉틴의 제1 40 아미노산에서 발견된 신호 펩타이드)이다. 일부 경우에 대상체 표적화 리간드는 셀렉틴의 스시 도메인 (예를 들어, E-셀렉틴, L-셀렉틴, P-셀렉틴)을 포함한다.
일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 MIASQFLSALTLVLLIKESGA (서열번호: 7)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 7로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 MVFPWRCEGTYWGSRNILKLWVWTLLCCDFLIHHGTHC (서열번호: 8)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 8로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 MIFPWKCQSTQRDLWNIFKLWGWTMLCCDFLAHHGTDC (서열번호: 9)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 9로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 MIFPWKCQSTQRDLWNIFKLWGWTMLCC (서열번호: 10)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 10으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
대상체 표적화 리간드로서 사용될 수 있는 셀렉틴의 단편 (예를 들어, 셀렉틴의 제1 40 아미노산에서 발견된 신호 펩타이드)은 일부 경우에 구체적으로-변형된 시알로뮤신에 대한 강한 결합을 달성할 수 있고, 예를 들어, 세포외 CD34의 다양한 시알릴 루이스x 변형 / O-시알릴화는 P-셀렉틴, L-셀렉틴 및 E-셀렉틴이 골수, 림프, 비장 및 편도의 구획에 대한 차별적인 친화성으로 이어질 수 있다. 반대로, 일부 경우에 표적화 리간드는 CD34의 세포외 부분일 수 있다. 일부 이러한 사례에서, 리간드의 시알릴화의 변형은 다양한 셀렉틴에 대해 표적화 리간드를 차별적으로 표적화하기 위해 이용될 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 E-셀렉틴에 대해 표적화된 결합을 제공한다. E-셀렉틴은 내피 세포에 대한 종양 세포의 접착을 매개할 수 있고 E-셀렉틴에 대한 리간드는 암 전이에서 역할을 수행할 수 있다. 예로서, (예를 들어, 인간 중성구로부터 유래된) P-셀렉틴 당단백질 -1 (PSGL-1)은 (예를 들어, 내피에 의해 발현된) E-셀렉틴에 대해 고-효율 리간드로 작용할 수 있고, 대상체 표적화 리간드는 따라서 일부 경우에 PSGL-1 아미노산 서열 (또는 E-셀렉틴에 결합하는 이의 단편)을 포함한다. 또 다른 예로서, E-셀렉틴 리간드-1 (ESL-1)는 E-셀렉틴에 결합할 수 있고, 대상체 표적화 리간드는 따라서 일부 경우에 ESL-1 아미노산 서열 (또는 E-셀렉틴에 결합하는 이의 단편)을 포함한다. 일부 경우에, PSGL-1 및/또는 ESL-1 아미노산 서열 (또는 E-셀렉틴에 결합하는 이의 단편)을 갖는 표적화 리간드는 E-셀렉틴에 결합하기 위해 하나 이상의 시알릴 루이스 변형을 담지한다. 또 다른 예로서, 일부 경우에 CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, 및 Mac2-BP는 E-셀렉틴에 결합할 수 있고, 대상체 표적화 리간드는 따라서 일부 경우에 CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, 및 Mac2-BP 중 임의의 아미노산 서열 (또는 E-셀렉틴에 결합하는 이의 단편)을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 P-셀렉틴에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 경우에 PSGL-1은 이러한 표적화된 결합을 제공할 수 있다. 일부 경우에 대상체 표적화 리간드는 따라서 일부 경우에 PSGL-1 아미노산 서열 (또는 P-셀렉틴에 결합하는 이의 단편)을 포함한다. 일부 경우에, PSGL-1 아미노산 서열 (또는 P-셀렉틴에 결합하는 이의 단편)을 갖는 표적화 리간드는 P-셀렉틴에 결합하기 위해 하나 이상의 시알릴 루이스 변형을 담지한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 트랜스페린 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 아미노산 서열 THRPPMWSPVWP (서열번호: 11)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 11로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 인테그린 (예를 들어, α5β1 인테그린)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 아미노산 서열 RRETAWA (서열번호: 12)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 12로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산 서열 RGDGW (서열번호: 181)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 181로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 아미노산서열 RGD를 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 인테그린에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 아미노산 서열 GCGYGRGDSPG (서열번호: 182)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 182로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에 그와 같은 표적화 리간드는 N-말단 상에서 아세틸화되고 및/또는 C-말단 상에서 아미드화 (NH2)된다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 인테그린 (예를 들어, α5β3 인테그린)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 아미노산 서열 DGARYCRGDCFDG (서열번호: 187)과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 187로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 뇌를 표적화하기 위해 사용된 표적화 리간드는 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) (예를 들어, YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGG (서열번호:183))로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 서열번호:183으로 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. (본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같은) 임의의 표적화 리간드에 대해서와 같이, RVG는 고착 도메인 (예를 들어, 9R 펩타이드 서열)에 접합 및/또는 융합될 수 있다. 예를 들어, 대상체 나노입자의 표면 도포의 일부로 사용된 대상체 전달 분자는 서열YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGGRRRRRRRRR (서열번호: 180)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 c-키트 수용체에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 서열번호:184로 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 184로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 CD27에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 서열번호:185로 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 185로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 CD150에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 일부 이러한 사례에서, 표적화 리간드는 서열번호:186으로 제시된 아미노산 서열과 85% 또는 그 초과 서열 동일성 (예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 서열번호: 186으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는 KLS CD27+/IL-7Ra-/CD150+/CD34- 조혈 줄기 및 선조 세포 골수 세포에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, (본 명세서에서 다른 곳에 기재된) 유전자 편집 도구(들)이 BCL11a 전사 인자의 발현을 방해하고 결과적으로 태아 헤모글로빈을 생성하기 위해 도입될 수 있다. 또 다른 예로서, 베타-글로빈 (HBB) 유전자가 상응하는 상동 지정 복구 공여체 템플레이트로 변경된 E7V 치환을 정정하기 위해 직접적으로 표적화될 수 있다. 하나의 예시로서, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)는 HBB 유전자 내 유전자좌에 결합할 것이고 게놈에서 이중-가닥 또는 단일-가닥 절단을 생성하여, 게놈 회복을 개시하도록 적절한 가이드 RNA로 전달될 수 있다. 일부 경우에, DNA 공여체 템플레이트 (단일 가닥 또는 이중 가닥)가 (적재물의 일부로) 도입되고 14-30일 동안 방출되는 반면 가이드 RNA/CRISPR/Cas 단백질 복합체 (리보핵단백질 복합체)는 1-7일의 경과에 걸쳐 방출될 수 있다. 일부 경우에, 적재물은, 예를 들어, 상동성 지향된 회복 (HDR)을 증진하고 인델 형성을 제한하기 위해 사용될 수 있는 ku70 또는 ku80에 대한 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 경우에, SIRT6에 대한 mRNA는 뉴클레아제-매개된 부위-특이적인 절단에 따른 공여체 가닥의 HDR-유도된 삽입을 증진하도록 14-30d에 걸쳐 방출된다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는, T-세포 수용체를 변형하기 위해, CD4+ 또는 CD8+ T-세포, 조혈 줄기 및 선조 세포 골수 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, (본 명세서에서 다른 곳에 기재된) 유전자 편집 도구(들)가 T-세포 수용체를 변형하기 위해 도입될 수 있다. T-세포 수용체는 신규한 T-세포 수용체에 대한 상응하는 상동 지정 복구 공여체 템플레이트로 직접적으로 표적화될 수 있고 치환될 수 있다. 일 예로서, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)는 TCR 유전자 내 유전자좌에 결합할 것이고 게놈에서 이중-가닥 또는 단일-가닥 절단을 생성하여, 게놈 회복을 개시하도록 적절한 가이드 RNA로 전달될 수 있다. 일부 경우에, DNA 공여체 템플레이트 (단일 가닥 또는 이중 가닥)가 HDR을 위해 (적재물의 일부로) 도입된다. 다른 CRISPR 가이드 RNA 및 HDR 공여체 서열, 표적화 베타-글로빈, CCR5, T-세포 수용체, 또는 임의의 다른 관심 유전자, 및/또는 다른 발현 벡터가 본 개시내용에 따라 이용될 수 있다는 것이 숙련가에게 분명할 것이다.
함께 표적화 리간드를 구성하는 2개의 상이한 펩타이드 서열을 갖는 전달 분자가 또한 제공된다. 예를 들어, 일부 경우에 표적화 리간드는 2가 (예를 들어, 헤테로2가)이다. 일부 경우에, 세포-침투 펩타이드 및/또는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 결합 리간드가 본 개시내용의 임의의 표적화 리간드와 함께 헤테로 2가 세포내이입 촉발자로서 사용된다. 헤테로2가 표적화 리간드는 표적화 리간드 중 하나로부터 친화성 서열 및 상이한 표적화 리간드로부터 오쏘스테릭 결합 서열 (예를 들어, 원하는 세포내이입 이동조절 경로에 관여하는 것으로 알려진 것)을 포함할 수 있다.
고착 도메인
일부 구현예에서, 표면 도포는 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 접합된 표적화 리간드를 포함하는 전달 분자를 포함한다 (예를 들어, 도 10, 패널 A-B 참고). 일부 경우에 표적화 리간드는, 예를 들어, 활성을 보전하기 위해, 표적화 리간드의 활성 영역에 대해 원위에서 고착 도메인에 대한 (또는 링커에 대한) 콘주게이트이다. 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)은 반복하는 양이온성 잔기 (예를 들어, 아르기닌, 라이신, 히스티딘)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 양이온성 고착 도메인은 3 내지 30 아미노산 (예를 들어, 3-28, 3-25, 3-24, 3-20, 4-30, 4-28, 4-25, 4-24, 또는 4-20 아미노산)의 범위인 길이를 갖는다. 일부 경우에, 양이온성 고착 도메인은 4 내지 24 아미노산의 범위인 길이를 갖는다. 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)의 적합한 예는 비제한적으로: RRRRRRRRR (9R)(서열번호: 15) 및 HHHHHH (6H)(서열번호: 16)을 포함한다.
일부 경우에, 대상체 전달 분자의 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)은, 예를 들어, 표적화 리간드가 나노입자를 원하는 세포/세포 표면 단백질에 대해 표적화하기 위해 사용되도록, 나노입자의 표면을 전달 분자로 도포하기 위한 앵커로 사용된다 (예를 들어, 도8, 도 9, 및 도 10 참고). 따라서, 일부 경우에, 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)은 나노입자의 하전된 탈피할 수 있는 층과 정전기적으로 상호작용한다. 일부 경우에, 안정화층은 음전하를 가지고 양성으로 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)은 따라서 안정화층과 상호작용하여, 전달 분자를 나노입자에 효과적으로 고착하고 나노입자 표면을 대상체 표적화 리간드로 도포한다 (예를 들어, 도 8, 도 9, 및 도 10 참고).
고착 도메인에 표적화 리간드의 콘주게이션은 임의의 편리한 기술에 의해 달성될 수 있고 많은 상이한 콘주게이션 화학이 당해 분야의 숙련가에게 알려질 것이다. 일부 경우에 콘주게이션은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합)을 통해 된다. 일부 경우에 콘주게이션은 아민-반응성 화학반응 (예를 들어, 고착 도메인에서 아미노산 잔기로부터 측쇄 상에 존재하는 아민)을 사용하여 달성된다. 전술한 바와 같이, 표적화 리간드는 콘주게이션을 용이하게 할 수 있는 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)은 콘주게이션을 용이하게 할 수 있는 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적화 리간드 및 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)은 동일한 폴리펩타이드의 일부인 덕분에 접합된다.
링커
일부 구현예에서 본 개시내용에 따른 표적화 리간드는 개재하는 링커를 통해 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 접합된다 (예를 들어, 도 10 참고). 링커는 단백질 링커 또는 비-단백질 링커일 수 있다. 링커는 일부 경우에 안정성에 도움이 될 수 있고, 보체 활성화를 방지할 수 있고, 및/또는 고착 도메인에 비하여 리간드에 대해 가요성을 제공할 수 있다.
링커에 대한 표적화 리간드 또는 고착 도메인에 대한 링커의 콘주게이션은 수많은 상이한 방법에 의해 달성될 수 있다. 일부 경우에 콘주게이션은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합, 예를 들어, 2개의 시스테인 잔기 사이, 예를 들어, 도 10 참고)을 통해 된다. 일부 경우에 콘주게이션은 아민-반응성 화학반응을 사용하여 달성된다. 일부 경우에, 표적화 리간드는 시스테인 잔기를 포함하고 시스테인 잔기를 통해 링커에 접합되고; 및/또는 고착 도메인은 시스테인 잔기를 포함하고 시스테인 잔기를 통해 링커에 접합된다. 일부 경우에, 링커는 펩타이드 링커이고 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 표적화 리간드 및 펩타이드 링커는 동일한 폴리펩타이드의 일부인 덕분에 접합되고; 및/또는 고착 도메인과 펩타이드 링커는 동일한 폴리펩타이드의 일부인 덕분에 접합된다.
일부 경우에, 대상체 링커는 폴리펩타이드이고 폴리펩타이드 링커로 지칭될 수 있다. 비록 폴리펩타이드 링커가 고려되지만, 비-폴리펩타이드 링커 (화학적 링커)가 일부 경우에 사용된다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커이다. 적합한 단백질 링커는 길이에서 4개 아미노산 내지 60개 아미노산 (예를 들어, 4-50, 4-40, 4-30, 4-25, 4-20, 4-15, 4-10, 6-60, 6-50, 6-40, 6-30, 6-25, 6-20, 6-15, 6-10, 8-60, 8-50, 8-40, 8-30, 8-25, 8-20, 또는 8-15개 길이의 아미노산)의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체 링커는 단단하다 (예를 들어, 하나 이상의 프롤린 잔기를 포함하는 링커). 단단한 링커의 하나의 비-제한적인 예는 GAPGAPGAP (서열번호: 17)이다. 일부 경우에, 폴리펩타이드 링커는 N- 또는 C-말단에 C 잔기를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 단단한 링커는 GAPGAPGAPC (서열번호: 18) 및 CGAPGAPGAP (서열번호: 19)로부터 선택된다.
어느 정도의 가요성을 갖는 펩타이드 링커가 사용될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 대상체 링커는 가요성이다. 연결하는 펩타이드는 사실상 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 가요성 링커는 일반적으로 가요성 펩타이드를 초래하는 서열을 가질 것이라는 점을 명심해야 한다. 작은 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌의 사용은 가요성 펩타이드를 생성하는데 있어서의 사용이다. 이러한 서열의 창출은 당해 분야의 숙련가에게 일상적이다. 다양한 상이한 링커가 상업적으로 입수가능하고 사용에 적합한 것으로 간주된다. 링커 폴리펩타이드 예는 글리신 폴리머 (G)n, 글리신-세린 폴리머 (예를 들어, (GS)n, GSGGSn (서열번호: 20), GGSGGSn (서열번호: 21), 및 GGGSn (서열번호: 22)을 포함하고, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머를 포함한다. 링커 예는, 비제한적으로, GGSG (서열번호: 23), GGSGG (서열번호: 24), GSGSG (서열번호: 25), GSGGG (서열번호: 26), GGGSG (서열번호: 27), GSSSG (서열번호: 28), 및 기타 동종의 것을 포함한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 당업자는 상기에 기재된 임의의 요소에 접합된 펩타이드의 디자인은 링커가 가요성 링커뿐만 아니라 가요성 구조를 거의 부여하지 않는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 모두 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 가요성 링커의 추가의 예는, 비제한적으로: GGGGGSGGGGG (서열번호: 29) 및 GGGGGSGGGGS (서열번호: 30)를 포함한다. 전술한 바와 같이, 일부 경우에, 폴리펩타이드 링커는 N- 또는 C-말단에 C 잔기를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 가요성 링커는 GGGGGSGGGGGC (서열번호: 31), CGGGGGSGGGGG (서열번호: 32), GGGGGSGGGGSC (서열번호: 33), 및 CGGGGGSGGGGS (서열번호: 34)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 대상체 폴리펩타이드 링커는 엔도솜분해적이다. 엔도솜분해적 폴리펩타이드 링커는 하기를 비제한적으로 포함한다: KALA (서열번호: 35) 및 GALA (서열번호: 36). 전술한 바와 같이, 일부 경우에, 폴리펩타이드 링커는 N- 또는 C-말단에 C 잔기를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 대상체 링커는 CKALA (서열번호: 37), KALAC (서열번호: 38), CGALA (서열번호: 39), 및 GALAC (서열번호: 40)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
설프하이드릴 커플링 반응의 예시
(예를 들어, 시스테인 잔기를 사용하여, 예를 들어, 설프하이드릴 화학반응을 통한 콘주게이션을 위함)
(예를 들어, 표적화 리간드를 링커에 접합하고, 표적화 리간드를 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 접합하고, 링커를 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 접합하고, 및 기타 동종의 것을 위함)
디설파이드 결합
유리 설프하이드릴기를 함유하는, 환원된 상태에서 시스테인 잔기는 전형적인 디설파이드 교환 반응에서 보호된 티올과 디설파이드 결합을 쉽게 형성한다.
티오에테르/티오에스테르 결합
시스테인의 설프하이드릴기는 말레이미드 및 아실 할라이드기와 반응하여, 안정한 티오에테르 및 티오에스테르 결합을 각각 형성한다.
말레이미드
아실할라이드
아자이드 - 알킨고리화부가
이 콘주게이션은 합성 펩타이드 제조에서 알킨 결합을 함유하는 시스테인 잔기의 화학적 변형에 의하거나, 또는 L-프로파르길 시스테인의 사용에 의해 촉진된다 (하기에 도시됨). 커플링은 그런 다음 Cu 촉진된 클릭 화학의 수단에 의해 달성된다.
표적화 리간드의 예
표적화 리간드의 예는, 비제한적으로, 하기 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함한다:
SCF (c-키트 수용체를 표적화하고/결합한다)
EGICRNRVTNNVKDVTKLVANLPKDYMITLKYVPGMDVLPSHCWISEMVVQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSKDLKKSFKSPEPRLFTPEEFFRIFNRSIDAFKDFVVASETSDCVVSSTLSPEKDSRVSVTKPFMLPPVA (서열번호:184);
CD70 (CD27을 표적화하고/결합한다)
PEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP (서열번호:185); 및
SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A) (CD150을 표적화하고/결합한다) SSGLVPRGSHMDAVAVYHGKISRETGEKLLLATGLDGSYLLRDSESVPGVYCLCVLYHGYIYTYRVSQTETGSWSAETAPGVHKRYFRKIKNLISAFQKPDQGIVIPLQYPVEKKSSARSTQGTTGIREDPDVCLKAP (서열번호:186)
따라서, (단독으로 또는 다른 표적화 리간드와 조합으로 사용될 수 있는) 표적화 리간드의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다:
9R-SCF
RRRRRRRRR MEGICRNRVTNNVKDVTKLVANLPKDYMITLKYVPGMDVLPSHCWISEMVVQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSKDLKKSFKSPEPRLFTPEEFFRIFNRSIDAFKDFVVASETSDCVVSSTLSPEKDSRVSVTKPFMLPPVA (서열번호:189)
9R-CD70
RRRRRRRRRPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP (서열번호:190)
CD70-9R
PEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRPRRRRRRRRR (서열번호:191)
6H-SH2D1A
MGSS HHHHHH SSGLVPRGSHMDAVAVYHGKISRETGEKLLLATGLDGSYLLRDSESVPGVYCLCVLYHGYIYTYRVSQTETGSWSAETAPGVHKRYFRKIKNLISAFQKPDQGIVIPLQYPVEKKSSARSTQGTTGIREDPDVCLKAP(서열번호:192)
6H-SH2D1A
RRRRRRRRR SSGLVPRGSHMDAVAVYHGKISRETGEKLLLATGLDGSYLLRDSESVPGVYCLCVLYHGYIYTYRVSQTETGSWSAETAPGVHKRYFRKIKNLISAFQKPDQGIVIPLQYPVEKKSSARSTQGTTGIREDPDVCLKAP(서열번호:193)
전달 분자 및 성분의 예시
(0a) 시스테인 콘주게이션 앵커 1 (CCA1)
[고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 시스테인]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP C (서열번호: 41)
(0b) 시스테인 콘주게이션 앵커 2 (CCA2)
[시스테인 - 링커 (GAPGAPGAP) - 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)]
C GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열번호: 42)
(1a) α5β1 리간드
[고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP RRETAWA (서열번호: 45)
(1b) α5β1 리간드
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)]
RRETAWAGAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열번호: 46)
(1c) α5β1 리간드 - Cys 좌측
CGAPGAPGAP(서열번호: 19)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA1 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(1d) α5β1 리간드 - Cys 우측
GAPGAPGAPC(서열번호: 18)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA2 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(2a) RGD α5β1 리간드
[고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRR GAPGAPGAP RGD (서열번호: 47)
(2b) RGD a5b1 리간드
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)]
RGD GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열번호: 48)
(2c) RGD 리간드 - Cys 좌측
CRGD (서열번호: 49)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA1 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(2d) RGD 리간드 - Cys 우측
RGDC (서열번호: 50)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA2 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(3a) 트랜스페린 리간드
[고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRRGAPGAPGAP THRPPMWSPVWP (서열번호: 51)
(3b) 트랜스페린 리간드
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)]
THRPPMWSPVWP GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열번호: 52)
(3c) 트랜스페린 리간드 - Cys 좌측
CTHRPPMWSPVWP (서열번호: 53)
CPTHRPPMWSPVWP (서열번호: 54)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA1 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(3d) 트랜스페린 리간드 - Cys 우측
THRPPMWSPVWPC (서열번호: 55)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA2 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(4a) E-셀렉틴 리간드 [1-21]
[고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRRGAPGAPGAP MIASQFLSALTLVLLIKESGA (서열번호: 56)
(4b) E-셀렉틴 리간드 [1-21]
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)]
MIASQFLSALTLVLLIKESGA GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열번호: 57)
(4c) E-셀렉틴 리간드 [1-21] - Cys 좌측
CMIASQFLSALTLVLLIKESGA (서열번호: 58)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA1 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(4d) E-셀렉틴 리간드 [1-21] - Cys 우측
MIASQFLSALTLVLLIKESGAC (서열번호: 59)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA2 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(5a) FGF 단편 [26-47]
[고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인) - 링커 (GAPGAPGAP) - 표적화 리간드]
RRRRRRRRRGAPGAPGAP KNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS (서열번호: 60)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA1 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(5b) FGF 단편 [26-47]
[표적화 리간드 - 링커 (GAPGAPGAP) - 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)]
KNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS GAPGAPGAP RRRRRRRRR (서열번호: 61)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA1 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(5c) FGF 단편 [25-47] - 좌측 상의 Cys이 고유한 것이다
CKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS (서열번호: 43)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA1 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(5d) FGF 단편 [26-47] - Cys 우측
KNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSC (서열번호: 44)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA2 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
(6a) 엑센딘 (S11C) [1-39]
HGEGTFTSDLCKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (서열번호: 2)
주석: 이것은 설프하이드릴 화학반응 (예를 들어, 디설파이드 결합) 또는 아민-반응성 화학반응 중 어느 하나를 통해 CCA1 (상기 참고)에 접합될 수 있다.
다가표면 도포
일부 경우에 표면 도포는 (임의의 원하는 조합으로) 하기의 것 중 임의의 1개 이상을 포함한다: (i) 상기에 기재된 폴리머 중 하나 이상, (ii) 하나 이상의 표적화 리간드, 하나 이상의 CPP, 및 하나 이상의 헵타펩타이드. 예를 들어, 일부 경우에 표면 도포는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 또는 그 초과) 표적화 리간드를 포함할 수 있지만, 또한 상기에 기재된 양이온성 폴리머 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 경우에 표면 도포는 하나 이상의 (예를 들어, 둘 이상, 셋 또는 그 초과) 표적화 리간드를 포함할 수 있지만, 또한 하나 이상의 CPP를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 표면 도포는 CD34 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드의 조합을 포함한다. 예를 들어, 폴리(L-아르기닌)은 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 대해 표적화된 결합을 제공하는 표면 도포의 일부로서 사용될 수 있다. 이와 같이, 일부 경우에, 양이온성 폴리머 (예를 들어, 폴리(L-아르기닌))로 나노입자를 표면 도포한 후, 코팅된 나노입자는 하이알루론산으로 인큐베이션되고, 그것에 의해 쯔비터 이온성 및 다가 표면을 형성한다.
일부 구현예에서, 표면 도포는 다가이다. 다가 표면 도포는 둘 또는 그 초과의 표적화 리간드 (예를 들어, 상이한 리간드를 포함하는 둘 또는 그 초과의 전달분자)를 포함하는 것이다. 다량체 (이 경우에 삼량체) 표면 도포 (외부 쉘)의 예는 (CD117로도 알려진, c-키트 수용체를 표적화하는) 표적화 리간드 줄기 세포 인자 (SCF), (CD27을 표적화하는) CD70, 및 (CD150을 표적화하는) SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A)를 포함하는 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, 조혈 줄기 세포 (HSC) [KLS (c-Kit+ Lin- Sca-1+) 및 CD27+/IL-7Ra-/CD150+/CD34-]를 표적화하기 위해, 대상체 나노입자는 각각 c-키트, CD27, 및 CD150을 표적화하는 표적화 리간드 SCF, CD70, 및 SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A)의 조합을 포함하는 표면 도포를 포함한다 (예를 들어, 표 1 참고). 일부 경우에, 그와 같은 표면 도포는 다른 림프양 및 골수 전구세포에 비해 HSPC 및 장기간 HSC (c-Kit+/Lin-/Sca-1+/CD27+/IL-7Ra-/CD150+/CD34-)를 선택적으로 표적화할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 모든 세 표적화 리간드 (SCF, CD70, 및 SH2D1A)는 양이온성 고착 도메인 (예를 들어, 폴리-히스티딘 예컨대 6H, 폴리-아르기닌 예컨대 9R, 및 기타 동종의 것)에 대한 융합을 통해 나노입자에 고정된다. 예를 들어, (1) (c-키트 수용체를 표적화하는) 표적화 폴리펩타이드 SCF는 X MEGICRNRVTNNVKDVTKLVANLPKDYMITLKYVPGMDVLPSHCWISEMVVQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSKDLKKSFKSPEPRLFTPEEFFRIFNRSIDAFKDFVVASETSDCVVSSTLSPEKDSRVSVTKPFMLPPVAX (서열번호:194)를 포함할 수 있고, 여기서 X는 양이온성 고착 도메인 (예를 들어, 폴리-히스티딘 예컨대 6H, 폴리-아르기닌 예컨대 9R, 및 기타 동종의 것)이고, 예를 들어, 이것은 일부 경우에 N- 및/또는 C-말단에 존재할 수 있거나, 또는 폴리펩타이드 서열 내에 포매될 수 있고; (2) (CD27을 표적화하는) 표적화 폴리펩타이드 CD70은 XPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRPX (서열번호:195)를 포함할 수 있고, 여기서 X는 양이온성 고착 도메인 (예를 들어, 폴리-히스티딘 예컨대 6H, 폴리-아르기닌 예컨대 9R, 및 기타 동종의 것)이고, 예를 들어, 이것은 일부 경우에 N- 및/또는 C-말단에 존재할 수 있거나, 또는 폴리펩타이드 서열 내에 포매될 수 있고; 그리고 (3) (CD150을 표적화하는) 표적화 폴리펩타이드 SH2D1A는 X SSGLVPRGSHMDAVAVYHGKISRETGEKLLLATGLDGSYLLRDSESVPGVYCLCVLYHGYIYTYRVSQTETGSWSAETAPGVHKRYFRKIKNLISAFQKPDQGIVIPLQYPVEKKSSARSTQGTTGIREDPDVCLKAP (서열번호:196)를 포함할 수 있고, 여기서 X는 양이온성 고착 도메인 (예를 들어, 폴리-히스티딘 예컨대 6H, 폴리-아르기닌 예컨대 9R, 및 기타 동종의 것)이고, 예를 들어, 이것은 일부 경우에 N- 및/또는 C-말단에 존재할 수 있거나, 또는 폴리펩타이드 서열 내에 포매될 수 있다 (예를 들어, 예컨대 MGSS X SSGLVPRGSHMDAVAVYHGKISRETGEKLLLATGLDGSYLLRDSESVPGVYCLCVLYHGYIYTYRVSQTETGSWSAETAPGVHKRYFRKIKNLISAFQKPDQGIVIPLQYPVEKKSSARSTQGTTGIREDPDVCLKAP (서열번호:197)).
전술한 바와 같이, 본 개시내용의 나노입자는 원하는 세포 유형을 표적화하거나, 또는 세포 유형의 원하는 조합을 표적화하기 위해 (표면 도포의 일부로) 다중 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 마우스 및 인간 조혈 세포 계통 내에서 관심 있는 세포의 예는 이들 세포에 대해 확인된 마커와 함께 도 17 (패널 A-B)에 묘사되어 있다. 예를 들어, 관심 있는 세포 표면 마커의 다양한 조합은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: [마우스] (i) CD150; (ii) Sca1, cKit, CD150; (iii) CD150 및 CD49b; (iv) Sca1, cKit, CD150, 및 CD49b; (v) CD150 및 Flt3; (vi) Sca1, cKit, CD150, 및 Flt3; (vii) Flt3 및 CD34; (viii) Flt3, CD34, Sca1, 및 cKit; (ix) Flt3 및 CD127; (x) Sca1, cKit, Flt3, 및 CD127; (xi) CD34; (xii) cKit 및 CD34; (xiii) CD16/32 및 CD34; (xiv) cKit, CD16/32, 및 CD34; 및 (xv) cKit; 및 [인간] (i) CD90 및 CD49f; (ii) CD34, CD90, 및 CD49f ; (iii) CD34; (iv) CD45RA 및 CD10; (v) CD34, CD45RA, 및 CD10; (vi) CD45RA 및 CD135; (vii) CD34, CD38, CD45RA, 및 CD135; (viii) CD135; (ix) CD34, CD38, 및 CD135; 및 (x) CD34 및 CD38. 따라서, 일부 경우에 표면 도포는 하기로부터 선택된 표면 단백질 또는 표면 단백질의 조합에 대해 표적화된 결합을 제공하는 하나 이상의 표적화 리간드를 포함한다: [마우스] (i) CD150; (ii) Sca1, cKit, CD150; (iii) CD150 및 CD49b; (iv) Sca1, cKit, CD150, 및 CD49b; (v) CD150 및 Flt3; (vi) Sca1, cKit, CD150, 및 Flt3; (vii) Flt3 및 CD34; (viii) Flt3, CD34, Sca1, 및 cKit; (ix) Flt3 및 CD127; (x) Sca1, cKit, Flt3, 및 CD127; (xi) CD34; (xii) cKit 및 CD34; (xiii) CD16/32 및 CD34; (xiv) cKit, CD16/32, 및 CD34; 및 (xv) cKit; 및 [인간] (i) CD90 및 CD49f; (ii) CD34, CD90, 및 CD49f ; (iii) CD34; (iv) CD45RA 및 CD10; (v) CD34, CD45RA, 및 CD10; (vi) CD45RA 및 CD135; (vii) CD34, CD38, CD45RA, 및 CD135; (viii) CD135; (ix) CD34, CD38, 및 CD135; 및 (x) CD34 및 CD38. 대상체 나노입자가 1 초과의 표적화 리간드를 포함할 수 있고, 일부 세포가 중첩 마커를 포함하기 때문에, 표면 도포의 조합을 사용하여 다중 상이한 세포 유형이 표적화될 수 있고, 예를 들어, 일부 경우에 표면 도포는 하나의 특이적 세포 유형을 표적화할 수 있는 반면 다른 사례에서 표면 도포는 1 초과의 특이적 세포 유형 (예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 또는 그 초과 세포 유형)을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 조혈 계열 내의 임의의 세포의 조합이 표적화될 수 있다. 예시로서, (CD34에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드를 사용하는) 표적화 CD34는 조혈 계열 내의 몇 개의 상이한 세포로 적재물의 나노입자 전달로 이어질 수 있다 (예를 들어, 도 17, 패널 A 및 B 참고).
iv. 전달
세포에 핵산, 단백질, 또는 리보핵단백질 적재물을 전달하는 방법이 제공된다. 전술한 바와 같이, 일부 경우에 적재물은 유전자 편집 도구를 포함한다. 따라서, 일부 경우에 본 방법은, 일부 경우에, 예를 들어, 공여체 DNA 템플레이트의 존재에서 수행될 때, 상동지정 복구를 유발시키는 부위-특이적인 게놈 편집을 수행하기 위해 사용된다.
그와 같은 방법은 세포를 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)는 임의의 원하는 진핵 표적 세포에 적재물을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, 설치류, 마우스, 랫트, 유제류, 소, 양, 돼지, 말, 낙타, 토끼, 갯과 (개), 고양이과 (고양이), 영장류, 비-인간 영장류, 또는 인간의 세포)이다. 임의의 세포 유형이 표적화될 수 있고, 일부 경우에 특정 세포의 특이적 표적화는, 예를 들어, 표면 도포의 일부로 표적화 리간드의 존재에 좌우되고, 여기서 표적화 리간드는 특정 세포 유형에 대한 표적화 결합을 제공한다. 예를 들어, 표적화될 수 있는 세포는 비제한적으로, 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 장기간 HSC, 단기 HSC, 조혈 줄기 및 선조 세포 골수 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구세포, 림프양 선조 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 중성구, 대식세포, 적혈구 선조 세포 (예를 들어, HUDEP 세포), 거핵구-적혈구 선조 세포 (MEP), 공통 골수 전구세포 (CMP), 다분화능 선조 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기간 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 별아교세포, 췌장 세포, 췌장 β-소도 세포, 근육 세포, 골격 근육 세포, 심장 근육 세포, 간세포, 지방 세포, 장내 세포, 결장의 세포, 및 위의 세포를 포함한다.
(예를 들어, 췌장, 조혈 줄기 세포 및 다분화능 선조세포, 등의 세포, 뉴런을 표적화하기 위한) 다양한 적용의 예가, 예를 들어, 표적화 리간드의 맥락에서 상기에 논의되어 있다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포 및 다분화능 선조세포는 생체내 유전자 편집 (예를 들어, 삽입)을 위해 표적화될 수 있다. 심지어 생체내에서 골수 세포의 1% (대략 150억 개 세포)를 편집하는 것이 생체외 요법보다 많은 세포 (대략 100억 개의 세포)를 표적화할 수 있다. 또 다른 예로서, 췌장 세포 (예를 들어, β 소도 세포)는, 예를 들어, 췌장암을 치료하기 위해, 당뇨병을 치료하기 위해, 등으로 표적화될 수 있다. 또 다른 예로서, 뉴런과 같은 뇌에서의 체세포는 (예를 들어, 징후 예컨대 헌팅턴병, 파킨슨 (예를 들어, LRRK2 돌연변이), 및 ALS (예를 들어, SOD1 돌연변이)를 치료하기 위해) 표적화될 수 있다. 일부 경우에 이것은 직접적인 두개내 주사를 통해 달성될 수 있다.
또 다른 예로서, 내피 세포 및 조혈 시스템의 세포 (예를 들어, 거핵구 및/또는 거핵구의 임의의 선조세포 업스트림 예컨대 거핵구-적혈구 선조 세포 (MEP), 공통 골수 전구세포 (CMP), 다분화능 선조 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기간 HSC (LT-HSC) - 예를 들어, 도 17 참고)는 폰 빌레브란트 질환을 치료하기 위해 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 인코딩하는 유전자에 돌연변이를 장착하는 세포 (예를 들어, 내피 세포, 거핵구 및/또는 거핵구 임의의 선조 세포 업스트림 예컨대 MEP, CMP, MPP, HSC 예컨대 ST-HSC, IT-HSC, 및/또는 LT-HSC)가 (예를 들어, 기능적 VWF 단백질 및/또는 기능적 VWF 단백질을 인코딩하는 핵산의 전달을 통해) 활성 단백질을 도입하거나 및/또는, 예를 들어, (예를 들어, 유전자 편집 도구의 전달 및 DNA 공여체 템플레이트의 전달을 통해) 대체 서열을 도입함에 의해 돌연변이된 유전자를 편집하기 위해 (시험관내, 생체외, 생체내) 표적화될 수 있다. 상기 사례 중 일부에서 (예를 들어, VWF를 인코딩하는 유전자에서 돌연변이를 장착하는 세포를 표적화하는 것과 관련된 사례에서 폰 빌레브란트 질환을 치료하기 위해 관련된 사례에서), 대상체 표적화 리간드는 E-셀렉틴에 대한 표적화된 결합을 제공한다.
또 다른 예로서, 줄기 세포 계통의 세포 (예를 들어, 조혈계열의 줄기 및/또는 선조 세포, 예를 들어, GMP, MEP, CMP, MLP, MPP, 및/또는 HSC)가 세포에서의 줄기 세포 인자 (SCF)의 발현을 증가시키기 위해 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)로 표적화될 수 있어, 따라서 표적화된 세포의 증식을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)는 표적화된 세포에 대해 SCF 및/또는 SCF를 인코딩하는 핵산 (DNA 또는 mRNA)을 전달하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물은 알려진 원인이 되는 돌연변이, 예를 들어, 게놈에서의 돌연변이에 연관된 임의의 질환을 포함하는 임의의 수의 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 겸상적혈구질환, β 지중해 빈혈, HIV, 골수 이형성 증후군, JAK2-매개된 진성 적혈구 증가증, JAK2-매개된 일차 골수 섬유증, JAK2-매개된 백혈병, 및 다양한 혈액학적 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 추가의 비-제한적인 예로, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 또한 B-세포 항체 생성, 면역 요법 (예를 들어, 체크포인트 차단 시약의 전달), 및 줄기 세포 분화 적용을 위해 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 KLS CD27+/IL-7Ra-/CD150+/CD34- 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, (본 명세서에서 다른 곳에 기재된) 유전자 편집 도구(들)는 BCL11a 전사 인자의 발현을 방해하고 결과적으로 태아 헤모글로빈을 생성하기 위해 도입될 수 있다. 또 다른 예로서, 베타-글로빈 (HBB) 유전자가 상응하는 상동 지정 복구 공여체 템플레이트로 변경된 E7V 치환을 정정하기 위해 직접적으로 표적화될 수 있다. 하나의 예시로서, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)는 HBB 유전자 내 유전자좌에 결합할 것이고 게놈에서 이중-가닥 또는 단일-가닥 절단을 생성하여, 게놈 회복을 개시하도록 적절한 가이드 RNA로 전달될 수 있다. 일부 경우에, DNA 공여체 템플레이트 (단일 가닥 또는 이중 가닥)가 (적재물의 일부로) 도입되고 14-30일 동안 방출되는 반면 가이드 RNA/CRISPR/Cas 단백질 복합체 (리보핵단백질 복합체)는 1-7일의 경과에 걸쳐 방출될 수 있다. 일부 경우에, 적재물은, 예를 들어, 상동성 지향된 회복 (HDR)을 증진하고 인델 형성을 제한하기 위해 사용될 수 있는 ku70 또는 ku80에 대한 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 경우에, SIRT6에 대한 mRNA는 뉴클레아제-매개된 부위-특이적인 절단에 따른 공여체 가닥의 HDR-유도된 삽입을 증진하도록 14-30d에 걸쳐 방출된다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는, T-세포 수용체를 변형하기 위해, CD4+ 또는 CD8+ T-세포, 조혈 줄기 및 선조 세포 골수 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한 표적화된 결합을 제공한다. 예를 들어, (본 명세서에서 다른 곳에 기재된) 유전자 편집 도구(들)가 T-세포 수용체를 변형하기 위해 도입될 수 있다. T-세포 수용체는 신규한 T-세포 수용체에 대한 상응하는 상동 지정 복구 공여체 템플레이트로 직접적으로 표적화될 수 있고 치환될 수 있다. 일 예로서, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas9, CasX, CasY, Cpf1)는 TCR 유전자 내 유전자좌에 결합할 것이고 게놈에서 이중-가닥 또는 단일-가닥 절단을 생성하여, 게놈 회복을 개시하도록 적절한 가이드 RNA로 전달될 수 있다. 일부 경우에, DNA 공여체 템플레이트 (단일 가닥 또는 이중 가닥)가 HDR을 위해 (적재물의 일부로) 도입된다. 다른 CRISPR 가이드 RNA 및 HDR 공여체 서열, 표적화 베타-글로빈, CCR5, T-세포 수용체, 또는 임의의 다른 관심 유전자, 및/또는 다른 발현 벡터가 본 개시내용에 따라 이용될 수 있다는 것이 숙련가에게 분명할 것이다.
일부 경우에, 세포가 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)와 접촉하는 경우, 본 접촉은 시험관내 (예를 들어, 세포는 배양중에 있음)에서 되고, 예를 들어, 세포는 확립된 조직 배양 세포주의 세포일 수 있다. 일부 경우에, 접촉은 생체외 (예를 들어, 세포는 개체, 예를 들어 환자로부터 단리된 일차 세포 (또는 최근 자손)임)에서 된다. 일부 경우에, 세포는 생체내이고 따라서 유기체의 내부 (의 일부)에 있다. 생체내 접촉의 예로, 일부 경우에 접촉 단계는 개체에 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)의 투여를 포함한다.
대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)는 임의의 하기 경로를 통해 상기 대상체에 도입 (즉, 개체에 투여)될 수 있다: 전신, 국소, 비경구, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 두개내 (i.c.), 척수내, 안구내, 진피내 (i.d.), 근육내 (i.m.), 림프내 (i.l.), 또는 척수액내.　 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)은 주사 (예를 들어, 전신 주사, 직접적인 국소 주사, 종양 및/또는 종양절제 부위 안이나 근처로 국소 주사, 등), 카테터, 등에 의해 도입될 수 있다.　국소 전달 (예를 들어, 종양 및/또는 암 부위로 전달)을 위한 방법의 예는, 예를 들어 관절, 종양, 또는 장기 안으로, 또는 관절, 종양, 또는 장기 근처로, 예를 들어, 볼러스 주사, 예를 들어 주사기에 의해; 예를 들어, 연속적 주입에 의해, 예를 들어 캐뉼라 삽입에 의해, 예를 들어 대류로 주입을 포함한다 (예를 들어 본 명세서에 참고로 편입된 미국 출원 번호 20070254842 참고).
대상체에 대한 치료의 투여의 횟수는 다양할 수 있다. 개체 안으로 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)를 도입하는 것은 한번일 수 있지만; 특정 상황에서, 이러한 치료는 제한된 기간 동안 개선을 유도할 수 있고 반복된 치료의 진행중인 시리즈를 요할 수 있다. 다른 상황에서, 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)의 다중 투여가 효과가 관측되기 전에 요구될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 정확한 프로토콜은 질환 또는 병태, 질환의 단계 및 치료되어 지는 개체의 파라미터에 의존한다.
"치료적으로 효과적인 용량" 또는 "치료적 용량"은 원하는 임상 결과에 영향을 미치는 (즉, 치료적 효능을 달성하는) 충분한 양이다. 치료적으로 효과적인 용량은 하나 이상의 투여에서 투여될 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 대상체 나노입자 (또는 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클)의 치료적으로 효과적인 용량은 개체에 투여될 때, 질환 상태/질병의 진행을 완화하거나, 개선하거나, 안정화시키거나, 역전시키거나, 예방하거나, 늦추거나 또는 지연시키기에 충분한 양이다.
예로 치료 중재는 숙주 게놈에 통합된 모든 임의의 레트로바이러스 DNA를 제거하는 것에 부가하여 HIV 감염에 대한 내성을 만드는 것이다. T-세포는 HIV에 의해 직접적으로 영향을 받고 따라서 CD34+ 및 CD45+ 세포에 대한 하이브리드 혈액 표적화 전략은 이중 유도된 뉴클레아제 전달에 대해 조사될 수 있다. HSC 및 T-세포를 동시에 표적화하고 (예를 들어, 단일 입자 내에) 다중 유도된 뉴클레아제를 통해 CCR5-Δ32 및 gag/rev/pol 유전자에 절제를 전달함에 의해, 환자의 삶을 통해 지속되는 보편적인 HIV 치료가 생성될 수 있다.
v. 공동-전달 (본 개시내용의 나노입자를 요하지 않음)
전술한 바와 같이, 동일한 패키지의 일부로 다중 적재물을 전달하는 하나의 이점은 각각의 적재물의 효율이 희석되지 않는다는 것이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, (예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 유전자 편집 도구는 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 본 전달 비히클은 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 게놈 편집 효율을 증가시키는 비-코딩 RNA와 조합하여 전달된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자 편집 도구는 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 본 전달 비히클은 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 세포 분열 및/또는 분화를 조절하는 비-코딩 RNA와 조합하여 전달된다. 예를 들어, 일부 경우에 하나 이상의 유전자 편집 도구는 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 본 전달 비히클은 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 세포 분열을 조절하는 비-코딩 RNA와 조합하여 전달된다. 일부 경우에 하나 이상의 유전자 편집 도구는 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 본 전달 비히클은 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 분화를 조절하는 비-코딩 RNA와 조합하여 전달된다. 일부 경우에, 하나 이상의 유전자 편집 도구는 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 본 전달 비히클은 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 단백질 (및/또는 이를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA) 및/또는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 또는 상동성 지향된 회복 (HDR)을 향해 세포 DNA 회복 기구를 편향시키는 비-코딩 RNA와 조합하여 전달된다.
전술한 바와 같이, 일부 경우에 전달 비히클은 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없다. 예를 들어, 일부 경우에 전달 비히클은 바이러스이고 일부 경우에 전달 비히클은 비-바이러스이다. 비-바이러스 전달 시스템의 예는 다중 핵산 적재물, 또는 단백질과 핵산 적재물의 조합을 함께 응축하기 위해 사용될 수 있는 물질을 포함한다. 그 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: (1) 지질 기반 입자 예컨대 쯔비터이온성 또는 양이온성 지질, 및 엑소좀 또는 엑소좀-유래된 소포; (2) 무기/하이브리드 복합 입자 예컨대 핵산 및/또는 단백질 적재물과 함께-응축된 이온성 착물을 포함하는 것, 및 Ca, Mg, Si, Fe의 양이온성 이온성 상태 및 생리적 음이온 예컨대O2-, OH, PO4 3-, SO4 2-로부터 응축될 수 있는 복합체; (3) 탄수화물 전달 비히클 예컨대 사이클로덱스트린 및/또는 알기네이트; (4) 중합체 및/또는 공중합체 복합체 예컨대 폴리(아미노-산)계 정전 복합체, 폴리(아미도-아민), 및 양이온성 폴리(B-아미노 에스테르); 및(5) 바이러스 유사 입자 (예를 들어, 단백질 및 핵산 기재) 예컨대 Li2016 인공 바이러스. 바이러스 전달 시스템의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 및 렌티바이러스.
공동-전달을 위한 적재물의 예
일부 구현예에서 하나 이상의 유전자 편집 도구는 (예를 들어, 동일한 패키지/전달 비히클의 일부로서, 여기서 본 전달 비히클은 본 개시내용의 나노입자일 필요는 없음) 하기의 것 중 하나 이상과 조합하여 전달될 수 있다: SCF (및/또는 SCF를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA), HoxB4 (및/또는 HoxB4를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA), BCL-XL (및/또는 BCL-XL을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA), SIRT6 (및/또는 SIRT6을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA), miR-155를 억제하는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA 및/또는 LNA), ku70 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA), 및 ku80 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA).
함께 전달될 수 있는 마이크로RNA (RNA 또는 RNA를 인코딩하는 DNA로 전달됨)의 예에 대해서는 도 18A를 참고한다. 예를 들어, 하기 목적을 위해 하기 마이크로RNA가 사용될 수 있다: 외배엽 계열을 향한 만능 줄기 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-430/427/302; 내배엽 계열을 향한 만능 줄기 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-109 및/또는 miR-24; 내배엽 계열을 향한 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-122 및/또는 miR-192; 각질형성 세포 운명을 향한 외배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-203; 평활근 운명을 향한 신경능 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-145; 신경교세포 운명 및/또는 뉴런 운명을 향한 신경 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-9 및/또는 miR-124a; 연골 세포 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-199a; 골아세포 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-296 및/또는 miR-2861; 심장근육 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-1; 심장근육 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-133; 골격근육 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-214, miR-206, miR-1 및/또는 miR-26a; 골격근육 운명을 향한 중배엽 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-133, miR-221, 및/또는 miR-222; 분화를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-223; 분화를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-128a 및/또는 miR-181a; 림프양 선조세포를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-181; 림프양 선조세포를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-146; 골수전구세포를 향한 조혈 선조 세포의 분화를 차단하기 위해: miR-155, miR-24a, 및/또는 miR-17; T 세포 운명을 향한 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-150; 과립구 운명을 향한 골수전구세포의 분화를 차단하기 위해: miR-223; 단핵구 운명을 향한 골수전구세포의 분화를 차단하기 위해: miR-17-5p, miR-20a, 및/또는 miR-106a; 적혈구 운명을 향한 골수전구세포의 분화를 차단하기 위해: miR-150, miR-155, miR-221, 및/또는 miR-222; 및 적혈구 운명을 향한 골수전구세포의 분화를 촉진하기 위해: miR-451 및/또는 miR-16.
(예를 들어, 본 명세서에서 다른 곳에 기재된) 하나 이상의 유전자 편집 도구와 함께 전달될 수 있는 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)의 예에 대해서는 도 18B를 참고한다. 예를 들어, 하기 목적을 위해 하기 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질) (예를 들어, 단백질로 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 예컨대 DNA 또는 RNA로 전달됨)이 사용될 수 있다: 공통 림프양 선조세포 계통을 향한 조혈 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-7; 공통 골수전구세포 계통을 향한 조혈 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-3, GM-CSF, 및/또는 M-CSF; B-세포 운명을 향한 공통 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-3, IL-4, 및/또는 IL-7; 천연 살해 세포 운명을 향한 공통 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-15; T-세포 운명을 향한 공통 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-2, IL-7, 및/또는 Notch; 수지상 세포 운명을 향한 공통 림프양 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: Flt-3 리간드; 수지상 세포 운명을 향한 공통 골수전구세포의 분화를 촉진하기 위해: Flt-3 리간드, GM-CSF, 및/또는 TNF-알파; 과립구-대식세포 선조 세포 계통을 향한 공통 골수전구세포의 분화를 촉진하기 위해: GM-CSF; 거핵구-적혈구 선조 세포 계통을 향한 공통 골수전구세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-3, SCF, 및/또는 Tpo; 거핵구 적혈구 운명을 향한 거핵구-적혈구 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: IL-3, IL-6, SCF, 및/또는 Tpo; 적혈구 운명을 향한 거핵구-적혈구 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: 에리트로포이에틴; 혈소판 운명을 향한 거핵구의 분화를 촉진하기 위해: IL-11 및/또는 Tpo; 단핵구 계열을 향한 과립구-대식세포 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: GM-CSF 및/또는 M-CSF; 골수아세포 계열을 향한 과립구-대식세포 선조 세포의 분화를 촉진하기 위해: GM-CSF; 단핵구-유래된 수지상 세포 운명을 향한 단핵구의 분화를 촉진하기 위해: Flt-3 리간드, GM-CSF, IFN-알파, 및/또는 IL-4; 대식세포 운명을 향한 단핵구의 분화를 촉진하기 위해: IFN-감마, IL-6, IL-10, 및/또는 M-CSF; 중성구 운명을 향한 골수아세포의 분화를 촉진하기 위해: G-CSF, GM-CSF, IL-6, 및/또는 SCF; 호산구 운명을 향한 골수아세포의 분화를 촉진하기 위해: GM-CSF, IL-3, 및/또는 IL-5; 및 호염기구 운명을 향한 골수아세포의 분화를 촉진하기 위해: G-CSF, GM-CSF, 및/또는 IL-3.
(예를 들어, 본 명세서에서 다른 곳에 기재된) 하나 이상의 유전자 편집 도구와 함께 (예를 들어, 단백질로 및/또는 단백질을 인코딩하는 핵산 예컨대 DNA 또는 RNA로) 전달될 수 있는 단백질의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: SOX17, HEX, OSKM (Oct4/Sox2/Klf4/c-myc), 및/또는 bFGF (예를 들어, 간줄기 세포 계통을 향한 분화를 촉진하기 위함); HNF4a (예를 들어, 간세포 운명을 향한 분화를 촉진하기 위함); Poly (I:C), BMP-4, bFGF, 및/또는 8-Br-cAMP (예를 들어, 내피 줄기 세포/선조 계열을 향한 분화를 촉진하기 위함); VEGF (예를 들어, 동맥 내피 운명을 향한 분화를 촉진하기 위함); Sox-2, Brn4, Myt1l, Neurod2, Ascl1 (예를 들어, 신경 줄기 세포/선조 계열을 향한 분화를 촉진하기 위함); 및 BDNF, FCS, 포르스콜린, 및/또는 SHH (예를 들어, 분화 뉴런, 별아교세포, 및/또는 희소돌기교세포 운명을 촉진하기 위함).
(예를 들어, 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 유전자 편집 도구와 함께 (예를 들어, 단백질로 및/또는 단백질을 인코딩하는 핵산 예컨대 DNA 또는 RNA로) 전달될 수 있는 신호전달 단백질 (예를 들어, 세포외 신호전달 단백질)의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 사이토카인 (예를 들어, IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, CD8+ T-세포를 활성화하기 위함); Notch, Wnt, 및/또는 Smad 신호전달 경로 중 하나 이상을 조정하는 리간드 및 또는 신호전달 단백질; SCF; 줄기세포 분화하는 인자 (예를 들어 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, c-Myc, 및 기타 동종의 것); 및 후속적인 단리/정제/농도를 위한 일시적 표면 마커 "태그" 및/또는 형광 리포터. 예를 들어, 섬유모세포는 Sox2의 전달을 통해 신경 줄기 세포로 전환될 수 있는 반면, 이것은 Oct3/4 및 소분자 "후성유전적 재설정 인자"의 존재에서 심근 세포로 전환할 것이다. 헌팅턴병 또는 CXCR4 돌연변이가 있는 환자에 있어서, 이들 섬유모세포는 각각 뉴런 및 심장 세포와 연관된 이환 표현형 특성을 인코딩할 수 있다. 단일 패키지에 유전자 편집 정정 및 이들 인자를 전달함에 의해, 도입되어 지는 모든 인자/적재물이 아닌 하나 이상에 기인한 유해한 효과의 위험이 상당히 감소될 수 있다.
적용은 세포사 신호가 성공적이지 못한 유전자 편집에 따라 조건적일 수 있고, 세포 분화/증식/활성화가 조직/장기-특이적 프로모터 및/또는 외인성 인자에 연결되어 있는 생체내 접근법을 포함한다. 유전자 편집을 수용하는 이환 세포는 활성화 및 증식할 수 있지만, 또 다른 프로모터-유도된 발현 카세트의 존재 (예를 들어 종양 억제 인자 예컨대 p21 또는 p53의 부재에 결부된 것)에 기인하여, 이들 세포는 후속으로 제거될 것이다. 원하는 특성을 발현하는 세포는, 다른 한편으로, 원하는 다운스트림 계열로 더 분화하도록 유발될 수 있다.
vi. 키트
본 개시내용의 범위 내에는 또한 키트가 있다. 예를 들어, 일부 경우에 대상체 키트는 (임의의 조합으로) 하기의 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 표적화 리간드, (ii) 링커, (iii) 링커에 접합된 표적화 리간드, (iv) (예를 들어, 링커로 또는 없이) 고착 도메인에 접합된 표적화 리간드, (v) 탈피할 수 있는 층으로 사용하기 위한 제제 (예를 들어, 실리카), (vi) 적재물, 예를 들어, siRNA 또는 siRNA 또는 shRNA용 전사 템플레이트; 유전자 편집 도구, 및 동종의 것, (vii) 양이온성 폴리머로서 사용될 수 있는 폴리머, (viii) 음이온성 폴리머로서 사용될 수 있는 폴리머, (ix) 양이온성 폴리펩타이드로서 사용될 수 있는 폴리펩타이드, 예를 들어, 하나 이상의 HTP, 및 (x) 대상체 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클. 일부 경우에, 대상체 키트는 사용 지침을 포함할 수 있다. 키트는 키트의 내용물의 의도한 용도를 나타내는 표지를 전형적으로 포함한다. 용어 표지는 키트 상에 또는 함께 제공되거나 달리는 키트에 동봉된 임의의 서면 또는 기록된 자료를 포함한다.
본 개시내용의 예시적인 비제한적 양태
상기에 기재된 본 요지의 구현예를 포함한 양태는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양태 또는 구현예와 조합하여 유익할 수 있다. 전술한 설명에 제한됨이 없이, 본 개시내용의 특정한 비제한적인 양태가 아래 세트 A (1-74로 넘버링됨), 세트 B (1-33으로 넘버링됨), 및 세트 C (1-11로 넘버링됨)에서 제공된다. 본 개시내용을 읽음에 의해 당해 분야의 숙련가에게 분명하게 될 바와 같이, 개별적으로 넘버링된 양태의 각각은 임의의 이전의 또는 이어지는 개별적으로 넘버링된 양태로 사용될 수 있거나 또는 이들과 조합될 수 있다. 이것은 모든 이러한 양태의 조합에 대한 지지를 제공하기 위해 의도되고 그리고 하기에 명백하게 제공된 양태의 조합에 제한되지 않는다:
양태 (세트 A)
1. 코어 및 코어를 캡슐화하는 탈피할 수 있는 층을 포함하는 나노입자로, 상기 코어는 하기를 포함하고:
(i) 음이온성 폴리머 조성물;
(ii) 양이온성 폴리머 조성물;
(iii) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및
(iv) 핵산 및/또는 단백질 적재물,
여기서 (a) 상기 음이온성 폴리머 조성물은 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고; 및/또는 (b) 상기 양이온성 폴리머 조성물은 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함한다.
2. 1의 나노입자로, 상기 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된 제1 음이온성 폴리머를 포함하고; 그리고 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된 제2 음이온성 폴리머를 포함한다.
3. 1 또는 2의 나노입자로, 상기 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된 제1 양이온성 폴리머를 포함하고; 그리고 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-라이신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된 제2 양이온성 폴리머를 포함한다.
4. 1-3 중 어느 하나의 나노입자로, 상기 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 상기 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 비하여 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다.
5. 1-4 중 어느 하나의 나노입자로, 상기 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 상기 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 비하여 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다.
6. 코어 및 코어를 캡슐화하는 탈피할 수 있는 층을 포함하는 나노입자로, 상기 코어는 하기를 포함하고:
(a) 음이온성 폴리머 조성물;
(b) 양이온성 폴리머 조성물;
(c) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및
(d) 핵산 및/또는 단백질 적재물,
여기서 (a) 및 (b) 중 하나는 아미노산의 D-이성질체 폴리머를 포함하고, (a) 및 (b) 중 다른 것은 아미노산의 L-이성질체 폴리머를 포함하고, 여기서 D-이성질체 폴리머 대 L-이성질체 폴리머의 비는 10:1 내지 1.5:1, 또는 1:1.5 내지 1:10의 범위로 된다.
7. 6의 나노입자로, 상기 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된 음이온성 폴리머를 포함한다.
8. 7의 나노입자로, 상기 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-라이신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 폴리머를 포함한다.
9. 6의 나노입자로, 상기 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 폴리머를 포함한다.
10. 9의 나노입자로, 상기 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된 음이온성 폴리머를 포함한다.
11. 1-10 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 탈피할 수 있는 층은 음이온성 도포이다.
12. 1-11 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 탈피할 수 있는 층은 pH 및/또는 글루타티온 감수성이다.
13. 1-12 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 탈피할 수 있는 층은: 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 칼슘, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 망간, 망간 포스페이트, 망간 설페이트, 마그네슘, 마그네슘 포스페이트, 황산 마그네슘, 철, 철 포스페이트, 철 설페이트, 리튬, 리튬 포스페이트, 및 리튬 설페이트 중 하나 이상을 포함한다.
14. 8의 나노입자로, 여기서 탈피할 수 있는 층은 실리카 도포이다.
15. 1-14 중 어느 하나의 나노입자로, 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 표면 도포를 더 포함한다.
16. 15의 나노입자로, 여기서 표면 도포는 탈피할 수 있는 층과 정전기적으로 상호작용하는 양이온성 성분을 포함한다.
17. 15 또는 16의 나노입자로, 여기서 표면 도포는: 양이온성 아미노산의 폴리머, 폴리(아르기닌), 고착 도메인, 양이온성 고착 도메인, 세포 침투 펩타이드, 바이러스 당단백질, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 및 표적화 리간드 중 하나 이상을 포함한다.
18. 15-17 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 표면 도포는 쯔비터이온성 및 다가이다.
19. 15-18 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 표면 도포는 하나 이상의 표적화 리간드를 포함한다.
20. 19의 나노입자로, 여기서 하나 이상의 표적화 리간드 중 적어도 하나는 탈피할 수 있는 층과 상호작용하는 고착 도메인에 접합된다.
21. 21의 나노입자로, 여기서 고착 도메인은 RRRRRRRRR (서열번호: 15) 및 HHHHHH (서열번호: 16)으로부터 선택된 양이온성 고착 도메인이다.
22. 21 또는 21의 나노입자로, 여기서 고착 도메인은 링커를 통해 하나 이상의 표적화 리간드 중 적어도 하나에 접합된다.
23. 22의 나노입자로, 여기서 링커는 폴리펩타이드가 아니다.
24. 22의 나노입자로, 여기서 링커는 폴리펩타이드이다.
25. 22-24 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 링커는 설프하이드릴 또는 아민-반응성 화학반응을 통해 표적화 리간드에 접합되고, 및/또는 링커는 설프하이드릴 또는 아민-반응성 화학반응을 통해 고착 도메인에 접합된다.
26. 22-25 중 어느 하나의 나노입자로, 상기 하나 이상의 표적화 리간드 중 적어도 하나는 시스테인 잔기를 포함하고 시스테인 잔기를 통해 링커에 접합된다.
27. 19-26 중 어느 하나의 나노입자로, 상기 하나 이상의 표적화 리간드는 계열 B G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)에 대한 표적화된 결합을 제공한다.
28. 27의 나노입자로, 상기 표적화 리간드는 상응하는 야생형 아미노산 서열에 비하여 하나 이상의 내부 아미노산 위치에 시스테인 치환을 포함한다.
29. 27 또는 28의 나노입자로, 상기 표적화 리간드는 아미노산 서열 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (서열번호: 1)에 85% 또는 그 초과 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
30. 29의 나노입자로, 상기 표적화 리간드는 서열번호: 1)에서 제시된 아미노산 서열의 위치 L10, S11, 및 K12 중 하나 이상에서 시스테인 치환을 포함한다.
31. 30의 나노입자로, 상기 표적화 리간드는 아미노산 서열 HGEGTFTSDLCKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (서열번호: 2)을 포함한다.
32. 19-31 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 표면 도포는 c-Kit, CD27, 및 CD150으로부터 선택된 세포 표면 단백질에 대한 표적화된 결합을 제공하는 하나 이상의 표적화 리간드를 포함한다.
33. 19-32 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 표면 도포는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적화 리간드를 포함한다: 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) 단편, ApoE-트랜스페린, 락토페린, 멜라노페리틴, 오보트랜스페리틴, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, PSGL-1, ESL-1, CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, 줄기 세포 인자 (SCF), CD70, SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A), 엑센딘-4, GLP1, α5β1을 표적화하는 표적화 리간드, RGD, 트랜스페린리간드, FGF 단편, 석신산, 비스포스포네이트, CD90, CD45f, CD34, 조혈 줄기 세포 화학주성 지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고신-1-포스페이트, 세라미드-1-포스페이트, 및 상기 중 임의의 것의 활성 표적화 단편.
34. 19-33 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 표면 도포는 줄기 세포 인자 (SCF) 또는 이의 표적화 단편, CD70 또는 이의 표적화 단편, 및 SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A) 또는 이의 표적화 단편을 포함한다.
35. 19-34 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 표면 도포는: 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 줄기 및 선조 세포 골수 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구세포, 림프양 선조 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 중성구, 대식 세포, 적혈구 선조 세포, 거핵구-적혈구 선조 세포 (MEP), 공통 골수 전구세포 (CMP), 다분화능 선조 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기간 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 별아교 세포, 췌장 세포, 췌장 β-소도 세포, 간 세포, 근육 세포, 골격 근육 세포, 심장 근육 세포, 간 세포, 지방 세포, 장내 세포, 결장의 세포, 및 위의 세포로부터 선택된 표적 세포에 대한 표적화된 결합을 제공하는 하나 이상의 표적화 리간드를 포함한다.
36. 19-34 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 표면 도포는 둘 또는 그 초과의 표적화 리간드를 포함하고, 이들의 조합은: 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구세포, 림프양 선조 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 중성구, 대식세포, 적혈구 선조 세포 (예를 들어, HUDEP 세포), 거핵구-적혈구 선조 세포 (MEP), 공통 골수 전구세포 (CMP), 다분화능 선조 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기간 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 별아교 세포, 췌장 세포, 췌장 β-소도 세포, 간 세포, 근육 세포, 골격 근육 세포, 심장 근육 세포, 간 세포, 지방 세포, 장내 세포, 결장의 세포, 및 위의 세포로부터 선택된 세포에 대한 표적화된 결합을 제공한다.
37. 1-36 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
38. 37의 나노입자로, 여기서 NLS는 서열번호: 151-157 및 201-264 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
39. 1-38 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 히스톤 꼬리 펩타이드 (HTP)를 포함한다.
40. 39의 나노입자로, 여기서 HTP는 양이온성 아미노산 폴리머에 접합된다.
41. 40의 나노입자로, 여기서 HTP는 시스테인 잔기를 통해 양이온성 아미노산 폴리머에 접합된다.
42. 40 또는 41의 나노입자로, 여기서 양이온성 아미노산 폴리머는 폴리(라이신)을 포함한다.
43. 38-42 중 어느 하나의 나노입자로, 상기 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 분지형 구조를 갖는 히스톤 펩타이드를 포함한다.
44. 1-43 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 적재물은: (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA, (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, (iii) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, (iv) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드, (v)　CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드로 복합체화된 CRISPR/Cas 가이드 RNA, (vi) 아연 핑거 단백질 (ZFP)을 인코딩하는 핵산 분자, (vii) ZFP, (viii) 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, (ix) TALE 단백질, 및 (x) DNA 공여체 템플레이트 중 하나 이상을 포함한다.
45. 1-44 중 어느 하나의 나노입자로, 여기서 적재물은 (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA 및/또는 상기 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자; 및 (ii) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 및/또는 상기 CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
46. 45의 나노입자로, 여기서 적재물은 추가로 DNA 공여체 템플레이트를 포함한다.
47. 1-46 중 어느 하나의 나노입자로, SCF, SCF를 인코딩하는 핵산, HoxB4, HoxB4를 인코딩하는 핵산, BCL-XL, BCL-XL을 인코딩하는 핵산, SIRT6, SIRT6을 인코딩하는 핵산, miR-155를 억제하는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, LNA), ku70 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA), 및 ku80 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA) 중 하나 이상을 더 포함한다.
48. 하기를 포함하는 나노입자 제형:
(a) 1-47 중 어느 하나에 따른 제1 나노입자로, 여기서 적재물은: (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA, (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, (iii) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, (iv) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드, (v)　CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드와 복합체화된 CRISPR/Cas 가이드 RNA, (vi) 아연 핑거 단백질 (ZFP)을 인코딩하는 핵산 분자, (vii) ZFP, (viii) 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, 및 (ix) TALE 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 제1 나노입자; 및
(b) DNA 공여체 템플레이트를 포함하는 핵산 적재물을 포함하는 제2 나노입자.
49. 하기를 포함하는 다중-층상 나노입자:
(a) DNA 공여체 템플레이트를 포함하는 적재물을 포함하는 내부 코어;
(b) 내부 코어를 둘러싸는 제1 탈피할 수 있는 층;
(c) 제1 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 중간 코어로, 상기 중간 코어는: (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA, (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, (iii) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, (iv) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드, (v) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드로 복합체화된 CRISPR/Cas 가이드 RNA, (vi) 아연 핑거 단백질 (ZFP), (vii) ZFP를 인코딩하는 DNA 분자, (viii) 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 단백질, 및 (ix) TALE 단백질을 인코딩하는 DNA 분자 중 하나 이상을 포함하는, 중간 코어; 및
(d) 중간 코어를 둘러싸는 제2 탈피할 수 있는 층.
50. 49의 다중-층상 나노입자로, 여기서 제1 및/또는 제2 탈피할 수 있는 층은 실리카, 펩토이드, 폴리시스테인, 칼슘, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 망간, 망간 포스페이트, 망간 설페이트, 마그네슘, 마그네슘 포스페이트, 황산 마그네슘, 철, 철 포스페이트, 철 설페이트, 리튬, 리튬 포스페이트, 및 리튬 설페이트 중 하나 이상을 포함한다.
51. 49 또는 50의 다중-층상 나노입자로, 제2 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 표면 도포를 포함한다.
52. 51의 다중-층상 나노입자로, 여기서 표면 도포는 제2 탈피할 수 있는 층과 정전기적으로 상호작용하는 양이온성 성분을 포함한다.
53. 51 또는 52의 다중-층상 나노입자로, 여기서 표면 도포는 양이온성 아미노산의 폴리머, 폴리(아르기닌), 세포 침투 펩타이드, 바이러스 당단백질, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 및 표적화 리간드 중 하나 이상을 포함한다.
54. 49-53 중 어느 하나의 다중-층상 나노입자로, 여기서 표면 도포는 쯔비터이온성 및 다가이다.
55. 49-54 중 어느 하나의 다중-층상 나노입자로, 여기서 표면 도포는 하나 이상의 표적화 리간드를 포함한다.
56. 핵산 및/또는 단백질 적재물을 표적 세포로 전달하는 방법으로, 상기 방법은 진핵 표적 세포를 1-47 중 어느 하나의 나노입자, 48의 나노입자 제형, 및/또는 49-55 중 어느 하나의 다중-층상 나노입자와 접촉시키는 것을 포함한다.
57. 56의 방법으로, 여기서 적재물은 유전자 편집 도구를 포함한다.
58. 56 또는 57의 방법으로, 여기서 적재물은: CRISPR/Cas 가이드 RNA, CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 아연 핑거 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 분자, TALE 또는 TALEN, TALE 또는 TALEN을 인코딩하는 핵산 분자, DNA 공여체 템플레이트, 부위-특이적인 재조합효소 (예를 들어, Cre 재조합효소, Dre 재조합효소, Flp 재조합효소, KD 재조합효소, B2 재조합효소, B3 재조합효소, R 재조합효소, Hin 재조합효소, Tre 재조합효소, PhiC31 인테그라제, Bxb1 인테그라제, R4 인테그라제, 람다 인테그라제, HK022 인테그라제, HP1 인테그라제)를 인코딩하는 핵산 분자, 부위-특이적인 재조합효소, 레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta)를 인코딩하는 핵산 분자,　레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta), 트랜스포존 및/또는 트랜스포존으로부터 유래된 DNA (예를 들어, 박테리아 트랜스포존 예컨대 Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, Tn10, Tn903, Tn1681; 진핵 트랜스포존 예컨대 Tc1/마리너 수퍼 패밀리 트랜스포존, 피기백 상과 트랜스포존, hAT 상과 트랜스포존, 피기백, 슬리핑 뷰티, 프로그 프린스, 미노스, Himar1, 마리너), 및 전위효소 중 하나 이상을 포함한다.
59. 56-58 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 포유동물 세포이다
60. 56-59 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 인간 세포이다
61. 56-60 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 시험관내 배양중이다.
62. 56-60 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 생체내에 있다.
63. 62의 방법으로, 상기 접촉하는 것은 나노입자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다
64. 63의 방법으로, 여기서 개체는 헌팅턴병, ALS, 파킨슨병, 췌장암, 당뇨병, 또는 폰빌레브란트 질환을 갖는다.
65. 56-64 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 나노입자는 표적화 리간드를 포함하는 표면 도포를 포함한다.
66. 65의 방법으로, 여기서 표적화 리간드는 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구세포, 림프양 선조 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 중성구, 대식세포, 적혈구 선조 세포 (예를 들어, HUDEP 세포), 거핵구-적혈구 선조 세포 (MEP), 공통 골수 전구세포(CMP), 다분화능 선조 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기간 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 별아교 세포, 췌장 세포, 췌장 β-소도 세포, 간 세포, 근육 세포, 골격 근육 세포, 심장 근육 세포, 간 세포, 지방 세포, 장내 세포, 결장의 세포, 및 위의 세포로부터 선택된 세포에 대한 표적 결합을 제공한다.
67. 56-66 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 줄기 및 선조 세포 골수 세포, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구세포, 림프양 선조 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 중성구, 대식세포, 적혈구 선조 세포, 거핵구-적혈구 선조 세포 (MEP), 공통 골수 전구세포(CMP), 다분화능 선조 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기간 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 별아교 세포, 췌장 세포, 췌장 β-소도 세포, 간 세포, 근육 세포, 골격 근육 세포, 심장 근육 세포, 간 세포, 지방 세포, 장내 세포, 결장의 세포, 및 위의 세포로부터 선택된다.
68. 56-67 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 줄기 및/또는 선조세포이고 적재물은 줄기 세포 인자 (SCF) 및/또는 SCF를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
69. 56-67 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 (i) 표적 세포는 폰 빌레브란트 질환이 있는 개체로부터의 것이고 및/또는 표적 세포는 세포가 하위-정상 수준의 기능적 VWF를 생성하도록 VWF를 인코딩하는 유전자에서 게놈 돌연변이를 포함하고; (ii) 표적 세포는 거핵구, 내피 세포, MEP, CMP, MPP, HSC, ST-HSC, 및 LT-HSC 중 임의의 하나이고; 그리고 (iii) 적재물은 기능적 VWF 단백질 및/또는 기능적 VWF를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
70. 양이온성 폴리머의 측쇄에 접합된 하나 이상의 히스톤 꼬리 펩타이드 (HTP)를 포함하는 분지형 히스톤 분자.
71. 70의 분지형 히스톤 분자로, 여기서 양이온성 폴리머는 폴리(아르기닌) 또는 폴리(라이신)을 포함한다.
72. 70 또는 71의 분지형 히스톤 분자로, 여기서 양이온성 폴리머의 측쇄 중 최대 40%가 상기 하나 이상의 HTP에 접합된다.
73. 분지형 히스톤 분자가 브러쉬 중합체, 웹 (예를 들어, 스파이더 웹 구조), 그라프트 중합체, 별모양의 폴리머, 빗살모양 중합체, 폴리머 네트워크, 및 덴드리머로부터 선택된 구조를 형성하도록 서로에 대해 접합된 하나 이상의 히스톤 꼬리 펩타이드 (HTP)를 포함하는, 분지형 히스톤 분자.
74. 73의 분지형 히스톤 분자로, 여기서 분지형 히스톤 분자는 웹 구조를 형성한다.
양태 (세트 B)
1. 단백질 및/또는 핵산 적재물을 전달하기 위한 지질 제형으로, 상기 지질 제형은 지질 및 코어를 포함하고, 상기 코어는 하기를 포함하고:
(i) 음이온성 폴리머 조성물;
(ii) 양이온성 폴리머 조성물;
(iii) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및
(iv) 핵산 및/또는 단백질 적재물,
여기서 (a) 상기 음이온성 폴리머 조성물은 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하고; 및/또는 (b) 상기 양이온성 폴리머 조성물은 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함한다.
2. 1의 지질 제형으로, 상기 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된 제1 음이온성 폴리머를 포함하고; 그리고 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된 제2 음이온성 폴리머를 포함한다.
3. 1 또는 2의 지질 제형으로, 상기 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된 제1 양이온성 폴리머를 포함하고; 그리고 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-라이신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된 제2 양이온성 폴리머를 포함한다.
4. 1-3 중 어느 하나의 지질 제형으로, 상기 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 상기 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 비하여 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다.
5. 1-4 중 어느 하나의 지질 제형으로, 상기 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머는 상기 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머에 비하여 10:1 내지 1:10의 범위인 비로 존재한다.
6. 단백질 및/또는 핵산 적재물을 전달하기 위해 지질 제형으로, 상기 지질 제형은 지질 및 코어를 포함하고, 상기 코어는 하기를 포함하고:
(a) 음이온성 폴리머 조성물;
(b) 양이온성 폴리머 조성물;
(c) 양이온성 폴리펩타이드 조성물; 및
(d) 핵산 및/또는 단백질 적재물,
여기서 (a) 및 (b) 중 하나는 아미노산의 D-이성질체 폴리머를 포함하고, (a) 및 (b) 중 다른 것은 아미노산의 L-이성질체 폴리머를 포함한다.
7. 6의 지질 제형으로, 여기서 D-이성질체 폴리머 대 L-이성질체 폴리머의 비는 10:1 내지 1.5:1, 또는 1:1.5 내지 1:10의 범위로 된다.
8. 7의 지질 제형으로, 상기 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-글루탐산) (PDEA) 및 폴리(D-아스파르트산) (PDDA)으로부터 선택된 음이온성 폴리머를 포함한다.
9. 8의 지질 제형으로, 상기 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(L-아르기닌), 폴리(L-라이신), 폴리(L-히스티딘), 폴리(L-오르니틴), 및 폴리(L-시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 폴리머를 포함한다.
10. 7의 지질 제형으로, 상기 양이온성 폴리머 조성물은 폴리(D-아르기닌), 폴리(D-라이신), 폴리(D-히스티딘), 폴리(D-오르니틴), 및 폴리(D-시트룰린)으로부터 선택된 양이온성 폴리머를 포함한다.
11. 10의 지질 제형으로, 상기 음이온성 폴리머 조성물은 폴리(L-글루탐산) (PLEA) 및 폴리(L-아스파르트산) (PLDA)으로부터 선택된 음이온성 폴리머를 포함한다.
12. 1-11 중 어느 하나의 지질 제형으로, 여기서 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
13. 12의 지질 제형으로, 여기서 NLS는 서열번호: 151-157 및 201-264 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
14. 1-13 중 어느 하나의 지질 제형으로, 여기서 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 히스톤 꼬리 펩타이드 (HTP)를 포함한다.
15. 14의 지질 제형으로, 여기서 HTP는 양이온성 아미노산 폴리머에 접합된다.
16. 15의 지질 제형으로, 여기서 HTP는 시스테인 잔기를 통해 양이온성 아미노산 폴리머에 접합된다.
17. 14 또는 15의 지질 제형으로, 여기서 양이온성 아미노산 폴리머는 폴리(라이신)을 포함한다.
18. 1-17 중 어느 하나의 지질 제형으로, 상기 양이온성 폴리펩타이드 조성물은 분지형 구조를 갖는 히스톤 펩타이드를 포함한다.
19. 1-18 중 어느 하나의 지질 제형으로, 여기서 적재물은: (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA, (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, (iii) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, (iv) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드, (v)　CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드로 복합체화된 CRISPR/Cas 가이드 RNA, (vi) 아연 핑거 단백질 (ZFP)을 인코딩하는 핵산 분자, (vii) ZFP, (viii) 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, (ix) TALE 단백질, (x) DNA 공여체 템플레이트, (xi) 부위-특이적인 재조합효소 (예를 들어, Cre 재조합효소, Dre 재조합효소, Flp 재조합효소, KD 재조합효소, B2 재조합효소, B3 재조합효소, R 재조합효소, Hin 재조합효소, Tre 재조합효소, PhiC31 인테그라제, Bxb1 인테그라제, R4 인테그라제, 람다 인테그라제, HK022 인테그라제, HP1 인테그라제)를 인코딩하는 핵산 분자, (xii) 부위-특이적인 재조합효소, (xiii) 레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta)를 인코딩하는 핵산 분자, (xiv)　레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta), (xv) 트랜스포존 및/또는 트랜스포존으로부터 유래된 DNA (예를 들어, 박테리아 트랜스포존 예컨대 Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, Tn10, Tn903, Tn1681; 진핵 트랜스포존 예컨대 Tc1/마리너 수퍼 패밀리 트랜스포존, 피기백 상과 트랜스포존, hAT 상과 트랜스포존, 피기백, 슬리핑 뷰티, 프로그 프린스, 미노스, Himar1, 마리너), 및 (xvi) 전위효소 중 하나 이상을 포함한다.
20. 1-19 중 어느 하나의 지질 제형으로, 여기서 적재물은 (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA 및/또는 상기 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자; 및 (ii)　CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드 및/또는 상기 CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
21. 20의 지질 제형으로, 여기서 적재물은 추가로 DNA 공여체 템플레이트를 포함한다.
22. 핵산 및/또는 단백질 적재물을 표적 세포로 전달하는 방법으로, 상기 방법은 진핵 표적 세포를 1-21 중 어느 하나의 지질 제형과 접촉시키는 것을 포함한다.
23. 22의 방법으로, 여기서 적재물은 유전자 편집 도구를 포함한다.
24. 22 또는 23의 방법으로, 여기서 적재물은 CRISPR/Cas 가이드 RNA, CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드, CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, 아연 핑거 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 분자, TALE 또는 TALEN, TALE 또는 TALEN을 인코딩하는 핵산 분자, DNA 공여체 템플레이트, 부위-특이적인 재조합효소 (예를 들어, Cre 재조합효소, Dre 재조합효소, Flp 재조합효소, KD 재조합효소, B2 재조합효소, B3 재조합효소, R 재조합효소, Hin 재조합효소, Tre 재조합효소, PhiC31 인테그라제, Bxb1 인테그라제, R4 인테그라제, 람다 인테그라제, HK022 인테그라제, HP1 인테그라제)을 인코딩하는 핵산 분자, 부위-특이적인 재조합효소, 레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta)를 인코딩하는 핵산 분자,　레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta), 트랜스포존 및/또는 트랜스포존으로부터 유래된 DNA (예를 들어, 박테리아 트랜스포존 예컨대 Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, Tn10, Tn903, Tn1681; 진핵 트랜스포존 예컨대 Tc1/마리너 수퍼 패밀리 트랜스포존, 피기백 상과 트랜스포존, hAT 상과 트랜스포존, 피기백, 슬리핑 뷰티, 프로그 프린스, 미노스, Himar1, 마리너)), 및 전위효소 중 하나 이상을 포함한다.
25. 22-24 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 포유동물 세포이다
26. 22-25 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 인간 세포이다
27. 22-26 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 시험관내 배양중이다.
28. 22-26 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 생체내에 있다.
29. 28의 방법으로, 상기 접촉하는 것은 지질 제형을 개체에 투여하는 단계를 포함한다
30. 29의 방법으로, 여기서 개체는 헌팅턴병, ALS, 파킨슨병, 췌장암, 당뇨병, 또는 폰빌레브란트 질환을 갖는다.
31. 22-30 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 골수 세포, 조혈 줄기 세포 (HSC), 조혈 줄기 및 선조 세포 골수 세포, a 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수 전구세포, 림프양 선조 세포, T-세포, B-세포, NKT 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 적혈구, 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 중성구, 대식 세포, 적혈구 선조 세포, 거핵구-적혈구 선조 세포 (MEP), 공통 골수 전구세포(CMP), 다분화능 선조 세포 (MPP), 조혈 줄기 세포 (HSC), 단기 HSC (ST-HSC), IT-HSC, 장기간 HSC (LT-HSC), 내피 세포, 뉴런, 별아교세포, 췌장 세포, 췌장 β-소도 세포, 간 세포, 근육 세포, 골격 근육 세포, 심장 근육 세포, 간 세포, 지방 세포, 장내 세포, 결장의 세포, 및 위의 세포로부터 선택된다.
32. 22-31 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 즐기 및/또는 선조 세포이고 적재물은 줄기 세포 인자 (SCF) 및/또는 SCF를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
33. 22-31 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 표적 세포는 폰 빌레브란트 질환이 있는 개체의 세포이고 및/또는 표적 세포는 세포가 하위-정상 수준의 기능적 VWF를 생성하도록 VWF를 인코딩하는 유전자에서 게놈 돌연변이를 포함하고; (ii) 표적 세포는 거핵구, 내피 세포, MEP, CMP, MPP, HSC, ST-HSC, 및 LT-HSC 중 임의의 하나이고; 그리고 (iii) 적재물은 기능적 VWF 단백질 및/또는 기능적 VWF를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
양태 (세트 C)
1. 핵산 및/또는 단백질 적재물을 표적 세포에 전달하는 방법으로, 상기 방법은 진핵 표적 세포를 하기를 포함하는 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클과 접촉시키는 것을 포함한다:
(a) 유전자 편집 도구; 및
(b) 표적 세포의 증식 및/또는 편향 분화를 유도하는 핵산 또는 단백질 제제.
2. 1의 방법으로, 여기서 (a)는: (i) CRISPR/Cas 가이드 RNA, (ii) CRISPR/Cas 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자, (iii) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자, (iv) CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드, (v)　CRISPR/Cas RNA-유도된 폴리펩타이드로 복합체화된 CRISPR/Cas 가이드 RNA, (vi) 아연 핑거 단백질 (ZFP)을 인코딩하는 핵산 분자, (vii) ZFP, (viii) 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, (ix) TALE 단백질, (x) DNA 공여체 템플레이트, (xi) 부위-특이적인 재조합효소 (예를 들어, Cre 재조합효소, Dre 재조합효소, Flp 재조합효소, KD 재조합효소, B2 재조합효소, B3 재조합효소, R 재조합효소, Hin 재조합효소, Tre 재조합효소, PhiC31 인테그라제, Bxb1 인테그라제, R4 인테그라제, 람다 인테그라제, HK022 인테그라제, HP1 인테그라제)를 인코딩하는 핵산 분자, (xii) 부위-특이적인 재조합효소, (xiii) 레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta)를 인코딩하는 핵산 분자, (xiv)　레솔바제 및/또는 인버타제 (예를 들어, Gin, Hin, γδ3, Tn3, Sin, Beta), (xv) 트랜스포존 및/또는 트랜스포존으로부터 유래된 DNA (예를 들어, 박테리아 트랜스포존 예컨대 Tn3, Tn5, Tn7, Tn9, Tn10, Tn903, Tn1681; 진핵 트랜스포존 예컨대 Tc1/마리너 수퍼 패밀리 트랜스포존, 피기백 상과 트랜스포존, hAT 상과 트랜스포존, 피기백, 슬리핑 뷰티, 프로그 프린스, 미노스, Himar1, 마리너), 및 (xvi) 전위효소 중 하나 이상을 포함한다.
3. 1 또는 2의 방법으로, 여기서 (b)는 표적 세포의 증식을 유도하는 핵산 또는 단백질 제제를 포함한다.
4. 1-3 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 (b)는 표적 세포의 분화를 편향시키는 핵산 또는 단백질 제제를 포함한다.
5. 1-4 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 (b)는 SCF, SCF를 인코딩하는 핵산, HoxB4, HoxB4를 인코딩하는 핵산, BCL-XL, BCL-XL을 인코딩하는 핵산, SIRT6, SIRT6을 인코딩하는 핵산, miR-155를 억제하는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, LNA), ku70 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA), 및 ku80 발현을 감소시키는 핵산 분자 (예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA) 중 하나 이상을 포함한다.
6. 1-5 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 (b)는 표적 세포의 분화를 차단 또는 촉진하기 위한 마이크로RNA를 포함한다.
7. 1-6 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 (b)는 표적 세포의 분화를 위한 신호전달 단백질을 포함한다.
8. 1-7 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 전달 비히클은 비-바이러스이다.
9. 1-7 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 전달 비히클은 바이러스이다.
10. 1-9 중 어느 하나의 방법으로, 여기서 전달 비히클은 나노입자가 아니다.
11. 1-9중 어느 하나의 방법으로, 여기서 전달 비히클은 나노입자, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 나노입자이다.
본 발명의 사상 또는 범위를 벗어남이 없이 다양한 변화 및 변형이 이루어 질 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
실험적
하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 당해 분야의 숙련가에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니며, 아래의 실험은 수행된 실험의 모두 또는 유일한 실험을 나타내는 것으로 의도되지도 않는다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 대한 정확성을 확보하기 위한 노력이 이루어졌지만 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
본 명세서에서 인용된 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참고로 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것처럼 본 명세서에서 참고로 편입된다.
본 발명은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 포함하도록 발견되거나 제안된 특정 구현예와 관련하여 기술되었다. 본 개시내용에 비추어, 본 발명의 의도된 범위를 벗어남이 없이 예시된 특정 구현예에서 많은 변형 및 변경이 이루어질 수 있음이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 것이다. 예를 들어, 코돈 과잉성에 기인하여, 단백질 서열에 영향을 미치지 않고 근본적인 DNA 서열을 변경할 수 있다. 또한, 생물학적 기능적 동등성 고려 사항들에 기인하여, 종류 또는 양에서 생물학적 작용에 영향을 미침이 없이 단백질 구조에서 변화가 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구항들의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예 1
코어 제형 파라미터를 결정하기 위해, 형광분광법을 사용하여 (이중 가닥 DNA 적재물에 대한) 핵산 축합을 모니터했다. 삽입작용 에티듐브로마이드 (EtBr)의 방출 스펙트럼을 증가하는 전하 비에서 축합제를 첨가 후에 측정하였다. 폴리머 유도된 핵산 축합에 의해 야기된 에티듐브로마이드의 탈-삽입은 형광 신호의 저하를 초래한다. 이것은 에티듐브로마이드가 비결합된 상태보다 DNA-결합된 상태에서 훨씬 높은 양자 형광 산출을 나타내기 때문이다. 결과는 도 1에 묘사되어 있다.
도 1은 핵산 적재물의 축합을 위한 다양한 파라미터 (예를 들어, 양이온:음이온 전하 비)를 시험하는 형광측정 검정으로부터의 결과를 묘사한다. 결과는, 예를 들어, 가이드 RNA 분자와 Cas9를 인코딩하는 플라스미드의 축합에 대해 2의 전하 비가 잘 작동한다는 것을 나타냈다. 100μl의 음이온성 용액을 각 웰에 첨가했다: 100ng/μl DNA, 80ng/μl 폴리(D-글루탐산) (PDE), 0.5 ng/μl 에티듐브로마이드. 응축 종은 각각의 데이터 포인트에 대해 12.5μl에서 적정되었다. 용액에서 축합제의 총 농도 (m/v)는 괄호에서 그것의 질량 분율이 표지된 히스톤 꼬리 펩타이드 (HTP)[H3K4(me3)] 및 폴리(L-아르기닌) (PLR)의 상이한 조성물을 갖는 0.4ug/μl였다. 각각의 적정 후, 플레이트는 250nm 여기로 605nm에서 판독되었다. 각각의 시험된 전하 비에 대해, 대조군은: (i) 무 EtBr로 DNA인, "DNA 단독"; (ii) PDE, PLR, 또는 HTP가 존재하지 않는 DNA 플러스 EtBr인 "DNA"; 및 (iii) PLR 또는 HTP가 존재하지 않는 DNA 플러스 EtBr 플러스 PDE인 "DNA + PDE"를 포함했다.
실시예 2: 실시예 합성 방법
절차는 멸균된 분진 없는 환경 (BSL-II 후드)에서 수행하였다. 가스기밀 주사기를 여과된 뉴클레아제 자유수로 3회 린스하기 전에 70% 에탄올로 멸균하고 사용 전 4℃에 저장했다. 표면은 사용 존에 RNAse 억제제로 처리했다.
나노입자 코어
제1 용액 (음이온성 용액)을 적절한 양의 적재물 (이 경우에 플라스미드 DNA (EGFP-N1 플라스미드)을 폴리(D-글루탐산) 및 폴리(L-글루탐산)의 수성 혼합물 ('음이온성 폴리머 조성물')과 배합시킴에 의해 제조했다. 이 용액을 pH 8.5에서 10mM 트리스-HCl으로 적절한 용적으로 희석했다. '양이온성 폴리머 조성물'과 '양이온성 폴리펩타이드 조성물'의 조합인 제2 용액 (양이온성 용액)을 적절한 양의 축합제를 함유하는 농축된 용액을 pH 5.5에서 60mM HEPES로 적절한 용적으로 희석함에 의해 제조했다. 이 경우에, '양이온성 폴리머 조성물'은 폴리(L-아르기닌)이었고 '양이온성 폴리펩타이드 조성물'은 16 μg의 H3K4(me3) (히스톤 H3의 꼬리, K4 상에 트리 메틸화됨)였다.
200 μl 미만 조에서 나노입자 코어의 침전은 유리 바이알 또는 낮은 단백질 결합 원심관에서 적재물 용액에 응축 용액의 적가와 이어서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션에 의해 수행될 수 있다. 200 μl 초과의 조에 대해, 두 용액이 표준 혼합 칩 (예를 들어 백운석 마이크로믹서) 또는 유체역학적 유동 초점조정 칩을 사용하여 미세유체 형식으로 조합될 수 있다. 각 경우에, 최적의 유입 유속은 나노입자 코어의 얻어진 현탁액이 단분산되어, 100nm 아래의 평균 입자 크기를 나타내도록 결정될 수 있다.
이 경우에, 상기로부터의 두 동등 용적 용액 (양이온성 축합제의 하나 및 음이온성 축합제의 하나)을 혼합하여 제조하였다. 양이온성 축합제의 용액의 경우, 폴리머/펩타이드 용액을 하나의 단백질 낮은 결합 튜브 (에펜도르프)에 첨가하고 그런 다음 (전술한 바와 같이) 100 μl의 총 용적으로 60mM HEPES (pH 5.5)로 희석하였다. 이 용액을 음이온성 용액을 제조하는 동안 실온에서 유지했다. 음이온성 축합제의 용액의 경우, 음이온성 용액을 최소 광 노출로 얼음 상에서 냉각시켰다. 수용액 (거의 1 μg/μl) 및 7μg의 수성 폴리 (D-글루탐산) [.1%] 내 10μg의 핵산을 (전술한 바와 같이) 100 μl의 총 용적으로 10mM 트리스-HCl (pH 8.5)로 희석하였다.
두 용액 각각을.2 마이크론 주사기 필터를 사용하여 여과하고 그 자신의 Hamilton 1ml Gastight 주사기 (유리, (제품 번호 삽입)로 이전하였다. 각각의 주사기는 하바드 펌프 11 엘리트 듀얼 실린지 펌프 상에 배치했다. 주사기는 튜우빙을 사용하여 백운석 마이크로 혼합기 칩의 적당한 유입구로 연결하고, 그리고 주사기 펌프는 100 μl 총 용적에 대해 120 μl/min에서 작동되었다. 얻어진 용액은 (이제 핵산 적재물, 음이온성 성분, 및 양이온성 성분을 포함한) 코어 조성물을 포함했다. 나노입자 크기 (피크)는 128.8 nm였고, 제타 전위 (피크)는 +10.5 mV (100%)였다 (예를 들어, 도 2 참고).
코어 안정화 (탈피할 수 있는 층을 부가함)
코어를 탈피할 수 있는 층으로 도포하기 위해, 나노입자 코어의 얻어진 현탁액을 그 다음 10mM Tris HCl (pH 8.5, 10 - 500mM) 내 나트륨 실리케이트 또는 10mM PBS (pH 8.5, 10 - 500mM) 내 염화칼슘의 희석 용액과 조합시키고 그리고 1-2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이 경우에, 코어 조성물은 희석된 나트륨 실리케이트 용액에 첨가되어 중합체 실리카 (탈피할 수 있는 층의 예)의 산 불안정성 코팅으로 코어를 도포된다. 그렇게 하기 위해, 10 μl의 스톡 나트륨 실리케이트 (Sigma)를 1.99 mL의 Tris 완충액 (10mM Tris pH = 8.5, 1:200 희석)에 먼저 용해시키고 철저하게 혼합하였다. 실리케이트 용액은 멸균 0.1 마이크론 주사기 필터를 사용하여 여과하고, 그리고 주사기 펌프 상에 실장된 멸균 Hamilton Gastight 주사기로 이전하였다. 상기로부터의 코어 조성물은 또한 주사기 펌프 상에 또한 실장된 멸균 Hamilton Gastight 주사기로 이전하였다. 주사기는 PTFE 튜우빙을 사용하여 백운석 마이크로 혼합기 칩의 적당한 유입구로 연결하고, 그리고 주사기 펌프는 120 μl/min에서 작동되었다.
안정화된 (코팅된) 코어는 표준 원심 여과 디바이스 (100 kDa Amicon Ultra, Millipore)를 사용하거나 또는 고분자량 컷오프 막을 사용한 30mM HEPES (pH 7.4)에서 투석으로 정제될 수 있다. 이 경우에, 안정화된 (코팅된) 코어는 원심 여과 디바이스를 사용하여 정제된다. 수집된 코팅된 나노입자 (나노입자 용액)는　희석 PBS (1:800) 또는 HEPES로 세정하고 다시 여과하였다 (용액은 저장을 위해 500 μl 멸균 분산물 완충액 또는 뉴클레아제 자유수에서 재현탁될 수 있다). 효과적인 실리카 도포이 실증되었다. 안정화된 코어는 110.6 nm의 크기와 -42.1 mV (95%)의 제타 전위를 가졌다 (도 3).
표면 도포 (외부 쉘)
때때로 "표면 작용화"로 지칭되는 표면 도포 (또한 일명 외부 쉘)의 첨가를 안정화된 (이 경우에 실리카 도포된) 나노입자의 음으로 하전된 표면에 리간드 종 (이 경우에 양이온성 고착 도메인으로 9-Arg 펩타이드 서열에 융합된 광견병 바이러스 당단백질 - 'RVG9R')을 정전기적으로 그라프팅함에 의해 달성하였다. 여과되고 분산물 완충액 또는 물에 재현탁된 실리카 도포된 나노입자로 시작하여, 각각의 나노입자 분산물의 최종 용적은 양성자화된 아민기의 최종 농도가 적어도 75 uM이 되도록 하는 폴리머 또는 펩타이드의 원하는 양이 부가되도록 결정되었다. 원하는 표면 구성성분을 첨가하고 용액을 20-30초 동안 초음파처리하고 그 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. 원심 여과를 300 kDa에서 수행하였고 (최종 생성물은, 예를 들어, Amicon Ultra Millipore로부터의 표준 원심 여과 디바이스, 300-500kDa을 사용하거나, 또는 투석, 예를 들어, 고분자량 컷오프 막을 사용하여 30mM HEPES (pH 7.4)에서 정제될 수 있음), 그리고 최종 재현탁은 세포 배양 배지 또는 분산물 완충액 중 어느 하나에서 되었다. 일부 경우에, 최적의 외부 쉘 첨가는 50 내지 150 nm의 평균 입자 크기 및 0 내지 -10 mV의 제타 전위를 갖는 입자의 단분산된 현탁액을 생성한다. 이 경우에, 외부 쉘을 갖는 나노입자는 115.8 nm의 크기와 -3.1 mV (100%)의 제타 전위를 가졌다 (도 4).
실시예 3: 나노입자 흡수
이들 연구 (예를 들어, 도 5 참고)에서, 다양한 표면 화학물질 및 전하 비를 갖는 나노입자가 시험되었다. 제형은 아래와 같다 (전하 비는 나노입자 코어를 지칭한다):
HTT018B: 전하 비 (양이온/음이온)는 2이고; 표면 도포는 폴리(L-아르기닌)임
HTT019B: 전하 비는 5이고; 표면 도포는 폴리(L-아르기닌)임
HTT020B: 전하 비는 2이고, 표면 도포는 N-아세틸 세맥스임
HTT021B: 전하 비는 5이고, 표면 도포는 N-아세틸 세맥스임
HTT022B: 전하 비는 2이고, 표면 도포는 N-아세틸 셀랭크임
HTT023B: 전하 비는 5이고, 표면 도포는 N-아세틸 셀랭크임
L3000GFP: GFP를 인코딩하는 핵산의 리포펙타민 (비-나노입자) 전달 (GFP를 인코딩하는 플라스미드)
L3000CRISPR: GFP 또는 형광 태그 없는 CRISPR/Cas 성분의 리포펙타민 (비-나노입자) 전달.
나노입자를 생성하였다. HTT018B-023B의 경우, 코어 성분은 핵산 적재물 (CRISPR/Cas 인코딩 핵산: Cas9 가이드 RNA를 인코딩하는 하나의 플라스미드 및 Cas9 단백질을 인코딩하는 제2 플라스미드) 및 형광단 (FITC)으로 태깅된 폴리(L-아르기닌) (양이온성 폴리머 조성물)을 포함했고 따라서 흡수가 형광현미경검사에 의해 평가될 수 있었다. L3000GFP (양성 대조군)의 경우, 나노입자가 사용되지 않았고 전달된 핵산은 GFP를 인코딩하는 플라스미드였다. L3000CRISPR (음성 대조군)의 경우, 나노입자가 사용되지 않았고 전달된 핵산은 CRISPR 성분을 인코딩하는 플라스미드였으나, 사용된 플라스미드는 GFP를 인코딩하지 않고 FITC로 태깅되지 않았다.
신경 줄기 세포는 105 세포/웰 (96-웰 플레이트)의 밀도로 씨딩되어 섬유모세포 성장 인자 (FGF)(1:1000)가 보충된 Neurobasal 배지에서 성장되었다. 나노입자 및 리포펙타민 3000 (0.75 μL 시약/μg DNA)을 웰당 형질감염된 DNA 적재물의 400 ng으로 씨딩 24시간 후 세포에 도입하였다. 나노입자 샘플은 배양 중인 신경 줄기 세포에 적용하여 4-24 시간 동안 인큐베이션하고 PBS로 최대 3회 세정하여 임의의 바-내재화된 입자를 제거하였다. 흡수는 적절한 레이저 여기 및 필터 선택으로 이미지형성함에 의해 결정하였다. 세포는 20X 대물렌즈를 사용하여 Zeiss LSM780으로 이미지화되었다. 대안적인 것으로 또는 부가적으로 정량적 흡수 데이터가 높은 함량 이미지 형성 및 유세포 측정을 사용하여 수득될 수 있다. 세 열은 세 개의 상이한 복제를 묘사한다.
전술한 바와 같이, 샘플 HTT18B, HTT20B, 및 HTT22B를 2의 전하 비로 준비하고, 반면에, 샘플 HTT19B, HTT21B, 및 HTT23B는 5의 전하 비로 준비하였다. 데이터는 (코어의 축합에 대한) 2의 전하 비가 5의 전하 비보다 더 높은 내재화를 초래했다는 것을 나타낸다. 또한, 헵타펩타이드 적용물질 셀랭크 및 세맥스의 표면 코팅물 (외부 쉘)은 세포 침투 펩타이드 폴리(L-아르기닌)을 포함하는 표면 도포 [9.7 kDa]보다 더 높은 정도의 내재화를 촉진했다.
실시예 4: 나노입자 내재화 행동 및 아세포 이동조절의 특징화
신경 줄기 세포는 핵산 적재물로 CRISPR/Cas9 플라스미드를 포함하는 나노입자와 접촉되었다. 나노입자 코어는 형광단 (FITC)으로 태깅된 폴리(L-아르기닌) (양이온성 폴리머 조성물)을 포함했고 따라서 흡수는 형광현미경검사에 의해 평가될 수 있었다. 엔도솜 및 핵은 각각 Lysotracker (적색) 및 Hoescht 3342 (청색)을 사용하여 염색하였다. 나노입자 및 립펙타민 3000 (0.75μl 시약/μg DNA)을 웰당 형질감염된 DNA 적재물의 400 ng으로 씨딩 16시간 후 세포로 도입하였다. 세포를 이미지형성 전에 Hoescht 3342 및 Lysotracker Red로 인큐베이션하였다. 세포는 10x 대물렌즈를 사용하여 Cellomics CX5로 형질감염-2.5 및 5시간 후 이미지화되었다 (도 6, 패널 A-B). 염색된 엔도솜 및 핵의 것으로 나노입자의 형광신호의 공동-국재화가 정량적으로 측정되었고 공동-국재화의 정도는 수득한 Pearson 생성물-모멘트 계수에 의해 표시되었다 (도 6, 패널 C-D).
표 2 (도 6 참고)에 열거된 모든 나노입자의 경우, 코어는 (i) 표에서 지시된 양이온성 폴리펩타이드 조성물, (ii) 핵산 적재물, (iii) 폴리(L-아르기닌) [양이온성 아미노산 폴리머], 및 (iv) 폴리(L-글루탐산) [음이온성 아미노산 폴리머]를 포함했다. 탈피할 수 있는 층은 실리카 도포였고 표면 도포는 표 2에 지시되어 있다.
도 6, 패널 C는 나노입자 폴리머 (FITC 태깅된 코어 폴리머)와 Hoescht DNA 얼룩 사이, 또는 나노입자 폴리머 (FITC 태깅된 코어 폴리머)와 Lyotracker 사이의 Pearson 생성물-모멘트 상관 계수를 묘사한다. 상관 계수는 패널 A 및 B에서 이미지를 생성하는 동안 계산되었다. 모든 값은 음성 대조군 (Cas9 리포펙타민 3000)의 값에 대해 정규화되었다. Hoescht와 FITC 사이 및 2.5시간과 5시간 시점 사이의 줄어든 Pearson 상관 관계는 나노입자 폴리머 열화, 경시적으로 핵 이외의 구획으로 방출, 또는 확산을 나타낸다. 도 6, 패널 D는 나노입자 폴리머와 엔도솜 (Lysotracker Red) 사이의 Pearson 생성물-모멘트 상관 계수를 묘사한다. 상관 계수는 패널 A 및 B에서 이미지를 생성하는 동안 계산되었다. 모든 값은 음성 대조군 (Cas9 리포펙타민 3000)의 값에 대해 정규화되었다. 2.5시간 및 5시간 시점의 비교는 경시적으로 엔도조말 탈출을 나타냈다.
실시예 5: 적기-방출
도 7은 핵산 적재물이 GFP를 인코딩하는 mRNA를 포함한 나노입자로 형질감염된 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)의 현미경검사 이미지를 묘사한다. 본 이미지는 mRNA 발현이 정의된 비로 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 갖는 코어를 포함하는 나노입자로 16일까지 연장되었다는 것을 입증한다. 이 경우에, 폴리(D-글루탐산) 대 폴리(L-글루탐산)의 2:1 비를 갖는 나노입자 코어의 사용은 16일에서 최대 발현을 초래했다 (패널 A = 4일; 패널 B = 16일). 나노입자 코어는 (i) 음이온성 폴리머 조성물: 7 μg 총 폴리(글루탐산)(즉, 전체로 7 μg으로 조합된 D- 및 L- 이성질체);(ii) 양이온성 폴리머 조성물: 폴리(L-아르기닌); (iii) 양이온성 폴리펩타이드 조성물: H3K4(me3) [즉, 히스톤 H3의 꼬리, K4 상에 트리 메틸화됨]; 및 (iv) 핵산 적재물: GFP를 인코딩하는 mRNA를 포함했다. 나노입자 코어는 실리카 도포 (탈피할 수 있는 층)에 의해 캡슐화되었고 표면 도포는 폴리(L-아르기닌) (PLR)이었다.
실시예 6: 계열 B GPCR에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드
도 11은, 예를 들어, 알로스테릭/친화성 N-말단 도메인 및 오쏘스테릭 엔도조말-분류/신호전달 도메인에 대한 결합에 대해, 표적화 리간드를 평가할 때 고려되어 지는 별개의 도메인을 강조하는, 계열 B GPCR의 개략도를 제공한다. (도면은 문헌 [Siu, Fai Yiu, et al., Nature 499.7459 (2013): 444-449]으로부터 적응됨). 그와 같은 도메인은 시스테인 치환에 대해 표적화 리간드 엑센딘-4 내에서 부위를 선정할 때 고려되었다.
도 12에서, 시스테인 11 치환 (S11C)이 친화성이 유지되고 또한 핵산 방출을 증진하고 핵산 열화를 제한하는 긴 엔도조말 재순환 경로를 이용하는 그와 같은 방식으로 고착 도메인 (예를 들어, 양이온성 고착 도메인)에 대해 엑센딘-4를 접합하기 위한 하나의 가능한 아미노산 변형으로 확인되었다. 글루카곤-GCGR (4ERS) 및 GLP1-GLP1R-ECD 복합체 (PDB: 3IOL)의 알려진 결정 구조로 모의실험된 엑센딘-4 (서열번호: 1)의 정렬에 따라, PDB 표현은 두 결합 틈을 파괴하지 않도록 가교결합된 복합체가 반드시 향하는 방향을 예측하기 위해 3-차원 공간으로 회전되었다. 세크레틴-계열 리간드의 가교 결합 부위가 상응하는 세크레틴-계열 수용체의 두 결합 틈들에 충분히 직교하는 경우, 고-친화성 결합뿐만 아니라 최적의 적재물 방출을 위한 수반되는 긴 엔도조말 재순환 경로 격리가 일어날 수 있다는 것이 결정되었다. 이 기술을 사용하여, 엑센딘-4의 아미노산 위치 10, 11, 및 12는 시스테인 잔기의 삽입 또는 이들로 치환에 대한 위치로 확인되었다.
실시예 7: RTK에 대한 표적화된 결합을 제공하는 표적화 리간드
도 13은 3원 FGF2-FGFR1-헤파린 복합체 (PDB 상의 1fq9)의 일부로서 tbFGF 단편을 도시한다. CKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKS (강조됨) (서열번호: 14)는 FGFR1에 대한 친화성에 중요한 것으로 결정되었다. 도 14는 HFKDPK (서열번호: 5)가 리간드-수용체 오쏘스테릭 활성 및 친화성을 위해 사용하는 펩타이드로 결정되었다는 것을 도시한다. 도 15는 LESNNYNT (서열번호: 6)가 리간드-수용체 오쏘스테릭 활성 및 친화성을 위해 사용하는 펩타이드로 또한 결정되었다는 것을 도시한다.
실시예 8
표 3 - 표 5는 이어지는 실험 (예를 들어, 축합 데이터; 이화학적 데이터; 및 유세포측정 및 영상 데이터)에서 사용된 성분에 대한 안내를 제공한다.
물질 및 방법
리간드 합성
대두분의 표적화 리간드 서열이 인하우스 설계되었고 제3자의 상업적 제공자에 의해 맞춤 제작되었다. 펩타이드 리간드는 천연 폴리펩타이드 서열로부터 유래되었으며 일부 경우에는 결합 친화도를 개선시키기 위해 돌연변이되었다. 결합 동력학의 전산 분석과 최적 돌연변이의 결정은 Rosetta 소프트웨어의 사용을 통해 달성되었다. 표적 리간드가 인하우스 제조되는 경우, 방법 및 재료는 아래와 같다:
펩타이드는 표준 Fmoc-기반 고체상 펩타이드 합성 (SPPS)을 사용하여 합성되었다. 펩타이드는 Rink-아미드 AM 수지 상에서 합성되었다. 아미노산 커플링은 디메틸 포름아미드 (DMF) 내 O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 커플링 시약 및 N-메틸모폴린 (NMM)으로 수행되었다. 펩타이드의 탈보호 및 절단은 트리플루오로 아세트산 (TFA), 트리이소프로필실란 (TIPS), 및 물로 수행되었다. 조 펩타이드 혼합물은 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 정제되었다. 순수한 펩타이드 분획을 냉동시키고 동결 건조시켜 정제된 펩타이드를 획득했다.
나노입자 합성
나노입자는 양이온성과 음이온성 성분 간에 실온, 37C 또는 차별적인 37C 및 실온에서 합성되었다. 용액은 양이온성 및 음이온성 성분의 혼합 동안 천연 정전 상호작용을 이용하여 수성 완충액에서 제조했다. 시작시, 음이온성 성분은 Tris 완충액 (30mM - 60mM; pH = 7.4 - 9) 또는 HEPES 완충액 (30mM, pH = 5.5)에 용해시키고 반면 양이온성 성분은 HEPES 완충액 (30mM - 60mM, pH = 5 - 6.5)에 용해시켰다.
구체적으로, 적재물 (예를 들어, 유전 물질 (RNA 또는 DNA), 유전 물질-단백질-핵 국재화 신호 폴리펩타이드 복합체 (리보핵 단백질), 또는 폴리펩타이드)을 염기성, 중성 또는 산성 완충액에서 재구성했다. 분석적 목적을 위해, 적재물이 형광단으로 공유적으로 태깅되거나 또는 유전자적으로 인코딩하도록 제조했다. pDNA 적재물로, TATATA 연쇄 반복에 대해 특이적인 Cy5-태깅된 펩타이드 핵산 (PNA)을 형광 리포터 벡터 및 형광 리포터-치료적 유전자 벡터를 형광으로 태그하기 위해 사용했다. 음으로 하전된 응축 종 (예를 들어폴리(글루탐산))으로 또한 작용할 수 있는 적기-방출 성분을 또한 염기성, 중성 또는 산성 완충액에서 재구성했다. 링커-앵커 서열에 접합된 야생형 유래된 또는 야생형 돌연변이된 표적화 펩타이드를 갖는 표적화 리간드를 산성 완충액에서 재구성했다. 추가의 응축 종 또는 핵 국재화 신호 펩타이드가 나노입자에 포함되는 경우, 이들은 양이온성 종에 대해 0.03% w/v 작동 용액으로, 그리고 음이온성 종에 대해 0.015% w/v로 완충액에서 또한 재구성했다. 실험은 또한 양이온성 종에 대해 0.1% w/v 작동 용액으로, 그리고 음이온성 종에 대해 0.1% w/v로 수행되었다. 유전 물질과 복합체를 형성한 것들을 제외한 모든 폴리펩타이드는 10분 동안 초음파처리하여 가용화를 개선시켰다.
나노입자의 각각의 별도로 재구성된 성분을 그런 다음 조사되어 지는 첨가의 순으로 혼합하였다. 조사된 첨가의 상이한 순서는 하기를 포함한다:
1) 적재물<양이온성 종
2) 적재물<양이온성 종 (앵커) <양이온성 종 (앵커-링커-리간드)
3) 적재물<음이온성 종<양이온성 종
4) 적재물<양이온성 종<음이온성 종
5) 적재물<양이온성 종 (앵커) <양이온성 종 (앵커-링커-리간드) <음이온성 종
6) 적재물<음이온성 종<양이온성 종 (앵커) + 양이온성 종 (앵커-링커-리간드)
7) 적재물 + 음이온성 종<양이온성 종 (앵커) + 양이온성 종 (앵커-링커-리간드)
8) 적재물 1 (리보핵 단백질 또는 다른 유전적/단백질 물질) <양이온성 종 (히스톤 단편, NLS 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드 없음) <음이온성 종
9) 적재물 1 (리보핵 단백질 또는 다른 유전적/단백질 물질) <양이온성 종 (히스톤단편, NLS 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드 없음) <음이온성 종<양이온성 종 (히스톤단편, NLS, 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드가 있거나 없음)
10) 적재물 1 (리보핵 단백질 또는 다른 유전적/단백질 물질) <양이온성 종 (히스톤단편, NLS 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드 없음) <적재물 2/3/4 (하나 이상의 적재물) <양이온성 종 (히스톤 단편, NLS, 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드가 있거나 없음)
11) 적재물 1 (리보핵 단백질 또는 다른 유전적/단백질 물질) <양이온성 종 (히스톤 단편, NLS 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드 없음) <적재물 2/3/4 (하나 이상의 적재물) + 음이온성 종<양이온성 종 (히스톤 단편, NLS, 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드가 있거나 없음)
12) 적재물 1/2/3/4 (하나 이상의 리보핵 단백질, 단백질 또는 핵산 적재물) + 음이온성 종<양이온성 종 (히스톤 단편, NLS, 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드가 있거나 없음)
13) 적재물 1/2/3/4 (하나 이상의 리보핵 단백질, 단백질 또는 핵산 적재물) <양이온성 종 (히스톤 단편, NLS, 또는 하전된 폴리펩타이드 앵커로 링커-리간드가 있거나 없음)
세포 배양
T 세포
형질감염 24시간 이전에, 20M 인간 일차 Pan-T 세포 (Stemcell 포함한다70024)를 함유하는 극저온 바이알을 해동하고 200μl 및 75,000 세포/웰 (1.5E6 세포/ml)로 4개 96-웰 플레이트의 4x66 웰들에 씨딩했다. 세포를 10% FBS 및 L-글루타민이 보충된 항생제 프리 RPMI 1640 배지 (Thermofisher 포함한다11875119)에서 배양하고 2일마다 배지를 교체함에 의해 유지했다.
조혈 줄기 세포 (HSC)
형질감염 24시간 이전에, 500k 인간 일차 CD34+ 세포 (Stemcell 포함한다 70002)를 함유하는 극저온 바이알을 해동하고 200μl 및 10-12k 세포/웰로 96-웰 플레이트의 48 웰들에 씨딩했다. 배양 배지는 10% FBS, 25ng/ml TPO, 50ng/ml Flt-3 리간드, 및 50ng/ml SCF가 보충된 Stemspan SFEM II (Stemcell 포함한다09605)로 구성되었고 2일마다 배지를 교체함에 의해 유지했다.
사이노몰구스 골수 (HSC)
형질감염 48시간 이전에, 1.25M 사이노몰구스 원숭이 골수 세포 (IQ Biosciences 포함한다 IQB-MnBM1)를 함유하는 극저온 바이알을 해동하고 둥근 바닥 96-웰플레이트의 48 웰들에 200μl 및 ~30k 세포/웰로 씨딩했다. 세포를 12% FBS로 보충된 항생제 프리 RPMI 1640 배지에서 배양하고 2일마다 배지를 교체함에 의해 유지했다.
인간 전혈
5mL의 전혈을 정맥 천자를 통해 채취했다. 1mL를 14mL의 PBS와 혼합했다. 나노입자는 15mL 튜브 안으로 직접적으로 형질감염되거나, 또는 100μl의 혈액이 나노입자 형질감염 이전 96-웰 플레이트의 각 웰에 적정되었다.
형질감염
나노입자의 모액을 형성한 후, 10μl의 나노입자가 96-웰플레이트의 웰당 첨가되고 세포 배양 조건에 대한 변화 또는 배지의 보충 없이 인큐베이션되었다 (표 6 참고). 96-웰 플레이트는 CO2 및 온도 조절된 환경하에서 BioTek Cytation 5를 통한 생존 세포 이미지형성 동안 유지되었다.
분석
축합 및 봉입 곡선
0.0044ug/μl의 헤모글로빈 서브유닛 베타 (HBB) gRNA 또는 폰 빌레브란트 인자 (VWF)-EGFP-pDNA를 함유하는 50μl 용액을 30 mM Tris 완충액 (pH = 7.4 - 8.5)에 0.4x 현탁된 1 μl의 SYBR를 갖는 pDNA 결합 부위 또는 mRNA 또는 siRNA와 혼합함에 의해 축합 곡선을 생성하였다. HBB gRNA는 RNP에 복합체화된 상태로 존재하였다. 개재된 SYBR 골드로부터의 형광 방출이 카복실레이트-대-포스페이트 (C:P) 비가 1 내지 150 사이의 범위로 되는 PLE20, PLE35, PLE100, 또는 PLE100:PDE100 (1:1 D:L 비)의 단일 첨가 전후에 모니터링되었다. 나중에, 원하는 아민 대 포스페이트 (N:P) 또는 아민 대 포스페이트+카복실레이트 [N:(P+C)] 비에 도달하도록 양이온성 종을 첨가하였다. 대표적인 양이온성 종은 상이한 양전하 대 음전하 비 (CR)에 상응하는, PLR10, PLR50, PLR150, 앵커-링커 펩타이드, 하전된 폴리(아르기닌) 사슬에 접합된 GGGGSGGGGS (서열번호: 298) 링커에 접합된 다양한 돌연변이된 표적화 리간드 (즉 내부 명칭: SCF_mcKit_(4GS)2_9R_C), 히스톤_H3K4(Me3) 펩타이드 [1-22] (mH3_K4Me3_1), 히스톤_H4K16(Ac) 펩타이드 [1-20] (mH4_K16Ac_1), 히스톤_H2A 펩타이드 [1-20] (mH2A_1)를 포함했다. 일부 실험에서, 양이온성 종은 상기 지침에 따라 음이온성 종 이전에 첨가했다.
봉입 곡선은 상이한 나노입자 제형에 캡슐화된 VWF-EGFP-pDNA, gRNA HBB, Alexa555 Block-IT-siRNA의 알려진 양 (100 내지 600 ng)을 함유하는 60 mM HEPES (pH = 5.5) 용액에 현탁된 나노입자에 대해 Tris 완충액 30 mM ( pH = 7.4)에 0.2x 희석된 SYBR 골드의 다중 첨가를 수행한 후 수득되었다.
GFP 채널에 개재된 SYBR 골드로부터의 형광 방출은 Synergy Neo2 Hybrid 다중방식 판독기 (Biotek, USA) 또는 CLARIOstar 마이크로플레이트 판독기 (BMG, Germany)를 사용하여 편평한 바닥, 절반 영역, 96 웰-플레이트에서 기록되었다.
나노입자 추적 분석 (제타)
나노입자 제형의 유체역학적 직경 및 제타 전위는 ZetaView 기기 (Particle Metrix, Germany)를 사용하여 나노입자를 추적 분석함에 의해 조사되었다. 기기 안으로 주입하기 전에 샘플은 PBS (1:12)에서 1:100으로 희석시켰다. 측정을 얻기 위해, 분석 전에 최적의 감수성 및 입자/프레임 (~100-150)으로 카메라 설정을 조정한다.
형광현미경 검사 - BioTek Cytation 5
Cytation 5 고-함량 스크리닝 생존-세포 이미지형성 현미경 (BioTek, USA)을 이용하여 유세포측정에 의한 평가 이전에 형질감염 효율을 이미지형성하였다. 간단히, GFP 및/또는 Cy5 채널뿐만 아니라 10x 대물렌즈 하에서 명시야를 이용하여 4h 동안 15m 증분 후-형질감염으로, 그리고 그 다음 이어지는 12시간 동안 2h 증분으로, 세포는 형질감염 이전에 이미지화되었다. 이미지는 후속으로 연속적 동력학의 대표적인 것으로 또는 별개의 1-18, 24, 36, 또는 48-시간 시점에 수집되었다.
유동-세포측정
세포 라벨링 실험은 세포 배지를 제거하기 위한 수세 단계와 이어서 실온에서 30분 동안 PBS에 용해된 Zombie NIR 생존력 키트 염색 및/또는 CellEvent™ 카스파제-3/7 그린 (Invitrogen, U.S.A.)으로 세포의 인큐베이션을 행하여 수행되었다. 생존력 라벨링 혼합물의 총 용적은 25 μl/웰이었다. 형광 일차 항체의 패널이 그런 다음 혼합물에 첨가되고 (0.25 μl의 각각의 항체/웰) 15분 동안 인큐베이션되었다. 양성 대조군 및 음성 단일-채널 대조군을 생존 세포의 UltraComp eBeads 보상 비드 및 음성 비드 또는 Cy5 핵 염색을 이용하여 생성하였다. 모든 인큐베이션 단계는 회전식 진탕기 상에서 그리고 어둠에서 수행되었다. Attune 다중변수의 유세포측정은 상이한 채널 중에 적절한 보상이 적용되어 진 후 Attune NxT 유세포측정기 (ThermoFisher, USA)를 사용하여 생존 세포 상에서 수행되었다. 세포의 대표적인 모집단은 전면 및 측면 산란 강도의 적절한 게이트의 선택에 의해 선택되었다. 세포 형광의 검출은 적어도 10000 건이 수집될 때까지 계속되었다.
결과/데이터
도 19 - 도 44 : 축합 데이터
도 19. (a) SYBR 골드가 초기에 개재된 PNA 적재물을 갖는 VWF-EGFP pDNA를 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다.
CR은 양이온성 PLR150의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 관측된 형광 감소는 PLR150의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 c:p 비에 걸쳐 일관된다. 바탕 용액은 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유한다. (b) PLE100이 없는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로서 형광 강도 변이.
도 20. SYBR 골드가 초기에 개재된 NLS-CAS9-NLS RNP 복합체화된 w/ HBB gRNA 적재물을 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR*)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 추가로, CR*의 결정은 cas9로 복합체화에 의해 감추어 진 gRNA의 음으로 하전된 부분을 포함하지 않는다. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다.
CR은 양이온성 PLR150의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 바탕 용액은 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유한다. 관측된 형광 감소는 PLR150의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 c:p 비에 걸쳐 일관된다.
도 21. SYBR 골드가 초기에 개재된 gRNA HBB 적재물을 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다.
CR은 PLR150의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 바탕 용액은 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유한다. 관측된 형광 감소는 PLR150의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, CR에 관한 축합은 다양한 C:P 비에 걸쳐 일관된다.
도 22 - 도 24: 양이온성 물질로서 펩타이드 SCF_rmAc-cKit_(4GS)2_9R_C로의 축합 곡선
도 22. (a)(b) SYBR 골드가 초기에 개재된 HBB gRNA 적재물을 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다. CR은 양으로 하전된 폴리(아르기닌)에 접합된 (GGGS)2 링커에 접합된 양이온성 돌연변이된 cKit 표적화 리간드 (내부 리간드 명칭: SCF_rmAc-cKit_(4GS)2_9R_C)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 관측된 형광 감소는 SCF_rmAc-cKit_(4GS)2_9R_C의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 c:p 비에 걸쳐 일관된다. 바탕 용액은 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유한다.
도 23. (a)(b) SYBR 골드가 초기에 개재된 NLS-CAS9-NLS RNP 복합체화된 w/ HBB gRNA 적재물을 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다.
CR은 양으로 하전된 폴리(아르기닌)에 접합된 (GGGS)2 링커에 접합된 양이온성 돌연변이된 cKit 표적화 리간드 (내부 리간드 명칭: SCF_rmAc-cKit_(4GS)2_9R_C)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 관측된 형광 감소는 SCF_rmAc-cKit_(4GS)2_9R_C의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 c:p 비에 걸쳐 일관된다. 바탕 용액은 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유한다.
도 24. (a)(b) SYBR 골드가 초기에 개재된 PNA 적재물을 갖는 VWF-EGFP pDNA를 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다.
CR은 양으로 하전된 폴리(아르기닌)에 접합된 (GGGS)2 링커에 접합된 양이온성 돌연변이된 cKit 표적화 리간드 (내부 리간드 명칭: SCF_rmAc-cKit_(4GS)2_9R_C)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 관측된 형광 감소는 SCF_rmAc-cKit_(4GS)2_9R_C의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 c:p 비에 걸쳐 일관된다. 바탕 용액은 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유한다.
도 25 - 도 26: 양이온성 물질로 히스톤 H3K4Me로의 축합 곡선
도 25. SYBR 골드가 초기에 개재된 PNA 적재물을 갖는 VWF-EGFP를 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다. CR은 양이온성 돌연변이된 히스톤_H3K4(Me3) 펩타이드 [1-22] (내부 펩타이드 명칭 mH3_K4Me3_1)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 관측된 형광 감소는, PLE100의 존재에서, mH3_K4Me3_1의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 SYBR이 적재물로부터 충분히 이탈되도록 하는데 실패했다는 것을 도시한다. 바탕 용액은 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유한다.
도 26. (a) SYBR 골드가 초기에 개재된 NLS-CAS9-NLS RNP 복합체화된 w/ HBB gRNA 적재물을 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다. CR은 양이온성 돌연변이된 히스톤_H3K4(Me3) 펩타이드 [1-22] (내부 펩타이드 명칭 mH3_K4Me3_1)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 관측된 형광 감소는, PLE100의 존재에서, mH3_K4Me3_1의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 SYBR이 적재물로부터 일관되게 이탈되도록 하는데 실패했다는 것을 도시한다. 그러나, 히스톤_H3K4(Me3)은 음이온성 폴리펩타이드의 부재에서 CR≤8:1에서 효과적인 축합제인 것으로 나타났다.
도27 - 도 30: 양이온성 물질로 펩타이드 CD45_aSiglec_(4GS)2_9R_C로의 축합 곡선
도27. SYBR 골드가 초기에 개재된 PNA 적재물을 갖는 VWF-EGFP pDNA를 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다. CR은 양으로 하전된 폴리(아르기닌)에 접합된 (GGGS)2 링커에 접합된 양이온성 돌연변이된 CD45 수용체 표적화 리간드 (내부 리간드 명칭: CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 비어있는 기호는 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유하는 바탕 용액을 나타낸다.
관측된 형광 감소는 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 C:P 비에 걸쳐 일관된다.
도28. SYBR 골드가 초기에 개재된 Cy5-EGFP mRNA 적재물을 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다.
CR은 양으로 하전된 폴리(아르기닌)에 접합된 (GGGS)2 링커에 접합된 양이온성 돌연변이된 CD45 수용체 표적화 리간드 (내부 리간드 명칭: CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 관측된 형광 감소는 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 c:p 비에 걸쳐 일관된다.
도29. SYBR 골드가 초기에 개재된 BLOCK-iT Alexa Fluor 555 siRNA 적재물을 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다. CR은 양으로 하전된 폴리(아르기닌)에 접합된 (GGGS)2 링커에 접합된 양이온성 돌연변이된 CD45 수용체 표적화 리간드 (내부 리간드 명칭: CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 관측된 형광 감소는 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 C:P 비에 걸쳐 일관된다.
도 30. (a) SYBR 골드가 초기에 개재된 HBB gRNA 적재물에 복합체화된 NLS-Cas9-EGFP RNP를 함유하는 나노입자에서 양전하 대 음전하 비 (CR)의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 범례에서 도시된 카복실레이트 대 포스페이트 (C:P) 비는 음이온성 폴리펩타이드 종 (PLE100) 상의 카복실레이트기 대 적재물의 유전 물질 상의 포스페이트기의 나노입자의 비에 기반된다.
CR은 양으로 하전된 폴리(아르기닌)에 접합된 (GGGS)2 링커에 접합된 양이온성 돌연변이된 CD45 수용체 표적화 리간드 (내부 리간드 명칭: CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C)의 단계적인 첨가를 통해 증가되었다. 채워진 기호는 적재물의 부재에서 SYBR 골드를 함유하는 바탕 용액을 나타낸다.
관측된 형광 감소는 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C의 첨가를 통해 CR을 증가시키는 것이 입자가 응축함에 따라 SYBR이 적재물로부터 이탈되도록 한다는 것을 도시한다. 추가로, 축합은 다양한 c:p 비에 걸쳐 일관된다. (b) PLE가 없고 전하 비 = 22를 갖는 나노입자에 대한 유체역학적 직경 분포의 대표적인 이미지. 평균 직경은 <d>= 134 nm ±65이다.
도 31 - 도 34: 봉입 곡선
도 31. 150 ng의 BLOCK-iT Alexa Fluor 555 siRNA 적재물을 함유하는 상이한 나노입자 제형 모두에 단계적인 SYBR 첨가의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 봉입 검정. 0μl 내지 50μl의 SYBR로부터 형광에서의 델타 변화는 나노입자 제형의 안정성을 나타낸다. 덜 안정적으로 응축된 제형일수록, SYBR 골드가 유전적 적재물에 더 많이 삽입될 가능성이 높다. 리포펙타민 RNAiMAX는 여기서 양성 대조군으로 사용된다. 표 2-4.
도 32. 300 ng HBB gRNA 적재물을 함유하는 상이한 나노입자 제형 모두에 단계적인 SYBR 첨가의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 봉입 검정. 0μl 내지 50μl의 SYBR로부터 형광에서의 델타 변화는 나노입자 제형의 안정성을 나타낸다. 덜 안정적으로 응축된 제형일수록, SYBR 골드가 유전적 적재물에 더 많이 삽입될 가능성이 높다. 리포펙타민 CRISPRMAX는 여기서 양성 대조군으로 사용된다. 표 2-4.
도 33. Cy5 EGFP mRNA 적재물을 함유하는 상이한 나노입자 제형 모두에 단계적인 SYBR 첨가의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 봉입 검정. 0μl 내지 50μl의 SYBR로부터 형광에서의 델타 변화는 나노입자 제형의 안정성을 나타낸다. 덜 안정적으로 응축된 제형일수록, SYBR 골드가 유전적 적재물에 더 많이 삽입될 가능성이 높다. 리포펙타민 메신저 MAX는 여기서 양성 대조군으로 사용된다. 표 2-4.
도 34. Cy5 태깅된 펩타이드 핵산 (PNA) 결합 부위 적재물을 갖는 600 ng의 VWF-EGFP pDNA를 함유하는 상이한 나노입자 제형 모두에 단계적인 SYBR 첨가의 함수로 형광 강도 변이를 나타내는 SYBR 골드 봉입 검정. 0μl 내지 50μl의 SYBR로부터 형광에서의 델타 변화는 나노입자 제형의 안정성을 나타낸다. 덜 안정적으로 응축된 제형일수록, SYBR 골드가 유전적 적재물에 더 많이 삽입될 가능성이 높다. 리포펙타민 3000은 여기서 양성 대조군으로 사용된다. 표 2-4.
도 35 - 도 44: TC.001에 대한 SYBR 배제/축합 검정 (표 2-4 참고)
이들 데이터는 실험 TC.001에서 사용된 제형이 안정하는 것을 나타내고, 게다가 이들은 H3과 달리 H2A 및 H4 히스톤 꼬리 펩타이드가 모든 열거된 적재물에 대해 그 자체로 효과적인 축합이다는 것을 나타낸다. H2A 및 H4는 추가로 앵커-링커-리간드와 조합될 수 있다는 것을 또한 도시한다. 마지막으로, 음이온성 폴리머 (이 구현예에서, PLE100)의 후속적인 첨가는 입자 안정성에 영향을 미치지 않거나, 또는 음이온성 폴리머에 첨가 이전에 핵산 또는 리보핵 단백질 적재물에 접합된 다양한 앵커-링커-리간드 펩타이드에 대한 크기 및 제타 전위 측정을 통해 실증된 바와 같이 안정성을 증진한다는 증거가 제시된다.
도 35. PLE100에 이은 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C의 첨가에 의해 그리고 RNP에 양이온성 폴리펩타이드의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정. 형광 배경 신호는 RNP로부터의 GFP 형광에 기인한다.
도 36. PLE100에 이은 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C의 첨가에 의해 그리고 siRNA 및 SYBR 골드에 양이온성 폴리펩타이드의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정.
도 37. CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C에 이은 양이온성 폴리펩타이드히스톤펩타이드 H2A의 첨가에 의해 그리고 HBB gRNA 및 SYBR 골드를 갖는 NLS-Cas9-EGFP의 RNP에 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정.
도 38. CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C와 함께 양이온성 폴리펩타이드히스톤펩타이드 H4의 첨가에 의해 그리고 HBB gRNA 및 SYBR 골드를 갖는 NLS-Cas9-EGFP의 RNP에 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정.
도 39. 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C f의 첨가에 의해 그리고 mRNA에 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정.
도 40. 히스톤 H4 첨가에 의해 그리고 mRNA에 CD45-mSiglec-(4GS)2_9R_c 및 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정.
도 41. 히스톤 H2A 첨가에 의해 그리고 mRNA에 CD45-mSiglec-(4GS)2_9R_c 및 PLE100의 추가의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 SYBR 골드 배제 검정.
도 42. PLE100에 이은 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 VWF_EGFP pDNA로의 삽입으로부터 SYBR 골드 배제 검정.
도 43. PLE100에 이은 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C에 이어서, 히스톤 H4의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 VWF_EGFP pDNA로의 삽입으로부터 SYBR 골드 배제 검정.
도 44. PLE100에 이은 양이온성 폴리펩타이드 CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C에 이어서, 히스톤 H4의 첨가에 의한 형광 강도 감소를 나타내는 VWF_EGFP pDNA로의 삽입으로부터 SYBR 골드 배제 검정.
도 45 - 도 83: 물리화학적 데이터
입자 크기 및 제타 전위는 콜로이드성 나노물질의 특성규명에서 사용된 일상적인 측정이다. 이들 측정은 광산란 기술 예컨대 DLS (동적 광산란)를 통해 주로 획득된다. 나노입자 추적 분석 (NTA)은 레이저 산란 현미경검사 및 이미지 분석을 이용하여 고해상도로 입자 크기 및 제타 전위의 측정을 얻는다.
분석
분산도는 샘플 불균질성의 척도이고, 편차 및 단일 피크의 낮은 표준이 입자 균일성을 나타내는 분포에 의해 결정된다.
리간드를 갖는 폴리펩타이드, (GGGGS)2 링커, 및 정전 앵커 도메인으로 구성되는 표적화 리간드가 고상 펩타이드 합성에 의해 합성되어 pEGFP-N1 플라스미드 DNA 적재물을 담지하는 입자의 실리카 표면 (탈피할 수 있는 층)을 기능화하기 위해 사용되었다. 얻어진 입자 크기 및 제타 전위 분포는 ZetaVIEW 기기 (Particle Metrix, Germany)를 사용하여 나노입자 추적 분석에 의해 수득되었다.
도 45. (A) H3K4(Me3)로 복합체화된 pEGFP-N1 플라스미 및 폴리(L-아르기닌) ( 29kD, n=150)으로 구성된 코어 폴리플렉스 크기 분포. (B) 특징적인 음성 제타 전위 및 124nm의 평균 입자 크기를 나타내는 실리카 탈피할 수 있는 층을 갖는 도 45A의 폴리플렉스. (C) 도 45B에 도시된 입자 상에 코팅된 N 말단 앵커 및 글리신-세린 링커 ((GGGGS)2)를 갖는 E 셀렉틴 리간드.
도 46. 분지형 히스톤 펩타이드 콘주게이트 파일롯트 입자. C-말단 시스테인을 갖는 히스톤 H3 펩타이드는 10% 측쇄 티올 치환을 갖는 48kD 폴리(L-라이신)에 접합되었다. 원심 여과 및 분자량 배제에 의해 정제된 최종 생성물은 복합체 플라스미드 DNA (pEGFP-N1)에 사용되었다. 도 46에 묘사된 얻어진 측정은 좁은 크기 분포를 나타낸다. 플라스미드 DNA (pEGFP-N1)와 복합체에서 H3-폴리(L-라이신) 콘주게이트의 크기 분포
도 47-도 83의 경우, 데이터는 실험 번호 (프로젝트 코드)에 의해 색인이 만들어졌다. 많은 사례에서, 이것은 표 5의 프로젝트 코드에 교차-참조될 수 있다 (HSC=조혈 줄기 세포; BM=골수 세포; Tcell=T 세포; 혈액=전혈; cynoBM=사이노몰구스 골수).
도 47은 프로젝트 HSC.001.001에 관련된 데이터를 제공한다.
도 48은 PNA-태깅된 pDNA에 복합체화된 H3-폴리(L-라이신) 콘주게이트 및 E-셀렉틴 표적화 펩타이드 (ESELLg_mESEL_(4GS)2_9R_N)를 사용한 프로젝트 HSC.001.002에 관련된 데이터를 제공한다.
도 49 - 도 52는 다양한 표적화 리간드 또는 스텔스 분자가 실리카-코팅된 입자 및 실리카-코팅된 나노다이아몬드 (진단 향상된 형광 적용 용) 상에 코팅된 실험에 대한 데이터를 제공한다. 크기 및 제타 전위 분포는 연관된 통계로 제시된다. 표적화 리간드는 각각 ESELLg_mESEL_(4GS)2_9R_N, ESELLg_mESEL_(4GS)2_9R_C, CD45_mSiglec_(4GS)2_9R_C, 및 Cy5mRNA-SiO2-PEG였다.
나노제형 및 표적화 리간드의 성능은 다양한 적재물 및 리간드-표적화 접근법으로, - 실리카 층의 제거 및 모든 제형에 걸쳐 나노입자의 형질감염 효율성이 상당히 향상된 하전된 음이온성 탈피할 수 있는 폴리펩타이드 매트릭스로 대체에 따라 모든 데이터에서 상당히 개선되었다. 그러나, 상기 데이터에서 사용된 다층화 기술뿐만 아니라 분지형 히스톤 복합체로 향상된 축합 및 후속적인 펩타이드 매트릭스 엔지니어링 (실시예는 Tcell.001, HSC.004, CYNOBM.002, 및 BLOOD.002에 제시됨)은 (예를 들어, 다층화) 기술의 유연성 및 코어 생체적합물질 (예를 들어, 전체의 개시내용 및 후속적인 실험 참고)을 입증한다. 본 명세서에서 기재된 모든 기술은 진단 또는 치료제이든, 뿐만 아니라 자기-조립된 물질이든 임의의 입자 코어에 적용될 수 있다. 예를 들어, 분지형 히스톤은 링커-리간드 도메인에 접합될 수 있거나 또는 복수의 구현예 및 이의 용도로 함께-응축될 수 있다.
도 53 - 도 57은 탈피할 수 있는 폴리(글루탐산) 표면 매트릭스 및 CD45 리간드로 복합체화된, Cy5-EGFP mRNA 적재물을 담지하는 입자를 묘사한다. 이 제형을 사용하여 생산된 나노입자는 입자 크기 및 제타 전위에서 고도로 균일하였다. mRNA (BLOOD.002.88)로 SIGLEC-유래된 펩타이드 회합 후 첨가된 폴리(글루탐산)을 갖는 입자는 mRNA 및 폴리(글루탐산)으로 SIGLEC-유래된 회합 전에 부가된 폴리(글루탐산)을 갖는 입자보다 보다 안정하였고 단분산하여, 첨가의 특정 순서가 보다 안정한 입자를 형성하는데 도움이 될 수 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 포스페이트-함유 핵산 없이 SIGLEC-유래된 펩타이드로 복합체화된 폴리(글루탐산)으로부터 형성된 입자는 고도로 음이온성 단분산되었다 (BLOOD.002.92). mRNA로 PLR 회합 후 첨가된 PLE100과 함께 PLR50으로부터 형성된 입자는 고도로 안정하고, 단분산되고 양이온성이었다 (BLOOD.002.91). 그에 반해서, PLE100 첨가 이전에 mRNA와 PLK-PEG 회합은 불균질 전하 분포를 갖는 매우 작은 입자를 초래했다. 이들 첨가의 순서 및 SIGLEC-유도체 펩타이드의 효능은 유세포측정 데이터에 의해 실증되었고 여기서 리간드-표적화된 SIGLEC-유도체 입자는 페길화된 대조군에 대한 유사한 형질감염 효율성에도 불구하고 전혈 세포에서 거의 두 자릿수 이상의 Cy5 강도를 초래했다.
도 53은 BLOOD.002.88로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 180nm 미만의 직경을 갖는 -3.32 +/- 0.29mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 전혈에서 58.6% 효율적인 Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다. 좁고 균일한 피크는 탁월한 전하 분포를 예시하고, TCELL.001.18에서 총 음이온성 입자를 형성하여 재생가능하였다. 이것은 전신 전달을 위한 SIGLEC-유래된 표적화 펩타이드의 넓은 적용가능성을 입증한다 (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고).
도 54는 BLOOD.002.89로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 176nm 미만의 직경을 갖는 -0.25 +/- 0.12mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 전혈에서 58.6% 효율적인 Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다. 이것은 전신 전달을 위한 Siglec 유래된 표적화 펩타이드의 넓은 적용가능성을 입증한다 (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고).
도 55는 BLOOD.002.90으로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 99nm 미만의 직경을 갖는 2.54 +/- 0.03mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 전혈에서 79.9% 효율적인 Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다 (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고).
도 56은 BLOOD.002.91로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 130nm 미만의 직경을 갖는 27.10 FWHM 18.40mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 각각 전혈에서 96.7% 효율적인 Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다 (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 강하게 양으로 하전된 제타 전위는 전혈 세포 상에서 Cy5+ 신호의 높은 효율성 및 강도를 유도했다. 간단히, 이 구현예에서, 더 큰 용량의 PLR50 (15 μl의 PLR50 0.1% w/v 용액)이 2.5 ug Cy5 mRNA (TriLink)를 갖는 100 μl pH 5.5 30 mM HEPES에 첨가되었다. 37℃에서 5분 후, 1.5 μl의 PLE100 0.1%가 상기 용액에 첨가되었다. 그에 반해서, 다른 실험은 사전형성된 양이온성 폴리머 + 음이온성 물질 코어에 PLE100의 더 큰 상대 용적 (총 용액 용적의 5-20%)을 부가하는 것을 포함했다.
도 57은 BLOOD.002.92로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 130nm 미만의 직경을 갖는 -22.16 FWHM 18.40mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는, 이들이 형광단으로 표지되지 않았기 때문에, 유세포측정 데이터에 따라 전혈에서 검출가능한 Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래하지 않았다 (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 적재물 (비히클) 없는 이들 나노입자의 효과적인 축합은 소분자 또는 화학 치료제에 하전된 중합체의 콘주게이션과 같은, 비-유전 물질 적재물 전달에 또한 연루하지 않는다.
도 58 - 도 73은 CRISPR 리보핵 단백질 (RNP) (TCELL.001.01 - TCELL.001.15), mRNA (TCELL.001.16 - TCELL.001.30), 플라스미드 DNA (TCELL.001.31 - TCELL.001.45) 및 siRNA (TCELL.001.46 - TCELL.001.60)를 함유하고, 상응하는 군에서 동일한 리간드로 패턴화된 대표적인 입자를 특징화하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 묘사한다.
도 58은 TCELL.001.1로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 77nm 미만의 직경을 갖는 -3.24 +/- 0.32mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 각각 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 팬 T 세포에서 99.16% 및 98.47% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP 흡수를 초래했다 (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 이들 제형은 또한 CYNOBM.002.82 - CYNOBM.002.85에서 후속적인 층화를 위한 기질로 작용하는 코어뿐만 아니라 모든 CYNOBM.002.75의 물리화학적 특성의 반영이며, 여기서 PLR10-코팅된 입자는 D:L 비의 범위, 분자량, 및 조성물의 하나 이상의 음이온성 폴리펩타이드의 탈피할 수 있는 음이온성 도포, 핵산 및/또는 하전된 거대분자로 복합체화되었다. TCELL.001.1은 CYNOBM.002.82 - CYNOBM.002.85에서 하전된 중합체 또는 하전된 앵커-링커-리간드의 첨가 이전에 PLE100 + mRNA에서 후속으로 코팅되었다.
도 59는 TCELL.001.3으로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 65nm 미만의 직경을 갖는 -0.98 +/- 0.08mV의 제타 전위를 가졌다. 이상적인 크기 범위에도 불구하고, 이들 나노입자는 동일한 세포 모집단에서 ~99% 효율을 달성한 TCELL.001.1에서의 강하게 음이온성의 유사한-크기의 입자에 대조적으로 유세포측정 데이터에 따라 각각 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 팬 T 세포에서 11.6% 및 13.2% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP 흡수를 초래했다. 입자 크기와 안정한 음성 제타 전위의 관계 및 이의 방법과 용도는 본 명세서에 기재된 실험을 통해 예측가능한 구속인 것으로 여겨진다. 이상적인 나노 입자는 <-5mV의 제타 전위를 갖는 대다수의 입자<70nm이고, 그리고 본 명세서에서 기재된 탈피할 수 있는 음이온성 코팅 방법뿐만 아니라 CYNOBM.002에 기재된 공동전달을 위한 다단계-층화 탈피할 수 있는 매트릭스는 인간 및 사이노몰구스 혈액, 골수, 및 상기 언급된 것 이내의 특이적 세포로부터 감수성 일차 세포의 안정하고 극도로 효율적인 형질감염을 달성한다. TCELL.001.3의 감소된 효율은 TCELL.01.27의 결과에 대한 현저한 대비로, 여기서 동일한 리간드는 이 특정 CRISPR 제형에 대해 사용된 것보다 변경된 아민-대-포스페이트-대-카복실레이트 비에서 mRNA의 안정한 축합을 달성했다 (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고).
도 60은 TCELL.001.13으로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 101nm 미만의 직경을 갖는 2.19 +/- 0.08mV의 제타 전위를 가졌다. 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 팬 T 세포에서 CRISPR-GFP-RNP 흡수의 효율에 대해 하기 유세포측정/영상 데이터 참고.
도 61은 TCELL.001.14로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 111nm 미만의 직경을 갖는 -9.37 +/- 0.16mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 각각 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 팬 T 세포에서 25.7% 및 28.6% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP 흡수를 초래했다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고).
도 62는 TCELL.001.16으로부터의 데이터를 제공한다.
도 63은 TCELL.001.18로부터의 데이터를 제공한다. 이들 입자의 크기 및 제타 전위는 -20.26 +/- 0.15 mV의 제타 전위를 갖는 80.9nm의 평균 입자 크기와 입자의 90%가 39.2 - 129.8nm 직경을 갖는 것을 입증하여, 1.35 카복실레이트-대-포스페이트 (C:P) 및 0.85 아민-대-포스페이트 비에서 강한 입자 안정성을 나타내며 여기서 폴리(글루탐산)은 양이온성 앵커-링커-리간드의 봉입에 이어서 첨가되었다. 고-효율 일차 세포 형질감염을 획득하는 것과 관련하여 추가의 일반적인 패턴, 엔지니어링 구속, 관찰 및 경험적 측정에 대한 TCELL.001.2, TCELL.001.18, 및 CYNOBM.002의 모든 제타 전위, 크기, 유세포측정 및 현미경검사 데이터를 참고한다 (예를 들어, 표 5 및 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고).
도 64는 TCELL.001.28로부터의 데이터를 제공한다. 도 65는 TCELL.001.29로부터의 데이터를 제공한다. 도 66은 TCELL.001.31로부터의 데이터를 제공한다. 도 67은 TCELL.001.33으로부터의 데이터를 제공한다. 도 68은 TCELL.001.43으로부터의 데이터를 제공한다. 도 69는 TCELL.001.44로부터의 데이터를 제공한다. 도 70은 TCELL.001.46으로부터의 데이터를 제공한다. 도 71은 TCELL.001.48로부터의 데이터를 제공한다. 도 72는 TCELL.001.58로부터의 데이터를 제공한다. 도 73은 TCELL.001.59로부터의 데이터를 제공한다.
도 74 - 도 83은 사이노몰구스 골수 세포에 사용된 제형을 특징화하는 결과를 묘사한다.
도 74는 CYNOBM.002.82로부터의 데이터를 제공한다. 입자는 생존 세포의 3%에서 태아 헤모글로빈 단백질 발현에 의해 입증된 바와 같이 전체의 골수 적혈구 선조 세포에서 BCL11a 적혈구 향상제를 성공적으로 삭제하였다. CYNOBM.002.82 나노 입자는 90%가 132nm 미만의 직경을 갖고 입자의 50%가 30nm 미만의 직경을 갖는 2.96 +/- 0.14mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 단지 11.4% 전체적인 골수 생존가능한 부분모집단 표적화에도 불구하고 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 부분모집단에서 CRISPR RNP 및 Cy5의 ~48%, ~53%, 및 ~97% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA 공동국소화된 흡수를 초래했다.
그에 반해서, PLR50의 mRNA 공동-전달 성분 또는 추가의 층이 없지만 PLR10, PLE100, PDE100 및 Cas9 RNP로 구성된 동일한 코어 템플레이트를 갖는 CYNOBM.002.75는 유세포측정 데이터에 따라 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 부분모집단에서 ~20%, ~14%, 및 ~100% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP 흡수, 및 18.0% 전체적인 골수 생존가능한 부분모집단 표적화를 나타냈다.
이들 데이터로, 혼합된 골수 일차 모집단 내의 전체적인 형질감염 효율이 약간 향상되는 것으로 보이는 경우에도 더 큰 입자가 선택적 표적화에 덜 부합할 수 있다고 추론될 수 있다. 일차 세포 배양 형질감염에 대한 입자의 양봉형 분포의 효과는 결정되어야 한다. 이전 연구에서, 골아세포는 높은 효율로 150-200nm 입자를 세포이입하는 것으로 밝혀졌다. 현저하게, CYNOBM.002.82를 갖는 입자의 다수의 모집단은 85nm 피크 이하로, TCELL.001.1에 유사하지만 PLE, PDE, mRNA 및 Cas9 RNP의 하층 폴리펩타이드-리보핵 단백질-mRNA-단백질 매트릭스를 둘러싸는 PLR50의 양으로 하전된 양성 매트릭스를 갖는다.
추가로, 전체적인 생존가능 세포의 3.0%는 CD34+인 이들 세포의 어느 것도 없이, 태아 헤모글로빈에 대해 양성이어서, CD34- 적혈구 선조 세포 내에서 BCL11a 적혈구 선조 녹아웃 모집단의 성공적인 클론 팽창을 시사한다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 결과는 또한 내피 세포, 골아세포, 파골세포, 및 골수의 다른 세포에서 성공적인 표적화에 연루될 수 있다.
도 75는 CYNOBM.002.83으로부터의 데이터를 제공한다. 입자는 CD34+인 이들 세포의 어느 것도 없이, 생존 세포의 1.9%에서 태아 헤모글로빈 단백질 발현에 의해 입증된 바와 같이 전체의 골수 적혈구 선조 세포에서 BCL11a 적혈구 향상제를 성공적으로 삭제하였다. 나노 입자는 90%가 206nm 미만의 직경을 갖는 -2.47 +/- 0.33mV의 제타 전위를 가져, 동일한 IL2-모방체 펩타이드 코팅을 갖는 CYNOBM.002.03에 대비하여 개선된 형질감염 효율을 야기했다. 대략 -50 mV 및 +25 mV에서의 꼬리로 큰 전하 분포는, CYNOBM.002.83에 유사하고, -18mV의 안정한 음이온성 단일-피크 제타 전위와 다른 CRISPR + mRNA 공동-전달 입자 그룹 (CYNOBM.002.82 - CYNOBM.002.85)에 비교하여 세포 생존력에서 상응하는 증가를 갖는 CYNOBM.002.84에 대조적으로, 입자 안정성의 변동을 갖는 다분산 입자 모집단을 나타낸다. 전체적인 사이노몰구스 골수 공동-전달의 관점에서 다음-최상의 나노입자 그룹은 CYNOBM.002.86로, -20mV의 유사한 고도로 순-음으로 하전된 제타 전위 및 형질감염의 상응하는 높은 효율, CD34 클론 팽창, 및 BCL11a 적혈구 향상제 녹아웃으로부터 태아 헤모글로빈 생산을 실증했다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 혼합된 세포 모집단뿐만 아니라 8.1%의 전체의 골수 생존가능한 부분모집단 내에서 생존가능한 CD34+ 골수 세포에서 ~100% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다. 본 유세포측정 데이터는 사이노몰구스 골수 세포에서 선택적 CD34+ 증식의 유도를 나타내어, CD34- 적혈구 선조 세포 내에서 BCL11a 적혈구 선조 녹아웃 모집단의 성공적인 클론 팽창을 시사한다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 결과는 또한 내피 세포, 골아세포, 파골세포, 및/또는 골수의 다른 세포에서 성공적인 표적화에 연루된다.
도 76은 CYNOBM.002.84로부터의 데이터를 제공한다. 입자는 생존 전체의 골수 세포의 9.5%에서 태아 헤모글로빈 단백질 발현 및, 각각의 선택적 부분모집단에서 Cy5-mRNA+ 및 CRISPR-GFP-RNP+ 게이트에 의해 측정될 때, 중간 정도 형질감염 효율성에도 불구하고 CD34+, CD45 또는 CD3+ 부분모집단에서 무 양성 태아 헤모글로빈 측정에 의해 입증된 바와 같이 전체의 골수 적혈구 선조 세포에서 BCL11a 적혈구 향상제를 성공적으로 삭제하였다. CYNOBM.002.84 나노입자는 90%가 205nm 미만의 직경을 갖는 -18.07 +/- 0.71mV의 제타 전위를 가졌다. 높은 순-음전하는 안정한 입자 형성을 나타낸다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 25.5%의 전체의 골수 생존가능한 부분모집단뿐만 아니라 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 세포에서 76.5%, 71%, 및 ~100% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다. 추가로, 전체적인 생존가능 세포의 9.5%는 CD34+인 이들 세포의 어느 것도 없이, 태아 헤모글로빈에 대해 양성이어서, CD34- 적혈구 선조 세포 내에서 BCL11a 적혈구 선조 녹아웃 모집단의 성공적인 클론 팽창을 시사한다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 결과는 또한 내피 세포, 골아세포, 파골세포, 및/또는 골수의 다른 세포에서 성공적인 표적화에 연루된다.
도 77은 CYNOBM.002.85로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 186nm 미만의 직경을 갖는 -12.54 +/- 0.25mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 세포에서 ~33%, ~23%, 및 ~100% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 결과는 내피, 골아세포, 파골세포, 및 골수의 다른 세포에서 성공적인 표적화에 연루될 수 있다. 입자 크기 및 전하 분포는 후속적인 CYNOBM.002 그룹 및 사이노몰구스 골수 CRISPR 및/또는 mRNA 전달에서 그것의 기대된 생물학적 성능과 일치하였다.
도 78은 CYNOBM.002.86으로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 120nm 미만의 직경을 갖는 -20.02 +/- 0.10mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 ~68%, 70%, 및 ~97% 효율적인 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 각각의 표적화로, 생존가능한 사이노몰구스 골수에서 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA의 20.1% 효율적인 공동전달을 초래했다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 결과는 내피, 골아세포, 파골세포, 및 골수의 다른 세포에서 성공적인 표적화에 연루될 수 있다. 고도로 음으로 하전된 제타 전위 및 90%의 <200nm 입자 계수는 높은 효율을 예측한다.
도 79는 CYNOBM.002.76으로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 135nm 미만의 직경을 갖는 -12.02 +/- 0.59mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 세포에서 18.4%, 10.3%, 및 ~100% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP 흡수를 초래했다 (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 추가로, 입자는 유사한 제타 전위 분포와 ~500nm에서 큰 용적 피크의 첨가를 갖는 크기를 나타내는, CYNOBM.002.78에서 나타낸 바와 같이, 큰 응집체가 없는 25.8 - 80.6nm의 10차 - 50차 백분위수 입자 크기 고도로 음성 제타 전위를 갖는 히스톤-모방체 입자로부터 기대된 대로 제한된 독성을 나타낸다.
도 80은 CYNOBM.002.77로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 대부분이 171 - 254nm 범위로 90%가 254nm 이하인 그것의 직경을 갖는다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 추가로, 번호에 의한 10차 - 50차 백분위수 입자는 70 - 172nm로, 이 모집단 내에서 합리적인 크기 분포를 나타낸다. 입자 >200nm의 다수가 용액으로 존재하고 및/또는 큰, 분포된 제타 전위 및/또는 비-음이온성 제타 전위를 갖는다는 다른 연구와 일치하여, 이들 입자는 상당한 세포사로 이어진다. 이들 나노입자는 전반적으로 높은 흡수 백분율을 초래했지만, 다수의 세포 (>90%)가 사멸하였다. 궁극적으로, 입자는 유세포측정 데이터에 따라 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 세포에서 CRISPR-GFP-RNP의 검출의 한계에서 무시할만한 흡수와 전체의 골수 생존가능한 부분모집단 내에서 3.8% CRISPR 흡수를 초래했다. 그에 반해서, 동일한 표면 코팅을 갖는 CYNOBM.002.83 (CRISPR & mRNA 공동전달 변이체) 입자의 90%는 121nm인 수 평균으로 200nm 이하였다. 유사한 제형을 갖는 TCELL.001.01 - TCELL.001.15에서의 입자와 상이한 방법을 통해 생산된 CYNOBM.002.75 - CYNOBM.002.81에서의 다른 입자는 보다 양호한 크기 및 제타 전위 분포를 가졌고 생존가능한 인간 CD4+ 및 CD8a+ T-세포에서 높은 형질감염 효율성 (최대 99%)을 초래했다.
도 81은 CYNOBM.002.78로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 90%가 223nm 미만의 직경을 갖는 -11.72 +/- 0.79mV의 제타 전위를 가졌다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 유사하게, CYNOBM.002.84dnk 제타 전위는 상당히 보다 음성 (-18.07mV 대 -11.72mV)이지만 동일한 표면 코팅을 갖는 CYNOBM.002.84 (CRISPR & mRNA 공동전달 변이체) 입자의 90%가 125nm인 수 평균을 갖는 200nm 이하로, PLR10으로 초기 Cas9 RNP 전하 균질화에 대한 음이온성 탈피할 수 있는 층간 단계 매개와 리간드 또는 첨가의 선택적으로 분자량 엇갈린 폴리머 또는 폴리펩타이드로 후속적인 코팅으로 향상된 안정성을 나타낸다. 이들 단일전달 대 공동-전달 (또는 리간드 대 RNP의 층간 대 직접적인 콘주게이션) 나노입자 및 그것의 각각의 크기 범위의 차별적인 물리화학적 특성은 형질감염 효율 및 독성에 강하게 상관된다.
도 82는 CYNOBM.002.79로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 200nm 미만의 직경을 가졌다. 이들 나노입자는 골수에서 전반적으로 초저 (3.7%) GFP-RNP 흡수를 초래했지만, 세포는 배양에서 예외적인 생존력 (음성 대조군에 대해 70.0% 대 71.6%)을 유지했다. 초저 전체적인 흡수에도 불구하고, 입자는 CD34+ 부분모집단에서 세포수에 대한 검출의 한계에서, 유세포측정 데이터에 따라 ~9.0%의 생존가능한 CD3+ 세포, 4.4%의 생존가능한 CD45+ 세포, 및 ~100%의 생존가능한 CD34+ 세포에 대해 선택적 흡수를 실증했다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 결과는 혼합된 세포 모집단 내에서 CD34+ 조혈 줄기 세포의 특이적 표적화에 연루된다.
도 83은 CYNOBM.002.80으로부터의 데이터를 제공한다. 나노입자는 1.36 +/- 1.69mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 세포수에 대한 검출의 한계에서, 유세포측정 데이터에 따라 생존가능한 CD34+ 골수 세포에서 ~100% 효율적인 CRISPR-GFP-RNP 흡수와 8% 형질감염 효율을 초래했다. (예를 들어, 하기 유세포측정 및 영상 데이터 참고). 결과는 내피, 골아세포, 파골세포, 및 골수의 다른 세포에서 성공적인 표적화에 연루될 수 있다. 넓은 표면으로 ~0mV에서의 평탄한 피크는 쯔비터이온성 입자 표면을 나타낸다. 고도의 세포 생존력은 입자가 이 크기로 잘 용인되었고 c-키트-수용체-유래된 입자 표면이 세포-세포 상호작용 동안 골수 내에서 천연 줄기 세포 모집단 표면 마커의 표현을 모방하기 쉽다는 것을 나타낸다.
도 84 - 도 120 : 유세포측정 및 영상 데이터
도 84. 사이노몰구스 골수에서 CynoBM.002 샘플에 대한 형질감염되지 않은 대조군.
현미경 이미지 - 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합. 유세포측정 데이터 - 생존력으로, CD34, CD3, 및 CD45 스테인.
도 85. NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP의 리포펙타민 CRISPRMAX 전달은 생존가능 세포에서 2.5% 형질감염 효율을 획득하고 사이노몰구스 골수에서 음성 대조군에 비교하여 상당히 줄어든 부분모집단에 대비한 CD45 및 CD3의 백분율로 상당한 독성을 야기한다. 리포펙타민 CRISPRMAX는 CD45+ 및 CD34+ 세포의 무시할만한 나머지 모집단과 나머지 CD3+ 세포의 7.4% 효율적인 표적화에 의해 예시된 바와 같이 세포-선택성을 나타내지 않았다. 현미경 이미지 - 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합.
도 86. CynoBM.002 RNP-단독 대조군은 전달 벡터는 없지만, 형질감염 이전 사전-조합된 적재물 양자를 갖는 사이노몰구스 골수에서 무시할만한 형질감염 효율성을 획득하는 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP를 나타낸다. 전달 벡터 및 최소 사건이 없음에도 불구하고 고도의 공국재화는 mRNA를 갖는 리보핵 단백질 복합체의 회합을 나타내고 CRISPR RNP의 음이온성 작용화를 예시한다. (이 사례에서, mRNA는 RNP에 대해 느슨하게-연관된 탈피할 수 있는 도포로 작용하고 양이온성 물질로 추가로 층상화될 수 있었다). 공국재화 계수 계산. X: 생존 세포에서 % CRISPR 흡수:
Y: 생존 세포에서 % mRNA 흡수
C: CRISPR 및 mRNA를 갖는 세포의 %
Z: X 또는 Y 값으로, 큰 값
공국재화 계수 = C/Z
Cas9-mRNA 공국재화 계수: 92.2%
도 87. CynoBM.002.82는 비-특이적으로-표적화된 NLS-Cas9-EGFP가 98.9% 공국재화 계수로 사이노몰구스 골수로 11.3% 효율적인 mRNA 전달 및 11.4% 효율적인 CRISPR 전달을 달성한다는 것을 실증했다. 세포하 국재화는 정오-구체적으로 표적화된 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP가 Cy5 mRNA로 공-국제화하고 높은 형질감염 효율성을 획득한다는 것을 실증했다. 고도의 공국재화는 별개의 입자가 양 적재물로 장입되었다는 것을 결정한다. 추가로, Cas9는 mRNA와 별개의 구획에서 정연하게 국소화된 것으로 볼 수 있고, 여기서 mRNA는 핵-연관된 Cas9 주위에 관상 구조를 형성한다. 이것은 두 적재물의 세포질 (mRNA) 대 핵 (CRISPR) 국재화를 나타낸다. 현미경 이미지 - 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: Cy5 mRNA; 하단: 통합. 및 상단: Cas9-GFP RNP; 하단: Cas9-GFP RNP로 공국소화된 Cy5 mRNA.
물리화학적 파라미터 및 추가의 관찰에 대해서 상기 데이터를 참조한다.
CYNOBM.002.82는 90%가 132nm 미만의 직경을 갖고 입자 중 50%가 30nm 미만의 직경을 갖는 2.96 +/- 0.14mV의 제타 전위를 가졌다. 이들 나노입자는 단지 11.4% 전체적인 골수 생존가능한 부분모집단 표적화에도 불구하고 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 부분모집단에서 45.5%, 56.0%, 및 97.3%　효율적인 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다. Cas9-mRNA 공국재화 계수: 94.8%. 생존가능한 CD34+ 및 CRISPR+: 생존가능한 CD34+의 97.2%. 태아 헤모글로빈 양성: 생존가능 세포의 3.022%
도 88. CynoBM.002.83은 93.0% 공국재화 계수로 사이노몰구스 골수에 대해 8.1% 효율적인 mRNA 전달 및 8.1% 효율적인 CRISPR 전달을 달성한다. 세포하 국재화는 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP와 연관된 동가로-표적화된 IL2-유래된 펩타이드는 Cy5 mRNA로 공-국제화하고 높은 형질감염 효율성을 획득한다는 것을 실증했다. 고도의 공국재화는 별개의 입자가 양 적재물로 장입되었다는 것을 결정한다. 추가로, Cas9는 mRNA와 별개의 구획에서 정연하게 국소화된 것으로 볼 수 있고, 여기서 mRNA는 핵-연관된 Cas9 주위에 관상 구조를 형성한다. 이것은 두 적재물의 세포질 (mRNA) 대 핵 (CRISPR) 국재화를 나타낸다. 현미경 이미지 - 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: Cy5 mRNA; 하단: 통합. 및 상단: Cas9-GFP RNP; 하단: Cas9-GFP RNP로 공국소화된 Cy5 mRNA.
물리화학적 파라미터 및 추가의 관찰에 대해서 상기 데이터를 참조한다.
이들 나노입자는 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 세포에서 ~27%, 41%, 및 ~100%　효율적인 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다. Cas9-mRNA 공국재화 계수: 93.0%. 태아 헤모글로빈 양성: 생존가능 세포의 1.9%
도 89. CYNOBM.002.84 입자는 생존 전체의 골수 세포의 9.5%에서 태아 헤모글로빈 단백질 발현 및, 각각의 선택적 부분모집단에서 Cy5-mRNA+ 및 CRISPR-GFP-RNP+ 게이트에 의해 측정될 때, 중간 정도 형질감염 효율성에도 불구하고 CD34+, CD45 또는 CD3+ 부분모집단에서 무 양성 태아 헤모글로빈 측정에 의해 입증된 바와 같이 전체의 골수 적혈구 선조 세포에서 BCL11a 적혈구 향상제를 성공적으로 삭제하였다. 세포하 국재화는 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP와 연관된 동가로-표적화된 E-셀렉틴-유래된 펩타이드는 Cy5 mRNA로 공-국제화하고 높은 형질감염 효율성을 획득한다는 것을 실증했다. 고도의 공국재화는 별개의 입자가 양 적재물로 장입되었다는 것을 결정한다. 추가로, Cas9는 mRNA와 별개의 구획에서 정연하게 국소화된 것으로 볼 수 있고, 여기서 mRNA는 핵-연관된 Cas9 주위에 관상 구조를 형성한다. 이것은 두 적재물의 세포질 (mRNA) 대 핵 (CRISPR) 국재화를 나타낸다. 현미경 이미지 - 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: Cy5 mRNA; 하단: 통합. 및 상단: Cas9-GFP RNP; 하단: Cas9-GFP RNP로 공국소화된 Cy5 mRNA.
물리화학적 파라미터 및 추가의 관찰에 대해서 상기 데이터를 참조한다.
이들 나노입자는 유세포측정 데이터에 따라 ~25.5%의 전체의 골수 생존가능한 부분모집단뿐만 아니라 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 세포에서 76.5%, 71%, 및 ~100%　효율적인 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA 공국소화된 흡수를 초래했다. 추가로, 전체적인 생존가능 세포의 9.5%가 CD34+, CD3+, 또는 CD45+인 이들 세포의 어느 것도 없이 태아 헤모글로빈에 대해 양성이어서, CD34- 적혈구 선조 세포 내에서 BCL11a 적혈구 선조 녹아웃 모집단의 성공적인 클론 팽창을 시사한다. Cas9-mRNA 공국재화 계수: 97.1%. 태아 헤모글로빈 (HbF) 양성: 생존가능 세포의 9.5%
14% CD34+ 세포; CD34+ 및 HbF+의 0% 공국재화
도 90. CynoBM.002.85는 87.2% 공국재화 계수로 사이노몰구스 골수에 5.2% 효율적인 mRNA 전달 및 5.3% 효율적인 CRISPR 전달을 달성했다. 생존가능 세포에 5.3% 효율적인 CRISPR 전달에도 불구하고, CynoBM.002.85는 다른 공동전달 구현예에서 나타낸 바와 같이 태아 헤모글로빈 양성 세포에서 수반되는 증가로 이어지지 않았다. 세포하 국재화는 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP와 연관된 동가로-표적화된 SCF-유래된 펩타이드는 Cy5 mRNA로 공-국제화하고 높은 형질감염 효율성을 획득한다는 것을 실증했다. 고도의 공국재화는 별개의 입자가 양 적재물로 장입되었다는 것을 결정한다. 추가로, Cas9는 mRNA와 별개의 구획에서 정연하게 국소화된 것으로 볼 수 있었고, 여기서 mRNA는 핵-연관된 Cas9 주위에 관상 구조를 형성한다. 이것은 두 적재물의 세포질 (mRNA) 대 핵 (CRISPR) 국재화를 나타낸다. 현미경 이미지 - 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: Cy5 mRNA; 하단: 통합. 및 상단: Cas9-GFP RNP; 하단: Cas9-GFP RNP로 공국소화된 Cy5 mRNA.
추가의 물리화학적 특성에 대해서 상기 데이터를 참조한다. 이들 나노입자는 각각 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 세포에서 ~33%, ~23%, 및 ~100%　효율적인 CRISPR-GFP-RNP + Cy5_EGFP_mRNA 흡수를 초래했다. Cas9-mRNA 공국재화 계수: 87.2%. 태아 헤모글로빈 양성: 생존가능 세포의 0.9%
도 91. CynoBM.002.86은 98.6% 공국재화 계수로 사이노몰구스 골수에 20.1% 효율적인 mRNA 전달 및 21.8% 효율적인 CRISPR 전달을 달성했다. 세포하 국재화는 헤테로3가로-표적화된 IL2-, E-셀렉틴- 및 SCF-유래된 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP는 Cy5 mRNA로 공-국소화하고 높은 형질감염 효율성을 획득한다는 것을 실증했다. 고도의 공국재화는 별개의 입자가 양 적재물로 장입되었다는 것을 결정한다. 추가로, Cas9는 mRNA와 별개의 구획에서 정연하게 국소화된 것으로 볼 수 있었고, 여기서 mRNA는 핵-연관된 Cas9 주위에 관상 구조를 형성한다. 이것은 두 적재물의 세포질 (mRNA) 대 핵 (CRISPR) 국재화를 나타낸다. 현미경 이미지 - 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: Cy5 mRNA; 하단: 통합. 및 상단: Cas9-GFP RNP; 하단: Cas9-GFP RNP로 공국소화된 Cy5 mRNA;.
추가의 물리화학적 특성에 대해서 상기 데이터를 참조한다. Cas9-mRNA 공국재화 계수: 91.3%. 태아 헤모글로빈 양성: 생존가능 세포의 7.6%
도 92. CynoBM.002.75는 탈피할 수 있는 음이온성 폴리펩타이드 도포를 갖는 비-특이적으로-표적화된 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP가 생존가능한 사이노몰구스 골수에서 18.0% 형질감염 효율을 획득한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 생존가능한 CD3+ T-세포의 20%가 본 명세서에서 혼합된 모집단 사이노몰구스 골수 배양 모델에서 CRISPR+로, TCELL.001에서 CRISPR+인 인간 일차 팬 T-세포에서 생존가능한 CD4 및 CD8a T-세포의 97-99%인 것에 대조적이다. 동일한 제형의 입자 크기는 수작업과 대조적으로 유체-취급 로보트를 통해 합성된 TCELL1에서 더 작고 보다 균일하였다. 추가의 정성적 및 정량적 주석 및 데이터 비교에 대해서 상기 데이터를 참조한다. 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합.
도 93. CynoBM.002.76은 이중-히스톤-단편-연관된 및 비-특이적으로-표적화된 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP는 사이노몰구스 골수에서 13.1% 형질감염 효율과 음성 대조군에 대비해 제한된 독성을 획득한다는 것을 실증했다. CD3+, CD45+ 및 CD34+ 생존가능한 부분모집단의 18%, 10%, 및 0%는 CRISPR+였다. 추가의 물리화학적 특성 및 관찰에 대해서 상기 데이터를 참조한다. 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합.
도 94. CynoBM.002.77은 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP와 연관된 동가로-표적화된 IL2-유래된 펩타이드가 사이노몰구스 골수에서 3.8% 형질감염 효율과 음성 대조군에 대비해 향상된 생존력을 획득한다는 것을 실증했다. 형질감염된 세포의 ~90%가 사멸되었다. 궁극적으로, 입자는 생존가능한 CD3+, CD45+, 및 CD34+ 골수 세포에서 CRISPR-GFP-RNP의 검출의 한계에서 무시할만한 흡수를 초래하여, 생존 CRISPR+ 세포의 나머지 3.8%는 이들 부분모집단으로부터의 것이 아니다는 것을 나타낸다. 크기 데이터는 큰 입자 다분산도 및 ~999nm 90차 용적 백분위수 입자 크기에서 독성에 대한 원인이 되는 역할을 지지한다. 추가의 물리화학적 특성에 대해서 상기 데이터를 참조한다. 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합.
도 95. CynoBM.002.78은 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP와 연관된 동가로-표적화된 E-셀렉틴-유래된 펩타이드가 사이노몰구스 골수에서 형질감염된 나머지 생존세포의 4.5%만으로 (죽은 세포를 포함하여) 전체적인 ~71% 형질감염 효율을 획득한다는 것을 실증했다. 이것은 입자 독성을 나타내고, 33.1 - 113.1nm인 수에 의한 입자의 50%에도 불구하고, 큰 크기 분포에 상관될 수 있다. 용액에서 다수의 입자 질량 및 용적을 포함하여 >250nm 입자가 이 실험의 감소된 생존력을 초래하기 쉽다. CD45+ 및 CD3+ 부분모집단 밀도는 이 구현예에서 마찬가지로 배로 감소된다. 동일한 형질감염으로부터의 나노입자 그룹과 비교하여 보다 상세한 물리화학적 특성 및 정성적 관찰에 대해서 상기 데이터를 참조한다. 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합.
도 96. CynoBM.002.79은 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP와 연관된 동가로-표적화된 SCF-유래된 펩타이드가 사이노몰구스 골수에서 3.7% 형질감염 효율성과 음성 대조군에 보다도 탁월한 생존력을 획득한다는 것을 실증했다. 이들 나노입자는 골수에서 전반적으로 초저 (3.7%) GFP-RNP 흡수를 초래했으나, 세포는 배양에서 예외적인 생존력 (음성 대조군에 대해 69.0% 대 71.6%)을 유지했다. 초저 전체적인 흡수에도 불구하고, 입자는 ~5%의 생존가능한 CD3+ 세포, ~4%의 생존가능한 CD45+ 세포, 및 ~100%의 생존가능한 CD34+ 세포에 대한 선택적 흡수를 실증했다 (후자는 수에서 검출의 한계에 있었다). 다른 그룹보다 강하게 음성 제타 전위와 상당히 많은 CD45+ 세포로 커플링된 고도의 세포 생존력은 줄기 세포 틈새 표적화 및 증식 및/또는 생존 기술을 확립하는데 SCF-모방체 입자 표면의 다인 역할을 함축한다. 추가의 물리화학적 파라미터에 대해서 상기 데이터를 참조한다. 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합..
도 97. CynoBM.002.80은 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP와 연관된 동가로-표적화된 c-키트-(CD117)-유래된 펩타이드가 8.097% 형질감염 효율성을 획득한다는 것을 실증했다. 형질감염 효율성은 3.3%, 2.4%이었고, 각각 CD3+, CD45+ 및 CD34+ 생존가능한 부분모집단에 대한 검출의 한계에서, CD3+ 및 CD45+ 세포에 대한 낮은 선택성을 나타낸다. 그 초과 정량적 및 정성적 데이터에 대해서 상기 데이터를 참조한다. 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합. (cont.): 유세포측정 데이터.
도 98. CynoBM.002.81은 헤테로3가로-표적화된 IL2-, E-셀렉틴- 및 SCF-유래된 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP가 단지 0.48%의 CD34+인 세포에도 불구하고 생존 CD34+ 세포인 형질감염된 세포의 ~10%로 사이노몰구스 골수에서 5% 형질감염 효율을 획득한다는 것을 실증했다. 이것은 CD34+ 세포 중 거의 100% 효율적인 선택적 형질감염을 나타낸다. 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합..
도 99. CynoBM.002 RNP-단독 대조군의 정성적 이미지는 전달 벡터 없이 사이노몰구스 골수에서 경미한 양성 신호를 획득하는 NLS-Cas9-EGFP BCL11a gRNA RNP를 나타낸다. 상당: 디지털 상 콘트라스트; 중간: GFP; 하단: 통합.
도 100. HSC.004 (나노입자 69-74, 표 5 참고) 고-함량스크리닝. 원발성 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포에서 HSC.004 Cy5 mRNA 전달 12-15h 후-형질감염의 형광 현미경검사 이미지 (Cy5 mRNA). mRNA 제형의 특정 구현예로, SCF 펩타이드 및 E-셀렉틴으로 헤테로2가 표적화뿐만 아니라, SCF 펩타이드가 아닌 E-셀렉틴으로 동가 표적화는 리포펙타민 메신저 MAX보다 더 높은 형질감염 효율성을 달성한다. HSC.001.69: A1 - A6; HSC.001.70: B1 - B6; HSC.001.71: C1 - C6; HSC.001.72: D1 - D6; HSC.001.73: E1 - E6; HSC.001.74: F1 - F6; HSC.004 리포펙타민 메신저 MAX 용량 1: G1 - G2 & G4 - G5; TC.001 리포펙타민 메신저 MAX 용량 2: H1 - H2 & H4 - H5; TC.001 음성: G3, G6, H3, H6
도 101. TCELL.001 (나노입자 1-15, 표 5 참고) 고-함량스크리닝. 로보트제형은 4개 적재물 (CRISPR RNP, mRNA, siRNA 및 pDNA)에 걸쳐 15개 리간드를 나타내는 TC.001.1 - TC.001.60에 대해 수행되었다. T-세포 CRISPR 전달 및 정성적 형질감염 효율성의 구현예 - 원발성 인간 팬 T-세포로 TCELL.001 CRISPR-EGFP RNP 전달의 12-15h 후-형질감염 복합체 현미경 검사의 아주 작은 이미지가 도시되어 있다.
플레이트 레이아웃: TC.001.1: A1 - C1; TC.001.3: D1 - F1; TC.001.4: A2 - C2; TC.001.5: D2 - F2; TC.001.6: A3 - C3; TC.001.7: D3 - F3; TC.001.8: A4 - C4; TC.001.9: D4 - F4; TC.001.10: A5 - C5; TC.001.11: D5 - F5; TC.001.12: A6 - C6; TC.001.13: D6 - F6; TC.001.14: A7 - A9; TC.001.15: B7 - B9 ; TC.001.2: A10 - A12; TC.001 리포펙타민 CRISPRMAX 용량 1: B10 - B12; TC.001 리포펙타민 CRISPRMAX 용량 2: C7 - C9; TC.001 RNP 단독: C10 - C12; TC.001 음성: D7 - E12.
도 102. TCELL.001 리포펙타민 CRISPRMAX. 리포펙타민 CRISPRMAX는 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 각각 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단에서 NLS-Cas9-EGFP RNP의 4.7% 및 4.8% 효율적인 전달을 획득했다. 전반적으로, 12.5%의 CRISPR+ 세포 및 65.9%의 전체적인 세포가 생존가능하다.
도 103: TCell.001.1은 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 99.163% 효율적인 및 98.447% 효율적인 비-특이적으로-표적화된 CRISPR-GFP 리보핵 단백질 흡수를 실증했다. 전반적으로, 60.2%의 CRISPR+ 세포 및 57.2%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 104. 비-특이적으로-표적화된 　페길화된 대조군인, TCell.001.2는 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 5.5% 효율적인 및 6.9% 효율적인 CRISPR-GFP 리보핵 단백질 흡수를 실증했다. 전반적으로, 5.6%의 CRISPR+ 세포 및 40.5%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 105. TCell.001.3은 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 시알로아드헤신-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 11.6% 효율적인 및 13.2% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 40.0%의 CRISPR+ 세포 및 79.2%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 106. TCell.001.4는 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 CD80-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 6.8% 및 8.8% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 12.9의 CRISPR+ 세포 및 60.2%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 107. TCell.001.5는 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 CD80-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 10.3% 및 10.9% 효율적인 CRISPR-GFP 리보핵 단백질 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 48.3의 CRISPR+ 세포 및 85.1%의 전체적인 세포가 생존가능했다. 음성 대조군의 9개 웰들 (TCELL.001 유세포측정에 대해 n=3 음성)에 걸쳐, 생존가능성은 81.4%, 84.7%, 및 82.5%로, C-말단으로 고정된 CD80-유래된 CD28-표적화 펩타이드가 배양액에서 비-형질감염된 세포에 대해 경미한 생존-증진 효과를 가질 수 있다는 것을 실증했다는 것을 주지한다. 그에 반해서, 동일한 N-말단으로 고정된 펩타이드인 TCell.001.4는, 또한 CD28 막 관통 수용체에 대해 상이한 다른 자리입체성을 갖는 CD80-유래된 단편인 TC.001.6 및 TC.001.7과 같이 현저한 독성을 나타냈다.
도 108. TCell.001.6은 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 CD86-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 1.7% 및 2.9% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 6.8%의 CRISPR+ 세포 및 69.1의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 109. TCell.001.7은 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 CD86-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 1.6% 및 2.1% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 10.3%의 CRISPR+ 세포 및 76.4%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 110. TCell.001.8은 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 CD86-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 14.5% 및 16.0% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 39.1%의 CRISPR+ 세포 및 76.3%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 111. TCell.001.9는 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 4-1BB-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 3.6% 및 3.2% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 27.5%의 CRISPR+ 세포 및 87.8%의 전체적인 세포가 생존가능했다. 음성 대조군의 9개 웰들 (TCELL.001 유세포측정에 대해 n=3 음성)에 걸쳐, 생존가능성은 81.4%, 84.7%, 및 82.5%로, T-세포로 선천적인 생존 신호전달을 갖는, C-말단으로 고정된 4-1BB-유래된 CD137-표적화 펩타이드가 배양액에서 비-형질감염된 세포에 대해 경미한 생존-증진 효과를 갖는다는 것을 실증했다는 것을 주지한다.
도 112. TCell.001.10은 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 4-1BB-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 5.8% 및 5.4% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 30.8%의 CRISPR+ 세포 및 84.2%의 전체적인 세포가 생존가능했다. 음성 대조군의 9개 웰들 (TCELL.001 유세포측정에 대해 n=3 음성)에 걸쳐, 생존가능성은 81.4%, 84.7%, 및 82.5%로, T-세포로 선천적인 생존 신호전달을 갖는, C-말단으로 고정된 4-1BB-유래된 CD137-표적화 펩타이드가 배양액에서 전체적인 무 독성을 입증한다는 것을 실증했다는 것을 주지한다.
도 113. TCell.001.11은 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 CD3-Ab-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 12.9% 및 12.4% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 50.0%의 CRISPR+ 세포 및 77.6%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 114. TCell.001.12는 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 CD3-Ab-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 9.0% 및 9.5% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 38.9%의 CRISPR+ 세포 및 80.7%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 115. TCell.001.13은 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 IL2-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 25.7% 및 28.6% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 40.3%의 CRISPR+ 세포 및 68.1%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 116. TCell.001.14는 CRISPR-GFP 리보핵 단백질과 연관된 동가로-표적화된 IL2-유래된 펩타이드가 24h 후-형질감염에서 인간 일차 팬 T-세포의 생존가능한 CD4+ 및 CD8a+ 부분모집단 각각에서 24.9% 및 25.8% 효율적인 흡수를 생성한다는 것을 실증했다. 전반적으로, 45.9%의 CRISPR+ 세포 및 70.1%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 117. 112가로-표적화된 12-리간드 변이체인, TCell.001.15는 세포내이입 흡수 또는 CRISPR 전달로 이어지지 않았다. 전반적으로, 59.8%의 전체적인 세포가 생존가능했다.
도 118. TCELL.001 음성 대조군. 음성 (비-형질감염된) 대조군의 9개 웰들 중 하나로부터의 대표적인 결과. 전반적으로, 81.4%, 84.7%, 및 82.5%의 총 세포가 세포씨딩 52h 후 (24h 후-형질감염) 생존가능하였다.
도 119. BLOOD.002는 당화된 세포 표면 마커 표적화를 위해 SIGLEC 유도체를 이용하는 것을 통해 전체의 인간 혈액의 림프구 게이트에서 60% - 97% mRNA 전달 효율을 얻는다; Attune NxT 유세포측정기를 통해 분석된 Cy5-태깅된 EGFP mRNA가 도시되어 있다. 리간드 표적화는 페길화된 대조군에 대비하여 세포 신호의 상당한 향상제이다. 나노입자 행동의 추가의 물리화학적 특성 예측에 대해 상기 데이터를 참고한다. BLOOD.002 대조군: 형질감염되지 않음. BLOOD.002.88: CD45- 및 Neu5Ac-표적화 SIGLEC 유도체 (음이온성 폴리머 후에 첨가된 양이온성 앵커-링커-리간드 펩타이드). BLOOD.002.89: CD45- 및 Neu5Ac-표적화 SIGLEC 유도체 (음이온성 폴리머 후에 첨가된 양이온성 앵커-링커-리간드 펩타이드). BLOOD.002.90: 페길화된 대조군 (음이온성 폴리머 후에 첨가된 양이온성 앵커-PEG). BLOOD.002.91: 비-특이적으로-표적화된 변이체. BLOOD.002.92: 적재물 없는 CD45- 및 Neu5Ac-표적화 SIGLEC 유도체 (앵커-링커-리간드는 음성 형광 대조군인, 음이온성 폴리머에 직접적으로 접합된다).
도 120. TCell.001.27은 동가로-표적화된 SIGLEC-유래된 펩타이드가 유세포 측정에 의해 측정될 때 5h 후-형질감염에서 인간 일차 팬T-세포의 생존가능한 CD8a+ 및 CD4+ 부분모집단에서 45% 효율적인 Cy5 mRNA 흡수를 지시한다는 것을 실증했다. 이들 입자의 크기 및 제타 전위는 -25.5 +/- 0.15 mV의 제타 전위로 171nm의 평균 입자 크기를 실증하여, 1.35 카복실레이트-대-포스페이트 (C:P) 및 0.85 아민-대-포스페이트 비에서 강한 입자 안정성을 나타내고 여기서 폴리(글루탐산)은 양이온성 앵커-링커-리간드의 봉입에 이어서 첨가된다. 제타 전위 및 크기 데이터, TCell.001.2 및 TCell.001.18에 대해서는 상기 데이터를 참고한다. 추가의 정량적 세부사항에 대해서는 상기 데이터를 참고한다. 상단-우측: 명시야; 중간-우측: Cy5 mRNA; 하단-우측: 병합 상단: 음성 대조군의 명시야; 하단: 음성 대조군의 Cy5 채널.
실시예 9
도 121. 리보핵단백질 및 단백질 전달에 대한 근거. CRISPR RNP의 전하 밀도 플롯은 음이온성 또는 양이온성 펩타이드/물질이 단백질 표면 상의 안정한 하전된 층을 형성하기 위해 첨가되어야하는지 여부를 결정하게 할 수 있다. 일 구현예에서, 노출된 핵산 (음이온성) 및 음이온성 전하 포켓은 하전된 음이온의 첨가 이전에 하전된 양이온의 강한 정전 고착 부위로, 또는 그들 자신의 리간드-링커 음이온성 앵커로 작용한다. 기준자: 전하.
도 122. 리보핵단백질 및 단백질 전달에 대한 근거. 슬리핑 뷰티 트랜스포존의 전하 밀도 플롯은 음이온성 또는 양이온성 펩타이드/물질이 단백질 표면 상의 안정한 하전된 층을 형성하기 위해 첨가되어야하는지 여부를 결정하게 할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 양이온성 전하 포켓은 하전된 음이온의 강한 정전 고착 부위로, 또는 하전된 양이온의 첨가 이전에, 그들 자신의 리간드-링커 음이온성 앵커 도메인으로서 작용한다. 기준자: 전하.
도 123. (1) 다음 (2) 이전에 CRISPR RNP 표면 상에 양이온성 부위 상에 고착하는 예시적인 음이온성 펩타이드 (9-10 아미노산 길이, 대략 10nm 직경 CRISPR RNP로 되는 규모) (2) (2b) 후속적인 다층화 화학반응, 다중 핵산 또는 하전된 치료제의 공동-전달, 또는 가교결합을 통한 층 안정화의 부가로 또는 없이 (2a) 앵커-링커-리간드 또는 독립형 양이온성 앵커로서 양이온성 앵커의 첨가.
텍스트로 전환된 좌측에서 우측으로 도면에서의 육필: '양이온성 앵커'. '스페이서'. '리간드'. '및/또는'. '2d'. '양이온성 폴리머 및/또는 폴리펩타이드'. '2b. 이어서 층간 화학반응'.
도 124. 하전된 단백질 코어 템플레이트로 적재물 공동-전달에 대한 근거. Cas9 RNP 또는 임의의 균질하게 또는 쯔비터이온성으로 하전된 표면을 포함할 수 있는, 코어 템플레이트에 기반한 정전 매트릭스 조성물 및 첨가의 순서의 예. 다양한 폴리머를 이용한 쯔비터이온성 표면의 전하를 균질화하는 방법이 도시되어 있다. gRNA에 결합된 CRISPR-Cas9 RNP로 구성된 ~10nm 코아 입자가 쯔비터이온성 도메인으로 도시되어 있다. 간단히, 양이온성 폴리머 또는 음이온성 폴리머는 반대로 하전된 중합체의 첨가 이전에 표면 전하를 균질화하기 위해 첨가될 수 있다. 음이온성 구성성분의 요동 분자량은 CYNOBM.002.75 - CYNOBM.002.81에서 단일 적재물 전달 변이체에 대비하여 CYNOBM.002.82 - CYNOBM.002-86에서 다양한 표면 코팅물을 갖는 mRNA-PLE 층간과 RNP 코어를 갖는 입자의 형질감염 효율 및 유전자 편집 효율을 증가시키는 것으로 실증되었다. 하전된 코어 템플레이트 구현예는 하전된 덴드리머 또는 올리고당-덴드리머, 재조합 또는 합성 히스톤 이량체/삼량체/사량체/팔량체, 나노다이아몬드, 골드 나노입자, 양자점, MRI 조영제, 또는 상기와 함께 이들의 조합을 포함한 임의의 하전된 표면을 포괄한다.
텍스트로 전환된 좌측에서 우측으로 도면에서의 육필: '음으로 하전된 코팅은 양이온성 폴리머 또는 앵커-링커-리간드에 의해 층상화될 수 있고, 여기서 상기 앵커는 양이온성이다.' '아미노 당'. '하전된 글리코사미노글리칸'. 'pDNA'. '공전달'. '노출된 gRNA'. '순 음성 탈피할 수 있는 폴리머 도포'. '글리칸'. 'cas9 상의 양이온성 단백질 도메인'. '-10nm cas9 RNP'. 'cas9 상의 양이온성 단백질 도메인'. 'PLR'. 'PDE (5-100)'. 'PLE(5-100)'. 'cas9 상의 음이온성 단백질 도메인'. 'mRNA'. '글리코펩타이드 상의 분지형 양이온성 폴리머'. '히스톤'. 'siRNA'. '음으로 하전된 코팅은 또한 음이온성 앵커-링커-리간드 또는 독립형 음이온성 매트릭스 조성물의 도메인일 수 있다. 일관된 폴리머의 엇갈린 mw는 콜로이드성 안정성 및 유전자 편집 효율을 증가시킨다.
실시예 10
도 125. 펩타이드 엔지니어링 - IL2R 표적화를 위한 신규한 IL2-모방체 단편. 인터류킨-2 수용체(우측)에 결합된 인터류킨-2 (좌측) (PDB: 1Z92)
서열 ASN(33)-PRO(34)-LYS(35)-LEU(36)-THR(37)-ARG(38)-MET(39)-LEU(40)-THR(41)-PHE(42)-LYS(43)-PHE(44)-TYR(45) (서열번호: 303)은 IL2 (PDB 1Z92)로부터 선택되고, IL2 수용체 알파 사슬에 결합하는 활성의 영역에 상관된다. IL2와 상호작용하는 IL2R의 모티프를 선택하는 것을 통한 상보적 결합을 조작하는 것: 여기서, 서열 CYS(3)-ASP(4)-ASP(5)-ASP(6)-MET(25)-LEU(26)-ASN(27)-CYS(28)-GLU(29) (서열번호: 308)은 IL2 수용체로부터 두 결합 모티프에 대해 선택된다.
도 126: 펩타이드 엔지니어링 - CD3으로 신규한 항체-유래된 "활성 결합 포켓" 엔지니어링 개념 증명. 서열 THR(30)-GLY(31)-ASN(52)-PRO(53)-TYR(54)-LYS(55)-GLY(56)-VAL(57)-SER(58)-THR(59)-TYR(101)-TYR(102)-GLY(103)-ASP(104) (서열번호: 309)은 CD3 항체 (PDB 1XIW)로부터 선택되고, CD3 엡실론 및 델타 사슬에 결합하는 활성의 영역에 상관된다. 아미노산의 순서는 더 큰 단백질에 의해 유지되는 삼차 구조를 더 이상 갖지 않는 결합 포켓에서 펩타이드의 2-차원 평면의 결합 동력학을 반영하기 위해 재배열된다. 이 차원의 감소는 하기를 초래한다: THR(59)-SER(58)-VAL(57)-GLY(56)-LYS(55)-TYR(54)-PRO(53)-ASN(52)-THR(30)-GLY(31)-TYR(101)-TYR(102)-GLY(103)-ASP(104) (서열번호: 304).
도 127: 펩타이드 엔지니어링 - CD45 당화 표적화를 위한 신규한 SIGLEC 유도체. N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac)으로 복합체에서 시알로아드헤신 N-말단의 PDB 표현 (RCS PDB 1ODA). 본 표현에서 시알로아드헤신에 근위인 시알로아드헤신 단편이 당화된 CD45 및 다른 복합체 세포-표면 당 단백질을 표적화하기 위해 이용되었다. 이것은 TCELL.001.3에서 CRISPR RNP뿐만 아니라 BLOOD.002.1 - BLOOD.002.2에서 전혈 림프구 게이트에서 mRNA로 T-세포의 성공적인 표적화를 생성한다. 리간드에 대한 서열은 SNRWLDVK (서열번호: 305)이다.
도 128: 펩타이드 엔지니어링 - c-키트 표적화를 위한 신규한 SCF 단편. 줄기 세포 인자의 대시기호로된 원 - 신호 펩타이드 도메인 (RCS PDB 1SCF)은 c-키트 활성에 필요한 이량체성 도메인을 나타낸다. 특정 나노입자 표면 크기 + SCF 코팅 밀도에 기인한 세포 흡수에 대한 리간드 제시의 효과는 CynoBM.002.79 (~5% 효율) 및 CynoBM.002.85 (~56% 효율) 사이에서 비교되고 대조될 수 있다. 추가로, 대비는 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포 형질감염의 정성적 형상화로 표시되고, 여기서 E-셀렉틴 + SCF 단편 (HSC.004.73)은 높은 효율성을 달성하지만, SCF 단편이 독자적으로 그렇지는 않다 (HSC.004.74). 행동에서의 현저한 차이는 세포내이입 신호 및 핵산 및/또는 리보핵단백질 물질의 후속적인 핵 표적화를 발생하는데 있어서 이량체성 펩타이드의 특정 역할을 시사한다. 리간드에 대한 서열은 EKFILKVRPAFKAV (서열번호: 302) (mSCF/rmSCF)이다.
도 129: 펩타이드 엔지니어링 - 막-결합 SCF 표적화에 대한 신규한 cKit 수용체 단편. 내피 및 골수 세포 상에서 조혈 줄기 세포 롤링 행동의 행동을 흉내 내고 전신 형질감염 효율을 증가시키는 c-키트로부터 유래된 줄기 세포 인자 표적화 펩타이드의 합리적인 디자인 (CynoBM.002.80 참고). 폴딩에 대해 평가된 서열: 명칭 SCFN, 서열: RRRRRRRRRGGGGSGGGGSEGICRNRVTNNVKDVTKLVANLPK (서열번호: 310). 서열은 Rosetta 및 NAMD 모의실험 패키지로 평가되었다 - Rosetta 결과: 단축된 서열은 순이론적 폴딩을 위해 Rosetta에 배치되었다 (GGSEGICRNRVTNNVKDVTKLVANLPK) (서열번호: 310의 잔기 17-43).
도 130: 펩타이드 엔지니어링 - cKit 수용체 단편 (계속됨). 나노입자 표면 상에 제시되는 바와 같이 엔트로피로 양호한 형태를 모방하도록 하기 위해 원위치에 유지된 앵커-링커-리간드의 앵커 분절로의 분자 동력학 모의실험. 각각의 결과는 임의의 이들 구조가 바람직할 수 있는지를 결정하는 것이 어렵다는 것을 의미하는 동일한 평점 인자를 함유한다. 또한 Rosetta는 폴딩 동력학으로 되지 않고 따라서 이들 서열은 나선-유사 구조로 접히지 않을 것이 매우 가능하다.
NAMD 결과: Rosetta가 폴딩 동력학으로 되지 않기 때문에, 전체 서열이 이차 구조로 빠르게 접힐 수 있는지가 검사되었다. 모의실험은 각각의 복제물에 대해 10ns로 모의실험되고 300-500 K 사이의 16 또는 32 복제물에 대해 복제물 교환 분자 동력학 (REMD)을 사용하여 NAMD에서 수행되었다. 앵커 부문 (poly-R)은 입자에 결합된 단백질을 시뮬레이션하기 위해 선형으로 고정되었다. 가장 낮은 에너지 스냅샷이 도시되어 있다.
키트로부터 유래된 서열의 추가의 분석은 그것이 많은 고유한 순서를 가지지 않을 것이라는 것을 나타냈다. 오렌지 만화 부분은 KIT로부터 초기에 선택된 서열에 속한다.
도 131: 펩타이드 엔지니어링 - cKit 수용체 단편 (계속됨). 아미노 이소부티르산으로 핵심 소수성 도메인의 변형을 통한 효과적인 리간드 제시를 위해 안정한 나선 펩타이드로 자기-접힘한 강한 리간드-링커로 랜덤 코일화된 펩타이드의 안정화.
청색 사슬은 71 내지 94 잔기의 범위인, KIT에 존재하는 보다 정렬된 헬릭스를 표시한다 :SNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENS (서열번호: 300). 앵커 및 링커를 갖는 키트 잔기 71 내지 94의 NAMD 모의실험 : RRRRRRRRRGGGGSGGGGSSNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENS (서열번호: 311).
가닥이 링커 잔기와 크게 상호 작용하는 구조로 수렴된다. 잔기 71 내지 94에 대해, KIT에서 2개의 다른 나선과 상호 작용함으로써 나선을 안정화시키는 소수성 잔기가 존재한다. 소수성 잔기는 빨간색 (밑줄)로 도시되어 있다: SNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENS (서열번호: 300). 서열은 변화되어 소수성 잔기를 제거하고 나선 접힘을 유도하는데 도움이 되는 아미노 이소부티르산 (Aib)으로 대체되어, 하기 서열에 도달한다: KIT7194_AIB1: SNYS AibADK AibANAibA DD AibAEAibAKENS (서열번호: 299). Aib를 함유하는 서열은 Rink 수지 상에서 합성되고 유리 아민 및 아실화된 아민 (Ac)에서 단리된다. 이차 구조는 원형 2색성에 의해 검사되었다.
도 132: 펩타이드 엔지니어링 - cKit 수용체 단편 (계속됨)
SCF_mcKit_(4GS)2_9R_N 및 SCF_mcKit(Ac)_(4GS)2_9R_N의 원형 2색성. 하전된 폴리펩타이드 말단의 전하를 중화시키기 위해 리간드 단부의 아세틸화가 이용될 수 있다. 상단: KIT7194_AIB1의 CD는 알파-나선 및 Aib 단위를 함유하는 나선의 이차 구조와 일치하는, 약간 깊은 대략 222 및 크게 깊은 대략 208을 도시한다. 하단: KIT7194_AIB1_Ac는 KIT7194_AIB1의 것에 유사한 CD를 도시한다. 때로 아실화는 폴딩에 도움이 될 수 있지만 이것이 필요한 것으로 여겨지지는 않는다. 아세틸화 또한 말단 아민이 하전되기 보다는 중성일 필요가 있는 리간드 상호작용에 도움이 될 수 있다. 전체 앵커-링커-KIT7194_AIB1 작제물: RRRRRRRRR - GGGGSGGGGS - SNYS AibADK AibANAibA DD AibAEAibAKENS (서열번호: 312).
SEQUENCE LISTING <110> Ligandal, Inc. Foster, Christian Watson, Andre Ronald <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID AND/OR PROTEIN PAYLOAD DELIVERY <130> 134554.8004.WO00 (LGDL-004) <140> PCT/US17/66545 <141> 2017-12-14 <150> US 62/443,522 <151> 2017-01-06 <150> US 62/434,344 <151> 2016-12-14 <150> US 62/443,567 <151> 2017-01-06 <150> US 62/517,346 <151> 2017-06-09 <160> 316 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Exendin-4 <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Exendin (S11C <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Cys Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> FGF fragment <400> 3 Lys Arg Leu 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Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 <210> 58 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> E-selectin ligand [1-21] - Cys left <400> 58 Cys Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Lys Glu Ser Gly Ala 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> E-selectin ligand [1-21] - Cys right <400> 59 Met Ile Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Ser Gly Ala Cys 20 <210> 60 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> FGF fragment [26-47] <400> 60 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 20 25 30 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 35 40 <210> 61 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> FGF fragment [26-47] <400> 61 Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp 1 5 10 15 Gly Val Arg Glu Lys Ser Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H2A [1-20] <400> 62 Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr 1 5 10 15 Arg Ser Ser Arg 20 <210> 63 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H2A [1-39] <400> 63 Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr 1 5 10 15 Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg 20 25 30 Leu Leu Arg Lys Gly Gly Gly 35 <210> 64 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H2A [1-130] <400> 64 Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys 1 5 10 15 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 20 25 30 Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu 50 55 60 Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile 65 70 75 80 Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys 85 90 95 Leu Leu Gly 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Ile Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 35 40 45 Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn 50 55 60 Ser Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg 65 70 75 80 Leu Ala His Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln 85 90 95 Thr Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val 100 105 110 Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys 115 120 125 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3 [1-8] <400> 72 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K4(Me1) [1-10] <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> K(Me1) <400> 73 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser 1 5 10 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K4(Me2) [1-10] <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> K(Me2) <400> 74 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K4(Me3) [1-10] <220> <221> 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sequence <220> <223> H3K9(Ac) [1-20] <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> ACETYLATION <400> 80 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu 20 <210> 81 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3 [1-21] <400> 81 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 82 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K9(Ac) [1-21] <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> ACETYLATION <400> 82 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 83 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K9(Me1) [1-21] <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> K(Me1) <400> 83 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala 20 <210> 84 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K9(Me2) [1-21] <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> K(Me2) <400> 84 Ala Arg 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Asp Leu Arg 1 5 10 <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K79(Me3) [73-83] <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> K(Me3) <400> 121 Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg 1 5 10 <210> 122 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3 [69-89] <400> 122 Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ala Val 20 <210> 123 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K79(Me1) [69-89] <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> K(Me1) <400> 123 Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ala Val 20 <210> 124 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K79(Me3) [69-89] <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> K(Me2) <400> 124 Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ala Val 20 <210> 125 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3K79(Me3) [69-89] <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> K(Me3) <400> 125 Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Ser Ser Ala Val 20 <210> 126 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3 [116-136] <400> 126 Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg Arg Ile 1 5 10 15 Arg Gly Glu Arg Ala 20 <210> 127 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3 [1-136] <400> 127 Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala 1 5 10 15 Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Val Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala 35 40 45 Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg 50 55 60 Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Met Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys 65 70 75 80 Thr Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala 85 90 95 Cys Glu Ser Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Val 100 105 110 Ile His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala 115 120 125 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<222> (16)..(16) <223> ACETYLATION <400> 132 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Gly Ser Gly Ser Lys 20 25 30 <210> 133 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H4 [1-20] <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> AMIDATION <400> 133 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 134 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H4K5(Ac) [1-20] <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> ACETYLATION <400> 134 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 135 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H4K8(Ac) [1-20] <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> ACETYLATION <400> 135 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 136 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H4K12(Ac) [1-20] <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> ACETYLATION <400> 136 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 137 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H4K16(Ac) [1-20] <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> ACETYLATION <400> 137 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys 20 <210> 138 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 138 Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg 1 5 10 15 Asp Asn Trp Cys 20 <210> 139 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H4 [1-103] <400> 139 Met Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala 1 5 10 15 Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys 20 25 30 Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu 50 55 60 Asn Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys 65 70 75 80 Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg 85 90 95 Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly 100 <210> 140 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 140 Cys Lys Ala Thr Gln Ala Ser Gln Glu Tyr 1 5 10 <210> 141 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 141 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Cys 20 <210> 142 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3 [1-18 WC] <400> 142 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Trp Cys 20 <210> 143 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 143 Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 144 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H4 [8-25 WC] <400> 144 Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg 1 5 10 15 Asp Asn Trp Cys 20 <210> 145 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 145 Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala 1 5 10 15 Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Val Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala 35 40 45 Leu Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg 50 55 60 Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Met Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys 65 70 75 80 Thr Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala 85 90 95 Cys Glu Ser Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Val 100 105 110 Ile His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala 115 120 125 Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala 130 135 <210> 146 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 146 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Selank <400> 147 Thr Lys Pro Arg Pro Gly Pro 1 5 <210> 148 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Semax <400> 148 Met Glu His Phe Pro Gly Pro 1 5 <210> 149 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mitochondrial localization sequence <400> 149 Pro Glu Asp Glu Ile Trp Leu Pro Glu Pro Glu Ser Val Asp Val Pro 1 5 10 15 Ala Lys Pro Ile Ser Thr Ser Ser Met Met Met Pro 20 25 <210> 150 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 150 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T-ag NLS <400> 151 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 152 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> SV40 T-Ag-derived NLS <400> 152 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Tyr Cys 1 5 10 <210> 153 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> SV40 NLS <400> 153 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly 1 5 10 15 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly 20 25 30 Cys <210> 154 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 154 Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 155 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 155 Cys Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Tyr Leu 1 5 10 15 Ile <210> 156 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 156 Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys <210> 157 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 157 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Tyr Cys 1 5 10 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> cMyc-NLS <400> 158 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 159 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 159 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 160 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HIV-1 TAT [47-57] <400> 160 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 161 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 161 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 162 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Transportan <400> 162 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 163 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 163 Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30 Ala <210> 164 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 164 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 165 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 166 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 166 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 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PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 173 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 174 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 174 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 175 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 175 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 20 25 30 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 35 40 45 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 50 55 60 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 100 105 110 Glu Glu Glu Glu 115 <210> 176 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 176 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 177 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 177 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 178 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 178 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 179 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 179 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 180 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Targeting molecule <400> 180 Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 <210> 181 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> a5b1 ligand <400> 181 Arg Gly Asp Gly Trp 1 5 <210> 182 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Integrin binding peptide <400> 182 Gly Cys Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly 1 5 10 <210> 183 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Rabies virus glycoprotein (RVG) <400> 183 Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 184 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Stem cell factor (SCF) <400> 184 Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr 1 5 10 15 Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr 20 25 30 Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met 35 40 45 Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser 50 55 60 Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val 65 70 75 80 Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys 85 90 95 Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro 100 105 110 Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp 115 120 125 Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu 130 135 140 Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu 145 150 155 160 Pro Pro Val Ala <210> 185 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CD70 <400> 185 Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly Cys 1 5 10 15 Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Cys 20 25 30 Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro 35 40 45 Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr 50 55 60 Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu 65 70 75 80 Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg 85 90 95 Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala 100 105 110 Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala 115 120 125 Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu 145 150 155 160 Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro 165 170 175 Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro 180 185 190 <210> 186 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> SH2 domain-containing protein 1A (SH2D1A) <400> 186 Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Asp Ala Val Ala Val 1 5 10 15 Tyr His Gly Lys Ile Ser Arg Glu Thr Gly Glu Lys Leu Leu Leu Ala 20 25 30 Thr Gly Leu Asp Gly Ser Tyr Leu Leu Arg Asp Ser Glu Ser Val Pro 35 40 45 Gly Val Tyr Cys Leu Cys Val Leu Tyr His Gly Tyr Ile Tyr Thr Tyr 50 55 60 Arg Val Ser Gln Thr Glu Thr Gly Ser Trp Ser Ala Glu Thr Ala Pro 65 70 75 80 Gly Val His Lys Arg Tyr Phe Arg Lys Ile Lys Asn Leu Ile Ser Ala 85 90 95 Phe Gln Lys Pro Asp Gln Gly Ile Val Ile Pro Leu Gln Tyr Pro Val 100 105 110 Glu Lys Lys Ser Ser Ala Arg Ser Thr Gln Gly Thr Thr Gly Ile Arg 115 120 125 Glu Asp Pro Asp Val Cys Leu Lys Ala Pro 130 135 <210> 187 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> a5b3 ligand <400> 187 Asp Gly Ala Arg Tyr Cys Arg Gly Asp Cys Phe Asp Gly 1 5 10 <210> 188 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Integrin binding peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> AMIDATION <400> 188 Gly Cys Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly 1 5 10 <210> 189 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9R-SCF <400> 189 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Met Glu Gly Ile Cys Arg Asn 1 5 10 15 Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu 20 25 30 Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val 35 40 45 Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp 50 55 60 Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu 85 90 95 Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe 100 105 110 Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile 115 120 125 Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu 130 135 140 Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser 145 150 155 160 Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala 165 170 <210> 190 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 9R-CD70 <400> 190 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys 1 5 10 15 Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val 20 25 30 Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg 35 40 45 Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp 50 55 60 Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg 65 70 75 80 Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly 85 90 95 Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr 100 105 110 Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala 115 120 125 Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala 130 135 140 Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr 145 150 155 160 Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys 165 170 175 Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr 180 185 190 Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro 195 200 <210> 191 <211> 201 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CD70-9R <400> 191 Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly Cys 1 5 10 15 Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Cys 20 25 30 Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro 35 40 45 Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr 50 55 60 Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu 65 70 75 80 Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg 85 90 95 Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala 100 105 110 Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala 115 120 125 Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu 145 150 155 160 Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro 165 170 175 Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro 180 185 190 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 195 200 <210> 192 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 6H-SH2D1A <400> 192 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Asp Ala Val Ala Val Tyr His Gly Lys Ile Ser 20 25 30 Arg Glu Thr Gly Glu Lys Leu Leu Leu Ala Thr Gly Leu Asp Gly Ser 35 40 45 Tyr Leu Leu Arg Asp Ser Glu Ser Val Pro Gly Val Tyr Cys Leu Cys 50 55 60 Val Leu Tyr His Gly Tyr Ile Tyr Thr Tyr Arg Val Ser Gln Thr Glu 65 70 75 80 Thr Gly Ser Trp Ser Ala Glu Thr Ala Pro Gly Val His Lys Arg Tyr 85 90 95 Phe Arg Lys Ile Lys Asn Leu Ile Ser Ala Phe Gln Lys Pro Asp Gln 100 105 110 Gly Ile Val Ile Pro Leu Gln Tyr Pro Val Glu Lys Lys Ser Ser Ala 115 120 125 Arg Ser Thr Gln Gly Thr Thr Gly Ile Arg Glu Asp Pro Asp Val Cys 130 135 140 Leu Lys Ala Pro 145 <210> 193 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 6H-SH2D1A <400> 193 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg 1 5 10 15 Gly Ser His Met Asp Ala Val Ala Val Tyr His Gly Lys Ile Ser Arg 20 25 30 Glu Thr Gly Glu Lys Leu Leu Leu Ala Thr Gly Leu Asp Gly Ser Tyr 35 40 45 Leu Leu Arg Asp Ser Glu Ser Val Pro Gly Val Tyr Cys Leu Cys Val 50 55 60 Leu Tyr His Gly Tyr Ile Tyr Thr Tyr Arg Val Ser Gln Thr Glu Thr 65 70 75 80 Gly Ser Trp Ser Ala Glu Thr Ala Pro Gly Val His Lys Arg Tyr Phe 85 90 95 Arg Lys Ile Lys Asn Leu Ile Ser Ala Phe Gln Lys Pro Asp Gln Gly 100 105 110 Ile Val Ile Pro Leu Gln Tyr Pro Val Glu Lys Lys Ser Ser Ala Arg 115 120 125 Ser Thr Gln Gly Thr Thr Gly Ile Arg Glu Asp Pro Asp Val Cys Leu 130 135 140 Lys Ala Pro 145 <210> 194 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Target polypeptide SCF <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Cationic anchoring domain <220> <221> misc_feature <222> (167)..(167) <223> Cationic anchoring domain <400> 194 Xaa Met Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp 1 5 10 15 Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu 20 25 30 Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser 35 40 45 Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys 50 55 60 Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys 65 70 75 80 Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser 85 90 95 Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe 100 105 110 Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe 115 120 125 Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser 130 135 140 Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe 145 150 155 160 Met Leu Pro Pro Val Ala Xaa 165 <210> 195 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Targeting polypeptide CD70 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Cationic anchoring domain <220> <221> misc_feature <222> (194)..(194) <223> Cationic anchoring domain <400> 195 Xaa Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly 1 5 10 15 Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile 20 25 30 Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu 35 40 45 Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His 50 55 60 Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala 65 70 75 80 Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu 85 90 95 Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu 100 105 110 Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu 115 120 125 Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro 145 150 155 160 Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu 165 170 175 Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg 180 185 190 Pro Xaa <210> 196 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Targeting polypeptide SH2D1A <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Cationic anchoring domain <400> 196 Xaa Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Asp Ala Val Ala 1 5 10 15 Val Tyr His Gly Lys Ile Ser Arg Glu Thr Gly Glu Lys Leu Leu Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Leu Asp Gly Ser Tyr Leu Leu Arg Asp Ser Glu Ser Val 35 40 45 Pro Gly Val Tyr Cys Leu Cys Val Leu Tyr His Gly Tyr Ile Tyr Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Ser Gln Thr Glu Thr Gly Ser Trp Ser Ala Glu Thr Ala 65 70 75 80 Pro Gly Val His Lys Arg Tyr Phe Arg Lys Ile Lys Asn Leu Ile Ser 85 90 95 Ala Phe Gln Lys Pro Asp Gln Gly Ile Val Ile Pro Leu Gln Tyr Pro 100 105 110 Val Glu Lys Lys Ser Ser Ala Arg Ser Thr Gln Gly Thr Thr Gly Ile 115 120 125 Arg Glu Asp Pro Asp Val Cys Leu Lys Ala Pro 130 135 <210> 197 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Targeting polypeptide SH2D1A <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Cationic anchoring domain <400> 197 Met Gly Ser Ser Xaa Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met 1 5 10 15 Asp Ala Val Ala Val Tyr His Gly Lys Ile Ser Arg Glu Thr Gly Glu 20 25 30 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202 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 202 Lys Arg Lys Arg Trp Glu Asn Asp Ile Pro 1 5 10 <210> 203 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 203 Lys Arg Lys Arg Trp Glu Asn Asn Ile Pro 1 5 10 <210> 204 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 204 Thr Gly Gly Val Met Lys Arg Lys Arg Gly Ser Val 1 5 10 <210> 205 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 205 Pro Ile Leu Pro Leu Lys Arg Arg Arg Gly Ser Pro 1 5 10 <210> 206 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 206 Thr Tyr Ser Gly Val Lys Arg Lys Arg Asn Val Val 1 5 10 <210> 207 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 207 Thr His Ile Gly Tyr Lys Arg Lys Arg Asp Ser Val 1 5 10 <210> 208 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 208 Leu Ser Gly Thr Lys Arg Lys Arg Ala Tyr Phe Ile 1 5 10 <210> 209 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 209 Gln Arg Arg Leu Leu Lys Arg Lys Arg Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 210 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 210 Gln Ile Gly Lys Lys Arg Lys Arg Asp Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 211 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 211 Lys Arg Gly Lys Arg Lys Arg Leu Val Arg Pro Trp 1 5 10 <210> 212 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 212 Lys Lys Gly Lys Arg Lys Arg Leu Val Arg Pro Trp 1 5 10 <210> 213 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 213 Pro Ser Arg Lys Arg Lys Arg Glu Ser Asp His Ile 1 5 10 <210> 214 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 214 Pro Ser Arg Lys Arg Lys Arg Asp His Tyr Ala Val 1 5 10 <210> 215 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 215 Ile Ser Arg Lys Arg Lys Arg Asp Leu Glu Phe Val 1 5 10 <210> 216 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 216 Ile Thr Arg Lys Arg Lys 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Trp Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu 130 135 140 Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe Ile Phe Val Arg Ile Val Gln Leu Leu 145 150 155 160 Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg Gln Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe 165 170 175 Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His 180 185 190 Glu Val Val Phe Ala Phe Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu 195 200 205 Arg Ser Ala Lys Leu Phe Phe Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly 210 215 220 Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser 225 230 235 240 Glu Leu Arg Arg Arg Trp His Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Trp 245 250 255 Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn 260 <210> 314 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF fragment <400> 314 Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe 1 5 10 15 Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys 20 25 30 Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val 35 40 45 Val Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu 50 55 60 Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe 65 70 75 80 <210> 315 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe 1 5 10 15 Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys 20 25 30 Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val 35 40 45 Val Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu 50 55 60 Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe 65 70 75 80 Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys 85 90 95 Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu 100 105 110 Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met 115 120 125 Ser Ala Lys Ser 130 <210> 316 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF fragment <400> 316 Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys 1 5 10 15 Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu 20 25 30 Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met 35 40 45 Ser Ala Lys Ser 50

Claims (11)

  1. (a) 제1 적재물(payload)을 포함하는 코어,
    (b) 코어를 캡슐화하고 표적화 리간드를 포함하는 제1 탈피할 수 있는(sheddable) 층,
    (c) 제2 적재물을 포함하고 제1 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 중간층, 및
    (d) 중간층을 둘러싸는 제2 탈피할 수 있는 층
    을 포함하는 다중-층상(multi-layered) 나노입자이며,
    여기서 상기 코어는
    (i) 하나 이상의 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및/또는 하나 이상의 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하며, D-이성질체의 폴리머 대 L-이성질체의 폴리머의 중량비가 2:1인 음이온성 폴리머 조성물로서, 폴리(글루탐산)을 포함하는 음이온성 폴리머 조성물;
    (ii) 하나 이상의 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및/또는 하나 이상의 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하며, L-이성질체의 폴리머 대 D-이성질체의 폴리머의 중량비가 1:0인 양이온성 폴리머 조성물로서, 폴리(L-아르기닌)을 포함하는 양이온성 폴리머 조성물; 및
    (iii) 히스톤 꼬리 펩타이드(HTP)를 포함하는 양이온성 폴리펩타이드 조성물
    을 포함하는 것인
    다중-층상 나노입자.
  2. (a) 제1 적재물을 포함하는 코어,
    (b) 코어를 캡슐화하고 표적화 리간드를 포함하는 제1 탈피할 수 있는 층,
    (c) 제2 적재물을 포함하고 제1 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 중간층, 및
    (d) 중간층을 둘러싸는 제2 탈피할 수 있는 층
    을 포함하는 다중-층상 나노입자이며,
    여기서 상기 코어는
    (i) 하나 이상의 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및/또는 하나 이상의 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하며, D-이성질체의 폴리머 대 L-이성질체의 폴리머의 중량비가 2:1인 음이온성 폴리머 조성물로서, 폴리(글루탐산)을 포함하는 음이온성 폴리머 조성물;
    (ii) 하나 이상의 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및/또는 하나 이상의 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하며, L-이성질체의 폴리머 대 D-이성질체의 폴리머의 중량비가 1:0인 양이온성 폴리머 조성물로서, 폴리(L-아르기닌)을 포함하는 양이온성 폴리머 조성물; 및
    (iii) HTP를 포함하는 양이온성 폴리펩타이드 조성물
    을 포함하며,
    상기 코어는 양이온 대 음이온의 전하 비가 2 또는 5로 준비된 것인
    다중-층상 나노입자.
  3. (a) 제1 적재물을 포함하는 코어,
    (b) 코어를 캡슐화하고 표적화 리간드를 포함하는 제1 탈피할 수 있는 층,
    (c) 제2 적재물을 포함하고 제1 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 중간층, 및
    (d) 중간층을 둘러싸는 제2 탈피할 수 있는 층
    을 포함하는 다중-층상 나노입자이며,
    여기서 상기 코어는
    (i) 하나 이상의 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및/또는 하나 이상의 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하며, D-이성질체의 폴리머 대 L-이성질체의 폴리머의 중량비가 2:1인 음이온성 폴리머 조성물로서, 폴리(글루탐산)을 포함하는 음이온성 폴리머 조성물;
    (ii) 하나 이상의 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및/또는 하나 이상의 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하며, L-이성질체의 폴리머 대 D-이성질체의 폴리머의 중량비가 1:0인 양이온성 폴리머 조성물로서, 폴리(L-아르기닌)을 포함하는 양이온성 폴리머 조성물; 및
    (iii) HTP를 포함하는 양이온성 폴리펩타이드 조성물
    을 포함하며,
    상기 코어는 상기 음이온성 폴리머 조성물 및 상기 제1 적재물의 축합에 의해 생성된 것인
    다중-층상 나노입자.
  4. (a) 제1 적재물을 포함하는 코어,
    (b) 코어를 캡슐화하고 표적화 리간드를 포함하는 제1 탈피할 수 있는 층,
    (c) 제2 적재물을 포함하고 제1 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 중간층, 및
    (d) 중간층을 둘러싸는 제2 탈피할 수 있는 층
    을 포함하는 다중-층상 나노입자이며,
    상기 표적화 리간드는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 62, 88, 137, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297 및 301로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고,
    여기서 상기 코어는
    (i) 하나 이상의 음이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및/또는 하나 이상의 음이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하며, D-이성질체의 폴리머 대 L-이성질체의 폴리머의 중량비가 2:1인 음이온성 폴리머 조성물로서, 폴리(글루탐산)을 포함하는 음이온성 폴리머 조성물;
    (ii) 하나 이상의 양이온성 아미노산의 D-이성질체의 폴리머 및/또는 하나 이상의 양이온성 아미노산의 L-이성질체의 폴리머를 포함하며, L-이성질체의 폴리머 대 D-이성질체의 폴리머의 중량비가 1:0인 양이온성 폴리머 조성물로서, 폴리(L-아르기닌)을 포함하는 양이온성 폴리머 조성물; 및
    (iii) HTP를 포함하는 양이온성 폴리펩타이드 조성물
    을 포함하는 것인
    다중-층상 나노입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 탈피할 수 있는 층을 둘러싸는 표면 코트를 추가로 포함하는 다중-층상 나노입자.
  6. 제4항에 있어서, RVG9R, 줄기 세포 인자(SCF) 또는 이의 표적화 단편, CD70 또는 이의 표적화 단편, 및 SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A) 또는 이의 표적화 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 표적화 리간드를 추가로 포함하는 다중-층상 나노입자.
  7. 제5항에 있어서, 표면 코트가 세포 침투 펩타이드, 폴리(L-아르기닌), 광견병 바이러스 당단백질(RVG), 또는 N-아세틸 셀랭크를 포함하는 것인 다중-층상 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 세포 침투 펩타이드가 TAT, VP22 도메인, 드로소필라 안테나페디아 단백질 형질도입 도메인, 절단된 인간 칼시토닌 펩타이드, 서열번호: 160, 서열번호: 161, 서열번호: 162, 서열번호: 163, 서열번호: 164, 서열번호: 165, 서열번호: 168 및 서열번호: 169로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 다중-층상 나노입자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 제2 표적화 리간드가 RVG 단편, ApoE-트랜스페린, 락토페린, 멜라노페리틴, 오보트랜스페리틴, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, PSGL-1, ESL-1, CD44, 사멸 수용체-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, 줄기 세포 인자 (SCF), CD70, SH2 도메인-함유 단백질 1A (SH2D1A), 엑센딘-4, GLP1, α5β1을 표적화하는 표적화 리간드, RGD, 트랜스페린 리간드, FGF 단편, 석신산, 비스포스포네이트, CD90, CD45f, CD34, 조혈 줄기 세포 화학주성 지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고신-1-포스페이트, 세라미드-1-포스페이트, 및 상기 중 임의의 것의 활성 표적화 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 다중-층상 나노입자.
  10. 제4항 또는 제6항에 있어서, 적어도 하나의 표적화 리간드가 탈피할 수 있는 층과 상호작용하는 고착 도메인에 접합된 것인 다중-층상 나노입자.
  11. 제10항에 있어서, 고착 도메인이 서열번호: 15 및 서열번호: 16으로부터 선택된 것인 다중-층상 나노입자.
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